CN111372593A - 治疗乙型肝炎感染的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及改进的基于寡核苷酸的组合物和用于治疗受试者中HBV感染的相关方法。在一些实施方式中，本公开涉及产生持久的HBV表面抗原(HBsAg)表达的敲低的有效寡核苷酸的开发。寡核苷酸诱导RNA干扰(RNAi)介导的mRNA的识别和破坏，所述mRNA编码肝细胞中所有形式的HBsAg。本公开提供了一种用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含反义链。在一些实施方式中，所述寡核苷酸还包含有义链，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区。

Description

治疗乙型肝炎感染的方法
技术领域
本申请涉及寡核苷酸及其用途，特别是涉及治疗乙型肝炎感染的用途。
背景技术
慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是全世界发病率和死亡率的重要原因。当前的HBV疗法(例如核苷类似物)需要终身治疗以降低血浆病毒血症，并且从长远来看通常无效。慢性HBV的功能治愈传统上是最佳的治疗结果。RNA干扰(RNAi)技术为药理上干预提供了可能性。
外包膜蛋白统称为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)。HBsAg由称为S、M和L由重叠的开放阅读框(ORF)编码的三个相关的多肽组成。最小的包膜蛋白是具有226个氨基酸的S，称为S-ORF。M和L是从上游翻译起始位点产生的，分别向S中添加55和108个氨基酸。HBV S、M和L糖蛋白存在于完整的、传染性HBV病毒体(被称为Dane颗粒)的病毒包膜中，并且所有三种产生和分泌过多，形成了慢性HBV患者血液中发现的非感染性亚病毒球形和丝状颗粒(均称为诱饵颗粒)。诱饵颗粒表面的大量HBsAg被认为抑制了慢性HBV感染(CHB)患者的体液免疫和自发清除。
发明内容
本公开的方面涉及改进的基于寡核苷酸的组合物和用于治疗受试者中HBV感染的和相关方法。在一些实施方式中，本公开涉及产生持久的HBV表面抗原(HBsAg)表达的敲低的有效寡核苷酸的开发。寡核苷酸诱导RNA干扰(RNAi)介导的mRNA的识别和破坏，所述mRNA编码肝细胞中所有形式的HBsAg。这包括从cccDNA和已整合到宿主基因组中的HBV DNA两者转录的病毒RNA翻译的蛋白。本文提供了寡核苷酸，其被设计为靶向在所有已知基因型上由HBV基因组编码的广泛的HBsAg转录物组。在一些实施方式中，已经发现，本文公开的靶向肝细胞中的HBsAg转录物的寡核苷酸可以高特异性地产生稳定的HBsAg表达降低，其在施用至受试者后持续延长的时间段(例如，大于7周至数月)的(参见例如实施例1和3)。在一些实施方式中，已经发现使用本文公开的寡核苷酸靶向HBsAg表达导致前基因组RNA(pgRNA)和其他病毒生命周期中间体的减少。还发现本文公开的某些RNAi寡核苷酸可以敲低源自cccDNA或整合病毒的HBsAg mRNA转录物。在其他方面，已经发现使用本文公开的寡核苷酸靶向HBsAg表达降低了所有HBV蛋白(HBx除外)的表达，即HBcAg、HBeAg和HBV聚合酶，导致HBV核心蛋白的胞质滞留。此外，在一些实施方式中，使用本文提供的方法由mRNA敲低导致的清除循环HBsAg在临床上是有利的，因为其能够破坏由CHB患者中高水平的循环HBsAg引起的HBV免疫耐受。重新激活针对HBV感染的免疫系统活性被认为是实现被定义为HBsAg的永久血清清除的功能性治愈的基石。
先前的工作已经表明，使用靶向多种不同HBV基因(即S、C、P和X基因)或在某些情况下仅靶向X基因转录物的RNAi剂的组合可有效抑制HBV复制和基因表达。但是，本文提供的结果表明，仅使用靶向HBsAg转录物的RNAi寡核苷酸也可以有效抑制HBV复制和基因表达，这为治疗HBV感染提供了一种新的治疗方法。除了沉默病毒RNA的直接作用外，HSB-219前体还可以阻止HBV核心抗原(HBcAg)的细胞核定位。重要的是，靶向HBV-X或同时靶向两者基因都不能阻止HBcAg细胞核定位。临床前数据强烈表明，由靶向S的RNAi疗法引起的细胞核核心定位的抑制可显著改善HBsAg抑制的持续。值得注意的是，已证明患者体内缺乏HBcAg细胞核定位与抗病毒疗法的有利响应相关。
本公开的一些方面提供了用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含长度为19至30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含与ACAANAAUCCUCACAAUA(SEQ ID NO:1)所示的HBsAg mRNA的序列互补的区域。
在一些实施方式中，所述寡核苷酸还包含长度为19至50个核苷酸的有义链，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区。在一些实施方式中，有义链包含与UUNUUGUGAGGAUUN(SEQ ID NO:2)所示的序列互补的区域。在一些实施方式中，有义链包含与5′-UUAUUGUGAGGAUUNUUGUC(SEQ ID NO:3)所示的序列互补的区域。
在一些实施方式中，反义链包含UUAUUGUGAGGAUUNUUGUCGG(SEQ ID NO:4)所示的序列。在一些实施方式中，反义链由UUAUUGUGAGGAUUCUUGUCGG(SEQ ID NO:5)所示的序列组成。在一些实施方式中，反义链由UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:5.1)所示的序列组成。
在一些实施方式中，有义链包含ACAANAAUCCUCACAAUAA(SEQ ID NO:6)所示的序列。在一些实施方式中，有义链包含GACAANAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:7)所示的序列。在一些实施方式中，有义链由GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:8)所示的序列组成。在一些实施方式中，有义链由GACAAGAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:8.1)所示的序列组成。
本公开的其他方面提供了用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与反义链形成双链体区的有义链，其中所述有义链包含GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:8)所示的序列，其中所述反义链包含UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:5.1)所示的序列，其中所述反义链和所述有义链各自包含一个或多个2'-氟和2'-O-甲基修饰的核苷酸和至少一个硫代磷酸酯键，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物，并且其中所述有义链与一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分缀合。
本文还提供用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与反义链形成双链体区的有义链，其中：所述有义链包含如下序列：如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:8)所示并且包含在第3、8-10、12、13和17位处的2'-氟修饰的核苷酸，在第1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36位处的2'-O-甲基修饰的核苷酸，以及至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述有义链与一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分缀合；和所述反义链包含如下序列：如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:5.1)所示并且包含在第2、3、5、7、8、10、12、14、16和19位处的2'-氟修饰的核苷酸，在第1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22位处的2'-O-甲基修饰的核苷酸，以及至少三个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。有义链包含在第1位与第2位核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
在一些实施方式中，反义链包含在核苷酸1与2、2与3、3与4、20与21以及21与22之间的五个硫代磷酸酯键。
在一些实施方式中，反义链的所述5’-核苷酸具有以下结构：
Figure BDA0002456233780000051
在一些实施方式中，所述有义链上的–GAAA–序列的一个或多个核苷酸与单价GalNac部分缀合。
在一些实施方式中，所述有义链上的所述–GAAA–序列的核苷酸各自与单价GalNac部分缀合。在一些实施方式中，–GAAA–基序包含以下结构：
Figure BDA0002456233780000052
其中：
L代表键、点击化学柄、或长度为1至20个包含的、连续的、共价键合的原子的接头，其选自取代和未取代的亚烷基、取代和未取代的亚烯基、取代和未取代的亚炔基、取代的和未取代的杂亚烷基、取代和未取代的杂亚烯基、取代和未取代的杂亚炔基及其组合；和
X是O、S或N。
在一些实施方式中，L是乙缩醛接头。在一些实施方式中，X是O。
在一些实施方式中，–GAAA–序列包含以下结构：
Figure BDA0002456233780000071
在一些实施方式中，有义链在其3'端包含S1-L-S2所示的茎环，其中S1是与S2互补，并且其中L在S1和S2之间形成长度为至多6个核苷酸的环。在一些实施方式中，L是四环。在一些实施方式中，L在S1和S2之间形成长度为4个核苷酸的环。在一些实施方式中，L包含GAAA所示的序列。在一些实施方式中，所述茎环的L的至多4个核苷酸各自与单独的GalNAc缀合。
在一些实施方式中，所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述修饰的核苷酸包括2'-修饰。在一些实施方式中，所述2'-修饰是选自以下的修饰：2'-氨基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸。在一些实施方式中，所述寡核苷酸的所有核苷酸是修饰的核苷酸。在一些实施方式中，所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸间键。在一些实施方式中，所述至少一个修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。
在一些实施方式中，所述寡核苷酸的至少一个核苷酸与靶向配体缀合。在一些实施方式中，所述靶向配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
本文还提供了组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸和抗衡离子，以及组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸和药学上可接受的载体。
本公开的其他方面提供了降低细胞中乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原的表达的方法，所述方法包括将本文所述的寡核苷酸递送至所述细胞。在一些实施方式中，所述细胞是肝细胞。在一些实施方式中，所述细胞是在体内。在一些实施方式中，所述细胞是在体外。
本公开的其他方面提供了治疗受试者中乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的寡核苷酸或组合物。
还提供了治疗受试者中HBV感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用选择性靶向HBsAg mRNA的RNAi寡核苷酸，其中所述RNAi寡核苷酸在没有用靶向编码非表面抗原的HBV mRNA转录物的RNAi寡核苷酸治疗的情况下施用。还提供了治疗受试者中HBV感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用选择性靶向HBsAg mRNA的RNAi寡核苷酸，其中未向所述受试者施用选择性靶向HBxAg mRNA转录物的RNAi寡核苷酸。在一些实施方式中，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。
本公开的其他方面提供了用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与反义链形成双链体区的有义链，其中：
所述有义链包含如下序列：如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ IDNO:8)所示并且包含在第3、8-10、12、13和17位处的2'-氟修饰的核苷酸，在第1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36位处的2'-O-甲基修饰的核苷酸，以及在第1位与第2位核苷酸之间的一个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述有义链上的–GAAA–序列的核苷酸各自与单价GalNac部分缀合，其中所述–GAAA–序列包含以下结构：
Figure BDA0002456233780000091
和
所述反义链包含如下序列：如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:5.1)所示并且包含在第2、3、5、7、8、10、12、14、16和19位处的2'-氟修饰的核苷酸，在第1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22位处的2'-O-甲基修饰的核苷酸，以及在核苷酸1与2、2与3、3与4、20与21以及21与22之间的五个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳具有以下结构：
Figure BDA0002456233780000101
还提供了包含寡核苷酸的组合物。在一些实施方式中，组合物还包含Na+抗衡离子。
还提供了降低细胞中乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原的表达的方法，所述方法包括递送寡核苷酸或组合物。在一些实施方式中，细胞是肝细胞。在一些实施方式中，细胞是在体内。在一些实施方式中，细胞是在体外。
还提供了治疗受试者中乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用寡核苷酸或组合物。在一些实施方式中，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。
附图说明
附图示出某些实施方式，并与书面描述一起用于提供本文公开的组合物和方法的某些方面的非限制性实例，所述附图被引入并作为本说明书的一部分。
图1显示在HBV基因组的组织的示意图上的RNAi靶位点的实例。
图2显示了用于降低HDI小鼠中HBsAg表达的寡核苷酸的单剂量评估。
图3是在用靶向HBsAg的寡核苷酸的指定给药方案期间血浆HBsAg水平随时间变化的图示。如该实施例中所示，寡核苷酸显示出临床前效力，并且在给药期间之后仍保持降低的水平。
图4显示了描绘使用报告子测定在HeLa细胞中HBsAg映射(mapping)的结果的图。指定浓度下的靶向HBV基因组第254位的未修饰siRNA用作阳性对照。来自Thermo Fisher的市售Silencer siRNA作为这些实验的阴性对照。误差棒代表SEM。
图5显示了基因型保守性比较，表明在靶向HBsAg的寡核苷酸HBV-219中设计的错配增加了跨HBV基因型的覆盖率。
图6示出了设计用于使用HBV基因型A作为原型序列的psiCHECK2报告子测定的载体。
图7显示了寡核苷酸的几个实例，所述寡核苷酸被设计用来评估引入错配的影响。亲本和错配链的寡核苷酸序列对齐显示且错配位置加框。进一步描述了在psiCHECK2报告子基因测定中使用的相应报告子序列。
图8显示了在错配研究中评估的寡核苷酸的单剂量滴定图，其证明了在体内可耐受指导链中的错配。
图9显示了体内剂量滴定图，表明将错配引入靶向HBsAg的寡核苷酸不会不利地影响体内功效。
图10显示了具有化学修饰且呈双链形式的靶向HBsAg的寡核苷酸(HBV(s)-219)的实例。较深的阴影表示2'-O-甲基核糖核苷酸。较浅的阴影表示2'-氟-脱氧核糖核苷酸。
图11A描绘了检测肝细胞中HBV核心抗原(HBcAg)的亚细胞分布的免疫组织化学染色结果。
图11B描绘了RNA测序结果，其将检测到的RNA转录物序列与HBV pgRNA进行映射(mapping)。
图12A描绘了在HBV的流体动力注射(HDI)模型中，相比于载剂对照和靶向HBxAgmRNA的RNAi寡核苷酸，用靶向HBsAg mRNA的HBV(s)-219寡核苷酸前体HBV(s)-219P2处理后的HBsAg mRNA表达的时程。
图12B描绘了在AAV-HBV模型中，相比于载剂对照和靶向HBxAg mRNA的RNAi寡核苷酸，用靶向HBsAg mRNA的HBV(s)-219寡核苷酸前体HBV(s)-219P2处理后HBsAg mRNA表达的时程。
图13显示了免疫组织化学染色结果，显示相比于载剂对照和靶向HBxAg mRNA的RNAi寡核苷酸(GalXC-HBVX)，用靶向HBsAg mRNA的HBV(s)-219寡核苷酸处理后，从HBV的AAV-HBV模型和HDI模型获得的肝细胞中HBcAg的亚细胞分布。
图14A-14D显示了在PXB-HBV模型中HBV(s)-219前体1(HBV(s)-219P1)的抗病毒活性。向9只小鼠的群组(cohort)通过皮下施用给予在PBS中的HBV(s)-219P1，3次，每周一次，剂量为0或3mg/kg。在所示的每个时间点(图14A和14B)通过非末端下颌颊颊出血分析来自每个群组的六只小鼠的血清HBsAg和血清HBV DNA。在第28天(从第一剂量HBV(s)-219P1开始)，对所有剩余的小鼠实施安乐死，并收集肝活检组织用于通过RT-qPCR分析肝HBV DNA(图14C)和肝cccDNA(图14D)。
图15A-15C显示，HBV(s)-219前体2(HBV(s)-219P2)增强了恩替卡韦的抗病毒活性。在HBV小鼠流体动力注射(HDI)模型中，在第1天将单剂量的HBV(s)-219P2皮下施用给小鼠，然后每天口服给药500ng/kg恩替卡韦(ETV)持续14天。通过qPCR测量循环病毒载量(HBVDNA)(图15A)。通过ELISA测量血浆HBsAg水平(图15B)。通过qPCR测量肝HBV mRNA和pgRNA水平(图15C)。结果显示联合疗法具有明显的累加作用。单独的ETV疗法显示对循环HBsAg或肝病毒RNA没有功效。通过HBsAb或HBV RNA测量的HBV(s)-219P2的抗病毒活性不受ETV共同给药的影响。“BLOD”是指“低于检测限”。
图16A-16B显示了靶向S抗原(HBV(s)-219P2)或X抗原(称为GalXC-HBVX)的GalNac缀合的寡核苷酸的HBsAg抑制活性的比较。结果表明，HBVS-219P2抑制HBsAg的持续时间比GalXC-HBVX或RNAi试剂两者的等摩尔组合更长。图16A显示了RNAi靶向位点在HBV基因组中的位置影响表达HBV的小鼠中的HBsAg恢复动力学。图16B显示了给药后2周(左图)和给药后9周(右图)的血浆HBsAg水平，表明单独靶向HBVX编码区或与HBV(s)-219P2组合导致较短的活性持续时间。显示了个体动物数据。几个数据点(最浅的灰色圆圈)低于检测限。
图17A-17C显示了在用HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX或1:1组合处理的表达HBV的小鼠中HBV核心抗原(HBcAg)的亚细胞定位。图17A显示了在施用后第1、2、6、9和13周获得的肝切片中代表性的肝细胞，并对HBcAg进行染色。图17B显示了每只动物中具有细胞核染色的HBcAg阳性细胞的百分比(n＝3/组，在给药后2周，每只动物计数了50个细胞)。设计并测试了靶向X和S开放阅读框内的替代序列。图17C显示了在施用靶向S抗原或X抗原的替代RNAi寡核苷酸后第2、3和9周获得的肝细胞中HBcAg的亚细胞分布。
图18以群组信息显示了设计用于评估健康患者中HBV(s)-219的安全性和耐受性以及HBV(s)-219对HBV患者的治疗功效的研究剂量。
图19A-19B显示了HBV(s)-219和HBV(s)-219P2的化学结构。(图19A)HBV(s)-219的化学结构。(图19B)HBV(s)-219P2的化学结构。
具体实施方式
根据一些方面，本公开提供了有效的寡核苷酸，其有效降低细胞特别是肝的细胞(例如，肝细胞)中的HBsAg表达以治疗HBV感染。在某些实施方式中，本文提供的靶向HBsAg的寡核苷酸被设计用于递送至靶组织的选择的细胞(例如，肝的肝细胞)以治疗那些组织中的HBV感染。因此，在相关方面，本公开提供了治疗HBV感染的方法，所述方法包括选择性降低细胞(例如，肝的细胞)中HBV表面抗原基因的表达。
下文提供本公开的其他方面，包括定义的术语的描述。
I.定义
近似地：如本文中所使用的，术语“近似地”或“大约”，如应用于一个或多个感兴趣的值，是指类似于所陈述的参考值的值。在某些实施方式中，术语“近似地”或“大约”是指在任一方向上(大于或小于)落入所陈述的参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的范围内的值，除非另有说明或从上下文中可以明显看出(除非这样的数字超过可能值的100％)。
施用：如本文所用，术语“施用(administrating/administration)”是指以药理学上有用的方式(例如，治疗受试者的病症)向受试者提供物质(例如，寡核苷酸)。
去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)：如本文所用，术语“唾液酸糖蛋白受体”或“ASGPR”是指由主要的48kDa(ASGPR-1)和次要的40kDa亚基(ASGPR-2)形成的二分(bipartite)C型凝集素。ASGPR主要在肝细胞的血窦面(sinusoidal surface)上表达，并在结合、内化和随后清除包含末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基(去唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein))的循环糖蛋白中具有主要作用。
互补的：如本文所用，术语“互补的”是指两个核苷酸之间(例如，在两个相对的核酸上或在单个核酸链的相对区域上)或两个核苷酸序列之间的结构关系，其允许两个核苷酸或两个核苷酸序列彼此形成碱基对。例如，与相对核酸的嘧啶核苷酸互补的一个核酸的嘌呤核苷酸可以通过彼此形成氢键而碱基对在一起。在一些实施方式中，互补核苷酸可以以Watson-Crick方式或以允许形成稳定双链体的任何其他方式碱基配对。在一些实施方式中，两个核酸可具有彼此互补的多核苷酸的区域，以形成如本文所述的互补区。
脱氧核糖核苷酸：如本文所用，术语“脱氧核糖核苷酸”是指与核糖核苷酸相比，在其戊糖的2'位置具有氢代替羟基的核苷酸。修饰的脱氧核糖核苷酸是在2'位置以外具有一个或多个原子的修饰或取代的脱氧核糖核苷酸，包括糖、磷酸基或碱基中或在其内的修饰或取代。
双链寡核苷酸：如本文所用，术语“双链寡核苷酸”是指基本上为双链体形式的寡核苷酸。在一些实施方式中，在共价分离的核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成双链寡核苷酸的一个或多个双链体区的互补碱基配对。在一些实施方式中，在共价连接的核酸链的核苷酸的反平行序列之间形成双链寡核苷酸的一个或多个双链体区的互补碱基对。在一些实施方式中，双链寡核苷酸的一个或多个双链体区的互补碱基配对由折叠(例如，经由发夹)的单个核酸链形成，以提供碱基配对在一起的核苷酸互补反平行序列。在一些实施方式中，双链寡核苷酸包含彼此完全双链的两条共价分离的核酸链。然而，在一些实施方式中，双链寡核苷酸包含两个部分地双链的共价分离的核酸链，例如，在一个或两个末端具有突出端。在一些实施方式中，双链寡核苷酸包含部分地互补的核苷酸的反平行序列，因此可以具有一个或多个错配，其可以包含内部错配或末端错配。
双链体：如本文所用，术语“双链体”相对于核酸(例如，寡核苷酸)，是指通过核苷酸的两个反平行序列的互补碱基配对形成的结构。
赋形剂：如本文所用，术语“赋形剂”是指可以包含在组合物中的非治疗剂，例如以提供或有助于期望的稠度或稳定作用。
肝细胞：如本文所用，术语“肝细胞”是指肝实质组织的细胞。这些细胞约占肝质量的70-85％，并制造血清白蛋白、纤维蛋白原和凝血因子(因子3和4除外)的凝血酶原组。肝细胞谱系细胞的标志物可以包括但不限于：运甲状腺素蛋白(Ttr)，谷氨酰胺合成酶(Glul)，肝细胞核因子1a(Hnf1a)和肝细胞核因子4a(Hnf4a)。成熟肝细胞的标志物可以包括但不限于：细胞色素P450(Cyp3a11)，延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)，6-磷酸葡萄糖(G6p)，白蛋白(Alb)和OC2-2F8。参见，例如，Huch等,(2013),Nature,494(7436):247-250，其与肝细胞标志物有关的内容通过引用并入本文。
乙型肝炎病毒：如本文所用，术语“乙型肝炎病毒”或“HBV”是指属于肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)的小DNA病毒，被归类为正嗜肝DNA病毒属(Orthohepadnavirus)的类型物种。HBV病毒颗粒(病毒粒子)包含外部脂质包膜和由蛋白质组成的二十面体核衣壳核心。核衣壳通常包封病毒DNA和具有与逆转录病毒相似的逆转录酶活性的DNA聚合酶。HBV外膜包含嵌入的蛋白质，这些蛋白质参与病毒与易感细胞的结合并进入易感细胞。攻击肝脏的HBV已基于序列根据至少十种基因型(A-J)进行了分类。通常，基因组编码有四个基因，这些基因称为C、P、S和X。核心蛋白由基因C(HBcAg)编码，其起始密码子前面是产生前核心蛋白的上游框内AUG起始密码子。HBeAg是通过蛋白水解加工前核心蛋白而产生的。DNA聚合酶由基因P编码。基因S编码表面抗原(HBsAg)。HBsAg基因是一个较长的开放阅读框，但包含三个框内的“起始”(ATG)密码子，可将基因分为前S1、S2和S三个部分。由于存在多个起始密码子，因此产生了三个不同大小的多肽，称为大、中和小(pre-S1+pre-S2+S，pre-S2+S或S)。它们的比例可以为1：1：4(Heermann等，1984)。
乙型肝炎病毒(HBV)蛋白可以组织成几种类别和功能。聚合酶具有逆转录酶(RT)的功能，可从前基因组RNA(pgRNA)制备病毒DNA，还具有DNA依赖性聚合酶的功能，以从病毒DNA制备共价封闭的环状DNA(cccDNA)。它们共价附着于负链的5'端。核心蛋白构成病毒衣壳和分泌的E抗原。表面抗原是肝细胞内化的配体，也是病毒球形和丝状颗粒的主要成分。产生的病毒颗粒是Dane颗粒(感染性病毒粒子)的1000倍以上，并且可以充当免疫诱饵。
乙型肝炎病毒表面抗原：如本文所用，术语“乙型肝炎病毒表面抗原”或“HBsAg”是指由HBV基因组的基因S(例如，ORFS)编码的S结构域蛋白。乙型肝炎病毒颗粒在核心颗粒中携带病毒核酸，所述核心颗粒被基因S编码的三种蛋白包封，即大表面蛋白、中表面蛋白和主要表面蛋白。在这些蛋白中，主要的表面蛋白通常约为226个氨基酸，仅包含S结构域。
感染：如本文所用，术语“感染”是指受试者中诸如病毒的微生物的病原体入侵和/或扩增。感染可能是溶原性的，例如病毒DNA在细胞内处于休眠状态。或者，感染可以是裂解性的，例如其中病毒活跃增殖并引起被感染细胞的破坏。感染可能会或可能不会导致临床上明显的症状。感染可以保持在局部，或者可以例如通过受试者的血液或淋巴系统传播。可以通过检测病毒载量、表面抗原(HBsAg)、e-抗原(HBeAg)以及本领域已知的各种其他检测HBV感染的方法中的一种或多种来鉴定患有HBV感染的个体。用于检测HBV感染的测定可以包括检测血清或血液样本中是否存在HBsAg和/或HBeAg，并任选地进一步筛选一种或多种病毒抗体(例如IgM和/或IgG)的存在以补偿其中HBV抗原可能处于不可检测的水平的任何时期。
肝炎症：如本文所用，术语“肝炎症”或“肝炎”是指其中肝脏变得肿胀、功能障碍和/或疼痛的物理状况，尤其是由于受伤或感染所致，可以由于接触肝毒剂引起。症状可能包括黄疸(皮肤或眼睛发黄)，疲劳，虚弱，恶心，呕吐，食欲下降和体重减轻。如果不加以治疗，肝炎症可能会进展为纤维化、肝硬化、肝衰竭或肝癌。
肝纤维化：如本文所用，术语“肝纤维化”或“肝的纤维化”是指由炎症和肝细胞死亡引起的细胞外基质蛋白在肝脏中的过度积累，其可以包括胶原蛋白(I、III和IV)，纤连蛋白，粗纤维调节素(undulin)，弹性蛋白，层粘连蛋白，透明质酸和蛋白聚糖。如果不加以治疗，肝纤维化可能会发展为肝硬化、肝衰竭或肝癌。
环：如本文所用，术语“环”是指核酸(例如，寡核苷酸)的未配对区域，其侧翼为两个彼此充分互补的核酸的反平行区，使得在在合适的杂交条件下(例如，在磷酸盐缓冲液中，在细胞中)，位于未配对区侧翼的两个反平行区杂交形成双链体(称为“茎”)。
修饰的核苷酸间键：如本文所用，术语“修饰的核苷酸间键”是指与包含磷酸二酯键的参考核苷酸间键相比具有一种或多种化学修饰的核苷酸间键。在一些实施方式中，修饰的核苷酸是非天然存在的键。通常，修饰的核苷酸间键赋予存在修饰的核苷酸间键的核酸一个或多个期望的性质。例如，修饰的核苷酸可以改善热稳定性，抗降解性，核酸酶抗性，溶解度，生物利用度，生物活性，降低的免疫原性等。
修饰的核苷酸：如本文所用，术语“修饰的核苷酸”是指与选自以下的相应参考核苷酸相比具有一个或多个化学修饰的核苷酸：腺嘌呤核糖核苷酸，鸟嘌呤核糖核苷酸，胞嘧啶核糖核苷酸，尿嘧啶核糖核苷酸，腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸，胞嘧啶脱氧核糖核苷酸和胸苷脱氧核糖核苷酸。在一些实施方式中，修饰的核苷酸是非天然存在的核苷酸。在一些实施方式中，修饰的核苷酸在其糖、核碱基和/或磷酸基团中具有一个或多个化学修饰。在一些实施方式中，修饰的核苷酸具有与相应的参考核苷酸缀合的一个或多个化学部分。通常，修饰的核苷酸赋予其中存在修饰的核苷酸的核酸一个或多个期望的性质。例如，修饰的核苷酸可以改善热稳定性，抗降解性，核酸酶抗性，溶解度，生物利用度，生物活性，降低的免疫原性等。
带缺口的四环结构：“带缺口的四环结构”是RNAi寡核苷酸的结构，其特征在于存在分开的有义链(乘客)和反义链(指导)，其中有义链具有与反义链互补的区域，并且其中至少一条链(通常是有义链)具有被配置以稳定在至少一条链内形成的相邻茎区域的四环。
寡核苷酸：如本文所用，术语“寡核苷酸”是指短核酸，例如长度小于100个核苷酸。寡核苷酸可以是单链或双链的。寡核苷酸可以具有或可以不具有双链体区。作为一组非限制性实例，寡核苷酸可以是但不限于小干扰RNA(siRNA)，微小RNA(miRNA)，短发夹RNA(shRNA)，dicer底物干扰RNA(dsiRNA)，反义寡核苷酸，短siRNA或单链siRNA。在一些实施方式中，双链寡核苷酸是RNAi寡核苷酸。
突出端：如本文所用，术语“突出端”是指由一条链或区域延伸超过互补链的末端形成的末端非碱基配对核苷酸，所述互补链与所述一条链或区域形成双链体。在一些实施方式中，突出端包含从双链寡核苷酸的5'末端或3'末端的双链体区延伸的一个或多个未配对的核苷酸。在某些实施方式中，突出端是双链寡核苷酸的反义链或有义链上的3'或5'突出端。
磷酸酯类似物：如本文所用，术语“磷酸酯类似物”是指模拟磷酸酯基团的静电和/或空间特性的化学部分。在一些实施方式中，磷酸酯类似物位于寡核苷酸的5'末端核苷酸处代替通常易于酶促去除的5'-磷酸酯。在一些实施方式中，5'磷酸酯类似物含有抗磷酸酶的键。磷酸酯类似物的实例包括5'膦酸酯，例如5'亚甲基膦酸酯(5'-MP)和5'-(E)-乙烯基膦酸酯(5'-VP)。在一些实施方式中，寡核苷酸在5'-末端核苷酸的糖的4'-碳位置具有磷酸酯类似物(称为“4'-磷酸酯类似物”)。4'-磷酸酯类似物的实例是氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子结合到糖部分(例如在其4'-碳上)或其类似物。参见，例如，2016年9月2日提交的美国临时申请号62/383,207和2016年9月12日提交的美国临时申请号62/393,401，其各自涉及磷酸酯类似物的内容通过引用并入本文。已经开发了针对寡核苷酸的5'端的其他修饰(参见例如，WO 2011/133871；美国专利号8,927,513；和Prakash等(2015),NucleicAcids Res.,43(6):2993-3011，其各自涉及磷酸酯类似物的内容通过引用并入本文。
降低的表达：如本文所用，术语基因的“降低的表达”是指与合适的对照细胞或受试者相比，细胞或受试者中基因编码的RNA转录物或蛋白质的量减少和/或基因的活性的量降低。例如，用双链寡核苷酸(例如，具有与HBsAg mRNA序列互补的反义链的寡核苷酸)处理细胞的行为可以导致RNA转录物、蛋白质和/或酶活性(例如，由HBV基因组的S基因编码)的量相比于未用双链寡核苷酸处理的细胞降低。类似地，本文所用的“降低表达”是指导致基因(例如，HBV基因组的S基因)表达降低的行为。
互补区：如本文所用，术语“互补区”是指与核苷酸的反平行序列充分互补以允许在适当的杂交条件下(例如在磷酸酯缓冲液中，在细胞中等)两个核苷酸序列之间的杂交的核酸的核苷酸序列(双链核苷酸)。
核糖核苷酸：如本文所用，术语“核糖核苷酸”是指具有核糖作为其戊糖的核苷酸，所述戊糖在其2'位置含有羟基。修饰的核糖核苷酸是在2'位置以外具有一个或多个原子的修饰或取代的核糖核苷酸，包括在核糖、磷酸基或碱基中或在其内的修饰或取代。
RNAi寡核苷酸：如本文所用，术语“RNAi寡核苷酸”是指(a)具有有义链(乘客)和反义链(指导)的双链寡核苷酸，其中反义链或反义链的一部分链由Argonaute 2(Ago2)核酸内切酶用于切割靶mRNA或(b)具有单反义链的单链寡核苷酸，其中该反义链(或该反义链的一部分)由Ago2核酸内切酶使用在靶mRNA的切割中。
链：如本文所用，术语“链”是指通过核苷酸间键(例如，磷酸二酯键，硫代磷酸酯键)连接在一起的核苷酸的单个连续序列。在一些实施方式中，链具有两个自由端，例如5'端和3'端。
受试者：如本文所用，术语“受试者”是指任何哺乳动物，包括小鼠、兔子和人类。在一个实施方式中，受试者是人类或非人类的灵长类动物。术语“个体”或“患者”可以与“受试者”互换使用。
合成的：如本文所用，术语“合成的”是指人工合成(例如，使用机器(例如，固态核酸合成仪))或不是衍生自通常产生该分子的天然来源(例如细胞或生物体)的核酸或其他分子。
靶向配体：如本文所用，术语“靶向配体”是指选择性地与感兴趣的组织或细胞的配对分子(例如，受体)结合并且可以与另一种物质缀合为了将另一物质靶向感兴趣的组织或细胞的分子(例如，碳水化合物、氨基糖、胆固醇、多肽或脂质)。例如，在一些实施方式中，为了将寡核苷酸靶向到感兴趣的特定组织或细胞，可以将靶向配体缀合至寡核苷酸。在一些实施方式中，靶向配体选择性地结合细胞表面受体。因此，在一些实施方式中，当与寡核苷酸缀合时，靶向配体通过选择性结合至细胞表面上表达的受体并由细胞对包含寡核苷酸、靶向配体和受体的复合物进行胞内体内化而促进寡核苷酸向特定细胞的递送。在一些实施方式中，靶向配体通过在细胞内化之后或期间被切割的接头与寡核苷酸缀合，使得寡核苷酸在细胞中从靶向配体释放。
四环：如本文所用，术语“四环”是指增加通过核苷酸的侧翼序列的杂交形成的相邻双链体的稳定性的环。稳定性的增加可检测为相邻茎双链体的解链温度(Tm)的升高，其高于所预期的由随机选择的核苷酸序列组成的具有可比较长度的一组环的平均相邻茎双链体的Tm。例如，四环在10mM NaHPO4中可以赋予包含长度为至少2个碱基对的双链体的发夹至少50℃，至少55℃，至少56℃，至少58℃，至少60℃，至少65℃或至少75℃的熔融温度。在一些实施方式中，四环可通过堆叠相互作用来稳定相邻茎双链体中的碱基对。另外，四环中核苷酸之间的相互作用包括但不限于非Watson-Crick碱基配对，堆积相互作用，氢键和接触相互作用(Cheong等,Nature 1990 Aug.16；346(6285):680-2；Heus and Pardi,Science 1991 Jul.12；253(5016):191-4)。在一些实施方式中，四环包含4至5个核苷酸。在某些实施方式中，四环包含可以被或可以不被修饰(例如，可以或可以不与靶向部分缀合)的三个、四个、五个或六个核苷酸或由其组成。在一个实施方式中，四环由四个核苷酸组成。可以在四环中使用任何核苷酸，并且可以按照Cornish-Bowden(1985)Nucl.Acids Res.13:3021-3030中所述的使用这样的核苷酸的标准IUPAC-IUB符号。例如，字母“N”可以用来表示任何碱基都可以在该位置，字母“R”可以用来表示A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)可以在该位置，而“B”可以用于表示C(胞嘧啶)、G(鸟嘌呤)或T(胸腺嘧啶)可以在该位置。四环的实例包括四环的UNCG家族(例如UUCG)，四环的GNRA家族(例如GAAA)和CUUG四环(Woese等,Proc NatlAcad Sci USA.1990 November；87(21):8467-71；Antao等,Nucleic Acids Res.1991Nov.11；19(21):5901-5)。DNA四环的实例包括四环的d(GNNA)家族(例如d(GTTA))，四环的d(GNRA)家族，四环的d(GNAB)家族，四环的d(CNNG)家族和四环的d(TNCG)家族(例如d(TTCG))。参见例如：Nakano等Biochemistry,41(48),14281-14292,2002.SHINJI等NipponKagakkai Koen Yokoshu VOL.78th；NO.2；PAGE.731(2000)，其相关公开内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，四环包含在带切口的四环结构内。
治疗：如本文所用，术语“治疗”是指例如通过向受试者施用治疗剂(例如寡核苷酸)来向有需要的受试者提供护理的行为，旨在相对于现有状况(例如，现有的HBV感染)改善受试者的健康和/或幸福，或预防或减少发生状况的可能性(例如，预防肝纤维化、肝炎、肝癌或与HBV感染有关的其他疾病)。在一些实施方式中，治疗涉及降低受试者经历的病症(例如，HBV感染或相关病症)的至少一种体征、症状或贡献因素的频率或严重性。在HBV感染期间，受试者可能表现出诸如皮肤和眼睛发黄(黄疸)，尿色深，极度疲劳，恶心，呕吐和腹痛等症状。因此，在一些实施方式中，本文提供的治疗可导致一种或多种这样的症状的频率或严重性降低。但是，HBV感染会发展为一种或多种肝病，例如肝硬化、肝纤维化、肝炎或肝癌。因此，在一些实施方式中，本文提供的治疗可导致一种或多种这样的病症的频率或严重性降低，或预防或减轻一种或多种这样的病症。
II.基于寡核苷酸的抑制剂
i.HBV表面抗原靶向
在一些实施方式中，本文提供了可用于获得治疗益处的基于寡核苷酸的HBV表面抗原表达的抑制剂。通过检查HBV表面抗原mRNA和测试不同的寡核苷酸，已开发出了有效的寡核苷酸用于减少HBV表面抗原(HBsAg)的表达以治疗HBV感染。在一些实施方式中，本文提供的寡核苷酸被设计为靶向覆盖95％已知HBV基因组在所有已知基因型上的HBsAg mRNA序列。在一些实施方式中，这样的寡核苷酸导致肝脏中HBV前基因组RNA(pgRNA)和HBsAg mRNA降低超过90％。在一些实施方式中，在单个剂量或治疗方案后，HBsAg表达的降低持续延长的时间段。
因此，在一些实施方式中，为了在细胞中靶向转录物并抑制其表达，将本文提供的寡核苷酸设计成具有与HBsAg mRNA互补的区域。互补区通常具有合适的长度和碱基含量，使得寡核苷酸(或其链)能够与HBsAg mRNA退火，以抑制其表达。在一些实施方式中，互补区的长度为至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，至少19个或至少20个核苷酸。在一些实施方式中，本文提供的寡核苷酸具有与HBsAg mRNA互补的区域，其长度为在12至30(例如12至30、12至22、15至25、17至21、18至27、19至19，15至30)个核苷酸的范围。在一些实施方式中，本文提供的寡核苷酸具有与HBsAg mRNA互补的区域，其长度为为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
在一些实施方式中，本文提供的寡核苷酸被设计成靶向编码HBsAg的mRNA序列。例如，在一些实施方式中，提供了具有反义链的寡核苷酸，所述反义链具有与以下所示序列互补的区域：ACAANAAUCCUCACAAUA(SEQ ID NO:1)，其中N是指任何核苷酸(A，G，T，或C)。在一些实施方式中，寡核苷酸还包含与反义链形成双链体区的有义链。在一些实施方式中，有义链具有与以下所示序列互补的区域：UUNUUGUGAGGAUUN(SEQ ID NO:2)。在一些实施方式中，有义链包含与以下所示(5'至3')序列互补的区域：UUAUUGUGAGGAUUNUUGUC(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方式中，反义链包含以下所示序列或由其组成：UUAUUGUGAGGAUUNUUGUCGG(SEQ ID NO:4)。在一些实施方式中，反义链包含以下所示序列或由其组成：UUAUUGUGAGGAUUCUUGUCGG(SEQ ID NO:5)。在一些实施方式中，反义链包含以下所示序列或由其组成：UUAUUGUGAGGAUUUUUGUGGGGG(SEQ ID NO：5.1)。在一些实施方式中，有义链包含以下所示序列或由其组成：ACAANAAUCCUCACAAUAA(SEQ ID NO:6)。在一些实施方式中，有义链包含以下所示序列或由其组成：GACAANAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:7)。在一些实施方式中，有义链包含以下所示序列或由其组成：GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:8)。在一些实施方式中，有义链包含以下所示序列或由其组成：GACAAGAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:8.1)。
在一些实施方式中，用于减少HBsAg mRNA表达的寡核苷酸包含与反义链形成双链体区的有义链，其中所述有义链包含如SEQ ID NO:6-8.1中任一项所述的序列，所述反义链包含如SEQ ID NO:4-5.1中任一项所示的序列。在一些实施方式中，有义链包含2'-氟和2'-O-甲基修饰的核苷酸和至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，有义链与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分缀合。在一些实施方式中，反义链包含2'-氟和2'-O-甲基修饰的核苷酸和至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。在一些实施方式中，每个反义链和有义链包含2'-氟和2'-O-甲基修饰的核苷酸和至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物，有义链与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分缀合。
在一些实施方式中，包含如SEQ ID NO:7-8.1中任一项所示的序列的有义链包含在第3、8-10、12、13和17位处的2'-氟修饰的核苷酸。在一些实施方式中，有义链包含在第1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36位处的2'-O-甲基修饰的核苷酸。在一些实施方式中，有义链包含一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，有义链包含在第1和2位核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，有义链与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分缀合。
在一些实施方式中，包含如SEQ ID NO:4-5.1中任一项所示的序列的反义链包含在第2、3、5、7、8、10、12、14、16和19处的2'-氟修饰的核苷酸。在一些实施方式中，反义链包含在第1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22位处的2'-O-甲基修饰的核苷酸。在一些实施方式中，反义链包含三个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，反义链包含在第1与2位核苷酸之间，第2与3位核苷酸之间，第3与4位核苷酸之间，第20与21位核苷酸之间，以及第21与22位核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。
ii.双链寡核苷酸
存在多种可用于靶向本公开的方法中的HBsAg mRNA表达的寡核苷酸结构，包括RNAi，反义，miRNA等。本文或其他地方描述的任何结构都可用作框架以引入或靶向本文描述的序列。用于靶向HBV抗原表达(例如，通过RNAi途径)的双链寡核苷酸通常具有彼此形成双链体的有义链和反义链。在一些实施方式中，有义链和反义链不是共价连接的。然而，在一些实施方式中，有义链和反义链是共价连接的。
在一些实施方式中，用于降低HBsAg mRNA表达的表达的双链寡核苷酸参与RNA干扰(RNAi)。例如，已经开发出RNAi寡核苷酸，每条链具有19-25个核苷酸的大小和至少一个1至5个核苷酸的3'突出端(参见例如，美国专利号8,372,968)。还已经开发了更长的寡核苷酸，其被Dicer加工以产生活性RNAi产物(参见，例如，美国专利号8,883,996)。进一步的工作产生了延伸的双链寡核苷酸，其中至少一条链的至少一个末端延伸超出了双链体靶向区，包括其中一条链包括热力学稳定的四环结构的结构(参见，例如，美国专利号8,513,207和8,927,705，以及WO2010033225，其关于这些寡核苷酸的公开内容通过引用并入本文)。这样的结构可以包括单链延伸(在分子的一侧或两侧)以及双链延伸。
在一些实施方式中，本文提供的寡核苷酸可被Dicer酶切割。这样的寡核苷酸在有义链的3'端可以具有突出端(例如，长度为1、2或3个核苷酸)。这样的寡核苷酸(例如，siRNA)可包含与靶RNA反义的21个核苷酸的指导链和互补的乘客链，其中两条链退火以形成19bp的双链体和在3'端中的任一者或两者上的2个核苷酸突出端。还可以使用更长的寡核苷酸设计，包括具有23个核苷酸的指导链和21个核苷酸的乘客链的寡核苷酸，其中分子的右侧(乘客链的3'端/指导链的5'端)有平末端和在分子的左侧(乘客链的5'端/指导链的3'端)有两个核苷酸的3'指导链突出端。在这样的分子中，存在21个碱基对的双链体区。参见，例如，US9012138，US9012621和US9193753，它们各自的相关公开内容并入本文。
在一些实施方式中，本文公开的寡核苷酸可包含长度都在17至26(例如17至26、20至25、19至21或21-23)个核苷酸范围内的有义链和反义链。在一些实施方式中，有义链和反义链具有相等的长度。在一些实施方式中，对于具有均在21-23个核苷酸长度范围内的有义和反义链的寡核苷酸，在有义链、反义链或有义链和反义链两者上的3'突出端的长度为1或2个核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸具有23个核苷酸的指导链和21个核苷酸的乘客链，其中在分子的右侧(乘客链的3'端/指导链的5'末端)具有平末端和在分子的左侧(乘客链的5'端/指导链的3'端)具有两个核苷酸的3'指导链突出端。在这样的分子中，存在21个碱基对的双链体区。在一些实施方式中，寡核苷酸包含25个核苷酸的有义链和27个核苷酸的反义链，当由dicer酶作用时，产生被引入到成熟RISC中的反义链。
与本文公开的组合物和方法一起使用的其他寡核苷酸设计包括：16-mer siRNA(参见例如，Nucleic Acids in Chemistry and Biology.Blackburn(ed.),Royal Societyof Chemistry,2006)，shRNA(例如，具有19bp或更短的茎；参见例如Moore等MethodsMol.Biol.2010；629:141-158)，平末端的siRNA(例如，长度为19bp；参见例如Kraynack andBaker,RNA Vol.12,p163-176(2006))，不对称siRNA(aiRNA；参见例如Sun等,Nat.Biotechnol.26,1379–1382(2008))，不对称短双链siRNA(参见例如，Chang等,MolTher.2009 Apr；17(4):725-32))，叉siRNA(参见例如Hohjoh,FEBS Letters,Vol 557,issues 1-3；Jan 2004,p 193-198)，单链siRNA(Elsner；Nature Biotechnology 30,1063(2012))，哑铃形环状siRNA(参见例如Abe等J Am Chem Soc 129:15108-15109(2007))以及小的内部分段干扰RNA(sisiRNA；参见例如，Bramsen等,Nucleic Acids Res.2007Sep；35(17):5886–5897)。前述参考文献的全部相关公开内容各自通过引用并入本文。可在一些实施方式中用于减少或抑制HBsAg表达的寡核苷酸结构的其他非限制性实例是microRNA(miRNA)，短发夹RNA(shRNA)和短siRNA(参见例如Hamilton等,Embo J.,2002,21(17):4671-4679；另请参见美国申请号20090099115)。
a.反义链
在一些实施方式中，寡核苷酸的反义链可被称为“指导链”。例如，如果反义链可以参与RNA诱导的沉默复合物(RISC)并与Argonaut蛋白结合，或者与一种或多种类似因子参与或结合，并直接沉默靶基因，则可以将其称为作为指导链。在一些实施方式中，与指导链互补的有义链可以被称为“乘客链”。
在一些实施方式中，本文提供的寡核苷酸包含长度至多50个核苷酸(例如，长度至多30，至多27，至多25，至多21或至多19个核苷酸)的反义链。在一些实施方式中，本文提供的寡核苷酸包含长度为至少12个核苷酸(例如，长度为至少12，至少15，至少19，至少21，至少25或至少27个核苷酸)的反义链。在一些实施方式中，本文公开的寡核苷酸的反义链的长度在12至50或12至30(例如12至30、11至27、11至25、15至21、15至27、17至21、17至25、19至27或19至30)个核苷酸的范围。在一些实施方式中，本文公开的任一个寡核苷酸的反义链的长度是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
在一些实施方式中，反义链包含与(5'至3'显示)AATCCTCACA(SEQ ID NO:9)所示的序列互补的区域。在一些实施方式中，反义链包含(5'至3'显示)UGUGAGGAUU(SEQ ID NO:10)所示的序列。在一些实施方式中，反义链包含(5'至3'显示)TGTGAGGATT(SEQ ID NO:11)所示的序列。
在一些实施方式中，用于降低HBsAg mRNA表达的寡核苷酸可包含具有与SEQ IDNO:9所示的序列互补的区域的反义链和在其3'末端的一个或两个非互补核苷酸。在一些实施方式中，反义链包含SEQ ID NO:4-5.1中任一项所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，用于减少HBsAg mRNA表达的寡核苷酸可包含反义链，所述反义链具有与SEQ ID NO:9所示序列互补的区域，其中所述反义链不具有以下任一者所示的序列(5'至3'显示)：TATTGTGAGGATTCTTGTCA(SEQ ID NO:12)；CGGTATTGTGAGGATTCTTG(SEQID NO:13)；TGTGAGGATTCTTGTCAACA(SEQ ID NO:14)；UAUUGUGAGGAUUUUUGUCAA(SEQ ID NO:15)；UGCGGUAUUGUGAGGAUUCTT(SEQ ID NO:16)；ACAGCATTGTGAGGATTCTTGTC(SEQ ID NO:17)；UAUUGUGAGGAUUUUUGUCAACA(SEQ ID NO:18)；AUUGUGAGGAUUUUUGUCAACAA(SEQ ID NO:19)；和UUGUGAGGAUUUUUGUCAACAAG(SEQ ID NO:20)。在一些实施方式中，反义链与SEQ IDNO:4、5或5.1所示的核苷酸序列相差不超过三个核苷酸。
b.有义链
在一些实施方式中，双链寡核苷酸可具有长度为至多40个核苷酸的有义链(例如，至多40个，至多35个，至多30个，至多27个，至多25个，至多21个，最多19个，最多17个或至多12个核苷酸)。在一些实施方式中，寡核苷酸可具有长度为至少12个核苷酸的有义链(例如，至少12，至少15，至少19，至少21，至少25，至少27，至少30，至少35个或至少38个核苷酸)。在一些实施方式中，寡核苷酸可具有长度为12至50个核苷酸范围内的有义链(例如12至40、12至36、12至32、12至28、15至40、15至36、15至32、15至28、17至21、17至25、19至27、19至30、20至40、22至40、25至40或32至40)。在一些实施方式中，寡核苷酸可具有长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的有义链。在一些实施方式中，寡核苷酸的有义链长于27个核苷酸(例如28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸)。在一些实施方式中，寡核苷酸的有义链长于25个核苷酸(例如26、27、28、29或30个核苷酸)。
在一些实施方式中，有义链在其3'端包含茎环。在一些实施方式中，有义链在其5'端包含茎环。在一些实施方式中，包含茎环的链的长度为2至66个核苷酸的范围(例如2至66、10至52、14至40、2至30、4至26、8至22、12至18、10至22、14至26或14至30个核苷酸长)。在一些实施方式中，包含茎环的链的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方式中，茎包含长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个核苷酸的双链体。在一些实施方式中，茎环为分子提供了更好的免于降解(例如，酶促降解)的保护，并促进了用于递送至靶细胞的靶向特征。例如，在一些实施方式中，环提供添加的核苷酸，可以在其上进行修饰而基本上不影响寡核苷酸的基因表达抑制活性。在某些实施方式中，本文提供了一种寡核苷酸，其中有义链包含(例如，在其3'端)如下所示的茎环：S1-L-S2，其中S1与S2互补，并且其中L在S1和S2之间形成长度为至多10个核苷酸的环(例如，长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)。
在一些实施方式中，茎环的环(L)是四环(例如在带切口的四环结构内)。四环可包含核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，修饰的核苷酸及其组合。通常，四环具有4至5个核苷酸。
c.双链体长度
在一些实施方式中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度为至少12(例如，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20或至少21)个核苷酸。在一些实施方式中，在有义链和反义链之间形成的双链体的长度在12-30个核苷酸的范围内(例如长度为12-30、12-27、12-22、15-25、18-30、18-22、18至25、18至27、18至30、19至30或21至30个核苷酸)。在一些实施方式中，在有义和反义链之间形成的双链体的长度是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方式中，在有义链和反义链之间形成的双链体不跨越有义链和/或反义链的整个长度。在一些实施方式中，有义链和反义链之间的双链体跨越有义或反义链的整个长度。在某些实施方式中，有义链和反义链之间的双链体跨越有义链和反义链两者的整个长度。
d.寡核苷酸末端
在一些实施方式中，寡核苷酸包含有义链和反义链，使得在有义链或反义链或有义链和反义链两者上都存在3'突出端。在一些实施方式中，本文提供的寡核苷酸具有一个5'端，所述5'端与另一5'端相比在热力学上不稳定。在一些实施方式中，提供了不对称寡核苷酸，其包含在有义链的3'端的平末端和在反义链的3'端的突出端。在一些实施方式中，反义链上的3'突出端的长度为1-8个核苷酸(例如，长度为1、2、3、4、5、6、7或8个核苷酸)。
通常，RNAi的寡核苷酸在反义(指导)链的3'端具有两个核苷酸突出端。但是，其他突出端也是可能的。在一些实施方式中，突出端是包含1至6个核苷酸之间长度的3'突出端，任选地为1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4，2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸。然而，在一些实施方式中，突出端是包含1至6个核苷酸之间长度的5'突出端，任选地1至5、1至4、1至3、1至2、2至6、2至5、2至4、2至3、3至6、3至5、3至4、4至6、4至5、5至6个核苷酸，或1、2、3、4、5或6个核苷酸。
在一些实施方式中，有义链和/或反义链的3'端或5'端的一个或多个(例如2、3、4)末端核苷酸被修饰。例如，在一些实施方式中，反义链的3'端的一个或两个末端核苷酸被修饰。在一些实施方式中，反义链的3'端的最后一个核苷酸被修饰，例如包含2'-修饰，例如2'-O-甲氧基乙基。在一些实施方式中，反义链的3'端的最后一个或两个末端核苷酸与靶标互补。在一些实施方式中，反义链的3'端的最后一个或两个核苷酸与靶标不互补。
在一些实施方式中，提供了双链寡核苷酸，其在3'端有义链上具有带切口的四环结构，并且在其反义链的3'端具有两个末端突出核苷酸。在一些实施方式中，两个末端突出核苷酸是GG。通常，反义链的两个末端GG核苷酸之一或两者与靶标互补或不互补。
在一些实施方式中，有义链或反义链的5'端和/或3'端具有反向的帽核苷酸。
在一些实施方式中，在有义链和/或反义链的3'端或5'端的末端核苷酸之间提供一个或多个(例如2、3、4、5、6)修饰的核苷酸间键。在一些实施方式中，在有义链和/或反义链的3'端或5'端的突出核苷酸之间提供了修饰的核苷酸间键。
e.错配
在一些实施方式中，寡核苷酸可在有义链和反义链之间具有一个或多个(例如1、2、3、4、5)错配。如果有义链和反义链之间存在多个错配，则它们可以连续定位(例如，在一行中2、3或更多个)，或者散布在整个互补区中。在一些实施方式中，有义链的3'末端含有一个或多个错配。在一个实施方式中，在有义链的3'末端引入了两个错配。在一些实施方式中，寡核苷酸有义链的3'端的区段的碱基错配或去稳定化可能通过Dicer加工促进了RNAi中合成双链体的效力。
在一些实施方式中，反义链可具有与HBsAg转录物互补的区域，其与相应的转录物序列相比包含一个或多个错配。寡核苷酸上的互补区可以具有至多1个，至多2个，至多3个，至多4个，至多5个等的错配，只要它在适当的杂交条件下保持与转录本形成互补碱基对的能力。或者，寡核苷酸的互补区可以具有不超过1，不超过2，不超过3，不超过4或不超过5个错配，只要其在适当的杂交条件下保持与HBsAg mRNA形成互补碱基对的能力。在一些实施方式中，如果在互补区中存在不止一个错配，则它们可以连续定位(例如，在一行中2、3、4或更多个)，或散布在整个互补区中，只要寡核苷酸在适当的杂交条件下保持与HBsAg mRNA形成互补碱基对的能力。
iii.单链寡核苷酸
在一些实施方式中，如本文所述用于降低HBsAg表达的寡核苷酸是与HBsAg mRNA互补的单链寡核苷酸。这样的结构可以包括但不限于单链RNAi寡核苷酸。最近的努力已经证明了单链RNAi寡核苷酸的活性(参见例如，Matsui等(May 2016),Molecular Therapy,Vol.24(5),946-955)。然而，在一些实施方式中，本文提供的寡核苷酸是反义寡核苷酸(ASO)。反义寡核苷酸是具有核苷酸碱基序列的单链寡核苷酸，当以5'至3'方向书写时，其包含特定核酸的靶向区段的反向互补序列并被适当修饰(例如，作为gapmer)以诱导在细胞中RNaseH介导的靶RNA的切割或(例如，作为mixmer)以抑制靶mRNA在细胞中的翻译。可用于本公开中的反义寡核苷酸可以以本领域中已知的任何合适方式进行修饰，包括例如美国专利号9,567,587中所示，其关于反义寡核苷酸的修饰(包括，例如长度、核碱基的糖部分(嘧啶、嘌呤)和核碱基的杂环部分的改变)的公开内容通过引用并入本文。此外，反义分子已经被用于降低特定靶基因的表达数十年(参见例如，Bennett等；Pharmacology of AntisenseDrugs,Annual Review of Pharmacology and Toxicology,Vol.57:81-105)。
iv.寡核苷酸修饰
寡核苷酸可以以各种方式修饰，以改善或控制特异性、稳定性、递送、生物利用度、对核酸酶降解的抗性、免疫原性、碱基配对特性、RNA分布和细胞摄取以及与治疗或研究用途相关的其他特征。参见Bramsen等,Nucleic Acids Res.,2009,37,2867-2881；Bramsenand Kjems(Frontiers in Genetics,3(2012):1-22)。因此，在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸可包括一种或多种合适的修饰。在一些实施方式中，修饰的核苷酸在其碱基(或核碱基)、糖(例如核糖、脱氧核糖)或磷酸基团中具有修饰。
寡核苷酸上的修饰数目和那些核苷酸修饰的位置可影响寡核苷酸的性质。例如，寡核苷酸可以通过将它们缀合或包裹在脂质纳米颗粒(LNP)或类似载体中而在体内递送。然而，当寡核苷酸不受LNP或类似载体的保护时，其核苷酸中的至少一些核苷酸被修饰可能是有利的。因此，在本文提供的任何寡核苷酸的某些实施方式中，寡核苷酸的所有或基本上所有核苷酸均被修饰。在某些实施方式中，多于一半的核苷酸被修饰。在某些实施方式中，少于一半的核苷酸被修饰。通常，在裸递送的情况下，每种糖都在2'位置被修饰。这些修饰可以是可逆的或不可逆的。在一些实施方式中，本文公开的寡核苷酸具有足以引起所期望特征(例如，防止酶促降解、在体内施用后靶向所期望细胞的能力、和/或热力学稳定性)的数量和类型的修饰核苷酸。
a.糖修饰
在一些实施方式中，修饰的糖(在本文中也称为糖类似物)包括修饰的脱氧核糖或核糖部分，例如，其中一个或多个修饰发生在糖的2'、3'、4'和/或5'碳位置。在一些实施方式中，修饰的糖还可以包括非天然的替代碳结构，例如存在于锁核酸(“LNA”)中的那些(参见例如，Koshkin等(1998),Tetrahedron 54,3607-3630)，未锁定的核酸(“UNA”)(参见例如，Snead等(2013),Molecular Therapy–Nucleic Acids,2,e103)和桥接的核酸(“BNA”)(参见例如Imanishi and Obika(2002),The Royal Society of Chemistry,Chem.Commun.,1653-1659)。Koshkin等,Snead等,以及Imanishi and Obika涉及糖修饰的公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，糖中的核苷酸修饰包括2'-修饰。2'-修饰可以是2'-氨基乙基，2'-氟，2'-O-甲基，2'-O-甲氧基乙基和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯核酸。通常，修饰是2'-氟，2'-O-甲基或2'-O-甲氧基乙基。在一些实施方式中，糖中的修饰包括糖环的修饰，其可以包含糖环的一个或多个碳的修饰。例如，核苷酸的糖的修饰可以包括糖的2'-氧与糖的1'-碳或4'-碳连接，或2'-氧与1'-碳或4'-碳通过乙烯或亚甲基桥连接。在一些实施方式中，修饰的核苷酸具有缺乏2'-碳至3'-碳键的无环糖。在一些实施方式中，修饰的核苷酸在例如糖的4'位置具有巯基。
在一些实施方式中，末端3'-端基(例如3'-羟基)是磷酸基或其他基团，其可用于例如连接接头、衔接子或标记或用于直接连接寡核苷酸与另一核酸。
b.5'末端磷酸酯
在一些实施方式中，寡核苷酸的5'-末端磷酸酯基团增强了与Argonaut 2的相互作用。但是，包含5'-磷酸酯基团的寡核苷酸可能易于通过磷酸酶或其他酶降解，这会限制它们在体内的生物利用度。在一些实施方式中，寡核苷酸包含抗这样的降解的5'磷酸酯的类似物。在一些实施方式中，磷酸酯类似物可以是羟甲基膦酸酯、乙烯基膦酸酯或丙二酰基膦酸酯。在某些实施方式中，寡核苷酸链的5'端连接至模拟天然5'-磷酸酯基团的静电和空间特性的化学部分(“磷酸酯模拟物”)(参见例如Prakash等(2015),Nucleic Acids Res.,Nucleic Acids Res.2015 Mar 31；43(6):2993–3011，其与磷酸酯类似物有关的内容通过引用并入本文)。已经开发了许多可以连接到5'端的磷酸酯模拟物(参见例如，美国专利号8,927,513，其与磷酸酯类似物有关的内容通过引入并入本文)。针对寡核苷酸的5'端已经开发了其他修饰(参见例如，WO 2011/133871，其与磷酸酯类似物有关的内容通过引用并入本文)。在某些实施方式中，羟基连接至寡核苷酸的5'端。
在一些实施方式中，寡核苷酸在糖的4'-碳位置具有磷酸酯类似物(称为“4'-磷酸酯类似物”)。参见例如，2016年9月2日提交的名称为4′-Phosphate Analogs andOligonucleotides Comprising the Same的美国临时申请号62/383,207，以及2016年9月12日提交的名称为4′-Phosphate Analogs and Oligonucleotides Comprising the Same的美国临时申请号62/393,401，其涉及磷酸酯类似物的内容各自通过引用并入本文。在一些实施方式中，本文提供的寡核苷酸在5'-端核苷酸处包含4'-磷酸酯类似物。在一些实施方式中，磷酸酯类似物是氧甲基膦酸酯，其中氧甲基的氧原子结合至糖部分(例如，在其4'-碳处)或其类似物。在其他实施方式中，4'-磷酸酯类似物是硫代甲基膦酸酯或氨基甲基膦酸酯，其中硫代甲基的硫原子或氨基甲基的氮原子与糖部分或其类似物的4'-碳键合。在某些实施方式中，4'-磷酸酯类似物是羟甲基膦酸酯。在一些实施方式中，氧甲基膦酸酯由式–O–CH2–PO(OH)2or–O–CH2–PO(OR)2表示，其中R独立地选自H、CH3、烷基、CH2CH2CN、CH2OCOC(CH3)3、CH2OCH2CH2Si(CH3)3、或保护基。在某些实施方式中，烷基为CH2CH3。更典型地，R独立地选自H、CH3或CH2CH3。
在某些实施方式中，连接至寡核苷酸的磷酸酯类似物是甲氧基膦酸酯(MOP)。在某些实施方式中，连接至寡核苷酸的磷酸酯类似物是5'单甲基保护的MOP。在一些实施方式中，例如在指导(反义)链的第一位置可以使用以下包含磷酸酯类似物的尿苷核苷酸：
Figure BDA0002456233780000361
该修饰的核苷酸称为[MePhosphonate-4O-mU]或5'-甲氧基、膦酸酯-4'氧基-2'-O-甲基尿苷。
c.修饰的核苷间键
在一些实施方式中，磷酸酯修饰或取代可以产生包含至少一个(例如，至少1，至少2，至少3或至少5个)修饰的核苷酸间键的寡核苷酸。在一些实施方式中，本文公开的任何寡核苷酸包含1至10(例如1至10、2至8、4至6、3至10、5至10、1至5、1至3或1至2)修饰的核苷酸间键。在一些实施方式中，本文公开的任何寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰的核苷酸间键。
修饰的核苷酸间键可以是硫代磷酸酯键，硫代磷酸酯键，磷酸三酯键，硫代烷基膦酸酯键，硫代烷基磷酸三酯键，亚磷酰胺键，膦酸酯键或硼酸磷酸酯键。在一些实施方式中，本文公开的任何一个寡核苷酸的至少一个修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
d.碱基修饰
在一些实施方式中，本文提供的寡核苷酸具有一个或多个修饰的核碱基。在一些实施方式中，修饰的核碱基(在本文中也称为碱基类似物)在核苷酸糖部分的1'位置连接。在某些实施方式中，修饰的核碱基是含氮碱基。在某些实施方式中，修饰的核碱基不包含氮原子。参见例如美国公开专利申请号20080274462。在一些实施方式中，修饰的核苷酸包含通用碱基。但是，在某些实施方式中，修饰的核苷酸不包含核碱基(无碱基)。
在一些实施方式中，通用碱基是位于修饰核苷酸中核苷酸糖部分的1'位置上的杂环部分，或核苷酸糖部分取代中的等同位置，当存在于双链体中时，其可以相对于一种以上类型的碱基而定位，而基本上不改变双链体的结构。在一些实施方式中，相比于与靶核酸完全互补的参考单链核酸(例如寡核苷酸)，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成双链体，所述双链体相比于与互补核酸形成的双链体具有更低的Tm。然而，在一些实施方式中，相比于其中通用碱基已被碱基替换以产生单个错配的参考单链核酸，含有通用碱基的单链核酸与靶核酸形成的双链体比由包含错配碱基的核酸形成的双链体具有更高的Tm。
通用结合核苷酸的非限制性实例包括肌苷、1-β-D-呋喃核糖-5-硝基吲哚和/或1-β-D-呋喃核糖-3-硝基吡咯(美国专利申请公开号20070254362，授予Quay等；Van Aerschot等,An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguousnucleoside.Nucleic Acids Res.1995 Nov 11；23(21):4363-70；Loakes等,3-Nitropyrrole and5-nitroindole as universal bases in primers for DNAsequencing and PCR.Nucleic Acids Res.1995 Jul 11；23(13):2361-6；Loakes andBrown,5-Nitroindole as an universal base analogue.Nucleic Acids Res.1994 Oct11；22(20):4039-43。上述与碱基修饰相关的内容各自通过引用并入本文。
e.可逆修饰
尽管可以进行某些修饰以保护寡核苷酸在到达靶细胞之前不受体内环境的影响，但是一旦寡核苷酸到达靶细胞的胞质溶胶，它们可以降低寡核苷酸的效力或活性。可以进行可逆的修饰，使得分子在细胞外保留所期望的特性，然后在进入细胞的胞质环境时将其除去。可以通过例如细胞内酶的作用或通过细胞内部的化学条件(例如，通过细胞内谷胱甘肽的还原)来去除可逆修饰。
在一些实施方式中，可逆地修饰的核苷酸包含谷胱甘肽敏感部分。通常，核酸分子已用环状二硫键部分进行化学修饰，以掩盖核苷酸间二磷酸(diphosphate)键所产生的负电荷，并改善细胞摄取和核酸酶的抗性。参见最初给予Traversa Therapeutics,Inc.(“Traversa”)的美国公开申请号2011/0294869，Solstice Biologics,Ltd.(“Solstice”)的PCT公开号WO 2015/188197，Meade等,Nature Biotechnology,2014,32:1256-1263(“Meade”)，Merck Sharp&Dohme Corp的PCT公开号WO 2014/088920，其关于这样的修饰的公开内容各自通过引用并入本文。核苷酸间二磷酸键的这种可逆修饰被设计成通过胞质溶胶的还原环境在细胞内切割(例如谷胱甘肽)。较早的实例包括中和的磷酸三酯修饰，据报道该修饰在细胞内是可切割的(Dellinger等J.Am.Chem.Soc.2003,125:940-950)。
在一些实施方式中，这样的可逆修饰允许在体内施用期间保护(例如，通过血液和/或细胞的溶酶体/内体隔室转运)，其中寡核苷酸将暴露于核酸酶和其他恶劣的环境条件(例如pH)。当将释放到其中谷胱甘肽的水平比细胞外空间更高的细胞的胞质溶胶中时，修饰被逆转，结果是寡核苷酸被切割。与使用不可逆化学修饰可获得的选择相比，使用可逆的谷胱甘肽敏感部分，可以将空间较大的化学基团引入感兴趣的寡核苷酸中。这是因为这些较大的化学基团将在胞质溶胶中被去除，因此不应干扰细胞胞质溶胶内寡核苷酸的生物学活性。结果，可以工程化这些较大的化学基团以赋予核苷酸或寡核苷酸各种优点，例如核酸酶抗性、亲脂性、电荷、热稳定性、特异性和降低的免疫原性。在一些实施方式中，可以工程化谷胱甘肽敏感部分的结构以改变其释放的动力学。
在一些实施方式中，谷胱甘肽敏感部分连接至核苷酸的糖。在一些实施方式中，谷胱甘肽敏感部分连接至修饰核苷酸的糖的2'-碳。在一些实施方式中，谷胱甘肽敏感部分位于糖的5'-碳上，特别是当修饰的核苷酸是寡核苷酸的5'-末端核苷酸时。在一些实施方式中，谷胱甘肽敏感部分位于糖的3'-碳上，特别是当修饰的核苷酸是寡核苷酸的3'-末端核苷酸时。在一些实施方式中，谷胱甘肽敏感部分包含磺酰基。参见例如于2016年8月23日提交的名称为“Compositions Comprising Reversibly Modified Oligonucleotides andUses Thereof”的美国临时专利号62/378,635，其相关公开内容通过引用并入本文。
v.靶向配体
在一些实施方式中，可以期望将本公开的寡核苷酸靶向一个或多个细胞或一个或多个器官。这样的策略可以帮助避免在其他器官中的不良作用，或者可以避免寡核苷酸在不会有益于寡核苷酸的细胞、组织或器官中的不当损失。因此，在一些实施方式中，可以修饰本文公开的寡核苷酸以促进靶向特定组织、细胞或器官，例如促进寡核苷酸向肝脏的递送。在某些实施方式中，本文公开的寡核苷酸可以被修饰以促进寡核苷酸向肝的肝细胞的递送。在一些实施方式中，寡核苷酸包含与一个或多个靶向配体缀合的核苷酸。
靶向配体可以包含碳水化合物、氨基糖、胆固醇、肽、多肽、蛋白质或蛋白质的一部分(例如抗体或抗体片段)或脂质。在一些实施方式中，靶向配体是适体。例如，靶向配体可以是用于靶向肿瘤脉管系统或神经胶质瘤细胞的RGD肽，用于靶向肿瘤脉管系统或造口的CREKA肽，运铁蛋白，乳铁蛋白或靶向CNS脉管系统上表达的运铁蛋白受体的适体，或靶向神经胶质瘤细胞上的EGFR的抗EGFR抗体。在某些实施方式中，靶向配体是一个或多个GalNAc部分。
在一些实施方式中，寡核苷酸的1个或更多个(例如1、2、3、4、5或6)核苷酸各自与单独的靶向配体缀合。在一些实施方式中，寡核苷酸的2-4个核苷酸各自与单独的靶向配体缀合。在一些实施方式中，靶向配体在有义或反义链的任一端与2-4个核苷酸缀合(例如，配体在有义链或反义链的5'或3'端与2-4个核苷酸的突出端或延伸缀合)，使得靶向配体类似于牙刷的刷毛，而寡核苷酸类似于牙刷。例如，寡核苷酸可在有义链的5'或3'端包含茎环，并且茎环的1、2、3或4个核苷酸可分别与靶向配体缀合。
在一些实施方式中，期望将降低HBV抗原表达的寡核苷酸靶向受试者的肝细胞。任何合适的肝细胞靶向部分均可用于该目的。
GalNAc是去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的高亲和力配体，其主要在肝细胞的血窦面上表达，并在结合、内化和随后清除包含末端半乳糖或N-乙酰半乳糖胺残基(去唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein))的循环糖蛋白中具有主要作用。GalNAc部分与本公开的寡核苷酸的缀合(间接或直接)可用于将这些寡核苷酸靶向到在这些肝细胞上表达的ASGPR。
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸直接或间接缀合至单价GalNAc。在一些实施方式中，寡核苷酸直接或间接缀合至多于一个的单价GalNAc(即，缀合至2、3或4个单价GalNAc部分，并且通常缀合至3或4个单价GalNAc部分)。在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸与一个或多个二价GalNAc、三价GalNAc或四价GalNAc部分缀合。
在一些实施方式中，寡核苷酸的1个或更多个(例如1、2、3、4、5或6)核苷酸各自与GalNAc部分缀合。在一些实施方式中，茎环的环(L)的2-4个核苷酸各自与单独的GalNAc缀合。在一些实施方式中，靶向配体在有义链或反义链的任一末端与2-4个核苷酸缀合(例如，配体在有义链或反义链的5'或3'端与2-4个核苷酸的突出端或延伸缀合)，使得GalNAc部分类似于牙刷的刷毛，而寡核苷酸类似于牙刷。例如，寡核苷酸可以在有义链的5'或3'端包含茎环，并且茎环的1、2、3或4个核苷酸可分别与GalNAc部分缀合。在一些实施方式中，GalNAc部分与有义链的核苷酸缀合。例如，可以将四个GalNAc部分与有义链的四环中的核苷酸缀合，其中每个GalNAc部分都与一个核苷酸缀合。
在一些实施方式中，本文的寡核苷酸包含连接至胍核苷酸的单价GalNac，称为[ademG-GalNAc]或2'-氨基二乙氧基甲醇-胍-GalNAc，如下所示：
Figure BDA0002456233780000411
在一些实施方式中，本文的寡核苷酸包含连接至腺嘌呤核苷酸的单价GalNac，称为[ademA-GalNAc]或2'-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc，如下所示：
Figure BDA0002456233780000412
下文显示了这样的缀合的实例，其显示了包含5'至3'的核苷酸序列GAAA(L＝接头，X＝杂原子)茎连接点的环。这样的环可以存在于例如图1A所示分子的第27-30位处。在化学式中，
Figure BDA0002456233780000413
是寡核苷酸链的连接点。
Figure BDA0002456233780000421
可以使用适当的方法或化学方法(例如点击化学方法)将靶向配体连接至核苷酸。在一些实施方式中，使用点击接头将靶向配体与核苷酸缀合。在一些实施方式中，基于缩醛的接头用于将靶向配体与本文所述的任一寡核苷酸的核苷酸。基于缩醛的接头例如公开于2016年6月23日公开的国际专利申请公开号WO2016100401A1中，并且其涉及这样的接头的内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，接头是不稳定的接头。但是，在其他实施方式中，接头是相当稳定的。
下文显示了一个实例，为包含5'至3'核苷酸GAAA的环，其中GalNac部分使用缩醛接头连接至环的核苷酸。这样的环可以存在于例如图10所示分子的第27-30位处。在化学式中，
Figure BDA0002456233780000422
是寡核苷酸链的连接点。
Figure BDA0002456233780000431
III.制剂
已经开发了各种制剂以促进寡核苷酸的使用。例如，可使用使降解最小化、促进递送和/或摄取或为制剂中的寡核苷酸提供另一种有益特性的制剂将寡核苷酸递送至受试者或细胞环境。在一些实施方式中，本文提供了包含寡核苷酸(例如，单链或双链寡核苷酸)以减少HBV抗原(例如，HBsAg)表达的组合物。可以适当地配制这样的组合物使得当施用于受试者时(在靶细胞的直接环境中或全身性地)，足够部分的寡核苷酸进入细胞以降低HBV抗原表达。如本文所公开，多种合适的寡核苷酸制剂中的任一种可用于递送寡核苷酸以减少HBV抗原。在一些实施方式中，将寡核苷酸配制在缓冲溶液中，例如磷酸盐缓冲盐溶液、脂质体、胶束结构和衣壳中。
具有阳离子脂质的寡核苷酸制剂可用于促进寡核苷酸转染到细胞中。例如，可以使用阳离子脂质(例如lipofectin)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子(例如聚赖氨酸)。合适的脂质包括Oligofectamine、Lipofectamine(Life Technologies)、NC388(RibozymePharmaceuticals,Inc.,Boulder,Colo.)或FuGene 6(Roche)，所有脂质均可根据制造商的说明使用。
因此，在一些实施方式中，制剂包含脂质纳米颗粒。在一些实施方式中，赋形剂包含脂质体、脂质、脂质复合物、微球、微粒、纳米球或纳米颗粒，或者可以被配制用于向有需要的受试者的细胞、组织、器官或身体施用(例如参见Remington:The Science andPractice of Pharmacy,22nd edition,Pharmaceutical Press,2013)。
在一些实施方式中，本文公开的制剂包含赋形剂。在一些实施方式中，赋形剂赋予组合物活性成分改善的稳定性、改善的吸收、改善的溶解度和/或治疗性增强。在一些实施方式中，赋形剂是缓冲剂(例如柠檬酸钠、磷酸钠、tris碱或氢氧化钠)或载剂(例如缓冲溶液、凡士林、二甲基亚砜或矿物油)。在一些实施方式中，将寡核苷酸冻干以延长其保存期限，然后在使用前(例如，施用于受试者)制成溶液。因此，包含本文所述的任一寡核苷酸的组合物中的赋形剂可以是冻干保护剂(例如，甘露醇、乳糖、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮)或崩解温度调节剂(例如，葡聚糖、ficoll或明胶)。
在一些实施方式中，将药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、透皮(局部)、透粘膜和直肠给药。
适用于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL.TM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇和氯化钠。无菌注射溶液可通过将所需量的寡核苷酸与所需的一种或以上列举的成分的组合加入到选定的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。
在一些实施方式中，组合物可包含至少约0.1％的治疗剂(例如，用于减少HBV抗原表达的寡核苷酸)或更多，尽管活性成分的百分比可占总组合物重量或体积的约1％至约80％或更多之间。制备这样的药物制剂的领域的技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用度、生物学半衰期、施用途径、产品保质期以及其他药理学考虑等因素，并因此多种剂量和治疗方案可以是期望的。
即使许多实施方式涉及本文公开的任何寡核苷酸的肝靶向递送，也可以考虑靶向其他组织。
IV.使用方法
i.降低HBsAg表达
在一些实施方式中，提供了用于将有效量的本文公开的任一寡核苷酸递送到细胞中以减少HBsAg表达的方法。本文提供的方法可用于任何合适的细胞类型。在一些实施方式中，细胞是表达HBV抗原的任何细胞(例如，肝细胞、巨噬细胞、单核细胞衍生的细胞、前列腺癌细胞、脑细胞、内分泌组织、骨髓、淋巴结、肺、胆囊、肝、十二指肠、小肠、胰腺、肾脏、胃肠道、膀胱、脂肪、软组织和皮肤)。在一些实施方式中，细胞是已经从受试者获得的原代细胞，并且可能已经经历了有限次数的传代，使得该细胞基本上保持其天然表型特性。在一些实施方式中，寡核苷酸被递送至的细胞是离体的或体外的(即可以被递送至培养中的细胞或该细胞所驻留的生物)。在特定的实施方式中，提供了用于将有效量的本文公开的任一寡核苷酸递送至细胞以仅在肝细胞中降低HBsAg的表达的方法。
在一些实施方式中，可以使用适当的核酸递送方法引入本文公开的寡核苷酸，所述方法包括注射包含寡核苷酸的溶液，由寡核苷酸覆盖的粒子轰击，将细胞或生物体暴露于含有寡核苷酸的溶液或在寡核苷酸存在下细胞膜的电穿孔。可以使用其他合适的方法将寡核苷酸递送至细胞，例如脂质介导的载体转运，化学介导的转运和阳离子脂质体转染，例如磷酸钙等。
抑制作用的结果可以通过评估细胞或受试者的一种或多种特性的适当测定或通过评估指示HBV抗原表达的分子(例如，RNA、蛋白质)的生化技术来确认。在一些实施方式中，通过将HBV抗原的表达水平(例如，mRNA或蛋白质水平)与合适的对照(例如，未递送寡核苷酸或已递送阴性对照的细胞或细胞群中HBV抗原的表达水平)比较，来评估本文提供的寡核苷酸降低HBV抗原的表达水平的程度。在一些实施方式中，HBV抗原表达的合适对照水平可以是预定水平或值，使得不需要每次都测量对照水平。预定水平或值可以采取多种形式。在一些实施方式中，预定水平或值可以是单个截断值(cut-off value)，例如中值或平均值。
在一些实施方式中，施用本文所述的寡核苷酸导致细胞中HBV抗原(例如，HBsAg)表达水平的降低。在一些实施方式中，HBV抗原表达水平的降低可以是相比于合适对照的HBV抗原水平降低至1％或更低，5％或更低，10％或更低，15％或更低，20％或更低，25％或更低，30％或更低，35％或更低，40％或更低，45％或更低，50％或更低，55％或更低，60％或更低，70％或更低，80％或更低，90％或更低。合适的对照水平可以是未与本文所述的寡核苷酸接触的细胞或细胞群中HBV抗原表达的水平。在一些实施方式中，在有限的时间段后评估根据本文公开的方法将寡核苷酸递送至细胞的效果。例如，可以在将寡核苷酸引入细胞中至少8小时、12小时、18小时、24小时；或至少1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、84、91、98、105、112、119、126、133、140或147天后在细胞中分析HBV抗原的水平。
在一些实施方式中，HBV抗原(例如，HBsAg)表达水平的降低在施用后持续延长的时间段。在一些实施方式中，在施用本文所述的寡核苷酸后，可检测的HBsAg表达减少持续7至70天。例如，在一些实施方式中，可检测的减少在施用寡核苷酸后的10至70、10至60、10至50、10至40、10至30或10至20天的时间内持续。在一些实施方式中，可检测的减少在施用寡核苷酸后20至70、20至60、20至50、20至40或20至30天的时间内持续。在一些实施方式中，可检测的减少在施用寡核苷酸后30至70、30至60、30至50、30至40天的时间内持续。在一些实施方式中，可检测的减少在施用寡核苷酸后40至70、40至60、40至50、50至70、50至60、或60-70天的时间内持续。
在一些实施方式中，可检测的HBsAg表达减少在施用本文所述的寡核苷酸后持续2至21周的时间。例如，在一些实施方式中，可检测的减少施用寡核苷酸后2至20、4至20、6至20、8至20、10至20、12至20、14至20、16至20或18至20周的时间内持续。在一些实施方式中，可检测的减少在施用寡核苷酸后2至16、4至16、6至16、8至16、10至16、12至16或14至16周的时间内持续。在一些实施方式中，可检测的减少在施用寡核苷酸后2至12、4至12、6至12、8至12或10至12周的时间内持续。在一些实施方式中，可检测的减少在施用寡核苷酸后2至10、4至10、6至10或8至10周的时间内持续。
在一些实施方式中，寡核苷酸以工程化以在细胞中表达寡核苷酸(例如，其有义链和反义链)的转基因的形式递送。在一些实施方式中，使用工程化以表达本文公开的任何寡核苷酸的转基因递送寡核苷酸。可以使用病毒载体(例如，腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、痘病毒、腺相关病毒或单纯疱疹病毒)或非病毒载体(例如质粒或合成的mRNA)递送转基因。在一些实施方式中，转基因可以直接注射给受试者。
ii.治疗方法
本公开的方面涉及用于降低HBsAg表达(例如，降低HBsAg表达)以治疗受试者的HBV感染的方法。在一些实施方式中，所述方法可以包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的任一寡核苷酸。本公开提供了治疗处于HBV感染风险(或对HBV敏感)和/或患有与HBV感染有关的疾病或病症的受试者的预防和治疗方法。
在某些方面，本公开提供了一种通过向受试者施用治疗剂(例如，寡核苷酸或编码该寡核苷酸的载体或转基因)在受试者中预防本文所述的疾病或病症的方法。在一些实施方式中，待治疗的受试者是将从例如肝脏中HBsAg蛋白的量减少在治疗上受益的受试者。可以通过例如本领域已知的诊断或预后测定中的一种或组合(例如，鉴定肝硬化和/或肝炎症)来鉴定具有疾病或病症风险的受试者。预防剂的施用可以在疾病或病症的特征性症状的检测或表现之前进行，使得疾病或病症被预防或替代地延缓了其发展。
本文所述的方法通常涉及向受试者施用有效量的寡核苷酸，即能够产生期望治疗结果的量。治疗上可接受的量可以是能够治疗疾病或病症的量。任何一名受试者的合适剂量取决于某些因素，包括受试者的身材、体表面积、年龄、要施用的特定组合物、组合物中的活性成分、施用时间和途径、总体健康状况、和其他药物同时施用。例如，剂量可以在0.1mg/kg至12mg/kg的范围内。剂量也可以在0.5至10mg/kg的范围内。或者，剂量可以在1.0至6.0mg/kg的范围内。剂量也可以在3.0至5.0mg/kg的范围内。
在一些实施方式中，通过肠内(enteranlly)(例如，通过胃饲管，通过十二指肠饲管，通过胃造口术或直肠)，肠胃外(例如，皮下注射，静脉内注射或输注，动脉内注射或输注，骨内输注，肌内注射，脑内注射，脑室内注射，鞘内注射)，局部(例如表皮，吸入，通过滴眼液或通过粘膜)或通过直接注射入靶器官(例如受试者的肝脏)向受试者施用本文公开的任何一种组合物。通常，本文公开的寡核苷酸通过静脉内或皮下施用。
作为一组非限制性实例，本公开的寡核苷酸通常每季度(每三个月一次)，每两个月(每两个月一次)，每月或每周一次施用。例如，寡核苷酸可以每一周、两周或三周施用一次。寡核苷酸可以每天施用。
在一些实施方式中，待治疗的受试者是人类或非人类的灵长类动物或其他哺乳动物受试者。其他示例性受试者包括家养动物，例如狗和猫；家畜，例如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡等；以及动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠等。
实施例
实施例1.开发有效的HBsAg表达的寡核苷酸抑制剂
HBV表面抗原被鉴定为基于RNAi的疗法的靶标以治疗HBV感染。如图1所示的HBV基因组组织中所描述的，HBsAg由从单个ORF转录的三个RNA分子编码。设计寡核苷酸的目的是沉默有助于HBsAg组装的一个或多个RNA转录物(在图1中用“X”表示示例性RNAi靶位点)。在体外和体内设计并评估了靶向HBsAg的寡核苷酸HBV-254。基于直接靶向四种HBV RNA种类(species)的靶mRNA转录物的能力，选择和设计了HBV-254。实验中使用的HBV-254双链体寡核苷酸包含(5'至3'显示)GUGGUGGACUUCUCUCAAUAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:21)所示的序列的有义链；和(5'至3'显示)UAUUGAGAGAAGUCCACCACGG(SEQ ID NO:22)所示的序列的反义链。
在HDI小鼠中进行寡核苷酸HBV-254的单剂量评估，证实皮下靶向HBsAg病毒转录物的能力(图2)。如所示，HBV-254随着剂量的增加而全身性地降低了小鼠的HBsAg水平。在以3mg/kg皮下施用HBV-254的QW×3给药方案后，在小鼠中进一步评估了临床前效力(图3)。施用点在图中用箭头表示。在经寡核苷酸处理的小鼠和未经处理的对照小鼠两者中监测HBsAg水平，持续147天的时间。在整个研究中，经处理小鼠的HBsAg水平持续降低，在第一次施用后约两个月，表达水平(相对于对照)似乎稳定在降低的基线。
使用未修饰的四环形式的寡核苷酸的psiCHECK报告子测定，通过体外筛选，鉴定了另外的有效的靶向HBsAg的寡核苷酸。来自三个不同平板的结果显示在图4中。使用基于荧光的报告子测定，在HeLa细胞中以三种浓度(1、10和100pM)评估每种寡核苷酸(包括HBV-254)。每个平板报告的结果进一步显示与阳性对照(8、40和200pM)、阴性对照(1nM)和模拟转染比较。用方框突出显示的寡核苷酸被放大用于体内测试，其中发现HBV-219和HBV-258是在HBV-254和从筛选中鉴定出的那些中最有效的寡核苷酸。与HBV-254相比，HBV-219在效力上表现出多log的改善，因此被选择用于另外的评估。
实施例2.序列保守性分析和工程化错配以增加整体治疗效用
将实施例1中评估的几种最有效的寡核苷酸与HBV基因型A-I的基因组序列进行比较。初步保守性分析的结果列于表1。如所示，HBV-219在这些基因组中具有相对较低的保守性百分比。但是，如果在指导链的第15位处引入错配(MM)，则保守性百分比将显著增加(从66％至96％)。来自GenBank公共数据库的基因型乙型肝炎病毒(HBV)序列数据(通过引用并入本文)用于生物信息学的管理和比对。
表1.顶端HBV序列的初步保守性分析
Figure BDA0002456233780000501
进行了随后的保守性分析，其重点在表1中的几种寡核苷酸上并且涉及更广泛的检索参数。例如，尽管初步分析仅包括全长基因组序列，但是重点分析包括全长和部分(与靶位点具有>80％同一性)序列。此外，检查的基因组的数量从初步分析中的5628个增加到重点分析中的17000个以上。重点分析的结果与初始分析中观察到的趋势基本一致(表2)。如所示并且进一步在图5中示出—HBV-219被预测对HBV基因型B、E、F、H和I没有活性，除非指导链第15位的错配是耐受的。
表2.重点的保守性分析
Figure BDA0002456233780000511
*以(完美匹配/MM)报告的保守性分析，以粗体显示<90％的值；[总共N#]
使用psiCHECK-2双荧光素酶报告子系统评估在HBV-217、HBV-219、HBV-254、HBV-255和HBV-258中各自所选择位置处错配的影响。psiCHECK载体能够监测与报告子基因融合的靶基因的表达的变化，其中具有活性的RNAi降解融合构建体，从而产生相应的报告子信号的下降。图6中的图概括地描述了在这些测定中使用的载体。亲本部分报告子序列包含在S ORF中感兴趣靶位点周围来自基因型A(GenBank：AM282986.1)的120个碱基对片段。亲本寡核苷酸双链体序列在图6所示的相应位点与报告子质粒具有100％同源性，而错配的寡核苷酸双链体序列与报告子质粒具有单个错配。图7中示出与相应的亲本部分报告子序列比对的所测试的寡核苷酸的亲本和错配序列。
对于示例性错配测定，所测试的寡核苷酸包括相同的修饰模式。根据针对图7中的每个寡核苷酸显示的编号方案，修饰如下：5'-甲氧基，第1位处的膦酸酯-4'-氧基-2'-O-甲基尿苷；第2、3、5、7、8、10、12、14、16和19位处的2'-氟修饰的核苷酸；第1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22位处的2'-O-甲基修饰的核苷酸；和第1与2、2与3、3与4、20与21以及21与22位核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。错配的位置对于每个亲本和错配组是不同的，并在图7的框中显示。
使用在HeLa细胞中转染的起始于1nM浓度的6点、5倍系列稀释，在3天的时间内对每种寡核苷酸进行psiCHECK2报告子测定。在第1天，将10,000个HeLa细胞/孔(96孔)接种到黑壁透明底部的平板(80-90％融合)中。在第2天，将载体DNA和RNAi分子在无血清的适量
Figure BDA0002456233780000521
I培养基中稀释并轻轻混合。将
Figure BDA0002456233780000522
2000轻轻混合后，对于每个反应，将0.2μL稀释到25μL不含血清的
Figure BDA0002456233780000523
I培养基中。将稀释液轻轻混合，并在室温下孵育5分钟。孵育5分钟后，将等体积的稀释的DNA和RNAi分子与稀释的
Figure BDA0002456233780000524
2000合并。将合并的混合物轻轻混合，并在室温下孵育20分钟，以允许复合物形成发生。随后，将DNA-RNAi分子-
Figure BDA0002456233780000525
2000复合物添加到每个包含细胞和培养基的孔中，并通过前后摇动板轻轻混合。然后将细胞在CO2培养箱中于37℃孵育，直至准备好收获细胞并测定靶基因。在第3天，将100μL Dual-Glo试剂添加到每个孔中，混合并孵育10分钟，然后读取发光。向每个孔中再添加100μL Dual-Glo Stop&Glo，混合并孵育10分钟，然后读取发光。为每个亲本和错配寡核苷酸生成剂量响应曲线，以评估错配对活性的影响。表3显示了针对每种寡核苷酸确定的EC50值以及另外的说明。
表3.靶向HBsAg的寡核苷酸的错配评估
Figure BDA0002456233780000531
如通过相对EC50s值所证实的，HBV-219双链体的体外剂量-响应曲线显示在指导链的第15位处的单个错配没有丧失活性。随后的体内分析比较了HBV-219亲本(本文称为HBV(s)-219P1)和错配寡核苷酸(本文称为HBV(s)-219P2)，确认引入错配不会产生活性丧失(图8)。如图9所描述的单剂量滴定曲线所示，在施用后70天的时期内体内耐受HBV-219错配寡核苷酸双链体(HBV(s)-219P2)。
图10示出了具有引入的错配的HBV-219(本文称为HBV(s)-219)的修饰的双链体结构的实例。根据针对图7中的每个寡核苷酸显示的编号方案，有义链跨越核苷酸1至36，而反义链跨越寡核苷酸1至22，反义链以从右至左的方向编号显示。显示的双链体形式在有义链的第36位和反义链的第1位核苷酸之间具有切口。有义链中的修饰如下：在第3、8-10、12、13和17位处的2'-氟修饰的核苷酸；在第1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36位处的2'-O-甲基修饰的核苷酸；在第1与2位核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键；在第27-30位处的2'-OH核苷酸；在第27位处的2'-氨基二乙氧基甲醇-胍基-GalNAc；在第28、29和30位各自为2'-氨基二乙氧基甲醇-腺嘌呤-GalNAc。反义链中的修饰如下：5'-甲氧基，第1位处的膦酸酯-4'-氧基-2'-O-甲基尿苷硫代磷酸酯；在第2、3、5、7、8、10、12、14、16和19位处的2'-氟修饰核苷酸；在第1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22位处的2'-O-甲基修饰的核苷酸；在第1与2、2与3、3与4、20与21以及21与22位核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。反义链包含在第15位处引入的错配。也如所示，双链体的反义链包含跨越第21-22位的“GG”突出端。
表4中示出关于HBV(s)-219和以上提到的两种前体(HBV(s)-219P1和HBV(s)-219P2)的细节。
表4.HBV(s)-219和前体
Figure BDA0002456233780000541
实施例3：HBV(s)-219前体的抗病毒活性
评估了用HBV(s)-219前体治疗对HBV核心抗原(HBcAg)的亚细胞定位的影响。对NODscid小鼠进行HBV基因组的头尾二聚体流体动力注射(HDI)。HDI后2周开始用寡核苷酸治疗。处理后从小鼠分离的肝细胞的免疫组织化学染色显示HBV核心抗原(HBcAg)表达急剧下降。
进行RNA测序以检查HBsAg敲低对HBV病毒转录物的整体表达的影响。三次剂量(每周一次，每次3mg/kg)后从HDI小鼠中分离出肝细胞。从肝细胞提取总RNA，并使用HiSeq平台进行Illumina测序。图11B描绘了RNA测序结果，其中将检测到的RNA转录物序列与HBV RNA进行映射(mapping)。还描述了HBV(s)-219及其前体的靶位点，表明寡核苷酸靶向pgRNA(3.5kb)，S1(2.4kb)和S2(2.1kb)转录物。结果表明，与载剂对照相比，用HBV(s)-219P1处理导致所有HBV病毒转录物的沉默率均超过90％。
在两种不同的HBV小鼠模型中检查了HBV(s)-219P1寡核苷酸的持续作用—一种是cccDNA依赖性的HDI模型，另一种是cccDNA非依赖性的AAV模型。在HBV的HDI模型中，相比于载剂对照和靶向HBxAg mRNA的RNAi寡核苷酸，在涉及三次剂量(每周一次，剂量为3mg/ml)的靶向HBsAg mRNA的HBV(s)-219P1寡核苷酸的处理的背景下，对HBsAg mRNA表达进行时程(12周)分析(图12A)。HBV(s)-219P1寡核苷酸产生≥3.9log减少，活性持续相对较长，超过7周。相反，通过比较，靶向HBV(x)的寡核苷酸产生了约3.0log的下降，持续时间较短。
在AAV-HBV模型中，相比于载剂对照和靶向HBxAg mRNA的RNAi寡核苷酸，在涉及三次剂量(每周一次，剂量为3mg/ml)的靶向HBsAg mRNA的HBV(s)-219P2寡核苷酸的处理的背景下，对HBsAg mRNA表达进行进一步的时程(12周)分析(图12B)。在该模型中，HBV(s)-219P2寡核苷酸产生的log减少和持续时间与靶向HBV(x)的寡核苷酸相当。图12A和12B中使用的靶向HBxAg mRNA的RNAi寡核苷酸具有UGCACUUCGCGUCACCUCUAGCAGCCGAAAGGCUGC的有义链序列和UAGAGGUGACGCGAAGUGCAGG的反义链序列。该靶向HBxAg的RNAi寡核苷酸在本文中称为GalXC-HBVX。
进行了免疫组织化学染色以检查相比于如上所述的载剂对照和靶向HBxAg mRNA的RNAi寡核苷酸在用如上所述的靶向HBsAg mRNA的HBV(s)-219前体寡核苷酸处理后从AAV-HBV模型和HBV的HDI模型获得的肝细胞中HbcAg的亚细胞分布。(图13)在HDI模型中，处理后的残留核心蛋白(HBcAg)在两种RNAi寡核苷酸之间表现出亚细胞定位的显著差异，而在AAV模型中则没有。
实施例4：在PXB-HBV嵌合人肝模型基因型C中评估HBV(s)-219P1
在PXB-HBV模型中评估了HBV(s)-219P1的抗病毒活性，该模型在HBV文献中也称为嵌合人肝模型。该技术基于将人类肝细胞移植到严重免疫功能低下的小鼠中，然后使用遗传机制毒害宿主鼠肝细胞(Tateno等，2015)。这个过程导致小鼠包含衍生自>70％人类组织的肝脏，与野生型小鼠不同，它可以被HBV感染(Li等，2014)。PXB-HBV模型在HBV(s)-219药理学的背景下具有多种用途：(1)确认寡核苷酸可在体内参与人RNAi机器(RISC)，(2)确认GalNAc靶向配体构型可以在体内通过人ASGR内化到肝细胞中，并且(3)在真实的HBV感染模型(与工程化的HBV表达模型相对)中确认功效。尽管移植的人类肝细胞导致不规则的嵌合肝生理功能存在局限性(Tateno等，2015)，但在该模型中仍可观察到显著的抗病毒功效。
在小鼠最初感染HBV基因型C后约8周，收集每只小鼠的血浆以作为基线HBsAg测量。然后，每群组9只小鼠(对于PK，n＝3，对于PD，n＝6)接受3次SC注射，每周一次0(PBS)或3mg/kg HBV(s)-219P1。给药的第一天被认为是第0天。每周进行非终末采血以确定每只小鼠的血清HBsAg和循环HBV DNA水平(图14A-14D)。在第28天对小鼠进行安乐死用于末端组织终点。对第28天的肝样本进行肝内HBV DNA和cccDNA水平的分析。在用HBV(s)-219P1处理的小鼠中分析的所有终点均观察到了显著的抗病毒活性，包括HBsAg降低>80％，以及循环HBV DNA、肝内HBV DNA和cccDNA显著降低(图14A-14D)。这些数据证实，全身性施用后，HBV(s)-219处理可在感染的人肝细胞中产生抗病毒活性。
实施例5：HBV(s)-219P2增强恩替卡韦的抗病毒活性
当前的护理标准，核苷酸类似物(例如恩替卡韦)可有效减少循环中的HBV基因组DNA，但不减少循环中的HBsAg。尽管在这样的治疗中导致控制的病毒血症，但是需要终生治疗并且很少实现功能性治愈。靶向S抗原的RNAi寡核苷酸会影响病毒聚合酶和HBsAg蛋白。在这项研究中，在表达HBV的小鼠(HDI模型)中探索了HBV(s)-219P2作为单药疗法和与恩替卡韦的联合疗法的抗病毒活性的联合作用。
每天向小鼠施用500ng/kg恩替卡韦(ETV)的口服剂量，持续14天。单次皮下施用了HBV(s)-219P2。通过qPCR测量循环病毒载量(HBV DNA)(图15A)，通过ELISA测量血浆HBsAg水平(图15B)，并且通过qPCR测量肝脏HBV mRNA和pgRNA水平。HBV(s)-219P2和ETV联合疗法观察到明显的累加作用。结果表明，单独的ETV疗法对循环的HBsAg或肝病毒RNA无效。此外，通过HBsAg或HBV RNA测量的HBV(s)-219P2的抗病毒活性不受ETV的共同给药的影响(图15B-15C)。
如图15A-15C所示，每天给药500ng/kg PO的恩替卡韦单药疗法持续14天导致血浆中检测到的HBV DNA相对于PBS处理的小鼠平均减少约1.6log(n＝6)。循环HBsAg或肝病毒RNA均未见明显减少。在第0天单个1mg/kg或3mg/kg SC剂量的HBV(s)-219P2的单药疗法导致血浆中检测到的HBV DNA相对于PBS分别降低平均～0.8log或～1.8log(n＝7)。在第0天单个6mg/kg SC剂量的HBV(s)-219P2的单药疗法导致血浆中HBV DNA降低平均～2.5log，并且两只小鼠的水平降至检测限以下(n＝7)。在第0天，单个SC剂量的HBV(s)-219P2单药疗法导致循环中的HBsAg和肝病毒RNA两者的剂量依赖性降低。恩替卡韦每天给药500ng/kg PO持续14天与第0天单个1mg/kg SC给药HBV(s)-219P2的联合疗法导致血浆中检测到的HBVDNA累加降低平均～2.3log。与单个1mg/kg SC剂量的HBV(s)-219P2的单药疗法观察到的血浆HBsAg和肝病毒转录物的水平降低相似，表明血浆HBV DNA而不是循环HBsAg或肝病毒转录物的累加降低。
实施例6.HBV(s)-219P2和GalXC-HBVX的抗病毒活性的比较
在该研究中，向表达HBV的小鼠(HDI模型)施用HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX(与图12A和12B中使用的GalXC-HBVX相同的序列)、或两者RNAi寡核苷酸的组合，给药后两周或九周监测血浆HBsAg水平。如图16B所示，在用单次饱和的9mg/kg SC剂量的HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX或两者的组合治疗后2周，观察到相似的HBsAg抑制水平。在用靶向S的HBV(s)-219P2治疗处理的小鼠中观察到HBsAg的抑制时间延长，而用GalXC-HBVX或两者组合处理的小鼠在处理后9周具有显著的HBsAg恢复(n＝3)。
还在接受HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX或两种RNAi寡核苷酸的组合的小鼠中评估了在表达HBV的小鼠中HBV核心抗原(HBcAg)的亚细胞定位。用单次饱和剂量(9mg/kg，s.c.)的HBV(s)-219P2、GalXC-HBVX或1：1组合处理表达HBV的小鼠(HDI模型)。在图17A所示的时间点，对肝脏切片进行HBcAg染色；显示了代表性的肝细胞。用HBV(s)-219P2作为单一疗法或与GalXC-HBVX组合处理的群组特征为细胞核HBcAg。仅用GalXC-HBVS处理的群组仅显示HBcAg的胞质定位，据报道是治疗响应的有利预后指标(Huang等，J.Cell.Mol.Med.2018)。每只动物中具有核染色的HBcAg阳性细胞的百分比显示在图17B(n＝3/组，给药后2周，每只动物计数50个细胞)。为了确认对HBcAg亚细胞定位的影响是由于HBV转录组的区域，而不是由于RNAi序列的未知特性，设计和测试了靶向X和S的开放阅读框内的替代序列(见图17C)。在图17C中使用了HBV-254。HBV-254的序列描述于实施例1中。图17C使用的靶向HBxAg的替代寡核苷酸具有GCACCUCUCUUUACGCGGAAGCAGCCGAAAGGCUGC的有义链序列和UUCCGCGUAAAGAGAGGUGCGG的反义序列。与图16B中使用的RNAi寡核苷酸相比，两种替代的RNAi寡核苷酸具有在S或X抗原中不同的RNAi靶序列。然而，它们在血浆水平HBcAg表现出相同的差异作用，表明该作用对靶向S抗原本身具有特异性，但对所使用的寡核苷酸没有特异性。
实施例7：评估对健康人受试者的安全性、耐受性以及HBV(s)-219在HBV患者中的功效。
该研究旨在评估健康受试者(A组)的安全性和耐受性以及HBV(s)-219在HBV患者中的功效(B组)。按群组信息的剂量在图18中示出。HBV(s)-219的分子结构如图10、图19A所示，也如下所示：
有义链：5′mG-S-mA-fC-mA-mA-mA-mA-fA-fU-fC-mC-fU-fC-mA-mC-mA-fA-mU-mA-mA-mG-mC-mA-mG-mC-mC-[ademG-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-[ademA-GalNAc]-mG-mG-mC-mU-mG-mC3′
杂交至：
反义链：5′[MePhosphonate-4O-mU]-S-fU-S-fA-S-mU-fU-mG-fU-fG-mA-fG-mG-fA-mU-fU-mU-fU-mU-mG-fU-mC-S-mG-S-mG3′
图例：
mX：2′-O-甲基核糖核苷酸
fX：2′-氟-脱氧核糖核苷酸
[ademA-GalNAc]：2′-修饰-GalNAc腺苷
[ademG-GalNAc]：2′-修饰-GalNAc鸟苷
[MePhosphonate-4O-mU]：4′-单甲基膦酸酯-2′-O-甲基尿苷
键：“-”表示磷酸二酯键
“S”表示硫代磷酸酯键
患者选择标准如下所示。
A组-健康受试者
纳入标准：
1.签署知情同意书时，年龄为18岁(或合法同意的年龄，以较大者为准)至65岁(含)。
2.据包括病史、体格检查和实验室检查在内的医学评估确定的筛选时明显健康。
a.无持续疾病的症状
b.在体温、脉搏、呼吸频率、血压上无临床显著异常
c.没有临床上显著的心血管或肺部疾病，也没有需要药物治疗的心血管或肺部疾病。
3.研究者认为在筛选和第-1天时，12导联心电图(ECG)在正常范围内或无临床显著异常
4.在筛选访视1和进入(admission)时(第-1天)对酒精或滥用药物进行阴性筛选
5.在筛选访视1之前至少5年为非吸烟者，在筛选访视1时尿可替宁浓度为负
6.体重指数(BMI)在18.0–32.0kg/m2(含)范围内。
7.男性或女性：
a.男性参与者：
男性参与者必须同意在治疗期间和研究干预的给药后至少两周使用避孕药具，并且在此期间不捐献精子。
b.女性参与者：
如果女性参与者没有怀孕，没有母乳喂养，并且符合以下条件中的至少一项，则有资格参加：不是具有生育能力的女性(WOCBP)，或者，取决于地区；同意遵循避孕指南的WOCBP，即从筛选后的研究入组(enrollment)开始，持续整个治疗期间，并在研究干预的给药后至少持续12周。
8.能够给出签署的包括遵守要求和限制的知情同意书1。
排除标准，A组
1.可能干扰研究药物的吸收、分布或消除或干扰本研究的临床和实验室评估的任何医学病史，包括(但不限于)；慢性或复发性肾脏疾病，功能性肠病(例如频繁的腹泻或便秘)，胃肠道疾病，胰腺炎，癫痫发作，粘膜皮肤或肌肉骨骼疾病，自杀企图史或自杀观念，或临床上显著的抑郁症或需要药物干预的其他神经精神病学疾病
2.高血压控制不良或不稳定；或筛选时持续收缩压>150mmHg或舒张压>95mmHg
3.用胰岛素或降糖药治疗的糖尿病病史
4.在前12个月内需要住院的哮喘病史
5.通过中心研究实验室的筛选结果确定的G-6-PD缺乏症的证据
6.当前的内分泌疾病控制不佳，除了甲状腺疾病(甲状腺机能亢进/甲状腺功能减退等)外，其中任何经药物治疗的甲状腺疾病均不包括在内
7.如果参与者的恶性肿瘤在过去三年中已经完全通过化学疗法缓解并且没有另外的医学或外科手术干预，则允许恶性肿瘤病史
8.对寡核苷酸或GalNAc的多种药物过敏史或过敏反应史
9.SC注射剂不耐受的历史或显著的腹部瘢痕形成，其可能潜在地阻碍研究干预的施用或局部耐受性的评估
10.临床上相关的手术史
11.过去3年内持续乙醇滥用(>40gm乙醇/天)或非法药物使用的历史。
12.施用研究干预之前的7天内具有临床意义的疾病
13.施用研究干预之前的2个月内捐赠500毫升以上的血液，或在筛选之前的7天内捐赠血浆
14.筛选时正在进行的重大感染或已知的炎性过程(研究者认为)
15.慢性或复发性尿路感染(UTI)病史，或筛选前一个月内的UTI
16.计划在该研究期间进行选择性外科手术
17.在施用研究干预之前4周内使用处方药
18.除非研究者和资助者同意在临床上不相关，否则在首次给药的7天内使用非处方(OTC)药物或草药补充剂(常规维生素除外)。
19.在给药前的三个月内已接受研究药物，或在研究入组前正在另一项临床研究的随访。
20.在筛选时对HBV、HIV、HCV或HDV抗体呈血清反应阳性(如果在筛选前的3个月内进行，则可使用历史测试)
21.在筛选访视时或进入时(-1天)超出参考范围的丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、总胆红素、碱性磷酸酶(ALP)或白蛋白。
22.研究者认为临床上相关且不能接受的全血细胞计数测试异常；血红蛋白<12.0g/dL(相当于120g/L)；血小板超出正常范围。
23.血红蛋白A1C(HbA1C)>7％
24.研究者认为临床上显著且不能接受的任何其他安全实验室测试结果
25.从进入临床研究中心之前的48小时直到研究结束，已经进行或计划进行运动水平的重大改变。
26.研究者认为，使参与者不适合入组或干扰研究的参与或完成的任何状况。
B组患有乙型肝炎的成年人
纳入标准，B组
1.在签署知情同意书时，年龄为18岁(或合法同意的年龄，以较大者为准)至65岁(含)。
2.慢性乙型肝炎感染，记录为：
a.基于兼容的临床信息与CHB兼容的临床病史，以及先前对HBsAg和可能的其他HBV血清学标志物(HBeAg，HBV DNA)的血清阳性结果。
b.对HBeAg阳性患者进行筛选时血清HBsAg>1000IU/mL，对HBeAg阴性患者为>500IU/mL
c.中心研究实验室的TaqManTMHBV DNA v2.0测定确定的初治患者的血清HBV DNA>20,000IU/mL
d.血清IgM抗HBc阴性
3.与代偿性肝病相容的临床病史，没有肝硬化的证据：
a.没有食管或胃肠道静脉曲张出血史
b.无腹水史
c.没有因慢性肝病引起的黄疸病史
d.无肝性脑病病史
e.没有门静脉高血压的身体红斑–蜘蛛血管瘤等。
f.没有先前的肝活检、肝成像研究或弹性成像结果表明肝硬化
4.未经治疗的乙型肝炎：先前没有针对乙型肝炎的抗病毒治疗(既无先前的HBV核苷酸或含干扰素的治疗)，或筛选访视前连续接受核苷酸(恩替卡韦或替诺福韦)治疗至少12周，具有令人满意的耐受性和依从性
5.血清ALT>60U/L(男性)或>38U/L(女性)(2倍于美国肝病研究协会(AASLD)HBV指导标准的ULN，Terrault等，2016)
6.在筛选和第-1天时，12导联心电图无临床显著异常(研究者认为)
7.没有其他已知的肝病原因
8.除了良好控制的高血压和他汀类药物对高胆固醇血症的治疗外，没有其他需要持续医学治疗或长期或反复药理干预的医学疾病
9.BMI在18.0–32.0kg/m2(含)范围内
10.男性或女性
a.男性参与者：
男性参与者必须同意在治疗期间和研究干预的最后一剂量后12周内使用避孕药具，并且在此期间不捐献精子。
b.女性参与者：
如果女性参与者没有怀孕，没有母乳喂养，并且符合以下条件中的至少一项，则有资格参加：不是WOCBP，或者，取决于地区；在治疗期间以及在研究干预的剂量后至少12周同意遵循避孕指南的WOCBP。
11.能够给出签署的包括遵守要求和限制的知情同意书。
排除标准，B组
1.可能干扰研究药物的吸收、分布或消除或干扰本研究的临床和实验室评估的任何医学病史，包括(但不限于)；慢性或复发性肾脏疾病，功能性肠病(例如频繁的腹泻或便秘)，胃肠道疾病，胰腺炎，癫痫发作，粘膜皮肤或肌肉骨骼疾病，自杀企图史或自杀观念，或临床上显著的抑郁症或需要药物干预的其他神经精神病学疾病
2.高血压控制不良或不稳定
3.用胰岛素或降糖药治疗的糖尿病病史
4.在前12个月内需要住院的哮喘病史
5.通过中心研究实验室的筛选结果确定的G-6-PD缺乏症的证据
6.当前的内分泌疾病控制不佳，除了甲状腺疾病(例如甲状腺功能亢进/甲状腺功能减退等)外，其中任何经药物治疗的甲状腺疾病均不包括在内
7.慢性或复发性UTI的病史，或筛选前一个月内的UTI
8.HCC的病史
9.如果患者的恶性肿瘤在过去三年中已经完全通过化学疗法缓解并且没有另外的医学或外科手术干预，则允许恶性肿瘤病史
10.过去3年内持续乙醇滥用(＞40gm乙醇/天)或非法药物使用的历史。
11.SC注射剂不耐受的历史或显著的腹部瘢痕形成，其可能会阻碍研究干预的施用或局部耐受性的评估。
12.在治疗前的最后6周中接受输血或直到试验后的随访进行预期的输血。
13.在筛选前2个月内捐献或丧失>500mL血液，或在筛选前7天内捐献血浆。
14.在筛选的3个月内的抗病毒疗法(恩替卡韦或替诺福韦除外)或最近3年用干扰素治疗。
15.在抗凝剂、全身施用的皮质类固醇、全身施用的免疫调节剂或全身施用的免疫抑制剂的最后6个月内使用(或预期需要)。
16.在PI研究者或资助者看来，在施用研究干预之前14天内使用处方药会干扰研究行为。没有全身吸收的局部用药、他汀类药物(瑞舒伐他汀除外)、高血压药物，非处方药和处方止痛药或激素避孕药(女性)是可以接受的。
17.在施用研究干预之前的三个月内，积存(depot)注射或植入任何药物，可注射/可植入的避孕措施除外。
18.持续使用草药补充剂或全身非处方药；参与者必须愿意在研究持续期间停下来。
19.在给药前的三个月内已经接受了研究药物，或者在研究入组之前正在另一项临床研究的随访。
20.在筛选时肝弹性成像(即，
Figure BDA0002456233780000651
)kPa＞10.5。
21.在筛选时，仰卧休息10分钟后收缩压>150mmHg，舒张压>95mmHg。
22.在筛选时确认肝转氨酶(ALT或AST)＞7×ULN
23.持续或复发性高胆红素血症的病史，除非有已知的吉尔伯特氏病或杜宾-约翰逊综合症。
24.针对人免疫缺陷病毒(HIV)或丙型肝炎病毒(HCV)或丁型肝炎病毒(HDV)的抗体呈阳性。
25.Hgb<12g/dL(男性)或<11g/dL(女性)
26.筛选时血清白蛋白＜3.5g/dL。
27.筛选时WBC计数＜4,000细胞/μL或绝对嗜中性白细胞计数(ANC)＜1800细胞/μL。
28.筛选时血小板计数≤100,000/μL。
29.筛选时国际标准比率(INR)或凝血酶原时间(PT)高于正常参考范围(根据当地实验室参考范围)的上限。
30.血清BUN或肌酐>ULN
31.血清淀粉酶或脂肪酶＞1.25×ULN
32.血清HbA1c>7.0％
33.血清α甲胎蛋白(AFP)值＞100ng/mL。如果筛查时的AFP>ULN但<100ng/mL，如果肝影像学检查显示无可疑的潜在HCC病变，则患者符合条件。
34.研究者认为临床上显著且不能接受的任何其他安全实验室测试结果。
35.从进入临床研究中心之前的48小时直到研究结束，已经进行或计划进行运动水平的重大改变。
36.研究者认为，使参与者不适合入组或干扰研究的参与或完成的任何状况。
在没有本文未具体公开的任何一个或多个元素、一种或多种限定的情况下，可以适当地实践本文示例性地描述的本公开。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包括/包含(comprising)”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任何一个都可以用其他两个术语中的任一个代替。已经采用的术语和表达用作描述性术语，而不是限制性的，并且不旨在使用这样的术语和表达时排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，而是应当认识到，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过优选实施方式具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文公开的概念的可选特征、修改和变型，并且这样的修改和变型可以视为在由说明书和所附权利要求书限定的本发明的范围内。
在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)术语“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”和类似指代的使用应解释为涵盖单数和复数形式，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包含/包括(comprising)”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。除非本文另有说明，否则本文中数值范围的列举仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简写方法，并且每个单独值都被并入说明书中，如同其在本文中被单独列举一样。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，而不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示对于实施本发明必不可少的任何未要求保护的要素。
本文描述了本发明的实施方式，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。通过阅读前述说明，那些实施方式的变型对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。
发明人期望本领域技术人员适当地采用这样的变型，并且发明人希望以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求书中所述主题的所有修改和等同方案。而且，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元素在其所有可能的变化中的任何组合。仅通过常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施方式的许多等同方案。这样的等同方案旨在由所附权利要求书涵盖。

Claims (55)

1.一种用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含长度为19至30个核苷酸的反义链，其中所述反义链包含与ACAANAAUCCUCACAAUA(SEQID NO:1)所示的HBsAg mRNA的序列互补的区域。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其还包含长度为19至50个核苷酸的有义链，其中所述有义链与所述反义链形成双链体区。
3.根据权利要求2所述的寡核苷酸，其中所述有义链包含与UUNUUGUGAGGAUUN(SEQ IDNO:2)所示的序列互补的区域。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的寡核苷酸，其中所述有义链包含与5′-UUAUUGUGAGGAUUNUUGUC(SEQ ID NO:3)所示的序列互补的区域。
5.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其中所述反义链包含UUAUUGUGAGGAUUNUUGUCGG(SEQ ID NO:4)所示的序列。
6.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其中所述反义链由UUAUUGUGAGGAUUCUUGUCGG(SEQID NO:5)所示的序列组成。
7.根据权利要求3所述的寡核苷酸，其中所述反义链由UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQID NO:5.1)所示的序列组成。
8.根据权利要求2至6中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链包含ACAANAAUCCUCACAAUAA(SEQ ID NO:6)所示的序列。
9.根据权利要求2至8中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链包含GACAANAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:7)所示的序列。
10.根据权利要求2至8中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链由GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:8)所示的序列组成。
11.根据权利要求2至8中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链由GACAAGAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:8.1)所示的序列组成。
12.一种用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与反义链形成双链体区的有义链，其中所述有义链包含GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:8)所示的序列，其中所述反义链包含UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:5.1)所示的序列，
其中所述反义链和所述有义链各自包含一个或多个2'-氟和2'-O-甲基修饰的核苷酸和至少一个硫代磷酸酯键，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物，并且其中所述有义链与一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分缀合。
13.一种用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与反义链形成双链体区的有义链，其中：
所述有义链包含如下序列：如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:8)所示并且包含在第3、8-10、12、13和17位处的2'-氟修饰的核苷酸，在第1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36位处的2'-O-甲基修饰的核苷酸，以及至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述有义链与一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分缀合；和
所述反义链包含如下序列：如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:5.1)所示并且包含在第2、3、5、7、8、10、12、14、16和19位处的2'-氟修饰的核苷酸，在第1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22位处的2'-O-甲基修饰的核苷酸，以及至少三个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。
14.根据权利要求13所述的寡核苷酸，其中所述有义链包含在第1位与第2位核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的寡核苷酸，其中所述反义链包含在核苷酸1与2、2与3、3与4、20与21以及21与22之间的五个硫代磷酸酯键。
16.根据权利要求13至14中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链的所述5’-核苷酸具有以下结构：
Figure FDA0002456233770000031
17.根据权利要求13至14中任一项所述的寡核苷酸，其中所述有义链上的–GAAA–序列的一个或多个核苷酸与单价GalNac部分缀合。
18.根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中所述有义链上的所述–GAAA–序列的核苷酸各自与单价GalNac部分缀合。
19.根据权利要求18所述的寡核苷酸，其中–GAAA–基序包含以下结构：
Figure FDA0002456233770000041
其中：
L代表键、点击化学柄、或长度为1至20个包含的、连续的、共价键合的原子的接头，其选自取代和未取代的亚烷基、取代和未取代的亚烯基、取代和未取代的亚炔基、取代的和未取代的杂亚烷基、取代和未取代的杂亚烯基、取代和未取代的杂亚炔基及其组合；和
X是O、S或N。
20.根据权利要求19所述的寡核苷酸，其中L是乙缩醛接头。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的寡核苷酸，其中X是O。
22.根据权利要求16所述的寡核苷酸，其中–GAAA–序列包含以下结构：
Figure FDA0002456233770000051
23.根据权利要求2所述的寡核苷酸，其中所述有义链在其3'端包含S1-L-S2所示的茎环，其中S1是与S2互补，并且其中L在S1和S2之间形成长度为至多6个核苷酸的环。
24.根据权利要求23所述的寡核苷酸，其中L是四环。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的寡核苷酸，其中L在S1和S2之间形成长度为4个核苷酸的环。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的寡核苷酸，其中L包含GAAA所示的序列。
27.根据权利要求23至26所述的寡核苷酸，其中所述茎环的L的至多4个核苷酸各自与单独的GalNAc缀合。
28.根据权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸。
29.根据权利要求28所述的寡核苷酸，其中所述修饰的核苷酸包括2'-修饰。
30.根据权利要求29所述的寡核苷酸，其中所述2'-修饰是选自以下的修饰：2'-氨基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯糖核酸。
31.根据权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的所有核苷酸是修饰的核苷酸。
32.根据权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷酸间键。
33.根据权利要求32所述的寡核苷酸，其中所述至少一个修饰的核苷酸间键是硫代磷酸酯键。
34.根据权利要求1至10中任一项所述的寡核苷酸，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳包含磷酸酯类似物。
35.根据权利要求1至10所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一个核苷酸与靶向配体缀合。
36.根据权利要求35所述的寡核苷酸，其中所述靶向配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分。
37.一种组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸和抗衡离子。
38.一种组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸和药学上可接受的载体。
39.一种降低细胞中乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原的表达的方法，所述方法包括将权利要求1至36中任一项所述的寡核苷酸递送至所述细胞。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
41.根据权利要求30至40所述的方法，其中所述细胞是在体内。
42.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述细胞是在体外。
43.一种治疗受试者中乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1至36中任一项所述的寡核苷酸或权利要求37或权利要求38所述的组合物。
44.一种治疗受试者中HBV感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用选择性靶向HBsAg mRNA的RNAi寡核苷酸，其中所述RNAi寡核苷酸在没有用靶向编码非表面抗原的HBVmRNA转录物的RNAi寡核苷酸治疗的情况下施用。
45.一种治疗受试者中HBV感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用选择性靶向HBsAg mRNA的RNAi寡核苷酸，其中未向所述受试者施用选择性靶向HBxAg mRNA转录物的RNAi寡核苷酸。
46.根据权利要求39-45中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。
47.一种用于降低乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)mRNA的表达的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含与反义链形成双链体区的有义链，其中：
所述有义链包含如下序列：如GACAAAAAUCCUCACAAUAAGCAGCCGAAAGGCUGC(SEQ ID NO:8)所示并且包含在第3、8-10、12、13和17位处的2'-氟修饰的核苷酸，在第1、2、4-7、11、14-16、18-26和31-36位处的2'-O-甲基修饰的核苷酸，以及在第1位与第2位核苷酸之间的一个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述有义链上的–GAAA–序列的核苷酸各自与单价GalNac部分缀合，其中所述–GAAA–序列包含以下结构：
Figure FDA0002456233770000081
和
所述反义链包含如下序列：如UUAUUGUGAGGAUUUUUGUCGG(SEQ ID NO:5.1)所示并且包含在第2、3、5、7、8、10、12、14、16和19位处的2'-氟修饰的核苷酸，在第1、4、6、9、11、13、15、17、18和20-22位处的2'-O-甲基修饰的核苷酸，以及在核苷酸1与2、2与3、3与4、20与21以及21与22之间的五个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述反义链的5'-核苷酸的糖的4'-碳具有以下结构：
Figure FDA0002456233770000082
48.一种组合物，其包含权利要求47所述的寡核苷酸。
49.根据权利要求48所述的组合物，其还包含Na+抗衡离子。
50.一种降低细胞中乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原的表达的方法，所述方法包括将权利要求47所述的寡核苷酸或权利要求48或权利要求49所述的组合物递送至所述细胞。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。
52.根据权利要求50或权利要求51所述的方法，其中所述细胞是在体内。
53.根据权利要求50或权利要求51所述的方法，其中所述细胞是在体外。
54.一种治疗受试者中乙型肝炎病毒(HBV)感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求47所述的寡核苷酸或权利要求48或权利要求49所述的组合物。
55.根据权利要求50-54中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用有效量的恩替卡韦。
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