SK281965B6

SK281965B6 - Monoklonálna protilátka inhibujúca zachytávanie krvotvorných kmeňových buniek a hybridóm

Info

Publication number: SK281965B6
Application number: SK256-96A
Authority: SK
Inventors: Naoshi Fukushima
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-09-02
Publication date: 2001-09-11
Also published as: CZ290424B6; FI960566A0; CA2169951A1; CN1067726C; PL181847B1; ZA946768B; PL313259A1; CN1130406A; EP0721014A4; NO960683L; AU692465B2; HU9600208D0; SK25696A3; EP0721014A1; KR100274791B1; CZ61896A3; WO1995006747A1; NO960683D0; FI960566A; AU7546594A

Abstract

Monoklonálna protilátka inhibujúca zachytávanie (usídlenie) krvotvorných kmeňových buniek a rozoznávajúca povrchový antigén slezinnej stromálnej bunky schopnej podporovať zachytávanie krvotvorných kmeňových buniek. Vynález sa ďalej týka hybridómu produkujúceho uvedenú protilátku. Pretože monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu má schopnosť inhibovať zachytávanie krvotvorných stromálnych buniek, je užitočná ako liečivo zvyšujúce účinok protirakovinových liečiv pri klinickej liečbe leukémie.ŕ

Description

Tento vynález sa vzťahuje na novú monoklonálnu protilátku, ktorá potláča zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek a rozoznáva slezinovú stromálnu bunku, ktorá má schopnosť podporovať kotvenie krvotvomých kmeňových buniek, ďalej sa vzťahuje na hybridom produkujúci uvedenú monoklonálnu protilátku.

Pretože monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu rozoznávajú látky dôležité na zachytávanie (usídlenie, kotvenie) buniek kostnej drene na krvotvomom tkanive ako antigén a majú vlastnosť inhibovať zachytávanie kmeňových krvotvomých buniek, sú užitočné ako liečivo s poslaním zvyšovať účinnosť protirakovinových látok, napríklad zlepšovať účinok protirakovinovej látky proti leukémii uvoľňovaním akútnych myeloidných leukemických buniek z kostnej drene podľa naznačenej charakteristiky.

Doterajší stav techniky

Stimulačné faktory granulocytových kolónií, napríklad rekombinantné stimulačné faktory granulocytových kolónií (rG-CSF) boli doteraz známe ako humorálne faktory stimulujúce diferenciáciu a proliferáciu granulocytových buniek. Bolo zverejnené, že v pokusoch s myšami in vivo zvyšuje podávanie rG-CSF krvotvorbu kostnej drene a navyše spôsobuje významnú mimodreňovú krvotvorbu v slezine proliferáciou krvotvomých kmeňových buniek a všetkých krvotvomých prekurzorov v slezine. Za mimodreňový krvotvomý mechanizmus v slezine sa považuje krvotvorba, ktorá nastáva v dôsledku zmien krvotvomého okolitého mikroprostredia v slezine, stimulovaných s rG-CSF, zvyšujúcich krvotvomý potenciál.

Autori vynálezu preto pozorovali slezinové stromálne bunky s podávaným rG-CSF z hľadiska vyjasnenia krvotvomého potenciálu v slezine. Z hľadiska analýzy zvýšenia krvotvomého potenciálu stromálnymi bunkami ovplyvnenými s rG-CSF a z hľadiska vyskúšania potenciálneho účinku na krvotvorbu zistili, že použitím krvotvomých stromálnych buniek s krvotvomou stromálnou bunkovou líniou (bunky CF-1) zo sleziny myší, ktorým sa podávali rG-CSF, sa dosiahla in vitro stimulácia aktivít kolónií a in vivo sa dosiahla podpora účinnosti krvotvomých kmeňových buniek [Blood, 80,1914 (1992)].

Pretože sa podpora účinnosti krvotvomých kmeňových buniek in vivo zistila vtedy, keď sa bunky CF-1 transplantovali spolu s bunkami kostnej drene na kostnú dreň, predpokladá sa, že uvedená línia stromálnych krvotvomých buniek (bunky CF-1) má funkciu ako adhézny faktor umožňujúci krvotvomým bunkám zachytávať sa na krvotvomom tkanive.

Hoci sa niektoré zo stromálnych buniek sleziny pripravili ako bunková línia (bunky CF-1), a hoci sa stanovila ich cytologická charakteristika, doteraz sa nepripravila špecifická protilátka, ktorá by rozoznávala ich povrchové antigény a ktorej vlastnosti by boli dostatočne známe.

Preto autori tohto vynálezu neúnavným štúdiom v oblasti vývoja špecifickej protilátky schopnej rozoznávať stromálnu slezinovú bunku, ktorá má podpornú účinnosť na zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek, na základe uvedených informácií o stromálnych slezinových bunkách a z výsledkov týchto štúdií, pri ktorých pripravili stromálnu slezinovú bunku, ktorá má podpornú účinnosť na zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek ako bunkovú líniu, a súčasne prípravou monoklonálnej protilátky s použitím stromálnej bunkovej línie sleziny ako antigénu na imunizá ciu, získali ako výsledok štúdia novú monoklonálnu protilátku.

Autori vynálezu zistili, že získaná monoklonálna protilátka rozoznáva povrchový antigén stromálnej slezinovej bunky, ktorá má podpornú účinnosť na kotvenie krvotvorných kmeňových buniek a vyznačuje sa potláčaním kotvenia krvotvomých kmeňových buniek, čo viedlo k dokončeniu tohto vynálezu.

Podstata vynálezu

Predmetom a účelom tohto vynálezu je nová monoklonálna protilátka rozoznávajúca povrchový antigén stromálnej slezinnej bunky, ktorá má podporný účinok na zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek, a táto protilátka má súčasne schopnosť potláčať zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek. Predmetom tohto vynálezu je tiež hybridóm produkujúci uvedenú monoklonálnu protilátku.

Výraz monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu sa vzťahuje na novú monoklonálnu protilátku k povrchovému antigénu stromálnej slezinnej bunky, ktorá má podporný účinok na zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek a ktorá je protilátkou rozoznávajúcou stromálnu slezinnú bunku vo vzťahu k zvýšeniu krvotvomého potenciálu sleziny a ktorá je mimoriadne užitočná ako látka spôsobujúca potláčanie zachytávania krvotvomých kmeňových buniek. Zachytávanie (usídľovanie, kotvenie) krvotvomých kmeňových buniek v tomto texte znamená, že priliehavosť (adherencia) krvotvomých kmeňových buniek je spôsobená stromálnymi bunkami krvotvomého tkaniva a že bunky sa diferencujú a proliferujú ako CFU-S kolónie.

Monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu sa môže pripraviť v podstate tak, ako je uvedené ďalej.

Monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu sa môže napríklad pripraviť použitím stromálnych slezinných buniek odvodených zo zvieraťa, ktorému sa podávalo rGCSF, ako sú CF-1 bunky (slezinné stromálne bunky), pripravené autormi tohto vynálezu ako bunková línia, ako antigén, ktorý zviera imunizuje bežným imunizačným spôsobom; fúziou imunizovaných buniek bežným spôsobom fúzie a klonovaním fúzovaných buniek bežným spôsobom klonovania.

Ako spôsob prípravy monoklonálnej protilátky podľa tohto vynálezu sa môže výhodne uviesť príklad zahrnujúci použitie uvedených CF-1 buniek, pripravených ako bunková línia autormi tohto vynálezu, ako antigén [Blood, Vol. 80, 1914, (1992)]. Spôsob ďalej zahrnuje fúziu plazmových buniek (imunocytov) cicavca imunizovaného antigénom s myelómovými bunkami cicavca, napríklad myši, klonovanie získaných fúzovaných buniek (hybridómy), vyhľadávanie uvedenej bunkovej línie a výber klonov produkujúcich protilátku podľa tohto vynálezu, kultiváciu vybraných klonov na získanie predmetnej protilátky. Uvedený spôsob sa opísal ako príklad, že sa na produkciu predmetnej protilátky môžu použiť nielen napríklad uvedené CF-1 bunky, ale vhodne aj iné stromálne bunky krvotvomého tkaniva získaného podobne ako pri bunkách CF-1, alebo stromálne bunky krvotvomého tkaniva odvodeného od ľudských stromálnych buniek. Pripravia sa rovnakým spôsobom, ako v prípade uvedených CF-1 buniek.

Pri príprave uvedených monoklonálnych protilátok nie je výber cicavcov na imunizáciu uvedeným antigénom osobitne vymedzený; pri ich výbere sa berie do úvahy najmä vhodnosť na ich použitie s myelómovými bunkami, s ktorými sa má vykonať fúzia. Výhodne sa použije myš, krysa alebo škrečok.

SK 281965 Β6

Imunizácia sa vykoná bežným spôsobom, napríklad podávaním slezinných stromálnych buniek, ako sú uvedené CF-1 bunky, injekciou do abdominálnej dutiny cicavca. Podrobnejšie, uvedené bunky sa zvieraťu podávajú výhodne zriedené alebo suspendované vo vhodnom množstve PBS alebo v izotonickom roztoku chloridu sodného, niekoľkokrát za mesiac. Výhodne sa použijú slezinné bunky získané po poslednom podávaní uvedených buniek ako imunocytov.

Myelómové bunky cicavca sa môžu využiť ako ďalšie východiskové bunky na fúziu s uvedenými imunocytmi. Výhodne sa môžu použiť rôzne známe bunky zahrnujúce P3(P3X63Ag8.653) [J. Immunol., 123, 1548, (1978)], p3-Ul [Current Topics in Micro-biology and Immunology, 81, 1 až 7, (1978)], NS-1 [Eur. J. Immunol., 6, 511 až 519 (1976)], MPC-11 [Celí, 8,405 až 415, (1976)], Sp2/0-Agl4 [Náture, 276, 269 až 270 (1978)], FO [J. Immunol. Meth., 35, 1 až 21 (1980)], S194 [J. Exp. Med., 148, 313 až 323, (1978)] a R210 [Náture, 277,131 až 133 (1979)].

Bunková fúzia uvedeného imunocytu a myelómovej bunky sa môže vykonať v podstate bežnými spôsobmi, napríklad spôsobom podľa Milsteina et al., [Methods Enzymol., 73,3 až 46 (1981)].

Podrobnejšie, uvedená fúzia buniek sa môže vykonať napríklad v bežnom výživnom prostredí za prítomnosti urýchľovačov fúzie. Ako urýchľovač fúzie sa môže výhodne pridávať polyetylénglykol (PEG) a vírus Sendai (HVJ), ďalej adjuvans, ako je dimetylsulfoxid, ak sa vyžaduje zvýšiť účinnosť fúzie. Čo sa týka pomerov imunocytov k myelómovým bunkám, výhodné je 1 až 10-násobné množstvo imunocytov ako myelómových buniek. Príklady prostredí použitých pri uvedenej bunkovej fúzii zahrnujú prostredie RPMI-1640 a prostredie MEM vhodné na proliferáciu uvedených myelómových buniek a ďalšie prostredia bežne používané pri kultivácii takýchto druhov buniek a navyše sa spolu s nimi môže použiť doplnkové sérum, ako je fetálne bovinné sérum (FBS).

Fúzia buniek sa vykoná zmiešaním určených množstiev uvedených imunocytov a myelómových buniek v uvedenom prostredí, pridaním roztoku PEG, predhriateho na 37 °C, napríklad polyetylénglykolu s priemernou molekulovou hmotnosťou poriadku 1000 až 6000, do prostredia, bežne v koncentrácii asi 30 až 60 % (hmotnosť/objem) a miešaním. Predmetné hybridómy sa potom môžu vytvoriť postupným opakovaním operácií pridávania vhodného prostredia, odstredením reakčnej zmesi a odstránením supematantov.

Uvedené hybridómy sa selektujú kultiváciou v bežnom selekčnom prostredí, napríklad v prostredí HAT (stredne doplnené s hypoxantínom, aminopterínom a tymidinom). Kultivácia v prostredí HAT pokračuje v čase, dostatočnom na to, aby vyhynuli iné než predmetné hybridómy (nefúzované bunky), bežne niekoľko dní až niekoľko týždňov. Potom sa vykoná výber a monoklonovanie hybridómov produkujúcich predmetné protilátky bežným spôsobom obmedzeného riedenia.

Vytvorené hybridómy produkujúce monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu sa môžu subkultivovať v bežnom prostredí. V tekutom dusíku sa môžu uchovávať dlhý čas.

Na získanie monoklonálnych protilátok podľa tohto vynálezu od hybridómov sa môže použiť spôsob zahrnujúci kultiváciu hybridómov bežným spôsobom a ich oddelenie z prostredia supematantu, alebo spôsob zahrnujúci podávanie hybridómov vhodným cicavcom na proliferáciu hybridómov a ich oddelenie z ascitu cicavcov. Prvý z uvedených spôsobov je vhodný na získanie vysoko čistých protilátok, druhý spôsob je vhodný na hromadnú výrobu protilátok.

Protilátky získané podľa uvedeného spôsobu sa môžu bežným spôsobom ďalej čistiť do vysokého stupňa použitím bežných prostriedkov, ako je technika vysoľovaním, gélová filtrácia a afinitná chromatografia.

Pretože monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu majú schopnosť potláčať zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek, môžu sa použiť ako liečivo, ktorého poslaním je zvyšovať účinnosť protirakovinových látok pri klinickej liečbe leukémie; napríklad využitím ich vplyvu sú akútne myeloidné leukemické bunky uvoľňované z kostnej drene a zvyšuje sa tak účinok protirakovinovej látky proti leukémii.

Medzi liečivá proti leukémii, využívajúce monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu, bez toho, že sa osobitne uvádza spôsob na ich použitie ako liečiv na zlepšenie účinku protirakovinovej látky na leukémiu, sú v rámci tohto vynálezu zahrnuté aj ich modifikácie a aplikácie, pokiaľ sa použijú v praxi bežnými spôsobmi, ktoré sú známe odborníkom skúseným v danej oblasti.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje záznam imunofluorescenčnej analýzy (kontrolná vzorka bez prítomnosti protilátky, bunky CF-1).

Obr. 2 znázorňuje analýzu väzbových vlastností protilátky GSPST-1 k bunkám CF-1 pomocou imunofluorescencie.

Obr. 3 znázorňuje analýzu väzbových vlastností protilátky HMS-1 k bunkám CF-1 pomocou imunofluorescencie.

Obr. 4 znázorňuje záznam imunofluorescenčnej analýzy (kontrolná vzorka bez prítomnosti protilátky, bunky kostnej drene).

Obr. 5 znázorňuje analýzu väzbových vlastností protilátky GSPST-1 k bunkám kostnej drene pomocou imunofluorescencie.

Obr. 6 znázorňuje analýzu väzbových vlastností protilátky HMS-1 k bunkám kostnej drene pomocou imunofluorescencie.

Obr. 7 znázorňuje výsledky skúšky na monoklonálne protilátky (GSPST-1) podľa tohto vynálezu na potlačenie transplantácie kostnej drene.

Obr. 8 znázorňuje výsledky skúšky na monoklonálne protilátky (HMS-1) podľa tohto vynálezu na potlačenie transplantácie kostnej drene.

V ďalšom texte sa tento vynález opisuje podrobnejšie pomocou základného príkladu a príkladu, ktorými však nie je nijako obmedzený.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1 - základný príklad

Získanie slezinných stromálnych buniek a ich charakteristika

1. Získanie slezinných stromálnych buniek

Línia slezinných stromálnych buniek, ktoré majú schopnosť podporovať krvotvomé kmeňové bunky sa pripravila z prvotnej kultúry slezinných buniek myši

C57BL/6J, ktorej bolo podávané 100 pg . kg'¹ rG-CSF počas 5 dní.

Po ukončení podávania rG-CSF sa slezina v sterilných podmienkach vybrala. Bunky sleziny sa kultivovali v 25 ml plastikových fľašiach (Coming Co.) počas 6 týždňov v Isocoveho modifikácii Dulbeccovho prostredia (IMDM) (Boehring-Mannheim Co.) s 10 % teplom inaktivovavného fetálneho bovinného séra (FBS) (Sanko Junyaku, Tokyo), 100 jednotkami. ml'¹ penicilínu a 100 pg . mľ’ streptomycínu. Kultivácia prebiehala pri 37 °C v inkubátore s 5 % οχιάν uhličitého. Prostredie sa menilo za čerstvé prostredie vždy dvakrát za týždeň.

V tekutej kultúre sa vypestovali a z kultivačnej nádoby sa získali príslušné bunkové populácie (stromálne bunky). Pomocou 0,05 %-ného trypsínu a 0,02 %-nej EDTA (Sigma Chemical Co.) v bez Ca- a bez Mg-PBS sa bunkové populácie preniesli do nových fliaš. Tieto prenášania sa opakovali približne raz alebo dva razy za týždeň. Pri počiatočných prenášaniach (od prvého po desiate prenesenie) bol pomer riedenia buniek 1/4 až 1/8, potom bol tento pomer 1/16 až 1/32. Približne po desiatom prenesení boli stromálne bunky homogénne a fibroplastoidné.

Pri dvadsiatom prenesení sa stromálne bunky získali rovnakým spôsobom, ako je opísaný, a preniesli sa na klonovanie využitím techniky obmedzeného riedenia. Klonovanie buniek sa dva razy opakovalo, čím sa získala stromálna bunková línia (CF-1 bunková línia).

Potom sa tieto bunky udržiavali v IMDM prostredí v 25 ml bankách (Coming Co) a vždy sa po piatich dňoch podrobili subkultivácii pri riedení buniek 1/32. Línie slezinových stromálnych buniek sa môžu získať aj z iných živočíchov ako je myš. Napríklad sa môžu získať ľudské slezinné stromálne bunky rovnakým spôsobom, aký sa opísal, transformáciou buniek pomocou SV-40 adenovírusového vektora [J. Celí. Physiol., 148,245 (1991)].

2. Charakteristika buniek CF-1

CF-1 bunky sa pripravili ako bunková línia uvedeným spôsobom a skúšali sa na alkalickú fosfatázu, kyslú fosfatázu, β-glukouronidázu, α-naftylacetátovú esterázu a olejovú červenú O bežnými spôsobmi cytochemickej techniky. Bunky CF-1 sa tiež charakterizovali pomocou imunoenzymatickej histochémie použitím nasledujúcich monoklonálnych a polyklonálnych protilátok: mael (Šero Tec.); antigén príbuzný faktoru VIII (Dakopatts); typ I kolagénu, typ III kolagénu a fibrinonektín (Chemicon Intemational Inc.). Fagocyty sa skúšali absorpciou latexových perličiek (priemer častíc 1,09 pm; Sigma) a schopnosť premeny CF-1 buniek na adipocyty po kultivácii v tekutom prostredí sa skúšala štvortýždňovým vystavením buniek účinku 10'⁶ mol. dm'³fosfátu hydrokortizónu (Sigma) v 25 ml bankách.

Podľa výsledkov boli bunky CF-1 negatívne na alkalickú fosfatázu, na antigén príbuzný faktoru VIII, mael a na fagocytózu, pričom boli pozitívne na kolagén typu I, kolagén typu III a fibrinonektín. Bunky CF-1 sa v priebehu štyroch týždňov kultivácie v tekutom prostredí za prítomnosti 10'⁶ mol . dm’³ hydrokortizónu nepremenili na adipocyty, hoci CF-1 bunky mali len stopy tukov. Z uvedených údajov je zrejmé, že uvedené CF-1 bunky nemajú vlastnosti preadipocytov, makrofágov alebo endoteliálnych buniek a z toho vyplýva, že sú odvodené od stromálnych buniek, ktoré sa od uvedených buniek odlišujú.

3. Podpora krvotvomých kmeňových buniek bunkami CF-1

Aby sa zistilo, či sú, alebo nie sú krvotvomé kmeňové bunky podporované bunkami CF-1, vykonali sa CFU-S skúšky (skúška slezinových buniek na tvorbu kolónií) spôsobom podľa Tilla a McCullocha. Skupiny vždy desiatich myší sa ožiarili 900 cGy (MBR-1520R; Hitachi, Tokyo) a myši sa intravenózne injektovali s mononukleámymi bunkami kostnej drene (BM bunky) (1,0 . 10⁵/hlavu, 5.0. . 10⁴/hlavu, alebo s 2,5 . lOVhlavu) a bunkami CF-1 (1,0 . 10⁵/hlavu) a na dvanásty deň sa v slezine počítali kolónie CFU-S (slezinové kolónie).

Výsledkom bolo, že mononukleáme bunky kostnej drene (BM bunky) a CF-1 bunky sa transplantovali ožiarenými myšami, významne sa zvýšil počet slezinových kolónií v každej skupine s BM bunkami (medzi 1,4- až 1,8-krát) v porovnaní s myšami bez transplantovaných CF-1 buniek a dvanásty deň po transplantácii pomer prežitých myší s BM bunkami a s CF-1 bunkami bol vyšší ako uvedený pomer u myší len s BM bunkami, čo poukazuje na nižšiu úmrtnosť. Preto je zrejmé, že krvotvomé kmeňové bunky sú podporované bunkami CF-1.

Príklad 2 - najlepší spôsob uskutočnenia vynálezu

Získanie monoklonálnych protilátok

1. Antigény a imunizácia

Na imunizáciu sa ako antigény použili bunky CF-1 získané v uvedenom príklade L Bunky sa subkultivovali v inkubátore v podmienkach: 5 % oxidu uhličitého pri 37 °C s použitím kultivačného Isocoveom modifikovaného Dulbeccovho prostredia (IMDM) (Boehring-Mannheim Co.), doplneného 10 %-ami fetálneho bovinného séra (FBS; Sanko Junyaku).

Na bunky sa pôsobilo lmM EDTA/PBS a bunky sa vybrali z kultivačnej nádoby pomocou pipety. Bunky sa suspendovali do 1 mM roztoku EDTA/PBS na koncentráciu

1. 10⁷ buniek v 1 ml a podávali sa krysám Wistar Imamich (7 týždňov staré, samičky; od Animal Breeding Research Laboratory). Na počiatočnú imunizáciu sa injektoval jeden mililiter suspenzie buniek s koncentráciou 10⁷ buniek v 1 ml do abdominálnej dutiny krysy a potom po jednom mesiaci sa injekcia opakovala s rovnakou dávkou. Potom sa injekcia opakovala s rovnako koncentrovanou suspenziou ešte niekoľkokrát v jednomesačných intervaloch. Potom, ako sa zistila reaktivita medzi imunizovanou protilátkou krysy a CF-1 bunkami, na konečnú imunizáciu sa podal 1 ml suspenzie buniek s koncentráciou 1 . 10⁸ v 1 mililitri. Tri dni po konečnej imunizácii sa krysy utratili a vyoperovala sa slezina.

2. Bunková fúzia

Vybratá slezina sa rozomlela, získané slezinné bunky sa odstredili, suspendovali v IMDM prostredí (Boehringer - Mannheim Co.) a dôkladne sa premyli. Na druhej strane sa bunky získané kultivovanou myelómovou bunkovou líniou myší Sp2/O-Agl4 [Náture, 276, 269 až 270 (1978)] v IMDM prostredí (Boehringer-Mannheim Co.), doplnenom 10 %-ným fetálnym bovinným sérom (FBS; Sanko Junyaku), premyli uvedeným IMDM prostredím rovnakým spôsobom a odobralo sa z nich 1 . 10* a spolu s 2 .10⁸ uvedených slezinových buniek sa vložili do nádoby odstredivky, miešali sa, aby nastala bunková fúzia, pomocou polyety

SK 281965 Β6 lénglykolu 4000 (Nakarai Kagaku) podľa zvyčajného postupu [Clin. Exp, Immunol., 42,458 až 462 (1980)].

Získané fúzované bunky sa potom neriedili IMDM prostredím doplneným 20 % FBS a napipetovali sa do 96-jamkovej platne. Kultivovali sa v inkubátore pri teplote 37 °C a pri 5 % oxidu uhličitého. Potom sa postupne prostredie nahradilo selektívnym HAT prostredím a pokračovalo sa v kultivácii.

Potom, ako začala kultivácia, sa supematant nahradil novým HAT prostredím dvakrát za týždeň, aby kultivácia pokračovala a podporila sa proliferácia.

V ďalšom postupe sa získané fúzované bunky klonovali bežným spôsobom s použitím postupu obmedzeného riedenia. Podrobnejšie, zvyčajným postupom sa klonovali len tie klony, ktoré mali vysokú väzbovú schopnosť k antigénom, čo sa skúšalo bežným spôsobom zrieďovacej analýzy s použitím protilátok v supematantoch uvedených fuzovaných buniek.

3. Výber

Výber fuzovaných buniek (hybridómov) sa vykonal nepriamou fluorescenčnou protilátkovou technikou s použitím cytometrie.

Výber klonov produkujúcich predmetné protilátky sa vykonal s použitím CF-1 buniek ako terčových buniek. Podrobnejšie, bunky sa suspendovali v reakčnom pufri (PBS doplnený 2 % FBS a 0,02 % NaN₃), odstredili sa a získali sa tak tablety, ktoré sa potom suspendovali v 100 mikrolitroch supematantov kultúry hybridómov (asi 1 . 10⁶ na 100 mikrolitrov) a nechali sa reagovať pri 4 °C počas 1 hodiny. Po premytí uvedeným pufrom sa pridala značená kozia protikrysia IgG (FC) protilátka (Chemicon) a inkubovalo sa 1 hodinu. Po premytí sa vykonali analýzy prietokovou cytometriou (FACScan, Becton Dickinson).

4. Čistenie protilátok

Fúzované bunky vytriedené spôsobom opísaným v bode 3 sa kultivovali bežným spôsobom a vznikajúce protilátky sa zo supematantov oddelili bežnými spôsobmi a čistili.

Podrobnejšie, z jamiek s vysokým protilátkovým titrom na antigény sa získali hybridómy, rozptýlili sa do tkanivovej kultúry v plastovej miske (Coming Co.), kultivovali sa v podmienkach s 5 % oxidu uhličitého pri 37 °C, proliferovali a čistili sa bežným spôsobom, čím sa získali monoklonálne protilátky GSPST-1 a HMS-1.

V tomto prípade sa vo vzťahu k protilátke HMS-1 a k protilátke GSPST-1 získané bunky injektovali do abdominálnej dutiny myší BALB/cAJcl-nu (osemtýždňovým samčekom, Nippon Kurea), z ktorých sa získal ascit po 10 až 14 dňoch, vysolil sa 33 %-ným síranom amónnym a dialyzoval s PBS.

V uvedenom príklade sa opísal prípad, v ktorom sa na imunizáciu ako antigény použili CF-1 bunky; rovnakým spôsobom možno pripraviť monoklonálnu protilátku v prípade, že sa použijú stromálne slezinné bunky vrátane stromálnej bunkovej línie krvotvomého tkaniva odvodeného z ľudských stromálnych buniek. Tento vynález nie je obmedzený na uvedené monoklonálne protilátky, ale zahrnuje všetky monoklonálne protilátky, ktoré majú rovnaké vlastnosti, pripravené rovnakým spôsobom, a všetky hybridómy produkujúce takéto monoklonálne protilátky.

Hybridóm produkujúci monoklonálnu protilátku HMS-1 podľa tohto vynálezu je nová fuzovaná bunka pripravená z rodičovských buniek Wistar Imamich - krysej slezinovej bunky a z myelómovej bunkovej línie SP2/O-Agl4 myší, a bola uložená 9. augusta 1993 pod označením HMS-1 (krysí-myšací hybridóm) s prístupovým číslom FERM BP-4383 v National Inštitúte of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology in Japan [adresa: 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305, Japonsko], na medzinárodnom úrade podľa Budapeštianskej dohody o medzinárodnom prieskume uloženia mikroorganizmov na patentové účely.

5. Vlastnosti protilátok

i) (Reaktivita s CF-1 bunkami)

Výsledky skúšok reaktivity získaných monoklonálnych protilátok GSPST-1 a HMS-1 s CF-1 bunkami imunofluorescenčnou analýzou sú znázornené na obr. 1 až 3. Na obr. 1 sú uvedené výsledky analýzy kontrolnej vzorky v neprítomnosti protilátky. Obr. 2 znázorňuje výsledky analýzy väzbových vlastností GPSPT-1 s CF-1 bunkami a obr. 3 znázorňuje výsledky analýzy väzbových vlastností HMS-1 s bunkami CF-1. Zvislá os na obrázkoch znázorňuje relatívny počet buniek a vodorovná os intenzitu fluorescencie.

Ako je zrejmé z obr. 1 až 3, ukázalo sa, že monoklonálne protilátky GSPST-1 a HMS-1 majú väzbové vlastnosti k CF-1 bunkám a rozoznávajú povrchové antigény CF-1 buniek.

Reaktivita k bunkám kostnej drene

Výsledky analýzy reaktivity GPSPT-1 a HMS-1 s normálnymi bunkami kostnej drene pomocou prietokovej cytometrie (FACScan, Becton, Dickinson) sú znázornené na ďalších obrázkoch 4 až 6. Obr. 4 znázorňuje výsledky analýzy kontrolnej vzorky v neprítomnosti protilátky. Obr. 5 znázorňuje výsledky analýzy väzbových vlastností GSPST-1 k bunkám kostnej drene a obr. 6 uvádza výsledky analýzy väzbových vlastností HMS-1 k bunkám kostnej drene. Na obrázkoch na zvislej osi je opäť vynesený relatívny počet buniek a na vodorovnej osi intenzita fluorescencie.

Ako je zrejmé z obr. 4 až 6, ukázalo sa, že GSPST-1 nemá schopnosť viazať sa na akékoľvek bunky kostnej drene a že MHS-1 má schopnosť viazať sa na niektoré bunky kostnej drene.

ii) Zatriedenie protilátok

Výsledkom zatriedenia (použitím krysej Mono Ab-ID-Sp súpravy (Zymed)) získaných monoklonálnych protilátok v podskupine IgG je pravdepodobnosť, že GSPST-1 je IgG2a a že HMS-1 je IgG2b.

iii) Schopnosť inhibovať transplantáciu kostnej drene

Na posúdenie vlastností uvedených protilátok sa vykonali pokusy inhibovať týmito protilátkami transplantáciu kostnej drene. Výsledky pokusov sú znázornené na obrázkoch 7 a 8. Ako je zrejmé z obr. 7 a z obr. 8, HMS-1 má inhibičný vplyv na transplantáciu kostnej drene, ale tento vplyv sa nezaznamenal u GSPST-1. Podrobnejšie, uvedené výsledky sa získali podaním 1,0 . 10⁵/hlavu buniek kostnej drene a monoklonálnej protilátky do chvostovej žily myšiam C57BL/6J ožiareným smrteľnými dávkami (900 cGy) a sledovaním tvorby slezinných kolónií. „Neliečené“ („Non-treated“) na obr. 8 znázorňuje prípad, keď sa nepodali nijaké bunky kostnej drene. Pretože sa zistilo, že monoklonálna protilátka HMS-1 podľa tohto vynálezu vykazuje inhibíciu transplantácie kostnej drene podľa uvedeného pokusu, je zrejmé, že protilátka inhibuje tiež zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek a vznik CFU-S kolónií.

Odborníkom skúseným v tejto oblasti je zrejmé, že inhibičný vplyv monoklonálnej protilátky voči transplantácii kostnej drene zodpovedá schopnosti inhibovať zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek a tvorbu CFU-S kolónií. Napríklad sa uvádza, že monoklonálna protilátka (ACK-2 protilátka, jedna z protilátok C-súpravy) vytvorená použitím známej žírnej bunky ako antigénu má funkciu inhibovať transplantáciu kostnej drene u myši, podobne ako monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu [Blood, 78, 1706 (1991)]; v správe sa uvádzajú závery pokusov s inhibíciou transplantácie kostnej drene tak, že protilátka potláča zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek a vznik kolónií CFU-S.

Spomenutá známa protilátka ACK-2 sa pripravuje použitím žírnej bunky ako antigén. Žírna bunka je krvotvomá bunka diferencovaná a proliferovaná z krvotvomej kmeňovej bunky. Na druhej strane nie je stromálna bunka krvotvomého tkaniva použitá v tomto vynáleze krvotvomou bunkou, ale bunkou podporujúcou diferenciáciu a proliferáciu krvotvomej bunky, a preto sú vzájomne celkom rozdielne.

Ukázalo sa, že keď sa hybridóm, produkujúci HMS-1 podáva do abdominálnej dutiny myši, myš nezomiera na hromadenie ascitu. Potom sa inhibičný vplyv HMS-1 na transplantáciu kostnej drene nepovažuje za jav spôsobovaný tzv. apoptózou (ktorá sa tiež označuje ako programové hynutie buniek, čo je jav, pri ktorom sa chromatínové DNA jadra odbúravajú v nukleozómovom prvku (tzv. vznik rebríka), čo vyúsťuje do hynutia buniek), ale jav spôsobovaný väzbou monoklonálnej protilátky na molekulu na zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek v krvotvomom tkanive. Preto je zrejmé, že antigén rozoznávaný protilátkou HMS-1 je látka dôležitá na zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek v krvotvomom tkanive.

Ako sa zistilo uvedenými pokusmi, monoklonálna protilátka HMS-1 podľa tohto vynálezu rozoznáva povrchový antigén slezinovej stromálnej bunky, ktorá má schopnosť podporovať zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek, a ďalej sa vyznačuje schopnosťou inhibovať zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek.

HMS-1 má tak schopnosť inhibovať zachytávanie buniek kostnej drene na krvotvomom tkanive; uvádza sa, že leukemické bunky sa uvoľňujú z kostnej drene v zhode so znižovaním expresie VLA4 a VLA5 priliehajúcich molekúl už uvedených krvotvomých buniek [expresia VLA molekúl môže byť vyvolaná pri uvoľňovaní akútnych myeloidných leukemických buniek z kostnej drene, Leuk. Res., 16, (5), 469 až 474 (1992)]; uvádza sa, že monoklonálna protilátka k VLA4 a VLA5 zlepšuje účinok liečiv leukémie uvoľňovaním leukemických buniek z kostnej drene. Na liečbu leukémie sa preto môže s rovnakým výsledkom použiť aj uvedená HMS-1.

Monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu sa podrobne opísali uvedeným príkladom; monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu zahrnujú v príkladoch uvedené monoklonálne protilátky, vynález však nie je ich uvedením obmedzený, ale zahrnuje všetky monoklonálne protilátky, ktoré majú rovnaký účinok a funkciu, pripravené rovnakým spôsobom.

Priemyselná využiteľnosť

Pretože monoklonálne protilátky podľa tohto vynálezu rozoznávajú látky dôležité na zachytávanie buniek kostnej drene na krvotvomom tkanive ako antigén a majú schopnosť inhibovať zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek, sú užitočné ako liečivo s poslaním zvýšiť účinok protirakovinových liečiv proti leukémii uvoľňovaním akútnych myeloidných leukemických buniek z kostnej drene v súlade s ich uvedenými vlastnosťami.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Monoklonálna protilátka inhibujúca zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek a rozoznávajúca povrchový antigén slezinnej stromálnej bunky schopnej podporovať zachytávanie krvotvomých kmeňových buniek.

2. Hybridóm produkujúci monoklonálnu protilátku podľa nároku 1.