CN1308444C - 基因重组α－半乳糖苷酶大批量发酵液的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因重组α-半乳糖苷酶发酵液的纯化方法，该方法将发酵液经过阳离子交换层析和疏水层析两步工序，即可得到蛋白纯度大于98%的基因重组α-半乳糖苷酶，为规模化生产高纯度的重组α-半乳糖苷酶提供了解决方案，并且纯化后的基因重组α-半乳糖苷酶内毒素小于10EU，无热源，可用于B→O血型改造、食品添加剂、化工和制药等领域。

Description

基因重组α-半乳糖苷酶大批量发酵液的纯化方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及使用基因工程技术获得的可分泌表达重组α-半乳糖苷酶的工程菌株进行发酵后进一步对发酵液进行纯化得到高纯度重组α-半乳糖苷酶的方法。

背景技术

α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)属外切糖苷酶类，可特异性水解多糖、糖脂、糖蛋白中糖链末端的α-半乳糖苷键。研究表明，从咖啡豆中提取的α-半乳糖苷酶可有效清除人红细胞表面的B抗原物质，从而将B型红细胞改造成O型红细胞。然而，用生化提取技术制备该酶的成本太高，用传统的生物化学方法，从50磅桑托斯(Santos)咖啡豆中仅能提取1.75克的酶(Zhu A，Monahan C，Zhang Z，et al.High-levelexpression and purification of coffee bean α-galactosidase produced in the yeast Pichia pastoris.Arch Biochem Biophys 1995，324(1)：65～70)，这只能满足一次实验的需要量。要将B→O血型改造真正在工业上实施，就需要建立起了规模化生产重组α-半乳糖苷酶的方法，大批量制备出了高纯度的重组α-半乳糖苷酶。发明人已成功地建立起了规模化生产重组α-半乳糖苷酶的发酵方法，并摸索了该方法制备的发酵液进一步纯化的工艺。

早期发明人曾尝试用离心、超滤、阳离子交换，脱盐、浓缩的方法纯化α-半乳糖苷酶，纯化产物的电泳结果呈单一蛋白条带，但该方法仅适于纯化少量α-半乳糖苷酶，可用于小样本的B→O血型转变实验(高新，杨军，李素波，刘泽澎，章扬培。基因工程α-半乳糖苷酶的制备及性质研究。生物工程学报。2003；19(2)：223-226)。当这一纯化工艺用于批量纯化α-半乳糖苷酶，用高效液相色谱标准方法检测纯化产物，发现其纯度远达不到基因工程产品检测规程规定的95％以上纯度。

发明人进一步得到的纯化方法需经超滤、阳离子交换、疏水层析和阴离子交换等多步纯化工序，可以解决产物的纯度问题，但操作相对复杂，费用较高，且因工序较多，产品收率也受影响。

发明创造内容

本发明的目的是提供一种简便、易于操作的基因重组α-半乳糖苷酶的大批量发酵液的纯度方法。

本发明基因重组α-半乳糖苷酶大批量发酵液的纯化方法，是将所述发酵液依次经过阳离子交换层析和疏水层析两步得到纯度为98％以上的重组α-半乳糖苷酶。

该方法中，所有用水均为无热源水。

上述方法中，还进一步包括对得到的纯度为98％以上的重组α-半乳糖苷酶洗脱液进行超滤浓缩的过程，采用Pellicon超滤系统，其中超滤膜堆分子截留量为8000道尔顿。

上述方法中，所述阳离子交换层析采用STREAMLINE-SP柱作为阳离子交换层析柱，用20mM，pH4.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液作为平衡缓冲液，平衡后上样；然后用平衡缓冲液由下向上洗掉吸附的杂蛋白，再用含0.07MNacl的柠檬酸-磷酸盐缓冲液由上向下洗掉杂蛋白；最后用含0.5MNacl的柠檬酸-磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集第一洗脱液。

所述疏水层析采用HiTrap Phenyl HP柱，HIC平衡缓冲液，平衡、上样流速为20ml/min，用HIC平衡缓冲液洗掉杂蛋白，再用pH6.0，含0.4M硫酸铵的50mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集第二洗脱液；疏水层析上样前，先将第一洗脱液中加入3M硫酸铵溶液和pH6.0的200mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液贮存液。

所述HIC平衡缓冲液为50mM、pH6.0、含1M硫酸铵的柠檬酸—磷酸盐缓冲液。

具体的，本发明基因重组α-半乳糖苷酶大批量发酵液的纯化方法包括以下步骤：

1)发酵液预处理：将所述发酵液通过高速离心回收上清液，用0.2M，pH4.0的磷酸-柠檬酸缓冲液将上清液的pH值调到4.0；

2)阳离子交换：

a.以STREAMLINE-SP柱作为阳离子交换层析柱，用1N的NaoH溶液由下向上洗STREAMLINE-SP柱，再用水洗至pH为中性；

b.用平衡缓冲液平衡STREAMLINE-SP柱，所述平衡缓冲液为pH4.0的20mM的柠檬酸-磷酸盐缓冲液；

c.平衡后上样，用平衡缓冲液由下向上洗掉杂蛋白；

d.改变流路，待填料沉积后先用含0.07AMNacl的柠檬酸-磷酸盐缓冲液由上向下洗杂蛋白，再用含0.5MNacl的柠檬酸—磷酸盐缓冲液由上向下进行洗脱，收集第一洗脱液。

3)疏水层析：

a.用50mM、pH6.0、含1M硫酸铵的柠檬酸-磷酸盐缓冲液即HIC平衡缓冲液平衡HiTrap Phenyl HP柱3-5个柱体积，流速20ml/min；

b.向第一洗脱液中加入3M硫酸铵溶液和pH6.0的200mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液贮存液使之与HIC平衡缓冲液离子强度一致；

c.平衡后上样，流速20ml/min；

d.用HIC平衡缓冲液洗掉杂蛋白；

e.用pH6.0、含0.4M硫酸铵的50mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液作洗脱液进行洗脱，收集第二洗脱液；该第二洗脱液得到的为纯度98％以上的重组α-半乳糖苷酶；

4)超滤除菌：采用Pellicon超滤系统，孔径为8000道尔顿的超滤膜堆，将第二洗脱液浓缩，再除菌后保存于2～8℃。

本发明通过改进纯化工艺，使大规模发酵生产的发酵液可以经过阳离子交换和疏水层析两步工序即得以纯化，单次可纯化1L的发酵上清液；该方法能达到很好的纯化效果，纯化产物纯度达到98％，并且纯化后的基因重组α-半乳糖苷酶内毒素小于10EU，无热源；该方法简化了操作程序，较以往方法提高了产品收率10％，同时也提高了生产效率，节约了生产成本。

附图说明

图1为发酵中α-半乳糖苷酶工程菌生长曲线与α-半乳糖苷酶的表达量的关系图

图2为纯化后α-半乳糖苷酶的SDS-PAGE图及薄层扫描图谱

图3为重组α-半乳糖苷酶的纯度鉴定图谱

A.毛细管电泳鉴定；B.HPLC鉴定

具体实施方式

本发明主要是适应大批量生产基因重组α-半乳糖苷酶而提出的一种这对大批量发酵液的简便有效的纯化方法。

关于基因重组α-半乳糖苷酶的发酵液，是以使用基因工程技术获得的可分泌表达重组α-半乳糖苷酶的工程菌株，通过发酵罐发酵得到。所谓基因重组，是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合，形成新DNA分子的过程，这是自然界中普遍存在的生命现象。现代基因工程技术是在离体条件下对DNA分子切割并将其与载体DNA分子连接，得到重组DNA。1977年美国科学家首次用重组的人长激素释放抑制因子基因生产人生长激素释放抑制因子获得成功。此后，运用基因重组技术生产医药上重要的药物以及在农牧业育种等领域中取得了很多成果，预计下世纪在生产治疗心血管病、镇痛和清除血栓等药物方面基因重组技术将发挥更大的作用。

本发明中用到的基因重组α-半乳糖苷酶，可以为将包括大肠杆菌K-12、大豆、斑豆、瓜耳豆、咖啡豆、和人在内的所有微生物、植物、动物及人类的α-半乳糖苷酶基因构建到原核或真核表达载体中，然后在宿主细胞中表达，经分离纯化得到的有生物活性的重组酶。

以下以基因重组咖啡豆α-半乳糖苷酶工程菌pPIC9K-Gal/GS11在5L发酵罐中发酵为例，说明该发酵液的得到以及其进一步纯化的方法。

一、基因重组中国海南Catimor咖啡豆α-半乳糖苷酶的发酵

1、材料：

基因重组咖啡豆α-半乳糖苷酶工程菌pPIC9K-Gal/GS115(将pPIC9K-Gal质粒转化P.pastorisGS115筛选得到阳性克隆pPIC9K-Gal/GS115，质粒pPIC9K-Gal的构建、转化、筛选菌株的方法参见杨军，《中国生物化学与分子生物学报》第16卷第4期P438～442，2000年8月)，-20℃甘油保存。

2、主要培养基及组分配方：

10×YNB：在100ml水中溶解13.4g YNB，过滤除菌；

10×GY：混和5ml甘油和95ml水，高压灭菌；

500×B：在100ml水中溶解20mg生物素，过滤除菌；

1M PB(pH6.0)：混和13.2ml的K₂HPO₄(1M)和86.8ml的KH₂PO₄(1M)；

BMGY：在700ml水中溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，高压灭菌，用前加入10×YNB、10×GY和1M PB(pH6.0)各100ml，500×B 2ml；

PTM₁Trace盐：CuSO₄·5H₂O   6.0g

             NaI               0.08g

             MgSO₄·H₂O     3.0g

             NaMoO₂·2H₂O   0.2g

             H₃BO₃          0.02g

             CoCl              0.5g

             ZnCl₂            20.0g

    FeSO₄·7H₂O      65.0g

    生物素              0.2g

    H₂SO₄            5ml

    H₂O               加至1000ml，过滤除菌；

基础无机盐培养基(1L)：

    H₃PO₄(85％)      26.7ml

    CaSO₄             0.93g

    K₂SO₄           18.2g

    MgSO₄·7H₂O     14.9g

    KOH                4.13g

    甘油               40.0g

    H₂O              加至1000ml

    50％甘油           500ml

    消泡剂             50ml

3、操作过程：

操作过程控制的主要参数有：(1)种子液状况，包括显微镜镜检无细菌污染，小量摇瓶培养后测定上清液α-半乳糖苷酶的活性；(2)温度，28-30℃；(3)pH＝5.0；(4)溶氧＞20％；(5)搅拌速度，根据溶氧状况及时调整，一般情况起始速度300r/min，菌株扩增达到高密度时搅拌速度提高到1000r/min；(6)补料，发酵过程中及时添加补料，根据我们的实验结果，需添加50％的甘油500ml，甲醇3500ml。

(1)种子液的培养：取50l冻存菌，接种于含5ml BMGY的试管中，30℃、＞250rpm培养至浑浊；然后从培养物中取1ml接种于含400ml BMGY的培养瓶中，30℃、＞250rpm培养10h使其OD₆₀₀达到2-6，作为种子液。

(2)甘油培养相：将4.5L基础无机盐培养基加入到5L发酵罐中，灭菌。灭菌结束，冷却到30℃时将pH调节到5.0；然后加入20ml PTM1 Trace盐和400ml种子液；设定各参数：pH＝5.0、搅拌速度＝500r/min、溶氧值(dissolved oxygen，DO)＝20％、空气流速为0.5vvm，温度＝30℃；开始时DO应该接近100％，随着酵母的生长扩增，DO值会逐渐下降，通过调节转速和通气量使其维持在20％以上，当DO升高并维持不变时表示预先加在培养基内的甘油在18-24小时被消耗完毕(此时间根据接种量的不同而有变化)，此阶段细胞湿重达到90-150mg/ml；开始补加甘油(含有12mlPTM1 trace salts/l 50％甘油)，设定补加速度为18.15ml/hr/L。4小时后，细胞湿重达到180-220mg/ml。

(3)甲醇诱导相：终止加甘油，开始甲醇诱导(含有12ml PTM1 tracesalts/L 100％甲醇)，设定甲醇的速率为3.6ml/hr/L。当酵母完全适应甲醇以后(2-4小时)，会出现DO维持稳定，间或出现DO突然升高(大约维持1分钟以内)，然后将甲醇供给速率调整为7.3ml/hr/L，维持2小时后提高到10.9ml/hr/L，此速率维持剩下的发酵过程。整个甲醇诱导过程大约需要70小时，约消耗甲醇3500ml。在诱导结束时，细胞湿重大约为350-450g/L。

(4)监测：一般发酵5-7天，每4小时取样一次，测定OD_600nm和湿菌重量，作为监测指标，以及时调整发酵参数。

(5)收料：诱导结束后将所有的参数设置为停止，打开阀门，收集发酵产物。完毕后清洗发酵罐，并注满去离子水，重新进行灭菌，关闭电源。

4、发酵产物鉴定：发酵结束后测定发酵液总蛋白浓度和α-半乳糖苷酶活性。

材料：上述发酵液离心所得上清液；对-硝基-苯基-α-D-半乳吡喃糖苷购自宝灵曼公司；咖啡豆α-半乳糖苷酶标准品(50U/ml)购自Sigma公司；柠檬酸——磷酸缓冲液：混和30.75ml的0.1M柠檬酸和69.25ml的0.2M磷酸氢二钠，pH＝6.5；反应终止液：0.2M的硼酸钠，pH＝9.8；BCA蛋白浓度测定试剂盒为PIERCE公司产品。

方法：

1)、α-半乳糖苷酶活性测定：将对-硝基-苯基-α-D-半乳吡喃糖苷溶解于柠檬酸-磷酸缓冲液中，配成浓度为12.5M的底物溶液，稀释5倍后取25μl加入96孔酶联板中；先将咖啡豆α-半乳糖苷酶标准品用柠檬酸-磷酸缓冲液稀释500倍作为母液，再依次取母液400μl加入100μl柠檬酸-磷酸缓冲液中进行系列稀释，各取25μl加入96孔酶联板中；待测样品分别稀释50倍和250倍，同样各取25μl加入96孔酶联板中。以缓冲液为空白对照，设3组平行。然后于37℃反应1h，加入150μl终止液，在酶联仪上测定OD405。

2)、SDS-PAGE分析：按标准方法在10％的聚丙稀酰胺凝胶上进行SDS-PAGE，上样量为10μl，考马斯亮兰R-250染色。

3)、蛋白浓度测定：按试剂盒说明书操作，测定培养上清液中的蛋白浓度，其中标准BSA的浓度分别为2、1.5、1.25、1.0、0.75、0.6、0.5、0.25、0.1mg/ml，待测样品稀释2.5倍。在酶联仪上测定OD₅₇₀。

试验结果：

表1示出-次发酵液的鉴定结果。

时间(h)	OD值	湿重(g/ml)	活性(U/ml)	蛋白浓度(mg/ml)	比活性(U/mg)
						812162024283236404448525660646872768084889296100104108112120	7.69526.11274.7165.33218.8234.4230244.8302.8336.1347393.9393404.7421.7405442446447450466470483.5515529519523551	0.0250.0430.1070.1660.2090.2050.2160.2390.2480.2490.2590.2670.2680.2770.2850.2930.2930.2890.3180.3210.3290.320.3440.350.3570.3560.3620.368	15.1525115.4280616.7751916.8517318.7652823.4190125.9908131.7467437.1199732.9867239.3549848.6012256.7146368.4714378.4524775.9725277.67174	0.3703090.7764531.0831761.2122111.3835531.5802791.7643131.6860461.6395091.6627771.8023891.774891.7452751.8214272.155652.4306432.3819912.4602582.6485232.7500592.9594773.234473.784457	13.9889613.838512.5101813.2737215.852817.429617.2198513.5711916.5218919.7545221.4136924.8981726.508923.488420.52388

从表1中可以看到发酵上清液中α-半乳糖苷酶的最终活性为77.67174U/ml，蛋白最终浓度为3.784457mg/ml；比活性最高出现在108小时，为26.5089U/mg。

表2示出五次发酵产物的鉴定结果。

表2、五次发酵液的鉴定结果

	活性(u/ml)	蛋白浓度(mg/ml)	比活(u/mg)
				第1次(03.1.15)第2次(03.7.21)第3次(03.7.31)第4次(03.9.1)第5次(03.9.11)	7785.2384.2486.25164	3.784.52.962.873.57	20.518.9428.4630.0245.94

重复发酵实验，测得发酵上清液总蛋白浓度达2.8-4.5mg/ml，发酵上清液中α-半乳糖苷酶酶活性达70-200U/ml，发酵上清液α-半乳糖苷酶比活性达30U/mg以上。参见图1，为α-半乳糖苷酶工程菌的发酵时间与菌密度和α-半乳糖苷酶表达量的关系图。

二、基因重组中国海南兴隆Catimor咖啡豆α-半乳糖苷酶的纯化

重组α-半乳糖苷酶工程菌株分泌表达的产物直接分泌在培养基中，无需破菌，表达上清中杂蛋白含量较低。但由于发酵培养基中含有大量的无机盐和酵母代谢产物，因此需先去除发酵液上清中的小分子杂质，再进行离子交换层析。

纯化工艺中所用的水均为无热源水。以对1L发酵上清液的纯化为例，具体纯化步骤如下：

1.发酵液预处理：将上述得到的发酵液通过高速离心(10000rpm、4℃、20min)回收上清液。把9L浓度为0.2M的磷酸-柠檬酸缓冲液(10mmol/L柠檬酸，20mmol/L磷酸氢二钠，pH4.0)加入到1L的发酵液上清中，将发酵上清液的pH值调到4.0，磷酸-柠檬酸的终浓度为20mM。

2.阳离子交换：

a.以STREAMLINE-SP柱(2.5cm×100cm)(购于瑞典安法玛西亚公司)作为阳离子交换层析柱，用1N的NaoH溶液洗STREAMLINE-SP柱，再用无热源水洗至pH为中性；

b.用平衡缓冲液即20mM，pH4.0的柠檬酸—磷酸盐缓冲液平衡；将预处理的发酵上清液用平衡缓冲液10倍稀释；

c.平衡后上样，再用平衡缓冲液洗掉吸附的杂蛋白；(步骤a-c过程液体由下向上)

d.改变流路(由上往下)，待填料沉积后先用含0.07MNacl的柠檬酸—磷酸盐缓冲液(20mM，pH4.0)洗杂蛋白；再用含0.5MNacl的柠檬酸—磷酸盐缓冲液(20mM，pH6.0)进行洗脱，收集洗脱液。

e.用1N的NaoH溶液处理柱子，进入下一次纯化过程，暂时不用时则用20％的乙醇处理。

f.测定洗脱液的蛋白含量及活性，计算酶的比活性。

步骤2可去除绝大部分杂蛋白，使蛋白纯度达85％以上。

3.疏水层析：该步为精纯化，采用HiTrap Phenyl sepharose HP柱(购于瑞典安法玛西亚公司)，以去除杂蛋白和大部分的色素、热源质和核酸片段等非蛋白类杂质。

a.用HIC平衡缓冲液(含1M硫酸铵的柠檬酸—磷酸盐缓冲液，50mM，pH6.0)平衡HiTrap Phenyl HP柱3-5个柱体积，流速20ml/min；

b.向步骤3收集的洗脱液中加入3M硫酸铵溶液和pH6.0的200mM柠檬酸—磷酸盐缓冲液贮存液使之与HIC平衡缓冲液离子强度一致；

c.平衡后上样，流速20ml/min；

d.用HIC平衡缓冲液洗掉未结合的杂蛋白，

e.用洗脱液(含0.4M硫酸铵的50mM柠檬酸—磷酸盐缓冲液，pH6.0)进行洗脱，收集该洗脱液，

f.用水洗柱，

g.再用20％乙醇洗柱。

h.测定洗脱液中蛋白含量及活性，计算酶的比活性。

经过步骤3后，用SDS-PAGE及薄层分析，测得洗脱液中蛋白纯度可大于98％，结果参见图2。

4.超滤和过滤除菌：

采用Pellicon超滤系统，孔径为8000道尔顿的超滤膜堆，将洗脱液浓缩并换成PCS缓冲液(0.021M的柠檬酸钠，0.058M的磷酸氢二钠，0.077M的氯化钠，pH5.60±0.05)。

根据酶活性测定结果将检定合格的α-半乳糖苷酶浓缩液用PCS缓冲液稀释至所需浓度(200U/ml)，用0.22μm滤膜过滤除菌后保存于2-8℃。

产率计算：经上述纯化工序后，重组α-半乳糖苷酶纯品收率可以达到35％，较以往多步纯化工序收率提高了5～10％。

经过纯化后的重组α-半乳糖苷酶纯度鉴定：使用美国Beckman公司P/ACE5000型毛细管电泳仪对浓缩液进行重组酶蛋白的毛细管电泳分析，毛细管柱37cm×50μm，缓冲液为50mmol/L，pH2.5Tris-H₃PO₄，分离电压16kv，检测波长214nm，测得样品的相对含量为98.6％。同时使用美国惠普公司HP1100液相色谱仪，以ZORBAX ExtendC18柱进行反相高压液相分析，测得样品中主峰的相对含量为98.05％。结果参见图3。

相应放大柱的尺寸和溶液的用量，用同样的步骤可以纯化更大体积的发酵上清液，同样可以得到纯度在98％以上的重组α-半乳糖苷酶纯品，收率也在35％左右，在此不一一赘述。

三、基因重组α-半乳糖苷酶的应用

经本发明发酵和纯化得到的的重组α-半乳糖苷酶为均一蛋白制品，纯度可达到98％以上，内毒素小于10EU，无热源，可用于临床上B→O血型改造，食品添加剂，化工和制药等领域。以下以重组α-半乳糖苷酶用于B→O血型改造为例，说明本发明产物的应用。

从200ml全血中分离出约100mL的B型红细胞，经本重组α-半乳糖苷酶酶解后，与抗B抗血清凝集反应消失。进一步使用流式细胞仪分析的结果显示，酶解后的红细胞(ECORBC)的B抗原标记率为0.49％，与阴性对照O型红细胞的标记率(0.47％)，呈现O型红细胞特征，说明B→O血型改造是成功的。所制备的ECORBC经测定，反应红细胞结构与功能的各项一致指标包括红细胞形态、变形性、渗透脆性、溶血、乙酰胆碱酯酶、胆固醇、ATP、2，3-DPG、P50、高铁血红蛋白等均保持正常。此结果表明，本发明制备的重组α-半乳糖苷酶可有效地将B型红细胞改造成O型红细胞，而不影响结构与功能。

Claims (3)

1、一种基因重组α-半乳糖苷酶大批量发酵液的纯化方法，其特征在于，包括将所述发酵液依次经过阳离子交换层析和疏水层析两步得到纯度为98％以上的重组α-半乳糖苷酶的过程，具体包括以下步骤：

1)发酵液预处理：将所述发酵液通过高速离心回收上清液，用0.2M，pH4.0的磷酸-柠檬酸缓冲液将上清液的pH值调到4.0；

2)阳离子交换：

a.以STREAMLINE-SP柱作为阳离子交换层析柱，用1N的NaOH溶液由下向上洗STREAMLINE-SP柱，再用水洗至pH为中性；

b.用平衡缓冲液平衡STREAMLINE-SP柱，所述平衡缓冲液为pH4.0的20mM的柠檬酸-磷酸盐缓冲液；

c.平衡后上样，用平衡缓冲液由下向上洗掉杂蛋白；

d.改变流路，待填料沉积后先用含0.07MNaCl的柠檬酸-磷酸盐缓冲液由上向下洗杂蛋白，再用含0.5MNaCl的柠檬酸—磷酸盐缓冲液由上向下进行洗脱，收集第一洗脱液；

3)疏水层析：

a.用50mM、pH6.0、含1M硫酸铵的柠檬酸-磷酸盐缓冲液即HIC平衡缓冲液平衡HiTrap Phenyl HP柱3-5个柱体积，流速20ml/min；

b.向第一洗脱液中加入3M硫酸铵溶液和pH6.0的200mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液贮存液使之与HIC平衡缓冲液离子强度一致；

c.平衡后上样，流速20ml/min；

d.用HIC平衡缓冲液洗掉杂蛋白；

e.用pH6.0、含0.4M硫酸铵的50mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液作洗脱液进行洗脱，

收集第二洗脱液；该第二洗脱液得到的为纯度98％以上的重组α-半乳糖苷酶。

2、根据权利要求1所述的基因重组α-半乳糖苷酶大批量发酵液的纯化方法，其特征在于，纯化过程中所有用水均为无热源水。

3、根据权利要求1或2所述的基因重组α-半乳糖苷酶大批量发酵液的纯化方法，其特征在于，还进一步包括步骤4)超滤除菌：采用Pellicon超滤系统，孔径为8000道尔顿的超滤膜堆，将第二洗脱液浓缩，再除菌后保存于2～8℃。

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