JP2023526059A - ｍＲＮＡ治療薬及びエフェクター分子を含むＬＮＰ組成物 - Google Patents

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Abstract

本開示は、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、結合エレメント、テザー分子及び／またはエフェクター分子を含む、ＬＮＰ組成物及びシステム、ならびにその使用を扱う。本開示のＬＮＰ組成物またはシステムは、（ａ）（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびに（ｂ）（１）エフェクター分子、及び／または（２）結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。かかる組成物またはシステムは、治療ペイロードまたは予防ペイロードのレベル及び／または活性を増加させる、例えば、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡのレベル、安定性、及び／または活性を増加させることができる。また、開示されるＬＮＰ組成物またはシステムを使用して対象における障害を処置する方法、または免疫応答を調節するための方法も本明細書に開示される。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年５月１４日に出願された米国仮出願第６３／０２４，８６２号、及び２０２１年５月３日に出願された米国仮出願第６３／１８３，１１９号の優先権の利益を主張するものであり、同文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、これは参照によりその全体が本明細書に援用される。２０２１年５月１４日に作成された該ＡＳＣＩＩの写しは、４５８１７－０１０３ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、４７５，２９１バイトのサイズである。
ｍＲＮＡの効力を増加させるための努力は、非翻訳領域（ＵＴＲ）及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対して最適な配列設計を有する古典的な線状ｍＲＮＡを生成することに注がれてきた。最近の進歩により、修飾されたキャップ及びテールがｍＲＮＡを細胞分解機構に対してより耐性なものとする、末端保護が追加された。しかしながら、発現のピークまたは持続期間に関して、これらの努力により可能な限りの最大効力が達成されたことを示すものはない。これは、ｍＲＮＡ治療薬の場合に特に当てはまる。現行のアプローチは、ｍＲＮＡ自体の修飾に焦点を当てる。したがって、ＲＮＡ生物学を利用することによってｍＲＮＡ発現のピーク及び／または持続期間をさらに改善する必要性がある。
本開示は、とりわけ、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、結合エレメント、テザー分子及び／またはエフェクター分子を含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物またはシステム、ならびにその使用を提供する。本開示のＬＮＰ組成物またはシステムは、（ａ）（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびに（ｂ）（１）エフェクター分子、及び／または（２）結合エレメントに結合する、例えば、それを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、エフェクター分子は、結合エレメントを認識し、それに結合する。ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、同じまたは異なるポリヌクレオチドに配置される。ある実施形態では、本明細書に開示されるシステムは、ＬＮＰとして製剤化される。ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰ及び第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、同じＬＮＰ中で製剤化される。ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰ及び第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、異なるＬＮＰ中で製剤化される。ある態様では、本開示のＬＮＰ組成物またはシステムは、治療ペイロードまたは予防ペイロードのレベル、発現の持続期間、及び／または活性を増加させる、例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡのレベル、発現の持続期間、及び／または活性を増加させるか、あるいは治療ペイロードもしくは予防ペイロードのレベル、発現の持続期間、及び／または活性を増加させることができる。また、対象における疾患もしくは障害を処置するため、または所望の生物学的効果を促進するために、例えば、対象における免疫応答を調節するために、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、結合エレメント、テザー分子及び／またはエフェクター分子を含む、ＬＮＰ組成物またはシステムを使用する方法も本明細書に開示される。本開示の追加の態様が、下記にさらに詳細に記載される。
ある態様では、（ａ）（１）ポリペプチドをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）（１）エフェクター分子、及び（２）結合エレメントに結合する、例えば、それを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチドを含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物が本明細書に開示される。
ある実施形態では、（ａ）のポリペプチドは、レポータータンパク質を含まない。別の実施形態では、（ａ）のポリペプチドは、望ましい生物学的効果を有するペプチドまたはポリペプチド、例えば、治療用タンパク質をコードする。
ある態様では、
（ａ）（１）ポリペプチドをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）（１）エフェクター分子をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチドを含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物が本明細書に開示される。ある実施形態では、エフェクター分子は、結合エレメントに結合する、例えば、それを認識するポリペプチド（テザー分子）をさらに含む。
ある実施形態では、（ａ）のポリペプチドは、レポータータンパク質を含まない。別の実施形態では、（ａ）のポリペプチドは、望ましい生物学的効果を有するペプチドまたはポリペプチド、例えば、治療用タンパク質をコードする。
ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子ポリペプチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＲＮＡによってコードされるタンパク質のパラメータ、例えば、そのレベル及び／または活性を調節する、第１のドメインを含む。ある実施形態では、パラメータは、（１）ｍＲＮＡレベル及び／もしくは活性及び／もしくは細胞内局在化（例えば、半減期及び／または発現）、（２）タンパク質レベル及び／もしくは活性（例えば、半減期及び／または発現）、（３）タンパク質翻訳速度、または（４）タンパク質局在化、例えば、位置、のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれらの全てを含む。ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子ポリペプチドは、結合エレメントに結合する、例えば、それを認識する第２のドメイン（テザー分子）を含む。
ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子は、第１のドメイン及び第２のドメインを含むポリペプチドを含む。ある実施形態では、第１のドメイン及び第２のドメインは、作動的に連結されている。
ある実施形態では、テザー分子をさらに含むエフェクター分子をコードする第２のポリヌクレオチドにおいて、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列は、テザー分子をコードするヌクレオチド配列の上流にある。ある実施形態では、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列は、テザー分子をコードするヌクレオチド配列の下流にある。ある実施形態では、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列は、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＴＰＥ（Ｐ２Ａ－Ｔ２Ａ－Ｅ２Ａ）部位）または配列内リボソーム進入部位によって、テザー分子をコードするヌクレオチド配列から分離される。
ある実施形態では、テザー分子をさらに含むエフェクター分子をコードする第２のポリヌクレオチドにおいて、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列は、テザー分子をコードするヌクレオチド配列に隣接する。
別の態様では、（ａ）（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）（１）エフェクター分子、及び（２）結合エレメントに結合する、例えば、それを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチドを含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物が本明細書に開示される。ある実施形態では、（ａ）及び（ｂ）は各々、ｍＲＮＡを含む。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドに配置される。
ある実施形態では、特定の順序を問わず、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＴＰＥ（Ｐ２Ａ－Ｔ２Ａ－Ｅ２Ａ）部位）または配列内リボソーム進入部位によって分離される。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、異なるポリヌクレオチドに配置される。
ある実施形態では、（ａ）及び（ｂ）は、ＬＮＰとして製剤化、例えば、同じＬＮＰとして製剤化される。ある実施形態では、（ａ）及び（ｂ）は、異なるＬＮＰとして製剤化される。
別の態様では、（ａ）（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）（１）エフェクター分子をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチドを含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物が本明細書に開示される。ある実施形態では、エフェクター分子は、結合エレメントに結合する、例えば、それを認識するポリペプチド（テザー分子）をさらに含む。
ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子ポリペプチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＲＮＡによってコードされるタンパク質のパラメータ、例えば、そのレベル及び／または活性を調節する、第１のドメインを含む。ある実施形態では、パラメータは、（１）ｍＲＮＡレベル及び／もしくは活性及び／もしくは細胞内局在化（例えば、半減期及び／または発現）、（２）タンパク質レベル及び／もしくは活性（例えば、半減期及び／または発現）、（３）タンパク質翻訳速度、または（４）タンパク質局在化、例えば、位置、のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれらの全てを含む。ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子ポリペプチドは、結合エレメントに結合する、例えば、それを認識する第２のドメイン（テザー分子）を含む。
ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子は、第１のドメイン及び第２のドメインを含むポリペプチドを含む。ある実施形態では、第１のドメイン及び第２のドメインは、作動的に連結されている。
ある実施形態では、テザー分子をさらに含むエフェクター分子をコードする第２のポリヌクレオチドにおいて、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列は、テザー分子をコードするヌクレオチド配列の上流にある。ある実施形態では、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列は、テザー分子をコードするヌクレオチド配列の下流にある。ある実施形態では、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列は、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＴＰＥ（Ｐ２Ａ－Ｔ２Ａ－Ｅ２Ａ）部位）または配列内リボソーム進入部位によって、テザー分子をコードするヌクレオチド配列から分離される。
ある実施形態では、テザー分子をさらに含むエフェクター分子をコードする第２のポリヌクレオチドにおいて、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列は、テザー分子をコードするヌクレオチド配列に隣接する。
ある実施形態では、（ａ）及び（ｂ）は各々、ｍＲＮＡを含む。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドに配置される。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＴＰＥ（Ｐ２Ａ－Ｔ２Ａ－Ｅ２Ａ）部位）または配列内リボソーム進入部位によって分離される。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、異なるポリヌクレオチドに配置される。
ある実施形態では、（ａ）及び（ｂ）は、ＬＮＰとして製剤化、例えば、同じＬＮＰとして製剤化される。ある実施形態では、（ａ）及び（ｂ）は、異なるＬＮＰとして製剤化される。
ある態様では、本開示は、（ａ）（１）ポリペプチドをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）（１）エフェクター、及び（２）結合エレメントに結合する、例えば、それを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチドを含む、システムを提供する。
ある実施形態では、（ａ）のポリペプチドは、レポータータンパク質を含まない。
なおも別の態様では、（ａ）（１）治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに／または（ｂ）（１）エフェクター分子、及び（２）結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチドを含む、システムが本明細書に開示される。ある実施形態では、（ａ）及び（ｂ）は各々、ｍＲＮＡを含む。
ある実施形態では、該システムは、（ａ）を含む。
ある実施形態では、該システムは、（ｂ）を含む。
ある実施形態では、該システムは、（ａ）及び（ｂ）を含む。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドに配置される。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＴＰＥ（Ｐ２Ａ－Ｔ２Ａ－Ｅ２Ａ）部位）または配列内リボソーム進入部位によって分離される。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、異なるポリヌクレオチドに配置される。
ある実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、レポータータンパク質ではない。
別の態様では、（ａ）（１）治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド、及び／または（ｂ）（１）エフェクター分子をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチドを含む、システムが本明細書に開示される。ある実施形態では、エフェクター分子は、結合エレメントに結合する、例えば、それを認識するポリペプチド（テザー分子）をさらに含む。
ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子ポリペプチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＲＮＡによってコードされるタンパク質のパラメータ、例えば、そのレベル及び／または活性を調節する、第１のドメインを含む。ある実施形態では、パラメータは、（１）ｍＲＮＡレベル及び／もしくは活性及び／もしくは細胞内局在化（例えば、半減期及び／または発現）、（２）タンパク質レベル及び／もしくは活性（例えば、半減期及び／または発現）、（３）タンパク質翻訳速度、または（４）タンパク質局在化、例えば、位置、のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれらの全てを含む。ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子ポリペプチドは、結合エレメントに結合する、例えば、それを認識する第２のドメイン（テザー分子）を含む。
ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子は、第１のドメイン及び第２のドメインを含むポリペプチドを含む。ある実施形態では、第１のドメイン及び第２のドメインは、作動的に連結されている。
ある実施形態では、テザー分子をさらに含むエフェクター分子をコードする第２のポリヌクレオチドにおいて、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列は、テザー分子をコードするヌクレオチド配列の上流にある。ある実施形態では、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列は、テザー分子をコードするヌクレオチド配列の下流にある。ある実施形態では、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列は、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＴＰＥ（Ｐ２Ａ－Ｔ２Ａ－Ｅ２Ａ）部位）または配列内リボソーム進入部位によって、テザー分子をコードするヌクレオチド配列から分離される。
ある実施形態では、テザー分子をさらに含むエフェクター分子をコードする第２のポリヌクレオチドにおいて、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列は、テザー分子をコードするヌクレオチド配列に隣接する。
ある実施形態では、（ａ）及び（ｂ）は各々、ｍＲＮＡを含む。
ある実施形態では、該システムは、（ａ）を含む。
ある実施形態では、該システムは、（ｂ）を含む。
ある実施形態では、該システムは、（ａ）及び（ｂ）を含む。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドに配置される。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＴＰＥ（Ｐ２Ａ－Ｔ２Ａ－Ｅ２Ａ）部位）または配列内リボソーム進入部位によって分離される。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、異なるポリヌクレオチドに配置される。
ある実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、レポータータンパク質ではない。
本明細書に開示されるシステムのうちのいずれかのある実施形態では、該システムは、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または５０％未満の細胞性不純物、例えば、細胞の構成成分、例えば、細胞抽出物に由来する膜、タンパク質、または脂質を含む。
本明細書に開示されるシステムのうちのいずれかのある実施形態では、（ａ）または（ｂ）のうちの少なくとも一方が、ＬＮＰとして製剤化される。
本明細書に開示されるシステムのうちのいずれかのある実施形態では、（ａ）は、ＬＮＰとして製剤化される。
本明細書に開示されるシステムのうちのいずれかのある実施形態では、（ｂ）は、ＬＮＰとして製剤化される。
本明細書に開示されるシステムのうちのいずれかのある実施形態では、（ａ）及び（ｂ）の両方が、ＬＮＰ、例えば、同じＬＮＰまたは異なるＬＮＰとして製剤化される。
本明細書に開示されるシステムのうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰとして製剤化される（ａ）は、第１の組成物中にある。ある実施形態では、ＬＮＰとして製剤化される（ｂ）は、第２の組成物中にある。ある実施形態では、ＬＮＰとして製剤化される（ａ）及びＬＮＰとして製剤化される（ｂ）は、別個の組成物中にある。ある実施形態では、ＬＮＰとして製剤化される（ａ）及びＬＮＰとして製剤化される（ｂ）は、同じ組成物中にある。
ある態様では、（ａ）（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含むＭＳ２配列、例えば、２０ヌクレオチド長のスペーサーによって分離された１９個のヌクレオチドの６つのＭＳ２配列を含む、第１のポリヌクレオチド、（ｂ）（１）ｅＩＦ４Ｇ、例えば、野生型ｅＩＦ４Ｇ、そのバリアントまたは断片を含むエフェクター分子、及び（２）ＭＢＰ、例えば、野生型ＭＢＰ、そのバリアントまたは断片を含むテザー分子をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチドを含む、システムが本明細書で提供される。
別の態様では、本明細書に開示されるシステム、またはＬＮＰ組成物を含む、薬学的組成物が本明細書で提供される。
ある態様では、本開示は、本明細書に開示されるシステム、またはＬＮＰ組成物を含む、細胞を提供する。ある実施形態では、細胞は、該システム、または該ＬＮＰ組成物に接触させられている。ある実施形態では、細胞は、該システム、または該ＬＮＰ組成物にインビボで接触させられる。ある実施形態では、細胞は、該システム、または該ＬＮＰ組成物にインビトロで接触させられる。ある実施形態では、細胞は、該システム、または該ＬＮＰ組成物にエクスビボで接触させられる。ある実施形態では、細胞は、該システム、または該ＬＮＰ組成物の一方または両方のポリヌクレオチドの発現を可能にするのに十分な条件下で維持される。
ある態様では、細胞において治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現を増加させる方法が本明細書で提供され、該方法は、細胞に、本明細書に開示されるシステム、またはＬＮＰ組成物を投与することを含む。一実施形態では、細胞は、対象内に存在する。
関連する態様では、細胞において治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現を増加させる方法において使用するための、システムまたはＬＮＰ組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、本開示は、対象において治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現を増加させる方法を提供し、該方法は、対象に、有効量の本明細書に開示されるシステムまたはＬＮＰ組成物を投与することを含む。
関連する態様では、対象において治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現を増加させる方法において使用するための、システムまたはＬＮＰ組成物が本明細書で提供される。
なおも別の態様では、本明細書に開示されるシステム、またはＬＮＰ組成物を送達する方法が本明細書で提供される。
関連する態様では、システムまたはＬＮＰ組成物を細胞に送達する方法において使用するための、システムまたはＬＮＰ組成物が本明細書で提供される。
ある実施形態では、該方法または使用は、細胞をインビトロ、インビボ、またはエクスビボで該システムまたはＬＮＰ組成物に接触させることを含む。
ある態様では、本開示は、本明細書に開示されるシステムまたはＬＮＰ組成物を、例えば、本明細書に記載されるような疾患または障害を有する対象に送達する方法を提供する。
関連する態様では、システムまたはＬＮＰ組成物を、例えば、本明細書に記載されるような疾患または障害を有する対象に送達する方法において使用するための、システムまたはＬＮＰ組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、対象における免疫応答を調節する方法が本明細書で提供され、該方法は、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に開示されるシステム、またはＬＮＰ組成物を投与することを含む。
関連する態様では、対象における免疫応答を調節する方法において使用するための、システムまたはＬＮＰ組成物が本明細書で提供され、該方法は、対象に、有効量の該システム、または該ＬＮＰ組成物を投与することを含む。
ある態様では、疾患または障害を処置するか、予防するか、またはその症状を予防する方法が本明細書で提供され、該方法は、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に開示されるシステム、またはＬＮＰ組成物を投与することを含む。
関連する態様では、対象における疾患または障害を処置するか、予防するか、またはその症状を予防する方法において使用するための、システムまたはＬＮＰ組成物が本明細書で提供され、該方法は、それを必要とする対象に、有効量の該システム、または該ＬＮＰ組成物を投与することを含む。
ある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、（ａ）（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）（１）エフェクター分子、及び（２）結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、（ａ）及び（ｂ）は各々、ｍＲＮＡを含む。
ある実施形態では、該システムは、（ａ）（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに（ｂ）（１）エフェクター分子、及び（２）結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、（ａ）及び（ｂ）は各々、ｍＲＮＡを含む。
ある実施形態では、該システムの第１のポリヌクレオチド及び／または第２のポリヌクレオチドは、ＬＮＰとして製剤化される。ある実施形態では、該システムの第１のポリヌクレオチドは、ＬＮＰとして製剤化される。ある実施形態では、該システムの第２のポリヌクレオチドは、ＬＮＰとして製剤化される。ある実施形態では、該システムの第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドの両方が、ＬＮＰとして製剤化される。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰと同じである。ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰとは異なる。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、第１の組成物中にある。ある実施形態では、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、第２の組成物中にある。ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰ及び第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、同じ組成物中にある。ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰ及び第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、異なる組成物中にある。
ある実施形態では、（ａ）を含むＬＮＰ及び（ｂ）を含むＬＮＰは、同時に、例えば、実質的に同時に投与される。
ある実施形態では、（ａ）を含むＬＮＰ及び（ｂ）を含むＬＮＰは、順次に投与される。
ある実施形態では、（ａ）を含むＬＮＰが最初に投与される。
ある実施形態では、（ａ）を含むＬＮＰが最初に投与され、続いて（ｂ）を含むＬＮＰが投与される。
ある実施形態では、（ｂ）を含むＬＮＰが最初に投与される。
ある実施形態では、（ｂ）を含むＬＮＰが最初に投与され、続いて（ａ）を含むＬＮＰが投与される。
本明細書に開示される方法のうちのいずれかの一部の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン化可能な脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（ＩＩａ）の化合物を含む。一部の実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（ＩＩｅ）の化合物を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、該ＬＮＰを含む薬学的組成物、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかの追加の特徴は、以下の実施形態を含む。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、第２のポリヌクレオチドのテザー分子は、第１のポリヌクレオチドの結合エレメントに結合する、例えば、それを認識する、ＲＮＡ結合タンパク質またはその断片を含む。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの結合エレメントは、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列のオープンリーディングフレームの上流（５’）もしくは下流（３’）またはその内部に位置する。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの結合エレメントは、第１のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲの上流（５’）または下流（３’）に位置する。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの結合エレメントは、第１のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲの上流（５’）または下流（３’）に位置する。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの結合エレメントは、第１のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲの下流に位置する。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの結合エレメントは、第２のポリヌクレオチドのテザー分子、例えば、表１で提供されるテザー分子、例えば、ＭＢＰ、ＰＣＰ、ラムダＮ、Ｕ１ＡもしくはＰＵＦ、もしくは１５．５ｋｄ、またはそれらのバリアントもしくは断片によって結合される。一部の実施形態では、結合エレメントは、テザー分子によって結合される、例えば、認識される配列を含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、テザー分子によって結合される、例えば、認識される構造を含む配列を含む。
一部の実施形態では、結合エレメントは、表１で提供される結合エレメント、例えば、ＭＳ２、ＰＰ７、ＢｏｘＢ、Ｕ１ＡヘアピンもしくはＰＲＥもしくはキンクターン、またはそれらのバリアントもしくは断片から選定される。一部の実施形態では、結合エレメントは、ＭＳ２である。一部の実施形態では、結合エレメントは、ＰＰ７である。一部の実施形態では、結合エレメントは、ＢｏｘＢである。一部の実施形態では、結合エレメントは、Ｕ１Ａヘアピンである。一部の実施形態では、結合エレメントは、ＰＲＥである。一部の実施形態では、結合エレメントは、キンクターンである。
一部の実施形態では、結合エレメントが、ＭＳ２（例えば、野生型ＭＳ２、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、テザー分子は、ＭＢＰ（例えば、野生型ＭＢＰ、そのバリアントまたは断片）である。
一部の実施形態では、結合エレメントが、ＰＰ７（例えば、野生型ＰＰ７、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、テザー分子は、ＰＣＰ（例えば、野生型ＰＣＰ、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、結合エレメントが、ＢｏｘＢ（例えば、野生型ＢｏｘＢ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、テザー分子は、ラムダＮ（例えば、野生型ラムダＮ、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、結合エレメントが、Ｕ１Ａヘアピン（例えば、野生型Ｕ１Ａヘアピン、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、テザー分子は、Ｕ１Ａ（例えば、野生型Ｕ１Ａ、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、結合エレメントが、ＰＲＥ（例えば、野生型ＰＲＥ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、テザー分子は、ＰＵＦ（例えば、野生型ＰＵＦ、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、結合エレメントが、キンクターン形成配列である場合、テザー分子は、１５．５ｋｄ（例えば、野生型１５．５ｋｄ、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、結合エレメントは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のヌクレオチドを含む配列を含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、約５～１００、約５～９０、約５～８０、約５～７０、約５～６０、約５～５０、約５～４０、約５～３０、約５～２５、約５～２０、約５～１９、約５～１８、約５～１７、約５～１６、約５～１５、約５～１４、約５～１３、約５～１２、約５～１１、約５～１０、約５～９、約５～８、約５～７、または約５～６個のヌクレオチドを含む配列を含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、約５～１００、約６～１００、約７～１００、約８～１００、約９～１００、約１０～１００、約１１～１００、約１２～１００、約１３～１００、約１４～１００、約１５～１００、約１６～１００、約１７～１００、約１８～１００、約１９～１００、約２０～１００、約２１～１００、約２２～１００、約２３～１００、約２４～１００、約２５～１００、約３０～１００、約４０～１００、約５０～１００、約６０～１００、約７０～１００、約８０～１００、または約９０～１００個のヌクレオチドを含む配列を含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、約５～１００、約６～９０、約７～８０、約８～７０、約９～６０、約１０～５０、約１１～４０、約１２～３０、約１３～２５、約１４～２４、約１５～２３、約１６～２２、約１７～２１、または約１８～２０個のヌクレオチドを含む配列を含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、１９個のヌクレオチドを含む配列、例えば、表２で提供される結合エレメントのヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、結合エレメントは、第２のポリヌクレオチドのテザー分子によって結合される配列の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または３０個のリピートを含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、第２のポリヌクレオチドのテザー分子によって結合される配列の８０、７０、６０、５０、４０、または３０個以下のリピートを含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、第２のポリヌクレオチドのテザー分子によって結合される配列の約１～３０、約１～２０、約１～１０、約１～９、約１～８、約１～７、約１～６、約１～５、約１～４、約１～３、または約１～２個のリピートを含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、第２のポリヌクレオチドのテザー分子によって結合される配列の約１～３０、約２～３０、約３～３０、約４～３０、約５～３０、約６～３０、約７～３０、約８～３０、約９～３０、約１０～３０、約１１～３０、約１２～３０、約１３～３０、約１４～３０、約１５～３０、または約２０～３０個のリピートを含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、第２のポリヌクレオチドのテザー分子によって結合される配列の約１～３０、約２～２０、約３～１５、約４～１４、約５～１３、約６～１２、約７～１１、または約８～１０個のリピートを含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、第２のポリヌクレオチドのテザー分子によって結合される配列の６個のリピートを含む。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、各リピートは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のヌクレオチドを含むスペーサー配列によって分離される。一部の実施形態では、スペーサー配列は、約１～１００、約１～９０、約１～８０、約１～７０、約１～６０、約１～５０、約１～４０、約１～３０、約１～２５、約１～２０、約１～１９、約１～１８、約１～１７、約１～１６、約１～１５、約１～１４、約１～１３、約１～１２、約１～１１、約１～１０、約１～９、約１～８、約１～７、約１～６、約１～５、約１～４、約１～３、または約１～２個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、約１～１００、約２～１００、約３～１００、約４～１００、約５～１００、約６～１００、約７～１００、約８～１００、約９～１００、約１０～１００、約１１～１００、約１２～１００、約１３～１００、約１４～１００、約１５～１００、約１６～１００、約１７～１００、約１８～１００、約１９～１００、約２０～１００、約２１～１００、約２２～１００、約２３～１００、約２４～１００、約２５～１００、約３０～１００、約４０～１００、約５０～１００、約６０～１００、約７０～１００、約８０～１００、または約９０～１００個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、約１～１００、約２～９０、約３～８０、約４～７０、約５～６０、約６～５０、約７～４０、約８～４０、約９～３０、約１０～２５、約１１～２４、約１２～２３、約１３～２２、約１４～２１、約１５～２０、約１６～１９、約１７～１８個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２０個のヌクレオチド、例えば、表２で提供されるスペーサー配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、エフェクター分子は、翻訳因子、スプライシング因子、ＲＮＡ安定化因子、ＲＮＡ編集因子、ＲＮＡ結合因子、ＲＮＡ局在化因子、またはそれらの組み合わせから選定される。一部の実施形態では、エフェクター分子は、翻訳因子、例えば、表４で提供される翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ、ポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、ｅＩＦ３ｄもしくはその構成要素、Ｄａｚｌ、またはそれらの断片もしくはバリアント、または組み合わせである。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、リボソーム結合、例えば、動員、転写開始前複合体の形成、またはＲＮＡ巻き戻しを調節する、例えば、それを容易にする、翻訳因子である。一部の実施形態では、エフェクター分子は、ｅＩＦ４Ｇ、例えば、野生型ｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４Ｇのバリアント、またはその断片を含む。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、野生型ｅＩＦ４Ｇを含む。一部の実施形態では、野生型ｅＩＦ４Ｇは、約１６００個のアミノ酸の配列を含む。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、例えば、本明細書に開示されるようなｅＩＦ４Ｇの断片を含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、リボソーム結合、例えば、動員を保持する。
一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約１，５００～２００アミノ酸、約１，４００～３００アミノ酸、約１，３００～３５０アミノ酸、約１，２００～４００アミノ酸、約１，１００～４５０アミノ酸、約１，０００～５００アミノ酸、約９００～５５０アミノ酸、約８００～６００アミノ酸、約１，５００～３００アミノ酸、１，５００～４００アミノ酸、１，５００～５００アミノ酸、約１，５００～６００アミノ酸、アミノ酸、約１，５００～７００アミノ酸、約１，５００～８００アミノ酸、約１，５００～９００アミノ酸、約１，５００～１０００アミノ酸、約１，５００～１，１００アミノ酸、約１，５００～１，２００アミノ酸、約１，５００～１，３００アミノ酸、約１，５００～１，４００アミノ酸、約１，４００～２００アミノ酸、約１，３００～２００アミノ酸、約１，２００～２００アミノ酸、約１，１００～２００アミノ酸、約１，０００～２００アミノ酸、約９００～２００アミノ酸、約８００～２００アミノ酸、約７００～２００アミノ酸、約６００～２００アミノ酸、または約５００～２００アミノ酸長である。
一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約５００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約６００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約７００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約８００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約９００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約１０００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約１１００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約１２００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約１３００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約１４００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約１５００アミノ酸長である。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、例えば、本明細書に開示されるようなｅＩＦ４Ｇのバリアントを含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、リボソーム結合、例えば、動員を保持する。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列において、以下の位置、すなわちアミノ酸７６８、アミノ酸７７１、またはアミノ酸７７６のうちのいずれか１つ、２つ、それらの全て、または組み合わせに変異（例えば、置換）を含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７６８位に変異、例えば、置換、例えば、７６８位にロイシンからアラニンへの置換を含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７１位に変異、例えば、置換、例えば、７７１位にロイシンからアラニンへの置換を含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７６位に変異、例えば、置換（例えば、７７６位にフェニルアラニンからアラニンへの）を含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７６８位に変異、例えば、置換、例えば、７６８位にアラニンを含み、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７１位に変異、例えば、置換、例えば、７７１位にアラニンを含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７６８位に変異、例えば、置換、例えば、７６８位にアラニンを含み、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７６位に変異、例えば、置換、例えば、７７６位にアラニンを含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７１位に変異、例えば、置換、例えば、７７１位にアラニンを含み、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７６位に変異、例えば、置換、例えば、７７６位にアラニンを含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７１位に変異、例えば、置換、例えば、７７１位にアラニンを含み、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７１位に変異、例えば、置換、例えば、７７１位にアラニンを含み、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７６位に変異、例えば、置換、例えば、７７６位にアラニンを含む。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、例えば、リボソームを動員することができる、ｅＩＦ３複合体の一部である。一部の実施形態では、ｅＩＦ３複合体は、ｅＩＦ３ｄ、ｅＩＦ３ｃ、ｅＩＦ３ｅ、もしくはｅＩＦ３ｉ、またはそれらの断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、表２で提供されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、エフェクター分子は、表２で提供されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列によってコードされる。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、エフェクター分子は、スプライシング因子、例えば、表４で提供されるスプライシング因子、例えば、Ｒｎｐｓ１、Ｍａｇｏｈ、Ｙ１４、またはそれらの断片もしくはバリアント、または組み合わせである。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、エフェクター分子は、ＲＮＡ安定化因子、例えば、表４で提供されるスプライシング因子、例えば、ＨｕＲまたはその断片もしくはバリアントである。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、テザー分子は、第１のポリヌクレオチドにおける結合エレメントに結合する。一部の実施形態では、テザー分子は、結合エレメントの配列、または結合エレメントの配列を含む構造に結合する。一部の実施形態では、テザー分子は、ＲＮＡ結合タンパク質またはその断片を含む。
一部の実施形態では、テザー分子は、表１で提供されるテザー分子、例えば、ＭＢＰ、ＰＣＰ、ラムダＮ、Ｕ１ＡもしくはＰＵＦ、もしくは１５．５ｋｄ、またはそれらのバリアントもしくは断片を含む。
一部の実施形態では、テザー分子が、ＭＢＰ（例えば、野生型ＭＢＰ、そのバリアントまたは断片）である場合、結合エレメントは、ＭＳ２（例えば、野生型ＭＳ２、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、テザー分子が、ＰＣＰ（例えば、野生型ＰＣＰ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、結合エレメントは、ＰＰ７（例えば、野生型ＰＰ７、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、テザー分子が、ラムダＮ（例えば、野生型ラムダＮ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、結合エレメントは、ＢｏｘＢ（例えば、野生型ＢｏｘＢ、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、テザー分子が、Ｕ１Ａ（例えば、野生型Ｕ１Ａ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、結合エレメントは、Ｕ１Ａヘアピン（例えば、野生型Ｕ１Ａヘアピン、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、テザー分子が、１５．５ｋｄ（例えば、野生型１５．５ｋｄ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、結合エレメントは、キンクターン形成配列（例えば、野生型キンクターン形成配列、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、テザー分子が、ＰＵＦ（例えば、野生型ＰＵＦ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、結合エレメントは、ＰＲＥ（例えば、野生型ＰＲＥ、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、テザー分子は、ＭＢＰを含む。一部の実施形態では、テザー分子は、表２で提供されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、テザー分子は、テザー分子を含み、表２で提供されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列によってコードされる。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、分泌タンパク質、膜結合型タンパク質、または細胞間タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、サイトカイン、抗体、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、受容体、酵素、ホルモン、転写因子、リガンド、膜輸送体、構造タンパク質、ヌクレアーゼ、またはそれらの構成要素、バリアント、もしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）から選定される。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、サイトカイン、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、抗体またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、またはその構成要素、バリアント、もしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、タンパク質またはペプチドを含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかは、細胞において（例えば、該システムまたはＬＮＰ組成物に接触させられた細胞において）、以下、
（ｉ）該治療ペイロードもしくは該予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの増加した発現及び／もしくはレベル、
（ｉｉ）該治療ペイロードもしくは該予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの持続的な発現及び／もしくはレベル、
（ｉｉｉ）治療ペイロードもしくは予防ペイロードの増加した発現及び／もしくはレベル、
（ｉｖ）治療ペイロードもしくは予防ペイロードの持続的な発現及び／もしくはレベル、
（ｖ）該治療ペイロードもしくは該予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの増加した安定性、
（ｖｉ）細胞環境、例えば、ストレスもしくは栄養欠乏もしくは翻訳因子の利用可能性に対する治療ペイロードもしくは予防ペイロードの翻訳の増加した耐性、
（ｖｉｉ）該治療ペイロードもしくは該予防ペイロードの低減された投薬量、または
（ｖｉｉｉ）細胞内の内因性ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の低減された毒性、例えば、低減された調節、
のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくはそれらの全て、または任意の組み合わせをもたらす。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかは、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの増加した発現及び／またはレベルをもたらす。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかは、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの持続的な発現及び／またはレベルをもたらす。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかは、治療ペイロードまたは予防ペイロードの増加した発現及び／またはレベルをもたらす。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかは、治療ペイロードまたは予防ペイロードの持続的な発現及び／またはレベルをもたらす。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかは、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの増加した安定性をもたらす。一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかは、細胞環境、例えば、ストレスもしくは栄養欠乏もしくは翻訳因子の利用可能性に対する治療ペイロードまたは予防ペイロードの翻訳の増加した耐性をもたらす。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかは、治療ペイロードまたは予防ペイロードの低減された投薬量をもたらす。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかは、細胞内の内因性ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の低減された毒性、例えば、低減された調節をもたらす。
一部の実施形態では、（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つ、またはそれらの全てが、
（ａ）本明細書に開示されるシステムに接触させられていないか、
（ｂ）本明細書に開示されるＬＮＰ組成物に接触させられていないか、
（ｃ）該第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰに接触させられていないか、または
（ｄ）該第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰに接触させられたが、該第２のポリヌクレオチド、例えば、該第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰには接触させられていない、
細胞と比較される。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかは、例えば、実施例２または３にあるアッセイによって測定したときに、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの増加した発現、発現の持続期間、及び／またはレベルをもたらす。一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの増加した発現、発現の持続期間、及び／またはレベルは、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡに接触させられたが、そのｍＲＮＡが第１のポリヌクレオチドの結合エレメントを欠いている、さもなければ類似の細胞と比較される。一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの発現、発現の持続期間、及び／またはレベルの増加は、約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、または５０倍である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡの発現及び／またはレベルの増加は、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの安定性（例えば、半減期）の増加、例えば、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの安定性の約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または２０倍の増加を含む。一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡは、約３～２５時間、約４～２０時間、約４～１５時間、約５～１０時間、約６～９時間、または約７～８時間の半減期を有する。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかは、例えば、実施例４にあるアッセイによって測定したときに、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの持続的な発現及び／またはレベルをもたらす。一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの発現及び／またはレベルの少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも多くは、一定期間、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、２４、または３６時間維持される。一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの持続的な発現及び／またはレベルは、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡに接触させられたが、そのｍＲＮＡが第１のポリヌクレオチドの結合エレメントを欠いている、さもなければ類似の細胞と比較される。本明細書で使用されるとき、「持続的な発現」という用語は、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡに接触させられたが、そのｍＲＮＡが第１のポリヌクレオチドの結合エレメントを欠いている、さもなければ類似の細胞におけるｍＲＮＡ発現と比較した、ｍＲＮＡレベルのより長い発現の持続期間及び／またはより長い維持を指す。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかは、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの減少した消失、例えば、その消失の約１．２倍、２倍、３倍、４倍、または５倍の減少をもたらす。一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの消失の減少は、一定期間、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または２４時間にわたって起こる。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかは、翻訳中ｍＲＮＡの減少した消失、例えば、その消失の約１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍の減少をもたらす。一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの消失の減少は、一定期間、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または２４時間にわたって起こる。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかは、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの翻訳の持続的な、例えば、維持されたレベルをもたらす。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかは、例えば、実施例４のアッセイによって測定したときに、治療ペイロードまたは予防ペイロードの増加した発現、発現の持続期間、及び／またはレベル、例えば、増加したタンパク質レベル、翻訳、または半減期をもたらす。一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードの増加した発現及び／またはレベルは、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡに接触させられたが、そのｍＲＮＡが第１のポリヌクレオチドの結合エレメントを欠いている、さもなければ類似の細胞と比較される。一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現及び／またはレベルの増加は、約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、または５０倍である。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかは、治療ペイロードまたは予防ペイロードの持続的な発現及び／またはレベルをもたらす。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは各々、ｍＲＮＡを含む。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、（ｂ）（２）のテザー分子は、（ａ）（２）の結合エレメントに結合する、例えば、それを認識する。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＬＮＰとして製剤化されるか、または第２のポリヌクレオチドは、ＬＮＰとして製剤化される。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、ＬＮＰとして製剤化され、かつ第２のポリヌクレオチドは、ＬＮＰとして製剤化される（例えば、同じＬＮＰまたは異なるＬＮＰ）。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰ及び第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、同じＬＮＰである。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰ及び第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、異なるＬＮＰである。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、結合エレメントは、１９個のヌクレオチドを含む配列、例えば、表２で提供される結合エレメントのヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、スペーサー配列は、２０個のヌクレオチド、例えば、表２で提供されるスペーサー配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、エフェクター分子は、表２で提供されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、エフェクター分子は、表２で提供されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列によってコードされる。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、テザー分子は、表２で提供されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、テザー分子は、表２で提供されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列によってコードされる。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾を含むｍＲＮＡを含む。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、ＬＮＰは、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、眼内、直腸、経肺、または経口送達用に製剤化される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、静脈内送達用に製剤化される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、皮下送達用に製剤化される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、筋肉内送達用に製剤化される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、鼻腔内送達用に製剤化される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、眼内送達用に製剤化される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、直腸送達用に製剤化される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、経肺送達用に製剤化される。一部の実施形態では、ＬＮＰは、経口送達用に製剤化される。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、ＬＮＰは、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、第１のポリヌクレオチド及び／または第２のポリヌクレオチドは、キャップ、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、ポリＡテール及び／またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位を含む。一部の実施形態では、キャップは、本明細書に開示されるキャップを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、第１のポリヌクレオチド及び／または第２のポリヌクレオチドは、キャップを含まない。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、本明細書に開示される３’ＵＴＲ、例えば、ｖ１．１ ３’ＵＴＲまたはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、本明細書に開示される５’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、ポリＡテールは、本明細書に開示されるポリＡテールの配列またはその断片を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、第１のポリヌクレオチド及び／または第２のポリヌクレオチドは、ポリＡテールを含まない。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本明細書に開示されるｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、第１のポリヌクレオチド及び／または第２のポリヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドである。一部の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドである。
本明細書に開示される方法または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、参照ＬＮＰと比較してより低い用量で投与される。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、参照ＬＮＰの用量と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低い用量で投与される。一部の実施形態では、参照ＬＮＰは、第１のポリヌクレオチドの結合エレメントを有しないポリヌクレオチドを含む、さもなければ類似のＬＮＰ、または第２のポリヌクレオチドを含まないＬＮＰから選定される。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰと比較してより高い用量で投与される。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰの用量と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い用量で投与される。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰと比較してモル過剰である。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰと比較して約１～８００倍モル過剰である。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰと比較して約１～７５０倍、約２～７００倍、約３～６５０倍、約４～６００倍、約５～５５０倍、約６～５００倍、約７～４５０倍、約８～４００倍、約１０～３５０倍、約１５～３００倍、約２０～２５０倍、約２５～２００倍、約３０～１５０倍、約３５～１００倍、約４０～９０倍、約４５～８０倍、約５０～７５倍、約６０～７０倍モル過剰である。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰと比較して約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約２５０倍、約３００倍、約３５０倍、約４００倍、約４５０倍、約５００倍、約６００倍、約６５０倍、約７００倍、約７５０倍、または約８００倍モル過剰である。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰと比較して約９倍モル過剰である。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰと比較して約１０倍モル過剰である。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰ及び第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、同じモル量である。本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、システム、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかのある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、１０：１、８：１、６：１、４：１、３：１、２：１、１．５：１、または１：１の（ａ）：（ｂ）質量比で製剤化される。ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、１：１、１：１．５、１：２、１：３、１：４、１：６、１：８、または１：１０の（ａ）：（ｂ）質量比で製剤化される。ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、１：１の（ａ）：（ｂ）質量比で製剤化される。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、システム、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかのある実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、または両方は、少なくとも１つの化学修飾を含む。ある実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される。ある実施形態では、化学修飾は、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。ある実施形態では、化学修飾は、Ｎ１－メチルシュードウリジンである。ある実施形態では、脂質ナノ粒子中の各ｍＲＮＡが、完全に修飾されたＮ１－メチルシュードウリジンを含む。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド、第２のポリヌクレオチド、または両方は、いずれの化学修飾も含まない。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、システム、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン化可能な脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び任意選択で（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、システム、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミノ脂質を含むイオン化可能な脂質を含む。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）、（ＩＩｇ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ１）、（ＩＩＩａ２）、（ＩＩＩａ３）、（ＩＩＩａ４）、（ＩＩＩａ５）、（ＩＩＩａ６）、（ＩＩＩａ７）、または（ＩＩＩａ８）のうちのいずれかの化合物を含む。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（Ｉ）の化合物を含む。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（ＩＩａ）の化合物を含む。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、式（ＩＩｅ）の化合物を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、システム、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－リンコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－リンコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（Ｃ１６リゾＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リン－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。ある実施形態では、リン脂質は、ＤＳＰＣ、例えば、ＤＳＰＣのバリアント、例えば、式（ＩＶ）の化合物である。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、システム、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、構造脂質を含む。一実施形態では、構造脂質は、植物ステロール、または植物ステロール及びコレステロールの組み合わせである。一実施形態では、植物ステロールは、β－シトステロール、スチグマステロール、β－シトスタノール、カンペステロール、ブラシカステロール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
一実施形態では、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、ホパノイド、植物ステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含むがこれらに限定されない群から選択され得る。一部の実施形態では、構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義されるとき、「ステロール」とは、ステロイドアルコールからなるステロイドの下位群である。ある特定の実施形態では、構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールの類似体である。ある特定の実施形態では、構造脂質は、アルファ－トコフェロールである。
一実施形態では、構造脂質は、β－シトステロール及びコレステロールから選択される。ある実施形態では、構造脂質は、β－シトステロールである。ある実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、システム、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＰＥＧ脂質を含む。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
ある実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。ある実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、及びＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質からなる群から選択される。ある実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧである。
ある実施形態では、ＰＥＧ脂質は、式（Ｖ）、式（ＶＩ－Ａ）、式（ＶＩ－Ｂ）、式（ＶＩ－Ｃ）、または式（ＶＩ－Ｄ）の化合物から選定される。ある実施形態では、ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ－Ａ）の化合物である。ある実施形態では、ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ－Ｂ）の化合物である。ある実施形態では、ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ－Ｃ）の化合物である。ある実施形態では、ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ－Ｄ）の化合物である。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、システム、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰは、約２０モル％～約６０モル％のイオン化可能な脂質、約５モル％～約２５モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約２５モル％～約５５モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約０．５モル％～約１５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約３５モル％～約５５モル％のイオン化可能な脂質、約５モル％～約２５モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０モル％～約４０モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約０モル％～約１０モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約５０モル％のイオン化可能な脂質、約１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３８．５モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約１．５モル％のＰＥＧ脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９．８３モル％のイオン化可能な脂質、約９．８３モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０モル％のＰＥＧ脂質を含む。
一実施形態では、ステロールまたは他の構造脂質のモル％は、植物ステロール１８．５％であり、構造脂質の総モル％は、３８．５％である。一実施形態では、ステロールまたは他の構造脂質のモル％は、植物ステロール２８．５％であり、構造脂質の総モル％は、３８．５％である。
本開示のＬＮＰ、システム、または方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約５０モル％の式（ＩＩａ）の化合物及び約１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、５０モル％の式（ＩＩａ）の化合物及び約１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰ、システム、または方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約５０モル％の式（ＩＩａ）の化合物及び１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、５０モル％の式（ＩＩａ）の化合物及び１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９．８３モル％の式（ＩＩａ）の化合物、約９．８３モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０モル％のＰＥＧ脂質を含む。
本開示のＬＮＰ、システム、または方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約５０モル％の式（ＩＩｅ）の化合物及び約１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、５０モル％の式（ＩＩｅ）の化合物及び約１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約５０モル％の式（ＩＩｅ）の化合物及び１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、５０モル％の式（ＩＩｅ）の化合物及び１０モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質を含む。本開示のＬＮＰまたは方法の一実施形態では、ＬＮＰは、約４９．８３モル％の式（ＩＩｅ）の化合物、約９．８３モル％の非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、約３０．３３モル％のステロールまたは他の構造脂質、及び約２．０モル％のＰＥＧ脂質を含む。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物、システム、方法、または使用に向けた組成物のうちのいずれかのある実施形態では、ＬＮＰは、静脈内、皮下、筋肉内、眼内、鼻腔内、直腸、経肺、または経口送達用に製剤化される。ある実施形態では、ＬＮＰは、静脈内送達用に製剤化される。ある実施形態では、ＬＮＰは、皮下送達用に製剤化される。ある実施形態では、ＬＮＰは、筋肉内送達用に製剤化される。ある実施形態では、ＬＮＰは、眼内送達用に製剤化される。ある実施形態では、ＬＮＰは、鼻腔内送達用に製剤化される。ある実施形態では、ＬＮＰは、直腸送達用に製剤化される。ある実施形態では、ＬＮＰは、経肺送達用に製剤化される。ある実施形態では、ＬＮＰは、経口送達用に製剤化される。
本明細書に開示される方法または使用に向けた組成物のうちのいずれかのある実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、ヒトである。
前述のＬＮＰ組成物または該ＬＮＰ組成物の使用方法のうちのいずれかの追加の特徴は、以下の列挙される実施形態のうちの１つまたは複数を含む。当業者であれば、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、またはほんの日常的な実験を使用して確認することができる。かかる均等物は、以下の列挙される実施形態よって包含されることが意図される。
本開示の他の実施形態
Ｅ１．
（ａ）（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
（ｂ）（１）エフェクター分子、及び／または（２）前記結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチド、を含み、
任意選択で、（ａ）及び（ｂ）が各々、ｍＲＮＡを含む、
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物。
Ｅ２．前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、同じポリヌクレオチドに配置される、実施形態Ｅ１に記載のＬＮＰ組成物。
Ｅ３．前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＴＰＥ（Ｐ２Ａ－Ｔ２Ａ－Ｅ２Ａ）部位）または配列内リボソーム進入部位によって分離される、実施形態Ｅ１に記載のＬＮＰ組成物。
Ｅ４．前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、異なるポリヌクレオチドに配置される、実施形態Ｅ１に記載のＬＮＰ組成物。
Ｅ５．（ａ）及び（ｂ）の各々が、ＬＮＰ、例えば、同じＬＮＰとして製剤化される、実施形態Ｅ１に記載のＬＮＰ組成物。
Ｅ６．（ａ）及び（ｂ）が、異なるＬＮＰとして製剤化され、任意選択で、
（ｉ）ＬＮＰとして製剤化される（ａ）が、第１の組成物中にあり、ＬＮＰとして製剤化される（ｂ）が、第２の組成物中にあり、例えば、（ｂ）及び（ｂ）が、異なる組成物中にあるか、または
（ｉｉ）ＬＮＰとして製剤化される（ａ）及びＬＮＰとして製剤化される（ｂ）が、同じ組成物中にある、
実施形態Ｅ１に記載のＬＮＰ組成物。
Ｅ７．
（ａ）（１）治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド、及び／または
（ｂ）（１）エフェクター分子、及び／もしくは（２）前記結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチド、を含み、
任意選択で、（ａ）及び（ｂ）が各々、ｍＲＮＡを含む、
システム。
Ｅ８．前記システムが、（ａ）を含む、実施形態Ｅ７に記載のシステム。
Ｅ９．前記システムが、（ｂ）を含む、実施形態Ｅ７に記載のシステム。
Ｅ１０．前記システムが、（ａ）及び（ｂ）を含む、実施形態Ｅ７に記載のシステム。
Ｅ１１．前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、同じポリヌクレオチドに配置される、実施形態Ｅ７～Ｅ１０のいずれか１つに記載のシステム。
Ｅ１２．前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＴＰＥ（Ｐ２Ａ－Ｔ２Ａ－Ｅ２Ａ）部位）または配列内リボソーム進入部位によって分離される、実施形態Ｅ１１に記載のシステム。
Ｅ１３．前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、異なるポリヌクレオチドに配置される、実施形態Ｅ７～Ｅ１０のいずれか１つに記載のシステム。
Ｅ１４．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードが、レポータータンパク質ではない、実施形態Ｅ７～Ｅ１３のいずれか１つに記載のシステム。
Ｅ１５．前記システムが、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または５０％未満の細胞性不純物、例えば、細胞の構成成分、例えば、細胞由来の膜、タンパク質、または脂質を含む、実施形態Ｅ７～Ｅ１３のいずれか１つに記載のシステム。
Ｅ１６．（ａ）または（ｂ）のうちの少なくとも一方が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される、実施形態Ｅ７～Ｅ１５のいずれか１つに記載のシステム。
Ｅ１７．（ａ）が、ＬＮＰとして製剤化される、実施形態Ｅ１６に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１８．（ｂ）が、ＬＮＰとして製剤化される、実施形態Ｅ１６に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１９．（ａ）及び（ｂ）の両方が、ＬＮＰ、例えば、同じＬＮＰまたは異なるＬＮＰとして製剤化され、任意選択で、
（ｉ）ＬＮＰとして製剤化される（ａ）が、第１の組成物中にあり、ＬＮＰとして製剤化される（ｂ）が、第２の組成物中にあり、例えば、（ｂ）及び（ｂ）が、異なる組成物中にあるか、または
（ｉｉ）ＬＮＰとして製剤化される（ａ）及びＬＮＰとして製剤化される（ｂ）が、同じ組成物中にある、
実施形態Ｅ１６に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ２０．前記第２のポリヌクレオチドの前記テザー分子が、前記第１のポリヌクレオチドの前記結合エレメントに結合する、例えば、それを認識する、ＲＮＡ結合タンパク質またはその断片を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法またはシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ２１．前記第１のポリヌクレオチドの前記結合エレメントが、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記配列の上流（５’）もしくは下流（３’）またはそのオープンリーディングフレーム内に位置する、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法またはシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ２２．前記第１のポリヌクレオチドの前記結合エレメントが、前記第１のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲの上流（５’）または下流（３’）に位置する、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法またはシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ２３．前記第１のポリヌクレオチドの前記結合エレメントが、前記第１のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲの上流（５’）または下流（３’）に位置する、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ２４．前記第１のポリヌクレオチドの前記結合エレメントが、前記第１のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲの下流に位置する、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ２５．前記第１のポリヌクレオチドの前記結合エレメントが、前記第２のポリヌクレオチドの前記テザー分子、例えば、表１で提供されるテザー分子、例えば、ＭＢＰ、ＰＣＰ、ラムダＮ、Ｕ１ＡもしくはＰＵＦ、もしくは１５．５ｋｄ、またはそれらのバリアントもしくは断片によって結合される、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ２６．前記結合エレメントが、前記テザー分子によって結合される、例えば、認識される配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ２７．前記結合エレメントが、前記テザー分子によって結合される、例えば、認識される構造を含む配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ２８．前記結合エレメントが、表１で提供される結合エレメント、例えば、ＭＳ２、ＰＰ７、ＢｏｘＢ、Ｕ１ＡヘアピンもしくはＰＲＥもしくはキンクターン、またはそれらのバリアントもしくは断片から選定される、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ２９．前記結合エレメントが、ＭＳ２（例えば、野生型ＭＳ２、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、前記テザー分子が、ＭＢＰ（例えば、野生型ＭＢＰ、そのバリアントまたは断片）である、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ３０．前記結合エレメントが、ＰＰ７（例えば、野生型ＰＰ７、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、前記テザー分子が、ＰＣＰ（例えば、野生型ＰＣＰ、またはそのバリアントもしくは断片）である、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ３１．前記結合エレメントが、ＢｏｘＢ（例えば、野生型ＢｏｘＢ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、前記テザー分子が、ラムダＮ（例えば、野生型ラムダＮ、またはそのバリアントもしくは断片）である、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ３２．前記結合エレメントが、Ｕ１Ａヘアピン（例えば、野生型Ｕ１Ａヘアピン、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、前記テザー分子が、Ｕ１Ａ（例えば、野生型Ｕ１Ａ、またはそのバリアントもしくは断片）である、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ３３．前記結合エレメントが、ＰＲＥ（例えば、野生型ＰＲＥ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、前記テザー分子が、ＰＵＦ（例えば、野生型ＰＵＦ、またはそのバリアントもしくは断片）である、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ３４．前記結合エレメントが、キンクターン形成配列である場合、前記テザー分子が、１５．５ｋｄ（例えば、野生型１５．５ｋｄ、またはそのバリアントもしくは断片）である、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ３５．前記結合エレメントが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のヌクレオチドを含む配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ３６．前記結合エレメントが、約５～１００、約５～９０、約５～８０、約５～７０、約５～６０、約５～５０、約５～４０、約５～３０、約５～２５、約５～２０、約５～１９、約５～１８、約５～１７、約５～１６、約５～１５、約５～１４、約５～１３、約５～１２、約５～１１、約５～１０、約５～９、約５～８、約５～７、または約５～６個のヌクレオチドを含む配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ３７．前記結合エレメントが、約５～１００、約６～１００、約７～１００、約８～１００、約９～１００、約１０～１００、約１１～１００、約１２～１００、約１３～１００、約１４～１００、約１５～１００、約１６～１００、約１７～１００、約１８～１００、約１９～１００、約２０～１００、約２１～１００、約２２～１００、約２３～１００、約２４～１００、約２５～１００、約３０～１００、約４０～１００、約５０～１００、約６０～１００、約７０～１００、約８０～１００、または約９０～１００個のヌクレオチドを含む配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ３８．前記結合エレメントが、約５～１００、約６～９０、約７～８０、約８～７０、約９～６０、約１０～５０、約１１～４０、約１２～３０、約１３～２５、約１４～２４、約１５～２３、約１６～２２、約１７～２１、または約１８～２０個のヌクレオチドを含む配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ３９．前記結合エレメントが、１９個のヌクレオチドを含む配列、例えば、表２で提供される結合エレメントのヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ４０．前記結合エレメントが、前記第２のポリヌクレオチドの前記テザー分子によって結合される前記配列の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または３０個のリピートを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ４１．前記結合エレメントが、前記第２のポリヌクレオチドの前記テザー分子によって結合される前記配列の８０、７０、６０、５０、４０、または３０個以下のリピートを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ４２．前記結合エレメントが、前記第２のポリヌクレオチドの前記テザー分子によって結合される前記配列の約１～３０、約１～２０、約１～１０、約１～９、約１～８、約１～７、約１～６、約１～５、約１～４、約１～３、または約１～２個のリピートを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ４３．前記結合エレメントが、前記第２のポリヌクレオチドの前記テザー分子によって結合される前記配列の約１～３０、約２～３０、約３～３０、約４～３０、約５～３０、約６～３０、約７～３０、約８～３０、約９～３０、約１０～３０、約１１～３０、約１２～３０、約１３～３０、約１４～３０、約１５～３０、または約２０～３０個のリピートを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ４４．前記結合エレメントが、前記第２のポリヌクレオチドの前記テザー分子によって結合される前記配列の約１～３０、約２～２０、約３～１５、約４～１４、約５～１３、約６～１２、約７～１１、または約８～１０個のリピートを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ４５．前記結合エレメントが、前記第２のポリヌクレオチドの前記テザー分子によって結合される前記配列の６個のリピートを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ４６．各リピートが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のヌクレオチドを含むスペーサー配列によって分離される、実施形態４０～４５のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ４７．前記スペーサー配列が、約１～１００、約１～９０、約１～８０、約１～７０、約１～６０、約１～５０、約１～４０、約１～３０、約１～２５、約１～２０、約１～１９、約１～１８、約１～１７、約１～１６、約１～１５、約１～１４、約１～１３、約１～１２、約１～１１、約１～１０、約１～９、約１～８、約１～７、約１～６、約１～５、約１～４、約１～３、または約１～２個のヌクレオチドを含む、実施形態４６に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ４８．前記スペーサー配列が、約１～１００、約２～１００、約３～１００、約４～１００、約５～１００、約６～１００、約７～１００、約８～１００、約９～１００、約１０～１００、約１１～１００、約１２～１００、約１３～１００、約１４～１００、約１５～１００、約１６～１００、約１７～１００、約１８～１００、約１９～１００、約２０～１００、約２１～１００、約２２～１００、約２３～１００、約２４～１００、約２５～１００、約３０～１００、約４０～１００、約５０～１００、約６０～１００、約７０～１００、約８０～１００、または約９０～１００個のヌクレオチドを含む、実施形態４６または４７に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ４９．前記スペーサー配列が、約１～１００、約２～９０、約３～８０、約４～７０、約５～６０、約６～５０、約７～４０、約８～４０、約９～３０、約１０～２５、約１１～２４、約１２～２３、約１３～２２、約１４～２１、約１５～２０、約１６～１９、約１７～１８個のヌクレオチドを含む、実施形態４６～４８のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ５０．前記スペーサー配列が、２０個のヌクレオチド、例えば、表２で提供されるスペーサー配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態４６～４９のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ５１．前記エフェクター分子が、翻訳因子、スプライシング因子、ＲＮＡ安定化因子、ＲＮＡ編集因子、ＲＮＡ結合因子、ＲＮＡ局在化因子、またはそれらの組み合わせから選定される、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ５２．前記エフェクター分子が、翻訳因子、例えば、表４で提供される翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ、ポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、ｅＩＦ３ｄもしくはその構成要素、Ｄａｚｌ、またはそれらの断片もしくはバリアント、または組み合わせである、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ５３．前記エフェクター分子が、リボソーム結合、例えば、動員、転写開始前複合体の形成、またはＲＮＡ巻き戻しを調節する、例えば、それを容易にする、翻訳因子である、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ５４．前記エフェクター分子が、ｅＩＦ４Ｇ、例えば、野生型ｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４Ｇのバリアント、またはその断片を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ５５．前記エフェクター分子が、例えば、本明細書に開示されるようなｅＩＦ４Ｇの断片を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ５６．前記ｅＩＦ４Ｇ断片が、リボソーム結合、例えば、動員を保持する、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ５７．前記ｅＩＦ４Ｇ断片が、約１，２００～２００アミノ酸、約１，１００～３００アミノ酸、１，０００～４００アミノ酸、９００～４５０アミノ酸、８００～５００アミノ酸、７００～５５０アミノ酸、６００～６５０アミノ酸、１，２００～３００アミノ酸、１，２００～４００アミノ酸、１，２００～５００アミノ酸、１，２００～６００アミノ酸、１，１００～２００アミノ酸、１，０００～２００アミノ酸、９００～２００アミノ酸、８００～２００アミノ酸、７００～２００アミノ酸、６００～２００アミノ酸、または５００～２００アミノ酸のアミノ酸長である、実施形態５４～５６のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ５８．前記ｅＩＦ４Ｇ断片が、約５００アミノ酸長である、実施形態５４～５７のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ５９．前記ｅＩＦ４Ｇ断片が、約１，１００アミノ酸長である、実施形態５４～５７のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ６０．前記エフェクター分子が、例えば、本明細書に開示されるようなｅＩＦ４Ｇのバリアントを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ６１．前記ｅＩＦ４Ｇバリアントが、リボソーム結合、例えば、動員を保持する、実施形態５４～６０のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ６２．前記ｅＩＦ４Ｇバリアントが、前記ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列において、以下の位置、すなわちアミノ酸７６８、アミノ酸７７１、またはアミノ酸７７６のうちのいずれか１つ、２つ、それらの全て、または組み合わせに変異（例えば、置換）を含む、実施形態５４～６１のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ６３．前記ｅＩＦ４Ｇバリアントが、前記ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７６８位に変異、例えば、置換、例えば、７６８位にロイシンからアラニンへの置換を含む、実施形態６２に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ６４．前記ｅＩＦ４Ｇバリアントが、前記ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７１位に変異、例えば、置換、例えば、７７１位にロイシンからアラニンへの置換を含む、実施形態６２に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ６５．前記ｅＩＦ４Ｇバリアントが、前記ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７６位に変異、例えば、置換（例えば、７７６位にフェニルアラニンからアラニンへの）を含む、実施形態６２に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ６６．前記ｅＩＦ４Ｇバリアントが、前記ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７６８位に変異、例えば、置換、例えば、７６８位にアラニンを含み、前記ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７１位に変異、例えば、置換、例えば、７７１位にアラニンを含む、実施形態６２に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ６７．前記ｅＩＦ４Ｇバリアントが、前記ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７６８位に変異、例えば、置換、例えば、７６８位にアラニンを含み、前記ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７６位に変異、例えば、置換、例えば、７７６位にアラニンを含む、実施形態６２に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ６８．前記ｅＩＦ４Ｇバリアントが、前記ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７１位に変異、例えば、置換、例えば、７７１位にアラニンを含み、前記ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７６位に変異、例えば、置換、例えば、７７６位にアラニンを含む、実施形態６２に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ６９．前記ｅＩＦ４Ｇバリアントが、前記ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７１位に変異、例えば、置換、例えば、７７１位にアラニンを含み、前記ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７１位に変異、例えば、置換、例えば、７７１位にアラニンを含み、前記ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７６位に変異、例えば、置換、例えば、７７６位にアラニンを含む、実施形態６２に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ７０．前記エフェクター分子が、例えば、リボソームを動員することができる、ｅＩＦ３複合体の一部である、実施形態５４～６９のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ７１．前記ｅＩＦ３複合体が、ｅＩＦ３ｄ、ｅＩＦ３ｃ、ｅＩＦ３ｅ、もしくはｅＩＦ３ｉ、またはそれらの断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態７０に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ７２．前記エフェクター分子が、表２で提供されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態５４～７１のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ７３．前記エフェクター分子が、表２で提供されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列によってコードされる、実施形態５４～７１のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ７４．前記エフェクター分子が、スプライシング因子、例えば、表４で提供されるスプライシング因子、例えば、Ｒｎｐｓ１、Ｍａｇｏｈ、Ｙ１４、またはそれらの断片もしくはバリアント、または組み合わせである、実施形態１～５１のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ７５．前記エフェクター分子が、ＲＮＡ安定化因子、例えば、表４で提供されるスプライシング因子、例えば、ＨｕＲまたはその断片もしくはバリアントである、実施形態１～５１のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ７６．前記テザー分子が、前記第１のポリヌクレオチドにおける結合エレメントに結合する、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ７７．前記テザー分子が、前記結合エレメントの配列、または前記結合エレメントの前記配列を含む構造に結合する、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ７８．前記テザー分子が、ＲＮＡ結合タンパク質またはその断片を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ７９．前記テザー分子が、表１で提供されるテザー分子、例えば、ＭＢＰ、ＰＣＰ、ラムダＮ、Ｕ１ＡもしくはＰＵＦ、もしくは１５．５ｋｄ、またはそれらのバリアントもしくは断片を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ８０．前記テザー分子が、ＭＢＰ（例えば、野生型ＭＢＰ、そのバリアントまたは断片）である場合、前記結合エレメントが、ＭＳ２（例えば、野生型ＭＳ２、またはそのバリアントもしくは断片）である、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ８１．前記テザー分子が、ＰＣＰ（例えば、野生型ＰＣＰ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、前記結合エレメントが、ＰＰ７（例えば、野生型ＰＰ７、またはそのバリアントもしくは断片）である、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ８２．前記テザー分子が、ラムダＮ（例えば、野生型ラムダＮ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、前記結合エレメントが、ＢｏｘＢ（例えば、野生型ＢｏｘＢ、またはそのバリアントもしくは断片）である、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ８３．前記テザー分子が、Ｕ１Ａ（例えば、野生型Ｕ１Ａ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、前記結合エレメントが、Ｕ１Ａヘアピン（例えば、野生型Ｕ１Ａヘアピン、またはそのバリアントもしくは断片）である、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ８４．前記テザー分子が、１５．５ｋｄ（例えば、野生型１５．５ｋｄ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、前記結合エレメントが、キンクターン形成配列（例えば、野生型キンクターン形成配列、またはそのバリアントもしくは断片）である、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ８５．前記テザー分子が、ＰＵＦ（例えば、野生型ＰＵＦ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、前記結合エレメントが、ＰＲＥ（例えば、野生型ＰＲＥ、またはそのバリアントもしくは断片）である、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ８６．前記テザー分子が、表２で提供されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ８７．前記テザー分子が、表２で提供されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列によってコードされる、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ８８．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードが、分泌タンパク質、膜結合型タンパク質、または細胞間タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ８９．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードが、サイトカイン、抗体、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、受容体、酵素、ホルモン、転写因子、リガンド、膜輸送体、構造タンパク質、ヌクレアーゼ、またはそれらの構成要素、バリアント、もしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）から選定される、実施形態８８に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ９０．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードが、サイトカイン、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む、実施形態８８に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ９１．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードが、抗体またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む、実施形態８８に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ９２．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードが、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、またはその構成要素、バリアント、もしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む、実施形態８８に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ９３．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードが、タンパク質またはペプチドを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ９４．細胞において（例えば、前記システムまたは前記ＬＮＰ組成物に接触させられた細胞において）、以下、
（ｉ）前記治療ペイロードもしくは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの増加した発現及び／もしくはレベル、
（ｉｉ）前記治療ペイロードもしくは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの持続的な発現及び／もしくはレベル、
（ｉｉｉ）治療ペイロードもしくは予防ペイロードの増加した発現及び／もしくはレベル、
（ｉｖ）治療ペイロードもしくは予防ペイロードの持続的な発現及び／もしくはレベル、
（ｖ）前記治療ペイロードもしくは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの増加した安定性、
（ｖｉ）細胞環境、例えば、ストレスもしくは栄養欠乏もしくは翻訳因子の利用可能性に対する治療ペイロードもしくは予防ペイロードの翻訳の増加した耐性、
（ｖｉｉ）前記治療ペイロードもしくは前記予防ペイロードの低減された投薬量、または
（ｖｉｉｉ）細胞内の内因性ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の低減された毒性、例えば、低減された調節、
のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくはそれらの全て、または任意の組み合わせをもたらす、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ９５．（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つ、またはそれらの全てが、
（ａ）実施形態７に記載のシステムに接触させられていないか、
（ｂ）実施形態１に記載のＬＮＰ組成物に接触させられていないか、
（ｃ）前記第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰに接触させられていないか、または
（ｄ）前記第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰに接触させられたが、前記第２のポリヌクレオチド、例えば、前記第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰには接触させられていない、
細胞と比較される、実施形態９４に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ９６．前記システム、または前記ＬＮＰ組成物が、例えば、実施例２または３にあるアッセイによって測定したときに、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡの増加した発現及び／またはレベルをもたらす、実施形態９４または９５に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ９７．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡの前記増加した発現及び／またはレベルが、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡに接触させられたが、そのｍＲＮＡが前記第１のポリヌクレオチドの結合エレメントを欠いている、さもなければ類似の細胞と比較される、実施形態９６に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ９８．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡの発現及び／またはレベルの前記増加が、約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、または５０倍である、実施形態９６または９７に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ９９．前記ｍＲＮＡの発現及び／またはレベルの前記増加が、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡの安定性（例えば、半減期）の増加、例えば、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡの安定性の約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または２０倍の増加を含む、実施形態９６または９７に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１００．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡが、約３～２５時間、約４～２０時間、約４～１５時間、約５～１０時間、約６～９時間、または約７～８時間の半減期を有する、実施形態９９に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１０１．前記システムまたは前記ＬＮＰ組成物が、例えば、実施例４にあるアッセイによって測定したときに、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡの持続的な発現及び／またはレベルをもたらす、実施形態９４または９５に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１０２．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡの前記発現及び／または前記レベルの少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも多くが、一定期間、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、２４、または３６時間維持される、実施形態１０１に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１０３．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡの前記持続的な発現及び／またはレベルが、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡに接触させられたが、そのｍＲＮＡが前記第１のポリヌクレオチドの結合エレメントを欠いている、さもなければ類似の細胞と比較される、実施形態１０２に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１０４．前記システム、または前記ＬＮＰ組成物が、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの減少した消失、例えば、その消失の約１．２倍、２倍、３倍、４倍、または５倍の減少をもたらす、実施形態１０１に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１０５．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの消失の前記減少が、一定期間、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または２４時間にわたって起こる、実施形態１０４に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１０６．前記システム、または前記ＬＮＰ組成物が、翻訳中ｍＲＮＡの減少した消失、例えば、その消失の約１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍の減少をもたらす、実施形態１０１に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１０７．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの消失の前記減少が、一定期間、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または２４時間にわたって起こる、実施形態１０６に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１０８．前記システム、または前記ＬＮＰ組成物が、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの翻訳の持続的な、例えば、維持されたレベルをもたらす、実施形態１０１に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１０９．前記システムが、例えば、実施例４のアッセイによって測定したときに、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードの増加した発現及び／またはレベル、例えば、増加したタンパク質レベル、翻訳、または半減期をもたらす、実施形態９４または９５に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１１０．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードの前記増加した発現及び／またはレベルが、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡに接触させられたが、そのｍＲＮＡが前記第１のポリヌクレオチドの結合エレメントを欠いている、さもなければ類似の細胞と比較される、実施形態１０９に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１１１．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードの発現及び／またはレベルの前記増加が、約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、または５０倍である、実施形態１０９または１１０に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１１２．前記システムが、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードの持続的な発現及び／またはレベルをもたらす、実施形態９４または９５に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１１３．
（ａ）前記第１のポリヌクレオチドが、
（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び
（２）ＭＳ２配列、例えば、２０ヌクレオチド長のスペーサーによって分離される１９個のヌクレオチドの６つのＭＳ２配列を含む結合エレメント、を含み、
（ｂ）前記第２のポリヌクレオチドが、
（１）ｅＩＦ４Ｇ、例えば、野生型ｅＩＦ４Ｇ、そのバリアントまたは断片を含むエフェクター分子、及び
（２）ＭＢＰ、例えば、野生型ＭＢＰ、そのバリアントまたは断片を含むテザー分子、をコードする配列を含む、
先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１１４．前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが各々、ｍＲＮＡを含む、実施形態１１３に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１１５．（ｂ）（２）の前記テザー分子が、（ａ）（２）の前記結合エレメントに結合する、例えば、それを認識する、実施形態１１３に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１１６．前記第１のポリヌクレオチドが、ＬＮＰとして製剤化されるか、または前記第２のポリヌクレオチドが、ＬＮＰとして製剤化される、実施形態１１３に記載のシステム。
Ｅ１１７．前記第１のポリヌクレオチドが、ＬＮＰとして製剤化され、かつ前記第２のポリヌクレオチドが、ＬＮＰとして製剤化される、実施形態１１３に記載のシステム。
Ｅ１１８．前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰ及び前記第２のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰが、同じである、実施形態１１７に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１１９．前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが各々、別個のＬＮＰとして製剤化され、任意選択で、
（ｉ）前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰが、第１の組成物中にあり、前記第２のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰが、別個の組成物中にあるか、または
（ｉｉ）前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰ及び前記第２のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰが、同じ組成物中にある、
実施形態１１７に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１２０．前記結合エレメントが、１９個のヌクレオチドを含む配列、例えば、表２で提供される結合エレメントのヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態１１３～１１９のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１２１．前記スペーサー配列が、２０個のヌクレオチド、例えば、表２で提供されるスペーサー配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態１１３～１２０のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１２２．前記エフェクター分子が、表２で提供されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態１１３～１２１のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１２３．前記エフェクター分子が、表２で提供されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列によってコードされる、実施形態１１３～１２２のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１２４．前記テザー分子が、表２で提供されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態１１３～１２３のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１２５．前記テザー分子が、表２で提供されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列によってコードされる、実施形態１１３～１２４のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１２６．前記第１のポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学修飾を含むｍＲＮＡを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１２７．前記第２のポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学修飾を含むｍＲＮＡを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１２８．前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される、実施形態１２６または１２７に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１２９．前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態１２８に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１３０．前記化学修飾が、Ｎ１－メチルシュードウリジンである、実施形態１２８に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１３１．前記ｍＲＮＡが、完全に修飾されたＮ１－メチルシュードウリジンを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
Ｅ１３２．前記ＬＮＰ組成物が、（ｉ）イオン化可能な脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む、実施形態１２６～１３１のいずれか１つに記載のシステム、または先行実施形態のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
Ｅ１３３．前記イオン化可能な脂質が、アミノ脂質を含む、実施形態１３２に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１３４．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）、（ＩＩｇ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ１）、（ＩＩＩａ２）、（ＩＩＩａ３）、（ＩＩＩａ４）、（ＩＩＩａ５）、（ＩＩＩａ６）、（ＩＩＩａ７）、または（ＩＩＩａ８）のうちのいずれかの化合物を含む、実施形態１３２または１３３に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１３５．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ）の化合物を含む、実施形態１３２～１３４のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１３６．前記イオン化可能な脂質が、式（ＩＩａ）の化合物を含む、実施形態１３２～１３５のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１３７．前記イオン化可能な脂質が、式（ＩＩｅ）の化合物を含む、実施形態１３２～１３５のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１３８．前記非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、またはＤＯＰＣからなる群から選択される化合物を含む、実施形態１３２～１３７のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１３９．前記リン脂質が、ＤＳＰＣ、例えば、ＤＳＰＣのバリアント、例えば、式（ＩＶ）の化合物である、実施形態１３８に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１４０．前記構造脂質が、アルファ－トコフェロール、β－シトステロール、またはコレステロールから選定される、実施形態１３２～１４１のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１４１．前記構造脂質が、アルファ－トコフェロールである、実施形態１４０に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１４２．前記構造脂質が、β－シトステロールである、実施形態１４０に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１４３．前記構造脂質が、コレステロールである、実施形態１４０に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１４４．前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される、実施形態１３２～１４３のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１４５．前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、及びＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質からなる群から選択される、実施形態１４４に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１４６．前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ－ＤＭＧである、実施形態１４５に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１４７．前記ＰＥＧ脂質が、式（Ｖ）、式（ＶＩ－Ａ）、式（ＶＩ－Ｂ）、式（ＶＩ－Ｃ）、または式（ＶＩ－Ｄ）の化合物から選定される、実施形態１４４に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１４８．前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ａ）の化合物である、実施形態１４７に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１４９．式（ＶＩ－Ｂ）の化合物である、実施形態１４７に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１５０．前記ＬＮＰが、約２０～６０％のイオン化可能な脂質：５～２５％のリン脂質：２５～５５％のコレステロール；及び０．５～１５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む、実施形態１３２～１４９のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１５１．前記ＬＮＰが、約５０％のイオン化可能な脂質：約１０％のリン脂質：約３８．５％のコレステロール；及び約１．５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む、実施形態１４９に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１５２．前記ＬＮＰが、約４９．８３％のイオン化可能な脂質：約９．８３％のリン脂質：約３０．３３％のコレステロール；及び約２．０％のＰＥＧ脂質のモル比を含む、実施形態１４９または１５０に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１５３．静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、眼内、直腸、経肺、または経口送達用に製剤化される、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１５４．静脈内送達用に製剤化される、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１５５．薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１５６．前記ポリヌクレオチド、例えば、前記第１のポリヌクレオチド及び／または前記第２のポリヌクレオチドが、キャップ、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、ポリＡテール及び／またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１５７．前記キャップが、本明細書に開示されるキャップを含む、実施形態１５６に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１５８．前記ポリヌクレオチド、例えば、前記第１のポリヌクレオチド及び／または前記第２のポリヌクレオチドが、キャップを含まない、実施形態１５６に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１５９．前記３’ＵＴＲが、本明細書に開示される３’ＵＴＲ、例えば、ｖ１．１ ３’ＵＴＲまたはそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む、実施形態１５６～１５８のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１６０．前記５’ＵＴＲが、本明細書に開示される５’ＵＴＲを含む、実施形態１５６～１５９のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１６１．前記ポリＡテールが、本明細書に開示されるポリＡテールの配列またはその断片を含む、実施形態１５６～１６０のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１６２．前記ポリヌクレオチド、例えば、前記第１のポリヌクレオチド及び／または前記第２のポリヌクレオチドが、ポリＡテールを含まない、実施形態１５６～１６０のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１６３．前記ｍｉＲＮＡ結合部位が、本明細書に開示されるｍｉＲＮＡ結合部位を含む、実施形態１５６～１６２のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１６４．前記ポリヌクレオチド、例えば、前記第１のポリヌクレオチド及び／または前記第２のポリヌクレオチドが、環状ポリヌクレオチドである、先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１６５．前記第１のポリヌクレオチドが、環状ポリヌクレオチドである、実施形態Ｅ１６５に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１６６．前記第２のポリヌクレオチドが、環状ポリヌクレオチドである、実施形態Ｅ１６５に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ１６７．先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物を含む、薬学的組成物。
Ｅ１６８．先行実施形態のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物を含む、細胞。
Ｅ１６９．前記システムまたは前記ＬＮＰ組成物に接触させられた、実施形態１６８に記載の細胞。
Ｅ１７０．前記システムまたは前記ＬＮＰ組成物の一方または両方のポリヌクレオチドの発現を可能にするのに十分な条件下で維持される、実施形態１６８または１６９に記載の細胞。
Ｅ１７０．細胞において治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現を増加させる方法であって、前記細胞に、実施形態１～１６６のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物を投与することを含む、方法。
Ｅ１７１．細胞において治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現を増加させる方法において使用するための、実施形態１～１６６のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物またはシステム。
Ｅ１７２．対象において治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現を増加させる方法であって、前記対象に、有効量の実施形態１～１６６のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物を投与することを含む、方法。
Ｅ１７３．対象において治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現を増加させる方法において使用するための、実施形態１～１６６のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物またはシステム。
Ｅ１７４．実施形態１～１６６のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物を細胞に送達する方法。
Ｅ１７５．前記システムまたは前記ＬＮＰ組成物を細胞に送達する方法において使用するための、実施形態１～１６６のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物またはシステム。
Ｅ１７６．前記細胞をインビトロ、インビボ、またはエクスビボで前記システムまたは前記ＬＮＰ組成物に接触させることを含む、実施形態１７４に記載の方法、または実施形態１７５に記載の使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ１７７．実施形態１～１６６のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物を、例えば、本明細書に記載されるような疾患または障害を有する対象に送達する方法。
Ｅ１７８．前記システムまたは前記ＬＮＰ組成物を、例えば、本明細書に記載されるような疾患または障害を有する対象に送達する方法において使用するための、実施形態１～１６６のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物またはシステム。
Ｅ１７９．対象における免疫応答を調節する方法であって、それを必要とする前記対象に、有効量の実施形態１～１６６のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物を投与することを含む、方法。
Ｅ１８０．対象における免疫応答を調節する方法であって、前記対象に、有効量の前記システムまたは前記ＬＮＰ組成物を投与することを含む方法において使用するための、実施形態１～１６６のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物またはシステム。
Ｅ１８１．疾患または障害を処置するか、予防するか、またはその症状を予防する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の実施形態１～１６６のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物を投与することを含む、方法。
Ｅ１８２．対象における疾患または障害を処置するか、予防するか、またはその症状を予防する方法であって、それを必要とする前記対象に、有効量の前記システムまたは前記ＬＮＰ組成物を投与することを含む、方法において使用するための、実施形態１～１６６のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物またはシステム。
Ｅ１８４．前記システムの前記第１のポリヌクレオチド及び／または前記第２のポリヌクレオチドが、ＬＮＰとして製剤化される、実施形態１７０～１８３のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたシステム。
Ｅ１８５．前記システムの前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドの両方が各々、ＬＮＰ、例えば、同じまたは異なるＬＮＰとして製剤化される、実施形態１８４に記載の方法。
Ｅ１８６．前記（ａ）を含むＬＮＰ及び前記（ｂ）を含むＬＮＰが、同時に、例えば、実質的に同時に投与される、実施形態１７０～１８５のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ１８７．前記（ａ）を含むＬＮＰ及び前記（ｂ）を含むＬＮＰが、順次に投与される、実施形態１７０～１８５のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ１８８．前記（ａ）を含むＬＮＰが最初に投与される、実施形態１８７に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ１８９．前記（ａ）を含むＬＮＰが最初に投与され、続いて前記（ｂ）を含むＬＮＰが投与される、実施形態１８７または１８８に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ１９０．前記（ｂ）を含むＬＮＰが最初に投与される、実施形態１８７に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ１９１．前記（ｂ）を含むＬＮＰが最初に投与され、続いて前記（ａ）を含むＬＮＰが投与される、実施形態１８７または１９０に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ１９２．前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰが、参照ＬＮＰと比較してより低い用量で投与される、実施形態１７０～１９１のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ１９３．前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰが、参照ＬＮＰの前記用量と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低い用量で投与される、実施形態１９２に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ１９４．前記参照ＬＮＰが、前記第１のポリヌクレオチドの前記結合エレメントを有しないポリヌクレオチドを含む、さもなければ類似のＬＮＰ、または前記第２のポリヌクレオチドを含まないＬＮＰから選定される、実施形態１９２または１９３に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ１９５．前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰが、前記第２のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰと比較してより高い用量で投与される、実施形態１７０～１９１のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ１９６．前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰが、前記第２のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰの前記用量と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高い用量で投与される、実施形態１９５に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ１９７．前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰが、前記第２のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰと比較してモル過剰である、実施形態１７０～１９１のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ１９８．前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰが、前記第２のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰと比較して約１～８００倍モル過剰である、実施形態１９７に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ１９９．前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰが、前記第２のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰと比較して約１～７５０倍、約２～７００倍、約３～６５０倍、約４～６００倍、約５～５５０倍、約６～５００倍、約７～４５０倍、約８～４００倍、約１０～３５０倍、約１５～３００倍、約２０～２５０倍、約２５～２００倍、約３０～１５０倍、約３５～１００倍、約４０～９０倍、約４５～８０倍、約５０～７５倍、約６０～７０倍モル過剰である、実施形態１９７または１９８に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２００．前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰが、前記第２のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰと比較して約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１１倍、約１２倍、約１３倍、約１４倍、約１５倍、約２０倍、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍、約１５０倍、約２００倍、約２５０倍、約３００倍、約３５０倍、約４００倍、約４５０倍、約５００倍、約６００倍、約６５０倍、約７００倍、約７５０倍、または約８００倍モル過剰である、実施形態１９７または１９８に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２０１．前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰが、前記第２のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰと比較して約９倍モル過剰である、実施形態１９７～２００のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２０２．前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰが、前記第２のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰと比較して約１０倍モル過剰である、実施形態１９７～２００のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２０３．前記第１のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰ及び前記第２のポリヌクレオチドを含む前記ＬＮＰが、同じモル量である、実施形態１９７～２００のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２０４．細胞において（例えば、前記システムまたは前記ＬＮＰ組成物に接触させられた細胞において）、以下のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくはそれらの全て、または任意の組み合わせをもたらす、実施形態１７１～２０３のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２０５．（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つ、またはそれらの全てが、
（ａ）実施形態７に記載のシステムに接触させられていないか、
（ｂ）実施形態１に記載のＬＮＰ組成物に接触させられていないか、
（ｃ）前記第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰに接触させられていないか、または
（ｄ）前記第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰに接触させられたが、前記第２のポリヌクレオチド、例えば、前記第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰには接触させられていない、
細胞と比較される、実施形態２０４に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２０６．前記システム、または前記ＬＮＰ組成物が、例えば、実施例２または３にあるアッセイによって測定したときに、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡの増加した発現及び／またはレベルをもたらす、実施形態２０４または２０５に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２０７．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡの前記増加した発現及び／またはレベルが、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡに接触させられたが、そのｍＲＮＡが前記第１のポリヌクレオチドの結合エレメントを欠いている、さもなければ類似の細胞と比較される、実施形態２０６に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２０８．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡの発現及び／またはレベルの前記増加が、約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、または５０倍である、実施形態２０６または２０７に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２０９．前記ｍＲＮＡの発現及び／またはレベルの前記増加が、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡの安定性（例えば、半減期）の増加、例えば、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡの安定性の約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または２０倍の増加を含む、実施形態２０６または２０７に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物またはシステム。
Ｅ２１０．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡが、約３～２５時間、約４～２０時間、約４～１５時間、約５～１０時間、約６～９時間、または約７～８時間の半減期を有する、実施形態２０９に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２１１．前記システムまたは前記ＬＮＰ組成物が、例えば、実施例４にあるアッセイによって測定したときに、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡの持続的な発現及び／またはレベルをもたらす、実施形態２０４または２０５に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２１２．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡの前記発現及び／または前記レベルの少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれよりも多くが、一定期間、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、２４、または３６時間維持される、実施形態２１１に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２１３．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記ｍＲＮＡの前記持続的な発現及び／またはレベルが、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡに接触させられたが、そのｍＲＮＡが前記第１のポリヌクレオチドの結合エレメントを欠いている、さもなければ類似の細胞と比較される、実施形態２１２に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２１４．前記システム、または前記ＬＮＰ組成物が、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの減少した消失、例えば、その消失の約１．２倍、２倍、３倍、４倍、または５倍の減少をもたらす、実施形態２１１に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２１５．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの消失の前記減少が、一定期間、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または２４時間にわたって起こる、実施形態２１４に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２１６．前記システム、または前記ＬＮＰ組成物が、翻訳中ｍＲＮＡの減少した消失、例えば、その消失の約１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍の減少をもたらす、実施形態２１１に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２１７．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの消失の前記減少が、一定期間、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、または２４時間にわたって起こる、実施形態２１６に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２１８．前記システム、または前記ＬＮＰ組成物が、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの翻訳の持続的な、例えば、維持されたレベルをもたらす、実施形態２１１に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２１９．前記システムが、例えば、実施例４のアッセイによって測定したときに、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードの増加した発現及び／またはレベル、例えば、増加したタンパク質レベル、翻訳、または半減期をもたらす、実施形態２０４または２０５に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２２０．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードの前記増加した発現及び／またはレベルが、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡに接触させられたが、そのｍＲＮＡが前記第１のポリヌクレオチドの結合エレメントを欠いている、さもなければ類似の細胞と比較される、実施形態２１９に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２２１．前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードの発現及び／またはレベルの前記増加が、約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、３５、４０、または５０倍である、実施形態２１９または２２０に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２２２．前記システムが、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードの持続的な発現及び／またはレベルをもたらす、実施形態２０４または２０５に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２２３．前記第１のポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学修飾を含むｍＲＮＡを含む、実施形態１７１～２２２のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２２４．前記第２のポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学修飾を含むｍＲＮＡを含む、実施形態１７１～２２２のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２２５．前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される、実施形態２２３または２２４に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２２６．前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、５－メチルシトシン、５－メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態２２５に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２２７．前記化学修飾が、Ｎ１－メチルシュードウリジンである、実施形態２２５に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２２８．前記ｍＲＮＡが、完全に修飾されたＮ１－メチルシュードウリジンを含む、実施形態１７１～２２７のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２２９．前記ＬＮＰ組成物が、（ｉ）イオン化可能な脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む、実施形態１７１～２２８のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２３０．前記イオン化可能な脂質が、アミノ脂質を含む、実施形態２２９に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２３１．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）、（ＩＩｇ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ１）、（ＩＩＩａ２）、（ＩＩＩａ３）、（ＩＩＩａ４）、（ＩＩＩａ５）、（ＩＩＩａ６）、（ＩＩＩａ７）、または（ＩＩＩａ８）のうちのいずれかの化合物を含む、実施形態２２９または２３０に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２３２．前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ）の化合物を含む、実施形態２２９～２３１のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２３３．前記イオン化可能な脂質が、式（ＩＩａ）の化合物を含む、実施形態２２９～２３２のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２３４．前記イオン化可能な脂質が、式（ＩＩｅ）の化合物を含む、実施形態２２９～２３２のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２３５．前記非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質が、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、またはＤＯＰＣからなる群から選択される化合物を含む、実施形態２２９～２３４のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２３６．前記リン脂質が、ＤＳＰＣ、例えば、ＤＳＰＣのバリアント、例えば、式（ＩＶ）の化合物である、実施形態２３５に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２３７．前記構造脂質が、アルファ－トコフェロール、β－シトステロール、またはコレステロールから選定される、実施形態２２９～２３８のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２３８．前記構造脂質が、アルファ－トコフェロールである、実施形態２３７に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２３９．前記構造脂質が、β－シトステロールである、実施形態２３７に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２４０．前記構造脂質が、コレステロールである、実施形態２３７に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２４１．前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される、実施形態２２９～２４０のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２４２．前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、及びＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質からなる群から選択される、実施形態２４１に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２４３．前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ－ＤＭＧである、実施形態２４１または２４２に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２４４．前記ＰＥＧ脂質が、式（Ｖ）、式（ＶＩ－Ａ）、式（ＶＩ－Ｂ）、式（ＶＩ－Ｃ）、または式（ＶＩ－Ｄ）から選定される化合物である、実施形態２２９～２４０のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２４５．前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ａ）の化合物である、実施形態２４４に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２４６．前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ｂ）の化合物である、実施形態２４４に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２４７．前記ＬＮＰが、約２０～６０％のイオン化可能な脂質：５～２５％のリン脂質：２５～５５％のコレステロール；及び０．５～１５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む、実施形態２２９～２４６のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２４８．前記ＬＮＰが、約５０％のイオン化可能な脂質：約１０％のリン脂質：約３８．５％のコレステロール；及び約１．５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む、実施形態２４７に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２４９．前記ＬＮＰが、約４９．８３％のイオン化可能な脂質：約９．８３％のリン脂質：約３０．３３％のコレステロール；及び約２．０％のＰＥＧ脂質のモル比を含む、実施形態２４７または２４８に記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２５０．前記ＬＮＰまたはシステムが、静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、眼内、直腸、経肺、または経口送達用に製剤化される、実施形態１７１～２４９のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２５１．前記対象が、哺乳動物、例えば、ヒトである、実施形態１７１～２５０のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２５２．前記対象が、本明細書に開示される疾患または障害を有する、実施形態１７１～２５１のいずれか１つに記載の方法または使用に向けたＬＮＰ組成物もしくはシステム。
Ｅ２５３．前記エフェクター分子が、前記結合エレメントを認識する、実施形態２に記載のＬＮＰ組成物。
Ｅ２５４．前記第２のポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
Ｅ２５５．前記エフェクター分子をコードする前記配列が、組織特異的プロモーターの制御下にある、実施形態２５４に記載のＬＮＰ組成物。
Ｅ２５６．前記エフェクター分子の発現または動員が、特定の微小環境または特定の細胞種におけるトリガーの制御下にある、実施形態１～４のいずれか１つに記載のＬＮＰ組成物。
Ｅ２５７．前記トリガーが、マイクロＲＮＡ、受容体介在性活性化、及び／またはｐＨの変化及び／または低酸素である、実施形態２５６に記載のＬＮＰ組成物。
Ｅ２５８．
（ａ）（１）治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに／または
（ｂ）エフェクター分子をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチド、を含み、
任意選択で、（ａ）及び（ｂ）が各々、ｍＲＮＡを含む、
システム。
Ｅ２５９．前記エフェクター分子が、前記結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をさらに含む、実施形態Ｅ２５８に記載のシステム。
Ｅ２６０．前記エフェクター分子が、前記結合エレメントを認識する、実施形態Ｅ２５８に記載のシステム。
Ｅ２６１．前記第２のポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、実施形態７のいずれかに記載のシステム。
Ｅ２６２．前記エフェクター分子が、組織特異的プロモーターの制御下にある、実施形態７に記載のシステム。
Ｅ２６３．前記エフェクター分子の発現または前記エフェクター分子の動員が、特定の微小環境または特定の細胞種におけるトリガーの制御下にある、実施形態２６２に記載のシステム。
Ｅ２６４．前記トリガーが、マイクロＲＮＡ、受容体介在性活性化、及び／またはｐＨの変化及び／または低酸素である、実施形態２６３に記載のシステム。
Ｅ２６５．前記第１のポリヌクレオチドが、いずれの化学修飾も有しないｍＲＮＡを含む、実施形態１～１２５及び１２８～２６４のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
Ｅ２６６．前記第２のポリヌクレオチドが、いずれの化学修飾も有しないｍＲＮＡを含む、実施形態１～１２５及び１２８～２６４のいずれか１つに記載のシステムまたはＬＮＰ組成物。
２つのＲＮＡシステムの概略図を提供する。３’ＵＴＲにＭＳ２ループを有する標的ｍＲＮＡ、及び切り詰められたｅＩＦ４Ｇ（ｅＩＦ４ＧΔＮ）に融合されたＭＳ２結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする別のｍＲＮＡが、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションによって共送達される。ＭＳ２ループは、３’ＵＴＲを完全に置き換えるか、またはｖ１．１ ＵＴＲ配列の前もしくは後に付加されるかのいずれかである。 Ａ～Ｄは、テザリングされたｅＩＦ４Ｇによる、ＨｅＬａ細胞における標的ｄｅｇ－ＧＦＰ ＲＮＡについての増加したタンパク質生産量を図示する。総計緑色強度対時間がプロットされる。３’ＵＴＲにＭＳ２ループを有する標的ｍＲＮＡを、対照タンパク質（ＥＰＯ、配列番号８１）またはテザリングされた対照（ＭＢＰ－ＬａｃＺ、配列番号３９）またはテザリングされたエフェクター（ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮ、配列番号１１）をコードする別のｍＲＮＡと共送達した。実験は、標的を１０倍モル過剰にして行った。Ａは、３’ＵＴＲに結合部位を有しない対照標的ｍＲＮＡの結果を示す（‘３ＵＴＲはｖ１．１配列を含む；配列番号４）。Ｂは、３’ＵＴＲにおいてｖ１．１配列の上流にＭＳ２結合部位を有する標的ｍＲＮＡの結果を示す。Ｃは、３’ＵＴＲにＭＳ２結合部位を有する標的ｍＲＮＡの結果を示す。Ｄは、３’ＵＴＲにおいてｖ１．１配列の下流にＭＳ２結合部位を有する標的ｍＲＮＡの結果を示す。この構築物において、ＭＳ２結合部位は、ポリＡ配列に隣接していた。 Ａ～Ｃは、テザリングされたｅＩＦ４Ｇによる、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、及びＨｅｐ３ｂ細胞における標的ｄｅｇ－ＧＦＰ ＲＮＡについての増加したタンパク質生産量を図示する。総ＡＵＣがプロットされる。標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲステータスがｘ軸上に示される。実験は、標的を３倍モル過剰にして行った。Ａは、ＨｅＬａ細胞におけるｄｅｇ－ＧＦＰ ＲＮＡタンパク質生産量を示す。Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞におけるｄｅｇ－ＧＦＰ ＲＮＡタンパク質生産量を示す。Ｃは、Ｈｅｐ３ｂ細胞におけるｄｅｇ－ＧＦＰ ＲＮＡタンパク質生産量を示す。 テザリングされたエフェクターの比を増加させることにより、ＨｅＬａ細胞における総タンパク質生産量が増加することを示す。標的ｄｅｇ－ＧＦＰ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲステータスが概略図に示される。経時的な総計緑色強度を示す。（標的ｍＲＮＡは、全ての条件において同じ量で添加した。エフェクターＲＮＡの量は、示されるように変化している）。 テザリングされたエフェクターの比を増加させることにより、当該モデルによって予測される半減期が増加することを示す。４パラメータモデルを使用した予測される半減期（時間）を示す。各条件下で得られた半減期の値が、データラベルとして追加される。 図示されるような異なるＲＮＡと共送達された標的ＲＮＡについての総計緑色強度対時間を示す（ＵＴＲの性質がパネルの上部に図示される）。ＨＥＫ２９３細胞に、標的レポーターＲＮＡ、及び対照タンパク質をコードするｍＲＮＡ（ＥＰＯ、配列番号８１）、またはテザリングされた対照タンパク質をコードするｍＲＮＡ（ＭＢＰ－ＬａｃＺ、配列番号３９）、またはテザリングされたエフェクタータンパク質をコードするｍＲＮＡ（ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮ、配列番号１１）をエレクトロポレーションで導入した。実験は、標的ＲＮＡを３倍モル過剰にして行った。ＵＴＲにＭＳ２部位を有する標的ＲＮＡについて、テザリングされたエフェクターの存在下でタンパク質の量及び発現の持続期間の両方が増加したことを示す。 図示されるような異なるＲＮＡと共送達された標的ＲＮＡについての総計緑色強度対時間を示す（ＵＴＲの性質がパネルの上部に図示される）。ＨＥＫ２９３細胞に、標的レポーターＲＮＡ、及び対照タンパク質をコードするｍＲＮＡ（ＥＰＯ、配列番号８１）、またはテザリングされた対照タンパク質をコードするｍＲＮＡ（ＭＢＰ－ＬａｃＺ、配列番号３９）、またはテザリングされたエフェクタータンパク質をコードするｍＲＮＡ（ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮ、配列番号１１）をエレクトロポレーションで導入した。実験は、標的ＲＮＡを３倍モル過剰にして行った。ＵＴＲにＭＳ２部位を有する標的ＲＮＡについて、テザリングされたエフェクターの存在下でタンパク質の量及び発現の持続期間の両方が増加したことを示す。 テザリングされたｅＩＦ４Ｇによる、標的ｍＲＮＡの出発量のうちＨＥＫ２９３細胞に残存する％を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、標的レポーターＲＮＡ、及び対照タンパク質をコードするｍＲＮＡ（ＥＰＯ、配列番号８１）、またはテザリングされた対照タンパク質をコードするｍＲＮＡ（ＭＢＰ－ＬａｃＺ、配列番号３９）、またはテザリングされたエフェクタータンパク質をコードするｍＲＮＡ（ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮ、配列番号１１）をエレクトロポレーションで導入した。実験は、標的ＲＮＡを３倍モル過剰にして行った。テザリングされたエフェクター条件では、ＭＳ２部位を有する標的ｍＲＮＡの出発量のうちの％が時間経過によりはるかに緩徐に低下したことを示す。これは標的ＲＮＡの半減期の増加を示唆する。 テザリングされたｅＩＦ４Ｇによる、標的ｍＲＮＡの出発量のうちＨＥＫ２９３細胞に残存する％を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、標的レポーターＲＮＡ、及び対照タンパク質をコードするｍＲＮＡ（ＥＰＯ、配列番号８１）、またはテザリングされた対照タンパク質をコードするｍＲＮＡ（ＭＢＰ－ＬａｃＺ、配列番号３９）、またはテザリングされたエフェクタータンパク質をコードするｍＲＮＡ（ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮ、配列番号１１）をエレクトロポレーションで導入した。実験は、標的ＲＮＡを３倍モル過剰にして行った。テザリングされたエフェクター条件では、ＭＳ２部位を有する標的ｍＲＮＡの出発量のうちの％が時間経過によりはるかに緩徐に低下したことを示す。これは標的ＲＮＡの半減期の増加を示唆する。 テザリングされたエフェクターによる、Ｈｅｐ３ｂにおけるより後の時点での標的ｍＲＮＡについての堅牢な翻訳の維持を図示する。Ｈｅｐ３ｂ細胞を、テザリングされていない対照（ＥＰＯ、配列番号８１）、テザリングされた対照（ＭＢＰ－ＬａｃＺ、配列番号３９）、またはテザリングされたエフェクター（ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮ、配列番号１１）とともにした標的ｍＲＮＡ（ＵＴＲを含むＭＳ２ループ）によるエレクトロポレーション後の示される時点で撮像した。全ての実験は、１．５倍モル過剰の標的を用いて行った。対照細胞には、ルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をエレクトロポレーションで導入したか、またはＲＮＡなしであった。画像は、ｓｍＦＩＳＨ及びＶ５シグナルに対してそれぞれ赤色及び緑色チャネルで解析した。テザリングされたエフェクターが標的ｍＲＮＡの分解速度を低減することを示す。 テザリングされたエフェクターによる、Ｈｅｐ３ｂにおけるより後の時点での標的ｍＲＮＡについての堅牢な翻訳の維持を図示する。Ｈｅｐ３ｂ細胞を、テザリングされていない対照（ＥＰＯ、配列番号８１）、テザリングされた対照（ＭＢＰ－ＬａｃＺ、配列番号３９）、またはテザリングされたエフェクター（ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮ、配列番号１１）とともにした標的ｍＲＮＡ（ＵＴＲを含むＭＳ２ループ）によるエレクトロポレーション後の示される時点で撮像した。全ての実験は、１．５倍モル過剰の標的を用いて行った。対照細胞には、ルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をエレクトロポレーションで導入したか、またはＲＮＡなしであった。画像は、ｓｍＦＩＳＨ及びＶ５シグナルに対してそれぞれ赤色及び緑色チャネルで解析した。テザリングされたエフェクターが時間経過による翻訳中ｍＲＮＡの消失を低減することを示す。 テザリングされたエフェクターによる、Ｈｅｐ３ｂにおけるより後の時点での標的ｍＲＮＡについての堅牢な翻訳の維持を図示する。Ｈｅｐ３ｂ細胞を、テザリングされていない対照（ＥＰＯ、配列番号８１）、テザリングされた対照（ＭＢＰ－ＬａｃＺ、配列番号３９）、またはテザリングされたエフェクター（ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮ、配列番号１１）とともにした標的ｍＲＮＡ（ＵＴＲを含むＭＳ２ループ）によるエレクトロポレーション後の示される時点で撮像した。全ての実験は、１．５倍モル過剰の標的を用いて行った。対照細胞には、ルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をエレクトロポレーションで導入したか、またはＲＮＡなしであった。画像は、ｓｍＦＩＳＨ及びＶ５シグナルに対してそれぞれ赤色及び緑色チャネルで解析した。テザリングされたエフェクターにより、より高いパーセンテージの細胞がより後の時点で堅牢な翻訳を維持したことを示す。 テザリングされたエフェクターによる、Ｈｅｐ３ｂにおけるより後の時点での標的ｍＲＮＡについての堅牢な翻訳の維持を図示する。Ｈｅｐ３ｂ細胞を、テザリングされていない対照（ＥＰＯ、配列番号８１）、テザリングされた対照（ＭＢＰ－ＬａｃＺ、配列番号３９）、またはテザリングされたエフェクター（ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮ、配列番号１１）とともにした標的ｍＲＮＡ（ＵＴＲを含むＭＳ２ループ）によるエレクトロポレーション後の示される時点で撮像した。全ての実験は、１．５倍モル過剰の標的を用いて行った。対照細胞には、ルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をエレクトロポレーションで導入したか、またはＲＮＡなしであった。画像は、ｓｍＦＩＳＨ及びＶ５シグナルに対してそれぞれ赤色及び緑色チャネルで解析した。テザリングされたエフェクターが経時的に標的ｍＲＮＡ当たりの翻訳を維持したこと示す。 テザリングされたエフェクターによる、Ｈｅｐ３ｂにおけるより後の時点での標的ｍＲＮＡについての堅牢な翻訳の維持を図示する。Ｈｅｐ３ｂ細胞を、テザリングされていない対照（ＥＰＯ、配列番号８１）、テザリングされた対照（ＭＢＰ－ＬａｃＺ、配列番号３９）、またはテザリングされたエフェクター（ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮ、配列番号１１）とともにした標的ｍＲＮＡ（ＵＴＲを含むＭＳ２ループ）によるエレクトロポレーション後の示される時点で撮像した。全ての実験は、１．５倍モル過剰の標的を用いて行った。対照細胞には、ルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をエレクトロポレーションで導入したか、またはＲＮＡなしであった。画像は、ｓｍＦＩＳＨ及びＶ５シグナルに対してそれぞれ赤色及び緑色チャネルで解析した。図６Ｄと類似のデータを示し、１細胞当たりの平均ＮＰＩ強度がプロットされる。図中のＮは、評定された細胞の数を表す。色は、テザリングされていない無関係のタンパク質（黒色）、テザリングされた対照タンパク質（オレンジ色）、及びテザリングされたエフェクタータンパク質（緑色）をコードするＲＮＡとともにした標的ＲＮＡのトランスフェクションを表す。 Ａ～Ｄは、テザリングされたエフェクターによる、ＨｅＬａにおけるより後の時点での標的ｍＲＮＡについての堅牢な翻訳の維持を図示する。ＨｅＬａ細胞を、テザリングされていない対照（ＥＰＯ、配列番号８１）、テザリングされた対照（ＭＢＰ－ＬａｃＺ、配列番号３９）、またはテザリングされたエフェクター（ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮ、配列番号１１）とともにした標的ｍＲＮＡ（ＵＴＲを含むＭＳ２ループ）によるエレクトロポレーション後の示される時点で撮像した。全ての実験は、１．５倍モル過剰の標的を用いて行った。対照細胞には、ルシフェラーゼ（Ｆｌｕｃ）をエレクトロポレーションで導入したか、またはＲＮＡなしであった。画像は、ｓｍＦＩＳＨ及びＶ５シグナルに対してそれぞれ赤色及び緑色チャネルで解析した。Ａは、いずれの条件においても経時的なサイトゾルｍＲＮＡの認識できる変化がないことを示す。Ｂは、いずれの条件においても時間経過によるｍＲＮＡ当たりの翻訳の認識できる変化がないことを示す。Ｃは、テザリングされたエフェクターが経時的により高いパーセンテージの翻訳中ｍＲＮＡを維持したことを示す。Ｄは、テザリングされたｅＩＦ４Ｇにより、より高いパーセンテージの細胞がより後の時点で堅牢な翻訳を維持したことを示す。 エフェクター機能に必要とされるｅＩＦ４Ｇのドメインを特定するための実験の結果を図示する。使用された構築物の概略図を提供する。標的ｄｅｇ－ＧＦＰ ＲＮＡを、対照タンパク質であるＥＰＯをコードするｍＲＮＡ（配列番号８１）、またはテザリングされた対照タンパク質であるＭＢＰ－ＬａｃＺをコードするｍＲＮＡ（配列番号３９）、またはテザリングされたエフェクタータンパク質であるＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮをコードするｍＲＮＡ（配列番号１１）、もしくは図８Ａに図解されるような切り詰め及び変異ｅＩＦ４Ｇに融合されたＭＢＰをコードするｍＲＮＡと共送達した。実験は、標的ＲＮＡを１０倍モル過剰にして行った。 エフェクター機能に必要とされるｅＩＦ４Ｇのドメインを特定するための実験の結果を図示する。ＨｅＬａ細胞における結果を示す。 エフェクター機能に必要とされるｅＩＦ４Ｇのドメインを特定するための実験の結果を図示する。ＨＥＫ２９３細胞における結果を示す。 エフェクター機能に必要とされるｅＩＦ４Ｇのドメインを特定するための実験の結果を図示する。ＨｅＬａ細胞における結果を示す。 エフェクター機能に必要とされるｅＩＦ４Ｇのドメインを特定するための実験の結果を図示する。ＨＥＫ２９３細胞における結果を示す。 図８Ａ～８Ｅの結合部位実験の要約データを図示する表である。 Ａ～Ｃは、テザリングシステム、及び標的ＲＮＡが２４個のＭＳ２部位を有した場合の行われた実験の結果を図示する。Ａは、標的タンパク質をコードするＲＮＡが検出可能なタンパク質発現を示さない、テザリングシステムの概略図である。このＲＮＡは、特定のエフェクタータンパク質と相互作用した際に活性化され得る。相互作用は、既知のＲＮＡ結合タンパク質－ＲＮＡ間相互作用のテザー（ＭＢＰタンパク質－ＲＮＡにおけるＭＳ２ステムループ構造）によって媒介される。Ｂは、２つのＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞についてのリアルタイム蛍光曲線を図示する。各試料は、対照（ＥＰＯ、配列番号８１）またはＭＢＰ－エフェクタータンパク質（ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧｄＮ、配列番号１１）をコードするＲＮＡとコトランスフェクトした、標的ｄｅｇ－ＧＦＰをコードするＲＮＡ（３’ＵＴＲ＿ｖ１．１、配列番号４；または３’ＵＴＲ＿２４ ＭＳ２、配列番号１５４）を有する。Ｃは、Ａにあるのと同じデータについてのＡＵＣを示す。 ＭＳ２結合タンパク質（ＭＢＰ）－ＭＳ２テザーを用いて潜在的なエフェクターを標的ＲＮＡに動員するためのシステムの概略図を提供する。標的ｍＲＮＡは、３’ＵＴＲにＭＳ２ループを有し、ポリＡテールを欠いている（Ａ０）。第２のｍＲＮＡは、エフェクター／ｅＩＦ４Ｇ－ｍｉｄ（ｅＩＦ４Ｇタンパク質の切り詰められた断片）に融合されたＭＳ２結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする。ＲＮＡ結合タンパク質であるＭＢＰは、ＭＳ２ヘアピンの認識を介してエフェクターであるｅＩＦ４Ｇを標的ＲＮＡにテザリングする。このシステムを、特定の細胞におけるテザリングを可能にするためのｍｉＲＮＡ依存性スイッチゲートに連結して、それによって標的タンパク質の発現をオンにすることができる。ｎｔ：ヌクレオチド、ａａ：アミノ酸。 Ａ～Ｄは、テザリングされたエフェクターとの共送達が、Ｈｅｐ３ｂまたはＨｅＬａ細胞におけるテールなしｍＲＮＡの発現を救済することを図示する。対照（Ａ１００）標的ＲＮＡ（ｖ１．１＿Ａ１００テールを有するｄｅｇＧＦＰ）または試験（Ａ０）標的ＲＮＡ（６×ＭＳ２＿Ａ０テールを有するｄｅｇＧＦＰ、配列番号３）を、対照タンパク質（ｔ－ｃｔｒｌ、ＭＢＰ－ＬａｃＺ、配列番号３９）またはテザリングされたエフェクター（ｔ－ｅｆｆ、ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧＭＩＤ２、配列番号２３）をコードする別のｍＲＮＡと共送達した。実験は、標的を１０倍モル過剰にして行った。Ａは、示されるＲＮＡ構築物でコトランスフェクトされたＨｅｐ３ｂ細胞における経時的な総計緑色強度を示す。Ｂは、Ａにあるデータについての、標準Ａ１００ ＲＮＡを用いて得られたＡＵＣに対して正規化されたＡＵＣである。Ｃは、示されるＲＮＡ構築物でコトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞における経時的な総計緑色強度を示す。Ｄは、Ｃにあるデータについての、標準Ａ１００ ＲＮＡを用いて得られたＡＵＣに対して正規化されたＡＵＣである。 テールなし標的ＲＮＡがエフェクターと共送達された場合にのみ検出可能な発現を示し、テールなしＲＮＡがｉｄＴにライゲーションされる場合には全体的発現がさらに改善されることを示す。この図は、エフェクター（ｔ－ｅｆｆ、ＭＢＰ－ｍｉｄ２、配列番号２３）または対照（ｔ－ｃｔｒｌ、ＭＢＰ－ＬａｃＺ、配列番号３９）ＲＮＡとともにした３’ｖ１．１＿ＭＳ２＿Ａ０、または３’ｖ１．１＿ＭＳ２－Ａ０－ｉｄＴ ｄｅｇ－ＧＦＰ構築物でのＨｅｐ３ｂ細胞のトランスフェクション後の示される時間（ｘ軸）で測定された緑色蛍光タンパク質のレベル（ＧＦＰ蛍光、ｙ軸）を図示する。 キャップなし標的ＲＮＡがエフェクターと共送達された場合にのみ検出可能な発現を示すことを示す。この図は、エフェクター（ｔ－ｅｆｆ、ＭＢＰ－ｅＩＦ４Ｇ－ｍｉｄ２、配列番号２３）または対照（ｔ－ｃｔｒｌ、ＭＢＰ－ｅＩＦ４Ｇ－ｍｉｄ２ｍｕｔ、配列番号６９）ＲＮＡとともにした５’ＰＰＰ－末端ＮｐｉＬＵＣ構築物でのＨｅＬａ細胞のトランスフェクション後の示される時間（ｘ軸）で測定された相対発光量のレベル（ＲＬＵ、ｙ軸）を図示する。 キャップなし－テールなし標的ＲＮＡがエフェクターと共送達された場合にのみ検出可能な発現を示すことを示す。この図は、エフェクター（ｔ－ｅｆｆ、ＭＢＰ－ｅＩＦ４Ｇ－ｍｉｄ２、配列番号２３）または対照（ｔ－ｃｔｒｌ、ＭＢＰ－ｅＩＦ４Ｇ－ｍｉｄ２ｍｕｔ、配列番号６９）ＲＮＡとともにした５’ＰＰＰ－Ａ０末端ＮｐｉＬＵＣ構築物でのＨｅＬａ細胞のトランスフェクション後の示される時間（ｘ軸）で測定された相対発光量のレベル（ＲＬＵ、ｙ軸）を図示する。 テザリングされたエフェクターが経時的な翻訳中ｍＲＮＡの消失を減少させることを示す。Ｈｅｐ３ｂ細胞を、テザリングされていない対照（ｎｔ－ｃｔｒｌ、ＥＰＯ）、テザリングされた対照（ｔ－ｃｔｒｌ、ＭＢＰ－ＬａｃＺ、配列番号３９）、またはテザリングされたエフェクター（ｔ－ｅｆｆ、ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮ、配列番号１１）と組み合わせた標的ｍＲＮＡ（ＵＴＲを含むＭＳ２ループ）によるエレクトロポレーション後の示される時点で撮像した。グラフは、１細胞当たりの新生ペプチドイメージング（ＮＰＩ）＋ｓｍＦＩＳＨ＋スポットの計数を図示する。全ての実験は、１．５倍モル過剰の標的を用いて行った。対照細胞には、ルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をエレクトロポレーションで導入したか、またはＲＮＡなしであった。画像は、ｓｍＦＩＳＨ及びＶ５シグナルに対してそれぞれ赤色及び緑色チャネルで解析した。１細胞当たりＮｐｉ及びｓｍＦＩＳＨの両方に対して陽性であるスポットの平均数がプロットされる。データは、平均値＋／－ＳＥＭとして示される。 Ａ～Ｃは、テザリングされたエフェクターが経時的により多くの細胞においてより多くの翻訳中ｍＲＮＡを維持することを示す。Ｈｅｐ３ｂ細胞に、テザリングされていない対照（ｎｔ－ｃｔｒｌ、ＬａｃＺ、配列番号９８）、テザリングされた対照（ｔ－ｃｔｒｌ、ＭＢＰ－ＬａｃＺ、配列番号３９）、またはｔ－エフェクター（ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮ、配列番号１１）と組み合わせて標的ＲＮＡ（３’ｖ１．１＿ＭＳ２＿Ａ１００、または３’ｖ１．１＿Ａ１００）をエレクトロポレーションで導入した。グラフは、トランスフェクション後４時間（Ａ）、８時間（Ｂ）、または１２時間（Ｃ）での翻訳中ｍＲＮＡのパーセンテージ（ｘ軸）に対する細胞のパーセンテージ（ｙ軸）を示す累積度数分布プロットである。全ての実験は、１．５倍モル過剰の標的を用いて行った。対照細胞には、ルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）をエレクトロポレーションで導入したか、またはＲＮＡなしであった。示される種々の時点（４時間、８時間、１２時間）での１細胞当たりの平均ＮＰＩ強度がプロットされる。 テザリングが分泌タンパク質の発現及び翻訳を増加させることを示す。２つの分泌抗体（Ａｂ１及びＡｂ２）の軽鎖及び重鎖対に対して最適化されたリーディングフレームを有するｖ１．１標的ＲＮＡ構築物（配列番号４）を、ｔ－ｃｔｒｌ（ＭＢＰ－ＬａｃＺ、配列番号３９）またはｔ－ｅｆｆ（ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮ、配列番号１１）とともにＨｅｋ２９３細胞内にコトランスフェクトした。実験は、５倍モル過剰の標的（Ａｂ１）または１倍モル過剰の標的（Ａｂ２）を用いて行った。抗体実験の各々において、テザリングされたエフェクターは、２つの別個の軽鎖及び重鎖をコードするＲＮＡにテザリングされる。グラフは、経時的なＡｂ１またはＡｂ２の濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。 単一のＲＮＡテザリングシステムの概略図を提供する。ｍＲＮＡ分子は、５’から３’に、ＣＡＰ、５’ＵＴＲ、標的ＯＲＦ、タンデムに並んだ３つのプロテアーゼ切断部位：Ｔ２Ａ－Ｐ２Ａ－Ｅ２Ａ／ＴＰＥ（赤色）、エフェクター（オレンジ色－ＲＢＰ、－緑色－エフェクター）に融合されたＲＮＡ結合タンパク質をコードする別のＯＲＦ、及び３’ＵＴＲにおけるＭＳ２ループ（オレンジ色の縞）を含む。ＭＳ２ループはｖ１．１ ＵＴＲ配列の後である。ＴＰＥプロテアーゼ切断部位は、細胞において翻訳中にリボソームスキッピングをもたらす。この翻訳の最終産物は、標的ＯＲＦにコードされたタンパク質がＣ末端タグを得、ＲＮＡ結合タンパク質－エフェクター融合体がＴＰＥからの残基プロリン（Ｃ末端アミノ酸）から開始することである。 Ａ～Ｃは、テザリングされた単一のＲＮＡシステムが、標的ＲＮＡからのタンパク質発現（曲線下面積）及び発現の全体的な持続期間を増加させることを示す。このシステムにおいては、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＴＰＥエレメントによって分離された標的（Ｌｕｃ）及びエフェクター／対照を含有するＲＮＡ構築物を注射する（それぞれ配列番号９４及び９６）。Ａは、ｔ－ｅｆｆ構築物（ＭＢＰ＿ｅＩＦ４Ｇ－ｍｉｄ２（６５３～１１３０）、エフェクター、配列番号２３）またはｔ－ｃｔｒｌ構築物（ＭＢＰ－ＬａｃＺ、対照、配列番号３９）を注射したマウスについての、示される種々の時点にわたる発光レベルを示す。Ｂは、Ａに対応する総曲線下面積（ＡＵＣ）としてプロットした累積発光を示す。Ｃは、ｔ－ｅｆｆ構築物（エフェクター）またはｔ－ｃｔｒｌ構築物（対照）を注射したマウスについての、示される時点にわたる発光を示す。データは、平均値＋／－ＳＥＭとして示される。 Ａ～Ｂは、ｅＩＦ４Ｇ１及びｅＩＦ４Ｇ３が完全長または切詰め型であるテザリングされたエフェクターによる、Ｈｅｐ３ｂ細胞における標的ｄｅｇ－ＧＦＰ ＲＮＡについての増加したタンパク質生産量を図示する。総計緑色強度対時間がプロットされる。３’ＵＴＲにｖ１．１＿ＭＳ２ループを有する標的ｍＲＮＡ（配列番号１）を、対照タンパク質（ＬａｃＺ）（配列番号９８）またはテザリングされた対照（ＭＢＰ－ＬａｃＺ）（配列番号３９）または図示されるような異なるテザリングされたエフェクタータンパク質（配列番号５１、５５、５９、または７９）をコードする別のｍＲＮＡと共送達した。実験は、標的を１０倍モル過剰にして行った。Ａは、３’ＵＴＲにおいてｖ１．１配列の下流にＭＳ２結合部位を有する標的ｍＲＮＡの結果を示す。この構築物において、ＭＳ２結合部位は、ポリＡ配列に隣接していた。Ｂは、Ａにあるデータについての積分による総曲線下面積を示す。 Ａ～Ｂは、ＲＮＡのポリＡテールに結合するか（ＰＡＢＰ）、またはそれを調節し得る（Ｇｌｄ２、ＴＥＮＴ４Ａ、ＴＥＮＴ４Ｂ）異なるタンパク質であるテザリングされたエフェクターによる、Ｈｅｐ３ｂ細胞における標的ｄｅｇ－ＧＦＰ ＲＮＡについての増加したタンパク質生産量を図示する。総計緑色強度対時間がプロットされる。３’ＵＴＲにｖ１．１＿ＭＳ２ループを有する標的ｍＲＮＡ（配列番号１）を、対照タンパク質（ＬａｃＺ）またはテザリングされた対照（ＭＢＰ－ＬａｃＺ）（配列番号３９）または図示されるような異なるテザリングされたエフェクタータンパク質（配列番号５１、５５、５９、または７９）をコードする別のｍＲＮＡと共送達した。実験は、標的を１０倍モル過剰にして行った。Ａは、３’ＵＴＲにおいてｖ１．１配列の下流にＭＳ２結合部位を有する標的ｍＲＮＡの結果を示す。この構築物において、ＭＳ２結合部位は、ポリＡ配列に隣接していた。Ｂは、Ａにあるデータについての積分による総曲線下面積を示す。
ｍＲＮＡの効力を増加させるための努力は、非翻訳領域（ＵＴＲ）及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に対して最適な配列設計を有する古典的な線状ｍＲＮＡを生成することに注がれてきた。本明細書では、とりわけ、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）－ＲＮＡ間相互作用が、外因性ｍＲＮＡからのタンパク質発現及び／またはｍＲＮＡの細胞内局在化を調節し得るという発見が開示される。一部の実施形態では、本開示は、例えば、ある特定の内因性因子からｍＲＮＡを独立させることによって（例えば、翻訳開始因子を動員することによって）、ｍＲＮＡの有効性、例えば、レベル及び／または活性を増加させることができる組成物及び方法を提供する。追加として、本明細書では、エフェクター分子、例えば、エフェクタータンパク質を、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡに動員して、例えば、ｍＲＮＡとエフェクター分子との間の望ましい相互作用を促進し得るという発見が開示される。一部の実施形態では、エフェクター分子は、ＲＮＡ結合タンパク質、例えば、テザー分子によって、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡに動員される。これらの構成要素を含む例示的なシステムの概略図が、図１及び図１９で提供される。
理論に拘束されることを望むものではないが、一部の実施形態では、（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡ、ならびに（２）ＲＢＰ、例えば、テザー分子、及び／またはエフェクター分子をコードするｍＲＮＡを含む、システムまたはＬＮＰ組成物は、ＲＢＰ－ＲＮＡ間相互作用を利用して、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの増加したタンパク質発現を可能にすると考えられる。
本明細書に開示されるシステムによるｍＲＮＡ発現に対する例示的な効果が、実施例２～１５で提供される。実施例２は、テザリングされたエフェクタータンパク質、例えば、テザリングされたｅＩＦ４ＧをコードするＲＮＡと共送達された場合の、標的ｍＲＮＡの増加した効力（例えば、増加したタンパク質発現及び／またはタンパク質発現の持続期間）について示す。実施例３及び４は、テザリングされたエフェクターと共送達された場合の標的ｍＲＮＡの増加した半減期、及び標的ｍＲＮＡの翻訳に対するテザリングされたエフェクターの効果について説明し、エフェクター機能に必要とされるｅＩＦ４Ｇのドメインの分析が、実施例５で提供される。実施例６は、テザリングされたエフェクターがタンパク質発現を救済し、ｍＲＮＡ安定性を増加させ得ることを示す。実施例７及び８は、テザリングされたエフェクターがテールなしＲＮＡの発現（及び推測されるｍＲＮＡ安定性）を増加させることを示す。最小からゼロのベースライン発現を有するテールなし標的ＲＮＡは、ＲＢＰ－ＲＮＡ（ＭＢＰ－ＭＳ２）テザーを使用して動員されたエフェクターによって救済され得る（翻訳が回復する）。実施例９～１１は、修飾されたテールなし及び／またはキャップなしＲＮＡがテザリングされたエフェクターによって救済され得ることを示す。実施例１２は、テザリングされたエフェクターが経時的により多くの翻訳中ｍＲＮＡを維持することを示す。実施例１３は、テザリングが分泌タンパク質の発現及び翻訳を増加させることを示す。実施例１４は、標的（すなわち、治療ペイロードまたは予防ペイロード）、及びテザリングされたエフェクターが同じＲＮＡ分子内にある、単一のＲＮＡテザリングシステムがインビボで標的発現を強化することを示す。実施例１４は、本明細書に開示されるシステムにおいて使用するための他の有用なエフェクタータンパク質またはそのドメインを特定する。
したがって、本明細書では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、結合エレメント、テザー分子及び／またはエフェクター分子を含む、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物またはシステム、ならびにその使用が開示される。本開示のＬＮＰ組成物またはシステムは、（ａ）（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびに（ｂ）（１）エフェクター分子、及び／または（２）結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。ある実施形態では、エフェクター分子は、テザー分子をさらに含む。ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子ポリペプチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＲＮＡによってコードされるタンパク質のパラメータ、例えば、そのレベル及び／または活性を調節する、第１のドメインを含む。ある実施形態では、パラメータは、（１）ｍＲＮＡレベル及び／もしくは活性及び／もしくは細胞内局在化（例えば、半減期及び／または発現）、（２）タンパク質レベル及び／もしくは活性（例えば、半減期及び／または発現）、（３）タンパク質翻訳速度、または（４）タンパク質局在化、例えば、位置、のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれらの全てを含む。ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子ポリペプチドは、結合エレメントに結合する、例えば、それを認識する第２のドメイン（テザー分子）を含む。ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子は、第１のドメイン及び第２のドメインを含むポリペプチドを含む。ある実施形態では、第１のドメイン及び第２のドメインは、作動的に連結されている。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、同じまたは異なるポリヌクレオチドに配置される。ある実施形態では、本明細書に開示されるシステムは、ＬＮＰとして製剤化される。ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、ＬＮＰとして製剤化される。一部の実施形態では、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、ＬＮＰとして製剤化される。ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰ及び第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、同じＬＮＰである。ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰ及び第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、異なるＬＮＰである。ある態様では、本開示のＬＮＰ組成物またはシステムは、治療ペイロードもしくは予防ペイロードのレベル及び／もしくは活性を増加させる、例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡのレベル及び／もしくは活性を増加させる、または治療ペイロードもしくは予防ペイロードタンパク質のレベル及び／もしくは活性を増加させることができる。ある態様では、該ＬＮＰ組成物または該システムは、対象における疾患もしくは障害を処置するか、または免疫応答を調節するための方法において使用することができる。
定義
投与すること：本明細書で使用されるとき、「投与すること」とは、組成物を対象または患者に送達する方法を指す。投与方法は、身体の特定の領域または系に送達を標的化する（例えば、特異的に送達する）ように選択され得る。例えば、投与は、非経口（例えば、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、動脈内、関節滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、もしくは頭蓋内注射、ならびに任意の好適な注入技法）、経口、経皮もしくは皮内、皮間、直腸、膣内、局所（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、及び／もしくは液滴による）、粘膜、鼻腔、頬側、経腸、硝子体、腫瘍内、舌下、鼻腔内；気管内注入、気管支注入、及び／もしくは吸入による；口腔スプレー及び／もしくは粉末、鼻腔スプレー、及び／もしくはエアロゾルとして、ならびに／または門脈カテーテルを介するものであってもよい。好ましい投与手段は、静脈内または皮下である。
抗体分子：一実施形態では、所望の細胞種への標的化のために抗体分子が使用され得る。本明細書で使用されるとき、「抗体分子」とは、天然型抗体、操作された抗体、またはその断片、例えば、天然型抗体もしくは操作された抗体の抗原結合部分を指す。抗体分子には、例えば、抗体またはその抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、直鎖状抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）等の単一ドメイン抗体、ナノボディ、またはラクダ科動物ＶＨＨドメイン）、フィブロネクチンポリペプチドミニボディ等の抗原結合フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）骨格、リガンド、サイトカイン、ケモカイン、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が含まれ得る。例示的な抗体分子には、ヒト化抗体分子、無傷のＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体；二重または多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）等）；Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離されたＣＤＲまたはその組等の抗体断片；一本鎖Ｆｖ；ポリペプチド－Ｆｃ融合体；単一ドメイン抗体（例えば、ＩｇＮＡＲ等のサメ単一ドメイン抗体またはその断片）；ラクダ科抗体；マスクされた抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））；Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（「ＳＭＩＰ（商標）」）；一本鎖またはタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））；ＶＨＨ；Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）；ナノボディ（登録商標）；ミニボディ；ＢｉＴＥ（登録商標）；アンキリンリピートタンパク質またはＤＡＲＰＩＮ（登録商標）；Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）；ＤＡＲＴ；ＴＣＲ様抗体；Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）；Ｔｒａｎｓ－ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）；ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）；ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ；Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）；ならびにＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）が含まれるが、これらに限定されない。
およそ、約：本明細書で使用されるとき、目的とする１つまたは複数の値に適用されるような「およそ」または「約」という用語は、述べられる参照値に類似した値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別途定めのない限り、または文脈から別途明らかでない限り、述べられる参照値のいずれかの方向（それよりも大きいまたは小さい）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内に収まる値の範囲を指す（かかる数が、可能な値の１００％を超える場合を除く）。例えば、ＬＮＰの脂質成分中の所与の化合物の量の文脈で使用されるとき、「約」とは、列挙される値の＋／－５％を意味し得る。例えば、約４０％の所与の化合物を有する脂質成分を含むＬＮＰは、３０～５０％の該化合物を含んでもよい。
コンジュゲートされる：本明細書で使用されるとき、「コンジュゲートされる」という用語は、２つ以上の部分に関して使用されるとき、当該部分が、直接的に、または連結剤としての役目を果たす１つもしくは複数の追加の部分を介してのいずれかで、互いに物理的に会合するかまたはつなげられて構造を形成し、その構造は当該構造が使用される条件下、例えば、生理的条件下で、当該部分が物理的に会合したままであるように、十分に安定な構造であることを意味する。一部の実施形態では、２つ以上の部分は、直接的な共有結合性の化学結合によってコンジュゲートされてもよい。他の実施形態では、２つ以上の部分は、イオン結合または水素結合によってコンジュゲートされてもよい。
接触させる：本明細書で使用されるとき、「接触させる」という用語は、２つ以上の実体間の物理的つながりを確立することを意味する。例えば、細胞をｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子組成物に接触させることは、細胞及びｍＲＮＡまたは脂質ナノ粒子に物理的つながりを共有させることを意味する。細胞を、インビボ、インビトロ、及びエクスビボの両方で外部実体に接触させる方法は、生物学分野で周知である。本開示の例示的な実施形態では、哺乳類細胞を組成物（例えば、本開示のナノ粒子、または薬学的組成物）に接触させるステップは、インビボで実施される。例えば、脂質ナノ粒子組成物と、生物（例えば、哺乳動物）内に配置され得る細胞（例えば、哺乳類細胞）とを接触させることは、任意の好適な投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下投与を含めた、生物への非経口投与）によって実施されてもよい。インビトロに存在する細胞については、組成物（例えば、脂質ナノ粒子）と細胞とは、例えば、組成物を細胞の培養基に添加することによって接触させられてもよく、トランスフェクションを伴い得るか、またはそれをもたらし得る。さらに、２つ以上の細胞が、ナノ粒子組成物により接触させられてもよい。
送達する：本明細書で使用されるとき、「送達する」という用語は、実体を目的箇所に提供することを意味する。例えば、治療薬及び／または予防薬を対象に送達することは、治療薬及び／または予防薬を含むＬＮＰを対象に（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、経肺、または皮下経路によって）投与することを伴い得る。哺乳動物または哺乳類細胞へのＬＮＰの投与は、１つまたは複数の細胞を脂質ナノ粒子に接触させることを伴い得る。
カプセル封入する：本明細書で使用されるとき、「カプセル封入する」という用語は、封入する、包囲する、または包むことを意味する。一部の実施形態では、化合物、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、または他の組成物は、完全にカプセル封入されるか、部分的にカプセル封入されるか、または実質的にカプセル封入されてもよい。例えば、一部の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、脂質ナノ粒子、例えば、リポソーム中にカプセル封入されてもよい。
カプセル封入効率：本明細書で使用されるとき、「カプセル封入効率」とは、ＬＮＰの調製に使用された治療薬及び／または予防薬の当初の総量に対する、ＬＮＰの一部となる治療薬及び／または予防薬の量を指す。例えば、組成物に当初提供された総計１００ｍｇの治療薬及び／または予防薬のうち、９７ｍｇの治療薬及び／または予防薬がＬＮＰ中にカプセル封入される場合、カプセル封入効率は、９７％として求められ得る。本明細書で使用されるとき、「カプセル封入」は、完全な、実質的な、または部分的な封入、閉じ込め、包囲、または包み込みを指してもよい。
有効量：本明細書で使用されるとき、薬剤の「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば、臨床結果を達成するのに十分な量であり、したがって、「有効量」は、それが適用されている文脈に依存する。例えば、本開示の脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）中の標的細胞送達増強脂質の量の文脈において、標的細胞送達増強脂質の有効量は、標的細胞送達増強脂質を欠いた脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）と比較して有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な量である。脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）によって達成される有益なまたは所望の結果の非限定的な例としては、トランスフェクトされた細胞のパーセンテージの増加、及び／または脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）に会合した／それによりカプセル封入された核酸によってコードされるタンパク質の発現レベルの増加が挙げられる。対象において有効量の脂質ナノ粒子が標的細胞によって取り込まれるように、標的細胞送達増強脂質を含有する脂質ナノ粒子を投与することの文脈において、標的細胞送達増強脂質を含有するＬＮＰの有効量は、標的細胞送達増強脂質を欠いたＬＮＰと比較して有益なまたは所望の結果を達成するのに十分な量である。対象における有益なまたは所望の結果の非限定的な例としては、標的細胞送達増強脂質を欠いたＬＮＰと比較した、トランスフェクトされた細胞のパーセンテージの増加、標的細胞送達増強脂質を含有するＬＮＰに会合した／それによりカプセル封入された核酸によってコードされたタンパク質の発現レベルの増加、及び／または標的細胞送達増強脂質を含有するＬＮＰに会合した／それによりカプセル封入された核酸、もしくはそのコードされたタンパク質のインビボでの予防効果もしくは治療効果の増加が挙げられる。一部の実施形態では、標的細胞送達増強脂質を含有するＬＮＰの治療上有効量は、感染症、疾患、障害、及び／または病態を患っているかまたはそれに感受性がある対象に投与されたときに、感染症、疾患、障害、及び／または病態を処置する、その症状を改善する、それを診断する、それを予防する、及び／またはその発症を遅延させるのに十分である。別の実施形態では、脂質ナノ粒子の有効量は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、またはそれよりも多くの標的細胞において所望のタンパク質の発現をもたらすのに十分である。例えば、標的細胞送達増強脂質を含有するＬＮＰの有効量は、単回静脈内注射後に少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、または３５％の標的細胞のトランスフェクションをもたらす量であり得る。
発現：本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」とは、以下の事象のうちの１つまたは複数を指す：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の産生（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、及び／または３’末端プロセシングによる）、（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳、ならびに（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
エクスビボ：本明細書で使用されるとき、「エクスビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物、もしくは微生物、またはその細胞もしく組織）の外側で生じる事象を指す。エクスビボ事象は、天然（例えば、インビボ）環境から最小限に変化した環境で起こってもよい。
断片：本明細書で使用される「断片」とは、一部分を指す。例えば、タンパク質の断片は、培養細胞から単離された完全長タンパク質を消化することによって得られる、または組換えＤＮＡ技法により得られるポリペプチドを含んでもよい。タンパク質の断片は、例えば、タンパク質の断片が当該タンパク質の機能的活性を保持するように１つまたは複数の機能的ドメインを含む、タンパク質の一部分であり得る。
ＧＣリッチ：本明細書で使用されるとき、「ＧＣリッチ」という用語は、グアニン（Ｇ）及び／もしくはシトシン（Ｃ）核酸塩基、またはそれらの誘導体もしくは類似体を含み、ＧＣ含量が約５０％超である、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、またはその任意の部分（例えば、ＲＮＡエレメント）の核酸塩基組成を指す。「ＧＣリッチ」という用語は、約５０％のＧＣ含量を含む、遺伝子、非コード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、ＲＮＡエレメント、配列モチーフ、またはその任意の個別的な配列、断片、もしくはセグメントを含むがこれらに限定されない、ポリヌクレオチドの全て、または一部分を指す。本開示の一部の実施形態では、ＧＣリッチポリヌクレオチド、またはその任意の部分は、グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）核酸塩基のみから構成される。
ＧＣ含量：本明細書で使用されるとき、「ＧＣ含量」という用語は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、またはその一部分（例えば、ＲＮＡエレメント）中の、（ＤＮＡ中及びＲＮＡ中のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）、ならびにそれらの誘導体または類似体を含む、可能な核酸塩基の総数から）グアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）核酸塩基、またはそれらの誘導体もしくは類似体のいずれかである核酸塩基のパーセンテージを指す。「ＧＣ含量」という用語は、遺伝子、非コード領域、５’もしくは３’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、ＲＮＡエレメント、配列モチーフ、またはその任意の個別的な配列、断片、もしくはセグメントを含むがこれらに限定されない、ポリヌクレオチドの全て、または一部分を指す。
異種：本明細書で使用されるとき、「異種」とは、配列（例えば、アミノ酸配列、またはアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド）が、所与のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに通常は存在しないことを示す。例えば、あるタンパク質のドメインまたはモチーフに対応するアミノ酸配列は、第２のタンパク質に対して異種であり得る。
単離された：本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、それが会合していた（自然界でまたは実験環境でのいずれを問わず）成分のうちの少なくとも一部から分離された物質または実体を指す。単離された物質は、それらが会合していた物質に関して、様々なレベルの純度を有し得る。単離された物質及び／または実体は、それらが当初会合していたその他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれよりも多くから分離され得る。一部の実施形態では、単離された薬剤は、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超、または約９９％超純粋である。本明細書で使用されるとき、物質は、それが他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。
コザック配列：「コザック配列」（「コザックコンセンサス配列」とも称される）という用語は、遺伝子またはオープンリーディングフレームの発現を強化するための翻訳開始エンハンサーエレメントを指し、これは真核生物において、５’ＵＴＲに位置する。コザックコンセンサス配列は元々、プレプロインスリン遺伝子の翻訳に対する開始コドン（ＡＵＧ）の周囲の単一の変異の影響の分析に次いで、配列ＧＣＣＲＣＣ（Ｒ＝プリン）として定義された（Ｋｏｚａｋ（１９８６）Ｃｅｌｌ ４４：２８３－２９２）。本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、コザックコンセンサス配列、またはその誘導体もしくは修飾体を含む。（翻訳エンハンサー組成物及びその使用方法の例は、Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第５，８０７，７０７号（参照によりその全体が本明細書に援用される）、Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙに対する米国特許第５，７２３，３３２号（参照によりその全体が本明細書に援用される）、Ｗｉｌｓｏｎに対する米国特許第５，８９１，６６５号（参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照されたい。）
読み漏らし（Ｌｅａｋｙ ｓｃａｎｎｉｎｇ）：ＰＩＣが開始コドンを迂回し、代わりに、代理または代替の開始コドンが認識されるまで下流にスキャンし続ける、「読み漏らし」として知られる現象が生じ得る。発生頻度に応じて、ＰＩＣによる開始コドンの迂回は、翻訳効率の減少をもたらし得る。さらに、この下流ＡＵＧコドンからの翻訳が生じ得、これは、所望の治療応答を誘発することができない可能性がある、望まれない異常な翻訳産物の産生をもたらすことになる。場合によっては、異常な翻訳産物は、実際、有害な応答を引き起こす可能性がある（Ｋｒａｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３（４）：５０１－５０７）。
リポソーム：本明細書で使用されるとき、「リポソーム」とは、水性の内部を封入する脂質含有膜を含む構造を意味する。リポソームは、１つまたは複数の脂質膜を有してもよい。リポソームには、単層（ｓｉｎｇｌｅ－ｌａｙｅｒｅｄ）リポソーム（当該技術分野で単層（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ）リポソームとしても知られている）及び多層（ｍｕｌｔｉ－ｌａｙｅｒｅｄ）リポソーム（当該技術分野で多重層（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ）リポソームとしても知られている）が含まれる。
修飾された：本明細書で使用されるとき、「修飾された」とは、本開示の分子の変化した状態または構造、例えば、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の組成または構造の変化を指す。分子、例えば、ポリヌクレオチドは、化学的、構造的、及び／または機能的を含む様々な方式で修飾され得る。例えば、分子、例えば、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のＲＮＡエレメントの組み込みによって構造的に修飾され得、このＲＮＡエレメントは、１つまたは複数の機能（例えば、翻訳制御活性）を提供する配列及び／またはＲＮＡ二次構造（複数可）を含む。したがって、本開示の分子、例えば、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾体から構成されてもよい（例えば、１つまたは複数の化学的、構造的、または機能的修飾（それらの任意の組み合わせを含む）を含んでもよい）。一実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ分子は、非天然ヌクレオシド及び／またはヌクレオチドの導入によって修飾される（例えば、それが天然リボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、及びＣに関するとき）。キャップ構造等の非古典的ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕリボヌクレオチドの化学構造とは異なるものの、「修飾された」とは見なされない。
ｍＲＮＡ：本明細書で使用されるとき、「ｍＲＮＡ」とは、メッセンジャーリボ核酸を指す。ｍＲＮＡは、天然型であっても非天然型であってもよい。例えば、ｍＲＮＡは、修飾された及び／または非天然型の構成要素、例えば、１つまたは複数の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーを含んでもよい。ｍＲＮＡは、キャップ構造、連鎖停止ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含んでもよい。ｍＲＮＡは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有してもよい。ｍＲＮＡの翻訳、例えば、哺乳類細胞の内部でのｍＲＮＡのインビボ翻訳は、ポリペプチドを産生し得る。慣例では、ｍＲＮＡ分子の基本的構成要素には、少なくともコード領域、５’非翻訳領域（５’－ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、５’キャップ、及びポリＡ配列が含まれる。ある実施形態では、ｍＲＮＡは、環状ｍＲＮＡである。
ナノ粒子：本明細書で使用されるとき、「ナノ粒子」とは、同じ材料のバルク試料と比較して新規の特性を示す、約１０００ｎｍ未満のスケールでの任意の１つの構造的特徴を有する粒子を指す。通例では、ナノ粒子は、約５００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、または約１００ｎｍのスケールでの任意の１つの構造的特徴を有する。同じく通例では、ナノ粒子は、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約５０ｎｍ～約２００ｎｍ、または約７０～約１２０ｍｎのスケールでの任意の１つの構造的特徴を有する。例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約１～１０００ｎｍ程度の１つまたは複数の寸法を有する粒子である。他の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約１０～５００ｎｍ程度の１つまたは複数の寸法を有する粒子である。他の例示的な実施形態では、ナノ粒子は、約５０～２００ｎｍ程度の１つまたは複数の寸法を有する粒子である。球状ナノ粒子は、例えば、約５０～１００または７０～１２０ナノメートルの直径を有するであろう。ナノ粒子は、その輸送及び特性の点で、単位として挙動することが最も多い。対応するバルク材料からナノ粒子を差別化する新規の特性は、典型的には、１０００ｎｍ未満のサイズスケールで、または約１００ｎｍのサイズで現れるが、ナノ粒子は、例えば、長円形、管状等である粒子の場合、より大きなサイズのものであり得ることに留意されたい。ほとんどの分子のサイズは上記の外形に収まろうが、個々の分子は通常、ナノ粒子とは称されない。
核酸：本明細書で使用されるとき、「核酸」という用語は、最も広義に使用され、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／または物質を包含する。これらのポリマーは、ポリヌクレオチドと称される場合が多い。本開示の例示的な核酸またはポリヌクレオチドには、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ＲＮＡｉ誘導剤、ＲＮＡｉ剤、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、触媒ＤＮＡ、三重らせん形成を誘導するＲＮＡ、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（β－Ｄ－リボ構成を有するＬＮＡ、α－Ｌ－リボ構成を有するα－ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－ＬＮＡ、及び２’－アミノ官能基化を有する２’－アミノ－α－ＬＮＡを含めたＬＮＡ）、またはそれらのハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。
核酸構造：本明細書で使用されるとき、「核酸構造」（「ポリヌクレオチド構造」と互換的に使用される）という用語は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、連結されたヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の原子、化学構成成分、元素、モチーフ、及び／または配列の配置構成もしくは編成を指す。この用語はまた、核酸の２次元または３次元状態も指す。したがって、「ＲＮＡ構造」という用語は、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、連結されたヌクレオチド、またはその誘導体もしくは類似体の原子、化学構成成分、元素、モチーフ、及び／または配列の配置構成もしくは編成を指し、ならびに／あるいはＲＮＡ分子の２次元及び／または３次元状態を指す。核酸構造は、編成複雑性の増加に基づいて、本明細書で「分子構造」、「一次構造」、「二次構造」、及び「三次構造」と称される４つの編成カテゴリーにさらに区分することができる。
核酸塩基：本明細書で使用されるとき、「核酸塩基」（代替として「ヌクレオチド塩基」または「窒素塩基」）という用語は、核酸またはその一部分もしくはセグメントに改善された特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学的安定性）を付与する、天然型プリン及びピリミジンの任意の誘導体または類似体を含めた、核酸に見出されるプリンまたはピリミジン複素環式化合物を指す。アデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシルは、天然核酸に優勢的に見出される核酸塩基である。当該技術分野で既知である及び／または本明細書に記載されるような、他の天然、非天然、及び／または合成核酸塩基が、核酸に組み込まれ得る。
ヌクレオシド／ヌクレオチド：本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド」という用語は、核酸塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）、またはその誘導体もしくは類似体（本明細書で同じく「核酸塩基」と称される）に共有結合性で連結された糖分子（例えば、ＲＮＡにおいてはリボース、またはＤＮＡにおいてはデオキシリボース）、またはその誘導体もしくは類似体を含有するが、ヌクレオシド間連結基（例えば、リン酸基）を欠いた化合物を指す。本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」という用語は、核酸またはその一部分もしくはセグメントに改善された化学特性及び／または機能的特性（例えば、結合親和性、ヌクレアーゼ耐性、化学的安定性）を付与する、ヌクレオシド間連結基（例えば、リン酸基）に共有結合されたヌクレオシド、またはその任意の誘導体、類似体、もしくは修飾体を指す。
オープンリーディングフレーム：本明細書で使用されるとき、「オープンリーディングフレーム」（「ＯＲＦ」と略称される）という用語は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子のセグメントまたは領域を指す。ＯＲＦは、開始コドンから始まり、終止コドンで終わる、重複しないインフレームコドンの連続した連なりを含み、リボソームによって翻訳される。
患者：本明細書で使用されるとき、「患者」とは、特定の疾患または病態に対して、処置を求め得るか、もしくはその必要があり得るか、処置を必要とするか、処置を受けているか、処置を受けることになる対象、またはそれに対して訓練された専門家にかかっている対象を指す。特定の実施形態では、患者は、ヒト患者である。一部の実施形態では、患者は、例えば、本明細書に記載されるような自己免疫疾患を患っている患者である。
薬学的に許容される：「薬学的に許容される」という語句は、本明細書において、賢明な医療判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比に見合って、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適な、化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指して用いられる。
薬学的に許容される賦形剤：本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という語句は、本明細書に記載の化合物以外（例えば、活性化合物を懸濁または溶解させることができるビヒクル）であり、患者において実質的に無毒で非炎症性である特性を有する任意の成分を指す。賦形剤には、例えば、粘着防止剤、酸化防止剤、結合剤、コーティング剤、圧縮助剤、崩壊剤、染料（色素）、軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルム形成剤またはコーティング剤、香味料、香料、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（流動促進剤（ｆｌｏｗ ｅｎｈａｎｃｅｒ））、滑沢剤、防腐剤、印刷インク、吸着剤、懸濁剤または分散剤、甘味剤、及び水和水が含まれ得る。例示的な賦形剤には、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微晶質セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが含まれるが、これらに限定されない。
薬学的に許容される塩：本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される塩」とは、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって（例えば、遊離塩基を好適な有機酸と反応させることによって）親化合物が修飾されている、開示される化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、アミン等の塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸等の酸性残基のアルカリ塩または有機塩等が挙げられるが、これらに限定されない。代表的な酸付加塩には、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩（ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ）、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシルスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が含まれる。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等、ならびにアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等を含むがこれらに限定されない無毒のアンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンカチオンが含まれる。本開示の薬学的に許容される塩には、例えば、無毒の無機酸または有機酸から形成された、親化合物の従来の無毒の塩が含まれる。本開示の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、塩基性または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、かかる塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、水中もしくは有機溶媒中、またはこれら２つの混合物中（一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性溶媒が好ましい）で化学量論量の適切な塩基または酸と反応させることによって調製することができる。好適な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８、及びＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）に見出され、同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
ポリペプチド：本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」または「目的とするポリペプチド」という用語は、天然に（例えば、単離または精製される）または合成的に生産され得る、典型的にはペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。
ＲＮＡ：本明細書で使用されるとき、「ＲＮＡ」とは、天然型または非天然型であり得るリボ核酸を指す。例えば、ＲＮＡは、修飾された及び／または非天然型の構成要素、例えば、１つまたは複数の核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはリンカーを含んでもよい。ＲＮＡは、キャップ構造、連鎖停止ヌクレオシド、ステムループ、ポリＡ配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含んでもよい。ＲＮＡは、目的とするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有してもよい。例えば、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であり得る。特定のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳、例えば、哺乳類細胞の内部でのｍＲＮＡのインビボ翻訳は、コードされたポリペプチドを産生し得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及びそれらの混合物からなる非限定的な群から選択され得る。
ＲＮＡエレメント：本明細書で使用されるとき、「ＲＮＡエレメント」という用語は、生物学的機能を提供する、及び／または生物学的活性（例えば翻訳制御活性）を有する、ＲＮＡ分子の一部分、断片、またはセグメントを指す。本明細書に記載のＲＮＡエレメント等の１つまたは複数のＲＮＡエレメントの組み込みによるポリヌクレオチドの修飾は、修飾されたポリヌクレオチドに１つまたは複数の望ましい機能的特性を提供する。本明細書に記載されるようなＲＮＡエレメントは、天然型、非天然型、合成、操作型、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、制御活性を提供する天然型ＲＮＡエレメントには、ウイルス、原核生物及び真核生物（例えば、ヒト）のトランスクリプトーム全体にわたって見出されるエレメントが含まれる。特定の真核生物ｍＲＮＡ及び翻訳されたウイルスＲＮＡにおけるＲＮＡエレメントは、細胞内の多くの機能の媒介に関与することが示されている。例示的な天然ＲＮＡエレメントには、翻訳開始エレメント（例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、Ｋｉｅｆｔ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＲＮＡ７（２）：１９４－２０６を参照されたい）、翻訳エンハンサーエレメント（例えば、ＡＰＰ ｍＲＮＡ翻訳エンハンサーエレメント、Ｒｏｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４（１０）：６４２１－６４３１を参照されたい）、ｍＲＮＡ安定性エレメント（例えば、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、Ｇａｒｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８（２）：１１３－１２６を参照されたい）、翻訳抑制エレメント（例えば、Ｂｌｕｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ １１０（１－２）：９７－１１２を参照されたい）、タンパク質結合ＲＮＡエレメント（例えば、鉄応答性エレメント、Ｓｅｌｅｚｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４２５（１８）：３３０１－３３１０を参照されたい）、細胞質ポリアデニル化エレメント（Ｖｉｌｌａｌｂａ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２１（４）：４５２－４５７）、及び触媒ＲＮＡエレメント（例えば、リボザイム、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １７８９（９－１０）：６３４－６４１を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
特異的送達：本明細書で使用されるとき、「特異的送達」、「特異的に送達する」、または「特異的に送達すること」という用語は、ナノ粒子による治療薬及び／または予防薬の、目的とする標的細胞（例えば、哺乳類標的細胞）への、オフターゲット細胞（例えば、非標的細胞）と比較してより多くの（例えば、少なくとも１０％多く、少なくとも２０％多く、少なくとも３０％多く、少なくとも４０％多く、少なくとも５０％多く、少なくとも１．５倍多く、少なくとも２倍多く、少なくとも３倍多く、少なくとも４倍多く、少なくとも５倍多く、少なくとも６倍多く、少なくとも７倍多く、少なくとも８倍多く、少なくとも９倍多く、少なくとも１０倍多くの）送達を意味する。特定の細胞へのナノ粒子の送達レベルは、標的細胞対非標的細胞において産生されたタンパク質の量の比較（例えば、フローサイトメトリーを使用した平均蛍光強度によって）、タンパク質を発現している標的細胞対非標的細胞の％の比較（例えば、定量的フローサイトメトリーによって）、標的細胞対非標的細胞において産生されたタンパク質の量と、該標的細胞対非標的細胞における総タンパク質の量との比較、または標的細胞対非標的細胞における治療薬及び／もしくは予防薬の量と、該標的細胞対非標的細胞における総計の治療薬及び／もしくは総予防薬の量との比較によって測定され得る。ナノ粒子が標的細胞に特異的に送達する能力は、処置されている対象において決定される必要はなく、動物モデル（例えば、マウスまたはＮＨＰモデル）等の代理において決定されてもよいことが理解されよう。
実質的に：本明細書で使用されるとき、「実質的に」という用語は、目的とする特徴または特性の総範囲もしくは程度またはほぼ総範囲もしくは程度を示す定性的条件を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的現象及び化学的現象が、完全に達する及び／もしくは完全性まで進行する、または絶対的な結果を達成もしくは回避することは、たとえあったとしても稀であることを理解しよう。「実質的に」という用語は、したがって、多くの生物学的現象及び化学的現象に本質的に存在する、完全性の欠如の可能性を捕捉するように本明細書で使用される。
患っている：疾患、障害、及び／または病態を「患っている」個体は、疾患、障害、及び／または病態であると診断されたか、またはその１つもしくは複数の症状を呈する。
標的化部分：本明細書で使用されるとき、「標的化部分」とは、ナノ粒子を特定の細胞、組織、及び／または臓器の種類に標的化し得る化合物または薬剤である。
エフェクター分子：本明細書で使用されるとき、「エフェクター分子」という用語は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＲＮＡによってコードされるタンパク質のパラメータ、例えば、そのレベル及び／または活性を調節し得る分子を指す。ある実施形態では、パラメータは、（１）ｍＲＮＡレベル及び／もしくは活性及び／もしくは細胞内局在化（例えば、半減期及び／または発現）、（２）タンパク質レベル及び／もしくは活性（例えば、半減期及び／または発現）、（３）タンパク質翻訳速度、または（４）タンパク質局在化、例えば、位置、のうちの１つ、２つ、またはそれらの全てを含む。ある実施形態では、エフェクター分子は、例えば、表４で提供されるような、翻訳因子、スプライシング因子、ＲＮＡ安定化因子、ＲＮＡ編集因子、ＲＮＡ結合因子、ＲＮＡ局在化因子、またはそれらの任意の組み合わせを含む。エフェクター分子は、前述の分類のエフェクター分子のうちのいずれかの野生型（例えば、天然型、例えば、ヒト）、完全長、断片（例えば、生物学的に活性な断片または機能的断片）、またはバリアントを含む。ある実施形態では、エフェクター分子は、テザー分子をさらに含む。ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子ポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるような、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＲＮＡによってコードされるタンパク質のパラメータ、例えば、そのレベル及び／または活性を調節する、第１のドメインを含む。ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子ポリペプチドは、結合エレメントに結合する、例えば、それを認識する第２のドメイン（テザー分子）を含む。ある実施形態では、エフェクター分子は、ＲＮＡ結合タンパク質またはその断片を含む。ある実施形態では、エフェクター分子は、翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇを含む。ある実施形態では、エフェクター分子は、ｅＩＦ４Ｇの野生型（例えば、天然型、例えば、ヒト）、完全長、断片（例えば、生物学的に活性な断片または機能的断片）、またはバリアントを含む。例示的なｅＩＦ４Ｇ構築物は、本明細書で、例えば、表２で提供される。
結合エレメント：本明細書で使用されるとき、「結合エレメント」という用語は、テザー分子によって認識される核酸配列、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。ある実施形態では、結合エレメントは、構造、例えば、３次元構造、例えば、キンクターン、ループ、ステム、または他の既知の構造を形成する。例示的な結合エレメントには、表１で提供されるものが含まれるが、これらに限定されない。
テザー分子：本明細書で使用されるとき、「テザー分子」という用語は、結合エレメントまたはその断片に結合する、例えば、それを認識する分子を指す。ある実施形態では、テザー分子は、結合エレメント、またはその断片を含む配列、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に結合する、例えば、それを認識する。ある実施形態では、テザー分子は、結合エレメント、またはその断片を含む配列、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む構造に結合する、例えば、それを認識する。ある実施形態では、エフェクター分子は、ＲＮＡ結合タンパク質またはその断片を含む。例示的なテザー分子が、表１で提供される。
治療剤：「治療剤」という用語は、対象に投与されたとき、治療、診断、及び／もしくは予防効果を有し、ならびに／または所望の生物学的及び／もしくは薬理学的効果を引き出す任意の薬剤を指す。一部の実施形態では、治療剤は、治療ペイロードを含むか、または治療ペイロードである。一部の実施形態では、治療剤は、低分子もしくは生物学的薬剤（例えば、抗体分子）を含むか、または低分子もしくは生物学的薬剤（例えば、抗体分子）である。
治療ペイロードまたは予防ペイロード：本明細書で使用されるとき、「治療ペイロードまたは予防ペイロード」という用語は、所望の生物学的効果及び／または薬理効果を引き出す薬剤を指す。ある実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、治療効果及び／または予防効果を有する。ある実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはそれらの断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。ある実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、タンパク質、例えば、治療用タンパク質をコードする配列を含む。治療ペイロードまたは予防ペイロードのいくつかの例としては、分泌タンパク質、膜結合型タンパク質、または細胞内タンパク質が挙げられ得るが、これらに限定されない。ある実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードには、サイトカイン、抗体、ワクチン（例えば、抗原、または免疫原性エピトープ）、受容体、酵素、ホルモン、転写因子、リガンド、膜輸送体、構造タンパク質、ヌクレアーゼ、またはそれらの構成要素、バリアント、もしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）が含まれる。タンパク質、ポリペプチド及びペプチドという用語は、本明細書で互換的に使用される。
トランスフェクション：本明細書で使用されるとき、「トランスフェクション」という用語は、種（例えば、ｍＲＮＡ等のポリヌクレオチド）を細胞に導入する方法を指す。
翻訳制御活性：本明細書で使用されるとき、「翻訳制御活性」（「翻訳制御機能」と互換的に使用される）という用語は、ＰＩＣ及び／またはリボソームの活性を含めた、翻訳装置の活性を調節する（例えば、制御する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）、影響を与える、制御する（ｃｏｎｔｒｏｌ）、変化させる）生物学的機能、機構、またはプロセスを指す。一部の態様では、所望の翻訳制御活性は、ｍＲＮＡ翻訳の翻訳忠実性を促進及び／または強化する。一部の態様では、所望の翻訳制御活性は、読み漏らしを低減及び／または阻害する。
対象：本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、本開示による組成物が、例えば、実験、診断、予防、及び／または治療目的で投与され得る、任意の生物を指す。典型的な対象には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒト等の哺乳動物）及び／または植物が含まれる。一部の実施形態では、対象は、患者であってもよい。
処置する：本明細書で使用されるとき、「処置する」という用語は、特定の感染症、疾患、障害、及び／または病態の１つまたは複数の症状または特徴を部分的にまたは完全に軽減する、回復させる、改善する、緩和する、その発症を遅延させる、その進行を阻害する、その重症度を低減する、及び／またはその発生率を低減することを指す。例えば、がんを「処置する」とは、腫瘍の生存、成長、及び／または広がりを阻害することを指してもよい。処置は、疾患、障害、及び／または病態に関連する病理の発症リスクを減少させる目的で、疾患、障害、及び／もしくは病態の徴候を呈していない対象、ならびに／または疾患、障害、及び／もしくは病態の早期徴候のみを呈する対象に施され得る。
予防する：本明細書で使用されるとき、「予防する」という用語は、特定の感染症、疾患、障害、及び／または病態の１つまたは複数の症状または特徴の発症を部分的にまたは完全に阻害することを指す。
未修飾：本明細書で使用されるとき、「未修飾」とは、任意の方式で変化させられる前の任意の物質、化合物、または分子を指す。未修飾は、生体分子の野生型または天然型を指してもよいが、常にそうではない。分子は、一連の修飾を経てもよく、そうすることで、各修飾分子が、後続の修飾のための「未修飾」出発分子として機能し得る。
ウリジン含量：「ウリジン含量」または「ウラシル含量」という用語は、互換的であり、ある特定の核酸配列に存在するウラシルまたはウリジンの量を指す。ウリジン含量またはウラシル含量は、絶対値（配列内のウリジンまたはウラシルの総数）または相対的（核酸配列内の核酸塩基の総数に対するウリジンまたはウラシルのパーセンテージ）として表され得る。
ウリジン修飾配列：「ウリジン修飾配列」という用語は、候補核酸配列のウリジン含量及び／またはウリジンパターンに対して異なる全体的もしくは局所的ウリジン含量（より高いまたはより低いウリジン含量）を有する、または異なるウリジンパターン（例えば、勾配分布またはクラスター化）を有する、配列最適化された核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）を指す。本開示の内容において、「ウリジン修飾配列」及び「ウラシル修飾配列」という用語は、同等と見なされ、互換的である。
「高ウリジンコドン」は、２つまたは３つのウリジンを含むコドンとして定義され、「低ウリジンコドン」は、１つのウリジンを含むコドンとして定義され、「ウリジンなしコドン」とは、いずれのウリジンも含まないコドンである。一部の実施形態では、ウリジン修飾配列は、高ウリジンコドンの低ウリジンコドンでの置換、高ウリジンコドンのウリジンなしコドンでの置換、低ウリジンコドンの高ウリジンコドンでの置換、低ウリジンコドンのウリジンなしコドンでの置換、ウリジンなしコドンの低ウリジンコドンでの置換、ウリジンなしコドンの高ウリジンコドンでの置換、及びそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、高ウリジンコドンは、別の高ウリジンコドンで置き換えられ得る。一部の実施形態では、低ウリジンコドンは、別の低ウリジンコドンで置き換えられ得る。一部の実施形態では、ウリジンなしコドンは、別のウリジンなしコドンで置き換えられ得る。ウリジン修飾配列は、ウリジン濃縮またはウリジン希薄化（ｒａｒｅｆｉｅｄ）され得る。
ウリジン濃縮：本明細書で使用されるとき、「ウリジン濃縮」という用語及び文法的変形は、配列最適化された核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）における、対応する候補核酸配列のウリジン含量に対するウリジン含量の増加（絶対値でまたはパーセンテージ値として表される）を指す。ウリジン濃縮は、候補核酸配列におけるコドンを、より少ないウリジン核酸塩基を含有する同義コドンで置換することによって実施され得る。ウリジン濃縮は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対して）または局所的（すなわち、候補核酸配列の部分配列または領域に対して）であり得る。
ウリジン希薄化：本明細書で使用されるとき、「ウリジン希薄化」という用語及び文法的変形は、配列最適化された核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ配列）における、対応する候補核酸配列のウリジン含量に対するウリジン含量の減少（絶対値でまたはパーセンテージ値として表される）を指す。ウリジン希薄化は、候補核酸配列におけるコドンを、より少ないウリジン核酸塩基を含有する同義コドンで置換することによって実施され得る。ウリジン希薄化は、全体的（すなわち、候補核酸配列の全長に対して）または局所的（すなわち、候補核酸配列の部分配列または領域に対して）であり得る。
バリアント：本明細書で使用されるとき、「バリアント」という用語は、例えば、当該技術分野で認識されるアッセイによって測定したとき、野生型分子の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の活性を有する分子を指す。
テザリングされたエフェクターとともにした治療ペイロードまたは予防ペイロードの送達
本明細書では、とりわけ、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、結合エレメント、テザー分子及び／またはエフェクター分子を含む、ＬＮＰ組成物またはシステム、ならびにその使用が開示される。ある実施形態では、本開示のＬＮＰ組成物は、（ａ）（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびに（ｂ）（１）エフェクター分子、及び／または（２）結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。ある実施形態では、エフェクター分子は、テザー分子をさらに含む。
ある態様では、本開示のＬＮＰ組成物またはシステムは、治療ペイロードもしくは予防ペイロードのレベル及び／または活性を増加させる、例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡのレベル及び／もしくは活性を増加させる、治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの安定性を増加させる、または治療ペイロードもしくは予防ペイロードタンパク質のレベル及び／もしくは活性を増加させることができる。ある態様では、本開示のＬＮＰ組成物は、細胞に、例えば、エクスビボまたはインビボで接触させられ、疾患もしくは障害を処置するため、対象における免疫応答を調節するため、または分泌ポリペプチド、細胞内ポリペプチド、もしくは膜貫通型ポリペプチドを対象に送達するために使用することができる。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドに配置される。ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、異なるポリヌクレオチドに配置される。
ある態様では、本明細書に開示されるシステムは、ＬＮＰとして製剤化される。ある実施形態では、本明細書に開示されるシステムは、（１）例えば、本明細書に記載されるような治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードするポリヌクレオチド、例えば、第１のポリヌクレオチド、ならびに／または（２）テザー分子及びエフェクター分子をコードするポリヌクレオチド、例えば、第２のポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び／または第２のポリヌクレオチドを含むシステムは、ＬＮＰとして製剤化される。
ある態様では、本明細書に開示されるシステムは、ＬＮＰとして製剤化される。ある実施形態では、本明細書に開示されるシステムは、（１）例えば、本明細書に記載されるような治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードするポリヌクレオチド、例えば、第１のポリヌクレオチド、及び／または（２）エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド、例えば、第２のポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、エフェクター分子は、テザー分子をさらに含む。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰ及び第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、同じであり、例えば、同じＬＮＰが、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含む。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰ及び第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、異なり、例えば、第１のＬＮＰは、第１のポリヌクレオチドを含み、第２のＬＮＰは、第２のポリヌクレオチドを含む。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、ある組成物中にある。ある実施形態では、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、別個の組成物中にある。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰ及び第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、同じ組成物中にある。
単一のＲＮＡシステムが使用される態様では（例えば、図１９のシステム）、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、同じＲＮＡ分子中にあり、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｐ２Ａ、もしくはＴ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＴＰＥ（Ｐ２Ａ－Ｔ２Ａ－Ｅ２Ａ）部位）または配列内リボソーム進入部位によって分離され得る。ＴＰＥ領域は、自己切断性ペプチドをコードする。単一のＲＮＡの切断は、２ＡペプチドのＣ末端におけるプロリン（Ｐ）とグリシン（Ｇ）との間のペプチド結合のリボソームスキッピングによって誘発され、その結果、２Ａペプチドの上流に位置するペプチド（すなわち、標的ペプチド）がそのＣ末端上に余分のアミノ酸を有することになり、一方で、２Ａペプチドの下流に位置するペプチド（すなわち、テザリングされたエフェクター）はそのＮ末端上に余分のプロリンを有することになる。２Ａペプチド媒介性切断の分子機構は、真のタンパク質分解切断ではなく、グリシル－プロリル間ペプチド結合形成のリボソーム「スキッピング」を伴うと考えられる。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，２０１７ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７：２１９３。
本開示において使用され得る２Ａ自己切断型ペプチドには、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：
Ｔ２Ａ（ＧＳＧ）ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号８９）、
Ｐ２Ａ（ＧＳＧ）ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号９０）、
Ｅ２Ａ（ＧＳＧ）ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号９１）、及び
Ｆ２Ａ（ＧＳＧ）ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号９２）、またはＴＰＥ等の上記の組み合わせ。
ある態様では、治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードするポリヌクレオチド、例えば、第１のポリヌクレオチド、ならびに／またはテザー分子及び／もしくはエフェクター分子をコードするポリヌクレオチド、例えば、第２のポリヌクレオチドを含む、ＬＮＰ組成物は、（ｉ）イオン化可能な脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。
別の態様では、本開示のＬＮＰ組成物は、対象における疾患もしくは障害を処置する方法、または免疫応答を阻害する方法において使用される。
ある態様では、（１）例えば、本明細書に記載されるような治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードするポリヌクレオチド、例えば、第１のポリヌクレオチド、ならびに／または（２）テザー分子及びエフェクター分子をコードするポリヌクレオチド、例えば、第２のポリヌクレオチドを含む、ＬＮＰ組成物またはシステムは、例えば、本明細書に記載されるような追加の薬剤とともに投与することができる。
治療ペイロードまたは予防ペイロード
本明細書では、とりわけ、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードするポリヌクレオチドを含む、システムまたはＬＮＰが開示される。一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、分泌タンパク質、膜結合型タンパク質、もしくは細胞間タンパク質、またはそれらのペプチド、ポリペプチド、もしくは生物学的に活性な断片をコードするｍＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、分泌タンパク質、またはそのペプチド、ポリペプチド、もしくは生物学的に活性な断片をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、分泌タンパク質は、サイトカイン、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、分泌タンパク質は、抗体またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、分泌タンパク質は、酵素またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、分泌タンパク質は、ホルモンまたはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、分泌タンパク質は、リガンド、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、分泌タンパク質は、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、またはその構成要素、バリアント、もしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、ワクチンは、予防ワクチンである。一部の実施形態では、ワクチンは、治療ワクチン、例えば、がんワクチンである。一部の実施形態では、分泌タンパク質は、成長因子またはそれらの構成要素、バリアント、もしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、分泌タンパク質は、免疫モジュレーター、例えば、免疫チェックポイントアゴニストまたはアンタゴニストを含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、膜結合型タンパク質、またはそのペプチド、ポリペプチド、もしくは生物学的に活性な断片をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、膜結合型タンパク質は、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、またはその構成要素、バリアント、もしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、ワクチンは、予防ワクチンである。一部の実施形態では、ワクチンは、治療ワクチン、例えば、がんワクチンである。一部の実施形態では、膜結合型タンパク質は、リガンド、そのバリアントまたは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、膜結合型タンパク質は、膜輸送体、そのバリアントまたは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、膜結合型タンパク質は、構造タンパク質、そのバリアントまたは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、膜結合型タンパク質は、免疫モジュレーター、例えば、免疫チェックポイントアゴニストまたはアンタゴニストを含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、細胞内タンパク質、またはそのペプチド、ポリペプチド、もしくは生物学的に活性な断片をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、細胞内タンパク質は、酵素、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、細胞内タンパク質は、ホルモン、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、細胞内タンパク質は、サイトカイン、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、細胞内タンパク質は、転写因子、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、細胞内タンパク質は、ヌクレアーゼ、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、細胞内タンパク質は、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、またはその構成要素、バリアント、もしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、ワクチンは、予防ワクチンである。一部の実施形態では、ワクチンは、治療ワクチン、例えば、がんワクチンである。一部の実施形態では、細胞内タンパク質は、構造タンパク質、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、サイトカイン、抗体、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、受容体、酵素、ホルモン、転写因子、リガンド、膜輸送体、構造タンパク質、ヌクレアーゼ、成長因子、免疫モジュレーター、またはそれらの構成要素、バリアント、もしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）から選定される。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、サイトカイン、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、抗体またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、またはその構成要素、バリアント、もしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、ワクチンは、予防ワクチンである。一部の実施形態では、ワクチンは、治療ワクチン、例えば、がんワクチンである。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、受容体、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、酵素、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、ホルモン、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、成長因子、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、ヌクレアーゼ、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、転写因子、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、リガンド、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、膜輸送体、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、構造タンパク質、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、免疫モジュレーター、またはそのバリアントもしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）を含む。一部の実施形態では、免疫モジュレーターは、免疫チェックポイントアゴニストまたはアンタゴニストを含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードは、タンパク質またはペプチドを含む。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列及び結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドにおける不活性化／不安定化配列または分解タグの存在に起因して本質的に不安定、自己分解性、及び／または休止状態である。第１のポリヌクレオチドは、結合エレメントに結合するテザリングされたエフェクターをコードする第２のポリヌクレオチドと共送達された場合に安定化及び／またはタンパク質発現を受ける。
一部の実施形態では、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列及び結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチドは、ポリＡテールを有せず、したがって本質的に不安定及び／または翻訳不可能である。第１のポリヌクレオチドは、結合エレメントに結合するテザリングされたエフェクターをコードする第２のポリヌクレオチドと共送達された場合に安定化を受ける。
結合エレメント
本明細書では、とりわけ、結合エレメントを含むポリヌクレオチド、例えば、第１のポリヌクレオチドを含む、システムまたはＬＮＰが開示される。結合エレメントは、例えば、本明細書に開示されるようなＲＮＡ結合タンパク質またはその断片、例えば、テザー分子によって結合される、例えば、認識される配列、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、テザー分子は、結合エレメント、またはその断片を含む配列に結合する。一部の実施形態では、テザー分子は、結合エレメント、またはその断片を含む構造に結合する。
一部の実施形態では、該システムまたは該ＬＮＰは、第１のポリヌクレオチドの結合エレメントに結合する、例えば、それを認識するＲＮＡ結合タンパク質またはその断片、例えば、テザー分子をコードする、第２のポリヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの結合エレメントは、治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列のオープンリーディングフレームの上流（５’）もしくは下流（３’）、またはその内部に位置する。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの結合エレメントは、第１のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲの上流（５’）または下流（３’）に位置する。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの結合エレメントは、第１のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲの上流（５’）または下流（３’）に位置する。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの結合エレメントは、第１のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲの下流に位置する。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの結合エレメントは、ポリＡテールに隣接して、例えば、その隣に位置する。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドの結合エレメントは、第２のポリヌクレオチドのテザー分子、例えば、テザー分子をさらに含むエフェクター分子によって結合される。
一部の実施形態では、テザー分子は、表１で提供されるテザー分子、例えば、ＭＢＰ、ＰＣＰ、ラムダＮ、Ｕ１ＡもしくはＰＵＦ、１５．５ｋｄ、もしくはＬＡＲＰ７、またはそれらのバリアントもしくは断片から選定される。一部の実施形態では、結合エレメントは、テザー分子によって結合される、例えば、認識される配列を含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、テザー分子によって結合される、例えば、認識される構造を含む配列を含む。
一部の実施形態では、結合エレメントは、表１で提供される結合エレメント、例えば、ＭＳ２、ＰＰ７、ＢｏｘＢ、Ｕ１Ａヘアピン、ＰＲＥ、キンクターン形成配列、７ｓｋ、またはそれらのバリアントもしくは断片から選定される。一部の実施形態では、結合エレメントは、ＭＳ２である。一部の実施形態では、結合エレメントは、ＰＰ７である。一部の実施形態では、結合エレメントは、ＢｏｘＢである。一部の実施形態では、結合エレメントは、Ｕ１Ａヘアピンである。一部の実施形態では、結合エレメントは、ＰＲＥである。一部の実施形態では、結合エレメントは、キンクターン形成配列である。一部の実施形態では、結合エレメントは、７ＳＫである。
一部の実施形態では、結合エレメントが、ＭＳ２（例えば、野生型ＭＳ２、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、テザー分子は、ＭＢＰ（例えば、野生型ＭＢＰ、そのバリアントまたは断片）である。
一部の実施形態では、結合エレメントが、ＰＰ７（例えば、野生型ＰＰ７、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、テザー分子は、ＰＣＰ（例えば、野生型ＰＣＰ、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、結合エレメントが、ＢｏｘＢ（例えば、野生型ＢｏｘＢ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、テザー分子は、ラムダＮ（例えば、野生型ラムダＮ、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、結合エレメントが、Ｕ１Ａヘアピン（例えば、野生型Ｕ１Ａヘアピン、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、テザー分子は、Ｕ１Ａ（例えば、野生型Ｕ１Ａ、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、結合エレメントが、ＰＲＥ（例えば、野生型ＰＲＥ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、テザー分子は、ＰＵＦ（例えば、野生型ＰＵＦ、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、結合エレメントが、キンクターン形成配列である場合、テザー分子は、１５．５ｋｄ（例えば、野生型１５．５ｋｄ、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、結合エレメントが、７ｓｋ配列である場合、テザー分子は、ＬＡＲＰ７（例えば、野生型ＬＡＲＰ７、またはそのバリアントもしくは断片）である。
Figure 2023526059000002
一部の実施形態では、結合エレメントは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のヌクレオチドを含む配列を含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、約５～１００、約５～９０、約５～８０、約５～７０、約５～６０、約５～５０、約５～４０、約５～３０、約５～２５、約５～２０、約５～１９、約５～１８、約５～１７、約５～１６、約５～１５、約５～１４、約５～１３、約５～１２、約５～１１、約５～１０、約５～９、約５～８、約５～７、または約５～６個のヌクレオチドを含む配列を含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、約５～１００、約６～１００、約７～１００、約８～１００、約９～１００、約１０～１００、約１１～１００、約１２～１００、約１３～１００、約１４～１００、約１５～１００、約１６～１００、約１７～１００、約１８～１００、約１９～１００、約２０～１００、約２１～１００、約２２～１００、約２３～１００、約２４～１００、約２５～１００、約３０～１００、約４０～１００、約５０～１００、約６０～１００、約７０～１００、約８０～１００、または約９０～１００個のヌクレオチドを含む配列を含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、約５～１００、約６～９０、約７～８０、約８～７０、約９～６０、約１０～５０、約１１～４０、約１２～３０、約１３～２５、約１４～２４、約１５～２３、約１６～２２、約１７～２１、または約１８～２０個のヌクレオチドを含む配列を含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、１９個のヌクレオチドを含む配列を含む。
一部の実施形態では、結合エレメントは、表２で提供される結合エレメントのヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１５４で提供される結合エレメントの配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、結合エレメントは、第２のポリヌクレオチドのテザー分子によって結合される配列の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、または３０個のリピートを含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、第２のポリヌクレオチドのテザー分子によって結合される配列の８０、７０、６０、５０、４０、または３０個以下のリピートを含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、第２のポリヌクレオチドのテザー分子によって結合される配列の約１～３０、約１～２０、約１～１０、約１～９、約１～８、約１～７、約１～６、約１～５、約１～４、約１～３、または約１～２個のリピートを含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、第２のポリヌクレオチドのテザー分子によって結合される配列の約１～３０、約２～３０、約３～３０、約４～３０、約５～３０、約６～３０、約７～３０、約８～３０、約９～３０、約１０～３０、約１１～３０、約１２～３０、約１３～３０、約１４～３０、約１５～３０、または約２０～３０個のリピートを含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、第２のポリヌクレオチドのテザー分子によって結合される配列の約１～３０、約２～２０、約３～１５、約４～１４、約５～１３、約６～１２、約７～１１、または約８～１０個のリピートを含む。一部の実施形態では、結合エレメントは、第２のポリヌクレオチドのテザー分子によって結合される配列の６個のリピートを含む。
本明細書に開示されるシステム、ＬＮＰ組成物、方法、または使用のうちのいずれかの一部の実施形態では、各リピートは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のヌクレオチドを含むスペーサー配列によって分離される。一部の実施形態では、スペーサー配列は、約１～１００、約１～９０、約１～８０、約１～７０、約１～６０、約１～５０、約１～４０、約１～３０、約１～２５、約１～２０、約１～１９、約１～１８、約１～１７、約１～１６、約１～１５、約１～１４、約１～１３、約１～１２、約１～１１、約１～１０、約１～９、約１～８、約１～７、約１～６、約１～５、約１～４、約１～３、または約１～２個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、約１～１００、約２～１００、約３～１００、約４～１００、約５～１００、約６～１００、約７～１００、約８～１００、約９～１００、約１０～１００、約１１～１００、約１２～１００、約１３～１００、約１４～１００、約１５～１００、約１６～１００、約１７～１００、約１８～１００、約１９～１００、約２０～１００、約２１～１００、約２２～１００、約２３～１００、約２４～１００、約２５～１００、約３０～１００、約４０～１００、約５０～１００、約６０～１００、約７０～１００、約８０～１００、または約９０～１００個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、約１～１００、約２～９０、約３～８０、約４～７０、約５～６０、約６～５０、約７～４０、約８～４０、約９～３０、約１０～２５、約１１～２４、約１２～２３、約１３～２２、約１４～２１、約１５～２０、約１６～１９、約１７～１８個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、２０個のヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、スペーサー配列は、表２で提供されるスペーサー配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
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テザー分子
本明細書では、とりわけ、ＲＮＡ結合タンパク質、例えば、テザー分子をコードするポリヌクレオチド、例えば、第２のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを含む、システムまたはＬＮＰが開示される。一部の実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、テザー分子をさらに含むエフェクター分子をコードする。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるシステムまたはＬＮＰは、結合エレメントを含む第１のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、テザー分子、例えば、エフェクター分子をさらに含むテザー分子は、第１のポリヌクレオチドにおける結合エレメントに結合する。一部の実施形態では、テザー分子、例えば、エフェクター分子をさらに含むテザー分子は、結合エレメントの配列、または結合エレメントの配列を含む構造に結合する。一部の実施形態では、テザー分子は、ＲＮＡ結合タンパク質、またはそれらのバリアントもしくは断片を含む。例示的なＲＮＡ結合タンパク質が、表１及び４で提供される。
一部の実施形態では、テザー分子は、表１で提供されるテザー分子、例えば、ＭＢＰ、ＰＣＰ、ラムダＮ、Ｕ１ＡもしくはＰＵＦ、１５．５ｋｄ、ＬＡＲＰ７、またはそれらのバリアントもしくは断片を含む。一部の実施形態では、テザー分子は、ＭＢＰである。一部の実施形態では、テザー分子は、ＰＣＰである。一部の実施形態では、テザー分子は、ラムダＮである。一部の実施形態では、テザー分子は、Ｕ１Ａである。一部の実施形態では、テザー分子は、ＰＵＦである。一部の実施形態では、テザー分子は、１５．５ｋｄである。一部の実施形態では、テザー分子は、ＬＡＲＰ７である。
一部の実施形態では、テザー分子が、ＭＢＰ（例えば、野生型ＭＢＰ、そのバリアントまたは断片）である場合、結合エレメントは、ＭＳ２（例えば、野生型ＭＳ２、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、テザー分子が、ＰＣＰ（例えば、野生型ＰＣＰ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、結合エレメントは、ＰＰ７（例えば、野生型ＰＰ７、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、テザー分子が、ラムダＮ（例えば、野生型ラムダＮ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、結合エレメントは、ＢｏｘＢ（例えば、野生型ＢｏｘＢ、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、テザー分子が、Ｕ１Ａ（例えば、野生型Ｕ１Ａ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、結合エレメントは、Ｕ１Ａヘアピン（例えば、野生型Ｕ１Ａヘアピン、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、テザー分子が、１５．５ｋｄ（例えば、野生型１５．５ｋｄ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、結合エレメントは、キンクターン形成配列（例えば、野生型Ｕ１Ａヘアピン、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、テザー分子が、ＰＵＦ（例えば、野生型ＰＵＦ、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、結合エレメントは、ＰＲＥ（例えば、野生型ＰＲＥ、またはそのバリアントもしくは断片）である。
一部の実施形態では、テザー分子が、ＬＡＲＰ７（例えば、野生型ＬＡＲＰ７、またはそのバリアントもしくは断片）である場合、結合エレメントは、７ＳＫ（例えば、野生型７ＳＫ、またはそのバリアントもしくは断片）である。
テザー分子として使用され得る追加の例示的なＲＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡ結合ドメインは、Ｃｏｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ７８：１ ｐｐ．９－２９に開示され、同文献の内容全体は、参照により本明細書に援用される。例えば、表３は、テザー分子として使用され得る追加の例示的なＲＮＡ結合タンパク質またはドメインを提供する。ある実施形態では、本明細書に開示されるテザー分子は、表３に列挙されるドメイン（またはそのバリアントもしくは断片）またはタンパク質（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。
Figure 2023526059000054
一部の実施形態では、テザー分子は、ＭＢＰを含む。一部の実施形態では、テザー分子は、表２で提供されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、テザー分子は、配列番号６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、テザー分子は、表２で提供されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列によってコードされる。一部の実施形態では、テザー分子は、配列番号７のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列によってコードされる。
エフェクター分子
本明細書では、とりわけ、エフェクター分子をコードするポリヌクレオチド、例えば、第２のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを含む、システムまたはＬＮＰが開示される。一部の実施形態では、エフェクター分子は、表４で提供される因子、例えば、翻訳因子、スプライシング因子、ＲＮＡ安定化因子、ＲＮＡ編集因子、ＲＮＡ結合因子（例えば、ｍＲＮＡのポリＡテールに結合するＰＡＢＰ）、ＲＮＡ局在化因子、もしくはＲＮＡ調節因子（Ｇｌｄ２、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂ等（これらはｍＲＮＡのポリＡテールにより多くのＡ及びまたはＡ／Ｇヌクレオチドを付加することが知られている））またはそれらの組み合わせから選定される。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、翻訳因子、例えば、表４で提供される翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ、ポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、ｅＩＦ３ｄもしくはその構成要素、Ｄａｚｌ、またはそれらの断片もしくはバリアント、または組み合わせである。追加の例示的な翻訳因子が、Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎｅｎｅｂｅｒｇ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１９．８８：３０７－３５で提供され、同文献の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、スプライシング因子、例えば、表４で提供されるスプライシング因子、例えば、Ｒｎｐｓ１、Ｍａｇｏｈ、Ｙ１４、またはそれらの断片もしくはバリアント、または組み合わせである。追加のスプライシング因子が、Ｎｏｔｔ ｅｔ ａｌ，（２００４）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ，２００４．１８，２１０－２２２で提供され、同文献の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、ＲＮＡ安定化因子、例えば、表４で提供される安定化因子、例えば、ＨｕＲまたはその断片もしくはバリアントである。例示的なＲＮＡ安定化因子が、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２ Ａｐｒ １９；２７７（１６）：１３６３５－４０で提供され、同文献の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、ＲＮＡ編集因子である。例示的なＲＮＡ編集因子が、Ｋｉｍ Ｄ．ｅｔ ａｌ（２０１９），Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，８８，１９１－２００で提供され、同文献の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、ＲＮＡ結合因子である。例示的なＲＮＡ結合因子が、Ｓｉｎｇｈ Ｇ．ｅｔ ａｌ（２０１５）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ；８４：３２５－３５４で提供され、同文献の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、ＲＮＡ局在化因子である。例示的なＲＮＡ局在化因子が、Ｂｌｏｗｅｒ Ｍ．Ｄ．（２０１３）Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．；３０２：１－３９で提供され、同文献の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、ＲＮＡ調節因子である。例示的なＲＮＡ因子が、Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．２０１８ Ｄｅｃ １９；３７３（１７６２）で提供され、同文献の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
Figure 2023526059000055
一部の実施形態では、エフェクター分子は、結合エレメントに直接結合する。エフェクター分子は、それが結合し得る特定の標的配列を有してもよい。エフェクター分子には、ｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４ｄ、ＰＡＢＰＣ、ＴＥＮＴ４Ａ、ＴＥＮＴ４Ｂ、及びＧｌｄ２が含まれるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、結合エレメントに結合する、例えば、それを認識するポリペプチド（テザー分子）をさらに含む。
ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子ポリペプチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＲＮＡによってコードされるタンパク質のパラメータ、例えば、そのレベル及び／または活性を調節する、第１のドメインを含む。ある実施形態では、パラメータは、（１）ｍＲＮＡレベル及び／もしくは活性及び／もしくは細胞内局在化（例えば、半減期及び／または発現）、（２）タンパク質レベル及び／もしくは活性（例えば、半減期及び／または発現）、（３）タンパク質翻訳速度、または（４）タンパク質局在化、例えば、位置、のうちの１つ、２つ、３つ、またはそれらの全てを含む。ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子ポリペプチドは、結合エレメントに結合する、例えば、それを認識する第２のドメイン（テザー分子）を含む。
ある実施形態では、テザー分子を含むエフェクター分子は、第１のドメイン及び第２のドメインを含むポリペプチドを含む。ある実施形態では、第１のドメイン及び第２のドメインは、作動的に連結されている。
ある実施形態では、テザー分子をさらに含むエフェクター分子をコードする第２のポリヌクレオチドにおいて、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列は、テザー分子をコードするヌクレオチド配列の上流にある。ある実施形態では、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列は、テザー分子をコードするヌクレオチド配列の下流にある。ある実施形態では、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列は、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＴＰＥ（Ｐ２Ａ－Ｔ２Ａ－Ｅ２Ａ）部位）または配列内リボソーム進入部位によって、テザー分子をコードするヌクレオチド配列から分離される。
ある実施形態では、テザー分子をさらに含むエフェクター分子をコードする第２のポリヌクレオチドにおいて、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列は、テザー分子をコードするヌクレオチド配列に隣接する。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、リボソーム結合、例えば、動員、転写開始前複合体の形成、またはＲＮＡ巻き戻しを調節する、例えば、それを容易にする、翻訳因子である。一部の実施形態では、エフェクター分子は、ｅＩＦ４Ｇ、例えば、野生型ｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４Ｇのバリアント、またはその断片を含む。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、野生型ｅＩＦ４Ｇを含む。一部の実施形態では、野生型ｅＩＦ４Ｇは、約１６００個のアミノ酸の配列を含む。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、例えば、本明細書に開示されるようなｅＩＦ４Ｇの断片を含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、リボソーム結合、例えば、動員を保持する。
一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約１，５００～２００アミノ酸、約１，４００～３００アミノ酸、約１，３００～３５０アミノ酸、約１，２００～４００アミノ酸、約１，１００～４５０アミノ酸、約１，０００～５００アミノ酸、約９００～５５０アミノ酸、約８００～６００アミノ酸、約１，５００～３００アミノ酸、１，５００～４００アミノ酸、１，５００～５００アミノ酸、約１，５００～６００アミノ酸、アミノ酸、約１，５００～７００アミノ酸、約１，５００～８００アミノ酸、約１，５００～９００アミノ酸、約１，５００～１０００アミノ酸、約１，５００～１，１００アミノ酸、約１，５００～１，２００アミノ酸、約１，５００～１，３００アミノ酸、約１，５００～１，４００アミノ酸、約１，４００～２００アミノ酸、約１，３００～２００アミノ酸、約１，２００～２００アミノ酸、約１，１００～２００アミノ酸、約１，０００～２００アミノ酸、約９００～２００アミノ酸、約８００～２００アミノ酸、約７００～２００アミノ酸、約６００～２００アミノ酸、または約５００～２００アミノ酸長である。
一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約５００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約６００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約７００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約８００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約９００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約１０００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約１１００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約１２００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約１３００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約１４００アミノ酸長である。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇ断片は、約１５００アミノ酸長である。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、例えば、本明細書に開示されるようなｅＩＦ４Ｇのバリアントを含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、リボソーム結合、例えば、動員を保持する。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列において、以下の位置、すなわちアミノ酸７６８、アミノ酸７７１、またはアミノ酸７７６のうちのいずれか１つ、２つ、それらの全て、または組み合わせに変異（例えば、置換）を含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７６８位に変異、例えば、置換、例えば、７６８位にロイシンからアラニンへの置換を含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７１位に変異、例えば、置換、例えば、７７１位にロイシンからアラニンへの置換を含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７６位に変異、例えば、置換（例えば、７７６位にフェニルアラニンからアラニンへの）を含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７６８位に変異、例えば、置換、例えば、７６８位にアラニンを含み、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７１位に変異、例えば、置換、例えば、７７１位にアラニンを含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７６８位に変異、例えば、置換、例えば、７６８位にアラニンを含み、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７６位に変異、例えば、置換、例えば、７７６位にアラニンを含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７１位に変異、例えば、置換、例えば、７７１位にアラニンを含み、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７６位に変異、例えば、置換、例えば、７７６位にアラニンを含む。一部の実施形態では、ｅＩＦ４Ｇバリアントは、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７１位に変異、例えば、置換、例えば、７７１位にアラニンを含み、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７１位に変異、例えば、置換、例えば、７７１位にアラニンを含み、ｅＩＦ４Ｇポリペプチド配列の７７６位に変異、例えば、置換、例えば、７７６位にアラニンを含む。
一部の実施形態では、エフェクター分子は、例えば、リボソームを動員することができる、ｅＩＦ３複合体の一部である。一部の実施形態では、ｅＩＦ３複合体は、ｅＩＦ３ｄ、ｅＩＦ３ｃ、ｅＩＦ３ｅ、もしくはｅＩＦ３ｉ、またはそれらの断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
一部の実施形態では、エフェクター分子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ、ＰＡＢＰ、ＴＥＮＴ４Ａ、ＴＥＮＴ４Ｂ、またはＧｌｄ２は、表２で提供されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、エフェクター分子、例えば、ｅＩＦ４Ｇは、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４、もしくは配列番号１５５、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、エフェクター分子、例えば、ＰＡＢＰは、配列番号４８、もしくは配列番号５０、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、エフェクター分子、例えば、ＴＥＮＴ４Ａは、配列番号５２、もしくは配列番号５４、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、エフェクター分子、例えば、ＴＥＮＴ４Ｂは、配列番号５６、もしくは配列番号５８、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、エフェクター分子、例えば、Ｇｌｄ２は、配列番号７６、もしくは配列番号７８、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、エフェクター分子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ、ＰＡＢＰ、ＴＥＮＴ４Ａ、ＴＥＮＴ４Ｂ、またはＧｌｄ２は、表２で提供されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列によってコードされる。
一部の実施形態では、エフェクター分子、例えば、ｅＩＦ４Ｇは、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、もしくは配列番号１５６のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列によってコードされる。
一部の実施形態では、エフェクター分子、例えば、ＰＡＢＰは、配列番号４９、もしくは配列番号５１のヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列によってコードされる。
一部の実施形態では、エフェクター分子、例えば、ＴＥＮＴ４Ａは、配列番号５３、もしくは配列番号５５、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、エフェクター分子、例えば、ＴＥＮＴ４Ｂは、配列番号５７、もしくは配列番号５９、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、エフェクター分子、例えば、Ｇｌｄ２は、配列番号７７、もしくは配列番号７９、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。
ＬＮＰの脂質含量
上述したように、脂質に関して、本明細書に開示されるＬＮＰは、（ｉ）イオン化可能な脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び任意選択で（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む。これらのカテゴリーの脂質は、下記により詳細に述べられる。一部の実施形態では、本発明の核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物として製剤化される。
脂質ナノ粒子は典型的には、目的とする核酸カーゴとともにアミノ脂質、リン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ脂質成分を含む。本発明の脂質ナノ粒子は、当該技術分野で一般に既知であるような構成要素、組成物、及び方法を使用して生成され得る。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６８３００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３７５５１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２７４００、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４７４０６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６０００１２９、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１４２８０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３８４２６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２７０７７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５５３９４、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／５２１１７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６９６１０、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４９２、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５９５７５、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６９４９３、及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／６６２４２を参照されたく、同文献の全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、他の脂質成分に対して２０～６０％のアミノ脂質のモル比を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、２０～５０％、２０～４０％、２０～３０％、３０～６０％、３０～５０％、３０～４０％、４０～６０％、４０～５０％、または５０～６０％のアミノ脂質のモル比を含んでもよい。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０％、３０％、４０％、５０、または６０％のアミノ脂質のモル比を含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、他の脂質成分に対して５～２５％のリン脂質のモル比を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、５～３０％、５～１５％、５～１０％、１０～２５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２５％、１５～２０％、２０～２５％、または２５～３０％のリン脂質のモル比を含んでもよい。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％の非カチオン性脂質のモル比を含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、他の脂質成分に対して２５～５５％の構造脂質のモル比を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、１０～５５％、２５～５０％、２５～４５％、２５～４０％、２５～３５％、２５～３０％、３０～５５％、３０～５０％、３０～４５％、３０～４０％、３０～３５％、３５～５５％、３５～５０％、３５～４５％、３５～４０％、４０～５５％、４０～５０％、４０～４５％、４５～５５％、４５～５０％、または５０～５５％の構造脂質のモル比を含んでもよい。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または５５％の構造脂質のモル比を含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、他の脂質成分に対して０．５～１５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む。例えば、脂質ナノ粒子は、０．５～１０％、０．５～５％、１～１５％、１～１０％、１～５％、２～１５％、２～１０％、２～５％、５～１５％、５～１０％、または１０～１５％のＰＥＧ脂質のモル比を含んでもよい。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０％のアミノ脂質、５～２５％のリン脂質、２５～５５％の構造脂質、及び０．５～１５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０～６０％のアミノ脂質、５～３０％のリン脂質、１０～５５％の構造脂質、及び０．５～１５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む。
アミノ脂質
一部の態様では、本開示のアミノ脂質は、式（Ｉ）の化合物のうちの１つまたは複数、
Figure 2023526059000056
 またはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体であり得、式中、
Ｒ１が、Ｃ５－３０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、Ｃ２－１４アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３が、それらが結合している原子と一緒に、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４が、水素、Ｃ３－６炭素環、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、－ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１－６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑが、炭素環、複素環、－ＯＲ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＸ２Ｈ、－ＣＸＨ２、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ８、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び－Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎが独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６が独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、式中、Ｍ”が、結合、Ｃ１－１３アルキル、またはＣ２－１３アルケニルであり、
Ｒ７が、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８が、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９が、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１－６アルキル、－ＯＲ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ３－６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル、Ｃ２－３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１８アルキル、Ｃ２－１８アルケニル、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１５アルキル及びＣ３－１５アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｘが独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるが、Ｒ４が、－（ＣＨ２）ｎＱ、－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、－ＣＨＱＲ、または－ＣＱ（Ｒ）２である場合、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４、もしくは５であるときには－Ｎ（Ｒ）２ではないか、または（ｉｉ）Ｑは、ｎが１もしくは２であるときには５、６、もしくは７員のヘテロシクロアルキルではない。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＡ）のもの、
Figure 2023526059000057
 またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、式中、ｌが、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍが、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１が、結合またはＭ’であり、Ｒ４が、水素、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、Ｑが、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。

例えば、ｍは、５、７、または９である。例えば、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。例えば、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＢ）のもの、
Figure 2023526059000058
 またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、式中、全ての可変要素は、本明細書で定義される通りである。例えば、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｒ４は、水素、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
例えば、ｍは、５、７、または９である。例えば、Ｑは、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。例えば、Ｑは、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、または－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒである。
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットは、式（ＩＩ）のもの、
Figure 2023526059000059
 またはそのＮ－オキシド、またはその塩もしくは異性体を含み、式中、ｌが、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｍ１が、結合またはＭ’であり、Ｒ４が、水素、非置換Ｃ１－３アルキル、または－（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎが、２、３、または４であり、Ｑが、ＯＨ、－ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｒ８、－ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。
一実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩａ）のもの、
Figure 2023526059000060
 またはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載される通りである。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｂ）のもの、
Figure 2023526059000061
 またはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載される通りである。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｃ）もしくは（ＩＩｅ）のもの、
Figure 2023526059000062
 またはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体であり、式中、Ｒ４は、本明細書に記載される通りである。
別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｆ）のもの、
Figure 2023526059000063
 またはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体であり、
式中、Ｍが、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－であり、Ｍ”が、Ｃ１－６アルキルまたはＣ２－６アルケニルであり、Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され、ｎが、２、３、及び４から選択される。
さらなる実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｄ）のもの、
Figure 2023526059000064
 またはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体であり、式中、ｎは、２、３、または４であり、ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２からＲ６は、本明細書に記載される通りである。例えば、Ｒ２及びＲ３の各々は独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択され得る。
さらなる実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｇ）のもの、
Figure 2023526059000065
 またはそれらのＮ－オキシド、またはそれらの塩もしくは異性体であり、式中、ｌが、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍが、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１が、結合またはＭ’であり、Ｍ及びＭ’が独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）－Ｍ”－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ－Ｓ－、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、Ｒ２及びＲ３が独立して、Ｈ、Ｃ１－１４アルキル、及びＣ２－１４アルケニルからなる群から選択される。例えば、Ｍ”は、Ｃ１－６アルキル（例えば、Ｃ１－４アルキル）またはＣ２－６アルケニル（例えば、Ｃ２－４アルケニル）である。例えば、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ５－１４アルキル及びＣ５－１４アルケニルからなる群から選択される。
一部の実施形態では、アミノ脂質は、米国出願第６２／２２０，０９１号、同第６２／２５２，３１６号、同第６２／２５３，４３３号、同第６２／２６６，４６０号、同第６２／３３３，５５７号、同第６２／３８２，７４０号、同第６２／３９３，９４０号、同第６２／４７１，９３７号、同第６２／４７１，９４９号、同第６２／４７５，１４０号、及び同第６２／４７５，１６６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２３５２号に記載される化合物のうちの１つまたは複数である。
一部の実施形態では、アミノ脂質は、
Figure 2023526059000066
 またはその塩である。
一部の実施形態では、アミノ脂質は、
Figure 2023526059000067
 またはその塩である。
式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）、または（ＩＩｇ）に従った脂質の中心アミン部分は、生理的ｐＨでプロトン化され得る。故に、脂質は、生理的ｐＨで正電荷または部分的に正の電荷を有してもよい。かかるアミノ脂質は、カチオン性脂質、イオン化可能な脂質、カチオン性アミノ脂質、またはイオン化可能なアミノ脂質と称され得る。アミノ脂質はまた、双性イオン性、すなわち、正電荷及び負電荷の両方を有する中性分子であってもよい。
一部の態様では、本開示のアミノ脂質は、式（ＩＩＩ）の化合物のうちの１つまたは複数、
Figure 2023526059000068
 またはそれらの塩もしくは異性体であり得、式中、
Ｗが、
Figure 2023526059000069
 であり、
環Ａが、
Figure 2023526059000070
 であり、
ｔが、１または２であり、
Ａ１及びＡ２が、各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、
Ｚが、ＣＨ２または不在であるが、ＺがＣＨ２である場合、破線（１）及び（２）は各々、単結合を表し、Ｚが不在である場合、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５が独立して、Ｃ５－２０アルキル、Ｃ５－２０アルケニル、－Ｒ”ＭＲ’、－Ｒ＊ＹＲ”、－ＹＲ”、及び－Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
ＲＸ１及びＲＸ２が、各々独立して、ＨまたはＣ１－３アルキルであり、
各Ｍが独立して、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）－、－Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｓ）－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｍ＊が、Ｃ１～Ｃ６アルキルであり、
Ｗ１及びＷ２が、各々独立して、－Ｏ－及び－Ｎ（Ｒ６）－からなる群から選択され、
各Ｒ６が独立して、Ｈ及びＣ１－５アルキルからなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３が独立して、結合、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－ＣＨＲ－、－ＣＨＹ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎ－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－（ＣＨ２）ｎ－、－（ＣＨ２）ｎ－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－（ＣＨ２）ｎ－、－ＣＨ（ＯＨ）－、－Ｃ（Ｓ）－、及び－ＣＨ（ＳＨ）－からなる群から選択され、
各Ｙが独立して、Ｃ３－６炭素環であり、
各Ｒ＊が独立して、Ｃ１－１２アルキル及びＣ２－１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒが独立して、Ｃ１－３アルキル及びＣ３－６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’が独立して、Ｃ１－１２アルキル、Ｃ２－１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”が独立して、Ｃ３－１２アルキル、Ｃ３－１２アルケニル、及び－Ｒ＊ＭＲ’からなる群から選択され、
ｎが、１～６の整数であるが、
環Ａが、
Figure 2023526059000071
 である場合、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、－ＣＨ２－ではなく、及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、－Ｒ”ＭＲ’である。
一部の実施形態では、化合物は、式（ＩＩＩａ１）～（ＩＩＩａ８）のうちのいずれかのものである。
Figure 2023526059000072
Figure 2023526059000073
一部の実施形態では、アミノ脂質は、
Figure 2023526059000074
 またはその塩である。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ１）、（ＩＩＩａ２）、（ＩＩＩａ３）、（ＩＩＩａ４）、（ＩＩＩａ５）、（ＩＩＩａ６）、（ＩＩＩａ７）、または（ＩＩＩａ８）に従った脂質の中心アミン部分は、生理的ｐＨでプロトン化され得る。故に、脂質は、生理的ｐＨで正電荷または部分的に正の電荷を有してもよい。
リン脂質
本明細書に開示される脂質ナノ粒子組成物の脂質組成物は、１つまたは複数のリン脂質、例えば、１つもしくは複数の飽和もしくは（多価）不飽和リン脂質またはそれらの組み合わせを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つまたは複数の脂肪酸部分を含む。
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
脂肪酸部分は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。
特定のリン脂質は、膜への融合を容易にし得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つまたは複数の負に帯電したリン脂質と相互作用し得る。リン脂質の膜への融合により、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つまたは複数の要素（例えば、治療剤）が膜を通過して、例えば、１つまたは複数の要素が標的組織に送達されるのを可能にすることができる可能性がある。
分岐、酸化、環化、及びアルキンを含めた修飾及び置換を有する天然種を含む非天然のリン脂質種もまた企図される。例えば、リン脂質は、１つまたは複数のアルキン（例えば、１つまたは複数の二重結合が三重結合と置き換えられているアルケニル基）で官能基化、またはそれに架橋され得る。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドに曝露されると銅触媒環化付加を経ることができる。かかる反応は、膜透過もしくは細胞認識を容易にするようにナノ粒子組成物の脂質二重層を官能基化する際、またはナノ粒子組成物を標的化もしくはイメージング部分（例えば、色素）等の有用な成分にコンジュゲートする際に有用であり得る。
リン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、及びホスファチジン酸等のグリセロリン脂質が含まれるが、これらに限定されない。リン脂質にはまた、スフィンゴミエリン等のリンスフィンゴ脂質も含まれる。
一部の実施形態では、本発明のリン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＤＬＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－リンコリン（ＤＭＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジウンデカノイル－ｓｎ－グリセロ－リンコリン（ＤＵＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１－オレオイル－２コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン（Ｃ１６リゾＰＣ）、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンコリン、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン（ＭＥ １６．０ ＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジリノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジリノレノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジドコサヘキサエノイル－ｓｎ－グリセロ－３－リンエタノールアミン、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－リン－ｒａｃ－（１－グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの混合物を含む。
ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または有用な可能性があるリン脂質は、ＤＳＰＣの類似体またはバリアントである。ある特定の実施形態では、本発明において有用な、または有用な可能性があるリン脂質は、式（ＩＶ）の化合物、
Figure 2023526059000075
 またはその塩であり、式中、
各Ｒ１が独立して、任意選択で置換されるアルキルであるか、または任意選択で、２つのＲ１が、介在原子と一緒に連結されて、任意選択で置換される単環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換される単環式ヘテロシクリルを形成するか、または任意選択で、３つのＲ１が、介在原子と一緒に連結されて、任意選択で置換される二環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換される二環式ヘテロシクリルを形成し、
ｎが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａが、式：
Figure 2023526059000076
 のものであり、
Ｌ２の各出現例が独立して、結合、または任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位が、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）により任意選択で置き換えられ、
Ｒ２の各出現例が独立して、任意選択で置換されるＣ１－３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１－３０アルキニルであり、ここで、任意選択で、Ｒ２の１つまたは複数のメチレン単位が独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各出現例が独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂが、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり、
ｐが、１または２であるが、
但し、該化合物が、下記式のものではないことを条件とし、
Figure 2023526059000077
 式中、Ｒ２の各出現例が独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである。
一部の実施形態では、リン脂質は、米国出願第６２／５２０，５３０号、または２０１８年６月１５日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３７９２２号に記載されるリン脂質のうちの１つまたは複数であり得、同文献の各々の内容全体は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
構造脂質
本明細書に開示される薬学的組成物の脂質組成物は、１つまたは複数の構造脂質を含み得る。本明細書で使用されるとき、「構造脂質」という用語は、ステロール、及びまたステロール部分を含有する脂質を指す。
脂質ナノ粒子中の構造脂質の組み込みは、粒子中の他の脂質の凝集を軽減するのに役立ち得る。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ－トコフェロール、ホパノイド、植物ステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含むがこれらに限定されない群から選択され得る。一部の実施形態では、構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義されるとき、「ステロール」とは、ステロイドアルコールからなるステロイドの下位群である。ある特定の実施形態では、構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールの類似体である。ある特定の実施形態では、構造脂質は、アルファ－トコフェロールである。
一部の実施形態では、構造脂質は、米国出願第１６／４９３，８１４号に記載される構造脂質のうちの１つまたは複数であり得る。
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質
本明細書に開示される薬学的組成物の脂質組成物は、１つもしくは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含み得る。
本明細書で使用されるとき、「ＰＥＧ脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を指す。ＰＥＧ脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが挙げられる。かかる脂質は、ＰＥＧ化脂質とも称される。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であり得る。
一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質には、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイル、ＰＥＧ－ジオレイル、ＰＥＧ－ジステアリル、ＰＥＧ－ジアシルグリカミド（ＰＥＧ－ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ－１，２－ジミリスチルオキシプロピル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｌｐｒｏｐｙｌ）－３－アミン（ＰＥＧ－ｃ－ＤＭＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ（別称、ＰＥＧ－ＤＯＭＧ）、ＰＥＧ－ＤＳＧ、及び／またはＰＥＧ－ＤＰＧである。
一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質の脂質部分は、約Ｃ１４～約Ｃ２２、好ましくは約Ｃ１４～約Ｃ１６の長さを有するものを含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ部分、例えばｍＰＥＧ－ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ダルトンのサイズを有する。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含み得る。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例としては、ＰＥＧ－ＤＳＧ及びＰＥＧ－ＤＳＰＥが挙げられる。
ＰＥＧ脂質は、例えば、米国特許第８１５８６０１号及び国際公開第ＷＯ２０１５／１３０５８４ Ａ２号に記載されるもの等、当該技術分野で既知であり、同文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
一般に、本明細書に記載の種々の式の他の脂質成分（例えば、ＰＥＧ脂質）のうちのいくつかは、２０１６年１２月１０日に出願された、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ」と題される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９号に記載されるように合成されてもよく、同文献は、参照によりその全体が援用される。
脂質ナノ粒子組成物の脂質成分は、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質等、ポリエチレングリコールを含む１つまたは複数の分子を含んでもよい。かかる種は、代替的にＰＥＧ化脂質と称され得る。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びその混合物を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であってもよい。
一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ－ＤＭＧは、以下の構造を有する。
Figure 2023526059000078
一実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号に記載されるＰＥＧ化脂質であり得、同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される。本明細書に記載のこれらの例示的なＰＥＧ脂質のうちのいずれかは、ＰＥＧ鎖上にヒドロキシル基を含むように修飾されてもよい。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である。本明細書で一般に定義されるとき、「ＰＥＧ－ＯＨ脂質」（本明細書で「ヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質」とも称される）とは、脂質上に１つまたは複数のヒドロキシル（－ＯＨ）基を有するＰＥＧ化脂質である。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨ脂質は、ＰＥＧ鎖上に１つまたは複数のヒドロキシル基を含む。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ－ＯＨまたはヒドロキシ－ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に－ＯＨ基を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
ある特定の実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、式（Ｖ）の化合物である。本明細書では、式（Ｖ）の化合物、
Figure 2023526059000079
 またはその塩が提供され、式中、
Ｒ３が、－ＯＲＯであり、
ＲＯが、水素、任意選択で置換されるアルキル、または酸素保護基であり、
ｒが、１～１００（端点値を含む）の整数であり、
Ｌ１が、任意選択で置換されるＣ１－１０アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されるＣ１－１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンが独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）で置き換えられ、
Ｄが、クリックケミストリーによって得られる部分、または生理学的条件下で切断可能な部分であり、
ｍが、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａが、式：
Figure 2023526059000080
 のものであり、
Ｌ２の各出現例が独立して、結合、または任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンであり、ここで、任意選択で置換されるＣ１－６アルキレンの１つのメチレン単位が、Ｏ、Ｎ（ＲＮ）、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、またはＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）により任意選択で置き換えられ、
Ｒ２の各出現例が独立して、任意選択で置換されるＣ１－３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１－３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１－３０アルキニルであり、ここで、任意選択で、Ｒ２の１つまたは複数のメチレン単位が独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各出現例が独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂが、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり、
ｐが、１または２である。
ある特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、ＰＥＧ－ＯＨ脂質である（すなわち、Ｒ３は、－ＯＲＯであり、ＲＯは、水素である）。ある特定の実施形態では、式（Ｖ）の化合物は、式（Ｖ－ＯＨ）のもの、
Figure 2023526059000081
 またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ化脂肪酸である。ある特定の実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩ）の化合物である。本明細書では、式（ＶＩ－Ａ）の化合物、
Figure 2023526059000082
 またはその塩が提供され、式中、
Ｒ３が、－ＯＲＯであり、
ＲＯが、水素、任意選択で置換されるアルキル、または酸素保護基であり、
ｒが、１～１００（端点値を含む）の整数であり、
Ｒ５が、任意選択で置換されるＣ１０－４０アルキル、任意選択で置換されるＣ１０－４０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１０－４０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ５の１つまたは複数のメチレン基が、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、Ｎ（ＲＮ）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）Ｓ、ＳＣ（Ｏ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）、Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）、ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）、ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）、Ｓ（Ｏ）、ＯＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｏ、ＯＳ（Ｏ）２Ｏ、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ、Ｓ（Ｏ）２、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２、Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）、またはＮ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏで置き換えられ、
ＲＮの各出現例が独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基である。
ある特定の実施形態では、式（ＶＩ）の化合物は、式（ＶＩ－ＯＨ）のもの、
Figure 2023526059000083
 またはその塩である。一部の実施形態では、ｒは、４０～５０である。
なおも他の実施形態では、式（ＶＩ－Ｃ）の化合物は、
Figure 2023526059000084
 またはその塩である。
一実施形態では、式（ＶＩ－Ｄ）の化合物は、
Figure 2023526059000085
 である。
一部の態様では、本明細書に開示される薬学的組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ脂質を含まない。
一部の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、米国出願第ＵＳ１５／６７４，８７２号に記載されるＰＥＧ脂質のうちの１つまたは複数であり得る。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのうちのいずれかのアミノ脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、構造脂質、及びＰＥＧ－ＤＭＧを含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのうちのいずれかのアミノ脂質、ＤＳＰＣを含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ脂質、式ＩＶを有する化合物を含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶまたはＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ脂質、式ＩＶを有する化合物を含むリン脂質、構造脂質、及び式ＶまたはＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ脂質、式ＩＶを有するリン脂質、構造脂質、及び式ＶＩを有する化合物を含むＰＥＧ脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約２：１～約３０：１のＮ：Ｐの比を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約６：１のＮ：Ｐの比を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約３：１、４：１、または５：１のＮ：Ｐの比を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約１０：１～約１００：１のアミノ脂質成分対ＲＮＡの重量／重量比を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約２０：１のアミノ脂質成分対ＲＮＡの重量／重量比を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約１０：１のアミノ脂質成分対ＲＮＡの重量／重量比を含む。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍの平均直径を有する。
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、約６０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均直径を有する。
例示的な追加のＬＮＰ成分
界面活性剤
ある特定の実施形態では、本開示の脂質ナノ粒子は、任意選択で、１つまたは複数の界面活性剤を含む。
ある特定の実施形態では、界面活性剤は、両親媒性ポリマーである。本明細書で使用されるとき、両親媒性「ポリマー」とは、オリゴマーまたはポリマーを含む両親媒性化合物である。例えば、両親媒性ポリマーは、２つ以上のＰＥＧモノマー単位等のオリゴマー断片を含み得る。例えば、本明細書に記載の両親媒性ポリマーは、ＰＳ２０であり得る。
例えば、両親媒性ポリマーは、ブロックコポリマーである。
例えば、両親媒性ポリマーは、凍結保護剤である。
例えば、両親媒性ポリマーは、約３０℃及び大気圧で、水中で２×１０－４Ｍ未満の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
例えば、両親媒性ポリマーは、約３０℃及び大気圧で、水中で約０．１×１０－４Ｍ～約１．３×１０－４Ｍの範囲の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を有する。
例えば、両親媒性ポリマーの濃度は、例えば、凍結または凍結乾燥の前に、製剤中で、およそそのＣＭＣからＣＭＣの約３０倍（例えば、そのＣＭＣの最大約２５倍、約２０倍、約１５倍、約１０倍、約５倍、または約３倍）の範囲である。
例えば、両親媒性ポリマーは、ポロキサマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポロキサミン（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ポリソルベート）、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択される。
例えば、両親媒性ポリマーは、ポロキサマーである。例えば、両親媒性ポリマーは、以下の構造のものであり、
Figure 2023526059000086
 式中、ａは、１０～１５０の整数であり、ｂは、２０～６０の整数である。例えば、ａは約１２であり、ｂは約２０であるか、またはａは約８０であり、ｂは約２７であるか、またはａは約６４であり、ｂは約３７であるか、またはａは約１４１であり、ｂは約４４であるか、またはａは約１０１であり、ｂは約５６である。
例えば、両親媒性ポリマーは、Ｐ１２４、Ｐ１８８、Ｐ２３７、Ｐ３３８、またはＰ４０７である。
例えば、両親媒性ポリマーは、Ｐ１８８（例えば、ポロキサマー１８８、ＣＡＳ番号９００３－１１－６、別名、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ Ｐ１８８）である。
例えば、両親媒性ポリマーは、ポロキサミン、例えば、ｔｅｔｒｏｎｉｃ ３０４またはｔｅｔｒｏｎｉｃ ９０４である。
例えば、両親媒性ポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、例えば、３ｋＤａ、１０ｋＤａ、または２９ｋＤａの分子量を有するＰＶＰである。
例えば、両親媒性ポリマーは、ＰＳ２０等のポリソルベートである。
ある特定の実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、界面活性剤を含む。一部の実施形態では、界面活性剤は、両親媒性ポリマーである。一部の実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。
例えば、非イオン性界面活性剤は、ポリエチレングリコールエーテル（Ｂｒｉｊ）、ポロキサマー、ポリソルベート、ソルビタン、及びそれらの誘導体からなる群から選択される。
例えば、ポリエチレングリコールエーテルは、式（ＶＩＩＩ）の化合物、
Figure 2023526059000087
 またはその塩もしくは異性体であり、式中、
ｔが、１～１００の整数であり、
Ｒ１ＢＲＩＪが独立して、Ｃ１０～４０アルキル、Ｃ１０～４０アルケニル、またはＣ１０～４０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ５ＰＥＧの１つまたは複数のメチレン基が独立して、Ｃ３～１０カルボシクリレン、４員～１０員のヘテロシクリレン、Ｃ６～１０アリーレン、４員～１０員のヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｏ－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で置き換えられ、
ＲＮの各出現例が独立して、水素、Ｃ１～６アルキル、または窒素保護基である。
一部の実施形態では、Ｒ１ＢＲＩＪは、Ｃ１８アルキルである。例えば、ポリエチレングリコールエーテルは、式（ＶＩＩＩ－ａ）の化合物、
Figure 2023526059000088
 またはその塩もしくは異性体である。
一部の実施形態では、Ｒ１ＢＲＩＪは、Ｃ１８アルケニルである。例えば、ポリエチレングリコールエーテルは、式（ＶＩＩＩ－ｂ）の化合物、
Figure 2023526059000089
 またはその塩もしくは異性体である。
一部の実施形態では、ポロキサマーは、ポロキサマー１０１、ポロキサマー１０５、ポロキサマー１０８、ポロキサマー１２２、ポロキサマー１２３、ポロキサマー１２４、ポロキサマー１８１、ポロキサマー１８２、ポロキサマー１８３、ポロキサマー１８４、ポロキサマー１８５、ポロキサマー１８８、ポロキサマー２１２、ポロキサマー２１５、ポロキサマー２１７、ポロキサマー２３１、ポロキサマー２３４、ポロキサマー２３５、ポロキサマー２３７、ポロキサマー２３８、ポロキサマー２８２、ポロキサマー２８４、ポロキサマー２８８、ポロキサマー３３１、ポロキサマー３３３、ポロキサマー３３４、ポロキサマー３３５、ポロキサマー３３８、ポロキサマー４０１、ポロキサマー４０２、ポロキサマー４０３、及びポロキサマー４０７からなる群から選択される。
一部の実施形態では、ポリソルベートは、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０、またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０である。
一部の実施形態では、ソルビタンの誘導体は、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）６５、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、またはＳｐａｎ（登録商標）８５である。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中の非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．００００１ｗ／ｖ％～約１ｗ／ｖ％、例えば、約０．００００５ｗ／ｖ％～約０．５ｗ／ｖ％、または約０．０００１ｗ／ｖ％～約０．１ｗ／ｖ％の範囲である。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中の非イオン性界面活性剤の濃度は、約０．０００００１重量％～約１重量％、例えば、約０．０００００２重量％～約０．８重量％、または約０．０００００５重量％～約０．５重量％の範囲である。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中のＰＥＧ脂質の濃度は、約０．０１モル％～約５０モル％、例えば、約０．０５モル％～約２０モル％、約０．０７モル％～約１０モル％、約０．１モル％～約８モル％、約０．２モル％～約５モル％、または約０．２５モル％～約３モル％の範囲である。
アジュバント
一部の実施形態では、本発明のＬＮＰは、任意選択で、１つまたは複数のアジュバント、例えば、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（例えば、クラスＡまたはＢ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）、水酸化アルミニウム、及びＰａｍ３ＣＳＫ４を含む。
他の成分
本発明のＬＮＰは、任意選択で、先の節に記載されたものに加えて１つまたは複数の成分を含んでもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、ビタミン（例えば、ビタミンＡまたはビタミンＥ）またはステロール等の１つまたは複数の小さい疎水性分子を含んでもよい。
脂質ナノ粒子はまた、１つまたは複数の透過促進剤分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤、または他の成分を含んでもよい。透過促進剤分子は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号により記載される分子であってもよい。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）及び多糖類（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及び類似体）を含んでもよい。
ポリマーは、脂質ナノ粒子に含まれても、及び／または脂質ナノ粒子をカプセル封入するもしくは部分的にカプセル封入するために使用されてもよい。ポリマーは、生分解性及び／または生体適合性であってもよい。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートから選択され得るが、これらに限定されない。例えば、ポリマーには、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、エチレン酢酸ビニルポリマー（ＥＶＡ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸）（ＰＬＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（Ｌ－乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＬＧＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド）（ＰＤＬＡ）、ポリ（Ｌ－ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン－ｃｏ－グリコリド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－ＰＥＯ－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－ＰＰＯ－ｃｏ－Ｄ，Ｌ－ラクチド）、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリウレタン、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）、ヒドロキシプロピルメタクリレート（ＨＰＭＡ）、ポリエチレングリコール、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ（エステルアミド）、ポリアミド、ポリ（エステルエーテル）、ポリカーボネート、ポリエチレン及びポリプロピレン等のポリアルキレン、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド（ＰＥＯ）等のポリアルキレングリコール、ポリ（エチレンテレフタレート）等のポリアルキレンテレフタレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルエーテル、ポリ（酢酸ビニル）等のポリビニルエステル、ポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）等のハロゲン化ビニル、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリシロキサン、ポリスチレン、ポリウレタン、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル、セルロースエステル、ニトロセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等の誘導体化セルロース、ポリ（メチル（メタ）アクリレート）（ＰＭＭＡ）、ポリ（エチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソブチル（メタ）アクリレート）、ポリ（ヘキシル（メタ）アクリレート）、ポリ（イソデシル（メタ）アクリレート）、ポリ（ラウリル（メタ）アクリレート）、ポリ（フェニル（メタ）アクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ならびにそれらのコポリマー及び混合物等のアクリル酸のポリマー、ポリジオキサノン及びそのコポリマー、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリプロピレンフマレート、ポリオキシメチレン、ポロキサマー、ポロキサミン、ポリ（オルト）エステル、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－カプロラクトン）、トリメチレンカーボネート、ポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）（ＰＡｃＭ）、ポリ（２－メチル－２－オキサゾリン）（ＰＭＯＸ）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（ＰＥＯＺ）、ならびにポリグリセロールが含まれ得る。
表面改質剤には、アニオン性タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）、界面活性剤（例えば、ジメチルジオクタデシル－臭化アンモニウム等のカチオン性界面活性剤）、糖または糖誘導体（例えば、シクロデキストリン）、核酸、ポリマー（例えば、ヘパリン、ポリエチレングリコール、及びポロキサマー）、粘液溶解剤（例えば、アセチルシステイン、マグワート、ブロメライン、パパイン、クレロデンドルム、ブロムヘキシン、カルボシステイン、エプラジノン、メスナ、アンブロキソール、ソブレロール、ドミオドール、レトステイン、ステプロニン、チオプロニン、ゲルゾリン、チモシンβ４、ドルナーゼアルファ、ネルテネキシン、及びエルドステイン）、及びＤＮａｓｅ（例えば、ｒｈＤＮａｓｅ）が含まれ得るが、これらに限定されない。表面改質剤は、ナノ粒子内及び／またはＬＮＰの表面上に（例えば、コーティング、吸着、共有結合、または他のプロセスによって）配置されてもよい。
脂質ナノ粒子はまた、１つまたは複数の官能基化脂質を含んでもよい。例えば、脂質は、適切な反応条件下でアジドに曝露されたときに環化付加反応を経ることができる、アルキン基で官能基化されてもよい。特に、脂質二重層は、この様式で、膜透過、細胞認識、またはイメージングを容易にする際に有用な１つまたは複数の基で官能基化されてもよい。ＬＮＰの表面はまた、１つまたは複数の有用な抗体とコンジュゲートされてもよい。標的細胞送達、イメージング、及び膜透過において有用な官能基及びコンジュゲートは、当該技術分野で周知である。
これらの成分に加えて、脂質ナノ粒子は、薬学的組成物において有用な任意の物質を含んでもよい。例えば、脂質ナノ粒子は、限定されないが、１つまたは複数の溶媒、分散媒、希釈剤、分散補助剤、懸濁補助剤、造粒補助剤、崩壊剤、充填剤、流動促進剤、液体ビヒクル、結合剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、緩衝剤、滑沢剤、油、防腐剤、及び他の種等の、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤または副成分を含んでもよい。ワックス、バター、着色剤、コーティング剤、香味剤、及び芳香剤等の賦形剤もまた含まれてもよい。薬学的に許容される賦形剤は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照されたい）。
希釈剤の例としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微晶質セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、トウモロコシデンプン、粉末糖、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。造粒剤及び分散剤は、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、柑橘類パルプ、寒天、ベントナイト、セルロース及び木材製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル－ピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルデンプンナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（デンプン１５００）、微晶質デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム、第四級アンモニウム化合物、及び／またはそれらの組み合わせからなる非限定的なリストから選択され得る。
表面活性剤及び／または乳化剤には、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドルックス（ｃｈｏｎｄｒｕｘ）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、及びレシチン）、コロイド粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］及びＶＥＥＧＵＭ（登録商標）［ケイ酸マグネシウムアルミニウム］）、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、モノステアリン酸トリアセチン、ジステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸グリセリル、及びモノステアリン酸プロピレングリコール、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、及びカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０］、ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０］、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、モノパルミチン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、モノステアリン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）６０］、トリステアリン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）６５］、モノオレイン酸グリセリル、モノオレイン酸ソルビタン［ＳＰＡＮ（登録商標）８０］）、ポリオキシエチレンエステル（例えば、モノステアリン酸ポリオキシエチレン［ＭＹＲＪ（登録商標）４５］、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ステアリン酸ポリオキシメチレン、及びＳＯＬＵＴＯＬ（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ポリ（ビニル－ピロリドン）、モノラウリン酸ジエチレングリコール、オレイン酸トリエタノールアミン、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウム、及び／またはそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
結合剤は、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン及びデンプンペースト）、ゼラチン、糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）、天然及び合成ガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワーガム（ｐａｎｗａｒ ｇｕｍ）、ガティガム（ｇｈａｔｔｉ ｇｕｍ）、イサポールハスク（ｉｓａｐｏｌ ｈｕｓｋｓ）の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微晶質セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニル－ピロリドン）、ケイ酸マグネシウムアルミニウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標）、及びカラマツアラビノガラクタン（ｌａｒｃｈ ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ））、アルギネート、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、無機カルシウム塩、ケイ酸、ポリメタクリレート、ワックス、水、アルコール、ならびにそれらの組み合わせ、または任意の他の好適な結合剤であってもよい。
防腐剤の例としては、酸化防止剤、キレート剤、抗菌防腐剤、抗真菌防腐剤、アルコール防腐剤、酸性防腐剤、及び／または他の防腐剤が挙げられ得るが、これらに限定されない。酸化防止剤の例としては、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、及び／または亜硫酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。キレート剤の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、及び／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。抗菌防腐剤の例としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、及び／またはチメロサールが挙げられるが、これらに限定されない。抗真菌防腐剤の例としては、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、及び／またはソルビン酸が挙げられるが、これらに限定されない。アルコール防腐剤の例としては、エタノール、ポリエチレングリコール、ベンジルアルコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート、及び／またはフェニルエチルアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。酸性防腐剤の例としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ－カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロアスコルビン酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、及び／またはフィチン酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の防腐剤には、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム（ｄｅｔｅｒｏｘｉｍｅ ｍｅｓｙｌａｔｅ）、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、ＧＬＹＤＡＮＴ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＨＥＮＯＮＩＰ（登録商標）、メチルパラベン、ＧＥＲＭＡＬＬ（登録商標）１１５、ＧＥＲＭＡＢＥＮ（登録商標）ＩＩ、ＮＥＯＬＯＮＥ（商標）、ＫＡＴＨＯＮ（商標）、及び／またはＥＵＸＹＬ（登録商標）が含まれるが、これらに限定されない。
緩衝剤の例としては、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、ｄ－グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ラクトビオン酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、アミノスルホン酸緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱性物質不含水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、硬化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びそれらの組み合わせからなる非限定的な群から選択され得る。
油の例としては、アーモンド、アンズ核、アボカド、ババス、ベルガモット、クロスグリの種、ボラージ、カデ、カモミール、カノーラ、キャラウェイ、カルナウバ、ヒマシ、シナモン、ココアバター、ココナッツ、タラ肝、コーヒー、トウモロコシ、綿実、エミュー、ユーカリ、ツキミソウ、魚、亜麻仁、ゲラニオール、ヒョウタン、グレープシード、ヘーゼルナッツ、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、ククイナッツ、ラバンジン、ラベンダー、レモン、アオモジ、マカデミアナッツ、ゼニアオイ、マンゴーシード、メドウフォームシード、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、パーム、パーム核、トウニン、ピーナッツ、ポピーシード、パンプキンシード、ナタネ、米ぬか、ローズマリー、ベニバナ、サンダルウッド、サザンカ（ｓａｓｑｕａｎａ）、セイバリー、シーバックソーン、ゴマ、シアバター、シリコーン、大豆、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチバー、クルミ、及び小麦胚芽油、ならびにステアリン酸ブチル、トリカプリル酸グリセリル（ｃａｐｒｙｌｉｃ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、トリカプリン酸グリセリル（ｃａｐｒｉｃ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン３６０、シメチコン、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、及び／またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
システムまたはＬＮＰ組成物の使用方法
本開示は、細胞、例えば、標的細胞に、例えば、インビトロまたはインビボで送達され得る、ＬＮＰ組成物を提供する。インビトロでのタンパク質発現の場合、細胞は、ＬＮＰ及び細胞をエクスビボでインキュベートすることによってＬＮＰに接触させられる。かかる細胞はその後、インビボで導入されてもよい。インビボでのタンパク質発現の場合、細胞は、ＬＮＰを対象に投与することによってＬＮＰに接触させられ、それによって対象内の細胞におけるまたは細胞上でのタンパク質発現が増加または誘導される。例えば、一実施形態では、ＬＮＰは、静脈内に投与される。別の実施形態では、ＬＮＰは、筋肉内に投与される。なおも他の実施形態では、ＬＮＰは、皮下、結節内、及び腫瘍内からなる群から選択される経路によって投与される。
インビトロ送達の場合、一実施形態では、細胞は、ＬＮＰ及び標的細胞をエクスビボでインキュベートすることによってＬＮＰに接触させられる。一実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。種々の種類の細胞が、ＬＮＰによってトランスフェクト可能であることが実証されている。
別の実施形態では、細胞は、例えば、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、または少なくとも２４時間、ＬＮＰに接触させられる。
一実施形態では、細胞は、単回の処理／トランスフェクションでＬＮＰに接触させられる。別の実施形態では、細胞は、複数回の処理／トランスフェクション（例えば、同じ細胞の２回、３回、４回、またはそれを超える処理／トランスフェクション）でＬＮＰに接触させられる。
別の実施形態では、インビボ送達の場合、細胞は、ＬＮＰを対象に投与することによってＬＮＰに接触させられ、それによって核酸が対象内の細胞に送達される。例えば、一実施形態では、ＬＮＰは、静脈内に投与される。別の実施形態では、ＬＮＰは、筋肉内に投与される。なおも他の実施形態では、ＬＮＰは、皮下、結節内、及び腫瘍内からなる群から選択される経路によって投与される。
ある態様では、細胞において治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現を増加させる方法が本明細書で提供され、該方法は、細胞に、本明細書に開示されるシステム、またはＬＮＰ組成物を投与することを含む。
関連する態様では、細胞において治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現を増加させる方法において使用するための、システムまたはＬＮＰ組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、本開示は、対象において治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現を増加させる方法を提供し、該方法は、対象に、有効量の本明細書に開示されるシステムまたはＬＮＰ組成物を投与することを含む。
関連する態様では、対象において治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現を増加させる方法において使用するための、システムまたはＬＮＰ組成物が本明細書で提供される。
なおも別の態様では、本明細書に開示されるシステム、またはＬＮＰ組成物を送達する方法が本明細書で提供される。
関連する態様では、システムまたはＬＮＰ組成物を細胞に送達する方法において使用するための、システムまたはＬＮＰ組成物が本明細書で提供される。
ある実施形態では、該方法または使用は、細胞をインビトロ、インビボ、またはエクスビボで該システムまたはＬＮＰ組成物に接触させることを含む。
ある実施形態では、本開示のＬＮＰとして製剤化されたＬＮＰ組成物またはシステムは、細胞に、例えば、エクスビボまたはインビボで接触させられ、分泌ポリペプチド、細胞内ポリペプチド、または膜貫通型ポリペプチドを対象に送達するために使用することができる。
ある態様では、本開示は、本明細書に開示されるシステムまたはＬＮＰ組成物を、例えば、本明細書に記載されるような疾患または障害を有する対象に送達する方法を提供する。
関連する態様では、システムまたはＬＮＰ組成物を、例えば、本明細書に記載されるような疾患または障害を有する対象に送達する方法において使用するための、システムまたはＬＮＰ組成物が本明細書で提供される。
別の態様では、対象における免疫応答を調節する方法が本明細書で提供され、該方法は、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に開示されるシステム、またはＬＮＰ組成物を投与することを含む。
関連する態様では、対象における免疫応答を調節する方法において使用するための、システムまたはＬＮＰ組成物が本明細書で提供され、該方法は、対象に、有効量の該システム、または該ＬＮＰ組成物を投与することを含む。
別の態様では、分泌ポリペプチド、細胞内ポリペプチド、または膜貫通型ポリペプチドを対象に送達する方法が本明細書で提供される。
ある態様では、疾患または障害を処置するか、予防するか、またはその症状を予防する方法が本明細書で提供され、該方法は、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に開示されるシステム、またはＬＮＰ組成物を投与することを含む。
関連する態様では、対象における疾患または障害を処置するか、予防するか、またはその症状を予防する方法において使用するための、システムまたはＬＮＰ組成物が本明細書で提供され、該方法は、それを必要とする対象に、有効量の該システム、または該ＬＮＰ組成物を投与することを含む。
ある実施形態では、該システムの第１のポリヌクレオチド及び／または第２のポリヌクレオチドは、ＬＮＰとして製剤化される。ある実施形態では、該システムの第１のポリヌクレオチドは、ＬＮＰとして製剤化される。ある実施形態では、該システムの第２のポリヌクレオチドは、ＬＮＰとして製剤化される。ある実施形態では、該システムの第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドの両方が、ＬＮＰとして製剤化される。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰと同じである。ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰとは異なる。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、ある組成物中にある。ある実施形態では、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、別個の組成物中にある。ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰ及び第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、同じ組成物中にある。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰ及び第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、同時に、例えば、実質的に同時に投与される。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰ及び第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、共送達される。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰ及び第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰは、順次に投与される。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰが最初に投与される。
ある実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰが最初に投与され、続いて第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰが投与される。
ある実施形態では、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰが最初に投与される。
ある実施形態では、第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰが最初に投与され、続いて第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰが投与される。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法または使用に向けた組成物のうちのいずれかは、細胞において（例えば、該システムまたはＬＮＰ組成物に接触させられた細胞において）、以下、
（ｉ）該治療ペイロードもしくは該予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの増加した発現及び／もしくはレベル、
（ｉｉ）該治療ペイロードもしくは該予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの持続的な発現及び／もしくはレベル、
（ｉｉｉ）治療ペイロードもしくは予防ペイロードの増加した発現及び／もしくはレベル、
（ｉｖ）治療ペイロードもしくは予防ペイロードの持続的な発現及び／もしくはレベル、
（ｖ）該治療ペイロードもしくは該予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの増加した安定性、
（ｖｉ）細胞環境、例えば、ストレスもしくは栄養欠乏もしくは翻訳因子の利用可能性に対する治療ペイロードもしくは予防ペイロードの翻訳の増加した耐性、
（ｖｉｉ）該治療ペイロードもしくは該予防ペイロードの低減された投薬量、または
（ｖｉｉｉ）細胞内の内因性ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の低減された毒性、例えば、低減された調節、
のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくはそれらの全て、または任意の組み合わせをもたらす。
一部の実施形態では、該方法または使用に向けた組成物は、該治療ペイロードまたは該予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの増加した発現及び／またはレベルをもたらす。
一部の実施形態では、該方法または使用に向けた組成物は、該治療ペイロードまたは該予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの持続的な発現及び／またはレベルをもたらす。
一部の実施形態では、該方法または使用に向けた組成物は、治療ペイロードまたは予防ペイロードの増加した発現及び／またはレベルをもたらす。
一部の実施形態では、該方法または使用に向けた組成物は、治療ペイロードまたは予防ペイロードの持続的な発現及び／またはレベルをもたらす。
一部の実施形態では、該方法または使用に向けた組成物は、該治療ペイロードまたは該予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの増加した安定性をもたらす。
一部の実施形態では、該方法または使用に向けた組成物は、細胞環境、例えば、ストレスまたは栄養欠乏または翻訳因子の利用可能性に対する治療ペイロードまたは予防ペイロードの翻訳の増加した耐性をもたらす。
一部の実施形態では、該方法または使用に向けた組成物は、該治療ペイロードまたは該予防ペイロードの低減された投薬量をもたらす。
一部の実施形態では、該方法または使用に向けた組成物は、細胞内の内因性ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の低減された毒性、例えば、低減された調節をもたらす。
一部の実施形態では、（ｉ）～（ｖｉｉ）のうちのいずれか１つ、またはそれらの全てが、
（ａ）本明細書に開示されるシステムに接触させられていないか、
（ｂ）本明細書に開示されるＬＮＰ組成物に接触させられていないか、
（ｃ）該第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰに接触させられていないか、または
（ｄ）該第１のポリヌクレオチドを含むＬＮＰに接触させられたが、該第２のポリヌクレオチド、例えば、該第２のポリヌクレオチドを含むＬＮＰには接触させられていない、
細胞と比較される。
併用療法
一部の実施形態では、本明細書に開示される処置方法または使用に向けた組成物は、追加の薬剤と組み合わせて本明細書に開示されるＬＮＰを投与することを含む。ある実施形態では、追加の薬剤は、疾患または障害、例えば、自己免疫疾患に対する標準治療薬である。ある実施形態では、追加の薬剤は、ｍＲＮＡである。
一部の態様では、本方法または組成物に対する対象は、１つまたは複数の標準治療法で処置されたことがある。他の態様では、本方法または組成物に対する対象は、１つまたは複数の標準治療法または抗がん療法に応答性でなかった。
配列最適化及びその方法
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードする配列最適化されたヌクレオチド配列、例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、このＯＲＦは、配列最適化されている。
本明細書に開示される配列最適化されたヌクレオチド配列は、対応する野生型ヌクレオチド酸配列、及び他の既知の配列最適化されたヌクレオチド配列とは明確に異なり、例えば、これらの配列最適化された核酸は、固有の組成特性を有する。
一部の実施形態では、配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子、それらの機能的断片もしくはバリアントをコードする）中のウラシルまたはチミン核酸塩基のパーセンテージは、参照の野生型ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミン核酸塩基のパーセンテージに対して修飾されている（例えば、低減されている）。かかる配列は、ウラシル修飾またはチミン修飾配列と称される。ヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミン含量のパーセンテージは、配列中のウラシルまたはチミンの数をヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることによって決定することができる。一部の実施形態では、配列最適化されたヌクレオチド配列は、参照の野生型配列中のウラシルまたはチミン含量よりも低いウラシルまたはチミン含量を有する。一部の実施形態では、本開示の配列最適化されたヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミン含量は、参照の野生型配列中のウラシルまたはチミン含量よりも高いが、依然として、参照の野生型配列と比較したときに有益な効果、例えば、増加した発現及び／またはシグナル伝達応答を維持する。
一部の実施形態では、本開示の最適化された配列は、配列中に固有の範囲のウラシルまたはチミン（ＤＮＡの場合）を含有する。最適化された配列のウラシルまたはチミン含量は、種々の方式で、例えば、理論上の最小値（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）に対する、野生型（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）に対する、及び総ヌクレオチド含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）に対する、最適化された配列のウラシルまたはチミン含量で表され得る。ＤＮＡの場合、ウラシル（Ｕ）の代わりにチミン（Ｔ）が存在することが認識され、Ｕが現れる箇所においてＴを代用することになろう。ＲＮＡの場合、チミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）が存在することが認識される。当業者であれば、ＤＮＡ配列が提供される場合、そのＤＮＡ配列におけるチミンをウラシルに置換することによってＲＮＡ配列を容易に得ることができる。故に、例えば、ＲＮＡに関する％ＵＴＭ、％ＵＷＴ、または％ＵＴＬに関連する全ての開示は、ＤＮＡに関する％ＴＴＭ、％ＴＷＴ、または％ＴＴＬにも等しく適用可能である。
ウラシルまたはチミンの理論上の最小値に対するウラシル含量またはチミン含量は、配列最適化されたヌクレオチド配列中のウラシルまたはチミンの数を仮説上のヌクレオチド配列（仮説上の配列中の全てのコドンは、可能な限り低いウラシルまたはチミン含量を有する同義コドンで置き換えられている）中のウラシルまたはチミンの総数で割り、１００を掛けることによって決定されるパラメータを指す。このパラメータは、本明細書で％ＵＴＭまたは％ＴＴＭと略称される。
一部の実施形態では、本開示の治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするウラシル修飾配列は、対応する野生型核酸配列に対して低減された数の連続したウラシルを有する。例えば、２つの連続したロイシンは、４ウラシルのクラスターを含む、配列ＣＵＵＵＵＧによってコードされ得る。かかる部分配列は、例えば、ウラシルクラスターを除去する、ＣＵＧＣＵＣで代用され得る。フェニルアラニンは、ＵＵＣまたはＵＵＵによってコードされ得る。故に、ＵＵＵによってコードされるフェニルアラニンがＵＵＣに置き換えられる場合であっても、同義コドンは依然として、ウラシル対（ＵＵ）を含有する。したがって、配列中のフェニルアラニンの数は、コードされたポリペプチドにおけるフェニルアラニンの数を変化させることなしには排除することができない、最小数のウラシル対（ＵＵ）を確立する。
一部の実施形態では、本開示の治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列に対して低減された数のウラシル三つ組（ＵＵＵ）を有する。一部の実施形態では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列中のウラシル対（ＵＵ）の数に対して低減された数のウラシル対（ＵＵ）を有する。一部の実施形態では、本開示の治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列中の可能な限り最小数のウラシル対（ＵＵ）に対応する数のウラシル対（ＵＵ）を有する。
「野生型核酸配列中のウラシル対（ＵＵ）に対するウラシル対（ＵＵ）」という語句は、配列最適化されたヌクレオチド配列中のウラシル対（ＵＵ）の数を対応する野生型ヌクレオチド配列中のウラシル対（ＵＵ）の総数で割り、１００を掛けることによって決定されるパラメータを指す。このパラメータは、本明細書で％ＵＵｗｔと略称される。一部の実施形態では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするウラシル修飾配列は、１００％未満の％ＵＵｗｔを有する。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、本明細書に開示される治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするウラシル修飾配列を含む。一部の実施形態では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学修飾された核酸塩基、例えば、５－メトキシウラシルを含む。一部の実施形態では、本開示の治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするウラシル修飾配列中の核酸塩基（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％が、修飾核酸塩基である。一部の実施形態では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするウラシル修飾配列中のウラシルの少なくとも９５％が、５－メトキシウラシルである。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列（例えば、野生型配列、それらの機能的断片、またはバリアント）を含むポリヌクレオチド）は、配列最適化される。
配列最適化されたヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列は、本明細書で「核酸」とも称される）は、参照配列（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする野生型配列）に対して少なくとも１つのコドン修飾を含む。故に、配列最適化された核酸において、少なくとも１つのコドンが、参照配列（例えば、野生型配列）中の対応するコドンとは異なる。
一般に、配列最適化された核酸は、少なくとも参照配列中のコドンを同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）で置換することを含むステップによって生成される。かかる置換は、例えば、コドン置換マップ（すなわち、コドン最適化された配列中の各アミノ酸をコードするコドンを提供する表）を適用することによって、または一組の規則（例えば、グリシンが中性アミノ酸の隣にある場合、グリシンはある特定のコドンによってコードされるが、それが極性アミノ酸の隣にある場合、それは別のコドンによってコードされる）を適用することによって達成され得る。コドン置換（すなわち、「コドン最適化」）に加えて、本明細書に開示される配列最適化方法は、有害なモチーフの除去（不安定化モチーフ置換）等の、厳密にコドン最適化を目的とするのではない追加の最適化ステップを含む。これらの配列最適化された核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含む組成物及び製剤は、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする機能的に活性なもののインビボ発現を容易にするために、それを必要とする対象に投与され得る。
配列最適化の追加の例示的な方法は、２０１７年５月１８日に出願された国際ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１７／２０１３２５号に開示され、同文献の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、制御エレメント、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列及び／またはモチーフ、内因性核酸結合分子に対する疑似受容体として作用するように操作された人工結合部位、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。
一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、目的とするポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）をさらに含む。ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の包含または組み込みは、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）、及びひいては、それからコードされるポリペプチドの、天然型ｍｉＲＮＡの組織特異的及び／または細胞種特異的発現に基づいた制御を可能にする。
ｍｉＲＮＡ、例えば、天然型ｍｉＲＮＡは、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に結合し、ポリヌクレオチドの安定性を低減することによってまたはその翻訳を阻害することによってのいずれかで遺伝子発現を下方制御する、１９～２５ヌクレオチド長の非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの２～８位の領域にある配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの２～８位または２～７位を含み得る。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、７個のヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～８）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ結合部位におけるシード相補的部位には、ｍｉＲＮＡの１位に対向するアデノシン（Ａ）が隣接する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、６個のヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～７）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ結合部位におけるシード相補的部位には、ｍｉＲＮＡの１位に対向するアデノシン（Ａ）が隣接する。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ Ａ，Ｆａｒｈ ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ－Ｅｎｇｅｌｅ Ｐ，Ｌｉｍ ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ；Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００７ Ｊｕｌ ６；２７（１）：９１－１０５を参照されたい。標的細胞または組織のｍｉＲＮＡプロファイリングを実施して、細胞または組織におけるｍｉＲＮＡの存否を決定することができる。一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、１つまたは複数のマイクロＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ相補的配列、またはマイクロＲＮＡシード相補的配列を含む。かかる配列は、米国公開ＵＳ２００５／０２６１２１８及び米国公開ＵＳ２００５／００５９００５に教示されるもの等の任意の既知のマイクロＲＮＡに対応する、例えば、それに対して相補性を有する可能性があり、同文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
本明細書で使用されるとき、「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」という用語は、ｍｉＲＮＡの全てまたはある領域に対して、ｍｉＲＮＡと相互作用する、それと会合する、またはそれに結合するのに十分な相補性を有する、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ中を含めた核酸分子内、例えば、ＤＮＡ内またはＲＮＡ転写物内の配列を指す。一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、目的とするポリペプチドをコードするＯＲＦを含み、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）をさらに含む。例示的な実施形態では、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲが、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。
ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）のｍｉＲＮＡ媒介性制御、例えば、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）のｍｉＲＮＡ媒介性翻訳抑制またはその分解を容易にするのに十分な程度の相補性を指す。本開示の例示的な態様では、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位とは、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）のｍｉＲＮＡ媒介性分解、例えば、ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡガイドによるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介性切断を容易にするのに十分な程度の相補性を指す。ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９～２５ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列に対して、１９～２３ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列に対して、または２２ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ配列に対して相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部分のみに対して、例えば、天然型ｍｉＲＮＡ配列の全長の１、２、３、もしくは４ヌクレオチド未満の部分に対して相補的であり得る。所望の制御がｍＲＮＡ分解である場合、完全な（ｆｕｌｌ）または完全な（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）相補性（例えば、天然型ｍｉＲＮＡの長さの全てまたは大部分にわたる完全な（ｆｕｌｌ）相補性または完全な（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）相補性）が好ましい。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列との完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列との完全な相補性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、１、２、または３ヌクレオチドの置換、末端付加、及び／または切詰めを除いてｍｉＲＮＡ配列との完全な相補性を有する。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと同じ長さである。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、または両方にて、対応するｍｉＲＮＡよりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヌクレオチド（複数可）だけ短い。依然として他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、または両方にて、対応するマイクロＲＮＡよりも２ヌクレオチドだけ短い。対応するｍｉＲＮＡよりも短いｍｉＲＮＡ結合部位は、依然として、ｍｉＲＮＡ結合部位のうちの１つもしくは複数を組み込むｍＲＮＡを分解することができるか、またはｍＲＮＡの翻訳を阻止することができる。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、活性ＲＩＳＣ含有Ｄｉｃｅｒの一部である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、ＲＩＳＣにおける対応するｍｉＲＮＡへのｍｉＲＮＡ結合部位の結合は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含有するｍＲＮＡを分解するか、またはｍＲＮＡが翻訳されるのを阻止する。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を切断するように、ｍｉＲＮＡに対して十分な相補性を有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に不安定性を誘導するように、不完全な相補性を有する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の転写を抑制するように、不完全な相補性を有する。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡから１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のミスマッチ（複数可）を有する。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡのそれぞれ少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、または少なくとも約２１個の連続ヌクレオチドに相補的な、少なくとも約１０個、少なくとも約１１個、少なくとも約１２個、少なくとも約１３個、少なくとも約１４個、少なくとも約１５個、少なくとも約１６個、少なくとも約１７個、少なくとも約１８個、少なくとも約１９個、少なくとも約２０個、または少なくとも約２１個の連続ヌクレオチドを有する。
１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位を本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に導入操作することによって、当該ｍｉＲＮＡが利用可能である限り、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を分解または低減された翻訳に向けて標的化することができる。これは、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の送達時のオフターゲット効果を低減し得る。例えば、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）が、ある組織または細胞に送達されることが意図されないが、結果的に該組織または細胞に到達する場合、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ内にｍｉＲＮＡの１つまたは複数の結合部位が導入操作されていると、その組織または細胞に豊富に存在するｍｉＲＮＡが、目的とする遺伝子の発現を阻害し得る。
例えば、当業者であれば、リンパ系細胞以外の細胞種における発現を最小限に抑えるために、１つまたは複数のｍｉＲ結合部位を核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に含めることができることを理解しよう。一実施形態では、ｍｉＲ１２２結合部位が使用され得る。別の実施形態では、ｍｉＲ１２６結合部位が使用され得る。依然として別の実施形態では、これらのｍｉＲ結合部位の複数のコピーまたは組み合わせが使用されてもよい。
逆に、特定の組織におけるタンパク質発現を増加させるために、ｍｉＲＮＡ結合部位を、それらが天然に存在する核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）配列から除去することができる。例えば、ｍｉＲＮＡを含有する組織または細胞におけるタンパク質発現を改善するために、特定のｍｉＲＮＡのための結合部位を核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）から除去することができる。
複数の組織における発現の制御は、１つまたは複数のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、１つまたは複数の別々のｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去により遂行することができる。ｍｉＲＮＡ結合部位を除去するかまたは挿入するかのどちらかの決定は、発生及び／または疾患における組織及び／または細胞中のｍｉＲＮＡ発現パターン及び／またはそれらのプロファイリングに基づいて行うことができる。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位の特定、ならびに生物学におけるそれらの発現パターン及び役割が報告されている（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２０１０ １１：９４３－９４９、Ａｎａｎｄ ａｎｄ Ｃｈｅｒｅｓｈ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ２０１１ １８：１７１－１７６、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ ａｎｄ Ｒａｏ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１２ ２６：４０４－４１３（２０１１ Ｄｅｃ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）、Ｂａｒｔｅｌ Ｃｅｌｌ ２００９ １３６：２１５－２３３、Ｌａｎｄｇｒａｆ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７ １２９：１４０１－１４１４、Ｇｅｎｔｎｅｒ ａｎｄ Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２ ８０：３９３－４０３、及びその中の全ての参考文献（同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される））。
ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ結合部位は、米国公開第２０１４／０２００２６１号、同第２００５／０２６１２１８号、及び同第２００５／００５９００５号に記載される非限定的な例を含めた、任意の既知の配列に対応し得、同文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
ｍｉＲＮＡが、ｍＲＮＡ、及びそれによってタンパク質発現を制御することが知られている組織の例としては、肝臓（ｍｉＲ－１２２）、筋肉（ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－２０６、ｍｉＲ－２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ－１７－９２、ｍｉＲ－１２６）、骨髄系細胞（ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－２２３、ｍｉＲ－２４、ｍｉＲ－２７）、脂肪組織（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ－１ｄ、ｍｉＲ－１４９）、腎臓（ｍｉＲ－１９２、ｍｉＲ－１９４、ｍｉＲ－２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ－７、ｍｉＲ－１３３、ｍｉＲ－１２６）が挙げられるが、これらに限定されない。
具体的には、ｍｉＲＮＡは、免疫細胞（別称、造血細胞）、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞及び単球）、単球、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞等において差次的に発現することが知られている。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染症に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子療法及び組織／臓器移植後の望まれない免疫応答に関与する。免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡはまた、造血細胞（免疫細胞）の発生、増殖、分化、及びアポトーシスの多くの側面も制御する。例えば、ｍｉＲ－１４２及びｍｉＲ－１４６は、免疫細胞に限って発現し、特に骨髄系樹状細胞に豊富に発現する。核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に対する免疫応答は、ｍｉＲ－１４２結合部位をポリヌクレオチドの３’－ＵＴＲに付加することによって遮断され得、これにより組織及び細胞中のより安定な遺伝子導入が可能となることが実証されている。ｍｉＲ－１４２は、抗原提示細胞において外因性核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を効率的に分解し、形質導入された細胞の細胞傷害性排除を抑制する（例えば、Ａｎｎｏｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２－５１６１、Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ ｍｅｄ．２００６，１２（５），５８５－５９１、Ｂｒｏｗｎ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（１３）：４１４４－４１５２（同文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に援用される））。
抗原媒介性免疫応答は、外来性抗原によって誘発される免疫応答を指すことができ、外来性抗原は、生物に進入すると、抗原提示細胞によってプロセシングされ、抗原提示細胞の表面上に提示される。Ｔ細胞は、提示された抗原を認識して、抗原を発現する細胞の細胞傷害性排除を誘導することができる。
ｍｉＲ－１４２結合部位を本開示の核酸分子の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに導入することにより、ｍｉＲ－１４２媒介性分解を通して抗原提示細胞における遺伝子発現を選択的に抑制して、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）における抗原提示を制限し、それによって核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の送達後の抗原媒介性免疫応答を阻止することができる。すると核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、細胞傷害性排除を誘発することなく標的組織または細胞で安定して発現される。
一実施形態では、免疫細胞、特に抗原提示細胞で発現することが知られているｍｉＲＮＡに対する結合部位を本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）内に導入操作して、ｍｉＲＮＡ媒介性ＲＮＡ分解を通して抗原提示細胞における核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の発現を抑制することにより、抗原媒介性免疫応答を抑えることができる。核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の発現は、免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡが発現していない非免疫細胞においては維持される。例えば、一部の実施形態では、肝臓特異的タンパク質に対する免疫原性反応を阻止するために、いずれのｍｉＲ－１２２結合部位も除去され得、ｍｉＲ－１４２（及び／またはｍｉｒＲ－１４６）結合部位が本開示の核酸分子の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ内に導入操作され得る。
ＡＰＣ及びマクロファージにおいて選択的分解及び抑制をさらに駆動するために、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、単独で、またはｍｉＲ－１４２及び／またはｍｉＲ－１４６結合部位と組み合わせてのいずれかで、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲにさらなる負の制御エレメントを含み得る。非限定的な例として、さらなる負の制御エレメントは、構成的分解エレメント（Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｄｅｃａｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＣＤＥ）である。
免疫細胞特異的ｍｉＲＮＡには、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－２－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ａ－３ｐ、ｈｓａ－７ａ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｃ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｅ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｇ－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｉ－５ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１１８４、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－１－－３ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－２－５ｐ、ｈｓａ－ｌｅｔ－７ｆ－５ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－１－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１２７９、ｍｉＲ－１３０ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１３２－３ｐ、ｍｉＲ－１３２－５ｐ、ｍｉＲ－１４２－３ｐ、ｍｉＲ－１４２－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４３－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１４７ａ、ｍｉＲ－１４７ｂ、ｍｉＲ－１４８ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１４８ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－３ｐ、ｍｉＲ－１５０－５ｐ、ｍｉＲ－１５１ｂ、ｍｉＲ－１５５－３ｐ、ｍｉＲ－１５５－５ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１５ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－１５ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－１６－１－３ｐ、ｍｉＲ－１６－２－３ｐ、ｍｉＲ－１６－５ｐ、ｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－３ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－３ｐ、ｍｉＲ－１８２－５ｐ、ｍｉＲ－１９７－３ｐ、ｍｉＲ－１９７－５ｐ、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－２１－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－３ｐ、ｍｉＲ－２１４－５ｐ、ｍｉＲ－２２３－３ｐ、ｍｉＲ－２２３－５ｐ、ｍｉＲ－２２１－３ｐ、ｍｉＲ－２２１－５ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２３ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２４－１－５ｐ、ｍｉＲ－２４－２－５ｐ、ｍｉＲ－２４－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－１－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－２－３ｐ、ｍｉＲ－２６ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２６ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－２７ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２８－３ｐ、ｍｉＲ－２８－５ｐ、ｍｉＲ－２９０９、ｍｉＲ－２９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－１－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｂ－２－５ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－３ｐ、ｍｉＲ－２９ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、ｍｉＲ－３３１－５ｐ、ｍｉＲ－３３９－３ｐ、ｍｉＲ－３３９－５ｐ、ｍｉＲ－３４５－３ｐ、ｍｉＲ－３４５－５ｐ、ｍｉＲ－３４６、ｍｉＲ－３４ａ－３ｐ、ｍｉＲ－３４ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３６３－３ｐ、ｍｉＲ－３６３－５ｐ、ｍｉＲ－３７２、ｍｉＲ－３７７－３ｐ、ｍｉＲ－３７７－５ｐ、ｍｉＲ－４９３－３ｐ、ｍｉＲ－４９３－５ｐ、ｍｉＲ－５４２、ｍｉＲ－５４８ｂ－５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－５４８ｉ、ｍｉＲ－５４８ｊ、ｍｉＲ－５４８ｎ、ｍｉＲ－５７４－３ｐ、ｍｉＲ－５９８、ｍｉＲ－７１８、ｍｉＲ－９３５、ｍｉＲ－９９ａ－３ｐ、ｍｉＲ－９９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－９９ｂ－３ｐ、及びｍｉＲ－９９ｂ－５ｐが含まれるが、これらに限定されない。さらに、マイクロアレイハイブリダイゼーション及びミクロトーム解析により新規のｍｉＲＮＡが免疫細胞において特定され得る（例えば、Ｊｉｍａ ＤＤ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８－ｅ１２７、Ｖａｚ Ｃ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８（同文献の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される））。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）において、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の任意の位置（例えば、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ）で挿入される。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）における挿入部位は、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）におけるｍｉＲＮＡ結合部位の挿入が、対応するｍｉＲＮＡの不在下で機能的ポリペプチドの翻訳を妨害せず、かつｍｉＲＮＡの存在下で、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）におけるｍｉＲＮＡ結合部位の挿入及び対応するｍｉＲＮＡへのｍｉＲＮＡ結合部位の結合が、ポリヌクレオチドを分解するか、または核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の翻訳を阻止することができる限り、核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の任意の箇所であることができる。
一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ＯＲＦを含む本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）において、ＯＲＦの終止コドンから少なくとも約３０ヌクレオチド下流に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示のポリヌクレオチドにおいて、ＯＲＦの終止コドンから少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド下流に挿入される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）において、ＯＲＦの終止コドンから約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド～約６５ヌクレオチド下流に挿入される。
ｍｉＲＮＡ遺伝子制御は、限定されないが、周囲の配列の種、配列の種類（例えば、異種、同種、外因性、内因性、または人工）、周囲の配列内の制御エレメント及び／または周囲の配列内の構造エレメント等の、ｍｉＲＮＡの周囲の配列によって影響を受け得る。ｍｉＲＮＡは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲによって影響を受け得る。非限定的な例として、非ヒト３’ＵＴＲは、同じ配列の種類のヒト３’ＵＴＲと比較して、目的とするポリペプチドの発現に対するｍｉＲＮＡ配列の制御効果を増加させ得る。
一実施形態では、５’ＵＴＲの他の制御エレメント及び／または構造エレメントが、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子制御に影響を及ぼし得る。制御エレメント及び／または構造エレメントの一例は、タンパク質翻訳を開始するための翻訳伸長因子の結合に必要である、５’ＵＴＲ内の構造化ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）である。５’－ＵＴＲ内のこの二次構造化エレメントへのＥＩＦ４Ａ２の結合は、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子発現に必要である（Ｍｅｉｊｅｒ ＨＡ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４０，８２－８５（参照によりその全体が本明細書に援用される））。本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、マイクロＲＮＡ媒介性遺伝子制御を強化するために、この構造化５’ＵＴＲをさらに含み得る。
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位が、本開示のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲ内に導入操作され得る。この文脈において、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、またはそれよりも多くのｍｉＲＮＡ結合部位が、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲ内に導入操作され得る。例えば、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、２個、または１個のｍｉＲＮＡ結合部位が、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲ内に導入操作され得る。一実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、同じであることもできるし、または異なるｍｉＲＮＡ部位であることもできる。本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込まれる異なるｍｉＲＮＡ結合部位の組み合わせは、異なるｍｉＲＮＡ部位のうちのいずれかの１つよりも多くのコピーが組み込まれる組み合わせを含み得る。別の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、体内の同じまたは異なる組織を標的とすることができる。非限定的な例として、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）の３’－ＵＴＲ内の組織特異的、細胞種特異的、または疾患特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入により、特定の細胞種（例えば、肝細胞、骨髄系細胞、内皮細胞、がん細胞等）における発現の程度が低減され得る。
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）において３’ＵＴＲの５’末端の近くに、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間のおよそ中間に、及び／または３’ＵＴＲの３’末端の近くに導入操作され得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端の近く及び３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間のおよそ中間に導入操作され得る。別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの３’末端の近く及び３’ＵＴＲの５’末端と３’末端との間のおよそ中間に導入操作され得る。なおも別の非限定的な例では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端の近く及び３’ＵＴＲの３’末端の近くに導入操作され得る。
別の実施形態では、３’ＵＴＲは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列、及び／またはシード配列に隣接するｍｉＲＮＡ配列に相補的であり得る。
本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、異なる組織、細胞種、または生物学的条件でのｍｉＲＮＡの発現パターンに基づいて、特定の組織、細胞種、または生物学的条件でのより標的化された発現に向けて操作され得る。組織特異的ｍｉＲＮＡ結合部位の導入により、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、組織もしくは細胞、または生物学的条件の関連における最適なタンパク質発現に向けて設計され得る。
一部の実施形態では、本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、治療薬送達によって引き起こされる望まれない免疫原性反応を抑えるように免疫細胞においてｍＲＮＡ治療薬を選択的に分解するために、３’ＵＴＲ内に少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、抗原提示細胞において本開示の核酸分子（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）をより不安定にし得る。これらのｍｉＲＮＡの非限定的な例としては、ｍｉｒ－１４２－５ｐ、ｍｉｒ－１４２－３ｐ、ｍｉｒ－１４６ａ－５ｐ、及びｍｉｒ－１４６－３ｐが挙げられる。
ＩＶＴポリヌクレオチドアーキテクチャ
一部の実施形態では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするｍＲＮＡを含む本開示のポリヌクレオチドは、ＩＶＴポリヌクレオチドである。慣例では、ｍＲＮＡ分子の基本的構成要素には、少なくともコード領域、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、５’キャップ、及びポリ－Ａテールが含まれる。本開示のＩＶＴポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして機能し得るが、例えば、核酸ベースの治療薬を使用した有効なポリペプチド産生の既存の問題を克服する役目を果たすそれらの機能的及び／または構造的設計特徴において、野生型ｍＲＮＡとは区別される。
ＩＶＴポリヌクレオチドの一次構築物は、第１の隣接領域及び第２の隣接領域が隣接する、連結されたヌクレオチドの第１の領域を含む。この第１の領域には、コードされた治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子が含まれ得るが、これらに限定されない。第１の隣接領域は、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えば、ポリペプチドの天然５’ＵＴＲ、または限定されないが、異種５’ＵＴＲもしくは合成５’ＵＴＲ等の非天然５’ＵＴＲをコードする核酸のうちのいずれかの５’ＵＴＲとして機能する、連結されたヌクレオシドの配列を含み得る。治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするＩＶＴは、その５末端に、１つまたは複数のシグナル配列をコードするシグナル配列領域を含み得る。隣接領域は、１つまたは複数の完全または不完全な５’ＵＴＲ配列を含む、連結されたヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域はまた、５’末端キャップも含み得る。第２の隣接領域は、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子の天然３’ＵＴＲ、あるいは限定されないが、異種３’ＵＴＲまたは合成３’ＵＴＲ等の非天然３’ＵＴＲをコードし得る１つまたは複数の完全または不完全な３’ＵＴＲを含む、連結されたヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域はまた、３’テーリング配列も含み得る。３’テーリング配列は、ポリＡテール、ポリＡ－Ｇカルテット、及び／またはステムループ配列であり得るが、これらに限定されない。
ＩＶＴポリヌクレオチドアーキテクチャの追加の例示的な特徴は、２０１７年５月１８日に出願された国際ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１７／２０１３２５号に開示され、同文献の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ
ＵＴＲは、ポリヌクレオチドにおけるコード領域に対して同種または異種であり得る。一部の実施形態では、ＵＴＲは、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするＯＲＦに対して同種である。一部の実施形態では、ＵＴＲは、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするＯＲＦに対して異種である。
一部の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、２つ以上の５’ＵＴＲまたはそれらの機能的断片を含み、これらの各々は、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、２つ以上の３’ＵＴＲまたはそれらの機能的断片を含み、これらの各々は、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせは、配列最適化される。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも１つの化学修飾核酸塩基、例えば、Ｎ１－メチルシュードウラシルまたは５－メトキシウラシルを含む。
ＵＴＲは、制御的役割、例えば、増加もしくは減少した安定性、局在化、及び／または翻訳効率を提供する特徴を有し得る。ＵＴＲを含むポリヌクレオチドを細胞、組織、または生物に投与することができ、通例の方法を使用して１つまたは複数の制御的特徴を測定することができる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの機能的断片は、それぞれ完全長の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲの１つまたは複数の制御的特徴を含む。
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始において役割を果たす特徴をもつ。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般的に知られているコザック配列のようなシグネチャを保有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧ（配列番号１５７）を有し、配列中、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニンまたはグアニン）であり、開始コドンの後には別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲはまた、伸長因子の結合に関与する二次構造を形成することが知られている。
特定の標的臓器の豊富に発現する遺伝子に典型的に見出される特徴を操作することによって、ポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質産生を強化することができる。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子等の肝臓で発現するｍＲＮＡの５’ＵＴＲを導入することで、肝細胞株または肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を強化することができる。同様に、他の組織特異的ｍＲＮＡからの５’ＵＴＲを使用してその組織における発現を改善することが、筋肉で（例えば、ＭｙｏＤ、Ｍｙｏｓｉｎ、Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ、Ｍｙｏｇｅｎｉｎ、Ｈｅｒｃｕｌｉｎ）、内皮細胞で（例えば、Ｔｉｅ－１、ＣＤ３６）、骨髄系細胞で（例えば、Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ－１、ｉ－ＮＯＳ）、白血球で（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織で（例えば、ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）、及び肺上皮細胞で（例えば、ＳＰ－Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）可能である。
一部の実施形態では、ＵＴＲは、転写物のタンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する転写物のファミリーから選択される。例えば、コードされたポリペプチドは、特定の細胞、組織で、または発生中の何らかの時点で発現する、あるファミリーのタンパク質（すなわち、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する）に属することができる。遺伝子またはｍＲＮＡのうちのいずれかからのＵＴＲを、同じまたは異なるファミリーのタンパク質の任意の他のＵＴＲと交換して、新たなポリヌクレオチドを作出することができる。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、異種であり得る。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、３’ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。
権利が共有された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１５２２号（公開第ＷＯ／２０１４／１６４２５３号（参照によりその全体が本明細書に援用される））は、本発明のポリヌクレオチドにおいてＯＲＦの隣接領域として利用され得る例示的なＵＴＲの一覧を提供する。
この出願の例示的なＵＴＲには、グロビン、例えば、α－またはβ－グロビン（例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ、マウス、ウサギ、またはヒトグロビン）；強力なコザック翻訳開始シグナル；ＣＹＢＡ（例えば、ヒトシトクロムｂ－２４５ αポリペプチド）；アルブミン（例えば、ヒトアルブミン７）；ＨＳＤ１７Ｂ４（ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ）；ウイルス（例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デング熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１））、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルス、またはＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス）；熱ショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０）；翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４Ｇ）；グルコース輸送体（例えば、ｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコース輸送体１））；アクチン（例えば、ヒトαまたはβアクチン）；ＧＡＰＤＨ；チューブリン；ヒストン；クエン酸回路酵素；トポイソメラーゼ（例えば、５’ＴＯＰ（オリゴピリミジントラクト）モチーフを欠いたＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ）；リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ ３２（Ｌ３２）；リボソームタンパク質（例えば、ヒトまたはマウスリボソームタンパク質、例えば、ｒｐｓ９等）；ＡＴＰ合成酵素（例えば、ミトコンドリアＨ＋－ＡＴＰ合成酵素のＡＴＰ５Ａ１またはβサブユニット）；成長ホルモン（例えば、ウシ（ｂＧＨ）またはヒト（ｈＧＨ））；伸長因子（例えば、伸長因子１ α１（ＥＥＦ１Ａ１））；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）；筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）；β－Ｆ１－ＡＴＰａｓｅ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）；コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、アルファ２（Ｃｏｌ１Ａ２）、Ｉ型コラーゲン、アルファ１（Ｃｏｌ１Ａ１）、ＶＩ型コラーゲン、アルファ２（Ｃｏｌ６Ａ２）、ＶＩ型コラーゲン、アルファ１（Ｃｏｌ６Ａ１））；リボホリン（例えば、リボホリンＩ（ＲＰＮＩ））；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（例えば、ＬＲＰ１）；カルジオトロフィン様サイトカイン因子（例えば、Ｎｎｔ１）；カルレチクリン（Ｃａｌｒ）；プロコラーゲン－リジン、２－オキソグルタール酸５－ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）；及びヌクレオバインディン（例えば、Ｎｕｃｂ１）の核酸配列に由来する１つまたは複数の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲが含まれるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、β－グロビン５’ＵＴＲ；強力なコザック翻訳開始シグナルを含有する５’ＵＴＲ；シトクロムｂ－２４５ αポリペプチド（ＣＹＢＡ）５’ＵＴＲ；ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ１７Ｂ４）５’ＵＴＲ；タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲ；ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＴＥＥＶ）５’ＵＴＲ；非構造タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５’近位オープンリーディングフレーム；デング熱ウイルス（ＤＥＮ）５’ＵＴＲ；熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）５’ＵＴＲ；ｅＩＦ４Ｇ ５’ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１ ５’ＵＴＲ；それらの機能的断片及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、β－グロビン３’ＵＴＲ；ＣＹＢＡ ３’ＵＴＲ；アルブミン３’ＵＴＲ；成長ホルモン（ＧＨ）３’ＵＴＲ；ＶＥＥＶ ３’ＵＴＲ；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）３’ＵＴＲ；α－グロビン３’ＵＴＲ；ＤＥＮ ３’ＵＴＲ；ＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ－ＰＡＶ）３’ＵＴＲ；伸長因子１ α１（ＥＥＦ１Ａ１）３’ＵＴＲ；マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）３’ＵＴＲ；ミトコンドリアＨ（＋）－ＡＴＰ合成酵素のβサブユニット（β－ｍＲＮＡ）３’ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１ ３’ＵＴＲ；ＭＥＦ２Ａ ３’ＵＴＲ；β－Ｆ１－ＡＴＰａｓｅ ３’ＵＴＲ；それらの機能的断片及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
任意の遺伝子またはｍＲＮＡに由来する野生型ＵＴＲが、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。一部の実施形態では、ＵＴＲを、例えば、ＯＲＦに対するＵＴＲの配向もしくは位置を変更することによって、または追加のヌクレオチドの組み込み、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転位によって、野生型または天然ＵＴＲに対して改変して、バリアントＵＴＲを生産することができる。一部の実施形態では、５’または３’ＵＴＲのバリアント、例えば、野生型ＵＴＲの変異体、または１つもしくは複数のヌクレオチドがＵＴＲの末端に付加されるもしくはそこから除去されるバリアントを利用することができる。
追加として、１つまたは複数の合成ＵＴＲを１つまたは複数の非合成ＵＴＲと組み合わせて使用することができる。例えば、Ｍａｎｄａｌ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３ ８（３）：５６８－８２を参照されたく、同文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。
ＵＴＲまたはその一部分は、それらが選択された転写物の場合と同じ配向で配置され得るか、または配向もしくは位置を改変することができる。よって、５’及び／または３’ＵＴＲは、反転、短縮、延長されるか、または１つもしくは複数の他の５’ＵＴＲもしくは３’ＵＴＲと組み合わせることができる。
一部の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、複数のＵＴＲ、例えば、二重、三重、または四重５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含む。例えば、二重ＵＴＲは、直列でまたは実質的に直列でのいずれかで同じＵＴＲの２つのコピーを含む。例えば、二重ベータ－グロビン３’ＵＴＲを使用することができる（ＵＳ２０１０／０１２９８７７を参照されたく、同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に、例えば、表５に開示されるＵＴＲのうちのいずれかから選択される５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む。
Figure 2023526059000090
Figure 2023526059000091
Figure 2023526059000092
Figure 2023526059000093
Figure 2023526059000094
Figure 2023526059000095
Figure 2023526059000096
ある特定の実施形態では、本発明の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ配列は、表５で提供される配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、表５で提供される配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、表５で提供される配列に対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするポリヌクレオチドは、表５で提供される５’ＵＴＲの配列、またはそれに対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の同一性を有する配列を有する５’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、もしくは１５２のうちのいずれか１つの配列、またはそれに対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の同一性を有する配列を含む５’ＵＴＲを含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド、例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするポリヌクレオチドは、表５で提供される３’ＵＴＲの配列、またはそれに対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の同一性を有する配列を有する３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、該ポリヌクレオチドは、配列番号９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、もしくは１３２のうちのいずれか１つの配列、またはそれに対して少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の同一性を有する配列を含む３’ＵＴＲを含む。
本発明のポリヌクレオチドは、特徴の組み合わせを含み得る。例えば、ＯＲＦには、強力なコザック翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ及び／またはポリ－Ａテールの鋳型依存性付加（ｔｅｍｐｌａｔｅｄ ａｄｄｉｔｉｏｎ）のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含む３’ＵＴＲが隣接し得る。５’ＵＴＲは、同じ及び／または異なるＵＴＲからの第１のポリヌクレオチド断片及び第２のポリヌクレオチド断片を含み得る（例えば、ＵＳ２０１０／０２９３６２５を参照されたい（参照によりその全体が本明細書に援用される））。
他の非ＵＴＲ配列を本発明のポリヌクレオチド内の領域または部分領域として使用することができる。例えば、イントロンまたはイントロン配列の一部分が、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質産生ならびにポリヌクレオチド発現レベルを増加させ得る。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＴＲの代わりにまたはそれに加えて内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む（例えば、Ｙａｋｕｂｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０ ３９４（１）：１８９－１９３を参照されたく、同文献の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ配列の代わりにＩＲＥＳを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＯＲＦ及びウイルスカプシド配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、非合成３’ＵＴＲと組み合わせて合成５’ＵＴＲを含む。
一部の実施形態では、ＵＴＲはまた、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、翻訳エンハンサーエレメント（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔ）、または翻訳エンハンサーエレメント（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）（総称的に「ＴＥＥ」、これはポリヌクレオチドから産生されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる核酸配列を指す）も含み得る。非限定的な例として、ＴＥＥは、転写プロモーターと開始コドンとの間に位置し得る。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＴＥＥを含む。
一態様では、ＴＥＥは、限定されないが、キャップ依存性またはキャップ非依存的翻訳等の、核酸の翻訳活性を促進することができるＵＴＲ内の保存されたエレメントである。
５’キャップを有する領域
本開示はまた、５’キャップ及び本発明のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドも含む。
天然ｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外搬出に関与して、ｍＲＮＡ安定性を増加させ、ｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）（これはＣＢＰがポリ（Ａ）結合タンパク質と会合して、成熟した環状ｍＲＮＡ種を形成することにより、細胞内のｍＲＮＡ安定性及び翻訳能力を担う）に結合する。キャップはさらに、ｍＲＮＡスプライシング中に５’近位イントロンの除去を補助する。
内因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端がキャップ付加されて、末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端の転写センスヌクレオチドとの間に５’－ｐｐｐ－５’－三リン酸結合を生成し得る。次いで、この５’－グアニル酸キャップがメチル化されて、Ｎ７－メチル－グアニル酸残基を生成し得る。ｍＲＮＡの５’末端の末端及び／または末端前（ａｎｔｅ－ｔｅｒｍｉｎａｌ）転写ヌクレオチドのリボース糖もまた、任意選択で、２’－Ｏ－メチル化され得る。加水分解による５’－キャップ除去及びグアニル酸キャップ構造の切断は、分解に向けてｍＲＮＡ分子等の核酸分子を標的とすることができる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ部分を組み込む。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ除去を阻止し、ひいてはｍＲＮＡ半減期を増加させる、非加水分解性キャップ構造を含む。キャップ構造の加水分解は、５’－ｐｐｐ－５’ホスホロジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｅｓｔｅｒ）結合の切断を必要とするため、キャップ付加反応中に修飾ヌクレオチドが使用され得る。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）からのワクシニアキャップ付加酵素を、製造業者の説明書に従ってα－チオ－グアノシンヌクレオチドとともに使用して、５’－ｐｐｐ－５’キャップにホスホロチオエート結合を作出することができる。α－メチル－ホスホン酸ヌクレオチド及びセレノリン酸ヌクレオチド等の追加の修飾グアノシンヌクレオチドを使用することができる。
追加の修飾には、ポリヌクレオチドの５’末端及び／または５’末端前ヌクレオチドのリボース糖の、糖環の２’－ヒドロキシル基上での２’－Ｏ－メチル化（上述した通り）が含まれるが、これらに限定されない。複数の別々の５’－キャップ構造を使用して、ｍＲＮＡ分子として機能するポリヌクレオチド等の核酸分子の５’－キャップを生成することができる。本明細書で合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構造的もしくは機能的キャップ類似体とも称される、キャップ類似体は、キャップ機能を保持しつつも、天然（すなわち、内因性、野生型、または生理学的）５’－キャップとはそれらの化学構造が異なる。キャップ類似体は、本発明のポリヌクレオチドに化学的に（すなわち、非酵素的に）または酵素的に合成及び／または連結され得る。
例えば、アンチリバースキャップ類似体（Ａｎｔｉ－Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ）（ＡＲＣＡ）キャップは、５’－５’－三リン酸基によって連結された２つのグアニンを含有し、ここで、一方のグアニンは、Ｎ７メチル基及び３’－Ｏ－メチル基を含有する（すなわち、Ｎ７，３’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン（ｍ７Ｇ－３’ｍｐｐｐ－Ｇ；これは同等に３’Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇと表記され得る））。他方の未修飾グアニンの３’－Ｏ原子は、キャップ付加ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに連結されるようになる。Ｎ７－メチル化及び３’－Ｏ－メチル化グアニンは、キャップ付加ポリヌクレオチドの末端部分を提供する。
別の例示的なキャップはｍＣＡＰであり、これはＡＲＣＡに類似しているが、グアノシン上に２’－Ｏ－メチル基を有する（すなわち、Ｎ７，２’－Ｏ－ジメチル－グアノシン－５’－三リン酸－５’－グアノシン、ｍ７Ｇｍ－ｐｐｐ－Ｇ）。
一部の実施形態では、キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体である。非限定的な例として、ジヌクレオチドキャップ類似体は、米国特許第ＵＳ８，５１９，１１０号（同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されるジヌクレオチドキャップ類似体等、異なるリン酸位置にて、ボラノリン酸基またはホスホロセレノエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｓｅｌｅｎｏａｔｅ）基で修飾され得る。
別の実施形態では、キャップは、当該技術分野で既知及び／または本明細書に記載のキャップ類似体のＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態である、キャップ類似体である。キャップ類似体のＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）置換ジヌクレオチド形態の非限定的な例としては、Ｎ７－（４－クロロフェノキシエチル）－Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ及びＮ７－（４－クロロフェノキシエチル）－ｍ３’－ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体が挙げられる（例えば、Ｋｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１３ ２１：４５７０－４５７４に記載される種々のキャップ類似体及びキャップ類似体の合成方法を参照されたく、同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。別の実施形態では、本発明のキャップ類似体は、４－クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体である。
キャップ類似体は、ポリヌクレオチドまたはその領域の同時に起こるキャップ付加を許容するが、インビトロ転写反応では、最大２０％の転写物がキャップ付加されないままである可能性がある。このこと、ならびに内因性の細胞転写機構によって生産される核酸の内因性５’－キャップ構造とのキャップ類似体の構造的差異は、低減された翻訳能力及び低減された細胞安定性につながる可能性がある。
本発明のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）はまた、酵素を使用して、製造後（ＩＶＴまたは化学合成を問わず）にキャップ付加して、より真正の５’－キャップ構造を生成することもできる。本明細書で使用されるとき、「より真正の」という語句は、構造的にまたは機能的にのいずれかで、内因性または野生型の特徴を厳密に反映または模倣する特徴を指す。つまり、「より真正の」特徴は、先行技術の合成的特徴もしくは類似体等と比較して内因性、野生型、天然、もしくは生理学的な細胞機能及び／もしくは構造をよりよく表すか、または１つもしくは複数の点で対応する内因性、野生型、天然、もしくは生理学的特徴よりも優れている。本発明のより真正の５’キャップ構造の非限定的な例は、当該技術分野で既知の合成５’キャップ構造（または野生型、天然、もしくは生理学的５’キャップ構造）と比較して、とりわけ、キャップ結合タンパク質の結合が強化されたもの、半減期が増加したもの、５’エンドヌクレアーゼへの感受性が低減されたもの、及び／または５’キャップ除去が低減されたものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャップ付加酵素及び組換え２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に古典的５’－５’－三リン酸結合を作出することができ、ここで、キャップグアニンは、Ｎ７メチル化を含有し、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルを含有する。かかる構造は、キャップ１構造と称される。このキャップは、例えば、当該技術分野で既知の他の５’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳能力及び細胞安定性、ならびに細胞炎症促進性サイトカインの活性化の低減をもたらす。キャップ構造には、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、及び７ｍＧ（５’）－ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が含まれるが、これらに限定されない。
非限定的な例として、製造後のキメラポリヌクレオチドのキャップ付加は、ほぼ１００％のキメラポリヌクレオチドがキャップ付加され得るため、より効率的であり得る。これは、キャップ類似体がインビトロ転写反応中にキメラポリヌクレオチドに連結される場合の約８０％の効率と対照的である。
本発明によれば、５’末端キャップには、内因性キャップまたはキャップ類似体が含まれ得る。本発明によれば、５’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体には、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、及び２－アジド－グアノシンが含まれるが、これらに限定されない。
ポリＡテール
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ポリ－Ａテールをさらに含む。さらなる実施形態では、安定化のためにポリ－Ａテール上の末端基が組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリ－Ａテールは、デス－３’ヒドロキシルテールを含む。
ＲＮＡプロセシング中に、アデニンヌクレオチドの長鎖（ポリ－Ａテール）をｍＲＮＡ分子等のポリヌクレオチドに付加して、安定性を増加させることができる。転写直後に、転写物の３’末端が切断されて、３’ヒドロキシルを遊離させ得る。次いで、ポリ－Ａポリメラーゼが、アデニンヌクレオチドの鎖をＲＮＡに付加する。ポリアデニル化と呼ばれるこのプロセスは、例えば、およそ８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０残基長を含む、およそ８０からおよそ２５０残基長であり得る、ポリ－Ａテールを付加する。一実施形態では、ポリ－Ａテールは、１００ヌクレオチド長である（配列番号８４）。
Figure 2023526059000097
ポリＡテールはまた、構築物が核から搬出された後に付加することもできる。
本発明によれば、安定化のためにポリＡテール上の末端基が組み込まれ得る。本発明のポリヌクレオチドは、デス－３’ヒドロキシルテールを含み得る。それらはまた、Ｊｕｎｊｉｅ Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．により教示されるような構造部分または２’－Ｏメチル修飾も含み得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，１５０１－１５０７，Ａｕｇｕｓｔ ２３，２００５（同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される））。
本発明のポリヌクレオチドは、ヒストンｍＲＮＡを含む代替のポリＡテール構造を有する転写物をコードするように設計され得る。Ｎｏｒｂｕｒｙによれば、「末端ウリジル化もまた、ヒト複製依存性ヒストンｍＲＮＡ上で検出されている。これらのｍＲＮＡの代謝回転は、染色体ＤＮＡ複製の完了または阻害に次ぐ毒性の可能性があるヒストン蓄積の阻止に重要であると考えられている。これらのｍＲＮＡは、それらに３’ポリ（Ａ）テールが欠如していることで区別され、その機能は、代わりに、安定なステム－ループ構造及びその同系のステム－ループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）によって引き受けられ、このうち後者は、ポリアデニル化ｍＲＮＡ上のＰＡＢＰの機能と同じ機能を実行する」（Ｎｏｒｂｕｒｙ，“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ＲＮＡ：ａ ｃａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｉｌ ｗａｇｇｉｎｇ ｔｈｅ ｄｏｇ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ；ＡＯＰ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２９ Ａｕｇｕｓｔ ２０１３；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）（同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
固有のポリ－Ａテール長は、本発明のポリヌクレオチドに、ある特定の利点を提供する。一般に、存在する場合、ポリ－Ａテールの長さは、３０ヌクレオチド長を超える。別の実施形態では、ポリ－Ａテールは、３５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチドであるか、またはそれらを超える）。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはその領域は、約３０～約３，０００ヌクレオチド（例えば、３０～５０、３０～１００、３０～２５０、３０～５００、３０～７５０、３０～１，０００、３０～１，５００、３０～２，０００、３０～２，５００、５０～１００、５０～２５０、５０～５００、５０～７５０、５０～１，０００、５０～１，５００、５０～２，０００、５０～２，５００、５０～３，０００、１００～５００、１００～７５０、１００～１，０００、１００～１，５００、１００～２，０００、１００～２，５００、１００～３，０００、５００～７５０、５００～１，０００、５００～１，５００、５００～２，０００、５００～２，５００、５００～３，０００、１，０００～１，５００、１，０００～２，０００、１，０００～２，５００、１，０００～３，０００、１，５００～２，０００、１，５００～２，５００、１，５００～３，０００、２，０００～３，０００、２，０００～２，５００、及び２，５００～３，０００）を含む。
一部の実施形態では、ポリ－Ａテールは、全体的なポリヌクレオチドの長さまたはポリヌクレオチドの特定の領域の長さに比例して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さに基づくか、またはポリヌクレオチドから発現される最終産物の長さに基づくことができる。
この文脈において、ポリ－Ａテールは、長さが、ポリヌクレオチドまたはその特徴よりも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長いことが可能である。ポリ－Ａテールはまた、それが属するポリヌクレオチドの分率として設計することもできる。この文脈において、ポリ－Ａテールは、構築物、構築物領域の全長、またはポリ－Ａテールを差し引いた構築物の全長の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０％、またはそれよりも長いことが可能である。さらに、導入操作された結合部位及びポリ－Ａ結合タンパク質のためのポリヌクレオチドのコンジュゲーションにより、発現を強化することができる。
追加として、複数の別々のポリヌクレオチドを、ポリ－Ａテールの３’末端で修飾ヌクレオチドを使用して、３’末端へＰＡＢＰ（ポリ－Ａ結合タンパク質）を介して一緒に連結することができる。関連する細胞株においてトランスフェクション実験を実施することができ、トランスフェクション後１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、及び７日目でタンパク質産生をＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリＡ－Ｇカルテット領域を含むように設計される。Ｇ－カルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方においてＧリッチ配列によって形成され得る、環状の水素結合した４つのグアニンヌクレオチドのアレイである。この実施形態では、Ｇ－カルテットは、ポリ－Ａテールの末端にて組み込まれる。結果として得られるポリヌクレオチドは、種々の時点で安定性、タンパク質産生、及び半減期を含めた他のパラメータに関してアッセイされる。ポリＡ－Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチドのポリ－Ａテールのみ（配列番号１５３）を使用して見られるタンパク質産生の少なくとも７５％に相当する、ｍＲＮＡからのタンパク質産生をもたらすことが発見されている。
Figure 2023526059000098
開始コドン領域
本発明はまた、開始コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドも含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似しているか、またはそのように機能する領域を有することができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧではないコドンで開始することができる。ポリヌクレオチドの翻訳は、限定されないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧ等の代替の開始コドンで開始することができる（Ｔｏｕｒｉｏｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ ９５（２００３）１６９－１７８及びＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたく、同文献の各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドンＡＣＧで始まる。別の非限定的な例として、ポリヌクレオチド翻訳は、代替の開始コドンＣＴＧまたはＣＵＧで始まる。別の非限定的な例として、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドンＧＴＧまたはＧＵＧで始まる。
限定されないが、開始コドンまたは代替の開始コドン等の翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ、及び／または構造に影響を及ぼすことが知られている（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１を参照されたく、同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのうちのいずれかのマスキングを使用して、ポリヌクレオチドの翻訳開始の位置、翻訳効率、長さ、及び／または構造を改変することができる。
一部の実施形態では、開始コドンまたは代替の開始コドンの近くでマスキング剤を使用して、コドンをマスクまたは隠して、マスクされた開始コドンまたは代替の開始コドンでの翻訳開始の確率を低減することができる。マスキング剤の非限定的な例としては、アンチセンスロックト核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチド及びエクソン接合部複合体（ＥＪＣ）が挙げられる（例えば、マスキング剤であるＬＮＡポリヌクレオチド及びＥＪＣについて記載しているＭａｔｓｕｄａ ａｎｄ Ｍａｕｒｏ（ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１０ ５：１１）を参照されたく、同文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
別の実施形態では、マスキング剤を使用して、ポリヌクレオチドの開始コドンをマスクして、代替の開始コドンで翻訳が開始する見込みを増加させることができる。一部の実施形態では、マスキング剤を使用して、最初の開始コドンまたは代替の開始コドンをマスクして、マスクされた開始コドンまたは代替の開始コドンの下流の開始コドンまたは代替の開始コドンで翻訳が開始する機会を増加させることができる。
一部の実施形態では、開始コドンまたは代替の開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位に対する完全な相補鎖内に位置し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な相補鎖は、マスキング剤と同様に、ポリヌクレオチドの翻訳、長さ、及び／または構造を制御するのに役立ち得る。非限定的な例として、開始コドンまたは代替の開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な相補鎖の中間に位置し得る。開始コドンまたは代替の開始コドンは、第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチド、第３のヌクレオチド、第４のヌクレオチド、第５のヌクレオチド、第６のヌクレオチド、第７のヌクレオチド、第８のヌクレオチド、第９のヌクレオチド、第１０のヌクレオチド、第１１のヌクレオチド、第１２のヌクレオチド、第１３のヌクレオチド、第１４のヌクレオチド、第１５のヌクレオチド、第１６のヌクレオチド、第１７のヌクレオチド、第１８のヌクレオチド、第１９のヌクレオチド、第２０のヌクレオチド、または第２１のヌクレオチドの後に位置し得る。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの開始コドンをポリヌクレオチド配列から除去して、ポリヌクレオチドの翻訳が開始コドンではないコドンで始まるようにすることができる。ポリヌクレオチドの翻訳は、除去された開始コドンに続くコドン、または下流の開始コドンもしくは代替の開始コドンで始まることができる。非限定的な例では、下流の開始コドンまたは代替の開始コドンで翻訳を開始させるために、開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧがポリヌクレオチド配列の最初の３ヌクレオチドとして除去される。開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列は、翻訳の開始、ポリヌクレオチドの長さ、及び／またはポリヌクレオチドの構造を制御するまたは制御しようとするために、下流の開始コドン及び／または代替の開始コドンに対する少なくとも１つのマスキング剤をさらに含み得る。
終止コドン領域
本発明はまた、終止コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドも含む。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の前に少なくとも２つの終止コドンを含み得る。終止コドンは、ＤＮＡの場合はＴＧＡ、ＴＡＡ、及びＴＡＧから、またはＲＮＡの場合はＵＧＡ、ＵＡＡ、及びＵＡＧから選択され得る。一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合は終止コドンＴＧＡ、またはＲＮＡの場合は終止コドンＵＧＡ、及び１つの追加の終止コドンを含む。さらなる実施形態では、追加の終止コドンは、ＴＡＡまたはＵＡＡであり得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３つの連続した終止コドン、４つの終止コドン、またはそれよりも多くを含む。
プロテアーゼ切断部位またはＩＲＥＳ
本発明はまた、プロテアーゼ切断部位または配列内リボソーム進入部位を含むポリヌクレオチドも含む。一部の実施形態では、本開示のＬＮＰ組成物またはシステムは、（ａ）（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびに（ｂ）（１）エフェクター分子、及び（２）結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、同じポリヌクレオチドに配置される。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、プロテアーゼ切断部位、例えば、Ｔ２Ａ部位もしくはＰ２Ａ部位もしくはＥ２Ａ部位、またはＴＰＥ（Ｐ２Ａ－Ｔ２Ａ－Ｅ２Ａ）、または他の既知のプロテアーゼ切断部位によって分離される。
一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドは、ＩＲＥＳによって分離される。
ポリヌクレオチドの作製方法
本開示はまた、本明細書に開示されるポリヌクレオチドまたはその相補鎖の作製方法も提供する。一部の態様では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、インビトロ転写を使用して構築することができる。
他の態様では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用した化学合成によって構築することができる。他の態様では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、宿主細胞を使用することによって作製される。ある特定の態様では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＶＴ、化学合成、宿主細胞発現、または当該技術分野で既知の任意の他の方法の１つまたは複数の組み合わせによって作製される。
天然型ヌクレオシド、非天然型ヌクレオシド、またはそれらの組み合わせは、候補ヌクレオチド配列に存在する天然型ヌクレオシドを全体的または部分的に置き換えることができ、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする配列最適化されたヌクレオチド配列（例えば、ｍＲＮＡ）に組み込むことができる。次いで、結果として得られるｍＲＮＡを、それらがタンパク質を産生する及び／または治療成果を生み出す能力に関して検査することができる。
本明細書に開示されるポリヌクレオチドの例示的な作製方法には、２０１７年５月１８日に出願された国際ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１７／２０１３２５号に開示されるインビトロ転写の酵素的合成及び化学合成が挙げられ、同文献の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
精製
他の態様では、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、精製され得る。本明細書に記載の治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の精製は、ポリヌクレオチドクリーンアップ、品質保証及び品質管理を含み得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、限定されないが、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリ－Ｔビーズ、ＬＮＡＴＭオリゴ－Ｔ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）等の当該技術分野で既知の方法、または限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）等のＨＰＬＣベースの精製方法によって実施することができる。「精製ポリヌクレオチド」等、ポリヌクレオチドに関連して使用されるときの「精製」という用語は、少なくとも１つの夾雑物から分離されているポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるとき、「夾雑物」とは、別の物質を不適当、不純、または劣るものにする任意の物質である。故に、精製ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが自然界で見出されるものとは異なる形態もしくは環境、またはそれを処理もしくは精製方法に供する前に存在していたものとは異なる形態もしくは環境に存在する。
一部の実施形態では、本開示の治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の精製は、不純物を除去し、これにより望まれない免疫応答が低減または除去され得る（例えば、サイトカイン活性の低減）。
一部の実施形態では、本開示の治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を使用して、投与前に精製される。一部の実施形態では、本明細書に開示される治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））で精製されたポリヌクレオチドは、異なる精製方法によって精製された治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードするポリヌクレオチドと比較して、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子の発現を増加させる。
一部の実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））で精製されたポリヌクレオチドは、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする。一部の実施形態では、精製されたポリヌクレオチドは、治療ペイロードもしくは予防ペイロード、エフェクター分子及び／またはテザー分子をコードする。
一部の実施形態では、精製ポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約８５％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９６％純粋、少なくとも約９７％純粋、少なくとも約９８％純粋、少なくとも約９９％純粋、または約１００％純粋である。
品質保証及び／または品質管理チェックは、限定されないが、ゲル電気泳動、ＵＶ吸光度、または分析ＨＰＬＣ等の方法を使用して実施することができる。
別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、逆転写酵素－ＰＣＲを含むがこれらに限定されない方法によってシーケンシングすることができる。
ポリヌクレオチドの化学修飾
本開示は、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸等のＲＮＡ核酸）の修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドを可能にする。「ヌクレオシド」とは、有機塩基（例えば、プリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書で同じく「核酸塩基」と称される）と組み合わせて糖分子（例えば、ペントースまたはリボース）またはその誘導体を含有する化合物を指す。「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾ヌクレオチドは、１つまたは複数の修飾または非天然ヌクレオシドを含むように、例えば、化学的、酵素的、または組換え等の、任意の有用な方法によって合成されてもよい。核酸は、連結されたヌクレオシドの領域（単数または複数）を含み得る。かかる領域は、可変の骨格結合を有してもよい。この結合は、標準的なホスホジエステル結合であり得、その場合、核酸は、ヌクレオチドの領域を含むことになろう。
修飾ヌクレオチド塩基対合は、標準的なアデノシン－チミン、アデノシン－ウラシル、またはグアノシン－シトシン塩基対だけでなく、ヌクレオチド及び／または非標準塩基もしくは修飾塩基を含む修飾ヌクレオチド間で形成される塩基対もまた包含し、ここで、水素結合ドナー及び水素結合アクセプターの配置構成が、例えば、少なくとも１つの化学修飾を有する核酸等において、非標準塩基と標準塩基との間、または２つの相補的な非標準塩基構造間の水素結合を可能にする。かかる非標準塩基対合の一例は、修飾ヌクレオチドイノシンと、アデニン、シトシン、またはウラシルとの間の塩基対合である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせが、本開示の核酸に組み込まれてもよい。
一部の実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸等のＲＮＡ核酸）における修飾核酸塩基は、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）、１－エチル－シュードウリジン（ｅ１ψ）、５－メトキシ－ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５－メチル－シチジン（ｍ５Ｃ）、及び／またはシュードウリジン（ψ）を含む。一部の実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸等のＲＮＡ核酸）における修飾核酸塩基は、５－メトキシメチルウリジン、５－メチルチオウリジン、１－メトキシメチルシュードウリジン、５－メチルシチジン、及び／または５－メトキシシチジンを含む。一部の実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、化学修飾を含むがこれらに限定されない、前述の修飾核酸塩基のうちのいずれかの少なくとも２つ（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多く）の組み合わせを含む。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つもしくは複数または全てのウリジン位置にＮ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）置換を含む。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つもしくは複数または全てのウリジン位置にＮ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ψ）置換、及び核酸の１つもしくは複数または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つもしくは複数または全てのウリジン位置にシュードウリジン（ψ）置換を含む。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つもしくは複数または全てのウリジン位置にシュードウリジン（ψ）置換、及び核酸の１つもしくは複数または全てのシチジン位置に５－メチルシチジン置換を含む。
一部の実施形態では、本開示のＲＮＡ核酸は、核酸の１つもしくは複数または全てのウリジン位置にウリジンを含む。
一部の実施形態では、核酸（例えば、ｍＲＮＡ核酸等のＲＮＡ核酸）は、特定の修飾について均一に修飾される（例えば、完全に修飾される、配列全体を通して修飾される）。例えば、核酸は、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで均一に修飾され得、つまり、ｍＲＮＡ配列内の全てのウリジン残基が、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで置き換えられる。同様に、核酸は、上述した残基等の修飾残基との置き換えによって、配列内に存在する任意の種類のヌクレオシド残基について均一に修飾され得る。
本開示の核酸は、分子の全長に沿って部分的または完全に修飾されてもよい。例えば、本開示の核酸内、またはその既定の配列領域内（例えば、ポリＡテールを含むまたは除くｍＲＮＡ内）で、１つもしくは複数または全てのヌクレオチドあるいは所与の種類のヌクレオチド（例えば、プリンもしくはピリミジン、あるいはＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか１つもしくは複数または全て）が、均一に修飾されてもよい。一部の実施形態では、本開示の核酸内（またはその配列領域内）の全てのヌクレオチドＸは、修飾ヌクレオチドであり、ここで、Ｘは、ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃのうちのいずれか１つ、または組み合わせＡ＋Ｇ、Ａ＋Ｕ、Ａ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ、Ｇ＋Ｃ、Ｕ＋Ｃ、Ａ＋Ｇ＋Ｕ、Ａ＋Ｇ＋Ｃ、Ｇ＋Ｕ＋Ｃ、もしくはＡ＋Ｇ＋Ｃのうちのいずれか１つであり得る。
核酸は、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（全体的なヌクレオチド含量に関して、または１つもしくは複数の種類のヌクレオチド、すなわち、Ａ、Ｇ、Ｕ、もしくはＣのうちのいずれか１つもしくは複数に関してのいずれか）、または介在する任意のパーセンテージ（例えば、１％～２０％、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）の修飾ヌクレオチドを含有してもよい。任意の残りのパーセンテージは、未修飾Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣの存在によって占められることが理解されよう。
核酸は、最小１％かつ最大１００％の修飾ヌクレオチド、または介在する任意のパーセンテージ、例えば、少なくとも５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも１０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも２５％の修飾ヌクレオチド、少なくとも５０％の修飾ヌクレオチド、少なくとも８０％の修飾ヌクレオチド、もしくは少なくとも９０％の修飾ヌクレオチドを含有してもよい。例えば、核酸は、修飾ウラシルまたはシトシン等の修飾ピリミジンを含有してもよい。一部の実施形態では、核酸内の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは１００％のウラシルが、修飾ウラシルで置き換えられる（例えば、５置換ウラシル）。修飾ウラシルは、単一の固有の構造を有する化合物に置き換えられ得るか、または、異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多くの固有の構造）を有する複数の化合物に置き換えられ得る。一部の実施形態では、核酸内の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、もしくは１００％のシトシンが、修飾シトシンで置き換えられる（例えば、５置換シトシン）。修飾シトシンは、単一の固有の構造を有する化合物に置き換えられ得るか、または、異なる構造（例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多くの固有の構造）を有する複数の化合物に置き換えられ得る。
薬学的組成物
本開示は、本明細書に開示されるシステム、またはＬＮＰ組成物のうちのいずれか、例えば、（ａ）（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびに（ｂ）（１）エフェクター分子、及び（２）結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、システムまたはＬＮＰ組成物を含む、薬学的製剤を提供する。
本開示の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた組成物及び複合体に製剤化される。薬学的組成物は、任意選択で、１つまたは複数の追加の活性物質、例えば、治療上及び／または予防上活性な物質を含み得る。本開示の薬学的組成物は、滅菌及び／または発熱性物質不含であり得る。薬学的薬剤の製剤化及び／または製造における一般考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５に見出すことができる。
一部の実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的で、「活性成分」という語句は一般に、本明細書に記載されるように送達されるポリヌクレオチドを指す。
本明細書で提供される薬学的組成物の説明は、原則として、ヒトへの投与に好適な薬学的組成物を対象とするものの、かかる組成物は、一般に、任意の他の動物、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に好適であることが当業者には理解されよう。ヒトへの投与に好適な薬学的組成物を種々の動物への投与に好適なものとするための、組成物の修飾は、十分に理解されており、通常の知識を有する獣医薬理学者は、たとえあるとしても通例にすぎない実験により、かかる修飾を設計及び／または実施することができる。薬学的組成物の投与が企図される対象には、ヒト及び／または他の霊長類、哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病巣内、頭蓋内、脳室内、経口、吸入スプレー、経肺、局所、直腸、鼻腔、頬側、膣内、または埋め込みリザーバー、筋肉内、皮下、または皮内送達用に製剤化される。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、皮下または静脈内送達用に製剤化される。
本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学分野で既知の任意の、または今後開発される方法によって調製することができる。一般に、かかる調製方法は、活性成分を賦形剤及び／または１つもしくは複数の他の補助成分と会合させ、次いで、必要であれば及び／または望ましければ、生成物を所望の単回または複数回投与単位に分割、成形、及び／または包装するステップを含む。
本開示による薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の固有性、サイズ、及び／または状態に応じて、またさらに組成物が投与されることになる経路に応じて様々であろう。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５％～５０％、１％～３０％、５％～８０％、または少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
製剤及び送達
本開示のｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドは、１つまたは複数の賦形剤を使用して製剤化され得る。
１つまたは複数の賦形剤の機能は、例えば、（１）安定性を増加させる、（２）細胞トランスフェクションを増加させる、（３）持続放出もしくは遅延放出を可能にする（例えば、ポリヌクレオチドのデポー製剤から）、（４）体内分布を改変する（例えば、ポリヌクレオチドを特定の組織または細胞種に標的化する）、（５）コードされたタンパク質のインビボでの翻訳を増加させる、及び／または（６）コードされたタンパク質のインビボでの放出プロファイルを改変することである。ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル等の慣習的な賦形剤に加えて、本開示の分散補助剤または懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、賦形剤には、限定されないが、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植用）、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、及びそれらの組み合わせが含まれ得る。したがって、本開示の製剤には、１つまたは複数の賦形剤が、各々合わせてポリヌクレオチドの安定性を増加させる、ポリヌクレオチドによる細胞トランスフェクションを増加させる、ポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質の発現を増加させる、及び／またはポリヌクレオチドによりコードされたタンパク質の放出プロファイルを改変する量で含まれ得る。さらに、本開示のポリヌクレオチドは、自己組織化した核酸ナノ粒子を使用して製剤化され得る。
本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学分野で既知の任意の、または今後開発される方法によって調製することができる。一般に、かかる調製方法は、活性成分を賦形剤及び／または１つもしくは複数の他の補助成分と会合させるステップを含む。
本開示による薬学的組成物は、バルクで、単一の単位用量として、及び／または複数の単一の単位用量として調製、包装、及び／または販売され得る。本明細書で使用されるとき、「単位用量」とは、既定量の活性成分を含む薬学的組成物の個別的な量を指す。活性成分の量は、一般に、対象に投与される活性成分の投薬量及び／またはかかる投薬量の好都合な分数、例えば、かかる投薬量の２分の１もしくは３分の１等に等しい。
本開示による薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、処置されている対象の固有性、サイズ、及び／または状態に応じて、またさらに組成物が投与されることになる経路に応じて様々であり得る。例えば、組成物は、０．１％～９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば、０．５～５０％、１～３０％、５～８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の製剤は、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有する。非限定的な例として、製剤は、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのポリヌクレオチドを含有する。
薬学的製剤は、追加として薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、本明細書で使用されるとき、これには、所望の特定の剤形に適するような、ありとあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散補助剤または懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤等が含まれるが、これらに限定されない。薬学的組成物を製剤化するための種々の賦形剤、及び組成物を調製する技法は、当該技術分野で既知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６を参照されたい）。任意の従来の賦形剤媒体が、例えば、何らかの望ましくない生物学的効果を生み出すか、さもなければ薬学的組成物の任意の他の成分（複数可）と有害な様態で相互作用することによって、物質またはその誘導体と不適合性であり得る場合を除き、従来の賦形剤媒体の使用が本開示の範囲内で企図され得る。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子の粒径は、増加及び／または減少させられる。粒径の変化は、限定されないが炎症等の生物学的反応に対抗するのに役立つことができる可能性があるか、または哺乳動物に送達される修飾ｍＲＮＡの生物学的効果を増加させ得る。
薬学的組成物の製造において使用される薬学的に許容される賦形剤には、不活性希釈剤、表面活性剤及び／もしくは乳化剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤、ならびに／または油が含まれるが、これらに限定されない。かかる賦形剤を任意選択で本開示の薬学的製剤に含めることができる。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、コレステロール等の分子を隔離し得るナノ構造体で、もしくはそれとともに投与されるか、ナノ構造体に製剤化されるか、またはそれとともに送達される。これらのナノ構造体の非限定的な例及びこれらのナノ構造体の作製方法は、米国特許出願第ＵＳ２０１３０１９５７５９号に記載される。これらのナノ構造体の例示的な構造は、米国特許出願第ＵＳ２０１３０１９５７５９号に示され、コア及びコアを取り囲むシェルを含み得る。
本開示のｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して細胞に送達することができる。例えば、本開示のｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドは、脂質ベースの送達、例えば、トランスフェクション、またはエレクトロポレーションによって、細胞に送達することができる。
Figure 2023526059000099
Figure 2023526059000100
Figure 2023526059000101
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Figure 2023526059000104
Figure 2023526059000105
Figure 2023526059000106
Figure 2023526059000107
均等物及び範囲
当業者であれば、本明細書に記載される本開示による具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識するか、またはほんの日常的な実験を使用して確認することができる。本開示の範囲は、以下の説明に限定されることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲に記載されるようなものである。
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」等の冠詞は、反対の指示がない限り、または文脈から別途明らかでない限り、１つまたは１つよりも多くを意味し得る。群の１つまたは複数の成員間に「または（ｏｒ）」を含む請求項または説明は、反対の指示がない限り、または文脈から別途明らかでない限り、群の成員のうちの１つ、１つよりも多く、または全てが所与の生成物またはプロセスに存在するか、用いられるか、または別様にそれと関連性がある場合、満たされるとみなされる。本開示は、群の厳密に１つの成員が所与の生成物またはプロセスに存在するか、用いられるか、または別様にそれと関連性がある実施形態を含む。本開示は、群の成員のうちの１つよりも多く、または全てが所与の生成物またはプロセスに存在するか、用いられるか、または別様にそれと関連性がある実施形態を含む。
また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、開放形式であることが意図され、追加の要素またはステップの包含を許容するが、それを必要とするものではないことにも留意されたい。故に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が本明細書で使用されるとき、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語もまた包含及び開示される。
範囲が与えられている場合、端点が含まれる。さらに、別途指示されない限り、または文脈及び当業者の理解から別途明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、本開示の異なる実施形態において述べられる範囲内の任意の具体的な値または部分範囲を、範囲の下限の単位の１０分の１までとることができることを理解されたい。
全ての引用元、例えば、本明細書で引用される参照文献、刊行物、データベース、データベースエントリー、及び技術は、たとえ引用文に明示的に述べられていなくても、参照により本明細書に援用される。引用元及び本願の記述が矛盾する場合、本願の記述が優先するものとする。
本開示は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解される。しかしながら、それらは、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示目的のものにすぎないこと、ならびにそれらに照らして種々の修正または変更が当業者に示唆され、本願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきであることが理解される。
実施例１：ＬＮＰ組成物の生産
Ａ．ナノ粒子組成物の生産
治療薬及び／または予防薬の細胞への送達において使用するための安全で効果的なナノ粒子組成物を調査するために、様々な製剤を調製及び試験する。具体的には、ナノ粒子組成物の脂質成分中の特定の要素及びそれらの比率を最適化する。
ナノ粒子は、２つの流体流（このうちの一方は治療薬及び／または予防薬を含有し、他方は脂質成分を有する）のマイクロ流体力学及びＴ字型接合部での混合等の混合プロセスにより作製することができる。
脂質組成物は、溶媒、例えば、エタノール中、例えば、約５０ｍＭの濃度で、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）、（ＩＩｇ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ１）、（ＩＩＩａ２）、（ＩＩＩａ３）、（ＩＩＩａ４）、（ＩＩＩａ５）、（ＩＩＩａ６）、（ＩＩＩａ７）、もしくは（ＩＩＩａ８）に従った脂質、または非カチオン性ヘルパー脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬから入手可能なＤＯＰＥ、またはＤＳＰＣ等）、ＰＥＧ脂質（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬから入手可能な１，２ジミリストイルｓｎグリセロールメトキシポリエチレングリコール、別名、ＰＥＧ－ＤＭＧ等）、及び植物ステロール（任意選択でコレステロール等の構造脂質を含む）を組み合わせることによって調製される。溶液は、保管のために、例えば、－２０℃で冷蔵するべきである。所望のモル比を得るように脂質を組み合わせ（例えば、下記の表６を参照されたい）、水及びエタノールで、例えば、約５．５ｍＭ～約２５ｍＭの最終脂質濃度まで希釈する。表６の植物ステロール＊は、植物ステロール、または任意選択でベータ－植物ステロール及びコレステロール等の植物ステロール及び構造脂質の組み合わせを指す。
Figure 2023526059000108
治療薬及び／または予防薬と脂質成分とを含むナノ粒子組成物は、脂質溶液と治療薬及び／または予防薬を含む溶液とを、約５：１～約５０：１の脂質成分対治療薬及び／または予防薬の重量：重量比で組み合わせることによって調製する。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロ流体ベースシステムを使用して、脂質溶液を約１０ｍｌ／分～約１８ｍｌ／分の流速で治療薬及び／または予防薬の溶液に迅速に注入して、約１：１～約４：１の水対エタノール比を有する懸濁液を得る。
ＲＮＡを含むナノ粒子組成物に関しては、脱イオン水中０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のＲＮＡの溶液を緩衝液、例えば、ｐＨ３～４の５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液中で希釈して、原液を形成させる。
ナノ粒子組成物を透析によって処理して、エタノールを除去し、緩衝液交換を達成することができる。製剤を、１０ｋＤａの分子量カットオフを用いたＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒカセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、一次生成物の２００倍の体積でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）に対して２回透析する。１回目の透析は、室温で３時間実施する。次いで、製剤を４℃で一晩透析する。得られたナノ粒子懸濁液を、０．２μｍ滅菌フィルター（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｎｕｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に通してガラスバイアル中に濾過し、クリンプクロージャで密封する。一般に、０．０１ｍｇ／ｍｌ～０．１０ｍｇ／ｍｌのナノ粒子組成物の溶液が得られる。
上述の方法は、ナノ沈殿及び粒子形成を含む。Ｔ字型接合部及び直接注入を含むがこれらに限定されない代替のプロセスを使用して、同じナノ沈殿を達成してもよい。
Ｂ．ナノ粒子組成物の特性評価
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、粒径の決定においては１倍ＰＢＳ及びゼータ電位の決定においては１５ｍＭのＰＢＳ中で、ナノ粒子組成物の粒径、多分散指数（ＰＤＩ）、及びゼータ電位を決定することができる。
紫外可視分光法を使用して、ナノ粒子組成物中の治療薬及び／または予防薬（例えば、ＲＮＡ）の濃度を決定することができる。１倍ＰＢＳ中１００μＬの希釈製剤を９００μＬのメタノール及びクロロホルムの４：１（ｖ／ｖ）混合物に添加する。混合後、ＤＵ ８００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）で溶液の吸光度スペクトルを、例えば、２３０ｎｍ～３３０ｎｍで記録する。ナノ粒子組成物中の治療薬及び／または予防薬の濃度は、組成物中で使用した治療薬及び／または予防薬の消衰係数、ならびに、例えば２６０ｎｍの波長での吸光度と、例えば３３０ｎｍの波長でのベースライン値との間の差異に基づいて算出することができる。
ＲＮＡを含むナノ粒子組成物に関しては、ＱＵＡＮＴ－ＩＴ（商標）ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、ナノ粒子組成物によるＲＮＡのカプセル封入を評価することができる。試料は、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス－ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中およそ５μｇ／ｍＬの濃度に希釈する。５０μＬの希釈試料をポリスチレン９６ウェルプレートに移し、５０μＬのＴＥ緩衝液または５０μＬの２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液のいずれかをウェルに添加する。プレートを３７℃の温度で１５分間インキュベートする。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）試薬をＴＥ緩衝液中１：１００に希釈し、１００μＬのこの溶液を各ウェルに添加する。蛍光強度は、蛍光プレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、例えば約４８０ｎｍの励起波長及び例えば約５２０ｎｍの発光波長で測定することができる。試薬ブランクの蛍光値を試料の各々の蛍光値から差し引き、無傷の試料（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の添加なし）の蛍光強度を破壊された試料（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００の添加によって引き起こされる）の蛍光値で割ることによって、遊離ＲＮＡのパーセンテージを決定する。
Ｃ．インビボ製剤研究
種々のナノ粒子組成物がどれほど有効に治療薬及び／または予防薬を標的細胞に送達するかを監視するために、特定の治療薬及び／または予防薬（例えば、ｍＲＮＡ等の修飾または天然型ＲＮＡ）を含む異なるナノ粒子組成物を調製し、齧歯類集団に投与する。マウスに、脂質ナノ粒子製剤を含むナノ粒子組成物を含む単回用量を静脈内、筋肉内、皮下、動脈内、または腫瘍内投与する。一部の事例では、マウスに用量を吸入させてもよい。用量サイズは、０．００１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよく、ここで、１０ｍｇ／ｋｇとは、マウスの体重各１ｋｇにつきナノ粒子組成物中１０ｍｇの治療薬及び／または予防薬を含む用量を説明する。ＰＢＳを含む対照組成物もまた用いてもよい。
マウスにナノ粒子組成物を投与すると、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、生物発光イメージング、または他の方法によって用量送達プロファイル、用量応答、ならびに特定の製剤の毒性及びその用量を測定することができる。ｍＲＮＡを含むナノ粒子組成物に関しては、タンパク質発現の時間経過もまた評価することができる。評価のために齧歯類から収集する試料は、血液、血清、及び組織（例えば、筋肉内注射の部位からの筋肉組織及び内部組織）を含んでもよい。試料収集は、動物の屠殺を伴い得る。
ｍＲＮＡを含むナノ粒子組成物は、治療薬及び／または予防薬の送達のための種々の製剤の有効性及び有用性の評価において有用である。ｍＲＮＡを含む組成物の投与によって誘導されるタンパク質発現のレベルがより高いことは、ｍＲＮＡ翻訳及び／またはナノ粒子組成物のｍＲＮＡ送達効率がより高いことを示すものとなる。非ＲＮＡ成分は翻訳機構自体に影響を及ぼすとは考えられないため、タンパク質発現のレベルがより高いことは、所与のナノ粒子組成物による治療薬及び／または予防薬の送達の効率が、他のナノ粒子組成物またはその不在と比べてより高いことを示す可能性が高い。
実施例２：テザリングされたｅＩＦ４Ｇは標的ｍＲＮＡの効力を増加させる
この実施例は、テザリングされたエフェクタータンパク質、例えば、テザリングされたｅＩＦ４ＧをコードするＲＮＡと共送達された場合の、標的ｍＲＮＡの増加した効力（例えば、増加したタンパク質発現及び／またはタンパク質発現の持続期間）について記載する。
この実施例で使用したシステムが、図１に図示される。ｅＩＦ４Ｇの中央からＣ末端ドメインは、リボソーム複合体の形成を補助し、キャップ非依存的翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）を介してｍＲＮＡ ３’ＵＴＲに動員された際にキャップ依存的翻訳を補助または強化し、ＩＲＥＳエレメントを介して動員された際にキャップなしｍＲＮＡの翻訳を刺激することができる（Ｋｒａｆｔ ＪＪ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＮＡＲ．４１（５）：３３９８－４１３、Ｐａｅｋ ＫＹ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＮＡＳ １１２（４）：１０４１－６、Ｐｅｓｔｏｖａ ＴＶ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６（１２）：６８７０－８）。故に、このドメイン（本明細書でｅＩＦ４ＧΔＮと名付けられる）をエフェクターとして使用した。ｅＩＦ４Ｅ及びＰＡＢＰ結合能力を有しないことから、このドメインは、細胞における他のｍＲＮＡには結合しない可能性があり、それによって、起こり得るオフターゲット効果を低減する。テザーとしては、この数十年にわたって広く有効性が確認されていることからＭＳ２－ＭＢＰシステムを使用した。注目すべきことに、ＭＳ２－ＭＢＰ間相互作用は、非常に強力で（Ｋｄ約１～１０ｎＭ）、細胞において安定であることが予想される（Ｔｕｔｕｃｃｉ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１５（１）：８１－８９）。６つのＭＳ２ループを標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに挿入した。ＭＳ２ループは、３’ＵＴＲを完全に置き換えるか、またはｖ１．１ ＵＴＲ配列の前もしくは後に付加されるかのいずれかである（図１）。
最初の細胞ベースの実験は、ＨｅＬａ細胞におけるレポーターとしてｄｅｇ－ＧＦＰの使用に依存した。標的レポーターＲＮＡを、対照タンパク質であるＥＰＯをコードするｍＲＮＡ、またはテザリングされた対照タンパク質であるＭＢＰ－ＬａｃＺをコードするｍＲＮＡ、またはテザリングされたエフェクタータンパク質であるＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮをコードするｍＲＮＡと共送達した。実験は、標的ＲＮＡを１０倍モル過剰にして行った。予想通り、３’ｖ１．１ ＵＴＲを有する標的ｍＲＮＡの発現の差異は異なる条件下で最小限であることが観察された（このＲＮＡは、コードされたタンパク質のうちのいずれに対しても結合部位を有しない）。テザリングされたタンパク質に対する結合部位を有する標的ｍＲＮＡの３つ全ての事例において、テザリングされたエフェクターは、ｍＲＮＡからのタンパク質生産量を有意に増加させた（タンパク質生産量の約３～６倍の増加）。テザーをポリＡ配列に直接隣接させた場合に最大の有益性が観察された（図２Ａ～２Ｄ）。この発現の増強は、複数の細胞種（図３Ａ～３Ｃ）にわたって３倍（中程度）～８０倍（高）の範囲で再現された。
最後に、標的ｍＲＮＡの固定量で、テザリングされたエフェクターによる効力の増強は、エフェクターの量の増加に伴い増加した。これはまた、標的ｍＲＮＡの半減期がエフェクター濃度の増加に伴い増加することを予測する半減期モデルにデータを当てはめた場合にも明らかであった（図４Ａ～４Ｂ）。９倍モル過剰の標的では、テザリングされたエフェクターとともに標的ｍＲＮＡを送達された細胞において（緑色のバー）、テザリングされた対照とともに標的ｍＲＮＡを送達された細胞と比較して（オレンジ色のバー）、標的ｍＲＮＡの半減期の約８～１０倍の増加が観察された（図４Ｂを参照されたい）。
テザリングされたエフェクターによるタンパク質発現の増強は、２つのさらなるレポーターであるＬｕｃ及びＮＰＩ－Ｌｕｃについて観察された。総計強度曲線の形状及びモデル当てはめはいずれも、テザリングされたエフェクタータンパク質の存在下での標的ｍＲＮＡについての増加した半減期を示唆する。
要約すると、この実験で提供されるデータは、標的ｍＲＮＡ及びそのコードされたタンパク質の発現が、該標的ｍＲＮＡがテザリングされたエフェクタータンパク質と共送達される場合に有意に増加し得ることを実証する。
実施例３：テザリングされたｅＩＦ４ＧはｍＲＮＡの半減期を増加させる
この実施例は、テザリングされたエフェクター、例えば、テザリングされたｅＩＦ４Ｇと共送達された場合の標的ｍＲＮＡの増加した半減期について説明する。
実施例２で使用したのと類似のシステムをこの実施例で使用した。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞に、標的レポーターＲＮＡ、及び対照タンパク質（ＥＰＯ）をコードするｍＲＮＡ、またはテザリングされた対照タンパク質（ＭＢＰ－ＬａｃＺ）をコードするｍＲＮＡ、またはテザリングされたエフェクタータンパク質（ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮ）をコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションで導入した。実験は、標的ＲＮＡを３倍モル過剰にして行った。
図５Ｃ～５Ｄに示されるように、標的ｍＲＮＡの半減期は、テザリングされた対照またはテザリングされていない対照と比較して、テザリングされたエフェクターの存在下で増加した。テザーをポリＡ配列に直接隣接させた場合に最大の有益性が観察された。図５Ｄは、対照条件（テザリングされた対照とともにした、またはテザリングされていない対照とともにした標的ｍＲＮＡ）と比較して、標的ｍＲＮＡ（テザリングされたエフェクターと共送達された）の約８０％がエレクトロポレーション後２４時間で存在する／検出され得ることを示す。
このデータは、標的ｍＲＮＡの半減期が、該標的ｍＲＮＡがテザリングされたエフェクター、例えば、テザリングされたｅＩＦ４Ｇと共送達される場合に増加し得ることを示す。
実施例４：テザリングされたエフェクターとともにした標的ｍＲＮＡ翻訳の評価
この実施例は、標的ｍＲＮＡの翻訳に対するテザリングされたエフェクターの効果について説明する。
この実施例に関して、テザリングされたエフェクターとともにした標的ｍＲＮＡの翻訳を評価するために新生ペプチドイメージング（ＮＰＩ）－Ｌｕｃレポーターシステム（ｍＲＮＡ、翻訳中ｍＲＮＡ、及びタンパク質を撮像するために使用）を利用した。ＮＰＩ－Ｌｕｃレポーターは、Ｎ末端上にＶ５ペプチドをタグ付けしたＬｕｃ ＯＲＦ、及び核局在化シグナルをコードする。このレポーターを使用することで、Ｖ５（新たに形成されるタンパク質）及びｓｍＦＩＳＨ（ＬＵＣ ＲＮＡを検出する）の両方に対して陽性であるスポット／シグナルを評定することによって、翻訳中ｍＲＮＡを測定することができる。これは、ＮＰＩ＋（またはＶ５陽性）ｓｍＦＩＳＨ＋の両方に対して陽性であるスポットを評定することによって行われ、ここで、ＮＰＩは新生ペプチドを反映し、ＦＩＳＨプローブはＬｕｃに特異的である。
全ての実験は、異なる条件下で標的または対照ＲＮＡによるエレクトロポレーションを用いて行った。ＨｅＬａにおいて、テザリングされていない対照、テザリングされた対照、及びテザリングされたエフェクターＲＮＡとともにした標的または対照ｍＲＮＡについて撮像結果を得た（テザリングされた対照及びエフェクターＲＮＡ群についての画像のみが示される）。テザリングされたエフェクターは、ＨｅＬａにおいて、ＭＳ２を含有する標的ＲＮＡに対して、とりわけより後の時点でより高い翻訳（ＮＰＩ＋ｓｍＦＩＳＨ＋スポットの共局在）を示した。ＵＴＲにＭＳ２結合部位を有するＮＰＩ－Ｌｕｃ ｍＲＮＡを用いてＨｅＬａ及びＨｅｐ３ｂにおいてこの実験を繰り返した。定量データが図６Ａ～６Ｅ、７Ａ～７Ｄ、１６、及び１７Ａ～１７Ｃに示される。
Ｈｅｐ３ｂ細胞において、エフェクターＲＮＡでのコトランスフェクションは、ｉ）時間経過によるｍＲＮＡの減少した消失、ｉｉ）時間経過による翻訳中ｍＲＮＡの減少した消失、ｉｉｉ）経時的な細胞における堅牢な翻訳維持、及びｉｖ）経時的なｍＲＮＡ当たりの翻訳維持をもたらした（図６Ａ～６Ｅ）。図１６は、テザリングされたエフェクターが、トランスフェクション後４８時間の期間にわたり翻訳中ｍＲＮＡの消失を減少させることを示す。ＨｅＬａ細胞において、翻訳は全体的により許容的であるようであった。いずれの条件下でのいずれの時点においても、時間経過によるサイトゾルｍＲＮＡ、及び時間経過によるｍＲＮＡ当たりの翻訳に対する影響は最小限であることが観察された。しかしながら、テザリングされたエフェクターは、時間経過による翻訳中ｍＲＮＡの消失を低減し、より高い割合の細胞において時間経過によるより堅牢な翻訳を示した（図７Ａ～７Ｄ）。観察された影響の大きさの差異は、細胞特異的である可能性があるか、または２つの細胞種におけるアッセイのダイナミックレンジに左右される可能性がある。
要約すると、この実施例で提供されるデータは、テザリングされたエフェクターが、時間経過によるｍＲＮＡの消失を阻止し、時間経過によるｍＲＮＡの翻訳の低減を阻止または翻訳を維持し、経時的に細胞において翻訳を促進することができることを示す。したがって、一部の実施形態では、テザリングされたエフェクター及び標的ｍＲＮＡの共送達を使用して、標的ｍＲＮＡの翻訳生産量を増加させるか、またはｍＲＮＡからの翻訳生産量の持続期間を増加させ、それによって標的タンパク質の量を増加させることができる。
実施例５：エフェクター機能に必要とされるｅＩＦ４Ｇのドメインの特定
この実施例は、エフェクター機能に必要とされるｅＩＦ４Ｇのドメインの分析について説明する。この実施例で使用した異なる構築物の概略図が、図８Ａで提供される。
標的ｄｅｇ－ＧＦＰ ＲＮＡを、対照タンパク質であるＥＰＯをコードするｍＲＮＡ、またはテザリングされた対照タンパク質であるＭＢＰ－ＬａｃＺをコードするｍＲＮＡ、またはテザリングされたエフェクタータンパク質であるＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮをコードするｍＲＮＡ、もしくは図８Ａに図解されるような切り詰め及び変異ｅＩＦ４Ｇに融合されたＭＢＰをコードするｍＲＮＡと共送達した。実験は、標的ＲＮＡを１０倍モル過剰にして行った。予想通り、３’ｖ１．１ ＵＴＲを有する標的ｍＲＮＡの発現の差異は異なる条件下で最小限であることが観察された。
図８Ｂ～８Ｅに示されるように、ｅＩＦ４Ｇ ｄＮ、ｅＩＦ４Ｇ ｄＮ２、ｅＩＦ４Ｇ ｄＮ３、ｅＩＦ４Ｇ ｍｉｄ１、ｅＩＦ４Ｇ ｍｉｄ２、ｅＩＦ４Ｇ ｍｉｄ３、ｅＩＦ４Ｇ ｍｉｄ４、ｅＩＦ４Ｇ Ｃ１、及びｅＩＦ４Ｇ Ｃ２構築物は、ＵＴＲにＭＳ２結合部位を有する標的ｍＲＮＡからの増加したタンパク質生産量をもたらした。対照的に、図８Ｂ及び８Ｄは、ｅＩＦ４Ｇ ｄＮ ３Ａ構築物（これは中央ドメインを介してｅＩＦ３及びｅＩＦ４Ａに結合することができない（Ｉｍａｔａｋａ Ｈ，Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ Ｎ．（１９９７）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７（１２）：６９４０－７））が、テザリングされた対照に勝る認識できる有益性を示さなかったことを示す。図９は、試験した種々の構築物についての予想される結合活性の要約を提供する。
まとめると、このデータは、ＥＩＦ３／ＥＩＦ４Ａを介したｅＩＦ４Ｇのリボソーム結合がエフェクター機能に重要であることを示す。
実施例６：テザリングされたｅＩＦ４Ｇはタンパク質発現を救済し、ｍＲＮＡ安定性を増加させる
この実施例は、テザリングされたエフェクターをコードするＲＮＡと共送達された場合の、不安定な／翻訳不活性な標的ｍＲＮＡのタンパク質発現（または安定性）の増加について説明する。
実施例２で使用したのと類似のシステムをこの実施例で使用した。ＨｅＬａ細胞に、２つのＲＮＡをエレクトロポレーションで導入した。各試料は、対照（ＥＰＯ）（すなわち、３’ＵＴＲ＋ＥＰＯ）またはエフェクタータンパク質をコードするＲＮＡ（すなわち、３’ＵＴＲ＋ＭＢＰ－ｅＩＦ４Ｇ）とコトランスフェクトした、標的ｄｅｇＧＦＰをコードするＲＮＡを有する。実験は、標的ＲＮＡを３倍モル過剰にして行った。使用した３’ＵＴＲは、２４個のＭＳ２ヘアピンを有する３’ＵＴＲ（３’ＵＴＲ＿２４ ＭＳ２）または３’ＵＴＲ＿ｖ１．１のいずれかである。図１０Ｂに示されるように、標的ＲＮＡの３’ＵＴＲにおける増加した数のＭＳ２ヘアピンループ（２４ ＭＳ２）は、３’ＵＴＲ ｖ１．１と比較してタンパク質発現（及び可能性としてｍＲＮＡ半減期）を低減した。しかしながら、２４個のＭＳ２ループを有するｍＲＮＡについてさえ、ＭＳ２結合タンパク質を使用してそれを活性化因子タンパク質（ｅＩＦ４Ｇ１（６２３～１５９９））にテザリングした場合、ｍＲＮＡ発現が回復した。加えて、活性化因子タンパク質の存在下では標的ＲＮＡの機能的半減期の顕著な延長があった。図１０Ｃは、図１０Ｂにあるのと同じデータについての曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。
このデータは、標的ｍＲＮＡがテザリングされたエフェクターをコードするＲＮＡと共送達される場合、タンパク質発現（及び可能性として標的ｍＲＮＡの半減期）が増加し得ることを示す。
実施例７：テールなし標的ＲＮＡはＲＢＰ－ＲＮＡ（ＭＢＰ－ＭＳ２）テザーを使用して動員されたエフェクターによって救済され得る
図１１は、テールなし標的ＲＮＡを救済するように、ＭＳ２結合タンパク質（ＭＢＰ）－ＭＳ２テザーを用いて潜在的なエフェクターを標的ＲＮＡに動員するためのシステムの概略図を提供する。標的ｍＲＮＡは、３’ＵＴＲにＭＳ２ループを有し、ポリＡテールを欠いている（Ａ０）。第２のｍＲＮＡは、エフェクター／ｅＩＦ４Ｇ－ｍｉｄに融合されたＭＳ２結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする。ＭＢＰ－ＭＳ２間結合相互作用は、エフェクタータンパク質を標的ＲＮＡに動員する。このシステムを、特定の細胞におけるテザリングを可能にするためのｍｉＲＮＡ依存性スイッチゲートに連結して、それによって標的タンパク質の発現をオンにすることができる。また、このシステムを、組織特異的プロモーターの制御下でエフェクターをコードするＤＮＡ分子に連結して、特定の細胞における発現をオンにすることもできる。最後に、このシステムは、エフェクタータンパク質の発現及び／または動員が、特定の微小環境及び／または特定の細胞種（その細胞種における特定のマイクロＲＮＡの存在）におけるトリガー（受容体介在性活性化、ｐＨの変化、低酸素等）の制御下にあるようにコードされ得る。故に、一部の実施形態では、エフェクターが作製される場合であっても、それは特定のトリガーなしには標的ＲＮＡに動員され得ない。
ｅＩＦ４Ｇの中央からＣ末端ドメインは、リボソーム複合体の形成を補助し、キャップ非依存的翻訳エンハンサー（ＣＩＴＥ）を介してｍＲＮＡ ３’ＵＴＲに動員された際にキャップ依存的翻訳を補助または強化し、ＩＲＥＳエレメントを介して動員された際にキャップなしｍＲＮＡの翻訳を刺激することができる（Ｋｒａｆｔ ＪＪ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＮＡＲ．４１（５）：３３９８－４１３、Ｐａｅｋ ＫＹ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＰＮＡＳ １１２（４）：１０４１－６、Ｐｅｓｔｏｖａ ＴＶ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６（１２）：６８７０－８）。故に、このドメイン（本明細書でｅＩＦ４ＧΔＮと名付けられる）は、エフェクターとして使用され得る。ドメインｅＩＦ４－ｍｉｄもまた、エフェクターとして使用され得る。ｅＩＦ４Ｅ及びＰＡＢＰ結合能力を有しないことから、このドメインは、細胞における他のｍＲＮＡには結合しない可能性があり、それによって、起こり得るオフターゲット効果を低減する。テザーとしては、この数十年にわたって広く有効性が確認されていることからＭＳ２－ＭＢＰシステムが使用され得る。注目すべきことに、ＭＳ２－ＭＢＰ間相互作用は、非常に強力で（Ｋｄ約１～１０ｎＭ）、細胞において安定であることが予想される（Ｔｕｔｕｃｃｉ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１５（１）：８１－８９）。６つのＭＳ２ループを標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに挿入した。
実施例８：テザリングされたｅＩＦ４ＧはテールなしｍＲＮＡのｍＲＮＡ安定性を増加させる
この実施例は、テザリングされたエフェクターと共送達された場合のテールなしｍＲＮＡの翻訳及び安定性の増加について説明する。
Ｈｅｐ３ｂ細胞またはＨｅＬａ細胞を２つのＲＮＡでトランスフェクトした。各試料は、テザリングされたタンパク質（エフェクター、ｅＩＦ４Ｇ－ｍｉｄ２）またはテザリングされた対照（ＭＢＰ－ＬａｃＺ）をコードするｍＲＮＡとコトランスフェクトした標的ｄｅｇＧＦＰを有する。標的ｍＲＮＡは、テールなし（Ａ０）であったか（すなわち、３’ｖ１．１＿ＭＳ２＿Ａ０）、またはＡ１００テールを有する（ｖ１．１＿Ａ１００）。実験は、標的ＲＮＡを１０倍モル過剰にして行い、タンパク質発現は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅによって測定した。図１２Ａ及び１２Ｃに示されるように、Ａ１００テールを有する標準ｍＲＮＡは堅牢な発現を示すが、テザリングされた対照と共送達されたＭＳ２ ＵＴＲを有するテールなしｍＲＮＡについては検出可能な発現は見られない（試験（Ａ０）標的ＲＮＡ＋ｔ－ｃｔｒｌ）。テールなし標的の翻訳は、ｅＩＦ４Ｇ中央ドメインの存在下で回復する（試験（Ａ０）標的ＲＮＡ＋ｔ－ｅｆｆ）。曲線の形状は、ＲＮＡ半減期の増加を示唆する。図１２Ｂ及び１２Ｄは、図１２Ａ及び１２Ｂにあるのと同じデータについての曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。
実施例９：ｉｄＴテールを有するテールなし標的ＲＮＡはＲＢＰ－ＲＮＡ（ＭＢＰ－ＭＳ２）テザーを使用して動員されたエフェクターによって救済され得る
図１１のシステムを使用して、修飾されたテールなし標的ＲＮＡの発現を救済することができることを例示するために、ＨＥＰ３Ｂ細胞を３’ｖ１．１＿ＭＳ２＿Ａ０、または３’ｖ１．１＿ＭＳ２＿Ａ０－ｉｄＴ＋エフェクター／対照ｄｅｇ－ＧＦＰ構築物でトランスフェクトした。この実験において、テールなし標的ＲＮＡをｉｄＴテール、すなわち、Ａ２０オリゴとそれに続く逆方向ｉｄＴで修飾した。対照ＲＮＡは、ＭＢＰ－ＬａｃＺをコードし、エフェクターＲＮＡは、ＭＢＰ－ｅＩＦ４Ｇ－ｍｉｄをコードする。標的ＲＮＡは、エフェクターＲＮＡに対して１０倍モル過剰であった。図１３で見られるように、Ａ０またはＡ０－ｉｄＴ構築物は、対照ＲＮＡとコトランスフェクトした場合に検出可能な発現を示さなかった。テザリングエフェクターは、Ａ０ ＲＮＡからの発現を増加させた。ｉｄＴの存在下でのテザリングは、はるかにより高いレベルまで発現を救済した。これらの結果は、Ａ０ ＲＮＡからの翻訳が、テザーに加えて、ｉｄＴの存在下で改善し得ることを実証する。
実施例１０：キャップなし標的ＲＮＡはＲＢＰ－ＲＮＡ（ＭＢＰ－ＭＳ２）テザーを使用して動員されたエフェクターによって救済され得る
図１１のシステムを使用して、キャップなし標的ＲＮＡを救済することができることを例示するために、ＨｅＬａ細胞を５’三リン酸（５’ｐｐｐ）末端ＮｐｉＬｕｃ＿３’ｖ１．１＿ＭＳ２＿Ａ１００標的ＲＮＡ＋エフェクター／対照ＮｐｉＬｕｃ構築物でトランスフェクトした。標的ＲＮＡは、エフェクターＲＮＡに対して１．５倍モル過剰であった。図１４で見られるように、キャップなしＲＮＡはそれ自体、対照テザーＲＮＡ（ＭＢＰ－ｍｉｄ２－Ｍｕｔ、変異体中央ドメインをコードする）では、バックグラウンドを上回る認識できるシグナルを示さなかったが、エフェクター（ＭＢＰ－ｍｉｄ２）＋エフェクター／対照ｄｅｇ－ＧＦＰ構築物、及び３’ｖ１．１＿ＭＳ２＿Ａ０＋対照またはエフェクターでテザリングされた場合、このＲＮＡに対して認識できる発現が回復する。
実施例１１：キャップなし－テールなし標的ＲＮＡはＲＢＰ－ＲＮＡ（ＭＢＰ－ＭＳ２）テザーを使用して動員されたエフェクターによって救済され得る
図１１のシステムを使用して、キャップなし－テールなし標的ＲＮＡを救済することができることを例示するために、ＨｅＬａ細胞を５’ｐｐｐ末端ＮｐｉＬｕｃ＿３’ｖ１．１＿ＭＳ２＿Ａ０標的ＲＮＡ＋エフェクター／対照ＮｐｉＬｕｃ構築物でトランスフェクトした。標的ＲＮＡは、エフェクターＲＮＡに対して１．５倍モル過剰であった。図１５で見られるように、キャップなし－テールなしＲＮＡはそれ自体、対照テザーＲＮＡ（ＭＢＰ－ｍｉｄ２－Ｍｕｔ、変異中央ドメインをコードする）では、バックグラウンドを上回る認識できるシグナルを示さなかったが、テザリングされたエフェクター構築物（ＭＢＰ－ｍｉｄ２）とともに送達された場合、このＲＮＡに対して認識できる発現が回復した。
実施例１２：テザリングされたエフェクターは経時的により多くの細胞においてより多くの翻訳中ｍＲＮＡを維持する
この実施例は、ｍＲＮＡがテザリングされたエフェクター、例えば、テザリングされたｅＩＦ４ＧΔＮと共送達される場合の、より多くの細胞におけるより多くの翻訳中ｍＲＮＡの経時的な維持について説明する。Ｈｅｐ３ｂ細胞に、テザリングされていない対照（ｎｔ－ｃｔｒｌ、ＬａｃＺ）、テザリングされた対照（ｔ－ｃｔｒｌ、ＭＢＰ－ＬａｃＺ）、またはｔ－エフェクター（ｅＩＦ４ＧΔＮ）と組み合わせて標的ＲＮＡ（３’ｖ１．１ＭＳ２＿Ａ１００または３’ｖ１．１＿Ａ１００）をエレクトロポレーションで導入した。図１７Ａ～１７Ｃで見られるように、テザリングされたエフェクターは、より長い期間にわたってより高いパーセンテージの翻訳中ｍＲＮＡ（ＮＰＩ＋ｓｍＦＩＳＨ＋スポット）を示した。
実施例１３：テザリングは分泌タンパク質の発現及び翻訳を増加させる
この実施例は、ｍＲＮＡがテザリングされたエフェクター、例えば、テザリングされたｅＩＦ４ＧΔＮと共送達される場合に、分泌タンパク質の発現及び翻訳が増加することを実証する。２つの分泌抗体（Ａｂ１及びＡｂ２）の軽鎖及び重鎖対に対して最適化されたリーディングフレームを有するｖ１．１標的ＲＮＡ構築物を、ｔ－ｃｔｒｌ（ＭＢＰ－ＬａｃＺ）またはｔ－ｅｆｆ（ＭＢＰ－ｅＩＦ４ＧΔＮ）とともにＨｅｋ２９３細胞内にコトランスフェクトした。実験は、５倍モル過剰の標的（Ａｂ１）または１倍モル過剰の標的（Ａｂ２）を用いて行った。抗体実験の各々において、テザリングされたエフェクターは、２つの別個の軽鎖及び重鎖をコードするＲＮＡにテザリングされる。図１８は、経時的なＡｂ１またはＡｂ２の濃度（μｇ／ｍｌ）を示し、テザリングが分泌タンパク質の発現及び翻訳を増加させることを示す。
実施例１４：単一のＲＮＡテザリングシステムはインビボで標的発現を強化する
この実施例は、単一のＲＮＡテザリングシステムがインビボで標的ＲＮＡの翻訳の効率を増加させ得ることを実証する。図１９は、単一のＲＮＡテザリングシステムの概略図を提供する。ｍＲＮＡ分子は、５’から３’に、ＣＡＰ、５’ＵＴＲ、標的ＯＲＦ、タンデムに並んだ３つのプロテアーゼ切断部位：Ｔ２Ａ－Ｐ２Ａ－Ｅ２Ａ／ＴＰＥ（赤色）、エフェクター（オレンジ色－ＲＢＰ、－緑色－エフェクター）に融合されたＲＮＡ結合タンパク質をコードする別のＯＲＦ、及び３’ＵＴＲにおけるＭＳ２ループ（オレンジ色の縞）を含む。ＭＳ２ループは、ｖ１．１ ＵＴＲ配列の後に付加される。ＴＰＥプロテアーゼ切断部位は、細胞において翻訳中にリボソームスキッピングをもたらす。この翻訳の最終産物は、標的ＯＲＦにコードされたタンパク質がＣ末端タグを得、ＲＮＡ結合結合－エフェクター融合体がＴＰＥからの残基プロリン（Ｃ末端アミノ酸）から開始することである。具体的なＴＰＥ切断部位に関して、この配置構成は、１個の標的：０．０５個のエフェクタータンパク質分子をもたらすことが予想される（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ，２０１７ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７：２１９３）。この１つのＲＮＡシステムにおいては、エフェクタータンパク質がＲＮＡ結合タンパク質相互作用を介してＲＮＡ ３’ＵＴＲに結合することにより、標的ＯＲＦ及びエフェクターＯＲＦの両方をコードするこの１つのＲＮＡにエフェクタータンパク質が結合することの有益性が付与される。
図２０Ａは、ｔ－ｅｆｆ構築物（エフェクター）またはｔ－ｃｔｒｌ構築物（対照）を注射したマウスについての、示される種々の時点にわたる発光レベルを示す。図２０Ｂは、図２０Ａに対応する総曲線下面積（ＡＵＣ）としてプロットした累積発光を示す。図２０Ｃは、ｔ－ｅｆｆ構築物（エフェクター）またはｔ－ｃｔｒｌ構築物（対照）を注射したマウスについての、示される時点にわたる発光を示す。データは、平均値＋／－ＳＥＭとして示される。ここで使用した送達システムは、ＬＮＰである。
実施例１５：他の有用なエフェクタータンパク質またはそのドメインの特定
この実施例は、エフェクター機能に必要とされるｅＩＦ４Ｇのホモログまたはドメインの分析について説明する。
標的ｄｅｇ－ＧＦＰ ＲＮＡを、対照タンパク質であるＬａｃＺをコードするｍＲＮＡ、またはテザリングされた対照タンパク質であるＭＢＰ－ＬａｃＺをコードするｍＲＮＡ、または図２１Ａ～２１Ｂ及び図２２Ａ～２２Ｂに図示されるようなテザリングされたエフェクタータンパク質をコードするｍＲＮＡと共送達した。実験は、Ｈｅｐ３ｂにおいて標的ＲＮＡを１０倍モル過剰にして行った。
図２１Ａ～２１Ｂに示されるように、ｅＩＦ４Ｇ１－ｆｌ及びｅＩＦ４Ｇ３－ｆｌの両方、ならびに中央ドメイン（ｅＩＦ４Ａ－３に結合する）を含有していたそれらのドメインが、標的ＲＮＡからのタンパク質生産量を増加させる。図２２Ａ～２２Ｂに示されるように、ポリＡ結合タンパク質、ならびにＧｌｄ２、ＴＥＮＴ４Ａ及びＴＥＮＴ４Ｂ等のポリヌクレオチジルトランスフェラーゼは全て、標的ＲＮＡからのタンパク質生産量を増加させる。
まとめると、このデータは、ｅＩＦ３／ｅＩＦ４Ａを介したｅＩＦ４Ｇホモログのリボソーム結合がエフェクター機能に重要であることを示す。追加として、ＰＡＢＰ及びポリヌクレオチジルトランスフェラーゼはまた、標的ＲＮＡからのタンパク質発現及び発現の持続期間を増加させるエフェクターとしての役目も果たす。
他の実施形態
本開示は発明を実施するための形態に関連して説明されているが、上記の説明は例示説明を意図しており、本開示の範囲を限定することは意図しておらず、本開示の範囲は添付の特許請求によって定義されることを理解されたい。他の態様、利点、及び変更形態が、以下の特許請求の範囲内にある。本明細書に記載の全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が援用される。

Claims (91)

  1. （ａ）（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
    （ｂ）（１）エフェクター分子、及び／または（２）前記結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチド、を含み、
    任意選択で、（ａ）及び（ｂ）が各々、ｍＲＮＡを含む、
    脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物。
  2. （ａ）（１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド、ならびに
    （ｂ）エフェクター分子をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチド、を含み、
    任意選択で、（ａ）及び（ｂ）が各々、ｍＲＮＡを含む、
    脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物。
  3. 前記エフェクター分子が、前記結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をさらに含む、請求項２に記載のＬＮＰ組成物。
  4. 前記エフェクター分子が、前記結合エレメントを認識する、請求項２に記載のＬＮＰ組成物。
  5. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、同じポリヌクレオチドに配置される、請求項１～４のいずれか１項に記載のＬＮＰ組成物。
  6. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＴＰＥ（Ｐ２Ａ－Ｔ２Ａ－Ｅ２Ａ）部位）または配列内リボソーム進入部位によって分離される、請求項５に記載のＬＮＰ組成物。
  7. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、異なるポリヌクレオチドに配置される、請求項１～４のいずれか１項に記載のＬＮＰ組成物。
  8. （ａ）及び（ｂ）が、同じＬＮＰ中にある、請求項７に記載のＬＮＰ組成物。
  9. （ａ）及び（ｂ）が、異なるＬＮＰ中にある、請求項７に記載のＬＮＰ組成物。
  10. 前記第２のポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項１～４のいずれか１項に記載のＬＮＰ組成物。
  11. 前記エフェクター分子をコードする前記配列が、組織特異的プロモーターの制御下にある、請求項１０に記載のＬＮＰ組成物。
  12. 前記エフェクター分子の発現または動員が、特定の微小環境または特定の細胞種におけるトリガーの制御下にある、請求項１～４のいずれか１項に記載のＬＮＰ組成物。
  13. 前記トリガーが、マイクロＲＮＡ、受容体介在性活性化、及び／またはｐＨの変化及び／または低酸素である、請求項１２に記載のＬＮＰ組成物。
  14. （ａ）（１）治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド、及び／または
    （ｂ）（１）エフェクター分子、及び（２）前記結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチド、を含み、
    任意選択で、（ａ）及び（ｂ）が各々、ｍＲＮＡを含む、
    システム。
  15. （ａ）（１）治療ペイロードもしくは予防ペイロードをコードする配列、及び（２）結合エレメントを含む、第１のポリヌクレオチド、及び／または
    （ｂ）エフェクター分子をコードする配列を含む、第２のポリヌクレオチド、を含み、
    任意選択で、（ａ）及び（ｂ）が各々、ｍＲＮＡを含む、
    システム。
  16. 前記エフェクター分子が、前記結合エレメントを認識するポリペプチド（テザー分子）をさらに含む、請求項１５に記載のシステム。
  17. 前記エフェクター分子が、前記結合エレメントを認識する、請求項１５に記載のシステム。
  18. 前記システムが、（ａ）を含む、請求項１４～１７のいずれか１項に記載のシステム。
  19. 前記システムが、（ｂ）を含む、請求項１４～１８のいずれか１項に記載のシステム。
  20. 前記システムが、（ａ）及び（ｂ）を含む、請求項１４～１９のいずれか１項に記載のシステム。
  21. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、同じポリヌクレオチドに配置される、請求項１４～２０のいずれか１項に記載のシステム。
  22. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＴＰＥ（Ｐ２Ａ－Ｔ２Ａ－Ｅ２Ａ）部位）または配列内リボソーム進入部位によって分離される、請求項２１に記載のシステム。
  23. 前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドが、異なるポリヌクレオチドに配置される、請求項１４～２０のいずれか１項に記載のシステム。
  24. （ａ）または（ｂ）のうちの少なくとも一方が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される、請求項１４～２３のいずれか１項に記載のシステム。
  25. （ａ）が、ＬＮＰとして製剤化される、請求項２４に記載のシステム。
  26. （ｂ）が、ＬＮＰとして製剤化される、請求項２４に記載のシステム。
  27. （ａ）及び（ｂ）の両方が、ＬＮＰ、例えば、同じＬＮＰまたは異なるＬＮＰとして製剤化される、請求項２４に記載のシステム。
  28. 前記第２のポリヌクレオチドが、ＤＮＡである、請求項１４～１７のいずれか１項に記載のシステム。
  29. 前記エフェクター分子が、組織特異的プロモーターの制御下にある、請求項１５に記載のシステム。
  30. 前記エフェクター分子の発現または前記エフェクター分子の動員が、特定の微小環境または特定の細胞種におけるトリガーの制御下にある、請求項１４～１７のいずれか１項に記載のシステム。
  31. 前記トリガーが、マイクロＲＮＡ、受容体介在性活性化、及び／またはｐＨの変化及び／または低酸素である、請求項３０に記載のシステム。
  32. 先行請求項のいずれか１項に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物を含む、薬学的組成物。
  33. 先行請求項のいずれか１項に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物を含む、細胞。
  34. 請求項１～３１のいずれか１項に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物に接触させられた、請求項３３に記載の細胞。
  35. 前記システムまたは前記ＬＮＰ組成物の一方または両方のポリヌクレオチドの発現を可能にするのに十分な条件下で維持される、請求項３３または３４に記載の細胞。
  36. 細胞において治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現を増加させる方法であって、前記細胞に、請求項１～２７のいずれか１項に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物を投与することを含む、方法。
  37. 対象において治療ペイロードまたは予防ペイロードの発現を増加させる方法であって、前記対象に、有効量の請求項１～２７のいずれか１項に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物を投与することを含む、方法。
  38. 請求項１～２７のいずれか１項に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物を、細胞に送達する方法。
  39. 前記細胞をインビトロ、インビボ、またはエクスビボで前記システムまたは前記ＬＮＰ組成物に接触させることを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 請求項１～２７のいずれか１項に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物を、例えば、本明細書に記載されるような疾患または障害を有する対象に送達する方法。
  41. 対象における免疫応答を調節する方法であって、それを必要とする前記対象に、有効量の請求項１～２７のいずれか１項に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物を投与することを含む、方法。
  42. 疾患または障害を処置するか、予防するか、またはその症状を予防する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項１～２７のいずれか１項に記載のシステムまたはＬＮＰ組成物を投与することを含む、方法。
  43. 前記システムの前記第１のポリヌクレオチドまたは前記第２のポリヌクレオチドが、ＬＮＰとして製剤化される、請求項３６～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記システムの前記第１のポリヌクレオチド及び前記第２のポリヌクレオチドの両方が、ＬＮＰ、例えば、同じまたは異なるＬＮＰとして製剤化される、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記（ａ）を含むＬＮＰ及び前記（ｂ）を含むＬＮＰが、同時に、例えば、実質的に同時に投与される、請求項３６～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記（ａ）を含むＬＮＰ及び前記（ｂ）を含むＬＮＰが、順次に投与される、請求項３６～４４のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記第２のポリヌクレオチドの前記テザー分子が、前記第１のポリヌクレオチドの前記結合エレメントに結合する、例えば、それを認識する、ＲＮＡ結合タンパク質またはその断片を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  48. 前記第１のポリヌクレオチドの前記結合エレメントが、前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードをコードする前記配列の上流（５’）もしくは下流（３’）またはそのオープンリーディングフレーム内に位置する、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  49. 前記第１のポリヌクレオチドの前記結合エレメントが、前記第１のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲの上流（５’）または下流（３’）に位置する、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  50. 前記第１のポリヌクレオチドの前記結合エレメントが、前記第１のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲの上流（５’）または下流（３’）に位置する、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  51. 前記第１のポリヌクレオチドの前記結合エレメントが、前記第１のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲの下流に位置する、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  52. 前記第１のポリヌクレオチドの前記結合エレメントが、前記第２のポリヌクレオチドの前記テザー分子、例えば、表１で提供されるテザー分子、例えば、ＭＢＰ、ＰＣＰ、ラムダＮ、Ｕ１ＡもしくはＰＵＦ、１５．５ｋｄ、ＬＡＲＰ７、またはそれらのバリアントもしくは断片によって結合される、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  53. 前記結合エレメントが、表１で提供される結合エレメント、例えば、ＭＳ２（例えば、野生型ＭＳ２、またはそのバリアントもしくは断片）から選定される、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  54. 前記結合エレメントが、１９個のヌクレオチドを含む配列、例えば、表２で提供されるＭＳ２結合エレメントのヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  55. 前記エフェクター分子が、翻訳因子、スプライシング因子、ＲＮＡ安定化因子、ＲＮＡ編集因子、ＲＮＡ結合因子、ＲＮＡ局在化因子、またはそれらの組み合わせから選定される、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  56. 前記エフェクター分子が、翻訳因子、例えば、表４で提供される翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ、ポリＡ結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、ｅＩＦ３ｄもしくはその構成要素、Ｄａｚｌ、またはそれらの断片もしくはバリアントもしくは組み合わせである、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  57. 前記エフェクター分子が、リボソーム結合、例えば、動員、転写開始前複合体の形成、またはＲＮＡ巻き戻しを調節する、例えば、それを容易にする、翻訳因子である、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  58. 前記エフェクター分子が、ｅＩＦ４Ｇ、例えば、野生型ｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４Ｇのバリアント、またはその断片を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  59. 前記ｅＩＦ４Ｇバリアントが、リボソーム結合、例えば、動員を保持する、請求項５８に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  60. 前記エフェクター分子が、末端トランスフェラーゼ等のＲＮＡ修飾酵素、例えば、ＴＥＮＴ４Ａ、ＴＥＮＴ４Ｂ、Ｇｌｄ２、それらのバリアントまたは断片を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  61. 前記エフェクター分子が、表２で提供されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  62. 前記エフェクター分子が、表２で提供されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列によってコードされる、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  63. 前記テザー分子が、前記第１のポリヌクレオチドにおける結合エレメントに結合する、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  64. 前記テザー分子が、表１で提供されるテザー分子、例えば、ＭＢＰ、ＰＣＰ、ラムダＮ、Ｕ１ＡもしくはＰＵＦ、１５．５ｋｄ、ＬＡＲＰ７、またはそれらのバリアントもしくは断片を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  65. 前記テザー分子が、ＭＢＰを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  66. 前記テザー分子が、表２で提供されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  67. 前記テザー分子が、表２で提供されるヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列によってコードされる、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  68. 前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードが、分泌タンパク質、膜結合型タンパク質、または細胞間タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  69. 前記治療ペイロードまたは前記予防ペイロードが、サイトカイン、抗体、ワクチン（例えば、抗原、免疫原性エピトープ）、受容体、酵素、ホルモン、転写因子、リガンド、膜輸送体、構造タンパク質、ヌクレアーゼ、成長因子、免疫モジュレーター、またはそれらの構成要素、バリアント、もしくは断片（例えば、生物学的に活性な断片）から選定される、請求項６５に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  70. 細胞において（例えば、前記システムまたは前記ＬＮＰ組成物に接触させられた細胞において）、以下、
    （ｉ）前記治療ペイロードもしくは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの増加した発現及び／もしくはレベル、
    （ｉｉ）前記治療ペイロードもしくは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの持続的な発現及び／もしくはレベル、
    （ｉｉｉ）治療ペイロードもしくは予防ペイロードの増加した発現及び／もしくはレベル、
    （ｉｖ）治療ペイロードもしくは予防ペイロードの持続的な発現及び／もしくはレベル、
    （ｖ）前記治療ペイロードもしくは前記予防ペイロードをコードするｍＲＮＡの増加した安定性、
    （ｖｉ）細胞環境、例えば、ストレスもしくは栄養欠乏もしくは翻訳因子の利用可能性に対する治療ペイロードもしくは予防ペイロードの翻訳の増加した耐性、
    （ｖｉｉ）前記治療ペイロードもしくは前記予防ペイロードの低減された投薬量、または
    （ｖｉｉｉ）細胞内の内因性ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質の低減された毒性、例えば、低減された調節、
    のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、もしくはそれらの全て、または任意の組み合わせをもたらす、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  71. （ａ）前記第１のポリヌクレオチドが、
    （１）治療ペイロードまたは予防ペイロードをコードする配列、及び
    （２）ＭＳ２配列、例えば、２０ヌクレオチド長のスペーサーによって分離される１９個のヌクレオチドの６つのＭＳ２配列を含む結合エレメント、を含み、
    （ｂ）前記第２のポリヌクレオチドが、
    （１）ｅＩＦ４Ｇ、例えば、野生型ｅＩＦ４Ｇ、そのバリアントまたは断片を含むエフェクター分子、及び
    （２）ＭＢＰ、例えば、野生型ＭＢＰ、そのバリアントまたは断片を含むテザー分子、をコードする配列を含む、
    先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  72. 前記第１のポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学修飾を含むｍＲＮＡを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  73. 前記第２のポリヌクレオチドが、少なくとも１つの化学修飾を含むｍＲＮＡを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  74. 前記第１のポリヌクレオチドが、いずれの化学修飾も有しないｍＲＮＡを含む、請求項１～７１のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  75. 前記第２のポリヌクレオチドが、いずれの化学修飾も有しないｍＲＮＡを含む、請求項１～７１及び７４のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  76. 前記化学修飾が、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、２－チオウリジン、４’－チオウリジン、５－メチルシトシン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－シュードウリジン、５－アザ－ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルウリジン、５－メトキシウリジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンからなる群から選択される、請求項７２～７５のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  77. 前記ＬＮＰ組成物が、（ｉ）イオン化可能な脂質、例えば、アミノ脂質、（ｉｉ）ステロールまたは他の構造脂質、（ｉｉｉ）非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  78. 前記イオン化可能な脂質が、アミノ脂質を含む、請求項７７に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  79. 前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｆ）、（ＩＩｇ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ１）、（ＩＩＩａ２）、（ＩＩＩａ３）、（ＩＩＩａ４）、（ＩＩＩａ５）、（ＩＩＩａ６）、（ＩＩＩａ７）、または（ＩＩＩａ８）のうちのいずれかの化合物を含む、請求項７７または７８に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  80. 前記非カチオン性ヘルパー脂質またはリン脂質が、ＤＳＰＣ（例えば、ＤＳＰＣのバリアント、例えば、式（ＩＶ）の化合物）、ＤＰＰＣ、またはＤＯＰＣから選定される化合物を含む、請求項７７～７９のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  81. 前記構造脂質が、アルファ－トコフェロール、β－シトステロール、またはコレステロールである、請求項７７～８０のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  82. 前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項７７～８１のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  83. 前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、及びＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質からなる群から選択される、請求項７７～８２のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  84. 前記ＰＥＧ脂質が、式（Ｖ）、式（ＶＩ－Ａ）、式（ＶＩ－Ｂ）、式（ＶＩ－Ｃ）、または式（ＶＩ－Ｄ）の化合物のものから選定される、請求項７７～８１のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  85. 前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ａ）の化合物である、請求項８４に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  86. 前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ｂ）の化合物である、請求項８４に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  87. 前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ｃ）の化合物である、請求項８４に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  88. 前記ＰＥＧ脂質が、式（ＶＩ－Ｄ）の化合物である、請求項８４に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  89. 前記ＬＮＰが、約２０～６０％のイオン化可能な脂質：５～２５％のリン脂質：２５～５５％のコレステロール；及び０．５～１５％のＰＥＧ脂質のモル比を含む、請求項７７～８８のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  90. 静脈内、皮下、筋肉内、鼻腔内、眼内、直腸、経肺、または経口送達用に製剤化される、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
  91. 前記対象が、哺乳動物、例えば、ヒトである、先行請求項のいずれか１項に記載のシステム、ＬＮＰ組成物、細胞、または方法。
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Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8613481D0 (en) 1986-06-04 1986-07-09 Diatech Ltd Translation of mrna
US5723332A (en) 1993-11-26 1998-03-03 British Technology Group Limited Translational enhancer DNA
US5824497A (en) 1995-02-10 1998-10-20 Mcmaster University High efficiency translation of mRNA molecules
JP4371812B2 (ja) 2001-09-28 2009-11-25 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ マイクロｒｎａ分子
US20050222064A1 (en) 2002-02-20 2005-10-06 Sirna Therapeutics, Inc. Polycationic compositions for cellular delivery of polynucleotides
WO2005013901A2 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
CA2715078C (en) 2007-09-26 2019-07-23 Intrexon Corporation Synthetic 5'utrs, expression vectors, and methods for increasing transgene expression
JP5539962B2 (ja) 2008-04-25 2014-07-02 ノースウェスタン、ユニバーシティ コレステロールを隔離するのに適したナノ構造体
PL215513B1 (pl) 2008-06-06 2013-12-31 Univ Warszawski Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka
KR20230098713A (ko) 2009-06-10 2023-07-04 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
DK3202760T3 (da) 2011-01-11 2019-11-25 Alnylam Pharmaceuticals Inc Pegylerede lipider og deres anvendelse til lægemiddelfremføring
WO2013013013A2 (en) * 2011-07-21 2013-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for producing modified glycoproteins
US9163706B2 (en) 2012-08-29 2015-10-20 Greg SEBLANTE, SR. Sprocket box for increasing the gas mileage of a vehicle with an automatic transmission
JP2016504050A (ja) 2013-01-17 2016-02-12 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 細胞表現型の改変のためのシグナルセンサーポリヌクレオチド
EP2964234A4 (en) 2013-03-09 2016-12-07 Moderna Therapeutics Inc NON-TRANSLATED HETEROLOGOUS REGIONS FOR MRNA
EP3110401A4 (en) 2014-02-25 2017-10-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems
US20160052352A1 (en) 2014-08-21 2016-02-25 The Goodyear Tire & Rubber Company Method of adhesion of rigid components to a tire
US9259829B1 (en) 2014-08-25 2016-02-16 Cougar Holdings, Llc Roofing and nail removal hammer
CN109476718B (zh) 2016-05-18 2023-07-04 莫得纳特斯公司 编码免疫调节多肽的mrna的组合及其用途
US20230081530A1 (en) * 2018-09-14 2023-03-16 Modernatx, Inc. Methods and compositions for treating cancer using mrna therapeutics

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