CN1948475A - 可用于治疗艾滋病的重组表达载体、经改造的造血干细胞和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的可用于治疗艾滋病的重组表达载体、经改造细胞(特别是造血干细胞)和方法。本发明提供重组表达载体和经改造细胞(特别是造血干细胞),其可表达:(1)MGMT(P140K)基因;和(2)多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸。本发明还提供治疗HIV感染的方法,包括(1)制备本发明的细胞,然后将其移植到HIV感染患者体内;和(2)进行适当的BG/BCNU治疗。
Description
技术领域
本发明涉及基因治疗领域,特别是可用于治疗艾滋病的重组表达载体、经改造细胞(特别是造血干细胞)和方法。
背景技术
当前,对艾滋病毒(HIV)感染的治疗手段主要是高强度的抗逆转录病毒治疗,该疗法联合使用针对病毒逆转录酶和蛋白酶的抑制剂。不幸的是,HIV具有很高的突变率及复杂的致病机理,因此能够逃避治疗。由于HIV-1可以整合入细胞的基因组,病毒的基因组可长期存在于细胞之中。HIV-1在药物治疗之后仍可在携带HIV-1基因组的CD4+细胞再次激活扩增。因此,需要发展新的治疗手段对付HIV的感染。
长期以来,将目的基因导入人类造血干细胞(HSC)以治疗人类疾病是众多科学家和医生期待实现的目标。然而,由于难于对足够数量的造血干细胞进行靶基因的转导,基因治疗至今无法在血细胞疾病治疗中得到应用。最近,出现了一种用P140K突变的O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶基因(P140K O6-methylguanine-DNA-methyltransferase,MGMT[P140K])作为抗性基因转导入细胞,然后用六氧苯甲基鸟嘌呤/卡莫司汀(O6-benzylguanine/1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea,BG/BCNU)杀死未带抗性基因的血液干细胞的筛选方法。化疗药物卡莫司汀(BCNU)是一种潜在的干细胞毒素,骨髓抑制是临床上观察到的BCDU治疗相关的剂量限制性毒性反应。六氧苯甲基鸟嘌呤(BG)本身并不杀伤干细胞,但能使干细胞对BCNU易感。联合使用BG和BCNU进行治疗可有效地在体内清除造血干细胞。表达MGMT(P140K)的造血干细胞在体内和体外对BG/BCNU联合治疗手段均呈现出抗性。基于以上原理,人们可以在体外改造血液干细胞,同时使其携带MGMT(P140K)基因。在这些改造好的血液干细胞移入体内之后,使用BG/BCNU。BG/BCNU将除去那些不带有MGMT(P140K)基因的血液干细胞,而携带MGMT(P140K)基因的血液干细胞将生存、扩增,最终取代原来的血液干细胞。此原理的可行性已在包括狗在内的大动物实验得以证实。(Neff T等,临床研究杂志,2003年,112卷:1581-1588页)。运用非肥胖型糖尿病/严重免疫缺陷型小鼠(NOD/SCID小鼠)模型,人们已经证明携带MGMT(P140K)基因的人的血液干细胞可以在体内抗BG/BCNU毒性,从而生存、扩增(Zielske SP等,临床研究杂志,2003年,112卷:1561-1570页)。该选择系统也可能可用于人类疾病治疗,使基因治疗得以在自体或异体骨髓移植中实现。
RNA干扰(RNAi)是一种抑制基因表达机制,通过21~23个核苷酸长度的双链短干扰RNA(siRNA)介导mRNA的序列特异性降解。已证明靶向HIV-1mRNA的siRNA可在组织培养细胞中有效抑制HIV-1(Martinez MA等,免疫学趋势,2002年,23卷:559-561页)。但不幸的是,在长期实验中发现HIV-1可对单一种类的siRNA抑制产生抗性(Das AT等,病毒学杂志,2004年,78卷:2601-2605页)。这也是由于HIV的高突变率造成的。克服这一困难的一个途径是采取一种联合治疗办法,即将多个不同的抗HIV的 siRNA同时导入以避免抗性突变逃避。然而,目前尚没有一种方法可以有效地同时向细胞中导入并表达多个siRNA。
因此,本领域需要改良的治疗或改善HIV感染的方法。本发明满足了这一需要,并提供了用于该目的和其它目的的重组表达载体、改造的细胞如造血干细胞等。
发明内容
本发明一方面提供可表达多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的表达盒,其包含由共同的启动子(例如一个或几个启动子)控制的、多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或 miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列。
在一个具体实施方案中,本发明的表达盒中所述编码核酸序列是通过在一个miRNA基因簇中将多个miRNA序列(例如miRNA17,18,19a,20,和19b-1)的编码序列替换为多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列而获得的。
另一方面,本发明提供重组表达载体,其可表达:(1)MGMT(P140K)基因;和(2)多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
在一个实施方案中,本发明重组表达载体包含(1)MGMT(P140K)基因,该基因与表达控制序列可操作地连接,使得该基因可在动物细胞(特别是哺乳动物细胞,如人细胞,如哺乳动物干细胞,优选造血干细胞)中表达;和(2)多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列,这些编码核酸序列与表达控制序列可操作地连接,使得可在动物细胞(特别是哺乳动物细胞,如人细胞,如哺乳动物干细胞,优选造血干细胞)中表达所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
在一个优选实施方案中,重组表达载体中所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列由共同的启动子控制表达。
在另一个优选实施方案中,上述重组表达载体中所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列是通过在一个miRNA基因簇中将多个miRNA序列(例如miRNA 17,18,19a,20,和19b-1)的编码序列替换为多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列而获得的。
本发明的重组表达载体可以是质粒载体或病毒载体,例如逆转录病毒载体,包括慢病毒载体。优选地,所述重组表达载体是逆转录病毒载体,更优选慢病毒载体(如慢病毒Xiada-1)。
在再一个相关方面,本发明提供改造后的用于生产逆转录病毒载体(例如慢病毒载体,如慢病毒Xiada-1)的包装载体(如包装质粒),其含有突变后的POL和GAG基因,特别地,POL和GAG基因可相互独立地具有如下突变:
GAG: --------GAUUGUACUGAGAGACAGGCU------------
突变为--------GACTGCACAGAACGTCAAGCA------------
POL: ---------GGGGCAGUAGUAAUACAAGAU-----------
突变为---------GGCGCTGTTGTTATCCAGGAC-----------
本发明还涉及转化或转染或转导了本发明重组表达载体的分离的细胞,包括原核细胞(如细菌细胞,如大肠杆菌细胞)和真核细胞(如真菌细胞,昆虫细胞,植物细胞,动物细胞,优选哺乳动物如人的细胞)。
本发明还涉及包含上述细胞的组织和生物,如动物,优选非人哺乳动物。本发明还涉及包含本发明的细胞的药物组合物。
本发明还涉及转化或转染或转导了本发明的包装载体(如包装质粒)的分离的细胞。本发明还涉及包含上述细胞的组织和生物,如动物,优选非人哺乳动物。
另一方面,本发明还涉及一种经改造的细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞,优选干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞),其可表达:(1)MGMT(P140K)基因;和(2)多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
在一个实施方案中,本发明的改造的细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞,优选干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞)在基因组中或者基因组外携带:(1)MGMT(P140K)基因,该基因与表达控制序列可操作地连接,使得该基因可在该细胞中表达;和(2)多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列,这些编码核酸序列与表达控制序列可操作地连接,使得可在该细胞中表达所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
在一个优选实施方案中,所述改造细胞中所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列由共同的启动子控制表达。
在另一个独立的优选实施方案中,所述改造细胞中所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列是通过在一个miRNA基因簇中将多个miRNA序列(例如miRNA17,18,19a,20,和19b-1)替换为多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列而获得的。
本发明的改造细胞包括但不限于,动物例如哺乳动物优选人的细胞,优选干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞;优选哺乳动物优选人的干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞。
本发明还涉及包含上述细胞的生物,如动物,优选非人哺乳动物。
另一方面,本发明还涉及制备本发明改造细胞的方法,包括用本发明的重组表达载体转化或转染或转导细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞,优选干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞)。
在一个具体实施方案中,所述方法包括用本发明重组逆转录病毒载体(例如慢病毒载体,如慢病毒Xiada-1)转导哺乳动物优选人的干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞。
在上述方法,所述细胞可以是分离的(或离体的),例如从感染HIV的患者或者正常个体分离的,或者是在体的。
在另一方面,本发明提供治疗HIV感染或者HIV患者的方法,包括(1)按照本发明的方法制备本发明的哺乳动物优选人的经改造的细胞(优选干细胞,最优选造血干细胞,如CD34+细胞),然后将其移植到HIV感染患者体内;和(2)进行适当的BG/BCNU治疗。
本发明还涉及本发明的经改造的细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞,优选干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞)在制备治疗HIV感染或者HIV患者中的药物中的用途。
本发明还涉及包含本发明的经改造的细胞的药物组合物。
本发明还涉及本发明载体在制备本发明细胞中的用途。
本发明还涉及本发明载体和细胞用于治疗HIV感染或者HIV患者的用途。
本发明还涉及(1)MGMT(P140K)基因和(2)多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的组合以及该组合在制备本发明载体、本发明细胞和用于治疗HIV感染的细胞中的用途。
在优选的实施方案中,如果适用的话,在本发明所有方面,所述MGMT(P140K)具有SEQ ID NO:1所示的序列或与之具有至少70%(优选至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列。
在另外的优选的实施方案中,如果适用的话,在本发明所有方面,所述siRNA是靶向HIV的,并包含如下序列或与其具有至少70%(优选至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列中的任何一个或几个序列:SEQ ID NO:2-6和8-44。
优选地,所述siRNA包括从上述序列中选择的至少2个序列,优选3个、4个序列,更优选5个序列,或者5个以上的序列,或者由从上述序列中选择的至少2个序列,优选3个、4个序列,更优选5个序列,或者5个以上的序列组成。
在另外的优选的实施方案中,如果适用的话,在本发明所有方面,所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列包含或由SEQ ID NO:7所示的序列或者与SEQ ID NO:7具有至少70%(优选至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列组成。
在另一方面,本发明还涉及核酸分子,其包含或具有
(1)SEQ ID NO:1-44中任何一个所示的序列,或者
(2)与(1)中序列具有至少70%(优选至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列,或者
(3)在严紧条件下或者高度严紧条件与(1)中序列能够杂交的核苷酸序列,或者
(4)上述序列的片段或者互补序列。
下面结合附图对本发明进行更详细的说明。从下文的详细描述中,本发明的上述方面和本发明的其他方面将是明显的。
附图说明
图1.五种HIV-siRNAs获得同时表达.Xiada-1或一个对照载体分别转染293细胞。在转染后24小时收获细胞总RNA。Xiada-1编码的siRNAs的表达通过引物延伸进行检测。Control:对照。FreeProbes:游离探针。
图2显示了不同siRNA靶点在与HIV感染性克隆质粒共转染实验对HIV p24蛋白表达的抑制效果。结果显示,这些siRNA靶点可用于有效抑制HIV。
图3显示,LV-GFP转导MT-4细胞后GFP基因的表达效率大于90%。左图为普通光,右图为蓝色光激发。
图4显示了在HIV体外感染细胞模型中验证Xiada-1的抑制效果。
图5是从脐带血中分离人CD34+细胞的流式细胞术检测结果,显示纯度高于95%。
图6显示,LV-GFP转导人CD34+细胞后GFP基因的表达效率高于40%。左图为普通光,右图为蓝色光激发。
图7显示了在移植了经Xiada-1转导的人造血干细胞的NOD/SCID小鼠中分离的人T细胞、B细胞、巨噬细胞中的五种siRNA的同时表达。Xiada-1编码的siRNAs的表达通过引物延伸进行检测。
T cells from control mouse 1:对照小鼠1的T细胞;
T cells from control mouse 2:对照小鼠2的T细胞;
T cells:T细胞;
B cells:B细胞;
Macrophasges:巨噬细胞;
Free Probes:游离探针。
具体实施方式
除非特别说明,本发明的术语具有本领域通常使用的含义。
在本发明中,“多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸”是指siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的任何组合,例如,这包括一个或多个siRNA和一个或者多个miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的组合,也可以是单独的多个siRNA、miRNAs、核酶或反义寡核苷酸,如单独的多个siRNA。“多个”的含义是至少两个,并可多达10个、20个或更多,优选2-10个,3-8个,例如3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个。
“siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸”通常设计成靶向目的基因或者调节序列,例如需要抑制其表达的基因或其调控序列,以便抑制或降低其表达。所针对的基因或其调控序列可以是需要抑制或降低其表达的任何基因或其调控序列,例如来自病原体的、或者参与癌症形成和发展的那些。特别是靶向HIV。本发明的siRNA、miRNAs、核酶和反义寡核苷酸可按照常规方法设计。
本发明使用的启动子可以是任何适于在目的宿主细胞中表达目的基因的启动子。可以是组成型的,也可以是诱导型的。还可以是复合启动子,如双启动子。
“可操作地连接”是指所连接的分子的连接方式使得能够实现预期的功能。例如,表达控制序列与基因编码序列的可操作的连接可实现表达控制序列对基因编码序列的表达控制作用。
“表达控制序列”是实现基因表达所需要的控制序列,是本领域熟知的。通常必须包括启动子,常常也包括转录终止序列,也可以包含其他序列,如增强子序列。基因表达对于siRNA、miRNAs、核酶和反义寡核苷酸等是指转录,也可以包括转录后加工;对于蛋白质编码序列如MGMT(P140K)而言通常是指转录和翻译,产生成熟的蛋白质。
在本发明重组表达载体的一个实施方案中,本发明重组表达载体包含(1)MGMT(P140K)基因,该基因与表达控制序列可操作地连接,使得该基因可在动物细胞(特别是哺乳动物细胞,如人细胞,优选造血干细胞)中表达;和(2)多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列,这些编码核酸序列与表达控制序列可操作地连接,使得可在动物细胞(特别是哺乳动物细胞,如人细胞,如哺乳动物干细胞,优选造血干细胞)中表达所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
在另一个实施方案中,MGMT(P140K)基因和多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列可以存在于分开的两个或更多个表达载体上。
类似地,在制备本发明改造细胞的方法中,可以通过用分别包含MGMT(P140K)基因和多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列的分开的两个或更多个表达载体转导细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞,优选干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞)来获得本发明改造细胞,只要最终得到的细胞包含并表达MGMT(P140K)基因和多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列即可。然而,优选的是,MGMT(P140K)基因和多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列存在于一个表达载体上。
本发明的重组表达载体可以是质粒载体或病毒载体,例如逆转录病毒载体,包括慢病毒载体。优选地,所述重组表达载体是逆转录病毒载体,更优选慢病毒载体(如慢病毒Xiada-1)。
本发明的改造的细胞优选是哺乳动物(优选人)的细胞,优选干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞。所述细胞优选在基因组中携带:(1)MGMT(P140K)基因,该基因与表达控制序列可操作地连接,使得该基因可在该细胞中表达;和(2)多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列,这些编码核酸序列与表达控制序列可操作地连接,使得可在该细胞中表达所述多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
本发明提供治疗HIV感染或者HIV患者的方法,包括(1)按照本发明的方法制备本发明的哺乳动物优选人的经改造的细胞(优选干细胞,最优选造血干细胞,如CD34+细胞),然后将其移植到HIV感染患者体内;和(2)进行适当的BG/BCNU治疗。优选的,该方法包括:(1)按照本发明的方法制备本发明的经改造的人类造血干细胞,如CD34+细胞,然后将其移植到HIV感染患者体内;和(2)进行适当的BG/BCNU治疗。
本发明还涉及本发明的经改造的细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞,优选干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞)在制备治疗HIV感染或者HIV患者中的药物中的用途。
在优选的实施方案中,如果适用的话,在本发明所有方面,所述MGMT(P140K)具有SEQ ID NO:1所示的序列或与之具有至少70%(优选至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列。
一致性(identity)可以按照本领域公知的方法计算。适合于确定序列一致性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法,它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25:3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。采用例如本文所述参数,BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的多核苷酸和多肽的序列一致性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。
在其它实施方案中,所述MGMT(P140K)具有在严紧条件下或者高度严紧条件与本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互补序列能够杂交的多核苷酸序列。在分子生物学领域中杂交技术是熟知的。为了举例说明的目的,所述杂交的条件是严紧条件,例如与滤膜结合的DNA在6×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中约45℃下杂交,之后在0.2×SSC/0.1%SDS中于约50-65℃下作一或多次洗涤;高度严紧条件,例如与滤膜结合的核酸在6×SSC中约45℃下杂交,之后在0.1×SSC/0.2%SDS中于约68℃下作一或多次洗涤;或本领域技术人员已知的其它严紧杂交条件(参见例如Ausubel,F.M.等编,1989,Current Protocols inMolecular Biology,第1卷,Green Publishing Associates,Inc.,和John Wiley&Sons,Inc.,纽约,第6.3.1-6.3.6和2.10.3页)。
在另外的优选的实施方案中,如果适用的话,在本发明所有方面,所述siRNA是靶向HIV的,并包含如下序列或与其具有至少70%(优选至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列中的任何一个或几个序列:SEQ ID NO:2-6和8-44。
优选地,所述siRNA包括从上述序列中选择的至少2个序列,优选3个、4个序列,更优选5个序列,或者5个以上的序列,或者由从上述序列中选择的至少2个序列,优选3个、4个序列,更优选5个序列,或者5个以上的序列组成。
在一方面,本发明还涉及如下序列或与其具有至少70%(优选至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列:SEQ ID NO:2-6。
本发明还涉及在严紧条件下或者高度严紧条件与SEQ ID NO:2-6的任一序列、或其片段、或其互补序列能够杂交的核苷酸序列。
本发明还涉及在严紧条件下或者高度严紧条件与SEQ ID NO:7的序列、或其片段、或其互补序列能够杂交的核苷酸序列。
本发明的重组载体和改造细胞可以用于HIV感染的治疗,还可以用于治疗其他疾病,例如癌症。
本发明治疗方法的其他用途
本发明治疗方法还可用于治疗某些类型的造血系统疾病或淋巴系统肿瘤,如由于病毒性原因(如HTLV)或基因表达异常所引发的白血病或淋巴肿瘤或实体瘤。在患者缺乏合适的正常造血干细胞来源(如合适配型的供体骨髓,脐带血)情况下,可动员收集自身的造血干细胞,通过合适的基因转导载体将治疗性RNAi元件(用于抑制异常基因或病毒基因的表达)和耐化疗药筛选基因MGMT导入造血干细胞,输回经预处理的患者体内,在化疗药BCNU/BG联合作用下筛选经改造后的造血干细胞,在患者体内重建正常的造血和免疫系统。
因此,本发明还涉及用于治疗造血系统疾病或淋巴系统疾病、或者用于重建正常的造血或免疫系统的方法,该方法包括:通过合适的(基因转导)载体将治疗性RNAi元件(用于抑制异常基因或病毒基因的表达)和耐化疗药筛选基因MGMT导入造血干细胞(可从自体或者同种异体分离),输回(优选经预处理的)患者体内,在化疗药BCNU/BG联合作用下筛选经改造后的造血干细胞,在患者体内重建正常的造血和免疫系统。造血系统疾病或淋巴系统疾病的例子是,如需要重建造血和/或免疫系统的疾病,或者造血和/或免疫系统受损的疾病,包括造血系统疾病或淋巴系统肿瘤,如由于病毒性原因(如HTLV)或基因表达异常所引发的白血病或淋巴肿瘤或实体瘤。
在另一方面,本发明还涉及治疗性RNAi元件和耐化疗药筛选基因MGMT联合用于治疗造血系统疾病或淋巴系统疾病的用途。本发明还涉及治疗性RNAi元件和耐化疗药筛选基因MGMT联合在制备用于治疗造血系统疾病或淋巴系统疾病的药物中的用途。优选的造血系统疾病或淋巴系统疾病是上文举例说明的那些。
作为举例,我们已发展了一种可以通过一个启动子同时表达几个siRNA的方法。我们已构建了一个慢病毒载体,命名为Xiada-1,其可同时表达MGMT(P140K)和五个HIV特异性的siRNA。已知MGMT(P140K)可在体内驱动一种潜在的药物介导的筛选,因此被病毒转导的造血干细胞能够重新长期存活。我们的实验显示在体外被这种慢病毒载体转导后的T细胞可用BG/BCNU进行筛选,而且筛选后的T细胞不支持HIV的复制。这表明BG/BCNU筛选了Xiada-1转导后的细胞,抗HIV的siRNA在这些细胞中进行了表达,从而导致对HIV的感染产生抗性。在进行了4个月的培养后,我们没有发现任何可逃避siRNA的病毒变种,说明进行多种siRNA的联合治疗的确可防止变种抗性病毒的产生。我们已使用Xiada-1转导了外周血来源的人原代CD34+祖细胞并将其移植入带有BG/BCNU处理的NOD/SCID小鼠。利用BG/BCNU进行几轮筛选后,在小鼠的T细胞、B细胞和巨噬细胞中均检测到了五种HIV-siRNAs的表达,表明基因修饰过的造血干细胞在体内获得了成功扩增。
艾滋病毒感染者的临床症状的发生主要是由于患者体内被HIV感染的CD4+细胞不断被杀死,而新生CD4+细胞又不断被感染,最终导致体内CD4+细胞的严重不足而引起机体免疫机能缺陷。
本发明通过分离患者自身的造血干细胞,在体外用Xiada-1处理细胞,使Xiada-1携带的抗性基因MGMT(P140K)以及针对HIV的siRNAs进入细胞。将处理后的造血干细胞回输入患者体内后,对病人给予化疗药物BG/BCNU,BG/BCNU会引起体内原有造血干细胞的死亡,而回输的改造后的造血干细胞仍能存活并复制分化出各种子代细胞。由改造后的干细胞分化出的子代细胞具有对药物BG/BCNU的抗性以及对细胞内的HIV的专一性降解能力,因此能长期存活,并不受HIV的感染,从而维持机体免疫系统功能的正常发挥。由于失去HIV赖以繁殖的宿主细胞,HIV在体内会逐渐减少直至消失,病人获得康复。
在具体的实施方案中,本发明涉及以下内容:
1.一种改造的造血干细胞,其携带(1)MGMT(P140K)基因;和(2)多个siRNAs,和/或miRNAs,和/或靶向HIV的核酶.MGMT(P140K)的序列是:
ATGGACAAGGATTGTGAAATGAAACGCACCACACTGGACAGCCCTTTGGGGAAGCTGGA
GCTGTCTGGTTGTGAGCAGGGTCTGCACGAAATAAAGCTCCTGGGCAAGGGGACGTCTG
CAGCTGATGCCGTGGAGGTCCCAGCCCCCGCTGCGGTTCTCGGAGGTCCGGAGCCCCTG
ATGCAGTGCACAGCCTGGCTGAATGCCTATTTCCACCAGCCCGAGGCTATCGAAGAGTT
CCCCGTGCCGGCTCTTCACCATCCCGTTTTCCAGCAAGAGTCGTTCACCAGACAGGTGT
TATGGAAGCTGCTGAAGGTTGTGAAATTCGGAGAAGTGATTTCTTACCAGCAATTAGCA
GCCCTGGCAGGCAACCCCAAAGCCGCGCGAGCAGTGGGAGGAGCAATGAGAGGCAATCC
TGTCAAAATCCTCATCCCGTGCCACAGAGTGGTCTGCAGCAGCGGAGCCGTGGGCAACT
ACTCCGGAGGACTGGCCGTGAAGGAATGGCTTCTGGCCCATGAAGGCCACCGGTTGGGG
AAGCCAGGCTTGGGAGGGAGCTCAGGTCTGGCAGGGGCCTGGCTCAAGGGAGCGGGAGC
TACCTCGGGCTCCCCGCCTGCTGGCCGAAACTGA(SEQ ID NO:1)
靶向HIV基因的五种siRNA序列:
siP24:AGCCTGTCTCTCAGTACAATC(SEQ ID NO:2)
siPOL:ATCTTGTATTACTACTGCCCC(SEQ ID NO:3)
siVIF1:CAGGGTCTACTTGTGTGCT(SEQ ID NO:4)
siVIF2:TAATGCTGCTAGTGCCAAG(SEQ ID NO:5)
siTAT:TGTTCTGATGAGCTCTTCGTC(SEQ ID NO:6)
2.改造后的造血干细胞的制备方法,该细胞其携带(1)MGMT(P140K)基因;和(2)多个siRNAs,和/或miRNAs,和/或靶向HIV的核酶.
A.MGMT(P140K)的序列(SEQ ID NO:1)
B.五种siRNA的序列(SEQ ID NO:2-6)
制备方法:
A.利用Ficoll-Paque密度离心从HIV患者或一个健康供体的血液中获得粗提的血液干细胞。使用CD34+细胞分离试剂盒(MiltenyiMiniMACS,德国Miltenyi Biotec GmbH公司)富集CD34+细胞。
B.分离一天后,细胞在含有10%热灭活胎牛血清、2mM谷氨酰胺、8μg/ml Polybrene(S igma-Aldrich公司)、100ng/ml干细胞因子(SCF),100ng/ml Flt-3L,和50ng/ml血栓形成素(TPO)的DMEM培养基中用慢病毒载体Xiada-1进行转导。细胞密度为4×105/mL,感染复数(MOI)为2。细胞在移入37℃5%CO2培养箱进行孵育前先在室温下600g离心30分钟。
C.进行一天的转导后,用无血清培养基洗细胞;然后再将细胞移植回HI V病人的体内。
3.慢病毒载体,Xiada-1,用于改造造血干细胞.
A.一个可表达(1)MGMT(P140K)基因;和(2)多个siRNAs、和/或miRNAs、和/或靶向HIV的核酶的重组慢病毒载体
B.一个改造后的用于生产慢病毒载体的包装载体(如包装质粒),其含有突变后的POL和GAG基因.
改造序列的两个例子为:
GAG: --------GAUUGUACUGAGAGACAGGCU------------
突变为--------GACTGCACAGAACGTCAAGCA------------
POL: ---------GGGGCAGUAGUAAUACAAGAU-----------
突变为---------GGCGCTGTTGTTATCCAGGAC-----------
4.慢病毒Xiada-1在造血干细胞上的应用.
A.慢病毒Xiada-1用于稳定表达抗HIV的分子,如可在造血干细胞中特异阻断HIV复制的siRNA。
B.慢病毒Xiada-1用于防止造血干细胞被BG/BCNU杀死。
5.造血干细胞用于HIV患者的治疗
A.含有MGMT(P140K)基因的表达产物
B.含有多个siRNAs,和/或miRNAs,和/或靶向HIV的核酶
6.HIV感染的治疗过程
(1)体外改造病人的造血干细胞,然后将其移植回病人体内。改造后的造血干细胞携带(A)MGMT(P140K)基因和(B)多个siRNAs,和/或miRNAs,和/或靶向HIV的核酶.
(2)依据病人的具体条件进行2到5个周期的BG/BCNU治疗。治疗具有3到5周的间隔。治疗中使用的药物剂量依据制造商的推荐而定。
实施例
实施例1.与HIV感染性克隆共转染实验筛选合适的RNAi靶点
(1)pNL4-3质粒是I型HIV的感染性克隆质粒,该质粒转染合适的哺乳细胞后会分泌具有感染能力的完整病毒颗粒。p24是HIV病毒的壳蛋白,通过检测培养上清中的p24蛋白的含量可以反映病毒颗粒的分泌表达水平;
(2)设计的不同siRNA序列分别构建于pSUPER载体(oligoengine公司Cat.No VEC-PBS-0001/0002),具体的构建过程参见该公司的pSUPER实验指南(
www.oligoengine.com);
(3)实验中的阴性对照是将不与HIV和人类基因相匹配的RNAi序列构建到pSUPER载体上,命名为pSUPER(-),具体序列是5’-TGCATCGGAAAATAGATGT-3’;
(4)将293T细胞培养于于24孔板中,汇合率约70%时。12h后每孔细胞转染0.1μg pNL4-3和1μg的含HIV抑制元件的质粒(pSUPER-RNAi),转染试剂为Lipofectamine 2000(InvitrogenCat.No 11668-027),方法参见该试剂盒的操作指南;
(5)转染48h后,收集细胞上清,用Murex HIV Antigen Mab(Cat.No.8E77-02)检测细胞中p24蛋白的含量。
我们目前初步获得以下s iRNA靶点可用于有效抑制HIV:
siP24:AGCCTGTCTCTCAGTACAATC(SEQ ID NO:2)
siPOL:ATCTTGTATTACTACTGCCCC(SEQ ID NO:3)
siVIF1:CAGGGTCTACTTGTGTGCT(SEQ ID NO:4)
siVIF2:TAATGCTGCTAGTGCCAAG(SEQ ID NO:5)
siTAT:TGTTCTGATGAGCTCTTCGTC(SEQ ID NO:6)
siGAG5:GTGCGAGAGCGTCGGTATT(SEQ ID NO:8)
siGAG120:GCTAGAACGATTCGCAGTT(SEQ ID NO:9)
siGAG1117:CCAGCTACCATAATGATAC(SEQ ID NO:10)
siGAG1438:GGAGCCGATAGACAAGGAA(SEQ ID NO:11)
siGAG161:CAGAAGGCTGTAGACAAAT(SEQ ID NO:12)
siGAG207:GACAGGATCAGAAGAACTT(SEQ ID NO:13)
siGAG263:TGCATCAAAGGATAGATGT(SEQ ID NO:14)
siGAG240:TACAATAGCAGTCCTCTAT(SEQ ID NO:15)
siGAG289:ACCAAGGAAGCCTTAGATA(SEQ ID NO:16)
siGAG290:CCAAGGAAGCCTTAGATAA(SEQ ID NO:17)
siGAG424:ATGGTACATCAGGCCATAT(SEQ ID NO:18)
siGAG586:AGCAGCCATGCAAATGTTA(SEQ ID NO:19)
siGAG768:CCCAGTAGGAGAAATCTAT(SEQ ID NO:20)
siGAG888:TGTAGACCGATTCTATAAA(SEQ ID NO:21)
siGAG816:AATAGTAAGAATGTATAGCCC(SEQ ID NO:22)
siGAG906:AACTCTAAGAGCCGAGCAA(SEQ ID NO:23)
siGAG1108:GTAACAAATCCAGCTACCA(SEQ ID NO:24)
siGAG1114:AATCCAGCTACCATAATGA(SEQ ID NO:25)
siGAG1115:ATCCAGCTACCATAATGAT(SEQ ID NO:26)
siGAG1031:AAGAAATGATGACAGCATGTC(SEQ ID NO:27)
siGAG1162:AAGACTGTTAAGTGTTTCA(SEQ ID NO:28)
siGAG1420:CAGAAGCAGGAGCCGATAG(SEQ ID NO:29)
siGAG1443:GGAACTGTATCCTTTAGCT(SEQ ID NO:30)
siPOL360:AGAAATCTGCGGACATAAA(SEQ ID NO:31)
siPOL2379:TGTAGCCAGTGGATATATA(SEQ ID NO:32)
siPOL401:GACCTACACCTGTCAACAT(SEQ ID NO:33)
siPOL1799:CAGCCAATAGGGAAACTAA(SEQ ID NO:34)
siPOL992:CAGACATAGTCATCTATCA(SEQ ID NO:35)
siPOL1072:GAGGAACTGAGACAACATC(SEQ ID NO:36)
siPOL2010:AGAGTTAGTCAGTCAAATA(SEQ ID NO:37)
siPOL195:CCTCGTCACAATAAAGATA(SEQ ID NO:38)
siPOL838:AGGAAGTATACTGCATTTA(SEQ ID NO:39)
siPOL1547:ACACTAATGATGTGAAACA(SEQ ID NO:40)
siPOL638:CTCCAGTATTTGCCATAAA(SEQ ID NO:41)
siPOL442:CAGATTGGCTGCACTTTAA(SEQ ID NO:42)
siPOL1871:TAACGGACACAACAAATCA(SEQ ID NO:43)
siPOL2736:GGAAAGAATAGTAGACATA(SEQ ID NO:44)
图2显示了上述不同siRNA靶点在与HIV感染性克隆质粒共转染实验对HIV p24蛋白表达的抑制效果。结果显示,这些siRNA靶点可用于有效抑制HIV。
优选的具体例子是如下可特异靶向HIV的siRNA的序列(命名为HIV-siRNA):
siP24:AGCCTGTCTCTCAGTACAATC(SEQ ID NO:2)
siPOL:ATCTTGTATTACTACTGCCCC(SEQ ID NO:3)
siVIF1:CAGGGTCTACTTGTGTGCT(SEQ ID NO:4)
siVIF2:TAATGCTGCTAGTGCCAAG(SEQ ID NO:5)
siTAT:TGTTCTGATGAGCTCTTCGTC(SEQ ID NO:6)
这些siRNA不会靶向任何人类的mRNA,且其与HIV mRNA的互补性为100%。在以下的实验中,我们以5个RNAi靶点(siP24、siPOL、siVIF1、siVIF2、siTAT)为例,用于构建慢病毒Xiada-1,构建方法见实施例2和实施例3。
实施例2.五种HIV-siRNA的同时表达:
miRNA是一类长度约为22核苷酸的调控小RNA。miRNA与mRNA的结合可导致蛋白编码基因的翻译抑制或mRNA的剪切。不同的miRNA基因通常集合成簇。因此我们在一个miRNA基因簇中将五个miRNA序列(miRNA17,18,19a,20,和19b-1)替换为HIV-siRNA序列以同时表达多个siRNA。我们全长合成了修改过的miRNA基因簇并将其插入慢病毒载体中。编码五个miRNA的合成基因的序列如下:
GCTGAAGATTGTGACCAGTCAGAATAATGTCGATTGTACTGAGAGATAGGTTAGTGATA
TGTGCATCTAGCCTGTCTCTCAGTACAATCAGCATTATGGTGACAGCTGCCTCGGGAAG
CCAAGTTGGGCTTTAAAGTGCAGGGCCTGCTGATGTTGAGTGCTTTTTGTTCATCTTGT
ATTACTACTGCCCCGTGAAGTAGATTAGCATCGGGGCAGTAGTAATATAAGATCTGGCA
TAAGAAGCTTATGTATTCATCCAATAATTCAAGCCAAGCAAGTATATAGGTGTTTTAAT
AGTTTTTGTTTGCAGTCCTCTGAGCACACAAGTAGACCTTGTACAAGAAGAATGTAGTC
AGGGTCTACTTGTGTGCTTGGTGGCCTGCTATTTCCTTCAAATGAATGATTTTTACTAA
TTTTGTGTACTTTTATTGTGTCGATGTAGAATCTGCCTGGTCTATCTCGAGTGACAGCT
TCTGTAGCACTAATGCTGCTAGTGCCAAGGTGTTTAGTTATCCTTGGCACTAGCAGTAT
TAGTACTGCTAGCTGTAGAACTCCAGCTTCGGCCTGTCGCCCAATCAAACTGTCCTGTT
ACTGAACACTGTTCTATGGGACGAAGAGCTCATTAGAATAGCTGTGTGATATTCTGCTG
TTCTGATGAGCTCTTCGTCCTGTGGTAGTGAAAAGTCTGTAGAAAAG(SEQ ID NO:7)包含了上述序列的慢病毒载体瞬时转染293细胞。通过引物延伸的方法检测五种HIV-siRNAs的表达。结果如图1所示。所有五种siRNA的表达都被检测到。因此,我们能够利用miRNA的基因结构在细胞中同时表达多个siRNA。
这里应该指出的是,其他的miRNA的骨架也可用于表达多个siRNA。
实施例3.慢病毒载体Xiada-1.
A.包装载体:慢病毒载体来源于HIV-1.慢病毒载体的体外包装需要几种HIV蛋白如HIV POL和GAG基因的产物。为了有效地抑制HIV-1的复制,分别设计了靶向HIV POL和GAG基因的siP24和siPOL。为了正常获得重组慢病毒Xiada-1,我们对包装载体上的POL和GAG基因进行了突变。因此,包装细胞中的POL和GAG基mRNA不会被siP24和siPOL所降解。序列突变情况如下所示。
GAG: --------GAUUGUACUGAGAGACAGGCU------------
突变为--------GACTGCACAGAACGTCAAGCA------------
POL: ---------GGGGCAGUAGUAAUACAAGAU-----------
突变为---------GGCGCTGTTGTTATCCAGGAC-----------
B.克隆载体:Xiada-1慢病毒包含了由mPGK启动子控制的MGMT(P140K)基因及一个由H1启动子控制的可表达五个HIV-siRNAs的表达框。也可以使用其他启动子。
C.慢病毒Xiada-1的构建和病毒原液制备过程慢病毒系统从Invitrogen公司购买,品名为:pLenti4/V5-DESTGateway Vector Kit,货号:V469-10。该系统共包含四个质粒分别为VSVG、pLP1、pLP2、pLenti4/V5-DEST,其中pLenti4/V5-DEST质粒用于克隆靶基因。
(A).构建转移载体质粒
我们对质粒pLenti4/V5-DEST进行了如下的改造得到构建重组慢病毒Xiada-1用转移载体质粒pDEST-MR:
(1)根据NCBI数据库中的基因信息合成以下四个基因片断,并克隆到pMD18-T载体上:
第一段为mPGK启动子(GI 57864178),5’端添加Cla I位点,3’端添加EcoR I位点;第二段为MGMT-P140K基因(GI 30584784),5’端添加EcoR I位点,3’端添加Sma I位点;第三段为H1启动子(GI56119188),5’端添加EcoR V位点,3’端添加Age I位点;第四段为microRNA基因(这里是实施例2所示的序列(SEQ ID NO:7),但是也可以是其他本发明的microRNA基因),5’端添加Age I位点,3’端添加Sma I位点。
(2)H1启动子经EcoR V、Age I酶切后回收,以T4DNA连接酶将该片段与经同样酶切的pLenti4/V5-DES质粒连接,构建得到pDEST-H;
(3)microRNA基因经Sma I、Age I酶切后回收,以T4 DNA连接酶将该片段与经同样酶切的pDEST-H质粒连接,构建得到pDEST-HR;
(4)MGMT-P140K基因经EcoR I、Sma I酶切后回收,以T4 DNA连接酶将该片段与经EcoR I、EcoR V酶切的pDEST-HR质粒连接,构建得到pDEST-HRM;
(5)mPGK启动子基因经EcoR I、Cla I酶切后回收,以T4DNA连接酶将该片段与经同样酶切的pDEST-HRM质粒连接,构建得到pDEST-MR。
(B).重组病毒Xiada-1的制备
(1)用氯化铯-溴化乙锭密度梯度离心法大量提取四种质粒VSVG、pLP1、pLP2、pDEST-MR(方法参见《分子克隆实验指南》,J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著,科学出版社,2002);
(2)293T细胞培养于DMEM培养基中(添加10%FBS,2mM L-glutamine,0.1mM MEM Non-Essential Amino Acids及1%penicillin-streptomycin);
(3)将293T细胞培养于直径9cm的细胞培养板上,汇合率约60%。12h后用磷酸钙转染方法介导10μg pLP1、10μg pLP2、10μg VSVG、20μg pDEST-MR共4种质粒进行共转染(方法参见《分子克隆实验指南》,J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著,科学出版社,2002);
(4)转染48h后收集细胞培养上清,0.45μm的滤膜过滤;用SW28转头(BECKMAN公司)以25,000rpm在4℃离心90mi n;
(5)弃去上清,加500μL PBS溶解沉淀;
(6)分装病毒溶液,贮存于-80℃备用。
实施例4.多种siRNA的联合治疗可防止变种抗性病毒的产生用Xiada-1转导T细胞,并测试转导后的T细胞对HIV的抗性。
(1)MT-4为人T淋巴细胞株,在体外能够支持HIV-1的感染和复制,可用于HIV-1体外培养。
(2)慢病毒Xiada-1以moi=10转导MT-4细胞,600g离心60min后换液;
对照病毒LV-GFP(可表达EGFP报告基因,无MGMT-P140K基因和RNAi元件)以moi=10转导MT-4细胞,600g离心60min后换液;
(3)转导后的MT-4细胞在37℃培养48h后,分别以HIV-1病毒(moi=1,0.1)进行感染实验,感染12h后换液培养;
(5)培养48h后用Murex HIV Antigen Mab(Cat.No.8E77-02)检测试剂盒检测细胞培养上清中p24蛋白的含量。
实验结果见图3和图4。图3显示,LV-GFP转导MT-4细胞后GFP基因的表达效率大于90%。图4显示了在HIV体外感染细胞模型中验证Xiada-1的抑制效果。
实验结果显示,我们使用的这种慢病毒载体可有效转导MT-4细胞(以同样病毒复数的LV-GFP对MT-4的细胞转导效率经流式细胞仪检测高于90%);在体外被这种慢病毒载体转导后的T细胞具有了抑制HIV病毒复制的能力,不支持HIV的复制。这表明在Xiada-1转导后的细胞中,抗HIV的siRNA在这些细胞中进行了表达,从而导致对HIV的感染产生抗性。在进行了4个月的培养后,我们没有发现任何可逃避siRNA的病毒变种,说明进行多种siRNA的联合治疗的确可防止变种抗性病毒的产生。
实施例5.Xiada-1改造后人造血干细胞在NOD/SICD小鼠重建耐BG/BCNU筛选的人造血/免疫细胞
(1)Xiada-1转导T细胞株Jurkat。BG/BCNU筛选显示约20%的转导后细胞在BG/BCNU处理后可存活下来。以不带MGMT(P140K)的对照慢病毒感染后的细胞则不能在BG/BCNU筛选中存活。这说明由Xiada-1导入的MGMT P140K可给靶细胞提供对BG/BCNU的抗性;
(2)用Ficoll-Paque密度离心从脐带血中获得粗提的造血干细胞,使用CD34+细胞分离试剂盒(Miltenyi MiniMACs,德国Miltenyi BiotecGmbH公司)富集CD34+细胞;
(3)Xiada-1转导CD34+细胞(以LV-GFP为对照慢病毒,LV-GFP可表达GFP基因,无MGMT-P140K基因和RNAi元件),细胞密度为4×105/mL,感染复数(MOI)为2。细胞在移入37℃5%CO2培养箱进行孵育前先在室温下600g离心30分钟;
(4)转导后造血干细胞通过静脉注射移植至NOD/SICD小鼠;
(5)分别在回输后第一天、第3周和第6周给予化疗药治疗,剂量BG 15μg/g体重,BCNU 5μg/g体重。
(6)在第9周采集小鼠骨髓和血样提取PBMC对体内人造血干细胞分化的人造血/免疫细胞进行检测。
结果表明:慢病毒载体可有效转导人CD34+细胞(以同样病毒复数的LV-GFP对人CD34+细胞的转导效率经流式细胞仪检测高于40%);MGMTP140K可给靶细胞在体外和体内提供对BG/BCNU的抗性;Xiada-1改造后的人造血干细胞可在NOD/SCID小鼠体内重建出耐化疗药物BG/BCNU筛选的人造血和免疫组织细胞。
图5显示,从脐带血中分离人CD34+细胞,纯度高于95%。
图6显示,LV-GFP转导人CD34+细胞后GFP基因的表达效率高于40%。
表1显示了anti-mouse CD8、anti-human CD45和anti-human CD4联合检测移植9周后NOD/SCID小鼠PBMC。结果表明,Xiada-1改造后的人造血干细胞可在NOD/SCID小鼠体内重建出耐化疗药物筛选的人造血组织细胞和免疫组织细胞。
表1.anti-mouse CD8、anti-human CD45和anti-human CD4联合检测移植8周后NOD/SCID小鼠PBMC。Xiada-1改造后的人造血干细胞可在NOD/SCID小鼠体内重建出耐化疗药物筛选的人造血组织细胞和免疫组织细胞。
LV-GFP | Xiada-1 | human | control | |||
% | MnX | % | MnX | % | MnX | |
PE-anti-mouse CD8 | 1.95 | 2.67 | 2.61 | 3.81 | - | - |
FITC-anti-human CD45 | 0.21 | 2.82 | 32.3 | 8.7 | - | - |
FITC-anti-human CD4 | 1.48 | 2.89 | 6.23 | 4.79 | 10.0 | 3.96 |
实施例6.在体内同时表达多个HIV-siRNA
在NOD/SCID小鼠体内移植入被Xiada-1或一个对照慢病毒(其与Xiada-1相似但不表达HIV-siRNA)转导后的人类原代CD34+祖细胞。经过三轮BG/BCNU筛选后,从小鼠中分离出T细胞、B细胞和巨噬细胞,分析细胞中五种HIV-siRNAs的表达情况。我们在移植了Xiada-1转导后的人CD34+细胞的小鼠中检测到了五种siRNA的表达,而在移植了对照病毒转导的细胞的小鼠中未能检测到。通过引物延伸的方法检测siRNA的结果见图7。
图7显示了在移植了经Xiada-1转导的人造血干细胞的NOD/SCID小鼠中分离的人T细胞、B细胞、巨噬细胞中的五种siRNA的同时表达。Xiada-1编码的siRNAs的表达通过引物延伸进行检测。
实施例7.HIV患者的治疗
A.外周血造血干细胞经改造后自体移植治疗:
1.治疗前准备:
(1)患者接受全面体检并检查详细病史,参照临床移植病例入选标准确定是否可进行移植治疗,例如:年龄<65岁,体力状况ECOG I级或Karnofsky评分≥80分,无心肺肝肾等重要脏器功能损害,骨髓造血功能正常,无严重的药物过敏史,无严重的精神病史。
(2)可提取测定患者体内所感染HIV毒株的关键区段,用于治疗参考。
(3)患者可接受合适的抗HIV药物治疗,在短期内降低外周血中的病毒载量。(检测外周血中的HIV RNA量和p24蛋白的活性)
2.外周血造血干细胞经改造后自体移植治疗
(1)外周血造血干细胞动员、采集方案:
方案1:患者接受重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)皮下注射,剂量5μg/kg,动员5天后分别在0d和+1d用血细胞分离机采集供者外周血单核细胞(PBMC)。
方案2:患者采用MD-Ara-c(中剂量阿糖胞苷)动员,剂量为1.0~1.2g·m-2·d-1×3d,待患者外周血WRC<1.0×109/L并开始回升时用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)皮下注射,剂量为5μg·kg-1·d-1。使用5~8d,当WBC>5.0×109/L时采集,每天1次,连续2d,每次处理血量为12000mL以上,采集的PBMC悬液加入肝素钠1250μ后,直接放4℃冰箱保存。
方案3:患者给予粒细胞集落刺激因子(G-CSF)300μg/q 12h,皮下注射,连用5~6d。第5天开始用血细胞分离仪进行单采,平均2(1~3)次。
(2)造血干细胞富集和体外改造
使用CD34+细胞分离试剂盒(Miltenyi MiniMACs,德国MiltenyiBiotec GmbH公司)从PBMC中富集CD34+细胞。用带有MGMT-P140K基因表达元件和microRNA表达元件的慢病毒载体(如Xiada-1)转导CD34+细胞,细胞密度为4×105/mL,感染复数(MOI)为2。细胞在移入37℃5%CO2培养箱进行孵育前先在室温下600g离心30分钟。
(3)患者的预处理方案和改造后造血干细胞移植:
MAC方案1:马法兰(Melphalan)180mg·m-2,一次顿服(-5天),阿糖胞苷(Ara-c)2g·(-5天);阿糖胞苷1.5g·(-4天);环磷酰胺(Cy)60mg·kg-1·d-1·(-4天,-3天);预处理结束后72小时输注改造后的造血干细胞。
MAC方案2:马法兰100mg·m-2一次顿服(-2天),阿糖胞苷1.5g·m-21次(-2天),环磷酰胺50mg·kg-1·d-1(-2天,-1天),两次环磷酰胺之间间隔12~16小时,预处理结束后24小时,回输改造后的造血干细胞。
非清髓方案:单用Bu(白消安):剂量4mg/(kg·d)×4d。
Bu为主,加用阿糖胞苷和(或)HHT(高三尖杉酯碱):如Bu 3mg/(kg·d)×3d加HHT 5mg/d×3d加Ara-c 1g/(m2·d)×3d;或Bu 4mg/(kg·d)×3d加Ara-c 2g/(m2·d)×3d。
联合化疗:三尖杉酯碱+阿糖胞苷(HA方案)、阿克拉霉素+阿糖胞苷(AA方案)等标准联合化疗方案。
清髓性方案:TBI(全身照射)加化疗:TBI剂量9~10Gy,化疗药包括环磷酰胺20mg/kg等,可依据临床情况在此基础上加用Ara-C1~4g/m2或VP16(依托泊甘)300mg。
Bu/Cy为主,或加用去甲氧柔红霉素、Ara-C:其中Bu 4mg/(kg·d)×4d,去甲氧柔红霉素20mg/m2,Cy及Ara-C剂量同TBI加化疗方案。
(4)移植后并发症防治:
住层流病房,无菌饮食,口服肠道不吸收的抗生素,用美斯钠(剂量为环磷酰胺量的120%~160%);碱化尿液,强迫性利尿预防出血性膀胱炎;预防VOD(肝静脉阻塞综合症)用肝素钠2500u,每天2次,静滴,从化疗开始直到血小板计数(BPC)<40×109/L;预防霉菌感染,伊曲康唑100~200mg/d,服用到造血恢复;当外周血WBC<1.0×109/L,或体温>37.5℃时,预防性使用抗生素;当患者WBC<1.0×109/L时,开始皮下注射G-CSF,剂量为5μg·kg-1·d-1,或加用GM-CSF 2.5g·kg-1·d-1,直到造血恢复。
(5)移植后治疗:
患者移植后2~4周内,当WBC>3.0×109/L,PBC>50×109/L时,采用IL-2治疗,IL-2剂量200万u·d-1×5d,静脉点滴,休息一周后继续用IL-250万u·d-1×10d,静脉点滴,用IL-2前后均检查CD4、CD8及两者比值。
移植后3个月内进行一次BCNU(7~10mg/Kg)结合O6-BG(六氧苯甲基鸟嘌呤)(20~30mg/kg)的化疗,以后每2~3个月维持BCNU(7~10mg/Kg)结合O6-BG(20~30mg/Kg)的化疗一次。
3.移植治疗后疗效检测:
全面检查患者的血象指标,观察造血恢复情况;
定期检查患者的骨髓象;
定期对患者进行体检;
分离外周血PBMC,检测MGMT和RNAi元件的表达;
检测外周血中HIV检测指标(HIV RNA量和p24蛋白的活性)。
B.外周血造血干细胞经改造后异体移植治疗:
1.治疗前准备:
(1)根据配型情况,选择合适的供体或造血干细胞来源(如骨髓库、脐血库等);
(2)其余情况参照前面自体移植方案。
2.外周血造血干细胞经改造后异体移植治疗
(1)供体外周血造血干细胞动员/采集方案
方法基本参照前面自体移植方案。
(2)造血干细胞纯化和体外改造
方法基本参照前面自体移植方案。
(3)患者(受体)的预处理方案和改造后造血干细胞移植
方法基本参照前面自体移植方案。
(4)移植后并发症防治
GVHD(移植物抗宿主病)的预防。非清髓预处理类型可采用单用环孢菌素A(CsA)方案:即-1d开始应用CsA 2mg/(kg·d)静脉滴注,可进食后改为5~8mg/kg口服,+100d后每两周减5%。若出现II度以上GVHD则加量或加用甲泼尼龙80mg/d,症状减轻后改为泼尼松30~60mg/d,至症状消失再减量,或维持原量并加用MMF(霉酚酸酯)1.5~2.0g/d;部分患者后期可以他可莫司(FK506)替代CsA。清髓性PBSCT类型:可采用CsA加短程甲氨蝶呤(MTX)方案,CsA用法同上,MTX15mg/m2·(+1d),10mg/m2·(+3,+6,+11d)。
其余情况参照前面自体移植方案。
(5)移植后治疗
方法基本参照前面自体移植方案。
3.移植治疗后疗效检测
方法基本参照前面自体移植方案。
参考文献
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缩写:
HSCs:造血干细胞.
MGMT:O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶基因
MGMT(P140K):MGMT突变体,其140位的脯氨酸被赖氨酸取代
BG:六氧苯甲基鸟嘌呤
BCNU:卡莫司汀
siRNA:小干扰RNA
miRNA:微小RNA
本领域技术人员应当明了,尽管为了举例说明的目的本文中描述了本发明的具体实施方案,但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此,本发明的具体实施方案和实施例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。
Claims (22)
1.可表达多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的表达盒,其包含由共同的启动子(例如一个或几个启动子)控制的、多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列。
2.权利要求1的表达盒,其中所述编码核酸序列是通过在一个miRNA基因簇中将多个miRNA序列(例如miRNA17,18,19a,20,和19b-1)替换为多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列而获得的。
3.一种重组表达载体,其可表达:(1)MGMT(P140K)基因;和(2)多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
4.权利要求3的重组表达载体,其包含(1)MGMT(P140K)基因,该基因与表达控制序列可操作地连接,使得该基因可在动物细胞(特别是哺乳动物细胞,如人细胞,优选造血干细胞)中表达;和(2)多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列,这些编码核酸序列与表达控制序列可操作地连接,使得可在动物细胞(特别是哺乳动物细胞,如人细胞,如哺乳动物干细胞,优选造血干细胞)中表达所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
5.权利要求4的重组表达载体,其中所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列由共同的启动子控制表达。
6.权利要求4或5的重组表达载体,其中所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列是通过在一个miRNA基因簇中将多个miRNA序列(例如miRNA17,18,19a,20,和19b-1)替换为多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列而获得的。
7.权利要求3-6任一项的重组表达载体,其是质粒载体或病毒载体,例如逆转录病毒载体,包括慢病毒载体。
8.权利要求7的重组表达载体,其是逆转录病毒载体,例如慢病毒载体(如慢病毒Xiada-1)。
9.一个改造后的用于生产逆转录病毒载体(例如慢病毒载体,如慢病毒Xiada-1)的包装载体(如包装质粒),其含有突变后的POL和GAG基因,特别地,POL和GAG基因可分别具有如下突变:
GAG: --------GAUUGUACUGAGAGACAGGCU------------
突变为--------GACTGCACAGAACGTCAAGCA------------
POL: ---------GGGGCAGUAGUAAUACAAGAU-----------
突变为---------GGCGCTGTTGTTATCCAGGAC-----------
10.转化或转染或转导了权利要求3-8任一项的重组表达载体的分离的细胞。
11.转化或转染或转导了权利要求9的包装载体(如包装质粒)的分离的细胞。
12.一种改造的细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞,优选干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞),其可表达:(1)MGMT(P140K)基因;和(2)多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
13.权利要求12的改造的细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞,优选干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞),其在基因组中或者基因组外携带(1)MGMT(P140K)基因,该基因与表达控制序列可操作地连接,使得该基因可在该细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞,优选干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞)中表达;和(2)多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列,这些编码核酸序列与表达控制序列可操作地连接,使得可在该细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞,优选干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞)中表达所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸。
14.权利要求13的细胞,其中所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列由共同的启动子控制表达。
15.权利要求13或14的细胞,其中所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列是通过在一个miRNA基因簇中将多个miRNA序列(例如miRNA17,18,19a,20,和19b-1)替换为多个siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列而获得的。
16.制备权利要求12-15任一项的细胞的方法,包括用权利要求3-6的重组表达载体转化或转染或转导细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞,优选干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞)。
17.权利要求16的方法,包括用权利要求8的重组表达载体转导哺乳动物优选人的干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞。
18.权利要求16或17的方法,其中细胞是分离的,例如从感染HIV的患者或者正常个体分离的,或者是在体的。
19.治疗HIV感染或者HIV患者的方法,包括(1)按照权利要求16-18任一项的方法制备权利要求12-15任一项的哺乳动物优选人的细胞(优选干细胞,最优选造血干细胞,如CD34+细胞),然后将其移植到HIV感染患者体内;和(2)进行适当的BG/BCNU治疗。
20.权利要求12-15任一项的细胞(包括动物例如哺乳动物优选人的细胞,优选干细胞,特别是造血干细胞,如CD34+细胞)在制备治疗HIV感染或者HIV患者中的药物中的用途。
21.前述任一项权利要求,其中所述MGMT(P140K)具有SEQ IDNO:1所示的序列或与之具有至少70%(优选至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列;与MGMT(P140K)相互独立地,所述siRNA是靶向HIV的,并包含如下序列或与其具有至少70%(优选至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列中的任何一个或几个序列:SEQ ID NO:2-6和8-44;
优选地,所述siRNA包括从上述序列中选择的至少2个序列,优选3个、4个序列,更优选5个序列,或者5个以上的序列,或者由从上述序列中选择的至少2个序列,优选3个、4个序列,更优选5个序列,或者5个以上的序列组成;
特别优选的是,所述多个(特别是靶向HIV的)siRNA和/或miRNAs和/或核酶和/或反义寡核苷酸的编码核酸序列包含或由SEQ ID NO:7所示的序列或者与SEQ ID NO:7具有至少70%(优选至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列组成。
22.核酸分子,其特征在于
(1)SEQ ID NO:1-44中任何一个所示的序列,或者
(2)与(1)中序列具有至少70%(优选至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列,或者
(3)在严紧条件下或者高度严紧条件与(1)中序列能够杂交的核苷酸序列,或者
(4)上述序列的片段或者互补序列。
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