CN101351231A - 包含阿拉伯糖修饰的核苷酸的小干扰核糖核酸双螺旋 - Google Patents

Abstract

本发明提供含有至少一个抑制基因表达的阿拉伯糖修饰的核苷酸的小干扰核糖核酸双螺旋(siRNA)。在一个实施方案中，这些双螺旋含有核糖核苷酸，其中至少一个阿拉伯糖修饰的核苷酸是2′－脱氧－2′－氟阿拉伯糖核苷酸(FANA)。

Description

包含阿拉伯糖修饰的核苷酸的小干扰核糖核酸双螺旋

技术领域

本发明大体而言涉及含有至少一个阿拉伯糖修饰的核苷酸的小干扰RNA双螺旋(siRNA)，以及小干扰2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖核酸：RNA杂合体，用于下调基因表达。

背景技术

正在发展用以核酸为基础的分子(nucleic acid-based molecule)来使基因表达沉默的多种策略[Stephenson，M.L.& Zamecnik，P.C.Inhibition of Rous sarcoma viral RNA translation by a specificoligodeoxynucleotide(特异性寡脱氧核苷酸对Rous肉瘤病毒RNA翻译的抑制).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，4370-4373(1977)；Opalinska，J.B.& Gewirtz，A.M.Nucleic-acid therapeutics：basicprinciples and recent applications(核酸治疗：基本原理和最新应用).Nature Rev.1(July)，1-10(2002)]。在这些策略中，使用核酶、脱氧核酶以及反义寡核苷酸(诸如嵌合RNA-DNA(有缝聚合体(gapmer)))或硫代磷酸酯DNA的杂合驱动“反义”策略最受关注并且是很多综述的主题[Stull，R.A.& Szoka，F.C.Antigene，ribozyme andaptamer nucleic acid drugs：progress and prospects(抗原、核酶和适体核酸药物：发展与展望).Pharmaceutical Res.12，465-483(1995)；Uhlmann E.and Peyman，A.Antisense oligonucleotides：a newtherapeutic principle(反义寡核苷酸：一种新的治疗原理).Chem.Rev.90，544-584(1990)]。近来，转录后基因沉默或RNA干扰(RNAi)已逐渐成为这些更为经典方法的令人振奋的有潜力的替代方法[Elbashir，S.M，Lendeckel，W.& Tuschl，T.RNA interference ismediated by 21-and 22-nucleotide RNAs(RNA干扰由21-和22-核苷酸RNA介导).Genes Dev.15，188-200(2001)；Caplen，N.J.等人Specific inhibition of gene expression by small dsRNAs ininvertebrate and vertebrate systems(无脊椎动物和脊椎动物体系中小dsRNA对基因表达的特异性抑制).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，9742-9747(2001)；Nishikura，K.A short primer on RNAi：RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst(RNAi：RNA-指导的RNA聚合酶上的短引物用作关键催化剂).Cell 107，415-418(2001)；Tuschl，T.Expanding small RNA interference(扩大小RNA干扰).Nature Biotechnol. 20，446-448(2002)；Mittal，V.Improvingthe efficiency of RNA interference in mammals(提高哺乳动物中RNA干扰效率).Nature Rev.5，355-365(2004)；Nykanen A.，Haley，B.& Zamore，P.D.ATP requirements and small interfering RNAstructure in the RNA interference pathway(RNA干扰途径中的ATP需求和小干扰RNA结构).Cell 107，309-321(2001)]。有很多描述这种方法使酵母菌至哺乳动物的生物中基因沉默的效用的报导[Yu，J.Y.，S.L.DeRuiter和D.L.Turner，RNA interference by expression ofshort-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells(短-干扰RNA和发夹RNA在哺乳动物细胞中的表达导致的RNA干扰).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，6047(2002)；Donze，O.和D.Picard，RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized withT7 RNA polymerase(用T7聚合酶合成的siRNA在哺乳动物细胞中进行RNA干扰).Nucleic Acids Res.30，e46(2002)；Sui，G.，C.Soohoo，B.Affar el等人，A DNA vector-based RNAi technology to suppress geneexpression in mammalian cells(一种抑制哺乳动物细胞中基因表达的以DNA载体为基础的RNAi技术).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，5515(2002)；Paddison，P.J.，A.A.Caudy，E.Bernstein等人，Shorthairpin RNAs(shRNAs) induce sequence-specific silencing inmammalian cells(短发夹RNA(shRNA)诱导哺乳动物细胞中序列特异性沉默).Genes Dev.16，948(2002)]。

siRNA在体内的效用和其在药物疗法中的可能应用，像其它以寡核苷酸为基础的疗法一样，面对着某些关键障碍(例如，寡核苷酸的传递、细胞摄取以及生物稳定性)。需要发展能够得到临床上有用分子的化学修饰。已用未修饰的天然分子进行了反义和siRNA寡核苷酸的前期工作。然而，不久发现天然寡核苷酸经受相对快速的降解，主要是通过3’核酸外切酶的作用，但是也缘于核酸内切酶的攻击。实际上，相对于DNA，寡核糖核苷酸(RNA)通常更易受核酸酶降解。

现常规地修饰反义和siRNA分子以提高它们的稳定性以及它们与RNA杂合的强度，因为这些物理属性常常是它们的治疗应用所必需的[Mangos，M.M.& Damha，M.J.Flexible and frozensugar-modified nucleic acids-modulation of biological activitythrough furanose ring dynamics in the antisense strand(柔性和冻结的糖修饰的核酸-通过反义链中呋喃糖环动力学调节生物活性)，Curr.Top.Med.Chem.2，1145-1169(2002)；Agrawal，S.和Q.Zhao.Mixedbackbone oligonucleotides：improvement in oligonucleotide-inducedtoxicity in vivo(混合骨架寡核苷酸：寡核苷酸诱导的体内毒性的提高).Antisense Nucleic Acid Drug Dev.8，135(1998)；Crooke，S.T.Molecular mechanisms of action of antisense drugs(反义药物的分子作用机理).Biochim.Biophys.Acta 1489，31(1999)；Micklefield，J.Backbone modification of nucleic acids：synthesis，structure andtherapeutic applications(核酸的骨架修饰：合成、结构和治疗应用).Curr.Med.Chem.8，1157(2001)；Nielsen，P.E.，Antisense peptidenucleic acids(反义肽核酸).Curr.Opin.Mol.Ther.2，282(2000)；Braasch，D.A.，S.Jensen，Y.Liu等人，RNA interference inmammalian cells by chemically-modified RNA(通过化学修饰的RNA在哺乳动物细胞中产生RNA干扰).Biochemistry 42，7967(2003)]。在存在传递载体(delivery vehicle)的情况下，两种分子均能够跨越细胞膜，然后与它们预期的RNA靶杂合。RNA三级结构是支配反义寡核苷酸[Opalinska，J.B.，A.Kalota，L.K.Gifford等人，Oxetanemodified，conformationally constrained，antisenseoligodeoxyribonucleotides function efficiently as gene silencingmolecules(有效用作基因沉默分子的环氧丙烷修饰的、构象受束缚的、反义寡脱氧核糖核苷酸)[Nucleic Acids Res.32，5791(2004).Scherr，M.，J.J.Rossi，G.Sczakiel等人，RNA accessibility prediction：atheoretical approach is consistent with experimental studies in cellextracts(RNA可及性预测：与细胞提取物中试验研究一致的理论方法).Nucleic Acids Res.28，2455(2000).Sokol，D.L.，X.Zhang，P.Lu等人，Real time detection of DNA.RNA hybridization in livingcells(活细胞中DNA.RNA杂交的实时检测).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，11538(1998)]和siRNA[Opalinska，J.B.，A.Kalota，L.K.Gifford等人Oxetane modified，conformationally constrained，antisense oligodeoxyribonucleotides function efficiently as genesilencing molecules(有效用作基因沉默分子的环氧丙烷修饰的、构象受束缚的、反义寡脱氧核糖核苷酸).Nucleic Acids Res.32，5791(2004)；Scherr，M.，J.J.Rossi，G.Sczakiel等人，RNA accessibilityprediction：a theoretical approach is consistent with experimentalstudies in cell extracts(RNA可及性预测：与细胞提取物中试验研究一致的理论方法).Nucleic Acids Res.28，2455(2000)；Sokol，D.L.，X.Zhang，P.Lu等人，Real time detection of DNA.RNA hybridization inliving cells(活细胞中DNA.RNA杂交的实时检测).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，11538(1998)]与它们的靶杂合的能力的重要因素。不言而喻，对于任一类型分子施加非序列特异性结合是不合需要的。符合所有这些要求将是一个苛求的任务。

已将未经修饰的siRNA双螺旋成功地用于基因沉默，然而，一个链或两个链的化学修饰可能是治疗应用必需的，以改进生物稳定性和药代动力学性质。已测试了很多种化学修饰对siRNA活性的影响，但尚不清楚这些修饰中的哪些修饰是最有利的。在设计新的类似物中，重要的是认识到siRNA的两个关键特点不同于传统反义方法：(i)识别双螺旋RNA且(ii)基因抑制涉及RISC(RNA-诱导的沉默复合体)-而不是RNase H-来促进mRNA靶的识别和裂解[Elbashir，S.M，Lendeckel，W.& Tuschl，T.RNA interference is mediated by 21-and22-nucleotide RNAs(RNA干扰由21-和22-核苷酸RNA介导).GenesDev.15，188-200(2001)；Caplen，N.J.等人，Specific inhibition of geneexpression by small dsRNAs in invertebrate and vertebratesystems(无脊椎动物和脊椎动物体系中小dsRNA对基因表达的特异性抑制).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，9742-9747(2001)；Nishikura，K.A short primer on RNAi：RNA-directed RNA polymerase acts as akey catalyst(RNAi：RNA-指导的RNA聚合酶上的短引物用作关键催化剂).Cell 107，415-418(2001)；Tuschl，T.Expanding small RNAinterference(扩大小RNA干扰).Nature Biotechnol.20，446-448(2002)；Mittal，V.Improving the efficiency of RNA interference inmammals(提高哺乳动物中RNA干扰效率).Nature Rev.5，355-365(2004)]。同样，RNA样寡核苷酸是用于引入糖或骨架修饰而不扰动它们活性所需的总A形式螺旋结构的最初(prime)候选物。一种比较有前景的修饰是锁核酸(LNA)，其中用并不显著地损害siRNA活性(例如，改进的热稳定性和生物稳定性，以及减小的脱靶效应)的相对少数的几个修饰来实现关键益处[Elmen，J.等人，Locked nucleic acid(LNA)mediated improvements in siRNA stability andfunctionality(锁核酸(LNA)介导的siRNA稳定性和功能的提高).Nucl.Acids Res.33，439-447(2005)]。然而，发现这些化合物的活性和特异性在很大程度上取决于LNA修饰的位点和程度。在反义链的5′-端的单LNA取代消除活性。此外，当修饰反义链时显著地削弱了活性，而有义链LNA修饰仅耐受略微修饰的寡核苷酸，显示了与未经修饰的siRNA相比相等或更低的活性。随着修饰程度增加，出现了对于其它化学性质(包括毒性(硫代磷酸酯-RNA))的限制且削弱了活性(2′F-RNA，硼烷磷酸酯-RNA)[Amarzguioui，M.等人，Tolerance formutations and chemical modifications in a siRNA(siRNA中突变和化学修饰的耐受性)，Nucl.Acids.Res.31，589-595(2003)]。虽然这在原则上可以被某些寡核苷酸化学性质所给予的核酸酶稳定性/和/或特异性补偿，但对有效siRNA化学性质的预测仍是后续研究的活跃焦点。

仍存在对化学修饰siRNA的需要，其要具有核酸酶稳定性和/或抑制基因表达的能力。

发明概要

根据本发明的一个广泛方面，本发明提供一种用于以序列特异性方式来调节靶基因表达的包括双链双螺旋的小干扰RNA(siRNA)，其中siRNA的至少一个核糖核酸核苷酸被阿拉伯糖修饰的核苷酸取代。阿拉伯糖修饰的核苷酸为2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖核苷酸(FANA)。

优选地，siRNA的长度为15至30个核苷酸且具有在3’末端和与5’末端突出的1至3个核苷酸突出端。

在具体实施方案中，双螺旋可在有义链或反义链的任何位置具有任何数目的阿拉伯糖核苷酸，例如：

5’-ARARARARARARARARARARA-3’

5’-AARRAARRAARRAARRAARRA-3’

5’-AARRRRRRRRRRRRRRRRRRR-3’

5’-RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRAA-3’等

其中A是阿拉伯糖核苷酸(arabinonucleotide)且R是核糖核苷酸。

在本发明的其它实施方案中，有义链完全被阿拉伯糖核苷酸取代，举例说来：

5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’

且有义链是全RNA链或部分取代的RNA链，例如：

5’-RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRR-3’

5’-RRRRRRRRRRRRRRRRRRRRRAA-3’

5’-AARRRRRRRRRRRRRRRRRRR-3’等。

在本发明的其它实施方案中，阿拉伯糖核苷酸包含选自下列的2’取代基：氟、羟基、氨基、叠氮基、烷基、烷氧基以及烷氧基烷基。在本发明的另一实施方案中，烷基选自：甲基、乙基、丙基、丁基以及官能化烷基(诸如乙氨基、丙氨基和丁氨基)。在实施方案中，烷氧基选自：甲氧基、乙氧基、丙氧基和官能化烷氧基(诸如-O(CH₂)_q-R，其中q＝2-4且-R为-NH₂、-OCH₃或-OCH₂CH₃)。在实施方案中，烷氧基烷基选自甲氧基乙基和乙氧基乙基。在实施方案中，2’取代基是氟且阿拉伯糖核苷酸是2’-氟阿拉伯糖核苷酸(FANA)。优选地，FANA核苷酸是araF-G、araF-T、araF-U、araF-A、araF-5-甲基-C。

根据本发明的某些实施方案，siRNA用于减少荧光素酶表达、CCR3表达或PDE4D表达中任一者。

根据本发明的另一实施方案，siRNA用于减少呼吸道合胞病毒复制。

在本发明的其它实施方案中，双螺旋包含一种或多种选自下列的核苷酸间键(internucleotide linkage)：

a)磷酸二酯；

b)磷酸三酯；

c)硫代磷酸酯；

d)膦酸甲酯；

e)硼烷磷酸酯(boranophosphate)，以及

f)(a)至(e)的任何组合。

根据本发明的另一广泛方面，提供一种用于增强siRNA的核酸酶稳定性和靶基因活性的调节中的至少一个的方法，包含用阿拉伯糖修饰的核苷酸(优选地为2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖核苷酸(FANA))来置换siRNA的至少一个核苷酸。

根据本发明的另一广泛方面，提供一种药用组合物，其包含本发明的siRNA以及药学上可接受的载体。

根据本发明的另一广泛方面，提供本发明的siRNA用于制备调节靶基因(优选地为CCR3和PDE4D中的一个)表达的药物中的用途。

根据本发明的另一实施方案，提供本发明的siRNA用于制备减少呼吸道合胞病毒复制的药物中的用途。

根据本发明的另一广泛方面，提供一种调节需要该调节的患者中基因表达的方法。该方法包含给予该患者治疗上有效量的本发明的药用组合物。优选地，该药用组合物包含siRNA用于减少CCR3的表达、减少PDE4D的表达以及减少呼吸道合胞病毒复制中的任一个。

根据本发明的另一广泛方面，提供一种商业包装。该商业包装包含本发明的药用组合物以及关于其用于调节基因表达的用途的说明书。优选地，药用组合物包含siRNA用于减少CCR3表达，减少PDE4D表达以及减少呼吸道合胞病毒复制中的任一个。

附图简述

现将参看附图来更详细地描述本发明，在附图中：

图1说明不同siRNA抑制海拉X1/5细胞中荧光素酶的功效。用0.21μg仅在有义链(A)中有修饰的siRNA、仅在反义链(B)中有修饰的siRNA或在反义链和有义链(C)中均有修饰的siRNA对细胞进行转染。在转染后24小时测量荧光素酶活性水平并且被标准化(normalize)为代谢活性。然后与被设置为100％的对照siRNA相比较，将标准化的荧光素酶活性确定为荧光荧光素酶活性的百分数。数据表示平均标准化荧光素酶活性+/-SEM。通过在转染后24小时进行实时PCR分析(相对于看家基因GAPDH的表达)来量化荧光素酶mRNA水平。条(bar)显示出平均荧光素酶/GAPDH比率+/-SEM。

图2显示出含有FANA的siRNA抑制荧光素酶活性的效力。通过用不同量的活性siRNA转染细胞24小时获得每个siRNA的剂量反应。在(A)中显示出在仅有义链中有修饰的siRNA的剂量反应，在(B)中显示出仅在反义链中有修饰的siRNA的剂量反应，在(C)中显示出在有义链和反义链中均有修饰的siRNA的剂量反应。测量荧光素酶活性并且将值标准化为代谢活性，并且与设置为100％的对照siRNA相比较。数据表示平均标准化荧光素酶活性+/-SEM。

图3说明靶向海拉X1/5细胞中荧光素酶mRNA的不同siRNA随着时间的功效。用0.21μg的siRNA来转染细胞。在转染后4小时、8小时、24小时、48小时、72小时和96小时测量荧光素酶活性。数据表示与被设置为100％的对照siRNA相比较的平均标准化荧光素酶活性+/-SEM。

图4说明含有FANA的siRNA的血清稳定性。在37℃在10％胎牛血清中孵育不同的siRNA并且在所表示的时间点取等分试样。siRNA通过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离并且用SYBR金显现。条带通过密度测定法进行量化并且起始量的完整siRNA的百分比被设置为100％。A)显示靶向荧光素酶的siRNA的血清稳定性。“ds”表示双链siRNA标记且“ss”表示单链标记。B)曲线图表示靶向荧光素酶的不同siRNA的血清稳定性。C)曲线图表示靶向CCR3的不同siRNA的血清稳定性。D)曲线图表示靶向PDE4D的不同siRNA的血清稳定性。数据表示两个或三个独立实验的平均值±SEM。

图5说明含有FANA的siRNA抑制NIH-3T3细胞中大鼠CCR3表达的功效。靶向大鼠CCR3的逐渐增加量的siRNA与NIH-3T3细胞中表达大鼠CCR3基因的质粒共转染。使用基因定量(Panomics)方法在转染后24小时测量CCR3 mRNA表达水平并且将其标准化为参考基因(荧光素酶)的表达水平。与被设置为100％的对照siRNA相比较，将siRNA的活性确定为抑制百分比。数据表示平均+/-SEM(n＝6)。

图6说明靶向RSV病毒P-蛋白质的含有FANA的siRNA对于A549细胞中RSV产生的功效。培养A549细胞并且在24孔板中以每孔0.1x10⁵个细胞接种并且在37℃，5％CO₂下培养过夜。次日，使用Lipofectamine2000转染试剂用0.05ug、0.2ug或0.4ug的siRSV-P2(抵抗RSV病毒P-蛋白质的siRNA)、siRSV-P2-Mi(抵抗RSV病毒P-蛋白质的siRNA错配)、siRSV-P2-O/F4以及阴性对照siRNA-P2-Mi-O/F4以1∶3的siRNA：Lipofectamine 2000比率对细胞培养进行转染。每个转染实验均以一式三份进行。在转染后一天，用hRSV在M.O.I＝1对细胞进行感染且在37℃，5％CO₂下孵育过夜。在感染后24小时收获上清液且通过RSV蛋白质量化用ELISA(酶联免疫吸附试验)来评估病毒水平。数据表示为相对于它们相应错配siRNA的RSV抑制水平的siRNA的％RSV抑制。

发明详述

本发明涉及修饰的寡核苷酸双螺旋，其被设计成靶向mRNA并经由RNAi机制来促进mRNA降解。特定而言，显示出了使用含有修饰的阿拉伯糖核苷酸(FANA)的短干扰RNA双螺旋来选择性地抑制荧光素酶活性、大鼠CCR3表达以及RSV病毒复制。本文所述的RNAi方法与上文所述的常用方法大不相同，其专注于来源于天然单元(即，DNA、RNA、2’-OMe-RNA、2’F-RNA核苷酸)的修饰的核苷酸的使用[Allerson，C.R.等人，Fully 2’-modified oligonucleotideduplexes with improved in vitro potency and stability compared tounmodified small interfering RNA(体外效力和稳定性比未修饰小干扰RNA有所提高的完全2’-修饰的寡核苷酸双螺旋).J.Med.Chem.48，901-904(2005)]。

本发明涵盖一系列抑制人细胞系中的基因表达的糖修饰双螺旋的表征。这些小干扰双螺旋含有阿拉伯糖修饰的核苷酸，其赋予双螺旋改进的特征，诸如抵抗体液中所存在的核酸酶的改进的稳定性。优选地，糖修饰的核苷酸为2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖核苷酸(FANA)。用于产生FANA修饰双螺旋的方法需要用FANA残基来取代RNA核苷酸。

使用被设计成过度表达荧光素酶的修饰海拉细胞系来评价修饰siRNA的活性。分别使用实时PCR与荧光素酶测定技术来确定荧光素酶mRNA表达水平和荧光素酶活性水平。根据Mittal等人[Mittal，V.Improving the efficiency of RNA interference in mammals(提高哺乳动物中RNA干扰的有效性).Nature Rev.5，355-365(2004)]用Ambion和Qiagen算法(Ambion and Qiagen algorithm)和NCBI同源检索来执行实际siRNA碱基序列的设计和选择。如上文所述来选择并测试至少三个候选siRNA双螺旋。一旦鉴别出活性最高siRNA双螺旋(EC₅₀～0.5 nM)，就进行预备实验来评估阿拉伯糖修饰对于siRNA活性的影响。表明了这种FANA修饰的双螺旋对于荧光素酶活性的选择性、特异性和有效抑制(图1)。用FANA链来完全置换siRNA双螺旋的一个RNA链(有义链)将产生FANA:RNA杂合体，FANA:RNA杂合体也提供对mRNA靶的选择性、特异性和有效下调(图1A)。

本文所公开的化合物表示FANA修饰的双螺旋的第一实施例(FANA修饰siRNA和FANA:RNA杂合体)能够经由RNAi机制来选择性地抑制基因表达。

具体说来，本发明提供FANA核苷酸，其与siRNA双螺旋的活性相容。此外，显示出整个FANA有义链可结合到互补未修饰的RNA反义链产生一种双螺旋，这种双螺旋进入RNAi路径以选择性地且有效地靶向mRNA并且促进其降解(图1A和图2A)。这些修饰的双螺旋通过合成组成链(constituent strand)(经由固相化学方法)获得并且然后使它们退火(anneal)以形成双螺旋。出人意料地，在涉及有义链的部分修饰或完全修饰的所有情况下，基因沉默活性类似于所观察到未修饰的自然siRNA双螺旋的情形(图1A和图2B)。用FANA修饰双螺旋进行处理导致荧光素酶活性以浓度依赖性的方式减小，且估计EC₅₀在0.06到3.6 nM的范围。所观察到的有义修饰的双螺旋的效力与自然siRNA的效力相当(图2A至图2C)，自然siRNA在这个系统中具有0.20 nM的估计EC₅₀(表1)。

本发明还提供RNA双螺旋，其中将未修饰的有义链退火至反义链上，在反义链中用FANA置换悬空的dN末端残基(3’或5’-末端)而不会影响活性(图1B和图2B)。令人意外地，用FANA残基来取代两个3’-脱氧核苷酸赋予比未经修饰的siRNA更强的增强的效力(图1B和图2B)，与具有LNA修饰的siRNA形成鲜明对比，在LNA修饰的siRNA中相应变化导致活性的显著减小或完全丧失[Elmen，J.等人，Locked nucleic acid(LNA)mediated improvements in siRNAstability and functionality(锁核酸(LNA)介导的siRNA稳定性和功能的提高).Nucl.Acids Res.33，439-447(2005)]。

本发明还提供RNA双螺旋，其中有义链和反义链均含有修饰残基，同时仍维持RNAi活性(图1C)。关于在两个链中的一个链上含有FANA的RNA双螺旋，这些双螺旋显示出与未经修饰的siRNA的效力相比相等或更强的特异性靶降解效力(图2C)。

类似于未经修饰的siRNA，当将阿拉伯糖修饰双螺旋转染至细胞内时观察到直至转染后4天的荧光素酶活性的持续抑制(图3)。然而，在这个时间点，发现修饰的siRNA具有比未经修饰的siRNA更强的抑制活性。

在本文中展示了含有FANA的siRNA双螺旋的核酸酶稳定性得到改进强于未经修饰的siRNA双螺旋的证据(图4)。未经修饰的siRNA在15分钟内完全降解，而含有完全修饰的有义链和3’-端突出端修饰的反义链的siRNA双螺旋在5小时后仍能过容易地被检测到。因此，2’-脱氧-2’-氟-β-D-阿拉伯糖-(寡核苷酸)(单独地或与核糖核苷酸(RNA)单元组合地)能够与互补(反义)RNA链杂合以产生具有改进效力和增强核酸酶抗性的siRNA双螺旋。在构思这些化合物的体内给药方面，这些性质是非常需要的。

“治疗上有效量”是指在剂量上有效且持续必需的时期以实现所要治疗结果的量。本发明的修饰核酸的治疗上有效量可根据以下因素而有所变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别以及体重，和修饰核酸在个体中引发所需反应的能力。可以调整剂量方案来提供最佳治疗反应。治疗上有效量也是化合物的治疗上有益影响胜过化合物的毒性或有害影响的量。对于任何特定受试者，可根据个体需要或者管理或监督组合物给药的人的职业判断来随着时间调整具体剂量方案。

如本文所使用的“药学上可接受的载体”或“赋形剂”包括随便哪种溶剂、分散介质、包衣、抗菌和杀真菌剂、等渗以及吸收延迟剂和在生理上相容的类似物。在一个实施方案中，载体适于胃肠外给药。或者，载体可适于静脉内给药、腹膜内给药、肌肉内给药、舌下给药或口服给药。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于无菌可注射溶液或分散液的临时制备的无菌粉末。将这些介质和试剂用于药学上有活性的物质是本领域中已知的。除了与该活性化合物不相容的任何常规介质或试剂外，构想到它们在本发明的药用组合物中的使用。补充活性化合物也可合并到组合物内。

治疗组合物在生产和贮存条件下通常必须无菌且稳定。组合物可配制为溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其它有序结构。载体可为含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙烯等)的溶剂或分散介质和其适当混合物。可使用诸如卵磷脂的包衣、通过维持所需颗粒大小(在分散液的情况下)和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选地在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇(诸如甘露醇、山梨糖醇)或氯化钠。可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如，一酯硬酸盐和凝胶)来实现可注射组合物的延长吸收。此外，本发明的寡核苷酸双螺旋可能以缓释制剂(time release formulation)给药，例如，以包括缓释聚合物的组合物形式。可用防止修饰的寡核苷酸双螺旋快速释放的载体来制备修饰的寡核苷酸，诸如控释制剂，包括植入物和微囊化传递系统。可使用可生物降解的生物相容聚合物，诸如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原质、聚原酸酯、聚乳酸以及聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。用于制备这样的制剂的许多方法已被申请专利且是本领域技术人员通常已知的。

可根据需要，通过将所需量的活性化合物(诸如本发明的寡核苷酸双螺旋)与上文所列举的成份中的一种成份或它们的组合加入到适当溶剂中，之后进行过滤杀菌而得到无菌可注射的溶液。一般而言，通过将活性化合物加入到无菌媒剂内来制备分散液，该无菌媒剂含有基础分散介质和所需要的上文所列出的那些成份中的其它成份。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从其先前无菌过滤的溶液得到活性成份加上任何附加所要成份的粉末。根据本发明的替代方面，可使用提高本发明的寡核苷酸双螺旋的溶解度的一或多种附加化合物来配制本发明的寡核苷酸双螺旋。

尽管在本文中公开了本发明的各种实施方案，但根据本领域技术人员的公知常识可在本发明的范畴内进行许多调整和修改。这些修改包括用已知等效物来代替本发明的任一方面以便以实质上相同的方式实现相同的效果。数字范围包括限定范围的数字。在权利要求书中，用词“包括(包含)”是开放式术语，实质上相当于短语“包括，但不限于”。

下面的实施例说明本发明的各种方面并且并不限制本文所公开的本发明的广泛方面。

实施例1：对于siRNA双螺旋和阿拉伯糖修饰的双螺旋的化学分析

在表1中显示出在这个研究中所制备的低聚物的序列和组成。根据已公布的协议[E.Viazovkina、M.M.Mangos、M.I.Elzagheid和M.J.Damha(2002)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry，Unit 4.15)；M.J.Damha和K.K.Ogilvie(1993)Oligoribonucleotidesynthesis-the silyl-phosphoramidite method in“Protocols forOligonucleotide and Analogs：Synthesis and Properties(“寡核苷酸和类似物的方案：合成和肽”中寡核苷酸合成-甲硅烷基-亚磷酰胺法)”S.Agrawal(ed.)，Methods in Molecular Biology pp.81-114，TheHumana Press Inc.，Totowa，New Jersey]使用标准β-氰乙基亚磷酰胺化学法在应用生物系统(ABI)合成仪上以1μmol的量(scale)合成寡核糖核苷酸、FANA修饰的寡核糖核苷酸以及全FANA寡核苷酸。将FANA修饰的寡核糖核苷酸和寡核糖核苷酸同样地去保护，纯化以及处理。所有寡核苷酸通过阴离子交换HPLC或凝胶电泳而纯化，且使用葡聚糖凝胶G-25珠粒经由尺寸排阻色谱法进行脱盐。通过混合有义链与相应反义链(1∶1化学剂量比率)，冻干样品以及添加足量的再悬浮/退火缓冲液(annealing buffer)制成20μM溶液来制备双螺旋的原液。siRNA再悬浮/退火缓冲液的组成是100 mM乙酸钾、30 mMHEPES-KOH、2 mM乙酸镁，pH 7.4。

实施例2：含有FANA的siRNA的功效

这个实施例涉及含有FANA的siRNA相对于靶mRNA的特异性敲减(specific knockdown)和海拉X1/5细胞中荧光素酶活性的降低。从ECACC(ECACC号95051229)获得海拉X1/5细胞系并且维持在补充有(Invitrogen，Burlington ON)10％胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％维生素、500μg/ml G418和300μg/ml潮霉素的EMEM培养基中。为进行转染，在转染前24小时，向24孔板上每孔接种(plate)1.0X10⁵个细胞。在转染的那天，根据生产商建议，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Burlington ON)，用0.21μg的siRNA以1∶2的siRNA：Lipofectamine 2000比率来转染细胞。在转染后24小时收获细胞。按照生产商建议，使用alamar Blue^TM荧光测定(Medicorp，Montreal QC)来评估细胞代谢活性，作为siRNA转染所造成的细胞毒性的指标。

根据生产商建议方案使用荧光酶素测定系统(BD Bioscience，Mississauga，ON)来执行荧光素酶活性测定。简言之，在暴露于siRNA后，用磷酸盐缓冲盐水(Invitrogen，Burlington ON)洗涤细胞并将细胞溶解。将细胞溶解产物进行离心分离以移除细胞碎片并将20μl等分试样转移到96孔lumitrac板(Ultident；Greiner Bio-one)。使用微孔板光度计(Luminoskan Ascent，Thermo LabSystem)来测量发光，紧接着添加荧光素底物溶液。然后将发光值标准化为细胞代谢活性值(alamarBlue^TM)来补偿转染所造成的毒性。

关于实时PCR分析，根据生产商建议方案使用RNeasy微型试剂盒(mini kit)(Qiagen，Mississauga ON)来提取总RNA。使用SuperScript^TM II逆转录酶和随机引物(Invitrogen，Burlington ON)来从1μg的总RNA制备cDNA。使用先前的优化条件和LightCycler(Roche，Laval QC)使用基因特异性引物和探针来执行荧光素酶基因(LUC5013F1：5’-acgctgggcgttaatcagag-3’；LUC5013 R1：5’-gtcgaagatgttggggtgttg-3’；TIB MOLBIOL)和看家基因GAPDH(huGAPD代表：5’-ggtggtctcctctgacttc-3’；huGAPD rev：5’-ctcttcctcttgtgctcttg-3’；TIB MOLBIOL)的定量实时PCR。

图1所展示的结果表明FANA当合并到siRNA内时耐受良好。实际上，与未经修饰的siRNA相比(图1A)，具有全FANA修饰的有义链(F3/O)的siRNA保留其活性(mRNA和荧光素酶活性)。我们的数据也表显示出FANA修饰当被引入到反义链内时耐受良好(图1B)。与未经修饰的siRNA双螺旋(55％)相比，用两个FANA残基(O/F4和F3/F4)置换两个3’-突出端脱氧核苷酸导致双螺旋的增强的抑制活性(65％)(图1B和1C)。这些结果与所公布的数据大不相同，其中显示，化学修饰基于修饰类型仅在一端耐受良好。然而，引入六个FANA，总地包括反义链的5’端部和中部，消除了siRNA双螺旋的活性，与被引入到有义链上的修饰无关(图1B和图1C)。已知siRNA的反义链的中间部分对于双螺旋与RNAi细胞机理的相互作用而言是重要的且对化学修饰非常敏感。因此，优选地，在有义链和反义链上的修饰均在上文所述的参数内(图1C)。

实施例3：含有FANA的siRNA的效力

这个实施例涉及含有FANA的siRNA相对于海拉X1/5细胞中荧光素酶活性的特异性敲减的效力。使用总量为0.21μg的siRNA进行剂量反应研究，由此用对照siRNA连续稀释有效siRNA，减少活性寡核苷酸的有效量同时保持siRNA的最终量恒定。在转染后24小时收获细胞并确定荧光素酶活性。

结果表明反义链的3’-突出端的脱氧核苷酸被FANA置换且有义链未被修饰(O/F4)或完全被修饰的siRNA以浓度依赖性的方式抑制荧光素酶活性，其具有比相对应的未经修饰的siRNA更强的增强的效力(图2B和2C)。在表1中展显示出估计EC50值。

实施例4：含有FANA的siRNA的作用持续时间

这个实施例显示出含有FANA的siRNA具有长达96个小时的持续抑制活性。在向不同修饰的siRNA和未经修饰的siRNA暴露后在不同的时间点测量荧光素酶活性(图3)。结果表明含有FANA残基的siRNA具有长达4天的延长的活性。此外，数据表明与未经修饰的siRNA相比，含有FANA的siRNA在96小时的时间点具有增强的抑制活性(分别为65％与45％的荧光素酶活性抑制)。

实施例5：含有FANA的siRNA的增强的稳定性

这个实施例涉及在胎牛血清存在下siRNA双螺旋稳定性。在图4中展示实验结果。在DMEM中在10％胎牛血清中稀释siRNA并且在37℃孵育。在0.25小时、0.5小时、0.45小时、1小时、2小时、6小时和24小时后收集12μl等分试样并且在36μl含有50％Ficoll的1.5X TBE装样缓冲液(loading buffer)中冷冻备分析用。在非变性条件下在20％聚丙烯酰胺凝胶上分离样品并且用SYBR金(Invitrogen，Burlington ON)进行染色。通过密度测定分析来量化对应于完整siRNA的条带。

结果显示出在有义链中掺入FANA赋予对血清介导的siRNA降解的显著抗性。引入FANA显著地提高了siRNA的血清抗性。代表凝胶在图4A中显示出。与序列无关，siRNA(O/O)的所有未修饰形式具有短于15分钟的半衰期(图4B、4C和4D)。用两个FANA(O/F4)取代在反义链中的两个3’-突出端脱氧核苷酸对于siRNA双螺旋的血清稳定性没有影响(图4B、4C和4D)。然而，由于观察到siRNA双螺旋半衰期高达4个小时，具有全FANA修饰的有义链(F3/O)赋予对抗血清介导降解的显著抗性(图4B)。最后，由于确定大约5h的siRNA半衰期，对有义链和反义链(F3/F4)都进行FANA修饰导致甚至更强对核酸酶的抗性(图4B和图4C)。

实施例6：含有FANA的siRNA抑制CCR3 mRNA表达水平的功效

这个实施例涉及含有FANA的siRNA对NIH-3T3细胞中CCR3mRNA表达水平特异性敲减的功效。从ATCC(ATCC CRL-1658)获得NIH-3T3细胞系并且维持在补充有10％小牛血清、4 mM L-谷氨酰胺、3.7g/L碳酸氢钠、4.5g/l葡萄糖以及1％青霉素/链霉素的DMEN培养基(Invitrogen，Burlington ON)中。在转染前一天，向24孔板上每孔接种1.0X10⁵个细胞。根据生产商建议，使用Lipofectamine2000(Invitrogen，Burlington ON)用0.2μg表达大鼠CCR3基因的质粒、0.2μg表达荧光素酶(参考基因)的质粒以及0.01、0.1或0.2μg的siRNA以1∶2的DNA/siRNA：Lipofectamine 2000比率转染细胞。在转染后24h收获细胞。使用基因定量方法(Panomics，Fremont CA)来量化CCR3和荧光素酶的表达水平。然后将CCR3表达水平标准化为对于荧光素酶所测量的水平。

图5展示的结果表明将FANA残基掺入到siRNA内导致靶向大鼠CCR3 mRNA的siRNA的抑制活性的剂量依赖性增强。实际上，用两个FANAs(O/F4)取代反义链中的两个3’-突出端脱氧核苷酸导致双螺旋增强的抑制活性(当与未经修饰的CCR3 siRNA(35％)相比较时高达49％)(图5)。此外，与未经修饰的siRNA比较，具有全FANA修饰有义链(F3/O)的CCR3 siRNA的活性更高(对CCR3 mRNA水平75％的抑制)(图5)。最后，对siRNA双螺旋的两个链进行的修饰良好地耐受，抑制活性达到75％。这些数据支持以下观察：FANA：1)当引入到siRNA双螺旋中时耐受良好，以及2)提高siRNA双螺旋的抑制活性。

实施例7：含有FANA的siRNA抑制病毒复制的增强功效

这个实施例涉及含有FANA残基的siRNA双螺旋抑制A549细胞中呼吸道合胞病毒(RSV)复制的功效。A549细胞系(ATCC，#CCL-185)维持在补充有10％未灭活FBS(HyClone)的Ham F12培养基(HyClone，Logan UT)中。在转染前一天，向24孔板的各孔内接种1.0X10⁵个细胞。在转染的那天，根据生产商建议方案用0.05μg、0.2μg或0.4μg的siRNA以1∶3的siRNA与转染试剂(Lipofectamine 2000(Invitrogen，Burlington ON))的比率来转染细胞。在转染后24小时，用RSV以1的感染复数(M.O.I.)来感染细胞并且允许病毒感染进行一天。在向病毒暴露后24小时后，收获细胞上清液并且使用ELISA方法评估RSV水平以检测RSV蛋白质。

结果表明siRNA双螺旋(其中反义链的3’突出端的两个脱氧核苷酸被FANA取代并且有义链保持未修饰(O/F4))以浓度依赖性的方式抑制RSV复制，与在较低剂量未经修饰的siRNA相比，其具有增强的抑制活性(图6)。这些结果支持以下观察：FANA增强siRNA的抑制活性。

所引用的所有参考文献以引用的方式结合到本文中。虽然已在本文中描述了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员应了解在不偏离本发明的精神或所附权利要求书的范畴的情况下可以做出各种变化。

表1：寡核苷酸和在这个研究中所合成的双螺旋

^a上标字母＝RNA；下标字母＝DNA；粗上标字母＝FANA

例如，O/O表示未经修饰的siRNA，而O/F1表示具有未修饰的有义链和在反义链中的F1修饰的siRNA。n.d.＝不确定。

<110>Topigen Pharmaceuticals Inc.

<120>包含阿拉伯糖修饰的核苷酸的小干扰核糖核酸双螺旋

<130>13424-14PCT

<150>US 60/730,876

<151>2005-10-28

<150>US 60/741,544

<151>2005-12-02

<160>50

<170>PatentIn version 3.3

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gcnngaaguc nnuaannaan n     21

<210>22

<211>21

<212>RNA

<213>人工

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<223>合成寡核苷酸

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<222>(1)..(2)

<223>n残基是2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶

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<222>(5)..(6)

<223>n残基是2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶

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<222>(13)..(14)

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<222>(20)..(21)

<223>n残基为2’-脱氧鸟苷

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nnaannaaag acnncaagcn n    21

<210>23

<211>21

<212>RNA

<213>人工

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<220>

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<222>(3)..(4)

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<220>

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<222>(11)..(12)

<223>n残基是2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶

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<222>(16)..(17)

<223>n残基是2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶

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<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n残基是2’-脱氧胸腺嘧啶

<400>23

gcnngaaguc nnuaannaan n    21

<210>24

<211>21

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n残基是2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖鸟苷

<400>24

uuaauuaaag acuucaagcnn     21

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<211>21

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<222>(1)..(21)

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gcttgaagtc tttaattaag g    21

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<211>21

<212>RNA

<213>人工

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<222>(20)..(20)

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<222>(21)..(21)

<223>n残基是2’-脱氧鸟苷

<400>26

uuaauuaaag acuucaagcn n    21

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<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

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<221>修饰碱基

<222>(1)..(21)

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<400>27

gcttgaagtc tttaattaag g    21

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<212>DNA

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<222>(1)..(2)

<223>n残基是2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶

<220>

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<222>(5)..(6)

<223>n残基是2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶

<220>

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<222>(13)..(14)

<223>n残基是2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶

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<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n残基为2’-脱氧鸟苷

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nnaannaaag acnncaagcn n    21

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gcttgaagtc tttaattaag g    21

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<222>(20)..(21)

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uuaauuaaag acuucaagcn n    21

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<212>RNA

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<222>(20)..(21)

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acacccuaug aauaugagun n    21

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<222>(20)..(21)

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acucauauuc auagggugun n    21

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<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n残基是2’-脱氧胸腺嘧啶

<400>33

acacccuaug aauaugagun n    21

<210>34

<211>21

<212>RNA

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<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n残基是2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶

<400>34

acucauauuc auagggugun n    21

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<211>21

<212>DNA

<213>人工

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<223>合成寡核苷酸

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<222>(1)..(21)

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acaccctatg aatatgagtt t    21

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<223>合成寡核苷酸

<220>

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<222>(20)..(21)

<223>n残基是2’-脱氧胸腺嘧啶

<400>36

acucauauuc auagggugun n    21

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>修饰碱基

<222>(1)..(21)

<223>所有残基是2’-脱氧-2’-氟-阿拉伯糖核苷酸

<400>37

acaccctatg aatatgagtt t    21

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<212>RNA

<213>人工

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<223>合成寡核苷酸

<220>

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<222>(20)..(21)

<223>n残基是2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶

<400>38

acucauauuc auagggugun n    21

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<211>21

<212>RNA

<213>人工

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<220>

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<222>(20)..(20)

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<220>

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<222>(21)..(21)

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aagaacuugc cuugauguan n    21

<210>40

<211>21

<212>RNA

<213>人工

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<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>(20)..(21)

<223>n残基是2’-脱氧胸腺嘧啶

<400>40

uacaucaagg caaguucuun n    21

<210>41

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<212>RNA

<213>人工

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<223>n残基是2’-脱氧胞啶

<220>

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<222>(21)..(21)

<223>n残基是2’-脱氧腺苷

<400>41

aagaacuugc cuugauguann    21

<210>42

<211>21

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n残基是2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶

<400>42

uacaucaagg caaguucuun n    21

<210>43

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<212>DNA

<213>人工

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<223>合成寡核苷酸

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<222>(1)..(21)

<223>所有残基是2’-脱氧-2’-氟-阿拉伯糖核苷酸

<400>43

aagaacttgc cttgatgtac a    21

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<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n残基是2’-脱氧胸腺嘧啶

<400>44

uacaucaagg caaguucuun n    21

<210>45

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>修饰碱基

<222>(1)..(21)

<223>所有残基是2’-脱氧-2’-氟-修饰阿拉伯糖核苷酸

<400>45

aagaacttgc cttgatgtac a    21

<210>46

<211>21

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n残基是2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶

<400>46

uacaucaagg caaguucuun n    21

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<211>21

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n残基是2’-脱氧胸腺嘧啶

<400>47

cccuacacca agugauaaun n    21

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<211>21

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n残基是2’-脱氧胸腺嘧啶

<400>48

auuaucacuu gguguagggn n    21

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<211>21

<212>RNA

<213>人工

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<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n残基是2’-脱氧胸腺嘧啶

<400>49

cccuacacca agugauaaun n    21

<210>50

<211>21

<212>RNA

<213>人工

<220>

<223>合成寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(21)

<223>n残基是2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖胸腺嘧啶

<400>50

Auuaucacuu gguguagggn n    21

Claims (49)

1.一种用于以序列特异性的方式调节靶基因表达的小干扰RNA(siRNA)，包括双链双螺旋，其中所述siRNA的至少一个核糖核酸核苷酸被阿拉伯糖修饰的核苷酸取代。

2.根据权利要求1所述的siRNA，长度为15至30个核苷酸。

3.根据权利要求2所述的siRNA，在3’末端和5’末端具有突出1至3个核苷酸的突出端。

4.根据权利要求3所述的siRNA，其中所述阿拉伯糖修饰的核苷酸具有选自下列的2’取代基：氟、羟基、氨基、叠氮基、烷基、烷氧基以及烷氧基烷基。

5.根据权利要求4所述的siRNA，其中所述烷基选自：甲基、乙基、丙基、丁基以及官能化烷基；所述烷氧基选自：甲氧基、乙氧基、丙氧基和官能化烷氧基；所述烷氧基烷基选自甲氧基乙基和乙氧基乙基。

6.根据权利要求5所述的siRNA，其中所述官能化烷基选自乙氨基、丙氨基以及丁氨基且所述官能化烷氧基选自-O(CH₂)_q-R，其中q＝2-4且-R是-NH₂、-OCH₃或-OCH₂CH₃基团。

7.根据权利要求3所述的siRNA，其中所述至少一个阿拉伯糖修饰的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖核苷酸(FANA)。

8.根据权利要求7所述的siRNA，其中所述至少一个阿拉伯糖修饰的核苷酸是在siRNA的有义链上。

9.根据权利要求7所述的siRNA，其中所述至少一个阿拉伯糖修饰的核苷酸是在siRNA的反义链上。

10.根据权利要求8所述的siRNA，其中在所述有义链上的全部核苷酸被FANA取代。

11.根据权利要求7所述的siRNA，其中所述至少一个阿拉伯糖修饰的核苷酸是至少一个所述突出端中的悬空核苷酸。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的siRNA，用于减少荧光素酶表达。

13.根据权利要求12所述的siRNA，所述双螺旋的所述链具有SEQ ID NO.1和2的碱基序列。

14.根据权利要求1所述的siRNA，所述双螺旋的所述链具有选自下列的序列：SEQ ID NO.3和4、SEQ ID NO.5和6、SEQ ID NO.7和8、SEQ ID NO.9和10、SEQ ID NO.11和12、SEQ ID NO.13和14、SEQ ID NO.15和16、SEQ ID NO.17和18、SEQ ID NO.19和20、SEQ ID NO.21和22、SEQ ID NO.23和24、SEQ ID NO.25和26、SEQ ID NO.27和28以及SEQ ID NO.29和30。

15.根据权利要求1至11中任一项所述的siRNA，用于减少CCR3表达。

16.根据权利要求12所述的siRNA，所述双螺旋的所述链具有SEQ ID NO.31和32的碱基序列。

17.根据权利要求1所述的siRNA，所述双螺旋的所述链具有选自下列的序列：SEQ ID NO.33和34、SEQ ID NO.35和36、或SEQ IDNO.37和38。

18.根据权利要求1至11中任一项所述的siRNA，用于减少呼吸道合胞病毒(RSV)病毒复制。

19.根据权利要求12所述的siRNA，所述双螺旋的所述链具有SEQ ID NO.47和48的碱基序列。

20.根据权利要求1所述的siRNA，所述双螺旋的所述链具有SEQ ID NO.49和50的序列。

21.根据权利要求1至11中任一项所述的siRNA，用于减少PDE4D表达。

22.根据权利要求12所述的siRNA，所述双螺旋的所述链具有SEQ ID NO.39和40的碱基序列。

23.根据权利要求1所述的siRNA，所述双螺旋的所述链具有选自下列的序列：SEQ ID NO.41和42、SEQ ID NO.43和44、以及SEQID NO.45和46。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的siRNA，含有至少一种选自下列的核苷酸间键：磷酸二酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、膦酸甲酯、硼烷磷酸酯以及其组合。

25.一种用于增强siRNA的核酸酶稳定性和靶基因抑制活性中至少一个的方法，包括用阿拉伯糖修饰的核苷酸置换所述siRNA中的至少一个核苷酸。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述阿拉伯糖修饰的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟阿拉伯糖核苷酸(FANA)。

27.根据权利要求25至26中任一项所述的方法，其中所述siRNA是双链双螺旋且在长度上具有15至30个核苷酸，且在3’末端和5’末端具有突出1至3个核苷酸的突出端。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述被置换的至少一个核苷酸在所述siRNA的有义链上。

29.根据权利要求27所述的方法，其中所述被置换的至少一个核苷酸在所述siRNA的反义链上。

30.根据权利要求28所述的方法，其中在所述有义链上的全部核苷酸被置换。

31.根据权利要求27所述的方法，其中所述被置换的至少一个核苷酸是在所述突出端上。

32.根据权利要求25至31中任一项所述的方法，其中所述双螺旋的所述链具有SEQ ID NO.1和2的碱基序列并且所述siRNA双链双螺旋降低荧光素酶表达。

33.根据权利要求25至31中任一项所述的方法，其中所述双螺旋的所述链具有SEQ ID NO.31和32的序列并且所述siRNA降低CCR3表达。

34.根据权利要求25至31中任一项所述的方法，其中所述双螺旋的所述链具有SEQ ID NO.39和40的序列并且所述siRNA降低PDE4D表达。

35.根据权利要求25至31中任一项所述的方法，其中所述双螺旋的所述链具有SEQ ID NO.47和48的序列并且所述siRNA减少呼吸道合胞病毒(RSV)复制。

36.一种药用组合物，包括根据权利要求1至24中任一项所述的siRNA以及药学上可接受的载体。

37.一种根据权利要求1至24中任一项所述的siRNA在制备调节靶基因表达的药物中的用途。

38.一种根据权利要求12至24中任一项所述的siRNA在制备减少荧光素酶的表达的药物中的用途。

39.一种根据权利要求15至17中任一项所述的siRNA在制备减少CCR3的表达的药物中的用途。

40.一种根据权利要求18至20中任一项所述的siRNA在制备预防或治疗呼吸道合胞病毒(RSV)感染的药物中的用途。

41.一种根据权利要求21至23中任一项所述的siRNA在制备降低PDE4D表达的药物中的用途。

42.一种用于调节需要所述调节的患者中的靶基因表达的方法，包括给予治疗上有效量的权利要求36所述的药用组合物。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述靶基因是CCR3且所述药用组合物包含根据权利要求15至17中任一项所述的siRNA。

44.根据权利要求42所述的方法，其中所述靶基因是用于呼吸道合胞病毒(RSV)复制的基因且所述药用组合物包括根据权利要求18至20中任一项所述的siRNA。

45.根据权利要求42所述的方法，其中所述靶基因是PDE4D且所述药用组合物包含根据权利要求21至23中任一项所述的siRNA。

46.一种商业包装，包含根据权利要求36所述的组合物以及关于所述组合物用于调节靶基因表达的用途的说明书。

47.根据权利要求46所述的商业包装，其中所述靶基因是CCR3且所述药用组合物包含根据权利要求15至17中任一项所述的siRNA。

48.根据权利要求46所述的商业包装，其中所述靶基因是用于呼吸道合胞病毒(RSV)复制的基因且所述药用组合物包含根据权利要求18至20中任一项所述的siRNA。

49.根据权利要求46所述的商业包装，其中所述靶基因是PDE4D且所述药用组合物包含根据权利要求21至23中任一项所述的siRNA。

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