JPH0159872B2 - - Google Patents
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- JPH0159872B2 JPH0159872B2 JP63118394A JP11839488A JPH0159872B2 JP H0159872 B2 JPH0159872 B2 JP H0159872B2 JP 63118394 A JP63118394 A JP 63118394A JP 11839488 A JP11839488 A JP 11839488A JP H0159872 B2 JPH0159872 B2 JP H0159872B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、広義には、新規な交雑細胞ライン
（hybrid cell line）さらに詳しくは正常のヒトの
単球および顆粒球に見い出されるある抗原に対す
るモノクローナル（monoclonal）抗体の生成の
ための交雑細胞ラインに関する。 1975年におけるKohlerおよびMilsteinによる
免疫されたマウスからの脾細胞へのマウスの骨髄
腫の融合（fusion）［Nature 256、495−497
（1975）］は、均質な（いわゆる「モノクローナ
ル」）抗体をつくる連続な細胞ラインを得ること
ができることを初めて証明した。この基本の研究
以来、種々の交雑細胞［いわゆる「ハイブリドマ
類（hybridomas）」］の生成およびこれらのハイ
ブリドマ類によりつくられた抗体の種々の科学的
研究への使用について多くの努力が向けられてき
た。たとえば、次の文献を参照：Current
Topics in Microbiology and Immunology、
Volume 81−“Lymphocyte Hybridomas”、F.
Melchers、M.Patter、およびN.Warner、
Editors、Springer−Verlag、1978、およびそこ
に含まれる参考文献；C.J.Barnstable、et al．、
Cell、14、９−20（May、1978）；P.Parhamおよ
びW.F.Bodmer、Nature 276、397−399
（November、1978）；Handbook of
Experimental Immunology、Third Edition
Volume ２、D.M.Wier、Editor Blackwell、
1978、Chapter 25；およびChemical and
Engineering News、January １、1979、15−
17。これらの文献は同時にハイブリドマ類からモ
ノクローナル抗体を生成する試みによつて得られ
る利益および複雑さを示している。一般的技術は
概念的によく理解されているが、各特定の場合に
多くの困難に出合い、そして変更が要求される。
事実、一定のハイブリドマを生成しようと試みる
前には、所望のハイブリドマが得られるか、得ら
れた場合抗体を生成するか、あるいはそのように
生成された抗体が所望の特異性をもつか、を確め
ることができない。成功の程度は、主として、使
用する抗原のタイプおよび所望のハイブリドマを
単離するために使用する選択技術によつて影響を
受ける。 人間のリンパ球細胞表面の抗原に対するモノク
ローナル抗体を生成する試みは、数例報告されて
いるだけである。たとえば、Current Topics in
Microbiology and Immunology、ibid、66−69
および164−169参照。これらの報告された実験に
おいて使用されている抗原は、培養したリンパ芽
様性白血病およびヒトの慢性リンパ球性白血病の
細胞ラインであつた。得られた多くのハイブリド
マ類は、すべてのヒト細胞の種々の抗原に対して
抗体を生成するように思われた。ハイブリドマ類
はいずれも、ヒトのリンパ球の前もつて定めた群
に対して抗体を生成しなかつた。 最近、本発明者らおよび他の研究者は、あるＴ
細胞に対する抗体をつくるハイブリドマの製造お
よび試験について文献に開示した。参照、たとえ
ば、Reinherz、E.L.、et al.、J.Immunol.123、
1312−1317（1979）；Reinherz、E.L.、et al．、
Proc.Natl.Acad.Sci.、76、4061−4065（1979）；
およびKung、P.C.、et al．、Science、206、347
−349（1979）。 さらに、抗大食細胞生成クローンの最近の報告
が存在する。参照、Springer、et al.、Eur.J.
Immunol.、９、301（1979）。 人間および動物の免疫系に含まれるリンパ球に
２つの主なクラスが存在することを理解すべきで
ある。これらのうちの第１クラス（胸腺誘導細
胞、すなわち、Ｔ細胞）は、ヘモポイエチン幹細
胞から胸腺において分化されている。胸腺内にあ
る間、分化する細胞は「胸腺細胞」と名づけられ
る。成熟したＴ細胞は胸腺から出、そして組織、
リンパ管、および血流の間を循環する。これらの
Ｔ細胞は、再循環する小さいリンパ球の貯留
（pool）の大きい比率を形成する。それらは免疫
学的特異性を有し、そして細胞性免疫応答（組織
移植注入のような）においてエフエクター
（effector）細胞として直接関与する。Ｔ細胞は
液性抗体を分泌しないが、後述するリンパ球の第
２クラスによるこれらの抗体の分泌に時々要求さ
れる。Ｔ細胞のいくつかの型は免疫系の他の面に
おいて調節機能をはたす。この細胞共働の過程の
機構はまだ完全に理解されていない。 リンパ球の第２クラス（骨髄誘導細胞、すなわ
ち、Ｂ細胞）は、抗体を分泌するものである。そ
れらもまたヘモポイエチン幹細胞から発生する
が、それらの分化は胸腺によつて決定されない。
鳥類において、それらはフアブリキウス嚢
（Bursa of Fabricius）と呼ばれる胸腺に類似す
る器官において分化されている。しかし、哺乳動
物においては、同等の器官は発見されておらず、
そしてこれらのＢ細胞は骨髄内で分化すると考え
られる。 ここで、Ｔ細胞は「ヘルパー（helper）」、「サ
プレツサー（Suppressor）」および「キラー
（killer）」Ｔ細胞と呼ばれる、少なくともいくつ
かのサブタイプに分けられ、それらは（それぞ
れ）反応を促進し、反応を抑制し、あるいは異種
細胞を殺す（分離する）機能を有することが認め
られた。これらのサブクラス群はネズミの系統に
ついてよく理解されているが、それらは人間の系
についてわずかに最近記載されただけである。た
とえば、次の文献を参照：R.L.Evans、et al．、
Journal of Experimental Medicine、Volume
145、221−232、1977；およびL.ChessおよびS.F.
Schlossman−“Functional Analysis of
Distinct Human Ｔ−Cell Subsets Bearing
Unique Differentiation Antigens”
“Contemporary Topics in Immunobiology”、
O.Stutman、Editor、Plenum Press、1977、
Volume ７、363−379。 Ｔ細胞のクラスまたはサブクラスを同定または
抑制することができることは、種々の免疫調節の
不調または状態の診断または処置にとつて重要で
ある。 たとえば、ある種の白血病およびリンパ腫は、
それらがＢ細胞またはＴ細胞のいずれを源とする
かによつて、異なる予後を有する。こうして、病
気の予後の評価はこれらのリンパ球の２つのクラ
スを区別することに依存する。たとえば、次の文
献を参照：A.C.AisenberyおよびJ.C.Long、The
American Journal of Medicine、58：300
（March、1975）；D.Belpomme、et al.、
Immunological Diagnosis of Leukemias and
Lymphomas、S.Thierfelder、et al.、Editors、
Springer、Heidelberg、1977、33−45；および
D.Belpomme、et、al．、British Journal of
Haematology、1978、38、85。 ある種の病気の状態（たとえば、若年性リウマ
トイド関節炎およびある種の白血病）は、Ｔ細胞
のサブクラスの不釣合いに関する。自己免疫の病
気は一般に「ヘルパー」Ｔ細胞の過剰またはある
種の「サプレツサー」Ｔ細胞の欠乏に関連する
が、悪性の病気は一般に「サプレツサー」Ｔ細胞
の過剰に関連することが示唆された。 ある種の白血病において、過剰のＴ細胞は発育
の停止した状態において生成される。診断はこう
してこの不釣合い、すなわち、過剰を検知するこ
とができることに依存しうるであろう。たとえ
ば、次の文献を参照：J.Kersey、et al.、
“Surface Markers Define Human Lymphoid
Malignancies with Differing Prognoses”、
Haematology and Blood Transfusion、
Volume 20、Springer−Verlag、1977、17−24、
およびその中に含まれる参考文献；およびE.L.
Reinherz、et al.、J.Clin.Invest.、64、392−397
（1979）。 後天性無ガンマグロブリン血症、すなわち免疫
グロブリンを生成しない疾患の状態は少なくとも
２つの明確な型からなる。型において、免疫グ
ロブリンを生成できないのはサプレツサーＴ細胞
の欠乏によるが、型はヘルパーＴ細胞の欠乏に
よる。両型において、患者のＢ細胞、すなわち抗
体の実際の分泌に関係するリンパ球の不足もしく
は欠乏は存在しないように思われる。しかしなが
ら、これらのＢ細胞は抑制されるか「ヘルプされ
ない」状態にあり、その結果免疫グロブリンの生
成は大きく減少するか、あるいは存在しない。こ
の型の後天性撫ガンマグロブリン症は、それゆ
え、サプレツサーＴ細胞の過剰またはヘルパーＴ
細胞の不存在を試験することによつて決定でき
る。 治療サイドにおいて、また明確に証明されてい
ないが、Ｔ細胞のサブタイプに対する抗体を過剰
量で投与することは自己免疫の病気または悪性の
病気において治療上有益であるという、いくらか
の示唆がある。たとえば、ヘルパーＴ細胞のガン
（ある種の皮膚Ｔ細胞リンパ腫およびある種のＴ
細胞急性リンパ芽球白血病）はヘルパーＴ細胞抗
原に対する抗体によつて処置できる。ヘルパー細
胞の過剰を原因とする自己免疫の処置も同じ方法
で達成できる。サプレツサーＴ細胞の過剰による
病気（たとえば、悪性腫瘍または型後天性無ガ
ンマグロブリン症）は、サプレツサーＴ細胞抗原
に対する抗体を投与することによつて処置でき
る。 ヒトＴ細胞の全クラス（いわゆる抗ヒト胸腺細
胞のグロブリン、すなわち、ATG）に対する抗
血清は、移植組織を受ける患者において治療上有
用であると報告されている。細胞性免疫応答（移
植組織を拒否する機構）はＴ細胞に依存するの
で、Ｔ細胞に対する抗体を投与すると、この拒否
の過程を防止または遅延する。たとえば、次の文
献を参照：Cosimi、et al.、“Randomized
Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal
Allgraft Recipients：Importance of Ｔ Cell
Monitoring”、Surgery 40：155−163（1976）お
よびその中に含まれる参考文献。 しかしながら、リンパ球は１つのクラスの白血
球のみからなる。他の２つのクラス、すなわち、
顆粒球および単球も人間および動物の免疫系の機
能において重要である。特に、単球の１つの型で
ある大食細胞は免疫機能において広く含まれる。
たとえば、大食細胞自体は、分泌抗体ではない
が、Ｂ細胞による抗体の生成においてＴ細胞の共
同に必要であることがわかつた。 大食細胞も、細胞障害性Ｔ細胞の生成に、そし
てミトゲン、たとえば、PHAまたはCon Ａに対
する反応におけるＴ細胞による増殖応答の発生
に、必要である。これらの方法における大食細胞
の機能についての考察が存在するが、その正確な
役割は知られていない。参照、たとえば、E.S.
Golub、TheCellular Basis of the Immune
Response、Sinauer Associates、Sunderland、
Massachusetts、1977、ページ146−158。 ヒトＴ細胞のクラスおよびサブクラスの同定お
よび抑制は、従来、動物をヒトＴ細胞で免疫し、
その動物を出血させて血清を取り、そしてこの抗
血清を（たとえば）自己由来の（autologous）
であるが、異種ではないＢ細胞で吸着して望まな
い反応性をもつ抗体を除去することによつて得
た、ヒトＴ細胞のための自発性自己抗体または選
択的抗血清を使用することによつて達成された。
これらの抗血清の製造は、とくに吸着および精製
の工程において、きわめて困難である。吸着され
且つ精製された抗血清でさえ、所望の抗体に加え
て、いくつかの理由で多くの不純物を含有する。
第１に、血清はＴ細胞で免疫する前に数百万の抗
体分子を含有する。第２に、この免疫法は注入し
たすべてのヒト細胞について見い出される種々の
抗原に対する抗体を生成させる。単一の抗原に対
する抗体は選択的に生成されない。第３に、この
ような方法で得られた特異性抗体の力価は通常極
めて低く（たとえば、１：100より大きい希釈度
において不活性）そして非特異性抗体に対する比
は１／106より小である。 たとえば、前述のChessおよびSchlossmanの
文献（365ページ以降参照）および前述の
Chemical and Engineering Newsを参照。ここ
には先行技術の抗血清の欠点およびモノクローナ
ル抗体の利点が記載されている。 今回、正常なヒトの末梢血液単球および顆粒球
について見い出されるが、ヒトの末梢リンパ細胞
（Ｔ細胞、Ｂ細胞または無特徴細胞）、胸腺細胞、
リンパ芽球様細胞ライン、またはＴ細胞直系もし
くはＢ細胞直系の腫瘍細胞について見い出されな
い抗原に対する新規なモノクローナル抗体を生成
できる新規なハイブリドマ（OKM1と表示する）
が発見された。 そのように生成された抗体は正常なヒトの末梢
血液の単球および顆粒球についての単一の決定子
に対して単一特異性（monospecific）であり、
そして他の抗ヒト免疫グロブリンを本質的に含有
しないが、これと対照的に先行技術の抗血清は多
数のヒト抗原に対して反応性の抗体で本来汚染さ
れており、そして先行技術のモノクローナル抗体
は正常なヒトの単球の抗原について単一特異性で
はない。その上、このハイブリドマは培養して抗
体を生成することができる。この場合動物を免疫
し、殺し、次いで先行技術の不純の抗血清を得る
ときにさえ、必要な長たらしい吸着および精製の
工程を実施することを要しない。 したがつて、本発明の１つの目的は、正常なヒ
トの末梢血液の単球および顆粒球について見い出
される抗原に対する抗体を生成するハイブリドマ
類を提供することである。 本発明のさらに別の面において、これらのハイ
ブリドマ類を製造する方法を提供する。 本発明の他の目的は、正常なヒトの末梢血液の
単球および顆粒球について見い出される抗原に対
する本質的に均質な抗体を提供することである。 さらに他の目的は、この抗体を用いる病気の処
置または診断の方法あるいは単球のサブクラスの
同定法を提供することである。 本発明のその他の目的および利益は、本発明の
開示を検討すると明らかになるであろう。 前述の目的および利益を達成するため、本発明
によれば、正常なヒトの末梢血液の単球および顆
粒球について見い出される（が正常のヒトの末梢
リンパ球、胸腺細胞、リンパ芽球様細胞ライン、
またはＴ細胞直系もしくはＢ細胞直系の腫瘍細胞
について見い出されない）抗原に対する新規な抗
体を生成する新規なハイブリドマ、この抗体それ
自体、およびこの抗体を用いる診断および治療の
方法が提供される。このハイブリドマはMilstein
およびKohlerの方法に一般に従つて製造される。
正常のＥロゼツト（rosette）精製したヒトの単
核細胞でマウスを免疫した後、免疫したマウスの
脾細胞をマウスの骨髄腫ラインからの細胞と融合
し、そして得られたハイブリドマ類を正常のＥロ
ゼツト陽性およびＥロゼツト陰性のヒトの末梢血
液の単球の集団に選択的に結合する抗体を含有す
る上澄液を用いてそれらについて選別した。所望
のハイブリドマ類を引き続いてクローン系に分け
（clone）、特性づけた。その結果、正常なヒトの
末梢血液の単球についての抗原に対する抗体
（OKM1と表示する）を生成するハイブリドマが
得られた。 先行技術において示された困難および抗原とし
て悪性の細胞ラインを用いて報告された成功の不
足を見ると、本発明の方法が所望のハイブリドマ
を提供したことは驚くべきことであつた。交雑細
胞のこの予測されえない性質は１つの抗原または
ラインから他のものへの補外（extrapolate）を
許さないことに注意すべきである。事実、本発明
者らは、抗原としてＴ細胞の悪性細胞ラインを用
いると、所望の抗体を生成しないハイブリドマ類
が形成することを見い出した。細胞表面から分離
した精製した抗原を使用する試みも不成功に終つ
た。 主題のハイブリドマおよびそれにより生成され
た抗体の両者は、この明細書中で表示「OKM1」
で呼ばれ、言及される特定の物質は文脈から明ら
かである。主題のハイブリドマは、アメリカン・
タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（12301Parklawn Drive、Rockville、MD、
20852）に1979年12月13日に寄託され、ATCC番
号CRL8026が付された。 このハイブリドマおよび生ずる抗体の製造およ
び特性は、以下の説明および実施例から一層理解
できるであろう。 ハイブリドマを製造する方法は一般に次の工程
からなる： Ａ 正常なヒトの末梢血液の単核細胞でマウスを
免疫する。メスのBALB／cJマウスが好まし
いことがわかつたが、他のマウスの系統を使用
できると考えられる。免疫スケジユールおよび
胸腺細胞の濃度は、有効量の適当に準備した脾
細胞を生成するようなものであるべきである。
0.2mlのリン酸塩緩衝食塩溶液中の２×107細
胞／マウス／注射を用いて、14日の間隔で、３
回免疫を行うことは有効であることがわかつ
た。 Ｂ 免疫したマウスから脾臓を取り出し、適当な
媒質中の脾懸濁液を調製する。約１ml／脾臓の
媒体で十分である。これらの実験の技術はよく
知られている。 Ｃ 懸濁した脾細胞を適当な細胞ラインからのマ
ウスの骨髄腫の細胞と、適当な融合促進剤の使
用により融合する。脾細胞対骨髄腫細胞の好ま
しい比は約５対１である。約108個の脾細胞に
ついて合計約0.5〜1.0mlの融合媒質は適当であ
る。多くのマウスの骨髄腫の細胞は知られてお
り、そして一般に学問的共同体のメンバーまた
は種々の寄託機関、たとえば、ザ・ソーク・イ
ンスチチユート・セル・デイストリビユーシヨ
ン・センター（the Salk Institute Cell
Distribution Center、La Jolla、CA）から入
手できる。使用する細胞ラインは好ましくはい
わゆる「薬物抵抗性」型であつて、未融合の骨
髄腫細胞が選択した媒体中で生存せず、一方交
雑細胞が生存するようにすべきである。最も普
通の群は８−アザグアニン抵抗性の細胞ライン
であり、これは酵素ヒポキサンチン・グアニ
ン・ホホリボシル・トランスフエラーゼ
（phophoribosyl transferase）を欠き、それゆ
えHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、
およびチミジン）媒体により支持されない。ま
た使用する骨髄腫細胞ラインはいわゆる「非分
泌」型である、すなわち、それはそれ自体抗体
を生成しないことが一般に好ましいが、分泌型
を使用できる。しかしながら、ある場合におい
て、分泌する骨髄腫ラインは好ましいことであ
る。好ましい融合促進剤は平均分子量が約1000
〜約4000であるポリエチレングリコール（商業
的にPEG 1000などとして入手できる）が好ま
しいが、この分野において知られている他の融
合促進剤を使用できる。 Ｄ 別の容器内において、未融合の脾細胞、未融
合の骨髄腫細胞、および融合した細胞の混合物
を、未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択的媒
質中で希釈し、未融合の細胞を死亡させるのに
十分な時間（約１週間）培養する。この希釈は
限定されたものの型であることができ、この希
釈において希釈剤の体積は統計的に計算して各
別々の容器［たとえば、微小力価の板の各ウエ
ル（well）］中である数の細胞（たとえば、１
〜４）を単離する。媒体は薬物抵抗性（たしえ
ば、８−アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄
腫細胞ラインを支持しないもの（たしえば、
HAT媒質）である。それゆえ、これらの骨髄
腫細胞は死ぬ。未融合の脾細胞は非悪性である
ので、有限の数の世代をもつだけである。こう
して、ある期間（約１週間）後、これらの未融
合の脾細胞は再生しない。融合した細胞は、こ
れに対して、骨髄腫の親の悪性をもち、そして
脾細胞の親の選択的媒体で生存できるので、再
生し続ける。 Ｅ ハイブリドマを含有する各容器（ウエル）中
の上澄液を、Ｅロゼツト陽性の精製したまたは
Ｅロゼツト陰性のヒトの末梢血液のリンパ球に
対する抗体について測定する。 Ｆ 所望の抗体を生成するハイブリドマを選択し
（たとえば、限定希釈により）そしてクローン
に分ける。 いつたん所望のハイブリドマを選択し、クロー
ンに分けると、終結の抗体は２つの方法の１つで
生成させることができる。最も純粋なモノクロー
ナル抗体は、所望のハイブリドマを適当な媒質中
で適当な長さの時間試験内で培養し、次いで所望
の抗体を上澄液から回収することによつて生成さ
れる。適当な媒質および適当な培養時間の長さ
は、既知であるか、あるいは決定容易である。こ
の試験管内技術は、他の特異性の抗ヒト免疫グロ
ブリンを本質的に含まない、単一特異性モノクロ
ーナル抗体を本質的に生成する。媒質は外因性血
清（たとえば、胎児の子牛の血清）を含有するの
で、少量の他の免疫グロブリンが存在する。しか
しながら、この試験管内の方法は、モノクローナ
ル抗体の濃度がわずかに約50μｇ／mlであるの
で、十分な量または濃度を生成できない。 非常に大きい濃度のわずかに純度に劣るモノク
ローナル抗体を生成させるため、所望のハイブリ
ドマをマウス、好ましくは先天性または半先天性
のマウスに注射できる。ハイブリドマは適当な潜
伏時間後抗体生成の腫瘍を形成させ、その結果宿
主マウスの血流および腹膜滲出液（腹水）中に高
濃度の所望とする抗体（約５〜20mg／ml）が生ず
る。これらの宿主マウスも正常の抗体を血流およ
び腹水の中に有するが、これらの正常な抗体の濃
度はモノクローナル抗体濃度のわずかに約５％で
あるにすぎない。その上、これらの正常の抗体は
特異性が抗ヒトでないので、収穫した腹水または
血清から得たモノクローナル抗体は汚染する抗ヒ
ト免疫グロブリンを本質的に含有しない。このモ
ノクローナル抗体は力価が高く（１：50000以上
の希釈で活性である）そして特異性免疫グロブリ
ン対非特異性免疫グロブリンの比が高い（約１／
20）。Ｋ軽量の骨髄腫鎖を組込んだ生成した免疫
グロブリンは非特異性の「無意味な」ペプチド類
であり、これらはモノクローナル抗体をその特異
性を減じないで単に希釈するだけである。 実施例 １ モノクローナル抗体の生成 Ａ 免疫および体細胞の交雑 メスのBALB／cJマウス（Jackson研究所；
生まれてから６〜８週間）を、0.2mlのリン酸
塩緩衝食塩溶液中の２×107のロゼツト精製し
たヒトの単核細胞で腹膜内的に14日の間隔で免
疫した。第３回目の免疫後、脾をマウスから取
り出し、そしてステンレス鋼の鋼に組織を通す
ことによつて単一細胞の懸濁液をつくつた。 細胞の融合をKohlerおよびMilsteinの方法
に従つて実施した。１×108の脾細胞を、
RPMI 1640媒質（Gibco、Grand Island、
NY）中の35％のポリエチレングリコール
（PEG1000）と５％のジメチルスルホキシドと
からなる融合媒質の0.5ml中において、２×107
のP3×63Ag 8U1骨髄腫細胞（Br.M.Scharff、
Albert Einstein College of Medicine、
Bronx、NYにより供給）と融合した。これら
の骨髄腫細胞はIgG1 KL鎖（light chains）を
分泌する。 Ｂ ハイブリドマの選択および成長 細胞の融合後、細胞をHAT媒体（ハイポキ
サンチン、アミノプチリン、およびチミジン）
中で37℃において５％のCO2を使用して湿つた
ふん囲気中で培養した。数週間後、ハイブリド
マ類を含有する培養液から40〜100μの上澄
液を、Mendes（J.Immunol．111：860、1973）
が記載するように健康なヒトの供与者の血液か
ら調製した、Ｅロゼツト陽性（E+）集団とＥ
ロゼツト陰性（E-）集団とに分けた106の末梢
リンパ球のペレツトに加えた。これらの細胞へ
結合するマウスのハイブリドマ抗体の検出は、
ラジオイムノアツセイおよび／または間接免疫
蛍光法により決定した。培養液の上澄液で培養
した細胞を蛍光を付与した山羊の抗マウスIgG
（Ｇ／Ｍ FITC）（Meloy研究所、Springfied、
VA；Ｆ／Ｐ＝2.5）で染色し、この蛍光性抗体
被覆細胞を引き続いてシトフルオログラフ
（Cytofluorograf）FC200／4800A（Ortho
Instruments、Westwood、MA）について実
施例に記載するように分析した。E+リンパ
球（Ｔ細胞）および／またはE-リンパ球と特
異的に反応する抗体を含有するハイブリドマ培
養液を選択し、供給体（feeder）細胞の存在で
限定希釈法により２回クローンに分けた。引き
続いて、クローンを２，６，10，14−テトラペ
ンタデカン（Aldrich、Chemical Companyか
ら商品名Pristineで市販されている）で準備し
たBALB／cJマウスに一定のクローンの１×
107細胞（0.2mlの体積）を注射することによつ
て、腹膜内に移植した。次いでこれらのマウス
からの悪性腹水を使用して、実施例において
後述するように、リンパ球を特徴づけた。E+
およびE-細胞の両方の小部分と反応するこれ
らのクローンの１つによつて生成するモノクロ
ーナル抗体をOKM1と名付けた。主題の交雑
抗体OKM1は、標準の技術によりサブクラス
IgG2aであると証明された。 実施例 OKM1の反応性の特性づけ Ａ 単核細胞個体群の単離 人間の末梢血液の単核細胞を、健康な志願者
の提供者（15〜40才）から、Boyum、Scand.
J.Clin.Lab.Invest.21（Suppl.97）：77、1968の技
術に従い、フイコール−ハイパツク（Ficoll−
Hypaque）密度勾配遠心分離（Pharmacia
Fine Chemicals、Piscataway、NJ）により
単離した。 付着性細胞は、20％のプールしたヒトのAB
血清を補充したRPM1 1640（Grand Island
Biological Company、Grand Island、NY）
を含むポリスチレン皿（100×20mm組織培養皿）
（Falcon、Oxnard、CA）中で単核細胞を１時
間培養することによつて得た。非付着性部分を
除去した後、付着性細胞を、４℃で血清不含
MEM、2.5ミリモルのEDTA中で培養し、使
い捨て注射器プランジヤーのゴム先端でおだや
かにこすることによつて、分離した。 単核細胞を、ヒツジの赤血球でロゼツト
（rosette）し、Ficoll−Hypaqueで示差遠心分
離（differetial Centrifugation）することによ
つて、E+集団とE-集団に分離する。ロゼツト
は単核細胞／ヒツジの赤血球の混合物を５分間
800rpmで遠心分離し、そして４℃で１時間培
養することによつて、達成した。赤血球：リン
パ球の比は40：１であつた。E+細胞は、ヒツ
ジの赤血球を0.85％の塩化アンモニウム溶液で
溶解することによつて回収した。 無特徴細胞は、Chess、et al．、J.
Immunol.、113：1113（1974）に記載されるよ
うに、Sephadex Ｇ−200抗ヒト（Ｆ（ab1）2ク
ロマトグラフイーにより、表面のイムノグロブ
リン陰性（SIg-）集団について、同様にロゼ
ツトすることによつて製造した。多形核の白血
球は、末梢血液のFicoll Hypaque遠心分離の
間形成したペレツト中に存在する赤血球の溶解
により得た。 Ｂ 胸腺細胞の単離 正常人の胸腺を２カ月〜14才の年令の患者か
ら、心臓の矯正手術のもとに得た。胸腺の新ら
しく得た部分を媒体199（Gibco）中の５％胎児
の子牛の血清中に直ちに入れ、鉗子とはさみで
小さく切り、引き続いて金網を通してプレスす
ることによつて単細胞の懸濁液にした。細胞を
次に前節Ａで説明したように、フイコール−ハ
イパツクで層状にし、回し、洗浄した。このよ
うにして得られた胸腺細胞は＞95％生活力があ
り、そして90ロゼツト陽性であつた。 Ｃ Ｔ直系の細胞ラインおよびＴ急性リンパ芽球
白血病 Ｔ細胞ラインCEM、HSB−２、およびＢ細
胞ラインLaz156およびLaz388を、H.Lazarus
博士（Sidney Farber Cancer Institute、
Boston、MA）から提供された。白血病細胞
は、急性骨髄単球白血病（AMML；５人の患
者）および急性骨髄芽球性白血病（AML；８
人の患者）の診断を受けた患者から得た。腫瘍
集団を10％DMSOおよび20％ABヒト血清と一
緒に−196℃の蒸気相液体窒素で、表面の特性
づけまで、寒冷保存した。 実施例 シトフルオログラフ（cytofluorographic）分
析および細胞分離 すべての細胞集団を用いるモノクローナル抗体
のシトフルオログラフ分析を、シトフルオログラ
フ（Cytofluorograf）FC200／4800A（Ortho
Instruments）を用いて蛍光共役したやぎの抗マ
ウスIgG（Ｇ／Ｍ FITC）（Meloy
Laboratories）を用いて間接免疫蛍光法により実
施した。要約すると、１〜２×106細胞を0.15ml
のOKM1で１：500希釈において処理し、４℃で
30分間培養し、２回洗浄した。次いで細胞を0.15
mlの１：40希釈のＧ／Ｍ FITCで４℃において
30分間反応させ、遠心分離し、２回洗浄した。次
いで細胞をFACS−１で分析し、蛍光の強さ／細
胞をパルス高さ分析器に記録した。バツクグラウ
ンドの染色は、非生成性交雑クローン性で腹膜的
に免疫したBALB／cJマウスからの１：500腹水
の0.15ml部分を代わりに使用することによつて得
た。 抗体および補体を中介するリンパ溶解を含む実
験において、胸腺および末梢Ｔ細胞は選択的溶解
後一夜溶解し、次いでシトグラフまたはFACSで
引続いて分析した。 Ａ 細胞障害性の研究 細胞を中介するリンパ溶解（CML）につい
ての増感培養を、次の手順により行つた。５×
106のターゲツト細胞を0.2mlの 51Crクロム酸
ナトリウム（292μCi／ml）（New England
Nuclear、Boston、MA）で処理し、そして37
℃で90分間培養した。２回洗浄後、細胞を10％
のFCSを含有する媒質中で２×105／mlに希釈
した。20μの標識付けした細胞を、2μのハ
イブリドマ抗体の血清希釈溶液を含む円錐形マ
イクロプレート（microplate）のウエルの中
に分配した。４℃で１時間培養した後、20μ
の新鮮なウサギの血清（１：10希釈）をウエル
に補体源として加えた。プレートを37℃で１時
間培養した。140μの媒質を次いでウエルに
加え。プレートを400ｇで10分間回転した。
100μの上澄液を各ウエルから取り出し、ガ
ンマシンチレーシヨンカウンター（Parkard
Instrumentation Company、Downer′s
Grove、11）で計数した。比 51Crの解放を、
次式を用いて計算した： ％比 51CR解放＝Exp−SR／MR−SR×100 ここでExpは観測された３回の結果の平均で
あり、SRは補体単独で培養した細胞からの自
発的解放であり、そしてMRは洗浄剤Triton
Ｘ（１％溶液）で細胞を処理して得られた最高
の解放である。 引き続く増殖検定のための細胞のより大きい
数の溶解は、20〜50×106の単核細胞を１の
OKM1中に１：250の希釈で再懸濁し、そして
４℃で１時間培養することによつて行つた。 引き続いて、0.1mlの新鮮なウサギの血清を
加え、細胞を37℃で１時間さらに培養した。３
回洗浄後、細胞を計数し、それらの生活力をト
リパン青の排除により評価した。 Ｂ 増殖の応答の検定 可溶性抗原に対する増殖の応答を、前述のよ
うに測定した。細胞を20％のヒトAB血清で補
充したRPMI 1640中で２×106生活力のある細
胞／mlの濃度にし、マイクロ力価
（microtiter）のプレート中で破傷風トキソイ
ド（TT）（Massachusetts Department of
Public Health Biological Laboratories、
Boston、MA）、精製したタンパク質誘導体
（PPD）（National Institutes of Health、
Bethesda、MD）、またはおたふくかぜCF抗原
（Microbiological Associates、Waker sville、
MD）の存在で培養した。培養物を0.2Ciの
［Ｈ−メチル］サイミジン（ 3H TdR）
（1.9μCi／ｍＭの比活性）（Schwarz−Mann、
Orangeburg、NY）で５日間パルス（Pulse）
し、18時間後MASH 11装置
（Microbiological Associates）で収穫した。
3H−TdRの組み込みはパツカード液体シンチ
レーシヨンカウンター（Packard
Instrumentation Company）で測定した。各
実験のグループは３回ずつ検定し、そして結果
を平均の計数値／分（cpm）±平均の標準偏差
として表わす。 ハイブリドマの生成、および生ずるモノクロー
ナル抗体の生成および特性づけは、上の実施例に
おけるように実施した。大量の主題の抗体を、主
題のハイブリドマのマウスへの腹腔内注射および
悪性腹水の収穫により調製したが、ハイブリドマ
は試験管内でこの分野においてよく知られた技術
により培養し、抗体を上澄液から取り出すことが
できることは、明らかに考えられる。 ９人の正常の提供者の末梢血液の単核細胞を、
付着性の集団および非付着性の集団にポリスチレ
ン皿で分離し、各部分をFACSで間接的に免疫蛍
光について分析した。OKM1で特別に標識付け
した細胞の百分率を表１に記載する。陽性の細胞
の平均は分別しない細胞について27％、非付着性
の細胞について18％、そして付着性の細胞につい
て78％であつた。提供者＃１についての３つの集
団のFACS蛍光のプロフイルを、第１図に示す。
第１Ａ図に見られるように、分別しない単核細胞
についてのOKM1の蛍光パターンは２つのモー
ドがある。同じ集団の次元写像（dimensional
mapping）は、OKM1により鮮明に染色された
細胞も大きいことを示した。蛍光の強さが弱い小
さい細胞の集団も検出された。これらの小さい細
胞のほとんどは、非付着性部分中に見い出される
（第１Ｂ図）。これと対照的に、付着性細胞は鮮明
に染色された大きい集団（第１Ｃ図）を含有す
る。このOKM1の付着性集団との反応性は、抗
体により認識された単核細胞が単球であつたこと
を示唆し、そして被検者の抗体を検出し、他の抗
体と区別できる１つの試験を提供する。 異なる抗体のリンパ球および骨髄細胞は、この
特異性についての証拠をさらに与えた。OKM1
はＢ細胞ライン（Laz156、およびLaz388）、Ｔ細
胞ライン（CEMおよびHSB2）および３種のヒ
トの胸腺細胞の製剤と反応しない。その上に、３
のＴ−CLL、６つのＢ−CLL、３つのＴ−ALL
および６つの非Ｔ−ALL腫瘍細胞も陰性であつ
た。これと対照的に、OKM1は５つの急性骨髄
単球白血病（AMML）試料の44〜82％および８
つの急性骨髄芽球白血病（AML）の場合のうち
の２つにおける細胞の約35％と強く反応性であつ
た。２つの骨髄ラインK562（Lozzio、et al．、
Blood 45、321（1975）およびHL 60（Collins、
et al．、Native、270 347（1977）は陰性であつ
た。４人の正常の提供者から単離した多形核の白
血病は鮮明の標識付けされた。これらの結果は、
共通の源の密接に関連する細胞である顆粒球およ
び単球の考えと一致した。さらに、AML細胞を
用いて得られたデータは、OKM1が骨髄直系の
単球細胞と優先的に反応することを示すように思
われた。この反応性のパターンは、被検者の抗体
を検出し、他の抗体から区別できる追加の試験を
提供する。 分別しない、付着性および非付着性の単核細胞
について観測された染色パターンは、抗体によつ
て定められた単球の集団が大きさおよび付着性に
関して不均質であることを示唆した。表面Iaの抗
原を単球の下位集団について説明してきたが、上
の細胞部分（提供者＃１）を単クローン性抗Ia抗
体、OKI1について試験して、OKM1によつて同
定される細胞の表現型をさらに特徴づけた。非付
着性の部分および付着性の部分中のOKI1+の百分
率は、それぞれ９％および80％であつた。Iaを有
するリンパ球は非付着性集団中のOKI1を用いて
見い出される染色のあるものを説明するので、
OKM1により認められる小さい非付着性の細胞
は主としてIa-である。これと対照的に、大きい
付着性のOKM1+単球は表面Ia決定子を有する。 E+集団およびE-集団の内部のOKM1の分布は、
表中に示されている。標識付け細胞のほとんど
はE-集団中に見い出されたが、22％まで（平均
13％）の陽性細胞はE+部分中に存在した。E-細
胞およびE+細胞についてのFAC蛍光のプロフイ
ルは第２図に示されている。E-細胞は、前述の
大きい細胞と小さい細胞の存在のため、２つのモ
ードの汚染パターンを有した。E+集団について
の蛍光の強さは、より均質であつた。この部分中
に見い出される陽性細胞は、小さい大きさの、大
部分Ia-であつた（OKI1との平均の反応性、３
％）。この反応性のパターンは、被検体の抗体を
検出し、他の抗体と区別できる、ほかの試験であ
る。 Ig-、E-、非付着性細胞の集団とのOKM1反応
性の代表的FACSヒストグラムは、第３図に示さ
れている。細胞の84％はOKM1で染色され、そ
して11％はOKI1で染色された。こうして、これ
らの研究によれば、OKM1+、Ia-非付着性細胞
は、驚くべきことには無特徴細胞のほとんどを占
めることが示された。この反応性のパターンは、
被検体の抗体を検知し、他の抗体と区別できる、
なおほかの試験である。 補体を中介とする溶解の検定は、前述の集団の
いくつかについて実施した。OKM1の血清希釈
液を、分別しない、非付着性細胞および付着性細
胞について試験した。比 51Cr解放値を、表４に
示す。各集団について直接的免疫蛍光（提供者
＃５、表）により見い出されている百分率およ
び補体が中介する溶解の間にすぐれた相関関係が
存在した。 また、E+細胞およびE-細胞を研究し、得られ
たデータを表に示す。再び、比 51Cr解放の結
果は直接的免疫蛍光により見い出される標識付け
に相当した（提供者＃８、＃９および＃10）。 既知の単球に依存するＴ細胞の機能についての
OKM1および補体の予備の影響、すなわち、可
溶性抗原に対する増殖を研究した。正常の提供者
からの単核細胞を、OKM1抗体（１：250希釈）
で補体の存在で培養した。等級づけた量の同原の
付着性細胞を、可溶性抗原で開始する（trigger）
前に、この予備処理した集団に加えた。表に示
すように、OKM1および補体処理した単核細胞
は可溶性抗原に応答して増殖しないが、０％の付
着性細胞の添加はそれらの増殖の応答を回復でき
た。補体の不存在下のOKM1抗体を用いる培養
はこのＴ細胞の機能に影響を及ぼさなかつたの
で、補体の存在下に見られる効果は単核細胞の集
団内の単球の特別の死に帰することができた。 10〜20％の付着性細胞をOKM1で予備処理し
た細胞へ加えたとき、バツクグラウンドおよび抗
原で誘発した増殖の両方は処理しない集団と比べ
たとき、増大した。 また、CMLについてのOKM1の効果は、被検
体の抗体を検知し、他の抗体から区別できる１つ
の試験である。 表は、末梢Ｔ細胞およびＴ細胞部分集合の水
準と種々の患者の状態との間の関係を示す。これ
らの関係は、これらの疾患の状態の１つをもつこ
とが凝わしい個体の血液試料を分析してＴ細胞お
よびＴ細胞部分集合の水準を決定することによ
り、診断の目的で（たとえば、急性伝染性単核症
を検出するために）使用できる。また、これらの
関係は、疾患の状態の原因がＴ細胞の部分集合の
水準の上昇（たとえば、型の後天性無ガンマグ
ロブリン血症）である場合、治療の目的に使用で
きる。治療の目的で、Ｔ細胞部分集合の水準が増
大した患者に適当なモノクローナル抗体を投与す
ると、その過剰を減少または排除できる。表に
示す関係は、OKT11抗体を検出し、他の抗体と
区別できるほかの方法である。 本発明者らが製造したハイブリドマを生成する
他のモノクローナル抗体（表示したOKT1、
OKT3、OKT4およびOKT5）は、次の米国特許
出願に記載され、そして特許請求されている： 1979年３月２日付け出願第22132号；1979年４
月26日付け出願第33639号；1979年４月26日付け
出願第33669号；1979年９月18日付け出願第76642
号；および1979年10月９日付け出願第82515号。
本発明者らが製造したハイブリドマを生成するな
お他のモノクローナル抗体（表示したOKT6、
OKT8、OKT9およびOKT10）は、1979年12月
４日付けの、次の発明の名称を有する米国特許出
願に記載され、特許請求されている：Hybrid
Cell Line for Producing Monoclonal
Antibody to ａ Human Thymocyte
Antigen、Antibody、and Methods；Hybrid
Cell Line For Producing Complement−
Fixing Monoclonal Antibody to Human
Suppressor Ｔ Cells、Antibody、and
Methods；Hybrid Cell Line For Producing
Monoclonal Antibody to Human Early
Thymocyte Antigen、Antibody、and
Methods；and Hybrid Cell Line For
Producing Monoclonal Antibody to ａ
Human Prothymocyte Antigen、Antibody、
and Methods（ヒトの胸腺細胞抗原に対するモノ
クローナル抗体を生成する交雑細胞ライン、抗
体、および方法；ヒトのサプレツサーＴ細胞に対
する補体固定モノクローナル抗体を生成する交雑
細胞ライン、抗体、および方法；ヒトの初期の胸
腺細胞抗原に対するモノクローナル抗体を生成す
る交雑細胞ライン、抗原、および方法；およびヒ
トの前胸腺細胞（Prothymocyte）抗原に対する
モノクローナル抗体を製造する交雑細胞ライン、
抗体、および方法）本発明者らによつて製造され
たほかのモノクローナル抗体生成ハイブリドマ
（OKT11と表示）は、本願と同日付けの、次の発
明の名称を有する米国特許に記載され、特許請求
されている；Hybrid Cell Line for Producing
Antibody for ａ Human Ｔ Cell、Antigen、
Antibody、and Methods（ヒトのＴ細胞抗原に対
する抗体を生成する交雑細胞ライン、抗体、およ
び方法）。これらの出願を引用によつてここに加
える。 本発明によれば、正常なヒトの単球に見い出さ
れる抗原に対する抗体を生成できるハイブリド
マ、このハイブリドマを生成する方法、正常なヒ
トの単球に見い出される抗原に対するモノクロー
ナル抗体、この抗体を生成する方法、およびこの
抗体を用いる病気の処置または診断の方法あるい
は単球の部分集合の同定法が提供される。 本明細書において、“超IgE（Hyper IgE）”と
は、この抗体の量が通常の値よりも多いことを意
味する。これは一般にアレルギ性体質に表われ
る。 また“急性組織移植対宿主反応（Acute graft
versus host reaction）”とは、例えば生体移植
の場合における宿主による免疫学的な、全体或い
は部分的な拒絶反応のことである。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 ヒトの胸腺細胞の抗原に対する単一のモノクロ
ーナル性抗体を生成する単一のハイブリドマだけ
を説明してきたが、本発明はここに説明する特性
を示すすべてのモノクローナル抗体を包含すると
考えられる。主題の抗体OKM1はねずみのIgGの
４つのサブクラスの１つであるサブクラスIgG2a
に属することが決定された。免疫グロブリンＧの
これらのサブクラスは互いにいわゆる「固定され
た」領域において異なるが、特定の抗原に対する
抗体はいわゆる「可変の」領域をもち、この領域
は免疫グロブリンＧのどのサブクラスがそれに属
するかに無関係に機能的に同一である。すなわ
ち、ここに説明した特性を示す抗体はサブクラス
IgG1、IgG2a、IgG2b、またはIgG3、あるいはク
ラスIgM、IgA、あるいは他の既知のクラスIgで
あることができる。これらのクラスまたはサブク
ラスの間の差異は抗体の反応パターンの選択性に
影響を及ぼさないが、抗体と他の物質、たとえ
ば、補体または抗マウス抗体とのほかの反応に影
響を及ぼすことがあるであろう。主題の抗体は
IgG2aに特定したが、ここに例示した反応性のパ
ターンを有する抗体類はそれらが属する免疫グロ
ブリンのクラスまたはサブクラスに無関係に本発
明の範囲内に包含されると考えられる。 さらに、本発明の範囲内に、ここに例示したハ
イブリドマの技術を用いて前述の単クローン性抗
体を生成する方法が包含される。ハイブリドマの
ただ１つの例をここに記載したが、当業者はここ
に提供した免疫法、融合法および選択法に従い、
ここに説明した反応性の特性を有する抗体類を生
成しうる他のハイブリドマ類を得ることができる
と考えられる。マウスの既知の種からの既知の骨
髄種細胞系統から生成した個々のハイブリドマは
このハイブリドマにより生成された抗体を参照す
る以外それ以上同定できないので、前述の反応性
の特性を有する抗体を生成するすべてのハイブリ
ドマ類は本発明の範囲内に包含され、これらのハ
イブリドマを用いるこの抗体をつくる方法も同様
に包含されると、考えられる。 本発明のほかの面は、モノクローナル抗体
OKM1またはここに明らかにした反応性のパタ
ーンを示す他のモノクローナル抗体を用いて病気
を処理または診断する方法である。主題の抗体を
使用して、単球の分化の検出および研究すること
ができる。その上、主題の抗体を使用して、表
に示す病気の状態を診断することができる。これ
らの技術は、OKM1抗体を単独で、または他の
抗体（たとえば、OKT3〜OKT11）と組み合わ
せて使用することにより、用いることができる。
Ｔ細胞およびＴ細胞部分集団および／または単球
部分集合に対する抗体のパネルとの反応性のパタ
ーンは、先行技術の診断法を用いて可能であるよ
りも、ある種の病気状態の一層精確な検知を許す
であろう。たとえば、AMMLおよび（より少な
い程度に）AMLを、個体からの白血病細胞を
OKM抗体と反応させることにより、検知でき
る。 OKM1+細胞の過剰を特徴とする病気の状態
（たとえば、AMMLのような悪性疾患）の処置
は、治療学的に有効な量のOKM1抗体を処置の
必要なとき個々の患者に投与することによつて、
行なうことができる。OKTM+抗原と選択的に反
応させることにより、有効量のOKM1抗体は過
剰量のOKM1+細胞を減少し、こうしてその過剰
の効果を軽減する。 有効量のOKM1抗体とそれぞれ診断学的また
は治療学的に許容できる担体とからなる診断学的
および治療学的組成物も、本発明の範囲内に包含
される。
（hybrid cell line）さらに詳しくは正常のヒトの
単球および顆粒球に見い出されるある抗原に対す
るモノクローナル（monoclonal）抗体の生成の
ための交雑細胞ラインに関する。 1975年におけるKohlerおよびMilsteinによる
免疫されたマウスからの脾細胞へのマウスの骨髄
腫の融合（fusion）［Nature 256、495−497
（1975）］は、均質な（いわゆる「モノクローナ
ル」）抗体をつくる連続な細胞ラインを得ること
ができることを初めて証明した。この基本の研究
以来、種々の交雑細胞［いわゆる「ハイブリドマ
類（hybridomas）」］の生成およびこれらのハイ
ブリドマ類によりつくられた抗体の種々の科学的
研究への使用について多くの努力が向けられてき
た。たとえば、次の文献を参照：Current
Topics in Microbiology and Immunology、
Volume 81−“Lymphocyte Hybridomas”、F.
Melchers、M.Patter、およびN.Warner、
Editors、Springer−Verlag、1978、およびそこ
に含まれる参考文献；C.J.Barnstable、et al．、
Cell、14、９−20（May、1978）；P.Parhamおよ
びW.F.Bodmer、Nature 276、397−399
（November、1978）；Handbook of
Experimental Immunology、Third Edition
Volume ２、D.M.Wier、Editor Blackwell、
1978、Chapter 25；およびChemical and
Engineering News、January １、1979、15−
17。これらの文献は同時にハイブリドマ類からモ
ノクローナル抗体を生成する試みによつて得られ
る利益および複雑さを示している。一般的技術は
概念的によく理解されているが、各特定の場合に
多くの困難に出合い、そして変更が要求される。
事実、一定のハイブリドマを生成しようと試みる
前には、所望のハイブリドマが得られるか、得ら
れた場合抗体を生成するか、あるいはそのように
生成された抗体が所望の特異性をもつか、を確め
ることができない。成功の程度は、主として、使
用する抗原のタイプおよび所望のハイブリドマを
単離するために使用する選択技術によつて影響を
受ける。 人間のリンパ球細胞表面の抗原に対するモノク
ローナル抗体を生成する試みは、数例報告されて
いるだけである。たとえば、Current Topics in
Microbiology and Immunology、ibid、66−69
および164−169参照。これらの報告された実験に
おいて使用されている抗原は、培養したリンパ芽
様性白血病およびヒトの慢性リンパ球性白血病の
細胞ラインであつた。得られた多くのハイブリド
マ類は、すべてのヒト細胞の種々の抗原に対して
抗体を生成するように思われた。ハイブリドマ類
はいずれも、ヒトのリンパ球の前もつて定めた群
に対して抗体を生成しなかつた。 最近、本発明者らおよび他の研究者は、あるＴ
細胞に対する抗体をつくるハイブリドマの製造お
よび試験について文献に開示した。参照、たとえ
ば、Reinherz、E.L.、et al.、J.Immunol.123、
1312−1317（1979）；Reinherz、E.L.、et al．、
Proc.Natl.Acad.Sci.、76、4061−4065（1979）；
およびKung、P.C.、et al．、Science、206、347
−349（1979）。 さらに、抗大食細胞生成クローンの最近の報告
が存在する。参照、Springer、et al.、Eur.J.
Immunol.、９、301（1979）。 人間および動物の免疫系に含まれるリンパ球に
２つの主なクラスが存在することを理解すべきで
ある。これらのうちの第１クラス（胸腺誘導細
胞、すなわち、Ｔ細胞）は、ヘモポイエチン幹細
胞から胸腺において分化されている。胸腺内にあ
る間、分化する細胞は「胸腺細胞」と名づけられ
る。成熟したＴ細胞は胸腺から出、そして組織、
リンパ管、および血流の間を循環する。これらの
Ｔ細胞は、再循環する小さいリンパ球の貯留
（pool）の大きい比率を形成する。それらは免疫
学的特異性を有し、そして細胞性免疫応答（組織
移植注入のような）においてエフエクター
（effector）細胞として直接関与する。Ｔ細胞は
液性抗体を分泌しないが、後述するリンパ球の第
２クラスによるこれらの抗体の分泌に時々要求さ
れる。Ｔ細胞のいくつかの型は免疫系の他の面に
おいて調節機能をはたす。この細胞共働の過程の
機構はまだ完全に理解されていない。 リンパ球の第２クラス（骨髄誘導細胞、すなわ
ち、Ｂ細胞）は、抗体を分泌するものである。そ
れらもまたヘモポイエチン幹細胞から発生する
が、それらの分化は胸腺によつて決定されない。
鳥類において、それらはフアブリキウス嚢
（Bursa of Fabricius）と呼ばれる胸腺に類似す
る器官において分化されている。しかし、哺乳動
物においては、同等の器官は発見されておらず、
そしてこれらのＢ細胞は骨髄内で分化すると考え
られる。 ここで、Ｔ細胞は「ヘルパー（helper）」、「サ
プレツサー（Suppressor）」および「キラー
（killer）」Ｔ細胞と呼ばれる、少なくともいくつ
かのサブタイプに分けられ、それらは（それぞ
れ）反応を促進し、反応を抑制し、あるいは異種
細胞を殺す（分離する）機能を有することが認め
られた。これらのサブクラス群はネズミの系統に
ついてよく理解されているが、それらは人間の系
についてわずかに最近記載されただけである。た
とえば、次の文献を参照：R.L.Evans、et al．、
Journal of Experimental Medicine、Volume
145、221−232、1977；およびL.ChessおよびS.F.
Schlossman−“Functional Analysis of
Distinct Human Ｔ−Cell Subsets Bearing
Unique Differentiation Antigens”
“Contemporary Topics in Immunobiology”、
O.Stutman、Editor、Plenum Press、1977、
Volume ７、363−379。 Ｔ細胞のクラスまたはサブクラスを同定または
抑制することができることは、種々の免疫調節の
不調または状態の診断または処置にとつて重要で
ある。 たとえば、ある種の白血病およびリンパ腫は、
それらがＢ細胞またはＴ細胞のいずれを源とする
かによつて、異なる予後を有する。こうして、病
気の予後の評価はこれらのリンパ球の２つのクラ
スを区別することに依存する。たとえば、次の文
献を参照：A.C.AisenberyおよびJ.C.Long、The
American Journal of Medicine、58：300
（March、1975）；D.Belpomme、et al.、
Immunological Diagnosis of Leukemias and
Lymphomas、S.Thierfelder、et al.、Editors、
Springer、Heidelberg、1977、33−45；および
D.Belpomme、et、al．、British Journal of
Haematology、1978、38、85。 ある種の病気の状態（たとえば、若年性リウマ
トイド関節炎およびある種の白血病）は、Ｔ細胞
のサブクラスの不釣合いに関する。自己免疫の病
気は一般に「ヘルパー」Ｔ細胞の過剰またはある
種の「サプレツサー」Ｔ細胞の欠乏に関連する
が、悪性の病気は一般に「サプレツサー」Ｔ細胞
の過剰に関連することが示唆された。 ある種の白血病において、過剰のＴ細胞は発育
の停止した状態において生成される。診断はこう
してこの不釣合い、すなわち、過剰を検知するこ
とができることに依存しうるであろう。たとえ
ば、次の文献を参照：J.Kersey、et al.、
“Surface Markers Define Human Lymphoid
Malignancies with Differing Prognoses”、
Haematology and Blood Transfusion、
Volume 20、Springer−Verlag、1977、17−24、
およびその中に含まれる参考文献；およびE.L.
Reinherz、et al.、J.Clin.Invest.、64、392−397
（1979）。 後天性無ガンマグロブリン血症、すなわち免疫
グロブリンを生成しない疾患の状態は少なくとも
２つの明確な型からなる。型において、免疫グ
ロブリンを生成できないのはサプレツサーＴ細胞
の欠乏によるが、型はヘルパーＴ細胞の欠乏に
よる。両型において、患者のＢ細胞、すなわち抗
体の実際の分泌に関係するリンパ球の不足もしく
は欠乏は存在しないように思われる。しかしなが
ら、これらのＢ細胞は抑制されるか「ヘルプされ
ない」状態にあり、その結果免疫グロブリンの生
成は大きく減少するか、あるいは存在しない。こ
の型の後天性撫ガンマグロブリン症は、それゆ
え、サプレツサーＴ細胞の過剰またはヘルパーＴ
細胞の不存在を試験することによつて決定でき
る。 治療サイドにおいて、また明確に証明されてい
ないが、Ｔ細胞のサブタイプに対する抗体を過剰
量で投与することは自己免疫の病気または悪性の
病気において治療上有益であるという、いくらか
の示唆がある。たとえば、ヘルパーＴ細胞のガン
（ある種の皮膚Ｔ細胞リンパ腫およびある種のＴ
細胞急性リンパ芽球白血病）はヘルパーＴ細胞抗
原に対する抗体によつて処置できる。ヘルパー細
胞の過剰を原因とする自己免疫の処置も同じ方法
で達成できる。サプレツサーＴ細胞の過剰による
病気（たとえば、悪性腫瘍または型後天性無ガ
ンマグロブリン症）は、サプレツサーＴ細胞抗原
に対する抗体を投与することによつて処置でき
る。 ヒトＴ細胞の全クラス（いわゆる抗ヒト胸腺細
胞のグロブリン、すなわち、ATG）に対する抗
血清は、移植組織を受ける患者において治療上有
用であると報告されている。細胞性免疫応答（移
植組織を拒否する機構）はＴ細胞に依存するの
で、Ｔ細胞に対する抗体を投与すると、この拒否
の過程を防止または遅延する。たとえば、次の文
献を参照：Cosimi、et al.、“Randomized
Clinical Trial of ATG in Cadaver Renal
Allgraft Recipients：Importance of Ｔ Cell
Monitoring”、Surgery 40：155−163（1976）お
よびその中に含まれる参考文献。 しかしながら、リンパ球は１つのクラスの白血
球のみからなる。他の２つのクラス、すなわち、
顆粒球および単球も人間および動物の免疫系の機
能において重要である。特に、単球の１つの型で
ある大食細胞は免疫機能において広く含まれる。
たとえば、大食細胞自体は、分泌抗体ではない
が、Ｂ細胞による抗体の生成においてＴ細胞の共
同に必要であることがわかつた。 大食細胞も、細胞障害性Ｔ細胞の生成に、そし
てミトゲン、たとえば、PHAまたはCon Ａに対
する反応におけるＴ細胞による増殖応答の発生
に、必要である。これらの方法における大食細胞
の機能についての考察が存在するが、その正確な
役割は知られていない。参照、たとえば、E.S.
Golub、TheCellular Basis of the Immune
Response、Sinauer Associates、Sunderland、
Massachusetts、1977、ページ146−158。 ヒトＴ細胞のクラスおよびサブクラスの同定お
よび抑制は、従来、動物をヒトＴ細胞で免疫し、
その動物を出血させて血清を取り、そしてこの抗
血清を（たとえば）自己由来の（autologous）
であるが、異種ではないＢ細胞で吸着して望まな
い反応性をもつ抗体を除去することによつて得
た、ヒトＴ細胞のための自発性自己抗体または選
択的抗血清を使用することによつて達成された。
これらの抗血清の製造は、とくに吸着および精製
の工程において、きわめて困難である。吸着され
且つ精製された抗血清でさえ、所望の抗体に加え
て、いくつかの理由で多くの不純物を含有する。
第１に、血清はＴ細胞で免疫する前に数百万の抗
体分子を含有する。第２に、この免疫法は注入し
たすべてのヒト細胞について見い出される種々の
抗原に対する抗体を生成させる。単一の抗原に対
する抗体は選択的に生成されない。第３に、この
ような方法で得られた特異性抗体の力価は通常極
めて低く（たとえば、１：100より大きい希釈度
において不活性）そして非特異性抗体に対する比
は１／106より小である。 たとえば、前述のChessおよびSchlossmanの
文献（365ページ以降参照）および前述の
Chemical and Engineering Newsを参照。ここ
には先行技術の抗血清の欠点およびモノクローナ
ル抗体の利点が記載されている。 今回、正常なヒトの末梢血液単球および顆粒球
について見い出されるが、ヒトの末梢リンパ細胞
（Ｔ細胞、Ｂ細胞または無特徴細胞）、胸腺細胞、
リンパ芽球様細胞ライン、またはＴ細胞直系もし
くはＢ細胞直系の腫瘍細胞について見い出されな
い抗原に対する新規なモノクローナル抗体を生成
できる新規なハイブリドマ（OKM1と表示する）
が発見された。 そのように生成された抗体は正常なヒトの末梢
血液の単球および顆粒球についての単一の決定子
に対して単一特異性（monospecific）であり、
そして他の抗ヒト免疫グロブリンを本質的に含有
しないが、これと対照的に先行技術の抗血清は多
数のヒト抗原に対して反応性の抗体で本来汚染さ
れており、そして先行技術のモノクローナル抗体
は正常なヒトの単球の抗原について単一特異性で
はない。その上、このハイブリドマは培養して抗
体を生成することができる。この場合動物を免疫
し、殺し、次いで先行技術の不純の抗血清を得る
ときにさえ、必要な長たらしい吸着および精製の
工程を実施することを要しない。 したがつて、本発明の１つの目的は、正常なヒ
トの末梢血液の単球および顆粒球について見い出
される抗原に対する抗体を生成するハイブリドマ
類を提供することである。 本発明のさらに別の面において、これらのハイ
ブリドマ類を製造する方法を提供する。 本発明の他の目的は、正常なヒトの末梢血液の
単球および顆粒球について見い出される抗原に対
する本質的に均質な抗体を提供することである。 さらに他の目的は、この抗体を用いる病気の処
置または診断の方法あるいは単球のサブクラスの
同定法を提供することである。 本発明のその他の目的および利益は、本発明の
開示を検討すると明らかになるであろう。 前述の目的および利益を達成するため、本発明
によれば、正常なヒトの末梢血液の単球および顆
粒球について見い出される（が正常のヒトの末梢
リンパ球、胸腺細胞、リンパ芽球様細胞ライン、
またはＴ細胞直系もしくはＢ細胞直系の腫瘍細胞
について見い出されない）抗原に対する新規な抗
体を生成する新規なハイブリドマ、この抗体それ
自体、およびこの抗体を用いる診断および治療の
方法が提供される。このハイブリドマはMilstein
およびKohlerの方法に一般に従つて製造される。
正常のＥロゼツト（rosette）精製したヒトの単
核細胞でマウスを免疫した後、免疫したマウスの
脾細胞をマウスの骨髄腫ラインからの細胞と融合
し、そして得られたハイブリドマ類を正常のＥロ
ゼツト陽性およびＥロゼツト陰性のヒトの末梢血
液の単球の集団に選択的に結合する抗体を含有す
る上澄液を用いてそれらについて選別した。所望
のハイブリドマ類を引き続いてクローン系に分け
（clone）、特性づけた。その結果、正常なヒトの
末梢血液の単球についての抗原に対する抗体
（OKM1と表示する）を生成するハイブリドマが
得られた。 先行技術において示された困難および抗原とし
て悪性の細胞ラインを用いて報告された成功の不
足を見ると、本発明の方法が所望のハイブリドマ
を提供したことは驚くべきことであつた。交雑細
胞のこの予測されえない性質は１つの抗原または
ラインから他のものへの補外（extrapolate）を
許さないことに注意すべきである。事実、本発明
者らは、抗原としてＴ細胞の悪性細胞ラインを用
いると、所望の抗体を生成しないハイブリドマ類
が形成することを見い出した。細胞表面から分離
した精製した抗原を使用する試みも不成功に終つ
た。 主題のハイブリドマおよびそれにより生成され
た抗体の両者は、この明細書中で表示「OKM1」
で呼ばれ、言及される特定の物質は文脈から明ら
かである。主題のハイブリドマは、アメリカン・
タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（12301Parklawn Drive、Rockville、MD、
20852）に1979年12月13日に寄託され、ATCC番
号CRL8026が付された。 このハイブリドマおよび生ずる抗体の製造およ
び特性は、以下の説明および実施例から一層理解
できるであろう。 ハイブリドマを製造する方法は一般に次の工程
からなる： Ａ 正常なヒトの末梢血液の単核細胞でマウスを
免疫する。メスのBALB／cJマウスが好まし
いことがわかつたが、他のマウスの系統を使用
できると考えられる。免疫スケジユールおよび
胸腺細胞の濃度は、有効量の適当に準備した脾
細胞を生成するようなものであるべきである。
0.2mlのリン酸塩緩衝食塩溶液中の２×107細
胞／マウス／注射を用いて、14日の間隔で、３
回免疫を行うことは有効であることがわかつ
た。 Ｂ 免疫したマウスから脾臓を取り出し、適当な
媒質中の脾懸濁液を調製する。約１ml／脾臓の
媒体で十分である。これらの実験の技術はよく
知られている。 Ｃ 懸濁した脾細胞を適当な細胞ラインからのマ
ウスの骨髄腫の細胞と、適当な融合促進剤の使
用により融合する。脾細胞対骨髄腫細胞の好ま
しい比は約５対１である。約108個の脾細胞に
ついて合計約0.5〜1.0mlの融合媒質は適当であ
る。多くのマウスの骨髄腫の細胞は知られてお
り、そして一般に学問的共同体のメンバーまた
は種々の寄託機関、たとえば、ザ・ソーク・イ
ンスチチユート・セル・デイストリビユーシヨ
ン・センター（the Salk Institute Cell
Distribution Center、La Jolla、CA）から入
手できる。使用する細胞ラインは好ましくはい
わゆる「薬物抵抗性」型であつて、未融合の骨
髄腫細胞が選択した媒体中で生存せず、一方交
雑細胞が生存するようにすべきである。最も普
通の群は８−アザグアニン抵抗性の細胞ライン
であり、これは酵素ヒポキサンチン・グアニ
ン・ホホリボシル・トランスフエラーゼ
（phophoribosyl transferase）を欠き、それゆ
えHAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、
およびチミジン）媒体により支持されない。ま
た使用する骨髄腫細胞ラインはいわゆる「非分
泌」型である、すなわち、それはそれ自体抗体
を生成しないことが一般に好ましいが、分泌型
を使用できる。しかしながら、ある場合におい
て、分泌する骨髄腫ラインは好ましいことであ
る。好ましい融合促進剤は平均分子量が約1000
〜約4000であるポリエチレングリコール（商業
的にPEG 1000などとして入手できる）が好ま
しいが、この分野において知られている他の融
合促進剤を使用できる。 Ｄ 別の容器内において、未融合の脾細胞、未融
合の骨髄腫細胞、および融合した細胞の混合物
を、未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択的媒
質中で希釈し、未融合の細胞を死亡させるのに
十分な時間（約１週間）培養する。この希釈は
限定されたものの型であることができ、この希
釈において希釈剤の体積は統計的に計算して各
別々の容器［たとえば、微小力価の板の各ウエ
ル（well）］中である数の細胞（たとえば、１
〜４）を単離する。媒体は薬物抵抗性（たしえ
ば、８−アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄
腫細胞ラインを支持しないもの（たしえば、
HAT媒質）である。それゆえ、これらの骨髄
腫細胞は死ぬ。未融合の脾細胞は非悪性である
ので、有限の数の世代をもつだけである。こう
して、ある期間（約１週間）後、これらの未融
合の脾細胞は再生しない。融合した細胞は、こ
れに対して、骨髄腫の親の悪性をもち、そして
脾細胞の親の選択的媒体で生存できるので、再
生し続ける。 Ｅ ハイブリドマを含有する各容器（ウエル）中
の上澄液を、Ｅロゼツト陽性の精製したまたは
Ｅロゼツト陰性のヒトの末梢血液のリンパ球に
対する抗体について測定する。 Ｆ 所望の抗体を生成するハイブリドマを選択し
（たとえば、限定希釈により）そしてクローン
に分ける。 いつたん所望のハイブリドマを選択し、クロー
ンに分けると、終結の抗体は２つの方法の１つで
生成させることができる。最も純粋なモノクロー
ナル抗体は、所望のハイブリドマを適当な媒質中
で適当な長さの時間試験内で培養し、次いで所望
の抗体を上澄液から回収することによつて生成さ
れる。適当な媒質および適当な培養時間の長さ
は、既知であるか、あるいは決定容易である。こ
の試験管内技術は、他の特異性の抗ヒト免疫グロ
ブリンを本質的に含まない、単一特異性モノクロ
ーナル抗体を本質的に生成する。媒質は外因性血
清（たとえば、胎児の子牛の血清）を含有するの
で、少量の他の免疫グロブリンが存在する。しか
しながら、この試験管内の方法は、モノクローナ
ル抗体の濃度がわずかに約50μｇ／mlであるの
で、十分な量または濃度を生成できない。 非常に大きい濃度のわずかに純度に劣るモノク
ローナル抗体を生成させるため、所望のハイブリ
ドマをマウス、好ましくは先天性または半先天性
のマウスに注射できる。ハイブリドマは適当な潜
伏時間後抗体生成の腫瘍を形成させ、その結果宿
主マウスの血流および腹膜滲出液（腹水）中に高
濃度の所望とする抗体（約５〜20mg／ml）が生ず
る。これらの宿主マウスも正常の抗体を血流およ
び腹水の中に有するが、これらの正常な抗体の濃
度はモノクローナル抗体濃度のわずかに約５％で
あるにすぎない。その上、これらの正常の抗体は
特異性が抗ヒトでないので、収穫した腹水または
血清から得たモノクローナル抗体は汚染する抗ヒ
ト免疫グロブリンを本質的に含有しない。このモ
ノクローナル抗体は力価が高く（１：50000以上
の希釈で活性である）そして特異性免疫グロブリ
ン対非特異性免疫グロブリンの比が高い（約１／
20）。Ｋ軽量の骨髄腫鎖を組込んだ生成した免疫
グロブリンは非特異性の「無意味な」ペプチド類
であり、これらはモノクローナル抗体をその特異
性を減じないで単に希釈するだけである。 実施例 １ モノクローナル抗体の生成 Ａ 免疫および体細胞の交雑 メスのBALB／cJマウス（Jackson研究所；
生まれてから６〜８週間）を、0.2mlのリン酸
塩緩衝食塩溶液中の２×107のロゼツト精製し
たヒトの単核細胞で腹膜内的に14日の間隔で免
疫した。第３回目の免疫後、脾をマウスから取
り出し、そしてステンレス鋼の鋼に組織を通す
ことによつて単一細胞の懸濁液をつくつた。 細胞の融合をKohlerおよびMilsteinの方法
に従つて実施した。１×108の脾細胞を、
RPMI 1640媒質（Gibco、Grand Island、
NY）中の35％のポリエチレングリコール
（PEG1000）と５％のジメチルスルホキシドと
からなる融合媒質の0.5ml中において、２×107
のP3×63Ag 8U1骨髄腫細胞（Br.M.Scharff、
Albert Einstein College of Medicine、
Bronx、NYにより供給）と融合した。これら
の骨髄腫細胞はIgG1 KL鎖（light chains）を
分泌する。 Ｂ ハイブリドマの選択および成長 細胞の融合後、細胞をHAT媒体（ハイポキ
サンチン、アミノプチリン、およびチミジン）
中で37℃において５％のCO2を使用して湿つた
ふん囲気中で培養した。数週間後、ハイブリド
マ類を含有する培養液から40〜100μの上澄
液を、Mendes（J.Immunol．111：860、1973）
が記載するように健康なヒトの供与者の血液か
ら調製した、Ｅロゼツト陽性（E+）集団とＥ
ロゼツト陰性（E-）集団とに分けた106の末梢
リンパ球のペレツトに加えた。これらの細胞へ
結合するマウスのハイブリドマ抗体の検出は、
ラジオイムノアツセイおよび／または間接免疫
蛍光法により決定した。培養液の上澄液で培養
した細胞を蛍光を付与した山羊の抗マウスIgG
（Ｇ／Ｍ FITC）（Meloy研究所、Springfied、
VA；Ｆ／Ｐ＝2.5）で染色し、この蛍光性抗体
被覆細胞を引き続いてシトフルオログラフ
（Cytofluorograf）FC200／4800A（Ortho
Instruments、Westwood、MA）について実
施例に記載するように分析した。E+リンパ
球（Ｔ細胞）および／またはE-リンパ球と特
異的に反応する抗体を含有するハイブリドマ培
養液を選択し、供給体（feeder）細胞の存在で
限定希釈法により２回クローンに分けた。引き
続いて、クローンを２，６，10，14−テトラペ
ンタデカン（Aldrich、Chemical Companyか
ら商品名Pristineで市販されている）で準備し
たBALB／cJマウスに一定のクローンの１×
107細胞（0.2mlの体積）を注射することによつ
て、腹膜内に移植した。次いでこれらのマウス
からの悪性腹水を使用して、実施例において
後述するように、リンパ球を特徴づけた。E+
およびE-細胞の両方の小部分と反応するこれ
らのクローンの１つによつて生成するモノクロ
ーナル抗体をOKM1と名付けた。主題の交雑
抗体OKM1は、標準の技術によりサブクラス
IgG2aであると証明された。 実施例 OKM1の反応性の特性づけ Ａ 単核細胞個体群の単離 人間の末梢血液の単核細胞を、健康な志願者
の提供者（15〜40才）から、Boyum、Scand.
J.Clin.Lab.Invest.21（Suppl.97）：77、1968の技
術に従い、フイコール−ハイパツク（Ficoll−
Hypaque）密度勾配遠心分離（Pharmacia
Fine Chemicals、Piscataway、NJ）により
単離した。 付着性細胞は、20％のプールしたヒトのAB
血清を補充したRPM1 1640（Grand Island
Biological Company、Grand Island、NY）
を含むポリスチレン皿（100×20mm組織培養皿）
（Falcon、Oxnard、CA）中で単核細胞を１時
間培養することによつて得た。非付着性部分を
除去した後、付着性細胞を、４℃で血清不含
MEM、2.5ミリモルのEDTA中で培養し、使
い捨て注射器プランジヤーのゴム先端でおだや
かにこすることによつて、分離した。 単核細胞を、ヒツジの赤血球でロゼツト
（rosette）し、Ficoll−Hypaqueで示差遠心分
離（differetial Centrifugation）することによ
つて、E+集団とE-集団に分離する。ロゼツト
は単核細胞／ヒツジの赤血球の混合物を５分間
800rpmで遠心分離し、そして４℃で１時間培
養することによつて、達成した。赤血球：リン
パ球の比は40：１であつた。E+細胞は、ヒツ
ジの赤血球を0.85％の塩化アンモニウム溶液で
溶解することによつて回収した。 無特徴細胞は、Chess、et al．、J.
Immunol.、113：1113（1974）に記載されるよ
うに、Sephadex Ｇ−200抗ヒト（Ｆ（ab1）2ク
ロマトグラフイーにより、表面のイムノグロブ
リン陰性（SIg-）集団について、同様にロゼ
ツトすることによつて製造した。多形核の白血
球は、末梢血液のFicoll Hypaque遠心分離の
間形成したペレツト中に存在する赤血球の溶解
により得た。 Ｂ 胸腺細胞の単離 正常人の胸腺を２カ月〜14才の年令の患者か
ら、心臓の矯正手術のもとに得た。胸腺の新ら
しく得た部分を媒体199（Gibco）中の５％胎児
の子牛の血清中に直ちに入れ、鉗子とはさみで
小さく切り、引き続いて金網を通してプレスす
ることによつて単細胞の懸濁液にした。細胞を
次に前節Ａで説明したように、フイコール−ハ
イパツクで層状にし、回し、洗浄した。このよ
うにして得られた胸腺細胞は＞95％生活力があ
り、そして90ロゼツト陽性であつた。 Ｃ Ｔ直系の細胞ラインおよびＴ急性リンパ芽球
白血病 Ｔ細胞ラインCEM、HSB−２、およびＢ細
胞ラインLaz156およびLaz388を、H.Lazarus
博士（Sidney Farber Cancer Institute、
Boston、MA）から提供された。白血病細胞
は、急性骨髄単球白血病（AMML；５人の患
者）および急性骨髄芽球性白血病（AML；８
人の患者）の診断を受けた患者から得た。腫瘍
集団を10％DMSOおよび20％ABヒト血清と一
緒に−196℃の蒸気相液体窒素で、表面の特性
づけまで、寒冷保存した。 実施例 シトフルオログラフ（cytofluorographic）分
析および細胞分離 すべての細胞集団を用いるモノクローナル抗体
のシトフルオログラフ分析を、シトフルオログラ
フ（Cytofluorograf）FC200／4800A（Ortho
Instruments）を用いて蛍光共役したやぎの抗マ
ウスIgG（Ｇ／Ｍ FITC）（Meloy
Laboratories）を用いて間接免疫蛍光法により実
施した。要約すると、１〜２×106細胞を0.15ml
のOKM1で１：500希釈において処理し、４℃で
30分間培養し、２回洗浄した。次いで細胞を0.15
mlの１：40希釈のＧ／Ｍ FITCで４℃において
30分間反応させ、遠心分離し、２回洗浄した。次
いで細胞をFACS−１で分析し、蛍光の強さ／細
胞をパルス高さ分析器に記録した。バツクグラウ
ンドの染色は、非生成性交雑クローン性で腹膜的
に免疫したBALB／cJマウスからの１：500腹水
の0.15ml部分を代わりに使用することによつて得
た。 抗体および補体を中介するリンパ溶解を含む実
験において、胸腺および末梢Ｔ細胞は選択的溶解
後一夜溶解し、次いでシトグラフまたはFACSで
引続いて分析した。 Ａ 細胞障害性の研究 細胞を中介するリンパ溶解（CML）につい
ての増感培養を、次の手順により行つた。５×
106のターゲツト細胞を0.2mlの 51Crクロム酸
ナトリウム（292μCi／ml）（New England
Nuclear、Boston、MA）で処理し、そして37
℃で90分間培養した。２回洗浄後、細胞を10％
のFCSを含有する媒質中で２×105／mlに希釈
した。20μの標識付けした細胞を、2μのハ
イブリドマ抗体の血清希釈溶液を含む円錐形マ
イクロプレート（microplate）のウエルの中
に分配した。４℃で１時間培養した後、20μ
の新鮮なウサギの血清（１：10希釈）をウエル
に補体源として加えた。プレートを37℃で１時
間培養した。140μの媒質を次いでウエルに
加え。プレートを400ｇで10分間回転した。
100μの上澄液を各ウエルから取り出し、ガ
ンマシンチレーシヨンカウンター（Parkard
Instrumentation Company、Downer′s
Grove、11）で計数した。比 51Crの解放を、
次式を用いて計算した： ％比 51CR解放＝Exp−SR／MR−SR×100 ここでExpは観測された３回の結果の平均で
あり、SRは補体単独で培養した細胞からの自
発的解放であり、そしてMRは洗浄剤Triton
Ｘ（１％溶液）で細胞を処理して得られた最高
の解放である。 引き続く増殖検定のための細胞のより大きい
数の溶解は、20〜50×106の単核細胞を１の
OKM1中に１：250の希釈で再懸濁し、そして
４℃で１時間培養することによつて行つた。 引き続いて、0.1mlの新鮮なウサギの血清を
加え、細胞を37℃で１時間さらに培養した。３
回洗浄後、細胞を計数し、それらの生活力をト
リパン青の排除により評価した。 Ｂ 増殖の応答の検定 可溶性抗原に対する増殖の応答を、前述のよ
うに測定した。細胞を20％のヒトAB血清で補
充したRPMI 1640中で２×106生活力のある細
胞／mlの濃度にし、マイクロ力価
（microtiter）のプレート中で破傷風トキソイ
ド（TT）（Massachusetts Department of
Public Health Biological Laboratories、
Boston、MA）、精製したタンパク質誘導体
（PPD）（National Institutes of Health、
Bethesda、MD）、またはおたふくかぜCF抗原
（Microbiological Associates、Waker sville、
MD）の存在で培養した。培養物を0.2Ciの
［Ｈ−メチル］サイミジン（ 3H TdR）
（1.9μCi／ｍＭの比活性）（Schwarz−Mann、
Orangeburg、NY）で５日間パルス（Pulse）
し、18時間後MASH 11装置
（Microbiological Associates）で収穫した。
3H−TdRの組み込みはパツカード液体シンチ
レーシヨンカウンター（Packard
Instrumentation Company）で測定した。各
実験のグループは３回ずつ検定し、そして結果
を平均の計数値／分（cpm）±平均の標準偏差
として表わす。 ハイブリドマの生成、および生ずるモノクロー
ナル抗体の生成および特性づけは、上の実施例に
おけるように実施した。大量の主題の抗体を、主
題のハイブリドマのマウスへの腹腔内注射および
悪性腹水の収穫により調製したが、ハイブリドマ
は試験管内でこの分野においてよく知られた技術
により培養し、抗体を上澄液から取り出すことが
できることは、明らかに考えられる。 ９人の正常の提供者の末梢血液の単核細胞を、
付着性の集団および非付着性の集団にポリスチレ
ン皿で分離し、各部分をFACSで間接的に免疫蛍
光について分析した。OKM1で特別に標識付け
した細胞の百分率を表１に記載する。陽性の細胞
の平均は分別しない細胞について27％、非付着性
の細胞について18％、そして付着性の細胞につい
て78％であつた。提供者＃１についての３つの集
団のFACS蛍光のプロフイルを、第１図に示す。
第１Ａ図に見られるように、分別しない単核細胞
についてのOKM1の蛍光パターンは２つのモー
ドがある。同じ集団の次元写像（dimensional
mapping）は、OKM1により鮮明に染色された
細胞も大きいことを示した。蛍光の強さが弱い小
さい細胞の集団も検出された。これらの小さい細
胞のほとんどは、非付着性部分中に見い出される
（第１Ｂ図）。これと対照的に、付着性細胞は鮮明
に染色された大きい集団（第１Ｃ図）を含有す
る。このOKM1の付着性集団との反応性は、抗
体により認識された単核細胞が単球であつたこと
を示唆し、そして被検者の抗体を検出し、他の抗
体と区別できる１つの試験を提供する。 異なる抗体のリンパ球および骨髄細胞は、この
特異性についての証拠をさらに与えた。OKM1
はＢ細胞ライン（Laz156、およびLaz388）、Ｔ細
胞ライン（CEMおよびHSB2）および３種のヒ
トの胸腺細胞の製剤と反応しない。その上に、３
のＴ−CLL、６つのＢ−CLL、３つのＴ−ALL
および６つの非Ｔ−ALL腫瘍細胞も陰性であつ
た。これと対照的に、OKM1は５つの急性骨髄
単球白血病（AMML）試料の44〜82％および８
つの急性骨髄芽球白血病（AML）の場合のうち
の２つにおける細胞の約35％と強く反応性であつ
た。２つの骨髄ラインK562（Lozzio、et al．、
Blood 45、321（1975）およびHL 60（Collins、
et al．、Native、270 347（1977）は陰性であつ
た。４人の正常の提供者から単離した多形核の白
血病は鮮明の標識付けされた。これらの結果は、
共通の源の密接に関連する細胞である顆粒球およ
び単球の考えと一致した。さらに、AML細胞を
用いて得られたデータは、OKM1が骨髄直系の
単球細胞と優先的に反応することを示すように思
われた。この反応性のパターンは、被検者の抗体
を検出し、他の抗体から区別できる追加の試験を
提供する。 分別しない、付着性および非付着性の単核細胞
について観測された染色パターンは、抗体によつ
て定められた単球の集団が大きさおよび付着性に
関して不均質であることを示唆した。表面Iaの抗
原を単球の下位集団について説明してきたが、上
の細胞部分（提供者＃１）を単クローン性抗Ia抗
体、OKI1について試験して、OKM1によつて同
定される細胞の表現型をさらに特徴づけた。非付
着性の部分および付着性の部分中のOKI1+の百分
率は、それぞれ９％および80％であつた。Iaを有
するリンパ球は非付着性集団中のOKI1を用いて
見い出される染色のあるものを説明するので、
OKM1により認められる小さい非付着性の細胞
は主としてIa-である。これと対照的に、大きい
付着性のOKM1+単球は表面Ia決定子を有する。 E+集団およびE-集団の内部のOKM1の分布は、
表中に示されている。標識付け細胞のほとんど
はE-集団中に見い出されたが、22％まで（平均
13％）の陽性細胞はE+部分中に存在した。E-細
胞およびE+細胞についてのFAC蛍光のプロフイ
ルは第２図に示されている。E-細胞は、前述の
大きい細胞と小さい細胞の存在のため、２つのモ
ードの汚染パターンを有した。E+集団について
の蛍光の強さは、より均質であつた。この部分中
に見い出される陽性細胞は、小さい大きさの、大
部分Ia-であつた（OKI1との平均の反応性、３
％）。この反応性のパターンは、被検体の抗体を
検出し、他の抗体と区別できる、ほかの試験であ
る。 Ig-、E-、非付着性細胞の集団とのOKM1反応
性の代表的FACSヒストグラムは、第３図に示さ
れている。細胞の84％はOKM1で染色され、そ
して11％はOKI1で染色された。こうして、これ
らの研究によれば、OKM1+、Ia-非付着性細胞
は、驚くべきことには無特徴細胞のほとんどを占
めることが示された。この反応性のパターンは、
被検体の抗体を検知し、他の抗体と区別できる、
なおほかの試験である。 補体を中介とする溶解の検定は、前述の集団の
いくつかについて実施した。OKM1の血清希釈
液を、分別しない、非付着性細胞および付着性細
胞について試験した。比 51Cr解放値を、表４に
示す。各集団について直接的免疫蛍光（提供者
＃５、表）により見い出されている百分率およ
び補体が中介する溶解の間にすぐれた相関関係が
存在した。 また、E+細胞およびE-細胞を研究し、得られ
たデータを表に示す。再び、比 51Cr解放の結
果は直接的免疫蛍光により見い出される標識付け
に相当した（提供者＃８、＃９および＃10）。 既知の単球に依存するＴ細胞の機能についての
OKM1および補体の予備の影響、すなわち、可
溶性抗原に対する増殖を研究した。正常の提供者
からの単核細胞を、OKM1抗体（１：250希釈）
で補体の存在で培養した。等級づけた量の同原の
付着性細胞を、可溶性抗原で開始する（trigger）
前に、この予備処理した集団に加えた。表に示
すように、OKM1および補体処理した単核細胞
は可溶性抗原に応答して増殖しないが、０％の付
着性細胞の添加はそれらの増殖の応答を回復でき
た。補体の不存在下のOKM1抗体を用いる培養
はこのＴ細胞の機能に影響を及ぼさなかつたの
で、補体の存在下に見られる効果は単核細胞の集
団内の単球の特別の死に帰することができた。 10〜20％の付着性細胞をOKM1で予備処理し
た細胞へ加えたとき、バツクグラウンドおよび抗
原で誘発した増殖の両方は処理しない集団と比べ
たとき、増大した。 また、CMLについてのOKM1の効果は、被検
体の抗体を検知し、他の抗体から区別できる１つ
の試験である。 表は、末梢Ｔ細胞およびＴ細胞部分集合の水
準と種々の患者の状態との間の関係を示す。これ
らの関係は、これらの疾患の状態の１つをもつこ
とが凝わしい個体の血液試料を分析してＴ細胞お
よびＴ細胞部分集合の水準を決定することによ
り、診断の目的で（たとえば、急性伝染性単核症
を検出するために）使用できる。また、これらの
関係は、疾患の状態の原因がＴ細胞の部分集合の
水準の上昇（たとえば、型の後天性無ガンマグ
ロブリン血症）である場合、治療の目的に使用で
きる。治療の目的で、Ｔ細胞部分集合の水準が増
大した患者に適当なモノクローナル抗体を投与す
ると、その過剰を減少または排除できる。表に
示す関係は、OKT11抗体を検出し、他の抗体と
区別できるほかの方法である。 本発明者らが製造したハイブリドマを生成する
他のモノクローナル抗体（表示したOKT1、
OKT3、OKT4およびOKT5）は、次の米国特許
出願に記載され、そして特許請求されている： 1979年３月２日付け出願第22132号；1979年４
月26日付け出願第33639号；1979年４月26日付け
出願第33669号；1979年９月18日付け出願第76642
号；および1979年10月９日付け出願第82515号。
本発明者らが製造したハイブリドマを生成するな
お他のモノクローナル抗体（表示したOKT6、
OKT8、OKT9およびOKT10）は、1979年12月
４日付けの、次の発明の名称を有する米国特許出
願に記載され、特許請求されている：Hybrid
Cell Line for Producing Monoclonal
Antibody to ａ Human Thymocyte
Antigen、Antibody、and Methods；Hybrid
Cell Line For Producing Complement−
Fixing Monoclonal Antibody to Human
Suppressor Ｔ Cells、Antibody、and
Methods；Hybrid Cell Line For Producing
Monoclonal Antibody to Human Early
Thymocyte Antigen、Antibody、and
Methods；and Hybrid Cell Line For
Producing Monoclonal Antibody to ａ
Human Prothymocyte Antigen、Antibody、
and Methods（ヒトの胸腺細胞抗原に対するモノ
クローナル抗体を生成する交雑細胞ライン、抗
体、および方法；ヒトのサプレツサーＴ細胞に対
する補体固定モノクローナル抗体を生成する交雑
細胞ライン、抗体、および方法；ヒトの初期の胸
腺細胞抗原に対するモノクローナル抗体を生成す
る交雑細胞ライン、抗原、および方法；およびヒ
トの前胸腺細胞（Prothymocyte）抗原に対する
モノクローナル抗体を製造する交雑細胞ライン、
抗体、および方法）本発明者らによつて製造され
たほかのモノクローナル抗体生成ハイブリドマ
（OKT11と表示）は、本願と同日付けの、次の発
明の名称を有する米国特許に記載され、特許請求
されている；Hybrid Cell Line for Producing
Antibody for ａ Human Ｔ Cell、Antigen、
Antibody、and Methods（ヒトのＴ細胞抗原に対
する抗体を生成する交雑細胞ライン、抗体、およ
び方法）。これらの出願を引用によつてここに加
える。 本発明によれば、正常なヒトの単球に見い出さ
れる抗原に対する抗体を生成できるハイブリド
マ、このハイブリドマを生成する方法、正常なヒ
トの単球に見い出される抗原に対するモノクロー
ナル抗体、この抗体を生成する方法、およびこの
抗体を用いる病気の処置または診断の方法あるい
は単球の部分集合の同定法が提供される。 本明細書において、“超IgE（Hyper IgE）”と
は、この抗体の量が通常の値よりも多いことを意
味する。これは一般にアレルギ性体質に表われ
る。 また“急性組織移植対宿主反応（Acute graft
versus host reaction）”とは、例えば生体移植
の場合における宿主による免疫学的な、全体或い
は部分的な拒絶反応のことである。 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 【表】 ヒトの胸腺細胞の抗原に対する単一のモノクロ
ーナル性抗体を生成する単一のハイブリドマだけ
を説明してきたが、本発明はここに説明する特性
を示すすべてのモノクローナル抗体を包含すると
考えられる。主題の抗体OKM1はねずみのIgGの
４つのサブクラスの１つであるサブクラスIgG2a
に属することが決定された。免疫グロブリンＧの
これらのサブクラスは互いにいわゆる「固定され
た」領域において異なるが、特定の抗原に対する
抗体はいわゆる「可変の」領域をもち、この領域
は免疫グロブリンＧのどのサブクラスがそれに属
するかに無関係に機能的に同一である。すなわ
ち、ここに説明した特性を示す抗体はサブクラス
IgG1、IgG2a、IgG2b、またはIgG3、あるいはク
ラスIgM、IgA、あるいは他の既知のクラスIgで
あることができる。これらのクラスまたはサブク
ラスの間の差異は抗体の反応パターンの選択性に
影響を及ぼさないが、抗体と他の物質、たとえ
ば、補体または抗マウス抗体とのほかの反応に影
響を及ぼすことがあるであろう。主題の抗体は
IgG2aに特定したが、ここに例示した反応性のパ
ターンを有する抗体類はそれらが属する免疫グロ
ブリンのクラスまたはサブクラスに無関係に本発
明の範囲内に包含されると考えられる。 さらに、本発明の範囲内に、ここに例示したハ
イブリドマの技術を用いて前述の単クローン性抗
体を生成する方法が包含される。ハイブリドマの
ただ１つの例をここに記載したが、当業者はここ
に提供した免疫法、融合法および選択法に従い、
ここに説明した反応性の特性を有する抗体類を生
成しうる他のハイブリドマ類を得ることができる
と考えられる。マウスの既知の種からの既知の骨
髄種細胞系統から生成した個々のハイブリドマは
このハイブリドマにより生成された抗体を参照す
る以外それ以上同定できないので、前述の反応性
の特性を有する抗体を生成するすべてのハイブリ
ドマ類は本発明の範囲内に包含され、これらのハ
イブリドマを用いるこの抗体をつくる方法も同様
に包含されると、考えられる。 本発明のほかの面は、モノクローナル抗体
OKM1またはここに明らかにした反応性のパタ
ーンを示す他のモノクローナル抗体を用いて病気
を処理または診断する方法である。主題の抗体を
使用して、単球の分化の検出および研究すること
ができる。その上、主題の抗体を使用して、表
に示す病気の状態を診断することができる。これ
らの技術は、OKM1抗体を単独で、または他の
抗体（たとえば、OKT3〜OKT11）と組み合わ
せて使用することにより、用いることができる。
Ｔ細胞およびＴ細胞部分集団および／または単球
部分集合に対する抗体のパネルとの反応性のパタ
ーンは、先行技術の診断法を用いて可能であるよ
りも、ある種の病気状態の一層精確な検知を許す
であろう。たとえば、AMMLおよび（より少な
い程度に）AMLを、個体からの白血病細胞を
OKM抗体と反応させることにより、検知でき
る。 OKM1+細胞の過剰を特徴とする病気の状態
（たとえば、AMMLのような悪性疾患）の処置
は、治療学的に有効な量のOKM1抗体を処置の
必要なとき個々の患者に投与することによつて、
行なうことができる。OKTM+抗原と選択的に反
応させることにより、有効量のOKM1抗体は過
剰量のOKM1+細胞を減少し、こうしてその過剰
の効果を軽減する。 有効量のOKM1抗体とそれぞれ診断学的また
は治療学的に許容できる担体とからなる診断学的
および治療学的組成物も、本発明の範囲内に包含
される。
第１図は、分別しない非付着性および付着性の
提供者＃１からの正常のヒトの末梢血液の単核細
胞を１：500の希釈のOKM1およびＧ／Ｍ
FITCと反応させた後、FACSで得られた蛍光パ
ターンを示す。図Ａ，ＢおよびＣはそれぞれ分別
しない単核細胞、非付着性単核細胞および付着性
単核細胞を用いた場合を示している。バツクグラ
ウンドの蛍光の染色は、非生成性クローン系で注
入したマウスからの腹水の流体の１：500の希釈
で各集団を培養することによつて、得た。第２図
は、正常のヒトのE+およびE-の末梢血液の単核
細胞をOKM1およびＧ／Ｍ FITCと反応させた
後、FACSで得られた蛍光を示す。第２図中、左
側の図はE-細胞を用いた場合を、右側の図はE+
細胞を用いた場合を示している。第３図は、正常
のヒトのIg-、E-、非付着性の無特徴細胞を
OKM1およびＧ／Ｍ FITCと反応させた後、
FACSで得られた蛍光パターンを示す。第４図
は、OKM1および補体のヒトの単核細胞につい
ての溶解能力を示す。
提供者＃１からの正常のヒトの末梢血液の単核細
胞を１：500の希釈のOKM1およびＧ／Ｍ
FITCと反応させた後、FACSで得られた蛍光パ
ターンを示す。図Ａ，ＢおよびＣはそれぞれ分別
しない単核細胞、非付着性単核細胞および付着性
単核細胞を用いた場合を示している。バツクグラ
ウンドの蛍光の染色は、非生成性クローン系で注
入したマウスからの腹水の流体の１：500の希釈
で各集団を培養することによつて、得た。第２図
は、正常のヒトのE+およびE-の末梢血液の単核
細胞をOKM1およびＧ／Ｍ FITCと反応させた
後、FACSで得られた蛍光を示す。第２図中、左
側の図はE-細胞を用いた場合を、右側の図はE+
細胞を用いた場合を示している。第３図は、正常
のヒトのIg-、E-、非付着性の無特徴細胞を
OKM1およびＧ／Ｍ FITCと反応させた後、
FACSで得られた蛍光パターンを示す。第４図
は、OKM1および補体のヒトの単核細胞につい
ての溶解能力を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒトの単核細胞で前もつて免疫されたマウス
からの脾細胞およびマウスの骨髄腫ラインからの
細胞の融合により生成され、そしてその抗体が、 (a) 正常のヒトの単球および顆粒球に見い出され
る抗原と反応するが、正常のヒトの末梢Ｔ細
胞、Ｂ細胞、無特徴細胞、胸腺細胞、リンパ芽
球様細胞ライン、またはＴ細胞直系もしくはＢ
細胞直系の腫瘍細胞と反応せず、 (b) AMMLをもつ患者からの白血病細胞と反応
し、 (c) 可溶性抗原に対する増殖的応答に必要な単球
集団を定める IgGモノクローナル抗体を生成するハイブリド
マ。 ２ ATCC CRL8026の標示特性を有する特許請
求の範囲第１項記載のハイブリドマ。
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|---|---|---|---|
| US06/110,509 US4364936A (en) | 1980-01-08 | 1980-01-08 | Monoclonal antibody to a human monocyte antigen and methods of preparing same |
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|---|---|
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| JPH0159872B2 true JPH0159872B2 (ja) | 1989-12-20 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19081A Granted JPS56103116A (en) | 1980-01-08 | 1981-01-06 | Hybrid cell line* antibody and method for manufacturing monoclonal antibody to human monocyte antigen |
| JP63118394A Granted JPS6413990A (en) | 1980-01-08 | 1988-05-17 | Hybridoma |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19081A Granted JPS56103116A (en) | 1980-01-08 | 1981-01-06 | Hybrid cell line* antibody and method for manufacturing monoclonal antibody to human monocyte antigen |
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| NZ (1) | NZ195944A (ja) |
| PT (1) | PT72319B (ja) |
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| YU (1) | YU44321B (ja) |
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