JPH06319585A - 抗体およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 分化誘導因子で刺激された細胞の細胞間接着
を抑制し、従来とは異なる免疫抑制作用機序を有する抗
体および分化誘導因子で刺激されて分化の過程にある細
胞の細胞間凝集を誘導する作用を有し、それらの細胞間
伝達による生体の免疫系の活性化を促し、エイズなどの
疾患に対して有益と考えられる抗体を提供する。 【構成】 リポポリサッカライドで刺激された単球／マ
クロファージ系細胞を抗原として得られる抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明はリポポリサッカライド
で刺激された単球／マクロファージ系細胞を抗原として
得られる抗体およびその製造法に関するものであり医療
の分野で利用される。

【０００２】

【従来の技術】発生の過程において種々な器官が形成さ
れ、成長にともなって細胞が増殖し、細胞集合体が形成
されてくるが、この集合体形成に欠くことのできないも
のが接着分子（ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）
である。接着分子は細胞と細胞との結合にあづかるだけ
でなく細胞同士の情報交換を行い、細胞間情報のネット
ワークを仲介して生体の恒常性を調節している。現在、
接着分子は構造の違いからいくつかのファミリーに分類
されており、種々な生体の条件等によってそれぞれの接
着分子が使い分けられている。例えばＴ細胞上のＬＦＡ
−２（ＣＤ２）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５４はＩｇスー
パーファミリーに、白血球に広く分布するＬＦＡ−１
（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８、ＣＤ
１１ｃ／ＣＤ１８）はインテグリンファミリーに分類で
きる。このように接着分子は細胞間の情報ネットワーク
を仲介して生体の免疫系を調節していると考えられてい
る。すなわち、接着分子はある意味では生体防御の誘導
に重要な役割を果し、微生物等の侵入に対する感染防御
にも接着分子は重要な位置を占めていると考えられる。

【０００３】例えば生体の感染防御には種々な細胞群が
関与するが、初期の防御には単球／マクロファージの細
胞群が関与している。一方、防御成立時には各種サイト
カインによる細胞同士の凝集（ｈｏｍｏｔｙｐｉｃ ｃ
ｅｌｌ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，以下「ＨＣＡ」と略
記することがある）、すなわち細胞の細胞間接着が生
じ、細胞間情報伝達が行われていると推測される。特に
グラム陰性菌感染の場合はその構成成分であり、各種サ
イトカインの強力なインデューサーであるリポポリサッ
カライド（以下「ＬＰＳ」と記すことがある）がその主
役を演じていると考えられる。すなわち、ＬＰＳは単球
／マクロファージ表面上のある種の接着分子の発現調節
をコントロールしていると考えられるが、現在のところ
ＬＰＳで刺激された単球／マクロファージ系細胞を抗原
として得られる抗体は知られていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】前記した接着分子のう
ちでも特に、ＬＦＡ−１（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｆｕ
ｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ
−１）−ＩＣＡＭ−１（ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ
ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１，ＣＤ５４）
接着経路は、白血球の血管内皮細胞への接着、リンパ球
の抗原特異的な反応など、免疫系のさまざまな相互作用
において重要な役割を果たしていることが知られてい
る。細胞の細胞間接着を抑制することは、免疫反応の抑
制、例えば臓器移植の際の拒絶反応の抑制などに有用で
ある。現在この細胞間接着を抑制するモノクローナル抗
体としては、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）を認識するモノ
クローナル抗体であるＬＢ−２、そのレセプターである
ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ１１ｃ）を
認識するモノクローナル抗体であるＧ２５．２，Ｄ１
２，ＳＨＣＬ−３，およびＣＤ１８を認識するＬ１３０
などが知られているが、これらのモノクローナル抗体で
は十分に抑制できない免疫反応があるのが現状である。

【０００５】一方、細胞間凝集を誘導する分子はカドヘ
リンを中心とした接着分子であるが、近年ＣＤ１４、Ｃ
Ｄ１８、ＣＤ４３、ＣＤ４９ｄ、ＨＬＡクラスＩＩ分子
からのシグナル伝達が細胞間凝集の誘導に重要な役割を
演じていることが報告されている。細胞の細胞間凝集を
誘導することは細胞間の情報伝達を活発化し、さらには
外界の現象を細胞内に伝達するための生理的現象であ
る。また細胞間凝集を誘導することはリンパ球（Ｔ．Ｂ
リンパ球）や単球にとっては増殖するための有益な条件
設定であり、しいては生体内の免疫系の活性化（増強）
につながるものである。現在この細胞間凝集の誘導に係
わる分子は上記のカドヘリン、ＣＤ１４、ＣＤ１８、Ｃ
Ｄ４３、ＣＤ４９ｄ、ＨＬＡクラスＩＩ分子等があげら
れるが、これらは主にある特定の未熟または成熟した細
胞群に対して細胞間凝集を誘導するものである。生体の
細胞はその発生からいくつかの分化段階を経て成熟細胞
に成長するのであるが、現在世界的に問題となっている
エイズ（ＡＩＤＳ）は、生体の成熟細胞、例えば末梢の
ヘルパーＴ細胞、さらには初期の感染防御に必須とされ
る単球／マクロファージ系細胞などが破壊されて自己免
疫力の低下を伴い種々の感染症を合併する疾患である。
そこで、初期の感染症を防御するために免疫力の低下し
た生体、例えばエイズ患者の成熟単球系細胞以外の、分
化の過程にある細胞、特に単球系細胞の細胞間凝集を誘
導し、生体免疫系の活性化を誘導するための分子が求め
られる。

【０００６】

【課題を解決するための手段】この発明の発明者らはこ
れらの課題を解決すべく鋭意研究した結果、リポポリサ
ッカライドで刺激された単球／マクロファージ系細胞を
抗原として得られる抗体、特にモノクローナル抗体の一
つが、分化誘導因子で刺激された細胞の細胞間接着を顕
著に抑制し、さらに公知のモノクローナル抗体とは異っ
た、すなわち従来の免疫抑制経路とは異なった新しい経
路で免疫反応を抑制することを見出した。

【０００７】また、同時に得られる別のモノクローナル
抗体が、従来知られている成熟したある特定の細胞の細
胞間凝集を誘導するモノクローナル抗体とは異なり、分
化誘導因子で刺激され、ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅのあ
る分化の過程にある細胞、特に単球系細胞の細胞間凝集
を誘導すること、さらにはこの抗体によりある分化段階
に位置する単球系細胞群の動態を調べることができるこ
とを見出した。そしてこの単球系細胞の細胞間凝集を誘
導することにより免疫系の活性化を促し、しいては種々
の感染症を伴い易いエイズ患者の初期の感染防御（免疫
力の増強）を付与するための一つの手段として大変有益
である可能性を見出してこの発明を完成した。

【０００８】この発明の抗体は、リポポリサッカライド
で刺激された単球／マクロファージ系細胞を抗原として
得られるものである。そしてこの発明の抗体は、分化誘
導因子（例えばリポポリサッカライド，ＰＭＡ，各種サ
イトカインなど）で刺激された細胞（例えば単球／マク
ロファージ系細胞など）の細胞間接着を抑制する作用を
有するものである。さらにこの発明の別の抗体、特にモ
ノクローナル抗体は分化誘導因子（例えばリポポリサッ
カライド，ＰＭＡ，各種サイトカインなど）で刺激され
て分化の過程にある細胞（例えば単球／マクロファージ
系細胞など）の細胞間凝集を誘導する作用を有するもの
である。またこの発明の抗体の製造法は、リポポリサッ
カライドで刺激された単球／マクロファージ系細胞を抗
原として用いるものである。

【０００９】この発明の抗体はポリクローナルまたはモ
ノクローナルのいずれでもよく、当該技術分野で周知の
方法により調製することができるが、モノクローナル抗
体が好ましい。ポリクローナル抗体は、ウサギ等の動物
にリポポリサッカライドで刺激された単球／マクロファ
ージ系細胞を投与して免疫した後、得られる抗血清から
硫安等の塩析、遠心分離、透析、カラムクロマトグラフ
ィーなどの常法の操作に付して、単離・精製することに
より得ることができる。単球／マクロファージ系細胞と
してはＵ９３７細胞などが挙げられる。このリポポリサ
ッカライドで刺激された単球／マクロファージ系細胞
は、未分化な単球／マクロファージ系細胞にリポポリサ
ッカライドを添加し培養することにより得ることができ
る。リポポリサッカライドはグラム陰性菌（例えばサル
モネラ菌など）由来のものを用いるのが好ましい。

【００１０】他方モノクローナル抗体（以下「ｍＡｂ」
と略記することがある）は、リポポリサッカライドで刺
激された単球／マクロファージ系細胞で免疫された哺乳
動物から取り出した抗体産生細胞と、適当な動物由来の
腫瘍細胞とを融合させ、目的抗体を生産する融合細胞を
クローン化して得られるハイブリドーマを培養して製造
される。ハイブリドーマを得るには、先ずリポポリサッ
カライドで刺激された単球／マクロファージ系細胞で哺
乳動物を免疫する。哺乳動物としては、マウス等が使用
できる。実際の免疫方法としては、例えばマウスに抗原
とするリポポリサッカライドで刺激された単球／マクロ
ファージ系細胞を腹腔内又は皮下等に接種することによ
り免疫する。接種は１回当り１０⁶〜１０⁷ｃｅｌｌｓ／
ｍｏｕｓｅで１〜２週毎に数回くり返す。最終免疫後１
〜５日目に脾臓を摘出し、抗体産生細胞として使用す
る。次にこの抗体産生細胞と融合させてハイブリドーマ
を得るための親細胞としてミエローマ等の腫瘍細胞株
（例えばＮＳ−１など）を用意し、これと抗体産生細胞
とを融合させてハイブリドーマを作製する。ハイブリド
ーマ作製は、培地としてＲＰＭＩ１６４０，イーグルの
ＭＥＭ、ダルベッコの改良ＭＥＭなどに１０％ＣＳ（ｃ
ａｌｆ ｓｅｒｕｍ）又は５％ＦＣＳ（ｆｅｔａｌ ｃ
ａｌｆ ｓｅｒｕｍ）＋５％ＣＳ、あるいは１０％ＦＣ
Ｓを加えたものを用いる。

【００１１】細胞融合を行うにあたり、まず親細胞であ
るミエローマ等の腫瘍細胞と脾細胞とを１：５乃至１：
１０の比率で用意する。融合剤としては、ポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ）などを使用する。融合株のＨＡＴ
セレクションの方法は、公知の方法により行う。生じる
ハイブリドーマのスクリーニング法は、主に培養上清を
用い、間接ロゼット法、ＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｚｙｍｅ
ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓ
ａｙ）（Ｄｙｎａｔｅｃｈ法）など公知の方法を用いて
目的の免疫グロブリンを分泌しているハイブリドーマの
クローンを拾いあげる。クローンは徐々にふやし、１０
⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌに達した時 点でサブクローニングを
行う。ハイブリドーマの単一性を吟味するため、９６穴
のマイクロウエルにフィーダー層（ｆｅｅｄｅｒ ｌａ
ｙｅｒ）として正常な脾細胞をおよそ１０⁵ｃｅｌｌｓ
／ｗｅｌｌまいた上にハイブリドーマを １穴に０．１
〜０．３個まき、約１〜２週間培養後生育してくるクロ
ーンについて再びスクリーニングを行う。このサブクロ
ーニングをくり返すことにより、単一性のハイブリドー
マを得る。

【００１２】次に、モノクローナル抗体を製造するため
に、上記で得られたハイブリドーマを培養容器中（ｉｎ
ｖｉｔｒｏ）又は動物体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で培養
するが、ｉｎ ｖｉｖｏ系の培養の方が好ましい。ｉｎ
ｖｉｔｒｏ系で培養する場合、培地は先に述べた通常
培地にＣＳ又はＦＣＳを添加したものでよく、この培地
で３〜５日培養の後、培養上澄よりｍＡｂを得る。ｉｎ
ｖｉｖｏ系による培養では、ハイブリドーマをマウス
などの哺乳動物の腹腔に接種し、１〜２週間後に腹水を
採取し、これよりｍＡｂを得る。こうして得られた培養
上澄又は腹水からのｍＡｂの精製は、硫安分画、プロテ
インＡアフィニティカラム等の公知の方法により行うこ
とができる。尚、これらのｍＡｂの諸性質はいくつかの
系を組んで、これまでに知られている抗体との反応性の
違いなどから見い出す。

【００１３】

【実施例】

実施例１ モノクローナル抗体の作製 (a) 免疫 単球系細胞株（Ｕ９３７細胞）を１０％ＦＣＳ−ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で１×１０⁵個／ｍｌになるように調整
した。その１０ｍｌを培養シャーレに分注し、サルモネ
ラ ミネソタ（Ｓａｌｍｏ ｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏ
ｔａ）由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）（Ｎｏ．
Ｌ−６２６１、Ｓｉｇｍａ社製）を１０〜２０μｇ／ｍ
ｌになるよう添加した。５％ＣＯ₂ インキュベータで４
８時間培養した後、シャーレに付着した細胞（５×１０
⁶ 個）を１週間隔で３回ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に
注射した。その後、１回静脈内に注射した。なおこのＵ
９３７細胞および（ｃ）のＮＳ−１細胞は、いずれも大
学、研究機関などでよく用いられており、容易に入手可
能なものである。 (b) 脾臓細胞の準備 最終免疫３日後に脾臓を無菌的に取り出し、ＲＰＭＩ１
６４０培地でｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓ
ｉｏｎを作った。赤血球をトリス塩化アンモニウム緩衝
液で処理することで溶血除去した後、ＲＰＭＩ１６４０
培地で３回遠心洗浄（１０００回転１０分）した。 (c) 親細胞株（Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−Ｉ；ＮＳ
−１）の準備 融合３日前にＮＳ−１細胞を１０⁵ 個／ｍｌの濃度にな
るように８−ａｚａｇｕａｎｉｎｅ（１００μＭ）加１
５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。対数増
殖期のＮＳ−１細胞をフラスコより回収し、ＲＰＭＩ１
６４０培地で３回遠心洗浄（１０００回転１０分）し
た。

【００１４】(d) 細胞融合 ＮＳ−１細胞１×１０⁷ 個と免疫脾細胞１×１０⁸ 個を
遠心管（５０ｍｌタイプ）内で混ぜ、１０００回転１０
分遠沈した。上清をパスツールピペットで完全に除去し
た後、細胞ペレットをときほぐし、そこへ３７℃に温め
ておいたＰＥＧ溶液０．５ｍｌを加え、室温で１分間反
応させた。１分後、３７℃に温めておいたＲＰＭＩ１６
４０培地１ｍｌを約１分かけて添加する。以後、３０秒
ごとにＲＰＭＩ１６４０培地を１ｍｌずつ加え、最終的
に１０ｍｌとした。ＰＥＧ溶液を希釈後、１２００回転
１０分間室温で遠沈し、上清を完全に除去した。つぎに
３７℃に温めておいた１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０
培地に浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに０．１
ｍｌずつ分注した（ＮＳ−１細胞５×１０⁴ 個／ウェ
ル）。２４時間後、３７℃に温めておいたＨＡＴ培地
（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含
む培地）を０．１ｍｌ加え、以後、２〜３日ごとに半量
ずつＨＡＴ培地を交換した。２週間後、いくつかのウェ
ルで細胞がコロニーを形成して増殖してきた。このコロ
ニーがウェルの１／３以上を占めたならばＨＴ培地（Ｈ
ＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）に置換し
た。約１週間ＨＴ培地で培養した後、ＨＴ培地を徐々に
通常培地（１５％ＦＣＳ−ＲＰＭＩ１６４０培地）に置
換した。細胞が順調に増殖してくればフラスコに移して
維持した。

【００１５】(e) クローニング ハイブリドーマを通常培地に浮遊させ、０．３個／ウェ
ルになるように９６ウェルマイクロプレートに分注し、
ＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞をｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌ
ｌとしてクローニングを行った。培地は３日ごとに交換
した。約２週間後にクローンの中から免疫原に対するモ
ノクローナル抗体を産生する３つのハイブリドーマを得
た。このうち１つのハイブリドーマから得られ、細胞間
接着を抑制するモノクローナル抗体をＮＩ−５８ｍＡｂ
と命名した。また、別のハイブリドーマから得られ、分
化誘導因子で刺激されて分化の過程にある単球系細胞の
細胞間凝集を誘導するモノクローナル抗体をＮＩ−１１
ｍＡｂと命名した。 (f) 抗体の腹水化と精製 プリスタン（Ｓｉｇｍａ）０．５ｍｌで約１〜２週間前
に処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに１０⁷ 個のこれら２つ
のハイブリドーマをそれぞれ接種した。１〜２週間後に
腹水が得られた。プロテインＡアフィニティカラムなど
を用いて精製した。

【００１６】以下の実施例２〜８にこの発明のＮＩ−５
８ｍＡｂの特性を示す。 実施例２ クラスの決定 実施例１で得られたこの発明のＮＩ−５８ｍＡｂのクラ
スを２重免疫拡散法で決定したところ、ＩｇＧ１である
ことが判った。

【００１７】実施例３ ＮＩ−５８ｍＡｂが認識する抗
原分子の同定 この発明のＮＩ−５８ｍＡｂが認識する抗原分子をＷｅ
ｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により検討した。Ｕ９
３７細胞をｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭＮａＣｌ，５ｍ
ＭＥＤＴＡ，０．５％ＮＰ−４０）で可溶化した後、抗
原を２−メルカプトエタノール存在下で１００℃１分間
処理した。一定量の抗原溶液を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで電気泳動した後、セルローズ膜に転写した。転写
後、セルローズ膜をｂｌｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ
（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍ
ＮａＣｌ，５ｍＥＤＴＡ，０．２５％ゼラチン、０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、５％ドライミルクでブ
ロッキングした。つぎに至適濃度のこの発明のＮＩ−５
８ｍＡｂおよびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇ
Ｆ（ａｂ’）₂をセルローズ膜に反応させ、基質液にて
発色させた。分子量マーカーとして分子量２９〜２０５
ＫＤのものを用いた。図１に示すように、この発明のＮ
Ｉ−５８ｍＡｂが認識するＮＩ−５８抗原は分子量約６
５ＫＤの単一バンドとして観察された。

【００１８】実施例４ ＮＩ−５８ｍＡｂの各種細胞に
対する結合能 各種標的細胞に至適濃度の各種モノクローナル抗体を４
℃で１時間反応させた。次いで各細胞をゼラチンベロナ
ール緩衝液（ＧＶＢ）で洗浄後、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マ
ウスＩｇＦ（ａｂ’）₂を加え、４℃で２０分間反応さ
せた。各細胞を再び洗浄後、螢光染色陽性細胞をフロー
サイトメトリー法で解析した。結果を表１に示す。

【表１】 表１から明らかなように、この発明のＮＩ−５８ｍＡｂ
は、公知の各モノクローナル抗体、特に公知の細胞間接
着を抑制するモノクローナル抗体（Ｇ２５．２，ＭＯ−
２，Ｌ１３０，ＬＢ−２）とは異なる結合能を有するた
め、これら公知のモノクローナル抗体とは認識する抗原
が異なることが判る。

【００１９】さらに、白血病細胞をＮＩ−５８ｍＡｂを
用いたフローサイトメトリーにより試験した。その結
果、ＮＩ−５８ｍＡｂによって認識された抗原は、急性
リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）患者から得られた白血病
細胞に強く反応した。また別実験によりＵ９３７細胞に
ＮＩ−５８ｍＡｂを反応させたのち、ＦＩＴＣまたはＰ
Ｅで標識したＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４４、ＣＤ５
４、ＣＤ２９およびＣＤ１１ｂの抗体をそれぞれ反応さ
せても、これらのいずれの抗体も強く反応することか
ら、ＮＩ−５８ｍＡｂはこれらのいずれの抗体とも交差
反応をしない新しい抗体であることが判った。

【００２０】実施例５ ＬＰＳ刺激Ｕ９３７細胞のＨＣ
Ａ阻害効果 １×１０⁵ 個のＵ９３７細胞を９６穴プレートにまき、
そこにＬＰＳ（２５μｇ／ｍｌ）およびこの発明のＮＩ
−５８ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）またはＬＢ−２（２０
μｇ／ｍｌ、ベクトンデッキンソン社製）を添加し、２
４時間培養した。モノクローナル抗体によるＬＰＳ刺激
Ｕ９３７細胞（ＣＤ１４陽性へと分化）の細胞間凝集阻
止効果を顕微鏡下で判定した。対照として無添加のも
の、ＬＰＳ（２５μｇ／ｍｌ）のみ添加したものおよび
陰性対照としてＬＰＳにＩｇＧ１またはＩｇＧ２ｂ抗体
を添加したものを用いた。 結果を図２に示す。図２か
ら明らかなように、この発明のＮＩ−５８ｍＡｂはＬＰ
Ｓ刺激Ｕ９３７細胞のＨＣＡを顕著に抑制し、その抑制
効果は同じ濃度のＬＢ−２よりも強いことが判る。

【００２１】実施例６ ＬＰＳ刺激後のＵ９３７細胞表面上に発現する実施例３
のＮＩ−５８ｍＡｂが認識する抗原（以下ＮＩ−５８抗
原という）およびＣＤ５４（ＬＢ−２ｍＡｂに対する抗
原）の発現量の変化をフローサイトメトリー法で解析し
た。結果を図３に示す。図３から明らかなように、ＣＤ
５４はＬＰＳ刺激後その発現量が著明に増加するが、Ｎ
Ｉ−５８抗原はＬＰＳ刺激後もその発現量が全く変化し
ないことが判る。すなわちＬＰＳ刺激Ｕ９３７細胞のＨ
ＣＡは、ＮＩ−５８抗原を介する経路とＣＤ５４を介す
る経路に分けられるが、ＮＩ−５８抗原を介する経路は
ＣＤ５４を介する経路とは異なりＬＰＳ刺激後のＮＩ−
５８抗原の発現量に左右されない経路であることが判
る。

【００２２】実施例７ リンパ球混合培養反応における
抑制効果（ＭＬＣ：ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
ｃｕｌｔｕｒｅ） 末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍ
ｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ；ＰＢＭＣ_s）を無菌
的に分離し、２０％ヒト正常血清（Ａ型、Ｂ型、ＡＢ型
およびＯ型を混合したもの）加ＲＰＭＩ１６４０培地に
調整した。反応細胞（Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）６×１０⁴
個と刺激細胞（Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）６×１０⁴個を
等量、さらにＮＩ−５８ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）を９
６穴マイクロプレートに加え、３７℃ ５％ＣＯ₂イン
キュベータで６日間培養した。この時刺激細胞は４０μ
ｇ／ｍｌのマイトマイシンＣでＤＮＡ合成を阻止してお
く。６日後、³Ｈ−チミジン １μＣｉを各穴に加え、
３７℃５％ＣＯ₂インキュベータで１日培養した。１日
後細胞をフィルター吸着させ、液体シンチレーションカ
ウンターで１分間の³Ｈ−チミジンの細胞内取り込みを
測定した。（ＤＮＡ合成能の測定） 結果を表２に示す。

【表２】 表２から明らかなように、ＦとＡは他人であり、主要組
織適合複合体であるＨＬＡ抗原のタイプが異なるので、
各々の細胞を混合した場合、反応Ｔ細胞のｃｐｍカウン
トは増殖の結果高い値を示す（ＤＮＡ合成能の増加）
が、この発明のＮＩ−５８ｍＡｂを同時に添加した場合
はｃｐｍカウントが顕著に低下した。すなわちＮＩ−５
８ｍＡｂはアロ抗原を認識したＴ細胞の増殖、すなわち
細胞性免疫を意味するリンパ球混合培養反応を、細胞間
接着に基づく細胞認識の阻害を通じて抑制すると考えら
れる。

【００２３】実施例８ ポックウィードマイトゲン（Ｐ
ＷＭ）刺激Ｂ細胞の抗体産生抑制効果 ＰＢＭＣ_sを無菌的に分離し、１０％牛胎児血清添加Ｒ
ＰＭＩ１６４０培地で調整した。調整されたＰＢＭＣ_s
１×１０⁵個をマイクロプレートに加え、同時にＰＷＭ
を最終濃度が（１：５０）になるように添加した。次い
でＮＩ−５８ｍＡｂを最終濃度が２０μｇ／ｍｌになる
よう添加し、３７℃ ５％ＣＯ₂ インキュベータで７日
間培養した。７日後細胞を回収し、プロティンＡを結合
したヒツジ赤血球による逆プラーク法により、ＰＷＭに
よるＢ細胞の抗体産生分化能をプラークをカウントする
ことで測定した。結果を表３に示す。

【表３】 表３から明らかなように、ＰＢＭＣ_sをＰＷＭで刺激す
ると顕著なＩｇＧ産生が認められるが、この系にこの発
明のＮＩ−５８ｍＡｂを同時に添加するとＩｇＧ産生が
顕著に減少する。この系ではＰＷＭでＰＢＭＣ_s 中のＢ
細胞が抗体産生細胞に分化し、Ｔ細胞、単球／マクロフ
ァージ等の細胞と接着することで抗体（ＩｇＧ）産生細
胞になるが、ＩｇＧ産生が著明に低下するこの結果は、
ＮＩ−５８ｍＡｂがＢ細胞、Ｔ細胞、単球／マクロファ
ージなどの細胞の接着を阻害したことを示すものであ
る。

【００２４】以下の実施例９〜１５にこの発明のＮＩ−
１１ｍＡｂの特性を示す。 実施例９ クラスの決定 実施例１で得られたこの発明のＮＩ−１１ｍＡｂのクラ
スを２重免疫拡散法で決定したところ、ＩｇＧ１である
ことが判った。

【００２５】実施例１０ この発明のＮＩ−１１ｍＡｂ
が認識する抗原分子の同定 この発明のＮＩ−１１ｍＡｂが認識する抗原分子をＷｅ
ｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法により検討した。Ｕ９
３７細胞をｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭＮａＣｌ，５ｍ
ＭＥＤＴＡ，０．５％ＮＰ−４０）で可溶化した。一定
量の抗原溶液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した
後、セルローズ膜に転写した。転写後、セルローズ膜を
ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＮａＣｌ，５ｍＥＤＴ
Ａ，０．２５％ゼラチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）
で洗浄し、５％ドライミルクでブロッキングした。つぎ
に至適濃度のこの発明のＮＩ−１１ｍＡｂおよびペルオ
キシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＦ（ａｂ’）₂をセル
ローズ膜に反応させ、基質液にて発色させた。分子量マ
ーカーとして分子量２９〜２０５ＫＤのものを用いた。
図４に示すように、この発明のＮＩ−１１ｍＡｂが認識
するＮＩ−１１抗原は分子量９５〜９７ＫＤの単一バン
ドとして観察された。

【００２６】実施例１１ ＮＩ−１１ｍＡｂの各種細胞
に対する結合能 各種標的細胞に至適濃度の各種モノクローナル抗体を４
℃で１時間反応させた。次いで各細胞をゼラチンベロナ
ール緩衝液（ＧＶＢ）で洗浄後、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マ
ウスＩｇＦ（ａｂ’）₂を加え、４℃で２０分間反応さ
せた。各細胞を再び洗浄後、螢光染色陽性細胞をフロー
サイトメトリー法で解析した。結果を表４および表５に
示す。

【表４】

【表５】 表４および表５から明らかなように、この発明のＮＩ−
１１ｍＡｂは、公知の各モノクローナル抗体、特に公知
の細胞間凝集を誘導するモノクローナル抗体（ＤＦＴ
１、Ｌ１３０）とは異なる結合能を有するため、これら
公知のモノクローナル抗体とは認識する抗原が異なるこ
とが判る。

【００２７】実施例１２ 未処理またはＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）で４８時間処理
したＵ９３７細胞（１×１０⁵ 個）を９６穴プレートに
まき、そこにこの発明のＮＩ−１１ｍＡｂ（１５μｇ／
ｍｌ）、正常マウス血清（ＮＭＳ、１５μｇ／ｍｌ）ま
たはＵ９３７細胞表面上のＨＬＡクラスＩを認識するＴ
ＯＫ−４５（１５μｇ／ｍｌ）をそれぞれ添加し、６〜
８時間培養し、細胞間凝集を顕微鏡下で観察した。結果
を図５および図６に示す。図５および図６から明らかな
ように、この発明のＮＩ−１１ｍＡｂは未処理のＵ９３
７細胞のＨＣＡは全く誘導しない（図５の（Ｂ））が、
ＬＰＳで処理されたＵ９３７細胞のＨＣＡを顕著に誘導
する（図６の（ｂ））ことが判明した。

【００２８】実施例１３ ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）で４８時間処理したＵ９３７
細胞（１×１０⁵ 個）を９６穴プレートにまき、そこに
この発明のＮＩ−１１ｍＡｂ（１５μｇ／ｍｌ）を添加
し、さらにＣＤ５４に対する抗体（ＬＢ−２）、ＣＤ１
８対する抗体（Ｌ１３０）、ＣＤ５８に対する抗体（Ｌ
３０６．４）をそれぞれ２５μｇ／ｍｌ添加して６〜８
時間培養し、細胞間凝集を顕微鏡下で観察した。結果を
図７に示す。図７から明らかなように、この発明のＮＩ
−１１ｍＡｂによるＬＰＳ刺激Ｕ９３７細胞の凝集誘導
効果は、ＬＢ−２またはＬ１３０の添加により阻害され
ることがわかる。このことから、この凝集誘導効果はＬ
ＦＡ−１（ＣＤ１８）／ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）のｐ
ａｔｈｗａｙであることが判明した。

【００２９】実施例１４ ＮＩ−１１ｍＡｂのＦ（ａｂ’）₂およびＦ（ａｂ’）
を作製し、ＬＰＳで刺激されたＵ９３７細胞を３７℃ま
たは４℃において、抗体添加または無添加で４〜６時間
培養し、凝集の程度を判定した。凝集の程度はＲｏｔｈ
ｌｅｉｎとＳｐｒｉｎｇｅｒの方法で判定した。結果を
表６に示す。

【表６】 この結果から、ＮＩ−１１ｍＡｂによって誘導される凝
集は温度に依存し、凝集を司る分子がインテグリンであ
ることが推定される。

【００３０】実施例１５ ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）で４８時間処理したＵ９３７
細胞（１×１０⁵ 個）を９６穴プレートにまき、そこに
この発明のＮＩ−１１ｍＡｂ（１５μｇ／ｍｌ）を添加
し、さらにＣキナーゼ阻害剤であるＨ−７またはスフィ
ンゴシンをそれぞれ２μＭ／ｍｌ添加して６〜８時間培
養し、細胞間凝集を顕微鏡下で観察した。結果を図８に
示す。図８から明らかなように、この発明のＮＩ−１１
ｍＡｂによるＬＰＳ刺激Ｕ９３７細胞の凝集誘導効果
は、Ｃキナーゼ阻害剤により阻害されることがわかる。
このことから、この凝集誘導効果にはプロティンキナー
ゼＣが一部関与していることが判明した。

【００３１】実施例１６ ＮＩ−５８ｍＡｂおよびＮＩ−１１ｍＡｂの反応性を健
康成人の末梢血単核粒を標的細胞としてｔｗｏ−ｃｏｌ
ｏｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ法で解析した。結
果をそれぞれ図９および図１０に示す。図９および図１
０より明らかなように、ＮＩ−５８ｍＡｂは白血球全般
に反応し、ＮＩ−１１ｍＡｂは単球系細胞とのみ反応す
ることがわかる。

【００３２】参考例１ 未処理およびＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）で４８時間処理
したＵ９３７細胞を、ＣＤ１４抗原に対するモノクロー
ナル抗体（ＭＹ−４）とＦＩＴＣ−抗マウスＩｇＦ（ａ
ｂ’）２で染色し、ＣＤ１４抗原の発現をＦＡＣＳ法で
解析した。結果を図１１に示す。図１１から明らかなよ
うに、ＬＰＳで処理したＵ９３７細胞では時間の経過と
ともに、ＣＤ１４抗原の発現が認められ（４８時間後２
４．３％、７２時間後３２．２％）、Ｕ９３７細胞はＬ
ＰＳによってｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅのある分化の段
階まで進むことがわかる。

【００３３】参考例２ 未処理およびＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）で４８時間処理
したＵ９３７細胞の各種サイトカインの産生能をＲＩＡ
またはＥＩＡ法で解析した。結果を表７に示す。

【表７】 表７より明らかなように、ＬＰＳ処理したＵ９３７細胞
は大量のＩＬ−６を培養上清中に放出することがわか
る。すなわちＬＰＳ処理Ｕ９３７細胞はＩＬ−６を産生
する細胞に変化していることがわかる。

【００３４】参考例３ 未処理およびＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）で４８時間処理
したＵ９３７細胞表面上のＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、Ｃ
Ｄ１１ｃ、ＣＤ１８およびＣＤ５４の動態をＦＡＣＳ法
で解析した。結果を図１２に示す。図１２に示すよう
に、ＬＰＳ処理されたＵ９３７細胞はＣＤ５４の著明な
増加が認められることが判明した。またＣＤ１１ｂにつ
いても中程度の増加が認められた。すなわちＬＰＳ処理
後、Ｕ９３７細胞表面上のＣＤ５４は著明にその発現量
が増加することがわかる。

【００３５】参考例４ 未処理およびＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）で４８時間処理
したＵ９３７細胞の位相差電子顕微鏡写真の所見を図１
３に示す。図１３に示すように、ＬＰＳ処理されたＵ９
３７細胞は未処理のＵ９３７細胞と比較して著しい突起
形成が認められた。

【００３６】

【発明の効果】この発明のリポポリサッカライドで刺激
された単球／マクロファージ系細胞を抗原として得られ
る抗体のうちＮＩ−５８ｍＡｂは、分化誘導因子で刺激
された細胞の細胞間接着を顕著に抑制する。またこのＮ
Ｉ−５８ｍＡｂによれば、従来知られている細胞の細胞
間接着を抑制するモノクローナル抗体とは全く異なる作
用機序ならびに強い抑制力を示し、従来十分な抑制がで
きなかった免疫反応の抑制が可能である。そのため臨床
的展開として、臓器移植後の拒絶反応の制御、自己免疫
疾患における接着分子の人為的調節、循環器疾患、特に
動脈硬化に伴う内皮細胞表面上の接着分子の調節、接着
分子が関与する癌細胞の増殖ならびに転移抑制などに有
用であると考えられる。また基礎的展開としては、単球
／マクロファージ細胞間接着における細胞間情報伝達の
解明、炎症における単球／マクロファージの内皮細胞へ
の接着能の解明、各種外来抗原によって誘導されるＴ細
胞、Ｂ細胞、単球／マクロファージの免疫反応抑制の解
明などに有用であると考えられる。

【００３７】他方、この発明のリポポリサッカライドで
刺激された単球／マクロファージ系細胞を抗原として得
られる抗体のうちＮＩ−１１ｍＡｂは、従来知られてい
るある特定の成熟細胞の細胞間凝集を誘導するモノクロ
ーナル抗体とは全く異なる作用機序を示し、分化誘導因
子で刺激されて分化の過程にある細胞、特に単球系細胞
の細胞間凝集を誘導する。さらにこのＮＩ−１１ｍＡｂ
は、ＰＭＡで前処理されたＵ９３７細胞に対して著明な
形態変化（組織マクロファージへと分化）を誘導し得る
能力を有する所見を得ている。そのため初期の感染症防
御に重要な単球系細胞群の活性化を容易にするのみなら
ず、この抗体を生体内に投与することにより、特に末梢
の成熟ヘルパーＴ細胞、単球／マクロファージ系細胞の
破壊を伴い、自己免疫力の低下で種々の感染症を合併す
るエイズ患者においては、その生体に存在する分化の過
程にある単球系細胞の細胞間伝達を計り得るものと考え
られる。そしてその細胞間伝達により生体の免疫系の活
性化を促し、従来有効な治療法のなかったこの疾患に対
する免疫療法の一つとして大変有益であると考えられ
る。さらに、この発明の抗体は初期感染防御に関与する
単球系細胞に特異性を示すことから、例えばエイズ患者
における分化段階に位置する単球系細胞群の動態を調べ
ることにより、臨床診断上有用であると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明のモノクローナル抗体（ＮＩ−５８ｍ
Ａｂ）が認識する抗原分子を示す電気泳動の写真であ
る。Ｂにおける矢印の位置はＮＩ−５８ｍＡｂが認識す
る抗原分子を示す。右の数字は各分子量マーカーの分子
量（ＫＤ）を示す。

【図２】ＬＰＳ刺激Ｕ９３７細胞（生物の形態）のＨＣ
Ａ阻害を示す写真である。 （Ａ）無添加 （Ｂ）ＬＰＳ（２５μｇ／ｍｌ）添加 （Ｃ）ＬＰＳ＋ＩｇＧ１（２０μｇ／ｍｌ）添加 （Ｄ）ＬＰＳ＋ＩｇＧ２ｂ（２０μｇ／ｍｌ）添加 （Ｅ）ＬＰＳ＋ＮＩ−５８ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）添
加 （Ｆ）ＬＰＳ＋ＬＢ−２ｍＡｂ（２０μｇ／ｍｌ）添加

【図３】ＬＰＳ刺激後のＵ９３７細胞表面上のＣＤ５４
およびＮＩ−５８抗原の変化を示す。 （Ａ）実線は未刺激のＣＤ５４、粗い点線はＬＰＳ刺激
ＣＤ５４、および細かい点線は未刺激陰性対照を示す。 （Ｂ）実線は未刺激のＮＩ−５８抗原、粗い点線（実線
と大部分重なっている）はＬＰＳ刺激ＮＩ−５８抗原、
および細かい点線は未刺激陰性対照を示す。

【図４】この発明のモノクローナル抗体（ＮＩ−１１ｍ
Ａｂ）が認識する抗原分子を示す電気泳動の写真であ
る。Ｂにおける矢印の位置はＮＩ−１１ｍＡｂが認識す
る抗原分子を示す。右の数字は各分子量マーカーの分子
量（ＫＤ）を示す。

【図５】ＮＩ−１１ｍＡｂの未処理Ｕ９３７細胞（生物
の形態）に与える効果を示す写真である。 （Ａ）無添加 （Ｂ）ＮＩ−１１ｍＡｂ（１５μｇ／ｍｌ）添加 （Ｃ）ＮＭＳ（１５μｇ／ｍｌ）添加 （Ｄ）ＴＯＫ−４５（１５μｇ／ｍｌ）添加

【図６】ＮＩ−１１ｍＡｂのＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）
処理Ｕ９３７細胞（生物の形態）に与える効果を示す写
真である。 （ａ）無添加 （ｂ）ＮＩ−１１ｍＡｂ（１５μｇ／ｍｌ）添加 （ｃ）ＮＭＳ（１５μｇ／ｍｌ）添加 （ｄ）ＴＯＫ−４５（１５μｇ／ｍｌ）添加

【図７】抗ＣＤ５４抗体および抗ＣＤ１８抗体のＮＩ−
１１ｍＡｂ誘導ＬＰＳ処理Ｕ９３７細胞（生物の形態）
のＨＣＡ阻害効果を示す写真である。 （Ｅ）ＮＩ−１１ｍＡｂ（１５μｇ／ｍｌ）添加 （Ｆ）ＮＩ−１１ｍＡｂ＋ＬＢ−２（２５μｇ／ｍｌ）
添加 （Ｇ）ＮＩ−１１ｍＡｂ＋Ｌ１３０（２５μｇ／ｍｌ）
添加 （Ｈ）ＮＩ−１１ｍＡｂ＋Ｌ３０６．４（２５μｇ／ｍ
ｌ）添加

【図８】Ｃキナーゼ阻害剤のＮＩ−１１ｍＡｂ誘導ＬＰ
Ｓ処理Ｕ９３７細胞（生物の形態）の部分的ＨＣＡ阻害
効果を示す写真である。 （Ｉ）ＮＩ−１１ｍＡｂ（１５μｇ／ｍｌ）添加 （Ｊ）ＮＩ−１１ｍＡｂ＋Ｈ−７（２μＭ／ｍｌ）添加 （Ｋ）ＮＩ−１１ｍＡｂ＋スフィンゴシン（２μＭ／ｍ
ｌ）添加

【図９】ＮＩ−５８ｍＡｂの反応性を示すｔｗｏ−ｃｏ
ｌｏｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏ−ｍｅｔｒｙ法で解析した
チャートである。

【図１０】ＮＩ−１１ｍＡｂの反応性を示すｔｗｏ−ｃ
ｏｌｏｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏ−ｍｅｔｒｙ法で解析し
たチャートである。

【図１１】未処理およびＬＰＳで処理したＵ９３７細胞
のＣＤ１４抗原の発現を示す。

【図１２】ＬＰＳ刺激後のＵ９３７細胞表面上のＣＤ１
１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８およびＣＤ５
４の動態を示す。 （ａ）ＣＤ１１ａ （ｂ）ＣＤ１１ｂ （ｃ）ＣＤ１１
ｃ （ｄ）ＣＤ１８ （ｅ）ＣＤ５４ 細かい点線：陰性対照 実線：ＬＰＳ未刺激 粗い点線：ＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）刺激

【図１３】未処理およびＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）で４
８時間処理したＵ９３７細胞（生物の形態）の位相差電
子顕微鏡写真である。 Ａ：未処理Ｕ９３７細胞 Ｂ：ＬＰＳ処理Ｕ９３７細胞

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＣ Ｊ 9284−4Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/20 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リポポリサッカライドで刺激された単球
   ／マクロファージ系細胞を抗原として得られる抗体。
2. 【請求項２】 分化誘導因子で刺激された細胞の細胞間
   接着を抑制する請求項１に記載の抗体。
3. 【請求項３】 分化誘導因子がリポポリサッカライドで
   ある請求項２に記載の抗体。
4. 【請求項４】 細胞が単球／マクロファージ系細胞であ
   る請求項２または３に記載の抗体。
5. 【請求項５】 単球／マクロファージ系細胞がＵ９３７
   細胞である請求項１乃至４に記載の抗体。
6. 【請求項６】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
   １乃至５に記載の抗体。
7. 【請求項７】 ＩｇＧ１クラスに属する請求項１乃至６
   に記載の抗体。
8. 【請求項８】 分子量約６５ＫＤの分子を特異的に認識
   する請求項１乃至７に記載の抗体。
9. 【請求項９】 分化誘導因子で刺激されて分化の過程に
   ある細胞の細胞間凝集を誘導する請求項１に記載の抗
   体。
10. 【請求項１０】 分化誘導因子がリポポリサッカライド
    である請求項９に記載の抗体。
11. 【請求項１１】 細胞が単球／マクロファージ系細胞で
    ある請求項９または１０に記載の抗体。
12. 【請求項１２】 単球／マクロファージ系細胞がＵ９３
    ７細胞である請求項９乃至１１に記載の抗体。
13. 【請求項１３】 抗体がモノクローナル抗体である請求
    項９乃至１２に記載の抗体。
14. 【請求項１４】 ＩｇＧ１クラスに属する請求項９乃至
    １３に記載の抗体。
15. 【請求項１５】 分子量９５〜９７ＫＤの分子を特異的
    に認識する請求項９乃至１４に記載の抗体。
16. 【請求項１６】 リポポリサッカライドで刺激された単
    球／マクロファージ系細胞を抗原として用いる抗体の製
    造法。
17. 【請求項１７】 抗体がモノクローナル抗体である請求
    項１６に記載の抗体の製造法。