HU220778B1

HU220778B1 - Kőtőszőveti sejtek felszíni antigénjeivel reagálni képes monoklonális antitestek

Info

Publication number: HU220778B1
Application number: HU9600208A
Authority: HU
Inventors: Naoshi Fukushima
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-09-02
Publication date: 2002-05-28
Also published as: CZ290424B6; SK281965B6; FI960566A0; CA2169951A1; CN1067726C; PL181847B1; ZA946768B; PL313259A1; CN1130406A; EP0721014A4; NO960683L; AU692465B2; HU9600208D0; SK25696A3; EP0721014A1; KR100274791B1; CZ61896A3; WO1995006747A1; NO960683D0; FI960566A

Description

A leírás terjedelme 12 oldal (ezen belül 5 lap ábra)

HU 220 778 Bl

A találmány tárgya új, monoklonális antitest, amely gátolja a hematopoetikus őssejtek „letelepedését” („homing”) és felismer olyan lépből származó kötőszöveti vázsejteket, melyek támogatják a hematopoetikus őssejtek vándorlását. A találmány tárgyát képezi továbbá a fenti monoklonális antitestet termelő hibridóma.

Mivel a találmány szerinti monoklonális antitestek egy olyan anyagot ismernek fel antigénként, amely fontos szerepet játszik a csontvelő-eredetű sejtek hematopoetikus szöveten történő „letelepedésében” („homing”-jában) és hematopoetikus őssejtek „letelepedését” gátló tulajdonságuk is van, olyan gyógyhatású anyagként használhatók, melynek jellemvonása, hogy rákellenes szer hatását növeli. Egy példa erre olyan gyógyhatású anyag, amely leukémia elleni rákellenes szer hatását javítja azáltal, hogy akut mieloid leukémiás sejteket szabadít fel a csontvelőből a fent leírt jellemvonásnak megfelelően.

Granulocita kolóniastimuláló faktorok, például rekombináns granulocita kolóniastimuláló faktorok (rG-CSF), eredetileg mint olyan Immorális faktorok voltak ismertek, melyek granulocitasejtek differenciálódását és proliferációját stimulálják. Egéren in vivő végzett kísérlet alapján leírták, hogy az rG-CSF növeli a csontvelő hematopoézisét, valamint ezenfelül figyelemre méltó extramedulláris (csontvelőn kívüli) hematopoézist okoz a lépben, melynek során a hematopoetikus őssejtek és minden hematopoetikus prekurzorsejt proliferál a lépben. Feltételezték továbbá, hogy a lépben az extramedulláris hematopoézis mechanizmusának fontos eleme, hogy a hematopoézis a hematopoetikus mikrokömyezet módosulásainak köszönhető, melyet az rG-CSF hematopoetikus képességet növelő stimulációja okoz.

Ezek alapján rG-CSF-el kezelt léperedetű kötőszöveti vázsejtekre fordítottuk a figyelmünket azzal a céllal, hogy tisztázzuk a hematopoézis lehetőségét a lépben, és létrehoztunk egy hematopoetikus kötőszöveti vázsejtvonalat (CF-1-sejtek) egy olyan egér lépéből, melynek rG-CSF-et adtunk be. Ezzel az volt a célunk, hogy megkíséreljük analizálni az rG-CSF-el kezelt kötőszöveti vázsejtek hematopoetikus képességének növekedését. Megvizsgáltuk továbbá a hematopoetikus kötőszöveti vázsejtek felhasználásával a lehetséges hatást a hematopoézisre, és eredményként megállapítottuk az in vitro kolóniastimuláló aktivitást, és in vivő a hematopoetikus őssejteket serkentő képességet [Blood, 80, 1914, (1992)].

Akasaka, Y. és munkatársai [Acta. Pathol. Jpn. 41(7): 499-506 (1991)] ismertetnek egy R4-R9 jelű monoklonális antitestet, melyről feltételezik, hogy pozitív szerepet játszik a hematopoetikus őssejtek proliferációjának és differenciálódásának szabályozásában (505. old. jobb oldali oszlop, utolsó 15. sor).

Mivel a hematopoetikus őssejteket serkentő hatás in vivő akkor ismerhető fel, amikor a CF-l-sejteket csontvelővel együtt ültetjük át csontvelő-átültetés során, úgy gondoltuk, hogy a fenti hematopoetikus kötőszöveti vázsejtvonal (CF-l-sejtek) egy sejtadhéziós faktornak megfelelő funkciót expresszál, ami lehetővé teszi a hematopoetikus őssejtek „letelepedését” a hematopoetikus szöveten.

Azonban, bár a léperedetű kötőszöveti vázsejtek egy részéből - melyek képesek voltak elősegíteni a hematopoetikus őssejtek „letelepedését” - egy sejtvonalat hoztunk létre (a CF-l-sejteket) továbbá megvizsgáltuk ezek citológiai jellemvonásait, korábban nem készült azok felszíni antigénjeit felismerő specifikus antitest, azonkívül jellemzőik is kevéssé voltak ismertek.

A léperedetű kötőszöveti vázsejtekről birtokunkban levő fenti ismeretek, és a kutatások eredményei alapján alapos vizsgálatokat folytattunk abból a célból, hogy egy, a léperedetű kötőszöveti vázsejtek felismerésére képes antitestet állítsunk elő, olyan vázsejtek felismerésére, melyek képesek elősegíteni a hematopoetikus őssejtek letelepedését. Létrehoztunk hematopoetikus őssejtek letelepedésének elősegítésére képes léperedetű kötőszöveti vázsejteket sejtvonal formájában, és ezzel párhuzamosan a léperedetű kötőszöveti vázsejtvonalat antigénként immunizálásra használva monoklonális antitestet készítettünk, és végeredményképpen egy új monoklonális antitestet nyertünk.

Megfigyeltük, hogy a kapott monoklonális antitestet az jellemzi, hogy felismeri a hematopoetikus őssejt letelepedését elősegíteni képes léperedetű kötőszöveti vázsejt felszíni antigénjét, és ezáltal a hematopoetikus őssejtek letelepedését (,,homing”-ját) gátolni képes, ily módon megvalósítottuk a találmány szerinti megoldást.

A találmány szerinti megoldás megvalósításakor célul tűztük ki egy új monoklonális antitest előállítását, ami felismeri a hematopoetikus őssejtek letelepedését elősegítő képességgel bíró léperedetű kötőszöveti vázsejtek felszíni antigénjét, és amely azzal jellemezhető, hogy gátolja a hematopoetikus őssejtek letelepedését. Célul tűztük ki továbbá egy hibridóma előállítását, amely a monoklonális antitestet termeli.

A találmány szerinti monoklonális antitest egy új monoklonális antitest, amely a hematopoetikus őssejtek letelepedését elősegítő képességgel bíró léperedetű kötőszöveti vázsejtek felszíni antigénje ellen készült, és amely felismeri a lép hematopoetikus képességének növeléséért felelős léperedetű kötőszöveti vázsejtet. Ugyanez a találmány szerinti monoklonális antitest különösen alkalmas anyag a hematopoetikus őssejtek letelepedésének a gátlására. Megjegyezzük, hogy a hematopoetikus őssejtek letelepedése („homing”) a leírásban használt értelemben azt jelenti, hogy a hematopoetikus őssejtek kötődését a hematopoetikus szövet kötőszöveti vázsejtjei okozzák, és a sejtek CFU-S-kolóniákként differenciálódnak és proliferálnak.

A találmány szerinti monoklonális antitestet el lehet készíteni például az alábbiakban leírtak szerint.

Nevezetesen a találmány szerinti monoklonális antitest elkészíthető például léperedetű kötőszöveti vázsejtek felhasználásával, melyek olyan állatból származnak, melyeknek rG-CSF-et adtunk be, mint például a CF-l-sejtek (léperedetű kötőszöveti vázsejtek) melyet mi hoztunk létre. A sejteket antigénként alkalmazva szokványos immunizáló módszerekkel immunizálunk, az immunizált sejteket szokványos sejtfüziós módsze2

HU 220 778 Bl rekkel fuzionáljuk, és a fuzionált sejteket szokványos klónozási módszerekkel klónozzuk.

A találmány szerinti monoklonális antitest elkészítésére előnyösen alkalmazhatunk például egy módszert, amely során antigénként felhasználjuk a fenti CF-l-sejteket, melyeket tenyészthető sejtvonal formájában mi állítottunk elő [Blood, 80, 1914, (1992)], fuzionáljuk egy, az antigénnel immunizált emlős plazmasejtjeit (immunocitáit) egy emlős (például egér) mielómasejtjeivel, klónozzuk a kapott fuzionált sejteket (hibridómákat), kiválasztjuk a kiónokat, amelyek a fenti sejtvonalat felismerő találmány szerinti antitestet termelik, majd tenyésztjük azokat, hogy a célul kitűzött antitestet visszanyerjük. Ez a módszer azonban csupán egy példa, és ebben az esetben például nem csupán a fenti CF-l-sejtek, hanem hematopoetikus szövet más kötőszöveti vázsejtjei - amelyeket a CF-l-sejtekhez hasonlóan nyertünk -, vagy a hematopoetikus szövet olyan kötőszöveti vázsejtjei, melyek emberi léperedetű kötőszöveti vázsejtekből származnak szintén megfelelően felhasználhatók arra, hogy a célul kitűzött antitesteket előállítsuk, ugyanolyan módon, mint a fenti CF-l-sejtek esetében.

A találmány szerinti monoklonális antitestek előállítására szolgáló eljárás alkalmazása során a fenti antigénnel immunizálandó emlősöket nem korlátozzuk adott fajokra; előnyösen figyelembe vesszük azonban a szelekció során azt, hogy a mielómasejtek különösen alkalmasak a sejtfúzióra, és előnyösen egeret, patkányt vagy hörcsögöt alkalmazunk.

Az immunizálást a szokványos módon végezzük, például a léperedetű kötőszöveti vázsejteket - mint például a fenti CF-1-sejteket - injektálással egy emlős hasüregébe juttatjuk. Közelebbről a sejteket előnyösen normális mennyiségű PBS vagy nátrium-klorid-oldattal hígítva, vagy abban szuszpendálva adjuk be egy állatnak néhány alkalommal egy hónapban. Előnyösen léperedetű sejteket alkalmazunk, melyeket a fenti sejtek utolsó alkalommal történő beadása után távolítunk el, mint immunocitákat.

A fenti immunocitával fuzionált emlős mielómasejtként - másik szülői sejtként - előnyösen számos ismert sejtet alkalmazhatunk, például a következőket: P3(P3X63Ag8.653) [J. Immunoi. 6, 511-519, (1976)], p3-Ul [Current Topics in Microbiology and Immunology 81, 1-7, (1978)], NS-1, [Eur. J. Immunoi. 6, 511-519, (1976)], MPC-11 [Cell 8, 405-415, (1976)], Sp2/0 - Agl4 (Natúré 276, 269-270 (1978)], FO [J. Immunoi. Meth. 35, 1-21, (1980)], S194, [J. Exp. Med. 148, 313-323, (1978)] és az R210 [Natúré 277, 131-133, (1979)].

A fenti immunocita és egy mielómasejt fúzióját alapvetően egy szokványos módszer szerint végezhetjük el, például Milstein és munkatársai módszerei szerint [Methods Enzymol. 73, 3-46 (1981)].

Közelebbről a fenti sejtfúziót elvégezhetjük például egy szokványos sejttenyésztő tápoldatban egy fúziót gyorsító szer jelenlétében. Fúziót gyorsító sejtként polietilénglikolt (PEG) és Sendai-vírust (HVJ), továbbá adjuvánsokat (például dimetil-szulfoxidot) adhatunk a tápoldathoz közönségesen ha szükséges a fúziós hatás növelése érdekében. Figyelembe véve az immunociták és a mielómasejtek arányát, a korábbit előnyösen 1:10 arányban alkalmazzuk az utóbbihoz képest. A fenti sejtfúzió során alkalmazott táptalaj lehet például RPMI1640 táptalaj és egy MÉM táptalaj, melyek alkalmasak a fenti mielómasejtek szaporítására, de egyéb táptalaj is, melyet közönségesen alkalmaznak az ilyen sejtek tenyésztésére. Ezenfelül kiegészítésképpen borjúszérumot (FBS) is alkalmazhatunk egyidejűleg. A sejtfúziót a fenti immunociták és mielómasejtek előírt mennyiségeinek a fenti táptalajban történő összekeverésével hatjuk végre 37 °C-ra előmelegített PEG-oldatot hozzáadva. Utóbbi lehet például átlagos molekulasúlyú PEG (1000-6000 között), melyet szokványos módon 30-60%-os koncentrációban (vegyesszázalék) adunk a táptalajhoz és összekeverjük. Ezután a megfelelő táptalajokat, egyiket a másik után, hozzáadva, a műveleteket ismételjük, lecentrifugáljuk a reakcióelegyet, eltávolítjuk a felülúszót és így megkapjuk a várt hibridómákat.

Az említett hibridómákat egy szokványos szelekciós táptalajon tenyésztve szelektáljuk, például HAT táptalajon (hipoxantint, aminopterint és timidint tartalmazó táptalaj). A HAT táptalajon annyi ideig tenyésztjük a sejteket, amennyi elegendő arra, hogy a nemkívánt hibridómák (nem fuzionált sejtek) kipusztuljanak. Ez szokványosán néhány napig, esetleg néhány hétig tart. Ezek után a kívánt antitesteket termelő hibridómák szkrínelését és klónozását a szokványos határhígítási módszerrel végezzük el.

A találmány szerinti monoklonális antitesteket termelő létrehozott hibridómákból szokványos táptalajban szubkultúrát hozhatunk létre, és azt folyékony nitrogénben hosszú ideig eltarthatjuk.

Ahhoz, hogy a hibridómákból a találmány szerinti monoklonális antitesteket megkaphassuk, alkalmazhatunk egy olyan módszert, amely magába foglalja a hibridómák szokványos módszer szerinti tenyésztését valamint az antitest kinyerését a felülúszóból, vagy egy másik módszert, amely során a hibridómát egy megfelelő emlősbe ültetjük be, hogy ott proliferáción menjenek keresztül, és az antitestet az aszciteszből nyerjük ki. Az előző módszer alkalmas arra, hogy nagy tisztaságú antitestet nyerjünk, míg az utóbbival nagy tömegű termelést érhetünk el.

A továbbiakban a fenti módszerrel nyert antitesteket nagymértékben megtisztíthatjuk szokványos tisztítási eljárásokat alkalmazva, mint például kisózási technikák, gélszűrés és affinitáskromatográfia.

Mivel a találmány szerinti monoklonális antitestek képesek gátolni a hematopoetikus őssejtek letelepedését, ezért gyógyhatású szerként alkalmazhatók. Ennek a gyógyhatású szemek a funkciója az lehet, hogy a leukémia klinikai kezelése során egy rákellenes szer hatását növeli; például ezt a funkciót kihasználva a csontvelőből akut mieloid leukémiás sejteket szabadít fel, ezzel növelve a leukémia elleni rákellenes szer hatását.

A leukémia ellenszerei közül, amelyek a találmány szerinti monoklonális antitestet hasznosítják, magától értetődik, hogy egy specifikus rendszer létrehozása annak gyógyhatású szerként való hasznosítására - mely gyógy3

HU 220 778 Bl szer növeli egy leukémia elleni rákellenes szer hatását valamint a találmány szerinti monoklonális antitest módosítása és alkalmazása, a találmány igényelt oltalmi körébe tartoznak, amennyiben mindezek a gyakorlatban szakember számára ismert módszerrel kivitelezhetők.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.

Az 1. ábrán egy immunfluoreszcenciás vizsgálat látható (kontrollmérés az antitest távollétében, CF-1sejtek).

A 2. ábrán a GSPST-1 antitest CF-l-sejtekhez való kötődési tulajdonságainak immunfluoreszcenciás vizsgálata látható.

A 3. ábrán a HMS-1 antitest CF-l-sejtekhez való kötődési tulajdonságainak immunfluoreszcenciás vizsgálata látható.

A 4. ábrán egy immunfluoreszcenciás vizsgálat látható (kontrollmérés az antitest távollétében, csontvelősejtek).

Az 5. ábrán a GSPST-1 antitest csontvelősejtekhez való kötődési tulajdonságainak immunfluoreszcenciás vizsgálata látható.

A 6. ábrán a HMS-1 antitest csontvelősejtekhez való kötődési tulajdonságainak immunfluoreszcenciás vizsgálata látható.

A 7. ábrán a találmány szerinti monoklonális antitestek (GSPST-1) csontvelő-átültetést gátló sajátságát kimutató vizsgálati eljárás látható.

A 8. ábrán a találmány szerinti monoklonális antitestek (HMS-1) csontvelő-átültetést gátló sajátságát kimutató vizsgálati eljárás látható.

A következőkben a találmány szerinti megoldást az alábbi példák és referenciapéldák alapján részletesebben is ismertetjük, anélkül azonban, hogy a találmány oltalmi körét az alábbi példákra korlátoznánk.

Referenciapélda

Léperedelű kötőszöveti vázsejtek előállítása és jellemzőik

1. Léperedetű kötőszöveti vázsejtek előállítása

Egy léperedetű kötőszöveti vázsejtvonalat - amely hematopoetikus őssejteket serkentő képességgel bír állítottunk elő C57BL/6J egér lépsejtjeiből készült elsődleges kultúrából. A C57BL/6J egérnek 5 napon keresztül 100 pg/kg rG-CSF-et adtunk be.

Nevezetesen az állat lépét az rG-CSF beadása után csíramentes körülmények között eltávolítottuk, 25 cm²es műanyag flaskában (Corning Co.) tenyésztettük 6 héten keresztül, Isocove szerint módosított Dulbecco-féle tápoldatban (IMDM) (Boehringer-Mannheim Co.)

10% hőinaktivált boqúszérum (FBS) (Sanco Junyaku, Tokyo), 100 egység/ml (E/ml) penicillin és 100 pg/ml sztreptomicin jelenlétében 37 °C-ra temosztált 5% CO₂-t tartalmazó inkubátorban. A táptalajt hetente kétszer friss sejttenyésztő tápoldatra cseréltük.

A konfluens kultúrában a kitapadó sejtpopulációt (kötőszöveti vázsejteket) 0,05% tripszin alkalmazásával 0,02% EDTA hozzáadásával, Ca- és Mg-mentes PBS-ben gyűjtöttük be, és vittük át új flaskákba. Ezeket az átviteleket egy vagy két alkalommal ismételtük meg hetente. A korai passzálások során (1-10. átvitel) a megosztási arány 1/4 és 1/8 között volt, míg később 1/16 és 1/32 között. A kötőszöveti vázsejtek körülbelül a 10. átvitel után váltak homogénné és fíbroblasztszerűvé. A 20. átvitel táján ezeket a kötőszöveti vázsejteket a fentiek szerint begyűjtöttük, és a határhígítási eljárás segítségével klónozásnak vetettük alá őket. A klónozást kétszer megismételtük ahhoz, hogy kötőszöveti vázsejtvonalat nyerjünk (CF-l-sejtvonal).

Ezeket a sejteket ezután 10% hőinaktivált FBS-sel kiegészített 5 ml IMDM-ben tartottuk fent, 25 cm^{1 2}-es flaskában (Corning Co.), és ötnaponta továbbtenyésztettük 1/32 hasadási aránynál. Léperedetű kötőszöveti vázsejtvonalakat egértől eltérő állatokból is létre lehet hozni; emberi léperedetű kötőszöveti vázsejtvonalat szintén létre lehet hozni a fent leírttal azonos módszer alkalmazásával, a sejteket SV-40 adenovírus-vektorral transzformálva [J. Cell. Physiol. 148, 245, (1991)].

2. A CF-l-sejtek jellemzői

A fent leírt módon sejtvonal formájában előállított CF-l-sejteket megvizsgáltuk alkalikus foszfatázra, β-glükuronidázra, α-naftil-acetát-észterázra és olajvörös O-ra standard citokémiai eljárásokat alkalmazva. A CF-lsejteket immunenzimatikus hisztokémia segítségével is jellemeztük, a következő monoklonális és poliklonális antitestek alkalmazásával: maci (Sero Tec.), VlII-as faktor-függő antigén (Dakopatts), I-es típusú és ΙΠ-as típusú kollagén, valamint fibronektin (Chemicon International Inc.). A fagocitózist latexgyöngyfelvétel segítségével teszteltük (részecskeátmérő: 1,09 pm, Sigma), a CFl-sejtek adipocitává átalakuló képességét pedig úgy, hogy 10^-6 mol/dm³ hidrokortizon-foszfát (Sigma) hatásának tettük ki őket az konfluens kultúra létrehozása után négy héten keresztül egy 25 cm²-es flaskában.

Eredményképpen a CF-l-sejtek alkalikus foszfatázra, macl-re, VlII-as faktor-függő antigénre és fagocitózisra negatívaknak bizonyultak, I-es típusú és III-as típusú kollagénre, valamint fibronektinre pedig pozitívak voltak. A CF-l-sejtek nem alakultak át adipocitákká négy hét alatt konfluens kultúrában, 10~⁶ mol/dm³ hidrokortizon jelenlétében, bár a CF-l-sejtek csupán nyomokban tartalmaztak lipideket. Ezekből az adatokból azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a CF-l-sejtek jellemzői nem azonosak a preadipocitákéval, makrofágokéval és endotél sejtekével, és így nyilvánvalóvá vált, hogy ezektől különböző kötőszöveti vázsejtekből származnak.

3. Hematopoetikus őssejtek fenntartása CF-l-sejtek segítségével

Ahhoz, hogy megvizsgálhassuk, vajon a hematopoetikus őssejteket a CF-l-sejtek fenntartják-e vagy sem, CFU-S vizsgálati eljárást alkalmaztunk (a lép kolóniaformáló sejtjeinek mérésére szolgáló eljárás) Till és McCulloch eljárása szerint. Csoportonként tíz egeret sugároztunk be 900 cGy-al, (MBR-1520R, Hitachi, Tokyo) és injektáltunk intravénásán csontvelő eredetű mononukleáris sejtekkel (BM-sejtekkel) (l,0xl0⁵/fej, 5,0x10⁴/fej vagy 2,5xlO⁴/fej) és CF-l-sejtekkel (l,0xl0⁵/fej), és a

HU 220 778 Bl

12. napon CFU-S-kolóniákként megszámoltuk a lépben a kolóniákat (a továbbiakban: lépkolóniák).

Ez azt eredményezte, hogy amikor a csontvelői mononukleáris sejteket (BM-sejtek) és a CF-l-sejteket átültettük a besugárzott egerekbe, a BM-sejtek minden csoportjában a lépkolóniák száma jelentősen emelkedett (1,4-1,8-szorosára) azokhoz az egerekhez képest, amelyekbe nem ültettünk CF-l-sejteket. Ezenkívül 12 nappal a transzplantáció után a BM-sejtekkel és a CF-1-sejtekkel transzplantált egerek túlélési aránya magasabb volt, mint azoké, amelyekbe csupán BM-sejteket ültettünk és amelyekre lassú elhalálozás volt a jellemző. így tehát nyilvánvalóvá lett, hogy a CF-l-sejtek fenntartják a hematopoetikus őssejtet.

Az alábbiakban részletesen leírjuk a találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási módját.

1. példa

Monoklonális antitestek létrehozása

1. Antigének és immunizálás

Az immunizálást a fenti referenciapélda szerint kapott CF-l-sejtek antigénként való alkalmazásával végeztük el. A sejtekből készült kultúrát egy inkubátorban tenyésztettük tovább, 5% CO₂ jelenlétében 37 °C-on, Isocove szerint módosított Dulbecco-féle tápoldatot alkalmazva (IMDM) (Boehringer-Mannheim Co.), - kiegészítve 10% borjúszérummal (FBS) (Sanko Junyaku) - táptalajként.

A sejteket PBS-ben oldott 1 mmol/dm³ EDTA-val kezeltük, és pipettázással távolítottuk el a tenyésztőedényből. A sejteket felszuszpendáltuk 1 mmol/dm³ EDTAban úgy, hogy a sejtek száma körülbelül 1 · 10⁷/ml legyen, és beadtuk őket egy Wistar Imamich-patkánynak (7 hetes, nőstény, „Animál Breeding Research Laboratory”, Állattenyésztési Kutatólaboratórium). 1 ml sejtet körülbelül 110⁷/ml-es koncentrációban injektáltunk az állat hasüregébe a kezdeti immunizálásnál, és ezenkívül 1 ml sejtet körülbelül 110⁷/ml-es koncentrációban adtunk be egy hónappal később. Továbbá újabb 1 ml-es körülbelül 1 · 10⁷/ml-es koncentrációjú adagokat adtunk be néhány alkalommal hónapos időközökkel, és azután, hogy a CF-l-sejtek és az immunizált patkányantitest közötti reaktivitást kimutattuk, 1 ml sejtet adtunk be körülbelül 1 · 10⁸/ml-es koncentrációban végső immunizálásként. Három nappal a végső immunizálás után a patkányt megöltük, hogy eltávolíthassuk a lépét.

2. Sejtfúzió

Miután a patkányból eltávolított lépet apróra daráltuk, az izolált lépsejteket lecentrifugáltuk, felszuszpendáltuk IMDM tápoldatban (Boehringer-Mannheim Co.), és alaposan mostuk. Másfelől azokat a sejteket, amiket 10% boqúszérummal (FBS) (Sanko Junyaku) kiegészített IMDM-ben (Boehringer-Mannheim Co.) tenyésztett Sp2/0-Agl4 egér-mielómasejtek [Natúré 276, 269-270, (1978)] révén nyertünk,ugyanazon a módon mostuk a fenti IMDM tápoldatban és belőlük 1 10⁸-t, valamint 2 · 10⁸-t a fenti lépsejtekből egy centrifugacsőbe tettünk, és összekevertünk, hogy polietilénglikol

4000 (Nakarai Kagaku) segítségével sejtfúziót érjünk el a szokványos eljárás szerint [Clin. Exp. Immunoi. 42, 458-462 (1980)].

Ezután a kapott fuzionált sejteket elosztottuk egy 96 mélyedést tartalmazó lemezen 20% FBS-sel kiegészített IMDM tápoldattal együtt, és 5% CO₂ jelenlétében 37 °C-on tenyésztettük őket egy inkubátorban. Másnap fokozatosan HAT szelekciós tápoldatba vittük át őket, és folytattuk a tenyésztést.

A kultúra elindításától kezdve a felülúszót hetente kétszer új HAT tápoldatra cseréltük, hogy folytathassuk a tenyésztést és fenntartsuk a proliferációt. Ezután a kapott fuzionált sejteket a szokványos módszer szerint, határhígítási eljárást alkalmazva klónoztuk. Nevezetesen csupán az antigénekhez erősen kötődő kiónokat klónoztuk a határhígítás szokványos módszerével. Az antigénekhez való kötési tulajdonságaikat a fenti fuzionált sejtek felülúszójában található antitesteket felhasználva vizsgáltuk meg.

3. Szkrínelés

A fuzionált sejtek (hibridómák) szkrínelését áramlási citometria („flow cytometry”) alkalmazásával az indirekt fluoreszcens antitest technika segítségével végeztük el.

A találmány célját képező antitesteket termelő kiónok szkrínelését a CF-l-sejteket mint célsejteket („target” sejteket) alkalmazva végeztük el. Nevezetesen a sejteket úgynevezett reakciópufferben szuszpendáltuk fel (PBS 2% FBS-sel és NaN₃-dal kiegészítve), lecentrifugáltuk, felszuszpendáltuk 100 μΐ hibridómatenyészetből származó felülúszóban (körülbelül 1 · 10⁶/100 μΐ), és 1 órán keresztül 4 °C-on reagáltattuk. Miután egyszer mostuk a fenti pufferrel, egy FITC-cel jelölt kecske anti-patkány IgG (FC) antitestet (Chemicon) adtunk hozzá, és 1 órán keresztül reagáltattuk. Miután egyszer mostuk, áramlási citometriával analizáltuk (FACScan, Becton Dickinson).

4. Az antitestek tisztítása

A fuzionált sejteket 3. szerint szkrineltük, szokványos eljárással tenyésztettük, és a felülúszók termelte antitesteket szokványos módon szeparáltuk és tisztítottuk.

Nevezetesen a hibridómákat a mélyedésekből az antigénre nézve nagy antitesttiterrel nyertük vissza, műanyag szövettenyésztő edényben szélesztettük (Corning Co), 5% CO₂ jelenlétében, 37 °C-on hagytuk proliferálni, és szokványos tisztítási eljárással megkapta a GSPST-1 és a HMS-1 monoklonális antitesteket.

Ezúttal, tekintettel a GSPST-1 és a HMS-1 monoklonális antitestekre a kapott sejteket egy BALB/cAJclnu „nude” egér (8 hetes, hím, Nippon Kurea) hasüregébe injektáltuk, az aszciteszt 10-14 nap múlva nyertük vissza, 33%-os ammónium-szulfáttal kisóztuk, majd PBS ellenében dializáltuk.

Megjegyezzük, hogy a fenti példában azt az esetet írtuk le, amikor a CF-l-sejteket használtuk immunizálásra antigénként; lehetséges azonban ugyanezen a módon előállítani monoklonális antitestet akkor is, ha más léperedetű kötőszöveti vázsejteket alkalmazunk, pél5

HU 220 778 Bl dául emberi léperedetű kötőszöveti vázsejtekből származó hematopoetikus szövet kötőszöveti vázsejtvonalait is. Az igényelt oltalmi kör nem korlátozódik a fenti monoklonális antitestre, hanem kiterjed minden olyan monoklonális antitestre, melynek jellemzői azonosak a fentivel, és hasonló módon készült, valamint minden hibridómára, amely ilyen monoklonális antitesteket termel.

A találmány szerinti HMS-1 monoklonális antitestet termelő hibridóma egy új fuzionált sejt, amely egy Wistar Imamich-patkány lépsejtjéből és SP2/0-Agl4 egér-mielómasejtvonal egy sejtjéből - mint szülői sejtekből - van preparálva, és 1993. augusztus 9-én lett letétbe helyezve HMS-1 (patkány-egér hibridóma) néven FERM BP1383-as deponálási számon a következő intézménynél: National Institute of Bioscience and Humán Technology, Agency of Industrial Science and Technology of Japan (Biológiai és Humántechnológiai Nemzeti Intézet, Japán Ipari Tudományos és Technológiai Ügynökség, cím: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305, Japan), amely a szabadalmi eljárások céljából letétbe helyezett mikroorganizmusok nemzetközi elismeréséről szóló Budapesti Egyezmény szerinti nemzetközi letéti szerv.

5. Az antitestek tulajdonságai (i) Az antitestek reaktivitása (Reaktivitás CF-l-sejtekkel)

A kapott GSPST-1 és HMS-1 monoklonális antitestek CF-l-sejtekkel való reaktivitása immunfluoreszcenciás analízissel végzett vizsgálatának eredménye az 1-3. ábrákon látható. Ezek közül az 1. ábrán egy kontroll (amelyből hiányzott az antitest) analízisének eredménye látható, a 2. ábrán a GSPST-1 CF-1-sejtekhez való kötődési tulajdonságainak analízise látható, majd a 3. ábrán a HMS-1 CF-l-sejtekhez való kötődési tulajdonságainak analízise látható. Az ábrákon a vertikális tengelyek a sejtek relatív számát, a vízszintes tengelyek a fluoreszcenciaintenzitást ábrázolnak.

Amint az 1-3. ábrából nyilvánvaló, kiderült, hogy a GSPST-1 és a HMS-1 monoklonális antitesteknek tulajdonsága a CF-l-sejtekhez való kötődés, és felismerik a CF-l-sejtek felszíni antigénjeit.

(Reaktivitás csontvelősejtekkel)

A továbbiakban, a 4-6. ábrán a GSPST-1 és a HMS-1 csontvelősejtekkel való reaktivitásának áramlási citometriával („flow cytometry”) (FACScan, Becton Dickinson) végzett analízise eredményei láthatók. Ezek közül a 4. ábrán egy kontroll (amelyből hiányzott az antitest) analízisének eredménye látható, az 5. ábrán a GSPST-1 csontvelősejtekhez való kötődési tulajdonságainak analízise látható, majd a 6. ábrán a HMS-1 csontvelősejtekhez való kötődési tulajdonságainak analízise látható. Az ábrákon a vertikális tengelyek a sejtek relatív számát, a vízszintes tengelyek a fluoreszcenciaintenzitást ábrázolnak.

Amint az a 4-6. ábrából nyilvánvaló, kiderült, hogy a GSPST-1 egyáltalán nem kötődik a csontvelősejtekhez, a HMS-1 monoklonális antitestek azonban kötődnek a csontvelősejtek egy részéhez.

(ii) Az antitestek tipizálása

Ezután, a kapott monoklonális antitestek IgG alosztálytípusokba sorolásának eredményeképpen - amit patkány „Mono Ab-ID-Sp” reagenskészlet (Zymed) segítségével végeztünk el - nyilvánvalóvá lett, hogy a GSPST-1 az IgG2a, a HMS-1 pedig az IgG2b alosztályba tartozik.

(iii) Csontvelő-átültetés gátlása

Ezután végrehajtottunk egy kísérletet melyben a csontvelő-átültetés gátlását vizsgáltuk a fenti antitestek alkalmazásával, hogy megvizsgálhassuk ilyen irányú jellemzőiket Az eredmények a 7. és a 8. ábrán láthatók. A 7. és a 8. ábrából nyilvánvaló, hogy míg a HMS-l-nek van csontvelő-átültetést gátló hatása, ezt a hatást a GSPST-1-nél nem találtuk meg. Nevezetesen a fenti eredményeket úgy kaptuk, hogy l,0 10⁵/fej csontvelősejtet és monoklonális antitesteket adtunk be C57BL/6J egérnek, besugároztuk a sugárzás halálos dózisával (900 cGy) a farokvénákon keresztül, és figyeltük a lépkolóniák keletkezését. Megjegyezzük, hogy a „nem kezelt” a 8. ábrán azt az esetet mutatja, amikor nem adtunk be csontvelősejteket. Ezek szerint, mivel a találmány szerinti HMS-1 antitestekről a fenti kísérlettel kimutattuk, hogy gátolják a csontvelő-átültetést, nyilvánvaló, hogy az antitest gátolja a hematopoetikus őssejtek letelepedését („homing”), valamint a CFU-S kolóniák keletkezését.

Megjegyezzük, hogy szakember számára nyilvánvaló, hogy a monoklonális antitestek csontvelő-átültetést gátló hatása megfelel a hematopoetikus őssejtek letelepedését gátló, és a CFU-S kolóniák kialakulását gátló aktivitásnak. Például, az egy ismert hízósejtvonal antigénként való felhasználásával előállított ACK-2 monoklonális antitestről (amely egyike a C-reagenskészlet antitestjeinek) leírták, hogy egérben csontvelő-átültetést gátló funkciója van, hasonlóan a találmány szerinti monoklonális antitestekhez [Blood 78, 1706 (1991)]. Az idézett publikációban a csontvelő-átültetés gátlásával kapcsolatos kísérlet eredményei alapján a szerzők arra a következtetésre jutnak, hogy az antitest gátolja a hematopoetikus őssejtek letelepedését és a CFU-S kolóniák keletkezését.

A fent említett ACK-2 antitestet hízósejteket antigénként használva készítették el, a hízósejt pedig egy, a hematopoetikus őssejtből differenciálódás és proliferáció útján keletkezett hematopoetikus sejt. Másfelől a hematopoetikus szövet kötőszöveti vázsejtje, amelyet a találmány szerinti megoldásban alkalmaztunk nem hematopoetikus sejt, hanem egy hematopoetikus sejt differenciálódását és proliferációját elősegítő sejt, tehát a kettő határozottan eltér egymástól.

Ezután megmutattuk, hogy amikor egy HMS-1 termelő hlbridómát egy „nude” egér hasüregébe juttattunk be, az egér nem pusztult el az aszcitesz hordozása miatt. Ebből arra következtettünk, hogy a HMS-1 csontvelőátültetést gátló hatása nem az úgynevezett apoptózisnak köszönhető jelenség. (Az apoptózist a sejtek önpusztításának is nevezik, ennek során a nukleáris kromatin DNS egy nukleoszóma egységnél megemésztődik - úgynevezett létraképződés -, ami a sejtek pusztulásához vezet.) Ellenkezőleg, olyan jelenségről van szó, amelyet a mo6

HU 220 778 Bl noklonális antitestnek a hematopoetikus őssejteknek a hematopoetikus szöveten való letelepedését elősegítő molekulához való kötődése okoz. Ebből nyilvánvaló, hogy az antigén, amelyet a HMS-1 felismer, a hematopoetikus őssejteknek a hematopoetikus szöveten való letelepedésében fontos szerepet játszó anyag.

Amint azt a fenti kísérlet során felismertük, a találmány szerinti HMS-1 monoklonális antitest léperedetű kötőszöveti vázsejtek felszíni antigénjeit ismeri fel, amely vázsejtek képesek elősegíteni a hematopoetikus őssejtek letelepedését, és így az antitest jellemzője a hematopoetikus őssejtek letelepedésének gátlása.

így, a HMS-1 képes gátolni a csontvelősejtek letelepedését a hematopoetikus szöveten; leírták, hogy a VLA4 és a VLA5 adhéziós molekulák (hematopoetikus sejtek adhéziós molekulái) expressziója csökkenésének megfelelően a csontvelőből leukémiás sejtek szabadulnak fel [„VLA molecule expression may be involved in the release of acute myeloid leukaemic cells from the boné marrow” (VLA-molekula expressziója szerepet játszhat az akut mieloid leukémiás sejtek csontvelőből való felszabadításában), Leuk. Rés. 16, 469-474 (1992)], és feltételezhető, hogy a VLA4 és a VLA5 elleni monoklonális antitestek javítják a leukémia elleni szerek hatását azáltal, hogy leukémiás sejteket szabadítanak fel a csontvelőből. Ezért tehát a fenti HMS-1 hasonlóképpen alkalmazható lehet ugyanezt a hatást elérve a leukémia előzetes kezelésében.

A fenti 1. példában egy specifikus találmány szerinti monoklonális antitest leírását adtuk meg. A találmány szerinti monoklonális antitestek körébe tartozik tehát a fenti példában ismertetett ellenanyag, de oltalmi igényünket nem korlátozzuk kizárólag erre, hanem kiterjesztjük minden olyan monoklonális antitestre, melyeknek tulajdonságai és funkciói azonosak, és amelyek hasonló módon lettek előállítva.

Ipari alkalmazhatóság

Mivel a találmány szerinti monoklonális antitestek a csontvelősejtek hematopoetikus szöveten való letelepedése („homing”) szempontjából fontos anyagot ismernek fel antigénként, és jellemzőjük az, hogy a hematopoetikus őssejtek letelepedését gátolni képesek, ezért olyan gyógyhatású szerként alkalmazhatók, melynek funkciója valamely rákellenes szer hatásának növelése - például egy leukémia elleni rákellenes szer hatásának növelése - azáltal, hogy a csontvelőből akut mieloid leukémiás sejteket szabadít fel említett sajátságának megfelelően.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Monoklonális antitest, amely gátolja a hematopoetikus őssejtek letelepedését („homing”) és felismeri egy, a hematopoetikus őssejtek letelepedését elősegíteni képes léperedetű kötőszöveti vázsejt letelepedést elősegíteni képes felszíni antigénjét, amely antitest egy antigénként rG-CSF-fel kezelt állatlép-eredetű vázsejtjei ellen lett termeltetve.
2. Hibridóma, amely 1. igénypont szerinti monoklonális antitestet termel.
3. Az 1. igénypont szerinti monoklonális antitest, amely nem reaktív a csontvelő-eredetű vázsejteken található c-kit molekulával (az ACK-2 antitest antigénmolekulájával) és a mintegy 100 kD-os molekulával (az R4-R9 antitest antigén-molekulájával) szemben.
4. Az 1. igénypont szerinti monoklonális antitest, amely specifikusan kötődik a HMS-1 antitesttel reagáló léperedetű vázsejtek egy epitópjához.
5. Az 1. igénypont szerinti monoklonális antitest, amely specifikusan kötődik a HMS-1 antitesttel reagáló léperedetű vázsejtek azon epitópjához, melyhez a HMS-1 antitest kötődik.
6. Leukémia kezelésére szolgáló rákellenes hatóanyag, amely aktív összetevőként 1. igénypont szerinti monoklonális antitestet tartalmaz.
7. A 2. igénypont szerinti hibridóma, amely a FERM BP-4383 számon letétbe helyezett hibridóma.