MXPA01009222A

MXPA01009222A - Preparaciones medicas para el tratamiento de deficiencia de alfa-galactosidasa a.

Info

Publication number: MXPA01009222A
Application number: MXPA01009222A
Authority: MX
Inventors: Richard F Selden
Original assignee: Transkaryotic Therapies Inc
Priority date: 1999-03-11
Filing date: 2000-03-09
Publication date: 2002-06-04
Also published as: EP2186902B1; EP3231871A1; DE60038104D1; EP2314699B1; CN106110309A; JP5615648B2; WO2000053730A3; JP6626071B2; KR20070090277A; CA2833396A1; DE60038104T2; JP6081980B2; IL145381A; US20110280856A1; JP2002538183A; ES2391221T3; WO2000053730A9; PL350658A1; CN1354796A; CN101219213A

Abstract

La invencion proporciona ?-Gal A altamente purificada y varios metodos para purificarla; preparaciones de ?-Gal A con carga alterada y metodos para elaborar esas preparaciones; preparaciones de ?-Gal A que tienen una vida media de circulacion extendida en un huesped mamifero, y metodos para elaborar las mismas-, y metodos y dosis para administrar una preparacion de ?-Gal A a un sujeto.

Description

PREPARACIONES MÉDICAS PARA EL TRATAMIENTO DE DEFICIE NCIA DE ALFA-GALACTOSIDASA A Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos y composiciones para el tratamiento de deficiencia de a-gaiactosidasa A.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Fabry es una enfermedad de almacenamiento lisosomal heredada enlazada a X caracterizada por deterioro renal severo, angioqueratomas; y anormalidades cardiovasculares, incluyendo alargamiento ventricular e insuficiencia de la válvula mitral. La enfermedad de Fabry también afecta el sistema nervioso periférico, causando episodios de agonía, escozor en las extremidades. La enfermedad de Fabry se causa por una deficiencia en la a-galactosidasa A (a-Gal A). a-Gal A es la glicohidrolasa lisosomal que separa las porciones de a-galactosil terminales de varios glicoconjugados. La enfermedad de Fabry resulta en un bloqueo del catabolismo del glicosfingolípido neutral, trihexósido de ceramida (CTH) y acumulación de este substrato de enzima dentro de las células y en la corriente sanguínea. Debido al patrón heredado enlazado a X de la enfermedad, la mayoría de los pacientes con la enfermedad de Fabry son hombres.

Aunque los heterocigotos femeninos severamente afectados se han observado, los heterocigotos femeninos con frecuencia son asintomáticos u tienen síntomas relativamente suaves (tales como una opacidad característica de la córnea). Una variante atípica de la enfermedad de Fabry, que muestra baja actividad de a-Gal A residual y cualquiera de los síntomas suaves o aparentemente ningún otro síntoma característico de la enfermedad de Fabry, se correlaciona con la hipertrofia ventricular izquierda y la enfermedad cardiaca. Nakano et al. , New Engl. J. Med. 333 288-293 (1 995). Una reducción en a-Gal A puede ser la causa de tales anormalidades cardíacas. El cADN y gen que codifica a-Gal A humana se han aislado y secuenciado. a-Gal A humana se expresa como un polipéptido de 429 aminoácidos, de los cuales 31 aminoácidos de terminal N son el péptido de señal. La enzima humana se ha expresado en células de Ovario de Hámster Chino (CHO) (Desnick et al., Patente de E. U . 5,356,804; loannou er al., J. Cell. Bio. 1 19: 37 (1992)); y células de insecto (Calhoun et al., WO 90/1 1353). Sin embargo, las preparaciones actuales de a-Gal A tienen eficacia limitada. Los métodos para la preparación de a-Gal A con pureza relativamente elevada dependen del uso de cromatografía por afinidad utilizando una combinación de cromatografía por afinidad de lectina (concanavalin A) (Con A) Sepharose®) y cromatografía por afinidad en base a la unión de a-Gal A al análogo de substrato N-6-aminohexanoil-a-D-galactosilamina acoplado a una matriz Sepharose®. Ver, por ejemplo, Bishopo et al. , J. Biol. Chem. 256: 1 307-1 316 (1981 ). El uso de resinas de por afinidad de lectina proteínica y las resinas del análogo de substrato típicamente se asocia con la lixiviación continua del agente de afinidad del soporte sólido (Marikar er al., Anal. Biochem. 201 : 306-310 (1992) que resulta en la contaminación del producto purificado con el agente de afinidad ya sea libre en solución o unido a la proteína eluida . Tales contaminantes hacen al producto inadecuado para utilizarse en preparaciones farmacéuticas. Ambos análogos de substrato y lectinas también pueden tener efectos negativos substanciales en las propiedades enzimáticas, funcionales o estructurales de las proteínas. Además, a-Gal A producida por los métodos de la técnica anterior se elimina rápidamente por el hígado. De esta manera, existe permanece una necesidad en la materia de un procedimiento de purificación que utiliza resinas de cromatografía convencionales, que se encuentran fácilmente disponibles en suministros y calidad adecuados para el uso comercial a gran escala, y que produce una preparación de a-Gal A que es libre de un agente de afinidad. Además, permanece una necesidad en la materia de preparaciones de a-Gal A con una vida media circulante incrementada y toma incrementada en tejidos específicos diferentes al hígado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona preparaciones de a-Gal A altamente purificadas, y varios métodos para purificar las glicoformas de a-Gal A. La invención también proporciona preparaciones de a-Gal A con carga alterada y métodos para elaborar esas preparaciones. Las alteraciones de carga se logran al incrementar el contenido de ácido siálico de a-Gal A y/o al incrementar la fosforilación de a-Gal A. La invención proporciona además preparaciones de a-Gal A que tienen una vida media circulante extendida en un huésped mam ífero , y métodos para elaborar las mismas. Finalmente, la presente invención proporciona además métodos y dosis par administrar una preparación de a-Gal A a un sujeto. Las preparaciones de a-Gal A de la presente invención será útiles para el tratamiento de individuos con enfermedad de Fabry o variantes atípicas de la enfermedad de Fabry, por ejemplo, poblaciones específicas de pacientes con Fabry con anormalidades predominantemente cardiovasculares, tales como alargamiento ventricular, por ejemplo, hipertrofia ventricular izquierda (LVH), y/o insuficiencia de la válvula mitral, o pacientes con Fabry con lesiones predominantemente renales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación de la sonda 21 0 bp que se utiliza para aislar un cADN de a-Gal A de una biblioteca de cADN de fibroblasto humano (SEQ ID NO: 1 ). La secuencia es de exón 7 del gen de a-Gal A. La sonda se aisla de ADN genómico humano por la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Las regiones subrayadas en la figura corresponden a las secuencias de las cargas de inicio de amplificación . La Figura 2 es una representación de la secuencia del fragmento de ADN que completa el extremo 5' del clon de cADN de a-Gal A (SEQ ID NO:2). El fragmento se amplifica de ADN genómico humano por PCR. Las regiones subrayadas corresponden a las secuencias de las cargas de inicio de amplificación . Las posiciones de los sitios de endonucleasa de restricción Ncol y Sacll que se utilizan para la subclonación como se describe en el Ejemplo 1 , también se muestran.

La Figura 3 es una representación de la secuencia de cADN de a-Gal A, que incluye la secuencia que codifica el péptido de señal (SEQ ID NO: 3). La Figura 4 es un mapa esquemático de pXAG-16, una construcción de expresión de a-Gal A que incluyen el promotor de CMV (citomegalovirus), exón 1 , y el primer intrón, la secuencia que codifica el péptido de señal hGH y el primer intrón , el cADN para a-Gal A (que carece de la secuencia del péptido de señal de a-Gal A) y UTS hHG 3'. pCDNeo indica la posición del gen neo derivado del plásmido pcDNeo. La Figura 5 es un mapa esquemático de pXAG-28, una construcción de expresión de a-Gal A que incluye el promotor Ia2 de colágeno y el primer exón, un intrón de ß-actina, la secuencia que codifica el péptido de señal hGH y el primer intrón, el cADN para a-Gal A (que carece de la secuencia del péptido de señal de a-Gal A) y UTS hHG 3'. pCDNeo indica la posición del gen neo derivado del plásmido pcDNeo. La Figura 6 es una representación de la secuencia de aminoácidos de a-Gal A humana (SEQ ID NO:4). La Figura 7 es una representación de la secuencia de cADN que codifica a-Gal A humana (sin péptido de señal) (SEQ ID NO:5). La Figura 8 es una cromatograma de la etapa de purificación de a-Gal A utilizando resina Butyl Sepharose®. La absorbencia a 280 nm (línea plana) y la actividad de a-Gal A (línea punteada) de las fracciones seleccionadas, se muestran. La Figura 9 es un mapa esquemático de pGA213C. La Figura 1 0 es una representación diagramática de la construcción objetivo, pGA21 3C, y la recombinación homologa con el lugar de a-galactosidasa A endógena. pGA21 3C se representa como secuencias objetivo alineadas arriba de las secuencias correspondientes del lugar de a-galactosidasa A cromosómica X. Las posiciones relativas del codón de iniciación de metionina, ATG, se indican por los números arriba de los mapas lineares. La unidad de activación que contiene dhfr de murino, neo bacterial, y secuencias de promotor de CMV/intrón de aldolasa se muestra arriba de la posición (-221 ) en la cual se insertan por la clonación de ADN . Las secuencias de codificación de a-galactosidasa A se indica por las cajas obscuras. Las secuencias genómicas sin codificación de a-galactosidasa A se indican por las cajas ligeramente llenadas. Las cabezas de las flechas grandes indican la dirección de la transcripción de los casettes de expresión de neo y dhrf. La separación del mARN de GA-GAL después del objetivo exitoso y la activación del gen se indica por la línea segmentada abajo del mapa del lugar de a-galactosidasa (GA-GAL) A activado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Introducción La invención descrita en la presente se refiere a ciertas nuevas preparaciones de a-Gal A y métodos para elaborarlas, así como también métodos para tratar pacientes con enfermedad de Fabry o variantes atípicas de enfermedad de Fabry utilizando esas preparaciones. Ciertas modalidades representativas contempladas se resumen y describen en mayor detalle abajo.

La invención utiliza a-Gal A producida en cualquier célula (una célula de producción de a-Gal A) para el tratamiento de enfermedad de Fabry. En una modalidad preferida , la invención utiliza a-Gal A producida utilizando técnicas de formación genética estándar (en base a la introducción del gen de a-Gal A clonado o cADN en una célula huésped), o activación del gen . La invención proporciona preparaciones, y métodos para elaborar los mismos, que contienen una a-Gal A de pureza elevada que la preparada en la técnica anterior. Utilizando los métodos de purificación de 10 la presente invención, las composiciones de las preparaciones de a-Gal A humana se purifican preferentemente a al menos 98% de homogeneidad, más preferentemente a al menos 99% de homogeneidad, y más preferentemente a al menos 95% de homogeneidad, como se mide por SDS-PAGE o HPLC de fase inversa. La actividad específica de las 15 preparaciones de a-Gal A de la presente invención es preferentemente ai menos 2.0 x 106 unidades/mg de proteína, más preferentemente al menos 3.0 x 1 06 unidades/mg de proteína y más preferentemente al menos 2.0 x 106 unidades/mg de proteína. En una modalidad, una preparación de a-Gal A se purifica al 20 separar las diversas glicoformas de a-Gal A de otros componentes en una resina de interacción hidrofóbica , pero no incluyen una etapa de cromatografía de lectina. En una modalidad preferida, la porción funcional de la resina de interacción hidrofóbica incluye un grupo butilo. En una modalidad alternativa, la preparación de a-Gal A se 25 purifica al unir primero las diversas glicoformas de a-Gal A a una resina ^^fc^ fea^jg^g de intercambio de catión en una columna de pH acídica en un regulador de equilibrio. La columna se enjuaga entonces con el regulador de equilibrio para eluir el material sin unir, y las diversas glicoformas de a-Gal A se eluyen utilizando, como una solución de elusión , una solución de sal de 5 1 0-1 00 mM, una solución regulada de pH 4-5, o una combinación de la misma. En una modalidad preferida, el regulador de equilibrio tiene un pH de aproximadamente 4.4. En otra modalidad alternativa, una preparación de a-Gal A se purifica al separar las diversas glicoformas de a-Gal A en una muestra de 10 los otros componentes en la muestra que utilizan un procedimiento de purificación que comprende una etapa de al menos una cromatografía de cromatoenfoque, cromatografía por afinidad de quelato de metal, o cromatografía por inmunoafinidad como un procedimiento de purificación . La invención proporciona además preparaciones de a-Gal A y 15 métodos para elaborar preparaciones de a-Gal A que tienen a-Gal A con carga alterada. Las preparaciones pueden incluir diferentes glicoformas de a-Gal A. Las alteraciones de carga se logran al incrementar el contenido de ácido siálico de preparaciones de a-Gal A y/o ai incrementar la fosforilación de preparaciones de a-Gal A. 20 El contenido de ácido siálico de preparaciones de a-Gal A se incrementa por (i) aislamiento de las glicoformas de a-Gal A de peso molecular más elevado y/o altamente cargado durante o después el proceso de purificación; (ii) agregar residuos de ácido siálico utilizando células genéticamente modificadas (ya sea por métodos de ingeniería 25 genética convencional o activación de gen) para expresar un gen de ^gj ^^?jlg^^^?^^t^ ^^ transferencia de sialilo o cADN; o (?ii) la fermentación o crecimiento de las células que expresan la enzima en un ambiente bajo en amonio. La fosforiliación de preparaciones de a-Gal A se incrementa al (i) agregar residuos de fosfato utilizando células genéticamente modificadas (ya sea por métodos de ingeniería genética convencionales o activación de! gen) para expresar el gen de transferasa o cADN; o (ii) agregar inhibidores de fosfatasa a las células cultivadas. Utilizando los métodos de la presente invención , las preparaciones de a-Gal A glicosilada humana se obtienen, en donde entre 35% y 85% de los oligosacáridos se cargan . En una modalidad preferida , al menos 35% de los oligosacáridos se cargan . En una modalidad más preferida , al menos 50% de los oligosacáridos se cargan . Las preparaciones de a-Gal A glicosilada humana preferidas tienen múltiples glicoformas de a-Gal A con preferentemente al menos 20% , más preferentemente al menos 50%, y más preferentemente al menos 70% de glicanos complejos con 2-4 residuos de ácido siálico. En una modalidad preferida alternativa, las preparaciones de a-Gal A glicosilada con múltiples glicoformas tienen una carga de oligosacárido, como se mide por el número Z, mayor a 100, preferentemente mayor a 150, y más preferentemente mayor a 170. En otra modalidad preferida alternativa, las preparaciones de a-Gal A glicosilada humana con múltiples glicoformas tienen al menos en promedio entre 16-50%, preferentemente 25-50%, más preferentemente al menos 30%, de glicoformas siendo fosforiladas. En otra modalidad alternativa, las preparaciones con múltiples glicoformas tienen entre 50-75%, preferentemente 60%, de los glicanos totales siendo sialilados. En una modalidad de la presente invención , una preparación de a-Gal A glicosilada que tienen una carga de oligosacárido incrementada se produce al introducir primero un polinucleótido que codifica una transferasa l l l de GIcNAc (GnT-l l l) , en una célula de producción de a-Gal A. o introducir una secuencia reguladora por la recombinación homologa que regula la expresión de un gen GnT-l ll endógeno. La producción de a-Gal A se cultiva entonces bajo condiciones de cultivo que da como resultado la expresión de a-Gal A y GnT-l l l. La etapa final consiste de aislar la preparación de a-Gal A con carga de oligosacárido incrementada . En una modalidad alternativa de la presente invención, una preparación de a-Gal A glicosilada que tiene una carga de oligosacárido incrementada se produce al introducir primero un polinucleótido, que codifica una transferasa de sialilo, en una célula de producción de a-Gal A, o introducir una secuencia reguladora por la recombinación homologa que regula la expresión de un gen de transferasa de sialilo endógeno. La célula de producción de a-Gal A se cultiva entonces bajo condiciones de cultivo que da como resultado la expresión de a-Gal A y la transferasa de sialilo. La etapa final consiste de aislar la preparación de a-Gal A con carga de oligosacárido incrementada. Las transferasas de sialilo preferidas incluyen una a-2,3-sialilo transferasa y una a-2,6-sialilo transferasa. En una modalidad preferida, este método incluye la etapa adicional de seleccionar glicoformas de a-Gal A con tamaño incrementado o carga incrementada por la división o purificación de la preparación.

En otra modalidad , una preparación de a-Gal A glicosilada con sialilación incrementada se obtiene al contactar una célula de producción de a-Gal A con un medio de cultivo que tiene una concentración de amonio por debajo de 1 0 mM, más preferentemente por debajo de 2 mM. En una modalidad preferida, el ambiente bajo en amonio se logra por la adición de sintasa de glutamina al medio de cultivo. En una modalidad alternativa, el ambiente bajo en amonio se logra por perfusión intermitente o continua de la célula de producción de a-Gal A con medio de cultivo fresco para mantener la concentración de amonio por debajo de 1 0 mM, más preferentemente por debajo de 2 mM. En todavía otra modalidad, una preparación de a-Gal A glicosilada con fosforilación incrementada se obtiene al introducir primero en una célula de producción de a-Gal A un polinucleótido que codifica la transferasa de fosforilo, o al introducir una secuencia reguladora por recombinación homologa que regula la expresión de un gen de transferasa de fosforilo endógeno. La célula de producción de a-Gal A se cultiva entonces bajo condiciones de cultivo que da como resultado la expresión de a-Gal A y transferasa de fosforilo. La preparación de a-Gal A con fosforilación incrementada en comparación con la a-Gal A producida en una célula sin el polinucleótido entonces se aisla. En una modalidad preferida, las preparaciones de a-Gal A producidas por los métodos de la presente invención tienen múltiples glicoformas con entre 16-50% , preferentemente 25-50%, más preferentemente al menos 30%, de glicoformas siendo fosforiladas. En una modalidad preferida, este método incluye la etapa adicional de seleccionar glicoformas de a-Gal A con tamaño incrementado o carga de incremento por fraccionación o purificación de la preparación . En todavía otra modalidad, una preparación de a-Gal A glicosilada con fosforilación incrementada se obtiene al agregar un inhibidor de fosfatasa , por ejemplo, bromotetramisola, para células cultivadas. Los bajos niveles de fosfatasa alcalina de plasma de bovino pueden estar presentes en el suero de bovino fetal como un aditivo de crecimiento de células cultivadas. Esto eleva la posibilidad de que los epítopos Man-6-P expuestos en a-Gal A segregada podrían ser un substrato para fosfatasa alcalina de suero. Bromotetramisola se ha mostrado que es un inhibidor potente de fosfatasa alcalina; Ki = 2.8 mM (Metaye er al., Biochem. Pharmacol. 15:4263-4268 (1 988)) y la inhibición completa se logra en una concentración de OJ mM (Borgers & Tone, Histochemistry 44:277-280 (1 975)). Por lo tanto, un inhibidor de fosfatasa, por ejemplo, bromotetramisola puede agregarse a las células cultivadas en una modalidad para maximizar la toma elevada de una a-Gal A presente en el medio de cultivo al evitar la hidrólisis de los grupos de éster Man-6-P. La invención proporciona además preparaciones de a-Gal A, y métodos para elaborar las mismas, que tienen una vida media circulante extendida en un huésped mamífero. La vida media circulante y la toma celular se aumenta al (i) incrementar el contenido de ácido siálico de a-Gal A (logrado como arriba), (ii) incrementar la fosforilación de a-Gal A (lograda como arriba); (iii) PEGilación de a-Gal A; o (iv) el retiro secuencial del ácido siálico y los residuos de galactosa terminales, o el retiro de residuos de galactosa terminales, en las cadenas de oligosacárido en a-Gal A. La sialilación mejorada de preparaciones de a-Gal A aumenta la vida media circulante de a-Gal A exógena. Además, la sialilación mejorada de a-Gal A mejora su toma, relativa a aquella de los hepatocitos, en no hepatocitos tal como células endoteliales de hígado, o células cardiacas. La preparación de a-Gal A glicosilada humana con contenido de ácido siálico incrementado preferentemente incluye múltiples glicoformas, con al menos 20% de glicanos complejos que tienen 2-4 residuos de ácido siálico. Una preparación de a-Gal A glicosilada humana preferida, alternativa tiene múltiples glicoformas, en donde entre 50-75%, preferentemente al menos 60%, de los glicanos totales se sialilan. La fosforilación de preparaciones de a-Gal A también mejora el nivel de las células que introducen a-Gal A. La fosforilación ocurre dentro de las céluias que expresan la a-Gal A. Una preparación de a-Gal A glicosilada humana, preferida de la presente invención preferentemente incluye múltiples glicoformas con al menos en promedio entre 1 6-50%, preferentemente 25-50%, más preferentemente al menos 30%, de las glicoformas siendo fosforiladas. En una modalidad alternativa, la vida media circulante de una preparación de a-Gal A humana se aumenta al complejar a-Gal A con glicol de polietileno. En una modalidad, preferida, la preparación de a-Gal A se compleja utilizando PEG de monometoxi tresilo (TMPEG) para formar un PEGilada-a-Gal A. La PEGilada-a-Gal A se purifica entonces para proporcionar una preparación PEGilada-a-Gal A, aislada. La PEGilación de a-Gal A incrementa la vida media circulante y la eficacia in vivo de la proteína. La sialilación afecta la vida media circulante y la biodistribución de las proteínas. Las proteínas con mínimo o nada de ácido siálico se internalizan fácilmente por el receptor de asialoglicoproteína (receptor Ashwell) en hepatocitos por residuos de galactosa expuestos en la proteína. La vida media circulante de a-Gal A terminada en galactosa puede aumentarse al (1 ) remover secuencialmente el ácido siálico al contactar a-Gal A con neuraminidasa (sialidasa), dejando así las porciones de galactosa terminales expuestas, y (2) remover los residuos de galactosida terminales al contactar la a-Gal A desialilada con ß-galactosidasa. La preparación de a-Gal A resultante tiene un número reducido de ácido siálico terminal y/o residuos de galactosida terminales en las cadenas de oligosacáridos en comparación con las preparaciones de a-Gal A no contactadas secuencialmente con neuraminidasa y ß-galactosidasa. Alternativamente, la vida media circulante de a-Gal A terminada en galactosa puede aumentarse al remover solamente los residuos de galactosidasa terminales al contactar la a-Gal A desialilada con ß-galactosidasa. La preparación de a-Gal A resultante tiene un número reducido de residuos de galactosida terminales en las cadenas de oligosacáridos en comparación con las preparaciones de a-Gal A no contactadas con ß-galactosidasa. En una modalidad preferida, después del contacto secuencial con neuraminidasa y ß-galactosidasa, las preparaciones de a-Gal A resultantes se contactan subsecuentemente con ß-hexosaminidasa, separando así el oligosacárido &.Í SL,. . . . . . « - -. - - - ^^^ t. al núcleo de tpmanosa Además, los niveles de sialilación pueden variar dependiendo del tipo de célula utilizado. Por lo tanto, en otra modalidad preferida, la sialilación de a-Gal A puede aumentarse al seleccionar las células mamíferas, por ejemplo, células humanas, que tienen actividad de transferasa rica en sialilo y utilizando tales células como células de producción de a-Gal A. La invención proporciona además formulaciones de una preparación de a-Gal A que se encuentran substancialmente libre de proteínas no a-Gal A, tal como albúmina, proteínas no a-Gal A producidas por la célula huésped , o proteínas aisladas de fluido o tejido animal. En una modalidad, la formulación comprende además un excipiente. Los excipientes preferidos incluyen manitol, sorbitol, glicerol, aminoácidos, lípidos, EDTA, EGTA, cloruro de sodio, glicol de polietileno, polivinilpirrolidona, dextran o combinaciones de cualquiera de estos excipientes. En otra modalidad , la formulación comprende además un detergente no iónico. En otra modalidad, la formulación comprende además un detergente no iónico. Los detergentes no ¡ónicos preferidos incluyen Polisorbato 20, Polisorbato 80, Tritón X-100, Tritón X-1 14, Nonidet P-40, Octil a-glucosida, Octil b-glucosida, Brij 35, Plurónico y Tween 20. En una modalidad preferida, el detergente no iónico comprende Polisorbato 20 o Polisorbato 80. Una formulación preferida comprende además salina regulada de fosfato, preferentemente en pH 6. La presente invención proporciona además métodos para administrar una preparación de a-Gal A a un sujeto. En una modalidad preferida, la preparación de a-Gal A es una preparación de a-Gal A con carga alterada, por ejemplo, carga de oligosacárido incrementada , y/o vida media circulante como se describe en la presente. La dosis de administración se encuentra preferentemente ente 0.05-5.0 mg , más preferentemente entre 0J -0.3 mg, de la preparación de a-Gal A por peso corporal en kilogramo por semana o cada dos semanas. En una modalidad preferida, la dosis de administración es aproximadamente 0.2 mg por peso corporal en kilogramo cada dos semanas. En estos métodos, la dosis puede administrarse intramuscularmente, oralmente, rectalmente, subcutáneamente, intra-arterialmente, intraperitonealmente, intracerebralmente, intranasalmente, intradérmicamente, intrahecalmente, transmucosalmente, transdérmicamente, o a través de inhalación. En una modalidad, el método para suministrar la preparación de a-Gal A a un sujeto comprende administrar subcutáneamente una dosis que varía entre 0.01 -1 0.0 mg, preferentemente 0.1 -5.0 mg, de la preparación de a-Gal A por peso corporal en kg cada dos semanas o por semana. La preparación de a-Gal A también puede administrarse intravenosamente, por ejemplo, en una inyección de bolo intravenosos, en una inyección intravenosa de empuje lento, o por la inyección intravenosa continua. En cualquiera de los métodos anteriores, la preparación de a-Gal A puede suministrarse utilizando un sistema de suministro tal como un suministro por bomba, suministro de célula encapsulada, suministro liposomal, inyección suministra por aguja , inyecciones sin aguja, nebulizador, aerosol, electroporación y el parche transdérmico. Cualquiera de las preparaciones de a-Gal A descritas arriba pueden administrarse por estos métodos.

Un individuo que sospecha tener, o sabe que tiene, la enfermedad de Fabry puede tratarse por la administración de la preparación de a-Gal A descrita arriba, utilizando los métodos arriba descritos de administración y dosis. La presente invención contempla el tratamiento de individuos con enfermedad de Fabry generalmente ("pacientes con Fabry"), así como también las variantes atípicas de la enfermedad de Fabry, por ejemplo, las poblaciones específicas de pacientes con Fabry con anormalidades predominantemente cardiovasculares, definidos en la presente como pacientes con Fabry con 10 alargamiento ventricular, por ejemplo, hipertrofia ventricular izquierda (LVH) y/o insuficiencia de la válvula mitral, o pacientes con Fabry con lesión predominantemente renal. a-Gal A Los términos "a-Gal A" madura y "GA-GAL" y "SEQ ID NO:5" 15 (ver Figura 7) se refieren a a-Gal A sin un péptido de señal (para a-Gal A con el péptido de señal, ver Figura 3 y SEQ ID NO:3). El término "preparación de a-Gal A" como se define en la presente, se utiliza de manera intercambiable con el término "preparación de a-Gal A glicosilada" y comprende varias formas a-Gal A glicosiladas. 20 Un "péptido de señal" es una secuencia de péptido que dirige un polipéptido recientemente sintetizado a la cual el péptido de señal se une al retículo endoplásmico (ER) para la distribución y procesamiento post-traslacional adicional. Un "péptido de señal heterólogo", como se utiliza en la 25 presente en el contexto de a-Gal A, significa un péptido de señal que no ^v******* * *** es el péptido de señal de a-Gal A humana, típicamente el péptido de señal de alguna proteína mamífera diferente a a-Gal A. Los expertos reconocerán que la secuencia de ADN de a-Gal A humana (ya sea cADN [SEQ I D NO:5] o ADN genómico), o una secuencia que difiere de ADN de a-Gal A humana debido a ya sea los cambios de codón silenciosos o los cambios de codón que producen substituciones de aminoácidos conservativos, pueden utilizarse para modificar genéticamente células humanas cultivadas de manera que sobreexpresarán y segregaran la enzima. Ciertas mutaciones en la secuencia de ADN de a-Gal A pueden codificar los polipéptidos q ue retienen o muestran actividad enzimática de a-Gal A mejorada. Por ejemplo, uno esperaría que las substituciones de aminoácido conservativas tengan poco o nada de efecto en la actividad biológica, particularmente si representan menos del 1 0% del número total de residuos en la proteína. Las substituciones conservativas típicamente incluyen substituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina, valina , isoleucina, leucina, ácido aspártico, ácido glutámico, ásparagina, glutamina , serina , treonina, lisina, arginina, y fenilamina, tirosina. Ver, por ejemplo Patente de E. U. 5,356,804 incorporada en la presente para referencia. Enfermedad de Fabry La enfermedad de Fabry es un desorden genético causado por la actividad deficiente de la enzima de a-Gal A. Por "deficiencia de a-Gal A" se entiende cualquier deficiencia en la cantidad o actividad de esta enzima en un paciente, dando como resultado acumulaciones anormales de glicolípidos neutrales (por ejemplo, globotriaosilceramida) en histiocitos en paredes del vaso sanguíneo, con angioqueratomas en los muslos, trasero y genitales, hipohidrosis, parestesia en extremidades, venticilata de córnea, y rayas como cataratas subcapsulares posteriores. Los depósitos de este material pueden resultar en dolor, enfermedad cardiovascular y renal seria, y ataque. La acumulación de glicolípido puede inducir varios síntomas como se observa típicamente en hombres que padecen de enfermedad de Fabry. Alternativamente, la acumulación puede inducir síntomas relativamente suaves, como puede observarse algunas veces en vehículos hembras heterozigosos del gen defectuoso. Los individuos afectados tienen una esperanza de vida grandemente reducida; la muerte usualmente resulta de complicaciones renales, cardiacas y cardiovasculares en aproximadamente la edad de 40. No existen tratamientos específicos para esta enfermedad. La enfermedad de Fabry, clasificada como desorden de almacenamiento lisosomal, afecta a más de 1 5,000 gentes alrededor del mundo. La enfermedad de Fabry como se define arriba es un síndrome clínico complejo caracterizado por la lesión de multisistema y multiórgano. Los pacientes que manifiestan la combinación de distrofia corneal, lesiones de la piel (angioqueratoma), neuropatía dolorosa, enfermedad vascular cerebral, cardiomiopatía, y disfunción renal se categoriza como a medida que se despliega el fenotipo "clásico". Sin embargo, existen pacientes que manifiestan alguno, pero no todos los aspectos del fenotipo clásico. Estos pacientes se clasifican como "variantes atípicos de enfermedad de Fabry". Existen varios fenotipos variantes atípicos asociados con deficiencia de a-galactosidasa A. Por ejemplo, algunos pacientes con deficiencia de a-galactosidasa A tienen una variación de la enfermedad de Fabry con solamente lesión cardiaca , por ejemplo , hipertrofia ventricular izquierda (LVH). Existe otro fenotipo variante en el cual los pacientes presentan solamente lesión renal . Aunque ambos de estos fenotipos variantes se han definido en hemicigotos machos, las formas variantes de enfermedad de Fabry también se han descrito en heterocigotos hembras también . Los pacientes con variante cardiaca atípica generalmente presentan enfermedad sintomática después en la vida. La edad mediana de diagnóstico par apacientes con el fenotipo variante cardiaco es de aproximadamente 52 años en comparación con aproximadamente 29 años del fenotipo clásico (Desnick, et al., En The Metabolic and Molecular Bases of Inhereted Disease, 6ta edición (1996). Scriver er al., (eds.), McGraw-Hill (Nueva York), pp. 2741 -2784; Meikle et al, . J. Am. Med. Assoc. 281 :249-254 (1 999). Los pacientes con este síndrome con frecuencia presentan síntomas tenues de disfunción cardiaca tal como disnea ejercional. Usualmente, el análisis ecocardiográfico estándar revela que los pacientes con fenotipo variante cardiaco se descubre que tienen hipertrofia ventricular izquierda (LVH) o hipertrofia septal asimétrica. Sin embargo, los pacientes también pueden presentar infarto miocardio o cardiomiopatía (Scheidt, et al., New Engl, J. Med. 324:395-399 (1 991 ); Nakao et al., New Engl. J. Med. 333:288-293 (1 995)). Estos pacientes con frecuencia experimentan biopsias de miocardio, y la patolog ía del síndrome variante es esencialmente similar a la enfermedad de Fabry clásica: infiltración del miocardio por glicolípido depositado. Los análisis de ia enzima a- galactosidasa A en estos pacientes revelan un amplio rango de niveles de enzima . Por ejemplo, los pacientes con variante cardiaca se han reportado que tienen tan elevado como 30% de los niveles normales de la actividad de enzima a-galactosidasa A, y, de esta manera, hasta ahora no se han considerado como candidatos para la terapia de reemplazo de a-Gal A. Los inventores ahora han descubierto inesperadamente que, aunque los pacientes con variante renal atípica o variante cardiaca atípica pueden tener niveles de actividad de enzima a-galactosidasa A que son relativamente altos en comparación con los pacientes con el fenotipo clásico de enfermedad de Fabry, estos pacientes pueden beneficiarse de la terapia de enzima a-galactosidasa A. Por ejemplo, los pacientes pueden tener una mutación que produce una enzima a-Gal A cinéticamente inestable en la célula, y en estos pacientes los niveles de enzima a-Gal A pueden aumentarse significativamente por la administración de preparaciones de a-Gal A de la presente invención. También, algunos pacientes con el fenotipo variante cardiaco atípico se han reportado que tienen una mutación de punto en el aminoácido 215 de a-galactosidasa A. Este aminoácido en la proteína no mutada es una asparagina que se glicosila (Eng, ef al., Am. J. Hum. Genet. 53: 1 1 86-1 197 (1 993)). De esta manera, la terapia de reemplazo de la enzima a-Gal A con preparaciones de a-galactosidasa A apropiadamente glicosilada de la presente invención, puede ser eficaz en estos pacientes. Además, los pacientes con variante renal atípica se han reportado, cuya manifestación solamente clínica de la enfermedad de Fabry es proteinuria suave. Sin embargo, la biopsia renal, revela las inclusiones de glicolípido típicas de la enfermedad de Fabry y el análisis de la enzima a-Gal A revela niveles más inferiores que los normales de a-Gal A Sin embargo, debido a que la trihexosida de ceramida en el riñon puede detectarse en células tubulares renales cambiadas en el sedimento de orina de estos pacientes, la administración de las preparaciones de a-Gal A de la presente invención puede reducir estos niveles substancialmente. Las enzimas lisosomales tal como a-Gal A son objetivo para el compartimiento lisosomal de una célula a través de la interacción con el receptor de manosa-6-fosfato (M6P), que se une a los residuos M6P presentes en las porciones de oligosacáridos de enzimas destinadas para el compartimiento lisosomal. Kornfeld & Mellman, Ann. Rev. Cell. Biol. 5:483-525 (1 989). La interacción primaria ocurre en el Golgi, en donde las enzimas unidas a los receptores M6P de Golgi se segregan para transportarse a los lisosomas. Un tipo secundario de interacción se cree que tiene lugar entre a-Gal A extracelular y receptores M6P en la superficie celular. Las enzimas que escapan el sistema de dirección se secretan por la célula a través de la trayectoria secretoria y con frecuencia de recapturan por los receptores M6P de superficie celular que regresan la a-galactosidasa A a la lisosoma por la trayectoria endocítica. Las substancias extracelulares internalizadas por las células se transportan a través del citoplasma en vesículas endocíticas, que se fusionan con los lisosomas primarios y vacían sus contenidos en los lisosomas. En este proceso, los receptores M6P de superficie celular también se incorporan en las vesículas endocíticas y transportarse a las lisosomas. En particular, las preparaciones de a-Gal A de la presente invención, en los cuales los niveles elevados de sialilación y/o fosforilación se encuentran presentes, se prefieren para el tratamiento de pacientes con variantes atípicas de enfermedad de Fabry. Tales preparaciones, por ejemplo, minimizan la fracción de la a-Gal A inyectada que se remueve por hepatocitos y permite niveles elevados de toma de a-Gal A por células no del hígado, tales como células renales, células vasculares, células tubulares, células glomerulares, miocitos cardiacos y células vasculares cardiacas. Los residuos M6P que comparten a-Gal A extracelular pueden unirse a los receptores M6P de superficie celular y pueden transportarse en el compartimiento lisosomal . Una vez en el compartimiento lisosomal, a-Gal A puede realizar la función apropiada. Este es el aspecto de tráfico de enzima lisosomal que hace a la terapia de reemplazo de la enzima a-galactosidasa A un tratamiento factible para los pacientes con enfermedad de Fabry. De esta manera, aún si una célula es deficientemente genética para producir a-Gal A, la célula puede tomar a-Gal A extracelular si a-Gal A se glicosila adecuadamente y la célula deficiente comparte receptores M6P. En los pacientes con enfermedad de Fabry, las células endoteliales vasculares del riñon y corazón despliegan varias anormalidades histopatológicas y contribuyen a la patología clínica de la enfermedad. Estas células, que portan receptores M6P, son un objetivo terapéutico particular de a-Gal A. Un objeto de la invención es proporcionar una preparación de a-Gal A en la cual M6P se encuentra presente en oligosacáridos enlazados a N. El grado al cual los oligosacáridos enlazados a N de a-Gal A se modifican por sialilación tiene un efecto substancial en las farmacocinéticas de a-Gal A y biodistribución . En la ausencia de sialilación apropiada, a-Gal A se limpia fácilmente de la circulación debido a la unión por receptores de asialoglicoproteínas hepáticas (receptores Ashwell), seguida por la internalización y degradación de hepatocitos. Ashwell & Harford, Ann. Rev. Biochem. 57 :531 -554 (1 982). Esto reduce la cantidad de a-Gal A disponible en la circulación para unir los receptores M6P en las células que contribuyen a la patología clínica de la enfermedad de Fabry, tal como las células endoteliales vasculares del riñon y corazón , a-Gal A secretada por las células humanas genéticamente modificadas tiene propiedades de glicosilación que son adecuadas para el tratamiento de enfermedad de Fabry por cualquier administración convencional de la proteína secretada purificada o por la terapia dei gen, sin requerir la modificación enzimática adicional como se ha reportado que se requiere por la enzima lisosomal, glucocerebrosidasa, en la cual la toma de enzima de glucocerebrosidasa purificada por las células clínicamente relevantes requiere modificación enzimática compleja de la enzima después de la purificación de la placenta humana. Beutler, New Engl. J. Med. 325:1354-1 360 (1991 ). Células Adecuadas para la Producción de a-Gal A Un individuo que se sospecha que tiene una deficiencia de a- Gal A tal como enfermedad de Fabry puede tratarse con a-Gal A humana purificada obtenida de células genéticamente modificadas, cultivadas, preferentemente células humanas. Cuando las células son para modificarse genéticamente para los propósitos de tratamiento de la enfermedad de Fabry, las células pueden modificarse por los métodos de ingeniería genética convencionales o por activación del gen. De acuerdo con los métodos convencionales, una molécula de ADN que contiene un cADN de a-Gal A o secuencia de ADN genómica puede contenerse dentro una construcción de expresión y se transfiere a células primarias, secundarias o inmortalizadas por métodos estándar que incluyen, pero no se limitan a transfección mediada por dextran DEAE, polibreno o liposoma, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, microinyección , o microproyectiles accionados por velocidad ("biolísticas") (ver, por ejemplo, una aplicación copendiente, USSN 08/334,797 , incorporada en la presente para referencia). Alternativamente, uno podría utilizar un sistema que suministra la información genética por el vector viral. Los virus conocidos para ser útiles para transferencia de gel incluyen adenovirus, adeno-virus asociados, virus del herpes, virus de la paperas, poliovirus, retrovirus, virus Sindbis, y virus de vacuna tal como virus de varicela . Alternativamente, las células pueden modificarse utilizando un planteamiento de activación del gen ("GA") , tal como se describe en las Patentes de Estados Unidos 5,733,761 y 5,750,376, cada una incorporada en la misma para referencia, a-Gal A hecha por activación del gen se refiere en la presente como GA-GAL. De acuerdo con lo anterior, el término "genéticamente modificado", como se utiliza en la presente en referencia a las células, significa comprender células que expresan un producto de gen particular después de la introducción de una molécula de ADN que codifica el producto de gen y/o elementos reguladores que controlan la expresión de una secuencia de codificación para el producto de gen . La molécula de ADN puede introducirse por el objetivo de gen o recombinación homologa, es decir, la introducción de la molécula de ADN en un sitio genómico particular. La recombinación homologa puede utilizarse para reemplazar ei gen defectuoso por sí mismo (el gen de a-Gal A defectuoso o una porción de él podría reemplazarse en las células propias del paciente con enfermedad de Fabry con gen completo o una porción del mismo). Como se utiliza en la presente, el término "célula primaria" incluye células presentes en una suspensión de células aisladas de una fuente de tejido vertebrado (antes de su colocación en placas, es decir, unida a un substrato de cultivo de tejido tal como un plato o matraz), las células presentes en una explantación derivada de tejido, ambos tipos previos de células colocadas en la placa para la primera vez, y la suspensiones celulares derivadas de estas células colocadas en placas. "Células secundarias" se refiere a las células en todas las etapas subsecuentes en el cultivo. Es decir, la primera vez que una célula primaria colocada en placa se remueve del substrato de cultivo y se vuelve a colocar en la placa (pasa), se refiere a una célula secundaria, como son todas las células en pasajes subsecuentes. Una "cepa celular" consiste de células secundarias que han pasado una o más veces; muestran un número finito de dobleces de población promedio en cultivo; muestran las propiedades de crecimiento dependiendo de sujeción, inhibida por contacto (excepto para las células propagadas en el cultivo celular), y no se inmortalizan.

Por "célula inmortalizada" se entiende una célula de una línea celular establecida que muestra una duración de vida aparentemente no limitada en cultivo. Los ejemplos de células primarias o secundarias incluyen fibroblastos, células epiteliales que incluyen células epiteliales intestinales y mam íferas, células endoteliales, elementos formados de la sangre que incluyen linfocitos y células de médula ósea , células gliales, hepatocitos, kerationocitos, células musculares, células neurales, o los precursores de estos tipos celulares. Los ejemplos de líneas celulares humanas inmortalizadas útiles en los métodos presentes incluyen, pero no se limitan a, células de Melanoma Bowes (No. de Acceso ATCC CRL 9607), células Daudi (No. de Acceso ATCC CCL 213), células HeLa y derivados de células HeLa (Nos. de Acceso ATCC CCL2, CCL 2.1 y CCL 2.2), células HL-60 (No. de Acceso ATCC CCL 240), células HT-1 080 (No. de Acceso ATCC CCL 1 21 ), céluias Jurkat (No. de Acceso ATCC TLB 1 52), células de carcinoma KB (No. de Acceso ATCC CCL 1 7), células de leucemia K-562 (No. de Acceso ATCC CCL 243), células del cáncer de pecho MCF-7 (No. de Acceso ATCC BTH 22), células MOLT-4 (No. de Acceso ATCC 1582), células de Namalwa (No. de Acceso ATCC CRL 1432), células Raji (No. de Acceso ATCC CCL 86), células RPMI 8266 (No. de Acceso ATCC CCL 1 55), células U-937 (No. de Acceso ATCC CRL 1 593), células de la sub línea 2R4 WI-38VA1 3 (No. de Acceso ATCC CLL 75.1 ), células CCRF-CEM (No. de Acceso ATCC CCL 1 19) y células de carcinomas de ovario 2780AD (Van der Blick er al., Cáncer Res. 48:5927-5932, 1 988), así como también las células heterohibridoma producidas por la fusión de células humanas y células de otras especies Después de la modificación genética de células humanas para producir una célula que secreta a-Gal A, una cepa celular clonal que consiste esencialmente de una pluralidad de células humanas cultivadas genéticamente idénticas o, cuando las células se inmortalizan , una línea celular clonal que consiste de esencialmente de una pluralidad de céluias humanas inmortalizadas genéticamente idénticas, pueden generarse. En una modalidad, las células de la cepa celular clonal o línea celular clona son fibroblastos. En una modalidad preferida, las células son fibroblastos humanos secundarios, por ejemplo, células BRS-1 1 . Después de la modificación genética, las células se cultivan bajo condiciones que permiten la secreción de a-Gal A. La proteína se aisla de las células cultivadas al recolectar el medio en el cual las células se desarrollan, y/o lisar las células para libreras sus contenidos, y después aplicar las técnicas de purificación de proteína. Purificación de a-Gal A del Medio Acondicionado de Células Establemente Transfectadas De acuerdo con los métodos de esta invención, la proteína de a-Gal A se aisla de las células cultivadas ("células de producción de a-Gal A") al recolectar el medio en el cual las células se desarrollan, o lisar las células para liberar sus contenidos, y después aplicar las técnicas de purificación de proteína sin el uso de cromatografía por afinidad de lectina. El proceso de purificación preferido se señala en el Ejemplo 2 de abajo. Las resinas de interacción hidrofóbicas alternativas, tal como Source Iso (Pharmacia), Macro-Prep® Soporte de Metilo (Bio-Rad), Butil TSK (Tosohaas) o Fenil Sepharose® (Pharmacia), también pueden utilizarse para purificar a-Gal A. La columna puede equilibrarse en una concentración relativamente elevada de una sal, por ejemplo, 1 M de sulfato de amonio o 2M de cloruro de sodio, en un regulador de pH 5.6. La muestra a purificarse se prepara al ajustar el pH y la concentración de sal a aquella del regulador de equilibrio. La muestra se aplica a la columna y la columna se enjuaga con regulador de equilibrio para remover el material sin unir. a-Gal A se eluye de la columna con un regulador de resistencia iónica inferior, agua, o solvente orgánico en agua , por ejemplo, 20% de etanol o 50% de glicol de propileno. alternativamente, a-Gal A puede hacerse fluir a través de la columna al utilizar una concentración inferior de sal en el regulador de equilibrio y en la muestra o al utilizar un pH diferente. Otras proteínas pueden unirse a la columna , dando como resultado la purificación de la muestra que contiene a-Gal A que no une la columna. Una primer etapa de purificación preferida es el uso de una columna de hidroxiapatita. Una etapa alternativa de purificación puede utilizar una resina de intercambio de catión, por ejemplo, SP Sepharose® 6 de Flujo Rápido (Pharmacia), Fuente 30S (Pharmacia), CM Sepharose® de Flujo Rápido (Pharmacia), Macro-Prep® CM Soporte (Bio-Rad) o Macro-Prep® S Soporte Elevado (Bio-Rad), para purificar a-Gal A. La "primer etapa de cromatografía" es la primer aplicación de una muestra a una columna de cromatografía (todas las etapas asociadas con la preparación de la muestra se excluyen). a-Gal A puede unirse a la columna en pH 4.4. Un regulador, tal como 10 mM de acetato de sodio, pH 4.4, 1 0 mM de citrato de sodio, pH 4.4 , y otro regulador con capacidad de regulación adecuada en aproximadamente pH 4.4 puede utilizarse para equilibrar la columna. La muestra a purificarse se ajusta al pH y la intensidad iónica del regulador de equilibrio. La muestra se aplica a la columna y la columna se enjuaga después de la carga para retirar el material sin unir. Una sal, tal como cloruro de sodio o cloruro de potasio, pueden utilizarse para remover el material sin unir. Alternativamente, a-Gal A puede eluirse de la columna con un regulador o pH más elevado o en combinación de la sal de concentración más elevada y pH más elevado. a-Gal A también puede hacerse fluir a través de la columna durante la carga al incrementar la concentración de sal en el regulador de equilibrio y en la carga de muestra, al pasar la columna a un pH más elevado, o por una combinación tanto de sal incrementada como pH más elevado. Otra etapa de purificación puede utilizar un Q Sepharose® 6 de Flujo Rápido para la purificación de a-Gal A. Q Sepharose® 6 de Flujo Rápido es una resina de intercambio de anión relativamente fuerte. Una resina de intercambio de anión más débil tal como DEAE Sepharose® de Flujo Rápido (Pharmacia) o Macro-Prep® DEAB (Bio-Rad) también puede utilizarse para purificar a-Gal A. La columna se equilibra en un regulador, por ejemplo, 1 0 mM de fosfato de sodio, pH 6. El pH de la muestra se ajusta a pH 6, y la baja intensidad iónica se obtiene por dilución o diafiltración de la muestra. La muestra se aplica a la columna bajo condiciones que unen a-Gal A. La columna se enjuaga con regulador de equilibrio para remover el material sin unir. a-Gal A se eluye con aplicación de sal, por ejemplo, cloruro de sodio o cloruro de potasio, o aplicación de un regulador de pH inferior, o una combinación de sal incrementada y pH inferior. a-Gal A también puede hacerse fluir a través de la columna durante la carga al incrementar la concentración de sal en la carga o al pasar la columna en un pH inferior, o por una combinación tanto de sal incrementada como pH inferior. Otra etapa de purificación puede utilizar un Superdex® 200 (Pharmacia) cromatografía de exclusión por tamaño para la purificación de a-Gal A. Otra resina de cromatografía de exclusión por tamaño tal como Sephacryl® S-200 HR o Bio-Gel® A-L5 también puede utilizarse para purificar a-Gal A. El regulador preferido para la cromatografía por exclusión por tamaño es 25 mM de fosfato de sodio, pH 6.0, que contiene 0.1 5 M de cloruro de sodio. Otros reguladores compatibles con la formulación también pueden utilizarse, por ejemplo, 10 mM de citrato de potasio o de sodio. El pH del regulador puede encontrarse entre pH 5 y pH 7 y debe contener una sal, por ejemplo, cloruro de sodio o una mezcla de cloruro de sodio y cloruro de potasio. Otra etapa de purificación puede utilizar una resina de cromatografía tal como Intercambiador de Poliregulador PBE 94 (Pharmacia) para purificar a-Gal A. La columna se equilibra a pH relativamente elevado (por ejemplo, pH 7 o arriba), el pH de la muestra a purificarse se ajusta al mismo pH , y la muestra se aplica a la columna. Las proteínas se eluyen con un gradiente de pH decreciente a un pH tal como pH 4, utilizando un sistema regulador, por ejemplo, Poliregulador 74 (Pharmacia) que se ha ajustado a pH 4. Alternativamente, la cromatografía por inmunoafinidad puede utilizase para purificar a-Gal A Un anticuerpo monoclonal o policlonal apropiado para a-Gal A (generado por la inmunización con a-Gal A o con un péptido derivado de la secuencia de a-Gal A que utiliza técnicas estándar) puede inmovilizarse en una resina de acoplamiento activada, por 5 ejemplo, Sepharose® activada por NHS 4 de Flujo Rápido (Pharmacia) o Sepharose® activada por CNBr 4 de Flujo Rápido (Pharmacia). La muestra a purificarse puede aplicarse a la columna de anticuerpo inmovilizada a aproximadamente pH 6 o pH 7. La columna se enjuaga para remover el material sin unir, a-Gal A se eluye de la columna con reactivos típicos ^ O utilizados para la elusión de columna por afinidad tal como pH bajo, por ejemplo, pH 3, desnaturalizante, por ejemplo, guanidina HCl o tiocianato, o solvente orgánico, por ejemplo, 50% de glicol de propileno en un regulador de pH 6. El procedimiento de purificación también puede utilizar una resina por afinidad de quelato, por ejemplo, Sepharose® de quelación de 15 Flujo Rápido (Pharmacia), para purificar a-Gal A. La columna se precarga con iones de metal, por ejemplo, Cu2+, Zn2+, Ca2+, Mg2+ o Cd +. La muestra a purificarse se aplica a la columna en un pH apropiado, por ejemplo, pH 6 a 7.5, y la columna se enjuaga para remover las proteínas sin unir. Las proteínas unidas se eluyen por la elusión competitiva con 20 imidazola o histidina o al disminuir el pH utilizando citrato de sodio o acetato de sodio a un pH menor a 6, o al introducir los agentes de quelación, tal como EDTA o EGTA. De acuerdo con los procedimientos anteriores, la invención proporciona preparaciones con una preparación de a-Gal A de pureza más 25 elevada, que la preparada en la técnica anterior, purificada al menos 98% de homogeneidad , más preferentemente por SDS-PAGE o HPLC de fase inversa. Las preparaciones de a-Gal A de la presente invención pueden comprender numerosas glicoformas de a-Gal A. De acuerdo con lo anterior, el término "homogeneidad", como se utiliza en la presente en el contexto de preparaciones de a-Gal A, se refiere a las preparaciones que son substancialmente libres (<2% de las proteínas totales) de las proteínas diferentes a a-Gal A. Los ejemplos de proteínas no a-Gal A tal como albúmina , proteínas no a-Gal A producidas por la célula huésped , y proteínas no a-Gal A aisladas del tejido animal o fluido. La actividad de especificidad de las preparaciones de a-Gal A de la presente invención es preferentemente al menos 20 x 1 06 unidades/mg de proteína, más preferentemente al menos 3.0 x 106 unidades/mg de proteína, y más preferentemente 3.5 x 1 06 unidades/mg de proteína. Mejora de la Vida Media Circulante de Preparaciones de a-Gal A Al Remodelar el Glicano para Incrementar la Carga de Oligosacárido. La invención proporciona un programa de modificación de glicoproteína para toma incrementada de una enzima terapéutica en tejidos específicos diferentes al hígado y macrófagos. Utilizando los métodos de la presente invención, las preparaciones de a-Gal A glicosilada humana se obtienen , en donde entre 35% y 85% de los oligosacáridos se cargan, preferentemente al menos 50% de los oligosacáridos se cargan. La glicosilación de N de proteína funciona al modificar los residuos de asparagina apropiados de las proteínas con estructuras de oligosacárido, que influencian sus propiedades y bioactividades.

Kukuruzinska & Lennon, Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 9:41 5-48 (1 998). La presente invención proporciona una preparación de a-Gal A aislada en la cual un alto porcentaje de los oligosacáridos se cargan negativamente, principalmente por la adición de uno o a cuatro residuos de ácido siálico en glicanos complejos, o de uno a dos porciones de fosfato en glicanos ricos en mañosa , o de un solo fosfato y un solo ácido siálico en giicanos h íbridos. Las cantidades más pequeñas de glicanos complejos sulfonados también pueden estar presentes. Una proporción elevada de estructuras cargadas sirve a dos funciones principales. Primero, el cubrir los penúltimos residuos de galactosa por 2,3- o 2 ,6-ácido siálico enlazado evita el retiro prematuro de la circulación por el receptor de asiaglicoproteína presente en los hepatocitos. Este receptor reconoce las glicoproteína con residuos de galactosa terminales. El incremento de la vida medica circulante de a-Gal A da a los órganos objetivos importantes tal como el corazón y el riñon la oportunidad de cantidades mayores de endocitosa de enzima de plasma después de la infusión de enzima. Segundo, la presencia de Man-6-fosfato en glicanos híbridos o ricos en mañosa proporciona una oportunidad para la toma mediada por el receptor por el receptor de Man-6-fosfato independiente de catión (CI-MPR). Esta toma mediada por receptor ocurre en la superficie de muchas células, incluyendo células endoteliales vasculares, que son un sitio de almacenamiento principal de CTH en pacientes con Fabry. Las moléculas de enzima con dos residuos de Man-6-fosfato tienen una afinidad mucho mayor para CI-MPR que aquella con una sola Man-6-fosfatasa. Las estructuras de glicano representativas se proporciona en la Tabla 1 .

Tabla 1 Estructuras de Glicano Representativas Glicano biantenario A: ±Fucal,6 SAo .3/6Galß l,4GlcNAcß 1 ,2Mana 1 ,6 \ | Manßl,4GlcNAc|Jl,4GlcNAc-Asn SA 2,3/6GalßI,4sicNAcßl,2Manal,3 / Glicano tetraantenario A: SAc-2,3/6Galßl,4GlcNAcßI,6 \ ±FucaI,6 SAa2,3/6Galßl,4GlcNAcßl>2Manc.l,6 \ j Manl3 l,4GlcNAcf3t.4GlcNAc-Asn SAa2,3/6Galßl ,4GlcNAcßl,2Maj? / SAa2J/6Galßl.4GlcNAcßl,4 / Glicano rico en mañosa A: Mana l T2Mana?,6 \ Map l,6 \ Mana 1 ,2ManaI ,3 / ManßI,4GlcNAcß 1 ,4GlcNAc-Asp Man l^Mapal,2ManaI,3 / Glicano híbrido Fosforilado A: P-ManaI,o" \ Mana 1,6 \ Manal,3 / Manßl,4GlcNAcßt,4GlcNAc-Asn SAa2,3/6Galßl,4GlcNAcßl,2Manal,3 / Glicano bifosforilado A: P-Manal,2Manal,6 \ Manal,6 \ Mana 1,3 / Manßl,4GlcNAcßl ,4G3cNAc-Asp La biosíntesis de N-glicoproteína incluye una multitud de enzimas, glicosintransferasas, y glicosidasas. La mayoría de estas enzimas funcionan en el retículo endoplásmico (ER) y aparato de Golgi en una manera bien orquestada y ordenada. La complejidad de la N- glicosilación se aumenta por el hecho de que diferentes residuos de asparagina dentro del mismo polipéptido pueden modificarse con diferentes estructuras de oligosacáridos, y varias proteínas se distinguen ^ft entre sí por las características de sus porciones de carbohidrato. Los 5 avances recientes en genéticas moleculares han expedido la identificación, aislamiento y la caracterización de genes de N-Glicosilación . Como un resultado, la información que considera las relaciones entre N-glicosilación y otras funciones celulares ha emergido. El procesamiento de glicoproteína de N-enlazado en la célula 10 comienza cuando una cadena de oligosacárido con un Glc3MangGlcNac2 se agrega a una asparagina aceptora en un péptido naciente en el lumen del ER como una unidad única. Una cadena de oligosacáridos de azúcar catorce que consiste de Glc3Man9GlcNac2 se forma en dolicol, un alcohol alifático de cadena larga: 15 anaJ,2Manal .d \ Mana.1,6 \ Manir l,2.Vfancc 1,3 / apßl>4GlcNAcß lI4GI?.NAc.PP-D?lÍC?l C?Ical.2 ik«l 13Glcal ,3 an l .¿ManaI ,2Manal,3 / Este oligosacárido se transfiere como una unidad única a un residuo de asparganina aceptora en una cadena de péptido naciente en el lumen del ER. El tamaño largo del glicano relativo al péptido puede guiar 20 el pliegue de proteína. Los tres residuos de glucosa sirven como una señal que el oligosacárido se completa y esta listo para transferencia por transferasa de oligosacárido. Esta enzima también transferirá oligosacáridos no glucosilados pero en solamente una fracción de la velocidad de la cadena completa debido a que estos son substratos sub- 25 óptimos. Una de la forma de síndrome de glicoproteína deficiente de I^HIgg^^^^ ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ carbohidrato en humanos ha mostrado causarse por una deficiencia de Dolicol-P-Glc: transferasa de glucosil de Man9GlcNac2-PP-Dolicol, la primer enzima en la trayectoria de adición de glucosa, que resulta en la hipoglicosilación de proteínas de suero. Korner er al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 95: 1 3200-1 3205 (1 998). Después del retiro de tres residuos de glucosa y el logro de la conformación correcta, la glicoproteína recientemente sintetizada se exporta al Golgi. Dependiendo de la accesibilidad del glicano a la manosidasas Golgi después del pliegue de proteína, la cadena de glicano puede permanecer como una cadena rica en mañosa con 5-9 residuos de mañosa. Alternativamente, la cadena de glicano puede procesarse además a un núcleo de trimanosilo, y se vuelve un aceptor para otras transferasas de glicosilo que forman cadenas complejas por la adición de más residuos de GIcNAc, seguido por Gal, NeuAc y Fue. Una tercer posibilidad , si la proteína tiene dos residuos de lisina exactamente 34 ángstrom aparte y en la relación espacial correcta a una cadena rica en mañosa, es la adición de GlcNaca-1 -PO en carbono 6 de uno, o algunas veces dos, residuos de mañosa. Cuozzo er al., J. Biol. Chem 273:21069-21 076 (1998). Después del retiro del GIcNAc a-enlazado por una enzima específica, se genera un epítopo de M6P terminal que se reconoce por un receptor M6P en la red de Golgi trans que entonces tiene como objetivo estas enzimas a las lisosomas en células de origen mesenquimal. Para a-Gal A objetivo para tantos tejidos diferentes como sea posible, muchas estructuras de carbohidrato diferentes (glicoforma) son útiles. Matsuura et al., Glycobiology 8:329-339 (1998) reportó que las estructuras de glicano en a-Gal A hechas en células CHO tuvieron 41 % de glicanos ricos en mañosa y el nivel de fosforilización fue 24%. Sin embargo, el nivel de glicanos complejos sialilados fue solamente 1 1 % . De esta manera, 2/3 de las cadenas complejas no se sialilan , lo que resulta en la eliminación rápida de a-Gal A por el hígado. a-Gal A producida en las células humana de ia invención tiene un porcentaje más elevado de oligosacáridos cargados que la a-Gal A de la técnica anterior producida en células CHO. Por ejemplo, las células HT-1 080 sintetizadas de a-Gal A descritas en la misma son particularmente adecuadas, debido a que a-Gal A producida en las células HT-1 080 contiene aproximadamente 1 5% estructuras neutrales (ricas en mañosa e híbridas), aproximadamente 16% de glicanos fosforilados, y aproximadamente 67% de glicanos complejos con 2 a 4 residuos de ácido siálico. De esta manera, esencialmente todas las cadenas complejas se sialilan en comparación con a-Gal A producida en células CHO. La a-Gal A de célula HT-1080 tiene tres sitios glicosilados enlazados a N . Dos sitios se procesan a glicanos complejos en el aparato de Golgi, mientras que el tercer sitio se ocupa por un glicano rico en mañosa, 50% de los cuales se modifica por fosforilación específico de enzima lisosomal para producir tanto especies monofosforiladas y difosforiladas. Se proporcionan cuatro planteamientos para remoldeo de carbohidratos en una proteína que contiene cadenas de glicano enlazadas a N. Primero, la proporción de a-Gal A cargada puede incrementarse por el aislamiento selectivo de glicoformas durante el proceso de purificación. La presente invención proporcionar incrementar la proporción de glicoformas a-Gal A de peso molecular más elevado y altamente cargadas por la fraccionación de especies de a-Gal A en resinas de columna de cromatografía de gel durante y/o después del proceso de purificación . Las especies de glicoforma más altamente cargadas de a-Gal A contiene más ácido siálico y/o más fosfato, y las glicoformas de peso molecular más elevado podrían también contener las especies altamente cargadas y altamente ramificadas, completamente glicosiladas. La selección de las especies cargadas, o el retiro de las especies de a-Gal A no glicosilada, deficientemente glicosilada o deficientemente sialilada y/o fosforilada JO podría resultan en una población de glicoformas de a-Gal A con más ácido siálico y/o más fosfato, proporcionado entonces una preparación de a-Gal A con vida media más elevada y eficacia terapéutica potencial. Este proceso de fraccionación puede ocurrir en, pero no se limita, a resinas de columna cromatográfica adecuadas utilizadas para 15 purificar o aislar a-Gal A. Por ejemplo, la fracción puede ocurrir en , pero no se limita a , resinas de intercambio de catión (tal como SP-Sepharose®), resinas de intercambio de anión (Q-Sepharose®), resinas por afinidad (Heparin Sepharose®, columnas de lectina) columnas de exclusión por tamaño (Superdurex® 200) y columnas de interacción hidrofóbica (Butil 20 Sepharose®) y otras resinas de columna cromatográfica conocidas en la materia. Ya que a-Gal A se produce en células como una mezcla heterogéneia de glicoformas que difieren del peso molecular y carga, a- Gal A tiende a eluirse en un valores máximos relativamente amplios de las 25 resinas de cromatografía. Dentro de estas elusiones, las glicoformas se -*-¡*afc««<nafcAa»_~ distribuyen en una manera particular dependiendo de la naturaleza de la resina que se utiliza . Por ejemplo, en la cromatografía por exclusión de tamaño, las glicoformas más largas tienden a eluirse de manera más temprana en el perfil de elusión que las glicoformas más pequeñas. En cromatografía de intercambio de ion , las glicoformas negativamente más cargadas tienden a unirse a una resina positivamente cargada (tal como Q-Sepharose®) con afinidad más elevada que las glicoformas negativamente menos cargadas, y por lo tanto tenderán a eluirse después en el perfil de eiusión . En contraste, estas glicoformas negativamente cargadas de manera más elevada pueden unirse de manera menos estrecha a una resina negativamente cargada, tal como SP Sepharose®, especies negativamente menos cargadas, o pueden no unirse del todo. La fraccionación de las especies glicoformes en las resinas cromatográficas pueden influenciarse por pH, intensidad iónica, selección de sal reguladora, viscosidad y/u otros parámetros tal como la elección de tipo de resina. El uso de diversos tipos de elusiones gradientes (gradientes lineales de línea recta, curvos, por ejemplo, gradientes exponenciales) o el uso de una serie de elusiones de etapa corta para eluir selectivamente especies de a-Gal A de la columna de cromatografía también pueden optimizarse para la fracción de a-Gal A. Todos estos factores, solos o en combinación, pueden optimizarse para lograr la fraccionación eficiente de las glicoformas. La fraccionación también pueden ocurrir después de que el proceso de purificación se completa, en una resina cromatográfica particular selectivamente optimizada para la fraccionación y selección de la población de glicoforma deseada. La selección de las poblaciones de glicoforma de las especies de a-Gal A fraccionadas puede lograrse después del análisis de las glicoformas de a-Gal A eluidas. El valor máximo de elusión puede analizarse por varias técnicas tales como, pero no limitándose a, SDS-PAGE , enfoque isoeléctrico, electrofóresis capilar, intercambio de ion analítico HPLC, y/o exclusión por tamaño analítico HPLC. Las fracciones particulares pueden seleccionarse las cuales que conducen hacia el tamaño deseado o perfiles de carga. La selección puede ocurrir en cada etapa cromatográfica en el proceso, permitiendo el logro gradual de la población de glicoforma deseada, o puede limitarse a una etapa particular o etapas si la eficacia de fraccionación de la(s) etapa(s) es elevada. La fraccionación también puede ocurrir después de que se completa el proceso de purificación, en una resina cromatográfica particular selectivamente optimizada para la fraccionación y selección de la población de glicoforma deseada. La fraccionación y selección de glicoformas de a-Gal A de peso molecular elevado y/o altamente cargadas puede realizarse en cualquier preparación de a-Gal A, tal como aquella derivada de las células genéticamente modificadas tales como células modificadas por los métodos de ingeniería genética convencionales o por activación del gen (GA). Puede realizarse en líneas células que crecen en sistemas optimizados para proporcionar sialilación más elevada y fosforilación como se describe arriba o a-Gal A PEGilada como se describe abajo. Por ejemplo, en el proceso de purificación de a-Gal A según se describe en la presente, el fraccionamiento de las glicoformas a-Gal A puede ocurrir en diversas etapas en el proceso. En la resina hidrofóbica , Butil Sepharose® de Flujo Rápido, las glicoformas de a-Gal A más altamente cargadas se extraen primero, seguido por la especie de menos altamente cargadas. Para Heparina Sepharose®, la especie más altamente cargada también se extrae primero en el valor máximo de elusión , seguido por la especie menos altamente cargada. Lo contrario ocurre con Q-Sepharose®, en donde la especie menos altamente cargada se extrae primero, seguido por las glicoformas más altamente cargadas. En la cromatografía por exclusión de tamaño en Superdex® 200, se extraen primero las glicoformas de peso molecular más alto seguido por el peso molecular más bajo, de especie a-Gal A menos glicosilada . Para permitirse para el fraccionamiento eficaz de las poblaciones de glicoforma a-Gal A en particular, pueden combinarse múltiples etapas cromatográficas, todas las cuales se fraccionan en diferentes métodos físicos. Por ejemplo, para obtener las glicoformas a-Gal A que contienen el pl más bajo (aquellas que contienen la carga más negativa) que limitan el agrupamiento de las fracciones de butilo eluyente inicial podrían mejorarse para la a-Gal A más altamente cargada. Procediendo con este grupo seleccionado en ia columna de Heparina, y limitando nuevamente el agrupamiento a la especia de a-Gal A más altamente elevada, inicial, se mejora además la proporción de las glicoformas de a-Gal A de pl bajo en el grupo. Además, puede hacerse la sintonización precisa de la población de glicoforma en diversas etapas del proceso de purificación al monitorear la distribución de carga y tamaño de los grupos de elusión por SDS-PAGE y el enfoque isoeléctrico. Un ejemplo de fraccionamiento por tamaño y carga se señala abajo en el Ejemplo 2.4. El segundo procedimiento para la remodelación de carbohidrato incluye modificar ciertas glicoformas en la a-Gal A purificada mediante la unión de un residuo de azúcar terminal adicional utilizando una transferasa de glicosilo purificado y el adecuado donador de azúcar de nucleótido Este tratamiento afecta solamente a aquellas glicoformas que tienen un residuo de azúcar terminal libre para actuar como un receptor para la transferasa de glicosilo que se utiliza. Por ejemplo, transferasa de a2 ,6-sialilo agrega ácido siálico en un 2,6-enlace en una terminal Ga 1 ß1 , aceptor GIcNaC-R, utilizando ácido CMP-siálico como el donador de azúcar de nucleótido. Las enzimas comercialmente disponibles y sus especies de origen incluyen: fucosa a1 ,3 transferasas lll, V y VI (humanos); galactosa a1 ,3 transferasa (porcino); galactosa ß1 ,4 transferasa (bovino); mañosa a1 ,2 transferasa (levadura); ácido siálico a2,3 transferasa (rata); y ácido siálico a2,6 transferasa (rata). Después de que la reacción se completa, la transferasa de glicosilo puede removerse de la mezcla de reacción por una columna de afinidad específica de transferasa de glicosilo que consiste del adecuado nucleótido unido a un gel a través de un espaciador de 6 carbonos por un pirofosfato (GDP, UDP) o enlace de fosfato (CMP) o por otros métodos cromatográficos conocidos en la materia. De las transferasas de glicosilo anteriormente listadas, el sialilo de transferasas es particularmente útil para la modificación de enzimas, tal como a-Gal A, para la terapia de reemplazo de enzima en los pacientes humanos. El uso ya sea del sialilo de transferasa con CMP-5-fluoresceinil-ácido neuraminico como el donador de azúcar de nucleótido se produce una glicoproteína marcada fluorescentemente cuya toma y localización de tejido puede monitorearse fácilmente. El tercer procedimiento para la remodelación de carbohidrato incluye la glico-elaboración , por ejemplo, la introducción de genes que afectan los mecanismos de glicosilación de la célula, de la célula de producción de a-Gal A para modificar el procesamiento post-traslación en el aparato de Golgi, es un procedimiento preferido. El cuarto procedimiento para la remodelación de carbohidrato incluye tratar a-Gal A con las glicosidasas adecuadas para reducir el número de diferentes glicoformas presentes. Por ejemplo, el tratamiento secuencial de las cadenas de glicano de complejo con neuraminidasa, ß-galactosidasa, y ß-hexosaminidasa penetra el oligosacárido al núcleo de trimanosa. La estructura de un glicano ligado N depende de la accesibilidad de la cadena de glicano a las manosidasas de procesamiento Golgi después de que la proteína se ha plegado, y la presencia en el Golgi de una familia de transferasas de glicosilo y los donadores de azúcar de nucleótido adecuados. Muchas de las transferasa de glicosilo catalizan las reacciones de competición, que pueden resultar en la cadena de glicano que se alarga en varias diferentes maneras compatibles, dependiendo de que enzima reacciona primero. Esto resulta en mucrogeterogeneidad y la formación de una familia compleja de glicoformas. Algunas estructuras son únicas para un tejido único, tal como la modificación de ciertas hormonas pituitarias por la adición de GalNAc-4-SO4, o se limitan a unos pocos órganos. Un ejemplo de lo último es la formación de un así llamado GIcNac de bisección (GIcNAc enlazado ß1 , 4 al residuo de ß-manosa) en glicanos complejos de glutamíltranspéptidos en riñon, pero no en hígado. Una estructura biatenaria biseccionada en ?-glutamiltranspeptidasa se muestra abajo: ±Fucul.ó SA?*2, 3/6Galßl,4GlcNAcßl,2Vla?:ul,6 \ | Gl cNAcß 1 ,4Maaßl ,4GlcNAcfU ,4GlcNAc-Asn SAc?2,3/'6Galßl,4Gk:NAcßl,2M??:?ul ,3 / En mamíferos, la enzima responsable, transferasa lll de GIcNac (GnT-l l l) se encuentra en ciertas células del cerebro y riñon y en ciertas células del hígado en pacientes con hepatocarcinomas. Gnt-ll l cataliza la adición de N-acetilglucosamina en el enlace de ß1 , 4 a la ß-manosa enlazada del núcleo de trimanosilo de cadenas de azúcar enlazadas a N para producir un residuo GIcNAc de bisección. Los genes de ratón, rata y humano para Gnt-ll l se han clonado. Ihara et al., J. Biochem. (Tokio) 1 13:692-698 (1 993). La presencia de actividad de GIcNAc T-l ll adicional en células humanas puede producir un incremento en los glicanos híbridos monofosforilados en el gasto de glicanos de complejo bi-, tri- y tetranetarios. Esto no debe afectar la vida media del plasma de manera adversa, pero puede incrementar el objetivo a células endoteliales vasculares. Una estructura representativa se muestra abajo: P-Manal.6 \ GlcN?cß Mar. l,6 \ ! Manal J / Man l ,4G NAcß 1 ,4GlcNAc-A»;? SAa2.3/óGa1ß 1 ,4Glc ? ß I JMana [,3 / Alguna de a-Gal A se toma por el riñon y resulta en una reducción significativa en los glicolípidos aislados. Debido a que el riñon puede formar N-glicanos con residuos de GlcANAc de bisección, las células epiteliales renales pueden reconocer las glicoproteínas con este epítopo con una especificidad particularmente elevada. La actividad de GnT-ll l elevada puede causar un desequilibrio 0 en la ramificación en el núcleo de trimanosilo al inhibir la ramificación adicional por GnT-l l, IV, V y Gal ß1 ,4-transferasa en el nivel de substrato. Recientemente, una línea celular de ovario de hámster Chino (CHO) capaz de producir oligosacáridos biseccionados en glicoproteínas se crea por ia sobreexpresión de GnT-ll l recombinante. Sburalti et al., Biotechnol. Progr. 5 74: 189-192 (1 998). El interferón ß (IFN-ß) se elige como un modelo y proteína heteróloga secretada terapéutica en la cual el efecto de la expresión de GnT-l l l en la glicosilación de producto podría evaluarse. IFN-ß con oligosacáridos biseccionados se produce por las células CHO formadas de GnT-ll l, pero no por la línea celular parental sin modificar. 0 La producción de terapéuticos de glicoproteina requiere la caracterización de glicosilación con respecto a la consistencia de mucho en mucho. La 'carga Z de glicano N hipotética' se ha utilizado como un parámetro para caracterizar la glicosilación de proteína en una manera simple, eficiente. La determinación de Z se ha validad en múltiples 5 experimentos repetitivos y prueba ser altamente exacta y confiable. iáam Hermentin eí al. , Glycobiology 6 21 7-230 ( 1 996). La carga de N-glicano hipotética de una glicoproteína dada se deduce del perfil de mapeo de N-glicano obtenido a través de la cromatografía de intercambio de anión de alto desempeño (HPAEC/detección amperométrica impulsada (PAD). En HPACE, N-glicanos se separan claramente de acuerdo a su carga, por ejemplo, su número de residuos de ácido siálico, proporcionando regiones distintas para estructuras neurales así como para los N-glicanos mono-, di-y tetrasilados. Z se define como la suma de los productos de las áreas respectivas (A) en la región de asíalo, monosialo, disialo, trisialo, tetrasialo, y pentasialo, cada una multiplicada por la carga correspondiente: 7- - A(asLalo)' ' A(MS) J + A(DiS) '2 + A(TñS) "3 - ?(TetraS) *4 O A<pe aS) *5J Z - SA( • (0 en donde /' es la región asíalo, 1 en la región monosialo (MS), 2 en la región diasalo (DiS), 3 en la región trisialo (TriS), 4 en la región tetrasiaio (TetraS), y 5 en la región pentasialo (PentaS). De esta manera, una glicoproteína con estructuras principalmente C4-4* proporcionarán Z = 400, una glicoproteína que lleva estructuras grandemente C2-2* tendrá Z = 200, y una glicoproteína que lleva solamente las estructuras truncadas o de tipo rico en mañosa proporcionarán Z = 0. Las preparaciones de a-Gal A de la presente invención tienen una carga de oligosacárido, como se mide por el número Z, mayor a 100, preferentemente mayor a 150, y más preferentemente mayor a 1 70. Alteración de la Vida Media del a-Gal A de suero Por fosforilación. La fosforilación de a-Gal A puede alterarse para afectar la vida media circulante de a-Gal A y el nivel de a-Gal A que entra en las células. La fosforilación se logra preferentemente dentro de la célula que expresa a-Gal A. Se contempla específicamente obtener una preparación de a-Gal A glicosilada dentro de la fosforilación incrementada al introducir primer en una célula que produce a-Gal A una secuencia de ADN que codifica la transferasa de fosforilo, o al introducir una secuencia reguladora por recombinación homologa que regula la expresión de un gen de transferasa de fosforilo endógeno. La célula de producción de a-Gal A se cultiva entonces bajo condiciones que resultan en la expresión de a-Gal A y transferasa de fosforilo. El aislamiento puede entonces realizarse de la preparación de a-Gal A con fosforilación incrementada en comparación con a-Gal A producida en una célula sin el polinucleótido. Tales transferasas de fosforilo se conocen bien en la materia. Ver, por ejemplo, patentes de Estados Unidos 5,804,41 3 y 5,789,247 cada una incorporada en la presente para referencia. Las acciones concertadas de las dos enzimas de Golgi unidas a la membrana son necesarias para generar un marcador de reconocimiento Man-6-fosfato en una proenzima lisosomal. La primera, UDP-?/-acetilglucosamina; glicoproteína ?/-acetilglucosamina-4-fosfotransferasa (fosfotransferasa de GIcNAc), requiere una determinante de reconocimiento de proteína en las enzimas lisosomales que consiste de dos residuos de lisina exactamente 34 A aparte y en la relación espacial correcta a una cadena rica en mañosa. La segunda, ?/-acetilglucosamina- 4-fosfodiéster-a-?/-acetilglucosamintdasa (fosfodiéster a-GIcNAcasa), hidroliza la unión de a-GIcNAc-fosfato que expone el sitio de reconocimiento Man-6-fosfato. De acuerdo a los métodos de esta invención , las preparaciones de a-Gal A producidas por los métodos de la presente invención tienen múltiples glícoformas con entre 1 6-50% , preferentemente 25-50%, más preferentemente al menos 30%, de glicoformas fosforilándose. Alteración de la Vida Media de a-Gal A de suero por Sialilación incrementada La sialilación incrementada de glicanos subsialilados con residuos de galactosa terminales puede llevarse a cabo por la transfección de células mamíferas y preferentemente humanas con gen de transferasa de sialilo. La presente invención proporciona una preparación de a-Gal A glicosilada que tiene una carga de oligosacárido producida al introducir primero un polinucleótido, que codifica la transferasa de sialilo, en una célula que produce a-Gal A, o introducir una secuencia reguladora por recombinación homologa que regula la expresión de un gen de transferasa de sialilo endógeno. La célula de producción de a-Gal A se cultiva entonces bajo condiciones de cultivo que dan como resultado la expresión de a-Gal A y transferasa de sialilo. La siguiente etapa consiste de aislar la preparación de a-Gal A con carga de oligosacárido incrementada. Las transferasas de sialilo se conocen bien. Por ejemplo, ver Patente de E. U . 5,858,751 , incorporada en la presente para referencia. En una modalidad preferida , este método para incrementar la sialilación incluye la etapa adicional de seleccionar glicoformas de a-Gal A con tamaño incrementado o carga incrementada mediante la fraccionación o purificación de la preparación (como se trata abajo). Alternativamente, la invención proporciona incrementar la sialilación al mantener las células en un ambiente bajo en amonio. En particular, la preparación de a-Gal A glicosilada que incrementa la sialilación se obtiene al contactar una célula de producción de a-Gal A con un medio de cultivo que tiene una concentración de amonio por debajo de 1 0 mM, más preferentemente por debajo de 2 mM. La sialilación incrementada puede realizarse por perfusión de células de producción mediante la cual los metabolitos tóxicos, tal como amonio, se remueven periódicamente del medio de cultivo. En una modalidad, preferida, el ambiente bajo en amonio se logra por la adición del gen de cintaza de glutamina o cADN a las células de producción. Alternativamente, el ambiente bajo en amonio se logra por la perfusión de la célula de producción de a-Gal A con medio de cultivo fresco para mantener la concentración de amonio por debajo de 1 0 mM, más preferentemente, por debajo de 2 mM. Las células de producción pueden penetrarse continuamente con el medio de cultivo fresco con una concentración de amonio por debajo de 1 0 mM, más preferentemente por debajo de 2 mM. Alternativamente, las células de producción pueden penetrarse intermitentemente con medio de cultivo fresco. La perfusión intermitente, como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier perfusión en intervalos de tiempo regulares, periódicos, o después de una medición de la concentración de amonio que se acerca a la concentración objetivo (es decir, 1 0 mM, más preferentemente por debajo de 2 mM). Las perfusiones intermitentes deben encontrarse en intervalos suficientemente frecuentes de manera que la concentración de amonio nunca excede la concentración objetivo. Las células de producción se penetran por un periodo de tiempo necesario para obtener una preparación de a-Gal A con entre 50-70%, preferentemente 60%, de los glicanos totales siendo sialilados. Incremento de la Vida Media Circu lante de a-Gal A por PEGilación de a-Gal A También de acuerdo con esta invención, la vida media circulante de una preparación de a-Gal A glicosilada humana se aumenta al complejar a-Gal A con glicol de polietileno. Poli(glicol de polietileno) (PEG) es un polímero soluble en agua que cuando se enlaza covalentemente a las proteínas, altera sus propiedades en maneras que extienden sus usos potenciales. La modificación de glicol de polietileno ("PEGilación") es una técnica bien establecida que tiene la capacidad de resolver o mejorar muchos de los problemas de farmacéuticos de péptido y proteína. El desempeño farmacológico mejorado de proteínas PEG cuando se compara con sus contrapartes no modificadas indicaron el desarrollo de este tipo de conjugado como un agente terapéutico. Las deficiencias de enzima para las cuales la terapia con la enzima nativa fueron insuficientes (debido a la limpieza rápida y/o reacciones inmunológicas) pueden ahora tratarse con enzimas PEG equivalentes. Por ejemplo, deaminasa de adenosina PEG ya ha obtenido la aprobación de FDA. Delgado et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9:249-304 (1 992): La unión covalente de PEG a a-galactosidasa de las semillas de café verde altera las propiedades catalíticas de la enzima al ocultar los sitios determinantes específicos en la molécula. Esto da como resultado un incremento en Km y una reducción en los valores de Vmax contra los análogos de substrato de p-nitrofenilo. Wieder & Davis, J. Appl. Biochem. 5: 337-47 (1 983). a-galactosidasa todavía fue capaz de separar los residuos de galactosa terminales de la substancia B del grupo de saliva humana. La unión específica de lectína y anticuerpo se pierde de la PEG-a-galactosidasa . Los anticuerpos generados de a-galactosidasa nativa pueden bloquear la actividad de la enzima, y su inhibición se pierde gradualmente cuando se prueba contra preparaciones de la enzima con cantidades progresivamente aumentadas de PEG. En contraste, los antisueros de animales inmunizados con PEG-a-galactosidasa no inhiben la actividad enzimática en ninguna a-galactosidasa o preparación de PEG-a-galactosidasa. Estos resultados indican que PEG tiene a cubrir las porciones de carbohidrato específicas de lectina y los determinantes antigénicos y que estos sitios probablemente permanecen crípticos durante el procesamiento de enzimas PEG. La unión covalente de PEG a proteínas requiere la activación del grupo terminal hidroxilo del polímero con un grupo saliente adecuado que puede desplazarse por el ataque nucleofílico de la terminal e-amino de lisina y el grupo a-amino del término N. Varios grupos químicos se han explotado para activar PEG. Para cada aplicación particular, los diferentes métodos de acoplamiento proporcionan ventajas distintas. Los diferentes modos de PEGilación tienen un impacto dramático y sorprendente en factores tales como la retención de bioactividad, estabilidad e inmunogenicidad de los péptidos y proteínas PEGiladas resultntes. Francis eí al., Int. J. Hematol. 68(1)A -? 8 (1 998). Por ejemplo, una técnica de PEGilacoón sin enlazador une solamente PEG a la molécula objetivo. Más específicamente, la aplicación de una técnica de PEGilación biológicamente optimizada, utilizando PEG(TMPEG) de monometoxi de tresilo, a una variedad de proteínas objetivo revela, como se describe por Francis eí al., Int. J. Hematol. 68(1)? -? 8 (1 998), una capacidad excepcional para conservar la actividad biológica del objetivo. Esto, y el beneficio de agregar nada más que PEG (que se ha mostrado ser seguro para utilizarse en terapéuticos humanos), a la proteína hace al método ideal para la modificación de a-Gal A. Cuatro sitios posibles para acoplar PEG a proteínas son los (1 ) grupos amino (término N y lisina); (2) grupos carboxilo (ácido glutámico y aspártico); (3) grupos sulfhidrilos (cisteína); y (4) grupos carbohidrato (aldehidos generados después del tratamiento con periodato). El acoplamiento a los grupos carboxilo de proteínas y a grupos aldehidos en carbohidratos requiere un reactivo PEG con un grupo amino nucleofílico. Esta química cambia el pl de a-Gal A después de que los grupos carboxilo negativamente cargados se unen por PEG. Cualquier cambio en Pi puede afectar la actividad biológica de a-Gal A. Además, el acoplamiento de PEG a las cadenas de carbohidrato puede afectar la toma de a-Gal A por el receptor M6P, que es crítico para la actividad biológica. La química de sulfhidrilo también afecta la estructura física de la molécula y no se recomienda.

Los métodos comúnmente utilizados para la PEGilación forman un enlace de amida entre los grupos aminos de una proteína y el grupo metoxi en monometoxi-PEG. NHS-PEG se encuentra comercialmente disponible y da como resultado un enlace de amida entre la proteína y PEG. Sin embargo, la formación de la unión de amida cambia pl debido a la pérdida de la carga positiva del grupo -NH2. Un método para acoplar PEG a a-Gal A sin afectar su pl utiliza tresil-PEG. Tresil-PEG se acopla a través de los grupos amino y forman una amina secundaria estable. Las aminas secundarias ofrecen la ventaja de retener la carga positiva del grupo amino. El reactivo de tresil-PEG se encuentra comercialmente disponible y es estable como un polvo disecado y liofilizado. El tresil-PEG se ha caracterizado completamente y la reacción y los sub-productos se entienden bien. De acuerdo con lo anterior, en una modalidad preferida , la preparación de a-Gal A se compleja utilizando PEG de monometoxi de tresilo (TMPEG) para formar una a-Gal A-PEGilada. La a-Gal A PEGilada se purifica entonces para proporcionar a-Gal A-PEGilada, aislada. ESQUEMÁTICA DE LA REACCIÓN CH3(OCH2CH2)rOSO2CH2CF3 + H2N-proteína i CH3(OCH2CH2)n-HN-proteína-monometox¡ tresilado-PEG a-Gal A contiene 18 grupos amino, 17 grupos e-amino (lisina) y un grupo a-amino (término N). La reacción puede controlarse para producir a-Gal A con substituciones mínimas y después las moléculas con una PEG por molécula, o un número promedio menor de porciones PEG por molécula, pueden purificarse de formas no substituidas y substituidas múltiples. Las múltiples substituciones en a-Gal A pueden no afectar de manera significativa la actividad biológica; por lo tanto el producto final puede consistir de una mezcla heterogénea de una a 18 moléculas PEG unidas. El nivel de substitución dependerá del nivel de actividad enzimática retenida. Debe observarse que una reducción en la actividad enzimática puede desplazarse por un efecto terapéutico aumentado derivado del alargamiento de la vida media circulante y el reconocimiento inmune reductor de a-Gal A. De esta manera, para desarrollar un producto PEG-a-Gal A, la proporción de PEG a a-Gal A deberá ser dependiente de la actividad biológica, y no solamente en la actividad enzimática. La reacción de PEGilación requiere un pH controlado, composición reguladora, y concentración de proteína. Las condiciones de reacción apropiadas pueden lograrse por una etapa de ultrafiltración/diafiltración que se utiliza actualmente en el proceso de elaboración. Inmediatamente antes de reaccionar, tresil-PEG se solubiliza rápidamente en agua con agitación continua. Esta solución se agrega entonces a a-Gal A preparada y se deja reaccionar por una cantidad controlada de tiempo y a una temperatura controlada (por ejemplo, 2 horas a 250°C). La PEGilación puede ocurrir antes del proceso de purificación adicional, que eliminará las etapas de adición para el procedimiento de purificación. Después de que el acoplamiento se completa, PEG-a-Gal A se procesa por las etapas restantes del proceso de purificación. El llevar a cabo la reacción antes de la columna Q (intercambio de anión) permite dos etapas de purificación para remover los subproductos de reacción. Ya que PEG no contiene ninguna carga negativa , no se retendrá por la Q Sepharose® y eluirá en el volumen vacío. La cantidad de PEGilación puede medirse por técnicas conocidas. Por ejemplo, las fluorescencias fluorescen cuando se unen a grupos a-amino y e-amino. La pérdida porcentual en fluorescencia después de la PEGilación se correlaciona con e! porcentaje de PEG unido a a-Gal A. El análisis BCA de Pierce para la proteína total puede utilizarse para determinar la concentración de proteína . El análisis de actividad de metilumbeliferil-a-D-galactopiranosida (4-MUF-a-Gal) se utiliza para evaluar el efecto de la actividad enzimática de PEG-a-Gal A. a-Gal A contiene M6P, que se requiere para tomarse en los lisosomas. La interferencia de PEG en el reconocimiento del receptor M6P puede evaluarse utilizando un análisis en base a la célula para monitorear la toma celular de PEG-a-Gal A en lisosomas. Métodos de Administración de Preparación de a-Gal A Las composiciones de la presente invención (es decir, que comprenden varias glicoformas de a-Gal A) pueden administrarse por cualquier vía que es compatible con la preparación de a-Gal A. La preparación de a-Gal A purificada puede administrarse a individuos que producen proteína a-Gal A defectuosa o insuficiente o que pueden beneficiarse de la terapia de a-Gal A. Las preparaciones terapéuticas de la presente invención pueden proporcionarse a un individuo por cualquier medio adecuado, directamente (por ejemplo, localmente como por inyección, implantación o administración tópica a un lugar de tejido) o sistémicamente (por ejemplo, oralmente o parenteralmente).

La vía de administración puede ser oral o parenteral, incluyendo intravenosa , subscutánea, intra-arterial, intraperitoneal, oftálmica , intramuscular, bucal, rectal, vaginal , intraorbital , intracerebral, intradérmica, intracranial , intraespinal, ¡ntraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsular, intrapulmonar, intranasal, transmucosal, transdérmica o a través de inhalación. Los métodos de suministro intrapulmonar, aparato y preparación de medicamento se describen , por ejemplo, en las Patentes de E. U . 5,785,049, 5,780,01 9 y 5,775,320, cada una incorporada en la presente para referencia. Un método preferido de suministro intradérmico es por suministro iontoforético a través de parches; un ejemplo de tal suministro se enseña en la Patente de E. U. 5,843,015 que se incorpora en la presente para referencia . Una vía particularmente útil de administración es por inyección subcutánea. Una preparación de a-Gal A de la presente invención se formula de manera que ia dosis requerida puede administrarse en una sola inyección de uno o dos milímetros. Con objeto de permitir un volumen de inyección de uno o dos milímetros, una preparación de a-Gal A de la presente invención puede formularse en una concentración en la cual la dosis preferida se suministra en un volumen de uno a dos milímetros, o la preparación de a-Gal A puede formularse en forma liofilizada, que se reconstituye en agua o un regulador fisiológicamente compatible apropiado antes de su administración. Las inyecciones subcutáneas de las preparaciones de a-Gal A tienen la ventaja de ser convenientes para el paciente, en particular al permitir la auto-administración, mientras también resulta en una vida media de plasma en comparación con, por ejemplo, j= ^ administración intravenosa. Una prolongación en la vida media de plasma resulta en el mantenimiento de los niveles de a-Gal A de plasma eficaces durante periodos largos de tiempo, el beneficio de lo cual es incrementar la exposición de tejidos clínicamente afectados a la a-Gal A inyectada, como un resultado, incrementan la toma de una a-Gal A en tales tejidos. Esto permite un efecto más benéfico al paciente y/o una reducción en la frecuencia de administración . Además, una variedad de dispositivos diseñados para la conveniencia del paciente, tales como plumas de inyección rellenables y dispositivos de inyección sin aguja, pueden utilizarse con las preparaciones de a-Gal A de la presente invención como se trata en la presente. La administración puede ser por inyecciones periódicas de un bolo de la preparación , o puede administrarse por administración intraperitoneal o intravenosa de un receptor que es externo (por ejemplo, una bolsa IV) o interno (por ejemplo, un implante bioerodable, un órgano bioartificial, o una población de células de producción de a-Gal A implantadas). Ver, por ejemplo, Patentes de E. U. 4,407,957 y 5,798, 1 1 3, cada una incorporada en la presente para referencia. Los métodos de suministro intrapulmonar y el aparato se describen, por ejemplo, en las Patentes de E. U. 5,654,007, 5,780,014 y 5,814,607, cada una incorporada en la presente para referencia. Otros sistemas de suministro parenterales útiles incluyen partículas de copolímero de etileno-vinil acetato, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables, suministro por bomba, suministro de célula encapsulada, suministro liposomal, inyección suministrada por aguja, inyección sin aguja, nebulizador, aerosol, electroporación , y parche transdérmico. Los dispositivos inyectores sin aguja se describe en las Patentes de E. U . 5,879, 327 ; 5,520,639M 5,846,233 y 5,704,91 1 , las especificaciones de las cuales se incorporan para referencia. Cualquiera de las preparaciones de a-Gal A descritas arriba pueden administrarse en estos métodos. La vía de administración y la cantidad de proteína suministrada puede determinarse por los factores que se encuentran bien dentro de la habilidad del experto para valorar. Además, los técnicos expertos se encuentran conscientes de que la ruta de administración y la dosis de una proteína terapéutica pueden variar para un paciente dado hasta que se obtiene un nivel de dosis terapéutico. Formulación Farmacéutica de Proteína A de a-Gal Esta invención proporciona además formulaciones novedosas de una preparación de a-Gal A que se encuentran substancialmente libres de proteínas A sin a-Gal. tales como albúmina , proteínas A sin a-Gal producidas por la célula huésped o proteínas aisladas de tejido o fluido animal. La preparación preferentemente comprende parte de una suspensión o solución de fluido fisiológicamente compatible. El portador o vehículo es fisiológicamente compatible a fin de que, además de suministrar la preparación deseada al paciente, no afecte de ninguna otra manera negativa el equilibrio de electrolitos y/o volumen del paciente. Las soluciones útiles para la administración parenteral pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos muy conocidos en la técnica farmacéutica. Ver, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Gennaro, A. , ed . ) , Mack Pub. , 1990. También pueden utilizarse formulaciones no parenterales tales como supositorios y formulaciones orales. Preferentemente, la formulación contiene un excipiente. Los excipientes farmacéuticamente aceptables para a-Gal A que pueden incluirse en la formulación son reguladores tales como regulador de citrato, regulador de fosfato, regulador de acetato y regulador de bicarbonato, amino ácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos; proteínas, tales como albúmina de suero, colágeno, y gelatina; sales tales como EDTA o EGTA, y cloruro de sodio; liposomas; polivinilpirrolidona; azúcares, tales como dextrano, mannitol, sorbitol, y glicerol; glicol de propileno y glicol de polietileno (por ejemplo, PEG-4000, PEG-6000); glicerol; glicina u otros amino ácidos; y lípidos. Los sistemas reguladores para utilizarse con preparaciones de a-Gal A incluyen citrato; acetato; bicarbonato; y reguladores de fosfato (todos disponibles en Sigma). El regulador de fosfato es una modalidad preferida. Un rango de pH preferido para preparaciones de a-Gal A es pH 4.5-7.4. La formulación también contiene preferentemente un detergente no iónico. Los detergentes no iónicos preferidos incluyen Polisorbato 20, Polisorbato 80, Tritón X-1 00, Tritón X-1 14, Nonidet P-40, a-Glucosida de octilo, ß-Glucosida de octilo, Brij 35, Pluronic y Tween 20 (todos disponibles en Sigma). Una formulación particularmente preferida contiene detergente no iónico de Polisorbato 20 o Polisorbato 80 y solución salina regulada con fosfato, más preferentemente a un pH 6.

Para la liofilización de preparaciones de a-Gal A, la concentración de proteína puede ser de 0. 1 -1 0 mg/mL. Los agentes de abultamiento, tales como glicina, mannitol , albúmina y dextrano, pueden agregarse a la mezcla de liofilización. Además, posibles crioprotectores, tales como disacáridos, amino ácidos y PEG , pueden agregarse a la mezcla de liofilización . También puede agregarse cualquiera de los reguladores, excipientes y detergentes arriba listados. En una formulación preferida , la a-Gal A para la inyección se encuentra a una concentración de 1 mg/mL. Las formulaciones para la administración pueden incluir glicerol y otras composiciones de alta viscosidad para ayudar a mantener al agente en los sitios deseado. Los polímeros biocompatibles, preferentemente bioreabsorbibles, polímeros biocompatibles (incluyendo, por ejemplo, ácido hialurónico, colágeno, polibutirato, láctido, y polímeros glicólidos y copolímeros láctidos/giicólidos) pueden ser excipientes útiles para controlar la liberación del agente in vivo. Las formulaciones para la administración parenteral pueden incluir glicocolato para la administración bucal, metoxisalicilato para administración rectal o ácido cútrico para administración vaginal. Los supositorios para administración rectal pueden prepararse mediante la mezcla de una preparación de a-Gal A de la invención con un excipiente no irritante tal como manteca de cacao u otras composiciones que son sólidas a temperatura ambiente y líquidas a temperaturas corporales. Las formulaciones para administración por inhalación pueden contener lactosa u otros excipientes o pueden ser soluciones acuosas que pueden contener éter de polioxietileno-9-laurilo, glicocolato o deoxicoxolato. Un aerosol de inhalación preferido se caracteriza por tener partículas de pequeña densidad de masa y gran tamaño. Las partículas con densidades de masa de menos de 0.4 gramos por centímetro cúbico y 5 diámetros medios que exceden 5 µm, suministran de manera eficiente los terapéuticos inhalados en la circulación sistémica Tales partículas se inspiran de manera profunda en los pulmones y escapan de los mecanismos de evacuación naturales hasta que las partículas inhaladas entregan su carga útil terapéutica. (Edwards eí al., Science 276: 1868- 10 1872 (1 997)). Las preparaciones de a-Gal A de la presente invención pueden administrarse en forma de aerosol, por ejemplo mediante el uso de métodos de preparación y formulaciones que se describen en las Patentes de E. U. Nos. 5,654,007, 5,780,014 y 5,814,607, cada una incorporada en la presente para referencia. La formulación para la administración 15 ¡ntranasal puede incluir soluciones aceitosas para su administración en la forma de gotas nasales o como un gel para aplicarse de manera intranasal. Las formulaciones para la administración tópica en la superficie de la piel pueden prepararse mediante la dispersión de preparación de a-Gal A con un vehículo dermatológico aceptable tal como 20 una loción, crema, ungüento o jabón. Son particularmente útiles los vehículos capaces de formar una película o capa sobre la piel para localizar la aplicación e inhibir el retiro. Para la administración tópica a superficies de tejido internas, la preparación de a-gal A puede dispersarse en un adhesivo de tejido líquido u otra substancia conocida por mejorar la 25 absorción en una superficie de tejido. Por ejemplo, se han descrito varios ^^^^^g«*¡^^ -¡^^¿^ adhesivos mucosales y tabletas bucales para el suministro transmucosal de fármacos, tal como en las Patente de E . U . Nos. 4,740, 365, 4,764,378 y 5,780,045, cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia . También pueden incorporarse soluciones de hidroxipropilcelulosa o fibrinogen/trombina . De manera alternativa, pueden utilizarse las soluciones de cubierta de tejido, tales como formulaciones que contienen pectina. Las preparaciones de la invención pueden proporcionarse en contenedores adecuados para mantener la esterilidad, proteger la actividad de los ingredientes activos durante la distribución y almacenamiento apropiados, y proporcionar un acceso conveniente y eficaz de la preparación para su administración a un paciente. Una formulación inyectable de una preparación de a-Gal A podría suministrarse en un frasco taponado a través de la separación adecuada de los contenidos mediante ei uso de una aguja y jeringa . El frasco se propondría ya sea para uso individual o para múltiples usos. La preparación también puede suministrarse como una jeringa prellenada. En algunos casos, el contenido se suministraría en una formulación líquida, mientras que en otros se suministraría en un estado liofilizado o en polvo, lo cual en algunos casos requeriría de reconstitución a un estado líquido con un estándar o diluyente suministrado. Cuando la preparación se suministra como un líquido para administración intravenosa, podría proporcionarse en una bolsa o contenedor estéril, adecuado para su conexión a un catéter o línea de administración intravenosa. En modalidades preferidas, las preparaciones de la invención se suministran ÜK^^J^faÜB en formulaciones ya sea líquidas o en polvo, en dispositivos que administran de manera conveniente una dosis predeterminada de la preparación ; ejemplos de tales dispositivos incluyen un inyector sin aguja para inyección ya sea subcutánea o intramuscular y un dispositivo de suministro medido de aerosol. En otros casos, la preparación puede suministrarse en una forma adecuada para liberación prolongada, tal como en un parche o aposito para aplicarse a la piel para administración transdérmica o a través de dispositivos erosionables para su administración transmucosal. En casos donde la preparación se administra de manera oral en forma de tableta o pildora, la preparación podría suministrarse en una botella con una cubierta removible. Los contenedores pueden etiquetarse con información tal como el tipo de preparación , el nombre del fabricante o distribuidor, la indicación , la dosis sugerida, instrucciones para su almacenamiento apropiado o instrucciones de administración. Dosis para Administración de la Preparación de a-Gal A La presente invención proporciona además métodos para la administración de una preparación de a-Gal A a un paciente con enfermedad de Fabry, variante atípica de la enfermedad de Fabry o cualquier condición en la cual se presente un nivel reducido o forma mutante de a-Gal A. La dosis de administración es preferentemente de 0.05-5.0 mg, más preferentemente entre 0.1 -0.3 mg, de la preparación de a-Gal A por kilogramo de peso corporal y se administra de manera semanal o dos veces a la semana. En una modalidad preferida, se administra dos veces a la semana una dosis de aproximadamente 0.2 mg/kg . Las dosis repetidas con regularidad de la proteína son necesarias durante la vida del paciente. Las inyecciones subcutáneas pueden utilizarse para mantener una exposición sistémica del fármaco a mayor plazo. La dosis subcutánea puede ser de entre 0.01 -1 0.0 mg , preferentemente 0.1 -5.0 mg, de la preparación de a-Gal A por kg de peso corporal, semanalmente o dos veces por semana. Las dosis de preparaciones de a-Gal A que se administran mediante inyecciones intramusculares pueden ser iguales o diferentes a las inyectadas de manera subcutánea; en una modalidad preferida, las dosis intramusculares son más pequeñas y se administran de manera menos frecuente. La preparación de a-Gal A también puede administrarse de manera intravenosa o mediante inyección intravenosa continua. La infusión IV continua (por ejemplo, durante 2-6 horas) permite el mantenimiento de niveles específicos en la sangre. Un método preferido alternativo para la administración de una preparación de a-Gal A a un paciente involucra la administración de una dosis preferida de una preparación de a-Gal A, semanalmente o dos veces por semana, por un periodo de varios años, por ejemplo, hasta tres años, durante cuyo tiempo un paciente se monitorea clínicamente para evaluar el estado de su enfermedad. La mejora clínica medida por, por ejemplo, mejora en la función renal o cardiaca o el bienestar general del paciente (por ejemplo, dolor), y la mejora de laboratorio medida por, por ejemplo, reducciones en los niveles de orina, plasma o CTH de tejido, pueden utilizarse para determinar el estado de salud del paciente. En el caso de que se observe una mejora clínica después del periodo de tratamiento y monitoreo , puede reducirse la frecuencia de administración de a-Gal A. Por ejemplo , un paciente que recibe inyecciones semanales de una preparación de a-Gal A puede cambiar a inyecciones dos veces por semana . De manera alternativa, un paciente que recibe inyecciones dos veces por semana de una preparación de a-Gal A puede cambiar a inyecciones mensuales. Siguiendo tal cambio en la frecuencia de dosificación , el paciente debe monitorearse por varios años más, por ejemplo, un periodo de tres años, con objeto de determinar las mediciones clínicas y de laboratorio relacionadas con la enfermedad de Fabry. En una modalidad preferida, la dosis administrada no cambia si se hace un cambio en la frecuencia de dosificación. Esto asegura que ciertos parámetros farmacocinéticos (por ejemplo, concentración máxima de plasma [Cma?], tiempo para la concentración máxima de plasma [tmax], vida media del plasma [t1 2] y exposición , según se miden por área bajo la curva [AUC]) permanezcan relativamente constantes después de cada dosis administrada. El mantenimiento de estos parámetros farmacocinéticos dará como resultado niveles relativamente constantes de ingestión mediada por receptor de una a-Gal A en tejidos a medida que cambian las frecuencias de la dosis. Un paciente con una variante atípica de enfermedad de Fabry, por ejemplo, que exhibe anormalidades predominantemente cardiovasculares o involucramiento renal, se trata con estos mismos regímenes de dosis, es decir, desde 0.05 mg/kg hasta 5 mg/kg semanalmente o dos veces por semana. La dosis se ajusta según sea necesario. Por ejemplo, un paciente con el fenotipo de variante cardiaca que es tratado con terapia de reemplazo de enzima A de a-galactosidasa , tendrá un cambio en la composición de su corazón y mejorará la función cardiaca después de la terapia. Este cambio puede medirse con ecocardiografía estándar, la cual es capaz de detectar un grosor incrementado de la pared ventricular izquierda en pacientes con enfermedad de Fabry (Goldman eí al., J Am Coil Cardiol 7: 1 1 57-1 161 (1 986)). Las mediciones ecocardiográficas en serie del grosor de la pared ventricular izquierda pueden conducirse durante la terapia y una disminución del tamaño de la pared ventricular es indicativo de una respuesta terapéutica. Los pacientes que se someten a una terapia de reemplazo de enzima A de a-gal, también pueden darse seguimiento con representación de resonancia magnética cardiaca (MRI). La MRI tiene la capacidad de determinar la composición relativa de un tejido dado. Por ejemplo, la MRI cardiaca en pacientes con enfermedad de Fabry revela lípidos depositados dentro del miocardio en comparación con pacientes de control (Matsui eí al., Am Heart J 1 1 7: 472-474 (1 989)). Las evaluaciones de MRI cardiaca en serie en un paciente que se somete a terapia de reemplazo de enzimas, pueden revelar un cambio en la deposición de lípidos dentro del corazón de un paciente. Los pacientes con el fenotipo variante renal también pueden beneficiarse de una terapia de reemplazo de enzima A de a-galactosidasa. El efecto de la terapia puede medirse mediante pruebas estándares de la función renal, tal como nivel proteínico en orina de 24 horas, eliminación de creatinina y velocidad de filtración glomerular. Los siguientes ejemplos se presentan con objeto de ilustrar de manera más completa las modalidades preferidas de la invención. Estos ejemplos no deben considerarse de ninguna manera como limitantes al alcance de la invención, según se define por las reivindicaciones anexas. Ejemplo 1 Preparación y Uso de Construcciones Diseñadas para Suministrar y Expresar una a-Gal A Se construyeron dos plásmidas de expresión , pXAG-16 y pXAG-28. Estas plásmidas contienen cADN de a-Gal A que codifica los 398 amino ácidos de ¡a enzima de a-Gal A(sin el péptido de señai de a-Gai A); la secuencia de ADN genómica de péptido de señal de hormona de crecimiento humana (hGH), la cual se interrumpe por el primer intrón del gen de hGH; y ia secuencia 3' no trasladada (UTS) del gen de hGH, el cual contiene una señal para la poliadenilación. La plásmida pXAG-16 tiene el promotor inmediato-anterior de citomegalovirus humano (CMV IE) y el primer intrón (flanqueado por secuencias de exón no codificadoras), mientras que pXAG28 se dirige por el promotor Ia2 de colágeno y el exón 1 y también contiene la UTS 5' del gen de ß-actina, el cual contiene el primer intrón del gen de ß-actina. 1 .1 Clonación del cADN de a-Gal A Completo y Construcciones de la Plásmida pXAG-1 6 de Expresión de a-Gal A El cADN de a-Gal humana se clonó a partir de una biblioteca de cADN de fibroblasto humano que se construyó como sigue. El mARN de poli-A+ se aisló de ARN total y la síntesis de cADN se llevó a cabo mediante el uso de reactivos para el sistema lambda Zapll® de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stratagene Inc. , LaJolla, CA). En resumen, el cADN de "primer filamento" se generó mediante la transcripción inversa en la presencia de una carga de inicio de oligo-Dt que contiene un sitio interno de endonucleasa de restricción de Xhol. Después del tratamiento con RNasa H , el cADN se trasladó de muesca con polimerasa de ADN I para generar cADN de doble filamento. Este cADN se hizo de extremo trunco con polimerasa de ADN T4 y se ligó a adaptadores de EcoRI. Los productos de esta ligación se trataron con quinasa de ADN T4 y se digirieron con Xhol. El cADN se fraccionó mediante cromatografía de Sephacryl®-400. Se depositaron fracciones de tamaño grande y mediano y los cADNs se ligaron a EcoRI y brazos de Zapl l Lambda digeridos por Xhol. Los productos de esta ligación se empaquetaron y titularon . La biblioteca primaria tuvo un título de 1 .2 x 1 07 pfu/mL y un tamaño de inserción promedio de 925 bp. Una sonda de 21 0 bp de exón 7 del gen de a-Gal A humana (FIG. 1 , SEQ ID NO: 1 ) se utilizó para aislar el cADN. La sonda se aisló por sí misma a partir de cADN genómico por la reacción en cadena de polimerasa (PCR) mediante el uso de los siguientes oligonucleótidos: 5'-CTGGGCTGTAGCTATGATAAAC-3' (Oligo 1 ; SEQ ID NO:6) y 5 CTAGCTGAAGCAAAACAGTG-3' (Oligo 2; SEQ ID NO:7). El producto de PCR se utilizó para seleccionar la biblioteca de cADN de fibroblasto y se aislaron clonas positivas y después se caracterizaron. Una clona positiva, fago 3A, se sujetó I protocolo del sistema lambda Zapll® (Stratagene, Inc. , LaJolla, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este procedimiento produjo plásmida pBSAG3A, la cual contiene la secuencia de cADN de a-Gal A en la estructura plásmida pBluescriptSK™. Por consiguiente, el extremo 5' se reconstruyó mediante el uso de un fragmento de PCR amplificado a partir de ADN genómico humano. Para llevar a cabo esto , un fragmento de ADN genómico de 268 bp (FIG. 2, SEQ ID NO:2) se amplificó mediante el uso de los siguientes oligonucleótidos: 5'-ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-3' (Oligo 3; S EQ ID NO:8) y 5'-TGATGCAGGAATCTGGCTCT-3' (Oligo 4; SEQ I D NO:9). Este 5 fragmento se subclonó en una plásmida de clonación "TA" (Invitrogen Corp. , San Diego, CA) para generar la plásmida pTAAGEI. La plásmida pBSAG3A, la cual contiene la mayoría de la secuencia de cADN de a-Gal A, y pTAAGEl, la cual contiene el extremo 5' del cADN de a-Gal A, se digirieron cada una con Sacl l y Ncol. Las posiciones de los sitios 10 relevantes de Sacll y Nco l dentro del fragmento de ADN amplificado, se muestran en la figura 2. El fragmento de 0.2 kb de Sacl l-Nco l de pTAAGEl se aisló y ligó al pBSAG3A igualmente digerido. Esta plásmida, pAGAL, contiene la secuencia completa de cADN de a-Gal A, incluyendo la secuencia que codifica el péptido de señal de a-Gal A. El cADN se ordenó 15 en secuencia por completo (mostrado en la FIG . 3 que incluye e! péptido de señal de a-Gal A; SEQ ID NO:3) y se encontró idéntico a la secuencia publicada para el cADN de a-Gal A humano (secuencia de Genbak HUMGALA). La plásmida pXAG-16 se construyó a través de varios 20 intermedios, como sigue. Primero, pAGAL se digirió con Sacll y Xhol y se truncó su extremo. En segundo lugar, los extremos del cADN de a-Gal A completo se ligaron a enlazadores Xbal y se subclonaron en pEF-BOS digerido por Xbal (Mizushima eí al., Nucí. Acids Res. 18: 5322, 1990), creando pXAG-1 . Esta construcción contiene el UTS de 3' del factor 25 estimulador de colonias granulocitas humanas (G-CSF) y el promotor de ^^^^¿¡éj&& &&¡2?¡^^^&l^ factor de alargamiento 1 a humano (EF-1 a) que flanquea el cADN que codifica la a-Gal A más el péptido de señal de a-Gal A, de tal manera que el extremo 5' del cADN de a-Gal A se fusione con el promotor de EF-1 a. Para crear una construcción con el promotor de CMV IE y el primer intrón , el cADN de a-Gal A y la UTS 3' de G-CSF se retiraron de pXAG-1 como un fragmento de 2 kb de Xbal-BamHI . Se truncó el extremo del fragmento, e ligó a enlazadores BamH I y se insertó en pCMVflpNeo digerido por BamHI (el cual se construyó como se describe abajo). La orientación fue tal que el extremo 5' del cADN de a-Gal A se fusionó con la región promotora de CMV I E. Se creó pCMVflpNeo como sigue. Un fragmento promotor de gen de CMV IE se amplificó por PCR mediante el uso de ADN genómico de CMV como un templado y los oligonucleótidos: 5'-TTTTGGATCCCTCGAGGACATTGATTATTGACTAG-3' (SEQ ID NO: 1 0) y 5'-TTTTGGATCCCGTGTCAAGGACGGTGAC-3' (SEQ ID NO: 1 1 ) El producto resultante (un fragmento de 1 .6 kb) se digirió con BamH I , produciendo un fragmento que contiene promotor de CMV con extremos digeridos por BamHI cohesivos. La unidad de expresión neo se aisló de la plásmida pMCI neopA (Stratagene Inc. , LaJolla, CA) como un fragmento de 1 .1 kb de Xhol-BamHI. Los fragmentos de neo y que contienen promotor de CMV se insertaron en una plásmida digerida por BamHI y Xhol (pUC12). Notablemente, pCMVflpNeo contiene la región promotora de CMV IE, que comienza en el nucleótido 546 y termina en el nucleótido 21 05 (de la secuencia de Genbank HS5MIEP) y el gen de resistencia a la neomicina accionado por el promotor de quinasa de timidina del Virus Simplex de Herpes (HSV) (el gen TKneo) inmediatamente 5' al fragmento promotor de CMV IE . La dirección de la transcripción del gen neo es la misma que la del fragmento promotor de CMV. Esta construcción intermedia fue llamada pXAG-4. Para agregar la UTS 3' de hGH, la UTS 3' de GCSF se retiró de pXAG-4 como un fragmento de Xbal-Sma l y se hicieron truncos los extremos de pXAG-4. La UTS 3' de hGH se retiró de pXGH5 (Selden eí al. , Mol. Cell. Biol. 6: 3173-31 79, 1 986) como un fragmento de 0.6 kb de Smal-EcoRI. Después de que se truncó el extremo de este fragmento, s ¡e ligó a pXAG-4 inmediatamente después del sitio Xbal de extremo trunco de pXAG-4. Este compuesto intermedió se llamó pXAG-7. El fragmento TKneo se retiró de esta plásmida como un fragmento de Hindll l-Clal y los extremos de la plásmida se truncaron mediante "encaje" con el fragmento Klenow de polimerasa I de ADN . Un gen de resistencia a la neomicina accionado por el promotor anterior SV40 se ligó como un fragmento trunco de Clal-BsmBI proveniente de una digestión de pcDNeo (Chen eí al. , Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752, 1987), colocando la unidad de transcripción neo en la misma orientación que la unidad de transcripción de a-Gal A. Este compuesto intermedio se llamó pXAG-13. Para completar pXAG-16, el cual tiene el péptido de señal hGH de 26 amino ácidos que codifica la secuencia y el primer intrón del gen de hGH, se retiró primero un fragmento de 2.0 kb de EcoRI-BamHI de pXAG-1 3. Este fragmento incluyó el cADN de a-Gal A y la UTS 3' de hGH. Este fragmento grande se reemplazó con 3 fragmentos. El primero fragmento consistió en 0.3 kb de producto de PCR de pXGH 5, el cual contiene la secuencia que codifica el péptido de señal de hGH e incluye la secuencia del primer intrón de hGH , provenientes de un sitio sintético de BamH I localizado justo corriente arriba de la secuencia de consenso de Kozak hacia el extremo de la secuencia que codifica el péptido de señal de hGH . Los siguientes oligonucleótidos se utilizaron para amplificar este fragmento (Fragmento 1 ): 5 TTTGGATCCACCATGGCTA-3' (Oligo HGH 101 , SEQ ID NO: 12) y 5'-TTTTGCCGGCACTGCCCTCTTGAA-3' (Oligo HGH 1 02; SEQ ID NO: 13). El segundo fragmento consistió en un producto de 0.27 kb de PCR que contiene las secuencias correspondientes al inicio del cADN que codifica la enzima de a-Gal A de 398 amino ácidos (es decir, que carece del péptido de señal de a-Gal A) para el sitio Nhel. Los siguientes oligonucleótidos se utilizaron para amplificar este fragmento (Fragmento 2): 5'-TTTTCAGCTGGACAATGGATTGGC-3' (Oligo AG 10; SEQ ID NO: 14) y 5'-TTTTGCTAGCTGGCGAATCC-3' (Oligo AG 1 1 ; SEQ ID NO: 1 5). El tercer fragmento consistió en el fragmento de Nhel-EcoRI de pXAG-7 que contiene la secuencia restante de a-Gal A así como también la UTS 3' de hGH (Fragmento 3). El fragmento 1 (digerido con BamHI y Nael), Fragmento 2 (digerido con Pvull y Nhel) y el Fragmento 3 se mezclaron con el fragmento de 6.5 kb de BamH I-EcoRI de pXAG-13 que contiene el genero y el promotor de CMV IE y se ligan en conjunto para generar la plásmida pXAG-16 (FIG. 4). 1 .2 Construcción de la Plásmida de Expresión de a-Gal A pXAG-28 El promotor Ia2 de colágeno humano se aisló para utilizarse en la construcción de expresión de a-Gal A de pXAG-28 como sigue. Un fragmento de 408 bp de PCR de ADN genómico humano que contiene parte del promotor Ia2 de colágeno humano se aisló mediante el uso de los siguientes oligonucleótidos: 5'-TTTTGGATCCGTGTCCCATAGTTTTCCAA-3' (Oligo 72; SEQ I D NO: 16) y 5'-TTTTGGATCCGCAGTCGTGGCCAGTACC-3' (Oligo 73; SEQ ID NO: 1 7). Este fragmento se utilizó para seleccionar una biblioteca de leucocitos humanos en EMBL3 (Clontech Inc. , Palo Alto, CA). Una clona positiva (fago 7H) que contiene un fragmento de 3.8 kb de EcoRI se aisló y clonó en pBSI ISK+ (Stratagene Inc. , La Jolla, CA) en el sitio EcoRI (creando pBS/7h.2). Se introdujo un sitio Avrll en pBSIISK+ mediante digestión con Spel, el cual se disocia dentro del polienlazador de pBSI ISK+, "ajustándose" al fragmento de Klenow de la polimerasa I de ADN, e insertando el oligonucleótido 5'-CTAGTCCTAGGA-3' (SEQ ID NO: 1 8). Esta variante de pBSIISK+ se digirió con BamH I y Avrll y se ligó al fragmento de 121 bp de BamHI-Avrll del fragmento de PCR de promotor original de Ia2 de colágeno de 408 bp arriba descrito, creando pBS/121 CO.6. La plásmida pBS/121 COL.6 se digirió cpn Xbal, la cual se disocia dentro de la secuencia de pBSIISK + polienlazador, se "ajusta" con el fragmento de Klenow de la polimerasa I de ADN y se digiere con Avrl l. El fragmento de 3.8 kb de BamHI-Avrl l de pBS/7H.2 se aisló y el sitio BamHI se truncó en su extremo mediante tratamiento con enzima de Klenow. El fragmento se digirió entonces con Avrl l y se ligó al vector digerido con Avrll, creando así la plásmida promotora de colágeno pBS/1 21 bpCOL7H J 8. Enseguida, el promotor de colágeno se fusionó con la UTS 5' del gen de ß-actina humano, el cual contiene el primer intrón del gen de ß-actina humano. Para aislar esta secuencia, se aisló un fragmento de 2 kb de PCR a partir de ADN genómico humano mediante el uso de los siguientes oligonucleótidos: 5'-TTTTGAGCACAGAGCCTCGCCT-3' (Oligo BA1 ; SEQ ID NO: 1 9) y 5'-TTTTGGATCCGGTGAGCTGCGAGAATAGCC-3' (Oligo BA2 ; SEQ ID NO:20). Este fragmento se digirió con BamH I y BsiHKAI para liberar un fragmento de 0.8 kb que contiene la UTS 5' de ß-actina y el intrón. Se aisló entonces un fragmento de 3.6 kb de Sall-Srfl a partir de la plásmida promotora de colágeno pBS/121 bpCOL7H. 18 como sigue. El pBS/121 bpCOL7HJ 8 se digirió parcialmente con BamHI (el sitio BamH I yace en el extremo 5' del fragmento promotor de Ia2 de colágeno), se truncó su extremo mediante tratamiento con el fragmento de Klenow y se ligó a un enlazador de Salí (5'-GGTCGACC-3'), colocando así un sitio Salí corriente arriba del promotor de Ia2 de colágeno. Esta plásmida se digirió entonces con Salí y Srfl (el sitio Srfl yace 1 10 bp corriente arriba del sitio CAP promotor de Ia2 de colágeno) y se aisló el fragmento de 3.6 kb. Los fragmentos de 0.8 y 3.6 kb se combinaron con Salí - y BamHI - se digirieron con pBSIISK (Stratagene Inc., LaJolla, CA) y se compuso un fragmento de los siguientes cuatro oligonucleótidos templados en conjunto (formando un fragmento con un extremo trunco y un extremo de BsiHKAI): 5'-GGGCCCCCAGCCCCAGCCCTCCCATTGGTGGAGGCCCTT TTGGAGGCACCCTAGGGCCAGGAAACTTTTGCCGTAT-3' (Oligo COL-1 ; SEQ ID NO:21 ), 5'-AAATAGGGCAGATCCGGGCTTTATTATTTTAGCACCACGG CCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAGCA-3' (Oligo COL-2; SEQ I D NO:22), 5'-TGCCCTATTTATACGGCAAAAGTTTCCTGGCCCTAGGGTGC CTCCAAAAGGGCCTCCACCAATGGGAGGGCTGGGGCTGGGGGCCC-3' (Oligo COL-3; SEQ ID NO: 23), y 5'-CGCGGGGCGGACGCGGTCTCGGCGGCCGTGGTGCTAAA ATAATAAAGCCCGGATC-3' (Oligo COL-4; SEQ ID NO:24). Cuando estos cuatro oligonucleótidos se templan, corresponden a la región que comienza en el sitio Srfl del promotor de colágeno y continúan a través del sitio BsiHKAI del promotor de ß-actina.

La plásmida resultante se designó pCOL/ß-actina. Para completar la construcción de pXAG-28, se aisló el fragmento de Sall-BamH I de pCOL/ß-actina, que contiene el promotor de Ia2 de colágeno y UTS 5' de ß-actina. Este fragmento se ligó a dos fragmentos de pXAG-16 (ver Ejemplo 1 .1 y FIG. 4): (1 ) el fragmento de 6.0 kb de BamHI (que contiene el gen neo, la estructura plásmida, el cADN que codifica la enzima de a-Gal A de 398 amino ácidos y la UTS 5' de hGH); y (2) el fragmento de 0.3 kb de BamHI-Xhol (el cual contiene la secuencia poli A de SV40 de pcDneo). PXAG-28 contiene el promotor de Ia2 de colágeno humano fusionado con la UTS 5' de ß-actina humana, el péptido de señal hGH (el cual se interrumpe por el primer intrón de hGH), el cADN que codifica la enzima de a-Gal A, y la UTS 3' de hGH. En la FIG. 5 se muestra un mapa de la construcción de expresión completa de pXAG-28. 1 .3 Transfección y Selección de Fibroblastos Electroporados con Plásmidas de Expresión de a-Gal A Con objeto de expresar a-Gal A en fibroblastos, los fibroblastos secundarios se cultivaron y transfectaron de acuerdo con los procedimientos publicados (Selden eí al. , WO 93/09222). Las plásmidas pXAG-1 3, pXAG-16 y pXAG-28 se transfectaron mediante electroporación en fibroblastos de piel anterior humana para generar cepas celulares clónales, establemente transfectadas, y los niveles de expresión de a-Gal A resultantes se monitorearon según se describe en el Ejemplo 1 .4. La secreción de a-Gal A mediante fibroblastos de piel anterior normal se encuentra en el rango de 2-1 0 unidades/1 06 células/24 horas. En contraste, los fibroblastos transfectados mostraron niveles de expresión medios según se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2 Niveles Medios de Expresión de a-Gal A (+ desviación estándar) pXAG-1 3: 420 + 344 U/1 0b células/día N=26 cepas clónales (rango 3 - 1 1 33 U/106 células/día) pXAG-16: 2,051 + 1 253 U/106 células/día N=24 cepas clónales (rango 422 - 5200 U/1 06 células/día) pXAG-28: 141 + 1 31 U/1 06 células/día N=38 cepas clónales (rango 20 - 616 U/106 células/día) Estos datos muestran que las tres construcciones de expresión son capaces de incrementar la expresión de a-Gal A muchas veces la de los fibroblastos no transfectados. La expresión por fibroblastos establemente transfectados con pXAG-1 3, el cual codifica una a-Gal A enlazada al péptido de señal de a-GalA, fue substancialmente inferior que la expresión por fibroblastos transfectados con pXAG-16, el cual difiere solamente en que el péptido de señal es el péptido de señal de hGH, la secuencia codificadora del cual se interrumpe por el primer intrón del gen de hGH. Cada vez que se pasaron las células transfectadas, la actividad de a-Gal A segregada se determinó, se realizó un conteo de las células y se calculó la densidad celular. En base al número de células cosechadas y al tiempo permitido para la secreción de a-Gal A, se determinó la velocidad de expresión específica de a-Gal A y se reportó en las Tablas 3 y 4 como unidades segregadas (de a-Gal A) por 106 células por un período de 24 horas. Las cepas celulares deseables para la terapia genética o para utilizarse en la generación de material para purificación de a-Gal A, exhiben un crecimiento y expresión estables durante varias pasadas. Los datos de las cepas celulares mostrados en las Tablas 3 y 4, las cuales se transfectaron establemente con la construcción de expresión de a-Gal A pXAG-16, ilustran el hecho de que la expresión de a-Gal A se mantiene estable durante su paso en serie. Tabla 3 Crecimiento y Expresión de Células BRS-1 1 que Contienen la Construcción de Expresión de a-Gal A pXAG-1 6 Pasada Expresión Densidad Celular (unidades/1 06 (células/cm2) células/24 hr) ? 2601 4.80 x 1 04 14 1616 4.40 x 1 04 1 5 3595 4.40 X 1 04 Tabla 4 Crecimiento y Expresión de Células HF503-242 que Contienen la Construcción de Expresión de a-Gal A pXAG-16 Pasada Expresión Densidad Celular (unidades/1 06 (células/cm2) células/24 hr) 5 4069 2.80 x 104 6 7585 3.55 x 104 7 5034 2.48 x 104 1 .4 Cuantificación de la Expresión de a-Gal A La actividad de la actividad de a-Gal A se midió mediante el uso de substrato soluble en agua de 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranosida (4-MUF-gal; Research Products, Inc.) mediante una modificación del protocolo descrito por loannou eí al., J. Cell Biol. 199: 1 137-1 1 50 (1992). El substrato se disolvió en regulador de substrato (0J M de citrato-fosfato, pH 4.6) a una concentración de 1 .69 mg/mL (5 mM). Típicamente, se agregaron 10 mL de sobrenadante de cultivo a 75 mL de la solución de substrato. Los tubos se cubrieron y permitieron incubar en un baño de agua a 37°C durante 60 minutos. Al final del periodo de incubación, se utilizaron 2 mL de regulador de glicina-carbonato (1 30 mM de glicina, 83 mM de carbonato de sodio, a pH 1 0.6), para detener la reacción. La fluorescencia relativa de cada muestra se midió mediante el uso de un fluorómetro modelo TK0100 (Hoefer Scientific Instruments) el cual tiene una longitud de onda de excitación fija de 365 nm y detecta una longitud de onda de emisión fija de 460 nm. Las lecturas de las muestras se compararon con los estándares preparados a partir de un depósito de 1 mM de metilumbeliferona (Sigma Chemical CO.) y se calculó la cantidad de substrato hidrolizado. La actividad de la a-Gal A se expresó en unidades; una unidad de actividad de a-Gal A es equivalente a un nanomol de substrato hidrolizado por hora a 37°C. Los datos de expresión celular se expresaron generalmente como unidades de la actividad de a-Gal A segregada/106 células/24 horas. Este ensayo también se utilizó para medir la cantidad de actividad de a-Gal en lisados celulares y en muestras de diversas etapas de purificación de a-Gal, como se discute abajo. 1 .5Preparación de a-Gal A Activada por Gen (GA-GAL) la producción de a-Gal A activada por gen (GA-GAL) ocurrió mediante la inserción de secuencias de ADN reguladoras y estructurales corriente arriba de la secuencia codificadora de a-Gal A humana, utilizando la tecnología de GA substancialmente como se describe en la Patente de E. U. No. 5,733,761 , incorporada en la presente para referencia. Esta inserción precisa de la secuencia de activación por gen ocurre como resultado de la recombinación homologa entre ADN presente en un fragmento de ADN transfectado y secuencias de ADN genómico corriente arriba de los sitios de a-Gal A en una célula humana. La secuencia de activación por gen contiene por sí misma una secuencia de codificación de a-Gal A hasta, pero sin incluir, el sitio de disociación del péptido de señal. Las células que contienen un sitio activado de a-Gal A se aislaron y sujetaron a selección de fármacos para aislar células con producción incrementada de GA-GAL.

Un fragmento de ADN de direccíonamiento que contiene una secuencia de activación por gen apropiada se introdujo en líneas celulares humanas, huéspedes, mediante electroporación. Una de tales líneas celulares es HT-1 080, una línea celular certificada disponible en ATCC 5 (Rocville, Maryland). La plásmida de activación del gen (construcción de direccionamiento) pGA 21 3C que contiene ta! fragmento de ADN se muestra en la FIG. 9. Esta plásmida contiene secuencias diseñadas para activar una porción de los sitios endógenos de a-Gal A en la línea celular huésped , y contiene secuencias que codifican el péptido de señal, pero no 10 a-Gal A humana. La construcción de direccionamiento también contiene cassettes de expresión para los genes neo bacterianos y dhfr de ratón.

Estos permiten la selección de fragmentos de direccionamiento establemente integrados (a través del gen neo) y para la selección subsecuente del gen dhfr mediante el uso de selección de metotrexato 15 (MTX) etapa por etapa. Además, pGA213C contiene secuencias diseñadas para dirigir secuencias cromosómicas corriente arriba de los sitios endógenos de a- Gal A mediante recombinación homologa. La recombinación homologa entre los sitios endógenos de a-Gal A y el fragmento de 9.6 kb de ADN de 20 pGA21 3C se muestra en la FIG. 10. pGA213C se construyó para omitir 962 bp de secuencias genómicas que se extienden desde posiciones -1 183 hasta -222 con relación al codón de iniciación de metionina de a-Gal A, después de la recombinación homologa del fragmento de pGA213C con los sitios de 5 cromosoma X de a-Gal A. La activación transcripcional de los sitios de a- gjg^? Gal A ocurre a través del direccionamiento preciso de las secuencias reguladoras exógenas corriente arriba de ia región codificadora de a-Gal A. Los sitios de GA-GAL resultantes provocan que la transcripción se inicie desde el promotor de CMV y que proceda a través del exón 1 CMV, el intrón de aldolasa y los siete exones y seis intrones de la secuencia codificadora de a-Gal A. La división del mARN de precursor grande une el exón de CMV exógeno (insertado mediante direccionamiento) con el primer exón endógeno entero de la transcripción de a-Gal A. La transcripción del mARN de GA-GAL da como resultado pre GA-GAL con un péptido de señal de treinta y un amino ácidos. Después de la secreción de la célula huésped, se retira el péptido de señal. Las líneas celulares correctamente direccionadas se identifican primero por selección de reacción en cadena de polimerasa respecto a la presencia de mARN de GA-GAL. Las clonas que producen el mARN de GA-GAL también se encontró que segregan a-Gal A enzimáticamente activo en el medio de cultivo. La confirmación subsecuente de los eventos de direccionamiento se lleva a cabo por digestión de enzima de restricción y análisis de hibridización Southern blot de ADN genómico. Las células se expusieron a selección de metotrexato ("MTX") paso a paso. Después de la selección en 0.05 µM de MTX, se aisló una clona de células y se sujetó a OJ µM de selección de MTX. A partir de este proceso, se aisló un depósito de células resistentes a OJ µM de MTX (línea celular RAG001 ) , se expuso en cultivo y se caracterizó. Ejemplo 2 Purificación de a-Gal A El siguiente es un método preferido para producir, purificar y examinar a-Gal A. El proceso de purificación mantiene a-Gal A en una forma soluble, activa , nativa a través de todo el proceso de purificación . La proteína no se expone a extremos de pH, solventes orgánicos ni detergentes, no se disocia proteolíticamente durante el proceso de purificación y no forma agregados. El proceso de purificación se diseña para no alterar la distribución de glicoformas de a-Gal A. 2.1 Purificación de a-Gal A El Ejemplo 2J ilustra que la a-Gal A puede purificarse hasta cerca de la homogeneidad a partir del medio acondicionado de cepas celulares humanas cultivadas que se han transfectado establemente para producir la enzima . La a-Gal A se aisla de la a-Gal A que contiene un medio que utiliza una serie de cinco etapas cromatográficas. Las cinco etapas utilizan diversos principios de separación que toman ventaja de las diferentes propiedades físicas de la enzima para separar a-Gal A de material contaminante. Se incluyen la cromatografía de interacción hidrofóbica en butiol Sepharose®, interacción iónica en hidroxiapatita , cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharose® y cromatografía de exclusión por tamaño en Superdex® 200. Además de ser la etapa final en el proceso de purificación, la cromatografía de exclusión por tamaño también sirve como un medio eficaz para intercambiar la proteína purificada en un regulador compatible con la formulación. A. Uso de Cromatografía de Butilo Sepharose® como una Primer Etapa en la Purificación de a-Gal A El medio acondicionado frío (1 .34 litros) se clarificó mediante centrifugación y se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0.45 µm mediante el uso de prefiltros de fibra de vidrio. Mientas se agotaba, el pH del medio filtrado, frío, se ajustó a 5.6 mediante la adición gota a gota de 1 N de HCl, y se agregó sulfato de aminoácido a una concentración final de 0.66 M mediante la adición gota a gota de una solución en depósito (temperatura ambiente) de 3.9 M de sulfato de amoniaco ultrapuro. El medio se agitó por 5 minutos adicionales a 4°C, se filtró como antes y se aplicó a una columna de Flujo Rápido de Butilo Sepharose® 4 (81 ml de volumen en la columna, 2.5 x 16.5 cm; Pharmacia, Uppsala, Suecia) que se había equilibrado en 10 mM de MES-Tris, pH 5.6, que contiene 0.66 M de sulfato de amoniaco (regulador A). La cromatografía se llevó a cabo a 4°C en un Sistema Gradi-Frac™ (Pharmacia, Uppsala, Suecia) equipado con monitores de conductividad y UV en línea (280 nm) para determinar la concentración total de proteína y sal, respectivamente. Después de la aplicación de la muestra a una velocidad de flujo de 10 ml/min, la columna se enjuagó con 1 0 volúmenes de coiumna de regulador A. La a-Gal A se levigó de ia columna de Butilo Sepharose® con una gradiente lineal de 14 volúmenes de columna de regulador A (que contiene sulfato de amoniaco) para 10 mM de MES-Tris, pH 5.6 (no sulfato de amoniaco). Las fracciones se ensayaron para la actividad de a-Gal A mediante el ensayo de 4-MUF-gal y se depositaron aquellas que contienen actividad de enzima apreciable. Como se observa en la Fig. 8 y el resumen de purificación (Tabla 5), esta etapa retira aproximadamente 99% de la proteína contaminante (muestra de precolumna = 8.14 g de proteína total: muestra de post-columna = 0.0638 g de proteína total).

Tabla 5: Purificación de a-Gal A a Partir del Medio Acondicionado de Fibroblastos Humanos Establemente Transfectados Etapa de Volumen Actividad Proteína Actividad Purificaci Recupera Purificaci (ml) de a-Gal Total Específic ón de ción ón A (x106 (mg) a (x1 06 Doblez Porcentu Unidades Unidades (Acumula al ) /mg) tiva) Sobrenad 1 340 14.6 8140 0.0018 =1 =1 00 ante de cultivo Butilo 417 14.1 63.8 0.221 1 23 96.6 Sepharos e® Heparina 134 1 2.1 14.6 0.829 436 82.9 Sepharos e® Hidroxi- 47 9.73 4.46 2.1 8 1220 66.6 apatita Q 31 .5 8.91 3.31 2.69 1 503 61 .0 Sepharos e® Superdex 1 0 8.58 2.93 2.92 1634 59.0 ® 200 B. Uso de Cromatografía de Heparina Sepharose® como una Etapa de Purificación de a-Gal A Las fracciones pico de la columna de Butilo Sepharose® se dializaron a 4°C contra (4 litros) de 10 mM de MES-Tris, pH 5.6 (cambiado una vez). La conductividad del dializado se ajustó a 1 .0 mMHO a 4°C mediante la adición de H2O o NaCI según sea necesario. Después de esto, la muestra se aplicó a una columna de Heparina Sepharose® 6 de Flujo Rápido (Pharmacia, Uppsala, Suecia; 29 ml de volumen de columna, 2.5 x 6 cm) que se había equilibrado en 1 0 mM de MES-Tris, pH 5.6, que contiene 9 mM de NaCI (regulador B). Esto se hizo a 4°C a una velocidad de flujo de 10 ml/min. Los monitores de conductividad y UV en línea (280 nm) midieron la concentración total de proteína y sal. Después de que se aplicó la muestra, la columna se enjuagó con 10 volúmenes de columna de regulador B seguidos por una gradiente lineal de 3 volúmenes de columna hasta 8% de regulador C/92% de regulador B (donde el regulador C es 10 mM de MES-Tris, pH 5.6, que contiene 250 mM de NaCI) y un enjuague de 10 volúmenes de columna con 8% de regulador C. Esto fue seguido por levigación de a-Gal A con una gradiente lineal de 1 .5 volúmenes de columna hasta 29% de regulador C y una gradiente lineal subsecuente de 1 0 volúmenes de columna hasta 35% de regulador C . Las fracciones se ensayaron respecto a la actividad de a-Ga l A y se depositaron aq uella s que contienen actividad apreciable . C. Uso de Cromatografía de Hidroxiapatita como una Etapa para la Purificación de a-Gal A Ei depósito de hepapna se filtró y aplicó directamente a una columna de HC de Hidroxiapatita Cerámica (40 µm; American Internationa l Chemical, Natick, MA; 1 2 ml de volumen de columna, 1 .5 x 6.8 cm) que se había equilibrado en 1 mM de fosfato de sodio, pH 6.0 (regulador D). La cromatografía se llevó a cabo a temperatura ambiente en un Sistema híbrido Gradi-Frac™/FPLC® (Pharmacia, Uppsala, Suecia) equipado con monitores de UV (280 nm) y conductividad en línea. Después de que se aplicó la muestra (5 ml/min), la columna se enjuagó con 1 0 volúmenes de columna de regulador D. La a-Gal A se levigó con una gradiente lineal de 7 volúmenes de columna hasta 42% de regulador E/58% de regulador D (donde el regulador E es 250 mM de fosfato de sodio, pH 6.0) seguida por una gradiente de 1 0 volúmenes de columna hasta 52% de regulador E. Las fracciones se ensayaron respecto a la actividad de a-Gal A y se depositaron las fracciones que contienen actividad apreciable. D. Uso de Cromatografía de Intercambio Aniónico de Q Sepharose® como una Etapa para la Purificación de a-Gal A El depósito de hidroxiapatita se diluyó aproximadamente 1 .5 veces con H2O hasta una conductividad final de 3.4-3.6 mMHO a temperatura ambiente. Después de la filtración, la muestra se aplicó a una columna de Q Sepharose ® HP (Pharmacia , Uppsala , Suecia ; 5J ml de volumen de columna, 1 .5 x 2.9 cm) equilibrado en 1 0% de regulador G/90% de regulador F, donde el regulador F es 25 M de fosfato de sodio, pH 6.0 y regulador G es 25 mM de fosfato de sodio, pH 6.0, 250 mM de NaCl. La cromatografía se llevó a cabo a temperatura ambiente en el sistema híbrido Gradi-Frac™/FPLC® (Pha rmacia , Uppsaia , Suecia) y las concentraciones totales de proteína y sal fueron monitoreadas mediante los mínitores en l ínea . La muestra se aplicó a una velocidad de flujo de 5 ml/min , después se llevaron a cabo las siguientes etapas: ( 1 ) un enjuague de 5 volúmenes de columna a 10% de regulador G, (2) un enjuague de 7 volúmenes de columna a 12% de regulador G, (3) una gradiente lineal de volúmenes de columna a 50% de regulador G , (4) una gradiente lineal de 1 0 volúmenes de columna a 53% de regulador G, (5) una gradiente de 3 volúmenes de columna a 1 00% de regulador G y (6) un enjuague de 1 0 volúmenes de columna a 1 00% de regulador G. La a-Gal A se levigó básicamente durante las etapas 3 y 4. Se depositaron las fracciones que contienen actividad apreciable (el "depósito de Q"). E. Uso de Cromatografía de Filtración de Gel Superdex®-200 como una Etapa para la Purificación de a- Gal A El depósito de Q se concentró aproximadamente 5 veces mediante el uso de Centriprep® - 1 0 unidades concentradoras centrífugas (Amicon , Beverly, MA) y se aplicó a una columna Superdex® 200 (Pharmacia, Uppsala , Suecia; 1 89 ml de volumen de columna, 1 .6 x 94 cm). La columna se equilibró y levigó con 25 mM de fosfato de sodio, pH 6.0. conteniendo 1 50 mM de NaCl . La cromatografía se llevó a cabo en un sistema de FPLC® (Pha rmacia , Uppsala , Suecia ) a temperatura ambiente mediante el uso de un monitor en línea de UV (280 nm) para seguir la levigación de la proteína . El volumen de la muestra aplicado a la columna fue de <2 ml, la velocidad de flujo fue de 0.5 ml/min y el tamaño de la fracción fue de 2 ml . Se llevaron a cabo múltiples recorridos de la columnatas fracciones se ensayaron respecto a la actividad de a-Gal A y se depositaron las fracciones que contienen actividad apreciable. Las fracciones depositadas provenientes de la columna JO Superdex® 200 se concentraron mediante el uso de 1 0 unidades Centriprep, se formaron alícuotas, se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80°C durante periodos de tiempo cortos. En la Tabla 5 se muestra un resumen de este ejemplo de purificación de a-Gal A. La producción final de a-Gal A fue de 59% de la actividad de la materia prima 15 y la actividad específica del producto purificado fue de 2.92 x 106 unidades/mg de proteína . El producto resultante mostró un alto nivel de pureza después de la electroforesis bajo condiciones reductoras en un gel ^fc de SDS-poliacrilamida al 4-1 5% , el cual fue subsecuentemente teñido de plata. 20 Resumen El proceso de purificación proporcionó a-Gal A altamente purificada. La mayoría de la purificación ocurre en las primeras 2 etapas del proceso, mientras que las tres etapas finales sirven para pulir el material al retirar los contaminantes menores restantes. La última etapa, 25 de cromatografía por exclusión de tamaño en Superdex® 200, también sirve para intercambiar la a-Gal A en u n regulador comparable con la formulación 2.2 Tamaño de la a-Gal A Produc ida por Cé lu las H u manas Establemente Transfectadas en Cu ltivo Las propiedades estructurales y funcionales de la a-Gal A humana purificada se investigaron . El producto resultante mostró un alto nivel de pureza después de la electroforesis bajo condiciones reductoras en un gel de S DS-poliacrilamida de 4-1 5%, el cual fue subsecuentemente teñido de plata. 10 La masa molecular de una a-Gal A se estimó por espectrometría de MALDI-TOF. Estos resultados demostraron que la masa molecular de! dímero es de 1 02,353 Da , mientras que la del monómero es de 51 ,002 Da . La masa molecular esperada del monómero, en base a la composición amíno acida, es de 45,400 Da. Por consiguiente, el contenido 15 de carbohidratos de la enzima se cuantifica en hasta 5,600 Da de! peso molecular. 2.3 Mod ificación de Carbohidratos de a-Gal A Produc ida por Células Humanas Establemente Transfectadas El patrón de glicosilación de a-Gal A producida de acuerdo con 20 la invención también se evaluó. La glicosilación apropiada es importante para una óptima actividad in vivo de a-Gal A; la a-Gal A expresada en sistemas de no glicosilación es inactiva o inestable. Hantzopolous eí al. , Gene 57: 1 59 (1 987). La glicosilación también es importante para la internalización de a-Gal A en las células objetivo deseadas y afecta la vida 25 media en circulación de la enzima in vivo. En cada subunidad de a-Gal A, _ ¿¿ existen cuatro sitios disponibles para la adición de cadenas de carbohidrato enlazadas a asparagina , de los cuales solamente se ocupan tres. Desnick eí al. , I N THE METABOLIC AN D MOLECU LAR BASES OG IN HERITED DISEASE, (McGraw Hill, New York, 1 995) pág . 2741 -2780. Una muestra de a-Gal A producida mediante células establemente transfectadas se trató con neuraminidasa , ¡a cual se aisló de A. urafaciens, (Boehringer-Mannheim , Indianapolis, I N) para retirar ácido siálico. Esta reacción se llevó a cabo mediante tratamiento con 5 mg de a-Gal A durante la noche con 10 mU de neuraminidasa a temperatu ra ambiente en un volumen total de 1 0 mL de solución salina regulada con acetato (ABS, 20 mM de acetato de sodio, pH 5.2, 1 50 mM de NaCI). La a-Gal A purificada, producida mediante células establemente transfectadas, también se desforforiló mediante el uso de fosfatasa alcalina (fosfatasa alcalina intestinal fetal, Boehringer-Mannheim, Indianapolis. IN), mediante tratamiento con 5 mg de a-Gal A durante la noche a temperatura ambiente con 1 5 U de fosfatasa alcalina en ABS (pH elevado a 7.5 con 1 M Tris). Las muestras se analizaron mediante SDS-PAGE y/o enfoque isoeléctrico seguido por Western blot con un anticuerpo específico de anti-a-Gal A. El anticuerpo utilizado fue un anticuerpo de anti-péptido policlonal de conejo, el cual se produjo mediante el uso de un péptido que representa 68-81 amino ácidos de a-Gal A como un inmunogen. Después de la transferencia de la proteína a PVDF (Mil lipore, Bedford, MA), la membrana se sondeó con una dilución 1 :2000 del antisuero en 2.5% de blotto (leche seca no grasa en 20 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 0.05% de üCA».

Tween-20). Esto se siguió por la detección con IgG de anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Órgano Technique/Cappella, Durham, NC; dilución 1 :5000) y reactivos del equipo de quim ioluminiscencia ECL (Amersham, Arii ngton Heights, IN) . El tratamiento de a-Gal A con neuraminidasa seguida por análisis de SDS-PAGE dio como resultado un desplazamiento en la masa molecular (aproximadamente 1 500-2000 Da o 4-6 ácidos siálicos/monómero), sugiriendo que existe una modificación extensa de a- Gal A con ácido siálico. Para referencia , la forma de plasma de a-Gal A tiene 5-6 residuos de ácido siálico por monómero y la forma placentaria tiene 0.5-1 .0 residuos de ácido siálico por monómero. Bishop eí al. , J. Biol. Chem. 256: 1 307 (1 981 ). Otro método utilizado para examinar las modificaciones de ácido siálico y M6P de a-Gal A fu el enfoque isoeléctrico (IEF), donde las 15 muestras se separaron sobre la base de su punto isoeléctrico (pl) o carga neta . Por lo tanto, se espera que el retiro de los residuos cargados, tales como el ácido siálico o fosfato e a-Gal A, altere la movilidad de la proteína en el sistema de IEF. Para llevar a cabo el experimento de IEF, las muestras de a- 0 Gal A producida de acuerdo con la invención , se trataron con neuraminidasa y/o fosfatasa alcalina, mezclada 1 : 1 con regulador de muestra 2X Novex (con 8 M de urea , pH 3.0-7.0) y se cargaron en 6 M de gel IEF de urea (5.5% poliacrilamida) elaborado mediante el uso de Pharmalyte® (Pharmacia, Uppsala , Suecia, pH 3.0-6.5; Pharmalyte® 4-6.5 5 y 2.5-5.5, 0.25 mL cada uno por gel). También se incluyeron los estándares de puntos isoeléctricos (Bio-Rad). Después de la electroforesis, el gel se transfirió a PVDF y se llevó a cabo un análisis Western blot como se describe arriba El tratamiento de neuraminidasa de la enzima incrementó el pl de las tres isoformas, indicando que todas se modificaron en cierto grado por el ácido siálico. Estos datos sugieren que las preparaciones de a-Gal A producidas como se describe en la presente deben tener una vida media de plasma deseable, indicando que este material es muy adecuado para uso farmacológico. Además, el tratamiento de a-Gal A tratada con neuraminidasa con fosfatasa alcalina incrementó aún más el pl de una porción de la proteína hasta aproximadamente 5.0-5J , indicando que la enzima contiene uno o más residuos de M6P. Esta modificación se requiere para la internalización eficiente de a-Gal A mediante las células objetivo. Las cadenas de carbohidrato enlazadas a N de a-Gal A se analizaron mediante HPLC de intercambio iónico (Glyco-Sep C) y etiquetado del extremo no reductor con la 2-amino benzamida de compuesto fluorescente (AB). Los resultados de los análisis de AB-glicanos de tres preparaciones separadas de a-Gal A se resumen en la Tabla 6. Las tres preparaciones tuvieron un número Z mayor de 170. Además, más de 67% de los glicanos se sialilaron , más de 16% de los glicanos se fosforilaron y menos de 1 6% fue neutral. Estos resultados se compararon muy favorablemente con los resultados reportados en la técnica anterior. Por ejemplo, Desnick eí al. , (Patente de E. U. No. 5, 356, 804) reportó que más del 60% de los glicanos fue neutral , sialilándose solamente el 11%. Tabla 6 Resultados de los Análisis de AB-glicanos de GA-GAL Tratamiento Número % % % Di- % Tri % Z Neutral Mono- Tetra Ninguno 170.04 16.83 22.8 39.45 15.34 5.58 Ninguno 177.71 14.22 20.63 44.62 14.2 6.31 Ninguno 171.68 15.81 20.73 43.2 14.33 5.39 Media (N = = 3) 173.14 15.62 21.39 42.42 14.62 5.76 Neuramin idas 24.36 85.25 5J4 9.61 ND ND Fosfatasa Alk. 150.93 23.38 24.47 34.28 13.58 4.29 Por ciento de Preparaciones Desnick eí Total: GA- al., GAL de la Patente de presente E.U. invención 5,356,804 Total P-glicanos 16.62 24.1 Total Sialilados 67.57 11 Total Neutral 15.62 62.9 (hih-mannosa e híbrido) Las caracterizaciones detalladas adicionales de las preparaciones purificadas de GA-GAL se proporcionan en la Tabla 7 Tabla 7 Volumen Purificado de GA-GAL 2.4 Proporción Creciente de a-Gal A Cargada Mediante Fraccionamiento de Especies de a-Gal A Como se discutió arriba, el fraccionamiento de glicoformas de a-Gal A puede ocurrir en diversas etapas en el proceso de purificación descrito en la presente. En el presente ejemplo, se fraccionaron glicoformas de a-Gal A por tamaño y por carga . También es posible fraccionar a-Gal A mediante una combinación de estas u otras técnicas cromatográficas, según se describe arriba . Para el fraccionamiento por tamaño de glicoformas a-Gal A, se llevó a cabo una cromatografía por exclusión de tamaño en una columna Superdex® 200 (Pharmacia , 1 .6 cm por 94. 1 cm) equilibrada en solución salina regulada con fosfato a pH 6. Se cargó a-Gal A (2.6 mg en 1 mL) en la columna y ia columna se levigó a 0.35 mL/min . Las fracciones se recolectaron a través del perfil de levigación y las fracciones que comprendían el pico amplio de levigación de la a-Gal A se analizaron por SDS-PAGE, después se visualizaron con teñido de plata . Las fracciones en el borde sobresaliente del pico conten ían a-Gal A del mayor peso molecular y a medida que las fracciones continuaban a través del pico, el aparente peso molecular de la a-Gal A disminuyó gradualmente. Las fracciones de a-Gal A se seleccionaron y depositaron entonces para proporcionar una preparación de a-Gal A de los rangos de peso molecular deseado. Para el fraccionamiento de glicoformas de a-Gal A por carga , la a-Gal A se fraccionó mediante cromatografía de Q-Sepharose®. La columna de Q Sepharose® (1 .5 cm por 9.4 cm) se equilibró en 20 mM de fosfato de sodio, pH 6.0, que contiene 30 mM de NaCI y la velocidad de flujo se mantuvo a 4 mL/min . Se cargó a-Gal A (1 30 mg en 1 66 mL) en la columna , se enjuagó con regulador de equilibrio, después se levigó con 20 mM de fosfato de sodio, pH 6.0, conteniendo 130 mM de NaCl. Para un fraccionamiento más extenso, puede utilizarse una levigación gradiente (por ejemplo, 10 volúmenes de columna) desde el regulador de equilibro hasta el regulador de levigación. Las fracciones se recolectaron a través del perfil de levigación y las fracciones que comprenden el pico de levigación de a-Gal A se ana liza ron mediante SDS-PAGE, después se visualizaron mediante teñido plata Las especies de peso molecular inferior se observaron en el gel levigado en el enjuague y en el borde sobresaliente del pico, las glicoformas de mayor peso molecular se levigaron hacia el extremo del pico. Las especies de peso molecular inferior corresponden a glicoformas cargadas de manera menos negativa de a-Gal A, las cuales se unen de manera menos firme a la columna de Q-Sepharose® cargada de manera positiva (comprendida de una resina substituida con amina cuaternaria). Las especies de a-Gal A de mayor carga negativa se levigaron posteriormente en el perfil del levigación y tienen un mayor peso molecular, según se analizó por SDS-PAGE. El fraccionamiento por carga se confirmó mediante enfoque isoeléctrico de las fracciones levigadas o de los depósitos seleccionados. Por lo tanto , tanto el fraccionamiento por tamaño como el fraccionamiento por carga permitieron la selección de glicoformas altamente cargadas de a-Gal A. 2.5 Internalización de a-Gal A mediada por Mannosa o Mannosa-6-Fosfato (M6P) Para que la a-Gal A producida por células establemente transfectadas sea un agente terapéutico eficaz para las deficiencias de a-Gal A, la enzima debe internalizarse por las células afectadas. La a-Gal A es mínimamente activa a niveles fisiológicos de pH , por ejemplo, en la sangre o fluidos intersticiales. La a-Gal A metaboliza los substratos lípidos acumulados de manera óptima solo cuando se internalizan en el ambiente acídico del lisosoma . Esta internalización es mediada por la unión de a-Gal A a los receptores M6P , los cuales se expresan sobre la superficie celular y se suministran la enzima al lisosoma a través de la trayectoria endocítica . El receptor de M6P se expresa de manera ubíquita ; la mayoría de las células somáticas expresan M6P hasta cierto grado. El receptor de mannosa , e¡ cual es específico para los residuos de mañosa expuestos sobre las glicoproteínas, es menos prevalescente. Los receptores de mannosa se encuentran generalmente solo en células macrófagas o similares a macrófagas y proporcionan un medio adicional de entrada de a-Gal A en estos tipos de células. Con objeto de demostrar la internalización mediada por M6P de la a-Gal A, los fibroblastos dérmicos de un paciente con enfermedad de Fabry (Repositor Celular Mutante Genético Humano de N IGMS) se cultivaron durante la noche en presencia de concentraciones crecientes de a-Gal A purificada de la invención. Algunas de las muestras contenían 5 mM de M6P soluble, el cual inhibe de manera competitiva la unión e internalización por el receptor de M6P. Otras muestras contuvieron 30 mg/mL de mannan, el cual inhibe la unión e internalización por el receptor de mannosa. Después de la incubación, las células se enjuagaron y recolectaron mediante raspadura en regulador de lisis (1 0 mM de Tris, pH 7.2, 100 mM de NaCI, 5 mM de EDTA, 2 mM de Pefabloc™ (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, 1N) y 1 % NP-40). Las muestras que experimentaron lisi se ensayaron entonces respecto a la concentración de proteína y actividad de a-Gal A. Los resultados se expresaron como unidades de actividad de a-Gal A/mg de proteína celular. Las células de Fabry internalizaron a-Gal A en u na manera dependiente de la dosis. Esta internalización se in h ibió por M6P , pero no existió inhibición con mannan . Por consiguiente, la internalización de a-Gal A en fibroblastos de Fabry se medió por el receptor de M6P, pero no por el receptor de mannosa. La a-Gal A también se internaliza in vitro mediante células objetivo importantes de células endoteliales para el tratamiento de la enfermedad de fabry. Las células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs) se cultivaron durante la noche con 7500 unidades de a-Gal A; algunas de las cavidades conten ían M6P. Después del periodo de incubación , las células se recolectaron y ensayaron respecto a a-Gal A como se describió arriba . Las células incubadas con a-Gal A tuvieron niveles de enzima de casi 1 0 veces aquellos de células de control (sin incubación con a-Gal A). M6P inhibió la acumulación intracelular de a-Gal A, sugiriendo que la internalización de a-Gal A por HUVECs se media por el receptor de M6P. Por lo tanto, la a-Gal A humana de la invención se internaliza por células clínicamente relevantes. Se conocen unas cuantas líneas celulares humanas cultivadas que expresan receptor de mañosa. Sin embargo, una línea celular sim ilar a macrófago de ratón (J774. E) que contiene receptores de mannosa pero pocos sí pueden utilizarse receptores de M6P para determinar si la a-Gal A de la invención se internaliza a través del receptor de mannosa. Diment eí al. , J. Leukocyte Biol. 42: 485-490 (1 987). Las células J774.E se cultivaron durante la noche en presencia de 1 0 ,000 unidades/mL de a-Gal A. Las muestras seleccionadas también contuvieron 2 mM de M6P y otras contuvieron 100 mg/mL de mannan. Las células se enjuagaron y recolectaron como se describió arriba y se determinó la proteína tota l y la actividad de a-Gal A de cada muestra . M6P no inhibe la toma de a-Gal A por estas células, mientras que el mannan disminuye los n iveles acumulados de a-Gal A en 75% . Por lo tanto , la a-Gal A de la invención puede internalizarse por el receptor de mannosa en tipos celulares que expresan este receptor de superficie celular en particular. Ejemplo 3 Formulación Farmacéutica Preparación de Soluc iones y Formu laciones Regu ladoras El Volumen Purificado de a-Gal A se diluye a una 10 concentración final con un diluyente de a-Gal A. El base al volumen purificado por formularse, la concentración de a-Gal A (mg/mL) y la concentración deseada de a-Gal A en la formulación final, se determina el volumen de diluyente de a-Gal A requerido. Se prepara un diluyente de a- Gal A dentro de 24 horas de uso mediante cantidades de mezcla ! apropiadas de WFI. cloruro de sodio y monobásico de fosfato de sodio y se ajusta el pH a 6.0 con solución de hidróxido de sodio. La composición de Diluyente de a-Gal A se enlista en la Tabla 8. Tabla 8 Composición de Diluyente de a-Gal A (por Litro) 0 Componente Número de Parte Cantidad Cloruro de sodio (USP) 1 00-1 916 8.8 g Hidróxido de sodio, 5N 200-1 903 qs para ajustar pH a 6.0 Fosfato de sodio, 1 00-1 91 3 3.5 g monobásico (USP) 5 Agua para inyección 1 00-2301 qs agrega 1 .0 L (USP) Un litro o volúmenes más pequeños de Diluyente de a-Gal A se filtran mediante filtración a! vacío mediante el dúo de filtros de nylon de 0.2 mm estériles (Nalge Nunc International, Rochester, NY). Los volúmenes mayores se filtran mediante presión positiva que utiliza una bomba peristáltica y 0.2 mm de filtros de cápsula Supor® (Pall , Port Washington , NY). Todos los filtros se sujetan a examinación de integridad del punto de burbuja de post-filtración . Las etapas de mezcla y filtración se llevan a cabo en una cubierta de flujo laminar certificada Clase 1 00. El diluyente de a-Gal A se agrega al volumen purificado de a-Gal A en un recipiente de mezcla para dar una solución final de 1 mg/ml. Después, se agrega el volumen apropiado de polisorbato 20 (Tweem 20, Spectrum) para alcanzar una concentración final de 0.02%. Ejemplo 4 a-Gal A Desgalactosilada Desialilada Para explorar el efecto de la glicosilación sobre la biodistribución de a-Gal A, una preparación purificada de a-Gal A se desglicosiló de manera secuencial y cada forma se inyecta en ratones. Los órganos de los ratones se recolectaron a cuatro horas después de la inyección y se llevó a cabo una inmunoquímica en los tejidos para visualizar los posibles cambios en ia biodistribución de la proteína. La a-Gal A se trató primero con neuraminidasa (sialidasa) para retirar los residuos de ácido siálico, dejando expuestos residuos de galactosa . Una porción de esta sialidasa tratada reaccionó posteriormente con ß-galactosidasa para retirar los residuos de galactosa ; esto dejo expuestos residuos de N-acetilglucosamina (GIcNAC). Los GIcNACs se retiraron entonces mediante N-acetilglucosaminidasa , dejando los grupos de mannosa de núcleo en la proteína. La a-Gal A sin tratar (control) o una de las formas tratadas de la proteína se inyectaron a través de ¡a vena alta en ratones. Cuatro horas después de las inyecciones, se recolectaron, preservaron e inmunotiñeron el h ígado, bazo, corazón , riñon y pulmones de los ratones, para la detección de a-Gal A. Cuando se compararon los animales de control que recibieron la proteína sin tratar, los ratones que recibieron la enzima tratada con sialidasa (residuos de galactosa expuestos) tuvieron más a-Gal A localizada en el hígado y correspondientemente menos de la enzima en otros órganos examinados. De manera adicional , el patrón de teñido en el hígado fue bastante diferente. En animales de control, la a-Gal A se localizó preferentemente en células Kupffer y células endoteliales con solo un teñido hepatocito moderado. En los animales que reciben la a-Gal A tratada con sialidasa, la enzima se localizó solamente en los hepatocitos, consistentes con la biodistribución conocida del receptor de asialoglicoproteína . Este efecto de desglicosilación en la biodistribución se invirtió cuando los residuos de galactosa se retiraron por ß-galactosidasa. El patrón de teñido observado en el h ígado de los ratones que recibieron esta proteína sin elementos de galactosa , fue similar al de los animales de control; la mayoría del teñido fue en células Kupffer y células endoteliales, con mínimo teñido hepatocito. El tratamiento adícional de la a-Gal A con N-acetilglucosaminidasa no alteró el patrón de teñido del observado para la proteína tratada con ß-galactosidasa ; es decir, el retiro de los residuos de N-acetilglucosamina pareció tener poco efecto en la biodistribución de a-Gal A. Ejemplo 5 Corrección de Fibroblastos de Fabry Mediante Fibroblastos Humanos que Expresan a-Gal A Para la terapia genética, un implante de células autólogas que produce a-Gal A debe producir la enzima en una forma adecuadamente modificada para "corregir" la deficiencia de a-Gal A en células objetivo. Para determinar el efecto de la producción de a-Gal A mediante fibroblastos humanos transfectados en células Fabry, los fibroblastos recolectados de pacientes con enfermedad de Fabry (Repositor Celular Mutante Genético Humano de NIGMA) se co-cultivaron con una cepa celular de producción de a-Gal A (BRS-1 1 ) en Transwells® (Costar, Cambridge, MA). Las céluias de fabry se cultivaron en discos de cultivo de tejido de 1 2 cavidades, algunos de los cuales contienen inserciones (Transwells®, 0.4 mm de tamaño de poro) que tienen una superficie sobre la cual pueden desarrollarse células. La matriz de crecimiento de la inserción es porosa y permite que las macromoléculas pasen del lugar superior al inferior. Un conjunto de inserciones contuvieron fibroblastos de piel anterior humana (HF) normal, los cuales segregan niveles mínimos de a-Gal A, mientras que otro conjunto contenía la cepa de fibroblastos humanos establemente transfectados, BRS-1 1 , los cuales segregan grandes cantidades de a-Gal A. En las cavidades así cultivadas con células de producción de a-Gal A, la a-Gal A puede entrar al medio bañando las células de Fabry e internalizándose potencialmente por las células fabry. Los datos en la Tabla 9 muestran que las células fabry internalizan la a-Gal A segregada. Los niveles intracelulares de a-Gal A se monitorearon por 3 días. Aquellas células cultivadas sola (sin inserción) o en presencia de fibroblastos de piel anterior nc transfectados (inserción de HF) tuvieron niveles intracelulares muy bajos de actividad de la a-Gal A. Las células de Fabry cultivadas con las células de producción de a-Gal A (inserción BRS-1 1 ), sin embargo, exhibieron niveles de enzima 10 similares a aquellos de células normales al final del Día 2 (los fibroblastos normales tienen 25-80 unidades de a-Gal A/mg de proteína). El que la correción es atribuíble a la a-Gal A tomada a través del receptor de M6P se desmuestra por la inhibición con M6P (inserción de BRS-1 1 + M6P). Tabla 9 15 Corrección de Fibroblastos de Fabry Mediante Fibroblastos H umanos que Expresan Actividad de a-Gal A (un idades/mg de proteína total) Tiempo Sin inserción Inserción de Inserción de Inserción de HF BRS-1 1 BRS-1 1 + • M6P 20 Día 1 2 + 1 2 + 1 1 3 + 1 4 + 1 Día 2 2 + 1 2 + 1 41 + 1 1 6 + 2 Día 3 2 + 1 5 + 1 85 + 1 9 + 1 La descripción anterior se ha presentado solamente con 25 propósito de ilustración y no se intenta limitar la invención a la forma a~^-.^. ^'x r¿^?s^m^'r^ i »4?^- precisa expuesta, sino por las reivindicaciones anexas a la misma . En la especificación y las reivindicaciones anexas, las forma singulares incluyen referencias plurales, a menos que el contexto lo dicte claramente de otro modo. Todas las patentes y pu blicaciones citadas en esta especificación se incorporan para referencia .

LISTADO DE SECUENCIAS <110 > Transkaryotis kerapies , Inc . <120> Preparaciones Médicas para el Tratamiento de Deficiencia de Alfa-Galactosidasa A <130> 18082-001 PCT <1 0 > Aún no asignado :141> 2000- 03 - 08 <150> 09/266 , 014 <1S1> 1999-03- 11 <160> 24 <170> atencia Ver. 2.0 <210> 1 <211> 210 <212> ADN <213 > Secuencia Artificial <220> <223 > Descripción de la Secuencia Artificial: Sonda de biblioteca de fibroblasto humano; exón 7; que incluye cargas de inicio de amplificación <400> 1 ctgggetgta gcta gataa aacggcagga gateggtgga cctcgctctt SO ataceaecgc ag tgcttcc cegggtaaag gagcggeecg taatcetgcc 100 pgcctcatca cacagctcct ccctgcgaaa agg*agctag ggtcccaega iso aeggactcca aggteaagaa gtcaeataaa ecccacaggc «cegfctttge 200 ttcsgctaga 210 <310> 2 <211:> 268 <212> ADN < 213 > Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: extremo 5' del clon de cADN que incluye las cargas de inicio de amplificación <400> 2 atfcggtccgc ccctgaggtc aatcttaaaa gcccaggtta cccgcggaaa 50 cttacgctgt ceggtcaccg tgacaatgca gctgaggaac ccagaaccac 100 atctgggctg cgcgcttgcg cttcgcttcc cggtscctcgt ttectgggac 150 atceccgggg ccagagcacc ggacaatgga ttggcaagga cgcctaccat 200 gggctggctg cactgggage gctteacgcg caaccttgac cgccaggaag 250 agccagattc etgcatca 26B <210> 3 <211> 1343 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 ccgcgggaaa. ettaegcegc ccggtcaccg tgacaacgca gcegaggaac 50 ccsgaaccac acctgg ctg cgegctegcg cctcgcttcc eggcccccgt 100 cccctgggac atccctgggg ctagagcacc ggacaacgga CCggcaagga 150 cgcctacoat gggctggctg cactgggagc gctteaegeg caaccttgac 200 tgccaggaag agccagattc ctgcatcagt gagaagcCct tcaeggagat 250 ggcagagctc atggtcecag aaggctggaa ggatgcagge cacgageacc 300 Cctgcaccga tgastgttgg aeggctccca aaagagattc agaaggcaga 350 ctecaggcag accctcagcg ctttccccat gggaeecgcc agctagceaa 400 ttatgttcac agcaaaggac egaagctagg gacttatgca gaegetggaa 450 acaaaaceeg cgcaggertc ccegggagte ttggatacta cgacaeegae 500 gcccagacct etgeegaceg gggagtagat ?fcgctaaaat ctgatggt g 550 ttactgtgac agtttggaaa «tttggcaga tggttataag cacatgtect €00 tggccctgaa taggactgga agaagcaccg egtactcstg tgagtggcct 650 cttcaeaegt ggccatttea aaagcccaat tatacagaaa tccgacagta 700 ctgcaaecac tggcgaaatt ttgctgacat tgatgaetcc cggaaaagta 750 taaagagcac cttggactgg acatctttta accaggagag aactgtcgat 800 gecgctggac caggygyt-tg gaatgaccca gaeaegttag tgattggcaa 850 ctttggcctc agceggaatc agcaagtaac tcagatggcc ccctgggcta 900 tc tggcbgc tcctttaetc atgtceaaeg acctccgac caecagccce 350 caagccaaag ctecccteca ggaeaaggac gtaattgcca ccaatcagga 1000 ceecctgggc aagcaagggc accagcttag acagggagac aaceeegaag 1050 tgcgggaacg acctctctca ggcttagcct gggcfcgtagc tatga.eaaac 1100 cggcaggaga ttggtggacc ccgctcttae accatcgcag ttgcetccet USO gggtaaagga gtggcctgta aeccegcctg cttcatcaca cagctcctcc 1200 ctgrgaaaag gaageeaggg ttceaegaae ggacttcaag geeaagaage 1220 cacataaacc ccacaggcac tgtttfcgctt cagceagaaa atacaatgca 1300 gacg catta aaagacttac ettaaaaaaa aaaaaaacec gag 1343 <210> 4 <211> 398 <212> PRT <2 3> Homo sapiens <400> 4 Leu Asp Aßn Gly Leu Ala Arg Thr Pro l?ir Met Gly Trp Leu His Trp 10 15 Glu Arg Phe Met Cys Aßn. Leu Asp Cyß Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cye 20 25 30 lie Sex Glu Lyß Leu Plie Mee Glu Mßt Ala Glu Le Mee Val Ser Glu 35 40 15 Gly Trp Lys A3p Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys lie Aep Aap Cys Trp 50 55 60 Met Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala As Pro Gln 65 70 75 80 Arg Phe Pro H s Gly lie Arg Gln Leu Ala Aen Tyr Val ?is Ser Lys 85 90 95 Gly Leu Lys Leu Gly lie Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala 100 105 no Gly Phe Pro Gly Ser Phß Gly Tyx Tyv Asp lie Asp Ala Gln Thr Pbe 115 120 125 Ala Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lye Phe Aap Gly Cys Tyr Cys Asp 130 135 140 Ser Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu 145 150 155 160 Asn Arg Thr Gly Arg Ser Zle Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr 165 170 175 Mee Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu llß Arg Gl» Tyr Cys 180 185 190 Asa His Trp Arg Asn Phe Ala Aßp He Asp Aßp Ser Trp Lys Ser Ilß 195 200 205 Lya Ser lie Leu Asp Trp Thr Ser Phe Aan Gln Glu Arg lie Val Asp 210 215 220 Val Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val He ßly 22S 230 235 240 Asn Phe Gly Leu Ser Trp Asn Oln Gln Val Thr Gln Mee Ala Leu Trp 24S 250 255 Ala lie Met Ala Ala Pro Leu Phe Mee Ser Asn Asp Leu Arg His He 260 265 270 Ser Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gla Asp Lys Aep Val He Ala He 275 280 285 Asn Gln Asp Pro Leu Gly Lye Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp 290 295 300 Asn Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val 305 310 315 320 Ala Met He Aßn Arg Gln Glu He Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr He 325 330 335 Ala al Ala Ser Leu Gly Lys Gly al Ala Cyß Asn Pro Ala Cys Phß 340 345 350 He Thr Gln Leu Leu Pro val Lyß Axg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp 355 360 36S Thr Ser Arg Leu Arg Ser Kis He Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu 370 375 380 Gln Leu Glu Asn Thr Met G n Mat Ser Leu Lys Asp Leu Leu 385 390 395 <210> 5 <211> 1197 <212 ADN <213> Homo sapiens <400> 5 ctggacaatg gattggcaag gacgcctacc atgggctgge tgcactggga 50 gcgcttcatg tgcaaccttg actgccagga agagecagat tcctgcatca 100 gtgagaagce ctccatggag atggcagagc tcacggtctc ßgaaggcfcgg 150 aaggatgcag gttatgagta cctctgcate gatgacegtt ggatggctcc 200 eeaaagagat ecagaaggca gactccaggc agaccctcag cgcettcctc 250 atgggacecg ccagc agct aattatgttc acagcaaagg acegaagcta 300 gggattt tg cagatgeegg aaacaaaacc tgcgcaggce tccctgggag 350 etttgg tac tacgacaceg aegcccagac ccttgctgac tggggageag 400 atctgctaaa atttgatggt tgttactgtg acagtttgga aaatccggca 450 gatgg tata agcacatgtc cttggccceg aataggactg gcagaagcat 500 tgtgtactcc tgtgagtggc ctctttatat gtggeeette caaaagccca 550 ateaeacaga aatccgaeag tactgcaaec aceggcgaaa tteegctgae 600 attgatgatt cceggaaaag tataaagagt atcttggace ggacatcttt 650 taaccaggag agaattgttg atgttgctgg accagggggt tggaatgacc 700 cagacatgtt agtgattggc aactttggcc tcagctggaa tcagcaagta 750 actcagatgg ccctctgggc tatcatggct gctcctttat tcaegectaa 800 tgacctecga cacaecagcc ctcaagccaa agctctecct caggataagg 850 acgtaattgo catcaatcag gaccccctgg gcaageaagg gtaccagctt 900 agacagggag acaactttga agegtgggaa cgacctctct caggcttagc 950 ctgggctgta gctatgaeaa aecggeagga gaeeggtgga ccecgctcce 1000 aeaeeatcge agtegccccc cegggtaaag gagtggcctg taatccegcc 1050 tgcttcatca cac gcteet cccegtgaaa aggaagctag ggttctatga 1100 acggaeeeca aggttaagaa gtcacaeaaa tcccacaggc acegttttge 1150 eceagceaga aaacacaatg cagatgtcae taaaagacec actttaa 1197 <210> 6 <21l> 22 <2 2> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223 > Descripción de Secuencia Artificial: Carga de Inicio PCR <400> 6 ctgggctgta gccatgataa ac 22 <210> 7 <211> 21 <212> ADN <2 3> Secuencia Artificial <220> <223 > Descripción de Secuencia Artificial: Carga de Inicio PCR <400> 7 tceagccgaa gcaaaacagt g 21 <210» S <211> 19 212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Carga de Inicio PCR <400> 8 19 attggtccgc ccctgagge <210> 9 <2H> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220? <223 > Descripción de Secuencia Artificial: Carga de Inicio PCR < °°* 9 20 tgatgcagga atctggctct <210> 10 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223 > Descripción de Secuencia Artificial: Carga de Inicio PCR <400> 10 ttttggatce ctcgaggaca ttgaecaeeg actag 35 <210> 11 <211> 28 <212 ADN <213> Secuencia Artificial <220 <223> Descripción de Secuencia Artificial: Carga de Inicio PCR <400> 11 ttttggatce cgtgtcaagg acggtgac 2ß <210> 12 <211> 20 <212> ADN «213 > Secuencia Artificial <220> «223 > Descripción de Secuencia Artificial: Carga de Inicio PCR <400> 12 ccctggatcc acsatggcta 20 <210> 13 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220 > <2 3 > Descripción de Secuencia Artificial: Carga de Inicio PCR <400> 13 ttttgccggc actgcccect tgaa 2* <210> 14 <211> 24 «212> ADN «213 > Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Carga de Inicio PCR <400> 14 tctecagctg gacaatggat tggc 2* ¿210> 15 <211> 20 <212> ADN <213 > Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Carga de Inicio PCR <400> 15 teetgctagc tggegaaecc 20 <210> 16 <211> 30 <212> ADN <213 Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Carga de Inicio PCR <400> 16 ttttggaecc gcgtcccata gegeeeccaa 30 <210> 17 c211> 28 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Carga de Inicio PCR <400> 17 ttttggaccc gcagtcgtgg ccagtacc 28 <210 lß c211> 12 <212> ADN < 13 > Secuencia Artificial <220> <223 > Descripción de Secuencia Artificial: Inserción Oligo <400> 18 ctagecctag ga <210> 19 <2Í1> 22 <212> ADN <213 > Secuencia Artificial <220> <223 > Descripción de Secuencia Artificial: Carga de inicio PCR <400> 19 ctetgagcac agagcctcgc ct <210> 20 <211 30 <212> ADN <2l3 > Secuencia Artificial «220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Promotor de Colágeno Parcial «400=- 20 ttttggatcc ggtgagctgc gagaacagcc <210> 21 <2ll> 76 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Promotor de Colágeno Parcial <400> 21 gggcccccag ecccagcccC cccaeeggtg gaggecctct tggaggcacc 50 ctagggccag gaaacetttg cegtat 76 <210> 22 <211> 69 <212> ADN 213^ Secuencia Artificial <:223> Descripción de Secuencia Artificial: Promotor de Colágeno P Paarrcciiaall gatccgggct etattaette agcaccacgg ccgccgagac 50 cgcgtcegca ccgcgagca <210> 23 <211> 86 «212 > ADN <213 Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Promotor de Colágeno Parcial egccct ttt atacggcaaa agtttcctgg ccctagggtg cetccaaaag 50 ggcctccacc aatgggaggg ctggggoegg gggccc <210> 24 <211> 55 <212 ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Carga de Inicio PCR cgcggggígg acgcggt tc ggcggccgtg gtgctaaaat aataaagccc 50 ggatc

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Una composición que comprende una preparación de a-Gal A humana, purificada hasta al menos 99.5% de homogeneidad , según se mide por SDS-PAGE o HPLC de fase inversa , caracterizada porque dicha preparación comprende diversas glicoformas de a-Gal A y tiene una actividad específica de al menos 3.0 x 106 unidades/mg de proteína y en donde dicha preparación se encuentra substancialmente libre de lectinas. 2. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque se cargó al menos 35% de los oligosacáridos de dichas glicoformas de a-Gal A. 3. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque la carga de oligosacárido de dichas glicoformas de La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque-Gal A, según se midió por el número Z, es mayor de 150. 4. La composición según la reivindicación 1 , caracterizada porque se sialilaron al menos 60% de los glicanos totales de dichas glicoformas de a-Gal A. 5. La composición según la reivindicación 4, caracterizada porque dicha preparación tiene una vida útil en circulación. Prolongada. 6. Un método para producir una preparación purificada de a-Gal A, caracterizado porque comprende diversas glicoformas de a-glicosidasa A, comprendiendo dicho método las etapas de (a) unir dichas glicoformas de a-Gal A a una resina de intercambio catiónico a pH acídico en un regulador de equilibrio, (b) enjuagar dicha resina con dicho regulador de equilibrio para levigar el material no unido, y (c) levigar dichas glicoformas de a-Gal A mediante el uso de una solución de levigación seleccionada a partir del grupo que consiste en una solución de sal de 1 0-1 00 mM, una solución regulada de pH 4 y 5 y una combinación de las mismas, en donde dicha preparación de a-Gal A se purifica hasta al menos 99.5% de homogeneidad y en donde dicha preparación se encuentra substancialmente libre de lectinas. 7. El método según la reivindicación 6, caracterizado además porque comprende una etapa de purificación seleccionada a partir del grupo que consiste en cromatografía de cromatoenfoque, cromatografía de afinidad de quelato metálico y cromatografía de ¡nmunoafinidad. 8. Una preparación de a-Gal A caracterizada porque comprende diversas glicoformas de a-Gal A, purificada hasta al menos 99.5% de homogeneidad, producida por el método según la reivindicación 6. 9. Un método para producir una preparación de a-Gal A glicosilada que tiene una carga oligosacárida incrementada, caracterizado porque dicho método comprende las etapas de: (a) introducir un polinucléotido que codifica en su expresión transferasa ll l de GIcNac (GnT-l l l) en u na a-Gal A que produce células o que introduce una secuencia reguladora mediante recombinación homologa que regula la expresión de un gen endógeno de GnT-l l l, (b) cultivar dicha célula de producción de a-Gal A bajo condiciones de cultivo que resultan en la expresión de a- Gal A y Gnt-l l l ; y (c) aislar la a-Gal A, en donde dicha preparación de a-Gal A tiene carga incrementada de oligosacáridos en comparación con la a-Gal A producida a partir de una célula sin dicho polinucleótido. 1 0. El método según la reivindicación 9, caracterizado 10 porque se carga al menos 35% de los oligosacáridos de dicha preparación de a-Gal A. 1 1 . El método según la reivindicación 9, caracterizado porque dicha preparación de a-Gal A comprende múltiples glicoformas, comprendiendo dichas glicoformas al menos 20% de glicanos complejos 15 con 2-4 residuos de ácido siálico. 1 2. El método según la reivindicación 9, caracterizado porque la carga oligosacárida de dicha preparación de a-Gal A, según se mide por el número Z, es mayor de 1 50. 13. El método según la reivindicación 9, caracterizado 20 porque dicha preparación comprende múltiples glicoformas, siendo dichas glicoformas al menos fosforiladas en promedio entre 25-50%. 14. Una preparación de a-Gal A glicosilada caracterizada porque tiene una carga oligosacárida incrementada, producida por el método según cualquiera de las reivindicaciones 9-13. 25 1 5. Un método para producir una preparación de a-Gal A S jí¿ttm ?? . glicosilada con carga oligosacárida incrementada, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) introducir un polmucléotido que codifica en su expresión transferasa de sialilo en una a-Gal A que produce células o que introduce una secuencia reguladora mediante recombinación homologa que regula la expresión de una transferasa de sialilo endógena; (b) cultivar dicha célula de producción de a-Gal A bajo condiciones de cultivo que resultan en la expresión de a- Gal A y transferasa de sialilo; y (c) aislar la a-Gal A, en donde dicha preparación de a-Gal A tiene carga incrementada de oligosacáridos en comparación con la a-Gal A producida en una célula sin dicho polinucleótido. 16. El método según la reivindicación 15, caracterizado porque comprende además la etapa de: (d) seleccionar glicoformas de a-Gal A con tamaño incrementado o carga incrementada mediante fraccionamiento o purificación de las preparaciones de la etapa (c). 1 7. Una preparación de a-Gal A glicosilada con carga oligosacárida incrementada, producida mediante los métodos según las reivindicaciones 1 5 o 1 6. 18. Un método para producir una preparación de a-Gal A glicosilada con sialilación incrementada, caracterizado porque dicho método comprende la etapa de contactar una célula de producción de a-Gal A con un medio de cultivo que tiene una concentración de amoniaco por debajo de 1 0 mM. 19. El método según la reivindicación 18, caracterizado porque la etapa de contacto comprenden la perfusión continua o intermitente de dicha célula de producción de a-Gal A con medio de cultivo reciente para mantener la concentración de amoniaco por debajo de 1 0 mM. 20. Un método para producir una preparación de a-Gal A glicosilada que tiene fosforilación incrementada, caracterizado porque dicho método comprende las etapas de: (a) introducir un polinucléotido que codifica en su expresión transferasa de fosforilo en una a-Gal A que produce células o que introduce una secuencia reguladora mediante recombinación homologa que regula la expresión de una transferasa de fosforilo endógena; (b) cultivar dicha célula de producción de a-Gal A bajo condiciones de cultivo que resultan en la expresión de a- Gal A y transferasa de fosforilo; y (c) aislar la a-Gal A, en donde dicha preparación de a-Gal A tiene fosforilación incrementada en comparación con la a-Gal A producida en una célula sin dicho polinucleótido. 21 . Una preparación de a-Gal A glicosilada que tiene fosforilación incrementada, producida mediante el método según la reivindicación 20. 22. Un método para producir una preparación de a-Gal A glicosilada con un número reducido de residuos de galactosa terminal y ácido siálico en las cadenas oligosacáridas, caracterizado dicho método porque comprende las etapas de: (a) contactar a-Gal A con neuraminidasa (sialidasa) para retirar ios residuos de ácido siálico, dejando expuestos los residuos de galactosa terminales; y (b) contactar la a-Gal A desialilada de la etapa (a) con ß- galactosidasa para retirar los residuos de galactosa terminales, donde el producto de a-Gal A desgalactosilado, desialilado de la etapa (b) tiene un número reducido de residuos de galactosa o ácido siálico en las cadenas oligoscáridas en comparación con a-Gal A proveniente de a-Gal A sin contactar. 23. Un método para producir una a-Gal A glicosilada con un número reducido de residuos de galactosa terminales en las cadenas oligosacáridas, caracterizado dicho método porque comprende la etapa de contactar a-Gal A con ß-galactosidasa para retirar residuos de galactosa terminal, en donde el producto tiene un número reducido de residuos de galactosa terminales, en donde el producto tiene un número reducido de residuos de galactosa terminales en las cadenas oligosacáridas en comparación con a-Gal A de a-Gal A sin contactar. 24. Un preparación de a-Gal A desgalactosilada, caracterizada porque se produce según el método de la reivindicación 23. 25. El uso de una preparación de a-Gal A en la elaboración de un medicamento para la administración de una dosis semanal o dos veces por semana de entre 0.05 mg hasta 5.0 mg de dicha preparación de a-Gal A 26. El uso según la reivindicación 25, caracterizado porque 5 dicho medicamento es para su administración de dosis semanal o bimestral de aproximadamente 0.2 mg de dicha preparación de a-Gal A por kg de peso corporal de un sujeto. 27. El uso según las reivindicaciones 25 o 26, caracterizado porque dicha dosis se formula para administración intramuscular, oral, 10 rectal, subcutánea, intra-arterial, intraperitoneal, intracerebral, intranasal, 1 intratecal, transmucosal, transdérmica o a través de inhalación. 28. El uso de una preparación de a-Gal A en la elaboración de un medicamento para administración subcutánea de una dosis semanal o dos veces por semana de entre 0.01 mg hasta 10 mg de dicha 15 preparación de a-Gal A por kg de peso corporal de un sujeto. 29. El uso según las reivindicaciones 27 o 28, caracterizado porque dicha dosis se formula para su administración mediante el uso de un sistema de suministro seleccionado a partir del grupo que consiste en _ suministro por bombeo, suministro celular encapsulado, suministro 20 liposomal, inyección suministrada por aguja, inyección sin aguja, nebulizador, suministro en aerosol, electroporación y parche transdérmico. 30. El uso de una preparación de a-Gal A en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Fabry, en donde dicho medicamento es para la administración de una dosis semanal 25 o dos veces por semana de entre 0.01 mg hasta 1 0 mg de dicha ?SU&ja t i preparación de a-Gal A por kg de peso corporal de un sujeto. 31 . El uso según la reivindicación 30, caracterizado porque dicho medicamento se formula para administración subcutánea. 32. El uso de una preparación de a-Gal A en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una variante atípica de la enfermedad de Fabry, en donde dicho médicamente es para la administración de una dosis semanal o dos veces por semana de entre 0.05 mg hasta 5.0 mg de dicha preparación de a-Gal A por kg de peso corporal de un sujeto. 33. El uso según la reivindicación 22, caracterizado porque dicho paciente sufre de anormalidad cardiovascular. 34. El uso según la reivindicación 33, caracterizado porque dicha anormalidad cardiovascular es hipertrofia ventricular izquierda (LVH). RESU MEN La invención proporciona a-Gal A altamente purificada y varios métodos para purificarla; preparaciones de a-Gal A con carga alterada y métodos para elaborar esas preparaciones; preparaciones de a-Gal A que tienen una vida med ia de circulación extendida en un huésped mamífero, y métodos para elaborar las mismas; y métodos y dosis para administrar una preparación de a-Gal A a un sujeto.