ES2708562T3 - Evaluación cuantitativa de la eficacidad de tapa de ARN mensajero - Google Patents

Abstract

Un método para cuantificar la eficacia de la limitación del ARNm, que comprende: transcribiendo ARNm in vitro; tomar una muestra alícuota representativa de la reacción de síntesis in vitro; proporcionar una sustancia de unión de tapa específica en condiciones que permiten la formación de un complejo entre la sustancia de unión de tapa específica y el ARNm cubierto, en donde la sustancia de unión de tapa específica es un anticuerpo específico de la tapa; y determinar cuantitativamente la cantidad del complejo en la muestra alícuota representativa en comparación con un control, cuantificando así la eficacia de la capacidad de límite del ARNm para determinar su calidad como ingrediente farmacéutico activo (API) en un producto terapéutico final, en el que la etapa de determinar cuantitativamente la cantidad del complejo comprende realizar un ensayo ELISA.

Description

DESCRIPCION

Evaluacion cuantitativa de la eficacidad de tapa de ARN mensajero

ANTECEDENTES

[0001] La terapia de ARN mensajero ("ARNm") se esta convirtiendo en un enfoque cada vez mas importante para el tratamiento de una variedad de enfermedades. La terapia de ARNm efectiva requiere la administracion efectiva del ARNm al paciente y la produccion eficiente de la protema codificada por el ARNm dentro del cuerpo del paciente. Para optimizar el suministro de ARNm y la produccion de protemas in vivo, generalmente se requiere un lfmite adecuado en el extremo 5' de la construccion, que protege al ARNm de la degradacion y facilita la traduccion exitosa de protemas. Por lo tanto, la caracterizacion precisa de la eficiencia de tapa es particularmente importante para determinar la calidad del ARNm para aplicaciones terapeuticas. Nojima et al. (2007) J Biol Chem, 282:21, describe la provision de una sustancia de union espedfica de tapa para la investigacion de complejos de RNA con tope.

SUMARIO DE LA INVENCION

[0002] La presente invencion proporciona metodos mejorados para determinar de forma precisa y cuantitativa la eficacia de la limitacion del ARNm sintetizado in vitro. Como se menciono anteriormente, la limitacion adecuada es importante para la produccion exitosa de protemas in vivo. Sin embargo, antes de la presente invencion, la mayona de los ensayos de lfmites son cualitativos, lo que no es suficiente para evaluar la calidad de un producto terapeutico basado en ARNm y la seguridad y eficacia relacionadas para el uso in vivo. De hecho, antes de la presente invencion, no hay ningun metodo disponible que permita la cuantificacion de la eficacia de la limitacion sin alteraciones permanentes de los ARNm en una muestra. Como se describe en detalle a continuacion, la presente invencion se basa en la formacion y cuantificacion de un complejo entre un anticuerpo espedfico de tapa y un ARNm cubierto usando ELISA. Por lo tanto, la presente invencion proporciona un enfoque cuantitativo simple, confiable y eficiente para evaluar la eficacia de la limitacion del ARNm. La presente invencion es particularmente util para el control de calidad durante la fabricacion de ARNm y para la caracterizacion de ARNm como un ingrediente farmaceutico activo (API) en productos terapeuticos finales.

[0003] En un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para cuantificar la eficacia de la limitacion del ARNm, comprendiendo el metodo:

transcribiendo ARNm in vitro;

tomar una muestra almuota representativa de la reaccion de smtesis in vitro;

proporcionar una sustancia de union de tapa espedfica en condiciones que permiten la formacion de un complejo entre la sustancia de union de tapa espedfica y el ARNm cubierto, en donde la sustancia de union de tapa espedfica es un anticuerpo espedfico de la tapa; y

determinar cuantitativamente la cantidad del complejo en la muestra almuota representativa en comparacion con un control, cuantificando asf la eficacia de la capacidad de lfmite del ARNm para determinar su calidad como ingrediente farmaceutico activo (API) en un producto terapeutico final, en el que la etapa de determinar cuantitativamente la cantidad del complejo comprende realizar un ensayo ELISA.

[0004] En algunas realizaciones, se puede usar un metodo de la presente invencion para cuantificar una tapa que tiene una estructura de formula I:

en donde,

B es una nucleobase;

R1 se selecciona de un halogeno, OH y OCH3;

R2 se selecciona de H, OH y OCH3;

R3 es CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3 o vado;

R4 es NH2;

R5 se selecciona de OH, OCH3 y un halogeno;

n es 1,2 o 3; y

M es un nucleotido del ARNm.

[0005] En algunas realizaciones, la nucleobase es guanina.

[0006] En algunas realizaciones, un metodo de la presente invencion se puede usar para cuantificar una tapa m7G con una estructura de formula II:

en donde,

R2 es H o CH3;

R4 es NH2;

R5 es OH u OCH3;

R6 es H o CH3; y

M es un nucleotido del ARNm.

[0007] En algunas realizaciones, una sustancia de union de tapa espedfica adecuada es un anticuerpo anti-m7G.

[0008] En algunas realizaciones, la etapa de determinar cuantitativamente la cantidad del complejo midiendo una senal detectable asociada al complejo. En algunas realizaciones, la senal detectable esta directamente asociada con la sustancia de union de tapa espedfica. En algunas realizaciones, la senal detectable esta asociada indirectamente con la sustancia de union de tapa espedfica a traves de un agente secundario que se une a la sustancia de union de tapa espedfica. En algunas realizaciones, un agente secundario adecuado es un anticuerpo secundario.

[0009] En algunas realizaciones, una senal detectable adecuada es una senal fluorescente, una senal colorimetrica o una senal radiactiva. En algunas realizaciones, se genera una senal fluorescente adecuada convirtiendo un sustrato enzimatico en un producto cromogenico, quimifluorescente o quimioluminiscente por una enzima asociada directa o indirectamente con la sustancia de union de tapa espedfica. En algunas realizaciones, un sustrato enzimatico adecuado se selecciona de los grupos que consisten en sal disodica de fosfato de p-nitrofenilo (PNPP), sal de 2,2'-azinobis[3-etilbenzotiazolina-6-acido sulfonico]-diamonio (ABTS), dihidrocloruro de fenilendiamina (OPD) y 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). En algunas realizaciones, una enzima adecuada es la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rabano picante.

[0010] En algunas realizaciones, un control adecuado para la determinacion cuantitativa es una muestra de ARNm con una cantidad predeterminada de ARNm con tapa. En algunas realizaciones, un control adecuado para la determinacion cuantitativa comprende una cantidad predeterminada de tapa sintetizada.

[0011] En algunas realizaciones, la cuantificacion de la eficacia del lfmite del ARNm comprende la cuantificacion de la cantidad absoluta de ARNm con lfmite en la muestra del ARNm. En algunas realizaciones, la cuantificacion de la eficacia del lfmite del ARNm comprende la cuantificacion del porcentaje de ARNm con lfmite en la muestra del ARNm.

[0012] En algunas realizaciones, el metodo de acuerdo con la presente invencion comprende ademas una etapa de captura del ARNm sobre un sustrato. En algunas realizaciones, el ARNm es capturado por un oligo poli-T que se une a la cola poli-A del ARNm. En algunas realizaciones, el ARNm es capturado por una protema o anticuerpo de union a poli-A. En algunas realizaciones, un sustrato adecuado es una microplaca, perla magnetica, partmula, perla polimerica, resina cromatografica, papel de filtro, nitrocelulosa, diazocelulosa, vidrio, latex, poliestireno, cloruro de polivinilo, propileno, polietileno, dextrano, sefarosa, agar, almidon, nailon, gel de silicona, o hidrogel. En algunas realizaciones, el sustrato esta recubierto con avidina o estreptavidina. En algunas realizaciones, una protema o anticuerpo de union a oligo poli-T o poli-A usado para capturar el ARNm esta biotinilado.

[0013] La invencion proporciona ademas un metodo para fabricar ARNm que comprende una etapa de cuantificacion de la eficacia de limitacion del ARNm de acuerdo con el metodo descrito en los parrafos anteriores.

[0014] Entre otras cosas, la presente descripcion tambien proporciona composiciones y kits para realizar los metodos de la invencion descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la presente descripcion proporciona un kit para cuantificar la eficacia de la limitacion del ARNm, comprendiendo el kit una sustancia de union de tapa espedfica; uno o mas reactivos para detectar un complejo entre la sustancia de union de tapa espedfica y un ARNm con tapa, y un control para cuantificar el ARNm con tapa. En algunas realizaciones, una sustancia de union de tapa espedfica adecuada es un anticuerpo espedfico de la tapa. En algunas realizaciones, un anticuerpo espedfico de tapa adecuado es un anticuerpo anti-m7G. En algunas realizaciones, un kit de la presente descripcion contiene ademas un sustrato para capturar ARNm.

[0015] Como se usa en esta solicitud, los terminos "aproximadamente" y "alrededor de" se usan como equivalentes. Cualquier numero utilizado en esta solicitud con o sin aproximadamente/alrededor de esta destinado a cubrir cualquier fluctuacion normal apreciada por un experto en la tecnica relevante.

[0016] Otras caractensticas, objetos y ventajas de la presente invencion son evidentes en la descripcion detallada que sigue. Debe entenderse, sin embargo, que la descripcion detallada, si bien indica realizaciones de la presente invencion, se proporciona solo a modo de ilustracion, no de limitacion. Varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la invencion como se reivindica seran evidentes para los expertos en la tecnica a partir de la descripcion detallada.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

[0017] Los dibujos tienen fines ilustrativos y no son limitativos de ninguna manera.

FIG. 1 ilustra una representacion ejemplar de una realizacion de la invencion basada en ELISA tipo sandwich en la que un anticuerpo de anti-m7G de tapa de raton primario monoclonal se une espedficamente a la tapa de un ARNm. El ARNm se ha capturado indirectamente en un sustrato solido mediante la hibridacion de su cola de poli(A) con un cebador oligo-dT biotinilado, que se une directamente al sustrato solido recubierto con estreptavidina.

FIG. 2 es un diagrama de estructuras limitadas de ARNm a modo de ejemplo y una estructura sin tapar presente en diversas realizaciones de la invencion.

FIG. 3 es un grafico de barras que demuestra la cuantificacion de los niveles de protema de alfa-galactosidasa humana secretada (GLA) medida a traves de ELISA. La protema detectada es el resultado de su produccion a partir de ARNm de GLA administrado por via intravenosa a traves de una dosis unica de nanopartmulas lipfdicas (30 ug de ARNm de GLA encapsulado) seis horas despues de la administracion.

FIG. 4 muestra un grafico ejemplar que demuestra la cuantificacion del lfmite en varias cantidades de ARNm con y sin lfmite segun se mide por ELISA. La senal detectada se deriva de la interaccion del anticuerpo anti-tapa con la estructura de tapa en las muestras de ARN.

FIG. 5 muestra un grafico de barras ejemplar que demuestra la cuantificacion del lfmite interno en la casa y el ARNm protegido sintetizado comercialmente junto con un ARN estandar N7 Metilo cubierto como medido por ELISA. La senal detectada se deriva de la interaccion del anticuerpo anti-tapa con la estructura de tapa en las muestras de ARN.

DEFINICIONES

[0018] Para que la presente invencion se entienda mas facilmente, primero se definen ciertos terminos. Las definiciones adicionales para los siguientes terminos y otros terminos se establecen a lo largo de la especificacion.

[0019] Afinidad: como se conoce en la tecnica, la "afinidad" es una medida de la estrechez con la que se une un ligando particular (por ejemplo, se asocia de manera no covalente con) y/o la velocidad o frecuencia con la que se disocia, su pareja. Como se conoce en la tecnica, se puede utilizar cualquiera de una variedad de tecnologfas para determinar la afinidad. En muchas realizaciones, la afinidad representa una medida de union espedfica.

[0020] Recocido o hibridacion: como se usa en este documento, los terminos "recocido", "hibridacion" y equivalente gramatical, se refieren a la formacion de complejos (tambien llamados duplex o tubridos) entre secuencias de nucleotidos que son suficientemente complementarias para formar complejos a traves de Watson-Crick de bases de pareja o emparejamiento de bases no canonicas. Se apreciara que las secuencias de hibridacion o recocido no necesitan tener un complemento perfecto para proporcionar tubridos estables. En muchas situaciones, se formaran tubridos estables donde menos del 10% de las bases son desajustes. En consecuencia, como se usa en el presente documento, el termino "complementario" se refiere a una molecula de acido nucleico que forma un duplex estable con su complemento en condiciones particulares, generalmente donde hay aproximadamente un 90% o mas de homologfa (por ejemplo, aproximadamente un 95% o mas, aproximadamente un 98% o mas, o aproximadamente homologfa del 99% o mas). Los expertos en la materia entienden como estimar y ajustar la rigurosidad de las condiciones de hibridacion, de modo que las secuencias que tienen al menos un nivel deseado de complementariedad se hibriden de manera estable, mientras que las que tienen una menor complementariedad no lo haran. Para ver ejemplos de condiciones y parametros de hibridacion, consulte, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, Segunda edicion, Cold Spring Harbor Press: Plainview, NY y Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", 1994, John Wiley & Sons: Secaucus, NJ. Se dice que la complementariedad entre dos moleculas de acido nucleico es "completa", "total" o "perfecta" si todas las bases del acido nucleico son iguales, y se dice que es "parcial" de lo contrario.

[0021] Anticuerpo: como se usa en el presente documento, el termino "anticuerpo" se refiere a un polipeptido que consiste en uno o mas polipeptidos sustancialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de region constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, epsilon y mu, asf como innumerables genes de region variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican tfpicamente como kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican tfpicamente en gamma, mu, alfa, delta o epsilon, que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Se sabe que una unidad estructural tfpica de inmunoglobulina (anticuerpo) comprende un tetramero. Cada tetramero esta compuesto por dos pares de cadenas polipeptfdicas identicas, cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kD). El extremo N de cada cadena define una region variable de aproximadamente 100 a 110 o mas aminoacidos principalmente responsables del reconocimiento de antfgenos. Los terminos "cadena ligera variable" (VL) y "cadena pesada variable" (VH) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas, respectivamente. Un anticuerpo puede ser espedfico para un antfgeno particular (por ejemplo, tapas ARNm m7G). El anticuerpo o su antfgeno pueden ser un analito o una pareja de union. Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como una serie de fragmentos bien caracterizados producidos por digestion con varias peptidasas. Asf, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo debajo de los enlaces disulfuro en la region bisagra para producir F(ab)'2, un dfmero de Fab que es una cadena ligera unida a VH-CH1 por un enlace disulfuro. El F(ab)'2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la region bisagra, convirtiendo asf el dfmero (Fab')2 en un monomero Fab'. El monomero Fab' es esencialmente un Fab con parte de la region bisagra (ver, Fundamental Immunology, WE Paul, ed., Raven Press, NY (1993), para una descripcion mas detallada de otros fragmentos de anticuerpos). Aunque se definen varios fragmentos de anticuerpos en terminos de la digestion de un anticuerpo intacto, un experto en la tecnica apreciara que tales fragmentos Fab' pueden sintetizarse de novo qmmicamente o utilizando una metodologfa de ADN recombinante. Por lo tanto, el termino "anticuerpo", como se usa en este documento, tambien incluye fragmentos de anticuerpos producidos por la modificacion de anticuerpos completos o sintetizados de novo utilizando metodologfas de ADN recombinante. En algunas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos de cadena simple, como los anticuerpos Fv de cadena unica (scFv) en los que una cadena pesada variable y una cadena ligera variable se unen (directamente o a traves de un enlazador peptfdico) para formar un polipeptido continuo. Un polipeptido Fv de una sola cadena ("scFv") es un heterodfmero VH:VL enlazado covalentemente que puede expresarse a partir de un acido nucleico que incluye secuencias que codifican VH y VL, ya sea unidas directamente o unidas por un enlazador codificador de peptidos, por ejemplo, Huston, et al. (1988) PROC. NAT. ACAD. SCI. EE.UU., 85:5879-5883.). Existen varias estructuras para convertir las cadenas polipeptfdicas ligeras y pesadas naturalmente agregadas, pero separadas qmmicamente, de una region V de anticuerpo en una molecula scFv que se plegara en una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de union a antfgeno. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nos 5.091.513 y 5.132.405 y 4.956.778.

[0022] Aproximadamente: como se usa en el presente documento, el termino "aproximadamente” o “alrededor de", aplicado a uno o mas valores de interes, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En ciertas realizaciones, el termino "aproximadamente” o “alrededor de" se refiere a un rango de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier direccion (mayor o menor que) del valor de referencia indicado a menos que se indique lo contrario o sea evidente en el contexto (excepto cuando dicho numero supere el 100% de un valor posible).

[0023] Sustancia de union: como se usa en este documento, el termino "sustancia de union" incluye cualquier molecula, como una protema (por ejemplo, un peptido, un anticuerpo, etc.), un acido nucleico, un oligonucleotido, un compuesto qmmico, que se une un objetivo (por ejemplo, un antfgeno, un nucleotido, un peptido, un polinucleotido, etc.). Una sustancia vinculante tambien se conoce como un agente de captura.

[0024] Compuesto y agente: los terminos "compuesto" y "agente" se usan aqm de manera intercambiable. Se refieren a cualquier molecula de origen natural o no natural (es dedr, sintetica o recombinante), como una macromolecula biologica (por ejemplo, acido nucleico, polipeptido o protema), molecula organica o inorganica, o un extracto hecho de materiales biologicos. como bacterias, plantas, hongos o celulas o tejidos animales (especialmente mairnferos, incluidos los humanos). El compuesto puede ser una sola molecula o una mezcla o complejo de al menos dos moleculas.

[0025] Control: tal como se usa en el presente documento, el termino "control" tiene su significado en la tecnica de ser un estandar contra el que se comparan los resultados. Normalmente, los controles se usan para aumentar la integridad en los experimentos al aislar las variables para llegar a una conclusion acerca de dichas variables. En algunas realizaciones, un control es una reaccion o ensayo que se realiza simultaneamente con una reaccion o ensayo de prueba para proporcionar un comparador. En un experimento, se aplica la "prueba" (es decir, la variable que se esta ensayando). En el segundo experimento, el "control", la variable que se esta ensayando no se aplica. En algunas realizaciones, un control es un control historico (es decir, de una prueba o ensayo realizado anteriormente, o una cantidad o resultado que es conocido previamente). En algunas realizaciones, un control es o comprende un tronco impreso o guardado de otro modo. Un control puede ser un control positivo o un control negativo.

[0026] Senal detectable: como se usa en el presente documento, el termino "senal detectable" se refiere a una senal que puede ser detectada o medida por un ser humano o una maquina. En algunas realizaciones, una senal detectable se puede cuantificar de tal manera que la intensidad de la senal este relacionada con (por ejemplo, proporcional a) la cantidad del compuesto asociado con la senal. Dependiendo de la naturaleza de la senal, una senal detectable puede ser detectada, medida o cuantificada por medios espectroscopicos, fotoqmmicos, bioqmmicos, inmunoqmmicos, electricos, opticos o qmmicos. Una "senal detectable" tambien se conoce como "agente detectable" o "resto detectable" en esta solicitud.

[0027] Kit: como se usa en el presente documento, el termino "kit" se refiere a cualquier sistema de administracion para entregar materiales. Dichos sistemas de administracion pueden incluir sistemas que permitan el almacenamiento, transporte o administracion de diversos reactivos de diagnostico o terapeuticos (por ejemplo, oligonucleotidos, anticuerpos, enzimas, etc. en los contenedores apropiados) y/o materiales de apoyo (por ejemplo, tampones, instrucciones escritas para realizar el ensayo, etc.) de un lugar a otro. Por ejemplo, los kits incluyen uno o mas recintos (por ejemplo, cajas) que contienen los reactivos de reaccion relevantes y/o materiales de soporte. Tal como se usa en el presente documento, el termino "kit fragmentado" se refiere a sistemas de administracion que comprenden dos o mas contenedores separados que contienen cada uno una subporcion de los componentes totales del kit. Los contenedores se pueden entregar al destinatario previsto juntos o por separado. Por ejemplo, un primer recipiente puede contener una enzima para uso en un ensayo, mientras que un segundo recipiente contiene oligonucleotidos. El termino "kit fragmentado" pretende abarcar kits que contienen reactivos espedficos de analito (ASR) regulados en la seccion 520(e) de la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosmeticos, pero no estan limitados a los mismos. De hecho, cualquier sistema de administracion que comprenda dos o mas contenedores separados que contengan una subporcion de los componentes totales del kit se incluye en el termino "kit fragmentado". En contraste, un "kit combinado" se refiere a un sistema de administracion que contiene todos los componentes en un solo contenedor (por ejemplo, en una sola caja que contiene cada uno de los componentes deseados). El termino "kit" incluye kits fragmentados y combinados.

[0028] Etiquetado: como se usa en este documento, el termino "marcado" se refiere a la union de una senal, agente o resto detectable a un compuesto. Ver la definicion de senal detectable.

[0029] Nucleosido: el termino "nucleosido" o "nucleobase", como se usa en el presente documento, se refiere a adenina ("A"), guanina ("G"), citosina ("C"), uracilo ("U"), timina ("T") y sus analogos unidos a un carbohidrato, por ejemplo, D-ribosa (en ARN) o 2'-deoxi-D-ribosa (en ADN), a traves de un enlace N-glicosfdico entre el carbono anomerico del carbohidrato (atomo de 1'-carbono del carbohidrato) y la nucleobase. Cuando la nucleobase es purina, por ejemplo, A o G, el azucar ribosa generalmente se une a la posicion N9 del anillo heterodclico de la purina. Cuando la nucleobase es pirimidina, por ejemplo, C, T o U, el azucar esta generalmente unido a la posicion N1 del anillo heterodclico. El carbohidrato puede estar sustituido o no sustituido. Los azucares de ribosa sustituidos incluyen, pero no se limitan a, aquellos en los que uno o mas de los atomos de carbono, por ejemplo el atomo de carbono 2', esta sustituido con uno o mas de Cl, F, --R, O, --NR2 o grupos halogenos iguales o diferentes, donde cada R es independientemente H, C1-C6 alquilo o C5-C14 arilo. Los ejemplos de ribosa incluyen ribosa, 2'-desoxirribosa, 2',3'-didesoxirribosa, 2'-haloribosa, 2'-fluororibosa, 2'-clororibosa y 2'-alquilribosa, por ejemplo, 2'-O-metilo, 4'-nucleotidos alfa-anomericos, nucleotidos lA-anomericos (Asseline et al., NUCL. ACIDS RES., 19:4067-74 [1991]), modificaciones de azucar bidclico con enlaces 2'-4'- y 3'-4' y otras "bloqueadas" o "LNA", (documentos WO 98/22489; WO 98/39352; WO 99/14226).03

[0030] Nucleotido: el termino "nucleotido", como se usa en este documento, significa un nucleosido en una forma fosforilada (un ester de fosfato de un nucleosido), como una unidad monomerica o dentro de un polfmero polinucleotido. "Nucleotido 5'-trifosfato" se refiere a un nucleotido con un grupo ester trifosfato en la posicion 5', a veces indicado como "NTP" o "dNTP" y "ddNTP" para senalar particularmente las caractensticas estructurales del azucar ribosa. El grupo ester trifosfato puede incluir sustituciones de azufre para los diversos restos de oxfgeno, por ejemplo, alfa-tio-nucleotido 5'-trifosfatos. Los nucleotidos pueden existir en las formas mono-, di- o tri-fosforiladas.

Los atomos de carbono de la ribosa presentes en los nucleotidos se designan con un caracter principal (') para distinguirlos de la numeracion del esqueleto en las bases. Para una revision de la qmmica de polinucleotidos y acidos nucleicos, consulte Shabarova, Z. y Bogdanov, A. Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, VCH, Nueva York, 1994.

[0031] Acido nucleico: los terminos "acido nucleico", "molecula de acido nucleico”, “polinucleotido” u “oligonucleotido" se pueden usar aqu de manera intercambiable. Se refieren a polfmeros de monomeros de nucleotidos o analogos de los mismos, como el acido desoxirribonucleico (ADN) y el acido ribonucleico (ARN) y sus combinaciones. Los nucleotidos pueden ser de origen genomico, sintetico o semisintetico. A menos que se indique lo contrario, los terminos abarcan estructuras similares a los acidos nucleicos con esqueletos sinteticos, asf como productos de amplificacion. Como apreciara un experto en la materia, la longitud de estos polfmeros (es decir, el numero de nucleotidos que contiene) puede variar ampliamente, a menudo dependiendo de su funcion o uso previsto. Los polinucleotidos pueden ser moleculas lineales, ramificadas o circulares. Los polinucleotidos tambien tienen contraiones asociados, tales como H+, NH4+, trialquilamonio, Mg+, Na+ y similares. Un polinucleotido puede estar compuesto completamente de desoxirribonucleotidos, completamente de ribonucleotidos, o mezclas quimericas de los mismos. Los polinucleotidos pueden estar compuestos de nucleobase de nucleotido y analogos de azucar.

[0032] En algunas realizaciones, el termino "oligonucleotido" se usa en el presente documento para denotar un polinucleotido que comprende entre aproximadamente 5 y aproximadamente 150 nucleotidos, por ejemplo, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 100 nucleotidos, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 75 nucleotidos, o entre aproximadamente 15 y unos 50 nucleotidos. A lo largo de la especificacion, cada vez que un oligonucleotido esta representado por una secuencia de letras (elegidas, por ejemplo, de las cuatro letras basicas: A, C, G y T, que denotan adenosina, citidina, guanosina y timidina, respectivamente), los nucleotidos se presentan en el orden 5' a 3' de la izquierda a la derecha. Una "secuencia de polinucleotidos" se refiere a la secuencia de monomeros de nucleotidos a lo largo del polfmero. A menos que se indique lo contrario, siempre que se represente una secuencia de polinucleotidos, se entendera que los nucleotidos estan en orientacion 5' a 3' de izquierda a derecha.

[0033] Los acidos nucleicos, polinucleotidos y oligonucleotidos pueden estar compuestos por bases de nucleotidos estandar o sustituirse por analogos de isoformas de nucleotidos, que incluyen, entre otros, bases iso-C e iso-G, que pueden hibridar mas o menos permisiblemente que las bases estandar, y que se hibridaran preferentemente con bases analogas de isoformas complementarias. Muchas de estas bases de isoformas se describen, por ejemplo, por Benner et al., (1987) Cold Spring Harb. Simp. Cuant. Biol. 52, 53-63. Los analogos de los monomeros de nucleotidos naturales incluyen, por ejemplo, 7-deazaadenina, 7-deaza-guanina, 7-deaza-8-azaguanina, 7-deaza-8-azaadenina, 7-metilguanina, inosina, nebularina, nitropirrol (Bergstrom, J Amer Chem. Soc., 117: 1201-1209 [1995]), nitroindol, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina, pseudouridina, pseudocitosina, pseudoisocitosina, 5-propinilo-citosina, isocitosina, isoguanina (Seela, patente de EE.UU. N° 6.147.199), 7-deazaguanina (patente Seela, patente de EE.UU. n.° 5.990.303), 2-azapurina (Seela, WO 01/16149), 2-tiopirimidina, 6-tioguanina, 4-tiogimina 4-tiouracilo, 0-6-metilguanina, N-6-metiladenina, O-4-metiltimina, 5,6-dihidrotimina, 5,6-dihidrouracilo, 4-metilindol, pirazolo [3,4-D]pirimidinas, "PPG" (Meyer, Patentes de EE.UU. Nos 6.143.877 y 6.127.121; Gall, WO 01/38584), y etenoadenina (Fasman (1989) en Practical Handbook of Bioochemistry and Molecular Biology, pp. 385-394, CRC Press, Boca Raton, Fla.).

[0034] El termino "3" se refiere a una region o posicion en un polinucleotido u oligonucleotido 3' (es decir, aguas abajo) desde otra region o posicion en el mismo polinucleotido u oligonucleotido. El termino "5" se refiere a una region o posicion en un polinucleotido u oligonucleotido 5' (es decir, aguas arriba) de otra region o posicion en el mismo polinucleotido u oligonucleotido. Los terminos "extremo 3'" y "extremo 3'", como se usan en el presente documento en referencia a una molecula de acido nucleico, se refieren al extremo del acido nucleico que contiene un grupo hidroxilo libre unido al carbono 3' del azucar pentosa terminal. El termino "extremo 5'" y "terminal 5'“, como se usa en el presente documento con referencia a una molecula de acido nucleico, se refiere al extremo de la molecula de acido nucleico que contiene un grupo hidroxilo o fosfato libre unido al carbono 5' del terminal de azucar pentosa. En algunas realizaciones, los cebadores oligonucleotidicos comprenden tractos de poli-adenosina en sus extremos 5'.

[0035] Anticuerpo primario y secundario: como se usa en el presente documento, el termino "anticuerpo primario" generalmente se refiere a un anticuerpo que se une directamente a un objetivo de interes. El termino "anticuerpo secundario", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que se une a otro anticuerpo (primario) que, a su vez, esta unido a un objetivo de interes.

[0036] Diana: como se usa en el presente documento, el termino "diana" se refiere a una molecula de interes.

DESCRIPCION DETALLADA

[0037] La presente invencion proporciona un metodo para cuantificar la eficacia de la limitacion del ARNm basandose en la formacion y la determinacion cuantitativa de un complejo entre un anticuerpo espedfico de la tapa y el ARNm cubierto como se describe en las reivindicaciones.

[0038] La presente invencion es util para cuantificar la eficacia de la limitacion de la smtesis de ARNm in vitro. Por lo tanto, la presente invencion proporciona un importante enfoque de control de calidad para la fabricacion de ARNm y, en particular, para evaluar la seguridad, eficacia y viabilidad comercial de los ARNm con aplicaciones terapeuticas.

[0039] Varios aspectos de la invencion se describen en detalle en las siguientes secciones. El uso de secciones no pretende limitar la invencion. Cada seccion puede aplicarse a cualquier aspecto de la invencion. En esta aplicacion, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario.

Tapado de ARNm y/o metilacion

[0040] Tfpicamente, los ARNm eucariotas tienen una estructura de "tapa" en sus extremos 5', que desempena un papel importante en la traduccion. Por ejemplo, la tapa desempena un papel fundamental en el metabolismo del ARNm y se requiere en diversos grados para el procesamiento y la maduracion de un transcrito de ARN en el nucleo, el transporte del ARNm desde el nucleo al citoplasma, la estabilidad del ARNm y la traduccion eficiente del ARNm a la protema. La estructura de la tapa 5' esta involucrada en el inicio de la smtesis de protemas de ARNm eucariotas celulares y eucariotas y en el procesamiento y la estabilidad de ARNm in vivo (ver, por ejemplo, Shatkin, AJ, CELL, 9: 645-653 (1976); Furuichi, et al., NATURE, 266: 235 (1977); FEDERATION OF EXPERIMENTAL BIOLOGISTS SOCIETY LETTER 96: 1-11 (1978); Sonenberg, N., PROG. Nuc. ACID RES MOL BIOL, 35: 173-207 (1988)). Existen protemas de union a tapa espedficas que son componentes de la maquinaria requerida para el inicio de la traduccion de un ARNm (ver, por ejemplo, Shatkin, CELL, 40: 223-24 (1985); Sonenberg, N., PROG. Nuc. ACID RES MOL BIOL, 35: 173-207 (1988)). El lfmite del ARNm se reconoce por el factor de iniciacion de la traduccion eIF4E (Gingras, et al., ANN. REV. BIOCHEM. 68:913-963 (1999); Rhoads, RE, J. BIOL. CHEM. 274: 30337-3040, (1999)). La estructura de la tapa 5' tambien proporciona resistencia a la actividad de la exonucleasa 5' y su ausencia da como resultado una rapida degradacion del ARNm (vease, por ejemplo, Ross, J., MOL. BIOL. MED.

5: 1-14 (1988); Green, MR et al., CELL, 32: 681-694 (1983)). Dado que las transcripciones primarias de muchos genes celulares eucariotas y genes virales eucariotas requieren un procesamiento para eliminar las secuencias intermedias (intrones) dentro de las regiones codificantes de estas transcripciones, el beneficio de la tapa tambien se extiende a la estabilizacion de dicho pre-ARNm.

[0041] Se ha informado que los ARN tapados in vitro se traducen de manera mas eficiente que los transcritos no encapsulados en una variedad de sistemas de traduccion in vitro, como el lisado de reticulocitos de conejo o los sistemas de traduccion de germen de trigo (vease, por ejemplo, Shimotohno, K., et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. EE.UU., 74: 2734-2738 (1977); Paterson y Rosenberg, ⁿA^t URE, 279: 692 (1979)). Tambien se cree que este efecto se debe en parte a la proteccion del ARN de las exoribonucleasas presentes en el sistema de traduccion in vitro, asf como a otros factores.

[0042] Las estructuras de la capsula que se producen naturalmente comprenden una 7-metilguanosina que esta unida a traves de un puente trifosfato al extremo 5' del primer nucleotido transcrito, lo que resulta en una capsula de dinucleotido de m7G(5')ppp(5')N, donde N es cualquier nucleosido in vivo, la tapa se anade enzimaticamente. La tapa se agrega en el nucleo y es catalizada por la enzima transferasa de guanililo. La adicion de la tapa al extremo 5' terminal del ARN se produce inmediatamente despues del inicio de la transcripcion. El nucleosido terminal es tfpicamente una guanosina, y esta en la orientacion inversa a todos los otros nucleotidos, es decir, G(5')ppp(5')GpNpNp.

[0043] Una tapa comun para el ARNm producido por transcripcion in vitro es m7G(5')ppp(5')G, que se ha usado como la tapa dinucleotido en la transcripcion con polimerasa de ARN T7 o SP6 in vitro para obtener ARN que tienen una estructura de tapa en sus 5'-terminales. El metodo predominante para la smtesis in vitro de ARNm bloqueado emplea un dinucleotido preformado de la forma m7G(5')ppp(5')G ("m7GpppG") como iniciador de la transcripcion. Una desventaja de usar m7G(5')ppp(5')G, un dinucleotido pseudimetrico, es la propension del 3'-OH del resto G o m7G para servir como el nucleofilo iniciador para el alargamiento transcripcional. En otras palabras, la presencia de un 3'-OH en los restos m7G y G conduce a que hasta la mitad de los ARNm incorporen un lfmite en una orientacion incorrecta. Esto conduce a la smtesis de dos ARN isomericos de la forma m7G(5')pppG(pN)n y G(5')pppm7G(pN)n, en proporciones aproximadamente iguales, dependiendo de las condiciones ionicas de la reaccion de transcripcion. Las variaciones en las formas isomericas pueden tener un efecto adverso en la traduccion in vitro y son indeseables para un producto terapeutico homogeneo.04*

[0044] Hasta la fecha, la forma habitual de una tapa de dinucleotido sintetico usado en experimentos de traduccion in vitro es el analogo de tapa anti-inverso ("ARCA"), que generalmente es un analogo de tapa modificado en el que el grupo 2' o 3' OH se sustituye por -OCH3. ARCA y los analogos de la tapa triple metilada se incorporan en la orientacion hacia adelante. La modificacion qmmica de m7G en el grupo 2' o 3' OH del anillo de ribosa hace que la tapa se incorpore unicamente en la orientacion hacia adelante, aunque el grupo 2' OH no participa en el enlace fosfodiester. (Jemielity, J. et al., "Novel 'anti-reverse' cap analogs with superior translational properties", RNA, 9: 1108-1122 (2003)). Se ha establecido el procedimiento selectivo para la metilacion de guanosina en N7 y O-metilacion 3' y smtesis de difosfato 5' (Kore, A. y Parmar, G. NUCLEOSIDES, NUCLEOTIDES, AND NUCLEIC ACIDS, 25:337-340, (2006) y Kore, A. R., et al. NUCLEOSIDES, NUCLEOTIDES, AND NUCLEIC ACIDS 25 (3): 307-14, (2006).

[0045] La transcripcion de ARN usualmente comienza con un trifosfato de nucleosido (usualmente una purina, A o G). La transcripcion in vitro tipicamente comprende una polimerasa de ARN de fago tal como T7, T3 o SP6, una plantilla de ADN que contiene un promotor de polimerasa de fago, nucleotidos (ATP, GTP, CTP y UTP) y un tampon que contiene sal de magnesio. La smtesis de ARN con tapa incluye la incorporacion de un analogo de tapa (por ejemplo, m7GpppG) en la reaccion de transcripcion, que en algunas realizaciones se incorpora mediante la adicion de transferasa de guanililo recombinante. El exceso de m7GpppG a GTP (4:1) aumenta la oportunidad de que cada transcripcion tenga un lfmite de 5'. Los kits para el lfmite de los ARNm transcritos in vitro estan disponibles comercialmente, incluido el kit mMESSAGE mMACHINE® (Ambion, Inc., Austin, Tejas). Normalmente, estos kits produciran un 80% de ARN limitado a un 20% de ARN sin tapar, aunque los rendimientos totales de ARN son menores a medida que la concentracion de GTP se convierte en una limitacion de la velocidad a medida que se necesita GTP para el alargamiento de la transcripcion. Sin embargo, actualmente no hay tecnologfa/metodo disponible que permita la cuantificacion de la eficiencia de la limitacion sin alteraciones permanentes de los ARNm en una muestra.

[0046] Los metodos para estimar la eficiencia de la limitacion son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la polimerasa de ARN de T7 se puede incubar con un dinucleotido de tapa, los cuatro trifosfatos de ribonucleotido, [a-32P]GTP, y una plantilla corta de ADN en la que G es el primer ribonucleotido especificado despues del promotor (ver Grudzien, et al. al. "Novel cap analogs for in vitro synthesis of mRNA with high translation efficiency", r Na , 10: 1479­ 1487 (2004)). Cualquier nucleotido en el lado 5' de un residuo G adquiere un grupo 3'-fosfato marcado con 32P despues de la digestion con ARNsa T2 mediante la transferencia del vecino mas cercano. La cromatograffa de intercambio anionico se usa luego para resolver los nucleosidos marcados 3'-monofosfatos, resultantes de las posiciones internas en el ARN, de los productos 5'-terminales. Los productos 5'-terminales son de dos tipos. Los ARN no tapados producen guanosina 5'-trifosfato 3'-monofosfato (p3Gp*; en donde * indica el grupo fosfato marcado). Los ARN tapados producen varias estructuras 5'-terminales, dependiendo de la naturaleza del analogo de tapa utilizado (m7Gp3Gp* y Gp3m7Gp* cuando el analogo de tapa es m7Gp3G).

[0047] Sin embargo, un inconveniente importante de estos metodos es que toda la muestra se vuelve radioactiva o se destruye de otra manera, y por lo tanto no se puede usar en aplicaciones terapeuticas posteriores. Aunque en teona se podna realizar una reaccion de cuantificacion separada junto con una reaccion de smtesis terapeutica, tales arreglos son inadecuados. Las muestras simultaneas pero separadas son intrmsecamente variables debido a un error entre operadores y variaciones mmimas en las condiciones de reaccion. Esto es particularmente cierto para las cuantificaciones que usan una curva estandar, en la cual un valor para un punto en la curva estandar en un dfa dado puede no ser el mismo al dfa siguiente. Para obtener resultados precisos en el calculo de la eficiencia de limitacion, es deseable utilizar una muestra representativa tomada de la reaccion de smtesis terapeutica, una muestra para la cual la eficiencia de limitacion puede evaluarse en relacion con los controles y que es representativo de la eficacia de la limitacion en la reaccion de smtesis terapeutica.

[0048] Por lo tanto, la presente invencion proporciona metodos mejorados para cuantificar directamente la eficacia de la capacidad de cobertura del ARNm en una muestra representativa de almuotas a partir de una reaccion de smtesis in vitro. La invencion comprende el uso de un anticuerpo de union espedfica a la tapa en condiciones que permiten la formacion de un complejo entre el anticuerpo de union espedfica de la tapa y el ARNm cubierto. La formacion de un complejo entre el anticuerpo de union espedfica a la tapa y el ARNm cubierto permite la determinacion cuantitativa de la cantidad del complejo (es decir, los ARNm protegidos) en relacion con un control positivo de productos con lfmite o control negativo de productos sin tapar. En otras palabras, la union indica la cantidad de dianas de ARNm limitadas en la muestra y la eficiencia de limitacion en una reaccion de la cual se deriva la muestra. Por lo tanto, la etapa de determinar cuantitativamente la cantidad del complejo comprende realizar un ensayo de tipo ELISA en el que el anticuerpo de union espedfica a la tapa se une espedficamente a una cubierta de ARNm. (Consulte la Figura 1) La formacion del complejo se puede cuantificar mediante la adicion de un agente de deteccion espedfico para el anticuerpo de enlace espedfico de la tapa (por ejemplo, un anticuerpo anti-raton de cabra que se une a un anticuerpo anti-m7G de raton) y que produce una senal directamente proporcional a la cantidad de ARNm capsulado. El metodo descrito se puede usar para cuantificar la eficacia de la limitacion de una amplia variedad de especies de ARN, incluido el ARNm transcrito in vitro, el ARNm eucariotico aislado y el ARN viral. Las realizaciones de la invencion se pueden usar para cuantificar cualquiera de la estructura de la tapa y los analogos de la tapa descritos en el presente documento.049

[0049] Los metodos descritos en el presente documento son generalmente susceptibles de cuantificacion de cualquier tipo de lfmite de ARNm. En algunas realizaciones, la tapa tiene una estructura de formula I:

en donde B es una nucleobase, R1 se selecciona de un halogeno, OH y OCH3, R2 se selecciona de H, OH, y OCH3, R3 es CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3 o vado, R4 es NH2, R5 se selecciona de OH, OCH3 y un halogeno, n es 1, 2 o 3, y M es un nucleotido, es decir, la tercera base del ARNm. En realizaciones particulares, B es guanina, pero puede ser cualquier nucleobase. En algunas realizaciones, la tapa es m7G(5')ppp(5')G en la que esta presente un residuo 2'-O-metilo en el grupo 2' OH del anillo de ribosa de la base 1 (es decir, en la posicion R5 de Formula I).

[0050] En algunas realizaciones, la tapa tiene una estructura de formula II:

en donde R2 es H o CH3, R4 es NH2, R5 es OH u OCH3, R6 es H o CH3, y M es un nucleotido del ARNm.

[0051] Los analogos de tapa incluyen, pero no se limitan a, estructuras qmmicas seleccionadas del grupo que consiste en m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; analogos de tapa no metilados (por ejemplo, GpppG); analogo de tapa dimetilado (por ejemplo, m27GpppG), analogo de tapa trimetilado (por ejemplo, m227GpppG), analogos de tapa simetricos dimetilados (por ejemplo, m7Gpppm7G), o analogos de tapa inverso (por ejemplo, ARCA; m72OmeGpppG, m72'dGpppG, m73OmeGpppG, m73'dGpppG y sus derivados de tetrafosfato (ver, por ejemplo, Jemielity, J. et al., "Novel 'anti-reverse' cap analogs with superior translational properties”, RNA, 9: 1108-1122 (2003)).

[0052] En una realizacion preferida, la tapa es un 7-metilo guanilato ("m7G") unido a traves de un puente trifosfato al extremo 5' del primer nucleotido transcrito, dando como resultado m7G(5')ppp(5')N, donde N es cualquier nucleosido. Una realizacion preferida de una tapa m7G utilizada en realizaciones de la invencion es m7G(5')ppp(5')G.

[0053] En algunas realizaciones, el ARNm esta destapado. (Figura 2A) El ARNm sin tapar puede estar presente en una muestra (es decir, como resultado de un taponamiento incompleto en una reaccion de transcripcion in vitro) y/o puede usarse como control para cuantificar el nivel de especies sin tapar en una muestra. En algunas realizaciones, la tapa es una estructura Tapa0. (Figura 2B). Las estructuras de Tapa0 carecen de un residuo 2'-O-metilo de la ribosa unida a las bases 1 y 2. En algunas realizaciones, la tapa es una estructura de Tapa1. (Figura 2C) Las estructuras Tapa1 tienen un residuo 2'-O-metilo en la base 1. En algunas realizaciones, la tapa es una estructura de Tapa2. Las estructuras de Tapa2 tienen un residuo 2'-O-metilo unido a ambas bases 1 y 2.

[0054] Se conocen en la tecnica una variedad de analogos de tapa m7G, muchos de los cuales estan disponibles comercialmente. Estos incluyen los m7GpppG descritos anteriormente, asf como los analogos de tapa ARCA 3'-OCH3 y 2 -OCH3 (Jemielity, J. et al., RNA, 9: 1108-1122 (2003)). Los analogos de tapa adicionales para uso en realizaciones de la invencion incluyen analogos de tetrafosfato de dinucleosido bencilado en N7 (descritos en Grudzien, E. et al., RNA, 10: 1479-1487 (2004)), analogos de tapa de fosforotioato (descritos en Grudzien-Nogalska, E., et al., RNA, 13: 1745-1755 (2007)), y analogos de tapa (incluidos analogos de tapa biotinilados) descritos en las patentes de EE.UU. Nos 8.093.367 y 8.304.529.

Produccion de ARNm tapados

[0055] Los ARNm tapados adecuados para los metodos cuantitativos descritos en el presente documento pueden producirse mediante cualquier metodo conocido en la tecnica.

[0056] En algunas realizaciones, el ARNm tapado se produce por transcripcion in vitro, originalmente desarrollado por Krieg y Melton (METHODS ENZYMOL., 1987. 155:397-415) para la smtesis de ARN utilizando una polimerasa de fago de ARN. Tfpicamente, estas reacciones incluyen al menos una polimerasa de ARN de fago (T7, T3 o SP6), una plantilla de ADN que contiene un promotor de la polimerasa de fago, nucleotidos (ATP, CTP, GTP y UTP), y un tampon que contiene una sal de magnesio. Los rendimientos de la smtesis de ARN pueden optimizarse aumentando las concentraciones de nucleotidos, ajustando las concentraciones de magnesio e incluyendo pirofosfatasa inorganica (Patente de EE.UU. N° 5.256.555; Gurevich, et al., ANAL. BIOCHEM. 195: 207-213 (1991); Sampson, JR y Uhlenbeck, OC, PROC. NATL. ACAD. SCI. EE.UU. 85, 1033-1037 (1988); Wyatt, JR, et al., BIOTECHNIQUES, 11: 764-769 (1991)). Algunas realizaciones utilizan kits comerciales para la smtesis a gran escala de transcritos in vitro (por ejemplo, MEGAscript®, Ambion). El ARN sintetizado en estas reacciones generalmente se caracteriza por un nucleotido terminal 5' que tiene un trifosfato en la posicion 5' de la ribosa. Tfpicamente, dependiendo de la combinacion de polimerasa de ARN y promotor utilizada, este nucleotido es una guanosina, aunque puede ser una adenosina (ver por ejemplo, Coleman, TM, et al., NUCLEIC ACIDS RES., 32: e14 (2004)). En estas reacciones, los cuatro nucleotidos se incluyen tfpicamente en concentraciones equimolares y ninguno de ellos es limitante.

[0057] Algunas realizaciones de la invencion son reacciones discontinuas, es decir, todos los componentes se combinan y luego se incuban a aproximadamente 37°C para promover la polimerizacion del ARN hasta que finaliza la reaccion. Tfpicamente, una reaccion discontinua se usa por conveniencia y para obtener tanto ARN como sea necesario de tales reacciones para sus experimentos. En algunas formas de realizacion, se utiliza un sistema "alimentado por lotes" (ver, por ejemplo, JEFFREY A. KERN, BATCH AND FED-BATCH STRATEGIES FOR LARGE-SCALE PRODUCTION OF RNA BY IN VITRO TRANSACTION (Universidad de Colorado) (1997)) para aumentar la eficiencia de la reaccion de transcripcion in vitro. Todos los componentes se combinan, pero luego se agregan cantidades adicionales de algunos de los reactivos a lo largo del tiempo, como los nucleotidos y el magnesio, para tratar de mantener condiciones de reaccion constantes. Ademas, en algunas realizaciones, el pH de la reaccion se puede mantener en 7,4 al monitorearlo con el tiempo y agregar KOH segun sea necesario.

[0058] Para sintetizar un ARN tapado por transcripcion in vitro, se incluye un analogo de tapa (por ejemplo, n-7 metilo GpppG; es decir, m7GpppG) en la reaccion de transcripcion. En algunas realizaciones, la polimerasa de ARN incorporara el analogo de la tapa tan facilmente como cualquiera de los otros nucleotidos; es decir, no hay sesgo para el analogo de tapa. En algunas realizaciones, el analogo de tapa se incorporara en el extremo 5' por la enzima transferasa de guanililo. En algunas realizaciones, el analogo de la tapa se incorporara solo en el extremo 5' porque no tiene un trifosfato 5'. En algunas realizaciones que utilizan una polimerasa de ARN T7, T3 y SP6, el nucleotido 1 de sus promotores respectivos suele ser un residuo G y si tanto GTP como m7GpppG estan presentes en concentraciones iguales en la reaccion de transcripcion, entonces cada uno tiene la misma posibilidad de incorporarse en la posicion 1. En algunas realizaciones, m7GpppG esta presente en estas reacciones en concentraciones varias veces mas altas que el GTP para aumentar las posibilidades de que una transcripcion tenga un lfmite de 5'. En algunas realizaciones, se usa un kit mMESSAGE mMACHINE® (Cat. N° 1344, Ambion, Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, donde se recomienda que la relacion de tapa a GTP sea 4:1 (6 mM: 1,5 mM). En algunas realizaciones, a medida que aumenta la relacion del analogo de tapa a GTP en la reaccion, la proporcion de capturado a ARN sin lfmite aumenta proporcionalmente. Las consideraciones sobre la eficiencia de la limitacion deben equilibrarse con las consideraciones de rendimiento. El aumento de la proporcion de analogo de tapa a GTP en la reaccion de transcripcion produce rendimientos mas bajos de ARN total porque la concentracion de GTP se vuelve limitante cuando se mantiene constante la concentracion de tapa y gTp . Por lo tanto, el rendimiento final de ARN depende de la concentracion de GTP, que es necesaria para el alargamiento de la transcripcion. Los otros nucleotidos (ATP, CTP, UTP) estan presentes en exceso.

[0059] En realizaciones particulares, el ARNm se sintetiza por transcripcion in vitro de una plantilla de ADN plasmfdico que codifica un gen de eleccion. En algunas realizaciones, la transcripcion in vitro incluye la adicion de una estructura de tapa 5', Tapa1 (Figura 2C), que tiene un residuo 2'-O-metilo en el grupo 2' OH del anillo de ribosa de la base 1, por conjugacion enzimatica de GTP a traves de transferasa de guanililo. En algunas realizaciones, la transcripcion in vitro incluye la adicion de una estructura de tapa 5', Tapa0 (FIG. 2B), que carece del residuo 2'-O-metilo, por conjugacion enzimatica de GTP a traves de transferasa de guanililo. En algunas realizaciones, la transcripcion in vitro incluye la adicion de una tapa 5' de cualquiera de las estructuras de tapa descritas en este documento mediante conjugacion enzimatica de GTP a traves de transferasa de guanililo. En algunas realizaciones, se incorporo una cola poli(A) 3' de aproximadamente 200 nucleotidos de longitud (determinada por electroforesis en gel) a traves de la adicion de ATP junto con la polimerasa PoliA. En algunas realizaciones, la cola de poli(A) tiene una longitud de aproximadamente 100-250 nucleotidos. En algunas realizaciones, la cola de poli(A) tiene una longitud de aproximadamente 50-300 nucleotidos. En algunas realizaciones, los productos de transcripcion in vitro incluyen regiones no traducidas 5' y 3'.

Sustratos solidos para la captura de ARNm

[0060] En algunas realizaciones, el ARNm cubierto se captura en un sustrato solido antes de ponerse en contacto con una sustancia de union espedfica de la cubierta. Estas realizaciones no estan limitadas por el tipo de sustrato solido. El unico requisito de tales realizaciones es que el sustrato solido debe poder unirse directa o indirectamente a los ARNm con tapa, y en algunas realizaciones tambien a los ARNm no tapados. El sustrato puede ser una microplaca, perla magnetica, partmula, perla polimerica, resina cromatografica, papel de filtro, nitrocelulosa, diazocelulosa, vidrio, latex, poliestireno, cloruro de polivinilo, propileno, polietileno, dextrano, sefarosa, agar, almidon, nylon, gel de sflice, o hidrogel.

[0061] En algunas realizaciones, el soporte solido comprende un primer agente de captura que se une al ARNm que esta cubierto o no. En algunas realizaciones, el primer agente de captura es una secuencia polinucleotidica monocatenaria que corresponde (es decir, es complementaria con) una secuencia en el ARNm monocatenario. Por lo tanto, cuando se une a un soporte solido, el agente de captura del primer polinucleotido puede hibridar con el ARNm. En un ejemplo particular, el primer agente de captura es un tracto de politimidina (por ejemplo, oligo-dT) que es capaz de hibridar con la cola poliA del ARNm. En algunas realizaciones, una region del 3' no traducida puede ser dirigida por un primer agente de captura (por ejemplo, un oligonucleotido de secuencia complementaria). En algunas realizaciones, las regiones codificantes espedficas del gen del ARNm pueden ser dirigidas. El oligonucleotido de captura puede tener una longitud de aproximadamente 10-50 nucleotidos, por ejemplo, aproximadamente 10 nucleotidos, aproximadamente 15, nucleotidos, aproximadamente 20 nucleotidos, aproximadamente 25 nucleotidos, aproximadamente 30 nucleotidos o mas.

[0062] Una amplia variedad de secuencias de acido nucleico se pueden unir a un soporte solido para facilitar la captura. Del mismo modo, la manera en que los agentes de captura de polinucleotidos se unen directa o indirectamente al soporte solido no debe ser limitante de ninguna manera. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el agente de captura de polinucleotidos se puede sintetizar en la superficie de una manera adecuada para la desproteccion pero no la escision del soporte de smtesis (ver, por ejemplo, Weiler et al., NUCL. ACIDS RES., 25 (14): 2792-2799 (1997)). En algunas realizaciones, el agente de captura polinucleotfdico puede estar unido covalentemente a una superficie mediante la reaccion de un grupo funcional adecuado en las caractensticas de aislamiento con un grupo funcional de la superficie (ver, por ejemplo, Geiger et al., NUCLEOSIDES & NUCLEOTIDES 17 (9-11): 1717-1724 (1998)).

[0063] En una realizacion particular, el oligonucleotido del tracto de politimidina esta biotinilado y, por lo tanto, es capaz de unirse a un soporte solido recubierto de avidina o estreptavidina. Los oligonucleotidos del tracto de politimidina biotinilados estan disponibles comercialmente (por ejemplo, Promega, Invitrogen). Alternativamente, los oligonucleotidos del tracto de politimidina o cualquier otro agente de captura de polinucleotidos se pueden sintetizar y biotinilar a la medida de acuerdo con metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, los residuos de biotina-11-dUTP se pueden agregar enzimaticamente, usando la desoxinucleotidil transferasa terminal, al extremo 3' de un oligonucleotido sintetico (ver, por ejemplo, Riley, LK et al., DNA, 5: 333-337 (1986)). Una amplia variedad de soportes solidos recubiertos con avidina y estreptavidina tambien estan disponibles comercialmente (por ejemplo, microplacas recubiertas con estreptavidina de 96 pocillos Pierce; Thermo Scientific).

[0064] Los oligonucleotidos pueden sintetizarse por medios convencionales, por ejemplo, a traves de la qrnmica de la fosforamidita en un sintetizador comercial de ADN. En algunas realizaciones, los oligonucleotidos se sintetizan en un soporte en fase solida como lo describen Gryaznov y Letsinger, NUCLEIC ACIDS RESEARCH, 20: 3403-3409 (1992). Brevemente, despues de la desproteccion, el hidroxilo 5' de una desoxitimidina unido a un soporte a traves de un enlace succinilo estandar se fosforila por reaccion con cloro-(diisopropiletilamino)-metoxifosfina en un disolvente apropiado, como diclorometano/diisopropiletil-amina. Despues de la activacion con tetrazol, la timidina 5'-fosforilada se hace reaccionar con un 5'-tritil-O-3'-amino-3'-desoxinucleosido para formar un dfmero nucleosidotimidina en el que las fracciones de nucleosido estan unidas covalentemente por un enlace de fosforamidato. El resto del oligonucleotido se sintetiza mediante la qrnmica estandar de la fosforamidita. Despues de romper el enlace succinilo, el oligonucleotido con un grupo amino terminal 3' se genera al dividir el enlace fosforamidato mediante tratamiento acido, por ejemplo, acido acetico acuoso al 80% durante 18-20 horas a temperatura ambiente.

[0065] En algunas realizaciones, el primer agente de captura es una protema. Se puede usar cualquier protema que se enlace selectivamente al ARNm. En algunas realizaciones, una primera protema de agente de captura se une al extremo 3' del ARNm (por ejemplo, protemas de union a poli(A)). En otras realizaciones, las protemas del primer agente de captura se unen al extremo 5' del ARNm (por ejemplo, anticuerpos anti-m7G). Las protemas ejemplares que pueden funcionar como primeros agentes de captura incluyen protemas de union a poli(A) ("PABP"), anticuerpos anti-m7G y sus fragmentos de union a antfgeno, y factor de iniciacion eucariotico 4E (eIF-4E). Los metodos de captura dependiente de tapa de ARNm dependiente de tapa se han descrito anteriormente (Edery, I. et al., MOL ^c E^lL BI^o L, 15: 3363-3371 (1995)); la publicacion preconcedida de EE.UU. 2007/0281336) y puede adaptarse a las realizaciones de la invencion.06*

[0066] Metodos para la union qrnmica de los primeros agentes de captura (ya sean protemas o acidos nucleicos) a superficies de soporte solido pueden implicar la reaccion de un grupo nucleofilo (por ejemplo, una amina o tiol) del agente de captura a inmovilizar, con un grupo electrofilo en la superficie de soporte solido. Alternativamente, el nucleofilo puede estar presente en el soporte y el electrofilo (por ejemplo, acido carboxflico activado) puede estar presente en las caractensticas de anti-aislamiento. En algunas realizaciones, los primeros agentes de captura se pueden unir a un soporte solido mediante qmmica clic. En algunas realizaciones, los primeros agentes de captura se unen a traves de una 1,3-cicloadicion de una azida con un alquino, opcionalmente en presencia de un catalizador de cobre. Los metodos para utilizar la qmmica de clics son conocidos en la tecnica e incluyen los descritos por Rostovtsev et al., Angew. CHEM. INT. Ed. 41: 2596-99 (2002) y Sun et al., BIOCONJUGATE CHEM., 17: 52-57 (2006).

[0067] En algunas realizaciones de la invencion, los primeros agentes de captura se unen directamente a sustratos solidos mediante procedimientos de acoplamiento de amina N-etilo-N'-(dimetilaminopropilo)carbodiimida/N-hidroxisuccinimida (EDC /NHS) estandar. El acoplamiento de aminas introduce esteres de N-hidroxisuccinimida en la matriz superficial mediante la modificacion de los grupos carboximetil con una mezcla de N-hidroxisuccinimida (NHS) y N-etilo-N'-(dimetilaminopropilo)-carbodiimida (EDC). Estos esteres reaccionan espontaneamente con las aminas y otros grupos nucleofilos en el resto de captura para formar enlaces covalentes. Esta es una tecnica de funcionalizacion superficial altamente estable y comun. En algunas realizaciones, los primeros agentes de captura se unen directamente al sustrato solido utilizando un tampon de recubrimiento de NaHCO350 mM, pH 9,6.

[0068] Se dispone comercialmente de numerosos tipos de soportes solidos derivados con grupos amino, grupos acido carboxflico, isocianatos, isotianocianatos y grupos malimida, que pueden facilitar el acoplamiento del primer agente de captura al sustrato.

[0069] En algunas realizaciones en las que los primeros agentes de captura son protemas, las protemas pueden biotinilarse de acuerdo con metodos conocidos, y posteriormente unirse a sustratos solidos recubiertos con avidina o estreptavidina. Los reactivos y kits de marcado estan disponibles comercialmente para anticuerpos biotinilados espedficamente y otras protemas o peptidos con marcadores de biotina en aminas primarias (lisina y extremo N), el grupo reactivo mas abundante en la superficie de las protemas, para la deteccion de estreptavidina. Por ejemplo, las microplacas ELISA recubiertas con estreptavidina pueden recubrirse con una protema biotinilada que se une a la protema de union a poliA (PAIP2). En algunas realizaciones, el PAIP2 humano recombinante disponible en el mercado se biotinila mediante marcadores de biotina modificada con amina para biotinilar espedficamente el extremo C utilizando el EDC (reticulante de carbodiimida).

[0070] En algunas realizaciones, los primeros agentes de captura se etiquetan o modifican de otro modo para facilitar la union al sustrato. Por ejemplo, en realizaciones en las que el primer agente de captura es una protema (por ejemplo, PABP), la protema puede producirse de forma recombinante y etiquetarse. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las protemas del primer agente de captura se etiquetan con glutation S-transferasa (GST). En algunas realizaciones, los primeros agentes de captura estan etiquetados con FLAG, etiquetados con HA, etiquetados con His o etiquetados con myctag.

[0071] En ciertas realizaciones, no es necesario usar un primer agente de captura. Como se menciono anteriormente, las realizaciones de la invencion incluyen la incorporacion de analogos de tapa biotinilados en muestras de ARNm sintetizados in vitro para cuantificar. Vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 8.344.118, de Kore et al. Las muestras de ARNm bloqueadas biotiniladas pueden unirse directamente a sustratos solidos recubiertos de avidina o estreptavidina.

[0072] En algunas realizaciones, un segundo agente de captura esta unido directamente a un sustrato solido, que a su vez se une al primer agente de captura. En algunas realizaciones, el segundo agente de captura es estreptavidina o avidina, que puede unirse a un primer agente de captura biotinilado (por ejemplo, una protema de union a poli(A) biotinilada). En algunas realizaciones, el segundo agente de captura es la protema A o la protema G. En algunas realizaciones, el segundo agente de captura es el glutation. En algunas realizaciones, el segundo agente de captura es un sustrato recubierto de mquel, por ejemplo, Ni Sepharose, NTA-agarosa, His60 Ni, resina HisPur o resina TALON. En algunas realizaciones, el segundo agente de captura es un anticuerpo espedfico para el primer agente de captura; por ejemplo, un anticuerpo anti-HA o anti-myc.073

[0073] Se apreciara que la elegancia de los metodos descritos en este documento radica, en parte, en su adaptabilidad. Todas las configuraciones de las disposiciones descritas anteriormente se contemplan en la presente descripcion. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un ARNm es capturado por su extremo 3' (por ejemplo, por hibridacion de oligo-dT inmovilizado o protema de union a poliA a la cola poliA), y la presencia de una tapa se cuantifica mediante la formacion de un complejo entre una sustancia de union de tapa espedfica y el ARNm cubierto. En otras realizaciones, sin embargo, es posible capturar ARNm tapado por su extremo 5'; por ejemplo, mediante la formacion de un complejo entre el ARNm cubierto y una sustancia de union espedfica de la cubierta inmovilizada sobre un soporte solido, o si la cubierta esta biotinilada por interaccion con una placa recubierta con estreptavidina). La presencia de ARNm tapado se puede cuantificar luego mediante la adicion del primer agente de deteccion que se une directamente a una cola poliA expuesta (es decir, una protema de union a poliA puede funcionar como un agente de deteccion en lugar de un agente de captura). La union del primer agente de captura a la cola poliA puede visualizarse mediante la adicion de un segundo agente de captura que genera una senal detectable (por ejemplo, un anticuerpo anti-PABP conjugado con HRP).

Sustancia de union de capa espedfica

[0074] Una "sustancia de union de tapa espedfica", como se usa en el presente documento, hace referencia a cualquier sustancia (protema, molecula pequena, etc.) que se une selectivamente a capsulas de ARNm o analogos de capsulas como se describio anteriormente. Es deseable que una sustancia de union espedfica de tapa adecuada para la invencion se una espedficamente o selectivamente a una capsula de ARNm o analogo de tapa (por ejemplo, las descritas en este documento), y que el evento de union sea detectable.

[0075] En algunas realizaciones, una sustancia de union de tapa espedfica es una protema. En realizaciones particulares, la protema es el factor de iniciacion eucariotico 4E ("eIF-4E"). eIF-4E se ha utilizado en la purificacion de ARNm basada en tapa (ver, por ejemplo, Edery, I. et al., " An efficient strategy to isolate full-length cDNAs based on an mRNA cap retention procedure (CAPture)", MOL. CELL. BIOL., 15: 3363-3371 (1995)), y sus propiedades de union espedficas de tapa son adaptables para uso en la presente invencion.

[0076] De acuerdo con la invencion, una sustancia de union de tapa espedfica es un anticuerpo espedfico de la tapa que incluye, pero no se limita a, anticuerpos que se unen espedficamente a m7G, m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; analogos de tapa no metilados (por ejemplo, GpppG); analogo de tapa dimetilada (por ejemplo, m27GpppG), analogo de tapa trimetilada (por ejemplo, m227GpppG), analogos de tapa simetricos dimetilados (por ejemplo, m7Gpppm7G), o analogos de tapa inversa (por ejemplo, ARCA; OmeGpppG, m72'dGpppG, m73OmeGpppG, m73’d GpppG y sus derivados tetrafosfato). Se pueden generar anticuerpos espedficos de la tapa usando metodos estandar. Los ejemplos de anticuerpos anti-m7G se describen en detalle a continuacion.

[0077] Otras protemas de union espedficas de tapa que pueden utilizarse en los metodos descritos en este documento incluyen la subunidad de protema de union a tapa nuclear, la subunidad de protema de union a tapa nuclear, el complejo de union de tapa nuclear, etc.

[0078] En algunas realizaciones, las protemas de union espedficas de la tapa se modifican (por ejemplo, se biotinilan o se marcan) para facilitar la union a un soporte solido. Por ejemplo, los ensayos de union de tapa basados en GST-eIF-4E son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, McKracken, S. et al., "’-capping enzymes are targeted to pre-mRNA by binding to the phosphorylated carboxy-terminal domain of RNA polymerase II”, Genes & Dev., 11: 3306-3318 (1997)).

[0079] Como se menciono anteriormente, la determinacion cuantitativa de la cantidad del complejo entre la sustancia de union de tapa espedfica y el ARNm cubierto comprende la medicion de una senal detectable asociada con la formacion del complejo. En algunas realizaciones, la senal detectable esta directamente asociada con la sustancia de union de tapa espedfica. En algunas realizaciones, en donde la senal detectable esta asociada indirectamente con la sustancia de union de tapa espedfica a traves de un agente secundario que se une a la sustancia de union de tapa espedfica (ver, por ejemplo, la discusion de ELISA a continuacion, donde el agente secundario es un anticuerpo contra la sustancia de union de tapa espedfica). Independientemente de si la senal detectable esta directa o indirectamente asociada con la sustancia de union de tapa espedfica, la senal detectable puede ser una senal fluorescente, una senal colorimetrica o una senal radiactiva. En general, la intensidad de la senal es directamente proporcional a la cantidad aproximada de objetivos de ARNm limitados en la muestra. Las senales tambien pueden seleccionarse del grupo que consiste en ficoeritrina, alexa 532, estreptavidina-ficoeritrina y estreptavidina-Alexa 532. En algunas realizaciones, la senal se detecta por actividad enzimatica (es decir, peroxidasa de rabano picante o fosfatasa alcalina), quimioluminiscencia, radioactividad, emision de infrarrojos, transferencia de energfa de resonancia de fluorescencia (FRET) o cualquier otro metodo conocido por un experto en la tecnica.

Anticuerpos de tapa anti-m7G

[0080] En algunas realizaciones, una sustancia de union de tapa espedfica es un anticuerpo anti-m7G. Los anticuerpos anti-m7G son conocidos en la tecnica y estan disponibles comercialmente. Los anticuerpos anti-m7G para uso en realizaciones de la invencion incluyen los descritos en Meredith, RD y Erlanger, BF, " Isolation and characterization of rabbit anti-m7G-5’P antibodies of high apparent affinity", NUCLEIC ACIDS RES., 6: 2179-2191 (1979). En realizaciones particulares, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de raton anti-m7G-tapa (por ejemplo, disponible comercialmente de Synaptic Systems).

[0081] Los anticuerpos adicionales contra la tapa de m7G y los analogos de tapa estan incluidos dentro del alcance de la presente invencion y pueden generarse por metodos bien conocidos por los expertos en la tecnica. Como se usa en este documento, los anticuerpos anti-m7G incluyen cualesquiera anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen espedficamente a cualquier epftopo de las capas m7G del ARNm. Tal como se usa en el presente documento, el termino "anticuerpos" pretende incluir inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas que son espedficamente reactivos a la protema o peptido designado, o fragmentos de las mismas. Por ejemplo, el termino "anticuerpos" incluye anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos de dominio unico (por ejemplo, anticuerpos de dominio unico de tiburon (por ejemplo, IgNAR o fragmentos de los mismos)), y fragmentos de anticuerpos siempre que exhiban la actividad biologica deseada. Los anticuerpos adecuados tambien incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de raton, anticuerpos de cabra, anticuerpos de conejo, anticuerpos humanos, anticuerpos primatizados, anticuerpos quimericos, anticuerpos biespedficos, anticuerpos humanizados, anticuerpos conjugados (es decir, anticuerpos conjugados o fusionados con otras protemas, radiomarcas, citotoxinas), y fragmentos de anticuerpos.

[0082] Como se usa en este documento, un "fragmento de anticuerpo" incluye una porcion de un anticuerpo intacto, tal como, por ejemplo, la region variable o de union a antigeno de un anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; triacuerpos; tetracuerpos; anticuerpos lineales; moleculas de anticuerpos de cadena unica. El termino "fragmento de anticuerpo" tambien incluye cualquier protema sintetica o geneticamente modificada que actua como un anticuerpo al unirse a un antfgeno espedfico para formar un complejo. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos aislados, fragmentos "Fv", que consisten en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moleculas polipeptfdicas recombinantes de cadena simple en las que las regiones variables de la cadena ligera y pesada estan conectadas por un conector peptfdico ("protemas ScFv"), y unidades de reconocimiento mmimas que consisten en los residuos de aminoacidos que imitan la region hipervariable.

[0083] Los anticuerpos anti-m7G pueden generarse usando metodos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los protocolos para la produccion de anticuerpos estan descritos por Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, (1988). Tfpicamente, los anticuerpos se pueden generar en ratones, ratas, cobayas, hamsters, camellos, llamas, tiburones u otros huespedes apropiados. Alternativamente, los anticuerpos pueden producirse en pollos, produciendo moleculas de IgY (Schade et al., ALTEX 13 (5): 80-85 (1996)). En algunas realizaciones, los anticuerpos adecuados para la presente invencion son anticuerpos de primate subhumano. Por ejemplo, las tecnicas generales para producir anticuerpos terapeuticamente utiles en babuinos se pueden encontrar, por ejemplo, en Goldenberg et al., Publicacion de patente internacional n° WO 91/11465 (1991), y en Losman et al., INT. J. CANCER, 46: 310 (1990). En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando metodos de hibridoma (Milstein y Cuello, NATURE, 305: 537-40 (1983))). En algunas realizaciones, los anticuerpos monoclonales tambien pueden prepararse mediante metodos recombinantes (vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 4.166.452).

[0084] Muchas de las dificultades asociadas con la generacion de anticuerpos monoclonales por inmortalizacion de celulas B se pueden superar mediante ingeniena y expresion de fragmentos de anticuerpos en E. coli, utilizando la visualizacion de fagos. Para garantizar la recuperacion de los anticuerpos monoclonales de alta afinidad, una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria debe contener un tamano de repertorio grande. Una estrategia tfpica utiliza ARNm obtenido a partir de linfocitos o celulas de bazo de ratones inmunizados para sintetizar ADNc utilizando transcriptasa inversa. Los genes de las cadenas pesada y ligera se amplifican por separado mediante PCR y se ligan en vectores de clonacion de fagos. Se producen dos bibliotecas diferentes, una que contiene los genes de la cadena pesada y otra que contiene los genes de la cadena ligera. El ADN del fago se afsla de cada biblioteca, y las secuencias de las cadenas pesada y ligera se ligan y se empaquetan para formar una biblioteca combinatoria. Cada fago contiene un par aleatorio de ADNc de cadenas pesadas y ligeras y, tras la infeccion de E. coli, dirige la expresion de las cadenas de anticuerpos en las celulas infectadas. Para identificar un anticuerpo que reconoce el antfgeno de interes, la biblioteca de fagos se coloca en placas y las moleculas de anticuerpos presentes en las placas se transfieren a los filtros. Los filtros se incuban con un antfgeno marcado radiactivamente y luego se lavan para eliminar el exceso de ligando no unido. Un punto radioactivo en el autorradiograma identifica una placa que contiene un anticuerpo que se une al antfgeno. Los vectores de clonacion y expresion que son utiles para producir una biblioteca de fagos de inmunoglobulina humana se pueden obtener, por ejemplo, de STRATAGENE Cloning Systems (La Jolla, CA).

[0085] Se puede emplear una estrategia similar para obtener scFv de alta afinidad. Ver, por ejemplo, Vaughn et al., NATURE BlOTECH., 14: 309314 (1996). Se puede construir una biblioteca scFv con un gran repertorio mediante el aislamiento de genes V de donantes humanos no inmunizados utilizando cebadores de PCR correspondientes a todas las familias de genes Vh, Vk y Va conocidas. Despues de la amplificacion, las agrupaciones Vk y Va se combinan para formar una agrupacion. Estos fragmentos se ligan en un vector fagemido. El enlazador scFv, (Gly4, Ser)3, luego se liga en el fagemido aguas arriba del fragmento Vl. Los fragmentos Vh y enlazador-VL se amplifican y ensamblan en la region JH. Los fragmentos VH-enlazadores-VL resultantes se ligan en un vector fagemido. La biblioteca de fagemidos se puede panoramizar utilizando filtros, como se describio anteriormente, o usando inmunotubos (Nunc; Maxisorp). Se pueden lograr resultados similares construyendo una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria a partir de linfocitos o celulas de bazo de conejos inmunizados y expresando las construcciones de scFv en P. pastoris. Ver, por ejemplo, Ridder et al., BIOTECHNOLOGY, 13: 255 260 (1995). Ademas, tras el aislamiento de un scFv apropiado, se pueden obtener fragmentos de anticuerpos con mayores afinidades de union y tasas de disociacion mas lentas mediante procesos de maduracion de afinidad, como la mutagenesis CDR3 y la combinacion de cadenas. Ver, por ejemplo, Jackson et al., BR. J. CANCER, 78: 181 188 (1998); Osbourn et al., IMMUNOTECHNOLOGY, 2: 181 196 (1996).

[0086] Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un peptido que codifica una unica CDR. Los peptidos CDR ("unidades de reconocimiento mmimo") se pueden obtener construyendo genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interes. Tales genes se preparan, por ejemplo, utilizando la reaccion en cadena de la polimerasa para sintetizar la region variable a partir del ARN de celulas productoras de anticuerpos. Ver, por ejemplo, Larrick et al., METHODS: A COMPANION TO METHODS IN ENZYMOLOGY 2: 106 (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies", en MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), paginas 166 179 (Cambridge University Press 1995); y Ward et al., " Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," en MONOCLONAL ANTIBODIES: p RiNc IPLES AND APPLICATIONS, Birch et al., (eds.), paginas 137185 (Wiley-Liss, Inc. 1995).

[0087] En algunas realizaciones, los anticuerpos adecuados para la invencion pueden incluir anticuerpos humanizados o humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos son Igs quimericas, cadenas o fragmentos de Ig (como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de Abs que se unen al antigeno) que contienen una secuencia minima derivada de Ig no humana. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas residuos de aminoacidos introducidos de una fuente no humana. Estos residuos de aminoacidos no humanos a menudo se denominan residuos "importados", que normalmente se toman de un dominio variable "importado". La humanizacion se realiza sustituyendo las regiones determinantes de la complementariedad de roedores (CDR) o las secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano (Riechmann et al., NATURE, 332: 323-7 (1988); Verhoeyen et al., SCIENCE, 239: 1534-6, (1988)). Dichos anticuerpos "humanizados" son Abs quimericos (Patente de EE.UU. N° 4.816.567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En algunas realizaciones, los anticuerpos humanizados son tfpicamente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR estan sustituidos por residuos de sitios analogos en Abs de roedor. Los anticuerpos humanizados incluyen Igs humanas (anticuerpo receptor) en los cuales los residuos de una CDR del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como el raton, rata o conejo, que tienen la especificidad, afinidad y capacidad. En algunos casos, los residuos no humanos correspondientes sustituyen a los residuos de la estructura Fv de la Ig humana. Los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las CDR o secuencias marco importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente al menos uno, y tfpicamente dos, dominios variables, en los cuales la mayona, si no todas, las regiones CDR corresponden a las de una Ig no humana y la mayor parte si no todas las regiones de FR son las de una secuencia de consenso de Ig humana.

[0088] El uso de anticuerpos anti-m7G de alta afinidad es importante para la especificidad cuantitativa. Por lo tanto, en algunas realizaciones, un anticuerpo anti-m7G o un fragmento del mismo adecuado para la presente invencion tiene una afinidad de union de o mayor que aproximadamente 500 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 10pM, 50pM, 10pM, 1pM, 500fM, 400fM, 300fM, 200fM, 100fM, 50fM, 10fM, 1fM. En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-m7G 0 un fragmento del mismo adecuado para la presente invencion tiene una afinidad de union que vana entre aproximadamente 500 nM y 1 fM, entre 500 nM y 10 fM, entre 500 nM y 100 fM, entre 500 nM y 1pM, entre 10 nM y 1 fM, entre 10 nM y 100fM, entre 10nM y 1pM, entre 1nM y 1fM, entre 1nM y 100fM, entre 1nM y 500fM, entre 1nM y 1pM, entre 1nM y 10pM, entre 1nM y 50pM, entre 1nM y 100pM, entre 1nM y 100pM.

Cuantificacion de ARNm basada en ELISA

[0089] En algunas realizaciones, el metodo de la invencion comprende un ensayo basado en ELISA que usa un primer agente de captura (por ejemplo, un oligo poli-dT marcado con biotina) unido a un sustrato solido (por ejemplo, una placa de 96 pocillos recubierta con estreptavidina o bien 384 pocillos u otro). El primer agente de captura se utiliza para unir el ARNm sintetizado in vitro. Una vez unida, una sustancia de union de tapa espedfica se dirige al resto de la tapa m7G como su antfgeno. En algunas realizaciones basadas en ELISA, la sustancia de union de tapa espedfica primaria es un anticuerpo anti-m7G (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de raton anti-m7G). Se utiliza un anticuerpo marcado secundario para la visualizacion/cuantificacion (vease la Figura 1). En algunas realizaciones, la sustancia de union de tapa espedfica es otra protema de tapa espedfica (por ejemplo, eIF-4E), y el anticuerpo secundario es espedfico de la protema de tapa espedfica. En algunas realizaciones, el anticuerpo secundario es o proporciona un agente de deteccion; por ejemplo, posee actividad enzimatica para generar un sustrato detectable. Se puede sustituir y aplicar una variedad de agentes cromoforicos/fluorescentes. Se puede usar una capsula biotinilada sintetizada personalizada (m7GpppG-Biotina) como control positivo. Esto representa un nuevo metodo para la cuantificacion directa de la porcion lfmite en un constructo de ARNm reden sintetizado que es crucial para la caracterizacion adecuada. Los protocolos para ensayos de ELISA y la optimizacion de las condiciones son conocidos en la tecnica; vea, por ejemplo, Thermo Scientific, "Elisa technical guide and protocols", TECH TIP # 65 (2010) (disponible en www.piercenet.com/files/TR0065-ELISA-guide.pdf).

[0090] El agente secundario es un anticuerpo espedfico para la sustancia de union a tapa selectiva. En algunas realizaciones, el agente secundario esta marcado radiactivamente o con fluorescencia. En realizaciones preferidas, el agente secundario comprende una enzima que convierte un sustrato en un producto detectable. En algunas realizaciones, la enzima es fosfatasa alcalina o peroxidasa de rabano picante. El producto puede ser cromogenico, quimifluorescente o quimioluminiscente. En particular, las realizaciones, el sustrato se selecciona de los grupos que consisten en sal disodica de p-pitrofenilo fosfato (PNPP), 2,2'-Azinobis[3-etilbenzotiazolina-6-acido sulfonico]-sal de diamonio (ABTS), o dihidrocloruro de fenilendiamina (OPD) o 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). En realizaciones particulares, el producto es cromogenico y absorbe luz a 370-652 nanometros. Como se describio anteriormente, la intensidad de la senal es proporcional a la cantidad aproximada de dianas de ARN limitadas capturadas en el sustrato.

[0091] Los controles se utilizan para cuantificar la cantidad de ARNm tapado. En algunas realizaciones, el control comprende una muestra de ARNm con una cantidad predeterminada de ARNm con lfmite. En algunas realizaciones, el control comprende una cantidad predeterminada de tapa sintetizada. En algunas formas de realizacion, se utiliza una tapa biotinilada sintetizada personalizada (m7GpppG-Biotina) como control positivo.

[0092] En algunas realizaciones, los ensayos se hacen cuantitativos estableciendo una curva de calibracion mediante metodos bien conocidos por los expertos en la tecnica. En otras palabras, el alcance de la reaccion inmunologica se puede determinar cualitativamente o semicuantitativamente mediante la comparacion visual de la densidad optica de muestras desconocidas con estandares conocidos o cuantitativamente mediante comparacion espectrofotometrica con curvas estandar preparadas utilizando varias muestras de concentracion de tapa conocida. Por ejemplo, la cuantificacion se puede realizar haciendo un conjunto de patrones de tapa m7G o calibradores que retienen el epftopo del anticuerpo primario y pueden unirse a un sustrato solido. Estos estandares o calibradores pueden diluirse en serie, y se utiliza el valor de la senal resultante de cada concentracion ensayada de estandar o calibrador para generar una curva estandar; trazar la concentracion de estandares o calibradores con tope frente a los valores de senal resultantes. Una vez que se establece una curva cuantitativa estandar, se usa un ensayo para determinar los niveles de ARNm tapado en una muestra al trazar la senal resultante en la curva estandar.

Kits

[0093] La presente descripcion proporciona ademas kits que comprenden diversos reactivos y materiales utiles para llevar a cabo metodos de acuerdo con la presente invencion. Los procedimientos cuantitativos descritos en este documento pueden ser realizados por laboratorios de diagnostico, laboratorios experimentales o laboratorios comerciales. La descripcion proporciona kits que se pueden utilizar en estas diferentes configuraciones.

[0094] Por ejemplo, los materiales y reactivos para cuantificar la eficacia de la limitacion del ARNm en una muestra de ARNm al proporcionar una sustancia de union de tapa espedfica segun los metodos de la invencion se pueden ensamblar juntos en un kit. En ciertas realizaciones, un kit comprende al menos uno o mas reactivos que forman espedficamente un complejo con una cubierta de ARNm, opcionalmente agentes para detectar la formacion del complejo, e instrucciones para usar el kit de acuerdo con un metodo de la invencion.

[0095] Cada kit puede comprender preferiblemente el reactivo que hace que el procedimiento sea espedfico. Por lo tanto, para detectar/cuantificar la eficacia de la limitacion del ARNm, el reactivo que forma espedficamente un complejo con la tapa puede ser un anticuerpo. Los kits tambien pueden comprender agentes de deteccion o secundarios (por ejemplo, anticuerpos conjugados con HRP) que detectan la formacion del complejo. Los kits tambien pueden comprender sustratos solidos, conjugados opcionalmente con un segundo agente de captura para el aislamiento de ARNm (por ejemplo, placas de 96 pocillos biotiniladas). Los kits tambien pueden comprender primeros agentes de captura, por ejemplo, protemas u oligonucleotidos que interactuan espedficamente con el ARNm.

[0096] Los kits u otros artfculos de fabricacion de acuerdo con la descripcion pueden incluir uno o mas recipientes para contener diversos reactivos. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas (por ejemplo, jeringas precargadas), ampollas. El contenedor puede estar formado por una variedad de materiales tales como vidrio o plastico.

[0097] En algunas realizaciones, los kits de la presente descripcion pueden incluir niveles de control adecuados o muestras de control para determinar los niveles de control como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, los kits de la descripcion pueden incluir instrucciones para usar el kit de acuerdo con uno o mas metodos de la invencion y pueden comprender instrucciones para la transcripcion in vitro y la tapa.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Sintesis de ARNm

[0098] Se sintetizaron ARNm de luciferasa de luciernaga (FFL) y eritropoyetina humana (ePO) mediante transcripcion in vitro a partir de una plantilla de ADN plasmfdica que codifica cada gen respectivo. La transcripcion in vitro incluyo la adicion de una estructura de tapa 5', Tapal, que tiene un residuo 2'-O-metilo en el grupo 2' OH del anillo ribosa de la base 1, por conjugacion enzimatica de GTP a traves de transferasa de guanililo. Se incorporo una cola poli(A) 3' de aproximadamente 200 nucleotidos de longitud (segun lo determinado por electroforesis en gel) a traves de la adicion de ATP junto con la polimerasa de poliA (consulte las condiciones de reaccion detalladas a continuacion). El producto de la transcripcion in vitro incluyo las regiones no traducidas 5' y 3', que se representan como X e Y, respectivamente, en las siguientes secuencias:

ARNm de la eritropoyetina humana (ePO) (SEQ ID NO: 1)

XiAU G G G G G U G CACG AAU G U CCU G CCU G G CU G U G G CU U CU CCU G U CCCU

GCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCA

U CU G U G ACAG CCG AG U CCU G G AG AG G U ACCU CU U G G AG G CCAAG G AG G C

C G A G A A U A U C A C G A C G G G C U G U G C U G A A C A CU G C A G C U U G A A U G A G A A U

A U C A C U G U C C CA G A C A C C A A A G U U A A U U U C U A U G CC U G G A A G A G G A U G G

AGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUC

G G AAG CU G U CCU G CG G G G CCAG G CCCU G U U G G U CAACU CU U CCCAG CCG

U G G G A G CCCCU G CA G CU G CAU G U G G A U A A A G CCG U CA G U G G CCU U CG CA

G C C U C A C C A C U C U G CU U CG G G CU CU G G G A G CCCA G A A G G A A G CCA U CU C

CCCUC C A G AUGCG GCC U C AGC U GCU CC ACUC CG A A C A A U C ACU G CU G A C

ACUUU CC GC A AAC U CUUC CGAG U CUACUCC AAUUU CCU CCG GG G AAAG C

U G A A G C U G U A C A C A G G G G A G G C C U G C A G G A C A G G G G A C A G A U G A Yi

ARNm de luciferasa de luciernaga optimizado por codon (FFL) (SEQ ID NO: 2)

X 2A U G G A A G A U G CCA A A A A CA U U A A G A A G G G CCCA G CG CCAU U CU A CCC

A C U C G A A G A C G G G A C C G C C G G C G A G C AG C U G C A C AA A G C C A U G A A G C G C

U ACG CCCU G G U G CCCG G CACCAU CG CCU U U ACCG ACG CACAU AU CG AG G

UGG ACAU U ACCU ACG CCG AG U ACU U CG AG AU G AG CG U U CG G CU G G CAG A

AG CU AU G AAG CG CU AU G G G CU G AAU ACAAACCAU CG G AU CG U G G U G U G C

AGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGUGCCCUGUUCA

UCG G U G U G G CU G U G G CCCCAG CU AACG ACAU CU ACAACG AG CG CG AG CU

G CU G AACAG CAU G G G CAU CAG CCAG CCCACCG U CG U AU U CG U G AG CAAG

A A A G G G C U G C A A A A G A U C C U C A A C G U G C A A A A G A A G C U A C C G A U C A U A C

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GGUCGU GCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUG

CAAG ACUAUAAG AUUCAAUCU G CCCUG CUG G U G CCCACACUAU UUAG CTJ

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UGGCGCAGU AG GCAAGGU GGUGCCCUU CUUCGAGGCUAAGGU GGUGGAC

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A A A C G CU CU CAU CG ACAAG G ACG G CU G G CU G CACAG CG G CG ACAU CG CC

UACUG G G ACG AG G ACG AG CACU U CU U CAU CG U G G ACCG G CU G AAG AG CC

UGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAU

CCUG CUG CAACACCCCAACAU CU U CG ACG CCG G G G U CG CCG G CCU G CCCG

ACGACGAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGG

UAAAACCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUU

AC AAC CG CCAAGAAGCUGCGCG G UGGUG UUGU GUU CG UG G ACG AG GUG C

CUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCU

CAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUAY2

[0099] Las secuencias de UTR 5' y 3' para X1/Y1 y X2/Y2 fueron las siguientes:

Xi =

GGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGIJGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCG

UGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG (SEQ ID NO; 3)

X2 = GGGAUCCUACC (SEQ ID NO: 4)

Yi =

CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGLJUGCC

ACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC (SEQ ID NO: 5)

y2 = UUUGAAUU (SEQ ID NO: 6)

[0100] La smtesis de ARNm se llevo a cabo en condiciones completas sin ARNasa. Todos los tubos, viales, puntas de pipeta, pipetas, tampones, etc. se requirieron sin nucleasas. El ARN mensajero se sintetizo a partir de una plantilla de ADN linealizado. Para producir el constructo de pre-cursor de ARNm deseado (IVT), una mezcla de ~100 ug de linea ADN linealizado, rNTP (3,33 mM), DTT (10 mM), polimerasa de T7 ARN, inhibidor de ARNsa, pirofosfatasa y tampon de reaccion (10x, se preparo Hepes 800 mM (pH 8,0), espermidina 20 mM, MgCl2250 mM, pH 7,7) con agua libre de ARNasa hasta un volumen final de 2,24 ml. La mezcla de reaccion se incubo a 37°C durante entre 20 y 120 minutos. Una vez completado, la mezcla se trato con DNasa I durante 15 minutos adicionales y se detuvo en consecuencia.

[0101] El producto de ARNm purificado de la etapa IVT mencionada anteriormente se desnaturalizo a 65°C durante 10 minutos. Porseparado, se mezclan porciones de GTP (20 mM), S-adenosilo metionina, inhibidor de la ARNsa, 2'-O-metiltransferasa y transferasa de guanililo (10x, Tris-HCl 500 mM (pH 8,0), KCl 60 mM, MgCl212,5 mM) hasta una concentracion final de 8,3 ml. Tras la desnaturalizacion, el ARNm se enfrio en hielo y luego se anadio a la mezcla de reaccion. La solucion combinada se incubo a 37°C durante 20-90 minutos. Al finalizar, se agregaron partes alfcuotas de ATP (20 mM), poliA polimerasa y tampon de reaccion de colas (10x, Tris-HCl 500 mM (pH 8,0), NaCl 2,5 M, MgCl2100 mM) y la mezcla de reaccion total se incubo adicionalmente a 37°C durante unos 20-45 minutos. Una vez completado, la mezcla de reaccion final se apaga y se purifica en consecuencia.

Ejemplo 2: Cuantificacion de la eficiencia de la limitacion utilizando el ELISA de captura de oligo-dT basado en biotina-estreptavidina

[0102] Este ejemplo ilustra un metodo ELISA ejemplar para cuantificar la eficiencia de la limitacion. Una realizacion ejemplar se representa en la FIG. 1. Una microplaca de estreptavidina disponible comercialmente se lavo 3 veces con tampon de lavado (Tween 20 al 0,05%, PBS 0,01 M a pH 7,2) y se seco. Se anadio oligo dT20 5' de biotina comercialmente disponible a 1-5 pmol/pocillo en un volumen final de 100 pl y se incubo a temperatura ambiente (TA) durante una hora. La placa se lavo tres veces con tampon de lavado y se bloqueo durante 1 h con 320 ml de tampon de bloqueo (PBS 0,01 M, BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,15%).

[0103] Las muestras de ARN mensajero se desnaturalizaron durante 10 minutos a 94°C y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se anadieron a cada pocillo 100 pl de tampon de hibridacion (4xSSC, He PeS 20 mM, EDTA 2 mM, Tween 20 al 0,15%) que contema 20 pmol-1 pmol de ARNm y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavo tres veces con tampon de lavado que contema EDTA 2 mM.

[0104] Se aplico un anticuerpo primario, la tapa anti-m7G monoclonal de raton (dilucion 1:2000-1:25000 en alfcuotas de 100 ml) a cada pocillo de la placa y se incubo a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. La placa se lavo tres veces con tampon de lavado que contema EDTA 2 mM. Despues del lavado, se agregaron a cada pocillo 100 pl de un anticuerpo secundario, anticuerpo conjugado con HRP anti-raton de cabra (dilucion 1:40.000), y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavo tres veces con tampon de lavado que contema EDTA 2 mM.

[0105] Para detectar la interaccion de los anticuerpos primarios y secundarios, se preparo solucion de sustrato cromogenico TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se agrego a cada pocillo en almuotas de 100 |jl y se incubo durante 15 min a temperatura ambiente. La reaccion se detuvo agregando 100 j l de H2SO42N.

[0106] El TMB produjo un color azul reconocible al detectar HRP. Luego de la adicion del H2SO4, el color cambio a amarillo con la absorbancia maxima a 450 nm, que se leyo utilizando un lector de placa Molecular Devices.

[0107] Se encontro que un pocillo con absorbancia a 450 nm indicaba la presencia de un ARNm tapado. La medicion cuantitativa del ARNm tapado por muestra se determina a partir de los valores medios de absorbancia de la muestra, seguidos de la interpolacion de una curva estandar (representacion grafica de la concentracion frente a la absorbancia) generada a partir de controles positivos diluidos en serie de la pequena molecula de tapa m7G conjugada unida a placas recubiertas con estreptavidina y detectadas por el anticuerpo monoclonal de tapa m7G de raton (sistemas sinapticos).

Ejemplo 3: Cuantificacion de la eficacia de la limitacion utilizando el ELISA de captura basado en proteinas de union a PoliA

[0108] Este ejemplo ilustra otro metodo ELISA ejemplar utilizando placas ELISA recubiertas con protema de union a poliA. Espedficamente, una placa de ELISA se reviste con una protema de union a poliA ("PABP") a 1 jg/ml usando un tampon de recubrimiento (50 mM de NaHCO3, pH 9,6). La placa se lava posteriormente y se bloquea con tampon de bloqueo (1xPBS, Tween 20 al 0,05%, BSA al 2%) y se incuba durante una hora a temperatura ambiente. La placa se lava tres veces con tampon de lavado (1xPBS, Tween 20 al 0,05%).

[0109] Las muestras de ARNm se desnaturalizan durante 10 minutos a 94°C y se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las muestras luego se diluyen a una concentracion de aproximadamente (20 pmol-1 jmol) en tampon de hibridacion (4xSSC, HEPES 20 mM, EDTA 2 mM, Tween 20 al 0,15%) que contiene Ar N. Se anaden aproximadamente 100 j l a cada pocillo y se incuban durante una hora a temperatura ambiente.

[0110] Se aplica un anticuerpo primario, la tapa anti-m7G monoclonal de raton (dilucion 1:2000-1:25000 en partes almuotas de 100 jl) a cada pocillo de la placa y se incuba a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. La placa se lava tres veces con tampon de lavado que contiene EDTA 2 mM, seguido de la adicion de un anticuerpo secundario conjugado con HRP Fc IgG anti-raton de cabra (Pierce 31439) a una dilucion de 1:40.000 e incubacion a temperatura ambiente durante 1 hora. Despues de lavar 3x con tampon de lavado, se prepara TMB y se agrega como anteriormente. Despues de 15 minutos de incubacion a temperatura ambiente, la reaccion se detuvo mediante la adicion de H2SO42N y la placa se leyo a 450 nm como anteriormente.

[0111] En realizaciones alternativas, se utilizan microplacas disponibles comercialmente sobre las que se ha recubierto previamente el anticuerpo espedfico para PAlP2. Se agregan 100 j l de PAIP2 recombinante humano disponible comercialmente (Cusabio®) a 0,1 jg/ml - 10 jg/ml por pocillo usando un tampon de recubrimiento (50 mM NaHCO3, pH 9,6), seguido de una incubacion de una hora a temperatura ambiente. El PAIP2 recombinante humano presente esta unido por el anticuerpo inmovilizado. Despues de eliminar cualquier sustancia no unida, se agregan muestras de ARNm a los pozos como se indico anteriormente para limitar la cuantificacion de la eficiencia. Se aplica un anticuerpo primario, la tapa anti-m7G monoclonal de raton (dilucion 1:2000-1:25000 en almuotas de 100 jl) a cada pocillo de la placa y se incuba a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 hora. La placa se lava tres veces con tampon de lavado que contiene EDTA 2 mM. Despues del lavado, se anaden a cada pocillo 100 j l de un anticuerpo secundario, anticuerpo conjugado con HRP anti-raton de cabra (dilucion 1:40.000), y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lava tres veces, seguido de la adicion de la solucion de sustrato cromogenico TMB. Se detiene el desarrollo de color, se mide la intensidad del color y se cuantifica la cantidad de ARNm tapado utilizando una curva estandar como la anterior.

Ejemplo 4: Evaluacion de la limitacion del ARNm 5’ en la produccion de proteinas in vivo

[0112] En este ejemplo, evaluamos el impacto de la limitacion del ARNm 5' en la produccion de proteinas in vivo y su impacto potencial en la eficacia de la terapia basada en ARNm. Espedficamente, evaluamos el impacto de la limitacion de 5' en la produccion in vivo de alfa-galactosidasa A (alfa-Gal A), que es deficiente en la enfermedad de Fabry. La enfermedad de Fabry es una enfermedad de almacenamiento lisosomal hereditaria ligada al X caracterizada por insuficiencia renal grave, angioqueratomas y anomalfas cardiovasculares, que incluyen agrandamiento ventricular e insuficiencia de la valvula mitral. La enfermedad de Fabry tambien afecta el sistema nervioso periferico, causando episodios de dolor agonizante y ardiente en las extremidades. La enfermedad de Fabry es causada por una deficiencia en la enzima alfa-galactosidasa A (alfa-Gal A). La alfa-Gal A es la glicohidrolasa lisosomal que escinde los restos terminales alfa-galactosilo de diversos glicoconjugados. La enfermedad de Fabry produce un bloqueo del catabolismo del glicosfingolfpido neutro, la ceramida trihexosida (CTH) y la acumulacion de este sustrato enzimatico dentro de las celulas y en el torrente sangumeo.

[0113] El ADNc y el gen que codifica la alfa-Gal A humana, GLA, se han aislado y secuenciado. La alfa-Gal A humana se expresa como un polipeptido de 429 aminoacidos, de los cuales los 31 aminoacidos N-terminales son el peptido senal. La enzima humana se ha expresado en celulas de ovario de hamster chino (CHO) (Desnick et al., Patente de EE.UU. N° 5.356.804; loannou et al., J. CELL BIOL. 119: 1137 (1992)); y celulas de insecto (Calhoun et al., WO 90/11353).

[0114] Los individuos que padecen la enfermedad de Fabry pueden tratarse mediante terapia de sustitucion enzimatica con alfa-Gal A humana (vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N° 6.458.574). Los enfoques adicionales que modulan o complementan la expresion de la deficiencia de alfa-Gal A, y por lo tanto mejoran la deficiencia subyacente, senan utiles en el desarrollo de terapias apropiadas para los trastornos asociados. Tales enfoques incluyen metodos de administracion intracelular de acidos nucleicos (por ejemplo, ARNm de GLA) que son capaces de corregir defectos geneticos existentes y/o proporcionar funciones beneficiosas a una o mas celulas diana. Despues de la administracion exitosa a las celulas y tejidos diana, las composiciones y los acidos nucleicos transfectan la celula diana y los acidos nucleicos (p. ej., ARNm de GLA) se pueden traducir al producto genico de interes (p. ej., Alfa-GAL A) o pueden modular/regular de otra manera la presencia o expresion del producto genetico de interes. Tales metodos han sido descritos previamente; vease, por ejemplo, la publicacion de la subvencion de Estados Unidos 2011/0244026.

[0115] En este ejemplo, evaluamos el impacto de la limitacion de 5' en la produccion de protemas in vivo. El ARNm de GLA humano se sintetizo por transcripcion in vitro de una plantilla de a Dn plasirndica que codifica el gen, que fue seguida por la adicion de una estructura de tapa 5', ya sea Tapa0 o Tapa1 (Fechter, P. et al., J. GEN. VIROLOGY, 86: 1239-1249 (2005)). Tambien se agrego una cola poli(A) 3' de aproximadamente 200 nucleotidos de longitud, determinada por electroforesis en gel. Las regiones no traducidas 5' y 3' presentes en el ARNm de GLA se representan como X e Y en la SEQ ID NO: 7. como se indica a continuacion:

ARNm de alfa-galactosidasa (GLA) (SE Q ID NO: 7):

x 2a u g c a g c u g a g g a a c c c a g a a c u a c a u c u g g g c u g c g c g c u u g c g c u u c g c u u

CCUGGCCCUCGUUUCCUGGGACAUCCCUGGGGCUAGAGCACUGGACAAUGGAUUG

GCAAGGACGCCUACCAIJGGGCIJGGCUGCACUGGGAGCGCUIJCAIJGUGCAACCIJUG

AC U GCCAGOAAG A GCCAGAUUCCUGCAUCAGUGAGA A GCUCUUCAUGGAGAUGG

CAGAGCUCAUGGUCUCAGAAGGCUGGAAGGAUGCAGGtTUAUGAGUACCUCUGCA

UUGAUGACUGUUGGAUGGCUCCCCAAAGAGAUUCAGAAGGCAGACUUCAGGCAG

ACCCUCAGCGCUUUCCUCAUGGGAUUCGCCAGCUAGCUAAUUAUGUUCACAGCAA

AGGACUGAAGCUAGGGAUUUAUGCAGAUGUUGGAAAUAAAACCUGCGCAGGCUU

CCCUGGGAGUUUUGGAUACUACGACAUUGAUGCCCAGACCUUUGCUGACUGGGG

AGUAGAUCUGCUAAAAUUUGAUGGUUGUUACUGUGACAGUUUGGAAAAUUUGGC

AGAUGGUUAUAAGCACAUGUCCUUGGCCCUGAAUAGGACUGGCAGAAGCALJUGU

GUACUCCUGUGAGUGGCCUCUUUAUAUGUGGCCCUUUCAAAAGCCCAAUUAUACA

GAAAUCCGACAGUACUGCAAUCACUGGCGAAAUUUUGCUGACAUUGAUGAUUCC

UGGAAAAGUAUAAAGAGUAUCUUGGACUGGACAUCUUUUAACCAGGAGAGAAUU

GUUGAUGUUGCUGGACCAGGGGGUUGGAAUGACCCAGAUAUGUUAGUGAUUGGC

AACUUUGGCCUCAGCUGGAAUCAGCAAGUAACUCAGAUGGCCCUCUGGGCUAUCA

UGGCUGCUCCUUUAUUCAUGUCUAAUGACCUCCGACACAUCAGCCCUCAAGCCAA

AGCU CUCCUU CAGG AU A AGG ACGU AAUUG CC AU CAAU CAGGACCCCUU GGGC AAG

CAAGGGUACCAGCUUAGACAGGGAGACAACUUUGAAGUGUGGGAACGACCUCUC

UCAGGCUUAGCCUGGGCUGUAGCUAUGAUAAACCGGCAGGAGAUUGGUGGACCU

CGCUCUUAUACCAUCGCAGUUGCUUCCCUGGGUAAAGGAGUGGCCUGUAAUCCUG

CCUGCUUCAUCACACAGCUCCUCCCUGUGAAAAGGAAGCUAGGGUUCUAUGAAUG

GACUUCAAGGUUAAGAAGUCACAUAAAUCCCACAGGCACUGUUUUGCUUCAGCU

AGAAAAUACAAUGCAGAUGUCAUUAAAAGACUUACUUUAAY2

X = GGGAUCCUACC (SEQ ID NO: 4)

Y = UUUGAAUU (SEQ ID NO: 6)

[0116] En algunas realizaciones (SEQ ID NO: 8) tambien se utiliza una alfa-galactosidasa optimizada con codon con insercion de PoliA (CO-GLA-PolyA):

X,AUGCAGCUGAGGAACCCAGAGCUeCAUCUCGGAUGUGCACUGGCACUUAGAlJU

UCUCGCGCUUGUGUCGUGGGACAUCCCCGGAGCCAGGGCGCUGGAUAAUGGGCUC

GCCCGGACUCCCACAAUGGGUUGGCUGCACUGGGAGCGCUUUAUGUGCAAUCUGG

ACUGCCAGGAAGAGCCCGAUAGCUGUAUUUCGGAGAAGCUCUUCAUGGAAAUGG

CGGAGIJUGAUGGUGUCCGAAGGGUGGAAGGAUGCGGGAUAUGAGUAUCUGUGUA

UCGAUGACUGCUGGAUGGCACCGCAGCGAGAUUCGGAGGGGCGAUUGCAGGCCG

ACCCUCAGCGCUUCCCUCAUGGAAUUCGGCAGCUGGCCAACUACGUACACUCAAA

AGGACUUAAGUUGGGGAUCUACGCGGACGUCGGUAAUAAGACAUGCGCUGGGUU

CCCGGGGAGCUUCGGAUACUAUGAUAUUGAUGCCCAGACCUUCGCGGACUGGGGA

GUGGACUUGCUUAAGUUUGAUGGUUGUUACUGUGACUCAUUGGAAAACUUGGCG

GAUGGGUAUAAACAUAUGUCCUUGGCCUUGAAUCGGACAGGGCGGUCGAUCGUC

UACAGCUGCGAAUGGCCUUUGUAUAUGUGGCCGUUCCAGAAACCCAACUACACCG

AAAUUCGCCAGUAUUGCAAUCACUGGAGAAACUUCGCCGAUAUCGACGAUUCGU

GGAAAUCAAUCAAGUCCAUCCUCGACUGGACGUCCUUCAACCAAGAGAGAAUCGU

AGAUGUGGCCGGACCGGGAGGAUGGAACGACCCUGAUAUGCUUGUAAUUGGCAA

CUUUGGACUCUCGIJGGAACCAGCAAGUAACGCAAAUGGCACUCUGGGCUAUCAUG

GCUGCGCCCCUGUUCAUGUCAAACGACCUCAGGCACAUCUCGCCGCAGGCGAAAG

CCUUGCUUCAAGAUAAGGACGUCAUCGCGAUUAAUCAGGACCCGCUGGGGAAGCA

GGGCUAUCAGCUUAGACAGGGCGACAAUUUUGAGGUCUGGGAGCGACCCCUGAG

CGGACUCGCAUGGGCGGUGGCAAUGAUCAAUAGGCAGGAAAUUGGUGGGCCGAG

GUCGUACACUAUCGCCGUCGCGUCGUUGGGAAAGGGUGUGGCGUGUAAUCCAGC

GUGCUUUAUCACCCAACUGCUGCCCGUCAAGCGCAAACUGGGUUUUUACGAAUGG

ACGAGCAGACUUCGCUCACACAUUAACCCAACGGGUACGGUGUUGCUCCAGCUCG

AGAAUACAAUGCAAAUGUCACUUAAAGAUUUGCUCUGACGGGUGGCAUCCCUGU

GACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCA

GCCUUGUCCUAAUAAAAIJUAAGUUGCAUCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

[0117] El ARNm de GLA se almaceno en agua a una concentracion final de 1 mg/ml a -80°C hasta el momento de su uso. Todas las concentraciones de ARNm se determinaron mediante absorcion (Ymax 260 nm).

[0118] Las formulaciones adecuadas para la administracion in vivo de ARNm de GLA TapaO, ARNm de GLA Tapal, ARNm de GLA y otros controles incluyen una mezcla de lfpidos de multiples componentes de proporciones variables que emplean uno o mas lfpidos cationicos, lfpidos auxiliares y lfpidos PEGilados. Los Kpidos cationicos pueden incluir (pero no exclusivamente) DOTAP (1,2-dioleil-3-trimetilamonio propano), DODAP (1,2-dioleil-3-dimetilamonio propano), DOTMA (1,2-di-O-octadecenilo-3-trimetilamonio propano), DLinDMA (Heyes, J.; Palmer, L.; Bremner, K.; MacLachlan, I., "Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encap- sulated nucleic acids" J. CONTR. REL., 107: 276-287 (2005)), DLin-KC2-DMA (Semple, SC et al. "Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery", NATURE BIOTECH., 28: 172-176 (2010)), C12-200 (Love, KT et al. "Lipid-like materials for low-dose in vivo gene silencing", PROC NATL ACAD SCI. EE.UU., 107: 1864-1869 (2010), HGT4003, ICE, a base de dialquilamino, a base de imidazol, guanidina basados en, etc. Los lfpidos auxiliares pueden incluir (pero no exclusivamente) DSPC (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DPPC (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina), DOPE (1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DPPE (1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DMPE (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina), DOPG (,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo(1'-rac-glicerol)), colesterol, etc. Los lfpidos PEGilados pueden incluir (pero no exclusivamente) una cadena de poli(etilen)glicol de hasta 5 kDa de longitud unida covalentemente a un lfpido con cadena(s) de alquilo de longitud C6-C20. La encapsulacion lipfdica del ARNm se calculo realizando el ensayo de Ribogreen con y sin la presencia de Triton-X 100 al 0,1%. Los tamanos de partfculas (dispersion dinamica de la luz (DLS)) y los potenciales zeta se determinaron utilizando un instrumento Malvern Zetasizer en 1x PBS y soluciones KCl 1 mM, respectivamente.

[0119] Se mezclaron partes alfcuotas de soluciones etanolicas de 50 mg/ml de C12-200, DOPE, Chol y DMG-PEG2K y se diluyeron con etanol hasta un volumen final de 3 ml. Por separado, se preparo una solucion acuosa tamponada (citrato 10 mM/NaCl 150 mM, pH 4,5) de ARNm de CO-GLA (Tapa 0 o Tapa 1) a partir de una reserva de 1 mg/ml. La solucion lipfdica se inyecto rapidamente en la solucion de ARNm acuosa y se agito para producir una suspension final en etanol al 20%. La suspension de nanopartfculas resultante se filtro, se diafiltro con 1x PBS (pH 7,4), se concentro y se almaceno a 2-8°C. Concentracion final = 0,72 mg/ml de ARNm de GLA (encapsulado). Zave = 85,5 nm (Dv(50) = 61,9 nm; Dv(90) = 113 nm).

[0120] Para determinar si el tipo de tapa incorporado en el ARNm de GLA influyo en la produccion de protemas cuando el ARNm se encapsulo en un lfpido basado en C12-200, se realizo un experimento en el que los ratones de tipo salvaje (CD-1) se inyectaron con especies ARNm de GLA tapadas y posteriormente monitoreadas para la produccion de protema ^g L^a humana. Las especies de ARNm limitadas inclman Tapa0 (no metiladas en la posicion 2'-O) y Tapal (metiladas 2'-O).

[0121] Los estudios anteriores se realizaron utilizando ratones macho CD-1 de aproximadamente 6-8 semanas de edad al comienzo de cada experimento. Las muestras se introdujeron mediante una inyeccion unica en la vena de la cola de un bolo de una dosis total equivalente de 30 microgramos de ARNm de GLA, EPO, FIX o AIAT encapsulado. Las concentraciones sericas de protema GLA se determinaron a las seis horas. Todos los animales se sometieron a eutanasia por asfixia con CO26 horas despues de la administracion de la dosis (+ 5%), seguido de una toracotomfa y una extraccion terminal de sangre cardfaca. La sangre completa (volumen maximo obtenible) se recogio mediante puncion cardfaca en animales sacrificados en tubos separadores de suero, se dejo coagular a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, se centrifugo a 22°C 5°C a 9.300 g durante 10 minutos, y se extrajo el suero. Para la recogida provisional de sangre a las seis horas, se recogieron aproximadamente 40-50 pl de sangre completa mediante puncion de la vena facial o recorte de la cola. Las muestras recogidas de animales sin tratamiento se utilizaron como niveles de referencia de GLA para comparar con animales de estudio. El tngado y el bazo de cada raton se recogieron, se repartieron en tres partes y se almacenaron en formalina tamponada neutra al 10% o se congelaron rapidamente y se almacenaron a 80°C.

[0122] La produccion de protema GLA humana se midio mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas ("ELISA"). Se siguieron los procedimientos estandar de ELISA empleando IgG anti-Replagal G-188 de oveja como el anticuerpo de captura con IgG anti-Replagal de conejo como el anticuerpo secundario (deteccion). Se utilizo IgG anti-conejo de cabra conjugada con peroxidasa de rabano picante (HRP) para la activacion de la solucion de sustrato 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). La reaccion se detuvo utilizando H2SO42N despues de 20 minutos. La deteccion se controlo mediante absorcion (450 nm) en un instrumento Molecular Device Flex Station. Se utilizaron suero de raton no tratado y protema Replagal® humana como controles negativos y positivos, respectivamente.

[0123] Como se ilustra en la FIG. 3, despues de la inyeccion intravenosa de especies limitadas de ARNm de CO-GLA cargadas en las nanopartmulas lipfdicas basadas en C12-200, se pudo detectar un nivel sustancial de protema GLA humana en el suero de raton dentro de las 6 horas. En particular, hubo un aumento estadfsticamente significativo en la produccion de protemas cuando se emplea ARNm con una estructura de Tapa1 en comparacion con la de una estructura de Tapa0. Estos resultados demostraron la importancia de tener la capacidad de caracterizar y cuantificar la eficacia de la limitacion del proceso de smtesis del ARNm.

Ejemplo 5: ELISA de tapa usando placas recubiertas de Oligo dT

[0124] Este ejemplo demuestra el uso de placas ELISA recubiertas con oligo dT en ensayos de cuantificacion de tapado. Espedficamente, se analizo el oligo-T20 potenciado con LNA (exiqon) para determinar su eficacia de union en las placas de amino inmovilizador Nunc (Thermo Scientific) en un rango de 0,1 pmol/pocillo a 500 pmol/pocillo en 100 pl de tampon de recubrimiento (NaHCO350 mM pH 9,6). Las placas se incubaron durante 1,5 horas girando a temperatura ambiente, se lavaron 3 veces con 200 pl de tampon de lavado (1xPBS, Tween 20 al 0,05%) y se secaron sobre toallas de papel. La capacidad de union del ARNm se ensayo con ARNm taponado/no tapado en un rango de 7,8 ng/pocillo a 500 ng/pocillo en 100 pl de tampon de union (fosfato sodico 50 mM, pH 7,0) y se incubo durante 90 minutos rotando a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con 200 pl de tampon de lavado y se secaron sobre toallas de papel. Se conjugaron 2 pl de anticuerpo anti-tapa (Sysy) directamente con HRP usando el kit de marcaje IgGi de raton peroxidasa de rabano picante Zenon (Invitrogen) en un volumen final de 20 pl. El anticuerpo conjugado con HRP se mezclo a 0,8 pl/ml en tampon de bloqueo (1x PBS, 2% BSA, 0,05% Tween 20) y se anadio a 100 pl/pocillo y se incubo durante 1 hora rotando a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con 200 pl de tampon de union y se secaron sobre toallas de papel. La solucion de sustrato TMB EIA se preparo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se anadieron 100 pl de esto a cada pocillo y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reaccion se detuvo despues de 10 minutos agregando 100 pl de H2SO42N y se leyo usando un lector de placa Molecular Devices a 450 nm. FIG. 4 muestra resultados ejemplares de la cuantificacion de la limitacion en ARNm con lfmite y sin lfmite medido por ELISA. La senal detectada se deriva de la interaccion del anticuerpo anti-tapa con la estructura de tapa en las muestras de ARN.

[0125] Este ejemplo demuestra que la cuantificacion de la cobertura se puede optimizar utilizando placas ELISA recubiertas con oligo dT como sustratos de captura.

Ejemplo 6: Cuantificacion de la eficiencia de limitacion usando ELISA de captura de Oligo dT

[0126] En este ejemplo, demostramos ademas que la eficacia de la limitacion en varias muestras de ARNm se puede cuantificar de manera efectiva utilizando el ELISA de captura de oligo dT.

[0127] Espedficamente, las placas de captura de ARNm recubiertas con oligo dT se prepararon uniendo oligo-T20 potenciado con LNA de 50 pmol (exiqon) en 100 pl de tampon de revestimiento por pocillo en placas de amino inmovilizador Nunc (Thermo Scientific). Las placas se incubaron durante 1,5 horas girando a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con 200 pl de tampon de lavado (1xPBS, Tween 20 al 0,05%) y se secaron sobre toallas de papel. Oligo recubierto de metilo N7 [N7MeGppp]-AAAAAAAAA AAAAA se sintetizo (biosmtesis) para las mediciones de curva estandar. Se agregaron oligo recubierto con metilo N7 de 64 ng y ARNm recubierto con 64 ng comercialmente con una cola de poliA de 200 pb o en casa con una cola de poliA de 500 pb por pocillo en 100 j l de tampon de union a ARN (fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0) y se incubaron durante 90 minutos girando a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con 200 j l de tampon de lavado y se secaron sobre toallas de papel. Se conjugaron 2 j l de anticuerpo anti-tapa (Sysy) directamente con HRP utilizando el kit de marcaje IgG1 de raton peroxidasa de rabano picante Zenon (Invitrogen) en un volumen final de 20 jl. El anticuerpo conjugado con HRP se mezclo a 0,8 jl/m l en tampon de bloqueo (1x PBS, 2% BSA, 0,05% Tween 20) y se anadio a 100 jl/pocillo y se incubo durante 1 hora rotando a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con 200 j l de tampon de union y se secaron sobre toallas de papel. La solucion de sustrato TMB EIA se preparo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se anadieron 100 j l de esto a cada pocillo y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reaccion se detuvo despues de 10 minutos agregando 100 j l de H2SO42N y se leyo usando un lector de placa Molecular Devices a 450 nm. FIG. 5 muestra resultados ejemplares de la cuantificacion del lfmite en varias muestras de ARNm (por ejemplo, cierto ARNm interno de luciferasa de luciernaga (FFL), ARNm de FFL comercial y un ARN con lfmite de metilo N7 estandar) medido por ELISA.

[0128] Este ejemplo demuestra que se puede usar ELISA (tal como el ELISA de captura de oligo dT) para cuantificar de manera efectiva la eficacia de la cobertura en muestras de ARNm.

Equivalentes y alcance

[0129] Los expertos en la tecnica reconoceran, o seran capaces de determinar, utilizando solo la experimentacion rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones espedficas descritas en este documento. El alcance de la presente invencion no pretende limitarse a la descripcion anterior, sino que se establece en las reivindicaciones adjuntas.

[0130] Cuando los elementos se presentan como listas, por ejemplo, en formato de grupo de Markush, debe entenderse que cada subgrupo de los elementos tambien se divulga, y cualquier elemento puede ser eliminado del grupo. Debe entenderse que, en general, cuando se hace referencia a la invencion, o aspectos de la invencion, que comprenden elementos, caractensticas, etc. particulares, ciertas realizaciones de la invencion o aspectos de la invencion consisten, o consisten esencialmente en, tales elementos, caractensticas, etc. Para fines de simplicidad, dichas realizaciones no se han expuesto espedficamente en el presente documento. Se observa que el termino "que comprende" pretende ser abierto y permite la inclusion de elementos o pasos adicionales.

[0131] Donde se dan los intervalos, se incluyen los puntos finales. Ademas, debe entenderse que, a menos que se indique lo contrario o sea evidente en el contexto y se entienda de alguien con experiencia en la tecnica, los valores que se expresan como intervalos pueden asumir cualquier valor o sub-intervalo espedfico dentro de los rangos de estado en diferentes realizaciones de la invencion, a la decima parte de la unidad del lfmite inferior del intervalo, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

[0132] Las publicaciones discutidas anteriormente y en todo el texto se proporcionan unicamente para su descripcion antes de la fecha de presentacion de la presente solicitud. Ninguna parte de este documento debe interpretarse como una admision de que los inventores no tienen derecho a anticipar dicha descripcion en virtud de una descripcion previa.

[0133] Los expertos en la tecnica apreciaran facilmente que lo anterior representa simplemente ciertas realizaciones preferidas de la invencion. Se pueden hacer varios cambios y modificaciones a los procedimientos y composiciones descritas anteriormente.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para cuantificar la eficacia de la limitacion del ARNm, que comprende:

transcribiendo ARNm in vitro;

tomar una muestra alfcuota representativa de la reaccion de smtesis in vitro;

proporcionar una sustancia de union de tapa espedfica en condiciones que permiten la formacion de un complejo entre la sustancia de union de tapa espedfica y el ARNm cubierto, en donde la sustancia de union de tapa espedfica es un anticuerpo espedfico de la tapa; y

determinar cuantitativamente la cantidad del complejo en la muestra alfcuota representativa en comparacion con un control, cuantificando asf la eficacia de la capacidad de lfmite del ARNm para determinar su calidad como ingrediente farmaceutico activo (API) en un producto terapeutico final, en el que la etapa de determinar cuantitativamente la cantidad del complejo comprende realizar un ensayo ELISA.

2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la tapa tiene una estructura de formula I:

en donde,

B es una nucleobase, opcionalmente en donde la nucleobase es guanina; R1 se selecciona de un halogeno, OH y OCH3;

R2 se selecciona de H, OH y OCH3;

R3 es CH3, CH2CH3, CH2CH2CH3 o vado;

R4 es NH2;

R5 se selecciona de OH, OCH3 y un halogeno;

n es 1,2 o 3; y

M es un nucleotido del ARNm.

3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que la tapa es una tapa m7G con una estructura de formula II:

en donde,

R2 es H o CH3;

R4 es NH2;

R5 es OH u OCH3;

R6 es H o CH3; y

M es un nucleotido del ARNm.

4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la sustancia de union de tapa espedfica es un anticuerpo anti-m7G.

5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de determinar cuantitativamente la cantidad de complejo comprende medir una senal detectable asociada con el complejo, opcionalmente en donde

(i) la senal detectable esta directamente asociada con la sustancia de union de tapa espedfica, o

(ii) la senal detectable esta asociada indirectamente con la sustancia de union de tapa espedfica a traves de un agente secundario que se une a la sustancia de union de tapa espedfica, opcionalmente en donde el agente secundario es un anticuerpo secundario,

opcionalmente en donde la senal detectable es una senal fluorescente o una senal colorimetrica, opcionalmente en donde la senal fluorescente se genera al convertir un sustrato enzimatico en un producto cromogenico, quimifluorescente o quimioluminiscente por una enzima asociada directa o indirectamente con el enlace espedfico de la tapa sustancia, opcionalmente en donde el sustrato enzimatico se selecciona de los grupos que consisten en sal disodica de p-pitrofenilo fosfato (PNPP), 2,2'-azinobis[3-etilbenzotiazolina-6-acido sulfonico]-sal de diamonio (ABTS), o-fenilendiamina dihidrocloruro (OPD) y 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), opcionalmente en donde la enzima es fosfatasa alcalina o peroxidasa de rabano picante.

6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el control comprende (i) una muestra de ARNm con una cantidad predeterminada de ARNm con lfmite, o (ii) una cantidad predeterminada de tapa sintetizada.

7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la cuantificacion de la eficacia de limitacion del ARNm comprende (i) cuantificar la cantidad absoluta de ARNm con lfmite en la muestra de ARNm y/o (ii) cuantificar el porcentaje de ARNm con lfmite en la muestra de ARNm.

8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el metodo comprende ademas una etapa de captura del ARNm en un sustrato, opcionalmente en el que el ARNm es capturado por (i) un oligo poli-T que se une a la cola poli-A del ARNm o (ii) una protema o anticuerpo de union a poli-A, opcionalmente en donde el sustrato es una microplaca, perla magnetica, partmula, perla polimerica, resina cromatografica, papel de filtro, nitrocelulosa, diazocelulosa, vidrio, latex, poliestireno, policloruro de vinilo, propileno, polietileno, dextrano, sefarosa, agar, almidon, nailon, gel de sflice o hidrogel, opcionalmente en el que el sustrato esta recubierto con avidina o estreptavidina, en donde opcionalmente el oligo poli-T o la protema de union a poli-A o el anticuerpo esta biotinilado.

9. Un metodo para fabricar ARNm que comprende una etapa de cuantificacion de la eficacia de limitacion del ARNm de acuerdo con un metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. El metodo de la reivindicacion 9, en el que el metodo comprende una etapa de ajuste de una condicion de fabricacion basada en el resultado de la cuantificacion de la eficacia del lfmite del ARNm, opcionalmente en la que la etapa de cuantificacion se realiza antes de liberar un lote de ARNm.