CN102028947B - Fam3b基因的抑制剂和组合物及抑制方法以及脂肪肝的疗法和抑制剂的制药用途 - Google Patents

Fam3b基因的抑制剂和组合物及抑制方法以及脂肪肝的疗法和抑制剂的制药用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抑制剂，其中，该抑制剂能够抑制FAM3B基因的表达，以降低FAM3B基因的表达产物的水平；或者该抑制剂能够与FAM3B基因的表达产物结合，以降低FAM3B基因的产物的促进脂质生成的活性。本发明还涉及一种含有所述抑制剂的抑制剂组合物、抑制FAM3B基因的表达或抑制FAM3B基因产物的促进脂质生成活性的方法、治疗脂肪肝的方法、以及所述抑制剂在制备用于预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用。本发明提供的抑制剂以及抑制剂组合物和方法为治疗脂肪肝提供了一种新的有效途径。

Description

FAM3B基因的抑制剂和组合物及抑制方法以及脂肪肝的疗法和抑制剂的制药用途
技术领域
本发明是关于FAM3B基因的抑制剂和抑制方法以及治疗脂肪肝的方法和该抑制剂在制药中的应用，更确切地说，本发明涉及一种FAM3B基因的抑制剂、含有该抑制剂的抑制剂组合物和抑制FAM3B基因的表达或抑制FAM3B基因产物的促进脂质生成活性的方法，以及预防和/或治疗脂肪肝的方法和所述抑制剂在制备用于预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用。
背景技术
脂肪肝又称肝内脂肪变性，是指由各种原因引起的肝细胞内脂肪蓄积过多的病变。脂肪含量超过肝重量(湿重)的5％(最高可达40％-50％)，或在组织学上超过肝实质30％时称为脂肪肝。脂肪肝可由多种疾病和原因导致，最常见的诱因为肥胖、酒精中毒、糖尿病，此外还包括营养失调、药物中毒、妊娠等。随着人们物质生活水平的不断提高，饮食结构和生活方式的改变，脂肪肝的发病率逐年升高，已达到平均人口的10％，在肥胖、嗜酒和糖尿病人群中可高达50-60％。以往认为脂肪肝为良性病变，进展缓慢。但是近年研究发现约25％的患者发生肝脏纤维化，1.5-8％的患者发展为肝硬化。而非酒精性脂肪肝患者有20％进展为肝硬化，其中30-40％死于肝相关性疾病，部分发生亚急性肝衰竭和肝癌。因此脂肪肝的防治对阻止慢性肝病进展和改善预后十分重要。
目前，对脂肪肝的防治尚无有效药物，在临床治疗中，仍以去除病因、积极治疗原发病和坚持合理饮食制度为主，而药物仅起辅助作用。常用药物主要针对降血脂、肝细胞保护等方面，缺乏直接作用于肝脏脂质沉积的有效治疗手段。
因此，开拓一种治疗脂肪肝的有效途径成为迫切需要解决的问题。
发明内容
FAM3B因子是一种在胰腺的胰岛β细胞中特异性高表达的细胞因子。人FAM3B基因在染色体上定位于21q22染色体，含有至少8个外显子，编码含235个氨基酸的蛋白。最初于2002年由美国科学家克隆得到，FAM3B是一种可能在糖尿病病理生理过程中发挥作用的新细胞因子。
本发明人在研究糖尿病的病理过程中对FAM3B因子进行了深入的研究，意外地发现，FAM3B因子除了可能在糖尿病病理生理过程中发挥作用以外，FAM3B基因还在肝脏中弥漫性表达，说明FAM3B基因可能在肝脏功能调节中发挥作用。
因此，本发明人对FAM3B基因进行了进一步的研究，使用携带FAM3B基因的腺病毒处理野生型小鼠，可观察到肝脏发生明显的脂肪性变化，并且该肝脏切片的油红染色显示出大量的脂肪聚积，肝脏组织中甘油三酯、胆固醇酯含量显著增加。并且肝细胞系中FAM3B基因的过表达增加了中性脂肪在肝细胞内的聚积。由此可以看出，FAM3B因子可能参与了脂肪肝形成的过程，因此，FAM3B基因有可能是预防和/或治疗脂肪肝的关键因素。
基于上述发现，本发明人完成了本发明。
本发明的第一个目的是提供FAM3B基因的抑制物。
本发明的第二个目的是提供一种含有所述抑制物的抑制剂组合物。
本发明的第三个目的是提供一种抑制FAM3B基因的表达或抑制FAM3B基因产物的促进脂质生成活性的方法。
本发明的第四个目的是提供一种预防和/或治疗脂肪肝的方法。
本发明的第五个目的是提供所述抑制剂在制备用于预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用。
为了实现本发明的第一个目的，本发明提供了一种抑制剂，其中，该抑制剂能够抑制FAM3B基因的表达，以降低FAM3B基因的表达产物的水平；或者该抑制剂能够与FAM3B基因的表达产物结合，以降低FAM3B基因的产物的促进脂质生成的活性，其中，所述FAM3B基因的核苷酸序列与SEQID No 1所示的核苷酸序列具有98％以上的序列同一性。
为了实现本发明的第二个目的，本发明还提供了一种抑制剂组合物，该抑制剂组合物含有本发明提供的抑制剂作为活性成分。
为了实现本发明的第三个目的，本发明还提供了一种抑制FAM3B基因的表达或抑制FAM3B基因产物的促进脂质生成活性的方法，其中，该方法包括使用本发明提供的抑制剂或抑制剂组合物，以降低FAM3B基因的表达产物的水平；或者使FAM3B基因的产物的促进脂质生成的活性降低。
为了实现本发明的第四个目的，本发明还提供了一种预防和/或治疗脂肪肝的方法，其中，该方法包括：抑制患者的FAM3B基因的表达，以降低FAM3B基因的表达产物的水平；或者使FAM3B基因的产物的促进脂质生成的活性降低。
为了实现本发明的第五个目的，本发明还提供了所述抑制剂在制备用于预防和/治疗脂肪肝的药物中的应用。
本发明揭示了FAM3B基因在脂肪肝形成中的重要作用，从而为预防和/或治疗脂肪肝提供一种有效的途径。
具体实施方式
本发明人对FAM3B基因进行了详细的研究，发现FAM3B基因的产物可能参与了脂肪肝形成的过程；并对FAM3B基因的序列进行了研究，发现FAM3B基因的核苷酸序列与SEQ ID No 1所示的核苷酸序列的同一性可以为98％以上。基于上述发现，本发明提供了一种抑制剂，其中，该抑制剂能够抑制FAM3B基因的表达，以降低FAM3B基因的表达产物的水平；或者该抑制剂能够与FAM3B基因的表达产物结合，以降低FAM3B基因的产物的促进脂质生成的活性，其中，所述FAM3B基因的核苷酸序列与SEQ ID No1所示的核苷酸序列具有98％以上的序列同一性。
本发明中，对能够抑制FAM3B基因的表达或者能够与FAM3B基因的表达产物结合的抑制剂的种类没有特别的限制，只要能够实现沉默FAM3B基因的表达或抑制FAM3B基因的促进脂质生成的功能即可。例如，所述抑制剂的例子包括但不限制于：小干扰核酸、反义寡核苷酸、抗体、活性有机化合物、以及能够抑制FAM3B基因的表达或能够与FAM3B基因的表达产物结合的其他抑制剂种类。
根据本发明的一个方面，所述抑制剂可以为一种或多种反义寡核苷酸，反义寡核苷酸为长度为14-30bp的单链结构，并且所述反义寡核苷酸与SEQID No 1所示的核苷酸序列中相配对的核苷酸序列具有90％以上同一性。
根据本发明的另一个方面，所述抑制剂可以为一种或多种抗体，所述抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体，既可以是鼠源性抗体也可以是人源化抗体。从结构上来看，既可以是单链抗体也可以是其他抗体类似物，例如，包括但不限于核酸适配子(aptamer)或Affibody等。
根据本发明的另一个方面，所述抑制剂可以为能够抑制FAM3B基因的表达或者能够与FAM3B基因的表达产物结合的一种或多种活性化合物。
根据本发明的另一个方面，所述抑制剂可以包括一种或多种小干扰核酸，该小干扰核酸可以为双链RNA分子，包括正义链和反义链，且所述正义链和反义链的长度可以为15-27个核苷酸，所述正义链和反义链各自的3’端均可以为两个连续的脱氧胸苷酸，所述正义链和反义链中除去3’端的两个连续的脱氧胸苷酸以外的其他核苷酸可以互补形成双链，所述小干扰核酸的反义链能够与FAM3B基因的小核酸干扰靶位点序列碱基互补，以抑制FAM3B基因的表达，所述FAM3B基因的小核酸干扰靶位点序列可以包括SEQ ID NOs：2-33中之一所示的核苷酸序列，且所述小核酸干扰靶位点序列的长度可以为15-27个核苷酸。
优选情况下，所述小核酸干扰靶位点序列可以如SEQ ID Nos：34-65中之一所示。
在本发明的一个优选实施方式中，所述小干扰核酸的核苷酸序列与FAM3B-1至FAM3B-32中之一所示的核苷酸序列具有90％以上的同一性，或者所述小干扰核酸的核苷酸序列为经过修饰的并且与FAM3B-1至FAM3B-32中之一所示的核苷酸序列具有90％以上的同一性的核苷酸序列，其中，
FAM3B-1    正义链：5’-GCCUGCUCAAGGUGGUGUUdTdT-3’
           反义链：5’-AACACCACCUUGAGCAGGCdTdT-3’；
FAM3B-2    正义链：5’-UUCGUGGUCUUCGCCUCCUUGdTdT-3’
           反义链：5’-CAAGGAGGCGAAGACCACGAAdTdT-3’；
FAM3B-3    正义链：5’-CCUGCUCGCAGAGCUCAUUdTdT-3’
           反义链：5’-AAUGAGCUCUGCGAGCAGGdTdT-3’；
FAM3B-4    正义链：5’-CCAGUGCUGCCUAUAGCAUdTdT-3’
           反义链：5’-AUGCUAUAGGCAGCACUGGdTdT-3’；
FAM3B-5    正义链：5’-UGACACCUAUGCCUACAGGUUdTdT-3’
           反义链：5’-AACCUGUAGGCAUAGGUGUCAdTdT-3’；
FAM3B-6    正义链：5’-UACAGGUUACUCAGCGGAGGUdTdT-3’
           反义链：5’-ACCUCCGCUGAGUAACCUGUAdTdT-3’；
FAM3B-7    正义链：5’-AUCUGCUUUGAGGAUAACCUAdTdT-3’
           反义链：5’-UAGGUUAUCCUCAAAGCAGAUdTdT-3’；
FAM3B-8     正义链：5’-UGGGAGAACAGCUGGGAAAdTdT-3’
            反义链：5’-UUUCCCAGCUGUUCUCCCAdTdT-3’；
FAM3B-9     正义链：5’-GGAAAUGUUGCCAGAGGAAdTdT-3’
            反义链：5’-UUCCUCUGGCAACAUUUCCdTdT-3’；
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            反义链：5’-AUAGGUCACCAUGAAGAGCdTdT-3’；
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            反义链：5’-UCGUUAUUCAGUCUUGUGCdTdT-3’；
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            反义链：5’-UCUAUCUGGAUCUCUGCAGdTdT-3’；
FAM3B-22    正义链：5’-CCAGAUAGAAGGCUGCAUAdTdT-3’
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            反义链：5’-AUACAGAACACAUUUACUCdTdT-3’；
FAM3B-25    正义链：5’-AAACAAAUGCAGCUGGAAUdTdT-3’
            反义链：5’-AUUCCAGCUGCAUUUGUUUdTdT-3’；
FAM3B-26    正义链：5’-GCCCAUAUUUGAUGAGUAUdTdT-3’
            反义链：5’-AUACUCAUCAAAUAUGGGCdTdT-3’；
FAM3B-27    正义链：5’-GUUGUAAACCAAUGAACAUdTdT-3’
            反义链：5’-AUGUUCAUUGGUUUACAACdTdT-3’；
FAM3B-28    正义链：5’-GUAGUGAAGAUGUCAAUUAdTdT-3’
            反义链：5’-UAAUUGACAUCUUCACUACdTdT-3’；
FAM3B-29    正义链：5’-GAUGUCAAUUAGCAGGAAAdTdT-3’
            反义链：5’-UUUCCUGCUAAUUGACAUCdTdT-3’；
FAM3B-30    正义链：5’-GCAGGAAACUAAAAUGAAUdTdT-3’
            反义链：5’-AUUCAUUUUAGUUUCCUGCdTdT-3’；
FAM3B-31    正义链：5’-GAAAGAGGGUUGGGAGAAAdTdT-3’
            反义链：5’-UUUCUCCCAACCCUCUUUCdTdT-3’；
FAM3B-32    正义链：5’-AGACAGCCCUGCAGAGAGAdTdT-3’
            反义链：5’-UCUCUCUGCAGGGCUGUCUdTdT-3’。
更优选的情况下，所述小干扰核酸具有FAM3B-2、FAM3B-3、FAM3B-6、FAM3B-7、FAM3B-9、FAM3B-12、FAM3B-14、FAM3B-19、FAM3B-20或FAM3B-31所示的核苷酸序列。
根据本发明，所述化学修饰为如下修饰中的至少一种：
(1)对所述小干扰核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
(2)对所述小干扰核酸的核苷酸序列中的核糖的2’-OH的修饰；
(3)对所述小干扰核酸的核苷酸序列中的碱基的修饰。
所述化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰，如式1所示；和硼烷化磷酸盐修饰，如式2所示。两种修饰都能稳定小干扰核酸结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
Figure G2009101784547D00081
所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2’-OH的修饰，即，在核糖的羟基位置引入某些取代基，例如，2’-氟代修饰，如式3所示；2’-氧甲基修饰，如式4所示；2’-氧亚乙基甲氧基修饰，如式5所示；2，4’-二硝基苯酚修饰，如式6所示；锁核酸(LNA)，如式7所示；2’-氨基修饰，如式8所示；2’-脱氧修饰，如式9所示。
Figure G2009101784547D00091
所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，例如，5′-溴尿嘧啶修饰，如式10所示；5′-碘尿嘧啶修饰，如式11所示；N-甲基脲嘧啶修饰，如式12所示；2，6-二氨基嘌呤修饰，如式13所示。
Figure G2009101784547D00101
优选情况下，所述修饰使修饰后的小干扰核酸在细胞内抵抗核酸酶水解的能力增强。
此外，为了促进小干扰核酸进入细胞，可以在以上修饰的基础上，在小干扰核酸正义链的末端引入胆固醇等亲脂性的基团，亲脂性的基团包括以共价键与小干扰核酸结合，如末端引入胆固醇、脂蛋白、维生素E等，以利于通过由脂质双分子层构成的细胞膜与细胞内的mRNA发生作用。同时，小干扰核酸也可以进行非共价键修饰，如通过疏水键或离子键结合磷脂分子、多肽、阳离子聚合物等增加稳定性和生物学活性。
本发明提供的小干扰核酸的制备方法包括小干扰核酸序列的设计和小干扰核酸的制备。
所述小干扰核酸的设计是指选择FAM3B基因的cDNA序列(SEQ ID NO.1)(Genebank登记号为NM 058186)为模板，针对FAM3B基因的的保守区，选取15-27bp的核苷酸序列，设计相应的小干扰核酸。
所述针对FAM3B基因的小干扰核酸序列设计按以下原则进行：
在FAM3B基因的cDNA序列的1-1384bp的范围内选取15-27bp长度的核苷酸序列。15-27bp的核苷酸序列的选取主要参考以下几项原则：(1)GC含量在35-60％之间，(2)避免处于重复序列或低复杂性序列区域内，(3)避免出现4个以上的连续碱基序列，(4)避免含有单核苷酸多态性位点，(5)避免处于读码框起始密码和终止密码的50-100bp区域之内，除此之外，还要分析核苷酸序列的组成和热力学性质。通过BLAST分析，将候选小干扰核酸靶位点同人类基因序列进行同源性比对，排除同其它基因有很大的序列同源性(14个以上碱基)的序列，以确保候选小干扰核酸靶位点不会对其他非相关基因发生抑制作用，而仅对FAM3B基因具有特异的抑制作用。
最后将这样获得的15-27bp核苷酸序列的3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的正义链，在此15-27bp核苷酸序列的互补序列的3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的反义链。
根据本发明，所述小干扰核酸的制备方法为本领域技术人员所公知，例如，所述小干扰核酸可以通过化学合成得到，或者通过质粒和/或病毒载体的表达而得到。
所述小干扰核酸序列的合成可以采用化学合成的方法，或者委托专门从事核酸合成的生物技术公司合成，如委托上海GenePharma公司进行合成。
一般来说，所述化学合成的方法包括以下四个过程：(1)寡聚核糖核苷酸的合成；(2)脱保护；(3)纯化分离；(4)脱盐。
例如，具有FAM3B-1所示的核苷酸序列的小干扰核酸的化学合成的具体步骤如下：
(1)寡聚核糖核苷酸的合成：寡聚核糖核苷酸的合成是在自动DNA/RNA合成仪(例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上进行，根据FAM3B-1所示的核苷酸序列的顺序将对应的核苷酸逐个连接起来。由于小干扰核酸是由一段15-27个寡聚核糖核苷酸和2个脱氧胸苷酸组成。因此，起始物为固相连接的5’-O-对二甲氧基-胸苷，具体的每一个循环合成可分为四步来完成，第一步是将与固定连接的胸苷上5’位的保护基在三氯乙酸的作用下洗脱；第二步在活性催化剂S-乙基四唑的作用下，将5’-O-对二甲氧基三苯甲基-胸苷亚磷酰胺偶联至已脱去保护的上一个胸苷上，形成二胸苷亚磷酸三酯，偶合时间、偶合次数均按仪器厂家提供的程序来完成；第三步是将偶合的二胸苷亚磷酸三酯在0.05M碘水作用下，氧化成二胸苷磷酸三酯；第四步是乙酰化，将固相上的少量未反应的活性基团(例如，羟基和胺基)在乙酸酐的作用下形成酯或酰胺，从而达到封闭的作用，以减少整体副产物的产生，重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。
(2)脱保护
将合成好的固相小干扰核酸放入至一个可以密封的小瓶中，并加入1毫升的乙醇/胺(体积比为1∶3)，然后密封，置于55-70℃温箱中，孵育2-30小时，取出溶液，并将固相再次用双蒸水洗脱，收集洗脱液，并干燥去除溶剂。然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M)，室温放置4-12小时，再经过乙醇沉淀，得到小干扰核酸的粗产物。
(3)纯化分离
将小干扰核酸的粗产物溶解于2毫升的乙酸铵水溶液中，然后经过C18高压液相色谱的分离，按照C18高压液相色谱的标准程序，运用梯度洗脱的方法，收集小干扰核酸主产物(洗脱液A：0.1M乙酸铵；洗脱液B：20重量％的0.1M乙酸铵和80重量％的乙腈)，除去主产物中的溶剂，并加入5毫升80重量％的乙酸水溶液，在室温静置15分钟，然后将此溶液按照DEAE-5PW交换柱的标准程序进行阴离子交换的分离(DEAE-5PW，阴离子交换柱)，即可得到纯度在90重量％以上的小干扰核酸(梯度洗脱，洗脱液A：0.025M的Tris-HCl，0.025M的NaCl，pH＝8，5重量％的乙腈；洗脱液B：0.025M的Tris-HCl，2.0M的NaCl，pH＝8，5重量％的乙腈)。
(4)脱盐
纯化的小干扰核酸经过透析，除去盐份，随后将小干扰核酸溶液进行过滤消毒和干燥结晶。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸经过退火处理形成稳定的双链小干扰核酸，其方法是将正义链和反义链的寡聚核糖核苷酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)，将此溶液加热至95℃，然后缓缓将此溶液冷却至室温，最后将此溶液存放在4℃冰箱中保存，以备随时使用。
除化学合成外，小干扰核酸还可通过质粒和/或病毒载体的表达而得到，得到具有发夹结构的shRNA，其长度为50-90个核苷酸。shRNA的结构为：
两端为酶切位点(例如BamHI和EcoRI)，中间为一段loop序列(例如GAAGCTTG)，通过克隆技术将其插入到用相应内切酶酶切过的载体中，再整合到染色体中，即可稳定表达小干扰核酸，
例如，5’-GATCCG-正义链GAAGCTTG-反义链TTTTTTGGAATT-3’。
本发明还提供了一种抑制剂组合物，其中，该抑制剂组合物含有本发明提供的抑制剂作为活性成分。
优选情况下，所述抑制剂组合物还可以含有能够使所述抑制剂稳定、和/或能够维持和/或增强所述抑制剂效果的辅料，该辅料的用量没有特别的限制，只要能够使所述抑制剂稳定、和/或能够维持和/或增强所述抑制剂效果即可，例如，相对于100重量份的所述抑制剂，所述药学上可接受的载体的含量可以为100-10000000重量份。所述辅料的种类可以在很大范围内改变，例如，可以为脂质体、纳米粒、多肽复合物、蛋白复合物、脂类复合物、以及其他高分子和大分子材料中的一种或几种。
根据本发明的一个方面，所述药物组合物可以为注射液。
本发明中，所述注射液还可以含有药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体的量可以在很大范围内改变，优选情况下，相对于100重量份的抑制剂，所述药学上可接受的载体的含量为100-10000000重量份。
本发明中，对所述药学上可接受的载体没有特别的限制，例如，可以是pH值为4.0-9.0的磷酸缓冲液、pH值为7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液、生理盐水或pH为5.5-8.5的磷酸盐缓冲液，优选情况下，所述药学上可接受的载体为pH值为4.0-9.0的磷酸缓冲液。
根据本发明，所述注射液还可以含有保护剂和/或渗透压调节剂；以所述注射液为基准，所述保护剂的含量为0.01-30重量％，所述保护剂选自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或几种；所述渗透压调节剂的含量使所述注射液的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克，所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。
当注射本发明所述药用组合物时，注射用量可以为本领域常用的剂量，例如，单次注射1-1000mg/kg体重；在具体的使用中，所述剂量可以由医师根据各种参数、尤其根据待治疗患者的年龄、体重和病症的严重程度来确定。
本发明还提供了一种抑制FAM3B基因的表达或抑制FAM3B基因产物的促进脂质生成活性的方法，其中，该方法包括使用本发明提供的抑制剂或抑制剂组合物，以降低FAM3B基因的表达产物的水平；或者使FAM3B基因的产物的促进脂质生成的活性降低。
本发明还提供了一种预防和/或治疗脂肪肝的方法，其中，该方法包括：抑制患者的FAM3B基因的表达，以降低FAM3B基因的表达产物的水平；或者使FAM3B基因的产物的促进脂质生成的活性降低。所述抑制患者的FAM3B基因的表达，以降低FAM3B基因的表达产物的水平；或者使FAM3B基因的产物的促进脂质生成的活性降低的方法没有特别的限制，本领域的技术人员在理解本发明的内容的情况下，可以进行合适的选择，例如，该方法可以包括：向患者给药本发明提供的抑制剂或抑制剂组合物。
本发明还提供了所述抑制剂在制备用于预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用。
下面结合实施例进一步说明本发明，除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。
实施例1
小干扰核酸的合成
选择序列相对保守的FAM3B基因cDNA序列(Genbank登记号为NM_058186)(SEQ ID NO.1)的1-1384bp的范围内选取19-21bp长度的核苷酸序列。19-21bp核苷酸序列的选取主要参考以下几项原则：(1)GC含量在35-60％之间，(2)避免处于重复序列或低复杂性序列区域内，(3)避免出现4个以上的连续碱基序列，(4)避免含有单核苷酸多态性位点，(5)避免处于读码框起始密码和终止密码的50-100bp区域之内，除此之外，还要分析核苷酸序列的组成和热力学性质。通过BLAST分析，将候选小干扰核酸靶位点同人类基因序列进行同源性比对，排除同其它基因有很大的序列同源性(14个以上碱基)的序列，以确保候选小干扰核酸靶位点不会对其他非相关基因发生抑制作用，而仅对FAM3B基因具有特异的抑制作用。
最后将这样获得的19-21bp核苷酸序列的3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的正义链，在此19-21bp核苷酸序列的互补序列的3’末端加上两个脱氧胸腺嘧啶核苷酸作为小干扰核酸序列的反义链。
本实施例中设计的小干扰核酸所攻击的靶位点序列包括SEQ ID Nos：2-33中之一所示的核苷酸序列，具体的小核酸干扰靶位点序列如SEQ IDNos：34-65中之一所示(长度为19-21个核苷酸)。
设计好的小干扰核酸经上海吉玛(GenePharma)公司进行化学合成，得到小干扰核酸FAM3B-1至FAM3B-32，它们的核苷酸序列如表1所示。
表1
Figure G2009101784547D00161
Figure G2009101784547D00171
所述攻击范围是指该小干扰核酸在SEQ ID：NO.1中的相对应位置，所述小干扰核酸的反义链与靶位点具有相同的核苷酸序列。
实施例2
小干扰核酸对FAM3B基因表达的抑制活性检测
(1)HepG2细胞(人肝癌细胞系)的培养
HepG2细胞(购自北京大学)用含有10％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的的DMEM完全培养基，在温度为37℃及CO2含量为5％的培养箱中进行培养，每48小时传代、更换新鲜培养基。
(2)小干扰核酸的转染
使用Invitrogen公司的LipofectamineTM2000脂质体对实施例1得到的小干扰核酸FAM3B-1至FAM3B-32分别进行转染，以无关小干扰核酸(正义链：5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3；反义链：5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3)作为阴性对照。
具体操作步骤如下：将小干扰核酸溶解于无RNA酶的无菌水中，配制成浓度为20μmol/L的小干扰核酸溶液。将HepG2细胞接种至24孔板中，用OptiMEM I低血清培养基(Invitrogen公司，31985-062)稀释成浓度为8×105个细胞/ml，每孔500μl。分别将1.5μl小干扰核酸(20μmol/L)稀释于50μlOpti-MEM I低血清培养基(Invitrogen公司，31985-062)中，将1μlLipofectamineTM 2000脂质体稀释于50μl Opti-MEM I低血清培养基(Invitrogen公司，31985-062)中，，然后将上述两种溶液在室温下孵育5分钟后混合，混合溶液于室温静置20分钟后，把100μl该混合溶液加到接种有细胞的所述24孔板中。小干扰核酸的最终浓度是50nM。细胞37℃培养4小时，再加入1ml含10％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM完全培养基，然后在37℃下再培养24小时。
(3)小干扰核酸对FAM3B基因mRNA表达的抑制作用
通过Real-time PCR分别检测(2)中转染了小干扰核酸FAM3B-1至FAM3B-32的HepG2细胞中FAM3B基因mRNA的表达量。
具体步骤为：用1ml Trizol(GIBCOL公司)裂解转染小干扰核酸的HepG2细胞，并提取总RNA，提取总RNA的具体步骤为：将转染后的细胞在温度为37℃及CO2含量为5％的培养箱中培养48小时，然后离心收集细胞，并用预冷的2ml PBS洗一遍；所述PBS的组成为：NaCl 137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L；每孔加入1ml Trizol，室温放置5分钟，细胞发生裂解；将裂解物转移到1.5ml EP管中；加入200μl氯仿，用手剧烈震荡15秒，室温放置3分钟；14000rpm 4℃离心15分钟；取液相上清约500μl放于一新的EP管中，加入500μl异丙醇，室温放置10分钟；12000rpm，4℃离心10分钟，除去上清，用1ml浓度为75％的乙醇将沉淀物洗一次；7600rpm，4℃离心5分钟；除去上清，室温干燥RNA沉淀10分钟；加入20μl ddH2O溶解RNA。
将2单位的DNase I(RNase-free)(TakaRa公司)加入至上述溶解有RNA的DEPC水中，并在37℃条件下静置30分钟，以除去总RNA中残留的DNA。经过DNase I处理后，采用Invitrogen公司的PureLink Micro-to-Midi Total RNAPurification Kit对总RNA进行提纯，提纯的具体步骤为：在总RNA中加入20μl的浓度为70％的乙醇，振荡混合均匀，将混合物转移至纯化柱上，室温12000rpm离心15秒，弃去过滤液，加入700μl清洗缓冲液I(TakaRa公司)，室温12000rpm离心15秒，弃去过滤液，加入500μl清洗缓冲液II(TakaRa公司)，室温12000rpm离心15秒，弃去过滤液，再加入500μl清洗缓冲液II(TakaRa公司)，室温12000rpm离心15秒，弃过滤液，室温12000rpm离心1分钟，将纯化柱转移至RNA收集管上，加入30μl DEPC水，室温放置1分钟，室温13000rpm离心2分钟，将RNA样品置于-80℃保存。
对提纯后得到的总RNA进行逆转录反应，在逆转录反应中，所用的逆转录酶为Promega公司的M-MLV逆转录酶，逆转录反应的具体步骤为：将1ug提纯后的总RNA与1ul(0.5ug)的Oligo dT在试管中进行混合，用DEPC水将总体积补足至16.25μl，将试管进行加热，加热的条件包括加热温度为70℃，加热时间为5分钟；然后将试管迅速冷却至0℃，并加入缓冲液(5×MLVbuffer 5μl，10mM Dntp 1.25μl，RNasin 0.5μl，M-MLV 1μl)，在42℃条件下孵育1小时，得到cDNA。
将得到的cDNA作为PCR反应的模板，进行Real-time PCR反应。Real-time PCR反应体系为：ddH2O 17.5μl，10mM Dntp 0.5μl，10×Taq buffer2.5μl，Taq 0.5μl，F primer 0.5μl，R primer 0.5μl，Syber Green I 1μl，cDNA 2μl；PCR反应的条件为：94℃2分钟，94℃15秒，60℃30秒，共40个循环。同时设立GAPDH作为内参基因，根据下式计算小干扰核酸抑制活性，结果如表2所示。
Real-time PCR引物序列如下表：
Figure G2009101784547D00191
小干扰核酸抑制活性＝[1-(小干扰核酸转染后的FAM3B基因的拷贝数/小干扰核酸转染后的GAPDH拷贝数)/(对照孔FAM3B基因的拷贝数/对照孔GAPDH拷贝数)]×100％。
GAPDH：3-磷酸甘油醛脱氢酶基因。3-磷酸甘油醛脱氢酶基因是细胞中的看家基因，在细胞中稳定表达，不受其他外加因素的影响，因此作为荧光定量PCR反应的内参照。
表2
Figure G2009101784547D00201
从表2可以看出，本发明提供的小干扰核酸FAM3B-1至FAM3B-32能够高效抑制FAM3B基因的表达，特别是小干扰核酸FAM3B-2、FAM3B-3、FAM3B-6、FAM3B-7、FAM3B-9、FAM3B-12、FAM3B-14、FAM3B-19、FAM3B-20和FAM3B-31对FAM3B基因的抑制活性达分别到87％、91％、90％、88％、92％、95％、90％、85％、92％和94％，说明本发明提供的小干扰核酸用于抑制FAM3B基因的表达时，对FAM3B基因表达的抑制活性较高。
实施例3
HepG2细胞脂质聚积的抑制
(1)HepG2细胞的培养
选用HepG2细胞进行培养，具体培养过程为：用含有15％胎牛血清、2mM L-谷胺酰胺、100μ/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM培养液在37℃条件下，及CO2含量为5％的培养箱中进行培养，每48小时传代、更换新鲜培养基。
(2)HepG2细胞脂质聚积的诱导
以每孔2×104细胞/1mL接种于24孔培养板，每孔加入20％医用脂肪乳剂2ml/L，培养48小时。终止培养，进行油红O染色，观察细胞内脂质情况，具体操作如下：PBS冲洗细胞3次，每次5min；50％异丙醇固定细胞1min；油红O染液染色10min；蒸馏水冲洗细胞3次，每次1min；显微镜下观察和采集照片。正常情况下细胞应没有或有少量着色，医用脂肪乳剂诱导后细胞内大量脂质聚积，油红O染色后镜下可见红色脂滴。
(3)HepG2细胞脂质聚积抑制效果的检测
分别检测小干扰核酸FAM3B-1至FAM3B-32对细胞内脂质聚积的抑制效果，具体步骤如下：以每孔1×104细胞/1mL接种于24孔培养板，20％医用脂肪乳剂诱导48小时后，每孔分别加入小干扰核酸和LipofectamineTM2000脂质体(Invitrogen)进行转染，小干扰核酸的最终浓度为50nM。以无关小干扰核酸(正义链：5-UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3；反义链：5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3)作为阴性对照。转染后48小时弃培养基，进行油红O染色。具体操作如下：PBS冲洗细胞3次，每次5min；50％异丙醇固定细胞1min；油红O染液染色10min；蒸馏水冲洗细胞3次，每次1min；显微镜下观察和采集照片。在计算机彩色图像分析系统上进行灰度分析(灰度值越小，油红染色越深，脂肪沉积面积越大，强度越大)，并计算脂质聚积的抑制率，结果如表3所示。
细胞内脂质聚积抑制率＝[1-[(小干扰核酸转染后的孔灰度值-空白孔灰度值)/(对照孔灰度值-空白孔灰度值)]]×100％
表3
Figure G2009101784547D00221
从上表3可以看出，本发明提供的小干扰核酸FAM3B-1至FAM3B-32能够显著抑制细胞内脂质聚积，特别是通过小干扰核酸FAM3B-2、FAM3B-3、FAM3B-6、FAM3B-7、FAM3B-9、FAM3B-12、FAM3B-14、FAM3B-19、FAM3B-20和FAM3B-31对细胞内脂质聚积抑制率均达到了60％以上，说明本发明提供的小干扰核酸能够显著抑制细胞内脂质聚积。
实施例4
脂肪肝动物模型的治疗效果实验
为了增强小干扰核酸的稳定性，委托上海吉玛公司合成化学修饰的小干扰核酸FAM3B-1至FAM3B-32。其中，化学修饰是指对小干扰核酸FAM3B-1至FAM3B-32正义链的U、C和G核苷酸戊糖的2’-OH进行2’-氧甲基修饰，反义链U和C核苷酸戊糖的2’-OH进行2’-氟代修饰。
(2)诱导小鼠脂肪肝模型。C57BL/6J小鼠(购自北京大学医学部实验动物科学部)，雄性，8-10周龄，10只，分两组(正常饮食和MCD饮食)。MCD(高脂、蛋氨酸-胆碱缺乏)饮食是本领域研究非酒精性脂肪肝常用的方案。处理3-4周，以诱导成中度、重度脂肪肝，得到小鼠脂肪肝模型。
(3)小干扰核酸治疗脂肪肝
分别将修饰后的小干扰核酸1.2mg(0.09μmol)溶解于1.5ml无RNA酶的无菌生理盐水中，配制成浓度为60μmol/L的小干扰核酸溶液，并与脂质体以1∶1的体积比混合。用脂质体包裹后的小干扰核酸加入到5ml无RNA酶的无菌生理盐水(小干扰核酸浓度为0.25mg/ml)中，得到注射液。
分别使用注射液通过常规的尾静脉注射对步骤(2)得到的脂肪肝模型小鼠进行注射，注射的体积为10ml的注射液/千克体重，空白对照组注射相同体积的生理盐水，均只注射1次。注射3天后处死动物留取肝脏组织切片检测脂质聚积(油红O染色)，留取肝脏组织、血浆用甘油三酯酶法测定试剂盒检测肝组织内和血浆脂质水平。该试剂盒购自普利莱基因技术有限公司，操作按说明书进行，在500nm处测定吸光度值，其与甘油三酯浓度成正比。肝脏组织中甘油三酯测定结果以P/N值表示，并按下列公式计算小干扰核酸对细胞内脂质聚积的抑制率。
抑制率(％)＝[1-[(实验组P/N值-空白孔P/N值)/(对照组P/N值-空白孔P/N值)]]×100％
表4
Figure G2009101784547D00241
从表4可以看出，本发明提供的小干扰核酸FAM3B-1至FAM3B-32能够显著抑制肝细胞内脂质聚积，特别是通过小干扰核酸FAM3B-2、FAM3B-3、FAM3B-6、FAM3B-7、FAM3B-9、FAM3B-12、FAM3B-14、FAM3B-19、FAM3B-20和FAM3B-31对细胞内脂质聚积抑制率均达到了60％以上，说明本发明提供的小干扰核酸能够显著抑制肝细胞内脂质聚积，可用于治疗脂肪肝。
从上述实验可以看出，本发明提供的抑制物通过抑制FAM3B基因的表达，或者抑制FAM3B基因的产物的活性，能够显著的抑制肝细胞内脂质聚积，可用于预防和/或治疗脂肪肝。
SEQUENCE LISTING
<110>苏州瑞博生物技术有限公司
<120>FAM3B基因的抑制剂和组合物及抑制方法以及脂肪肝的疗法和抑制剂的制药用途
<130>I11623SRB
<160>65
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>3182
<212>DNA
<213>人类FAM3B(Homo sapiens)
<400>1
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Claims (10)

1.一种抑制剂，其特征在于，该抑制剂能够抑制FAM3B基因的表达，以降低FAM3B基因的表达产物的水平；其中，所述FAM3B基因的核苷酸序列为SEQ ID No：1所示的核苷酸序列；其中，该抑制剂包括一种或多种小干扰核酸；其中，所述小干扰核酸的核苷酸序列为FAM3B-11所示的核苷酸序列，或者所述小干扰核酸的核苷酸序列为经过修饰的并且为FAM3B-11所示的核苷酸序列，所述修饰为对FAM3B-11正义链的U、C和G核苷酸戊糖的2’-OH进行2’-氧甲基修饰，反义链U和C核苷酸戊糖的2’-OH进行2’-氟代修饰；其中，
FAM3B-11  正义链：5’-CUCUGGACCGAUGACAAAGdTdT-3’
          反义链：5’-CUUUGUCAUCGGUCCAGAGdTdT-3’。
2.一种抑制剂组合物，其特征在于，该抑制剂组合物含有权利要求1所述的抑制剂作为活性成分。
3.根据权利要求2的抑制剂组合物，其中，该抑制剂组合物还含有能够使所述抑制剂稳定和/或能够增强所述抑制剂效果的辅料。
4.根据权利要求3所述的抑制剂组合物，其中，所述辅料为纳米粒。
5.根据权利要求3所述的抑制剂组合物，其中，所述辅料为蛋白复合物、脂类复合物中的一种或几种。
6.根据权利要求2-5中的任意一项所述抑制剂组合物，其中，该抑制剂组合物为注射液，所述注射液还含有药学上可接受的载体，相对于100重量份的所述抑制剂，所述药学上可接受的载体的含量为100-10000000重量份。
7.根据权利要求6所述的抑制剂组合物，其中，所述药学上可接受的载体为pH值为4.0-9.0的磷酸缓冲液、pH值为7.5-8.5的三羟甲基胺基甲烷盐酸盐缓冲液或生理盐水。
8.根据权利要求6所述的抑制剂组合物，其中，所述药学上可接受的载体为pH为5.5-8.5的磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求7或8所述的抑制剂组合物，其中，所述注射液还含有保护剂和/或渗透压调节剂；以所述注射液的总重量为基准，所述保护剂的含量为0.01-30重量％，所述保护剂选自肌醇、山梨醇和蔗糖中的一种或几种；所述渗透压调节剂的含量使所述注射液的渗透压为200-700毫渗摩尔/千克，所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。
10.权利要求1所述的抑制剂在制备用于预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用。
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