CN1158388C - 连续灌流式培养杂交瘤细胞制备抗体的方法 - Google Patents

Abstract

该连续灌流式培养杂交瘤细胞制备抗体的方法，由接种细胞—连续灌流培养—检测方法—细胞代谢、生长速率、产物合成平衡调控分析—产物回收纯化过程完成，接种细胞是采用固定床填充巨载体，细胞代谢、生长速率、产物合成平衡调控是对葡萄糖、乳酸———以及pH值等指标进行分析，在细胞由对数生长期进入衰退期之前，添加相应的氨基酸，并降低葡萄糖和血清浓度，细胞由以生长代谢为主转为以产物合成为主，进入稳态培养，此方法反复应用，实现多个稳态，达到高密度、高产量的长期培养；产物回收纯化是采用Streamline SP介质，一步回收培养上清中的抗体，DEAE-Sepharose FF阴离子交换剂去除纯化后抗体产品中的热源质，成品冻干。

Description

连续灌流式培养杂交瘤细胞制备抗体的方法

技术领域

本发明是属于生物工程技术，动物细胞(这里指杂交瘤细胞)大规模培养及动物细胞生产蛋白质的制备工艺

背景技术

工程抗体在基础医学研究、临床诊断和治疗，以及免疫预防等领域中的广泛应用，大大促进了产业化的进程。原始的单克隆抗体生产方法，是将杂交瘤细胞注射小鼠腹腔体内，收集腹水经过纯化获得单克隆抗体。这种生产方法主要用于实验室研究和临床前研究，无法实现产业化，并且不可避免鼠类动物感染疾病污染物的污染，因此很难满足临床应用的需要。目前工业化生产单克隆抗体的主要方法是通过微载体的发酵罐、中空纤维和固定床式等生物反应器培养系统，以及微包囊法在体外大规模高密度培养杂交瘤细胞，或工程抗体表达的CHO细胞、昆虫细胞和微生物等，再通过相关的纯化手段浓缩纯化制备抗体。目前，动物细胞大规模培养的有关研究内容主要包括高密度和高表达细胞的培养环境及条件，促进单个细胞的基因合成和产物表达，改进培养系统的氧传递方式，以及减少剪切力和降低生产成本的培养条件等。此外，还包括采用灌注(灌流)系统连续培养动物细胞，同时开发无血清培养基和贴壁依赖性细胞的有效载体系统，和动物细胞生长性质的驯化等。动物细胞培养无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，就操作方式而言，主要分为分批式(batch)，流加式(fed-batch)和灌流式(perfusion)三种操作方式。连续灌注(灌流)培养法是近年来用于哺乳动物细胞培养生产分泌型重组治疗性药物如单克隆抗体、嵌合抗体以及人源化抗体等基因工程抗体较为推崇的一种操作方式。连续灌注式培养法是指把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。它最大的优点是：①细胞可处在营养的培养环境中，有害代谢废物浓度较低；②细胞密度较高，一般可达10⁷-10⁸cells/ml，从而较大的提高了产品的产量；③由于其培养细胞的密度大，且存活时间长，因此目标产品回收率高；④产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，有利于保持产品的活性。但由于哺乳动物细胞体外培养的复杂性，常会出现细胞维持时间短、密度及活性低等问题，限制了细胞产品产量、质量的提高和生产成本的降低。目前世界众多的研究领域将研究热点集中于动物细胞代谢调控、反应器操作模式和控制策略上，以实现细胞培养时间延长、细胞密度提高和细胞比生产率的提高。Foltshd于1999年对杂交瘤细胞CRL-1606进行的连续培养中，应用限制培养基营养成分的方法，观察到了两种不同的生理稳态。在谷氨酰胺限制的高效稳定状态中，丙酮酸代谢中的碳源流向TCA循环，营养成分的代谢流量分布更为有效，同低效的稳定状态比较，细胞密度升高进2倍(从7.36×10⁵cells/ml至1.36×10⁵cells/ml)，而细胞生长速率和活性相似。1999年Siegwart对HEK-293细胞的连续灌流培养中，维持葡萄糖和谷氨酰按浓度在较低水平，营养成分利用率提高，有害产物积累减少，细胞可达到稳定状态。

通过发酵罐、中空纤维和固定床等生物反应器系统制备单克隆抗体，其特点和优势之一就是回收液中目标产品明确，减少了鼠源病毒异种蛋白的污染，在无血清或低血清培养基其污染成分更少，易于纯化；但其回收体积较大，含有细胞和细胞碎片，如何保持蛋白质的生物学活性，分离纯化出高纯度、一致性的单克隆抗体是下游工艺的关键。目前单抗产品浓缩纯化工艺多采用盐析、超滤、离心，色谱分离等方法，新型下游纯化设备-Streamline，是专为大规模培养下游产品纯化而开发的扩张柱床吸附技术，从含有一些有形成份(如细胞和细胞碎片)的粗制样品中捕获目标蛋白，省去预先超滤、离心等步骤。单一操作单元可同时起到澄清、浓缩和粗纯化三方面的作用，因而能在短时间内获得高的产品回收率，而且很容易放大规模。用扩张柱床吸附技术纯化单抗类产品，国外文献已有报道。Fahrner等人用Streamlineprotein A纯化回收一株重组人源化单抗，以Streamline 2.5cm内径柱作小试，并放大到生产规模的streamline 60及80cm内经柱，其单抗回收率为97％±，抗体浓度为9.6g/L±。Streamliner Protein A是一种亲合层析介质，因而用一步纯化即可达到较高的纯度和回收率，但这种介质的寿命较短，价格相对于streamline SP高出近16倍，且对鼠IgG亚类的单抗吸附效率较低。

发明内容

本发明的目的是为了使培养杂交瘤细胞生产抗体过程进一步优化，而提供一种用连续灌流式培养杂交瘤细胞制备抗体的工艺方法，达到提高细胞密度，促进单个细胞的产率，实现高密度、高产量的长期培养；同时一步回收培养上清中的抗体。

本发明的目的是以下列技术方案来实现：该连续灌流式培养杂交瘤细胞制备抗体的工艺方法，主要由接种细胞——连续灌流式培养——检测方法——细胞代谢、生长速率、产物合成平衡调控分析——产物回收纯化的过程完成。其中，接种细胞是采用固定床填充巨载体，接种细胞密度应大于2-3×10⁵/ml；细胞代谢、生长速率、产物合成平衡调控是通过在线监测葡萄糖、乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、耗氧速率(OUR)以及pH值指标获得，同时监测细胞比生长速率、抗体比生成速率及氨基酸消耗量；在细胞由对数生长期进入衰退期之前，添加相应的氨基酸，并降低葡萄糖和血清浓度，以及控制灌流量，使细胞由以生长代谢为主转为以产物合成为主，进入稳态培养。上述方法的反复应用，可实现多个稳态，达到高密度、高产量的长期培养；产物回收纯是采用Streamline SP介质，一步回收培养上清中的抗体，DEAE-Sepharose FF阴离子交换剂去除纯化后抗体产品中的热源质，抗体成品冻干保存。细胞生长进入衰退期之前的主要指标是ΔOUR＜0.1mmol/l/h(指每12小时OUR两点间的变化率，其中“Δ”表示两点间差值的通用数学符号，它在生物学上也经常出现，例如：华东理工大学出版社于1992年5月第一版、1999年8月第5次印刷的《生物工艺学》下册的内容中第17页15行出现“Δtm”-培养基和降温水的平均温差；第27页3行“Δp”---空气流过丝网除雾器的压降，即压力差；39页4行“Δpi”---各阶段的推动力分压差等等)、葡萄糖消耗大于50％。添加的相应氨基酸包括必需氨基酸和非必需氨基酸，添加氨基酸的量由相应细胞和产物所消耗氨基酸的量而补加，逐渐递减降低葡萄糖和血清的浓度，使其进入稳态培养。稳态的指标是指乳酸生成速率与葡萄糖消耗速率比值保持较低水平，细胞比生长速率(μ)相对恒定。培养上清中的抗体是指单克隆抗体。抗体产物培养上清调解pH值是4-7，电导值是2-5mS/cm；平衡液(A液)是pH 4-7；洗脱液(B液)是A液+1M NaCl。产物回收纯中的DEAE-Sepharose FF阴离子交换剂去除纯化后抗体产品中的热源质，在pH 4～7的条件下，热源吸附于柱上，抗体在穿过峰中流出；再以1M NaCl和0.5M NaOH去除吸附于柱上的热源，柱子可重复使用。

我们的研究证实：1.在杂交瘤细胞大规模培养中，葡萄糖和谷氨酰胺消耗处于低水平时，氨基酸成为限制细胞密度提高的重要因素，氨基酸等营养物质的耗竭亦是引起凋亡的主要原因。2.在培养初期和对数生长期要注重培养条件对细胞的生长刺激作用，维持细胞高密度增长提高产率；进入一定的稳定期后要维持细胞正常生长，在培养基中添加合适的氨基酸等营养物质，抑制细胞凋亡，延长培养时期，增加单克隆抗体的产率。3.灌流式生物反应器的操纵上，大量补充新鲜培养基未必能刺激细胞增殖提高细胞的生产力。在细胞进入一定的稳态后，要逐渐降低血清、糖、谷氨酸的浓度，使细胞生长停滞或缓慢，大部分细胞由再增殖而转为生产蛋白，从而提高抗体和异源蛋白产量。

本发明的优点是：对连续灌流式培养杂交瘤细胞制备抗体的整个制备工艺进行过程优化，实现多个稳态培养，杂交瘤细胞在低/无血清培养基连续培养20-40天，最大细胞密度可达3-9×10⁷/ml，抗体产量200-800mg/L/d。这种成本低、易于操作的细胞能量代谢转移研究，为实现高密度、高产率的细胞培养优化工艺展开了广阔的应用前景。选择Streamline SP介质，在适宜的条件下，同样取得了理想的效果，抗体回收率大于90％，大大降低了工艺成本。本发明采用DEAE-Sepharose FF阴离子交换剂，在pH 4-7的条件下，使热原吸附于柱上，而抗体在穿过峰中流出，有效去除了热源污染。再以1MNaCl和0.5M NaOH去除吸附于柱上的热原，柱子可重复使用。该方法操作简便，除热原效果理想。

附图说明

图1是未生长细胞的载体Disk的结构图。

图2是杂交瘤细胞贴附生长在载体Disk上视图。

图3是连续培养中抗体分泌量与细胞活性关系图。

图4连续培养中抗体分泌量与细胞耗氧速率关系图。

图5是葡萄糖消耗量与灌流体量关系图

具体实施方式

本发明的目标产品是杂交瘤细胞(HAb18)分泌的鼠源性单克隆抗体(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心管藏，管藏时间为1999年12月6日，编号CGMCC NO.0426)。¹³¹I-HAb18 F(ab’)₂肝癌单抗注射液现已进入II、III期临床验证。肝癌单抗HAb18 IgG1和F(ab’)₂片段抗体对原发性肝细胞癌有高度的特异性和亲合性。本发明的制备工艺和技术路线可应用与单克隆抗体和人源化抗体的中试研究与大规模生产。其步骤如下：

一、杂交瘤细胞(HAb18)的大规模培养：

1、种子细胞的制备

(1)种子细胞的扩增

HAB18杂交瘤细胞是用新鲜肝癌手术标本的细胞悬液免疫BABL/c小鼠取其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP/20细胞融合制备获得。1987年8月建株，至今一直稳定分泌抗人肝细胞癌的抗体。HAb18杂交瘤细胞种子细胞株的保管分原始细胞库和生产细胞库，原始细胞库只用于保存细胞建株时较为原始的细胞株，以免在发生意外时进一步进行检测或扩增培养；生产细胞库保存的细胞株经质量控制后大量培养冻存，每次生产时取出一管进行复苏、扩增及生产，不再回冻。培养扩增用100ml玻璃培养瓶置于37℃的CO₂培养箱内进行，然后转入850ml罗氏瓶中进一步扩增，待细胞生长到一定密度时接种到生物反应器中。

(2)培养液的配制

用于细胞培养的培养基都是商品化的干粉合成培养基。用去离子(18兆欧姆)的无热原水，无菌过滤配制。HAb18杂交瘤细胞培养用HYCLONE公司的CCMI无血清培养基，根据需要加入一定量的血清、氨基酸、添加剂等，然后调pH为7.2。

2、接种细胞

(1)生物反应器

5L CELLIGEN生物反应器(美国NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC公司)，工作容积3.5L，罐体中间固定床填装200g的巨载体(美国NBS公司)，比表面积120cm²/cm³(见图一)。采用连续灌流式培养，搅拌与通气在固定床的上方，在搅拌中产生负压，使杂交瘤细胞固定吸附于栽体上(见图二)，培养基不段流经中间巨载体，有利于营养物质和气体的传递。

(2)接种细胞

生物反应器填充载体，注入0.01M pH7.2 PBS高压消毒120℃ 80分种；接种细胞前需将反应器中的PBS放出并加入新培养基；开机后将温度、搅拌速度、pH、溶氧等各项参数按具体要求设置好后，并观察1～2天无异常变化时再接种细胞。一般接种细胞密度为2-3×10⁵/ml，严格的无菌操作以防污染。

(3)各种参数的设定与监控

杂交瘤细胞的培养温度设定为3 7℃，pH为7.2～7.4；溶氧为40～50％，搅拌速度60～110转/分，气体(氧气、空气、二氧化碳、氮气)的比例由生物反应器自动化控制。细胞接种前、后即时取样测定实际的细胞数和葡萄糖含量，以后按时间点取样测定耗氧速率(OUR)、葡萄糖、氨基酸、分泌产物定量、乳酸和谷氨酸的浓度。连接Biocommard程序控制软件，通过计算机在线监控，根据测定的参数变化调整其培养基配比、灌流量、搅拌速度和溶氧等参数。

3、连续灌流培养

接种细胞后根据在线监测耗氧速率(OUR)、葡萄糖、氨基酸、分泌产物定量、乳酸和谷氨酸的量的变化，当葡萄糖含量≤50％，ΔOUR＜0.1mmol/L/h时，开始灌流培养液，流量0.5个罐体积，连续灌流培养；当葡萄糖含量≤50％，ΔOUR＜0.1mmol/L/h时，再增大灌流量(见图五)。

4、检测方法

(1)生化指标检测分析

用生化分析仪2730(AMPLE公司)检测葡萄糖、乳糖、半乳糖、乳酸、谷氨酸等，测定不同时间点细胞培养上清中的营养消耗与代谢产物生成。

(2)氨基酸分析检测

取原始培养液和不同时间点的杂交瘤细胞培养上清，在美国惠普1100高效液相色谱，用磷苯二甲醛(OPA)标前衍生化外标定量测定法测定氨基酸含量。

(3)抗体检测

酶联免疫吸咐试验ELIAS夹心法，羊抗鼠IgG和酶标羊抗鼠IgG均购自SIGMA公司。纯化小鼠IgG本室自制，送检中国生物制品检定所其纯度大于98％。设严格的阴阳性对照，每块板用纯化小鼠IgG做标准曲线，阴性对照为稀释样品用的稀释液，待测孔O.D.值大于阴性对照孔两倍以上为阳性孔，根据同一条件标准曲线计算小鼠IgG的含量。

(4)活细胞计数

用胎盼蓝染色法对杂交瘤细胞进行死活细胞计数。

5、细胞代谢、生长速率、产物合成平衡调控分析

要实现动物细胞的高密度长期培养，首先要掌握细胞代谢规律、生长速率和产物合成的关系，以寻求最佳的培养工艺。

所采用的技术路线(以杂交瘤细胞HAb18的培养工艺为例)：

杂交瘤细胞HAb18接种生物反应器

               ↓细胞密度2-3×10⁵/ml

CCMI无血清培养基(1％牛血清)

                      ↓在线检测3天

              ↓          ↓

细胞密度活性  生化指标           抗体分泌速率

(当ΔOUR＜0.1mmol/L/h，葡萄糖＜50％)↓

(0.5-1v)开始灌流培养基(0.5％血清)

              ↓

第一个稳定期(2-3天)

(当ΔOUR＜0.1mmol/L/h，葡萄糖＜50％)↓

有目的添加氨基酸，0.5％血清培养基灌流量(1v)(亮、苯丙、、蛋、苏氨酸)↓(8-24μmol/L)

第二个稳定期(3-5天)

当ΔOUR＜0.1mmol/L/h，葡萄糖＜50％ ↓补加浓缩氨基酸，无血清培养基，灌流量(1-2v)(亮、苯丙、、蛋、苏、异亮、赖、色氨酸)↓(20-40μmol/L)ΔOUR≤O细胞生长速率抗体比生长速率Δ＝O  氨↑ 乳酸↑ 葡萄糖↓

                ↓增加灌流量

        细胞生长与抗体生成的第三稳态

                ↓在线检测

调整培养基组分降低糖的浓度，补加浓缩营养成分

              ↓增加灌流量

                新的稳态出现

                     ↓

                  收获抗体

连续培养中抗体分泌量与细胞活性的关系见图3；

连续培养中葡萄糖消耗量与灌流量的关系见图5；

连续培养中抗体分泌量与细胞耗氧速率的关系见图4。

二、产物的回收与纯化

Streamline扩张床(Amersham pharmacia公司)是专为动物细胞大规模培养下游产物回收纯化而开发的流化床吸附技术。我们采用Streamline流化床SP阳离子交换介质，杂交瘤细胞培养上清直接上柱捕获目标蛋白。单一操作单元可同时起到澄清、浓缩和粗纯化三方面的作用，因而能在短时间内获得高的产品回收率，而且，很容易根据需要放大规模。

1、抗体回收与纯化工艺流程：

培养上清0.01～1M HCl调节pH至6，电导值2-5mS/cm

                   ↓

10-20mM的柠檬酸、PH6平衡、扩张Streamline50流化床

                 ↓

            上样 (流速200-400cm/h)

                 ↓

pH6、10-20mm柠檬酸(A液)冲洗

                 ↓

A液+1M NaCl(B液)洗脱，流速50-150cm/h

                 ↓

收集洗脱峰，0.291g/ml硫到铵盐析，静置

              ↓离心10000rpm×10’

                   ↓

pharyl-sepharose HP疏水柱纯化

                     ↓

             收集第一洗脱峰IgG，

2、抗体产品除热源：

              0.291g/ml的硫酸铵盐析

                      ↓静置离心10000rpm×10

pH5、10-20mM的NaAc缓冲液(A液)溶解，透析

                         ↓

              A液平衡DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱

                             ↓

                     上样、收集穿过峰IgG

                             ↓

               0.01M pH7.4、PBS溶解、透析

                             ↓

                        分装、冻干

3、产品的冻干

纯化后HAb18 IgG溶液调整浓度至8-10mg/ml

                      ↓

按10％(w/v)添加蔗糖，过0.2μm除菌滤膜

按5mg/瓶分装至2ml西林瓶中，半加塞

                      ↓

                     冻 干

Claims (3)

1、一种连续灌流式培养杂交瘤细胞制备抗体的方法，它主要由接种细胞-连续灌流培养-检测方法-细胞代谢、生长速率、产物合成平衡调控分析一产物回收纯化过程完成，其特征是接种细胞是采用固定床填充巨载体，接种细胞密度应大于2-3×10⁵/ml；细胞代谢、生长速率、产物合成平衡调控是通过在线监测葡萄糖、乳酸、谷氨酸、谷氨酰胺、耗氧速率OUR以及pH值指标获得，同时监测细胞比生长速率、抗体比生成速率及氨基酸消耗量，在细胞由对数生长期进入衰退期之前，即主要指标是ΔOUR＜0.1mmol/l/h，葡萄糖消耗大于50％，添加相应的氨基酸，并降低葡萄糖和血清浓度，以及控制灌流量，使细胞由以生长代谢为主转为以产物合成为主，进入稳态培养，其中，添加的相应氨基酸包括必需氨基酸和非必需氨基酸，添加氨基酸的量由相应细胞和产物所消耗氨基酸的量而补加，降低葡萄糖和血清的浓度采用逐渐递减方式，使其进入稳态培养的指标，即乳酸生成速率与葡萄糖消耗速率比值保持较低水平，保证细胞比生长速率μ相对恒定；产物回收纯是采用Streamline SP介质，一步回收培养上清中的抗体，DEAE-Sepharose FF阴离子交换剂去除纯化后抗体产品中的热源质，抗体成品冻干保存。

2、根据权利要求1所述的连续灌流式培养杂交瘤细胞制备抗体的方法，其特征是所述培养上清中的抗体是单克隆抗体，抗体产物培养上清调解pH值是4-7，电导值是2-5mS/cm；平衡液A是pH4-7；洗脱液B是平衡液A+1M NaCl。

3、根据权利要求1所述的连续灌流式培养杂交瘤细胞制备抗体的方法，其特征是所述DEAE-Sepharose FF阴离子交换剂去除纯化后抗体产品中的热源质，是在pH 4～7的条件下，热源吸附于柱上，抗体在穿过峰中流出；再以1M NaCl和0.5M NaOH去除吸附于柱上的热源，柱子可重复使用。

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