PL181847B1 - Sposób wytwarzania monoklonalnych przeciwcial oraz sposób wytwarzania hybrydomy produkujacej te monoklonalne przeciwciala PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania monoklonanych przeciwcial hamujacych osadzanie sie macie- rzystych komórek krwiotwórczych i rozpoznajacych powierzchniowy antygen komórki zrebu sledziony, nalezacych do klasy IgG, znamienny tym, ze immunizuje sie ssaka komórkami zrebu sledziony pochodzacymi od zwierzecia traktowanego rG-CSF, poddaje sie immunizowane ko- mórki ssaka fuzji z komórkami szpiczaka ssaka, takiego jak mysz, klonuje sie otrzymane hybrydo- my, wyselekcjonowuje sie komórki hybrydomy produkujace przeciwcialo, hoduje je 1 wyodrebnia otrzymane monoklonalne przeciwciala, które selekcjonuje sie na podstawie reaktywnosci wobec komórek szpiku kostnego, typowania przeciwcial i zdolnosci hamowania transplantacji szpiku kostnego. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazkujest sposób wytwarzania monoklonalnych przeciwciał reagujących z powierzchniowymi antygenami komórek zrębu oraz sposób wytwarzania hybrydomy produkującej te monoklonalne przeciwciała.

Nowe monoklonalne przeciwciała hamują osadzanie się macierzystych komórek krwiotwórczych i rozpoznają komórkę zrębu śledziony, mającą zdolność wspomagania osadzania się macierzystych komórek krwiotwórczych.

Ponieważ monoklonalne przeciwciała otrzymywane sposobem według wynalazku rozpoznają jako antygen substancję ważną dla osadzania się komórek szpiku kostnego na tkance krwiotwórczej i mająwłaściwość hamowania osadzania się macierzystych komórek krwiotwórczych, są one użyteczne jako lek wzmacniający działanie środka przeciwrakowego, np. dla polepszenia działania środka przeciwrakowego stosowanego w leczeniu białaczki, dzięki odłączeniu komórek ostrej białaczki szpikowej od szpiku kostnego, zgodnie z powyższą właściwością.

Czynniki stymulujące powstawanie kolonu granulocytów, np. rekombinacyjne czynniki stymulujące powstawanie kolonii granulocytów (rG-CSF), są znane głównie jako czynniki humoralne dla stymulowania różnicowania i proliferacji komórek granulocytowych, a w opisanym eksperymencie prowadzonym na myszach in vivo okazało się, że podawanie czynnika rG-CSF zwiększa hematopoezę szpiku kostnego, a w dodatku powoduje znacznąpozaszpikową hematopoezę w śledzionie powodując proliferację macierzystych komórek krwiotwórczych i wszystkich krwiotwórczych komórek prekursorowych w śledzionie. Odnośnie pozaszpikowego mechanizmu powstawania krwinek w śledzionie sądzono, że hematopoeza następuje na skutek modyfikacji krwiotwórczego mikrośrodowiska śledziony wskutek stymulacji czynnikiem rG-CSF, w celu zwiększenia potencjału krwiotwórczego.

181 847

Wynalazcy badali komórki zrębu śledziony potraktowane czynnikiem rG-CSF, w celu wyjaśnienia możliwości hematopoezy w śledzionie, określili Imię krwiotwórczych komórek zrębu (komórki CF-1) pochodzących ze śledziony myszy, której podawano czynnik rG-CSF, aby spróbować przeanalizować zwiększanie potencjału krwiotwórczego komórek zrębu potraktowanych czynnikiem rG-CSF i zbadali potencjalny wpływ na hematopoezę, stosując te krwiotwórcze komórki zrębu. W wyniku tych badań zaobserwowano aktywności stymulacji kolonii in vitro i możliwość wspomagania macierzystych komórek krwiotwórczych in vivo [Blood, 80,1914,(1992)].

Od momentu rozpoznania możliwości wspomagania macierzystych komórek krwiotwórczych in vivo, kiedy komórki CF-1 sątransplantowane wraz z komórkami szpiku kostnego przy transplantacji szpiku kostnego, sądzono, że powyższa lima krwiotwórczych komórek zrębu (komórki CF-1) spełnia zadanie czynnika działającego na adhezję komórek, umożliwiającego osadzanie się macierzystych komórek krwiotwórczych na tkance krwiotwórczej.

Jednakże, chociaż niektóre komórki zrębu śledziony, posiadające zdolność wspomagania osadzania się macierzystych komórek krwiotwórczych zostały określone jako linia komórek (komórki CF-1), a właściwości cytologiczne tych komórek zostały zbadane, dotychczas me otrzymano żadnego specyficznego przeciwciała rozpoznającego ich antygeny powierzchniowe, a ich właściwości sąjeszcze słabo znane.

Wynalazcy przeprowadzili zatem pracochłonne badania, mające na celu opracowanie specyficznego przeciwciała, zdolnego do rozpoznawania komórki zrębu śledziony, mającej zdolność wspomagania osadzania się macierzystych komórek krwiotwórczych. Na podstawie powyższych informacji o komórkach zrębu śledziony i na podstawie wyników badań określono komórkę zrębu śledziony, posiadającą zdolność wspomagania osadzania się macierzystych komórek krwiotwórczych jako Imię komórkową, a równocześnie przygotowano monoklonalne przeciwciało z wykorzystaniem linii komórek zrębu śledziony jako antygenu do immunizacji i w rezultacie otrzymano nowe monoklonalne przeciwciało.

Wynalazcy stwierdzili ponadto, że otrzymane monoklonalne przeciwciało rozpoznaje powierzchniowy antygen komórki zrębu śledziony, mający zdolność wspomagania osadzania się macierzystych komórek krwiotwórczych i posiada właściwość hamowania osadzania się macierzystych komórek krwiotwórczych, co doprowadziło do dokonania wynalazku.

Przedmiotem wynalazkujest sposób wytwarzania nowych monoklonalnych przeciwciał hamujących osadzanie się macierzystych komórek krwiotwórczych i rozpoznających powierzchniowy antygen komórki zrębu śledziony, należących do klasy IgG, polegający na tym, że immunizuje się ssaka komórkami zrębu śledziony pochodzącymi od zwierzęcia traktowanego rG-CSF, poddaje się immunizowane komórki ssaka fuzji z komórkami szpiczaka ssaka, takiego jak mysz, klonuje się otrzymane hybrydomy, wyselekcjonowuje się komórki hybrydomy produkujące przeciwciało, hoduje je i wyodrębnia monoklonalne przeciwciała, które selekcjonuje się na podstawie reaktywności wobec komórek szpiku kostnego, typowania przeciwciał i zdolności hamowania transplantacji szpiku kostnego.

Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania hybrydomy produkującej te monoklonalne przeciwciała, charakteryzujący się tym, ze immunizuje się ssaka komórkami zrębu śledziony pochodzącymi od zwierzęcia traktowanego rG-CSF, poddaje się immunizowane komórki ssaka fuzji z komórkami szpiczaka ssaka, takiego jak mysz, klonuje się otrzymane hybrydomy i wyselekcjonowuje się komórki hybrydomy produkujące przeciwciała.

Przykładem jest hybrydoma HMS-1 zdeponowana pod numerem FERM BP-4383.

Monoklonalne przeciwciało wytwarzane sposobem według wynalazkujest nowym monoklonalnym przeciwciałem skierowanym przeciwko powierzchniowemu antygenowi komórek zrębu śledziony, posiadającemu zdolność wspomagania osadzania się macierzystych komórek krwiotwórczych i jest to przeciwciało rozpoznające komórkę zrębu śledziony związaną ze zwiększeniem potencjału krwiotwórczego w śledzionie, przy czym przeciwciało to jest bardzo uzyteczne jako substancja, mająca za zadanie zahamowanie osadzania się macierzystych komórek krwiotwórczych. Osadzanie się macierzystych komórek krwiotwórczych oznacza tu, że przyle4

181 847 game macierzystych komórek krwiotwórczych zachodzi dzięki komórkom zrębu tkanki krwiotwórczej, a komórki te różnicują się i proliferująw kolonie CFU-S.

Monoklonalne przeciwciało otrzymane sposobem według wynalazku można otrzymać zasadniczo jak podano poniżej. Mianowicie, monoklonalne przeciwciało otrzymane sposobem według wynalazku można przygotować przykładowo przy użyciu komórek zrębu śledziony pochodzących od zwierzęcia, któremu podawano czynnik rG-CSF, takich jak komórki CF-1 (komórki zrębu śledziony) określone przez wynalazców jako linia komórek, w charakterze antygenu, immunizowanie go według konwencjonalnego sposobu immunizacji, przeprowadzanie fuzji immunizowanych komórek według konwencjonalnego sposobu przeprowadzania fuzji komórek oraz klonowanie połączonych komórek zgodnie z konwencjonalnym sposobem klonowania.

Jako sposób otrzymywania monoklonalnego przeciwciała według wynalazku można korzystnie przedstawić przykładowy sposób, obejmujący wykorzystanie powyższych komórek CF-1, określonych jako linia komórek hodowanych przez wynalazców, w charakterze antygenu [Blood, vol. 80, 1914 (1992)], przeprowadzenie fuzji komórek plazmatycznych (immunocyty) ssaka immunizowanego tym antygenem z komórkami szpiczaka ssaka, takiego jak mysz, klonowanie otrzymanych z fuzji komórek (hybrydom), wybieranie klonów wytwarzających przeciwciało rozpoznające powyższą linię komórek oraz hodowanie ich w celu uzyskania przeciwciał. Jednakże sposób ten stanowi tylko przykład, a w tym przypadku nie tylko powyższe komórki CF-1, ale również inne komórki zrębu tkanki krwiotwórczej otrzymane tak, jak komórki CF-1 lub komórki zrębu tkanki krwiotwórczej, pochodzące z ludzkich komórek zrębu śledziony mogą być odpowiednio użyte do wytworzenia przedmiotowych przeciwciał, w taki sam sposób jak w przypadku powyższych komórek CF-1.

W sposobie wytwarzania monoklonalnych przeciwciał ssaki poddawane immunizacji powyższym antygenem nie podlegają szczególnemu ograniczeniu. Korzystne jest dokonanie wyboru z uwzględnieniem zgodności komórek szpiczaka wykorzystywanego w fuzji komórek, przy czym korzystnie stosuje się mysz, szczura i chomika.

Immunizację przeprowadza się konwencjonalnym sposobem, np. podając komórki zrębu śledziony, takie jak powyższe komórki CF-1, dojamy brzusznej ssaka przez wstrzyknięcie. Korzystne jest zwłaszcza podawanie ich w postaci rozcieńczonej lub w postaci zawiesiny w odpowiedniej ilości PBS lub izotomcznego roztworu chlorku sodu zwierzęciu kilka razy na miesiąc. Korzystne jest stosowanie komórek zrębowych usuniętych po ostatnim podaniu powyższych komórek jako immunocytów.

Jako komórkę szpiczaka ssaka i inne macierzyste komórki wchodzące w fuzję z powyższymi immunocytami można stosować korzystnie różne znane komórki, takie jak P3(P3X63Ag8.653) [J. Immunol., 123, 1548 (1978)], p3-U1 [Current Topics m Micro-biology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], NS-1 [Eur. J. Immunol., 6,511-519 (1976)], MPC-11 [Celi, 8,405-415 (1976)], Sp2/0-Ag14 [Nature, 276, 269-270 (1978)], FO [J. Immunol. Meth., 35, 1-21 (1980)], S194 [J. Exp. Med., 148, 313-323 (1978)] i R210 [Nature, 277, 131-133 (1979)].

Fuzja komórkowa powyższego immunocytu i komórki szpiczaka może być przeprowadzona zasadniczo według konwencjonalnego sposobu, np. według sposobu opisanego przez Milstein i inni [Methods Enzymol., 73, 3-46 (1981)].

Powyższa fuzja komórek może być w szczególności przeprowadzona np. w zwykłym medium odżywczym w obecności środka przyspieszającego fńzję. Jako środek przyspieszający fuzję można dodać glikol polietylenowy (PEG) i wirus Sendai (HVJ), a ponadto adjuwanty, takie jak dimetylosulfotlenek, odpowiednio, jeśli trzeba, w celu zwiększenia wydajności fuzji. Jeśli chodzi o stosunki immunocytów i komórek szpiczaka, pierwsze stosowane sąkorzystnie w ilości 1-10 razy większej niż drugie. Przykłady medium stosowanego w powyższej fuzji komórek obejmująmedium RPMI-1640 i medium mEm odpowiednie do proliferacj i powyższej komórki szpiczaka oraz inne pożywki zwykle używane przy hodowli tego rodzaju komórek, a ponadto surowicę uzupełniającą, takąjak płodowa surowica bydlęca (FBS).

Fuzja komórek przeprowadzana jest przez mieszanie przepisowych ilości powyższych immunocytów i komórek szpiczaka w powyższym medium, dodanie roztworu pEg podgrzanego

181 847 do około 37°C, np. PEG o średnim ciężarze cząsteczkowym rzędu 1000-6000, do medium, zwykle do stężenia około 30-60% (wag./obj.) oraz mieszanie ich. Następnie przez powtarzanie operacji dodawania właściwych pożywek kolejno jedna po drugiej, wirowanie mieszaniny reakcyjnej i usuwanie nadsączy można wytworzyć hybrydomy.

Te hybrydomy są selekcjonowane przez hodowanie w zwykłym selektywnym medium, np. w pożywce HAT (pożywka z dodatkiem hipoksantyny, aminopteryny i tymidyny). Hodowla w medium HAT jest kontynuowana przez czas wystarczający, by komórki inne niż przedmiotowe hybrydomy (komórki nie pochodzące z fuzji) obumarły, zwykle przez czas wynoszący kilka dni do kilku tygodni. Następnie przeprowadza się badanie przesiewowe i klonowanie pojedynczych hybrydom wytwarzających przedmiotowe przeciwciała, zwykłym sposobem granicznego rozcieńczenia.

Określone hybrydomy wytwarzające monoklonalne przeciwciała mogą być dalej hodowane w zwykłym medium i przechowywane w ciekłym azocie przez długi czas.

W celu zebrania monoklonalnych przeciwciał z hybrydom można zastosować sposób obejmujący hodowanie hybrydom zwykłym sposobem i uzyskiwanie ich z nadsączy lub sposób obejmujący podawanie hybrydomy odpowiedniemu ssakowi w celu proliferacji i otrzymywanie ich z płynu jamy brzusznej zwierzęcia. Pierwszy sposób jest odpowiedni do otrzymywania przeciwciał o wysokiej czystości, a drugi jest odpowiedni do masowej produkcji przeciwciał.

Ponadto, przeciwciała otrzymane według powyższego sposobu mogą być oczyszczane w wysokim stopniu przez zastosowanie zwykłych środków oczyszczających, takich jak wysalanie, filtracja żelowa i chromatografia powinowactwa.

Ponieważ monoklonalne przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku majązdolność hamowania osadzania się macierzystych komórek krwiotwórczych, mogąbyć one stosowane w medycynie w celu wzmacniania działania środka przeciwrakowego w klinicznym leczeniu białaczki, np. dzięki wykorzystaniu tego, że komórki ostrej białaczki szpikowej są odłączane od szpiku kostnego, co zwiększa działanie środka przeciwrakowego stosowanego przy białaczce.

Z możliwości wykorzystania monoklonalnych przeciwciał wytwarzanych sposobem według wynalazku wśród środków przeciw białaczce wynika bezspornie, że ustalenie specyficznego systemu ich stosowania jako leku polepszającego działanie środka przeciwrakowego przy białaczce, modyfikacja i stosowanie go są objęte zakresem wynalazku o tyle, o ile są one wprowadzane do praktyki konwencjonalnym sposobem oczywistym dla fachowców.

Krótki opis rysunków.

Figura 1 przedstawia analizę immunofluorescencyjną (próbka kontrolna przy braku przeciwciała, komórki CF-1). Fig. 2 - analizę immunofluorescencyjną właściwości wiązania przeciwciała GSPST-1 do komórek CF-1. Fig. 3 - analizę immunofluorescencyjną właściwości wiążących przeciwciała HMS-1 do komórek CF-1. Fig. 4 - analizę immunofluorescencyjną (próbka kontrolna przy braku przeciwciała, komórki szpiku kostnego). Fig. 5 - analizę immunofluorescencyjną właściwości wiązania przeciwciała GSPST-1 do komórek szpiku kostnego. Fig. 6 analizę immunofluorescencyjną właściwości wiązania przeciwciała HMS-1 do komórek szpiku kostnego. Fig. 7 - test hamowania przez monoklonalne przeciwciała (GSPST-1) według przedmiotowego wynalazku transplantacji szpiku kostnego. Fig. 8 - test hamowania przez monoklonalne przeciwciała (HMS-1) według przedmiotowego wynalazku transplantacji szpiku kostnego.

Wynalazek będzie opisany bardziej szczegółowo poniżej w przykładzie odniesienia oraz w przykładzie, przy czym mniejszy wynalazek nie jest ograniczony do przykładu.

Przykład odniesienia.

Otrzymywanie komórek zrębu śledziony i ich właściwości.

1) Otrzymywanie komórek zrębu śledziony.

Linie komórek zrębu śledziony zdolnych do wspomagania krwiotwórczych komórek macierzystych otrzymano z pierwotnej hodowli komórek śledziony myszy C57BL/6J, której podawano czynnik rG-CSF w ilości 100 pg/kg przez 5 dni.

Mianowicie, śledzionę usuwano po podawaniu czynnika rG-CSF w warunkach jałowych, hodowano w naczyniu plastikowym 25 cm² (Corning Co.) przez 6 tygodni w zmodyfikowanym

181 847 medium Isocove's Dulbecco's (IMDM) (Boehringer-Mannheim Co.) z 10% dezaktywowanątermicznie bydlęcą surowicą płodową (FBS) (Sanko Junyaku, Tokio), 100 jednostkami/ml penicyliny i 100 (g/ml streptomycyny w inkubatorze w warunkach 37°C i 5% CO2, a medium to zmieniano na świeże medium wzrostowe dwa razy w tygodniu.

W konfluentnej hodowli przyrośnięte populacje komórek (komórki zrębowe) zbierano z naczynia przy użyciu 0,05% trypsyny i 0,02% eDtA (Sigma Chemical Co.) w PBS bez Ca i Mg i przenoszono do świeżych naczyń. Pasażowania te powtarzano w przybliżeniu raz lub dwa razy w tygodniu. We wczesnych pasażowamach (pasażowania 1-10) stosunek podziału komórek był 1/4 do 1/8, a później stosunek ten był 1/16 do 1/32. Komórki zrębu stawały się homogenne i fibroblastoidalne w przybliżeniu po dziesiątym pasażowaniu.

Przy dwudziestym pasażowaniu te komórki zrębu były zbierane jak opisano powyżej i klonowane przy zastosowaniu techniki granicznego rozcieńczenia. Klonowanie komórek powtarzano dwukrotnie w celu otrzymania linii komórek zrębu (linia komórek CF-1).

Następnie komórki te hodowano w 5 ml IMDM uzupełnionego 10% dezaktywowaną termicznie FBS w naczyniu 25 cm2 (Corning Co.) i prowadzono następną hodowlę raz na 5 dni przy stosunku podziału 1/32. Linie komórek zrębu śledziony można otrzymać z innych zwierząt niż myszy. Przykładowo, linie ludzkich komórek zrębu śledziony można otrzymać stosując taki sam sposób, jak opisano powyżej, transformując komórki wektorem adenowirusowym SV-40 [J. Celi. Physiol., 148, 245 (1991)].

2) Właściwości komórek CF-1.

Komórki CF-1 ustalone jako linia komórek, jak opisano powyżej, były poddane testom na fosfatazę alkaliczną, fosfatazę kwasową, β-glukuronidazę, esterazę α-naftylooctanową oraz czerwień olejową 0 przy użyciu standardowych technik cytochemicznych. Komórki CF-1 były również charakteryzowane sposobami immunoenzymatycznej histochemii przy zastosowaniu następujących przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych: mac I (Sero Tec.); antygen związany z czynnikiem VIII (Dakopatts); oraz kolagen typu I, kolagen typu III i fibronektyna (Chemicon International Inc.). Fagocytozę badano przez wychwyt kulkami lateksowymi (średnica cząstek: 1,09 (m; Sigma), a zdolność komórek CF-1 do przemiany w adipocyty badano przez wystawienie na działanie 10'⁶ mol/l fosforanu hydrokortyzonu (Sigma) w naczyniu 25 cm2 przez 4 tygodnie po hodowli kofluentnej.

W rezultacie komórki CF-1 dały negatywny wynik dla fosfatazy alkalicznej, antygenu związanego z czynnikiem VIII, mac I i fagocytozy, natomiast pozytywny dla kolagenu typu I, kolagenu typu III i fibronektyny. Komórki CF-1 nie podlegały przemianie w adipocyty w ciągu 4 tygodni w konfluentnej hodowli z 10'6 mol/l hydrokortyzonu, chociaż komórki CF-1 miały tylko ślady lipidu. Z tych danych wynika, że komórki CF-1 nie miały właściwości preadipocytów, makrofagów i komórek śródbłonkowych i dlatego stało się oczywiste, że pochodzą one z komórek zrębu różniących się od nich.

3) Utrzymywanie krwiotwórczych komórek macierzystych dzięki komórkom CF-1.

W celu zbadania, czy krwiotwórcze komórki macierzyste sąutrzymywane dzięki komórkom CF-1, czy też nie, przeprowadzono testy CFu-S (testy komórek śledzionowych tworzących kolonie) techniką Till i McCulloch. Dziesięć myszy z grupy napromieniowano 900 cGy (MBR-1520R; Hitachi, Tokio) i wstrzyknięto im dożylnie jednojądrowe komórki szpiku kostnego (komórki BM) (1,0 x 10⁵/głowę, 5,0 x 10⁴/głowęlub2,5 x 10⁴/głowę) oraz komórki CF-1 (1,0 x 10⁵/głowę), a kolonie w śledzionie liczono 12 dnia jako klony CFU-S (kolonie śledziony).

W rezultacie, kiedy jednojądrowe komórki szpiku kostnego (komórki BM) i komórki CF-1 były transplantowane napromieniowanym myszom, liczba kolonu śledziony każdej grupy komórek BM zwiększyła się znacznie (1,4-1,8 razy) w porównaniu z myszami bez komórek CF-1, a 12 dnia od transplantacji współczynnik przeżycia myszy z przeszczepionymi komórkami BM i komórkami CF-1 był większy niz dla myszy tylko z komórkami BM, przy małym współczynniku śmiertelności, a zatem stało się oczywiste, ze macierzyste komórki krwiotwórcze sąutrzymywane dzięki komórkom CF-1.

Najlepszy sposób realizacji wynalazku.

Poniżej zostanie opisany szczegółowo przykład wykonania wynalazku.

81 847 *7

Przykład. Otrzymanie przeciwciał monoklonalnych.

1) Antygeny i immunizacja.

Immunizację przeprowadzono stosując komórki CF-1 otrzymane w powyższym przykładzie odniesienia w charakterze antygenów. Komórki hodowano w inkubatorze w warunkach 5% CO2 i 37°C, stosując medium Isocove's modified Dulbecco's (IMDM) (Boehnnger-Mannheim Co.) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS; Sanko Junyaku).

Komórki te potraktowano 1 mM EDTA/PBS i usunięto z naczynia hodowlanego przez pipetowanie. Komórki zawieszono w 1 mM EDTA/PBS przy liczbie komórek około 1 x 10⁷/ml i podawano samicy szczura Wistar Imamich (wiek 7 tygodni; Animal Breeding Research Laboratory). 1 ml komórek o zawartości około 1 x 107/ml wstrzyknięto w jamę brzuszną szczura przy początkowej immunizacji, a 1 ml komórek o zawartości około 1 x 107/ml podano dodatkowo miesiąc później. Ponadto, 1 ml komórek o zawartości około 1 x 107/ml podawano kilkakrotnie w odstępach miesięcznych, a po spostrzeżeniu oddziaływania pomiędzy przeciwciałami lmmunizowanego szczura a komórkami CF-1, podano 1 ml komórek o zawartości 1 x 10⁸/mljako końcową immunizację. Trzy dni po końcowej immunizacji szczura zabito, by usunąć śledzionę.

2) Fuzja komórek.

Po rozdrobnieniu śledziony usuniętej szczurowi wyizolowane komórki śledzionowe odwirowano, zawieszono w medium IMDM (Boehnnger-Mannheim Co ) i dokładnie przemyto. Z drugiej strony komórki otrzymane z hodowanej linii komórek szpiczaka myszy Sp2/0-Ag 14 [Nature, 276, 269-270 (1978)] w medium IMDM (Boehringer-Mannheim Co.) uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS; Sanko Junyaku) przemywano powyższym medium IMDM w taki sam sposób i 1 x 10⁸ tych komórek oraz 2 x 10⁸ powyższych komórek śledzionowych wprowadzono do probówki, służącej do wirowania i mieszano w celu przeprowadzenia fuzji komórek za pomocą glikolu polietylenowego 4000 (Nakarai Kagaku) zgodnie ze zwykłym postępowaniem [Clm. Exp. Immunol., 42, 458-462 (1980)].

Następnie, komórki otrzymane po fuzji były nanoszone na płytkę z 96 zagłębieniami z medium IMDM uzupełnionym 20% FBS i hodowane w inkubatorze w warunkach 37°C 15% CO2. Przenoszono je stopniowo do selektywnego medium HAT następnego dnia i kontynuowano hodowlę.

Po rozpoczęciu hodowli nadsącza przenoszono do nowego medium HAT dwa razy w tygodniu, by kontynuować hodowlę i utrzymywać proliferację.

Następnie, komórki otrzymane z fuzji klonowano według zwyczajnej procedury stosując sposób granicznego rozcieńczenia. Mianowicie tylko klony, mające silne właściwości wiązania wobec antygenów były klonowane według zwyczajnej procedury z wykorzystywaniem analizy granicznego rozcieńczania przez badanie właściwości ich wiązania z antygenami, przy czym wykorzystywano przeciwciała w nadsączach powyższych komórek z fuzji.

3) Badanie przesiewowe.

Badanie przesiewowe komórek z fuzji (hybrydom) przeprowadzano techniką pośredniej fluorescencji przeciwciał przy zastosowaniu przepływowej cytometni.

Badanie przesiewowe klonów wytwarzających przedmiotowe przeciwciała przeprowadzano z zastosowaniem komórek CF-1 jako komórek docelowych. Mianowicie, komórki zawieszone w buforze reakcyjnym (PBS uzupełniony przez 2% FBS i 0,02% NaN3) wirowano i odzyskiwano w postaci osadów, po czym zawieszano w 100 (i nadsączy hodowli hybrydom (około 1 x 10⁶/100 pl) i przeprowadzano reakcję przy 4°C przez 1 h. Po jednokrotnym płukaniu powyższym roztworem buforowym dodawano do tego znakowane FITC kozie antyszczurze przeciwciało IgG (FC) (Chemicon) i prowadzono inkubację przez 1 h. Po jednorazowym płukaniu poddano je analizie metodą cytometrii przepływowej (FACScyn, Becton Dickinson).

4) Oczyszczanie przeciwciał.

Komórki z fuzji poddane analizie przesiewowej w sposób podany w punkcie 3) hodowano zgodnie z normalnym postępowaniem, a przeciwciała wytworzone w nadsączach oddzielano według zwyczajnej procedury i oczyszczano

Mianowicie, hybrydomy pozyskiwano ze studzienek z dużymi mianami przeciwciał do antygenów, rozprowadzano w plastikowej płytce do hodowli tkankowych (Coming Co.), hodo8

181 847 wano w warunkach 5% CO2137°C, doprowadzano do proliferacji i oczyszczano zgodnie ze zwyczajną procedurą, by otrzymać monoklonalne przeciwciała GSPST-1 i HMS-1.

W tym przypadku, jeśli chodzi o przeciwciało HMS-1 i przeciwciało GSPST-1, otrzymane komórki wstrzyknięto wjamę brzuszną nagiej myszy BALB/cAJcl-nu (samiec, osiem tygodni, Nippon Kurea), od której po 10-14 dniach pobrano ciecz z jamy brzusznej, wysolono za pomocą 33% siarczanu amonowego i dializowano wobec PBS.

Mimochodem w powyższym przykładzie opisano przypadek, w którym komórki CF-1 były użyte jako antygeny dla immunizacji. Jednakże możliwe jest otrzymanie monoklonalnego przeciwciała w taki sam sposób również w przypadku stosowania innych komórek zrębu śledziony, łącznie z liniami komórek zrębu tkanki krwiotwórczej otrzymanych z ludzkich komórek zrębu śledziony, a przedmiotowy wynalazek nie jest ograniczony do powyższych przeciwciał monoklonalnych, lecz obejmuje wszystkie monoklonalne przeciwciała, mające takie same właściwości, wytwarzane w taki sam sposób i wszystkie hybrydomy produkujące te monoklonalne przeciwciała.

Hybrydoma produkująca monoklonalne przeciwciało HMS-1 otrzymana sposobem według wynalazku jest nową komórką pochodzącąz fuzji, otrzymaną/, komórki śledziony szczura Wistar Imamich i linii komórek szpiczaka myszy SP2/0-Agl4 jako komórek macierzystych i została zdeponowana 9 sierpnia 1993 pod nazwą HMS-1 (hybrydoma szczur-mysz) pod numerem dostępu FERM-BP-4383 w National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industnal Science and Technology (Krajowy Instytut Nauk Biologicznych i Technologii Ludzkiej, Agencja Nauk Przemysłowych i Technologii) w Japonii [adres: 1-3, Higashi 1-chome, Tsulkuba-shi, Ibaraki 305, Japonia], który jest międzynarodowym organem depozytowym, zgodnie z Traktatem budapesztańskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu mikroorganizmów dla celów procedury patentowej.

5) Właściwości przeciwciał.

(i) Reaktywność przeciwciał.

(Reaktywność wobec komórek CF-1)

Wyniki badania reaktywności otrzymanych monoklonalnych przeciwciał GSPST-1 i HMS-1 wobec komórek CF-1 zgodnie z analizą immunofluorescencyjną pokazano na fig. 1-3. Fig. 1 przedstawia wyniki analizy próbki kontrolnej przy braku przeciwciała, fig. 2 przedstawia wyniki analizy właściwości wiązania GSPST-1 do komórek CF-1, a fig. 3 przedstawia wyniki analizy właściwości wiązania HMS-1 do komórek CF-1. Na rysunkach osie pionowe przedstawiają względną liczbę komórek, a osie poprzeczne natężenie fluorescencji.

Jak wynika z fig. 1-3, okazało się, że monoklonalne przeciwciała gSpST-1 i HMS-1 mają właściwości wiązania się do komórek CF-1i rozpoznajjipowierzchniowe antygeny komórek CF-1.

(Reaktywność wobec komórek szpiku kostnego)

Następnie wyniki analizy reaktywności GSPST-1 i HMS-1 wobec normalnych komórek szpiku kostnego metodą cytometni przepływowej (FACScan, Becton Dickinson) są pokazane na fig. 4-6. Fig. 4 pokazuje tu wyniki analizy próbki kontrolnej przy braku przeciwciała, fig. 5 - wyniki analizy właściwości wiązania GSPST-1 do komórek szpiku kostnego, a fig. 6 - wyniki analizy właściwości wiązania HMS-1 do komórek szpiku kostnego. Na rysunkach osie pionowe przedstawiają względną liczbę komórek, a osie poprzeczne natężenie fluorescencji.

Jak pokazano na fig. 4-6, okazało się, że GSPST -1 nie ma w ogóle właściwości wiązania się do komórek szpiku kostnego, oraz ze HMS-1 ma właściwości wiązania się do pewnych komórek szpiku kostnego (u) Typowanie przeciwciał.

Następnie w wyniku typowania podklasy IgG otrzymanych monoklonalnych przeciwciał [przy zastosowaniu szczurzego zestawu Mono Ab-ID-Sp (Zymed)] okazało się, że GSPST-1 jest przeciwciałem IgG2a, a HMS-1 jest przeciwciałem IgG2b.

(iii) Zdolność hamowania transplantacji szpiku kostnego.

Następnie przeprowadzono eksperyment hamowania transplantacji szpiku kostnego przy użyciu tych przeciwciał, by zbadać ich właściwości. Wyniki pokazano na fig. 7 i 8. Jak wynika z fig. 7 i 8, podczas gdy HMS-1 ma wpływ hamujący transplantację szpiku kostnego, nie stwier181 847 dzono tego wpływu w przypadku GSPST-1. Mianowicie, powyższe wyniki otrzymane były przez podawanie 1,0 x 1θ⁵ na głowę komórek szpiku kostnego i monoklonalnych przeciwciał myszom C57BL/6J, które otrzymały śmiertelną dawkę promieniowania (900 cGy), poprzez żyły ogonowe i obserwowanie powstawania kolonii śledzionowych. Przypadkowo, „Bez leczenia” na fig. 8 oznacza przypadek, gdy nie podano komórek szpiku kostnego. Ponieważ monoklonalne przeciwciało HMS-1 otrzymane sposobem według wynalazku wykazuje, jak się okazało, działanie hamujące transplantację szpiku kostnego zgodnie z powyższym doświadczeniem, jest oczywiste, ze przeciwciało to powstrzymuje również osadzanie się macierzystych komórek krwiotwórczych i powstawanie kolonu CFU-S.

Dla fachowców jest zatem oczywiste, że wpływ przeciwciała monoklonalnego na hamowanie transplantacji szpiku kostnego jest zgodny z aktywnością w zakresie hamowania osadzania się macierzystych komórek krwiotwórczych i tworzenia kolonu CFU-S. Przykładowo podano, że monoklonalne przeciwciało (przeciwciało ACK-2, jedno z zestawu C przeciwciał) otrzymane przy użyciu znanej komórki tucznej jako antygenu ma działanie hamujące transplantację szpiku kostnego u myszy, podobnie jak monoklonalne przeciwciała według wynalazku [Blood, 78, 1706 (1991)]. W sprawozdaniu, zgodnie z wynikami doświadczenia nad hamowaniem transplantacji szpiku kostnego stwierdzono, że przeciwciało to powstrzymuje osadzanie się macierzystych komórek krwiotwórczych i tworzenie kolonii CFU-S.

Wspomniane powyżej znane przeciwciało ACK-2 przygotowane zostało przy użyciu komórki tucznej jako antygenu, a ta komórka tuczna różni się od komórki krwiotwórczej i proliferuje z macierzystej komórki krwiotwórczej. Z drugiej strony komórka zrębu tkanki krwiotwórczej stosowanej w wynalazku nie jest komórką krwiotwórczą, ale komórką wspomagającą różnicowanie i proliferację komórki krwiotwórczej, a zatem są one wyraźnie różne.

Następnie, kiedy hydrydomę wytwarzającą HMS-1 podawano do jamy brzusznej nagiej myszy, okazało się, że mysz ta nie umarła na skutek wodobrzusza. Należy zatem sądzić, że wpływ HMS-1 na hamowanie transplantacji szpiku kostnego nie jest zjawiskiem powodowanym przez tzw. apoptozę [samodestrukcj a komórek, zjawisko polegające na tym, że jądrowa chromatyna DNAjest trawiona na jednostki nukleosomowe (tak zwana formacja drabinkowa), co powoduje śmierć komórek], ale zjawiskiem powodowanym przez wiązanie monoklonalnego przeciwciała z molekułą odpowiedzialną za osadzanie się macierzystych komórek krwiotwórczych na tkance krwiotwórczej. Jest zatem oczywiste, że antygen rozpoznawany przez HMS-1 jest substancją ważną dla osadzania się macierzystych komórek krwiotwórczych na tkance krwiotwórczej.

Jak wykazało powyższe doświadczenie, monoklonalne przeciwciało HMS-1 otrzymane sposobem według wynalazku rozpoznaje powierzchniowy antygen komórki zrębu śledziony, posiadający zdolność wspomagania osadzania się macierzystych komórek krwiotwórczych i ma właściwość hamowania osadzania się macierzystych komórek krwiotwórczych.

HMS-1 ma zatem zdolność hamowania osadzania się komórek szpiku kostnego na tkance krwiotwórczej. Istniejądoniesienia, że komórki białaczkowe są odłączane od szpiku kostnego na skutek spadku ekspresji VLA41VLA5 moleduł adhezyjnych już opisanych komórek krwiotwórczych [ekspresja molekuły VLA może uczestniczyć w odłączaniu komórek ostrej białaczki szpikowej od szpiku kostnego, Leuk. Res., 16 (5), 469-474 (1992)] i sądzi się, że monoklonalne przeciwciało przeciwko VLA4 i VLA5 polepsza działanie leków przeciw białaczce przez uwalnianie komórek białaczkowych od szpiku kostnego. Powyższe HMS-1 może więc być stosowane podobnie przed leczeniem leukemii, by otrzymać taki sam efekt.

Monoklonalne przeciwciała wytwarzane zgodnie z wynalazkiem zostały opisane szczególnie w przykładzie powyżej Monoklonalne przeciwciała obejmują te, które zostały przedstawione w przykładach powyżej, ale nie zawsze ograniczają się do nich, lecz obejmują wszystkie monoklonalne przeciwciała posiadające takie same właściwości i działanie przygotowane w taki sam sposób

Zastosowanie przemysłowe.

Ponieważ monoklonalne przeciwciała otrzymane sposobem według wynalazku rozpoznają jako antygen substancję ważną dla osadzania się komórek szpiku kostnego na tkance krwiotwórczej i mają właściwość hamowania osadzania się macierzystych komórek krwiotwór10

181 847 czych, są one użyteczne jako lek, mający za zadanie wzmacnianie działania czynnika przeciwrakowego, na przykład polepszanie działania czynnika przeciwrakowego w przypadku białaczki przez odłączanie komórek ostrej białaczki szpikowej od szpiku kostnego zgodnie z powyzszą właściwością.

Fig. 3

Fig. 4

181 847

Fig. 5

5E0

Fsc

BBC

FL1

FL2

B. 255 B. 255 0. 255 0. 255

gj ~1 I I I 11 ll| I Γ! I I II l| I I I 111111 Ί I I I 11 ll ia⁰ w¹ la² i0³ ia‘ FL 1

Fig. 6

181 847

Liczba kolonii śledzion/ (12 dni)

próbka GSPST-1 kontrolna

Monoklonalne przeciwciało

Test dla GSPST-1 hamowania transplantacji szpiku kostnego

Fig. 7

181 847

Monoklonalne przeciwciało

Test dla HMS-1 hamowania transplantacji szpiku kostnego

Fig 8

181 847

Fig. 1 rsc ssc

FLI

FL2

Fig. 2

Departament Wydawnictw UP RP Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania monoklonanych przeciwciał hamujących osadzanie się macierzystych komórek krwiotwórczych i rozpoznających powierzchniowy antygen komórki zrębu śledziony, należących do klasy IgG, znamienny tym, że immunizuje się ssaka komórkami zrębu śledziony pochodzącymi od zwierzęcia traktowanego rG-CSF, poddaje się immunizowane komórki ssaka fuzji z komórkami szpiczaka ssaka, takiego jak mysz, klonuje się otrzymane hybrydomy, wyselekcjonowuje się komórki hybrydomy produkujące przeciwciało, hoduje je i wyodrębnia otrzymane monoklonalne przeciwciała, które selekcjonuje się na podstawie reaktywności wobec komórek szpiku kostnego, typowania przeciwciał i zdolności hamowania transplantacji szpiku kostnego.
2. 2. Sposób według zastrz 1, znamienny tym, że hoduje się hybrydomę HMS-1 zdeponowaną pod numerem FERM BP-4383.
3. 3. Sposób wytwarzania hybrydomy produkującej monoklonalne przeciwciała hamujące osadzanie się macierzystych komórek krwiotwórczych i rozpoznające powierzchniowy antygen komórki zrębu śledziony, należące do klasy IgG, znamienny tym, że immunizuje się ssaka komórkami zrębu śledziony pochodzącymi od zwierzęcia traktowanego rG-CSF, poddaje się immunizowane komórki ssaka fuzji z komórkami szpiczaka ssaka, takiego jak mysz, klonuje się otrzymane hybrydomy i wyselekcjonowuje się komórki hybrydomy produkujące przeciwciała.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że wyselekcjonowuje się hybrydomę HMS-1 zdeponowaną pod numerem FERM BP-4383.

   * * *