CN1130406A - 可识别细胞表面抗原的单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种新的单克隆抗体。本发明涉及抑制造血干细胞生长固着，并识别具有支持造血干细胞生长固着潜能的脾脏基质细胞的表面抗原的单克隆抗体，以及产生该单克隆抗体的杂交瘤。因为本发明的单克隆抗体具有抑制造血干细胞生长固着的特性，故可用作具有增强临床治疗白血病的抗肿瘤剂的效力的药物。

Description

可识别细胞表面抗原的单克隆抗体

本发明涉及可抑制造血干细胞的生长固着的、并可识别具有造血干细胞生长固着支持潜能的脾脏基质细胞的新型单克隆抗体，本发明进一步涉及产生该单克隆抗体的杂交瘤。

因为本发明的单克隆抗体可识别作为抗原的对于骨髓细胞在造血组织中生长固着起重要作用的物质，并且具有抑制造血干细胞生长固着的特性，所以其可用作具有从骨髓内放出白血病细胞、提高对由抗癌药引起的白血病的治疗效果、增强抗癌药的效力的作用的药物，是非常有用的物质。

已知粒细胞集落刺激因子，例如基因重组粒细胞集落刺激因子(rG—CSF)基本上作为一种液性因子刺激粒细胞的分化和增殖，并已在小鼠体内实验中报导，给予rG—CSF可增强骨髓造血，另外可在脾脏中引起显著的髓外造血以增殖造血干细胞和脾脏中的所有造血前体细胞。并且认为脾脏中的髓外造血机制是，由于rG—CSF的刺激作用使脾脏造血微环境改变，致使造血能力增强而发生造血过程。

因此，本发明人注意到在给予rG—CSF后观察脾脏基质细胞，以便了解脾脏中造血能力的增强情况，并从给予了rG—CSF的小鼠的脾脏建立造血基质细胞系(CF—1细胞)，以试图分析基质细胞与rG—CSF对造血能力的增强作用，并使用造血基质细胞检查对造血的支持能力，结果已认识到了其体外集落刺激活性及造血干细胞支持能力(Blood，80，1914(1992))。

由于在骨髓移植时同时移植CF—1细胞和骨髓细胞而了解到造血干细胞的体内支持能力，所以认为上述造血基质细胞系(CF—1细胞)具有表达一种细胞粘附因子的功能，该因子可使造血干细胞生长固着在造血组织上。

虽然已确定某些具有造血干细胞生长固着支持潜能的脾基质细胞为一种细胞系(CF—1细胞)并已检查了其细胞学特性，但迄今尚未制得识别其表面抗原的特异性抗体，也没有完全了解特性。

因此，本发明人基于上述有关脾基质细胞的知识和研究结果，努力进行了深入研究以图开发能够识别具有造血干细胞生长固着支持潜能之脾脏基质细胞的特异性抗体，并建立了具有造血干细胞生长固着支持能力的脾脏基质细胞的细胞系，同时使用该脾脏基质细胞系作为免疫抗原制备了单克隆抗体，结果得到了一种新的单克隆抗体。

本发明人还发现，所得到的单克隆抗体可识别具有造血干细胞生长固着支持潜能的脾脏基质细胞的表面抗原，并具有抑制造血干细胞生长固着的特性，从而完成了本发明。

本发明的目的是提供识别具有造血干细胞生长固着支持能力之脾脏基质细胞的表面抗原，并具有抑制造血干细胞生长固着之特性的新的单克隆抗体，本发明的另一个目的是提供生产该单克隆抗体的杂交瘤。

本发明的单克隆抗体涉及相对于具有造血干细胞生长固着之支持能力的脾脏基质细胞表面抗原的新的单克隆抗体，并且其为识别与增强脾脏造血能力有关的脾基质细胞的抗体，并且它极适用作具有抑制造血干细胞生长固着功能的物质。有时，本文所说的造血干细胞的生长固着是指由造血组织的基质细胞引起的造血干细胞的粘附，以及作为CFU—S集落的细胞分化和增殖。

本发明的单克隆抗体基本上可按下述方法制得。

例如，使用得自投用了rG—CSF的动物的脾脏基质细胞，如由本发明人建立的CF—1细胞(脾脏基质细胞)系作为抗原，按照常规免疫方法免疫动物，按照常规细胞融合方法对免疫细胞进行细胞融合，并按照常规克隆方法克隆融合的细胞。

作为可举例的制备本发明单克隆抗体的方法，其包括使用本发明人建立的上述CF—1细胞(作为培养细胞系)作为抗原(Blood，Vol.80，1914(1992))，使以抗原免疫的哺乳动物的浆细胞(免疫细胞)与哺乳动物如小鼠的骨髓瘤细胞融合、克隆所得到的融合细胞(骨髓瘤)、从中选择产生能识别上述细胞系之根据本发明的抗体的克隆、并培养之以回收目的抗体。但该方法只是一个例子，并且在这种情况下，例如不只可以使用上述CF—1细胞，而且还可适当地使用按得到CF—1细胞的方法制得的造血组织的其他基质细胞，或衍生于人脾脏基质细胞的造血组织的基质细胞，以按如上述CF—1细胞情况下的同样方式产生目的抗体。

制备这种单克隆抗体的方法，对用上述抗原免疫的哺乳动物没有特殊限制；较好选择那些在细胞融合中对将要使用的骨髓瘤细胞有适应性的动物，并且优选使用小鼠、大鼠或仓鼠。

按照常规方法进行免疫，例如经腹腔内注射用脾脏基质细胞如上述CF—1细胞免疫哺乳动物。具体地说，最好在适当量的PBS或等渗氯化钠溶液中稀释或悬浮之，每个月给予动物注射几次。较好使用在最后一次给予上述细胞后分离的脾细胞作为免疫细胞。

可以使用不同的已知细胞作为与上述免疫细胞相融合的另一亲代细胞，即哺乳动物骨髓瘤细胞，这些已知细胞包括P3(P3×63Ag8.653)(J.Immunol.，123，1548(1978))、P3—U1(CurrentTopics in Micro—biology and Immunology.，81.1—7(1978))、NS—1(Eur.J.Immunol.，6，511—519(1976))、MPC—11(Cell，8，405—415(1976))、Sp2/o—Ag14(Nature，276，269—270(1978))、FO(J.I mmunol.Meth.，35，1—21(1980))、S194(J.Exp，Med.，148，313—323，(1978))和R210(Nature，277，131—133(1979))等。

可基本上按照常规方法，例如Milstein等人(MethodsEnzymol.，73，3—46(1981))的方法完成上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合。

更具体地说，可以在融合加速剂存在下，在常规营养培养基中完成上述细胞融合。可用聚乙二醇(PEG)和仙台病毒(HVJ)作为融合加速剂，并且可在需要时加入适当的佐剂如二甲基亚砜，以增强融合效力。就免疫细胞与骨髓瘤细胞的比例来说，前者优选是后者使用量的1—10倍。用于上述细胞融合的培养基的例子包括适于上述骨髓瘤细胞增殖的RPMI—1640培养基和MEM培养基，以及常规用于培养这种类型细胞的其他培养基；此外，可以在培养基中添加血清如胎牛血清(FBS)。

可在上述培养基中将预定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞混合，向培养基中加入预加热到大约37℃的PEG溶液，例如平均分子量为1,000—6,000的，浓度约30—60％(W/V)的PEG的溶液，并混合之以进行细胞融合。然后，经反复重复加入适当培养基，离心反应混合物及上清等操作，以得到所形成的目的杂交瘤。

经在常规选择培养基，例如HAT培养基(添加次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基)中培养来选择所说的杂交瘤。在HAT培养基中持续培养足够时间，以使目的杂交瘤以外的其他细胞(非融合细胞)死亡，一般培养几天到几周。然后，以常规的有限稀释法筛选产生目的抗体的杂交瘤并使之单克隆化。

可在常规培养基中继代培养产生本发明单克隆抗体的已建立杂交瘤细胞系并在液氮中长期储存。

可以使用常规培养杂交瘤并从上清中得到单克隆抗体的方法从杂交瘤中收集本发明的单克隆抗体，或者可以将杂交瘤注入适当的哺乳动物体内以使之增殖，然后从动物腹水中得到单克隆抗体。前者适于制得高纯度的抗体，后者适于大量产生抗体。

另外，可以使用常规纯化手段如盐析枝术、凝胶过滤及亲和层析法，将按上述方法制得的单克隆抗体纯化到高纯度。

因为本发明的单克隆抗体具有抑制造血干细胞生长固着的潜能，所以可在白血病的临床治疗中用作具有增强抗肿瘤剂效力之功能的药物；例如，利用这一功能，从骨髓释放急性髓样白血病细胞以改善白血病之抗肿瘤剂的效力。

在利用本发明之单克隆抗体的白血病药物中，显然使用该抗体作为改善白血病抗肿瘤剂之效力的药物的特殊体系，对其改变和应用只要是按照本领域技术人员显而易见的常规方法实践的，则均应包括在本发明范围内。

图1显示以免疫荧光法进行的分析(不存在抗体的对照、CF—1细胞)。

图2显示以免疫荧光法分析GSPST—1抗体对CF—1细胞的结合性质。

图3显示以免疫荧光法分析HMS—1抗体对CF—1细胞的结合性质。

图4显示按照免疫荧光法进行的分析(不存在抗体的对照，骨髓细胞)。

图5显示按照免疫荧光法分析GBPST—1抗体对骨髓细胞的结合性质。

图6显示按照免疫荧光法分析HMS—1抗体对骨髓细胞的结合性质。

图7显示本发明的单克隆抗体(GSPST—1)抑制骨髓移植的试验。

图8显示本发明的单克隆抗体(HMS—1)抑制骨髓移植的试验。

下面，将参照参考实验例和实施例更详细地描述本发明，但本发明并不受限于这些实施例。

参考实施例

脾脏基质细胞系的建立和其特性

(1)脾脏基质细胞系的建立

从已投用rG—CSF(100μg/kg)5天的C57BL/6J小鼠之脾细胞的初级培养物建立具有造血干细胞支持能力的脾脏基质细胞系。

即，在无菌条件下摘出给予rG—CSF后的脾脏，在25cm²塑料瓶(Corning Co.)内，并在添加10％热灭活胎牛血清(FBS)(Sanko Junyaku，Tokyo)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Isocove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM)(Boehringer—Mannheim Co.)中，在37℃和5％CO₂条件下，于培养箱中培养6周，每周换两次新鲜生长培养基。

在汇合培养物中，使用加在无Ca、Mg的PBS中的0.05％胰蛋白酶加入0.02％EDTA(Sigma Chemical Co.)，从培养瓶中收获粘附细胞群体(基质细胞)，并移入新的培养瓶中。这些继代培养每周重复1或2次。早期传代中(第1到第10代)，细胞的分裂比例为1/4到1/8，继后这一比例为1/16至1/32。大约第10代后基质细胞变为均一的和纤维母细胞样的。

在第20代时按上述方法收获这些基质细胞并使用有限稀释法使细胞克隆化；重复进行两次细胞克隆以建立基质细胞系(CF—1细胞系)。

继后，将这些细胞维持在含添加10％热灭活FBS之5mlIMDM的25cm²培养瓶(Corning Co.)中，并以1/32的分裂比例每5天继代培养1次。可从小鼠以外的其他动物建立脾脏基质细胞系；例如，可使用上述同样方法，经用SV—40腺病毒载体转化细胞(J.Cell.physiol.，148，245(1991))而建立人脾脏基质细胞系。

(2)CF—1细胞的特性

使用标准细胞化学技术检查按上述方法建立的作为细胞系的CF—1细胞的碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、β一半乳糖苷酶、2—萘酚基乙酸酯酶。还使用下列单克隆和多克隆抗体，以免疫酶学组织化学法检查CF—1细胞的特性：macI(Sero Tec)；因子VIII相关抗原(Dauopatts)；和I型胶原蛋白、III型胶原蛋白及粘连蛋白(Chemicon International Inc.)。用乳胶球摄入法(颗粒直径1.09μm；Sigma)试验胞吞作用，并在汇合培养后使细胞在25cm²培养瓶中暴露于10^-6mol/L磷酸氢化可的松(Sigma)4周，以试验CF—1细胞转变成脂肪细胞的能力。

结果发现，CF—1细胞为碱性磷酸酶、因子VIII相关抗原、mac I和吞噬作用阴性，而它们对I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和粘连蛋白则为阳性。在加10^-6mol/L氢化可的松汇合培养的4周期间，CF—1细胞没有转变为脂肪细胞，而只含有微量脂肪。从这些数据看，CF—1细胞没有前脂肪细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞的物征，因此可进一步表明它们衍生于与之不同的基质细胞。

(3)CF—1细胞对造血干细胞的维持

为了检验是否造血干细胞受到CF—1细胞的维持，按照Till和McCulloch的方法进行CFU—S试验(脾脏集落形成细胞检测法)。用900cGy(MBR—1520R；Hitachi，Tokyo)照射10只小鼠/组，然后静脉内注射骨髓单核细胞(BM细胞)(1.0×10⁵/只，5.0×10⁴/只，或2.5×10⁴/只)和CF—1细胞(1.0×10⁵/只)，并在第12天计数脾脏中的集落数作为CFU—S集落(脾脏集落)。

结果可见，当将骨髓单核细胞(BM细胞)和CF—1细胞移植到经过照射的小鼠体内时，各BM细胞组的脾集露数目比没有移植CF—1细胞的小鼠显著增加(1.4—1.8倍间)并且在移植后第12天，移植BM细胞和CF—1细胞之小鼠的存活比率比只移植BM细胞小鼠高，显示低的死亡率，因此进一步表明CF—1细胞对造血干细胞的维持作用。

下列实施例详细举例说明本发明。

实施例

单克隆抗体的制备

(1)抗原和免疫

使用按上述参考实施例所述方法制得的CF—1细胞作抗原进行免疫。使用添加10％胎牛血清(FBS；Sanko Junyaku)的Isocove氏改进的Dulbecco氏培养基(IMDM)(Boehringer—Mannheim Co.)，在5％CO₂和37℃条件下继代培养细胞。

用1mM EDTA/PBS处理细胞，并用吸移法从培养瓶中除去之。将细胞以大约1×10⁷个/ml的细胞数悬浮于1mM EDTA/PBS中，并给予Wistar Imamich大鼠(7周令，雌性，动物繁殖研究所)。初次免疫给动物腹腔注射1ml浓度约10⁷个/ml的细胞，一个月后再次追加注射1ml浓度约1×10⁷个/ml的细胞。另外，以一个月间隔给予追加注射几次浓度约1×10⁷个/ml的1ml细胞悬浮液，并在被免疫大鼠抗体和CF—1细胞间的反应性被确认后，用1ml浓度为1×10⁸个/ml细胞悬浮作最后免疫。最终免疫后3天杀死大鼠并摘取其脾脏。

(2)细胞融合

将从大鼠体内摘除的脾脏切碎，离心分离的脾细胞，悬浮在IMDM培养基(Boehringer—Mannheim Co.)中并充分洗净。另一方面，以同样方法在含有10％胎牛血清(FBS；Sanlco Junyaku)的IMDM(Boehringer—Mannheim Co.)中培养小鼠骨髓瘤细胞系S_p2/0—Ag14(Nature，276，269—270(1978))得到骨髓瘤细胞，并在上述IMDM培养基中洗净，然后将其1×10⁸个细胞和2×10⁸个上述脾细胞放入离心管中并混合，以在聚乙二醇4000(NakaraiKagaku)作用下按常规方法(Clin.Exp.Immunol.，42，458—462(1980))进行细胞融合。

然后，将所得到的融合细胞分散于加有含20％FBS之IMDM培养基的96孔平板中，并在37℃和5％CO₂条件下在保温箱中培养之。第二天后逐步将其置换成HAT选择培养基，并继续进行培养。

开始培养后，每周两次将上清置换成新的HAT培养基以继续培养并维持细胞增殖。

然后使用有限稀释法，按常规程序克隆所得到的融合的细胞。即利用上述融合细胞之上清中的抗体，用有限稀释法检测其与抗原的结合性质，而按常规方法克隆只表现有强的抗原结合性质的克隆。

(3)筛选

使用流式细胞计数仪，以间接荧光抗体法完成对融合细胞(杂交瘤)的筛选。

使用CF—1细胞作为靶细胞以筛选产生目的抗体的克隆。即，离心并回收悬浮在反应缓冲液(含有2％FBS和0.02％NaN₃的PBS)细胞，然后将细胞沉淀物悬浮在100μl杂交瘤培养上清(约1×10⁶个/100μl)中并在4℃下反应1小时。用上述缓冲液清洗1次后，向细胞中加入FITC标记的羊抗大鼠IgG(FC)抗体(Chemicon)并保温1小时。将细胞悬液洗1次后，用流式细胞计数器(FACScan，Becton Dickinson)分析之。

(4)抗体的纯化

按常规方法培养如上述步骤(3)中筛选的融合细胞，按常规方法分离上清液中产生的抗体并纯化之。

从小孔中回收对抗原有高抗体滴度的杂交瘤，分散于组织培养塑料皿(Corning Co.)中，在5％CO₂和37℃条件下培养之，增殖，并按常规方法纯化以得到单克隆抗体GSPST—1和HMS—1。

在这种情况下，就HMS—1抗体和GSPST—1抗体来说，将所得到的细胞注射到BALB/cAJcl—nu棵鼠(8周令，雄性，NipponKurea)的腹腔中，10—14天后回收其腹水，用33％硫酸铵盐析和对PBS透析。

有时，上述实施例中描述其中使用CF—1细胞作为免疫的抗原的情况；但在使基包括衍生于人脾脏基质细胞之造血组织的基质细胞系在内其他脾脏基质细胞的情况下，也有可能以同样方式建立单克隆抗体，并且本发明不只限于上述单克隆抗体，而是包括以同样方式制得的具有同样特征的所有单克隆抗体，及所有产生该单克隆抗体的杂交瘤。

产生本发明的单克隆抗体HMS—1的杂交瘤是由作为亲代细胞的Wistar Imamich大鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0—Ag14制得的新的融合细胞，并已按照用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约的规定，于1993年8月9日保藏于作为国际保藏机构的National Institute of Bioscience and HumanTechnology，Agency of Industrial Science and Technology(地址：日本国茨城县コくば市东1段1—3号(邮编305))，该细胞株名称为HMS—1(大鼠小鼠杂交瘤)，登记号为FERMBP—4383。

(5)抗体的性质

(i)抗体的反应性

(对CF—1细胞的反应性)

按照免疫荧光分析法检查所得到的单克隆抗体GPST—1和HMS—1对CF—1细胞的反应性，结果如图1至3所示。其中图1显示对没有抗体的对照组的分析结果；图2显示GSPST—1对CF—1细胞的结合性质的分析结果；图3显示HMS—1对CF—1细胞的结合性质的分析结果。在附图中，垂直轴显示细胞的相对数目，横轴显示荧光强度。

如从图1至图3中看出的，单克隆抗体GSPST—1和HMS—1具有与CF—1细胞结合的性质，并识别CF—1细胞的表面抗原。

(对骨髓细胞的反应性)

另外，图4到6中显示用流式细胞计数器(FACScan，Becton Dickinson)分析得到的GSPST—1和HMT—1对正常骨髓细胞的反应性。其中，图4显示对没有抗体的对照的分析结果；图5显示GSPST—1对骨髓细胞的结合性质的分析结果；图6显示HMS—1对骨髓细胞的结合性质的分析结果。附图中，垂直轴显示细胞的相对数目，横轴显示荧光强度。

如图4至6中所示，GSPST—1完全没有与骨髓细胞结合的性质，而HMS—1则有与某些骨髓细胞结合的性质。

(ii)抗体的分型

继后，对所得单克隆抗体的IgG亚类的分型(使用大鼠MonoAb—ID—Sp试剂盒(Zymed))结果显示，GSPST—1是IgG2a，HMS—1是IgG2b。

(iii)骨髓移植抑制作用

另外，使用这些抗体进行对骨髓移植之抑制作用的实验以检查其特性。结果如图7和8中所示。从图7和图8可以看出，虽然HMS—1具有抑制骨髓移植的作用，但GSPST—1中未见有这种作用。上述结果是在通过尾静脉给经过致死剂量照射(900cGy)的C57BL/6J小鼠注射1.0×10⁵个/只骨髓细胞和单克隆抗体，并观察脾脏集落的形成而得到的。另外，图8中“未处理的”显示没给予骨髓细胞时的情况。因为根据上述实验结果认识到本发明的单克隆抗体HMS—1对骨髓移植的抑制作用，故可以看出该抗体还抑制造血干细胞的生长固着和CFU—S集落的形成。

再者，对于本领域技术人员显而易见的是，单克隆抗体抑制骨髓移植的作用相当于抑制造血干细胞生长固着和形成CFU—S集落的活性。例如，据报导使用已知的肥大细胞作为抗原而产生的单克隆抗体(ACK—2抗体，为C—kit抗体之一)，具有与本发明的单克隆抗体相似的抑制小鼠骨髓移植的功能(Blood，78，1708(1991))；在该报导中，根据骨髓移植抑制实验的结果，得出了抗体抑制造血干细胞生长固着和CFU—S集落形成的结论。

上述已知抗体ACK—2是使用肥大细胞作为抗原制备的，并且肥大细胞是从造血干细胞分化并增殖的造血细胞。另一方面，用于本发明中的造血组织的基质细胞不是造血细胞，而是支持造血细胞分化和增殖的细胞，因此两者是完全不同的。

另外，当给裸鼠腹腔内注射产生HMS—1的骨髓瘤时，表明小鼠并没有因腹水储存而死亡。因此，认为HMS—1抑制骨髓移植的作用并不是由于所谓细胞程序性死亡〔(apoptosis)，也称为细胞自身破坏，为一种在核小体单位处消化核染色质DNA(所谓梯形成)而导改细胞死亡的现象〕，而是一种由于单克隆抗体上负责造血干细胞在造血组织上生长固着的分子相结合所引起的现象。从而可以看出，由HMS—1识别的抗原是一种对于造血干细胞在造血组织上生长固着有重要作用的物质。

如从上述实难所确认的，本发明的单克隆抗体HMS—1识别具有造血干细胞生长固着支持潜能的，并具有抑制造血干细胞生长固着特性的脾脏基质细胞的表面抗原。

因此，HMS—1具有抑制骨髓细胞在造血组织上生长固着的作用；已经报导，根据造血细胞粘附分子的VLA4和VLA5的表达降低而证明白血病细胞是从骨髓释放的〔VLA moleculeexpression may be involved in the release of acute myeloidleukaemic cells from the bone marrow，leuk.Res.，16(5)，469—474(1992)〕，并且认为抗VLA4和VLA5的单克隆抗体通过从骨髓释放白血病细胞而改善白血病的治疗效果。因而可在治疗白血病前相似地使用上述HMS—1以获得同样的效果。

以上，已参照实施例具体描述了本发明的单克隆抗体；本发明的单克隆抗体包括上文有代表性的实施例中举例的这些抗体，但不只限于这些，还包括以同样方法制备的，具有同样特性和功能的所有单克隆抗体。

工业可利用性

因为本发明的单克隆抗体识别一种作为抗原的对于骨髓细胞在造血组织上生长固着很重要的物质，并且具有抑制造血干细胞生长固着的特性，所以可用作具有提高抗肿瘤剂作用之功能的药物，例如可基于其上述特性从骨髓中释放白血病细胞而用作具有改善白血病治疗效果、增强抗肿瘤剂之效力的药物。

Claims (2)

1.一种单克隆抗体，可抑制造血干细胞生长固着并可识别具有支持造血干细胞生长固着支持潜能的脾脏基质细胞的表面抗原。

2.产生如权利要求1记载的单克隆抗体的杂交瘤。

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