CN1665927A

CN1665927A - 在肿瘤细胞中选择性增殖的肿瘤溶解病毒

Info

Publication number: CN1665927A
Application number: CN038160641A
Authority: CN
Inventors: 藤原俊义; 田中纪章; 京哲; 白木屋佳子; 川岛健
Original assignee: Kansai Technology Licensing Organization Co Ltd
Current assignee: Oncolys Biopharma Inc
Priority date: 2002-07-08
Filing date: 2003-07-07
Publication date: 2005-09-07
Anticipated expiration: 2023-07-07
Also published as: AU2003281310A1; PT1553178E; JP3867968B2; NZ537631A; JP2004033186A; EP1553178B1; CA2491907C; KR20050075867A; HK1082958A1; EP1553178A4; KR100947194B1; US20060239967A1; PL374644A1; EP1553178A1; CA2491907A1; ZA200500047B; CN100430476C; KR20090043589A; WO2004005511A1; ES2455127T3

Abstract

通过使用具有某种基因序列的病毒以及使用该病毒的抗癌剂，并使所述病毒在肿瘤细胞中增殖，可显示有效的抗癌作用；其中，所述基因序列含有端粒末端转移酶的启动子，与含有E1基因、优选E1A基因、IRES序列和E1B基因的序列。

Description

在肿瘤细胞中选择性增殖的肿瘤溶解病毒

技术领域

本发明涉及通过在肿瘤细胞中增殖来显示抗肿瘤作用的病毒、该病毒含有的多核苷酸、含该病毒的抗癌剂和使用该病毒治疗癌症的方法。

背景技术

现在，进行基因治疗是癌症的治疗方法之一。但是，在基因治疗中，由于使用非增殖性的病毒载体，在患病组织等部位导入基因，考虑人体的安全，只能在靶细胞周围使用。另外，在现在的基因治疗中，由于基因的导入效率低，不能得到令人满意的治疗效果。

在癌化细胞或永生化细胞株中，大多数情况下端粒末端转移酶的活性增大，另一方面，已知除生殖类细胞、血球类细胞、上皮类干细胞等以外的正常体细胞，几乎不能检出端粒末端转移酶的活性。

因此，本发明的主要目的是通过利用肿瘤细胞中活化的端粒末端转移酶在肿瘤细胞中增殖病毒，以有效地杀灭肿瘤细胞。

附图说明

图1示出在肿瘤细胞中选择性增殖的肿瘤溶解病毒的构造模式图。在非增殖性病毒载体中缺失E1基因的区域插入由hTERT启动子、E1A基因、IRES序列和E1B基因构成的复制盒。

图2示出在人癌细胞和正常细胞中的端粒末端转移酶活性的比较。

图3示出在人癌细胞和正常细胞在TRAD感染后表达的的E1A和E1B的mRNA和蛋白质。

图4显示了人癌细胞和正常细胞在TRAD感染后在细胞内的增殖。

图5示出通过考马斯亮蓝染色在人癌细胞和正常细胞中由TRAD引起的细胞毒活性后的照片。

图6示出在人癌细胞和正常细胞中由TRAD引起的细胞毒活性的显微镜照片。

图7示出在人癌细胞和正常细胞由TRAD引起的细胞阻碍活性根据XTT测定法的图。

图8示出使用裸鼠和人肺癌细胞H358的非增殖性p53基因表达腺病毒载体的肿瘤内局部给药的抗肿瘤效果的图表。

图9示出使用裸鼠和人大肠癌细胞SW620的TRAD的肿瘤内局部给药的抗肿瘤效果的图表。

发明内容

本发明人首先发现，通过使具有端粒末端转移酶的启动子和增殖能力的病毒感染癌细胞，使病毒在癌细胞中增殖，能够杀灭癌细胞，从而完成了本发明。

即，本发明涉及以下的1～10项。

1.一种多核苷酸，含人端粒末端转移酶的启动子和至少一种E1基因。

2.如上述第1项记载的多核苷酸，其中的E1基因是来自腺病毒的E1基因。

3.如上述第1或第2项记载的多核苷酸，其中的人端粒末端转移酶的启动子是hTERT。

4.如上述第1～3中任一项记载的多核苷酸，其中的E1基因按以下顺序按序含有以下基因：E1A基因、IRES序列和E1B基因。

5.一种病毒，其含有如上述第1～4中的任一项记载的多核苷酸。

6.如上述第5项记载的病毒，其病毒是腺病毒。

7.一种抗癌剂，含上述第5或第6项记载的病毒作为有效成分、及药用可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

8.一种癌症的治疗方法，其使用上述第5或第6项记载的病毒或前述第7项记载的抗癌剂进行治疗。

9.如上述第8项记载的治疗方法，其中的癌症至少包含下列部位中的一种癌症：胃、大肠、肺、肝、前列腺、胰腺、食道、膀胱、胆囊·胆管、乳房、子宫、甲状腺和卵巢。

10.如上述第9项记载的治疗方法，其中的癌症至少包含骨肉瘤和脑瘤中的一种。

发明详述

本发明的特征在于，基于许多种类的癌细胞具有端粒末端转移酶活性这一发现，使用具有端粒末端转移酶的启动子和增殖能力的病毒感染癌细胞，通过在癌细胞中增殖该病毒而杀灭癌细胞。

本发明中所用的病毒没有特别限制，但是，从安全性等考虑，优选使用腺病毒。另外，在腺病毒中，从使用简便等方面考虑，特别优选使用5型腺病毒。

所谓含病毒的多核苷酸的E1基因，是指病毒具有的DNA复制的早期基因(早期：E)和晚期基因(晚期：L)中的早期基因之一，E1基因编码有关控制病毒·染色体转录的蛋白质。

本发明中所用的E1基因，可使用来自任何病毒的E1基因，但是，优选使用来自腺病毒的E1基因。

另外，E1基因，已知由E1A、E1B等构成。通过E1A基因编码的E1A蛋白质，可以活化在病毒产生感染能力时使必需的基因群(E1B、E2、E4等)的转录。

由E1B基因编码的E1B蛋白质，可帮助晚期基因(L基因)的mRNA在感染的宿主细胞的细胞质中累积，阻碍宿主细胞蛋白质的合成，促进病毒的复制。腺病毒的E1A基因和E1B基因的序列，分别用以下的序列1和2表示。

在本发明中，E1基因也可以直接使用公知的基因，但优选使用以E1A基因、IRES序列和E1B基因的顺序具有的基因，即，将IRES序列插入E1A基因和E1B基因之间的基因。因为这可以使病毒感染宿主细胞时增殖能力提高。

只要可以达到本发明的效果，也可以将至少一个核苷酸插入选自下列位置中的至少一处：IRES序列和E1A基因之间、IRES序列和E1B基因之间、E1A基因的上游和E1B基因的下游。另外，只要可以达到本发明的效果，在E1A基因、IRES序列、E1B基因或E1基因中，至少一个，优选多个核苷酸被置换、缺失、插入或添加也是可以的。

IRES序列，是在小核糖核酸病毒科的病毒中特异性的蛋白质合成开始信号，因具有与18S核糖体RNA的3’末端互补的序列而被认为具有作为核糖体结合部位的效果。已知来自小核糖核酸病毒科的病毒的mRNA通过该序列翻译。

IRES序列的翻译效率高，在mRNA的中间也可进行非依赖帽结构的蛋白质合成。因此，在该病毒中，通过人端粒末端转移酶的启动子对E1A基因、和IRES序列下游的E1B基因两者各自进行独立的翻译。IRES序列如下述的序列3所示。

再者，在本发明中，E1基因优选在其上游具有人端粒末端转移酶的启动子。因为在具有端粒末端转移酶活性的癌细胞内，可促进本发明病毒的增殖。人端粒末端转移酶的启动子，只要来自人启动子，其种类等就没有限定，但其中优选hTERT。

hTERT是编码人端粒末端转移酶逆转录酶的基因，确认在其5’末端的上游1.4kbp的区域有许多转录因子结合序列。可认为该区域是hTERT启动子，但是，其中翻译开始部位的上游181bp的序列是下游基因表达的重要的核心区域。

在本发明中，人端粒末端转移酶的启动子，如果是包含该核心区域的启动子，那么可以没有限制地使用，但是，优选使用完全包含该核心区域的上游的约378bp的序列作为hTERT启动子。对于该约378bp的序列，确认其基因表达效率与单独181bp的核心区域的情况等同。hTERT的序列如下述序列4所示。

具有本发明的端粒末端转移酶的启动子和E1基因(含E1A基因、IRES基因和E1B基因的基因)的基因，可通过常规基因工程方法得到。

作为E1基因，可以使用含有其的公知病毒的E1基因，其中，优选腺病毒的E1基因。

例如，可在表达E1基因的细胞中，优选在表达E1基因的293细胞等中，使用E1A-S、E1A-AS、E1B-S，E1B-AS等引物，通过进行RT-PCR和/或DNA-PCR，可以扩增E1A基因和E1B基因。根据需要，使用TA克隆之类的公知方法确认序列后，使用EcoRI之类的限制酶，可切割E1A和E1B的DNA片断。

通过常规基因工程学手段，可将E1B和E1B插入pIRES之类公知的载体中，在该载体中制成E1A-IRES-E1B序列。然后，可将用M1uI、Bg1II等限制酶切割的hTERT启动子序列，插入到位于E1A上游的XhoI等部位。

根据需要，可使用用MfeI、NheI等限制酶切割去除pShuttle等公知的载体中含有的巨细胞病毒(CMV)启动子，在该部位可插入通过用限制酶NheI和NotI切割phTERT-E1A-IERS-E1B得到的序列(得到的序列称为“pSh-hAIB”)。

使用I-CeuI、Pl-SceI等限制酶从pSh-hAIB切割出必要部分的(含hTERT启动子、E1A基因、IRES序列和E1B基因)序列，使用Adeno-X Expression System(CLONTECH)等市售的试剂盒，可插入到Adeno-X病毒DNA等病毒的DNA中(得到的序列称为“AdenoX-hAIB”。)。

含上述hTERT启动子、E1A基因、IRES序列和E1B基因的序列，只要能达到本发明的效果，可插入到病毒基因的任何部分，但是，例如，在基因治疗用的腺病毒中，由于E1基因缺失，因此优选插入到其缺失部分。

通过PacI等公知的限制酶使AdenoX-hAIB线性化后，转染293细胞等培养细胞，可制作具有感染性的重组腺病毒(得到的病毒，称为“本发明的病毒”或“TRAD”)。转染方法没有限制，从效率考虑，优选使用磷酸钙法、电穿孔法等。

如上所述得到的本发明的病毒，可使用常规增殖病毒方法，例如感染293细胞等宿主细胞等进行增殖。

本发明的病毒，可作为抗癌剂使用。例如，不仅可用于癌症的治疗，而且也可用于手术后癌症复发的预防，转移的防止和/或预防等。

本发明的抗癌剂适用的癌症的种类没有限制，可用于所有种类的癌症。例如，对胃、大肠、肺、肝、前列腺、胰腺、食道、膀胱、胆囊·胆管、乳房、子宫、甲状腺、卵巢等的癌症，以及脑瘤、骨肉瘤等有效，其中对实体瘤尤为有效。

本发明的抗癌剂，可以直接使用于患病部位，或以公知的方法，例如，通过静脉、肌肉、腹腔内或皮下注射；通过从鼻腔、口腔或肺吸入；经口服、栓剂、外用剂等导入人体(靶细胞或脏器)。

另外，本发明的病毒，例如，通过冷冻干燥等方法处理便于操作后，以其原状或与赋形剂、增重剂、粘合剂、润滑剂等公知的药用可接受的载体、公知的添加剂(包括缓冲剂、等渗化剂、螯合剂、着色剂、保存剂、香料、调味剂、甜味剂等)等相混合，可制备医药组合物。

本发明的抗癌剂，根据片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、水剂、糖浆等口服剂；注射剂、外用剂、栓剂、滴眼剂等非口服剂等形态，可经口服或不经口服给药。优选例如经肌肉、腹腔等局部注射、经静脉注射等。

给药量，根据有效成分的种类、给药路径、给药对象、患者的年龄、体重、性别、症状等其它条件适当选择，但是，一日给药量，通常作为有效成分的本发明病毒量为10⁶-10¹¹ PFU左右，优选为10⁹-10¹¹ PFU左右，可以每日给药一次，也可以每日给药多次。

另外，在使用本发明的病毒时，通过使用公知的免疫抑制剂等抑制生物体的免疫功能，可以使该病毒易于感染。

而且，本发明的病毒，可与在现有基因治疗中使用的、例如包含p53基因之类的非增殖性病毒、公知的抗癌剂和放射线组成的组中选出的至少一种的抗癌剂组合使用。

感染生物体(癌细胞和癌组织)的本发明的病毒，可在该细胞内增殖，并杀灭该细胞。通过杀灭这样的癌细胞，可治疗癌症、抑制癌细胞增殖、防止癌细胞转移等。

由于下述理由，本发明的抗癌剂产生副作用的可能性极小，被认为是非常安全的制剂。

(1)在正常体细胞中，几乎没有端粒末端转移酶活性，而且，由于腺病毒自身难以感染造血细胞等浮游细胞，因此使用本发明的腺病毒时，对肿瘤种类的选择性很高。

(2)由于本发明的病毒具有增殖能力，所以可以比常规基因治疗用非增殖性病毒更低的浓度进行使用。

(3)即使在本发明的病毒过量给药的情况下，也可通过生物体内常规免疫作用起到抵抗病毒的作用。

实施例

以下，列举实施例以更详细地说明本发明，但是，本发明并不限于此。

实施例1

<TRAD的制备>

使用特异性的引物(E1A-S：序列5，E1A-AS：序列6)对由293细胞提取的RNA进行RT-PCR，扩增899bp的E1A基因。使用引物(E1B-S：序列7，E1B-AS：序列8)对由293细胞提取的DNA进行DNA-PCR，扩增1823bp的E1B基因。

对各自的PCR产物进行TA克隆(TA克隆试剂盒双启动子；Invitrogen)，确认序列后，通过限制酶EcoRI，分别切割出899bp(E1A)、1823bp(E1B)的DNA片断。

在pIRES载体(CLONTECH)的M1uI切断部位、及Sa1I部位，各自正向插入E1A和E1B(E1A-IRES-E1B)。

将用限制酶M1uI和BglII切割的455bp的hTERT启动子序列，正向插入在E1A-IRES-E1B的E1A上游的XhoI部位(phTERT-E1A-IRES-E1B)。

通过限制酶MfeI和NheI处理，除去pShuttle载体含有的巨细胞病毒(CMV)的启动子，在其部位插入用限制酶NheI和NotI切割phTERT-E1A-IRES-E1B得到的3828bp的序列(pSh-hAIB)。

通过限制酶I-CeuI和P1-SceI从pSh-hAIB切割出4381bp的序列，并插入到Adeno-X Expression System(CLONTECH)的腺-X病毒DNA中(腺X-hAIB)。用限制酶PacI对腺X-hAIB进行线性化处理后，使用磷酸钙法转染293细胞，制作具有感染性的重组腺病毒(TRAD)。该TRAD的模式图如图1所示。

实施例2

<人癌细胞和正常细胞的端粒末端转移酶活性的比较>

从人肺癌细胞(A549、H226Br、H1299)、人大肠癌细胞(SW620、DLD-1、LoVo)、人胎儿肾脏细胞293、SV40基因导入的永生化人血管内皮细胞HUVEC、人正常纤维母细胞(W138、NHLF)的10种细胞中，使用RNAzol(Cinna/Biotecx)提取RNA，使用LightCycler和LightCycler DNA TeloTAGGG 试剂盒(Roche MolecularBiochemicals)，进行实时定量的逆转录(RT)-PCR，比较各个细胞的hTERT基因的表达水平。结果如图2所示。

将表达水平最高的A549细胞作为1.0进行比较，确认A549、H226Br、H1299、SW620、DLD-1、LoVo等癌细胞和293细胞中为0.18～1.00的hTERT基因表达，但是，在永生化的HuVEC细胞和WI38、NHLF等正常细胞中没有检出其表达。

实施例3

<在人癌细胞和正常细胞中，TRAD感染后的E1A和E1B的mRNA和蛋白质的表达>

在体外培养人大肠癌细胞SW620和人正常纤维母细胞WI38，用0.1和1 MOI(感染复数)的浓度感染TRAD后，在36小时后回收RNA。使用293细胞作为阳性对照。

使用GeneAmp RNA PCR核心试剂盒进行逆转录(RT)，使用针对E1A和E1B基因的引物，通过GeneAmp PCR system 9700thermal cycler(PE Applied Biosystems)进行30次循环的扩增。PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭染色可视化(图3A上的2处)。在凝胶影像分析仪上测定带强度，将GAPDH作为内标物进行定量并制图(图3A下面)。

在体外培养人大肠癌细胞SW620和人正常纤维母细胞WI38，用0.1和1 MOI的浓度感染TRAD的48小时后回收吸附的细胞，在溶解液中反应30分钟之后进行离心，测定上清液的蛋白质浓度。在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，转移至膜上后，用抗腺病毒5型E1A抗体(PharMingen International)进行蛋白质印迹分析。结果示于图3B。

在癌细胞SW620中，发现通过TRAD感染后E1A基因(502bp)、E1B基因(543bp)的表达明显增强，但是，在正常细胞WI38中，仅发现其微弱的表达(图3A)。在阳性对照的293细胞中，确认其表达水平适中。

通过蛋白质印迹分析，E1A蛋白质的表达随SW620中的0.1MOI、1 MOI和TRAD的浓度而增强(图3B)。另一方面，在WI38中，即使采用1 MOI的TRAD，也几乎检出不到E1A蛋白质的表达。

实施例4

<人癌细胞和正常细胞在TRAD感染后的细胞内增殖的研究>

在人癌细胞(SW620和H1299)和人正常细胞(WI38和NHLF)中用1 MOI TRAD于37℃感染2小时，弃去含TRAD的培养液，用新鲜培养液洗涤一次，再加入新鲜培养液。此后立即在第0天用刮刀回收细胞，反复冻融后，悬浮在1毫升的培养液中。而且，用同样的方法回收第1天、第2天、第3天、第5天、第7天的病毒，进行病毒滴度测定。结果在图4示出。

在为正常细胞的WI38或NHLF中，测出10²PFU的TRAD在第3天增殖至10⁵PFU左右，其增殖了100-1000倍，但是，在癌细胞SW620和H1299中，确认为10⁷-10⁸PFU，其增殖了10⁵-10⁶倍，确认为癌细胞特异性病毒增殖。

实施例5

<TRAD对于人癌细胞和正常细胞的细胞毒活性>

将5种人癌细胞(SW620、H1299、A549、DLD-1、H226Br)以6～8×10⁴个/孔和2种人正常细胞(WI38、NHLF)以2～4×10⁴个/孔分别接种在24孔板中，在24小时后，用0.01、0.1、1、2、5 MOI的TRAD感染。从感染开始96小时后，在显微镜下观察SW620、DLD-1、NHLF细胞的形态学变化。并且弃去全部细胞的培养液，活细胞用考马斯亮蓝染色，用扫描仪读取放大的影像。

将SW620、H1299以10⁴个/孔、NHLF以5×10³个/孔接种在96孔板中，用0(非感染细胞)、0.01、0.1、1 MOI的TRAD进行感染，用XTT测定法，测定第1天、第2天、第3天、第5天、第7天的活细胞数。按每4孔依次测定，将非感染细胞作为1.0，作平均值+/-SD图。其结果分别示于图5、6和7。

在SW620、H1299、A549、DLD-1、H226Br等癌细胞中，确认细胞数随TRAD的浓度依赖性地减少，蓝色染色区域减少。另一方面，在WI38、NHLF等正常细胞中，没有发现兰色染色活细胞数显著减少(图5)。

在显微镜观察中，SW620、DLD-1细胞从板的底面剥离并变圆，细胞密度也减少，但是，在NHLF中，几乎没有发生形态学的变化，细胞数也没有减少(图6)。

在SW620和H1299中，通过1 MOI的TRAD感染后的第3天，确认几乎100％的细胞死亡，而0.1 MOI组也有80％以上的细胞数减少。相反，在NHLF中观察到，即使第3天几乎没有细胞数的减少，第7天用1 MOI的TRAD的组表达细胞数降低了约60％，但是用0.01MOI的组则完全没有病毒的影响(图7)。

实施例6

<使用动物模型的TRAD抗肿瘤活性的研究>

在5-6周龄裸鼠的背部皮下移植5×10⁶个人肺癌细胞H358，在直径约为5-6毫米时，在连续2天在肿瘤内局部处注入表达p53基因的非增殖性腺病毒载体(Ad-p53)1×10⁸PFU、3×10⁸PFU、1×10⁹PFU。此后，定期测定正交的肿瘤直径，按(长径)×(短径)²/2算出推定肿瘤重量。使用没有插入基因的非增殖性腺病毒载体-dl312作为空白对照。

在5-6周龄裸鼠的背部皮下移植5×10⁶个人大肠癌细胞SW620，在直径为约5-6毫米时，连续3天在肿瘤内局部处注入2×10⁷PFU的dl312和4×10³PFU的TRAD。同样方法测定肿瘤直径，算出推定肿瘤重量。结果如图8和图9所示。(图中，Mock表示对照，以PBS(磷酸缓冲液)进行给药)。

通过以3×10⁸PFU、1×10⁹PFU的Ad-p53进行给药，有效地抑制了H358肿瘤的增殖(p＜0.05)。但是，在以1×10⁸PFU的Ad-p53的给药，被认为未能有效地抑制肿瘤的增殖(图8)。另外，在对照的dl312给药中，肿瘤增殖完全没有受到影响。

通过以相比具有抗肿瘤效果的Ad-p53低很多的、4×10³PFU浓度的TRAD对肿瘤内部进行给药，能够显著性差异地抑制SW620肿瘤的增殖(p＜0.05)。在对照的dl312给药中，肿瘤增殖完全没有受到影响。

综上所述，可以表明本发明的病毒可在癌细胞中有效地增殖，并杀灭癌细胞。另外，由于本发明的癌细胞具有增殖能力，所以即使低浓度下也能发挥强大的抗癌作用，通过降低给药病毒的浓度，可抑制副作用。

序列表

<110>关西TLO株式会社，藤原俊义，田中纪章，京哲

<120>利用具有肿瘤特异复制能力的病毒进行的肿瘤细胞溶解

<130>P03-75

<150>JP2002-198941

<151>2002-07-08

<160>8

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>899

<212>DNA

<213>293细胞

<400>1

acaccgggac tgaaaatgag acatattatc tgccacggag gtgttattac cgaagaaatg 60

gccgccagtc ttttggacca gctgatcgaa gaggtactgg ctgataatct tccacctcct 120

agccattttg aaccacctac ccttcacgaa ctgtatgatt tagacgtgac ggcccccgaa 180

gatcccaacg aggaggcggt ttcgcagatt tttcccgact ctgtaatgtt ggcggtgcag 240

gaagggattg acttactcac ttttccgccg gcgcccggtt ctccggagcc gcctcacctt 300

tcccggcagc ccgagcagcc ggagcagaga gccttgggtc cggtttctat gccaaacctt 360

gtaccggagg tgatcgatct tacctgccac gaggctggct ttccacccag tgacgacgag 420

gatgaagagg gtgaggagtt tgtgttagat tatgtggagc accccgggca cggttgcagg 480

tcttgtcatt atcaccggag gaatacgggg gacccagata ttatgtgttc gctttgctat 540

atgaggacct gtggcatgtt tgtctacagt cctgtgtctg aacctgagcc tgagcccgag 600

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cgcccgacat cacctgtgtc tagagaatgc aatagtagta cggatagctg tgactccggt 720

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<210>2

<211>1823

<212>DNA

<213>293细胞

<400>2

ctgacctcat ggaggcttgg gagtgtttgg aagatttttc tgctgtgcgt aacttgctgg 60

aacagagctc taacagtacc tcttggtttt ggaggtttct gtggggctca tcccaggcaa 120

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ggcggcggca ggagcagagc ccatggaacc cgagagccgg cctggaccct cgggaatgaa 540

tgttgtacag gtggctgaac tgtatccaga actgagacgc attttgacaa ttacagagga 600

tgggcagggg ctaaaggggg taaagaggga gcggggggct tgtgaggcta cagaggaggc 660

taggaatcta gcttttagct taatgaccag acaccgtcct gagtgtatta cttttcaaca 720

gatcaaggat aattgcgcta atgagcttga tctgctggcg cagaagtatt ccatagagca 780

gctgaccact tactggctgc agccagggga tgattttgag gaggctatta gggtatatgc 840

aaaggtggca cttaggccag attgcaagta caagatcagc aaacttgtaa atatcaggaa 900

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ctttagatgt agcatgataa atatgtggcc gggggtgctt ggcatggacg gggtggttat 1020

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caaaagcagg gcttcaatta agaaatgcct ctttgaaagg tgtaccttgg gtatcctgtc 1260

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<210>3

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<212>DNA

<213>293细胞

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<213>293细胞

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<213>293细胞

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<212>DNA

<213>293细胞

<400>8

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Claims

1.一种多核苷酸，其含有人端粒末端转移酶的启动子和至少一种E1基因。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其E1基因是来自腺病毒的E1基因。

3.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其人端粒末端转移酶的启动子为hTERT。

4.如权利要求1～3任一项所述的多核苷酸，其E1基因依次含有E1A基因、IRES序列和E1B基因。

5.一种病毒，其含有权利要求1～4任一项所述的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的病毒，所述病毒为腺病毒。

7.一种抗癌剂，其含有权利要求5或6所述的病毒作为有效成分、药用可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

8.一种治疗癌症的方法，其使用权利要求5或6所述的病毒或者权利要求7所述的抗癌剂进行治疗。

9.如权利要求8所述的治疗方法，其中，癌症选自胃、大肠、肺、肝、前列腺、胰腺、食道、膀胱、胆囊·胆管、乳房、子宫、甲状腺和卵巢中的至少一种。

10.如权利要求9所述的治疗方法，其中，癌症是选自骨肉瘤和脑瘤中的至少一种。