JP2741483B2 - アポトーシスを誘起するモノクローナル抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、骨髄系細胞にアポトー
シスを誘起する特性を有し、骨髄性白血病の治療薬等と
して有用な新規モノクローナル抗体ならびにその断片、
および当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来、顆粒球コロニー刺激因子、例え
ば、遺伝子組換え型顆粒球コロニー刺激因子（ｒＧ−Ｃ
ＳＦ）は、主に顆粒球系細胞の分化、増殖を促進させる
液性因子として知られているものであるが、マウスのｉ
ｎ ｖｉｖｏの実験では、このｒＧ−ＣＳＦを投与する
ことにより、骨髄の造血亢進のみならず、脾臓でも著し
い髄外造血が起こり造血幹細胞を始めとしてすべての造
血前駆細胞が脾臓で増殖することが報告されている。そ
して、この脾臓での髄外造血のメカニズムとして、ｒＧ
−ＣＳＦの刺激により脾臓の造血微小環境が変化し、造
血支持能力が亢進したことにより造血が生じたものであ
ると考えられた。

【０００３】そこで、本発明者は、この脾臓での造血機
能を解明するために、ｒＧ−ＣＳＦ連投後の脾臓の間質
細胞に着目し、間質細胞を介したｒＧ−ＣＳＦによる造
血機能亢進の解析を試みるべく、ｒＧ−ＣＳＦを連投し
たマウス脾臓より造血間質細胞株（ＣＦ−１細胞）を樹
立し、かかる造血間質細胞を用いてその造血支持能を検
討したところ、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのコロニー刺激活性
およびｉｎ ｖｉｖｏでの造血幹細胞支持能が認められ
た〔Ｂｌｏｏｄ，８０，１９１４（１９９２）〕。

【０００４】しかしながら、この脾臓間質細胞について
は、その一部が細胞株（ＣＦ−１細胞）として樹立され
て、その細胞学的特性の検討等はなされているものの、
これまでに、その細胞表面抗原を認識する特定の抗体を
作製することは全く行われておらず、ましてやその特性
等については未だ全く知られていない状況にあった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者は、
脾臓間質細胞に関する前記したような知見とこれまでの
研究成果を踏まえ、この脾臓間質細胞を識別し得る特定
の抗体を開発することを目標として鋭意研究を積み重ね
る中で、当該脾臓間質細胞株を感作抗原として使用して
モノクローナル抗体を作製したところ、これまでに報告
された例のない新規モノクローナル抗体が得られた。

【０００６】そして、この取得されたモノクローナル抗
体の特性について検討したところ、当該モノクローナル
抗体は、驚くべきことに骨髄系細胞にアポトーシスを誘
起する特性を有するものであることを見い出し、本発明
を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、骨髄系細胞にアポト
ーシスを誘起させる特性を有し、骨髄性白血病の治療薬
等として有用な新規モノクローナル抗体およびその断片
を提供することを目的とするものであり、更には、当該
モノクローナル抗体を産生させるハイブリドーマを提供
することを目的とするものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明のモノクローナル
抗体は、骨髄系細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌ）のア
ポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）〔核クロマチンＤＮ
Ａがヌクレオソーム単位で切断（いわゆるラダー・フォ
ーメーション）され、その結果、細胞を死に至らしめる
現象で、細胞自滅とも云う〕を引き起こす抗原等を特異
的に認識する抗体として、これらを識別、同定する機能
を有するものとして、あるいは骨髄系細胞にアポトーシ
スを誘起させる機能を有するものとして極めて有用なも
のである。尚、骨髄系細胞には、リンパ球以外の細胞、
例えば、好中球、巨核球、骨髄芽球、骨髄球、肥満細
胞、マクロファージ、単球、赤芽球が含まれるが、本発
明で云う骨髄系細胞もこれと同義のものを意味する。従
来、一般に、骨髄系細胞にアポトーシスを誘起する特性
を有するモノクローナル抗体は全く知られておらず、従
って、本発明のモノクローナル抗体は、骨髄系細胞にア
ポトーシスを誘起する特性を有するすべてのモノクロー
ナル抗体を包括するものとして定義される。

【０００９】かかる本発明のモノクローナル抗体は、基
本的には、例えば、次のようにして作製することができ
る。すなわち、本発明のモノクローナル抗体は、例え
ば、ｒＧ−ＣＳＦ投与動物の脾臓間質細胞を感作抗原と
して使用して、基本的には、これを通常の免疫法を応用
して免疫し、通常の細胞融合法を応用して細胞融合さ
せ、通常のクローン化法を応用してクローン化すること
によって作製することができる。

【００１０】本発明のモノクローナル抗体の作製方法
は、より具体的には、例えば、前記感作抗原として、本
発明者らによって培養細胞株として樹立されたｒＧ−Ｃ
ＳＦ投与マウスの脾臓間質細胞であるＣＦ−１細胞〔Ｂ
ｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．８０，１９１４（１９９２）〕を使
用し、当該感作抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免
疫細胞）を、マウス等の哺乳動物のミエローマ細胞と融
合させ、得られた融合細胞（ハイブリドーマ）をクロー
ン化し、その中から前記細胞株を認識する本発明の抗体
を産生するクローンを選別し、これを培養して目的とす
る抗体を回収する方法が好適なものとして例示される。
しかしながら、本発明においては、かかる方法はあくま
で一例に過ぎず、例えば、この場合、前記感作抗原とし
ては、前記ＣＦ−１細胞に限らず、ＣＦ−１細胞の場合
に準じて得られるヒト脾臓間質細胞由来の細胞株を使用
することも適宜可能であり、前記ＣＦ−１細胞の場合と
同様にして目的とするヒト骨髄系細胞と結合するモノク
ローナル抗体を作製することができる。

【００１１】このようなモノクローナル抗体の作製方法
において、前記感作抗原で免疫される哺乳動物として
は、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用す
るミエローマ細胞との適合性などを考慮して選択するの
が好ましく、一般的には、マウス、ラット、ハムスター
等が好適なものとして使用される。

【００１２】次に、免疫は、一般的方法により、例え
ば、前記ＣＦ−１細胞等の脾臓間質細胞を哺乳動物に腹
腔内注射等により投与することにより、行われる。より
具体的には、ＰＢＳや生理食塩水等で適当量に希釈、懸
濁したものを、動物に１ヶ月毎に数回投与することが好
ましい。免疫細胞としては、前記細胞株の最終投与後に
摘出した脾細胞を使用するのが好ましい。

【００１３】次に、前記免疫細胞と融合される他方の親
細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞としては、すで
に公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ
８．６５３）〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３，１５４
８（１９７８）〕、ｐ３−Ｕ１〔Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏ
ｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１，１−７（１９７
８）〕、ＮＳ−１〔Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
６，５１１−５１９（１９７６）〕、ＭＰＣ−１１〔Ｃ
ｅｌｌ，８，４０５−４１５（１９７６）〕、Ｓｐ２／
０−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２７０
（１９７８）〕、ＦＯ〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔ
ｈ．，３５，１−２１（１９８０）〕、Ｓ１９４〔Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４８，３１３−３２３（１９７
８）〕、およびＲ２１０〔Ｎａｔｕｒｅ，２７７，１３
１−１３３（１９７９）〕等が好適に使用される。

【００１４】前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融
合は、基本的には通常の方法、例えば、ミルシュタイン
ら（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．）の方法〔Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３，３−４６（１９８
１）〕等に準じて行うことができる。

【００１５】より具体的には、前記細胞融合は、例え
ば、融合促進剤の存在下に通常の栄養培地中で実施され
る。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用
され、更に、所望により融合効率を高めるためにジメチ
ルスルホキシド等の補助剤を適宜添加使用することもで
きる。免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例え
ば、ミエローマ細胞に対して、免疫細胞を１〜１０倍程
度とするのが好ましい。また、前記細胞融合に用いる培
地としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好
適なＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、その他、こ
の種の細胞培養に使用される通常の培地が使用可能であ
り、更に、牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清補液を併用す
ることも可能である。

【００１６】細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細
胞との所定量を前記培地内でよく混合し、予め３７℃程
度に加温したＰＥＧ溶液、例えば、平均分子量１，００
０〜６，０００程度のＰＥＧを、通常、培地に約３０〜
６０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で添加し、混合することによっ
て行われる。続いて、適当な培地を逐次添加し、遠心し
て上清を除去する操作を繰り返すことにより目的とする
ハイブリドーマが形成される。

【００１７】当該ハイブリドーマは、通常の選択培地、
例えば、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン
およびチミジンを含む培地）で培養することにより選択
される。当該ＨＡＴ培地による培養は、目的とするハイ
ブリドーマ以外の細胞（未融合細胞）が死滅するのに充
分な時間、通常、数日〜数週間継続する。次いで、通常
の限界希釈法に従って、目的とする抗体を産生するハイ
ブリドーマのスクリーニングおよび単一クローン化が実
施される。

【００１８】このようにして作製される本発明のモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培地
で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で
長期保存することが可能である。

【００１９】当該ハイブリドーマから本発明のモノクロ
ーナル抗体を採取するには、当該ハイブリドーマを常法
に従って培養し、その培養上清から得る方法、あるいは
ハイブリドーマをこれと適合性のある哺乳動物に投与し
て増殖させその腹水から得る方法など適宜の方法が採用
される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適した
方法であり、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適
した方法である。

【００２０】更に、前記した方法により得られる抗体
は、塩析法、ゲル濾過法、アフィニティークロマトフラ
フィー等の通常の精製手段を応用して高純度に精製する
ことができる。

【００２１】本発明のモノクローナル抗体は、後記する
実施例において具体的に示す固有の特性、すなわち骨髄
系細胞にアポトーシスを誘起する機能を有するものであ
れば、如何なるものであってもよく、当該機能を有する
ものであれば、感作抗原の種類を問わず本発明の範囲に
含まれるものであり、本発明のモノクローナル抗体は、
当該特性を利用して、骨髄性白血病の治療等の分野にお
いて有用な治療薬剤等として使用し得るものである。

【００２２】このような本発明のモノクローナル抗体を
利用して骨髄系細胞にアポトーシスを引き起こす抗原等
を特異的に認識する抗体として、これらを識別、同定す
るための、あるいは、当該モノクローナル抗体の固有の
特性を利用して骨髄性白血病治療薬剤等として使用する
ための具体的システムの構築、その改変および応用等
は、当業者にとって自明の通常の方法を応用して実施さ
れるものである限り、いずれも本発明の範囲に含まれる
ものであることは云うまでもない。

【００２３】

【実施例】次に、本発明を参考例および実施例に基づい
て更に具体的に説明するが、本発明は当該実施例に限定
されるものではない。

【００２４】参考例 脾臓間質細胞株の樹立とその性質 １）脾臓間質細胞株の樹立 ｒＧ−ＣＳＦ連続投与による脾臓間質細胞株は、ｒＧ−
ＣＳＦ１００μｇ／ｋｇを５日間投与したＣ５７ＢＬ／
６Ｊマウスの脾臓細胞の初代培養から樹立された。すな
わち、ｒＧ−ＣＳＦ投与後に無菌条件下に脾臓を摘出
し、２５ｃｍ² プラスチック・フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎ
ｇ社製）で６週間培養し、１０％非働化血清（ＦＢＳ）
（三光純薬社製、東京）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンお
よび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＩ
ｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）で３
７℃、５％ＣＯ₂ のインキュベータ内で培養し、週２回
新鮮培地に交換した。

【００２５】コンフルエント培養から０．０５％トリプ
シン＋０．０２％ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ社製）、Ｃａ−Ｍｇ−ｆｒｅｅ ＰＢＳを用いて付
着性細胞集団（間質細胞）を分取して別なフラスコに移
した。この継代培養を週に約１〜２回繰り返した。初期
の継代培養（１〜１０回目）での細胞のｓｐｌｉｔｒａ
ｔｉｏは１／４〜１／８であったが、その後の比率は１
／１６〜１／３２とした。約１０回目の継代培養後に間
質細胞は均質な線維芽細胞様となった。２０回目の継代
時に上述の方法で間質細胞を採集し、限界希釈法を用い
て細胞のクローニングを２回繰返して間質細胞株（ＣＦ
−１細胞株）を樹立した。

【００２６】次いで、これらの細胞を１０％非働化ＦＢ
Ｓを加えたＩＭＤＭ５ｍｌを入れた２５ｃｍ² フラスコ
（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）内で維持培養し、５日毎にｓｐ
ｌｉｔ ｒａｔｉｏ １／３２で継代培養した。尚、他
の哺乳動物についても、その脾臓間質細胞株を樹立する
ことができ、例えば、ヒトの場合には、細胞をＳＶ−４
０アデノウィルスベクターで形質転換すれば前述と同様
の方法でヒト脾臓間質細胞株を樹立することが可能であ
る〔Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１４８，２４５
（１９９１）〕。

【００２７】２）ＣＦ−１細胞の特性 前記の如くして細胞株として樹立されたＣＦ−１細胞に
ついては、標準的な細胞化学的手法を用いてアルカリ・
ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、β−グルクロニ
ダーゼ、α−ナフチルアセテイトエステラーゼおよびオ
イル・レッドＯを検索すると共に下記のモノクローナル
およびポリクローナル抗体を用いて免疫酵素組織化学検
索によりその特性を検討した：ＭａｃＩ（Ｓｅｒｏ Ｔ
ｅｃ．社製）、第ＶＩＩＩ関連抗原（Ｄａｋｏｐａｔｔ
ｓ社製）、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲンおよび
フィブロネクチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ社製）、貪食能はラテックス・ビーズ（粒
子径：１．０９μｍ，Ｓｉｇｍａ）を用い、また、脂肪
細胞への分化能は、２５ｃｍ² フラスコでコンフルエン
ト培養後１０^-6ｍｏｌ／ｌの燐酸ハイドロコルチゾン
（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、４週間の培養で検討し
た。

【００２８】その結果、ＣＦ−１細胞は、アルカリ・ホ
スファターゼ、第ＶＩＩＩ因子関連抗原、ＭａｃＩおよ
び貧食能は陰性であったが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型
コラーゲンおよびフィブロネクチンは陽性であった。Ｃ
Ｆ−１細胞は、微かにリピッドを含むが、１０^-6ｍｏｌ
／ｌのハイドロコルチゾン存在下の４週間のコンフルエ
ント培養によっても脂肪細胞には分化しなかった。これ
らのデータから、ＣＦ−１細胞は、前脂肪細胞、マクロ
ファージおよび血管内皮細胞の特徴を備えていないと云
えることから、これらとは異なる間質細胞由来であるこ
とが明らかとなった。

【００２９】３）ＣＦ−１細胞による造血幹細胞の維持 造血幹細胞がＣＦ−１細胞によって維持されるか否かを
検討するため、Ｔｉｌｌ＆ＭｃＣｕｌｌｏｃｈの方法に
よるＣＦＵ−Ｓ ａｓｓａｙ（脾コロニー形成法）を行
なった。マウス１０匹／群に９００ｃＧｙを照射（ＭＢ
Ｒ−１５２０Ｒ，Ｈｉｔａｃｈｉ社製，東京）した後、
骨髄単核細胞（ＢＭ細胞）（１．０×１０⁵ ／ｈｅａ
ｄ、５．０×１０⁴ ／ｈｅａｄまたは２．５×１０⁴ ／
ｈｅａｄ）およびＣＦ−１細胞（１．０×１０⁵ ／ｈｅ
ａｄ）を静注し、１２日目に脾臓内のコロニー数を算え
てＣＦＵ−Ｓ（脾臓コロニー）とした。

【００３０】その結果、骨髄単核細胞（ＢＭ細胞）とＣ
Ｆ−１細胞とを放射線照射したマウスに同時に移植する
と、いずれのＢＭ細胞群についても脾コロニー数は、Ｃ
Ｆ−１細胞を移植しなかったマウスに比し有意に増加し
（１．４〜１．８倍）、また、ＢＭ細胞とＣＦ−１細胞
とを同時に移植したマウスの移植後１２日目の生存率
は、ＢＭ細胞を単独移植したマウスよりも高く、死亡率
が低下することから、造血幹細胞がＣＦ−１細胞によっ
て維持されることが明らかとなった。

【００３１】実施例 モノクローナル抗体の作製 １）感作抗原と免疫法 感作抗原として、前述の参考例で取得したＣＦ−１細胞
を用いて抗原感作を行った。細胞株は、１０％牛胎児血
清（ＦＢＳ、三光純薬社製）、Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌ
ｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−
Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を培地として使用し、５％ＣＯ
₂ インキュベーター中で３７℃の温度条件下で継代培養
を行った。

【００３２】細胞は、１ｍＭＥＤＴＡ、ＰＢＳ処理後、
軽いピペッティングによって培養フラスコより回収し
た。この細胞を約１×１０⁷ 個／ｍｌの細胞数で１ｍＭ
ＥＤＴＡ・ＰＢＳに懸濁し、浮遊させ、Ｗｉｓｔａｒ
Ｉｍａｍｉｃｈ系ラット（７週令、♀、動物繁殖研究
所）に免疫した。初回免疫には、約１×１０⁷ 個／ｍｌ
の細胞１ｍｌをラット腹腔内に注射し、１ヶ月後に１×
１０⁷ 個／ｍｌの細胞１ｍｌを追加免疫した。更に、１
ヶ月間隔にて１×１０⁷ 個／ｍｌの細胞１ｍｌを数回追
加免疫し、免疫されたラット抗体とＣＦ−１細胞との反
応性を確認後、最終免疫として、１×１０⁸ 個／ｍｌの
細胞１ｍｌを免疫した。最終免疫３日後にラットを屠殺
して脾臓を摘出した。

【００３３】２）細胞融合 １匹のラットから摘出した脾臓を細切後、遊離した脾細
胞を遠沈した後、ＩＭＤＭ培地（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）中に懸濁し、浮遊させ、充分
に洗浄を行った。一方、マウス・ミエローマ細胞株Ｓｐ
２／０−Ａｇ１４〔Ｎａｔｕｒｅ，２７６，２６９−２
７０（１９７８）〕を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ、三
光純薬社製）を含有するＩＭＤＭ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）培地にて培養して得た細胞
を、同様に前記ＩＭＤＭ培地で洗浄後、その１×１０⁸
個と、前記脾細胞２×１０⁸ 個とを遠心管に入れ混合
し、ポリエチレングリコール４０００（半井化学社製）
によって常法〔Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，
４２，４５８−４６２（１９８０）〕に従い細胞融合さ
せた。

【００３４】次いで、得られた融合細胞を、２０％ＦＢ
Ｓを含むＩＭＤＭ培地にて９６個のウエルプレートに分
注し、５％ＣＯ₂ インキュベーター中で３７℃で培養し
た。翌日よりＨＡＴ選択培地に徐々に置換させて培養を
続けた。培養開始後、上清を週２回の頻度に、それぞれ
新しいＨＡＴ培地に代え、培養を継続し、増殖維持させ
た。

【００３５】次に、このようにして得られた融合細胞を
常法により限界希釈法を用いてクローニングした。すな
わち、前記融合細胞の培養上清中の抗体を利用して、感
作抗原との結合性を調べ、感作抗原と強い結合性を有す
るクローンだけを常法により限界希釈法を用いてクロー
ニングした。

【００３６】３）スクリーニング 融合細胞（ハイブリドーマ）のスクリーニングは、フロ
ーサイトメトリー（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を
使った間接蛍光抗体法により行った。目的の抗体を産生
するクローンのスクリーニングは、ターゲット細胞とし
て、ＣＦ−１細胞を用いて行った。すなわち、反応バッ
ファー〔２％ＦＢＳ，０．０２％ＮａＮ₃ を含むＰＢ
Ｓ〕に懸濁した細胞を遠心し、ペレットとして回収した
後、ハイブリドーマ培養上清１００μｌ中に浮遊させ
（約１×１０⁶ 個／１００μｌ）、４℃にて１時間反応
させた。 前記バッファーにより１回洗浄した後、ＦＩ
ＴＣ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ（ＦＣ）抗体（Ｃｈｅｍｉ
ｃｏｎ社製）を加えて１時間インキュベーションした。
１回洗浄した後、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ Ｃ
ｙｔｏｍｅｔｒｙ）（ＦＡＣＳｃａｎ，ベクトン・デッ
キンソン社製）にて解析した。

【００３７】４）抗体の精製 前記３）でスクリーニングした融合細胞を常法に従って
培養し、培養上清中に産生される抗体を常法により分離
し、精製した。すなわち、各ウエルのうち前記感作抗原
に対する抗体価の高かったウエルからハイブリドーマを
採取し、組織培養プラスチックディッシュ（Ｃｏｒｎｉ
ｎｇ社製）に広げて５％ＣＯ₂ 中で３７℃にて継代培養
を行い、増殖させ、常法により精製することにより、モ
ノクローナル抗体ＧＳＰＳＴ−１、ＢＭＡＰ−１を得
た。

【００３８】ＧＳＰＳＴ−１については、得られた細胞
をプリスタン投与を施行したＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎ
ｕ系ヌードマウス（８週令，♂，日本クレア社製）に腹
腔内注入した。１０〜１４日後、産生された腹水を採取
し、３３％硫酸アンモニウムで塩析しＰＢＳで透析し
た。また、ＢＭＡＰ−１抗体については、１０％ＦＢＳ
を含むＩｓｃｏｖｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＭＥＭ培地に
て、大量培養し、培養上清を濃縮後、３３％硫酸アンモ
ニウムで塩析し、ＰＢＳで透析後、プロテインＡカラム
キット（アマシャム社製）により再度精製し、ＰＢＳに
より透析を行った。尚、上記の実施例においては、感作
抗原として、前記ＣＦ−１細胞を使用した場合について
例示したが、他の造血幹細胞支持能を有する間質細胞を
使用した場合にも同様にしてモノクローナル抗体を作製
することが可能であり、本発明は、前記モノクローナル
抗体に限らず、それと同様の特性を有するすべてのモノ
クローナル抗体、および当該モノクローナル抗体を産生
するすべてのハイブリドーマを包含するものである。

【００３９】本発明のモノクローナル抗体のＢＭＡＰ−
１を産生するハイブリドーマは、Ｗｉｓｔａｒ Ｉｍａ
ｍｉｃｈ系ラット脾細胞とマウス・ミエローマ細胞株Ｓ
ｐ２／０−Ａｇ１４を親細胞として作製された新規な融
合細胞であり、公的微生物寄託機関である工業技術院生
命工学工業技術研究所に、ＢＭＡＰ−１（ラット マウ
ス ハイブリドーマ），受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４３
８２として国際寄託されている。

【００４０】５）抗体の性質 抗体の反応性 （ＣＦ−１細胞に対する反応性）上記のようにして得ら
れたモノクローナル抗体ＧＳＰＳＴ−１、ＢＭＡＰ−１
のＣＦ−１細胞に対する反応性について免疫蛍光分析
（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎａｌｙ
ｓｉｓ）により検討した結果を図１〜図３に示す。ここ
で、図１は、抗体非存在下のコントロール、図２は、Ｇ
ＳＰＳＴ−１とＣＦ−１細胞との結合性、図３は、ＢＭ
ＡＰ−１とＣＦ−１細胞との結合性、の解析結果を示
す。尚、図中、縦軸は相対細胞数を、横軸は蛍光強度
を、示す。図１〜図３から明らかなとおり、モノクロー
ナル抗体ＧＳＰＳＴ−１、ＢＭＡＰ−１はＣＦ−１細胞
に対して結合性を有しており、ＣＦ−１細胞の表面抗原
を認識するものであることが分った。

【００４１】（骨髄細胞に対する反応性）次に、ＧＳＰ
ＳＴ−１、ＢＭＡＰ−１の正常の骨髄細胞に対する反応
性をフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔ
ｒｙ）（ＦＡＣＳｃａｎ，ベクトン・デッキンソン社
製）により検討した結果を図４〜図６に示す。ここで、
図４は、抗体非存在下のコントロール、図５は、ＧＳＰ
ＳＴ−１と骨髄細胞との結合性、図６は、ＢＭＡＰ−１
と骨髄細胞との結合性、の解析結果を示す。尚、図中、
縦軸は相対細胞数を、横軸は蛍光強度を、示す。図４〜
図６に示すように、ＧＳＰＳＴ−１は、骨髄細胞とは全
く結合せず、ＢＭＡＰ−１は、すべての骨髄細胞と結合
することが明らかとなった。

【００４２】（骨髄性白血病細胞株（ＮＦＳ−６０）に
対する反応性）ＧＳＰＳＴ−１およびＢＭＡＰ−１のＮ
ＦＳ−６０細胞〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８２，６６８７−６６９１（１９８５）〕
に対する反応性をフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ Ｃ
ｙｔｏｍｅｔｒｙ）（ＦＡＣＳｃａｎ，ベクトン・デッ
キンソン社製）により検討した結果を図７〜図１０に示
す。ここで、図７は、抗体非存在下のコントロール、図
８は、ＧＳＰＳＴ−１とＮＦＳ−６０細胞との結合性、
図９は、市販のラットＩｇＧ１（Ｚｙｍｅｄ社製）を用
いたコントロール、図１０は、ＢＭＡＰ−１とＮＦＳ−
６０細胞との結合性の解析結果を示す。尚、図中、縦軸
は相対細胞数を、横軸は蛍光強度を、示す。図７〜図１
０に示すように、ＧＳＰＳＴ−１は、ＮＦＳ−６０細胞
とは反応せず、ＢＭＡＰ−１は、ＮＦＳ−６０細胞と結
合することが明らかとなった。

【００４３】（ＢＭＡＰ−１のＮＦＳ−６０細胞に対す
る細胞増殖抑制試験）ＢＭＡＰ−１のＮＦＳ−６０細胞
に対する作用を、Ｇ−ＣＳＦ１００ｎｇ／ｍｌおよびサ
イクロヘキシミド１０^-9Ｍ存在下にて、ＭＴＴアッセイ
法により検討した結果を図１１に示す。９６穴の培養プ
レートを用い、ＮＦＳ−６０細胞を４×１０³ ／ｗｅｌ
ｌ／１００μｌに対し、ＢＭＡＰ−１は０，１０，１０
０ｎｇ／ｍｌ，１，１０，１００μｇ／ｍｌ濃度のもの
をそれぞれ１０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、その２日後に、
ＭＴＴ法により生細胞数を測定した。その結果、図１１
に示すように、ＮＦＳ−６０細胞はＢＭＡＰ−１により
著しく増殖が抑制されていることが明らかとなった。

【００４４】抗体のタイピング 次に、得られたモノクローナル抗体のＩｇＧのサブクラ
スをタイピングしたところ〔ラットＭｏｎｏ Ａｂ−Ｉ
Ｄ・Ｓｐキット（Ｚｙｍｅｄ社製）、およびビオチン標
識マウス抗ラットＩｇＧ１抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を使
用〕、ＧＳＰＳＴ−１はＩｇＧ２ａ、ＢＭＡＰ−１はＩ
ｇＧ１であることが明らかとなった。

【００４５】骨髄移植阻害作用 次に、これらの抗体を用いて骨髄移植阻害実試験を行
い、その特性について検討した。その結果を図１２〜図
１３に示す。図１２〜図１３に示されるように、ＢＭＡ
Ｐ−１は、骨髄移植阻害効果を有するが、ＧＳＰＳＴ−
１には、その効果は認められなかった。すなわち、致死
量の放射線照射（９００ｃＧｙ）をしたＣ５７ＢＬ／６
Ｊマウスに、１．０×１０⁵ ／ｈｅａｄの骨髄細胞およ
びモノクローナル抗体を、尾静脈より投与し、脾臓コロ
ニーの形成を観察したところ、上記の結果を得た。尚、
図１３のＮｏｎ−ｔｒｅａｔｅｄは、これらを投与しな
かった場合を示す。

【００４６】図１３に示されるように、ＢＭＡＰ−１
が、骨髄移植阻害試験において、移植を完全に抑制する
のは、このモノクローナル抗体が、骨髄細胞に反応しア
ポトーシスを引き起こすことに因るものであることが確
認された。すなわち、ＢＭＡＰ−１産生のハイブリドー
マをヌードマウスに腹腔内投与すると腹水がわずかに貯
留する時期にマウスは死亡した。また、正常のＣ５７Ｂ
Ｌ／６Ｊマウスに、５０μｇ／ｈｅａｄ（７）ＢＭＡＰ
−１を静脈内投与することにより骨髄細胞がすべて死滅
することが判明し、図１４にＢＭＡＰ−１静脈内投与６
日後の骨髄細胞が死滅したことを裏付ける顕微鏡写真を
示した。この顕微鏡写真から明らかなように、リンパ球
ばかりでなく、好中球、巨核球、骨髄芽球、骨髄球、肥
満細胞、マクロファージ、単球、赤芽球等（いわゆる骨
髄系細胞）が死滅していることが確認された。また、３
０μｇ／ｈｅａｄのＢＭＡＰ−１を投与したマウスの骨
髄細胞のＤＮＡを検討したところ、図１５に示すよう
に、明らかにラダー・フォーメーションが認められ、Ｂ
ＭＡＰ−１の骨髄細胞に対する前記反応は、アポトーシ
スに因るものであることが確認された。

【００４７】なお、ＢＭＡＰ−１抗体について、そのＩ
ｇＧのＦｃ領域をペプシン（Ｓｉｇｍａ社製）により切
断し、Ｆ（ａｂ′）₂ としてＧＰＣカラムにより精製し
た後、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにその３３．５μｇ／ｈ
ｅａｄ（完全なＩｇＧの５０μｇ／ｈｅａｄに相当する
量）を静脈内投与した結果、骨髄において、骨髄細胞が
死滅することが認められた。このことにより、ＢＭＡＰ
−１による骨髄細胞の死滅には、抗体依存性細胞障害お
よび補体依存性細胞障害は関与していないことが明らか
となった。

【００４８】ところで、アポトーシスを引き起こす抗原
としては、細胞表面蛋白質のＦａｓ抗原が既に報告され
ているが、このＦａｓ抗原は、胸腺、心臓、肝臓、肺、
卵巣などでｍＲＮＡの発現が認められているが、骨髄で
はそのｍＲＮＡがほとんど検出されないことから〔Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８，１２７４−１２７９（１９
９２）〕、ＢＭＡＰ−１が認識する抗原は、従来知られ
ているＦａｓ抗原とは異なるものであることは明らかで
ある。

【００４９】さらに、ＢＭＡＰ−１が認識する抗原が、
ＴＮＦレセプターか否かを明らかにするため、ＴＮＦに
反応し細胞死を起こすＬ−９２９細胞を用い、ＢＭＡＰ
−１の作用を検討した。マウスＴＮＦα（Ｇｅｎｚｙｍ
ｅ社製）の最終濃度は、０，１，１０，１００ｐｇ／ｍ
ｌ，１，１０，１００ｎｇ／ｍｌ，１μｇ／ｍｌとし、
ＢＭＡＰ−１の最終濃度は、０，１０，１００ｐｇ／ｍ
ｌ，１，１０，１００ｎｇ／ｍｌ，１，１０μｇ／ｍｌ
とし、ＴＮＦαおよびＢＭＡＰ−１添加後２日目に、Ｌ
−９２９細胞の生細胞数をＭＴＴ法により測定した。そ
の結果、図１６、１７に示すように、ＴＮＦαによりＬ
−９２９細胞は著明に減少するのに対し、ＢＭＡＰ−１
はＬ−９２９細胞に対し作用を及ぼさなかった。従っ
て、ＢＭＡＰ−１が認識する抗原はＴＮＦレセプターで
ないことが明らかとなった。

【００５０】ＢＭＡＰ−１が認識する抗原が、ＭＨＣｃ
ｌａｓｓＩ抗原であるか否かをフローサイトメトリー
（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）（ＦＡＣＳｃａｎ，
ベクトン・デッキンソン社製）により検討した結果を図
１８〜図２１に示す。ここで、図１８は、市販のラット
ＩｇＧ２ａ（Ｚｙｍｅｄ社製）を用いたコントロール、
図１９は、抗マウスＭＨＣｃｌａｓｓＩ抗体（ラットＩ
ｇＧ２ａ，ＢＭＡ社製）とＢＷＶ１細胞（ＢＷ５１４７
細胞由来のマウスリンパ腫）との結合性、図２０は、市
販のラットＩｇＧ１（Ｚｙｍｅｄ社製）を用いたコント
ロール、図２１は、ＢＭＡＰ−１とＢＷＶ１細胞との結
合性の解析結果を示す。尚、図中、縦軸は相対細胞数
を、横軸は蛍光強度を、示す。その結果、ＢＭＡＰ−１
はＢＷＶ１細胞を認識しないが、ＭＨＣｃｌａｓｓＩ抗
体は、ＢＷＶ１細胞と反応した。

【００５１】以上のように、ＢＭＡＰ−１は、骨髄系細
胞にアポトーシスを引き起こす作用を有するものである
ことが実験的に確認されたが、本発明者の知るところに
よれば、前述の如く、従来、骨髄系細胞にアポトーシス
を誘起するモノクローナル抗体について報告された例は
なく、かかる作用を有するモノクローナル抗体は、本発
明者が見い出した新規なものである。そして、このＢＭ
ＡＰ−１に代表される本発明のモノクローナル抗体の骨
髄細胞に対するアポトーシス作用を利用することによ
り、当該モノクローナル抗体は、その抗原の発現が高い
と考えられる骨髄性白血病細胞を死滅させることが可能
であると考えられることから、本発明の骨髄系細胞にア
ポトーシスを誘起するモノクローナル抗体は、骨髄性白
血病治療薬等として有用なものである。

【００５２】以上、本発明のモノクローナル抗体につい
て実施例を示して具体的に説明したが、本発明で云うと
ころの骨髄系細胞にアポトーシスを誘起するモノクロー
ナル抗体は、前記具体例として例示したものが代表的な
ものとしてあげられるものの、必ずしもこれに限定され
るものではなく、感作抗原の種類を問わず同様に作製さ
れた同様の特性および機能を有するすべてのモノクロー
ナル抗体を包含するものであることは云うまでもない。

【００５３】

【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、骨髄系
細胞にアポトーシスを引き起こす抗原等を特異的に認識
する抗体として、これらを識別、同定するのに有用であ
ると共に、骨髄系細胞にアポトーシスを引き起こす作用
を有することから、当該特性を利用して、骨髄性白血病
の治療等の分野において有用な治療薬剤等として使用し
得るものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】イムノフルオレッセンスによる解析（抗体非存
在下の対照，ＣＦ−１細胞）。

【図２】イムノフルオレッセンスによるＧＳＰＳＴ−１
抗体とＣＦ−１細胞との結合性の解析。

【図３】イムノフルオレッセンスによるＢＭＡＰ−１抗
体とＣＦ−１細胞との結合性の解析。

【図４】イムノフルオレッセンスによる解析（抗体非存
在下の対照，骨髄細胞）。

【図５】イムノフルオレッセンスによるＧＳＰＳＴ−１
抗体と骨髄細胞との結合性の解析。

【図６】イムノフルオレッセンスによるＢＭＡＰ−１抗
体と骨髄細胞との結合性の解析。

【図７】イムノフルオレッセンスによる解析（抗体非存
在下の対照）。

【図８】イムノフルオレッセンスによるＧＳＰＳＴ−１
とＮＦＳ−６０細胞との結合性。

【図９】イムノフルオレッセンスによる解析（ラットＩ
ｇＧ１による対照）。

【図１０】イムノフルオレッセンスによるＢＭＡＰ−１
とＮＦＳ−６０細胞との結合性。

【図１１】モノクローナル抗体の細胞増殖抑制試験（Ｂ
ＭＡＰ−１）。

【図１２】モノクローナル抗体の骨髄移植阻害試験（Ｇ
ＳＰＳＴ−１）。

【図１３】モノクローナル抗体の骨髄移植阻害試験（Ｂ
ＭＡＰ−１）。

【図１４】本発明のモノクローナル抗体のＢＭＡＰ−１
投与６日後の死滅した骨髄細胞（２）、抗体非存在下の
対照（１）、を示す説明図である〔骨髄標本（生物の形
態）の顕微鏡写真（Ｈ．Ｅ．染色）（×４００）〕。

【図１５】本発明のモノクローナル抗体のＢＭＡＰ−１
を投与した場合にみられる骨髄細胞のＤＮＡのラダー・
フォーメーションを示す説明図である（電気泳動クロマ
トグラフィーの泳動写真）。

【図１６】ＴＮＦによる細胞障害試験。

【図１７】モノクローナル抗体の細胞障害試験（ＢＭＡ
Ｐ−１）。

【図１８】イムノフルオレッセンスによる解析（ラット
ＩｇＧ２ａによる対照）。

【図１９】イムノフルオレッセンスによる抗マウスＭＨ
ＣｃｌａｓｓＩ抗体とＢＷＶ１細胞との結合性。

【図２０】イムノフルオレッセンスによる解析（ラット
ＩｇＧ１による対照）。

【図２１】イムノフルオレッセンスによるＢＭＡＰ−１
とＢＷＶ１細胞との結合性。

【符号の説明】

ａ ＢＭＡＰ−１投与したマウス胸腺のＤＮＡ（２４時
間） ｂ ＢＭＡＰ−１投与したマウス骨髄のＤＮＡ（２４時
間） ｃ ＢＭＡＰ−１投与したマウス骨髄のＤＮＡ（８時
間） ｄ ＢＭＡＰ−１投与したマウス骨髄のＤＮＡ（４時
間） ｅ 無処理マウスの骨髄のＤＮＡ（骨髄細胞） ｆ 分子量マーカー

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 骨髄系細胞と結合し、骨髄系細胞にアポ
   トーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘起するモノクロー
   ナル抗体。
2. 【請求項２】 骨髄系細胞と結合し、骨髄系細胞にアポ
   トーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘起するモノクロー
   ナル抗体断片。
3. 【請求項３】 請求項１記載のモノクローナル抗体を産
   生するハイブリドーマ。