JP2001103968A

JP2001103968A - 微小投射物衝撃による脊椎動物細胞のトランスフォーメーション

Info

Publication number: JP2001103968A
Application number: JP2000250310A
Authority: JP
Inventors: Stephen A Johnston; ステファンエー．ジョンストン; R Sanders Williams; アール．サンダースウイリアムス; John C Sanford; ジョンシー．サンフォード; Sandra G Mcelligott; サンドラジー．マクエリゴット
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc; EI Du Pont de Nemours and Co; Duke University
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc; Duke University; EIDP Inc
Priority date: 1989-11-16
Filing date: 2000-08-21
Publication date: 2001-04-17
Also published as: US7449449B2; US20040092019A1; EP0500799B1; ES2113371T3; EP0500799A1; GR3026594T3; CA2068863C; US20080138325A1; US6194389B1; AU6964191A; CA2068863A1; JPH05503841A; ATE162219T1; DK0500799T3; DE69031951T2; EP0500799A4; US20020006637A1; WO1991007487A1; US7358234B2; US20040097458A1

Abstract

(57)【要約】【課題】脊椎動物の標的細胞に遺伝子をトランス
ファーする。【解決手段】（ａ）微小投射物を提供する段階であっ
て、その微小投射物はポリ核酸配列を運搬し、そのポリ
核酸配列は5’から3’方向で動物細胞の中で機能する調
節配列を含み、かつその調節配列の下流側に位置し転写
を制御されている遺伝子を含む段階と、（ｂ）あらかじ
め選択された動物細胞に微小投射物を投射する段階であ
って、その微小投射物が動物細胞を貫通してその中にポ
リ核酸配列を沈着させるのに充分な速度で接触する段階
とを含む。トランスフォームされる標的細胞は、動物検
体内に存在している細胞、又は動物体内で所有している
性質を失っていない初代細胞であることが好ましい。好
ましい標的細胞は、真皮細胞あるいは下皮細胞であり、
標的細胞に挿入される好ましい遺伝子は、動物検体内で
生理的な応答を産生するタンパク質又はペプチドをコー
ドする遺伝子である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、微小投射物衝撃
によって行う異種接合型ＤＮＡでの動物細胞及び組織の
トランスフォーメーションに関する。

【０００２】

【従来の技術】外因性ＤＮＡまたはＲＮＡを運搬する微
小投射物を用いて、高速度で細胞に微小投射物を投射す
ることによって行う生きた細胞のトランスフォーメーシ
ョンは、最初、T. Klein、E. Wolf、R. Wu 及び J. San
ford の論文、Nature 327、70(1987)によって提案され
た。参照として、J. Sanford 他の論文、Particulate S
cience and Technology 5、27 (1987)を挙げる。最初の
論文は、タバコモザイクウイルス由来のＲＮＡを用いた
タマネギの表皮細胞のトランスフォーメーションに関わ
るものである。タマネギ表皮細胞での結果は、他の植物
に拡張されてきた。例を挙げると、微片衝撃による大豆
カルスのトランスフォーメーションが、P.Christou 他
の論文、Plant Physiol. 87、671(1988)に記載されてい
る。また、大豆の分裂組織におけるトランスフォーメー
ションが、D. McCabe 他の論文、Bio/Technology 6、92
3 (1988)に記載されている。別途参照として、B. Spald
ingの論文、Chemical Week、16 (Aug. 31, 1988)、P. C
hristou 他の欧州特許出願公開公報第 0 301 749 号を
挙げる。未熟なトウモロコシのカルス細胞の微片衝撃に
よるトランスフォーメーションが、T. Klein 他の論
文、Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85、4305(1988)に記載
されており、また、トウモロコシ花粉の微片衝撃により
トランスフォーメーションされたトウモロコシの種子の
生産については、デー．マクケーブ他（D. McCabe et a
l.）のヨーロッパ特許出願公開公報第0270 356号（Euro
pean Patent Application Publication No. 0 270 35
6）に記載されている。

【０００３】植物のトランスフォーメーションに加え
て、微小投射物衝撃は、細胞小器官のトランスフォーメ
ーションに使用されるようになった。微小投射物衝撃に
よる酵母ミトコンドリアのトランスフォーメーション
は、S. Johnston 他の論文、Science 240、1538 (1988)
に記載されており、また、微小投射物衝撃によるクラミ
ドモナス（Chlamidomonas）における葉緑体のトランス
フォーメーションは、J. Boynton 他の論文、Science 2
40、1534 (1988)に記載されている。

【０００４】動物組織または細胞のトランスフォーメ-
ションに対する微片衝撃の使用は、比較的に少ない関心
しか払われていなかった。Sanford 他の論文、Praticul
ateScience and Technology 5、27、35-36 (1987)で
は、微片衝撃を人間の遺伝子治療法へ使用することが示
唆されているが、そのような治療法を行うための組織の
タイプ、または組織の成長段階は示唆されていない。
「生きた細胞及び組織に物質を搬入するための方法及び
そのための装置（Method for Transporting Substances
Into Living Cells and Tissues and Apparatus There
for）」と命名された米国特許出願明細書第06/877,619
号（U. S. Patent Application No.06/877,619）は、微
小投射物衝撃による生物材料の細胞への導入に関連する
ものである。提案されている生物学的物質は、蛍光色素
や放射線標識がなされたプローブ、ウイルス、小器官、
ベシクル、酵素やホルモンなどのタンパク質やDNA、RNA
などの核酸である。そこに記載された手順は、（ａ）卵
や骨髄細胞、筋肉細胞や表皮細胞での微片衝撃について
は、16ページの5目から6行目までに、（ｂ）人間の組織
または他の動物組織で、表皮組織や臓器組織、腫瘍組織
などでの微片衝撃については、16ページの13行目から14
行目までに、そして（ｃ）骨髄組織の微片仲介トランス
フォーメーションによる鎌型赤血球血症のヒトの遺伝子
治療法については、22ページの8行目から9行目までに記
載されている。

【０００５】W. Brillは、Particle Propulsion by Ele
ctric Discharge (Tape of Speechat AAAS meeting mee
ting on Plant Molecular Biology/Genetic Engneering
for Agriculture (VI)(January 1989)）において、体
壁を失ったミオシン遺伝子を微片衝撃によって修復する
線虫のトランスフォーメーションについて論じている。
しかしながら、線虫をトランスフォームすることの実用
性は、比較的限られたものである。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このような観点からこ
の発明の目的は、動物、特に脊椎動物とそれらの組織や
細胞の微小投射物衝撃による治療の新たな利用法を提供
することにある。この発明のさらに特別な目的は、動物
の検体にタンパク質やペプチドを投与する手段として微
小投射物衝撃を使用することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】この発明の第一番目の局
面は、あらかじめ選択された脊椎動物細胞に遺伝子を伝
達する方法である。その方法は、最初の段階として微小
投射物を用意することであり、その微小投射物はポリ核
酸配列を運搬し、その配列には５’側から３’側の方向
へ、脊椎動物細胞において機能可能な調節配列と、調節
配列の下流側に位置して転写制御下にある異種接合型遺
伝子（heterologous gene）とが含まれている。その微
小投射物は、細胞を貫通してポリ核酸配列を沈着させる
のに十分な速度で細胞に接触する微小投射物で、あらか
じめ選択された細胞へ向けて加速される。ここで用いら
れた「細胞」「微片」「ポリ核酸配列」などの用語の複
数形は、単数形を包含する意図である。

【０００８】この発明の第二番目の局面は、あらかじめ
選択された脊椎動物組織に遺伝子を伝達する方法であ
る。その方法は、最初の段階として微小投射物を用意す
ることであり、その微小投射物はポリ核酸配列を運搬
し、その配列には５’側から３’側の方向へ、脊椎動物
組織において機能可能な調節配列と、調節配列の下流に
位置して転写制御下にある異種接合型遺伝子とが含まれ
ている。微小投射物は、組織の細胞を貫通してポリ核酸
配列を沈着させるのに十分な速度で細胞に接触する微小
投射物で、あらかじめ選択された細胞へ向けて加速され
る。

【０００９】この発明の第三番目の局面は、脊椎動物検
体（vertabrate subject）のあらかじめ選択された組織
に、インシトゥ（in situ）で遺伝子を伝達する方法で
ある。その方法は、最初の段階として微小投射物を用意
することであり、その微小投射物はポリ核酸配列を運搬
し、その配列には、５’側から３’側方向へ、脊椎動物
組織において機能可能な調節配列と調節配列の下流に位
置して転写制御下にある異種接合型遺伝子とが含まれて
いる。そして微小投射物はその動物検体へ向けて加速さ
れる。その際、その動物検体は微小投射物があらかじめ
選択された組織に接触するように配置され、かつ、前記
微小投射物は組織の細胞を貫通してポリ核酸配列を沈着
させるのに十分な速度で組織の細胞に接触するように構
成されている。

【００１０】ここで発表されたデータは、この出願人に
知られている（ａ）脊椎動物細胞、（ｂ）脊椎動物組
織、及び（ｃ）インシトゥ（in situ）における脊椎動
物組織の微片仲介トランスフォーメーションの最初の実
証を与えている。

【００１１】また、ここで発表されたものは、脊椎動物
検体にタンパク質あるいはペプチドを投与する方法でも
ある。この方法は、微片衝撃でトランスフォーメーショ
ンを施された脊椎動物組織が、カルスの形成、炎症、及
び他の防御応答が驚異的になくなるという我々の発見に
一部基づいている。このように、（細胞がトランスフォ
ーメーションを受けた事による薬効で）トランスフォー
メーション後の細胞から放出されたタンパク質やペプチ
ドは、その細胞が属する動物検体を通り抜けて循環する
ことができ、そして、動物検体内で循環する細胞（例と
して、リンパ球）は、トランスフォーメーション後の細
胞に接近する。この方法で標的の脊椎動物組織（好まし
くは、真皮組織（dermis）または下皮組織（hypodermi
s））が選択され、そして微小投射物が与えられる。そ
の微小投射物はポリ核酸配列を運び、その配列は、５’
側から３’側方向へ、選択された組織内で機能可能な調
節配列と、調節配列の下流に位置し転写制御下にある遺
伝子とを含んでいる。その遺伝子は、タンパク質または
ペプチドをコードしている。そして微小投射物は、組織
の細胞を貫通して、そこにポリ核酸配列を沈着させて、
トランスフォーメーションを受けた組織を作るのに十分
な速度でもって、組織の細胞に接触するように、選択さ
れた標的の組織へ向けて加速される。トランスフォーメ
ーションを受けた組織細胞は、その後動物検体中に維持
される。そして、そのトランスフォーメーションされた
組織細胞は、遺伝子が発現して、その遺伝子によってコ
ードされているタンパク質やペプチドに生理応答（例と
して、内分泌応答や免疫応答）を検体内に生産するのに
十分な数で検体中に存在している。

【００１２】

【発明の実施の形態】ここで用いられる「組織」（tiss
ue）という用語は、特定の機能を果たすことにおいて同
じように特殊化されて結びついた細胞の集合体を意味す
る。「組織細胞」（tissue cells）という用語は、組織
中に存在している細胞を意味する。「細胞」（cell）と
いう用語は、組織中に存在している（すなわち、「イン
シトゥ（in situ）」の）細胞、またはそれらの起源の
組織から取り出された（すなわち、「インビトロ（in v
itro）」の）細胞を意味する。

【００１３】動物組織細胞は、それらの起源の組織につ
いてはインシトゥ（in situ）で衝撃が受けられ、また
は組織から分離されてインビトロ（in vitro）で衝撃が
受けられる。起源の組織については、細胞は好ましくは
インシトゥ（in situ）でトランスフォーメーションさ
れる。トランスフォーメーションされるべき組織は、起
源の動物で、あるいはトランスフォーメーションされる
組織が以後維持されたままとされる動物で、狙う結果に
応じて、インビトロ（in vitro）またはインシトゥ（in
situ）のいずれかで同様に衝撃を受けることが可能で
ある。好ましくは、その組織は、動物内に維持されたま
まのインシトゥでトランスフォーメーションされる。

【００１４】この発明の方法で処理される動物検体は、
魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類などの典型的な脊
椎動物である。鳥類（例えば鶏、七面鳥）と哺乳類が好
ましく、特に哺乳類（例えば馬、牛、羊、豚、ヒト）が
最も好ましい。この発明の方法で処理される脊椎動物の
組織と細胞は各対応する起源からのものであるから、好
ましいあるいは最も好ましい組織と細胞の起源は、好ま
しいあるいは最も好ましい動物に対応している。

【００１５】この発明は、細胞培養で固定化され、また
は別の方法で天然の状態から変更された細胞を除くとい
う条件付きで、どの脊椎動物細胞でも実用化できるであ
ろう。このように、この発明でトランスフォーメーショ
ンを受けるべき細胞は、天然に出現する段階にある細胞
（即ち、初代細胞）で、組織内に存在しているか、イン
ビトロ（in vitro）の組織から離れて存在しているかど
ちらかである。インシトゥ（in situ）で所有している
性質を失わせるのに十分な時間及び／または効果的な条
件下で、インビトロで維持さた細胞は、この発明が関係
する細胞のグループからは、除かれる。

【００１６】この発明の方法で処理される脊椎動物細胞
は、分化した細胞が望ましく、最も望ましいのは、皮膚
細胞や下皮細胞（hypodermis cells）、筋肉細胞、神経
細胞、膵臓細胞、肝細胞などの端部が分化した細胞であ
る。皮膚細胞の例としては、基底細胞(basal cell)、真
皮細胞、及び下皮細胞が含まれる。

【００１７】同様に、この発明の方法で処理される脊椎
動物組織は、分化した組織が望ましく、最も望ましいの
は、皮膚組織や下皮組織（hypodermis tissue）、筋肉
組織、神経組織、すい臓組織、肝組織などの端部が分化
した組織である。皮膚組織の例としては、基底細胞層、
真皮、及び下皮が含まれる。

【００１８】微小投射物によって運ばれるポリ核酸配列
は、遺伝子と調整部位の組み換え構築物である。その構
築物は、プラスミド等やウシ乳頭腫ウイルスベクター等
のゲノムウイルスＤＮＡ（文献参照 E.Chen 他の論
文、299 Nature 529 (1982)）、レトロウイルスのＲＮ
Ａ配列、上記のものの誘導体、及び合成オリゴヌクレオ
チドのような、どの適切な型も取りうるであろう。ＤＮ
Ａ構築物、特にプラスミドが、現在のところ望ましい。
ポリ核酸配列に使われるであろう好ましい遺伝子は、動
物検体で生理的な応答（特に内分泌応答や免疫応答）を
産生するタンパク質やペプチドをコードしている遺伝子
である。遺伝子はトランスフォーメーションを受ける動
物について、相同型でもまたは異種接合型（非相同型）
でもよいし、また相同型遺伝子の修飾型でもよい。

【００１９】内分泌応答（すなわち、動物での一時的な
生理応答が、タンパク質やペプチドが検体の循環器系や
リンパ系を通じて移動することを要求するトランスフォ
ーメーションを受けた組織部位から十分に移動した。）
を産生するタンパク質やペプチドをコードしている遺伝
子の例としては、因子（Facter） VIII:Cをコードする
遺伝子、組織プラスミノーゲン活性化因子(Tissue Plas
minogen Activator)やウロキナーゼのようなプラスミノ
ーゲン活性化因子をコードしている遺伝子（例えば、米
国特許明細書第4,370,417号及び第4,558,010号を参
照）、ヒトまたはウシ成長ホルモン等の成長ホルモンを
コードしている遺伝子、インシュリンをコードしている
遺伝子、及び黄体ホルモンの放出ホルモン等の放出因子
をコードしている遺伝子である。

【００２０】免疫応答（すなわち、タンパク質やペプチ
ドによって活性化されたＢ細胞及びＴ細胞が、トランス
フォーメーションを受けた組織から移動した部位へ検体
の循環器系およびリンパ系を通ることが可能である。）
を産生するタンパク質やペプチドをコードしている遺伝
子の例は、ミノール他（Minor et al.）の米国特許第4,
857,634号明細書「エンテロウイルスに対するワクチン
に有効なペプチド（Peptides Useful in Vaccination a
gainst Enteroviruses）」、ローズ他（Rose etal.）の
米国特許第4,739,846号明細書「小水泡性口内炎ウイル
スに対するワクチン（Vaccine for Vesicular Stomatit
is Virus）」、ガリベルト他（Galibertet al.）の米国
特許第4,428,941号明細書「Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗
原をコードするヌクレオチド配列、前記ヌクレオチド
配列を含むベクター、それらを得るための手法とそれら
により得られた抗原（Nucleotidic Sequence Coding th
eSurface Antigen of the Hepatitis B Virus, Vector
Containing Said Nucleotidic Sequence, Process Allo
wing the Obtention Thereof and antigen Obtained Th
ereby）」、マース他（Maas et al.）の米国特許第4,76
1,372号明細書「突然変異体大腸菌腸毒素（Mutant Emte
rotoxin of E. coli）」に記載されたようなサブユニ
ットワクチンをコードする遺伝子である。

【００２１】ここに記載した方法のうち、免疫応答の産
生可能なタンパク質やペプチドを投与する利点は、長期
間において検体に効果的に抗原を提示する能力である。
これは、検体によって急速に消化、除去されるタンパク
質やペプチドの単なる注射とは対照的である。

【００２２】検体中で生理応答を産生するタンパク質や
ペプチドをコードしている他の遺伝子の例としては、α
₁アンチトリプシンなどの酵素をコードしている遺伝
子、インシュリンレセプター等のレセプターをコードし
ている遺伝子（参照として、ベル他（Bell et al.,）の
米国特許第4,761,371号明細書）、CD4受容体等のアドヘ
ソン（adhesons）をコードする遺伝子（参照として、ジ
ェネンテック（Genentech）のEPO特許出願公開公報第0,
314,317号「アドヘソン変異体、それらをコードする核
酸、及びそれらからなる組成物(adheson variants, nuc
leic acid encoding them and compositions comprisin
g them)」の公開公報）であって検体内で治療活性を有
する遺伝子、隣接する組織細胞に作用（パラクリン（pa
racrine）様の作用）するか、あるいは分泌されたり分
泌細胞に作用（オートクリン様の作用）したりするタン
パク質あるいはペプチドをコードする遺伝子、及び病原
体で誘導された抗体をコードする遺伝子が挙げられる。
参照としてJ. Sanford and S. Johnston の論文、113
J. Theor. Biol. 395 (1985) 及び J. Sanford の論
文、130 J. Theor. Biol. 469 (1988)を挙げる。

【００２３】ポリ核酸配列は、当該遺伝子から上流側に
すなわち５’の方に調節配列を含んでいる。その調節配
列は、当該遺伝子の転写を誘導することができるよう
に、遺伝子との機能的な関連においてポリ核酸配列内に
位置している。そのポリ核酸配列内で遺伝子の転写の制
御を行うために用いられているであろう調節配列は、一
般的には、標的とする組織細胞内で機能することのでき
るプロモーターである。プロモーターの例としては、例
えばヒトのα−アクチンプロモーター（参照としてT. M
iwa and L. Kedes の論文、7 Molec. Cell Biol. 2803
(1987)を挙げる。）、ヒトのβ−アクチンプロモーター
（J. Leavitt 他の論文、4 Molec,Cell Biol. 1961 (19
84)）、トロポニンＴ（troponin T）遺伝子プロモータ
ー（参照としてT. Cooper and C. Ordashl の論文、260
J. Biol. Chem. 11140 (1985)を挙げる。）、ヒトのヒ
ートショックタンパク質（heat shoch protein） (HSP)
70プロモーター、ロウスサルコーマウイルス（Rous
Sarcoma Virus）のロングターミナルリピート（long T
erminal repeat）のようなレトロウイルスのロングター
ミナルリピート、一般的に見られるＲＮＡ腫瘍ウイルス
（R. Weiss, N. Teich, H. Varmus and J. Coffin Eds.
2d ed. 1984）、及びメタロチオニン遺伝子プロモータ
ーである。そのプロモーター及び遺伝子は、トランスフ
ォーメーションされるように、細胞内でまたは組織の細
胞内で機能することができ（すなわち、そのプロモータ
ーは、遺伝子の転写を誘導することができ、そしてその
遺伝子は、翻訳されることのできるｍＲＮＡ配列のため
にコードされていなければならない。）、機能させるた
めの条件が当該技術分野で知られているものでなければ
ならない。一般的な参照として、R. Old and S. Primro
se 著、Principles of Gene Manipulation (3d Ed. 198
5) を挙げる。組織に関しては、これらの要素は、その
組織内において一つの細胞タイプの中で機能しさえすれ
ばよい。

【００２４】ポリ核酸配列に任意選択的に組み入れても
よい他の調節要素には、細胞に遺伝子が挿入されるその
細胞内で所望の程度の遺伝子の発現を得るために必要
な、当業者によく知られているエンハンサー（enhance
r）、終結配列（termination sequence）、及びポリア
デニル化部位がある。

【００２５】微小投射物加速式細胞トランスフォーメー
ション装置は、その装置が酸素呼吸を行っている動物の
処置を行えるように改造されている限り、本発明を実施
する上で用いられることができる。例えば、その装置
は、サンフォルド他の文献「微片衝撃法を用いた細胞及
び組織内への物質の送達」（Sanford et al., Delivery
of Substances into Cells and Tissues using a Parti
cle Bombardment Process, 5 Particulate Science and
Technology 27 (1988)）、クレイン他の文献「生きた
細胞へ核酸を送達するための高速微小投射物」（Klein
et al., High-Vel ocity Microprojectiles for Deliver
ing Nucleic Acids into Living Cells, 327 Nature 70
(1987)）及びアグラセタスのヨーロッパ特許出願公開
公報第0,270,356号公報（Agracetus European Patent A
pplication Publication No. 0,270,356）でその名称が
「花粉仲介による植物のトランスフォーメーション」
（Pollen-Mediated Plant transformation）である公報
において記載されている。発明者らは商業的に入手可能
な装置を用いた。その装置は、バイオリスチックス株式
会社、108 ラングミューアラボラトリー，コーネル
ビジネスアンドテクノロジーパーク，ブラウン
ロード，イサカ，ＮＹ，14850（Biolistics, Inc., 108
Langmuir Laboratory, Conell Buisiness and Technol
ogy Park, BrownRoad, Ithaca. NY, 14850.）から入手
した。この装置は、モデル BPG-4 微片加速装置（Model
BPG-4 Particle Acceleration Apparatus）と称される
もので、本質的にはクラインら（Klein 他の論文、327
Nature 70 (1987)）が示したように配置構成されてい
る。図１から図５（図２から図５は改良部分を有する）
に示された装置は、高さ調節可能な停止板支持体１３に
よって二つの独立した部屋１１，１２に分けられた衝撃
チャンバー１０を備えている。加速管１４は、衝撃チャ
ンバーの上部に取り付けられている。大きな投射物１５
は、火薬を充填することによって停止板１６に向けて加
速管を下方に放射される。在来の発射装置１８及び排気
装置１９が設けられている。その停止板１６には、まん
中に大きな投射物よりも小さな直径の穴１７が形成され
ており、大きな投射物が微小投射物を運び、その大きな
投射物は穴１７を狙って発射される。大きな投射物１５
が停止板１６によって停止されると、微小投射物が穴１
７を通って推進される。標的の組織４０は、ここでは動
物検体として概略的に示されており、衝撃チャンバー内
に配置され、穴１７を通って推進された微小投射物が標
的の組織の細胞の細胞膜を貫通して、その標的組織の細
胞に運び入れられたＤＮＡ構築物を沈着する。衝撃チャ
ンバー１０は、空気抵抗が微小投射物を不都合に減速さ
せることがないように、使用する前に、部分的に排気さ
れる。そのチャンバーは、衝撃の間、標的組織が過度に
乾燥しないように、部分的に排気するのみである。水銀
柱約２０〜２６インチ（約５０８〜６６０ｍｍＨｇ）の
間の減圧が好ましい。

【００２６】この発明を実施するのに用いた微小投射物
（即ち、微片）は、微片の速度及びその微片が移動しな
くてはならない距離を仮定して、トランスフォーメーシ
ョンされてつつある組織細胞の中へ推進されるのに充分
な密度および凝集性を有する如何なる物質で形成されて
もよい。微小投射物を形成する物質の例としては、金
属、ガラス、シリカ、氷、ポリエチレン、ポリプロピレ
ン、ポリカーボネート、及び炭素化合物（例えばグラフ
ァイト、ダイヤモンド）が挙げられるが、それらに限ら
れるものではない。金属微片が現在のところ好ましい。
好適な金属の例としては、タングステン、金、イリジウ
ムが挙げられるが、それらに限られるものではない。そ
の微片は、標的の組織内でそれらが接触する細胞の過度
の破壊を避けるためには充分に小さな大きさであるべき
で、また、標的組織の目的とする細胞まで貫通するのに
必要な慣性を有するのに充分な大きさも必要である。直
径が約１マイクロメートルから約３マイクロメートルの
範囲の金の微片は、インシトゥでの衝撃に好適であり、
（より特別には）直径が約１マイクロメートルのタング
ステンの微片が、インビトロでの筋肉の衝撃に好適であ
る。

【００２７】ポリ核酸配列は、沈降によって微片に固定
されてもよい。用いる正確な沈降パラメーターは、当該
技術分野で知られているように、用いられた微片加速手
方などのファクターに依存して変化するであろう。搬送
体微片は、適宜、EPO出願第0,270,356号明細書の第8欄
に記載されているように、微片上に固定化されたポリ核
酸配列構築物の安定性を上昇させる目的で、ポリリジン
（polylysin）等のカプセル剤で被覆されてもよい。

【００２８】脊椎動物の皮膚は、外側の表皮（epidermi
s）及び下層の真皮（または皮膚角質層(corneum)）から
形成されている。更にその真皮の下層にあるのは、通常
ゆるんで柔らかい、下皮と呼ばれるスポンジ層で、ここ
では皮膚の一部分として定義して扱われる。その真皮及
び／または下皮は、トランスフォーメーションの目的が
上記に記載したような動物検体において生理的応答を引
き起こすであろう方法で、動物検体にタンパク質あるい
はペプチドを投与することである場合、組織標的として
好ましい。

【００２９】陸居住性両性類、爬虫類、鳥類、哺乳類等
の陸居住性の脊椎動物では、表皮は一般に、外側表面か
ら内側表面に向かって次のような層からなっている。即
ち、：（ａ）角質層（stratum corneum）、あるいは角
質の層（horny layer）で、役に立たなくなって次第に
脱皮し、取り替えられた薄い鱗片状の（平らな）角質化
された細胞からなる層；（ｂ）透明層（stratum luci
dum）、あるいは透明な層（clear layer）で、その中に
はケラチン生成細胞が密に入っており透明で、またその
中には核が存在せず、細胞の輪郭もはっきりしていない
層；（ｃ）顆粒層（stratum granulosum）、あるいは
顆粒細胞の層（granular cell layer）で、そこでケラ
チン化が始まる層；（ｄ）スピノサム層（strarum sp
inosum）、あるいはプリックル細胞の層（prickle cell
layer）で、そこにはリボ核酸の豊富な細胞があり、そ
れによってケラチン化のためのタンパク質の合成が始ま
るようになっている層；そして（ｅ）基底層（syraru
m basale）、あるいは基底細胞の層（basal cell laye
r）で、それは表皮内において有糸分裂を受ける唯一の
細胞である円柱細胞（columnar）の単一の層からなって
いる層である。一般的な参照として、G. Thibodeau の
論文、Anatomy and Physiology、114-19 (1987); R. Fr
andson の論文、Anatomy and Physiology of Farm Anim
als、205-12 (2dEd. 1981); R. Nickel 他の論文、Anat
omy of the Domestic Birds、156-57 (1977)を挙げる。

【００３０】真皮は、また、「本当の皮膚(true ski
n)」とも呼ばれ、一般的には表在性の層（stratum supe
rficiale）あるいは乳頭状層（papillary layer）から
なり、それは表皮のすぐ下に存在する。そして、その下
に深在層（stratum profundum）あるいは網状層（retic
ular layer）が存在する。皮膚の動脈、静脈、毛細血
管、及びリンパ管は真皮に集中している。網状層は一般
に、白いコラーゲン繊維、骨格筋、及び不随意筋が絡み
合った密度の高い網状組織を含んでいる。乳頭状の層は
ゆるんだ柔らかな結合組織と薄いコラーゲン性で弾力性
の繊維の細かい網状組織からなっている。

【００３１】皮下組織あるいは表在性の筋膜は、ゆるん
で柔らかいスポンジ構造の層で、脂肪、疎性組織(areol
ar tissue)、及び血管が豊富に存在する。動物の皮膚が
鈍に切開（blunt dissection）されて取り除かれる場合
は、分離は、通常、皮下組織と下層の組織との間に存在
する分割面において生じ、少なくとも皮下組織のいくば
くかの部分が皮膚にくっついて来る。

【００３２】この発明の方法において、真皮と表皮は、
（ａ）表皮を通過して微小投射物を推進する（進入させ
る）こと、または（ｂ）動物から皮膚の弁状片を入刀し
て鈍な切開を行うことによって外科的に皮下及び真皮を
露出させ、外側の表面層を通して微小投射物を投射する
ことなく、直接皮下あるいは真皮に微小投射物を推進
し、続いてその動物における皮膚の弁状片を剥した位置
に、その切開した皮膚の弁状片を復元すること、のいず
れでトランスフォーメーションされてもよい。その皮膚
の弁状片は、微小投射物衝撃の間動物につけたままにし
ておくことができるし、あるいは微小投射物衝撃の間小
片として取り外しておき、その後動物に植皮し戻すこと
もできる。皮膚の弁状片を動物から取り外すのであれ
ば、動物の同じ部位に戻すこともできるし、あるいは異
なる部位に戻すこともできる。あるいは違う動物に移植
することも可能である。発明者らは、その皮膚の弁状片
をつけたままにしておくことを好んでいる。発明者ら
は、外科的に真皮を露出させることにより、この微小投
射物が表皮を通過する必要がなくなるため、真皮のトラ
ンスフォーメーションがより大きく起きるということを
見いだした。しかし、その微小投射物が陸居住性の脊椎
動物の表皮を通過して投射しても、相当程度の真皮のト
ランスフォーメーションが起きることも見いだした。

【００３３】この発明の種々の局面は、以下の実施例で
説明される。これらの実施例は、この発明を説明するた
めに記述されたものであり、本発明を限定するものと解
すべきではない。

【００３４】

【実施例】実施例１末端の分化された骨格筋管の微小片仲介トランスフォー
メーションこの実施例は、充分に分化された、非区分的な骨格の筋
管の主な培養物が、DNA−微片受容体を用いてインビト
ロでトランスフォーメーションできることを示してい
る。その導入された遺伝子は急速には退化せず、培養物
の生存中、転写的に活性を維持する（12日間）。

【００３５】筋管培養物（４×10⁵ 個の細胞）は、10％
のウマ血清及び5％の胚抽出液を添加したダルベッコの
ミニマムエッセンシャルメディアム（Dulbecco's M
inimum Essential Medium (DMEM)）中、ゼラチンで被覆
された60ｍｍのプラスチック皿において１１日齢のニワ
トリ胚の胸部筋肉から作成された。フレッシュな培地を
入れることなく５日間経た後、培養物はほとんど完全に
多核性の筋管からなっており、そのいくらかは横の線紋
を示す。ある培養物は、更に、シトシンアラビノシド
（cytosine arabinoside）（ara-C: 1.5から3.0μｇ／
ｍｌ）で処理されて残余が分化してない筋原細胞あるい
は非筋原性の細胞の成長を妨げる。参照としてG. Pulat
h et al., Nature 337, 570 (1989)を挙げる。この段階
（5日間の培養）において、条件づけされた培地は除去
して保存され、そしてそのプレートは真空チャンバー内
に置かれた。タングステン微小投射物（平均直径１μ
ｍ）は、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子を有するpHb-LU
C、即ちプラスミド構築物で被覆されており、それは、
J. de Wet et al., Molec. Cell Biol. 7, 725(1987)を
参照でき、ヒトのＢ−アクチンプロモーター（J. de
Wet et al., Molec. Cell Biol. 4, 1961(1984)参
照）、これらの細胞内で強い構造性の活性を有するプロ
モーターによって運ばれる。それぞれの培養物は、2μ
ｌの微小投射物の懸濁液で、真空（水銀柱２９インチ
（７３７ｍｍＨｇ））の条件下で、衝撃される。その微
小投射物は、砲身部の上から３ｃｍのところを起点とし
て、＃１火薬２２内径のカートリッジで加速された。そ
のペトリ皿は、チャンバーの底部に置かれた。微小投射
物を被覆するために用いられる装置、及び方法は、J. S
anford etal., Particulate sci. Technol. 5, 27(198
7)及び、T. Klein et al., Nature327, 70(1987)に記載
されている。この研究においては、予備的な実験が行わ
れ、微片速度、微片の大きさ、微片の成分、及び細胞の
密度について、発明者らの特別な条件のための衝撃後
に、ルシフェラーゼ活性の発現が最大となる条件が確立
された。一旦これらの条件が最適化されてから、表１に
示された実験が行われた。全細胞の溶解物は、衝撃後２
日後の細胞から調整され、過剰のＡＴＰの存在下でルシ
フェリンの添加をした後、ルシフェラーゼ活性が、バー
ソルドバイオルマット LB9500C ルミノメーター（B
erthold Biolumat LB9500C luminometer）で測定され
た。J. de Wet et al., Molec. Cell Biol. 7, 725 (19
87)による。これらのデータも表１に示されている。

【００３６】

【表１】

【００３７】微小投射物によるトランスフォーメーショ
ンは、標準的な燐酸カルシウム共沈物によって筋管の培
養物のトランスフォーメーションによって得られる活性
よりも10-20培の強度／プレート及び200-400培の強度／
μｇ DNA であるレポーター遺伝子活性を生成する。参
照としてC. Chen and H. Okayama, Molec. Cell Biol.
7, 2745 (1987)を挙げる。

【００３８】実施例２微片衝撃によって端部が分化した骨格筋管に導入される
ＤＮＡの時間経過による運命この実施例は、衝撃の後のさまざまな時間で誘導できる
プロモーターの応答を測定することによって、導入され
たDNAの時間経過後の運命を調べるものである。筋管
は、上記実施例１に記載したようにトランスフォーメー
ションされるが、ヒトのHSP70 プロモーターの制御のも
とで、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子を用いてトランス
フォーメーションされる。参照としてB. Wu et al., Pr
oc. Nat. Acad. Sci. USA 83, 629(1986)を挙げる。衝
撃後の第２〜７日目において、ルシフェラーゼ活性は、
３７℃（コントロール（対照標準）＝Ｃ）で維持される
か、あるいは４５℃で９０分間処理した（熱ショック＝
ＨＳ）のに引続き、３７℃で３時間回復させることで得
られる姉妹培養物内で測定された。

【００３９】衝撃の後、６〜７日間維持された培養物
は、トランスフェクトされていない筋管の培養物からの
ならし培地（細胞分裂促進増殖因子の枯渇した培地）
を、２日の間隔で再供給（re-fed）した。第６図は、こ
の期間の間中、導入されたプラスミドの誘導可能な発現
が維持されるということを示している。コントロールの
プレートにおける基底レベルでの発現に比較して計算し
た場合、２日目の培養物（7.9倍の誘導）及び７日目の
培養物（11.9倍の誘導）の間で、その発現において減少
は見られなかった。このように、これらの培養物の生存
期間の間中、プラスミドの機能低下も、異種接合型プロ
モーターの非作用も実質上なかった。

【００４０】実施例３端部が分化した筋管の培養物における、トランス遺伝子
発現の部位この実施例は、トランス遺伝子の発生が、これら初代培
養物内に残っている単核細胞と区別されて、全体的に分
化された筋管内で起こっているかどうかを決定するため
に行った。分化された筋管の培養物は、実施例１に示さ
れたように、ロウスサルコーマウイルスの長い末端
のリピート（pRSV-ADH）（Rous SarcomaVirus long ter
minal repeat (pRSV-ADH)）の制御の下で、ドロソフィ
ラアルコールデハイドロゲナーゼ（Drosophila Alc
ohol Dehydrogenase）（ADH）を含むプラスミド構築物
を用いて、微小投射物衝撃によってトランスフェクトさ
れた。翌日、細胞は、シー．オーダールら（C. ORdahl
et al.)の、Molecular Biology of Muscle Development
547 (C. Emerson et al. Eds. 1986)に記載された方法
によって固定化されて染色され、さらに、非整列の位相
リングを用いた位相差顕微鏡で写真がとられた。

【００４１】ドロソフィラ ADHは、単核細胞の中に検出
されたが、活性のほとんど大部分は、多核化された融合
筋管内に見いだされた。興味深いことに、筋管の染色に
は二つのパターンが現れていた。ある筋管では、ADH活
性は単一核の周りに場所的に限られて存在し、一方、残
りの多核化された細胞には活性は全く認められなかっ
た。この染色パターンは、これらの細胞内で、個々の核
を取り巻いている空間領域にトランス遺伝子が発現する
のを制限する条件が存在していることを示している。し
かしながら他の筋管では、ADH染色は細胞に均一で一様
に施されていた。このトランス遺伝子発現の拡散パター
ンは、多核が単一の筋管内でトランスフォーメーション
されているということか、あるいはある条件下におい
て、ADHタンパク質がこれらの延長された細胞の全区間
を通じて自由に拡散されているということかを意味して
いる。トランスフォーメーションの起こる頻度から見る
と、後者の説明の方がうまく付く。

【００４２】実施例４代替（alternate）細胞のｐＲＳＶＡＤＨによるトラ
ンスフォーメーション上記の実施例３に示された実験が、骨格筋管の代わりに
インビトロの心臓の細胞が用いられた点を除き、実質的
に同様の方法で繰り返された。陽性の結果は得られなか
った。トランスフォーメーションが起きなかったのは、
用いられた細胞のプレート上に、非常に少ない数の細胞
しかないことによるものと思われる。

【００４３】実施例３に記載された実験が、骨格筋管に
代えて全体のマウス横隔膜が用いられた点を除き、実質
的に同様な方法で再度繰り返された。その横隔膜は、一
片のスクリーンを用いて皿の上に平らに置かれ、そのス
クリーンは、重りで下に引っ張られた。トランスフォー
メーションは認められなかった。用いられた１マイクロ
メートルのタングステンの小さな微片が、横隔膜の組織
を貫通するのに充分な運動エネルギーを有していなかっ
たと思われる。

【００４４】実施例５動物のトランスフォーメーションのための装置上記諸実施例で用いられた装置は、図１から図５に示さ
れた要領で、そっくりそのままの動物内における組織の
トランスフォーメーションのために改造された。衝撃チ
ャンバー１０に取り付けられたドア２０が開かれ、動物
の衝撃のための取り付け部品３０または”トラップ(tra
p)”が挿入された。動物衝撃取り付け部品３０にはカバ
ープレート３１と動物チャンバー３２が備えてられてい
る。動物チャンバー３２は上面、底面、側面、背面、及
び外側のフランジ３３とからなる。そのチャンバー３２
は、カバープレート３１内に開口部から挿入され、カバ
ープレート３１の開口部と動物チャンバー３２のフラン
ジの縁部との間に位置するカバープレート３１の前面側
に設けた樹脂製のガスケットによって、カバープレート
に対して封止されている。ネジ付きの留め金具３４でカ
バープレート３１に動物チャンバー３２を固定してい
る。衝撃チャンバー１０にカバープレート３１を封止す
るために、カバープレート３１の裏側には、その外側の
縁部から内側に向かって配置された樹脂製のガスケット
が取り付けられている。

【００４５】動物チャンバー３２の上面には、そこに開
口部３５が設けられており、動物チャンバー３２がこの
衝撃チャンバー１０内に取り付けられた時に、その開口
部は停止板１６の穴１７の中心軸と同軸に整列されてい
る。内側の円筒状で上部と下部が開いたスリーブ３６
は、上部の開口部３５に連結してシールされている。内
部スリーブ３６の底縁部には樹脂製のガスケットが挿入
されている。

【００４６】封止プレート３８は内部スリーブ３６の底
面開口部を封止するために取り付けられている。その封
止プレート３８には中心孔３９が形成されている。トラ
ンスフォーメーションされるべき動物検体４０上の組織
表面は、封止プレート３８に接触して位置しており、ト
ランスフォーメーションされるべき組織が中心孔３９を
通してアクセスできるようになっている。そして封止プ
レート３８は、内部スリーブ３６の底縁部に接触して配
置され、減圧チャンバー内が減圧にされる。その封止プ
レート３８への検体組織の接触、内部スリーブ３６への
封止プレート３８の接触、動物チャンバー３２への内部
スリーブ３６の接触、カバープレート３１への動物チャ
ンバー３２の接触、及び衝撃チャンバー１０へのカバー
プレート３１の接触はすべて、衝撃チャンバー１０内を
封止できるようになっている。組織がチャンバー内に入
りにくいように、スクリーンが封止プレート３８の底面
にある中心孔３９にかぶせて設けられている。微小投射
物が加速されるときには、封止プレート３８に設けた中
心孔３９は、微小投射物が中心孔３９を通って組織表面
に接触するように位置づけられている。スポンジあるい
は他の間隔保持手段４１が、封止プレート３８に向かっ
て動物検体を持ち上げるために用いられうる。

【００４７】実施例６安楽死させたマウスの微片衝撃マウスを安楽死させて、その後ろ足の皮膚が露出するよ
うに、除毛剤を用いてマウスの後ろ足からその体毛を取
り除いた。そして、その皮膚は、その位置に残すかまた
は剥すかして、下層の筋肉を露出させた。動物を上記実
施例５において記述した装置の上に置き、後ろ足の皮
膚、あるいは筋肉組織のいずれかが衝撃を受けるように
位置させ、チャンバー内を水銀柱２６インチ（６６０ｍ
ｍＨｇ）の減圧にして、その組織を１マイクロメートル
のタングステン微小投射物を投射することで衝撃した。
１マイクロメートルのタングステン微片は、筋肉、ある
いは皮膚のいずれかを貫通させるには小さすぎることが
判明した。次いで、３．４マイクロメートルのタングス
テン微片で試みたところ、それは筋肉及び皮膚を貫通す
ることが判った。最適なのは金の微片で、直径１マイク
ロメートルから３マイクロメートルのものであった。

【００４８】実施例７生きたままのマウスの皮膚及び耳の微片衝撃生きたままの成熟した雌のバルブC（Balb C）及びチャ
ールスリバーCD1マウス（Charles River CD1 mice）
は、前実施例の中で記述された装置及び手順によってト
ランスフォーメーションされた。直径１マイクロメート
ルから３マイクロメートルの金の微片は、上記したよう
に、沈降法によってpHb-LUCを用いて被覆された。動物
は、ケタミン（ketamine）及びキシラジン（xylazine）
の等量ずつを含む混合物（体重1グラムあたり0.0067m
g）を用いて麻酔がかけられた。標的部位は、後ろ足の
皮膚及び耳であり、それは上記に示したような脱毛を行
って準備された。後ろ足の皮膚に対しては、水銀柱２６
インチ（６６０ｍｍＨｇ）の減圧を行い、耳に対して
は、水銀柱２０インチ（５０８ｍｍＨｇ）の減圧を行っ
た。衝撃の後、その組織はほとんど、あるいは全く損傷
の跡がないように見えた。かすかな茶色の染色が、ほと
んどの動物において微片を含んでいる領域に見られ、ま
れに毛細血管からの皮内出血の小さな（＜１ｍｍ²）領
域が認められた。トランスフェクション後第１日目の皮
膚及び耳のルシフェラーゼ活性のピークが、１分当りの
カウント数で、図７に示されている。それらの値は、平
均値±標準偏差で表してある。１７個の皮膚のサンプル
の活性は、4,699±4,126であり、１２個の耳のサンプル
の活性は、47,114±3,679であった。ホトルミネッセン
ス(Photoluminescence)は、抽出液の50マイクロリッタ
ー（皮膚）のサンプル及び25マイクロリッター（耳）の
サンプルと10秒間一体化したものについて、ベルトルド
LB9500 C ルミノメーターセット（Berthold LB 9500 C
luminometer set）で二重に測定された。期間中の皮膚
や耳に対しての平均ルシフェラーゼ活性は、１分当りの
カウント数で下記表２に示されている。

【００４９】

【表２】

【００５０】麻酔から回復した後、動物の行動に異常は
見られず、皮膚のトランスフォーメーションされた領域
に痛みやかゆみの兆候は現れなかった。過去の衝撃を与
えた皮膚の実験においても、組織構造に重要な変化は現
れなかったが、ただ時折、トランスフォーメーションさ
れた部位のリンパ球あるいは多形核白血球に現れたこと
があった。インシトゥにおけるハイブリダイゼーション
の研究で、表皮内にルシフェラーゼmRNAが発現する細胞
の比率は高く（約25％）、真皮及び髪の小胞に発現する
比率は低い（しかし、認識しうる）ことが明らかとなっ
た。

【００５１】実施例８微片衝撃による生きたマウスの耳における局在トランス
遺伝子の活性上記実施例７に記載したように、マウスの耳は、1マイ
クロメートルから3マイクロメートルの金の微片上に沈
降させたpGHを用いてトランスフォーメーションされ
た。そのプラスミドpGH は、メタロチオニンプロモータ
ー（metallothioninpromoter）によってドライブされる
ヒトの成長ホルモン(HGH)遺伝子を含んでいる。HGHの局
在レベルは、商業的に入手可能なニコルスインスチチ
ュートアレグロ（商標） HGH ラジオイムノアッセイ
（Nichols Institute Allegro HGH Radioimmunoassay）
を用いて測定された。そのRIAデータは、下記の表３に
示されている。活性は１分間当りのカウント数で表され
ている。

【００５２】

【表３】

【００５３】

【付言】上記の各実施例は、この発明を説明するための
例示であり、この発明を限定するものと解釈すべきでな
い。この発明は、前記の特許請求の範囲の記載により定
義され、かつ、請求の範囲と等価のものも、その範囲に
含まれる意図である。

【図面の簡単な説明】

【図１】現在入手可能な微小投射物衝撃装置の斜視図
である。

【図２】図１で示した衝撃チャンバー（chamber）の
詳細図で、停止板と挿入のために設けられた動物チャン
バーが示された図である。

【図３】衝撃チャンバーに設けられた動物チャンバー
の斜視図で、挿入のために装着した封止板を有する動物
チャンバーが示された図である。

【図４】図３で示した装置の側面断面図であり、微小
投射物の停止板までと微小投射物の停止板から検体まで
の進行経路を示す図である。

【図５】停止板と封止板の詳細図で、封止板上での衝
撃後の微小投射物と封止板までの微小投射物の進行経路
を示す図である。

【図６】微小投射物衝撃による培養された骨格筋管の
トランスフォーメーション後のヒト（human）HSP70プロ
モーターによってもたらされたホタルのルシフェラーゼ
遺伝子の存続熱誘導性を示す図である。

【図７】微小投射物衝撃による転写から一日後の、耳
と皮膚の最大ルシフェラーゼ活性を示す図である。

【符号の説明】

１０…衝撃チャンバー、１４…加速器、１５…投射物、
１６…停止板、１７…穴、１８…発射装置、３８…封止
プレート、３９…中心孔

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１２年９月１９日（２０００．９．１
９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 500341816 コーネルリサーチファンデーションインコーポレーテッドアメリカ合衆国ニューヨーク州 14850 イサカスイート 105 ソーンウッドドライブ 20 (71)出願人 500341827 イー．アイ．デュポンデニモアスアンドカンパニー（インコーポレーテッド) アメリカ合衆国デラウェア州 19898 ウィルミントンマーケットストリート 1008 (72)発明者ジョンストンステファンエー. アメリカ合衆国ノースカロライナ州 27701 ダーラムノースグレグソンストリート 309 (72)発明者ウイリアムスアール．サンダースアメリカ合衆国ノースカロライナ州 27701 ダーラムワッツストリート 406 (72)発明者サンフォードジョンシー. アメリカ合衆国ニューヨーク州 14456 ジェニーバサンセットドライブ 43 (72)発明者マクエリゴットサンドラジー. アメリカ合衆国ペンシルバニア州 19063 ローズバレーサウスロングポイントレーン 27

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】あらかじめ選択された脊椎動物細胞に遺
伝子をトランスファーする方法であって、（ａ）５’から３’の方向に、前記動物細胞の中で機能
する調節配列及びその調節配列の下流側に位置し転写制
御下にある遺伝子を含むポリ核酸配列を運搬する微小投
射物を提供する段階と、（ｂ）前記微小投射物が前記脊椎動物細胞を貫通してそ
の中に前記ポリ核酸配列を沈着させるのに充分な速度で
前記細胞に接触するように、前記微小投射物を前記あら
かじめ選択された細胞に向けて加速する段階を含んでな
る方法。
【請求項２】前記あらかじめ選択された細胞が皮膚細
胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記皮膚細胞が基底細胞（basal cel
l）、真皮細胞（dermiscell）、下皮細胞（hypodermis
cell）からなるグループから選択された細胞であること
を特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記あらかじめ選択された細胞が筋肉細
胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記あらかじめ選択された細胞がインビ
トロでトランスフォーメーションされることを特徴とす
る請求項１に記載の方法。
【請求項６】前記微小投射物が、１マイクロメートル
から３マイクロメートルの直径のものであることを特徴
とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】あらかじめ選択された脊椎動物細胞を含
む組織に遺伝子をトランスファーする方法であって、（ａ）５’から３’の方向に、前記動物組織の中で機能
する調節配列及びその調節配列の下流側に位置し転写制
御下にある遺伝子を含むポリ核酸配列を運搬する微小投
射物を提供する段階と、（ｂ）前記微小投射物が前記動物組織の細胞を貫通して
その中に前記ポリ核酸配列を沈着させるのに充分な速度
で前記細胞に接触するように、前記微小投射物を前記あ
らかじめ選択された組織に向けて加速する段階を含んで
なる方法。
【請求項８】前記あらかじめ選択された組織が皮膚組
織であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記皮膚の組織が、基底細胞層組織（ba
sal cell layer tissue）、真皮組織（dermis tissu
e）、及び下皮組織（hypodermis tissue）からなるグル
ープから選択された組織であることを特徴とする請求項
８に記載の方法。
【請求項１０】前記あらかじめ選択された組織が筋肉
組織であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】前記あらかじめ選択された組織がイン
ビトロでトランスフォーメーションされることを特徴と
する請求項７に記載の方法。
【請求項１２】前記微小投射物は、１マイクロメート
ルから３マイクロメートルの直径のものであることを特
徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１３】脊椎動物検体内のあらかじめ選択され
た脊椎動物組織にインシトゥで遺伝子をトランスファー
する方法であって、（ａ）５’から３’の方向に、前記動物組織の中で機能
する調節配列及びその調節配列の下流側に位置し転写制
御下にある遺伝子を含むポリ核酸配列を運搬する微小投
射物を提供する段階と、（ｂ）前記微小投射物があらかじめ選択された組織に接
触するように前記検体を配置して、前記微小投射物が前
記動物組織の細胞を貫通してその中に前記ポリ核酸配列
を沈着させるのに充分な速度で前記組織の細胞と接触す
るように、前記微小投射物を前記脊椎動物検体に向けて
加速する段階を含んでなる方法。
【請求項１４】前記あらかじめ選択された組織が皮膚
組織であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】前記皮膚組織が、基底細胞層組織（ba
sal cell layer tissue）、真皮組織（dermis tissu
e）、及び下皮組織（hypodermis tissue）からなるグル
ープから選択された組織であることを特徴とする請求項
１４に記載の方法。
【請求項１６】前記あらかじめ選択された組織が筋肉
組織であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】前記微小投射物は、１マイクロメート
ルから３マイクロメートルの直径のものであることを特
徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】脊椎動物の検体にタンパク質またはペ
プチドを投与する方法であって、（ａ）標的の脊椎動物組織を選択する段階と、（ｂ）５’から３’の方向に、前記選択された標的組織
の中で機能する調節配列及びその調節配列の下流側に位
置し転写制御下にあるタンパク質またはペプチドをコー
ドする遺伝子を含むポリ核酸配列を運搬する微小投射物
を提供する段階と、（ｃ）前記微小投射物が、前記組織の細胞を貫通してそ
の中に前記ポリ核酸配列を沈着させてその組織細胞にト
ランスフォーメーションを起こすのに充分な速度で前記
組織の細胞と接触するように、前記微小投射物を前記あ
らかじめ選択された標的組織に向けて加速する段階と、（ｄ）前記遺伝子が発現すると、前記遺伝子によってコ
ードされているタンパク質またはペプチドに対する生理
的な応答を前記検体内に産生するのに充分な数で前記ト
ランスフォーメーションされた組織細胞が前記検体内に
存在しているように、前記トランスフォーメーションさ
れた組織を前記動物検体内に維持する段階を含んでなる
方法。
【請求項１９】前記トランスフォーメーションされた
組織細胞は、内部に前記遺伝子が発現すると、前記遺伝
子によってコードされたタンパク質またはペプチドに対
する免疫応答を前記動物検体内に産生することを特徴と
する請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】前記トランスフォーメーションされた
組織細胞は、内部に前記遺伝子が発現すると、前記動物
検体内において、前記遺伝子によってコードされたタン
パク質またはペプチドの全身濃度を増大することを特徴
とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】前記遺伝子は成長ホルモンの産生をコ
ードしていることを特徴とする請求項２０に記載の方
法。
【請求項２２】前記選択された標的組織が、真皮組織
及び下皮組織からなるグループから選択されたことを特
徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】前記組織はインビトロでトランスフォ
ーメーションされ、そのトランスフォーメーションされ
た組織細胞はその後前記動物検体にトランスファーされ
ることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】前記組織細胞は前記動物検体において
インシトゥでトランスフォーメーションされることを特
徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】前記微小投射物は、１マイクロメート
ルから３マイクロメートルの直径のものであることを特
徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】脊椎動物の検体に、インシトゥでの微
小投射物衝撃によってタンパク質またはペプチドを投与
する方法であって、（ａ）検体内に存在する標的の脊椎動物組織、この組織
は真皮組織及び下皮組織からなるグループから選択され
るものである、を選択する段階と、（ｂ）５’から３’の方向に、前記選択された標的組織
の中で機能する調節配列及びその調節配列の下流側に位
置し転写制御下にあるタンパク質またはペプチドをコー
ドする遺伝子を含むポリ核酸配列を運搬する微小投射物
を提供する段階と、（ｃ）前記微小投射物が前記選択された標的組織に接触
するように前記検体を配置して、前記微小投射物が前記
標的組織の細胞を貫通してその中に前記ポリ核酸配列を
沈着させて、その組織細胞にトランスフォーメーション
を起こすのに充分な速度で前記標的組織の細胞と接触す
るように、前記微小投射物を前記検体に向けて加速する
段階と、（ｄ）前記遺伝子が発現すると、前記遺伝子によってコ
ードされているタンパク質またはペプチドに対する生理
的な応答を前記検体内に産生するのに充分な数で前記ト
ランスフォーメーションされた組織細胞が前記検体内に
存在しているように、前記トランスフォーメーションさ
れた組織を前記検体内に維持する段階を含んでなる方
法。
【請求項２７】前記トランスフォーメーションされた
組織細胞は、内部に前記遺伝子が発現すると、前記遺伝
子によってコードされたタンパク質またはペプチドに対
する免疫応答を前記動物検体内に起こすことを特徴とす
る請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】前記トランスフォーメーションされた
組織細胞は、内部に前記遺伝子が発現すると、前記動物
検体内において、前記遺伝子によってコードされたタン
パク質またはペプチドの全身濃度を増大することを特徴
とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】前記遺伝子は成長ホルモンの産生をコ
ードしていることを特徴とする請求項２８に記載の方
法。
【請求項３０】前記微小投射物を前記動物検体の表皮
を通って推進されることを特徴とする請求項２６に記載
の方法。
【請求項３１】更に外科的に組織細胞を露出させる段
階を含み、前記微小投射物を表皮を通過することなく前
記組織細胞の中に推進されることを特徴とする請求項２
６に記載の方法。
【請求項３２】前記微小投射物は、１マイクロメート
ルから３マイクロメートルの直径のものであることを特
徴とする請求項２６に記載の方法。