CN1948484A

CN1948484A - 抑制人hPEBP4基因表达的siRNA及其应用

Info

Publication number: CN1948484A
Application number: CNA2005100305335A
Authority: CN
Inventors: 王晓健; 李楠; 王青青; 曹雪涛
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2005-10-14
Filing date: 2005-10-14
Publication date: 2007-04-18

Abstract

本发明涉及一种特异性抑制人磷脂酰乙醇胺结合蛋白4(hPEBP4)的小干扰RNA(siRNA)核苷酸序列。具体而言，本发明涉及特异性抑制hPEBP4的表达及功能的siRNA核苷酸序列，该siRNA核苷酸序列具有靶向性抗肿瘤细胞hPEBP4mRNA和蛋白表达以及促进肿瘤细胞凋亡的功能，从而起到治疗肿瘤的作用。本发明还涉及含有该siRNA核苷酸序列的药物组合物，并公开了将该siRNA药物在肿瘤治疗中的用途，特别是在过表达hPEBP4的恶性肿瘤治疗中的用途。

Description

抑制人hPEBP4基因表达的siRNA及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域。本发明涉及一种特异性抑制人磷脂酰乙醇胺结合蛋白4(hPEBP4)的小干扰RNA(siRNA)核苷酸序列。具体而言，本发明涉及特异性抑制hPEBP4的表达及功能的siRNA核苷酸序列，该siRNA核苷酸序列具有靶向性抗肿瘤细胞hPEBP4 mRNA和蛋白表达以及促进肿瘤细胞凋亡的功能，从而起到治疗肿瘤的作用。本发明还涉及含有该siRNA核苷酸序列的药物组合物，并公开了将该siRNA药物在肿瘤治疗中的用途，特别是在过表达hPEBP4的恶性肿瘤治疗中的用途。

背景技术

细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是一种在特定时空主动发生的、受基因严密调控的细胞逐渐死亡现象，在肿瘤发生、发展、肿瘤治疗、胚胎发育、免疫反应、神经系统发育、组织细胞代谢等过程中起重要作用。肿瘤的发生是一个复杂的生物学过程，主要是由于细胞内癌基因、抑癌基因及其他相关调节基因突变，从而使细胞基因组失去稳定性，最终导致肿瘤的发生。细胞凋亡是细胞监测系统重要的组成部分，如果其出现异常，会导致本应凋亡的细胞“非法”存活，造成细胞的失控性增殖，产生高度恶化状态的肿瘤细胞。在细胞癌变过程中，许多凋亡活化基因功能受阻，而凋亡抑制基因的功能得到增强。已经发现，不少肿瘤的发生机制就是由于凋亡受阻引起的，如淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、慢性白血病等。

由于细胞凋亡异常在许多人类恶性肿瘤的发生、发展中起着重要的作用，选择性地诱导肿瘤细胞凋亡为目标的理论和技术已经成为治疗恶性肿瘤的主要策略之一。目前临床上采用的放射治疗，大多数化疗药物和生物治疗剂主要都是通过诱导细胞凋亡来清除肿瘤细胞。科学家们对未来肿瘤治疗的展望是通过凋亡疗法来增加杀死肿瘤的敏感性和特异性。即以诱导细胞凋亡为目标的基因治疗，通过分子生物学的途径在肿瘤细胞内导入诱导凋亡的活化基因或灭活凋亡的抑制基因，特异性的恢复并增强肿瘤细胞内的凋亡功能，提高肿瘤对放疗和化疗药物的特异性和敏感性，达到有效治疗肿瘤的目的。

磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)蛋白是一类能与磷脂酰乙醇胺(PE)结合的蛋白。该家族的所有成员都含有与PE结合的保守区域，PEBP家族来源广泛，包括果蝇触觉的气味结合蛋白(OBP)、盘尾丝吸虫感染后的免疫血清识别的抗原Ag16，酵母中抑制CDC25突变的TFS1因子，哺乳动物的Raf-kinaseinhibitor，RKIP等等。PEBP存在于组织细胞液，不存在于血清，淋巴液和乳液。在大脑特别是少突状足细胞和男性生殖器官高表达，在膜的生物合成和维持膜隔离抗原中扮演着重要的角色。人和小鼠大脑中PEBP为十一氨基酸多肽海马趾类胆碱神经刺激肽(HCNP)前体蛋白，而HCNP促进乙酰胆碱的合成。PEBP家族成员功能广泛，涉及到抵抗凋亡，膜形成，精子的成熟等各方面的生理功能，并与肿瘤的发生、发展、转移具有一定的相关性。

hPEBP4是从正常人骨髓基质细胞中分离到一种新型PEBP。HPEBP4原称为“HPEBP5”，其核苷酸序列和氨基酸见中国专利申请CN02136556.3。hPEBP4属于PEBP第四类亚家族，与PEBP家族蛋白具有高度同源性，在75位到195位为磷脂酰乙醇胺结合保守区域(PBP)其序列已在GenBank登录(GenBank登录号AY037148)。

RNAi干扰(RNA interference)技术，是近两年发展起来封闭基因表达的有效方法，采用与目的基因同源的21-23核苷酸或发夹状不同长度的双链RNA，可使不同类型细胞的靶向基因明显降低。甚至有时用专一性抗体都检测不到靶向基因所表达的蛋白质或肽类。RNAi是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(PETG，post-transcriptional gene silencing)。在哺乳动物细胞中建立RNA干涉技术，可以用于研究某些特定基因的功能，从而解决某些疾病的发病机制，同时对疾病尤其是对肿瘤的治疗有一定的价值。该策略可以将癌症基因关闭，而仅有一个碱基突变则丧失RNA干扰作用，对正常细胞影响甚微，特异性强。

在目前的技术领域中，以下列出的几种基因序列的给药方法，均可用于siRNA的给药：

1.直接裸DNA注射法

(1)新喷气注射系统释放裸DNA治疗序列，可以采用一种新的喷气注射系统，将裸DNA释放到体内的肺肿瘤中。沃尔瑟(W.Walter)博士和同事开发了一种便携的“高速喷气注射器”系统，在病毒媒介和脂质体基因释放系统之外提供了又一选择。研究者使用这种系统注射3段裸DNA到小鼠的Lewis肺肿瘤中，第一个质粒表达β-半乳糖激酶基因(LacZ)，第二个表达绿荧光(GFP)基因，第三个表达人类肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。每个小鼠都接受5次注射，压力为3Pa，释放3～5微升质粒DNA。沃尔瑟博士等在《基因治疗》(Gene Therpapy)报告说，注射后肿瘤上的基因呈广泛表达。LacZ和GFP基因表达在注射后48小时变得明显，在72～96小时达到峰值；LacZ表达和TNF-α分泌在24～120小时出现。他们认为，“这些发现证明了喷气注射的适用性，即在体内传送基因到肿瘤时使用最小剂量的裸DNA进行癌症基因治疗。”；

(2)裸DNA直接注射：将裸质粒DNA直接注射到机体的肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内、瘤体内。这种方法简单易行；

2.脂质体包裹DNA直接注射法：包裹DNA的脂质体能与组织细胞发生膜融合，而将DNA摄入，减少了核酸酶对DNA的破坏。注射途径同裸DNA直接注射；

3.金包被DNA基因枪轰击法：将质粒DNA包被在金微粒子表面，用基因枪使包被DNA的金微粒子高速穿入组织细胞；

4.繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法：选择一种容易进入某组织器官的细菌，将其繁殖基因去掉，然后用质粒DNA转为细菌，当这些细菌进入某组织器官后，由于不能繁殖，则自身裂解而释放质粒DNA。即：可口服的减毒沙门氏菌；

5.复制缺陷腺病毒携带目的DNA法：选择一种容易进入某组织器官的复制缺陷型腺病毒，携带目的RNA干扰序列，可以通过肌肉、皮内、皮下、粘膜、静脉内、瘤体内等途径在宿主体内表达目的RNA干扰序列。

随着近年来众多放疗和化疗药物开发和生产，如何提高肿瘤细胞和肿瘤对放疗和化疗药物的特异性和敏感性，从而达到有效治疗肿瘤的目的，是目前生物医药领域所面临的一大问题。RNA干扰正是研究者探寻出的一种通过促进肿瘤细胞凋亡而抑制肿瘤的方法。但是，虽然在临床试验及应用中，RNA干扰在治疗某些肿瘤和病毒性感染方面取得了一些进展，但是所取得的结果尚不十分令人满意。

因此，本领域迫切需要进一步开发特异性、高效性、可有效促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤的RNA干扰药物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题正是提供一种通过促进肿瘤细胞凋亡抗肿瘤的siRNA，所述的siRNA特异性地在mRNA水平靶向hPEBP4基因，对高表达hPEBP4基因的肿瘤细胞的生物学行为进行干预，有效抑制hPEBP4表达，促进肿瘤细胞的凋亡，从而达到抗肿瘤效果。

在本发明的第一方面中，提供了一种针对人hPEBP4的小干扰RNA，所述的小干扰RNA对应的靶序列是人hPEBP4基因的mRNA，所述的小干扰RNA的长度为16-30bp，且可使经其转染后的MCF-7细胞的mRNA或蛋白表达下降60％以上(如70-95％，较佳地80-90％)。较佳地，所述的小干扰RNA的长度为18-25bp。

在本发明的一个实施方式中，所述的小干扰RNA结合于hPEBP4的PE结合保守区域对应的核苷酸序列。较佳地，所述的小干扰RNA含有选自SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的小干扰RNA，其特征在于，所述的小干扰RNA的序列为：5’-GGAAAAGUCAUCUCUCUCCTT-3’

3’-TTCCUUUUCAGUAGUGAGAGG-5’。

较佳地，所述小干扰RNA的3’端还含有2-4个dT或含有2-6个U的延伸结构。

在本发明的第二方面中，涉及了一种组合物，所述组合物含有0.001-99.99wt％如前所述的小干扰RNA以及可接受的载体、稀释剂或赋形剂。较佳地，所述的组合物是药物组合物，并且所述的载体、稀释剂或赋形剂是药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明的第三方面涉及所述的小干扰RNA的用途，所述小干扰RNA用于制备促进肿瘤细胞凋亡的组合物或治疗肿瘤的药物组合物。

较佳地，所述的肿瘤细胞或肿瘤表达hPEBP4蛋白，并且选自下组：乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌。

本发明的第四方面，涉及一种hPEBP4的抑制剂或拮抗剂在制备促进肿瘤细胞的凋亡或抑制肿瘤生长的药物中的用途。

较佳地，所述的抑制剂或拮抗剂选自下组：反义核酸、siRNA、抗体。

附图说明

图1：本发明的siRNA处理48h后的MCF-7细胞中，hPEBP4的PCR扩增产物电泳图和蛋白表达的Western印迹图；

图2：本发明的siRNA处理对TNFα诱导的MCF-7乳腺癌细胞凋亡的影响。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究发现，hPEBP4高表达于肿瘤细胞内，这种高表达会导致TNFα诱导的凋亡受抑制，而hPEBP4在肿瘤细胞中的表达沉默能促进TNFα诱导凋亡，从而抑制肿瘤细胞和肿瘤的生长。本发明人还进一步合成和测试了多种hPEBP4的siRNA，筛选出了可强烈抑制RabJ的表达进而抑制肿瘤细胞的增殖和体内外的致瘤性的siRNA序列。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人的研究表明，hPEBP4的氨基酸序列在75-195位为典型的磷脂酰乙醇胺结合保守区域(PBP)。hPEBP4能通过抑制Ras/Raf/MEK/ERK途径、JNK活化和PE外翻来抑制TNFα诱导的细胞凋亡，这些功能均由其PE结合保守区域(PBP)介导。

RT-PCR显示，hPEBP4作为抗凋亡分子在前列腺癌PC-3、卵巢癌CaoV-3、乳腺癌MCF-7等肿瘤细胞中高表达，而肺癌来源的A549细胞和结肠癌来源的LoVo细胞等大部分实体肿瘤细胞未见表达。在临床肿瘤标本中，hPEBP4蛋白高表达于50％以上的乳腺癌肿瘤组织中，而仅表达于4％的正常乳腺组织中。此外，实验结果还显示hPEBP4表达下调增强了乳腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞对TNFα诱导凋亡的敏感性，表明hPEBP4是治疗乳腺癌等肿瘤潜在的作用靶点。

活性成分

在本发明中，活性成分是hPEBP4的siRNA序列。如本文所用，术语“活性成分”指这样的hPEBP4的siRNA序列：所述的siRNA的靶序列是人hPEBP4基因mRNA，其长度通常为16-30bp，更佳地为18-25bp，且所述的siRNA可使经其转染后的MCF-7细胞的mRNA和/或蛋白表达下降70％以上。

hPEBP4的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，编码hPEBP4蛋白质(如SEQ IDNO：9所示)。SEQ ID NO：8全长874bp，含681bp编码区，编码227个氨基酸，与其他分子比较发现与磷脂酰乙醇结合蛋白(PEBP)具有一定的同源性，在75位到195位为磷脂酰乙醇胺结合保守区域。

针对癌基因进行特定基因沉默时肿瘤治疗的热点之一，RNA干扰技术是目前高特异性的有效技术，因此无论是在功能基因组研究，还是肿瘤地基因治疗方面均具有广阔地应用前景。本发明人根据已知的siRNA设计原则(如Cenix等人的设计原则)，针对hPEBP4基因不同靶位点设计了多条siRNA。其中，干扰siRNA序列si-hPEBP4(SEQ ID NO：1)可有效地抑制hPEBP4的表达。这证实hPEBP4的siRNA可望成为治疗肿瘤的有效手段。

本发明的siRNA可以单独使用或几条siRNA联合，还可以与其它药物和治疗手段联合，用于高表达hPEBP4的恶性肿瘤的治疗。

本发明所选用的RNA干扰序列si-hPEBP4可以通过直接的化学合成、体外转录、质粒扩增、病毒复制等方式获得，因此本发明应包括包含该序列的前述应用形式。

本发明的hPEBP4的siRNA序列能有效封闭hPEBP4基因，从而抑制肿瘤细胞的增殖。具体地，本发明的si-hPEBP4序列在mRNA水平针对hPEBP4基因，对阳性表达hPEBP4的肿瘤细胞的生物学行为进行逆转。实验证明：(1)本发明的si-hPEBP4序列能显著抑制肿瘤细胞本发明的hPEBP4mRNA和蛋白的表达；(2)经本发明的si-hPEBP4序列抑制hPEBP4表达后，可提高肿瘤细胞对TNFα诱导凋亡的敏感性，从而促使肿瘤细胞凋亡。

药物组合物及给药方法

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量(如0.001-99wt％)的本发明的hPEBP4的siRNA序列以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。

使用药物组合物时，是将安全有效量的hPEBP4的siRNA序列施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约5毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

在制备药物组合物时，通常，可将这些本发明的siRNA序列配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

优选的本发明的siRNA序列药物的给药方式包括但不限于：(1)直接裸DNA注射法，如利用喷气注射系统释放裸DNA治疗序列、裸DNA直接注射；(2)脂质体包裹DNA直接注射法；(3)金包被DNA基因枪轰击法；(4)繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法；(5)复制缺陷腺病毒携带目的DNA法。

此外，本发明的siRNA序列可单独直接用于疾病治疗，还可与其他治疗剂联用，如TNF-α、TGF-β、IFN-α、Angiostatin、Endostatin、甘磷酰芥、血卟啉、石蒜碱内铵盐、鸦胆子乳、足叶乙甙(即依托泊甙)、脱水卫矛醇、阿霉素、三苯氧胺、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、双呋喃氟尿嘧啶、葫芦素、三尖杉酯碱、冬凌草乙素、马蔺子甲素、云芝糖肽、阿糖胞苷、卡波铂、紫杉醇、香菇多糖、氟他胺、异环磷酰胺、乌苯美司、醋酸亮丙瑞林、脱氧氟尿苷、洛波铂、依林诺特肯、来屈唑和替尼泊甙等。

本发明的主要优点在于：

(a)本发明针对hPEBP4基因靶位点所设计的siRNA序列，可有效抑制肿瘤相关的hPEBP4的表达，从而用于癌症治疗；

(b)本发明的siRNA序列可以单独使用或几个siRNA序列联合，还可以与其它药物和治疗手段联合，用于恶性肿瘤的治疗。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

材料和方法

(a)siRNA

本发明实施例中的hPEBP4的siRNA序列是根据Elbashir的siRNA userguider设计原则，针对hPEBP4mRNA的475-495位点选取的1段21个碱基的siRNA序列，其序列如下所示：

si-hPEBP4：5’-GGAAAAGUCAUCUCUCUCCTT-3’

3’-TTCCUUUUCAGUAGUGAGAGG-5’(SEQ ID NO：1)。

si-hPEBP4作用的靶位点序列如下所示：

5’-GGAAAAGTCATCTCTCTCCTT-3’(475-495位)(SEQ ID NO：2)

阴性对照siRNA寡核苷酸si-neg(SEQ ID NO：3)，为与人、大鼠小鼠基因均无任何同源性的杂乱序列，其序列如下所示：

si-neg：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT

3’-TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA(SEQ ID NO：3)

siRNA的体外化学合成由上海吉凯公司完成。

(b)细胞系

MCF-7细胞系：ATCC：HTB-22(购自ATCC)，这是一种阳性表达hPEBP4的乳腺癌肿瘤细胞系。

PC-3细胞系：ATCC：CRL-1435(购自ATCC)，这是一种阳性表达hPEBP4的前列腺癌肿瘤细胞系。

CaoV-3细胞系：ATCC：HTB-75(购自ATCC)，这是一种阳性表达hPEBP4的卵巢癌肿瘤细胞系。

细胞的培养和处理：将细胞接种于含10％的小牛血清的RPMI1640(Invitrogen公司)培养液，置于37摄氏度、体积分数为5％的CO₂培养箱中常规培养，实验前无药培养两周。将待转染的oligoRNA用无血清的Opti-MEM(Invitrogen)稀释，与OligofectAMINE按一定比例混合，室温作用20分钟；将生长于6孔细胞培养板或10mm培养皿的待转染细胞培养至60-80％汇合(confluent)，用Opti-MEM无血清培养基洗两遍后，按常规培养细胞方式加入正常培养基。滴入RNA-脂质体混合物，置37℃5％CO₂培养48小时，收集细胞进行检测。

实施例1：siRNA(small interfering RNA，小干扰RNA)的设计合成、退火和转染

本实施例的hPEBP4的siRNA序列是根据Elbashir的siRNA user guider设计原则设计，并另设阴性对照。

退火步骤如下：(1))用无RNA酶的水将体外合成的两条RNA链配成20μM；(2)将退火缓冲液(100mM醋酸钾，30Mm HEPES-KOH，pH7.4，2mM醋酸镁)与21-ntRNA(20μM)于90℃孵育1分钟后，37℃孵育1小时。

RNAi转染主要步骤如下：(1)待转染细胞的准备：将MCF-7(ATCC：HTB-22)细胞接种于含10％的小牛血清的RPMI1640(Invitrogen公司)培养液，置于37摄氏度、体积分数为5％的CO₂培养箱中常规培养，于实验前无药培养两周；(2)OligoRNA的准备：用无血清的Opti-MEM(Invitrogen)稀释待转染OligoRNA，将其与OligofectAMINE(Invitrogen)按一定比例混合，室温作用20分钟；(3)转染：将生长于6孔细胞培养板或10mm培养皿的待转染细胞培养至60-80％汇合(confluent)，用Opti-MEM无血清培养基洗两遍后，按常规培养细胞方式加入正常培养基，滴入RNA-脂质体混合物，置37℃5％CO₂培养48小时，收集细胞用作Western印迹或RT-PCR分析。

实施例2：RNA干扰对MCF-7细胞中hPEBP4的mRNA和蛋白表达的影响

本实施例从mRNA和蛋白质水平两个层次来检测si-hPEBP4对MCF-7细胞hPEBP4表达的抑制作用。

(a)RT-PCR法检测mRNA

方法如下：

(1)细胞总RNA的制备：制备按Trizol试剂(Invitrogen公司)说明进行。悬浮细胞离心收集后用PBS洗2次，按1×10⁷细胞加入1ml细胞总RNA抽提试剂Trizol，充分匀浆；加入0.2ml氯仿混匀，室温静置3分钟后，4℃，12,000g离心15分钟；吸取上层水相置于新管中，加入0.5ml异丙醇，室温静置10分钟后，4℃，12,000g离心10分钟；弃上清，沉淀以75％乙醇洗涤，4℃，7,500g离心5分钟后，空气干燥；溶解于40μl DEPC处理的水溶液，进行浓度和纯度测定(GeneQuant II，Pharmacia Biotech)后保存于-80℃；

(2)RT-PCR扩增及鉴定：取2μg细胞总RNA与1μg Oligo(dT)15及40U RNA酶抑制剂混合，以20U AMV逆转录酶于42℃作用1.5小时。经70℃灭活后，取1/10逆转录产物行PCR扩增(Gene Amp PCR system 9600，Perkin-Elmer公司)。

hPEBP4上游引物序列如下所示：

5’-GGG TTG GAC AAT GAG GCT G-3’(SEQ ID NO：4)；

hPEBP4下游引物序列如下所示：

5’-TGT GCT TGG GCT CGC TGG C-3’(SEQ ID NO：5)。

内参照hβ-actin上游引物序列如下所示：

5′-GCA TCC TCA CCC TGA AGT AC-3′(SEQ ID NO：6)；

内参照hβ-actin下游引物序列如下所示：

5′-TTC TCC TTA ATG TCA CCC AC-3′(SEQ ID NO：7)

反应参数：95℃15秒，57℃30秒，72℃30秒，28循环后72℃延伸10分钟，产物预期大小为653bp。反应体积为50μl，引物浓度为200nM，dNTP浓度为200μM，镁离子浓度为1.5mM。

扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。

(b)Western-blot法检测hPEBP4蛋白水平

方法如下：收集si-hPEBP4转染48小时的MCF-7细胞，裂解细胞。并将细胞裂解液进行12％SDS-PAGE，随后以100V恒电压于4℃转至硝酸纤维素膜上，丽春红染色并标记大小和方向。室温封闭2小时(5％脱脂奶粉的TBST溶液)，以封闭液稀释抗hPEBP4抗血清(按中国专利申请CN02136556.3的实施例5所述的方法制备)，室温孵育1小时，TBST(0.05％Tween20的TBS溶液)洗15分钟、3次，以阻断液1∶1000稀释二抗(HRP标记的抗兔IgG抗体)，室温孵育45分钟，TBST洗15分钟、3次，TBS(10mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl)洗15分钟，将Western印迹荧光检测试剂中的A液和B液以等体积混合，室温孵育1分钟，将膜封于塑料袋中室温放射自显影30秒-5分钟，以D72显影液显影3分钟，定影液定影10分钟。

结果

MCF-7细胞经siRNA处理48h后检测，与阴性对照组相比，si-hPEBP4组mRNA和蛋白表达明显下降，表明si-hPEBP4转染成功阻抑了hPEBP4的表达，而21nt的阴性对照siRNA寡核苷酸(si-neg)对hPEBP4的表达没有影响(结果如图1所示)。

实施例3：RNA干扰导致MCF-7细胞中hPEBP4的表达下调，对TNFα诱导的细胞凋亡的促进

本实施例采用流式细胞仪检测si-hPEBP4处理后的MCF-7细胞对TNFα诱导凋亡的敏感性。

si-hPEBP4感染MCF-7细胞48小时后，用20ng/ml TNFα(Peprotech公司)处理细胞24h。然后将细胞悬浮于50μl的染色液，加入1μl AnnexinV(ApoAlertAnnexin V Apoptosis kit，Becton Dickinson公司)或者0.5μl的10mMR123(R-302)(Molecular Probes公司)作用10分钟后，加入0.5μl PI标记5分钟。用流式细胞仪(FACSCalibur，Becton Dickinson公司)检测细胞凋亡情况。流式细胞分析的结果用CellQuest软件(Becton Dickinson公司)分析或叠加。

结果如图2所示：hPEBP-特异性siRNA(si-hPEBP4)或者突变的siRNA阴性对照(si-neg)转染MCF-7细胞48小时后，经hPEBP4-特异性siRNA作用后表达下调的MCF-7细胞对TNFα诱导的凋亡更加敏感(20ng/mlTNFα情况下，空白siRNA组、si-neg对照组和si-hPEBP4组Annexin V+凋亡细胞分别为30.06％、32.17％和70.41％)。

实施例4RNA干扰对前列腺癌PC-3、卵巢癌CaoV-3细胞中hPEBP4mRNA和蛋白表达的影响以及细胞凋亡的促进

本实施例所用的试验方法和材料基本与实施例2-3相同，不同点仅在于用前列腺癌PC-3、卵巢癌CaoV-3细胞替换了MCF-7细胞。

两种细胞系对hPEBP4mRNA和蛋白表达的试验结果均显示si-hPEBP4组mRNA和蛋白表达的明显下降，表明si-hPEBP4转染成功阻抑了hPEBP4的表达，而21nt的阴性对照siRNA寡核苷酸(si-neg)对hPEBP4的表达没有影响。

两种细胞系对TNFα诱导的细胞凋亡的试验结果也均显示经hPEBP4-特异性siRNA作用后表达下调的细胞对TNFα诱导的凋亡更加敏感。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>浙江大学

<120>抑制人hPEBP4基因表达的siRNA及其应用

<130>057870

<160>9

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>1

ggaaaaguca ucucucucct t 21

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>2

ggaaaagtca tctctctcct t 21

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>3

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>4

gggttggaca atgaggctg 19

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>5

tgtgcttggg ctcgctggc 19

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>6

gcatcctcac cctgaagtac 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>寡核苷酸

<400>7

ttctccttaa tgtcacccac 20

<210>8

<211>874

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(66)..(746)

<223>

<400>8

actggattcg ctgcggagcc ctggaagctg cctttccttc tccctgtgct taaccagagg 60

tgccc atg ggt tgg aca atg agg ctg gtc aca gca gca ctg tta ctg ggt 110

Met Gly Trp Thr Met Arg Leu Val Thr Ala Ala Leu Leu Leu Gly

1 5 10 15

ctc atg atg gtg gtc act gga gac gag gat gag aac agc ccg tgt gcc 158

Leu Met Met Val Val Thr Gly Asp Glu Asp Glu Asn Ser Pro Cys Ala

20 25 30

cat gag gcc ctc ttg gac gag gac acc ctc ttt tgc cag ggc ctt gaa 206

His Glu Ala Leu Leu Asp Glu Asp Thr Leu Phe Cys Gln Gly Leu Glu

35 40 45

gtt ttc tac cca gag ttg ggg aac att ggc tgc aag gtt gtt cct gat 254

Val Phe Tyr Pro Glu Leu Gly Asn Ile Gly Cys Lys Val Val Pro Asp

50 55 60

tgt aac aac tac aga cag aag atc acc tcc tgg atg gag ccg ata gtc 302

Cys Asn Asn Tyr Arg Gln Lys Ile Thr Ser Trp Met Glu Pro Ile Val

65 70 75

aag ttc ccg ggg gcc gtg gac ggc gca acc tat atc ctg gtg atg gtg 350

Lys Phe Pro Gly Ala Val Asp Gly Ala Thr Tyr Ile Leu Val Met Val

80 85 90 95

gat cca gat gcc cct agc aga gca gaa ccc aga cag aga ttc tgg aga 398

Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Ala Glu Pro Arg Gln Arg Phe Trp Arg

100 105 110

cat tgg ctg gta aca gat atc aag ggc gcc gac ctg aag aaa ggg aag 446

His Trp Leu Val Thr Asp Ile Lys Gly Ala Asp Leu Lys Lys Gly Lys

115 120 125

att cag ggc cag gag tta tca gcc tac cag gct ccc tcc cca ccg gca 494

Ile Gln Gly Gln Glu Leu Ser Ala Tyr Gln Ala Pro Ser Pro Pro Ala

130 135 140

cac agt ggc ttc cat cgc tac cag ttc ttt gtc tat ctt cag gaa gga 542

His Ser Gly Phe His Arg Tyr Gln Phe Phe Val Tyr Leu Gln Glu Gly

145 150 155

aaa gtc atc tct ctc ctt ccc aag gaa aac aaa act cga ggc tct tgg 590

Lys Val Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Asn Lys Thr Arg Gly Ser Trp

160 165 170 175

aaa atg gac aga ttt ctg aac cgt ttc cac ctg ggc gaa cct gaa gca 638

Lys Met Asp Arg Phe Leu Asn Arg Phe His Leu Gly Glu Pro Glu Ala

180 185 190

agc acc cag ttc atg acc cag aac tac cag gac tca cca acc ctc cag 686

Ser Thr Gln Phe Met Thr Gln Asn Tyr Gln Asp Ser Pro Thr Leu Gln

195 200 205

gct ccc aga gaa agg gcc agc gag ccc aag cac aaa aac cag gcg gag 734

Ala Pro Arg Glu Arg Ala Ser Glu Pro Lys His Lys Asn Gln Ala Glu

210 215 220

ata gct gcc tgc tagatagccg gctttgccat ccgggcatgt ggccacactg 786

Ile Ala Ala Cys

225

cccaccaccg acgatgtggg tatggaaccc cctctggata cagaacccct tcttttccaa 846

ataaaaaaaa aatcatccag gaaaaaaa 874

<210>9

<211>227

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>9

Met Gly Trp Thr Met Arg Leu Val Thr Ala Ala Leu Leu Leu Gly Leu

1 5 10 15

Met Met Val Val Thr Gly Asp Glu Asp Glu Asn Ser Pro Cys Ala His

20 25 30

Glu Ala Leu Leu Asp Glu Asp Thr Leu Phe Cys Gln Gly Leu Glu Val

35 40 45

Phe Tyr Pro Glu Leu Gly Asn Ile Gly Cys Lys Val Val Pro Asp Cys

50 55 60

Asn Asn Tyr Arg Gln Lys Ile Thr Ser Trp Met Glu Pro Ile Val Lys

65 70 75 80

Phe Pro Gly Ala Val Asp Gly Ala Thr Tyr Ile Leu Val Met Val Asp

85 90 95

Pro Asp Ala Pro Ser Arg Ala Glu Pro Arg Gln Arg Phe Trp Arg His

100 105 110

Trp Leu Val Thr Asp Ile Lys Gly Ala Asp Leu Lys Lys Gly Lys Ile

115 120 125

Gln Gly Gln Glu Leu Ser Ala Tyr Gln Ala Pro Ser Pro Pro Ala His

130 135 140

Ser Gly Phe His Arg Tyr Gln Phe Phe Val Tyr Leu Gln Glu Gly Lys

145 150 155 160

Val Ile Ser Leu Leu Pro Lys Glu Asn Lys Thr Arg Gly Ser Trp Lys

165 170 175

Met Asp Arg Phe Leu Asn Arg Phe His Leu Gly Glu Pro Glu Ala Ser

180 185 190

Thr Gln Phe Met Thr Gln Asn Tyr Gln Asp Ser Pro Thr Leu Gln Ala

195 200 205

Pro Arg Glu Arg Ala Ser Glu Pro Lys His Lys Asn Gln Ala Glu Ile

210 215 220

Ala Ala Cys

225

Claims

1.一种针对人hPEBP4的小干扰RNA，其特征在于，所述的小干扰RNA对应的靶序列是人hPEBP4基因的mRNA，所述的小干扰RNA的长度为16-30bp，且可使经其转染后的MCF-7细胞的mRNA或蛋白表达下降60％以上。

2.如权利要求1所述的小干扰RNA，其特征在于，所述的小干扰RNA的长度为18-25bp。

3.如权利要求1所述的小干扰RNA，其特征在于，所述的小干扰RNA结合于hPEBP4的PE结合保守区域对应的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的小干扰RNA，其特征在于，所述的小干扰RNA含有选自SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

5.如权利要求1所述的小干扰RNA，其特征在于，所述的小干扰RNA的序列为：

5’-GGAAAAGUCAUCUCUCUCCTT-3’

3’-TTCCUUUUCAGUAGUGAGAGG-5’。

6.根据权利要求1-5中任一所述的小干扰RNA，其特征在于，所述小干扰RNA的3’端还含有2-4个dT或含有2-6个U的延伸结构。

7.一种组合物，其特征在于，其含有0.001-99.99wt％权利要求1-6中任一项所述的小干扰RNA以及可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的组合物是药物组合物，并且所述的载体、稀释剂或赋形剂是药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

9.权利要求1所述的小干扰RNA的用途，其特征在于，用于制备促进肿瘤细胞凋亡的组合物或治疗肿瘤的药物组合物。

10.一种hPEBP4的抑制剂或拮抗剂在制备促进肿瘤细胞的凋亡或抑制肿瘤生长的药物中的用途。