CN112153986B - 用于递送rna的脂质基制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供适于递送RNA的组合物，所述组合物包含：(i)包含在液相中的颗粒，其中颗粒包含RNA和脂质组合物，和(ii)1,2丙二醇。脂质组合物包含：(i‑a)胆固醇衍生物、(i‑b)磷酸甘油酯、和(i‑c)聚乙二醇化磷酸甘油酯。进一步提供了用于制备所述组合物的方法，以及固体组合物，所述固体组合物能够通过冷冻其中颗粒包含在液相中的组合物获得。

Description

用于递送RNA的脂质基制剂
技术领域
本发明涉及脂质基组合物，其可以用于将RNA有效给予至对象。
背景技术
各种脂质基制剂是本领域已知的，其可以用作核酸的载体，从而允许核酸被递送至患者的身体，例如A.C.Silva等人,Current Drug Metabolism,16,2015,3-16以及其中引用的文献。在临床研究中已成功测试通过吸入进行pDNA递送的制剂是GL67A(E.Alton等人,Efficacy and Mechanism Evaluation,第3卷,第5期,2016年7月)。制剂GL67A含有，连同作为治疗活性核酸的pDNA，GL67(也称为Genzyme Lipid 67，一种阳离子衍生的胆固醇)、1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG5000(DMPE-PEG5000)。
然而，该制剂显示出有限的稳定性(t1/2:6h)，使得必须在其应用之前不久对其进行制备。此外，发现脂质制剂对于在体内进行RNA转染是无效的(O.Andries等人,MolecularPharmaceutics 2012,9,2136-2145)。鉴于这些问题，仍然需要可以充当在体内进行RNA递送的有效载体同时提供有益毒理学特性(profile)的制剂。
发明内容
在本发明的背景下，已经发现1,2-丙二醇(也称为丙二醇)的存在导致含有RNA作为核酸的GL67A中所使用类型的脂质基制剂的转染效率显著提高。
因此，根据第一方面，本发明提供了组合物，其包含：
(i)包含在液相中的颗粒，其中颗粒包含RNA和脂质组合物，并且其中脂质组合物包含：
(i-a)式(I)的胆固醇衍生物或其盐：
其中
n是0或1，优选是0，
R1是基团–(CH2)q-NH2或基团–(CH2)r-NH-(CH2)s-NH2，
其中q、r和s独立地是2至6的整数，
R2是基团–(CH2)t-NH2或基团–(CH2)u-NH-(CH2)w-NH2，
其中t、u和w独立地是2至6的整数，
R3是具有1至4个碳原子的直链烷二基(alkanediyl group)；
(i-b)式(II)的磷酸甘油酯或其盐：
其中
R4是具有10至20个碳原子的直链烷基或具有1至3个双键和10至20个碳原子的直链烯基；
R5是具有10至20个碳原子的直链烷基或具有1至3个双键和10至20个碳原子的直链烯基；
和
(i-c)式(III)的聚乙二醇化磷酸甘油酯(pegylated phosphoglyceride)或其盐：
其中
p是5至200，优选是10至170，并且最优选是10至140的整数
R6是具有10至20个碳原子的直链烷基或具有1至3个双键和10至20个碳原子的直链烯基；
R7是具有10至20个碳原子的直链烷基或具有1至3个双键和10至20个碳原子的直链烯基；
和
(ii)1,2-丙二醇。
本发明的第二方面涉及用于制备根据上述第一方面的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将脂质组合物的组分溶解并混合在有机溶剂中，随后进行脂质组合物的冻干；
b)通过添加水使冻干的脂质组合物再水合；
c)将再水合的脂质组合物与RNA的水溶液组合，以允许形成包含在液相中的包含RNA和脂质组合物的颗粒；
d)添加1,2-丙二醇。
1,2-丙二醇的添加可以例如通过以下来方便地完成：在步骤b)中将其与水一起添加、在步骤b)后将其添加至再水合的脂质组合物中、在步骤c)中将其与RNA的水溶液一起添加、或在步骤c)后将其添加至液相中，其中包含了含有RNA和脂质组合物的颗粒。将理解的是，添加可以在一个步骤中或多个步骤中进行，例如，在该方法的不同阶段进行。
此外，已发现1,2-丙二醇可以增强RNA的颗粒制剂在冷冻过程中的稳定性，例如，当将这种颗粒制剂冷冻以进行存储或处理时。换言之，1,2-丙二醇还可以充当包含RNA和脂质组合物的颗粒的冷冻保护剂。
因此，根据第三方面，本发明提供了固体组合物，其包含：
(i)包含RNA和脂质组合物的颗粒，和
(ii)1,2-丙二醇，该固体组合物能够通过冷冻以上限定的根据本发明的第一方面的组合物获得。
在下文中，将提供本发明及其以上讨论的方面的详细描述。在此上下文中将理解的是，这些方面是紧密相关的。因此，将理解的是，除非另有说明，否则关于一个方面的特征所提供的详细信息也将适用于依赖此特征的其它方面。
具体实施方式
RNA
根据本发明的组合物和固体组合物包含核糖核酸(RNA)，更优选是单链RNA，并且最优选是mRNA。
关于RNA，原则上任何类型的RNA都可以在本发明的背景下采用。在优选的实施方式中，RNA是单链RNA。术语“单链RNA”意为与由于分开的链的杂交，两条或更多条分开的链形成双链分子的RNA分子对比的单条连续的核糖核苷酸链。术语“单链RNA”不排除单链分子本身形成双链结构，如二级(例如环和茎环)结构或三级结构。
术语“RNA”涵盖编码氨基酸序列的RNA以及不编码氨基酸序列的RNA。已经提出，超过80％的基因组含有不编码蛋白质的功能性DNA元件。这些非编码序列包括调节性DNA元件(转录因子、调节子和共调节子等的结合位点)和编码从未被翻译成蛋白质的转录物的序列。这些由基因组编码并转录为RNA但未翻译成蛋白质的转录物被称为非编码RNA(ncRNA)。因此，在一个实施方式中，RNA是非编码RNA。优选地，非编码RNA是单链分子。研究表明，ncRNA在基因调控、维持基因组完整性、细胞分化、和发育中起关键作用，而其在各种人类疾病中被错义调控。存在不同类型的ncRNA：短链(20–50nt)、中等(50–200nt)、和长链(>200nt)ncRNA。短链ncRNA包括微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、和转录起始RNA(tiRNA)。中等ncRNA的实例是小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、转移RNA(tRNA)、转录起始位点相关RNA(TSSaRNA)、启动子相关小RNA(PASR)、和启动子上游转录物(PROMPT)。长链非编码RNA(lncRNA)包括基因间区长链非编码RNA(lincRNA)、反义lncRNA、内含子(intronic)lncRNA、转录的超保守RNA(T-UCR)等(Bhan A,Mandal SS,ChemMedChem.2014Mar 26.doi:10.1002/cmdc.201300534)。在上述非编码RNA中，只有siRNA是双链的。因此，由于在优选的实施方式中，非编码RNA是单链的，因此优选非编码RNA不是siRNA。在另一实施方式中，RNA是编码RNA，即编码氨基酸序列的RNA。这种RNA分子也称为mRNA(信使RNA)，并且是单链RNA分子。RNA可以通过本领域普通技术人员已知的合成化学和酶促方法制备，或者通过使用重组技术来制备，或者可以从天然来源分离，或者通过其组合来制备。
信使RNA(mRNA)是由磷酸核苷构造单元构造的共聚物，主要以腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷为核苷，其作为中间载体将遗传信息从细胞核中的DNA引入细胞质中，在细胞质中翻译成蛋白质。因此，信使RNA适合作为基因表达的替代物。
在本发明的上下文中，mRNA应被理解为意指任意的多核糖核苷酸分子，如果其进入细胞，则适合蛋白质或其片段的表达，或者能够翻译成蛋白质或其片段。术语“蛋白质”在本文中涵盖任意种类的氨基酸序列，即两个或更多个各自通过肽键连接的氨基酸的链，并且还包括肽和融合蛋白。
mRNA含有核糖核苷酸序列，该核糖核苷酸序列编码在细胞中或细胞附近需要的或有益的功能的蛋白质或其片段，例如这样的蛋白质：在细胞中或其附近，该蛋白质的缺失或有缺陷的形式诱发疾病或不适(illness)，其提供可以减轻或预防疾病或不适；或是这样的蛋白质：在细胞中或其附近，该蛋白质可以促进对身体有益的过程。mRNA可以含有完整蛋白质或其功能性变体的序列。进一步，核糖核苷酸序列可以编码充当因子、诱导物、调节剂、刺激剂或酶的蛋白质或其功能性片段，其中此蛋白质是其功能对于弥补障碍(特别是代谢障碍)或者启动体内过程(如新血管、组织等的形成)所必需的蛋白质。此处，功能性变体被理解为意指这种片段：其在细胞中可以承担蛋白质的功能，该蛋白质的功能在细胞中是需要的，或者该蛋白质的缺失或缺陷的形式是致病性的。另外，mRNA还可以具有其它功能区和/或3’或5’非编码区。3’和/或5’非编码区可以是天然地位于蛋白质编码序列或人工序列侧翼的区域，其有助于RNA的稳定。本领域技术人员可以通过常规实验确定在每种情况下适合于此的序列。
在优选的实施方式中，mRNA含有：5′-帽子(5′端帽子(five-prime-cap)；帽子-0)，其由通过5′到5′三磷酸酯键连接至mRNA的m7GpppG组成，mRNA的5′-端倒数第二个核苷酸上的另外的甲基(帽子-1，抗-反向帽子类似物(Anti-Reverse Cap Analog)(ARCA))和/或内部核糖体进入位点(IRES)和/或3’-端的polyA-尾，具体地，用以提高翻译。mRNA可以具有促进翻译的其它区域，如，例如，帽子-2结构或组蛋白茎-环结构。
如上所述，除非在具体上下文中另外指出，否则本文所用的术语mRNA涵盖修饰的mRNA，即mRNA可以是修饰的mRNA。
在另一实施方式中，mRNA含有标记的核酸(优选地，核苷酸和/或核糖核苷酸)，如，例如同位素和/或荧光标记的核苷酸。标记的mRNA分子在例如研究RNA和DNA分子的胞内构象中起重要作用。
在优选的实施方式中，RNA，优选mRNA，是含有修饰的核苷酸/核糖核苷酸的分子。除了四种经典的核糖核苷酸，即腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷外，存在这些核碱基中的每一个的多种类似物。有时在整个文献中，这些类似物或包括这些类似物中的一种或多种的RNA/mRNA分子就本发明而言被称为修饰的(例如，修饰的核苷酸或修饰的核糖核苷酸)。一些类似物与上述典型的核碱基不同，但是可以天然存在。其它类似物是非天然存在的。考虑了任一类型的类似物。
下表(表1)中列出了优选的修饰：
对于根据本发明的RNA，优选mRNA，所有尿苷核苷酸和胞苷核苷酸都可以各自以相同的形式修饰，或者修饰的核苷酸的混合物可以用于每一种。修饰的核苷酸可以具有天然或非天然存在的修饰。可以使用各种修饰的核苷酸的混合物。因此，例如一部分修饰的核苷酸可以具有天然修饰，而另一部分具有非天然存在的修饰，或者可以使用天然存在的修饰和/或非天然存在的修饰的核苷酸的混合物。此外，一部分修饰的核苷酸可以具有碱基修饰，而另一部分具有糖修饰。以相同方式，所有修饰都是碱基修饰或者所有修饰都是糖修饰或其任意合适的混合都是可能的。通过改变修饰，可以选择性地调节根据本发明的RNA，优选mRNA的作用的稳定性和/或持久性。
在本发明的一个实施方式中，一种类型的核苷酸使用至少两种不同的修饰，其中一种类型的修饰的核苷酸具有官能团，通过该官能团可以连接其它基团。也可以使用具有不同官能团的核苷酸，以提供用于连接不同基团的结合位点。因此，例如，一部分修饰的核苷酸可以携带叠氮基、氨基、羟基、硫醇基或一些其它适于在预定条件下反应的反应性基团。官能团也可以是使得其可以在某些条件下活化能够结合的天然存在的基团，从而可以偶联具有功能的分子。被修饰以提供结合位点的核苷酸也可以作为腺苷或鸟苷修饰引入。根据待引入的基团及其待存在的频率进行具体合适的修饰的选择和结合位点的选择。因此，提供有官能团和/或活化基团的核苷酸的含量取决于待偶联的基团的含量的高低，并且可以由本领域技术人员容易地确定。通常，经官能团和/或活化基团(如果存在)修饰的核苷酸的含量是经修饰的核苷酸的1至25％。如果需要，则本领域技术人员可以通过常规实验确定每种情况下最合适的基团及其最佳含量。
在优选的实施方式中，根据本发明的RNA，优选mRNA的特征在于，修饰的尿苷选自2-硫代尿苷、5-甲基尿苷、假尿苷、5-甲基尿苷5’-三磷酸(m5U)、5-碘尿苷5’-三磷酸(I5U)、4-硫代尿苷5’-三磷酸(S4U)、5-溴尿苷5’-三磷酸(Br5U)、2’-甲基-2’-脱氧尿苷5’-三磷酸(U2’m)、2’-氨基-2’-脱氧尿苷5’-三磷酸(U2’NH2)、2’-叠氮基-2’-脱氧尿苷5’-三磷酸(U2’N3)和2’-氟-2’-脱氧尿苷5’-三磷酸(U2’F)。
在另一优选的实施方式中，根据本发明的RNA，优选mRNA的特征在于，修饰的胞苷选自5-甲基胞苷、3-甲基胞苷、2-硫-胞苷、2’-甲基-2’-脱氧胞苷5’-三磷酸(C2’m)、2’-氨基-2’-脱氧胞苷5’-三磷酸(C2’NH2)、2’-氟-2’-脱氧胞苷5’-三磷酸(C2’F)、5-碘胞苷5’-三磷酸(I5U)、5-溴胞苷5’-三磷酸(Br5U)和2’-叠氮基-2’-脱氧胞苷5’-三磷酸(C2’N3)。
在优选的实施方式中，mRNA是含有修饰的和未修饰的核苷酸的组合的mRNA。优选地，它是含有如WO2011/012316中所描述的修饰的和未修饰的核苷酸的组合的mRNA。其中描述的mRNA据报道显示出提高的稳定性和减弱的免疫原性。在优选的实施方式中，在这种修饰的mRNA中，5至50％的胞苷核苷酸和5至50％的尿苷核苷酸是修饰的。含腺苷和鸟苷的核苷酸可以是未修饰的。腺苷和鸟苷核苷酸可以是未修饰的或部分修饰的，并且其优选以未修饰的形式存在。优选地，10至35％的胞苷和尿苷核苷酸是修饰的，并且特别优选地，修饰的胞苷核苷酸的含量在7.5至25％的范围内，并且修饰的尿苷核苷酸的含量在7.5至25％的范围内。已发现实际上相对低的含量，如修饰的胞苷和尿苷核苷酸各自仅10％就可以实现期望的性质。特别优选的是，修饰的胞苷核苷酸是5-甲基胞苷残基，而修饰的尿苷核苷酸是2-硫代尿苷残基。最优选地，修饰的胞苷核苷酸的含量和修饰的尿苷核苷酸的含量分别是25％。
在某些其它实施方式中，在这种修饰的RNA，优选mRNA中，5至50％的胞苷是C的类似物，并且5至50％的尿苷是U的类似物。在某些实施方式中，在这种修饰的RNA，优选mRNA中，5至40％的胞苷是C的类似物，并且5至40％的尿苷是U的类似物。在某些实施方式中，在这种修饰的RNA，优选mRNA中，5至30％的胞苷是C的类似物，并且5至30％的尿苷是U的类似物。在某些实施方式中，在这种修饰的RNA，优选mRNA中，10至30％的胞苷是C的类似物，并且10至30％的尿苷是U的类似物。在某些实施方式中，在这种修饰的RNA，优选mRNA中，5至20％的胞苷是C的类似物，并且5至20％的尿苷是U的类似物。在某些实施方式中，在这种修饰的RNA，优选mRNA中，5至10％的胞苷核苷酸和5至10％的尿苷核苷酸是修饰的。在某些实施方式中，在这种修饰的RNA，优选mRNA中，25％的胞苷核苷酸和25％的尿苷核苷酸是修饰的。在某些实施方式中，含腺苷和鸟苷的核苷酸可以是未修饰的。在某些实施方案中，腺苷和鸟苷核苷酸可以是未修饰的或部分修饰的，并且其优选以未修饰的形式存在。
如上所述，在某些实施方式中，U的类似物指代单一类型的U的类似物。在某些实施方式中，U的类似物指代两种或更多种类型的U的类似物。在某些实施方式中，C的类似物指代单一类型的C的类似物。在某些实施方案中，C的类似物指代两种或更多种类型的C的类似物。
在某些实施方式中，RNA(优选是mRNA)中作为胞苷的类似物的胞苷的百分比与RNA(优选是mRNA)中作为尿苷的类似物的尿苷的百分比不同。在某些实施方式中，胞苷的类似物的百分比低于尿苷的类似物的百分比。如上所述，这可以是在存在或不存在腺苷和鸟苷的类似物的情况下，但是在某些实施方式中，是在不存在腺苷的类似物和鸟苷的类似物的情况下。在某些实施方式中，本公开的RNA，优选mRNA包含少于15％、少于10％、少于5％或少于2％的腺苷的类似物、鸟苷的类似物或两者。
在某些实施方式中，本发明的RNA，优选mRNA包含胞苷的类似物和尿苷的类似物，并且5至20％的胞苷是胞苷的类似物，而25至45％的尿苷是尿苷的类似物。换言之，RNA，优选mRNA包含修饰的和未修饰的胞苷以及修饰的和未修饰的尿苷，并且5至20％的胞苷包含胞苷的类似物，而25至45％的尿苷包含尿苷的类似物。在其它实施方式中，RNA，优选mRNA包含5至10％的胞苷的类似物和30至40％的尿苷的类似物，如7-9％的胞苷的类似物(如约7、7.5或8％)和如32-38％的尿苷的类似物(如约33、34、35、36％)。
在某些实施方式中，可以使用本文所述的尿苷的类似物和胞苷的类似物中的任一种，任选地排除假尿苷。在某些实施方式中，胞苷的类似物包含5-碘胞苷或由5-碘胞苷组成(例如，在由其组成的情况下，其是所使用的单一类似物类型)，并且尿苷的类似物包含5-碘尿苷或由5-碘尿苷组成(例如，在由其组成的情况下，其是所使用的单一类似物类型)。
在任意前述内容的某些实施方式中，给定核苷酸的类似物的百分比指代输入百分比(例如，起始反应，如体外转录反应中的起始中类似物的百分比)。在任意前述内容的某些实施方式中，给定核苷酸的类似物的百分比指代输出(例如，在合成的或转录的化合物中的百分比)。两种选择均被同等考虑。
可以通过本领域技术人员已知的方法在体内系统中重组产生本发明的RNA，优选mRNA分子。
可选地，可以使用例如本领域技术人员已知的体外转录系统在体外系统中产生本发明的修饰的RNA，优选mRNA分子。能够产生RNA，优选mRNA的体外转录系统需要修饰的和未修饰的核苷三磷酸的输入混合物，以产生具有本发明的期望性质的修饰的RNA，优选mRNA分子。在某些实施方式中，这种输入混合物中5至50％的胞苷是胞苷的类似物，并且这种输入混合物中5至50％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，这种输入混合物中5至40％的胞苷是胞苷的类似物，并且这种输入混合物中5至40％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，这种混合物中5至30％的胞苷是胞苷的类似物，并且这种输入混合物中5至30％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方案中，这种混合物中5至30％的胞苷是胞苷的类似物，并且这种混合物中10至30％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，这种输入混合物中5至20％的胞苷是胞苷的类似物，并且这种输入混合物中5至20％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，这种输入混合物中5至10％的胞苷是胞苷的类似物，并且这种输入混合物中5至10％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，这种输入混合物中25％的胞苷是胞苷的类似物，并且这种输入混合物中25％的尿苷是尿苷的类似物。在某些实施方式中，输入混合物不包含腺苷和/或鸟苷的类似物。在其它实施方式中，任选地，输入混合物包含腺苷和/或鸟苷(或不含任一者或两者)的一种或多种类似物。
在某些实施方式中，输入混合物中作为胞苷的类似物的胞苷的百分比与输入混合物中作为尿苷的类似物的尿苷的百分比不同。在某些实施方式中，输入混合物中胞苷的类似物的百分比低于输入混合物中尿苷的类似物的百分比。如上所述，这可以是在输入混合物中存在或不存在腺苷和鸟苷的类似物的情况下，但在某些实施方式中，是在输入混合物中不存在腺苷的类似物和鸟苷的类似物的情况下。
在某些实施方式中，用于产生本发明的RNA，优选mRNA的体外转录系统的核苷酸的输入混合物包含胞苷的类似物和尿苷的类似物，并且输入混合物的5至20％的胞苷是胞苷的类似物，并且输入混合物的25至45％的尿苷是尿苷的类似物。换言之，输入混合物包含修饰的和未修饰的胞苷以及修饰的和未修饰的尿苷，并且输入混合物的5至20％的胞苷包含胞苷的类似物，而输入混合物的25至45％的尿苷包含尿苷的类似物。在其它实施方式中，输入混合物包含5至10％的胞苷的类似物和30至40％的尿苷的类似物，如7-9％的胞苷的类似物(如7、7.5或8％)和如32-38％的尿苷的类似物(如33、34、35、36％)。
在某些实施方式中，可以使用本文所述的尿苷的类似物和胞苷的类似物中的任一种，任选地排除假尿苷。在某些实施方式中，胞苷的类似物包含5-碘胞苷或由5-碘胞苷组成(例如，其是所使用的单一C类似物类型)，并且尿苷的类似物包含5-碘尿苷或由5-碘尿苷组成(例如，其是所使用的单一U类似物类型)。
上表中描述了示例性类似物。应理解，对于编码期望多肽(模块(a))的修饰的多核糖核苷酸，除非另有说明，否则应在编码期望多肽(模块(a))的整个多核糖核苷酸中考虑类似物和修饰水平，包括5’和3’非翻译区(例如，修饰水平基于体外转录反应中类似物的输入比例，使得可以在转录的位置处并入类似物)。
此外，修饰的RNA，优选mRNA分子可以化学合成，例如，通过使用固相支持物(support)和标准技术在自动化核苷酸序列合成仪上进行常规化学合成，或者通过化学合成相应的DNA序列，随后在体外或体内对其进行转录。
在另一优选的实施方式中，mRNA可以与目标结合位点、靶向序列和/或与微小RNA结合位点组合，以便仅在相关细胞中允许期望的mRNA的活性。在进一步优选的实施方式中，RNA可以与3’polyA尾下游的微小RNA或shRNA组合。
总体上，可以通过核糖核酸与细胞分子和细胞器的相互作用来实现治疗效果。这种相互作用单独可以例如激活先天免疫系统，对某些CpG寡核苷酸和设计为与toll样受体和其它胞外或胞内受体特异性相互作用的序列而言常常是这样的情况。此外，细胞中核糖核酸(优选mRNA)的摄入或引入可以旨在导致核苷酸序列，如核糖核酸(优选mRNA)中包含的基因的表达；可以旨在用于由于引入的外源核酸在细胞内的存在而导致的内源基因表达下调、沉默或敲低；或者可以旨在用于内源核酸序列的修饰，如所选择的碱基或内源核酸序列的整段序列(whole stretches)的修复、切除、插入或交换；或者可以旨在用于由于引入的外源核糖核酸(优选mRNA)在细胞内的存在和相互作用而实际上干扰任何细胞过程。引入的外源核糖核酸(优选mRNA)的过表达可以旨在补偿或互补内源基因表达，特别是在内源基因缺陷或沉默的情况下，导致基因表达产物不存在、不足或有缺陷或功能异常，多种代谢性和遗传性疾病，如囊性纤维化、血友病或肌肉营养不良等常常是这样的情况。引入的外源核糖核酸(优选mRNA)的过表达也可以旨在使表达产物与任意内源细胞过程相互作用或干扰任意内源细胞过程，如基因表达的调控、信号转导和其它细胞过程。引入的外源核糖核酸(优选mRNA)的过表达也可以旨在在转染或转导的细胞所驻留或使其驻留的生物体的背景下引起免疫应答。实例是抗原呈递细胞(如树突细胞)的遗传修饰，以使其呈递抗原用于疫苗接种目的。其它实例是肿瘤中细胞因子的过表达，以引起肿瘤特异性免疫应答。此外，引入的外源核糖核酸(优选mRNA)的过表达也可以旨在产生用于细胞疗法的体内或离体瞬时遗传修饰的细胞，如修饰的T细胞或前体或者干细胞或其它用于再生医学的细胞。
例如，可以通过RNA干扰(RNAi)、使用核酶、反义寡核苷酸、tRNA、长双链RNA来实现内源基因表达的下调、沉默或敲低以用于治疗目的，其中这种下调可以是序列特异性或非特异性的，并且常常在当长双链RNA被引入细胞中时的情况下，还可以导致细胞死亡。内源或预先存在的基因表达的下调、沉默或敲低可以用于治疗获得性、遗传性或自发性疾病，包括病毒感染和癌症。还可以设想，可以将核酸引入细胞中作为预防措施来实践，以预防例如病毒感染或瘤形成。内源基因表达的下调、沉默或敲低可以在转录水平上和翻译水平上起作用。多种机制是本领域技术人员已知的，并且包括例如表观遗传修饰、染色质结构的改变、所引入的核酸对转录因子的选择性结合、所引入的核酸与基因组DNA、mRNA或其它RNA种属中通过碱基配对(包括非常规碱基配对机制，如三螺旋形成)的杂交。类似地，可以在基因组水平和mRNA水平(包括外显子跳跃)实现基因修复、碱基或序列改变。碱基或序列改变可以例如通过RNA引导的位点特异性DNA切割、通过利用反式剪接、反式剪接核酶、嵌合修复体(chimeraplasts)、剪接体介导的RNA反式剪接的剪切和粘贴机制、或通过利用II类或重新靶向的内含子、或通过利用由病毒介导的插入诱变或利用使用原核、真核或病毒整合酶系统的靶向基因组插入来实现。由于核酸是生命系统构建计划的载体，并且由于其以直接和间接方式参与多种细胞过程，因此从理论上讲，任何细胞过程都可以受核酸从外部引入细胞的影响。值得注意的是，这种引入可以在细胞或器官培养物中直接于体内和离体进行，然后将因此修饰的器官或细胞移植到受体中。以核酸作为治疗活性剂的用于本发明的背景下的颗粒可以用于上述所有目的。
如上所述，RNA，优选mRNA可以含有核糖核苷酸序列，该核糖核苷酸序列编码在细胞中或细胞附近需要的或有益的功能的蛋白质或其片段，例如这样的蛋白质：在细胞中或其附近，该蛋白质的缺失或有缺陷的形式诱发疾病或不适，其提供可以减轻或预防疾病或不适；或是这样的蛋白质：在细胞中或其附近，该蛋白质可以促进对身体有益的过程。
确实，近年来，RNA(特别是mRNA)作为新的药物实体已变得越来越相关。与基于DNA的基因疗法相反，mRNA不需要转运到细胞核中，而是直接在细胞质中翻译成蛋白质(JControl Release,2011,150:238-247和Eur J Pharm Biopharm,2009,71:484-489)。
此外，由单一基因的突变引起的多种遗传障碍是已知的，并且是RNA，优选mRNA治疗方法的候选者(candidates)。关于某种性状将在后代中出现的可能性，单一基因突变引起的障碍，如囊性纤维化、血友病和多种其它疾病可以是显性或隐性的。显性等位基因在只有一个等位基因拷贝的个体中表现出表型，而对于隐性等位基因，个体必须具有两个拷贝，每个亲本都需要表现出一个拷贝。相比之下，多基因障碍由两个或更多个基因引起，并且相应疾病的表现形式常常是变数(流畅的，fluent)并且与环境因素相关。多基因障碍的实例是高血压、胆固醇水平升高、癌症、神经退行性疾病、精神疾病等。同样在这些情况下，代表这些基因中的一种或多种的治疗性RNA，优选mRNA可以对那些患者有益。此外，遗传障碍不一定是从亲本基因传递，也可能由新的突变引起。同样在这些情况下，代表正确基因序列的治疗性RNA，优选mRNA可以对患者有益。
可以在ONIM(在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance inMan))网址(http://onim.org)获得在线目录，其中具有22,993个人类基因和遗传障碍条目以及其相应基因和其表型的描述；每个序列都可以从Uniprot数据库(http://www.uniprot.org)中获得。作为非限制性实例，下表2列出了一些先天性疾病以及相应基因(一种或多种)。由于细胞信号传导途径的高度相互作用，某些基因的突变引起多种致病症状，表2仅列出了其中特征性的症状。
在本发明的一些实施方式中，由本发明的RNA，优选mRNA编码的治疗性蛋白选自表2中列出的细胞蛋白。因此，本发明的RNA，优选mRNA分子可以编码治疗性细胞蛋白，其中编码的治疗性蛋白是表2中列出的治疗性蛋白或其同系物。
在本发明的另一实施方式中，由本发明的RNA，优选mRNA编码的治疗性蛋白选自表2中列出的分泌蛋白。因此，本发明的RNA，优选mRNA可以编码治疗性融合蛋白，其中编码的治疗性蛋白或其同系物是表2中列出的治疗性蛋白或其同系物，而第二种蛋白质是允许治疗性蛋白分泌的信号肽。信号肽是短的，通常为5-30个氨基酸长的氨基酸序列，存在于所述治疗性蛋白的N末端，并且通过某些细胞器(即内质网、高尔基体或内体)将融合蛋白引向细胞的分泌途径。因此，这种融合蛋白从细胞或从细胞器分泌，或者插入细胞隔室或细胞表面的细胞膜(例如，多次跨膜蛋白(multi-spanning trans-membrane proteins))中。
因此，在本发明的优选实施方式中，本发明的RNA，优选mRNA可以编码但不限于引起、诱发或预防疾病的基因的下列蛋白质。可以治疗(或预防)的这些障碍的非限制性实例包括其中所述多肽、蛋白质或肽选自下表2中概述的多肽、蛋白质或肽的那些障碍。
在一些实施方式中，本发明的RNA，优选mRNA的编码序列可以被转录和翻译成部分或全长蛋白，该部分或全长蛋白包含水平等于或大于天然蛋白的水平的细胞活性。在一些实施方式中，本发明的RNA，优选mRNA编码具有治疗或预防作用的治疗或药学活性多肽、蛋白质或肽，其中所述多肽、蛋白质或肽选自下表2中概述的多肽、蛋白质或肽。RNA，优选mRNA，更具体地是其编码序列可以用于表达部分或全长蛋白，该部分或全长蛋白具有水平等于或小于天然蛋白的水平的细胞活性。这可以允许治疗可以指示给予RNA分子的疾病。
表2：人类基因和遗传障碍的非限制性实例
上表2显示了其中缺陷导致可用本发明的RNA，优选mRNA治疗的疾病的基因的实例，其中本发明的RNA，优选mRNA包含核糖核苷酸序列，其编码完整形式的蛋白质或上面公开的缺陷基因的功能片段。在特别优选的实施方式中，可以提及遗传性疾病，其例如影响肺，如SPB(表面活性蛋白B)缺乏、ABCA3缺乏、囊性纤维化和α1-抗胰蛋白酶缺乏，或者其影响血浆蛋白质(例如先天性血色素沉着病(铁调素(hepcidin)缺乏)、血栓性血小板减少性紫癜(TPP，ADAMTS 13缺乏)并引起凝血缺陷(例如血友病a和b)和补体缺陷(例如C蛋白缺乏)、免疫缺陷诸如例如SCID(引起在不同基因如RAG1、RAG2、JAK3、IL7R、CD45、CD3δ、CD3ε的突变)或缺乏——由于缺乏腺苷脱氨酶例如(ADA-SCID)、败血性肉芽肿病(例如由gp-91-phox基因p47-phox基因、p67-phox基因或p33-phox基因的突变引起)和贮积病如高歇氏病、法布里氏病、克腊比氏病、MPS I、MPS II(亨特综合征)、MPS VI、II型糖原贮积病或muccopolysacchaidoses。
本发明的RNA，优选mRNA对其可以是有用的其它障碍包括障碍如SMN1相关的脊髓性肌萎缩(SMA)；肌萎缩性侧索硬化(ALS)；GALT相关的半乳糖血症；囊性纤维化(CF)；SLC3A1相关的障碍，包括胱氨酸尿症；COL4A5相关的障碍，包括阿尔波特综合征；半乳糖脑苷脂酶缺乏；X连锁脑白质肾上腺萎缩症和肾上腺脊神经病；弗里德赖希氏共济失调；佩-梅二氏病；TSC1和TSC2相关的结节性硬化症；桑菲列普综合征B综合征(MPS IIIB)；CTNS相关的胱氨酸病；FMR1相关的障碍，包括脆性X染色体综合征、脆性X关联性震颤/共济失调综合症和脆性X卵巢早衰综合征；普-韦二氏综合征；遗传性出血性毛细血管扩张症(AT)；C1型尼-皮二氏病；神经元蜡样脂褐质沉积症相关的疾病，包括少年神经元蜡样脂褐质沉积症(JNCL)、少年巴腾病、Santavuori-Haltia病、Jansky-Bielschowsky病、和PTT-1和TPP1缺乏；EIF2B1、EIF2B2、EIF2B3、EIF2B4和EIF2B5相关的童年共济失调伴中枢神经系统髓鞘形成减少(hypomyelination)/消失白质；CACNA1A和CACNB4相关的发作性共济失调2型；MECP2相关的障碍，包括经典雷特综合征、MECP2相关的严重新生儿脑病和PPM-X综合征；CDKL5相关的非典型雷特综合征；肯尼迪氏病(SBMA)；Notch-3相关脑的常染色体显性动脉病伴皮层下梗死和脑白质病(CADASIL)；SCN1A和SCN1B相关的发作障碍；聚合酶G相关的障碍，包括Alpers-Huttenlocher综合征、POLG相关的感觉共济失调神经病、发音困难、和眼肌瘫痪(ophthalmoparesis)、和常染色体显性和隐性渐进性外眼肌麻痹伴线粒体DNA缺失；X连锁肾上腺发育不全；X连锁无丙种球蛋白血症；法布里病；和威尔逊氏病。
在所有这些疾病中，蛋白质，例如酶，是有缺陷的，其可以通过用本发明的编码任一种上述蛋白质的RNA，优选mRNA的治疗进行治疗，这使得由缺陷的基因或其功能性片段编码的蛋白质可获得。转录物替代疗法/酶替代疗法不影响潜在的遗传缺陷，但是增加患者缺乏的酶的浓度。作为实例，在蓬珀氏病中，转录物替代疗法/酶替代疗法替代缺乏的溶酶体酶酸性α-葡糖苷酶(GAA)。
因此，可由本发明的mRNA编码的蛋白质的非限制性实例是促红细胞生成素(EPO)、生长激素(growth hormone)(生长激素(somatotropin)、hGH)、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)、生长因子如GM-SCF、G-CSF、MPS、蛋白C、铁调素、ABCA3和表面活性蛋白B。可以用根据本发明的RNA治疗的疾病的其它实例是血友病A/B、法布里氏病、CGD、ADAMTS13、胡尔勒氏病、X染色体介导的A-γ-球蛋白血症、腺苷脱氨酶相关的免疫缺陷和新生儿中的呼吸窘迫综合征，其与SP-B相关。特别优选地，根据本发明的RNA，优选mRNA含有表面活性蛋白B(SP-B)或促红细胞生成素的编码序列。可以由根据本发明的本发明的RNA，优选mRNA编码的蛋白质的其它实例是生长因子，如人生长激素hGH、BMP-2或血管生成因子。
可选地，RNA，优选mRNA可以含有编码全长抗体或较小抗体(例如，重链和轻链两者)的核糖核苷酸序列，该全长抗体或较小抗体可以用于治疗环境(therapeuticsettings)，以例如赋予对象免疫力。相应抗体及其治疗应用(一种或多种)是本领域已知的。
在另一实施方式中，RNA，优选mRNA可以编码功能性单克隆或多克隆抗体，功能性单克隆或多克隆抗体可以用于靶向生物学目标(例如，刺激性细胞因子，如肿瘤坏死因子)和/或使其失活。类似地，RNA，优选mRNA序列可以编码例如用于治疗II型膜性增生性肾小球性肾炎或急性溶血性尿毒症综合征的功能性抗肾病因子抗体，或者可选地可以编码用于治疗VEGF介导的疾病(如癌症)的抗血管内皮生长因子(VEGF)抗体。
可选地，RNA，优选mRNA可以含有编码优选地可以用于治疗环境的抗原的核糖核苷酸序列。
在另一实施方式中，RNA，优选mRNA可以含有编码可以用于基因组编辑技术的多肽或蛋白质的核糖核苷酸序列。基因组编辑是一种使用核酸酶在生物体基因组中插入、缺失或置换DNA的基因工程。这些核酸酶在基因组中的期望位置产生位点特异性断裂。通过非同源末端连接或同源重组来修复诱导的断裂，导致基因组中的靶向突变，从而“编辑”基因组。断裂可以是单链断裂或双链断裂(DSB)，而双链断裂(DSB)是优选的。利用不同多肽或蛋白质的多种基因组编辑系统是本领域已知的，即，例如CRISPR-Cas系统、大范围核酸酶(归巢核酸内切酶，meganucleases)、锌指核酸酶(ZFN)和基于转录激活因子样效应物的核酸酶(TALEN)。Trends in Biotechnology,2013,31(7),397-405中综述了用于基因组工程的方法。
因此，在优选的实施方式中，RNA，优选mRNA可以含有编码Cas(CRISPR相关蛋白)蛋白家族的多肽或蛋白质——优选Cas9(CRISPR相关蛋白9)——的核糖核苷酸序列。可以在基于CRISPR/Cas9的方法和/或CRISPR/Cas9基因组编辑技术中使用Cas蛋白家族的蛋白质，优选Cas9。Nat.Biotechnol.,2014,32(4):347-355中综述了用于基因组编辑、调控和靶向的CRISPR-Cas系统。
在另一优选的实施方式中，RNA，优选mRNA可以含有编码大范围核酸酶的核糖核苷酸序列。大范围核酸酶是内切脱氧核糖核酸酶，其与“常规”内切脱氧核糖核酸酶相反，识别大的识别位点(例如，12至40个碱基对的双链DNA序列)。结果，在任何给定的基因组中，各自的位点只出现几次，优选地仅一次。因此，大范围核酸酶被认为是最特异的天然存在的限制酶，因此是基因组编辑技术中的合适工具。
在另一优选的实施方式中，RNA，优选mRNA含有编码锌指核酸酶(ZFN)的核糖核苷酸序列。ZFN是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制酶。锌指结构域可以被设计以靶向特定的期望的DNA序列，并且这使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组内的独特序列。通过利用内源DNA修复机制，ZFN可以用来精确地改变高等生物的基因组，因此是基因组编辑技术中的合适工具。
在另一优选的实施方式中，RNA，优选mRNA可以含有编码转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)的核糖核苷酸序列。TALEN是限制酶，其可被设计以切割DNA的特定序列。TALEN是融合蛋白，其中TAL效应物DNA结合结构域与核酸酶的DNA切割结构域融合。可以将转录激活因子样效应物(TALE)设计以实际上结合任何期望的DNA序列。因此，当与核酸酶组合时，可以在特定的期望位置切割DNA。
作为上述的可选方式，RNA含有不被表达成蛋白质或多肽的核糖核苷酸序列。因此，术语RNA不应仅仅理解为意指任何这样的多核苷酸分子：其如果被引入细胞中，则可翻译成多肽/蛋白质或其片段。确切地说，还考虑了RNA含有仅被转录成(功能性)RNA的核糖核苷酸序列，其中所述RNA是最终产物(并且因此，不需要被翻译)。在这种背景下，设想RNA含有核糖核苷酸序列，其优选地提供siRNA序列或另一期望的核糖核苷酸序列的遗传信息。
将理解的是，用于本发明的背景下的颗粒可以包含单一类型的RNA，但是可以可选地包含两种或更多种类型的RNA的组合，例如单一颗粒中包含两种或更多种类型的RNA的颗粒形式，或者其中所含RNA类型不同的颗粒混合物的形式。
脂质组合物
根据本发明的第一方面的组合物和根据本发明的第三方面的固体组合物包括含有RNA和脂质组合物的颗粒。
脂质组合物包含(i-a)式(I)的胆固醇衍生物或其盐，(i-b)式(II)的磷酸甘油酯或其盐，和(i-c)式(III)的聚乙二醇化磷酸甘油酯或其盐。可以存在其它脂质组分，但是优选地，组分(i-a)、(i-b)和(i-c)是颗粒中包含的脂质组合物中仅有的脂质组分。
脂质组合物的组分(i-a)是式(I)的胆固醇衍生物或其盐：
其中
n是0或1，
R1是基团–(CH2)q-NH2或基团–(CH2)r-NH-(CH2)s-NH2，
其中q、r和s独立地是2至6的整数，
R2是基团–(CH2)t-NH2或基团–(CH2)u-NH-(CH2)w-NH2，
其中t、u和w独立地是2至6的整数，
R3是具有1至4个碳原子的直链烷二基。
此式的化合物及其制备描述于例如US 5,783,565中。
式(I)中的整数n优选是0。
整数q、r、s、t、u和w优选独立地选自3和4。
还优选的是R1是基团–(CH2)q-NH2，并且R2是基团–(CH2)t-NH2或基团–(CH2)u-NH-(CH2)w-NH2，或者R2是基团–(CH2)t-NH2，并且R1是基团-(CH2)q-NH2或基团–(CH2)r-NH-(CH2)s-NH2。在这两种情况下，n也优选地是0。
式(I)的胆固醇衍生物的盐形式可以通过用酸使化合物中包含的一个或多个氨基质子化来提供，使得该化合物带有阳离子电荷。将理解的是，质子化的氨基是其中另外的氢原子结合至氨基的氮原子的质子化的氨基，使得产生带有阳离子电荷的四价氮。式(I)的化合物中合适的氮原子是基团-N(R1)(R2)中所含的氮原子，和R1中与R2中分别所含的氮原子。将理解的是，充当任何质子化的氨基的反荷离子的阴离子通常是生理上可接受的阴离子。在本发明的组合物中，式(I)的化合物通常将与RNA的酸性基团形成盐。然而，不排除其它反荷离子，并且实例包括氯根、溴根、碘根、硫酸根、硝酸根、磷酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、碳酸根、和碳酸氢根阴离子。
本领域技术人员将理解的是，作为胆固醇衍生物的式(I)的化合物可以通过优选的式(Ia)：
或还更优选的式(Ib)：
在式(Ia)和(Ib)中，以上关于式(I)给出的R1、R2、R3和n的定义和优选定义继续适用。
最优选作为脂质组合物的组分(i-a)是GL67或其盐，其中关于式(I)、(Ia)和(Ib)，n是0，R1是基团–(CH2)3-NH2，并且R2是基团-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2。
脂质组合物的组分(i-b)是式(II)的磷酸甘油酯或其盐：
其中
R4是具有10至24个碳原子的直链烷基或具有1至3个双键和10至24个碳原子的直链烯基；
R5是具有10至24个碳原子的直链烷基或具有1至3个双键和10至24个碳原子的直链烯基。
优选地，R4和R5各自是具有14至20个碳原子的直链烷基，或者各自是具有一个或两个双键和14至20个碳原子的直链烯基。更优选地，R4和R5各自是具有一个双键和14至20个碳原子的直链烯基。
式(II)的化合物的盐形式包括内部盐形式，其中连接至式(II)中所示P原子的酸性-OH基团的质子使其中所示的氨基质子化。这种盐形式还包括由酸性–OH基团与碱形成的盐，或由氨基与酸形成的盐。再次，将理解的是，盐通常是药学上可接受的盐。作为用碱形成的盐，可以提及碱金属盐，如钠盐或钾盐；碱土金属盐，如钙盐或镁盐和铵盐。作为用酸形成的示例性盐，可以提及用RNA的酸性基团形成的盐，但不排除其它盐，并且可以提及矿物酸盐，如氯化物、溴化物、或碘化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、或磷酸二氢盐、碳酸盐、和碳酸氢盐作为实例。
更优选作为脂质组合物的组分(i-b)是1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或其盐。
脂质组合物的组分(i-c)是式(III)的聚乙二醇化磷酸甘油酯或其盐：
其中
p是5至200，优选地10至170，并且最优选地10至140的整数；
R6是具有10至20个碳原子的直链烷基或具有1至3个双键和10至20个碳原子的直链烯基；
R7是具有10至20个碳原子的直链烷基或具有1至3个双键和10至20个碳原子的直链烯基。
优选地，R6和R7各自是具有10至20个碳原子的直链烷基，更优选地，R6和R7各自是具有10至16个碳原子的直链烷基。
因此，还优选的是，在式(III)中，R6和R7各自是具有10至16个碳原子的直链烷基，并且p是10至140的整数。
式(III)的化合物的盐形式通常是药学上可接受的盐。式(III)的化合物的典型盐是用碱形成的盐，并且可以提及例如碱金属盐，如钠盐或钾盐；碱土金属盐，如钙盐或镁盐和铵盐。
强烈优选作为脂质组合物中的组分(i-c)是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG(DMPE-PEG)或其盐，其中PEG(聚乙二醇)部分含有10至140个重复单元，即关于式(III)，R6和R7各自是具有13个碳原子的直链烷基，并且在此强烈优选的实施方式中，p是10至140的整数。最优选作为组分(i-c)是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG5000(DMPE-PEG5000)或其盐，其中5000表示PEG部分的数均分子量，对应于p的约113的平均值。
因此，将理解的是，用于本发明的背景下的特别优选的脂质组合物是这样的脂质组合物，其中：
组分(i-a)是GL67或其盐，
组分(i-b)是1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或其盐，和
组分(i-c)是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG(DMPE-PEG)或其盐，其中PEG(聚乙二醇)部分含有10至140个重复单元，并且更优选地是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG5000(DMPE-PEG5000)或其盐。
在本发明的颗粒中所含的脂质组合物中，组分(i-a)、(i-b)和(i-c)的摩尔比，即(i-a):(i-b):(i-c)优选是1:(0.5至5):(0.01至1)，更优选地1:(1至5):(0.01至0.5)，并且最优选地1:(1至3):(0.02至0.2)。
脂质组合物优选地含有组分(i-a)、(i-b)和(i-c)作为仅有的脂质组分。
与上文相符，根据本发明的第一方面的强烈优选的组合物是包含以下的组合物：
(i)包含在液相中的颗粒，其中颗粒含有mRNA和脂质组合物，并且其中脂质组合物包含组分(i-a):(i-b):(i-c)的摩尔比是1:(1至3):(0.02至0.2)的：
(i-a)GL67或其盐，
(i-b)1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或其盐，和
(i-c)1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG(DMPE-PEG)或其盐，其中PEG(聚乙二醇)部分含有10至140个重复单元，并且更优选地是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG5000(DMPE-PEG5000)或其盐，和
(ii)1,2-丙二醇。
类似地，本发明第三方面的强烈优选的实施方式涉及固体组合物，其包括(i)含有RNA和以上强烈优选的脂质组合物的颗粒，和(ii)1,2-丙二醇，该固体组合物可以通过冷冻以上强烈优选的组合物获得。
颗粒
根据本发明的第一方面的组合物和根据本发明的第三方面的固体组合物包括含有RNA和上述脂质组合物的颗粒。
颗粒通常包括含有RNA和脂质组合物的纳米颗粒或含有RNA和脂质组合物的微颗粒。本领域技术人员将理解的是，除非另外具体指出，否则在此上下文中以非排他方式使用“或”。因此，对纳米颗粒或微颗粒的提及涵盖含有纳米颗粒的组合物、含有微颗粒的组合物、以及既含有纳米颗粒又含有微颗粒的组合物。如本文所用，术语纳米颗粒通常指代直径在纳米尺寸范围(即直径为1nm以上且1000nm以下)的颗粒。术语微颗粒通常指代直径在微米尺寸范围(即直径为1000nm以上且100μm以下)的颗粒。优选地，颗粒由包含RNA和脂质组合物的纳米颗粒或包含RNA和脂质组合物的微颗粒组成。
根据本发明的组合物中所含的颗粒优选地显示1至5000nm，更优选地10至4000nm，并且最优选地50至3000nm范围的平均粒径。
根据本发明的组合物中的单一颗粒的直径上限优选是20μm，更优选是10μm，并且最优选是5μm。因此，将从上述内容理解到，强烈优选的颗粒制剂将是平均粒径在50至3000nm范围内，并且颗粒的最大粒径是5μm的颗粒制剂。
本文提及的纳米颗粒或微颗粒制剂的粒径和平均粒径可以通过动态光散射(DLS)方便地测定。总体上，本文提及的直径和平均直径表示为通过动态光散射测定的处于悬浮状态的颗粒的流体动力学直径。由于在报道结果时测量设备(例如Malvern ZetaSizer)考虑温度的影响，因此测量的直径通常不依赖于温度。然而，测量通常在室温(25℃)下进行。作为DLS测量的悬浮介质，可以适当地使用例如水或含1,2-丙二醇的水。在冷冻固体组合物的情况下，通常在融化组合物后测定粒径。在指示平均粒度或平均粒径的情况下，除非另外指出，否则平均值通常是z-平均值。
在根据本发明的组合物中所含的颗粒中，RNA的酸性基团将通常使脂质制剂中所含的氨基质子化，使得阴离子RNA分子和阳离子脂质分子可以相互作用，优选地导致在RNA分子与脂质分子之间形成复合物。
脂质组合物中源自式(I)的胆固醇衍生物的氮原子N的数量与RNA中磷酸根基团P的数量的N/P比优选在1至100，更优选地1至30，并且最优选地2至20的范围内。
优选地，颗粒具有脂质体或脂质纳米颗粒的形式。
与上文相符，根据本发明的第一方面的强烈优选的组合物是包含下列的组合物：
(i)包含在液相中的纳米颗粒或微颗粒，其中纳米颗粒或微颗粒包含mRNA和脂质组合物，其中脂质组合物包含组分(i-a):(i-b):(i-c)的摩尔比是1:(1至3):(0.02至0.2)的：
(i-a)GL67或其盐，
(i-b)1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或其盐，和
(i-c)1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG(DMPE-PEG)或其盐，其中PEG(聚乙二醇)部分含有10至140个重复单元，并且更优选地是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG5000(DMPE-PEG5000)或其盐，
并且其中脂质组合物中源自式(I)的胆固醇衍生物的氮原子N的数量与mRNA中磷酸根基团P的数量的N/P比是2至20；和
(ii)1,2-丙二醇。
类似地，本发明第三方面的强烈优选的实施方式涉及固体组合物，其包括：(i)含有RNA和前面段落中提及的脂质组合物的纳米颗粒或微颗粒，和(ii)1,2-丙二醇，该固体组合物能够通过冷冻上述强烈优选的组合物获得。
除了RNA和脂质组合物之外，根据本发明的组合物中的颗粒可以包含一种或多种其它组分，例如赋形剂或添加剂，其通常是药学上可接受的组分。例如，这种其它组分可以在已经将其给予至患者之后促进颗粒向特定部位的运输或促进颗粒进一步摄取到特定部位中，或者其可以帮助稳定颗粒或其中所含的治疗活性剂。
除了RNA和脂质组合物之外，根据本发明第一和第三方面的组合物中包含的颗粒可以包含作为一种或多种任选的添加剂的在治疗剂递送期间(并且优选地在将核糖核酸作为治疗剂递送至细胞和细胞内期间)发挥效应物功能的一种或多种组分。这种组分可以是但不限于聚阴离子、其它脂质、屏蔽性低聚物(shielding oligomers)或聚合物、泊洛沙姆(也称为聚氧丙烯类)、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物(poloxamines)、靶向配体、内吞体裂解剂(endosomolytic agents)、细胞穿透和信号肽、磁性和非磁性纳米颗粒、RNA酶抑制剂、荧光染料、放射性同位素或用于医学成像的造影剂。术语“效应物功能”涵盖支持在生物目标处或之中或生物目标周围实现组合物的治疗活性剂的预期生物作用的任何功能。例如，已将用于核酸递送的组合物配制以包含非编码核酸或非核酸聚阴离子作为填充材料(stuffermaterial)(Kichler等人2005,J Gene Med,7,1459-1467)。这种填充材料适用于减少具有预期生物学作用的核酸的剂量，同时在不存在这种填充材料的情况下维持以较高核酸剂量获得的该作用的程度或度。非核酸聚阴离子也已用于以降低的毒性获得延长的体内基因表达(Uchida等人2011,J Control Release,155,296-302)。
文献中描述的可以是包含核糖核酸与阳离子赋形剂的复合物的颗粒制剂的有用组分的其它示例性屏蔽性聚合物包括羟乙基淀粉(HES；Noga等人Journal of ControlledRelease,2012.159(1):92-103、PAS-/PA-多肽(Pro、Ala、Ser(或Pro、Ala)多肽：Schlapschyet a.Protein Eng Des Sel.2013Aug；26(8):489-501或聚肌氨酸(Psar,:Heller等人Macromol Biosci2014；14:1380-1395)。
靶向配体可以用于例如颗粒制剂中，以用于递送核糖核酸来实现对目标细胞的优先和提高的转染(Philipp和Wagner in“Gene and Cell Therapy–TherapeuticMechanisms and Strategy”,第3版,第15章,CRC Press,Taylor&Francis Group LLC,BocaRaton 2009)。靶向配体可以是以直接或间接方式赋予本发明的组合物目标识别和/或目标结合功能的任意化合物。示例性靶向配体是WO 2011/076391中公开的前列环素类似物，如Iloprost或Treprostinil。抗体还可以作为靶向配体。作为颗粒的配体，可以提及叶酸和N-乙酰半乳糖胺。一般而言，目标是独特的生物学结构，靶向配体可以通过分子相互作用特异性与其结合，并且其中这种结合将最终导致组合物中所含的治疗剂(如核酸)优先积累在目标组织中和/或目标细胞处或目标细胞中。靶向配体可以例如偶联至屏蔽性聚合物的末端。
此外，内吞体裂解剂如内吞体裂解肽(Plank等人1998,Adv Drug Deliv Rev,34,21-35)或适合增强内吞核酸的内体释放的任意其它化合物是本发明的组合物的有用组分。类似地，细胞穿透肽(在另一种背景下也称为蛋白质转导结构域)(Lindgren等人2000,Trends Pharmacol Sci,21,99-103)可以是本发明的组合物的有用组分，以介导核酸的胞内递送。所谓的TAT肽属于这一类，并且还具有核定位功能(Rudolph等人2003,J BiolChem,278,11411-11418)。
优选地，颗粒具有以作为治疗活性剂的RNA的重量比颗粒制剂中颗粒的总重量来表示的0.1至95％(w/w)，更优选地0.5至80％(w/w)，最优选地1至50％(w/w)范围内的活性载荷。
包含颗粒和1,2-丙二醇的组合物
根据本发明的第一方面的组合物和根据本发明的第三方面的固体组合物包括含有RNA和脂质组合物的颗粒以及1,2-丙二醇。将理解的是，关于RNA的、脂质组合物的和包含RNA和脂质组合物的颗粒的合适和优选实施方式的上述信息继续适用于以下讨论的上下文中。
由于根据本发明的第一方面的组合物含有RNA作为治疗活性剂并且适合于将治疗活性剂给予至患者，因此其可以被称为治疗组合物或药物组合物。
在根据本发明的第一方面的组合物中，所述组合物包括在液相中的含有RNA和脂质组合物的颗粒，含有RNA和脂质组合物的颗粒优选地分散在液相中。如术语“分散的”所暗示的，在这种情况下，颗粒在连续的液相中形成不连续相。通常，优选将分散体提供为两相分散体，具有一个连续液相和作为不连续相分散在其中的包含RNA和脂质组合物的颗粒。
根据本发明的第一方面的组合物，其中含有RNA和脂质组合物的颗粒包含在液相中，优选地包含一定量的颗粒，以提供基于组合物的总体积0.01至50mg/ml，更优选地0.02至30mg/ml，并且最优选地0.05至10mg/ml浓度的颗粒中所包含的RNA。
通常，根据本发明的第一方面的组合物的液相中含有1,2-丙二醇作为其它组分，其中含有包含RNA和脂质组合物的颗粒，该颗粒优选地悬浮在其中。1,2-丙二醇优选地溶解在液相中。然而，其也可以部分地与包含在液相中的颗粒结合。
在根据本发明的第一方面的组合物中，所述组合物包括在液相中包含的颗粒，1,2-丙二醇优选地以0.1至50％w/v，更优选地0.2至30％w/v，最优选地0.3至20％w/v的浓度存在，其中百分比值表示每100ml组合物的总体积中1,2-丙二醇的以g计的重量。
其中含有颗粒(颗粒优选地分散在其中)的液相通常含有水作为溶剂。优选地，水提供按体积(基于20℃下液相的总体积)计50％或更多，更优选地70％或更多。更优选地，水和1,2-丙二醇是液相中仅含有的溶剂。
作为液相的示例性进一步任选的添加剂，可以提及选自盐、糖、有机溶剂和缓冲剂中的一种或多种。可以使用常规用于医药应用或生物学应用的缓冲剂。
根据本发明的第三方面的固体组合物含有与可以经冷冻以获得固体组合物的组合物相同的组分。因此，以上提供的关于RNA的、脂质组合物的、包含RNA和脂质组合物的颗粒的、1,2-丙二醇的、和液相及其组分的合适和优选实施方式的信息同等适用于包含液相的组合物和适用于固体组合物。然而，本领域技术人员将理解的是，液相已在固体组合物中固化。就此而言，固体组合物优选地在冷冻液体的固体连续相中含有治疗剂的颗粒制剂的分散体。与上文相符，1,2-丙二醇优选地包含在其中颗粒制剂所分散的连续相中。
与上文相符，根据本发明的第一方面的强烈优选的组合物是包含以下的组合物：
(i)分散在包含水作为溶剂的液相中的纳米颗粒或微颗粒，其中纳米颗粒或微颗粒包含mRNA和脂质组合物，其中脂质组合物包含组分(i-a):(i-b):(i-c)的摩尔比是1:(1至3):(0.02至0.2)的：
(i-a)GL67或其盐，
(i-b)1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)或其盐，和
(i-c)1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG(DMPE-PEG)或其盐，其中PEG(聚乙二醇)部分含有10至140个重复单元，并且更优选地是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG5000(DMPE-PEG5000)或其盐，
并且其中脂质组合物中源自式(I)的胆固醇衍生物的氮原子N的数量与mRNA中磷酸根基团P的数量的N/P比是2至20；和
(ii)1,2-丙二醇，作为其中纳米颗粒或微颗粒所悬浮的液相中的其它组分；
并且其中组合物含有基于组合物的总体积，含量为0.3至20％w/v的1,2-丙二醇。
类似地，本发明的第三方面的强烈优选的实施方式涉及固体组合物，其包括：(i)含有RNA和前面段落中提及的脂质组合物的纳米颗粒或微颗粒，和(ii)1,2-丙二醇，该固体组合物能够通过冷冻以上强烈优选的组合物获得。
药物应用
已如上所述，存在于如上所定义的根据本发明的组合物中的RNA分子，优选mRNA分子特别用于医学环境中和某些疾病的治疗中，并且具体地用于基于RNA的疗法中。因此，包含RNA分子的根据本发明的组合物适合作为药物组合物。
具体地，根据本发明的第一方面的组合物适用于给予至患者。因此，其中含有的RNA，优选mRNA也可以被递送至对象。组合物的优选给予途径是向呼吸道给予或通过呼吸道给予，具体是肺部给予或鼻部给予。
然而，技术读者将理解的是，根据本发明的第一方面的组合物还可以通过本领域已知的用于治疗活性剂的颗粒制剂的其它给予途径来给予，如以分散体形式的静脉内给予。
用于由组合物形成气溶胶或用于雾化这样的组合物的装置是本领域已知的并且可商购获得，所述组合物包括包含在液体中的颗粒。可使用该装置以完成向呼吸道给予根据本发明的第一方面的组合物，或通过呼吸道，具体是肺部给予来给予根据本发明的第一方面的组合物。对于通过鼻部给予，例如可以使用鼻喷雾装置或鼻输注。
因此，本发明的进一步方面涉及用于由包含在液体中的颗粒组合物形成气溶胶或用于雾化这样的组合物的装置，该装置包含根据本发明的第一方面的组合物。该装置优选地是选自计量剂量吸入器、雾化器、和鼻喷雾装置的吸入器。
通过向对象的这种给予，可以在呼吸道中或通过呼吸道将包含在颗粒中的RNA递送至目标细胞。术语“递送至目标细胞”优选地意为将RNA，优选地单链RNA(如mRNA)转移至细胞中。
组合物以合适的剂量给予至对象。剂量方案将由主治医师和临床因素决定。如医学领域所公知的，用于任一对象的剂量取决于多种因素，包括对象的大小、体表面积、年龄、要给予的特定化合物、性别、给予时间和途径、总体健康以及其它同时给予的药物。治疗活性物质的典型剂量可以在例如1ng至几克的范围内。用于表达或抑制表达的(m)RNA的剂量应与此范围相对应；然而，设想了此示例性范围以下或以上的剂量，特别是考虑到上述因素。总体上，作为药物组合物的常规给予方案应在每天每千克体重0.01μg至10mg单位的范围内。如果方案是连续输注，则还应分别在每千克体重1μg至10mg单位的范围内。可以通过定期评估来监测进展。剂量将变化，但是给予作为本发明的组合物成分的(m)RNA的优选剂量是大约106至1019个拷贝的(m)RNA分子。
本发明还提供了治疗方法，包括向患者给予根据本发明的第一方面的组合物，优选地通过向呼吸道给予或通过呼吸道给予，更优选地通过肺部给予或鼻部给予。因此，包含在所述组合物中的RNA可以引起预防或治疗作用。值得注意的是，术语“患者”包括动物和人。
通过向对象给予本发明的，特别是本发明的第一方面的组合物，可以治疗或预防疾病。术语“疾病”指代可以通过使用本发明的组合物来治疗、预防或接种的任何可想到的病理状况。所述疾病可以例如被遗传、获得、是传染性或非传染性的、年龄相关的、是心血管的、代谢的、肠的、瘤的(特别是癌症)或基因的。疾病可以例如基于生物体内的生理过程、分子过程、生化反应的不规律性，其反过来可以例如基于生物体的遗传设备、基于行为、社会或环境的因素，如暴露于化学物质或辐射。
本文所用的术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”总体上意为获得期望的药理和/或生理作用。因此，本发明的治疗可以涉及某种疾病的(急性)状态的治疗，但是就完全或部分预防疾病或其症状而言也可以涉及预防性治疗。优选地，术语“治疗”应被理解为就部分或完全治愈疾病和/或归因于疾病的副作用和/或症状而言是治疗性的。在这方面，“急性”意为对象显示疾病的症状。换言之，待治疗的对象实际上需要治疗，并且在本发明的上下文中，术语“急性治疗”涉及在疾病发作或疾病爆发后实际治疗疾病所采取的措施。治疗还可以是预防性或预防治疗，即为预防疾病所采取的措施，例如，以防止疾病的感染和/或发作。可以通过定期评估来监测治疗进展。
总体上，RNA，优选mRNA以有效剂量包括在根据本发明的组合物中。术语“有效量”指代足以在给予药物组合物的对象中引起可检测的治疗反应的量。根据上文，药物组合物中根据本发明的上述第一方面的RNA，优选mRNA的含量不受限制，只要其用于上述治疗即可。如上所述，根据本发明的第一方面的组合物，其中包含RNA和脂质组合物的颗粒包含在液相中，优选地包含一定量的颗粒，以提供基于组合物的总体积0.01至50mg/ml，更优选地0.02至30mg/ml，并且最优选地0.05至10mg/ml浓度的包含在颗粒中的RNA。
根据本发明，术语“药物组合物”涉及给予至对象的根据本发明的组合物，具体是根据本发明的第一方面的组合物。示例性对象包括哺乳动物，如狗、猫、猪、牛、绵羊、马、啮齿类动物，例如大鼠、小鼠和豚鼠、或灵长类动物，例如大猩猩、黑猩猩和人。在最优选的实施方式中，对象是人。
本发明的药物组合物可以用于基于RNA的疗法中。如上所述，RNA分子，优选mRNA分子包含编码蛋白质的序列，因此可以用于基于RNA的疗法，其中RNA，优选mRNA编码具有治疗或预防作用的治疗或药物活性多肽或蛋白质。因此，在优选的实施方式中，本发明的药物组合物可以用于基于RNA的疗法中，以治疗或预防上表2中所列的疾病。因此，根据本发明的基于RNA的疗法可以用于治疗或预防上表2中所列的疾病。
因此，在上表2中描述的基因缺陷导致疾病的情况下，本发明的药物组合物可以用于基于RNA的疗法中，该疾病然后可以通过使用本发明的RNA分子，优选mRNA分子的转录物替代疗法/酶替代疗法来治疗或预防，其中RNA分子编码完整形式的蛋白质或其功能片段，从而补偿所公开的缺陷基因。
在其它实施方式中，本发明的药物组合物可以用于根据本发明的基于RNA的疗法中，其中RNA，优选mRNA编码具有治疗或预防作用的治疗或药物活性多肽、蛋白质或肽，其中所述多肽、蛋白质或肽选自由表2中概述的基因编码的组。
本发明的药物组合物特别适用于基于RNA的疗法中，以治疗或预防肺部疾病。作为示例性疾病，可以提及上表2中所列的α-1-抗胰蛋白酶、哮喘、囊性纤维化、表面活性剂代谢功能障碍或原发性纤毛运动障碍。
在其它示例性实施方式中，本发明的药物组合物可以用于基于RNA的疗法中，以治疗或预防溶酶体病，如高歇病、法布里病、MPS I、MPS II(亨特综合征)、MPS VI和糖原贮积病，如，例如糖原贮积病I型(冯吉尔克氏综合征病)、II型(蓬珀氏病)、III型(柯里氏病)、IV型(安德森氏病)、V型(麦卡德尔氏病)、VI型(赫斯氏病)、VII型(Tauri氏病)、VII型、IX型、X型、XI型(Fanconi-Bickel综合征)、XI型、0型。转录物替代疗法/酶替代疗法有益地不影响潜在的遗传缺陷，但是增加患者缺陷的酶的浓度。作为实例，在蓬珀氏病中，转录物替代疗法/酶替代疗法替代缺乏的溶酶体酶酸性α-葡糖苷酶(GAA)。
根据进一步的实例，根据本发明的基于RNA的疗法可以用于治疗癌症、心血管疾病、病毒感染、免疫机能障碍、自身免疫疾病、神经学障碍、遗传性代谢障碍或基因障碍或任何疾病，其中细胞中产生的蛋白质或蛋白质片段可具有本专利的有益作用。癌症的实例包括头颈癌、乳腺癌、肾癌、膀胱癌、肺癌、前列腺癌、骨癌、脑癌、子宫颈癌、肛门癌、结肠癌、结直肠癌、阑尾癌、眼癌、胃癌、白血病、淋巴瘤、肝癌、皮肤癌、卵巢癌、阴茎癌、胰腺癌、睾丸癌、甲状腺癌、阴道癌、外阴癌、子宫内膜癌、心脏癌和肉瘤。心血管疾病的实例包括动脉粥样硬化、冠心病、肺心病和心肌病。免疫机能障碍和自身免疫疾病的实例包括但不限于风湿性疾病、多发性硬化和哮喘。病毒感染的实例包括但不限于人免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒以及乙型和丙型肝炎病毒的感染。神经学障碍的实例包括但不限于帕金森氏病、多发性硬化和痴呆。遗传性代谢障碍的实例包括但不限于高歇氏病和苯丙酮尿症。
制备方法
用于提供在液相中包含核酸和脂质组合物的颗粒的合适技术是本领域技术人员可获得的，并且可被改造以提供根据本发明的第一方面的组合物，其中颗粒包含RNA以及上文讨论的脂质组合物。
例如，作为包含RNA和脂质组合物的颗粒的脂质体可以通过以下方便地提供：脂质组合物的再水合，如脂质膜的再水合，然后在需要时通过均化技术(如，例如超声作用或挤出)。可选方法是将溶于有机溶剂的脂质组合物输注到水或水溶液中。作为可依赖于例如脂质纳米颗粒的形成的示例性方法，可以提及溶剂置换法(solvent displacement method)。
作为用于提供其中颗粒包含在液相中的根据本发明的组合物的可选方法，可以提及沉淀法，如颗粒的纳米沉淀。
可以将1,2-丙二醇方便地添加至液相，其中含有包括RNA和脂质组合物的颗粒，或者颗粒将提供于其中。将1,2-丙二醇添加至液相可以在各个阶段中的一个或多个(包括在液相中提供包含RNA和脂质组合物的颗粒之前、期间或之后)完成。
因此，如上所述，本发明的进一步方面涉及用于制备根据本发明的第一方面的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将脂质组合物的组分溶解并混合在有机溶剂中，然后将脂质组合物冻干；
b)通过添加水使冻干的脂质组合物再水合；
c)将再水合的脂质组合物与RNA的水溶液组合，以允许形成包含在液相中的包含RNA和脂质组合物的颗粒；和
d)添加1,2-丙二醇。
1,2-丙二醇的添加可以例如通过以下来方便地完成：在步骤b)中将其与水一起添加、在步骤b)后将其添加至再水合的脂质组合物中、在步骤c)中将其与RNA的水溶液一起添加、或在步骤c)后将其添加至液相中，其中包含了含有RNA和脂质组合物的颗粒。将理解的是，添加可以在一个步骤中或多个步骤中进行，例如，在该方法的不同阶段进行。
根据本发明的第三方面的固体组合物可以通过方法来制备，所述方法包括：
第一步骤，通过包括以下的方法制备根据上述第一方面的组合物：
a)将脂质组合物的组分溶解并混合在有机溶剂中，然后将脂质组合物冻干；
b)通过添加水使冻干的脂质组合物再水合；
c)将再水合的脂质组合物与RNA的水溶液组合，以允许形成包含在液相中的包含RNA和脂质组合物的颗粒；和
d)添加1,2-丙二醇；
和第二步骤，冷冻第一步骤中获得的组合物。
同样在此方法中，1,2-丙二醇的添加可以例如通过以下来方便地完成：在步骤b)中将其与水一起添加、在步骤b)后将其添加至再水合的脂质组合物中、在步骤c)中将其与RNA的水溶液一起添加、或在步骤c)后将其添加至液相中，其中包含了含有RNA和脂质组合物的颗粒。将理解的是，添加可以在一个步骤中或多个步骤中进行，例如，在该方法的不同阶段进行。
作为第二步骤的冷冻步骤通常通过在合适的容器中使悬浮液组合物经受足够冷的温度(例如-10℃或更低，优选地-20℃或更低)来完成。作为冷却介质，例如，可以使用冷空气或冷液体。
附带地，如上解释的，根据本发明的第三方面的固体组合物是允许存储包含RNA的颗粒的组合物。在此程度上，将理解的是，通过解冻固体组合物，也可以从根据本发明的第三方面的固体组合物回收根据本发明的第一方面的组合物。
因此，作为进一步的方面，本发明还提供了用于制备根据上述第一方面的组合物的方法，所述方法包括：
第一步骤，通过包括以下的方法制备根据上述第一方面的组合物：
a)将脂质组合物的组分溶解并混合在有机溶剂中，然后将脂质组合物冻干；
b)通过添加水使冻干的脂质组合物再水合；
c)将再水合的脂质组合物与RNA的水溶液组合，以允许形成包含在液相中的包含RNA和脂质组合物的颗粒；和
d)添加1,2-丙二醇；
第二步骤，冷冻第一步骤中获得的组合物，和
第三步骤，解冻第二步骤中获得的冷冻组合物。
在以下项目中提供了本发明的重要方面的概述。将理解的是，这些项目形成本发明的一般性公开内容的部分，使得在说明书的前面部分中提供的例如关于进一步优选的实施方式或任选的特征的信息也适用于以下项目。
1.组合物，包含：
(i)包含在液相中的颗粒，其中颗粒包含RNA和脂质组合物，并且其中脂质组合物包含：
(i-a)式(I)的胆固醇衍生物或其盐：
其中
n是0或1，优选是0，
R1是基团–(CH2)q-NH2或基团–(CH2)r-NH-(CH2)s-NH2，
其中q、r和s独立地是2至6的整数，
R2是基团–(CH2)t-NH2或基团–(CH2)u-NH-(CH2)w-NH2，
其中t、u和w独立地是2至6的整数，
R3是具有1至4个碳原子的直链烷二基；
(i-b)式(II)的磷酸甘油酯或其盐：
其中
R4是具有10至24个碳原子的直链烷基或具有1至3个双键和10至24个碳原子的直链烯基；
R5是具有10至24个碳原子的直链烷基或具有1至3个双键和10至24个碳原子的直链烯基；
和
(i-c)式(III)的聚乙二醇化磷酸甘油酯或其盐：
其中
p是5至200，优选地10至170，并且最优选地10至140的整数
R6是具有10至20个碳原子的直链烷基或具有1至3个双键和10至20个碳原子的直链烯基；
R7是具有10至20个碳原子的直链烷基或具有1至3个双键和10至20个碳原子的直链烯基；
和
(ii)1,2-丙二醇。
2.根据项目1的组合物，其中RNA是mRNA。
3.根据项目1或2的组合物，其中，在式(I)中，n是0，R1是基团–(CH2)3-NH2，并且R2是基团-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2。
4.根据项目1或2的组合物，其中式(I)的胆固醇衍生物是GL67。
5.根据项目1至4中任一项的组合物，其中，在式(II)中，R4和R5各自是具有一个双键和14至20个碳原子的直链烯基。
6.根据项目1至4中任一项的组合物，其中式(II)的磷酸甘油酯是1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
7.根据项目1至6中任一项的组合物，其中，在式(III)中，R6和R7各自是具有10至16个碳原子的直链烷基，并且p是10至140的整数。
8.根据项目1至6中任一项的组合物，其中式(III)的聚乙二醇化磷酸甘油酯是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG(DMPE-PEG)，其中PEG部分含有10至140个重复单元，并且更优选地是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG5000(DMPE-PEG5000)。
9.根据项目1至8中任一项的组合物，其中脂质组合物中的组分(i-a):(i-b):(i-c)的摩尔比是：
1:(0.5至5):(0.01至1)，
更优选地
1:(1至5):(0.01至0.5)，
最优选地
1:(1至3):(0.02至0.2)。
10.根据项目1至9中任一项的组合物，其中颗粒是纳米颗粒或微颗粒。
11.根据项目10的组合物，其中颗粒的平均粒径在1至5000nm，更优选地10至4000nm，并且最优选地50至3000nm的范围内。
12.根据项目1至11中任一项的组合物，其中颗粒的最大粒径是20μm，更优选地10μm，并且最优选地5μm。
13.根据项目1至12中任一项的组合物，其中源自式(I)的胆固醇衍生物的氮原子N的数量与RNA中磷酸根基团P的数量的N/P比在1至100，更优选地1至30，并且最优选地2至20的范围内。
14.根据项目1至13中任一项的组合物，其中颗粒具有以RNA的重量比颗粒的总重量来表示的0.1至95％，更优选地0.5至80％，最优选地1至50％范围内的活性载荷。
15.根据项目1至14中任一项的组合物，其包含颗粒，所述颗粒包含一定量的RNA和脂质组合物，以提供基于组合物的总体积0.01至50mg/ml，更优选地0.02至30mg/ml，并且最优选地0.05至10mg/ml浓度的RNA。
16.根据项目1至15中任一项的组合物，其中包含RNA和脂质组合物的颗粒分散在液相中。
17.根据项目1至16中任一项的组合物，其中1,2-丙二醇包含在含有颗粒的液相中。
18.根据项目1至17中任一项的组合物，其中含有基于组合物的总体积0.1至50％w/v，更优选地0.2至30％w/v，并且最优选地0.3至20％w/v浓度的1,2-丙二醇。
19.根据项目1至18中任一项的组合物，其中，其中含有颗粒的液相包含水。
20.根据项目19的组合物，其中水提供基于液相的总体积50体积％或更多，更优选地70体积％或更多。
21.根据项目1至20中任一项的组合物，其中水和1,2-丙二醇是液相中仅含有的溶剂。
22.根据项目1至21中任一项的组合物，其中，其中含有颗粒的液相包含缓冲剂。
23.用于制备根据项目1至22中任一项的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将脂质组合物的组分溶解并混合在有机溶剂中，然后将脂质组合物冻干；
b)通过添加水使冻干的脂质组合物再水合；
c)将再水合的脂质组合物与RNA的水溶液组合，以允许形成包含在液相中的包含RNA和脂质组合物的颗粒；和
d)添加1,2-丙二醇。
24.固体组合物，包含：
(i)包含RNA和脂质组合物的颗粒，和
(ii)1,2-丙二醇,所述颗粒组合物能够通过冷冻根据项目1至22中任一项的组合物获得。
25.根据项目1至22中任一项的组合物，用于通过基于RNA的疗法治疗预防疾病。
26.根据项目25使用的组合物，其中要治疗或要预防的疾病是肺部疾病。
27.根据项目25或26使用的组合物，其中治疗或预防涉及将组合物给予至呼吸道或通过呼吸道，优选地通过肺部给予或鼻部给予来给予组合物。
28.治疗方法，包括向患者给予根据项目1至22中任一项所述的组合物，优选地向呼吸道给予或通过呼吸道给予，更优选地通过肺部给予或鼻部给予。
29.根据项目28的方法，用于治疗肺部疾病。
30.用于由包含在液体中的颗粒组合物形成气溶胶或用于雾化这样的组合物的装置，所述装置包含根据项目1至22中任一项的组合物。
31.根据项目30的装置，其中装置是选自计量剂量吸入器、雾化器、和鼻喷雾装置的吸入器。
实施例
缩写
缩写 描述
RT 室温
mRNA 信使核糖核酸
FLuc 萤火虫萤光素酶
w/o 没有
cmRNA 化学修饰的核糖核酸
FLuc 萤火虫萤光素酶
PG 1,2-丙二醇、丙二醇
N/P 胆固醇衍生物(I)中氮原子的数量/mRNA
中磷酸根基团的数量
实施例I：将复合物施加至ALI培养物
方法：
以N/P5(和N/P3)配制RNA-脂质复合物：
GL67、DOPE和DMPE-PEG5000的储备溶液各自在叔丁醇和水的9:1混合物中以10-20mg/mL的浓度产生。以1:2:0.05(GL67:DOPE:DMPE-PEG5000)的摩尔比，5mg的总脂质质量将脂质混合，在-80℃下冷冻过夜，并冻干至少96h。在使用前，通过添加400μL5％(v/v)丙二醇使干燥的脂质混合物再水合(得到的总脂质浓度是12.5mg/mL)，然后在室温下温育30min而不摇动，涡旋10s，然后在37℃水浴中超声作用10min。将产生的脂质体混合物稀释以与mRNA复合。为此目的，将69.65μL(对于N/P3为87.69μL)水与10.24μL丙二醇混合并涡旋3s。添加45.10μL(对于N/P3为27.06μL)脂质体混合物，并将混合物涡旋10s，并在39℃下平衡3min。将125μL mRNA水溶液(c:0.5mg/mL)在39℃下平衡3min。对于复合物组合(complexassembling)，将mRNA稀释液浸入(吸入，soaked into)细针注射器(BD Micro-FineInsuline注射器0.5mL U40 8mm，07468060Becton Dickinson)中，将其快速注入脂质体稀释液中，立即涡旋10s，并在室温下温育10min，以进行复合物组合。然后将复合物存储在冰上。
ALI培养物的处理
MucilAirTM-ALI获自Epithelix(法国)。转染前5天，进行粘液洗涤，以去除顶表面(apical surface)上的积累粘液。将200μL的PBS-/-添加至顶侧，并在37℃下温育20min。为了从顶表面分离粘液，用移液管，以100μL从顶部液体进行3次来回运动。通过轻柔吸取，从MucilAirTM顶表面去除PBS-/-，而不损伤上皮细胞。在转染的当天，用200μL PBS-/-再次洗涤ALI培养物，随后用200μL的mRNA复合物的相应稀释剂(水或5％丙二醇)进行洗涤步骤。通过轻柔吸取，立即从ALI培养物的顶表面去除稀释剂，而不损伤上皮细胞。然后，每个孔用总体积为50μL的3μg总复合的mRNA转染。用相应的稀释剂将制剂稀释，将其添加至ALI培养物的顶表面，并在37℃和5％CO2下温育6h。之后，去除复合物溶液，并用PBS-/-洗涤细胞层并作为ALI培养物在37℃和5％CO2下维持24h。
通过荧光显微镜检术检测tdTomato：
转染后24h，使用荧光成像检测阳性tdTomato信号。用以下设置产生每个孔的代表性图片：曝光500ms，增益：1.5，强度：30％。
结果：
为了处理ALI培养物，使用编码tdTomato的mRNA。处理后24小时，分析经处理的孔的tdTomato蛋白。在图1中，显示了示例性图片。
如图1中所示，丙二醇的添加显著提高了递送至细胞并翻译成蛋白质的mRNA的水平。可以在N/P 3以及N/P 5中观察到这种作用。
实施例II：复合物的鼻部施用
方法：
RNA-脂质复合物的配制：
如先前实施例I中所描述的形成复合物
动物的处理：
用mRNA剂量为10μg/40μL的复合物处理Balb/c小鼠(Charles River实验室)。在异氟烷(Isothesia,Henry Shine,德国)吸入麻醉期间，以一滴的形式施加溶液到动物鼻孔上。
鼻组织中萤光素酶水平的检测：
施用后5h，将1.5mg溶解于50μL PBS中的D-萤光素鼻内施加(嗅探法)到每只动物的鼻孔上。使用IVIS 100体内成像系统(Perkin Elmer,USA)进行生物发光成像。成像后，立即通过颈椎脱位(cervical dislocation)处死动物。使用Living Image软件(PerkinElmer,USA)，通过测量设定的感兴趣区域(ROI)中的辐射率来分析图片。数值显示为平均辐射率[p/s/cm2/sr]。
结果：
为了通过对鼻进行嗅探来处理Balb/c小鼠，使用以N/P 5复合的编码萤火虫萤光素酶的mRNA。处理后5h，鼻组织萤光素酶活性的分析结果(图2)显示，与不存在丙二醇(0％PG，水)的相同复合物相比，5％丙二醇溶液中的复合物导致了在鼻组织中更高的报道蛋白活性。
实施例III：一个冷冻-解冻周期期间粒度的稳定化
方法：
颗粒的配制：
如实施例I中所描述的形成颗粒。
颗粒溶液的冷冻：
配制后，通过将颗粒存储在-20℃下至少16h来将其冷冻。
大小测量：
使用ZetaSizer Nano ZS(Malvern仪器)，通过动态光散射来测量颗粒的流体动力学直径。为了进行正确的测量，如果适用，将软件所使用以计算溶液粘度的缓冲剂组分调整为含1,2-丙二醇的溶液。
结果：
配制颗粒。配制后，在含有或不含1,2-丙二醇的溶液中测量新鲜颗粒的粒度。将颗粒在-20℃下冷冻16h，并通过在室温下温育来解冻。再次测量解冻溶液中的粒度。为了维持活性，冷冻之前和解冻之后的粒度偏差应当最小。如图3中所示，由于在冷冻期间的聚集过程，在不含1,2-丙二醇的溶液中冷冻的颗粒的大小显著增加。在存在1,2-丙二醇的情况下，在冷冻解冻周期后，粒度保持稳定。
附图说明
图1显示了在N/P 3和5下，用在不同赋形剂溶液(水(0％丙二醇)或5％丙二醇)中的GL67复合物转染后的tdTomato水平。
图2显示了用在水中或在5％丙二醇溶液中的GL67复合物处理后5h，Balb/c小鼠的鼻中萤光素酶活性。
图3显示了在存在或不存在1,2-丙二醇的情况下冷冻之前和解冻之后的粒度。

Claims (19)

1.组合物，包含：
(i)包含在液相中的颗粒，其中所述颗粒包含RNA和脂质组合物，并且其中所述脂质组合物包含：
(i-a)式(I)的胆固醇衍生物或其盐：
其中
n是0或1，
R1是基团-(CH2)q-NH2或基团-(CH2)r-NH-(CH2)s-NH2，
其中q、r和s独立地是2至6的整数，
R2是基团-(CH2)t-NH2或基团-(CH2)u-NH-(CH2)w-NH2，
其中t、u和w独立地是2至6的整数，
R3是具有1至4个碳原子的直链烷二基；
(i-b)式(II)的磷酸甘油酯或其盐：
其中
R4是具有10至24个碳原子的直链烷基或具有1至3个双键和10至24个碳原子的直链烯基；
R5是具有10至24个碳原子的直链烷基或具有1至3个双键和10至24个碳原子的直链烯基；
和
(i-c)式(III)的聚乙二醇化磷酸甘油酯或其盐：
其中
p是5至200的整数；
R6是具有10至20个碳原子的直链烷基或具有1至3个双键和10至20个碳原子的直链烯基；
R7是具有10至20个碳原子的直链烷基或具有1至3个双键和10至20个碳原子的直链烯基；
和
(ii)1,2-丙二醇。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中n是0。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中p是10至170的整数。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中p是10至140的整数。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述RNA是mRNA。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述式(I)的胆固醇衍生物是GL67。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述式(II)的磷酸甘油酯是1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述式(III)的聚乙二醇化磷酸甘油酯是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-PEG5000。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述脂质组合物中组分(i-a):(i-b):(i-c)的摩尔比是1:(0.5至5):(0.01至1)。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述颗粒具有1至5000nm范围内的平均粒径。
11.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中源自所述式(I)的胆固醇衍生物的氮原子N的数量与所述RNA中磷酸根基团P的数量的N/P比在1至100的范围内。
12.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中含有基于所述组合物的总体积0.1至50％w/v浓度的所述1,2-丙二醇。
13.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中包含所述颗粒的所述液相包含水。
14.用于制备根据权利要求1至13中任一项的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将所述脂质组合物的组分溶解并混合在1,2-丙二醇中，然后冻干所述脂质组合物；
b)通过添加水和1,2-丙二醇的混合物使冻干的所述脂质组合物再水合；
c)将再水合的所述脂质组合物与所述RNA的水溶液组合，以允许形成包含在液相中的包含RNA和所述脂质组合物的颗粒；和
d)添加1,2-丙二醇。
15.固体组合物，包含：
(i)包含RNA和脂质组合物的颗粒，和
(ii)1,2-丙二醇，
所述固体组合物能够通过冷冻根据权利要求1至13中任一项所述的组合物获得。
16.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物在制备用于通过基于RNA的疗法治疗或预防疾病的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中要治疗或要预防的疾病是肺部疾病。
18.根据权利要求16或17所述的用途，其中所述治疗或预防涉及向呼吸道给予所述组合物或通过呼吸道来给予所述组合物。
19.根据权利要求16或17所述的用途，其中所述治疗或预防涉及通过肺部给予或鼻部给予来给予所述组合物。
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Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012170889A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cleavable lipids
JP6184945B2 (ja) 2011-06-08 2017-08-23 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド ｍＲＮＡ送達のための脂質ナノ粒子組成物および方法
CN104334161A (zh) 2012-03-29 2015-02-04 夏尔人类遗传性治疗公司 可电离的阳离子脂质
MX365409B (es) 2013-03-14 2019-05-31 Shire Human Genetic Therapies Composiciones de ácido ribonucleico mensajero del regulador transmembrana de fibrosis quística y métodos y usos relacionados.
CN105051213A (zh) 2013-03-14 2015-11-11 夏尔人类遗传性治疗公司 信使rna加帽效率的定量评估
EP2971098B1 (en) 2013-03-14 2018-11-21 Translate Bio, Inc. Quantitative assessment for cap efficiency of messenger rna
AU2014340149B2 (en) 2013-10-22 2020-12-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. CNS delivery of mRNA and uses thereof
CN105813656B (zh) 2013-10-22 2021-01-15 夏尔人类遗传性治疗公司 用于递送信使rna的脂质制剂
US10022455B2 (en) 2014-05-30 2018-07-17 Translate Bio, Inc. Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids
EP3884964A1 (en) 2014-12-05 2021-09-29 Translate Bio, Inc. Messenger rna therapy for treatment of articular disease
MX2019005470A (es) 2016-11-10 2019-11-21 Translate Bio Inc Formulación de nanopartículas lipídicas basadas en ice mejorada para el suministro de arnm.
IL268857B2 (en) 2017-02-27 2024-09-01 Translate Bio Inc Methods for the purification of messenger RNA
WO2018231709A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Translate Bio, Inc. Poly(phosphoesters) for delivery of nucleic acids
EP3727428A1 (en) 2017-12-20 2020-10-28 Translate Bio, Inc. Improved composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
AU2019258678B2 (en) * 2018-04-25 2024-08-22 Ethris Gmbh Lipid-based formulations for the delivery of RNA
WO2019222424A1 (en) 2018-05-16 2019-11-21 Translate Bio, Inc. Ribose cationic lipids
AU2019275068B2 (en) 2018-05-24 2024-09-26 Translate Bio, Inc. Thioester cationic lipids
US11547666B2 (en) 2018-05-30 2023-01-10 Translate Bio, Inc. Cationic lipids comprising a steroidal moiety
CA3109548A1 (en) * 2018-08-14 2020-02-20 Ethris Gmbh Lipid-based formulations containing salts for the delivery of rna
WO2020041793A1 (en) 2018-08-24 2020-02-27 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
EP3908597A1 (en) 2019-01-07 2021-11-17 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of primary ciliary dyskinesia
JP2022532214A (ja) 2019-05-15 2022-07-13 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａの精製方法
EP4041400A1 (en) 2019-10-09 2022-08-17 Translate Bio, Inc. Compositions, methods and uses of messenger rna
WO2021079002A2 (en) 2019-10-24 2021-04-29 Novago Therapeutics Ag Novel anti-nogo-a antibodies
JP2023508881A (ja) 2019-12-20 2023-03-06 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド Ｍｒｎａ担持脂質ナノ粒子を調製する改善されたプロセス
JP2023514450A (ja) 2020-02-25 2023-04-05 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド Ｍｒｎａ担持脂質ナノ粒子を調製する改善された方法
US20230242624A1 (en) 2020-06-02 2023-08-03 Neurimmune Ag HUMAN ANTIBODIES AGAINST SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS-2 (SARS-CoV-2)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1981044A (zh) * 2004-06-07 2007-06-13 普洛体维生物治疗公司 包封干扰rna的脂质
CN104382853A (zh) * 2008-10-16 2015-03-04 玛瑞纳生物技术有限公司 基因沉默治疗剂的脂质体有效递送方法和组合物
WO2018089540A1 (en) * 2016-11-08 2018-05-17 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4711955A (en) 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
CA1223831A (en) 1982-06-23 1987-07-07 Dean Engelhardt Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same
JPS607932A (ja) * 1983-06-29 1985-01-16 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd リポソーム懸濁液およびその製法
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5840710A (en) 1994-12-09 1998-11-24 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles containing ester or ether-linked lipophilic groups for intracellular delivery of therapeutic molecules
WO1996034109A1 (en) * 1995-04-25 1996-10-31 Vical Incorporated Single-vial formulations of dna/lipid complexes
US6017700A (en) 1995-08-04 2000-01-25 Bayer Corporation Cationic oligonucleotides, and related methods of synthesis and use
NZ502500A (en) * 1997-06-27 2002-03-28 Vivorx Pharmaceuticals Inc Novel formulations of pharmacological agents, methods for the preparation thereof and methods for the use thereof
TW520294B (en) * 1998-01-08 2003-02-11 Res Dev Foundation Stabilization of lipid: DNA formulations during nebulization
EP1766053A4 (en) * 2004-06-02 2007-12-12 Sourcepharm Inc MICROVESICLES CONTAINING RNA AND METHODS
SI3611266T1 (sl) 2005-08-23 2023-02-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modificirani nukleozidi, ki vsebujejo RNA, in postopki za njihovo uporabo
CA2631714C (en) * 2005-12-02 2014-09-16 Novartis Ag Nanoparticles for use in immunogenic compositions
BRPI0619932A2 (pt) 2005-12-15 2011-10-25 Centre Nat Rech Scient moléculas de oligonucleotìdeo-oligocátion, método para a obtenção das mesmas, reagentes de fosforamidita, método para uso em biologia e diagnóstico, e, composições farmacêuticas
CA2742954C (en) 2008-11-07 2018-07-10 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
EP2459231B1 (de) 2009-07-31 2016-06-08 Ethris Gmbh Rna mit einer kombination aus unmodifizierten und modifizierten nucleotiden zur proteinexpression
CA3044884A1 (en) 2009-12-07 2011-06-16 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
EP2338520A1 (de) 2009-12-21 2011-06-29 Ludwig Maximilians Universität Konjugat mit Zielfindungsligand und dessen Verwendung
DK2709589T3 (en) * 2011-05-16 2017-01-23 Univ Danmarks Tekniske Charge release of self-organized nanoparticles
LT3682905T (lt) 2011-10-03 2022-02-25 Modernatx, Inc. Modifikuoti nukleozidai, nukleotidai ir nukleorūgštys bei jų naudojimas
GB201118704D0 (en) * 2011-10-28 2011-12-14 Univ Oxford Cystic fibrosis treatment
PL2791160T3 (pl) * 2011-12-16 2022-06-20 Modernatx, Inc. Kompozycje zmodyfikowanego mrna
EP2858677B1 (en) 2012-06-08 2020-08-05 ethris GmbH Pulmonary delivery of messenger rna
ES2670529T3 (es) * 2013-03-15 2018-05-30 Translate Bio, Inc. Mejora sinergística de la entrega de ácidos nucleicos a través de formulaciones mezcladas
CA2916800C (en) 2013-06-28 2022-10-25 Ethris Gmbh Compositions comprising a component with oligo(alkylene amine) moieties
US9593077B2 (en) 2013-11-18 2017-03-14 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for RNA delivery
KR20160121584A (ko) * 2014-02-26 2016-10-19 에트리스 게엠베하 Rna의 위장 투여용 조성물
WO2016081029A1 (en) 2014-11-18 2016-05-26 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for rna delivery
EP3034539A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Ethris GmbH Compositions for introducing nucleic acid into cells
EP3247363A4 (en) * 2015-01-21 2018-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
CN114642735A (zh) 2015-01-21 2022-06-21 菲泽尔克斯公司 用于将治疗剂和诊断剂递送到细胞中的方法、组合物和系统
WO2018010815A1 (en) * 2016-07-15 2018-01-18 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Formulation for administration of rna
AU2019258678B2 (en) * 2018-04-25 2024-08-22 Ethris Gmbh Lipid-based formulations for the delivery of RNA

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1981044A (zh) * 2004-06-07 2007-06-13 普洛体维生物治疗公司 包封干扰rna的脂质
CN104382853A (zh) * 2008-10-16 2015-03-04 玛瑞纳生物技术有限公司 基因沉默治疗剂的脂质体有效递送方法和组合物
WO2018089540A1 (en) * 2016-11-08 2018-05-17 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Comparison of the gene transfer efficiency of mRNA/GL67 and pDNA/GL67 complexes in respiratory cells;Oliwia Andries et al.;《Mol Pharm.》;第9卷(第8期);2136-2145 *

Also Published As

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