WO2003080670A1 - Anticorps reconnaissant des celllules hepatiques humaines proliferatives, cellules hepatiques humaines proliferatives et cellules hepatiques humaines fonctionnelles - Google Patents

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cells
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human hepatocytes
human liver
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Chise Mukaidani
Katsutoshi Yoshizato
Chihiro Yamasaki
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to an antibody that recognizes proliferating human hepatocytes and human hepatocytes. More specifically, the invention of this application relates to a monoclonal antibody useful for specifically recognizing human hepatocytes having clonal proliferative capacity and isolating proliferative hepatocytes from a human hepatocyte population, and use of this antibody.
  • Proliferating human hepatocytes isolated by the method a method for inducing differentiation of the proliferating human hepatocytes into differentiated hepatocytes, a functional human hepatocyte induced to differentiate by this method, and the functional human hepatocytes It relates to hepatocyte kits and extracorporeal artificial livers. '
  • the liver has over 500 different kinds of unique functions.
  • the main functions of the liver include plasma protein synthesis and secretion, glycogenesis and blood glucose regulation by glycogen metabolism, lipid synthesis, urea synthesis, bile synthesis and detoxification.
  • Many of the substances taken into the body are metabolized in the liver.
  • many chemical substances have been synthesized and released to the environment. Elucidating how these substances affect the human body individually or in combination is extremely important for society, and it is important to evaluate the effects of these chemical substances on the human body. Toxicity testing for function is needed.
  • mice, rats, rabbits, dogs, monkeys, etc. are used for safety testing and drug metabolism testing of chemical substances including drug candidates.
  • toxicity studies and safety tests using animals are obligatory before entering the phase 1 study for rabbits, but this requires a great deal of time and effort.
  • the amount of investment will be enormous.
  • substances that were not toxic in animal experiments are toxic to rabbits, and vice versa. Therefore, the development of many drug candidates has been discontinued after entering the Phase 1 study in humans, and because of the high toxicity in animal experiments, the development was discontinued before entering the clinical study. In many cases, there are many cases where no toxicity is observed in humans.
  • the inventors of this application isolated small hepatocytes having clonal proliferative ability from normal hepatocytes isolated from human liver, primary culture of the small hepatocytes, and further, the cultured liver.
  • Invented a method for proliferating hepatocytes by subculturing cells, and obtained a patent (Japanese Patent Laid-Open No. 08-112092; Japanese Patent No. 3266766; US Pat. No. 6,004,810, Japanese Patent Laid-Open No. 10-179 148: Japanese Patent No. 32 1 1941, Japanese Patent Laid-Open No. 7-274951; Japanese Patent No. 3 157984, Japanese Patent Laid-Open No. 9-3 13172; Japanese Patent No. 3014322).
  • YamasaKi, Hajime Sato, and Katsutoshi Yoshizato Heterogeneity of growth potential of adult rat hepatocytes in vitro.Hepatology 31: 65-74, 2000. Snigeru Katayama, Chise Tateno, Toshimasa Asahara, and
  • hepatocytes as a substitute for human liver function or as a material for hybrid type artificial liver.
  • the small hepatocytes having proliferative ability can be used in addition to El Torei Yuichi. It can also be collected using a cell fractionator such as FACS or FACS, but the cells obtained by these means are not only proliferating hepatocytes but also other cells.
  • non-liver parenchymal cells such as stellate cells contained in the supernatant by low-speed centrifugation. Therefore, there has been a demand for means capable of obtaining substantially only proliferative human hepatocytes.
  • the invention of this application has been made in view of the circumstances as described above, and an object thereof is to provide a monoclonal antibody that specifically recognizes proliferating human hepatocytes.
  • Another object of the invention of this application is to provide a method for isolating proliferative human hepatocytes and proliferating human hepatocytes obtained by this method.
  • the invention of this application provides a method for inducing differentiation of proliferative human hepatocytes into functional human hepatocytes, functional human hepatocytes obtained by this method, and utilization of functional human hepatocytes. It is an issue.
  • This application provides a monoclonal antibody that specifically recognizes proliferating human hepatocytes as a first invention for solving the above-mentioned problems.
  • the first invention An example of a monoclonal antibody is a monoclonal antibody produced by the hybridoma cell Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP-8334).
  • FERM BP-8334 a monoclonal antibody produced by the hybridoma cell Mouse-Mouse hybridoma K8223
  • FERM BP-8334 a monoclonal antibody produced by the hybridoma cell Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP-8334).
  • a third invention there is provided a method for separating proliferative baboon hepatocytes characterized by separating cells recognized by the monoclonal antibody of the first invention from a human hepatocyte population.
  • proliferative human hepatocytes isolated by the method of the third invention are provided.
  • a method for inducing differentiation of proliferative human hepatocytes of the fourth invention comprising the following means:
  • HNF4 Hepatocyte nuclear factor 4
  • a method for inducing differentiation of proliferative human hepatocytes characterized by performing at least one of the above.
  • a functional human hepatocyte induced to differentiate by the method of the fifth invention As a sixth invention, there is provided a cell kit comprising the functional human hepatocyte of the sixth invention. Furthermore, as an eighth invention, there is provided a hybrid type artificial liver filled with the functional human hepatocytes of the sixth invention.
  • proliferating human hepatocytes refers to human hepatocytes that form colonies as a population of single cell types under culture conditions (in vitro) and proliferate to increase the colonies. Means.
  • the growth is referred to as “clonal growth” in that the colony component cell is a single species.
  • such cells are cells that can be further increased in cell number by subculture.
  • “functional human hepatocyte” means a cell having the same function as a human normal hepatocyte in the human body (in vivo) or in primary culture (in vitro). Means that at least “albumin expression level” and “cytochrome P450 activity” are substantially equivalent to human normal hepatocytes.
  • Other terms and concepts in the present invention are defined in detail in the description of the embodiments and examples of the invention.
  • Figure 1 shows growth curves when hepatocytes collected from patients of various ages are cultured.
  • Figure 2 is a phase-contrast microscope image of cultured human hepatocytes used as antigens to make monoclonal antibodies.
  • Fig. 3 is an image obtained by observing the reactivity of Hypridoroma K8223 culture supernatant in human liver tissue by fluorescent antibody staining.
  • Figure 4 shows the FACS analysis of the reactivity of the hybridoma No. 23 culture supernatant on the surface of chick liver cells immediately after separation.
  • Fig. 5 shows phase contrast microscopic images of the cell population (R2) and the unreacted cell population (R3) that reacted with the hybridoma No.
  • FIG. 6 shows the results of FACS analysis of the reactivity of Hachibri Doma No. 23 culture supernatant on the surface of subcultured human hepatocytes.
  • Fig. 7 shows phase contrast microscopic images of the first day (upper) and the seventh day (lower) of hepatocytes cultured in monolayer culture and spheroid culture.
  • FIG. 8 is a graph showing the expression levels of human P450 gene or GAPDH gene in hepatocytes immediately after separation from human liver, subcultured hepatocytes in monolayer culture, and hepatocytes cultured in spheroids.
  • FIG. 8 is a graph showing the expression levels of human P450 gene or GAPDH gene in hepatocytes immediately after separation from human liver, subcultured hepatocytes in monolayer culture, and hepatocytes cultured in spheroids.
  • FIG. 9 is a graph showing changes in albumin secretion over time in hepatocytes cultured in monolayer culture and spheroid culture.
  • FIG. 10 is a graph showing the expression level of the human P450 gene in cultured human cells introduced with the human HNF4 gene.
  • the monoclonal antibody of the first invention is characterized by specifically recognizing human liver cells that proliferate while forming colonies.
  • this monoclonal The antibody is characterized by specifically recognizing human hepatocytes that proliferate while forming colonies and can differentiate into functional human hepatocytes.
  • “specifically recognizes” means that it binds only to the above-mentioned human hepatocytes and does not bind to other cells and / or human hepatocytes not having the above characteristics.
  • the monoclonal antibody of the first invention can be obtained by a known method from the hybridoma cell of the second invention of this application.
  • ⁇ hybridoma cells and monoclonal antibodies are known monoclonal antibody production methods (“monoclonal antibodies”, Akira Nagamune, Hiroaki Terada, Yodogawa Shoten, 1990; “Monoclonal Antibody” James W. Goding, third edition, Academic According to Press, 1996), for example, it can be produced by the following procedure.
  • the mammal is immunized with an immunogen containing normal human hepatocytes that has been subcultured, and the animal is sufficiently boosted as necessary to sufficiently sensitize the animal. Subsequently, antibody-producing cells (lymph cells or spleen cells) are removed from the animal, and fusion cells of this with the Myechima (myeloma) cell line are obtained.
  • a hybridoma cell can be obtained by selecting and culturing a cell that produces the desired monoclonal antibody from these fused cell lines.
  • Human hepatocytes isolated from normal liver tissue with collagenase are subcultured and used as an immunogen. It is preferable to use human hepatocytes isolated from human liver tissue that can be passaged 4 times or more, preferably 6 times or more, for example, 15 years old or younger. b) Animal immunity
  • mice or rats as immunized animals. That's right.
  • mice 3 ⁇ 4 and rat strains actually used there are no particular restrictions on the mouse 3 ⁇ 4 and rat strains actually used.
  • rats for example, Low, Lewis ⁇ Spraque, Daweley, ACL BN, Fischer, etc.
  • the BALB / c strain is particularly preferable for mice and the low strain for rats is particularly preferable.
  • the age at the time of immunization of these mice or rats is preferably 5 to 12 weeks of age.
  • the animal can be immunized by administering about 10 4 to 10 8 passaged human hepatocytes as an immunogen intradermally or intraperitoneally.
  • the immunogen administration schedule varies depending on the type of animal to be immunized, individual differences, etc.
  • the administration interval is preferably 1 to 2 weeks.
  • Spleen cells or lymphocytes containing antibody-producing cells are aseptically removed from the immunized animal 1 to 5 days after the last immunization day of the above administration schedule. Separation of antibody-producing cells from these spleen cells or lymphocytes can be performed according to a known method.
  • the myeloma cells are not particularly limited and can be appropriately selected from known cell lines. However, in consideration of the convenience in selecting a hybridoma from the fused cells, it is preferable to use an HGPRT (Hpoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) deficient strain that has been established for the selection procedure.
  • HGPRT Hydroxanthine-guanine phosphoribosyl transferase
  • X63-Ag8 (X63), NS 1-Ag4 / l (NS-l), P3X63-Ag8.Ul (P3Ul), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2 / 0-Agl4 ( SP2 / 0), MPCl 1-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S 149 / 5XXO, BU.l, etc., rat-derived 210.RSY3.Ag.1 2.3 ( ⁇ 3), etc.
  • U266AR (SKO-007), GM 1500 ⁇ GTG-A12 (GM 1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2), 8226AR / NIP4-1 (NP41), etc.
  • Fusion of antibody-producing cells and myeloma cells can be appropriately performed according to a known method under conditions that do not extremely reduce cell viability.
  • a chemical method in which antibody-producing cells and myeloma cells are mixed in a high-concentration polymer solution such as polyethylene glycol, a physical method using electrical stimulation, or the like can be used.
  • the selection of the fused cells and the non-fused cells is preferably performed by, for example, a known HAT (hypoxanthine / aminopterin / thymidine) selection method.
  • HAT hyperxanthine / aminopterin / thymidine
  • This method is effective when obtaining fusion cells using HGPRT-deficient myeloma cells that cannot survive in the presence of aminopterin. That is, by culturing unfused cells and fused cells in a HAT medium, only fused cells having resistance to aminobuterin can selectively remain and proliferate.
  • HAT hyperxanthine / aminopterin / thymidine
  • Screening of hybridoma cells producing the desired monoclonal antibody can be performed by known enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), fluorescent immunoassay, etc. It can be carried out. Such screening provides a group of eight hybridoma cells that each produce monoclonal antibodies that specifically bind to highly proliferating human hepatocytes.
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescent immunoassay etc. It can be carried out.
  • Such screening provides a group of eight hybridoma cells that each produce monoclonal antibodies that specifically bind to highly proliferating human hepatocytes.
  • the hybridoma cells are cloned by a known method such as methylcellulose method, soft-garose method, limiting dilution method, and used for antibody production.
  • a known method such as methylcellulose method, soft-garose method, limiting dilution method, and used for antibody production.
  • the hybridoma cells obtained by the method as described above can be stored in a frozen state in liquid nitrogen or in a freezer of -803 ⁇ 4 or less.
  • This application provides Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP-8334) as a specific example of such a hybridoma cell.
  • a monoclonal antibody that specifically binds only to proliferating human hepatocytes can be obtained by culturing the hybridoma cells prepared in 1 above by a known method.
  • the culture is performed in a medium having the same composition used in the cloning method described above.
  • the culture is also possible to inject intraperitoneal mice with eight hybridoma cells and collect the monoclonal antibody from the ascites.
  • the monoclonal antibody thus obtained can be purified by, for example, ammonium sulfate salting out method, gel filtration method, ion exchange chromatography method, affinity chromatography method and the like.
  • a hyperidoma cell the above-mentioned hyperidoma cell Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP-8334) and as a specific example of a monoclonal antibody, a high-pridoma cell Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM A monoclonal antibody produced by BP-8334) is provided.
  • a third invention is a method for separating proliferative human hepatocytes, characterized in that cells recognized by the monoclonal antibody of the first invention are separated from a human hepatocyte population.
  • the human hepatocyte population is, for example, a primary cell that has been isolated from a human liver by a known method such as collagenase perfusion method and placed under culture conditions, or a subculture cell obtained by subculturing the primary cell 1 to 8 times. It can be.
  • this human hepatocyte population is a patented invention by the inventors of this application (Japanese Patent Laid-Open No. 08-112092; Japanese Patent No. 3266766; US Pat. No. 6,004,810, Japanese Patent Laid-Open No.
  • Proliferating human hepatocytes can be separated by contacting the aforementioned human hepatocyte population with a monoclonal antibody labeled with an enzyme, a radioisotope, a magnetic bead, or a fluorescent dye, and isolating cells that emit a labeled signal. It can be carried out. in this way, Proliferative human hepatocytes can be obtained in an almost intact state because there is almost no cell load in the centrifuge or cell fractionator.
  • the enzyme used as a label is not particularly limited as long as it satisfies conditions such as a large turnover number, stability even when bound to an antibody, and specific coloring of a substrate.
  • Enzymes used in normal EIA such as peroxidase,] 3-galactosidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase, acetylcholine esterase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, malate dehydrogenase, etc. It can also be used. Enzyme inhibitors and coenzymes can also be used. These enzymes and antibodies can be bound by a known method using a crosslinking agent such as a maleimide compound. As the substrate, a known substance can be used according to the type of enzyme used.
  • peroxidase when peroxidase is used as an enzyme, 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine can be used, and when enzyme rifphosphatase is used as an enzyme, paranitrophenol or the like can be used.
  • radioactive isotopes those used in normal RIA such as i 25 I and 3 H can be used.
  • fluorescent dye those used in a usual fluorescent antibody method such as fluorescent isothiocyanate (FITC) or tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) can be used.
  • the detection of the labeled signal is performed by adding a substrate that develops color due to enzymatic action, and optically measuring the amount of degradation of the substrate to determine the enzyme activity.
  • the amount of antibody is calculated from the comparison with the standard value.
  • radioisotopes measure the radiation dose emitted by the radioisotopes using a scintillation counter or the like.
  • the amount of fluorescence may be measured with a measuring device combined with a fluorescence microscope.
  • This proliferating human hepatocyte actively colonizes and forms colonies under culture conditions, and is also a cell capable of differentiating into functional human hepatocytes.
  • Such functional human hepatocytes can be induced to differentiate from proliferating human hepatocytes by the method of the fifth invention.
  • Proliferating human hepatocytes can also be obtained by the method for obtaining human hepatocytes used as an immunogen in the production of the monoclonal antibody of Example 1. However, in the case of the method of Example 1, non-proliferating cells may also be included.
  • the method using the monoclonal antibody of the present invention is an excellent method in that only proliferative human hepatocytes can be separated.
  • the method of the fifth invention is characterized by performing the following means (a) or (b), or (a) and (b).
  • “Sufu:!: Royde” means an aggregate of cells in which several hundred cells gather to form a tissue structure. Specifically, cells are made into a three-dimensional cell population by the method shown below, and this is cultured in animal cell culture medium.
  • Known methods for obtaining spheroids include Matrigel TM (Matrigel TM Matrix, Becton's Dickinson), positive charge incubator (Primary, Becton, Dickinson), U-bottom incubator (Spheroid 'MS? 0 0 9 6 S, Sumilon) or rotating culture in a roller potor. The culture may be performed for about 6 to 15 days.
  • HNF4 hepatocyte nuclear factor 4
  • Hepatocyte nuclear factor 4 is a protein related to transcription of genes that express specific functions in hepatocytes (for example, Bell'GI et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA). 88 (4), 1484-1488, 1991), and the cDNA sequence of human HNF4a is known (eg, GenBank / NM-000457).
  • the cDNA sequences of HNF4b (GenBank / X87871) and HNF4c (GenBank / X87872) are also known.
  • mouse HNF4 cDNA GenBank / NM-008261
  • rat HNF4 cDNA GenBank / X57133
  • HNF4 cDNAs were recombined into a eukaryotic expression vector, and this expression vector was subjected to known methods such as electroporation, calcium phosphate method, ribosome method, DEAE dextran method, etc.
  • the HNF4 gene can be introduced by introducing it into cells.
  • the HNF4 gene can also be introduced by a method based on gene therapy (ex vivo method) using hollow nanoparticles presenting biorecognition molecules, retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, etc. Can.
  • HNF4 gene cDNA can be obtained by screening a cDNA library such as human using a probe DNA prepared based on these known sequences.
  • the obtained cDNA can be used for gene amplification such as PCR (Polymerase Chain Reaction), NASBN (Nucleic acid sequence based amplification), TMA (Transcription-mediated amplification) and SDA (Strand Displacement Amplification).
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • NASBN Nucleic acid sequence based amplification
  • TMA Transcription-mediated amplification
  • SDA String Displacement Amplification
  • a sufficient amount of cDNA can also be obtained by RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR), which uses a set of primers made based on known sequences and uses mRNA isolated from mammalian cells as a saddle type. Can do.
  • the same level of functionality as human normal hepatocytes in human body or primary culture, specifically, sufficient expression of albumin and cytochrome P450 6 functional hepatocytes of the invention can be obtained.
  • the functional baboon hepatocytes by differentiation induction described above are subcultured cells obtained by the same method as that for preparing human hepatocytes as an immunogen in Example 1 described later, for example.
  • Hepatocytes that can be subcultured after forming colonies may also contain non-proliferating cells.
  • a human hepatocyte kit (7th invention) that can be used for drug metabolism tests, safety tests, etc.
  • Type artificial liver (8th invention) is provided.
  • the module used for the eight-hybrid artificial liver (a module filled with human hepatocytes) can be used to recover useful substances produced by human hepatocytes.
  • hepatocyte kits are known depending on the cell type and application, and those skilled in the art will be able to use the human hepatocytes of the sixth invention and the configuration of known cell kits to The cell kit of the invention can be easily prepared.
  • the structure of a module or hybrid type artificial organ is also known. An artificial liver or the like can be easily produced.
  • a cell dispersion was obtained from human liver tissue by collagenase perfusion. The cell dispersion was centrifuged at a low speed (50 g , 2 minutes), and the precipitated fraction was added to Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with fetal calf serum, baboon serum, EGF, nicotine amide, and sustained-active vitamin C. And mixed culture with Swiss 3T3 cells treated with mitomycin C. Swiss 3T3 cells were added every 10 days. From about day 7 of culture, colonies of human hepatocytes were observed. Hepatocytes grown in confluence were passaged using EDTA / Trypsin.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the spleen was extracted from one immunized animal and the spleen cells were collected.
  • the spleen cells and mouse myeloma cells (cell name NS-1) were cell-fused, seeded in a 372-well plate and cultured.
  • the reactivity of the obtained fusion cell culture supernatant to the antigen was measured by ELISA.
  • the measurement was performed by the following method. Subcultured hepatocytes used as antigens were seeded on a 96-well plate, cultured, washed with PBS, dried and stored at -80, and the culture supernatant was reacted. Next, the enzyme-labeled anti-mouse IgG or anti-mouse IgM antibody was reacted, and a substrate was added to develop color, and the absorbance was measured. As a result, the average absorbance of the 372 samples of fused cells was 0.149 (SD: 0.099), of which samples with an absorbance of 0.20 or more (81 samples, approximately 20%) were positive.
  • the reactivity of the culture supernatant after scale-up to the antigen was measured by ELISA similar to the primary screening, and positive samples and 88 samples were selected. Furthermore, the reactivity of these samples in tissues was examined by tissue staining. Among them, the human liver immediately after isolation of the cell culture of hepatocytes, the sample containing the hybridoma that specifically reacts with hepatocytes in the portal vein region, or the clone culture supernatant obtained by cloning from it. The reactivity to cells was examined. With regard to Hipridoma culture supernatant No.
  • hepatocytes before sorting were cultured in the same manner. As a result, colony formation was observed in the pre-sorted hepatocytes from day 7 of culture as described above. On the other hand, no colony-forming cells were observed in the R3 fraction, but many colonies were observed in the R2 fraction that reacted to No. 23 (Fig. 5). In addition, when the reactivity to subcultured human hepatocytes was examined by FACS, about 80% of the cells were positive (Fig. 6). In other words, it was considered that only the proliferating hepatocytes were recognized, not the cells that were differentiated during the culture process among the subcultured rabbit hepatocytes. This suggests that No.
  • telomere-Mouse hybridoma K8223 was deposited as a patent organism at the Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology on March 6, 2002 (Accession Number FERM P-18752). Furthermore, an international deposit was made on March 20, 2003 (accession number FERM BP-8334).
  • Example 2 By specifically cultivating the above eight ibridoroma (strain K8223) cells, and by injecting the hybridoma cells into the peritoneal cavity of the mouse and collecting monoclonal antibodies from the ascites, it specifically binds to proliferating human hepatocytes. A monoclonal antibody was obtained.
  • strain K8223 ibridoroma
  • proliferating human hepatocytes were isolated from a human hepatocyte population isolated from human liver tissue by the collagenase perfusion method. Specifically, cells obtained by collagenase perfusion and low-speed centrifugation from human liver tissue were treated with the monoclonal antibody obtained in Example 1 for 4 minutes for 30 minutes, and then FITC-labeled anti-mouse IgG antibody was added. Treated with 4 for 30 min and detected the reaction by FACS. The cell population that reacted with this antibody was collected as R2, and the cell population that did not react with this antibody as R3, and cultured in the same manner as in Example 1.1.
  • hepatocytes before sorting were cultured in the same manner.
  • colony formation was observed from around day 7 of culture, but hepatocytes that did not form colonies were also observed.
  • no colony-forming cells were observed in the R3 fraction, but many colonies were observed in the R2 fraction that reacted with this monoclonal antibody. From the above results, it was confirmed that proliferating hepatocytes can be efficiently isolated from the isolated hepatocyte population by using the method of the present invention.
  • the proliferative human hepatocytes obtained in Example 2 were seeded on Matrigel (MATRIGELTM Matrix ⁇ Becton, Dickinson) at 1 x 10 5 cells / cm 2 and supplemented with fetal calf serum, EGF, and sustained activity vitamin C Cultivated in DMEM medium. Hepatocytes formed spheroids on Matrigel on the first day of culture (Fig. 7, upper panel).
  • hepatocytes cultured in spheroids were confirmed to have higher gene expression of various human P450s than hepatocytes cultured in monolayers.
  • Some human P450 genes showed P450 gene expression similar to that of normal human hepatocytes immediately after isolation (Fig. 8).
  • the culture supernatants of spheroid-cultured hepatocytes and monolayer-cultured hepatocytes were collected every 3 days, and the concentration of human albumin in the medium was determined using Quantitative ELISA immunoassay (Bethyl Laboratories® nc.) did.
  • spheroid-cultured hepatocytes showed higher albumin secretion after the 6th day of culture compared to monolayer-cultured hepatocytes (Fig. 9).
  • lidocaine hydrochloride 500 ig / ml was added to the medium and incubated for 24 hours. The medium was collected, and the amount of MEGX, which is a lidocaine metabolite in the medium, was measured by HPLC. The same measurement was performed on hepatocytes cultured in a monolayer.
  • MEGX was not detected in the medium of monolayer cultured hepatocytes, but MEGX was detected in the medium of spheroid cultured hepatocytes (8.3 g / ml / 24 hours, 1.7 ig). / 105 cell / 24 hours). From this result, it was confirmed that the spheroid cultured hepatocytes have P450 enzyme activity (chemical substance metabolizing enzyme activity).
  • P450 enzyme activity chemical substance metabolizing enzyme activity
  • the proliferative human hepatocytes obtained in Example 2 were treated with human HNF4 cDNA (GenBank / X87870) via an adenovirus vector (Q BIO gene) on the first day of culture with a Multiplicity of infection (MOI) of 0, Infection was performed at 1, 5, 10, 20, 50 and 100.
  • human HNF4 cDNA GenBank / X87870
  • Q BIO gene adenovirus vector
  • MOI Multiplicity of infection
  • a monoclonal antibody that specifically recognizes proliferating human hepatocytes, and proliferative baboon hepatocytes isolated by the use of this antibody, Functional human hepatocytes obtained by inducing differentiation of these cells are provided.

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Description

明細書 増殖性ヒト肝細胞を認識する抗体と、 増殖性ヒト肝細胞
および機能性ヒト肝細胞 技術分野 この出願の発明は、 増殖性ヒト肝細胞を認識する抗体とヒト肝細胞に関するも のである。 さらに詳しくは、 この出願の発明は、 クローン性増殖能を有するヒト 肝細胞を特異的に認識し、 ヒト肝細胞集団から増殖性肝細胞を分離するのに有用 なモノクローナル抗体と、 この抗体の使用によって分離された増殖性ヒト肝細胞， この増殖性ヒト肝細胞を分化肝細胞に分化誘導する方法と、 この方法により分化 誘導された機能性ヒト肝細胞、 並びにこの機能性ヒト肝細胞を備えた肝細胞キッ トおよび体外型人工肝臓に関するものである。'
背景技術 肝臓は 500種類以上もの多種多様な特異機能を有する。 肝臓の主な機能とし て、 血漿蛋白質の合成分泌、 糖新生やグリコーゲン代謝による血糖調節、 脂質合 成、 尿素合成、 胆汁合成分泌、 解毒などが挙げられる。 体内に取り込まれた物質の多くは肝臓で代謝される。 医薬品開発の領域では、 医薬品候補物質が肝臓でどのような代謝を受け、 肝臓やその他の臓器や組織にど のような影響を与えるかは必須のデータである。 さらに、 これまで多くの化学物 質が合成され環境へも放出されている。 これらの物質が個々に、 あるいは複合し て人体にどのような影響をおよぼすかを解明することは、 社会的にも非常に重要 であり、 このような化学物質の人体への影響評価にも肝機能に対する毒性試験が 必要とされている。 医薬品候補物質をはじめとする化学物質の安全性試験や薬物代謝試験には、 現 在のところ、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ィヌ、 サル等が使われている。 特に医薬 品開発ではヒ卜を対象とする第一相試験へ入る前に、 動物を用いた毒性試験 ·安 全性試験が義務づけられているが、 これには多大な時間と労力を必要とし、 投資 額も莫大なものとなる。 しかしながら、 これらの動物実験で得られるデータがそのままヒトに適応され る保証はない。 事実、 動物実験では毒性の認められなかった物質がヒ卜に対して 毒性を示す例は多く、 また逆の場合もあり得る。 したがって、 これまで多くの医 薬品候補物質がヒトを対象とする第一相試験に入ってから開発中止となったり、 また、 動物実験では毒性が強いために臨床試験に入る前に開発中止となった物質 においても、 実際にはヒトには毒性が認めら.れないケースも多く存在しているも のと予想される。 このことは、 ヒトの肝臓における代謝機能とマウスやラットの肝臓における代 謝機能の違いが起因していると考えられている。 最近では、 ヒト肝細胞を用いた in vitro代謝試験や毒性試験が行われるようになった。 ところが、 移植に用いら れなかった脳死患者の肝臓や腫瘍摘出などによる切除肝から得られるヒト肝細胞 の量は需要をはるかに下回っている。 したがって、 ヒト肝細胞の増殖技術の開発 は医薬品開発において必要とされている。 また、 大量のヒト肝細胞の必要性は、 体外型人工肝臓においても同様である。 人工肝臓は、 人工的に肝臓機能を代行するための医療装置であり、 吸着、 透析、 濾過等の物理化学的原理に基づく人工的な作用と、 摘出肝や肝組織の灌流による 生物学的作用を組み合わせた八イブリッド型の人工肝臓の開発が精力的に進めら れている。 この人工肝臓の開発に当たっては、 物理化学的機能を向上させるため の膜や回路の性能向上とともに、 ヒトへの適用が可能な大量の肝細胞の供給が不 可欠とされている。 しかしながら、 ヒトの肝細胞については、 これまで成熟個体から単離した初代 細胞を継代的に培養することは不可能であるとされてきた。 すなわち、 接着依存 性の成熟肝細胞は、 その継代操作のために培養基質から剥離する際に大きく損傷 し、 また培養基質に再接着させることも困難なためである。 これに対し、 この出 願の発明者らは、 ヒト肝臓から分離した正常肝細胞からクローン性増殖能を有す る小型肝細胞を単離し、 この小型肝細胞を初代培養し、 さらにこの培養肝細胞を 継代培養して肝細胞を増殖させる方法を発明し、 特許を取得している （特開平 08- 1 12092号公報； 日本特許第 3266766号；米国特許第 6 ,004,810号、 特開 平 10- 179 148号公報： 日本特許第 32 1 1941号、 特開平 7-274951公報； 日本 特許第 3 157984号、 特開平 9-3 13172号公報； 日本特許第 3014322号） 。 ま た、 関連の論文も発表している （Chise Tateno, and Katsutoshi Yoshizato: Growth, and differentiation in culture of clonogenic hepatocvtes that express both phenotypes of hepatocytes and biliary epithelial cells.
American Journal of Pathology 149: 1593- 1605, 1996. Hiroshi Hino, Chise Tateno, Hajime Sato, Chihiro Yamasa i, Shiger Katayama, Toshihiko Kohashi, Akio Aratani, Toshimasa Asahara, Kiyohiko Dohi, and Kats toshi Yoshizato: A long-term culture of human hepatocytes which show a high growth potential and express their differentiated phenotypes. Biochemical and Biophysical Research Communications 256: 184- 19 1 , 1999. Chise Tateno, Kaori Takai-Kajihara, Chihiro
YamasaKi, Hajime Sato, and Katsutoshi Yoshizato: Heterogeneity of growth potential of adult rat hepatocytes in vitro. Hepatology 31 : 65-74， 2000. Snigeru Katayama, Chise Tateno, Toshimasa Asahara, and
Katsutoshi Yoshizato: Size-dependent in vivo growth potential of adult rat hepatocytes. American Journal of Pathology 158: 97- 105, 200 1.) 。 この先願特許発明の方法は、 in vitroで肝細胞を増殖させて大量のヒト肝細胞 を得るための新しい手段を提供するものであるが、 この方法で得られたヒト肝細 胞は、 長期間の継代培養中に幾つかの肝機能が低下してしまうという問題点を有 していた。 またこの小型肝細胞は、 アルブミン発現量や、 化学物質代謝酵素シト クロム P450活性等を指標とした場合、 正常肝細胞と同等の機能を有する肝細胞 (機能性肝細胞） には分化することができないという問題点を有してもいる。 こ のため、 例えば特定の肝機能を維持するための薬剤のスクリーニング系として、 あるいは長期間の継代培養後も保存されている特定の機能について薬剤の毒性や 薬効を試験する系としては有用であるが、 ヒト肝機能代替としての肝細胞として、 またはハイプリット型人工肝臓の材料としては不十分な点も存在する。 また増殖能を有する小型肝細胞は、 前記の先願特許発明に記載されているよう な遠心分離を用いた方法 （低速遠心分離した上澄み中の細胞を単離する方法） の 他、 エルトリエー夕一や FACS等の細胞分画装置によっても採取することがで きるが、 これらの手段で得られた細胞は、 増殖性肝細胞だけでなく、 他の細胞
(例えば、 低速遠心による上澄みに含まれる星細胞等の非肝実質細胞） との混合 物である。 従って、 実質的に増殖性ヒト肝細胞のみを取得することのできる手段 が求められていた。 この出願の発明は、 以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、 増殖 性ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供することを課題とし ている。 またこの出願の発明は、 増殖性ヒト肝細胞の分離方法と、 この方法により得ら れる増殖性ヒト肝細胞を提供することを課題としている。 さらにこの出願の発明は、 増殖性ヒト肝細胞を機能性ヒト肝細胞に分化誘導す る方法と、 この方法によって得られた機能性ヒト肝細胞、 および機能性ヒト肝細 胞の利用を提供することを課題としている。
発明の開示 この出願は、 前記の課題を解決するための第 1 の発明として、 増殖性ヒト肝 細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供する。 この第 1 発明のモノ クロ一ナル抗体の一例は、 ハイブリ ドーマ細胞 Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP-8334) が産生するモノクローナル抗体である。 第 2 の発明として、 第 1 発明のモノクローナル抗体を産生する Λイブリ ドー マ細胞を提供する。 このハイ ブリ ドーマ細胞の一例は、 Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP-8334) である。 第 3 の発明として、 ヒト肝細胞集団から、 前記第 1 発明のモノクローナル抗 体によって認識される細胞を分離することを特徴とする増殖性ヒ卜肝細胞の分離 方法を提供する。 第 4 の発明として、 前記第 3 発明の方法で分離された増殖性ヒト肝細胞を提 供する。 さらにまた、 第 5 の発明として、 前記第 · 4発明の増殖性ヒト肝細胞を分化誘 導する方法であって、 以下の手段：
(a) ·増殖性ヒト肝細胞のスフエロィド培養；および
(b) 増殖性ヒト肝細胞への肝細胞核因子 4 (HNF4) 遺伝子導入、
の少なくとも一方を行うことを特徴とする増殖性ヒト肝細胞の分化誘導方法を提 供する。 第 6 の発明として、 前記第 5 発明の方法で分化誘導された機能性ヒト肝細胞 を提供する。 さらに第 7 の発明として、 前記第 6 発明の機能性ヒト肝細胞を含む細胞キッ 卜を提供する。 さらにまた、 第 8 の発明として、 前記第 6 発明の機能性ヒト肝細胞を充填し たハイプリッド型人工肝臓を提供する。 なおこの発明において、 「増殖性ヒト肝細胞」 とは、 培養条件下 （in vitro) において、 単一細胞種の集団としてのコロニーを形成し、 そのコロニーを増大さ せるように増殖するヒト肝細胞を意味する。 また、 その増殖は、 コロニ一構成細 胞が単一種であるという点において 「クローン性増殖」 という場合もある。 さら に、 このような細胞は、 継代培養によって細胞数をさらに増加することができる 細胞である。 またこの発明において、 「機能性ヒト肝細胞」 とは、 人体内 （in vivo) また は初代培養 （in vitro) におけるヒト正常肝細胞と同程度の機能を有する細胞を 意味するが、 さらに具体的には、 少なくとも 「アルブミン発現量」 および 「シト クロム P450活性」 がヒト正常肝細胞と実質的に同等であることを意味する。 この発明におけるその他の用語や概念は、 発明の実施形態の説明や実施例にお いて詳しく規定する。 またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、 特 にその出典を明示した技術を除いては、 公知の文献等に基づいて当業者であれば 容易かつ確実に実施可能である。 例えば、 この発明の遺伝子工学および分子生物 学的技術は Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al.， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。
図面の簡単な説明 図 1 は、 様々な年令の患者から採取した肝細胞を培養した時の増殖曲線であ る。 図 2 は、 モノクローナル抗体を作るために抗原として用いた培養ヒト肝細胞 の位相差顕微鏡像である。 図 3 は、 ハイプリ ドーマ K8223 培養上清の、 ヒト肝組織における反応性を 蛍光抗体染色により観察した像である。 図 4は、 ハイブリ ド一マ No. 23培養上清の、 分離直後のヒ卜肝細胞表面にお ける反応性を FACSにより解析した結果である。 図 5 は、 ハイプリ ドーマ No. 23 培養上清に反応した細胞集団 （R2) と未反 応の細胞集団 （R3) を分取し、 培養した時の位相差顕微鏡像である。 図 6は、 八イブリ ドーマ No. 23培養上清の、 継代培養ヒト肝細胞表面におけ る反応性を FACSにより解析した結果である。 図 7 は、 単層培養およびスフエロイド培養した肝細胞それぞれの培養 1 日目 (上段） および 7日目 （下段） の位相差顕微鏡像である。 図 8 は、 ヒト肝臓から分離直後の肝細胞、 単層培養した継代培養肝細胞、 お よびスフエロィド培養した肝細胞のそれぞれにおけるヒト型 P450遺伝子または GAPDH遺伝子発現量を示したグラフである。 図 9 は、 単層培養およびスフエロイド培養した肝細胞それぞれのアルブミン 分泌量の経時的変化を示したグラフである。 図 10は、 ヒト HNF4遺伝子を導入した培養ヒト細胞におけるヒト型 P450遺 伝子の発現量を示したグラフである。
発明を実施するための最良の形態 第 1発明のモノクローナル抗体は、 コロニーを形成しながら増殖するヒト肝細 胞を特異的に認識することを特徴とする。 さらに詳しくは、 このモノクローナル 抗体は、 コロニーを形成しながら増殖し、 かつ、 機能性ヒト肝細胞へ分化可能な ヒト肝細胞を特異的に認識することを特徴とする。 この場合の 「特異的に認識す る」 とは、 前記のヒト肝細胞にのみ結合し、 他の細胞および/または前記の特徴 を有していないヒト肝細胞には結合しないことを意味する。 この第 1 発明のモノクローナル抗体は、 この出願の第 2 発明のハイプリ ドー マ細胞から公知の方法で得ることができる。 Λイブリ ドーマ細胞およびモノクロ ーナル抗体は、 公知のモノクローナル抗体作製法 （ 「単クローン抗体」 、 長宗香 明、 寺田弘共著、 廣川書店、 1990 年 ； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third edition, Academic Press, 1996) に従い、 例えば以下の様な手 順で作製することができる。
1 ：ハイプリ ドーマ細胞の作製
継代培養したヒト正常肝細胞を含む免疫原を用いて哺乳動物を免疫し、 必要に 応じて適宜に追加免疫して動物を充分に感化する。 次いでこの動物から抗体産生 細胞 （リンパ細胞または脾臓細胞） を摘出し、 これとミエ口一マ （骨髄腫） 細胞 株との融合細胞を得る。 そして、 これらの融合細胞株から、 目的とするモノクロ ーナル抗体を産生する細胞を選択し、 培養することによって、 ハイプリ ドーマ細 胞を得ることができる。 以下、 各工程を詳しく説明する。 a) 免疫原の調製
正常肝組織からコラゲナーゼで分離したヒト肝細胞を継代培養し、 免疫原とす る。 ヒト肝細胞は、 4回以上、 好ましくは 6回以上の継代が可能な、 例えば 15 歳以下のヒト肝組織から分離したものを使用することが好ましい。 b) 動物の免疫
被免疫動物としては、 公知のハイプリ ドーマ作製法に用いられる哺乳動物を使 用することができる。 具体的には、 たとえばマウス、 ラット、 ャギ、 ヒッジ、 ゥ シ、 ゥマ等である。 ただし、 摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞 の入手容易性等の観点からは、 マウスまたはラットを被免疫動物とするのが好ま しい。 また、 実際に使用するマウス ¾よびラットの系統は特に制限はなく、 マウ スの場合には、 たとえば各系統 A、 AKR、 BALB/c、 BDP、 BA、 CE、 C3H、 57BL、 C57BR、 C57L、 DBA、 FL、 HTH、 HT1、 LP、 NZB、 NZW、 RF、 RlE、 SJL、 SWR、 WB、 129 等が、 またラットの場合には、 たとえば、 Low、 Lewis ^ Spraque、 Daweley、 ACL BN、 Fischer等を用いることができる。 このうち、 後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、 マウスでは BALB/ c 系統 が、 ラットでは low 系統が被免疫動物として特に好ましい。 なお、 これらマウ スまたはラッ卜の免疫時の週齢は 5~ 12週齢が好ましい。
動物の免疫は、 免疫原である継代ヒト肝細胞を、 104〜108個程度、 動物の皮 内または腹腔内に投与することによって行うことができる。 免疫原の投与スケジ ユールは被免疫動物の種類、 個体差等により異なるが、 一般には、 抗原投与回数
1〜6回、 複数回の場合は投与間隔 1〜2週間が好ましい。 c) 細胞融合
上記の投与スケジュールの最終免疫日から 1〜5 日後に被免疫動物から抗体産 生細胞を含む脾臓細胞またはリンパ細胞を無菌的に取り出す。 これらの脾臓細胞 またはリンパ細胞からの抗体産生細胞の分離は、 公知の方法に従って行うことが できる。
次いで、 抗体産生細胞とミエ口一マ細胞とを融合する。 このミエローマ細胞に は特段の制限はなく、 公知の細胞株から適宜に選択して用いることができる。 た だし、 融合細胞からハイプリ ドーマを選択する際の利便性を考慮して、 その選択 手続が、確立 して い る HGPRT ( Hpoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) 欠損株を用いるのが好ましい。 すなわち、 マウス由来の X63- Ag8(X63) 、 NS l-Ag4/ l (NS- l) 、 P3X63-Ag8.Ul(P3Ul) 、 X63- Ag8.653(X63.653)、 SP2/0-Agl4(SP2/0)、 MPCl 1-45.6TG1.7(45.6TG)、 FO、 S 149/ 5XXO,BU. l 等、 ラッ ト由来の 210.RSY3.Ag.1 ·2.3(Υ3)等、 ヒト由来の U266AR(SKO- 007)、 GM 1500 · GTG-A12(GM 1500)、 UC729-6, LICR-LOW- HMy2(HMy2)、 8226AR/NIP4- 1(NP41)等である。
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、 公知の方法に従い、 細胞の生存率 を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。 そのような方 法は、 例えば、 ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細 胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、 電気的刺激を利用する物理的方法 等を用いることができる。 ■
融合細胞と非融合細胞の選択は、 例えば、 公知の HAT (ヒポキサンチン ' ァ ミノプテリン ·チミジン） 選択法により行うのが好ましい。 この方法は、 ァミノ プテリン存在下で生存し得ない HGPRT欠損株のミエローマ細胞を用いて融合細 胞を得る場合に有効である。 すなわち、 未融合細胞および融合細胞を HAT 培地 で培養することにより、 アミノブテリンに対する耐性を持ち合わせた融合細胞の みを選択的に残存させ、 かつ増殖させることができる。 d) ハイプリ ドーマのスクリーニング
目的とするモノク口一ナル抗体を産生するハイブリ ドーマ細胞のスクリ一ニン グは、 公知の酵素免疫検定法 （EIA： Enzyme Immunoassay) 、 放射線免疫測 定法 （RIA： Radio Immunoassay) 、 蛍光抗体法等により行うことができる。 このようなスクリーニングによって、 高い増殖能を有するヒト肝細胞と特異的 に結合するモノクローナル抗体をそれぞれに産生する八イブリ ドーマ細胞群が得 られる。
なお、 スクリーニング後のハイプリ ドーマ細胞は、 メチルセルロース法、 軟ァ ガロース法、 限界希釈法等の公知の方法によりクローニングし、 抗体産生に用い る。 - 以上の通りの方法によって得たハイプリ ドーマ細胞は、 液体窒素中または- 80¾以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。 この出願は、 このよ うなハイプリ ドーマ細胞の具体例として、 Mouse- Mouse hybridoma K8223 (FERM BP- 8334) を提供する。
2 ：モノクローナル抗体の取得おょぴ精製
上記 1で作製したハイプリ ドーマ細胞を公知の方法で培養することによって、 増殖性ヒト肝細胞のみと特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができ る。
培養は、 例えば、 前記のクローニング法で使用した同じ組成の培地中で培養し てもよく、 あるいはモノクローナル抗体を大量に産生するためには、 マウス腹腔 内に八イブリ ドーマ細胞を注射し、 腹水からモノクローナル抗体を採取してもよ い。
このようにして得たモノクローナル抗体は、 例えば硫安塩析法、 ゲル濾過法、 イオン交換クロマトグラフィー法、 ァフィ二ティークロマトグラフィー法等によ り精製することができる。 この出願は、 ハイプリ ドーマ細胞の具体例として、 前記のハイプリ ドーマ細胞 Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP-8334) を、 またモノクローナ ル抗体の具体例として、 ハイプリ ドーマ細胞 Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP-8334) が産生するモノクローナル抗体を提供する。 第 3 発明は、 増殖性ヒト肝細胞の分離方法であり、 ヒト肝細胞集団から前記 第 1 発明のモノクローナル抗体によって認識される細胞を分取することを特徴 とする。 ヒト肝細胞集団は、 例えば、 ヒト肝臓からコラゲナーゼ灌流法等の公知 の方法で単離され、 培養条件下に置かれた初代細胞、 またはこの初代細胞を 1 ~ 8 回継代培養した継代細胞とすることができる。 あるいはまた、 このヒト肝細胞 集団は、 この出願の発明者らによる特許発明 （特開平 08- 1 12092号公報； 日本 特許第 3266766号；米国特許第 6，004，810号、 特開平 10- 179148号公報： 日 本特許第 321 1941号、 特開平 7-274951公報； 日本特許第 3157984号、 特開 平 9-313172号公報； 日本特許第 3014322号） における 「小型ヒト肝細胞を含 む細胞集団」 であってもよい。 すなわちこれらの特許発明における小型ヒト肝細 胞には、 星細胞等の非実質肝細胞や、 小型ヒ卜肝細胞の培養および継代培養のた めに共培養される Swiss 3 T3 細胞等が含まれている。 第 1 発明のモノクロ一 ナル抗体を使用することによって、 このような細胞集団から、 さらに効率よく増 殖性ヒト細胞を分離することができる。 増殖性ヒト肝細胞の分離は、 前記のヒト肝細胞集団に、 酵素、 放射性同位体、 磁気ビーズまたは蛍光色素等で標識したモノクローナル抗体を接触させ、 標識シ グナルを発する細胞を単離することによって行うことができる。 この方法では、 遠心分離や細胞分画装置等における細胞負荷がほとんどないため、 ほぼ無傷の状 態で増殖性ヒト肝細胞を取得することができる。 なお、 標識として使用する酵素 は、 turnover number が大であること、 抗体と結合させても安定であること、 基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、 通 常の EIA に用いられる酵素、 例えば、 ペルォキシダーゼ、 ]3—ガラクトシダー ゼ、 アルカリフォスファターゼ、 グルコースォキシダ一ゼ、 アセチルコリンエス テラーゼ、 グルコース一 6—リン酸化脱水素酵素、 リンゴ酸脱水素酵素等を用い ることもできる。 また、 酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。 これら 酵素と抗体との結合は、 マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によつ て行うことができる。 基質としては、 使用する酵素の種類に応じて公知の物質を 使用することができる。 例えば酵素としてペルォキシダーゼを使用する場合には、 3,3'，5，5'—テトラメチルベンジシンを、 また酵素としてアル力リフォスファタ一 ゼを用いる場合には、 パラニトロフエノール等を用いることができる。 放射性同 位体としては、 i25 Iや 3H等の通常の RIA で用いられているものを使用するこ とができる。 蛍光色素としては、 フルォレツセンスイソチオシァネート (FITC) ゃテトラメチルローダミンイソチオシァネ一ト (TRITC) 等の通常の 蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。 また、 標識シグナルの検 出は、 酵素を用いる場合には酵素作用によって分解して発色する基質を加え、 基 質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、 これを結合抗体量 に換算し、 標準値との比較から抗体量が算出される。 放射生同位体を用いる場合 には、 放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンタ一等により測 定する。 また、 蛍光色素を用いる場合には、 蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置 によって蛍光量を測定すればよい。 以上の方法によって、 この出願の第 4 発明の 「増殖性ヒト肝細胞」 が得られ る。 この増殖性ヒト肝細胞は、 培養条件下においてコロニーを形成して活発に増 殖するが、 さらに、 機能性ヒト肝細胞への分化能を有する細胞でもある。 このよ うな機能性ヒト肝細胞は、 第 5 発明の方法によって増殖性ヒト肝細胞から分化 誘導することができる。 なお、 増殖性ヒト肝細胞は、 実施例 1 のモノクローナ ル抗体作製の際の免疫原として使用したヒト肝細胞の取得方法によっても得るこ とができるが、 この実施例 1 の方法の場合には、 非増殖性細胞も含まれている 可能性がある。 この発明のモノクローナル抗体を用いる方法は、 実質的に増殖性 ヒト肝細胞のみを分離することができる点において優れた方法である。 第 5 発明の方法は、 以下の手段 (a)または (b)、 もしくは (a)および (b)を行うこ とを特徴としている。
(a)：増殖性ヒト肝細胞のスフエロィ ド培養
「スフ：!：ロイ ド」 とは、 細胞が数百個集合して組織構造を形成する細胞の集合 体を意味する。 具体的には、 細胞を以下に示す方法で 3 次元的な細胞集団とし、 これを動物細胞培地で培養する。 スフエロイドを得る公知の方法としては、 マト リゲル （MATRIGELTM Matrix, べクトン 'ディッキンソン） 、 ポジティブチヤ ージの培養器 （プライマリア、 べクトン，ディッキンソン） 、 U底培養器 （スフ エロイ ド ' M S ? 0 0 9 6 S、 スミロン） 上での培養や、 ローラ一ポトルでの旋 回培養等が挙げられる。 また、 培養は 6~ 15 日間程度行えばよい。
(b)：増殖性ヒト肝細胞への肝細胞核因子 4 (HNF4) 遺伝子の導入
肝細胞核因子 4 (hepatocyte nuclear factor 4: HNF4) は、 肝細胞において 特異的な機能を発現する遺伝子の転写に関するタンパク質であり （例えば、 Bell'G.I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (4), 1484- 1488， 1991) 、 ヒト HNF4 aの cDNA配列が公知である （例えば、 GenBank/NM— 000457) 。 また HNF4b (GenBank/X87871 ) 、 HNF4c (GenBank/X87872) の cDNA 配列も公知である。 さらに、 マウス HNF4 cDNA (GenBank/NM— 008261) 、 ラット HNF4 cDNA (GenBank/X57133) 等も知られている。 従って、 これら の公知の HNF4 cDNA を真核細胞発現べクタ一に組換え、 この発現ベクターを、 例えば電気穿孔法、 リン酸カルシウム法、 リボソーム法、 DEAE デキストラン 法等の公知の方法を増殖性ヒ卜肝細胞に導入することによって HNF4 遺伝子を 導入することができる。 あるいは例えば生体認識分子を提示した中空ナノ粒子、 レトロウイルス、 レンチウィルス、 アデノウイルス、 アデノ随伴ウィルス等を用 いる遺伝子治療法 （ex vivo法） に準じた方法によっても HNF4遺伝子を導入す ることができる。 また、 HNF4 遺伝子 cDNA は、 それらの既知配列に基づいて 作製したプローブ DNAを用いて、 ヒト等の cDNAライブラリーをスクリ一ニン グすることによって取得することができる。 得られた cDNA は、 例えば、 PCR (Polymerase Chain Reaction) 法、 NASBN (Nucleic acid sequence based amplification) 法、 TMA (Transcription-mediated amplification) 法および SDA (Strand Displacement Amplification) 法などの通常行われる遺伝子増 幅法により増幅し、 使用することができる。 また、 既知配列に基づいて作成した プライマ一セットを用い、 哺乳動物細胞から単離した mRNA を铸型とする RT- PCR (Reverse Transcriptase-PCR) 法によっても目的とする十分量の cDNA を得ることができる。 以上の分化誘導方法によって、 後記の実施例に示したように、 人体内または初 代培養におけるヒト正常肝細胞と同程度の機能性、 具体的には十分量のアルブミ ン発現およびシ卜クロム P450 活性を有する 6 発明の機能性肝細胞が得られ る。 なお、 以上の分化誘導による機能性ヒ卜肝細胞は、 例えば後記の実施例 1 において免疫原のヒト肝細胞を調製したのと同様の方法で得られる継代培養細胞
(コロニ一を形成して継代培養可能な肝細胞） を用いても実施することができる c ただし、 このような継代培養細胞には、 非増殖性細胞も含まれている可能性があ る。 以上の方法によって得られた第 6 発明の機能性ヒト肝細胞を用いることによ つて、 薬物代謝試験や安全性試験などに用いることができるヒト肝細胞キッ ト (第 7 発明） や、 Λイブリツド型人工肝臓 （第 8 発明） が提供される。 さらに- 八イブリッド型人工肝臓に使用するモジュール （ヒト肝細胞を充填したモジユー ル） を使用して、 ヒト肝細胞が生産する有用物質を回収することできる。 肝細胞キットは、 細胞の種類や用途に応じて各種のものが公知であり、 当業者 であれば、 第 6 発明のヒト肝細胞と公知の細胞キットの構成を採用することに よって、 第 7 発明の細胞キッ トを容易に作製することができる。 また、 モジュ ールゃハイブリッド型人工臓器の構成も公知であり、 当業者であれば第 8 発明 の人工肝臓等を容易に作製することができる。
実施例 以下、 実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明す るが、 この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例 1
ヒト増殖性肝細胞を認識するモノクローナル抗体の作製
1. ヒト肝細胞の培養
ヒト肝臓組織よりコラゲナーゼ灌流法により、 細胞分散液を得た。 細胞分散液 を低速遠心分離 （50g、 2 分） し、 その沈殿画分を牛胎児血清、 ヒ卜血清、 EGF、 ニコチンアミ ド、 活性持続型ビタミン C を添加した Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) を用い、 マイトマイシン C処理した Swiss 3T3細 胞と混合培養した。 Swiss 3T3細胞は 10日毎に添加した。 培養 7日目頃よりヒ ト肝細胞のコロニーが観察された。 コンフルェン トに増殖した肝細胞を EDTA/Trypsin を用いて継代した。 継代は、 子供の肝細胞では 6-9 ·回継代でき、 60才以上の患者の肝細胞は 3-4 回しか継代できなかった （図 1) 。 もっとも高 い増殖能を示した子供 （12才） の肝細胞を抗原として用いた （図 2) 。
2. 動物の免疫
上記方法により、 3-5 回継代培養した子供 （12 才） の肝細胞を培養皿上で増 やした。 コンフルェントに増殖した細胞 （約 1 X 107個） を、 PBS (リン酸緩衝 塩類溶液） で洗浄した後、 PBS を取り除き、 セルスクレーパーで搔き取って回 収し、 PBS約 1mlに懸濁した。 これを 6週齢の Balb/cマウスの腹腔内に投与 した。 さらに 20 日後または 30 日後に、 同様の方法で免疫を行った。 3. 細胞融合
2回の免疫後、 抗体価の上昇がみられたため、 3回目の免疫 （boost) の 72時 間後、 1 匹の免疫動物より脾臓を摘出、 脾臓細胞を採取した。 この脾臓細胞とマ ウスミエローマ細胞 （細胞名 NS-1) を細胞融合し、 96-well plateに 372 well 播種、 培養した。
4. Λイブリ ドーマのスクリーニング
1次スクリーニング （ELISA、 組織染色） ：
得られた融合細胞の培養上清の抗原に対する反応性を ELISA により測定した。 測定は以下の方法により実施した。 抗原として用いた継代培養肝細胞を 96-well plateに播種し、 培養後 PBSで洗浄、 乾燥させ- 80でで保存しておいたものに、 培養上清を反応させた。 次に酵素標識の抗マウス IgG または抗マウス IgM抗体 を反応させ、 基質を加えて発色させ、 その吸光度を測定した。 その結果、 融合細 胞 372 サンプルの吸光度の平均は 0. 149 ( SD: 0.099) で、 このうち吸光度 0.20 以上 （81 サンプル、 約 20 % ) のサンプルを陽性とした。 また目視におい て、 吸光度 0. 15 以上でも発色が確認されたことから、 0. 15~0.20 のサンプル (46 サンプル）については、 組織染色を行い反応性を確認した。 その中から、 興 味深い染色パターンを示した 13サンプルについてのみ陽性サンプルとした。 選 択した陽性サンプル、 94 サンプルをスケールアップしてさらに培養し、 培養上 清を回収後、 細胞を凍結保存した。 '
5. 2次スクリーニング （ELISA、 組織染色） ：
1 次スクリ一ニングで選んだ 94サンプルから、 スケールアツプ後の培養上清 の抗原に対する反-応性を 1次スクリーニングと同様の ELISAにより測定し、 陽 性サンプル、 88 サンプルを選んだ。 さらに、 これらのサンプルの、 組織におけ る反応性を組織染色により調べた。 そのなかから、 肝細胞の細胞膜や、 門脈域の 肝細胞に特異的に反応するハイプリ ドーマを含むサンプル、 または、 そこからク ローニングによって得られたクローンの培養上清について、 分離直後のヒト肝細 胞への反応性を調べた。 組織において門脈域の肝細胞膜が染まる八ィプリ ドーマ培養上清 No. 23 につ いて、 分離直後の肝細胞表面における反応性を、 FACS ( Fluorescence activated cell sorting) を用いて解析した。 成人男性 （46才および 49才） の 肝臓からコラゲナ一ゼ灌流、 低速遠心により得られた細胞を、 このサンプルの培 養上清で 4で、 30分処理し、 次に FITC標識した抗マウス IgG抗体を 4で、 30 分処理することにより、 FACSでの検出を可能にした。 その結果、 肝細胞集団の 一部 （1〜2 % ) の細胞がこのサンプルに反応した （図 4) 。 そこで、 これらの 細胞集団を R2、 反応しなかった細胞集団を R3 として分取し、 培養した。 また 分取前の肝細胞も同様に培養した。 その結果、 分取前の肝細胞では、 前述したよ うに、 培養 7 日目頃より、 コロニー形成が観察された。 一方、 R3画分において は、 コロニーを形成する細胞は観察されなかったが、 No. 23 に反応した R2 画 分において、 多くのコロニーが観察された （図 5) 。 また、 継代培養ヒト肝細胞 への反応性を FACS により調べたところ、 約 80 %の細胞が陽性であった （図 6) 。 すなわち、 継代培養ヒ卜肝細胞のうち培養過程で分化した細胞は認識せず、 増殖性肝細胞のみを認識していると考えられた。 このことから、 No. 23 には、 コロニーを形成する細胞を特異的に認識するハイプリ ドーマが含まれている可能 性が示唆された。 No.23 サンプルからクローニングにより得られたクローンに ついても分離直後の肝細胞表面における反応性を FACS を用いて解析した。 そ の結果、 同様の反応性を示すクローンが 3 クローン得られた。 これらの中から， 1クローン （Mouse-Mouse hybridoma K8223) を 2002年 3月 6日付で独立 行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに特許生物として寄託し （受 託番号 FERM P- 18752) 、 さらに 2003年 3月 20 日付で国際寄託した （受託 番号 FERM BP- 8334) 。
6. モノクローナル抗体の作成
前記の八イブリ ドーマ （K8223 株） 細胞を培養することによって、 さらに、 マウス腹腔内にハイプリ ドーマ細胞を注射し、 腹水からモノクローナル抗体を採 取することにより、 増殖性ヒト肝細胞と特異的に結合するモノクローナル抗体を 得た。 実施例 2
増殖性ヒト肝細胞の分離 実施例 1で得たモノクローナル抗体を用いて、 コラゲナーゼ灌流法によりヒト 肝臓組織より単離したヒト肝細胞集団から、 増殖性ヒト肝細胞を分離した。 具体 的には、 ヒト肝臓組織からコラゲナ一ゼ灌流、 低速遠心により得られた細胞を、 実施例 1 で得たモノクローナル抗体で 4で、 30分処理し、 次に FITC標識した 抗マウス IgG抗体を 4で、 30分処理し、 反応を FACSで検出した。 この抗体に 反応した細胞集団を R 2、 反応しなかった細胞集団を R3 として分取し、 実施例 1.1 と同様の方法で培養した。 また分取前の肝細胞も同様に培養した。 その結果、 分取前の肝細胞では、 培養 7 日目頃より、 コロニー形成が観察されたがコロニ 一を形成しない肝細胞も観察された。 一方、 R3 画分においては、 コロニーを形 成する細胞は観察されなかったが、 このモノクローナル抗体に反応した R2画分 において、 多くのコロニーが観察された。 以上の結果から、 この発明の方法を用 いることにより、 分離肝細胞集団から増殖性肝細胞を効率よく単離することが可 能であることが確認された。
実施例 3
スフエロィド形成による増殖性ヒト肝細胞の分化誘導
1. 肝細胞のスフエロイド形成
実施例 2で得た増殖性ヒト肝細胞を、 マトリゲル （MATRIGELTM Matrix ^ ベ クトン，ディッキンソン） 上に 1cm2 当たり 1 X 105個播種し、 牛胎児血清、 EGF、 活性持続型ビタミン C を添加した DMEM 培地で培養した。 肝細胞は、 培養 1 日目にはマトリゲル上でスフエロイドを形成した （図 7上段） 。
2. ヒト型 P450遺伝子発現の解析
培養ヒト肝細胞をマトリゲル上に播種後、 7日目 （図 7下段） にスフエロイド を回収した。 このスフエロィドの肝細胞から total RNA を抽出し、 逆転写反応 により cDNAを合成した。 6種類のヒト型 P450分子種 （CYP1A1、 1 A2、 2C9、 2C19、 2D6、 3A4) のそれぞれの遺伝子 cDNA に対するプライマ一を合成し、 PRISM 7700 Sequence Detector (ABI PRISM™社） を用いて、 'それぞれの mRNA 発現量を定量した。 また、 ヒト肝臓から分離した直後の肝細胞および単 層培養した増殖性ヒト肝細胞も同様にして P450遺伝子究現を定量した。
その結果、 スフエロイド培養した肝細胞は、 単層培養した肝細胞に比較して、 各種ヒト型 P450 の遺伝子発現が高いことが確認された。 また一部のヒト型 P450遺伝子は、 分離直後の正常ヒト肝細胞と同程度の P450遺伝子発現を示し た （図 8) 。
3. アルブミン分泌量の解析
スフエロィド培養した肝細胞および単層培養した肝細胞のそれぞれの培養上清 を 3 日毎に回収し、 培地中のヒ トアルブミン濃度を Quantitative ELISA immunoassay (Bethyl Laboratories丄 nc.) を用いて l目』疋した。
その結果、 単層培養した肝細胞に比較して、 スフエロイド培養した肝細胞は、 培養 6 日目以降に高いアルブミン分泌量を示した （図 9) 。
4. P450酵素活性の解析
スフエロイド培養から 22 日目にリ ドカイン塩酸 （500 i g/ml) を培地に添加 し、 24 時間インキュベートした。 培地を回収し、 培地中のリ ドカイン代謝産物 である MEGX量を HPLCにより測定した。 単層培養した肝細胞についても同様 の測定を行った。
その結果、 単層培養した肝細胞では培地中には MEGX は検出されなかったが、 ス フエロィ ド培養した肝細胞の培地中には MEGX が検出された （ 8.3 g/ml/24時間、 1.7 i g/ 105 cell/24時間） 。 この結果から、 スフエロイド培養 した肝細胞は、 P450 酵素活性 （化学物質代謝酵素活性） を有していることが確 認された。 実施例 4
HNF4遺伝子導入による増殖性ヒト肝細胞の分化誘導
1. 遺伝子導入
実施例 2 で得た増殖性 ヒ ト 肝細胞 に、 ヒ ト HNF4 cDNA ( GenBank/X87870) をアデノウイルスベクター （Q · BIO gene 社） を介し て培養 1 日目に Multiplicity of infection (MOI) 0、 1、 5、 10、 20、 50、 100 の割合で感染させた。
2. ヒト型 P450遺伝子発現の解析
アデノウイルスベクター感染後 7 日目の細胞を回収し、 実施例 3-2 と同様に して各種ヒト型 P450遺伝子の発現量を定量した。
その結果、 感染量依存的にヒト型 P450遺伝子の発現量増加が認められた （図 10) 。
産業上の利用可能性 以上詳しく説明したとおり、 この出願の発明によって、 増殖性を有するヒト肝 細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体と、 この抗体の使用によって分離さ れる増殖性ヒ卜肝細胞、 この細胞を分化誘導することによって得られる機能性ヒ ト肝細胞が提供される。

Claims

請求の範囲
1. 増殖性ヒト肝細胞を特異的に認識するモノクローナル抗体。
2. ハイブリ ドーマ細胞 Mouse-Mouse hybridoma K8223 ( FERM BP- 8334) が産生する請求項 1のモノクローナル抗体。
3. 請求項 1のモノクローナル抗体を産生するハイプリ ド一マ細胞。
4. Mouse-Mouse hybridoma K8223 (FERM BP-8334) である請求項 3 の ハイプリ ドーマ細胞。
5. ヒト肝細胞集団から、 請求項 1 または 2 のモノクロ一ナル抗体によって認 識される細胞を分離することを特徴とする増殖性ヒト肝細胞の分離方法。
6. 請求項 5の方法で分離された増殖性ヒト肝細胞。
7. 請求項 6の増殖性ヒト肝細胞を分化誘導する方法であって、 以下の手段： (a) 増殖性ヒト肝細胞のスフエロイド培養；および
(b) 増殖性ヒト肝細胞への肝細胞核因子 4 (HNF4) 遺伝子導入、
の少なくとも一方を行うことを特徴とする増殖性ヒト肝細胞の分化誘導方法。
8. 請求項 7の方法で分化誘導された機能性ヒト肝細胞。
9. 請求項 8の機能性ヒト肝細胞を含む細胞キット。
10. 請求項 9の機能性ヒト肝細胞を充填したハイプリッド型人工肝臓。
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