WO1995006747A1 - Anticorps monoclonal reconnaissant des antigenes de surface de cellules interstitielles - Google Patents

Anticorps monoclonal reconnaissant des antigenes de surface de cellules interstitielles Download PDF

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Naoshi Fukushima
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel monoclonal antibody that inhibits hematopoietic stem cell engraftment and recognizes splenic stromal cells having the ability to support hematopoietic stem cell engraftment, and further relates to a hybridoma producing the monoclonal antibody. It is about.
  • the monoclonal antibody of the present invention has a property of recognizing, as an antigen, a substance important for bone marrow cells to engraft hematopoietic tissue and inhibiting the engraftment of hematopoietic stem cells. It is useful as a drug that has the effect of enhancing the efficacy of an anticancer drug, such as releasing leukemia cells from the bone marrow using the drug and improving the therapeutic effect of the anticancer drug on leukemia.
  • granulocyte colony stimulating factor for example, recombinant granulocyte colony stimulating factor (rG-CSF) is a humoral factor that mainly promotes the differentiation and proliferation of granulocyte cells.
  • rG-CSF recombinant granulocyte colony stimulating factor
  • administration of this rG-CSF not only promoted hematopoiesis in the bone marrow, but also caused marked extramedullary hematopoiesis in the spleen and all hematopoiesis including hematopoietic stem cells.
  • Progenitor cells have been reported to grow in the spleen.
  • hematopoiesis was induced by stimulation of rG-CSF, which changed the hematopoietic microenvironment of the spleen and enhanced the ability to support hematopoiesis. . .
  • hematopoietic stromal cell line (CF-1 cell) was established from the spleen of a mouse to which rG-CSF was continuously administered, and the hematopoietic stromal cells were used using the hematopoietic stromal cells.
  • CF-1 cells cell lines
  • the present inventors have developed a specific antibody capable of identifying splenic stromal cells having the ability to support hematopoietic stem cell engraftment based on the above-mentioned findings on splenic stromal cells and the results of previous research.
  • a spleen stromal cell capable of supporting hematopoietic stem cell engraftment as a cell line and producing a monoclonal antibody using the spleen stromal cell line as a sensitizing antigen
  • a novel monoclonal antibody was obtained.
  • the obtained monoclonal antibody recognizes the surface antigen of spleen stromal cells having the ability to support hematopoietic stem cell engraftment, and has the property of inhibiting the engraftment of hematopoietic stem cells. This led to the completion of the present invention. Disclosure of the invention
  • the monoclonal antibody of the present invention relates to a novel monoclonal antibody against a surface antigen of splenic stromal cells (splenic stromale Is) capable of supporting hematopoietic stem cell engraftment, and enhances the spleen hematopoietic function. It is an antibody that recognizes splenic stromal cells, which is greatly involved in erythrocytes, and is extremely useful as a function of inhibiting the engraftment of hematopoietic stem cells.
  • the engraftment of hematopoietic stem cells as used herein means that hematopoietic stem cells are homed by hematopoietic stromal cells and differentiate and proliferate as CFU-S colonies.
  • Such a monoclonal antibody of the present invention can be basically produced, for example, as follows.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used, for example, to sensitize splenic stromal cells of animals to which rG-CSF has been administered, such as CF-1 cells, which are splenic stromal cells established by the present inventors as cultured cell lines.
  • this is immunized by applying a normal immunization method
  • cell fusion is performed by applying a normal cell fusion method
  • cloning is performed by applying a normal cloning method. It can be manufactured by the following.
  • the method for producing the monoclonal antibody of the present invention is, for example, the CF-11 cell established by the present inventors as a cultured cell line (Blood, Vol. 80, 1914 (1992)], fusion of mammalian morphological cells (immune cells) immunized with the sensitizing antigen with mammalian myeloma cells such as mice,
  • the obtained fused cells (Hypridoma) are cloned, and a clone producing the antibody of the present invention that recognizes the cell line is cloned from the cloned cells.
  • a method of selecting and culturing this to recover the desired antibody is exemplified as a suitable method.
  • the sensitizing antigen is not limited to the CF-1 cell but may be obtained in accordance with the case of CF-1 cell.
  • Other hematopoietic stromal cell lines or hematopoietic stromal cell lines derived from human spleen stromal cells can also be used as appropriate. Can be made.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but may be determined in consideration of compatibility with the myeloma cells used for cell fusion. It is preferable to select, and generally, mouse, rat, hamster and the like are used as suitable ones.
  • immunization is performed by a general method, for example, by administering a spleen stromal cell such as the CF-11 cell to a mammal by intraperitoneal injection or the like. More specifically, it is preferable to administer several times a month to animals diluted and suspended in an appropriate amount with PBS or physiological saline.
  • spleen cells extracted after the final administration of the cell line are preferably used.
  • the cell fusion between the immune cells and the myeloma cells is basically performed by a usual method, for example, the method of Mirushiutain et al. (Mi 1 steineta 1.) [Methods Enzymol., 73, 3-4 6 (1981)]].
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient medium in the presence of a fusion promoter.
  • a fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like are used, and if necessary, an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be appropriately added and used to enhance the fusion efficiency.
  • the ratio of the use of the immune cells and the myeloma cells is preferably, for example, about 1 to 10 times that of the myeloma cells, and the medium used for the cell fusion is, for example,
  • RPM1-1640 medium, MEM medium, and other normal mediums used for cell culture of this type, which are suitable for the growth of the myeloma cell line can be used.
  • bovine fetal serum (FBS ) Can also be used in combination.
  • FBS bovine fetal serum
  • a PEG solution for example, PEG having an average molecular weight of about 0000 to 6,000 is usually added to the medium at a concentration of about 30 to 60% (W / V), and mixed. Subsequently, the desired hybridoma is formed by repeating the operation of successively adding an appropriate medium and centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma is selected by culturing it in a normal selection medium, for example, a HAT medium (a medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine).
  • a HAT medium a medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine.
  • the culture in the HAT medium is continued for a period of time sufficient to kill cells (unfused cells) other than the target hybridoma, usually several days to several weeks.
  • normal limiting dilution According to the method, screening and monocloning of hybridomas producing the desired antibody are performed.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention thus produced can be subcultured in a normal medium, and can be stored for a long time in liquid nitrogen. It is.
  • a method of culturing the hybridoma according to a conventional method and obtaining the culture supernatant, or converting the hybridoma to a mammal compatible therewith is used.
  • Appropriate methods such as a method of administering and proliferating and obtaining from the ascites fluid are adopted.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • the antibody obtained by the above-mentioned method can be purified to a high purity by applying ordinary purification means such as a salting-out method, a gel filtration method, and an affinity chromatography.
  • the monoclonal antibody of the present invention thus produced has a function of inhibiting the engraftment of hematopoietic stem cells, it is used to release leukemic cells from the bone marrow in the field of leukemia treatment using such a function. It can be used as a drug having an effect of enhancing the efficacy of an anticancer agent, such as improving the therapeutic effect of leukemia by an anticancer agent.
  • FIG. 1 shows the analysis by immunofluorescence (control in the absence of antibody).
  • FIG. 2 shows the analysis of the binding between GSPST-1 antibody and CF-11 cells by immunofluorescence.
  • FIG. 3 shows analysis of the binding between HMS-1 antibody and CF-1 cells by immunofluorescence.
  • FIG. 4 shows an analysis by immunofluorescence (control in the absence of antibody).
  • FIG. 5 shows the analysis of the binding between the GSPST-1 antibody and bone marrow cells by immunofluorescence.
  • FIG. 6 shows the analysis of the binding between HMS-1 antibody and bone marrow cells by immunofluorescence.
  • FIG. 7 shows a bone marrow transplantation inhibition test (GSPST-1) of the monoclonal antibody of the present invention.
  • FIG. 8 shows a bone marrow transplantation inhibition test (HMS-1) of the monoclonal antibody of the present invention.
  • HMS-1 bone marrow transplantation inhibition test
  • a spleen stromal cell line capable of supporting hematopoietic stem cell engraftment was established from primary culture of spleen cells of C57BL / 6J mice treated with rG-CSF100 1gZkg for 5 days. . That is, after administration of rG-CSF, the spleen was excised under sterile conditions, cultured in a 25 cm 2 plastic flask (manufactured by Corning) for 6 weeks, and then 10% inactivated serum (FBS) (Sanko Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • FBS inactivated serum
  • stromal Cells From confluent cultures, 0.05% trypsin + 0.02% ⁇ ⁇ TA (manufactured by Sigma Chemical) and Ca-Mg-iree PBS using an adherent cell population (stromal Cells) were collected and transferred to another flask. This subculture was repeated about 1-2 times a week. The splitratatio of the cells in the first subculture (1st to 10th times) was 14 to 1 8 and the ratio thereafter was 1 Z 16 to 13 2. After about the 10th subculture, the stromal cells became homogeneous fibroblast-like. At the 20th passage, stromal cells were collected by the method described above, and cloning of the cells was repeated twice using the limiting dilution method to establish a stromal cell line (CF-1 cell line).
  • CF-1 cell line limiting dilution method
  • spleen stromal cell lines can be established for other mammals. For example, in the case of humans, if cells are transformed with SV-40 adenovirus vector, the same It is possible to establish a human spleen stromal cell line by the method [J. Cell. Physio 1., 148, 245 (1991)]
  • alkaline phosphatase, acid phosphatase, 8-glucuronidase, ⁇ -naphthylfa were prepared using standard cytochemical techniques. Cetite esterase and oil red 0 were searched and their properties were examined by immunoenzyme histochemistry using the following monoclonal and polyclonal antibodies: Mac I (SeroTec., Inc.).
  • CF-1 cells were negative for alkaline phosphatase, factor VIII-related antigen, Mac I and phagocytosis, but positive for type I collagen, type III collagen and fibronectin. there were.
  • CF- 1 cells are faintly including re pit de, 1 0 - did not differentiate into adipocytes also by the 6 m 0 1/1 in Hyde port Konfuruen preparative culture 4 weeks of cortisone presence.
  • CFU-S assay serum marrow mononuclear cells (BM cells) (1.0 Oxl0 5 zh ead, 5. 0 xl 0 4 zh ead or 2. 5 x 1 0 4 / head ) and CF- 1 cells (1. 0 x 1 0 5 zh ead) injected intravenously, 1 day 2 in the spleen The number of colonies was counted and designated as CFU-S (spleen colony).
  • BM cells bone marrow mononuclear cells
  • CF-1 cells CF-1 cells
  • the antigen sensitization was performed using the CF-1 cells obtained in the above Reference Example as the sensitizing antigen.
  • the cell lines used were 10 bovine fetal serum (FBS, Sanko Junyaku) and Isc0Ve modified Du1becc0 medium (IMDM) (Boehringer-Mannheim) as medium.
  • IMDM Isc0Ve modified Du1becc0 medium
  • the cells were treated with 1 mM EDTA and PBS, and then recovered from the culture flask by light pipetting.
  • the cells were suspended cell count of approximately 1 X 1 0 7 or Zm 1 to I mM EDTA 'PBS, resuspended, W istar I m am ich system rats (7 weeks old, half, Animal Breeding Laboratories) in Immunized.
  • mice 'myeloma cell line Sp20-Ag14 (Nature, 276, 269-270 (19778)) was converted to 0.10% fetal bovine serum (FBS,
  • I MDM manufactured by Boehringer-Mannheim
  • FBS fetal bovine serum
  • the cells obtained by culturing in an I MDM (manufactured by Boehringer-Mannheim) medium containing Sanko Junyaku Co., Ltd.) were similarly washed with the IMDM medium, and 1 ⁇ 10 8 the splenocytes 2 X 1 0 to 8 and placed and mixed in a centrifuge tube, a conventional method by polyethylene glycol 4 0 0 0 (Nacalai Kagaku) [C li n. E x p. I mmu nol., 4 2 , 458-46 2 (19
  • the obtained fused cells was dispensed into 9 6 Uerupure bets at I MDM medium containing 2 0% FBS min were cultured at 3 7 ° C in 5% C_ ⁇ 2 b Nkyubeta scratch. From the next day, the culture was continued by gradually replacing the medium with a HAT selection medium.
  • the supernatant was replaced with a fresh HAT medium twice a week, and the culture was continued to maintain the growth.
  • the fusion cells thus obtained were cloned by a conventional method using a limiting dilution method. That is, the antibody in the culture supernatant of the fused cells is used to examine the binding property to the sensitizing antigen, and only clones having strong binding property to the sensitizing antigen are cloned by the limiting dilution method using a conventional method. I did it.
  • the fused cells screened in the above 3) were cultured in a conventional manner, and the antibody produced in the culture supernatant was separated and purified in a conventional manner.
  • the High Priestess dormer from antibody titers high and was Ueru for the sensitizing antigen were taken out of the Ueru, 3 7 ° spread in a tissue culture plastic Kdei Mesh (C manufactured by 0 Rning Inc.) in 5% C 0 2
  • the cells were subcultured in C, expanded, and purified by a conventional method to obtain the monoclonal antibodies GSPST-1 and HMS-1.
  • HMS- 1 antibodies and GS P ST- 1 is obtained BAL BZC the cells underwent Pris Yun administration AJ cl - nu system Nu nude mice (8 week old, sigma 71, manufactured by Nippon click Rare Inc. 10 to 14 days later, the produced ascites was collected, salt-broken with 33% ammonium sulfate, and dialyzed against PBS.
  • the case where the CF-1 cells were used as the sensitizing antigen was exemplified, but other spleen cells including the hematopoietic stromal cell line derived from human spleen stromal cells were used. It is also possible to produce a monoclonal antibody in the same manner when using a cytoplasmic cell, and the present invention is not limited to the above-described monoclonal antibody, and all the monoclonal antibodies having similar properties produced in the same manner can be produced. O, and all hybridomas producing the monoclonal antibody.
  • the hybridoma that produces the monoclonal antibody HMS-1 of the present invention is a rat imamich-type rat splenocyte and mouse mimetic.
  • the monoclonal antibodies GSPST-11 and HMS-1 have binding properties to CF-1 cells and recognize the surface antigen of CF-11 cells. I understood that.
  • Fig. 4 shows the control in the absence of antibody
  • Fig. 5 shows the binding between GSPST-1 and bone marrow cells
  • Fig. 6 shows the binding between HMS-1 and bone marrow cells.
  • the vertical axis indicates the relative cell number
  • the horizontal axis indicates the fluorescence intensity.
  • GSPST-1 was Ig G2a and HMS-1 were found to be IgG2b.
  • HMS-1 has an inhibitory effect on bone marrow transplantation, but GSPST-1 has no such effect. That is, the lethal dose of radiation (9 0 0 c Gy) C 5 7 B LZ 6 J mice, and the 1. 0 X 1 0 5 head of bone marrow cells and monoclonal antibodies, was administered from the tail vein, the spleen Observation of colony formation yielded the above results. Note that “Non-treated” in FIG. 8 indicates a case where these were not administered.
  • the monoclonal antibody HMS-1 of the present invention also inhibits the engraftment of hematopoietic stem cells, that is, inhibits the homing of hematopoietic stem cells and the formation of CFU-S colonies, since the above experiment confirmed that bone marrow transplantation was inhibited. It is clear that.
  • the bone marrow transplantation inhibitory effect of the monoclonal antibody corresponds to the hematopoietic stem cell homing and CFU-S colony formation inhibitory activities.
  • a monoclonal antibody (ACK-2 antibody, which is one of the C-kit antibodies) prepared by using a known mast cell as an antigen is also used for bone marrow transplantation in mice as in the case of the monoclonal antibody of the present invention. [Blood, 78, 176 (1991)]], but in the report, this antibody was found to be The home of And CFU-S colony formation.
  • the above-mentioned ACK-2 antibody which is a known antibody, is prepared using mast cells as an antigen.
  • Mast cells are blood cells that have been differentiated and expanded from hematopoietic stem cells.
  • the stromal cells in the hematopoietic zone used in the present invention are not blood cells but cells that support the differentiation and proliferation of blood cells, and therefore, they are greatly different.
  • HMS-1 hematopoietic stem cells to engraft hematopoietic tissues.
  • apoptosis a phenomenon in which nuclear chromatin DNA is cleaved in units of nucleosomes (so-called ladder formation), resulting in death of cells. It is also called cell self-destruction. It is considered that this is not a phenomenon caused by the binding of a monoclonal antibody to a molecule for hematopoietic stem cells to engraft hematopoietic tissue. Therefore, it is clear that the antigen recognized by HMS-1 is an important substance for hematopoietic stem cells to engraft hematopoietic tissues.
  • the monoclonal antibody HMS-1 of the present invention recognizes the cell surface antigen of spleen stromal stromal cells capable of supporting hematopoietic stem cell engraftment and inhibits hematopoietic stem cell engraftment It has the following characteristics.
  • HMS-1 has the effect of inhibiting the engraftment of bone marrow cells into hematopoietic tissues. This is due to the fact that VLA4 and VLA5, adhesion factors of hematopoietic cells that have already been reported. It has been reported that leukemia cells are released from the bone marrow due to reduced expression. 4 7 4 (1992)), for VLA 4 and VLA 5 It is thought that the monoclonal antibody releases leukemia cells from the bone marrow and improves the therapeutic effect of leukemia. Therefore, it is considered that the same effect can be obtained by using HMS-11 as a pretreatment for leukemia treatment.
  • the monoclonal antibody of the present invention has been specifically described with reference to Examples, but the monoclonal antibody referred to in the present invention may be exemplified by those exemplified as the above specific examples. However, it is needless to say that the present invention is not limited to this, and encompasses all monoclonal antibodies having similar properties and functions produced similarly.
  • the monoclonal antibody of the present invention has a property of recognizing, as an antigen, a substance important for bone marrow cells to engraft hematopoietic tissue and inhibiting the engraftment of hematopoietic stem cells. It is useful as a drug that has the effect of enhancing the efficacy of an anticancer drug, such as releasing leukemia cells from the bone marrow using the drug and improving the therapeutic effect of the anticancer drug on leukemia.

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Description

明細書 間質細胞表面抗原を認識するモノ クローナル抗体 技術分野
本発明は、 造血幹細胞の生着を阻害し、 造血幹細胞の生着支持能 を有する脾臓間質細胞を認識する新規モノ クローナル抗体に関する ものであり、 更には、 当該モノ クローナル抗体を産生するハイプリ ドーマに関するものである。
本発明のモノ クローナル抗体は、 骨髄細胞が造血組織に生着する のに重要な物質をその抗原として認識し、 造血幹細胞の生着を阻害 する特性を有するものであることから、 例えば、 かかる特性を利用 して、 白血病細胞を骨髄内より放出させ、 抗ガン剤による白血病の 治療効果を向上させるなど、 抗ガン剤の効力を増強する作用を有す る薬剤等として有用なものである。
背景技術
従来、 顆粒球コロニー刺激因子、 例えば、 遺伝子組換え型顆粒球 コロニー刺激因子 （ r G— C S F ) は、 主に顆粒球系細胞の分化、 増殖を促進させる液性因子として知られているものであるが、 マウ スの i n v i v oの実験では、 この r G— C S Fを投与するこ と により、 骨髄の造血亢進のみならず、 脾臓でも著しい髄外造血が起 こり造血幹細胞を始めとしてすベての造血前駆細胞が脾臓で増殖す ることが報告されている。 そして、 この脾臓での髄外造血のメカ二 ズムとして、 r G— C S Fの刺激により脾臓の造血微小環境が変化 し、 造血支持能力が亢進したことにより造血が生じたものであると 考えられた。 .
そこで、 本発明者は、 この脾臓での造血機能を解明するために、 r G— C S F連投後の脾臓の間質細胞に着目し、 間質細胞を介した r G— C S Fによる造血機能亢進の解析を試みるべく、 r G— C S Fを連投したマウス脾臓より造血間質細胞株 （C F - 1細胞） を樹 立し、 かかる造血間質細胞を用いてその造血支持能を検討したとこ ろ、 i n v i t r oでのコロニー刺激活性および i n v i v o での造血幹細胞支持能が認められた ！: B 1 o o d， 8 0 , 1 9 1 4 ( 1 9 9 2 ) 〕 。
このような i n v i v oでの造血幹細胞支持能は、 骨髄移植の 際に当該 C F— 1細胞を造血幹細胞の骨髄細胞と同時に移植した場 合に認められることから、 前記造血間質細胞株 （C F— 1細胞） に は造血幹細胞を造血域に生着 （H om i n g) させる細胞接着因子 としての機能が発現されているものと考えられた。
しかしながら、 この造血幹細胞の生着支持能を有する脾臓間質細 胞については、 その一部が細胞株 （ C F— 1細胞） として樹立され て、 その細胞学的特性の検討等はなされているものの、 これまでに 、 その細胞表面抗原を認識する特定の抗体を作製することは全く行 われておらず、 ましてやその特性等については未だ全く知られてい ない状況にあつた。
そこで、 本発明者は、 脾臓間質細胞に関する前記したような知見 とこれまでの研究成果を踏まえ、 造血幹細胞の生着支持能を有する 脾臓間質細胞を識別し得る特定の抗体を開発することを目標として 鋭意研究を積み重ねる中で、 造血幹細胞の生着支持能を有する脾臓 間質細胞を細胞株として樹立すると共に、 当該脾臓間質細胞株を感 作抗原として使用してモノ クローナル抗体を作製したところ、 新規 モノ クローナル抗体が得られた。
そして、 この取得されたモノ クローナル抗体は、 造血幹細胞の生 着支持能を有する脾臓間質細胞の表面抗原を認識するものものであ り、 造血幹細胞の生着を阻害する特性を有するものであることを見 い出し、 本発明を完成するに至った。 発明の開示
本発明は、 造血幹細胞の生着支持能を有する脾臓間質細胞の表面 抗原を認識し、 造血幹細胞の生着を阻害する特性を有する新規モノ ク口一ナル抗体を提供することを目的とするものであり、 更には、 当該モノ クローナル抗体を産生させるハイプリ ドーマを提供するこ とを目的とするものである。
本発明のモノ クローナル抗体は、 造血幹細胞の生着支持能を有す る脾臓間質細胞 （ s p l e n i c s t r om a l e e l I s ) の表面抗原に対する新規なモノ クローナル抗体に係るものであり、 脾臓の造血機能亢進に大き く関与している脾臓間質細胞を認識する 抗体であり、 造血幹細胞の生着を阻害する機能を有するものとして 極めて有用なものである。 尚、 ここで云う造血幹細胞の生着とは、 造血域間質細胞により造血幹細胞がホー ミ ングし、 C FU— Sコロ ニーとして分化、 増殖することを云う。
かかる本発明のモノ クローナル抗体は、 基本的には、 例えば、 次 のようにして作製することができる。
すなわち、 本発明のモノ クローナル抗体は、 例えば、 本発明者ら が培養細胞株として樹立した脾臓間質細胞である C F— 1細胞等の r G - C S F投与動物の脾臓間質細胞を感作抗原として使用して、 基本的には、 これを通常の免疫法を応用して免疫し、 通常の細胞融 合法を応用して細胞融合させ、 通常のクローン化法を応用してクロ —ン化することによって作製することができる。
本発明のモノ クローナル抗体の作製方法は、 より具体的には、 例 えば、 前記感作抗原として、 本発明者らによって培養細胞株として 樹立された前記 C F一 1細胞 〔 B l o o d, V o l . 8 0 , 1 9 1 4 ( 1 9 9 2 ) 〕 を使用し、 当該感作抗原で免疫した哺乳動物の形 質細胞 （免疫細胞） を、 マウス等の哺乳動物のミエローマ細胞と融 合させ、 得られた融合細胞 （ハイプリ ドーマ） をクローン化し、 そ の中から前記細胞株を認識する本発明の抗体を産生するクローンを 選別し、 これを培養して目的とする抗体を回収する方法が好適なも のとして例示される。 しかしながら、 本発明においては、 かかる方 法はあく まで一例に過ぎず、 例えば、 この場合、 前記感作抗原とし ては、 前記 C F— 1細胞に限らず、 C F— 1細胞の場合に準じて得 られる他の造血域間質細胞株あるいはヒ ト脾臓間質細胞由来の造血 域間質細胞株を使用することも適宜可能であり、 前記 C F一 1細胞 の場合と同様にして目的とする抗体を作製することができる。
このようなモノ クローナル抗体の作製方法において、 前記感作抗 原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが 、 細胞融合に使用する ミエローマ細胞との適合性などを考慮して選 択するのが好ましく、 一般的には、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター等 が好適なものとして使用される。
次に、 免疫は、 一般的方法により、 例えば、 前記 C F一 1細胞等 の脾臓間質細胞を哺乳動物に腹腔内注射等により投与することによ り、 行われる。 より具体的には、 P B Sや生理食塩水等で適当量に 希釈、 懸濁したものを、 動物に 1 ヶ月毎に数回投与することが好ま しい。 免疫細胞としては、 前記細胞株の最終投与後に摘出した脾細 胞を使用するのが好ま しい。
次に、 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物 のミエローマ細胞としては、 すでに公知の種々の細胞株、 例えば、 P 3 ( P 3 X 6 3 A g 8. 6 5 3 ) C J . I mmu n o l . , 1 2 3， 1 5 4 8 ( 1 9 7 8 ) 〕 、 p 3 - U l 〔 C u r r e n t T o p i c s i n M i c r o - b i o l o g y a n d I m m u n o 1 o g y , 8 1 , 1 - 7 ( 1 9 7 8 ) 〕 、 NS— 1 〔E u r . J . I mm u n o l . , 6 , 5 1 1 - 5 1 9 ( 1 9 7 6 ) 〕 、 MP C一 1 1 〔C e l l , 8 , 4 0 5 - 4 1 5 ( 1 9 7 6 ) 〕 、 S p 2 / 0 - A g 1 4 (N a t u r e, 2 7 6 , 2 6 9 - 2 7 0 ( 1 9 7 8 ) 〕 、 F O 〔J. I mmu n o l . M e t h. , 3 5， 1 - 2 1 ( 1 9 8 0 ) 〕 、 S 1 9 4 C J . E x p. M e d. , 1 4 8 , 3 1 3 - 3 2 3 ( 1 9 7 8 ) 〕 、 および R 2 1 0 [N a t u r e, 2 7 7, 1 3 1 - 1 3 3 ( 1 9 7 9 ) 〕 等が好適に使用される。
前記免疫細胞と ミエローマ細胞との細胞融合は、 基本的には通常 の方法、 例えば、 ミルシユタインら （M i 1 s t e i n e t a 1. ) の方法 [Me t h o d s E n z ym o l . , 7 3, 3 - 4 6 ( 1 9 8 1 ) 〕 等に準じて行うことができる。
より具体的には、 前記細胞融合は、 例えば、 融合促進剤の存在下 に通常の栄養培地中で実施される。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリ コール （P E G) 、 センダイウィルス （ H V J〉 等が使用され、 更に、 所望により融合効率を高めるためにジメチル スルホキシ ド等の補助剤を適宜添加使用することもできる。 免疫細 胞と ミエローマ細胞との使用割合は、 例えば、 ミエローマ細胞に対 して、 免疫細胞を 1〜 1 0倍程度とするのが好ま しい。 また、 前記 細胞融合に用いる培地としては、 例えば、 前記ミエローマ細胞株の 増殖に好適な R PM 1 - 1 6 4 0培地、 MEM培地、 その他、 この 種の細胞培養に使用される通常の培地が使用可能であり、 更に、 牛 胎児血清 （F B S) 等の血清補液を併用することも可能である。 細胞融合は、 前記免疫細胞と ミエローマ細胞との所定量を前記培 地内でよく混合し、 予め 3 7 °C程度に加温した P E G溶液、 例えば 、 平均分子量し 0 0 0〜 6， 0 0 0程度の P E Gを、 通常、 培地 に約 3 0〜 6 0 % (W/V) の濃度で添加し、 混合することによつ て行われる。 続いて、 適当な培地を逐次添加し、 遠心して上清を除 去する操作を繰り返すことにより目的とするハイプリ ドーマが形成 される。
当該ハイプリ ドーマは、 通常の選択培地、 例えば、 HAT培地 （ ヒポキサンチン、 アミ ノプテリ ンおよびチミ ジンを含む培地） で培 養することにより選択される。 当該 HAT培地による培養は、 目的 とするハイプリ ドーマ以外の細胞 （未融合細胞） が死滅するのに充 分な時間、 通常、 数日〜数週間継続する。 次いで、 通常の限界希釈 法に従って、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのスク リ一 ニングおよび単一ク口一 ン化が実施される。
このようにして作製される本発明のモノ ク口一ナル抗体を産生す るハイプリ ドーマは、 通常の培地で継代培養することが可能であり 、 また、 液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイプリ ドーマから本発明のモノ クローナル抗体を採取する には、 当該ハイプリ ドーマを常法に従って培養し、 その培養上清力ヽ ら得る方法、 あるいはハイプリ ドーマをこれと適合性のある哺乳動 物に投与して増殖させその腹水から得る方法など適宜の方法が採用 される。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適した方法であり 、 一方、 後者の方法は、 抗体の大量生産に適した方法である。
更に、 前記した方法により得られる抗体は、 塩析法、 ゲル濾過法 、 ァフィ二ティークロマ トフラフィ一等の通常の精製手段を応用し て高純度に精製することができる。
このようにして作製される本発明のモノ ク ローナル抗体は、 造血 幹細胞の生着を阻害する機能を有することから、 かかる機能を利用 して、 白血病治療の分野において、 白血病細胞を骨髄内より放出さ せ抗ガン剤による白血病の治療効果を向上させるなど、 抗ガン剤の 効力増強作用を有する薬剤等として使用し得るものである。
このような本発明のモノ ク ローナル抗体を利用して白血病治療の 分野において、 抗ガン剤による白血病の治療効果を向上させる薬剤 等として使用するための具体的システムの構築、 その改変および応 用等は、 当業者にとって自明の通常の方法を応用して実施されるも のである限り、 いずれも本発明の範囲に含まれるものであることは 云うまでもない。 図面の簡単な説明
図 1 はィムノ フルォレツセ ンスによる解析 （抗体非存在下の対照 ) を示す。 図 2はィムノ フルォレ ツセンスによる G S P S T— 1抗体と C F 一 1細胞との結合性の解析を示す。
図 3はィムノ フルォレツセンスによる HMS— 1抗体と C F— 1 細胞との結合性の解析を示す。
図 4はィムノ フルォレツセンスによる解析 （抗体非存在下の対照 ) を示す。
図 5はィムノ フルォレ ツセンスによる G S P S T— 1抗体と骨髄 細胞との結合性の解析を示す。 '
図 6はィムノ フルォレ ツセンスによる HMS— 1抗体と骨髄細胞 との結合性の解析を示す。
図 7は本発明のモノ クロ一ナル抗体の骨髄移植阻害試験 （G S P S T— 1 ) を示す。
図 8は本発明のモノ クロ ーナル抗体の骨髄移植阻害試験 （HMS - 1 ) を示す。 次に、 本発明を参考例および実施例に基づいて更に具体的に説明 するが、 本発明は当該実施例に限定されるものではない。 参考例
脾臓間質細胞株の樹立とその性質
1 ) 脾臓間質細胞株の樹立
造血幹細胞の生着支持能を有する脾臓間質細胞株は、 r G - C S F 1 0 0〃 gZk gを 5 日間投与した C 5 7 B L/ 6 Jマウスの脾 臓細胞の初代培養から樹立された。 すなわち、 r G— C S F投与後 に無菌条件下に脾臓を摘出し、 2 5 c m2 プラスチッ ク ■ フラスコ (C o r n i n g社製） で 6週間培養し、 1 0 %非働化血清 （ F B S ) (三光純薬社製、 東京） 、 1 0 0 UZm 1ペニシリ ンおよび 1 0 0 c gZm lス ト レプトマイシンを添加した I s c o v eの改変 D υ 1 b e c c 0培地 （ I MDM) (B o e h r i n g e r -Ma n n h e i m社製） で 3 7。C、 5 % C 02 のイ ンキュベータ内で培 養し、 週 2回新鮮培地に交換した。
コンフルェン ト培養から 0. 0 5 %ト リプシン + 0. 0 2 %Ε Ό TA (S i gm a C h em i c a l社製） 、 C a— Mg— i r e e P B Sを用いて付着性細胞集団 （間質細胞） を分取して別なフ ラスコに移した。 この継代培養を週に約 1〜2回繰り返した。 初期 の継代培養 （ 1〜 1 0回目） での細胞の s p l i t r a t i 0は 1 4〜 1ノ 8であ'つたが、 その後の比率は 1 Z 1 6〜 1 3 2と した。 約 1 0回目の継代培養後に間質細胞は均質な線維芽細胞様と なった。 2 0回目の継代時に上述の方法で間質細胞を採集し、 限界 希釈法を用いて細胞のクローニングを 2回繰返して間質細胞株 （ C F - 1細胞株） を樹立した。
次いで、 これらの細胞を 1 0 %非働化 F B Sを加えた I MDM 5 m lを入れた 2 5 c m2 フラスコ （C o r n i n g社製） 内で維持 培養し、 5日毎に s p l i t r a t i o 1 / 3 2で継代培養し た。 尚、 他の哺乳動物についても、 その脾臓間質細胞株を樹立する ことができ、 例えば、 ヒ トの場合には、 細胞を S V— 4 0アデノウ ィルスべクターで形質転換すれば前述と同様の方法でヒ ト脾臓間質 細胞株を樹立することが可能である 〔J. C e l l . P h y s i o 1. ， 1 4 8， 2 4 5 ( 1 9 9 1 ) 〕 o
2 ) C F— 1細胞の特性
前記の如く して細胞株として樹立された C F一 1細胞については 、 標準的な細胞化学的手法を用いてアル力 リ · ホスファ夕ーゼ、 酸 性ホスファターゼ、 ；8—グルクロニダーゼ、 α—ナフチルァセティ トエステラーゼおよびオイル · レツ ド 0を検索すると共に下記のモ ノ クロ一ナルおよびボリ クローナル抗体を用いて免疫酵素組織化学 検索によりその特性を検討した ： Ma c I (S e r o T e c . 社 製） 、 第 V I I I関連抗原 （D a k 0 p a t t s社製） 、 I型コラ 一ゲン、 I I I型コラーゲンおよびフイブロネクチン （ C h e m i c o n I n t e r n a t i o n a l社製） 、 貪食能はラテツ クス • ビーズ （粒子径 ： 1. 0 9〃m， S i gm a社製） を用い、 また 、 脂肪細胞への分化能は、 2 5 cm2 フラスコでコンフルェン ト培 養後 1 0 _6m 0 1 / 1の燐酸ハイ ドロコルチゾン （ S i gm a社製 ) を添加し、 4週間の培養で検討した。
その結果、 C F— 1細胞は、 アルカ リ ' ホスフ ァタ一ゼ、 第 V I I I因子関連抗原、 Ma c Iおよび貧食能は陰性であつたが、 I型 コラーゲン、 I I I型コラーゲンおよびフイブロネクチンは陽性で あった。 C F— 1細胞は、 微かにリ ピッ ドを含むが、 1 0 -6m 0 1 / 1のハイ ド口コルチゾン存在下の 4週間のコンフルェン ト培養に よっても脂肪細胞には分化しなかった。 これらのデータから、 C F - 1細胞は、 前脂肪細胞、 マクロファージおよび血管内皮細胞の特 徴を備えていないと云えることから、 これらとは異なる間質細胞由 来であることが明らかとなった。
3 ) C F— 1細胞による造血幹細胞の維持
造血幹細胞が C F一 1細胞によって維持されるか否かを検討する ため、 T i 1 1 &M c C u 1 1 0 c hの方法による C FU— S a s s a y (脾コロニー形成法） を行なった。 マウス 1 0匹/群に 9 0 0 c G yを照射 （MBR - 1 5 2 0 R, H i t a c h i社製， 東 京） した後、 骨髄単核細胞 （ B M細胞） （ 1. O x l 05 Zh e a d、 5. 0 x l 04 Zh e a dまたは 2. 5 x 1 04 /h e a d) および C F— 1細胞 （ 1. 0 x 1 05 Zh e a d) を静注し、 1 2 日目に脾臓内のコロニー数を算えて C F U— S (脾臓コロニー） と した。
その結果、 骨髄単核細胞 （BM細胞） と C F - 1細胞とを放射線 照射したマウスに同時に移植すると、 いずれの BM細胞群について も脾コロニー数は、 C F— 1細胞を移植しなかったマウスに比し有 意に増加し （ 1. 4〜 1. 8倍） 、 また、 BM細胞と C F— 1細胞 とを同時に移植したマウスの移植後 1 2日目の生存率は、 BM細胞 を単独移植したマウスより も高く、 死亡率が低下することから、 造 血幹細胞が C F一 1細胞によって維持されることが明らかとなった
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例について具体的に記載する。 実施例
モノ クローナル抗体の作製
1 ) 感作抗原と免疫法
感作抗原として、 前述の参考例で取得した C F― 1細胞を用いて 抗原感作を行った。 細胞株は、 1 0 牛胎児血清 （F B S、 三光純 薬社製） 、 I s c 0 V e改変 D u 1 b e c c 0培地 （ I MDM) ( B o e h r i n g e r— Ma n n h e i m社製） を培地として使用 し、 5 % C 02 インキュベータ一中で 3 7 °Cの温度条件下で継代培 養を ίτつた。
細胞は、 1 mM E D T A、 P B S処理後、 軽いピペッティ ングに よって培養フラスコより回収した。 この細胞を約 1 X 1 07 個 Zm 1の細胞数で I mMEDTA ' P B Sに懸濁し、 浮遊させ、 W i s t a r I m am i c h系ラ ッ ト （ 7週令、 半、 動物繁殖研究所） に免疫した。 初回免疫には、 約 1 X I 07 個 Zm lの細胞 l m lを ラッ ト腹腔内に注射し、 1 ヶ月後に 1 X 1 07 個 Zm 1の細胞 1 m 1を追加免疫した。 更に、 1 ヶ月間隔にて 1 X I 07 個 Zm lの細 胞 1 m 1を数回追加免疫し、 免疫されたラッ ト抗体と C F— 1細胞 との反応性を確認後、 最終免疫として、 1 X 1 08 個 Zm 1の細胞 1 m 1を免疫した。 最終免疫 3日後にラッ トを屠殺して脾臓を摘出 した。
2 ) 細胞融合
1匹のラッ トから摘出した脾臓を細切後、 遊離した脾細胞を遠沈 した後、 I MD M培地 （B o e h r i n g e r— Ma n n h e i m 社製） 中に懸濁し、 浮遊させ、 充分に洗浄を行った。 一方、 マウス ' ミエローマ細胞株 S p 2 0— A g 1 4 (N a t u r e, 2 7 6 , 2 6 9— 2 7 0 ( 1 9 7 8 ) 〕 を、 .1 0 %牛胎児血清 （F B S、 三光純薬社製） を含有する I MDM (B o e h r i n g e r - Ma n n h e i m社製） 培地にて培養して得た細胞を、 同様に前記 I M DM培地で洗浄後、 その 1 X 1 08 個と、 前記脾細胞 2 X 1 08 個 とを遠心管に入れ混合し、 ポリエチレングリ コール 4 0 0 0 (半井 化学社製） によって常法 〔 C l i n. E x p. I mmu n o l . , 4 2, 4 5 8 - 4 6 2 ( 1 9 8 0 ) 3 に従い細胞融合させた。
次いで、 得られた融合細胞を、 2 0 %F B Sを含む I MDM培地 にて 9 6個のゥエルプレー トに分注し、 5 %C〇 2 イ ンキュベータ 一中で 3 7 °Cで培養した。 翌日より H A T選択培地に徐々に置換さ せて培養を続けた。
培養開始後、 上清を週 2回の頻度に、 それぞれ新しい HAT培地 に代え、 培養を継続し、 増殖維持させた。
次に、 このようにして得られた融合細胞を常法により限界希釈法 を用いてクロ一ニングした。 すなわち、 前記融合細胞の培養上清中 の抗体を利用して、 感作抗原との結合性を調べ、 感作抗原と強い結 合性を有するクローンだけを常法により限界希釈法を用いてクロー ニングした。
3 ) スク リーニング
融合細胞 （ハイプリ ドーマ） のスク リーニングは、 フローサイ ト メ ト リー （F l ow C y t om e t r y) を使った間接蛍光抗体 法により行った。
目的の抗体を産生するクローンのスク リーニングは、 夕一ゲッ ト 細胞として、 C F— 1細胞を用いて行った。 すなわち、 反応バッフ ァ一 〔2 %F B S, 0. 0 2 %N a N3 を含む P B S〕 に懸濁した 細胞を遠心し、 ペレツ トとして回収した後、 ハイブリ ドーマ培養上 清 1 0 0〃 1中に浮遊させ （約 1 X 1 06 個 Z 1 0 0〃 1 ) 、 4。C にて 1時間反応させた。 前記バッフ ァ一により 1回洗浄した後、 F I TC標識ャギ抗ラッ ト I g G (F C) 抗体 （C h em i c o n 社製） を加えて 1時間イ ンキュベーショ ンした。 1回洗浄した後、 フローサイ トメ ト リ 一 （F l ow C y t om e t r y) (FAC S c a n, べク ト ン · デッキンソ ン社製） にて解析した。
4 ) 抗体の精製
前記 3) でスク リ一二ングした融合細胞を常法に従って培養し、 培養上清中に産生される抗体を常法により分離し、 精製した。
すなわち、 各ゥエルのうち前記感作抗原に対する抗体価の高かつ たゥエルからハイプリ ドーマを採取し、 組織培養プラスチッ クディ ッシュ （ C 0 r n i n g社製） に広げて 5 % C 02 中で 3 7 °Cにて 継代培養を行い、 増殖させ、 常法により精製することにより、 モノ クローナル抗体 G S P S T— 1、 HMS— 1を得た。
この場合、 HMS— 1抗体および GS P ST— 1は、 得られた細 胞をプリス夕ン投与を施行した BAL BZc AJ c l — n u系ヌー ドマウス （ 8週令， σ71, 日本ク レア社製） に腹腔内注入し、 1 0〜 1 4日後、 産生された腹水を採取し、 3 3 %硫酸ァンモニゥ厶で塩 折し、 P B Sによる透析を行った。
尚、 上記の実施例においては、 感作抗原として、 前記 C F - 1紬 胞を使用した場合について例示したが、 ヒ ト脾臓間質細胞由来の造 血域間質細胞株を含む他の脾臓間質細胞を使用した場合にも同様に してモノ クローナル抗体を作製することが可能であり、 本発明は、 前記モノ クローナル抗体に限らず、 それと同様にして作製される同 様の特性を有するすべてのモノ クローナル抗体、 および当該モノ ク ローナル抗体を産生するすべてのハイプリ ドーマを包含するもので め o
本発明のモノ クローナル抗体 HMS— 1を産生するハイプリ ドー マは、 W i s t a r I m a m i c h系ラ ッ ト脾細胞とマウス · ミ エロ一マ細胞株 S p 2 / 0 - A g 1 4を親細胞として作製された新 規な融合細胞であり、 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関 するブダぺス ト条約に基づく国際寄託当局である工業技術院生命ェ 学工業技術研究所 〔あて名 ： 日本国茨城県つく ば巿東 1丁目 1番 3 号 （郵便番号 S 0 5 ) 〕 に 1 9 9 3年 8月 9 日付で、 HMS— 1 ( ラッ ト マウス ハイプリ ドーマ） ， 受託番号 F E RM B P— 4 3 8 3 として国際寄託されている。
5 ) 抗体の性質
①抗体の反応性
(C F - 1細胞に対する反応性）
上記のようにして得られたモノ クローナル抗体 G S P S T— 1、 HMS— 1 の C F - 1細胞に対する反応性について免疫蛍光分析 （ I m m υ n o f l u o r e s c e n c e a n a 1 y s i s ) によ り検討した結果を図 1〜図 4に示す。 こ こで、 図 1 は、 抗体非存在 下のコン トロール、 図 2は、 G S P S T— 1 と C F— 1細胞との結 合性、 図 3は、 HMS— 1 と C F— 1細胞との結合性、 の解析結果 を示す。 尚、 図中、 縦軸は相対細胞数を、 横軸は蛍光強度を、 示す ο
図 1〜図 3から明らかなとおり、 モノ クローナル抗体 G S P S T 一 1、 HM S— 1 は C F— 1細胞に対して結合性を有しており、 C F一 1細胞の表面抗原を認識するものであることが分った。
(骨髄細胞に対する反応性）
次に、 G S P S T - 1、 HMS— 1の正常の骨髄細胞に対する反 応性をフローサイ トメ ト リ ー （ F 1 0 w C y t om e t r y) ( FAC S c a n, べク トン ' デッキンソン社製） により検討した結 果を図 4〜図 6に示す。 ここで、 図 4は、 抗体非存在下のコン ト口 —ル、 図 5は、 G S P S T— 1 と骨髄細胞との結合性、 図 6は、 H MS - 1 と骨髄細胞との結合性、 の解析結果を示す。 尚、 図中、 縦 軸は相対細胞数を、 横軸は蛍光強度を、 示す。 図 4〜図 6に示すように、 G S P S T— 1 は、 骨髄細胞とは全く 結合せず、 HMS— 1 は、 一部の骨髄細胞と結合することが明らか となった。
②抗体のタイ ビング
次に、 得られたモノ クローナル抗体の I g Gのサブクラスをタイ ビングしたところ 〔ラッ ト Mo n o Ab— I D— S pキッ ト （Z ym e d社製） を使用〕 、 G S P S T— 1 は I g G 2 a、 HMS - 1 は I g G 2 bであることが明らかとなった。
③骨髄移植阻害作用
次に、 これらの抗体を用いて骨髄移植阻害実試験行い、 その特性 について検討した。 その結果を図 7〜図 8に示す。 図 7〜図 8から 明らかなように、 HM S— 1 は、 骨髄移植阻害効果を有するが、 G S P S T— 1 には、 その効果は認められなかった。 すなわち、 致死 量の放射線照射 （ 9 0 0 c Gy) をした C 5 7 B LZ 6 Jマウスに 、 1. 0 X 1 05 h e a dの骨髄細胞およびモノ クローナル抗体 を、 尾静脈より投与し、 脾臓コロニーの形成を観察したところ、 上 記の結果を得た。 尚、 図 8の N o n— t r e a t e dは、 これらを 投与しなかった場合を示す。 従って、 本発明のモノ クローナル抗体 HMS— 1 も、 上記実験より骨髄移植阻害が確認されたこ とから、 造血幹細胞の生着阻害、 すなわち造血幹細胞のホー ミ ングおよび C FU— Sコロニーの形成も阻害することは明らかである。
尚、 モノ クローナル抗体の骨髄移植阻害効果が造血幹細胞のホー ミ ングおよび C F U— Sコロニー形成阻害活性に対応していること は当業者に自明のことである。 例えば、 既に知られている肥満細胞 を抗原として作製されたモノ クローナル抗体 （C一 k i t抗体の一 つである ACK— 2抗体） も、 本発明のモノ クローナル抗体と同様 に、 マウスでの骨髄移植を阻害する作用を有することが報告されて いる 〔 B l o o d, 7 8， 1 7 0 6 ( 1 9 9 1 ) 〕 が、 その報告で は、 骨髄移植阻害実験の結果から、 この抗体が造血幹細胞のホー ミ ングおよび C F U— Sコロニー形成を阻害すると結論づけている。 ところで、 上述の既知抗体である A C K— 2抗体は、 肥満細胞を 抗原として作製されたものであるが、 肥満細胞は、 造血幹細胞より 分化、 増殖した血液細胞である。 一方、 本発明で使用した造血域間 質細胞は、 血液細胞ではなく、 血液細胞の分化、 増殖を支持する細 胞であり、 従って、 両者は大き く相違するものである。
次に、 HMS— 1を産生するハイプリ ドーマをヌー ドマウスの腹 腔に投与しとところ、 腹水が貯留してもマウスが死亡しないことが 確認された。 従って、 HMS— 1の骨髄移植阻害効果は、 いわゆる アポトーシス （ a p o p t o s i s ) 〔核クロマチン DNAがヌ ク レオソー厶単位での切断 （いわゆるラダー · フ ォーメーショ ン） さ れ、 その結果、 細胞を死に至らしめる現象で、 細胞自滅とも云う。 〕 によるものではなく、 造血幹細胞が造血組織に生着するための分 子にモノ クローナル抗体が結合したために生じた現象であると考え られる。 従って、 HMS— 1が認識する抗原は、 造血幹細胞が造血 組織に生着するのに重要な物質であることは明らかである。
以上により実験的に確認されたように、 本発明のモノ クローナル 抗体 HMS - 1 は、 造血幹細胞の生着支持能を有する脾臓間質細胞 の細胞表面抗原を認識し、 造血幹細胞の生着を阻害する特性を有す るものである。
このように、 HMS— 1 は、 骨髄細胞が造血組織に生着すること を阻害する作用を有するものであるが、 このことは、 すでに報告が ある造血細胞の接着因子の V L A 4、 V L A 5の発現の低下により 、 白血病細胞が骨髄内より放出されることが報告されており 〔VL A m o l e c u l e e x p r e s s i o n m a y b e i n v o 1 v e d i n t h e r e l e a s e o f a c υ t e my e l o i d l e u k a e m i c c e l l s f r om t h e b o n e m a r r ow, L e u k R e s , 1 6 ( 5 ) ， 4 6 9— 4 7 4 ( 1 9 9 2 ) 〕 、 VLA 4、 VLA 5に対する モノ クローナル抗体が白血病細胞を骨髄内より放出させ、 白血病の 治療効果を向上させていることが考えられる。 従って、 この H M S 一 1 も、 それと同様に、 白血病治療の前処理として使用することに より同様の効果が得られるものと考えられる。
以上、 本発明のモノ クローナル抗体について実施例を示して具体 的に説明したが、 本発明で云う ところのモノ クローナル抗体は、 前 記具体例として例示したものが代表的なものとしてあげられるもの の、 必ずしもこれに限定されるものではなく、 同様に作製された同 様の特性および機能を有するすべてのモノ クローナル抗体を包含す るものであることは云うまでもない。 産業上の利用可能性
本発明のモノ クローナル抗体は、 骨髄細胞が造血組織に生着する のに重要な物質をその抗原として認識し、 造血幹細胞の生着を阻害 する特性を有するものであることから、 例えば、 かかる特性を利用 して、 白血病細胞を骨髄内より放出させ、 抗ガン剤による白血病の 治療効果を向上させるなど、 抗ガン剤の効力を増強する作用を有す る薬剤等として有用なものである。

Claims

請求の範囲
. 造血幹細胞の生着を阻害し、 造血幹細胞の生着支持能を有する 脾臓間質細胞の表面抗原を認識するモノ クロ一ナル抗体。
. 請求項 1記載のモノ クロ一ナル抗体を産生するハイプリ ドーマ
PCT/JP1994/001452 1993-09-03 1994-09-02 Anticorps monoclonal reconnaissant des antigenes de surface de cellules interstitielles WO1995006747A1 (fr)

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