KR100947194B1

KR100947194B1 - 종양 세포에서 선택적으로 증식하는 종양 융해 바이러스

Info

Publication number: KR100947194B1
Application number: KR1020097005916A
Authority: KR
Inventors: 도시요시 후지와라; 노리아키 다나카; 사토루 교; 요시코 시라키야; 다케시 가와시마
Original assignee: 간사이 티.엘.오 가부시키가이샤; 온콜리스 바이오파마 가부시키가이샤
Priority date: 2002-07-08
Filing date: 2003-07-07
Publication date: 2010-03-11
Also published as: CA2491907A1; DK1553178T3; PL374644A1; JP2004033186A; AU2003281310A1; KR20050075867A; WO2004005511A1; JP3867968B2; ES2455127T3; US20060239967A1; ZA200500047B; HK1082958A1; KR20090043589A; CN1665927A; EP1553178B1; PT1553178E; CN100430476C; AU2003281310B2; CA2491907C; EP1553178A1

Abstract

텔로머라아제의 프로모터와, E1 유전자, 바람직하게는 E1A 유전자, IRES 배열 및 E1B 유전자를 포함하는 배열을 포함하는 유전자 배열을 갖는 바이러스 및 그 바이러스를 사용한 항암제를 사용함으로써 상기 바이러스가 종양 세포에서 증식하게 되어 효율적인 항암 작용을 나타낸다.

텔로머라아제, E1 유전자, 종양 융해 바이러스, 아데노바이러스

Description

종양 세포에서 선택적으로 증식하는 종양 융해 바이러스 {TUMOR-LYSING VIRUS GROWING SELECTIVELY IN TUMOR CELLS}

본 발명은, 종양 세포에서 증식함으로써 항종양 작용을 나타내는 바이러스, 그 바이러스에 포함되는 폴리뉴클레오티드, 그 바이러스를 포함하는 항암제 및 그 바이러스를 사용한 암의 치료방법에 관한 것이다.

현재, 암의 치료방법의 하나로서 유전자 치료가 행해지고 있다. 그러나, 유전자 치료에서는, 비증식성 바이러스 벡터를 사용하여 환부 조직 등에 유전자가 도입되므로, 인체의 안전을 고려하여 표적 세포의 주위에만 적용할 수 있다. 또, 현재의 유전자 치료에서는, 유전자의 도입 효율이 낮기 때문에 만족스러운 치료효과를 얻을 수 없다.

암화된 세포 또는 불사화된 세포주에서는, 텔로머라아제의 활성이 증대하고 있는 경우가 많은 한편, 생식계의 세포, 혈구계 세포, 상피계 줄기세포 등 이외의 정상적인 체세포에서는, 텔로머라아제의 활성은 거의 검출되지 않은 것이 알려져 있다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은, 종양 세포에서 활성화하고 있는 텔로머라아 제를 이용함으로써 종양 세포에서 바이러스를 증식시켜, 종양 세포를 효율적으로 사멸시키는 것이다.

본 발명자는, 텔로머라아제의 프로모터와 증식능을 갖는 바이러스를 암세포에 감염시키는 것에 의해 암세포에서 바이러스가 증식되고 암세포를 사멸시킬 수 있다는 것을 처음으로 발견하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 항 1∼10 에 관한 것이다.

1. 인간 텔로머라아제의 프로모터 및 적어도 1 종의 E1 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드.

2. E1 유전자가 아데노바이러스 유래의 E1 유전자인 상기 항 1 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

3. 인간 텔로머라아제의 프로모터가 hTERT 인 상기 항 1 또는 2 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

4. E1 유전자가, E1A 유전자, IRES 배열 및 E1B 유전자를 이 순서로 포함하는 상기 항 1∼3 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드.

5. 상기 항 1∼4 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스.

6. 바이러스가 아데노바이러스인 상기 항 5 에 기재된 바이러스.

7. 상기 항 5 또는 6 에 기재된 바이러스를 유효성분으로서, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 함유하는 항암제.

8. 상기 항 5 또는 6 에 기재된 바이러스 또는 청구항 7 에 기재된 항암제를 사용한 암의 치료방법.

9. 암이, 위, 대장, 폐, 간, 전립선, 췌장, 식도, 방광, 담낭ㆍ담관, 유방, 자궁, 갑상선 및 난소로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 암인 상기 항 8 에 기재된 치료방법.

10. 암이, 골육종 및 뇌종양으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종인 상기 항 9 에 기재된 치료방법.

본 발명은, 많은 종류의 암세포가 텔로머라아제 활성을 갖는다는 지견에 의거하여, 텔로머라아제의 프로모터 및 증식능을 갖는 바이러스를 암세포에 감염시켜, 암세포에서 해당 바이러스를 증식시킴으로써, 암세포를 사멸시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용되는 바이러스는 특별히 한정되지 않지만, 안전성 등의 면에서 아데노바이러스가 바람직하다. 또한, 아데노바이러스 중에서도, 사용이 간편하다는 등의 면에서 타입 5 의 아데노바이러스가 특히 바람직하다.

바이러스의 폴리뉴클레오티드에 함유되는 E1 유전자란, 바이러스가 갖는 DNA 복제에 관한 초기 유전자 (early : E) 와 후기 유전자 (late : L) 중 초기 유전자의 하나를 말하며, E1 유전자는 바이러스ㆍ게놈의 전사 제어에 관계되는 단백질을 코드한다.

본 발명에서 사용하는 E1 유전자는, 어느 바이러스 유래의 것이라도 사용할 수 있지만, 아데노바이러스 유래의 것이 바람직하다.

또, E1 유전자는, E1A, E1B 등으로 구성되는 것이 알려져 있다. E1A 유전자에 의해 코드되는 E1A 단백질은, 감염가능한 바이러스 생성에 필요한 유전자군 (E1B, E2, E4 등) 의 전사를 활성화한다.

E1B 유전자에 의해 코드되는 E1B 단백질은, 후기 유전자 (L 유전자) 의 mRNA가 감염된 숙주세포의 세포질에 축적되는 것을 도와, 숙주세포의 단백질 합성을 저해함으로써 바이러스의 복제를 촉진한다. 아데노바이러스의 E1A 유전자 및 E1B 유전자의 배열은, 각각 이하의 배열 1 및 2 에 나타낸다.

본 발명에서, El 유전자는 공지된 것을 그대로 사용할 수도 있지만, E1A 유전자, IRES 배열 및 E1B 유전자를 이 순서로 갖는 것, 즉, IRES 배열을 EIA 유전자와 E1B 유전자 사이에 삽입한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 바이러스가 숙주세포에 감염되었을 때, 증식능이 높아지기 때문이다.

본 발명의 효과를 달성할 수 있는 것이라면, IRES 배열과 E1A 유전자 사이, IRES 배열과 E1B 유전자 사이, E1A 유전자의 상류 및 E1B 유전자의 하류로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 곳에, 적어도 1 개의 뉴클레오티드가 삽입되어 있어도 된다. 또, 본 발명의 효과를 달성할 수 있는 것이라면, E1A 유전자, IRES 배열, E1B 유전자 또는 E1 유전자에서, 적어도 1 개, 바람직하게는 복수개의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가되어 있어도 된다.

IRES 배열이란, 피코르나바이러스과의 바이러스에 특이적인 단백질 합성 개시 신호이며, 18S 리보솜 RNA 의 3' 말단과 상보적인 배열이 있기 때문에 리보솜 결합부위로서의 역할을 한다고 생각되고 있다. 피코르나바이러스과의 바이러스 유래의 mRNA 는 이 배열을 통해 번역되는 것이 알려져 있다.

IRES 배열로부터의 번역 효율은 높아, mRNA 의 도중에서도 캡구조 비의존적으로 단백질 합성이 이루어진다. 따라서, 이 바이러스에서는, 인간 텔로머라아제의 프로모터에 의해 E1A 유전자와 IRES 배열의 하류에 있는 E1B 유전자 모두가 독립으로 번역된다. IRES 배열을 이하의 배열 3 에 나타낸다.

또한, 본 발명에서 E1 유전자는, 그 상류에 인간 텔로머라아제의 프로모터를 갖는 것이 바람직하다. 텔로머라아제 활성을 갖는 암세포 내에서 본 발명의 바이러스 증식을 촉진시킬 수 있기 때문이다. 인간 텔로머라아제의 프로모터는, 인간 유래의 프로모터라면 종류 등은 한정되지 않지만, 그 중에서 hTERT 가 바람직하다.

hTERT 는 인간 텔로머라아제 역전사 효소를 코드하는 유전자이고, 그 5' 말단의 상류 1.4kbp 의 영역에는 많은 전사인자 결합배열이 확인되었다. 그 영역이 hTERT 프로모터라고 생각되지만, 그 중에서도 번역 개시부위의 상류 181bp 의 배열이 하류의 유전자 발현에 중요한 코어 영역이다.

본 발명에서, 인간 텔로머라아제의 프로모터로서는, 이 코어영역을 포함하는 것이라면 한정되지 않고 사용할 수 있지만, 이 코어영역을 완전히 포함하는 상류 378bp 정도의 배열을 hTERT 프로모터로서 사용하는 것이 바람직하다. 이 378bp 정도의 배열은, 그 유전자 발현 효율이 181bp 의 코어 영역 단독의 경우와 동등하다는 것이 확인되었다. hTERT 의 배열을 이하의 배열 4 나타낸다.

본 발명의 텔로머라아제의 프로모터 및 E1 유전자 (E1A 유전자, IRES 유전자 및 E1B 유전자를 포함하는 유전자) 를 갖는 유전자는, 통상의 유전자 공학적 수법에 의해 얻을 수 있다.

E1 유전자로서는, 그것을 갖는 공지된 바이러스의 것을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 아데노바이러스의 E1 유전자가 바람직하다.

또한, 예를 들어, E1 유전자를 발현하고 있는 세포, 바람직하게는 E1 유전자를 발현시킨 293 세포 등으로부터 E1A-S, E1A-AS, E1B-S, E1B-AS 등의 프라이머를 사용하여 RT-PCR 및/또는 DNA-PCR 을 행함으로써 E1A 유전자 및 E1B 유전자를 증폭할 수 있다. 필요에 따라 TA 클로닝과 같은 공지된 방법을 사용하여 배열을 확인한 후, EcoRI 와 같은 공지된 제한효소에 의해 E1A 및 E1B 의 DNA 단편을 잘라낼 수 있다.

pIRES 와 같은 공지된 벡터에, 통상의 유전자공학적 수법에 의해 E1A 및 E1B 를 삽입하고, 그 벡터 중에 E1A-IRES-E1B 배열을 작성할 수 있다. 이어서, MluI, BglII 등의 제한효소에 의해 잘라낸 hTERT 프로모터 배열을, E1A 의 상류에 있는 XhoI 등의 부위에 삽입할 수 있다.

필요에 따라, pShuttle 등의 공지된 벡터에 포함되는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 MfeI, NheI 등의 제한효소에 의해 제거하고, 그 부위에 phTERT-E1A-IRES-E1B 로부터 제한효소 NheI 및 NotI 에 의해 잘라낸 배열을 삽입할 수 있다 (얻어진 것을 「pSh-hAIB」라 한다).

pSh-hAIB 로부터 I-CeuI, Pl-SceI 등의 제한효소에 의해 필요한 부분의 (hTERT 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열 및 E1B 유전자를 포함한다) 배열을 잘라 내고, Adeno-X Expression System (CLONTECH) 등의 시판하는 키트를 사용하여 Adeno-X Viral DNA 등의 바이러스의 DNA 에 삽입할 수 있다 (얻어진 것을「AdenoX-hAIB」라 한다).

상기의 hTERT 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열 및 E1B 유전자를 포함하는 배열은, 본 발명의 효과를 달성할 수 있는 것이라면 바이러스의 유전자의 어떤 부분에라도 삽입할 수 있지만, 예를 들어 유전자 치료용의 아데노바이러스에서는, E1 유전자를 결손시키고 있기 때문에 그 결손시킨 부분에 삽입하는 것이 바람직하다.

AdenoX-hAIB 를 PacI 등의 공지된 제한효소에 의해 선상화한 후, 293 세포 등의 배양세포에 트랜스펙션하여 감염성이 있는 재조합 아데노바이러스를 제작할 수 있다 (얻어진 바이러스를 「본 발명의 바이러스」 또는 「TRAD」라 하는 경우가 있다). 트랜스펙션하는 방법도 한정되지 않고, 효율이란 점에서 인산칼슘법, 일렉트로포레이션 등을 이용하는 것이 바람직하다.

상기한 바와 같이 하여 얻어진 본 발명의 바이러스는, 통상 바이러스를 증식시키는 방법, 예를 들어 293 세포 등의 숙주세포에 감염시키는 등으로 하여 증식시킬 수 있다.

본 발명의 바이러스는 항암제로 사용할 수 있다. 예를 들어, 암의 치료뿐만 아니라, 수술후의 재발 예방, 전이의 방지 및/또는 예방 등에도 사용할 수 있다.

본 발명의 항암제를 적용하는 암의 종류는 한정되지 않고 모든 종류의 암에 사용할 수 있다. 예를 들어, 위, 대장, 폐, 간, 전립선, 췌장, 식도, 방광, 담 낭ㆍ담관, 유방, 자궁, 갑상선, 난소 등에서의 암이나, 뇌종양, 골육종 등에 유효하고, 그 중에서도 고형 암에 보다 유효하다.

본 발명의 항암제는, 그대로 환부에 적용할 수도 있고, 모든 공지된 방법, 예를 들어, 정맥, 근육, 복강내 또는 피하와 같은 주사, 비강, 구강 또는 폐로부터의 흡입, 경구 투여, 좌제, 외용제 등에 의해 인간 (대상이 되는 세포나 장기) 에 도입할 수도 있다.

또한, 본 발명의 바이러스는, 예를 들어 동결건조 등의 방법에 의해 취급하기 쉽게 한 후, 그대로 또는 부형제, 증량제, 결합제, 활택제 등 공지된 약학적으로 허용되는 담체, 공지된 첨가제 (완충제, 등장화제, 킬레이트제, 착색제, 보존제, 향료, 풍미제, 감미제 등이 포함된다) 등과 혼합하여 의약 조성물로서 조제할 수 있다.

본 발명의 항암제는, 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 환제, 액제, 시럽제 등의 경구 투여제, 주사제, 외용제, 좌제, 점안제 등의 비경구 투여제 등의 형태에 따라 경구 투여 또는 비경구 투여할 수 있다. 바람직하게는, 근육, 복강 등에의 국부 주사, 정맥에의 주사 등이 예시된다.

투여량은, 유효성분의 종류, 투여 경로, 투여 대상, 환자의 연령, 체중, 성별, 증상 그 밖의 조건에 따라 적절히 선택되지만, 1 일 투여량으로서, 통상 유효성분인 본 발명 바이러스의 양을 10⁶∼10¹¹PFU 정도, 바람직하게는 10⁹∼10¹¹PFU 정도로 하는 것이 좋고, 1 일 1 회 투여할 수도 있고, 수회로 나누어 투여할 수도 있 다.

또, 본 발명의 바이러스를 사용하는 때에는, 공지된 면역억제제 등을 사용함으로써, 생체의 면역을 억제하여 그 바이러스가 감염되기 쉽게 할 수도 있다.

또한, 본 발명의 바이러스는, 종래의 유전자 치료에서 사용되고 있는, 예를 들어 p53 유전자를 포함하는 비증식성 바이러스, 공지된 항암제 및 방사선으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1 종의 항암제를 병용할 수도 있다.

생체 (암세포나 암조직) 에 감염된 본 발명의 바이러스는, 그 세포내에서 증식하여 그 세포를 사멸시킬 수 있다. 이와 같이 암세포를 사멸시킴으로써 암을 치료하거나 암세포의 증식을 억제하거나 전이를 막을 수 있다.

본 발명의 항암제는, 이하의 이유로 부작용이 생길 가능성은 매우 낮다고 생각되어 매우 안전한 제제라 할 수 있다.

(1) 정상적인 체세포에서는 텔로머라아제 활성이 거의 없고, 또한 아데노바이러스 자체가 조혈세포 등의 부유세포에는 감염되기 어렵기 때문에, 본 발명에서 아데노바이러스를 사용한 경우에는, 종양의 종류에 대하여 보다 선택성이 높아진다.

(2) 본 발명의 바이러스는 증식능을 가지므로, 통상의 유전자 치료에서 사용되고 있는 비증식성 바이러스보다도 낮은 농도로 사용할 수 있다.

(3) 본 발명의 바이러스가 과잉으로 투여된 경우라 하더라도, 생체내의 통상의 면역작용에 의해 항바이러스 작용이 작용한다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하기 위해 실시예를 들지만, 말할 필요도 없이 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

<TRAD의 제작>

293 세포로부터 추출한 RNA 로부터 특이적 프라이머 (E1A-S : 배열 5, E1A-AS : 배열 6) 를 사용하여 RT-PCR 을 행하고, 899bp 의 E1A 유전자를 증폭하였다. 293 세포로부터 추출한 DNA 로부터 프라이머 (E1B-S : 배열 7, E1B-AS : 배열 8) 를 사용하여 DNA-PCR 을 행하고, 1823bp 의 E1B 유전자를 증폭하였다.

각각의 PCR 산물의 TA Cloning (TA Cloning Kit Dual Promoter; Invitrogen) 을 행하고, 시퀀스를 확인한 후, 제한효소 EcoRI 에 의해 각각 899bp (E1A), 1823bp (E1B) 의 DNA 단편을 잘라내었다.

pIRES 벡터 (CLONTECH) 의 MluI 절단부위에 E1A 를, SalI 부위에 E1B 를 각각 순방향으로 삽입하였다 (E1A-IRES-E1B).

제한효소 MluI 및 BglII 에 의해 잘라낸 455bp 의 hTERT 프로모터 배열을, E1A-IRES-E1B 의 E1A 상류에 있는 XhoI 부위에 순방향으로 삽입하였다 (phTERT-E1A-IRES-E1B).

pShuttle 벡터에 포함되는 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 제한효소 MfeI 및 NheI 처리에 의해 제거하고, 그 부위에 phTERT-E1A-IRES-E1B 로부터 제한효소 NheI 및 NotI 에 의해 잘라낸 3828bp 의 배열을 삽입하였다 (pSh-hAIB).

pSh-hAIB 로부터 제한효소 I-CeuI 및 Pl-SceI 에 의해 4381bp 의 배열을 잘라내고, Adeno-X Expression System (CLONTECH) 의 Adeno-X Viral DNA 에 삽입하였다 (AdenoX-hAIB). AdenoX-hAIB 를 제한효소 PacI 처리로 선상화한 후, 293 세포에 인산칼슘법을 사용하여 트랜스펙션하여 감염성이 있는 재조합 아데노바이러스를 제작하였다 (TRAD). TRAD 의 모식도를 도 1 에 나타낸다.

실시예 2

<인간 암세포 및 정상 세포에서의 텔로머라아제 활성의 비교>

인간 폐암 세포 (A549, H226Br, H1299), 인간 대장암 세포 (SW620, DLD-1, LoVo), 인간 태아 신장 세포 293, SV40 유전자 도입으로 불사화한 인간 혈관 내피 세포 HUVEC, 인간 정상 선유아 세포 (WI38, NHLF) 의 10 종류의 세포로부터 RNAzo1 (Cinna/Biotecx) 를 사용하여 RNA 를 추출하고 LightCycler 및 LightCycler DNA TeloTAGGG Kit (Roche Molecular Biochemicals) 를 사용하여 리얼타임 정량적 역전사 (reverse transcription (RT))-PCR 을 행하여 각각의 세포에서의 hTERT 유전자 발현 레벨을 비교하였다. 결과를 도 2 에 나타낸다.

가장 발현 레벨이 높았던 A549 세포를 1.0 으로 하여 비교하면, A549, H226Br, H1299, SW620, DLD-1, LoVo 등의 암세포 및 293 세포에서는 0.18∼1.00 의 hTERT 유전자 발현이 확인되었지만, 불사화한 HuVEC 세포나 WI38, NHLF 등의 정상 세포에서는 그 발현은 검출되지 않았다.

실시예 3

<인간 암세포 및 정상 세포에서의, TRAD 감염후의 E1A 및 E1B 의 mRNA 및 단백질의 발현>

인간 대장암 세포 SW620 및 인간 정상 선유아 세포 WI38 를 in vitro 로 배양하고, 0.1 및 1MOI (multiplicity of infection) 의 농도로 TRAD 를 감염시켜 36 시간후에 RNA 를 회수하였다. 양성 컨트롤로서 293 세포를 사용하였다.

GeneAmp RNA PCR Core Kit 를 사용하여 RT 를 행하고, E1A 및 E1B 유전자에 대한 프라이머를 사용하여 GeneAmp PCR system 9700 thermal cycler (PE Applied Biosystems) 에 의해 30 사이클의 증폭을 행하였다. PCR 산물을 1.2% 아갈로스겔 상에서 영동하여 에티디움브로마이드로 염색하여 가시화하였다 (도 3A 의 상 2 개). 밴드의 강도를 이미지 분석기로 측정하여 GAPDH 를 내부 컨트롤로서 정량화하여 그래프화하였다 (도 3A 의 하).

인간 대장암 세포 SW620 및 인간 정상 선유아 세포 WI38 를 in vitro 로 배양하고, 0.1 및 1MOI 의 농도로 TRAD 를 감염시켜 48 시간후에 부착세포를 회수하고, 용해액 중에서 30 분간 반응시킨 후에 원침(遠沈)하여, 상등액의 단백질 농도를 측정하였다. 12% 폴리아크릴아미드겔 상에서 전기영동하여 막에 트랜스퍼한 후, 항아데노바이러스 5 형 E1A 항체 (PharMingen International) 를 사용하여 웨스턴블롯 해석을 행하였다. 결과를 도 3B 에 나타낸다.

암세포인 SW620 에서는, TRAD 의 감염에 의해 명확하게 강한 E1A 유전자 (502bp), E1B 유전자 (543bp) 의 발현이 보였지만, 정상 세포인 WI38 에서는, 그들은 약한 발현이 보였을 뿐이었다 (도 3A). 양성 컨트롤의 293 세포에서는, 그들은 중등도의 발현이 확인되었다.

웨스턴블롯 해석에서는, SW620 에서 0.1MOI, 1MOI 와 TRAD 의 농도에 따라 E1A 단백질의 발현이 증강되었다 (도 3B). 한편, WI38 에서는 1MOI 의 TRAD 를 사용하여도 E1A 단백질의 발현은 거의 검출되지 않았다.

실시예 4

<인간 암세포 및 정상 세포에서의 TRAD 감염후의 세포내 증식의 검토>

인간 암세포 (SW620 및 H1299) 및 인간 정상 세포 (WI38 및 NHLF) 에 TRAD 를 1MOI 에서 2 시간 37℃ 로 감염시키고, TRAD 를 포함하는 배양액을 버리고 새로운 배양액으로 1 회 세정하고, 다시 새로운 배양액을 첨가하였다. 그 직후에 Day 0 으로서 스크레이퍼로 세포를 회수하고 동결 융해를 반복한 후에 1 ml 의 배양액에 부유시켰다. 동일한 방법으로 Day1, 2, 3, 5, 7 에 바이러스를 회수하여 역가를 측정하였다. 결과를 도 4 에 나타낸다.

정상 세포인 WI38 나 NHLF 에서는 10² PFU 의 TRAD 가 3 일째에는 10⁵ PFU 정도로 100∼1000 배의 증식이 보였지만, 암세포인 SW620 나 H1299 에서는 10⁷∼l0⁸ PFU 로 1O⁵∼10⁶ 배의 증식이 보여, 암세포 특이적인 바이러스 증식이 확인되었다.

실시예 5

<인간 암세포 및 정상 세포에서의 TRAD 의 세포 장애 활성>

24 웰 플레이트에 5 종류의 인간 암세포 (SW620, H1299, A549, DLD-1, H226Br) 를 6∼8×10⁴ 개/웰, 및 2 종류의 인간 정상 세포 (WI38, NHLF) 를 2∼4×10⁴ 개/웰로 각각 뿌리고, 24 시간후에 TRAD 를 0.01, 0.1, 1, 2, 5MOI 로 감염시켰다. 감염으로부터 96 시간후에, 현미경하에 SW620, DLD-1, NHLF 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다. 또한, 모든 세포에서 배양액을 버리고 생세포를 Coomassie brilliant blue 로 염색하여 스캐너로 매크로 화상을 넣었다.

96 웰 플레이트에 SW620, H1299 를 10⁴ 개/웰, NHLF 를 5×10³ 개/웰로 뿌리고, TRAD 를 0 (비감염 세포), 0.01, 0.1, 1MOI 로 감염시켜, XTT 분석으로 Day1, 2, 3, 5, 7 에 생세포수를 계측하였다. 4 웰씩 측정하여 비감염세포를 1.0 으로 하여 평균치 +/- SD 로 그래프화하였다. 각각의 결과를 도 5, 6 및 7 에 나타낸다.

SW620, H1299, A549, DLD-1, H226Br 등의 암세포에서는, TRAD 의 농도에 의존하여 세포수가 줄고, 푸르게 염색되는 영역이 감소하였음을 알 수 있다. 한편, WI38, NHLF 등의 정상 세포에서는, 푸르게 염색되는 생세포수의 현저한 감소는 보이지 않았다 (도 5).

현미경 소견에서는, SW620, DLD-1세포는 플레이트의 저면으로부터 벗겨져 원형화되고 세포밀도도 감소하였지만, NHLF 에서는 거의 형태학적 변화는 보이지 않고 세포수의 감소도 보이지 않았다 (도 6).

SW620 및 H1299 에서는, 1MOI 의 TRAD 의 감염에 의해 3 일째까지 거의 100% 의 세포사가 관찰되고, 0.1MOI 에서도 80% 이상의 세포수 감소가 보였다. 이에 비해, NHLF 에서는 3 일째에서도 거의 세포수의 감소는 보이지 않고, 7 일째에는 1MOI의 TRAD 에서 60% 정도의 세포수의 저하가 관찰되었지만, 0.01MOI 에서는 전혀 바이러스의 영향은 없었다 (도 7).

실시예 6

<동물 모델을 사용한 TRAD 의 항종양 활성의 검토>

생후 5∼6 주의 누드 마우스의 등부위 피하에 인간 폐암 세포 H358 을 5×10⁶개 이식하여, 직경이 약 5∼6mm 이 된 시점에서, p53 유전자를 발현하는 비증식성 아데노바이러스 벡터 (Ad-p53) 1×10⁸ PFU, 3×10⁸ PFU, 1×10⁹ PFU 를 연일 2 일간 종양내 국소 주입하였다. 그 후, 직교하는 종양 직경을 정기적으로 측정하여, 추정 종양중량을 (장직경)×(단직경)²/2 로 산출하였다. 컨트롤로서 삽입 유전자를 갖지 않는 비증식성 아데노바이러스 벡터 dl312 를 사용하였다.

생후 5∼6 주의 누드 마우스의 등부위 피하에 인간 대장암 세포 SW620 를 5×10⁶개 이식하여, 직경이 약 5∼6mm 이 된 시점에서, 2×10⁷ PFU 의 d1312 및 4×10³ PFU 의 TRAD 를 연일 3 일간 종양내 국소 주입하였다. 동일하게 종양 직경을 측정하여 추정 종양중량을 산출하였다. 결과를 도 8 및 9 에 나타낸다 (도면 중, 모의 (Mock)란 컨트롤을 나타내고, PBS (인산 완충액) 을 투여하였다.).

3×10⁸PFU, 1×10⁹ PFU 의 Ad-p53 투여에 의해 H358 종양의 증식은 유의하게 (p<0.05) 억제되었다. 그러나, 1×10⁸ PFU 의 Ad-p53 투여에서는 유의한 증식 억제는 보이지 않았다 (도 8). 또, 컨트롤의 d1312 의 투여에서는 종양 증식은 전혀 영향받지 않았다.

항종양 효과가 보인 Ad-p53 보다 매우 저농도인 4×10³ PFU 의 TRAD 의 종양내 투여에 의해, 유의차를 갖고 (p<0.05) SW620 종양의 증식이 억제되었다. 컨트롤의 d1312 의 투여에서는 종양 증식은 전혀 영향받지 않았다.

이상으로부터, 본 발명의 바이러스는 효율적으로 암세포에서 증식하여 암세포를 사멸시키는 것을 알 수 있다. 또한, 본 발명의 바이러스는 증식능을 갖고 있기 때문에 저농도라도 큰 항암작용을 발휘하며, 투여하는 바이러스를 저농도로 함으로써 부작용을 억제할 수도 있다.

도 1 은, 종양 세포에서 선택적으로 증식하는 종양 융해 바이러스 구조의 모식도를 나타낸다. 비증식성 바이러스 벡터에서는 결실되어 있는 E1 유전자 영역에, hTERT 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열 및 E1B 유전자로 이루어지는 증식 카세트가 삽입되어 있다.

도 2 는, 인간 암세포 및 정상 세포에서의 텔로머라아제 활성의 비교를 나타낸다.

도 3 은, 인간 암세포 및 정상 세포에서의 TRAD 감염후의 E1A 및 E1B 의 mRNA 및 단백질의 발현을 나타낸다.

도 4 는, 인간 암세포 및 정상 세포에서의 TRAD 감염후의 세포내에서의 증식을 나타낸다.

도 5 는, 인간 암세포 및 정상 세포에서의 TRAD 에 의한 세포 장애 활성을 Coomassie brilliant blue 염색에 의해 나타낸 사진이다.

도 6 은, 인간 암세포 및 정상 세포에서의 TRAD 에 의한 세포 장애 활성을 현미경 사진으로 나타낸 것이다.

도 7 은, 인간 암세포 및 정상 세포에서의 TRAD 에 의한 세포 장애 활성을 XTT 분석에 의해 나타낸 그래프이다.

도 8 은, 누드 마우스 및 인간 폐암 세포 H358 을 사용한 비증식성 p53 유전자 발현 아데노바이러스 벡터의 종양내 국소 투여의 항종양 효과를 나타낸 그래프이다.

도 9 는, 누드 마우스 및 인간 대장암 세포 SW620 을 사용한 TRAD 의 종양내 국소 투여의 항종양 효과를 나타낸 그래프이다.

<110> KANSAI Technology Licensing Organization, Toshiyoshi FUJIWARA, Noriaki TANAKA, Satoru KYO <120> Oncolyis with Tumor-specific Replication-competent Virus <130> P03-75 <150> JP2002-198941 <151> 2002-07-08 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 899 <212> DNA <213> 293 cell <400> 1 acaccgggac tgaaaatgag acatattatc tgccacggag gtgttattac cgaagaaatg 60 gccgccagtc ttttggacca gctgatcgaa gaggtactgg ctgataatct tccacctcct 120 agccattttg aaccacctac ccttcacgaa ctgtatgatt tagacgtgac ggcccccgaa 180 gatcccaacg aggaggcggt ttcgcagatt tttcccgact ctgtaatgtt ggcggtgcag 240 gaagggattg acttactcac ttttccgccg gcgcccggtt ctccggagcc gcctcacctt 300 tcccggcagc ccgagcagcc ggagcagaga gccttgggtc cggtttctat gccaaacctt 360 gtaccggagg tgatcgatct tacctgccac gaggctggct ttccacccag tgacgacgag 420 gatgaagagg gtgaggagtt tgtgttagat tatgtggagc accccgggca cggttgcagg 480 tcttgtcatt atcaccggag gaatacgggg gacccagata ttatgtgttc gctttgctat 540 atgaggacct gtggcatgtt tgtctacagt cctgtgtctg aacctgagcc tgagcccgag 600 ccagaaccgg agcctgcaag acctacccgc cgtcctaaaa tggcgcctgc tatcctgaga 660 cgcccgacat cacctgtgtc tagagaatgc aatagtagta cggatagctg tgactccggt 720 ccttctaaca cacctcctga gatacacccg gtggtcccgc tgtgccccat taaaccagtt 780 gccgtgagag ttggtgggcg tcgccaggct gtggaatgta tcgaggactt gcttaacgag 840 cctgggcaac ctttggactt gagctgtaaa cgccccaggc cataaggtgt aaacctgtg 899 <210> 2 <211> 1823 <212> DNA <213> 293 cell <400> 2 ctgacctcat ggaggcttgg gagtgtttgg aagatttttc tgctgtgcgt aacttgctgg 60 aacagagctc taacagtacc tcttggtttt ggaggtttct gtggggctca tcccaggcaa 120 agttagtctg cagaattaag gaggattaca agtgggaatt tgaagagctt ttgaaatcct 180 gtggtgagct gtttgattct ttgaatctgg gtcaccaggc gcttttccaa gagaaggtca 240 tcaagacttt ggatttttcc acaccggggc gcgctgcggc tgctgttgct tttttgagtt 300 ttataaagga taaatggagc gaagaaaccc atctgagcgg ggggtacctg ctggattttc 360 tggccatgca tctgtggaga gcggttgtga gacacaagaa tcgcctgcta ctgttgtctt 420 ccgtccgccc ggcgataata ccgacggagg agcagcagca gcagcaggag gaagccaggc 480 ggcggcggca ggagcagagc ccatggaacc cgagagccgg cctggaccct cgggaatgaa 540 tgttgtacag gtggctgaac tgtatccaga actgagacgc attttgacaa ttacagagga 600 tgggcagggg ctaaaggggg taaagaggga gcggggggct tgtgaggcta cagaggaggc 660 taggaatcta gcttttagct taatgaccag acaccgtcct gagtgtatta cttttcaaca 720 gatcaaggat aattgcgcta atgagcttga tctgctggcg cagaagtatt ccatagagca 780 gctgaccact tactggctgc agccagggga tgattttgag gaggctatta gggtatatgc 840 aaaggtggca cttaggccag attgcaagta caagatcagc aaacttgtaa atatcaggaa 900 ttgttgctac atttctggga acggggccga ggtggagata gatacggagg atagggtggc 960 ctttagatgt agcatgataa atatgtggcc gggggtgctt ggcatggacg gggtggttat 1020 tatgaatgta aggtttactg gccccaattt tagcggtacg gttttcctgg ccaataccaa 1080 ccttatccta cacggtgtaa gcttctatgg gtttaacaat acctgtgtgg aagcctggac 1140 cgatgtaagg gttcggggct gtgcctttta ctgctgctgg aagggggtgg tgtgtcgccc 1200 caaaagcagg gcttcaatta agaaatgcct ctttgaaagg tgtaccttgg gtatcctgtc 1260 tgagggtaac tccagggtgc gccacaatgt ggcctccgac tgtggttgct tcatgctagt 1320 gaaaagcgtg gctgtgatta agcataacat ggtatgtggc aactgcgagg acagggcctc 1380 tcagatgctg acctgctcgg acggcaactg tcacctgctg aagaccattc acgtagccag 1440 ccactctcgc aaggcctggc cagtgtttga gcataacata ctgacccgct gttccttgca 1500 tttgggtaac aggagggggg tgttcctacc ttaccaatgc aatttgagtc acactaagat 1560 attgcttgag cccgagagca tgtccaaggt gaacctgaac ggggtgtttg acatgaccat 1620 gaagatctgg aaggtgctga ggtacgatga gacccgcacc aggtgcagac cctgcgagtg 1680 tggcggtaaa catattagga accagcctgt gatgctggat gtgaccgagg agctgaggcc 1740 cgatcacttg gtgctggcct gcacccgcgc tgagtttggc tctagcgatg aagatacaga 1800 ttgaggtact gaaatgtgtg ggc 1823 <210> 3 <211> 605 <212> DNA <213> 293 cell <400> 3 tgcatctagg gcggccaatt ccgcccctct ccctcccccc cccctaacgt tactggccga 60 agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt gattttccac catattgccg 120 tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg 180 ggtctttccc ctctcgccaa aggaatgcaa ggtctgttga atgtcgtgaa ggaagcagtt 240 cctctggaag cttcttgaag acaaacaacg tctgtagcga ccctttgcag gcagcggaac 300 cccccacctg gcgacaggtg cctctgcggc caaaagccac gtgtataaga tacacctgca 360 aaggcggcac aaccccagtg ccacgttgtg agttggatag ttgtggaaag agtcaaatgg 420 ctctcctcaa gcgtattcaa caaggggctg aaggatgccc agaaggtacc ccattgtatg 480 ggatctgatc tggggcctcg gtgcacatgc tttacatgtg tttagtcgag gttaaaaaaa 540 cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataagct 600 tgcca 605 <210> 4 <211> 455 <212> DNA <213> 293 cell <400> 4 tggcccctcc ctcgggttac cccacagcct aggccgattc gacctctctc cgctggggcc 60 ctcgctggcg tccctgcacc ctgggagcgc gagcggcgcg cgggcgggga agcgcggccc 120 agacccccgg gtccgcccgg agcagctgcg ctgtcggggc caggccgggc tcccagtgga 180 ttcgcgggca cagacgccca ggaccgcgct ccccacgtgg cggagggact ggggacccgg 240 gcacccgtcc tgccccttca ccttccagct ccgcctcctc cgcgcggacc ccgccccgtc 300 ccgacccctc ccgggtcccc ggcccagccc cctccgggcc ctcccagccc ctccccttcc 360 tttccgcggc cccgccctct cctcgcggcg cgagtttcag gcagcgctgc gtcctgctgc 420 gcacgtggga agccctggcc ccggccaccc ccgcg 455 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> 293 cell <400> 5 acaccgggac tgaaaatgag 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> 293 cell <400> 6 cacaggttta caccttatgg c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> 293 cell <400> 7 ctgacctcat ggaggcttgg 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> 293 cell <400> 8 gcccacacat ttcagtacct c 21

Claims

hTERT 프로모터, E1A 유전자, IRES 배열 및 E1B 유전자를 이 순서로 포함하는, 아데노바이러스에 삽입하기 위한 콘스트럭트로서,

hTERT 프로모터의 염기 배열이 배열 번호 4 로 나타내는 염기 배열로 이루어지고, E1A 유전자의 염기 배열이 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열로 이루어지며, IRES 배열의 염기 배열이 배열 번호 3 으로 나타내는 염기 배열로 이루어지고, 또한 E1B 유전자의 염기 배열이 배열 번호 2 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 상기 콘스트럭트.
제 1 항에 기재된 콘스트럭트를 포함하는 아데노바이러스.
유효성분으로서 제 2 항에 기재된 아데노바이러스 및 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 함유하는 항암제.