PT2186902E

PT2186902E - Preparações médicas para o tratamento de deficiência em -galactosidase a

Info

Publication number: PT2186902E
Application number: PT10152432T
Authority: PT
Inventors: Richard Selden; Marianne Borowski; Carol M Kinoshita; Douglas A Treco; Melanie D Williams; Thomas J Schuetz; Peter Francis Daniel
Original assignee: Shire Human Genetic Therapies
Priority date: 1999-03-11
Filing date: 2000-03-09
Publication date: 2012-08-28
Also published as: ATE386808T1; CN101219213A; HK1245320A1; JP2017014279A; DE60038104D1; JP2002538183A; CN103585621A; DE60038104T2; ES2634317T3; HK1043386A1; EP2314699A1; CA3012663A1; JP6346236B2; CA2365923A1; KR100892334B1; JP2011037867A; PL210833B1; DK2186902T3; NO329689B1; PT2314699T

Description

ΡΕ2186902 1

DESCRIÇÃO

"PREPARAÇÕES MÉDICAS PARA O TRATAMENTO DE DEFICIÊNCIA EM a—GALACTOSIDASE A"

CAMPO DO INVENTO 0 presente invento está relacionado com métodos e composições para o tratamento de deficiência em a-galactosidase A.

FUNDAMENTO DO INVENTO A doença de Fabry é uma doença hereditária, associada a X, de armazenamento lisossómico, caracterizada por falência renal grave, angioqueratomas e anormalidades cardiovasculares, incluindo aumento ventricular e insuficiência da válvula mitral. A doença de Fabry também afecta o sistema nervoso periférico, causando episódios de dor intensa de queimadura nas extremidades. A doença de Fabry é causada por uma deficiência na enzima α-galactosidase A (α-Gal A) . α-Gal A é a glico-hidrolase lisossómica que cliva os grupos terminais α-galactosilo de vários glico-conjugados. A doença de Fabry resulta num bloqueio do catabolismo do glicosfingolipido neutro ceramida tri-hexósido (CTH) e na acumulação deste substrato da enzima dentro das células e na corrente sanguínea. 2 ΡΕ2186902

Devido ao padrão hereditário da doença associado a X, a maior parte dos doentes com doença de Fabry são do sexo masculino. Apesar de terem sido encontradas mulheres heterozigóticas gravemente afectadas, as mulheres heterozi-góticas são geralmente assintomáticas ou possuem sintomas relativamente ligeiros (como seja opacidade caracteristica da córnea). Uma variante atípica da doença de Fabry, apresentando actividade residual de α-Gal A e sintomas muito ligeiros ou aparentemente sem sintomas caracterís-ticos da doença de Fabry, está correlacionada com hipertrofia ventricular esquerda e doença cardíaca. Nakano et al., New Engl. J. Med. 333:288-293 (1995). Uma redução de a-Gal A pode ser a causa de tais anormalidades cardíacas. O cDNA e o gene codificador de α-Gal A humana foram isolados e sequenciados. α-Gal A é expressa como um polipéptido de 429 aminoácidos, dos quais os 31 aminoácidos do extremo N constituem o péptido sinal. A enzima humana foi expressa em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) (Desnick et al., Patente U.S. 5356804; Ioannou et al., J. Cell Biol. 119:1137 (1992)); e células de insecto (Calhoun et al., WO 90/11353).

No entanto, as preparações correntes de α-Gal A possuem uma eficácia limitada. Os métodos para a preparação de α-Gal A com uma pureza relativamente elevada dependem da utilização de cromatografia de afinidade, usando uma combinação de cromatografia de afinidade com lectinas 3 ΡΕ2186902 (concanavalina A (Con A) Sepharose®) e cromatografia de afinidade baseada na ligação de α-Gal A ao análogo de substrato Ν-6-amino-hexanoil-a-D-galactosilamina acoplado a uma matriz de Sepharose®. Ver, e.g., Bishop et al., J. Biol. Chem. 256: 1307-1316 (1981). A utilização de resinas de afinidade proteicas do tipo lectinas e resinas com análogos do substrato está tipicamente associada a uma lavagem continua do agente de afinidade a partir do suporte sólido (Marikar et al., Anal. Biochem. 201:306-310 (1992), resultando em contaminação do produto purificado com o agente de afinidade, livre em solução ou ligado à proteina eluida. Tais contaminantes tornam o produto inadequado para utilização em preparações farmacêuticas. Os análogos do substrato ligados e as lectinas podem igualmente ter efeitos negativos substanciais nas propriedades enzimáticas, funcionais e estruturais da proteina. Ainda, a α-Gal A produzida pelos métodos dos trabalhos anteriores é rapidamente eliminada pelo figado.

Assim, mantém-se a necessidade de um protocolo de purificação usando resinas de cromatografia convencional, que estão facilmente disponíveis em quantidade e qualidade adequada para uma utilização comercial em larga escala e que produza uma preparação de α-Gal A sem agente de afinidade. Ainda, mantém-se a necessidade na área de preparações de α-Gal A com maior semi-vida de circulação no sangue e maior penetração em tecidos específicos, exceptuando o figado. 4 ΡΕ2186902 WO98/11206 descreve a produção de α-Gal A humana em células transgénicas, que pode ser usada para tratar doentes que sofram de uma deficiência de α-Gal A. As células transgénicas podem ser directamente administradas a um doente ou a α-Gal A transgénica pode ser administrada como preparação farmacêutica.

SUMÁRIO DO INVENTO A invenção providencia uma composição farmacológica de α-Gal A da qual pelo menos 50% do total de glicanos da referida preparação de α-Gal A são glicanos de tipo complexo para uso no tratamento de uma deficiência de α-Gal A numa dose semanal ou quinzenal entre 0,05 mg to 5,0 mg de uma preparação de α-Gal A por kg de peso corporal de um indivíduo.

Outras características estão descritas nas reivindicações apensas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 é uma representação da sonda de 210 pb que foi usada para isolar um cDNA de α-Gal A a partir de uma biblioteca de cDNA de fibroblastos humanos (SEQ ID NO:l). A sequência é do exão 7 do gene de α-Gal A. A sonda foi isolada a partir de DNA genómico humano por reacção em cadeia com polimerase (PCR). As regiões sublinhadas na figura correspondem às sequências das sequências iniciadoras de amplificação. 5 ΡΕ2186902 A FIG. 2 é uma representação da sequência do fragmento de DNA que completa o extremo 5' do clone de cDNA de α-Gal A (SEQ ID N0:2). Este fragmento foi amplificado a partir de DNA genómico humano por PCR. As regiões sublinhadas correspondem às sequências das sequências iniciadoras de amplificação. As posições dos locais de restrição Ncol e SacII, que foram usadas para subclonagem como descrito no Exemplo 1, estão igualmente apresentadas.

A FIG. 3 é uma representação da sequência de cDNA de α-Gal A, incluindo a sequência que codifica o péptido sinal (SEQ ID NO:3).A A FIG. 4 é um mapa esquemático de pXAG-1 6, uma construção de expressão de α-Gal A que inclui o promotor, o exão 1 e o primeiro intrão de CMV (citomegalovirus), a sequência codificadora do péptido sinal e o primeiro intrão de hGH, o cDNA de α-Gal A (sem a sequência do péptido sinal de α-Gal A) e a UTS 3' de hGH. pcDNeo indica a posição do gene neo derivado do plasmídeo pcDNeo.

A FIG. 5 é um mapa esquemático de pXAG-2 8, uma construção de expressão de α-Gal A que inclui o promotor e o primeiro exão do colagénio Ia2, um intrão da β-actina, a sequência codificadora do péptido sinal e o primeiro intrão de hGH, o cDNA de α-Gal A (sem a sequência do péptido sinal de α-Gal A) e a UTS 3' de hGH. pcDNeo indica a posição do gene neo derivado do plasmideo pcDNeo.A 6 ΡΕ2186902 A FIG. 6 é uma representação da sequência de aminoácidos de α-Gal A humana (SEQ ID NO:4).

A FIG. 7 é uma representação da sequência de cDNA codificadora de α-Gal A humana (sem péptido sinal) (SEQ ID NO:5). A FIG. 8 é um cromatoqrama do passo de purificação de α-Gal A usando a resina Butyl Sepharose®. É apresentada a absorvância a 280 nm (linha a cheio) e a actividade de α-Gal A (linha a tracejado) de fracções seleccionadas. A FIG. 9 é um mapa esquemático de pGA213C. A FIG. 10 é uma representação esquemática da construção de transferência de DNA alvo, pGA213C, e recombinação homóloga com o locus endógeno de a-galacto-sidase A. pGA213C está descrito como sequências alvo alinhadas correspondendo às sequências no locus de a-galactosidase A no cromossoma X. As posições relativas do codão de iniciação da metionina, ATG, estão indicadas pelos números acima dos mapas lineares. A unidade de activação contendo dhfr murina, neo bacteriana e a sequência do promotor de CMV/intrão da aldolase está apresentada acima da posição (-221) na qual foi inserida através de clonagem de DNA. As sequências codificadoras de α-galactosidase A estão indicadas por caixas escuras. As sequências genómicas 7 ΡΕ2186902 não codificadoras de α-galactosidase A estão indicadas por caixas claras. As setas largas indicam a direcção da transcrição das cassetes de expressão dhfr e neo. O processamento do mRNA de GA-GAL após transferência bem sucedida e activação do gene está indicado pela linha segmentada abaixo do mapa do locus da α-galactosidase A activado (GA-GAL).

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Introdução São aqui descritas novas preparações de α-Gal A e métodos para a sua preparação, assim como métodos para tratamento dos doentes com doença de Fabry ou variantes atípicas da doença de Fabry usando aquelas preparações. Determinadas realizações representativas contempladas estão resumidas e descritas mais detalhadamente abaixo. 0 invento usa α-Gal A produzida em qualquer célula (uma célula produtora de α-Gal A) para o tratamento da doença de Fabry. Numa realização preferida, o invento usa α-Gal A humana utilizando técnicas de engenharia genética convencionais (baseado na introdução do gene ou cDNA de α-Gal A clonado numa célula hospedeira) ou activação do gene.

Proporcionamos preparações, e métodos para a preparação das mesmas, que contêm uma α-Gal A com um grau ΡΕ2186902 de pureza mais elevado do que o obtido em trabalhos anteriores. Usando estes métodos de purificação, composições das preparações de α-Gal A humana são preferencialmente purificadas até pelo menos 98% de homogeneidade, mais de preferência até pelo menos 99% de homogeneidade, e mais de preferência 99,5% de homogeneidade, conforme medido por SDS-PAGE ou HPLC de fase reversa. A actividade especifica das preparações de α-Gal A é, de preferência, pelo menos 2,0 x 106 unidades/mg de proteína, mais de preferência pelo menos 3,0 x 106 unidades/mg de proteína, e mais de preferência pelo menos 3,5 x 106unidades/mg de proteína.

Numa realização, a preparação de α-Gal A é purificada através da separação das várias glicoformas de α-Gal A de outros componentes numa resina de interacção hidrofóbica, mas não inclui um passo de cromatografia com lectinas. Numa realização preferida, o grupo funcional da resina de interacção hidrofóbica inclui um grupo butilo.

Numa realização alternativa, a preparação de a-Gal A é purificada ligando primeiro as várias flicoformas de α-Gal A a uma resina de permuta catiónica numa coluna na presença de tampão de equilíbrio com pH ácido. A coluna é então lavada com o tampão de equilíbrio para eluir o material não ligado e as várias glicoformas de α-Gal A são eluídas usando, como solução de eluição, um solução salina 10-100 mM, uma solução tamponada de pH 4-5, ou uma combinação das mesmas. Numa realização preferida, o tampão de equilíbrio tem um pH de aproximadamente 4,4. 9 ΡΕ2186902

Numa outra realização alternativa, a preparação de α-Gal A é purificada, através da separação das várias glicoformas de α-Gal A numa amostra dos outros componentes na amostra, usando um processo de purificação compreendendo pelo menos um passo cromatografia de cromatofocagem, cromatografia de afinidade com um quelato de metais ou cromatografia de imunoafinidade.

Ainda proporcionamos preparações de α-Gal A e métodos para a produção das preparações de α-Gal A com carga alterada. As preparações podem incluir diferentes glicoformas de α-Gal A. As alterações de carga são conseguidas aumentando o teor em ácido siálico das preparações de α-Gal A e/ou aumentando a fosforilação das preparações de α-Gal A. 0 teor em ácido siálico das preparações de a-Gal A é aumentado através de (i) isolamento das glicoformas de α-Gal A altamente carregadas e/ou de peso molecular mais elevado durante ou após o processo de purificação; (ii) adição de residuos de ácido siálico usando células geneticamente modificadas (por métodos convencionais de engenharia genética ou de activação de genes) para expressarem um gene ou cDNA de sialil-transferase; ou (iii) fermentação ou crescimento de células que expressam a enzima num ambiente de baixo teor de amónio. A fosforilação das preparações de α-Gal A é 10 ΡΕ2186902 aumentada através de (i) adição de resíduos de fosfato usando células geneticamente modificadas (por métodos convencionais de engenharia genética ou de activação de genes) para expressar um gene ou cDNA de fosforil-transferase; ou (ii) adição de inibidores de fosfatases às células cultivadas.

Usando os métodos referidos, foram obtidas preparações de α-Gal A humana glicosiladas, em que entre 35% e 85% dos oligossacáridos estão carregados. Numa realização preferida, pelo menos 35% dos oligossacáridos estão carregados. Numa realização mais preferida, pelo menos 50% dos oligossacáridos estão carregados.

Preparações alternativas preferidas de α-Gal A humana glicosilada possuem múltiplas glicoformas de a-Gal A, preferencialmente com pelo menos 20%, mais de preferência pelo menos 50% e, ainda mais de preferência, pelo menos 70% de glicanos complexos com 2-4 resíduos de ácido siálico. Numa realização alternativa preferida, as preparações de α-Gal A humana glicosilada com múltiplas glicoformas possuem uma carga de oligossacárido, conforme medido pelo número Z, superior a 100, de preferência superior a 150, e mais de preferência superior a 170. Numa outra realização alternativa preferida, as preparações de α-Gal A humana glicosilada com múltiplas glicoformas possuem pelo menos, em média, entre 16 e 50%, mais de preferência pelo menos 30%, das glicoformas fosforiladas. Numa outra realização alternativa, as preparações com 11 ΡΕ2186902 múltiplas glicoformas possuem entre 50 e 75%, de preferência 60%, dos glicanos totais sialilados.

Numa realização, uma preparação de α-Gal A glicosilada tendo uma maior carga de oligossacárido é produzida introduzindo primeiro um polinucleótido, que codifica a transferase III de GlcNAc (GnT-III), numa célula produtora de α-Gal A ou introduzindo uma sequência reguladora por recombinação homóloga, a qual regula a expressão de um gene de GnT-III endógeno. A célula produtora de α-Gal A é então cultivada em condições de cultura que resultam na expressão de α-Gal A e GnT-III. O passo final consiste no isolamento da preparação de a-Gal A com maior carga de oligossacáridos.

Numa realização alternativa, uma preparação de α-Gal A glicosilada tendo uma maior carga de oligossacárido é produzida introduzindo primeiro um polinucleótido codificador de uma sialil-transferase numa célula produtora de α-Gal A ou introduzindo uma sequência reguladora através de recombinação homóloga, a qual regula a expressão de um gene de sialil-transferase endógeno. A célula produtora de α-Gal A é então cultivada em condições de cultura que resultam na expressão de α-Gal A e da sialil-transferase. 0 passo final consiste no isolamento da preparação de α-Gal A com maior carga de oligossacáridos. As sialil-transferases preferidas incluem uma a2,3-sialil-transferase e uma a2,6-sialil-transferase. Numa realização preferida, este método inclui o passo adicional de selecção 12 ΡΕ2186902 de glicoformas de α-Gal A com maior tamanho ou maior carga, através de fraccionamento ou purificação da preparação.

Numa outra realização, uma preparação de α-Gal A glicosilada, com maior grau de sialilação, é obtida através do contacto de uma célula produtora de α-Gal A com um meio de cultura tendo uma concentração de amónio abaixo de 10 mM, mais de preferência abaixo de 2 mM. Numa realização preferida, o ambiente de amónio baixo é conseguido através da adição de sintetase de glutamina ao meio de cultura. Numa realização alternativa preferida, o ambiente com baixo teor de amónio é conseguido por perfusão continua ou intermitente da célula produtora de α-Gal A com meio de cultura fresco para manter a concentração de amónio abaixo de 10 mM, mais de preferência abaixo de 2 mM.

Ainda numa outra realização, uma preparação de α-Gal A glicosilada com maior fosforilação é obtida introduzindo primeiro um polinucleótido codificador de uma fosforil-transferase numa célula produtora de α-Gal A ou introduzindo uma sequência reguladora através de recombi-nação homóloga, a qual regula a expressão de um gene de fosforil-transferase endógeno. A célula produtora de a-Gal A é então cultivada em condições de cultura que resultam na expressão de α-Gal A e de fosforil-transferase. A preparação de α-Gal A com maior grau de fosforilação, comparativamente com α-Gal A produzida numa célula sem o polinucleótido, é então isolada. Numa realização preferida, as 13 ΡΕ2186902 preparações de α-Gal A produzidas pelos métodos referidos possuem múltiplas glicoformas com 16-50%, de preferência 25-50%, mais de preferência pelo menos 30%, de glicoformas fosforiladas. Numa realização preferida, este método inclui o passo adicional de selecção de glicoformas de α-Gal A com maior tamanho ou maior carga, através de fraccionamento ou purificação da preparação.

Ainda, numa outra realização, uma preparação de α-Gal A glicosilada com maior fosforilação é conseguida adicionando um inibidor de fosfatase, e.g., bromotetra-misole, às células cultivadas. Niveis baixos de fosfatase alcalina de plasma bovino podem estar presentes no soro fetal usado como aditivo de crescimento nas culturas celulares. Isto levanta a possibilidade de os epitopos Man-6-P expostos em α-Gal A secretada poderem ser um substrato da fosfatase alcalina sérica. Foi encontrado que bromotetramisole é um forte inibidor da fosfatase alcalina; Ki = 2,8 mM (Metaye et al., Biochem. Pharmacol. 15:4263-4268 (1988) e é conseguida inibição completa numa concentração de 0,1 mM (Borgers & Thone, Histochemistry 44:277-280 (1975)). Assim, numa realização, um inibidor de fosfatases, e.g., bromotetramisole, pode ser adicionado às células em cultura para maximizar a forma de elevada captura de α-Gal A, presente no meio de cultura, apresentando hidrólise dos grupos éster de Man-6-Ρ.

Ainda proporcionamos preparações de α-Gal A e métodos para a produção das mesmas, que possuem uma semi- 14 ΡΕ2186902 vida prolongada no sangue de um hospedeiro mamífero. A semi-vida no sangue e a captura celular é aumentada através de (i) aumento do teor de ácido siálico de α-Gal A (conseguido como atrás descrito); (ii) aumento da fosforilação de α-Gal A (conseguido como descrito atrás) ; (iii) PEGilação de α-Gal A; ou (iv) remoção sequenciada dos resíduos de ácido siálico e galactose terminais, ou remoção de resíduos de galactose terminais, nas cadeias de oligossacárido de α-Gal A.

Uma maior sialilação das preparações de α-Gal A aumenta a semi-vida no sangue de α-Gal A exógena. Ainda, uma maior sialilação de α-Gal A aumenta a sua captura por não hepatócitos relativamente à dos hepatócitos, tais como células endoteliais do fígado, células sinusoidais do fígado, células pulmonares, células renais, células neuro-nais, células endoteliais ou células cardíacas. A preparação de α-Gal A humana glicosilada com maior teor em ácido siálico, de preferência, inclui múltiplas glico-formas, com pelo menos 20% de glicanos complexos tendo 2-4 resíduos de ácido siálico. Uma preparação alternativa preferida de α-Gal A humana glicosilada possui múltiplas glicoformas, em que 50-75%, de preferência pelo menos 60%, dos glicanos totais estão sialilados. A fosforilação das preparações de α-Gal A também aumenta o nível de α-Gal A que entra nas células. A fosforilação ocorre dentro das células que expressam a α-Gal A. Uma preparação preferida de α-Gal A humana glicosilada, de 15 ΡΕ2186902 preferência, inclui múltiplas glicoformas com pelo menos, em média, 16-50%, de preferência 25-54%, mais de preferência pelo menos 30%, das glicoformas fosforiladas.

Numa realização alternativa, a semi-vida no sangue de uma preparação de α-Gal A é aumentada através da formação de um complexo de α-Gal A com polietilenoglicol. Numa realização preferida, a preparação de α-Gal A é complexada usando tresil-monometoxi-PEG (TMPEG) para formar uma α-Gal A PEGilada. A α-Gal A PEGilada é então purificada para proporcionar uma preparação de α-Gal A PEGilada isolada. A PEGilação de α-Gal A aumenta a semi-vida no sangue e a eficácia in vivo da proteina. A sialilação afecta a semi-vida no sangue e a biodistribuição das proteínas. As proteínas com pouco ou nenhum ácido siálico são facilmente internalizadas pelo receptor de asialoglicoproteínas (receptor de Ashwell) em hepatócitos através dos resíduos de galactose expostos na proteína. A semi-vida no sangue de α-Gal A terminada com galactose pode ser aumentada de forma sequenciada através de (1) remoção do ácido siálico pelo contacto de α-Gal A com neuraminidase (sialidase), deixando assim os grupos de galactose terminais expostos e (2) remoção dos resíduos de galactósido terminais através do contacto de α-Gal A desialilado com β-galactosidase. A preparação de α-Gal A resultante possui um número reduzido de ácido siálico terminal e/ou os resíduos de galactósido terminais nas cadeias de oligossacárido comparativamente com as prepa- 16 ΡΕ2186902 rações de α-Gal A que não contactaram sequencialmente com neuraminidase e β-galactosidase. Como alternativa, a semi-vida no sangue de α-Gal A terminada em galactose pode ser aumentada removendo apenas os resíduos de galactósido terminais através do contacto da α-Gal A desialilada com β-galactosidase. A preparação resultante de α-Gal A possui um número reduzido de resíduos de galactósido terminais nas cadeias de oligossacárido comparativamente com as preparações de α-Gal A que não contactaram com β-galactosidase. Numa realização preferida, após contacto sequenciado com neuraminidase e β-galactosidase, as preparações de α-Gal A resultantes são subsequentemente contactadas com β-hexosa-minidase, clivando assim o oligossacárido até ao núcleo de trimanose.

Ainda, os níveis de sialilação podem variar dependendo do tipo de célula usado. Assim, numa outra realização preferida, a sialilação de α-Gal A pode ser aumentada através da triagem de células de mamífero, e.g., células humanas, que possuam actividade de sialil-trans-ferase relativamente elevada e usando tais células como células produtoras de α-Gal A.

Proporcionamos também formulações de uma preparação de α-Gal A substancialmente sem proteínas que não sejam α-Gal A, tais como albumina, proteínas que não sejam α-Gal A produzidas pela célula hospedeira ou proteínas isoladas a partir de tecido ou fluido animal. Numa realização, a formulação pode ainda compreender um 17 ΡΕ2186902 excipiente. Excipientes preferidos incluem manitol, sorbitol, glicerol, aminoácidos, lípidos, EDTA, EGTA, cloreto de sódio, polietilenoglicol, polivinilpirrolidona, dextrano ou combinações de qualquer um destes excipientes. Numa outra realização, a formulação ainda compreende um detergente não iónico. Detergentes não iónicos preferidos incluem Polysorbate 20, Polysorbate 80, Triton X-100, Triton X-114, Nonidet P-40, octil a-glucósido, octil b-glucósido, Brij 35, Pluronic e Tween 20. Numa realização preferida, o detergente não iónico compreende Polysorbate 20 ou Polysorbate 80. Uma formulação preferida ainda compreende soro fisiológico tamponado com fosfatos, de preferência a pH 6. A presente invenção proporciona também métodos para administração de uma preparação de α-Gal A a um indivíduo. Numa realização preferida, a preparação de a-Gal A é uma preparação de α-Gal A com carga alterada, e.g., carga de oligossacáridos aumentada, e/ou semi-vida no sangue prolongada, como aqui descrito. A dose de administração é, de preferência, 0,05-5,0 mg, mais de preferência 0,1-0,3 mg, da preparação de α-Gal A por kg de peso de corpo, semanalmente ou bissemanalmente. Nestes métodos, a dose pode ser administrada por via intramuscular, oral, rectal, subcutânea, intra-arterial, intraperitoneal, intracerebral, intranasal, intradérmica, intratecal, transmucosal, transdérmica ou através de inalação. Numa realização, o método para a administração da preparação de α-Gal A a um indivíduo compreende a 18 ΡΕ2186902 administração subcutânea de uma dose variando entre 0,01 e 10,0 mg, de preferência 0,1-5,0 mg, da preparação de a-Gal A por kg de peso do corpo bissemanalmente ou semanalmente. A preparação de α-Gal A também pode ser administrada por via intravenosa, e.g., numa injecção de bólus intravenosa, numa injecção intravenosa lenta, ou através de injecção intravenosa continua. Em qualquer um dos métodos atrás referidos, a preparação de α-Gal A pode ser administrada usando um sistema de distribuição como seja uma bomba de distribuição, distribuição por células encapsuladas, distribuição lipossomal, injecção com agulha, injecção sem agulha, nebulizador, aerossolizador, electroporação e penso transdérmico. Qualquer uma das preparações de α-Gal A descrita atrás pode ser administrada por estes métodos.

Um indivíduo que seja suspeito de ter ou que tenha doença de Fabry pode ser tratado através da administração da preparação de α-Gal A descrita atrás, usando os métodos de administração e doses descritos. O presente invento contempla o tratamento de indivíduos com doença de Fabry em geral ("doentes Fabry") assim como variantes atípicas da doença de Fabry, e.g., populações específicas de doentes de Fabry com predominância de anormalidades cardiovasculares, aqui definidos como doentes Fabry com dilatação ventricular, e.g., hipertrofia ventricular esquerda (LVH) e/ou insuficiência da válvula mitral, ou doentes Fabry com predominância de envolvimento renal. 19 ΡΕ2186902

α-Cal A α-Gal A é uma glicoproteína homodimérica que hidrolisa os grupos α-galactosilo terminais dos glico-lípidos e glicoproteinas.

Os termos "α-Gal A" madura e "GA-GAL" e "SEQ ID NO: 5" (ver Fig. 7) referem-se a α-Gal A sem um péptido sinal (para α-Gal A com o péptido sinal, ver α-Gal A Fig. 3 e SEQ ID NO.3). 0 termo "preparação de α-Gal A", como definido aqui, é usado indiferentemente com o termo "preparação de α-Gal A glicosilada" e compreende várias glicoformas de α-Gal A glicosiladas.

Um "péptido sinal" é uma sequência peptidica que dirige um polipéptido acabado de sintetizar, ao qual está ligado o péptido sinal, para o reticulo endoplasmático (RE) para posterior processamento pós-tradução e distribuição.

Um "péptido sinal heterólogo", como aqui usado no contexto de α-Gal A, significa um péptido sinal que não é o péptido sinal de α-Gal A humano, tipicamente o péptido sinal de algumas proteínas de mamífero que não de α-Gal A.

Os especialistas na matéria reconhecerão que a sequência de DNA de α-Gal A humana (cDNA [SEQ ID NO: 5] ou DNA genómico) ou sequências que diferem do DNA de α-Gal A humano devido a alterações silenciosas de codões ou a alterações de codões que produzem substituições de 20 ΡΕ2186902 aminoácidos conservadas, podem ser usadas para modificar geneticamente as células humanas em cultura, de forma a expressarem e secretarem a enzima em grandes quantidades. Determinadas mutações na sequência de α-Gal A podem codificar polipéptidos que mantém ou apresentam melhor actividade enzimática do que α-Gal A. Por exemplo, espera-se que as substituições conservadas de aminoácidos tenham pouco ou nenhum efeito na actividade biológica, particularmente se representarem menos de 10% do número total de resíduos na proteína. As substituições conservadas, tipicamente, incluem substituições dentro dos seguintes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutâmico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; e fenilalanina, tiro-sina. Ver, por exemplo, Patente US 5356804.

Doença de Fabry A doença de Fabry é uma alteração genética causada por actividade deficiente da enzima α-Gal A. Por "deficiência de α-Gal A", pretende-se significar qualquer deficiência na quantidade ou actividade desta enzima num doente, resultando em acumulações anormais de glicolípidos neutros (e.g., globotriaosilceramida) em histiócitos nas paredes dos vasos sanguíneos, com angioqueratomas nas coxas, nádegas e genitais, hipo-hidrose, parestesia das extremidades, córnea verticilata e cataratas subcapsulares posteriores tipo radial. Os depósitos deste material podem resultar em dor, doença renal e cardiovascular grave e 21 ΡΕ2186902 acidente cardiovascular. A acumulação de glicolipidos pode induzir sintomas graves, observados tipicamente em homens que sofrem de doença de Fabry. Como alternativa, a acumulação pode induzir sintomas relativamente suaves, conforme pode ser observado em mulheres heterozigóticas portadoras do gene defectivo. Os indivíduos afectados possuem uma esperança de vida grandemente encurtada; a morte geralmente resulta de complicações renais, cardíacas ou cerebrovasculares por volta dos 40 anos. Não existem tratamentos específicos para esta doença. A doença de Fabry, classificada como uma alteração de armazenamento dos lipossomas, afecta mais de 15000 pessoas a nível mundial. A doença de Fabry como aqui definida é uma síndrome clínica complexa, caracterizada pelo envolvimento de múltiplos órgãos e sistemas. Os doentes que manifestam a combinação de distrofia da córnea, lesões da pele (angioqueratoma), neuropatia dolorosa, doença vascular cerebral, cardiomiopatia e disfunção renal são classificados como apresentando o fenótipo "clássico". Existem, no entanto, doentes que manifestam alguns, mas não todos os aspectos do fenótipo clássico. Estes doentes são classificados como "variantes atípicas da doença de Fabry". Existem vários fenótipos variantes atípicos associados a deficiência de α-galactosidase A. Por exemplo, alguns doentes com deficiência de α-galactosidase A possuem uma variação da doença de Fabry com apenas envolvimento cardíaco, e.g., hipertrofia ventricular esquerda (LHV). Existe também um outro fenótipo variante em que os doentes 22 ΡΕ2186902 apresentam apenas envolvimento renal. Se bem que ambos os fenótipos variantes tenham sido definidos em homens hemizigóticos, as formas variantes da doença de Fabry foram igualmente descritas em mulheres heterozigóticas.

Os doentes com a variante cardiaca atípica, de um modo geral, apresentam doença sintomática numa fase tardia da vida. A idade média do diagnóstico dos doentes com o fenótipo cardiaco variante é de aproximadamente 52 anos comparativamente com aproximadamente 29 anos para o fenótipo clássico (Desnick, et al., In "The Metabolic and Molecular Bases of the Inherited Disease", 6th edition (1996). Scriver, et al., (eds=, McGraw-Hill (New York). 2741-2784; Meikle, et al., J. Am. Med. Assoe. 281: 249-254 (1999)) . Os doentes com este síndrome muitas vezes apresentam sintomas ligeiros de disfunção cardiaca como seja dispneia de esforço. Geralmente, a análise ecocar-diográfica revela que os doentes com o fenótipo cardíaco variante possuem hipertrofia ventricular esquerda (LVH) ou hipertrofia septal assimétrica. No entanto, os doentes podem também apresentar enfarte do miocárdio ou cardi-omiopatia (Scheidt, et al., New Engl. J. Med. 324:395-399 (1991); Nakao, et al., New Engl. J. Med. 333:288-293 (1995)). Estes doentes muitas vezes fazem biopsias do miocárdio e a patologia do síndrome variante é essencialmente semelhante ao da doença de Fabry clássica: infiltração miocárdica pelo glicolípido depositado. Os ensaios da enzima α-galactosidase nestes doentes revelam uma larga gama de níveis da enzima. Por exemplo, foi descrito que os 23 ΡΕ2186902 doentes com a variante cardíaca possuem até 30% dos níveis normais de actividade da enzima α-galactosidase e, assim, até agora não foram considerados como candidatos para a terapia de substituição com α-Gal A.

Os inventores, inesperadamente, descobriram agora que apesar dos doentes com a variante cardíaca atípica ou com a variante renal atípica poderem ter níveis de actividade da enzima α-galactosidase que são relativamente elevados, comparativamente com doentes com a doença de Fabry com o fenótipo clássico, estes doentes podem também beneficiar da terapia com a enzima α-galactosidase. Por exemplo, os doentes podem ter uma mutação que produz uma enzima α-Gal A cineticamente instável na célula e nestes doentes os níveis da enzima α-Gal A podem ser aumentados significativamente através da administração de preparações de α-Gal A do presente invento. Igualmente, alguns doentes com o fenótipo da variante cardíaca atípica foram descritos como tendo uma mutação pontual no aminoácido 215 da a-galactosidase A. Este aminoácido na proteína não mutada é uma asparagina que é glicosilada (Eng, et al., Am. J. Hum. Genet. 53: 1186-1197 (1993)). Assim, a terapia de substi tuição com a enzima α-Gal A usando preparações de a-galactosidase A adequadamente glicosilada do presente invento pode ser eficaz nestes doentes. Ainda, foram descritos doentes com a variante renal atípica cuja manifestação clínica da doença de Fabry é proteinúria ligeira. No entanto, a biopsia renal revela as inclusões glicolipídicas típicas da doença de Fabry e o ensaio da 24 ΡΕ2186902 enzima α-Gal A revela níveis de α-Gal A mais baixos que o normal. No entanto, devido ao tri-hexósido de ceramida depositado no rim poder ser detectado nas células tubulares renais presentes no sedimento da urina destes doentes, a administração de preparações de α-Gal A do presente invento pode reduzir estes níveis substancialmente. As enzimas lisossomais, tais como α-Gal A, são direccionadas para o compartimento lisossomal de uma célula através da sua interacção com o receptor de manose-6-fosfato (M6P), que se liga aos resíduos de M6P presentes nos grupos de oligossacárido das enzimas destinadas ao compartimento lisossomal. Kornfeld & Mellman, Ann. Ver. Cell Biol. 5: 483-525 (1989) . A interacção principal ocorre no Golgi, onde as enzimas ligadas aos receptores de M6P do Golgi são segregadas para transporte para os lisossomas. Pensa-se que ocorra um tipo secundário de interacção entre α-Gal A extracelular e os receptores de M6P na superfície celular. As enzimas que escapam ao sistema de direccionamento são secretadas pela célula através da via secretória constitutiva e são muitas vezes recapturadas pelos receptores de M6P na superfície celular, os quais reencaminham a a-galactosidase A para o lisossoma através da via endocítica. Substâncias extracelulares internalizadas pelas células são transportadas ao longo do citoplasma nas vesículas de endocitose, as quais se fundem com os lisossomas primários e esvaziam os seus conteúdos nos lisossomas. Neste processo, os receptores de M6P na superfície celular são igualmente incorporados nas vesículas de endocitose e transportados para os lisossomas. Em particular, as prepa- 25 ΡΕ2186902 rações de α-Gal A em que níveis elevados de sialilação e/ou fosforilação estão presentes, são preferidos para o tratamento de doentes com variantes atípicas da doença de Fabry. Tais preparações, por exemplo, minimizam a fracção da α-Gal A injectada que é removida pelos hepatócitos e permite níveis elevados de incorporação de α-Gal A pelas células que não sejam do fígado, tais como células renais, células vasculares, células tubulares, células glomeru-lares, miócitos cardíacos e células vasculares cardíacas.

Resíduos de M6P presentes em α-Gal A extra-celular podem ligar-se a receptores de M6P na superfície celular e ser transportados para o compartimento lisos-somal. Uma vez no compartimento lisossomal, α-Gal A pode desempenhar a sua função adequada. É este aspecto do tráfego de enzimas lisossomais que torna a terapia de substituição com a enzima α-galactosidase A um tratamento terapêutico possível para os doentes com doença de Fabry. Assim, mesmo que uma célula seja geneticamente deficiente na produção de α-Gal A, a célula pode incorporar α-Gal A se a α-Gal A estiver adequadamente glicosilada e a célula deficiente possuir receptores de M6P. Nos doentes com a doença de Fabry, as células do endotélio vascular do rim e coração apresentam anormalidades histopatológicas graves e contribuem para a patologia clínica da doença. Estas células, que são portadoras dos receptores de M6P, são um alvo terapêutico particular de α-Gal A. Proporcionamos uma preparação de α-Gal A em que M6P está presente nos oligossacáridos ligados em N. 26 ΡΕ2186902

O grau de modificação por sialilação dos oligossacáridos ligados em N de α-Gal A possui um efeito substancial na farmacocinética e biodistribuição de a-Gal A. Na ausência de sialilação adequada, α-Gal A é rapidamente eliminado da circulação devido à ligação pelos receptores de asialoglicoproteínas hepáticas (receptores de Ashwell), seguido de internalização e degradação pelos hepatócitos. Ashwell & Harford, Ann. Ver. Biochem. 51:531-554 (1982) . Isto decresce a quantidade de α-Gal A disponível na circulação para ligação aos receptores de M6P nas células, o que contribui para a patologia clinica da doença de Fabry, como sejam as células endoteliais vasculares do rim e coração. α-Gal A secretada por células humanas geneticamente modificadas possui propriedades de glicosilação que são adequadas para o tratamento da doença de Fabry, através da administração farmacêutica convencional da proteína secretada purificada ou por terapia génica, sem necessidade de mais modificação enzimática como foi referido ser necessário para a enzima lisossomal, glucocerebrosidase, em que a internalização da enzima glucocerebrosidade purificada por células clinicamente relevantes requer a modificação enzimática complexa da enzima após purificação a partir da placenta humana. Beutler, New Engl. J. Med. 325-1360 (1991).

Células adequadas para a produção de α-Gal A

Um indivíduo suspeito de ter uma deficiência de α-Gal A, como seja os doentes de Fabry, pode ser tratado 27 ΡΕ2186902 com α-Gal A humana purificada obtida a partir de células em cultura geneticamente modificadas, de preferência células humanas.

Quando as células são geneticamente modificadas para fins de tratamento da doença de Fabry, as células podem ser modificadas por métodos de engenharia genética convencionais ou através de activação de genes.

De acordo com métodos convencionais, uma molécula de DNA que contem um cDNA ou sequência de DNA genómico de α-Gal A pode ser inserida numa construção de expressão e ser transfectada para células primárias, secundárias ou imortalizadas, através de métodos convencionais incluindo, mas não estando limitados a transfecção mediada por lipossomas, polibreno ou DEAE-dextrano, electroporação, precipitação com fosfato de cálcio, microinjecção ou microprojécteis lançados a velocidade ("biolistica") (ver, e.g., pedido de patente co-pendente, USSN 08/334,797).

Como alternativa, pode-se usar um sistema que entrega a informação através de um vector virai. Os vírus conhecidos como sendo úteis à transferência de genes incluem adectovirus, vírus adeno-associados, herpesvírus, vírus da papeira, poliovírus, retrovírus, vírus Sindbis e vírus da vacina tais como virus pox dos canários.

Como alternativa, as células podem ser modificadas usando uma abordagem de activação de genes ("GA"), como descrito nas patentes dos Estados Unidos 5733761 e 28 ΡΕ2186902 5750376. A α-Gal A produzida por activação de genes é referida como GA-GAL.

Assim, o termo "geneticamente modificado", como aqui usado relativamente a células, pretende englobar células que expressam um produto de gene particular após introdução de uma molécula de DNA codificadora do produto de gene e/ou elementos reguladores que controlam a expressão de uma sequência codificadora do produto de gene. A molécula de DNA pode ser introduzida através de transferência do gene ou recombinação homóloga, i.e., introdução da molécula de DNA num local genómico particular. A recombinação homóloga pode ser usada para substituir o próprio gene defectivo (o gene α-Gal A defectivo ou uma porção do mesmo pode ser substituido nas células do próprio doente com doença de Fabry pelo gene completo ou uma porção do mesmo).

Como aqui usado, o termo "célula primária" inclui células presentes numa suspensão de células isoladas a partir de um tecido de vertebrado (antes de serem semeadas, i.e., aderentes a um substrato de cultura de tecidos como seja uma placa ou frasco), células presentes num explante derivado de tecido, ambas dos tipos anteriores de células semeadas pela primeira vez, e suspensões de células derivadas destas células semeadas. "Células secundárias" refere-se às células em todos os passos subsequentes de cultura. Ou seja, a 29 ΡΕ2186902 primeira vez que uma célula primária semeada é removida do substrato de cultura e novamente semeada (passada), é referida como uma célula secundária, tal como todas as células em passagens subsequentes.

Uma "estirpe celular" consiste em células secundárias que foram passadas uma ou mais vezes; apresentam um número finito de duplicações médias da população em cultura; apresentam as propriedades de inibição de contacto, crescimento dependente de ancoragem (excepto para as células propagadas em culturas em suspensão) e não estão imortalizadas.

Por "célula imortalizada" pretende-se significar uma célula derivada de uma linha celular estabelecida que apresenta uma vida aparentemente ilimitada em cultura.

Exemplos de células primárias ou secundárias incluem fibroblastos, células epiteliais incluindo células epiteliais mamárias e intestinais, células endoteliais, elementos figurados do sangue incluindo linfócitos e células da medula óssea, células da glia, hepatócitos, queratinócitos células do músculo, células neuronais ou os precursores deste tipo de células. Exemplos de linhas celulares humanas imortalizadas úteis nos presentes métodos incluem, mas não estão limitados a células do melanoma de Bowes (ATCC N° de Acesso CRL 9607), células de Daudi (ATCC N° de Acessos CCL213), células HeLa e derivados de células HeLa (ATCC N° de Acesso CCL2, CCL2.1 e CCL2.2), células HL- 30 ΡΕ2186902 60 (ATCC N° de Acesso CCL240), células HT-1080 (ATCC N° de Acesso CCL 121), células Jurkat (ATCC N° de Acesso TIB 152), células de carcinoma KB (ATCC N° de Acesso CCL 17), células de leucemia K-562 (ATCC N°de Acesso CCL 243), células de cancro da mama MCF-7 (ATCC N° de Acesso BTH 22), células MOLT-4 (ATCC N° de Acesso 1582), células Namalwa (ATCC N° de Acesso CRL 1432), células Raj i (ATCC N° de Acesso CCL 86), células RPMI 8226 (ATCC N° de Acesso CCL 155), células U-937 (ATCC N° de Acesso CRL 1593), células WI-38VAI3 da sub-linha 2R4 (ATCC N° de Acesso CLL 75.1), células CCRF-CEM (ATCC N° de Acesso CCL 119) e células de carcinoma do ovário 2780AD (Van der Blick et al., Câncer Res. 48:5927-5932, 1988), assim como células de hetero- hibridoma produzidas pela fusão de células humanas e células de uma outra espécie.

Após a modificação genética de células humanas para produzir uma célula que secreta α-Gal A, pode ser gerada uma estirpe celular clonal consistindo essencialmente numa pluralidade de células humanas primárias em cultura geneticamente idênticas ou, quando as células estão imortalizadas, uma linha celular clonal consistindo essencialmente numa pluralidade de células humanas imortalizadas geneticamente idênticas. Numa realização, as células da estirpe celular clonal ou da linha celular clonal são fibroblastos. Numa realização preferida, as células são fibroblastos humanos secundários, e.g., células BRS-11.

Após modificação genética, as células são 31 ΡΕ2186902 cultivadas em condições que permitem a secreção de a-Gal A. A proteína é isolada a partir das células em cultura, através da colheita do meio em que as células são crescidas e/ou lise das células para libertar o seu conteúdo, seguido da aplicação das técnicas de purificação de proteínas.

Purificação de α-Gal A a partir do meio condicionado de células estavelmente transfectadas.

De acordo com os métodos aqui descritos, a proteína α-Gal A é isolada a partir de células em cultura ("células produtoras de α-Gal A") através da colheita do meio em que as células são crescidas ou lise das células para libertar o seu conteúdo, seguido de aplicação das técnicas de purificação de proteínas sem a utilização de cromatografia de afinidade com lectinas. 0 processo de purificação preferido está descrito no Exemplo 2 abaixo.

Resinas de interacção hidrofóbica alternativas, tais como Source Isso (Pharmacia),Macro-Prep®Methyl Support (BioRad), TSK Butyl (Tosohaas) ou Phenyl Sepharose® (Pharmacia), podem ser igualmente usadas para purificar a-Gal A. A coluna pode ser equilibrada numa concentração de sal relativamente elevada, e.g., sulfato de amónio 1M ou cloreto de sódio 2M, num tampão de pH 5,6. A amostra a ser purificada é preparada ajustando o pH e a concentração de sal aos do tampão de equilíbrio. A amostra é aplicada na coluna e esta é lavada com tampão de equilíbrio para remover o material não ligado. A α-Gal A é eluída a partir 32 ΡΕ2186902 da coluna com um tampão de força iónica mais baixa, água ou solvente orgânico em água, e.g., 20% de etanol ou 50% de propilenoglicol. Como alternativa, a α-Gal A pode ser preparada de forma a passar através da coluna, usando uma concentração de sal mais baixa no tampão de equilíbrio e na amostra ou usando um pH diferente. Outras proteínas podem ligar-se à coluna, resultando na purificação da amostra contendo a α-Gal A que não se ligou à coluna. Um primeiro passo de purificação preferido é a utilização de uma coluna de hidroxiapatite.

Um passo alternativo de purificação pode usar uma resina de permuta catiónica, e.g., SP Sepharose® Fast Flow (Pharmacia), Source 30S (Pharmacia), CM Sepharose® Fast Flow (Pharmacia), Macro-Prep® CM Support (BioRad) ou Macro-Prep® High S Suppport (BioRad), para purificar α-Gal A. O "primeiro passo de cromatografia" é a primeira aplicação de uma amostra numa coluna de cromatografia (todos os passos associados com a preparação da amostra estão excluídos). A α-Gal A pode ligar-se à coluna a pH 4,4. Um tampão como seja acetato de sódio 10 mM, pH 4,4, citrato de sódio 10 mM, pH 4,4 ou outro tampão com capacidade tamponante adequada a aproximadamente pH 4,4, pode ser usado para equilibrar a coluna. A amostra a ser purificada é ajustada ao pH e à força iónica do tampão de equilíbrio. A amostra é aplicada na coluna e a coluna é lavada após a aplicação para remover o material não ligado. Um sal, como seja cloreto de sódio ou cloreto de potássio, pode ser usado para eluir a α-Gal A da coluna. Como alternativa, a a-Gal 33 ΡΕ2186902 A pode ser eluída da coluna com um tampão de pH mais elevado ou uma combinação de concentração de sal mais elevada e pH mais elevado. A α-Gal A pode também ser preparada para passar pela coluna, sem retenção, durante a aplicação através do aumento da concentração de sal no tampão de equilíbrio e na amostra aplicada, através da corrida da coluna num pH mais elevado ou através de uma combinação de aumento do sal e do aumento do pH.

Um outro passo de purificação pode usar uma coluna Q Sepharose® 6 Fast Flow para a purificação de a-Gal A. Q Sepharose® 6 Fast Flow é uma resina de permuta aniónica relativamente forte. Uma resina de permuta aniónica mais fraca, como seja DEAE Sepharose® Fast Flow (Pharmacia) ou Macro-Prep® DEAB (BioRad), pode também ser usada para purificar α-Gal A. A coluna é equilibrada num tampão, e.g., fosfato de sódio 10 mM, pH 6. O pH da amostra é ajustado a pH 6 e a força iónica baixa é conseguida através de diluição ou diafiltração da amostra. A amostra é aplicada na coluna em condições que permitem a ligação de α-Gal A. A coluna é lavada com tampão de equilíbrio para remover o material não ligado. A α-Gal A é eluida com aplicação de sal, e.g., cloreto de sódio ou cloreto de potássio, ou aplicação de tampão a pH mais baixo, ou uma combinação de concentração mais alta de sal e pH mais baixo. A α-Gal A pode também ser preparada para passar através da coluna, sem retenção, durante a aplicação através de aumento da concentração de sal na aplicação ou através de corrida da coluna a um pH mais baixo ou através 34 ΡΕ2186902 de uma combinação de concentração de sal mais elevado e pH mais baixo.

Um outro passo de purificação pode usar uma cromatografia de exclusão por tamanho Superdex®200 (Pharmacia) para purificação de α-Gal A. Outras resinas de exclusão por tamanho tais como Sephacryl®S-200 HR ou Bio-Gel® A-1.5 m podem também ser usadas para purificar a-Gal A. 0 tampão preferido para a cromatografia de exclusão por tamanho é fosfato de sódio 25 mM, pH 6,0, contendo cloreto de sódio 0,15M. Outros tampões compatíveis com a formulação podem também ser usados, e.g., citrato de sódio ou potássio 10 mM. O pH do tampão pode ser entre pH 5 e pH 7 e deverá conter um sal, e.g., cloreto de sódio ou uma mistura de cloreto de sódio e cloreto de potássio.

Um outro passo de purificação pode usar uma resina de cromatofocagem como seja Polybuffer Exchanger PBE 94 (Pharmacia) para purificar α-Gal A. A coluna é equilibrada a pH relativamente elevado (e.g., pH 7 ou acima), o pH da amostra a ser purificada é ajustado ao mesmo pH e a amostra é aplicada à coluna. As proteínas são eluídas com um gradiente de pH decrescente até um pH como seja o pH 4, usando um sistema tampão, e.g., Polybuffer 74 (Pharmacia), que foi ajustado a um gradiente de pH decrescente até um pH como seja pH 4, usando um sistema tampão, e.g., Polybuffer 74 (Pharmacia), que foi ajustado a pH 4.

Como alternativa, a cromatografia de imunoafini- 35 ΡΕ2186902 dade pode ser usada para purificar α-Gal A. Um anticorpo policlonal ou monoclonal adequado contra α-Gal A(gerado por imunização com α-Gal A ou com um péptido derivado da sequência de α-Gal A usando técnicas convencionais) pode ser imobilizado numa resina de acoplagem activada, e.g., Sepharose® 4 Fast Flow (Pharmacia) ou Sepharose® 4 Fast Flow activada com CNBr (Pharmacia). A amostra a ser purificada pode ser aplicada à coluna de anticorpo imobilizado, a aproximadamente pH 6 ou pH 7. A coluna é lavada para remover o material não ligado. α-Gal A é eluida da coluna com os reagentes típicos utilizados para a eluição de colunas de afinidade, como seja pH baixo, e.g., pH 3, desnaturantes, e.g., guanidina HC1 ou tiocianato, ou solventes orgânicos e.g., 50% de propilenoglicol num tampão pH 6. 0 processo de purificação pode também usar uma resina de afinidade com um quelato de metais, e.g., Chelating Sepharose® Fast Flow (Pharmacia), para purificar α-Gal A. A coluna é pré-carregada com iões metálicos, e.g., Cu2+, Zn2+, Ca2+, Mg2+ ou Cd2+. A amostra a ser purificada é aplicada na coluna num pH adequado, e.g., pH 6 a pH 7,5, e a coluna é lavada para remover as proteínas não ligadas. As proteínas ligadas são eluídas através de eluição competitiva com imidazole ou histidina ou através do abaixamento do pH usando citrato de sódio ou acetato de sódio a um pH inferior a 6 ou através da introdução de agentes quelantes, tais como EDTA ou EGTA.

De acordo com os protocolos anteriores, proporcionamos preparações com uma pureza de α-Gal A mais 36 ΡΕ2186902 elevada no que nas preparações de trabalhos anteriores, purificada até pelo menos 98% de homogeneidade, mais de preferência até pelo menos 99% de homogeneidade e mais de preferência até pelo menos 99,5% de homogeneidade, conforme medido por SDS-PAGE ou HPLC de fase reversa. As preparações de α-Gal A podem compreender numerosas glicoformas de a-Gal A. Assim, o termo "homogeneidade", como aqui é usado no contexto de preparações de α-Gal A, refere-se a preparações substancialmente livres (<2% das proteínas totais) de proteínas diferentes de α-Gal A. Exemplos de proteínas não α-Gal A tais como albumina, proteínas não α-Gal A produzidas pela célula hospedeira e proteínas não α-Gal A isoladas a partir de tecido ou fluido animal. A actividade especifica das preparações de α-Gal A do presente invento é preferencialmente pelo menos 2,0 x 106 unidades/mg de proteina, e mais de preferência pelo menos 3,5 x 106 unidades/mg de proteina.

Aumento da semi-vida no sangue de preparações de α-Gal A através da remodelação de glicanos para aumentar a carga de oligossacáridos.

Proporcionamos um programa de modificação de glicoproteinas para aumentar a incorporação de uma enzima terapêutica em tecidos específicos, que não sejam o figado e as macrofases. Usando os métodos aqui descritos, são obtidas preparações de α-Gal A humana glicosiladas em que entre 35% e 85% dos oligossacáridos estão carregados, de preferência pelo menos 50% dos oligossacáridos estão 37 ΡΕ2186902 carregados . A N-glicosilação de proteínas funciona através da modificação dos resíduos de asparagina adequados das proteínas com estruturas de oligossacáridos, influenciando assim as suas propriedades e bioactividades. Kukuruzinska & Lennon, Crit. Ver. Oral. Biol, Med. 9: 415-48 (1998). Proporcionamos uma preparação de α-Gal A isolada em que uma elevada percentagem dos oligossacáridos estão carregados negativamente, principalmente pela adição de um a quatro resíduos de ácido siálico em glicanos complexos ou de um a dois grupos de fosfato em glicanos de elevado teor de manose ou de um fosfato simples e de um ácido siálico simples em glicanos híbridos. Quantidades mais pequenas de glicanos complexos sulfatados podem estar igualmente presentes. Uma proporção elevada de estruturas carregadas serve duas funções principais. Primeiro, a protecção dos penúltimos resíduos de galactose por ácido siálico ligado em 2,3 ou em 2,6 evita a remoção prematura da circulação pelo receptor de asialoglicoproteínas presente nos hepató-citos. Este receptor reconhece glicoproteínas com resíduos de galactose terminais. 0 aumento da semi-vida no sangue de α-Gal A dá aos órgãos alvo importantes, tais como coração e rim, a oportunidade de endocitar maiores quantidades de enzima do plasma após infusão da enzima. Segundo, a presença de Man-6-fosfato em glicanos com elevado teor de manose ou híbridos proporciona a oportunidade da inter-nalização mediada por receptores, através do receptor de Man-6-fosfato, independente de catiões (CI:-MPR). Esta internalização mediada por receptores ocorre na superfície 38 ΡΕ2186902 de muitas células, incluindo células do endotélio vascular, as quais são um local importante de armazenamento de CTH nos doentes com a doença de Fabry. As moléculas de enzima com dois residuos de Man-6-fosfato possuem uma maior afinidade para a CI-MPR do que as que possuem um único Man-6-fosfato. Na Tabela 1 estão apresentadas estruturas representativas de glicanos.

Tabela 1

Estruturas representativas de glicano Um glicano biantenário: áJFucal»6 $Aa2,3/6Galp 1,4GlcNAcp í ,2Mana 1,6\ 1

Manp! /GlcNAcpl ^GlcNAc-Ásn SAa2s3/6Gaipl AGlcNÀcP 1,2Manaí3 /

Um glicano tetra-antenário: SAct2*3/6GaIp 1,4GieNA.c£ I. á \ SAcc2í3/6GaÍpts4G'k-NAcpIJ2MasíxlJ6 \ |

Man 13 1t4 GIcNAcB 3,4G3eNÁc~Asn SAa2,3/6Ga1 β I ,.4G!cNÀc β 1 s2Mara.l ,3 / $Aa2.3/6Ga! β 1AGicNAcp 1,4 /

Um glicano com elevado teor de manose:

Mana 1,2MauaI,6 \

Manal.6 \

Mana! ,2Mana 1,3/ Man β l, 4G kH At β 1 }4GÍoKAc~Asn

Manal na I >2María 1,3 /

Um glicano híbrido fosforilado: P-MmaGâ \

Manai,6 \

Mana 1,3 / Manpl ,4GlcNΑοβ 1 »4 GlcNAc-Asn SAa2,3/6Galpl ,4Gl«NAcp l,2Mana 1,3 / 39 ΡΕ2186902

Um glicano bifosforilado: P~Manal,2Man*xl,6 \

Maualt6 \

Mana1,3 / Manf$! ,4GlcNAc$ 1,4G1cNAc-Asn F»Manal,2MaaaJ,3 / A biossíntese de N-glicoproteínas envolve uma variedade de enzimas, glicosiltransferases e glicosidades. A maioria destas enzimas funciona no reticulo endoplas-mático (ER) e no aparelho de Golgi, numa forma ordenada e bem orquestrada. A complexidade da N-glicosilação é aumentada pelo facto de diferentes residuos de asparagina dentro do mesmo polipéptido puderem ser modificados com diferentes estruturas de oligossacáridos e várias proteínas serem distintas umas das outras pelas caracteristicas dos seus grupos de açúcar. Avanços recentes na genética molecular tornaram mais acessível a identificação, isolamento e caracterização dos genes de N-glicosilação. Como resultado, emergiu informação relativa às relações entre a N-glicosilação e outras funções celulares.

Na célula, o processamento de glicoproteínas com ligações em N começa quando uma cadeia de oligossacárido com um Glc3Man9GlcNAc2 é adicionada a uma asparagina aceitadora, presente num péptido nascente no lúmen do RE, como uma única unidade. Uma cadeia de oligossacárido de 14 açúcares consistindo em GlC3Man9GlcNAc2 é construída sobre dolicol, um álcool alifático de cadeia muito longa: 40 ΡΕ2186902

Mana(,2Manal ,6 \

Manals6 \

Manai ,2Mana ] ,3 / Manp 1 s4GleNÀcf31,4GlcNAc-PP-Dolicho!

Gica 1 >2010« 1,3Gteal ,3Manal ;2Ma»al,2Manal,3 /

Este oligossacárido é transferido como unidade simples para um resíduo de asparagina aceitador numa cadeia peptídica nascente no lúmen do RE. 0 tamanho grande do glicano relativamente ao péptido pode conduzir o enrolamento da proteína. Os três resíduos de glucose servem como um sinal de que o oligossacárido está completo e pronto para a transferência pela transferase de oligossacarilo. Esta enzima também transferirá oligossa-cáridos não glucosilados mas a uma taxa inferior apenas à das cadeias completas porque serem substratos sub-óptimos. Foi demonstrado que uma forma da síndrome de glicoproteínas deficientes em açúcares nos seres humanos é causada por uma deficiência em transferase de dolicol-P-Glc :MangGlcNAc2-PP-dolicolglucosilo, a primeira enzima na via de adição de glucose, o que resulta em hipoglicosilação de proteínas do soro. Komer et al. , Proc. Natl. Acd. Sei. USA 95: 13200- 13205 (1998) . Após a remoção dos três resíduos de glucose e de atingir a conformação correcta, a nova glicoproteína sintetizada é exportada para o Golgi. Dependendo da acessibilidade do glicano às manosidases do Golgi após enrolamento da proteína, a cadeia de glicano pode ficar como uma cadeia de elevado teor de manose com 5-9 resíduos de manose. Como alternativa, a cadeia de glicanos pode ainda ser processada para dar um núcleo de trimanosilo e tornar-se um aceitador de outras transferases de glicosilo 41 ΡΕ2186902 que formam cadeias complexas pela adição de residuos GlcNAc, seguido de Gal, NeuAc e Fuc. Uma terceira possibilidade, se a proteina possuir dois residuos de lisina distando exactamente 34 angstrons e na relação espacial correcta relativamente a uma cadeia de elevado teor de manose, é a adição de GlcNAca-l-P04 no carbono 6 de um ou, por vezes, dois residuos de manose. Cozzo et al., J. Biol. Chem. 273:21069-21076 (1998). Após remoção do GlcNAc ligado em α por uma enzima especifica, é gerado um epitopo M6P terminal que é reconhecido por um receptor M6P na rede do trans Golgi, o qual depois direcciona estas enzimas para os lisossomas das células com origem no mesênquima.

Para dirigir α-Gal A para tantos tecidos diferentes quanto possivel, são úteis muitas estruturas diferentes de açúcares (glicoformas). Matsuura et al., Glycobiology 8:329-339 (1998) descreveram que as estruturas de glicano de α-Gal A humana produzida nas células CHO tinham 41% de glicanos com elevado teor de manose e com um nivel de fosforilação de 24%. No entanto, o nivel de glicanos complexos sialilados foi de apenas 11%. Assim, 2/3 das cadeias complexas não estavam sialiladas, o que resulta na eliminação rápida de α-Gal A pelo figado. A α-Gal A produzida nas células humanas do invento possui uma percentagem mais elevada de oligossacáridos carregados do que a α-Gal A anteriormente produzida em células CHO. Por exemplo, α-Gal A sintetizada em células HT-1080 aqui descritas é particularmente adequada, porque α-Gal A produzida em células HT-1080 possui aproximadamente 15% de 42 ΡΕ2186902 estruturas neutras (elevado teor de manose e híbridas), aproximadamente 16% de glicanos fosforilados e aproximadamente 67% de glicanos complexos com 2 a 4 resíduos de ácido siálico. Assim, essencialmente todas as cadeias complexas estão sialiladas comparativamente com a-Gal A produzida em células CHO. A α-Gal A de células HT-1080 tem três locais de glicosilação ligada em N. Dois locais são processados em glicanos complexos no aparelho de Golgi, enquanto que o terceiro local é ocupado por um glicano de alto teor de manose, 50% do qual é modificado por fosforilação específica das enzimas lisossomais para dar espécies monofosforiladas e difosforiladas. São proporcionadas quatro abordagens para a remodelação de açúcares numa proteína contendo cadeias de glicano ligadas em N. Primeiro, a proporção de α-Gal A carregada pode ser aumentada através do isolamento selectivo de glicoformas durante o processo de purificação. 0 presente invento proporciona aumento da proporção de glicoformas de α-Gal A altamente carregadas e de alto peso molecular através do fraccionamento de espécies de α-Gal A em resinas de cromatografia em coluna durante e/ou após o processo de purificação. As espécies de glicoformas mais altamente carregadas de α-Gal A possuem mais ácido siálico e/ou mais fosfato e as glicoformas com peso molecular mais elevado conterão também espécies totalmente glicosiladas, na sua maioria altamente ramificadas e altamente carregadas. A selecção das espécies carregadas ou remoção das espécies de α-Gal A não glicosiladas, fracamente glico- 43 ΡΕ2186902 siladas ou fracamente sialiladas e/ou fosforiladas resultará numa população de glicoformas de α-Gal A com mais ácido siálico e/ou mais fosfato, proporcionando assim uma preparação de α-Gal A com maior semi-vida e potencial eficiência terapêutica.

Este processo de fraccionamento pode ocorrer mas não se limita a resinas de colunas de cromatografia adequadas usadas para purificar ou isolar α-Gal A. Por exemplo, o fraccionamento pode ocorrer mas não está limitado a resinas de permuta catiónica (tais como SP-Sepharose®), resinas de permuta aniónica (Q-Sepharose®), resinas de afinidade (Heparin Sepharose®, colunas de lectinas) colunas de exclusão por tamanho (Superdex® 200) e colunas de interacção hidrofóbicas (Butyl Sepharose®) e outras resinas de colunas cromatográficas conhecidas.

Uma vez que α-Gal A é produzida em células como uma mistura heterogénea de glicoformas que diferem no peso molecular e carga, α-Gal A tende a eluir em picos relativamente largos a partir das resinas de cromatografia. Nestas eluições, as glicoformas são distribuídas numa forma particular dependendo da natureza da resina a ser utilizada. Por exemplo, na cromatografia de exclusão por tamanho, as glicoformas maiores tenderão a eluir mais cedo no perfil de eluição do que as glicoformas mais pequenas.

Na cromatografia de permuta iónica, as glicoformas mais negativamente carregadas tenderão a ligar-se a uma resina positivamente carregada (como seja Q- 44 ΡΕ2186902

Sepharose®) com maior afinidade do que as glicoformas menos carregadas negativamente e tenderão portanto a eluir mais tarde no perfil de eluição. Pelo contrário, estas glicoformas altamente carregadas negativamente podem ligar-se menos fortemente a uma resina carregada negativamente, como seja SP Sepharose®, do que as espécies menos carregadas negativamente ou podem nem se ligar de todo. O fraccionamento das espécies de glicoformas em resinas cromatográficas pode ser influenciado pelo pH, força iónica, selecção do sal do tampão, viscosidade e/ou outros parâmetros tais como escolha do tipo de resina. A utilização de vários tipos de eluições com gradiente (gradientes lineares, curvos, e.g., gradientes exponenciais) ou a utilização de uma série de pequenos passos de eluição para eluir selectivamente as espécies de α-Gal A da coluna de cromatografia podem também ser optimizados para o fraccionamento de α-Gal A. Todos estes factores, sozinhos ou em combinação, podem ser optimizados para conseguir um fraccionamento eficiente das glicoformas. 0 fraccionamento também pode ocorrer após o processo de purificação estar completo, numa resina cromatográfica particular selectivamente optimizada para o fraccionamento e selecção da população de glicoformas pretendida. A selecção de populações de glicoformas a partir das espécies de α-Gal A fraccionadas pode ser conseguida após análise das glicoformas de α-Gal A eluidas. 0 pico de eluição pode ser analisado através de várias técnicas tais 45 ΡΕ2186902 como, mas não estando limitado a SDS-PAGE, focagem iso-eléctrica, electroforese capilar, HPLC analítica de permuta iónica e/ou HPLC analítica por exclusão de tamanho. Podem ser seleccionadas fracções particulares que tendem para o perfil de tamanho ou carga pretendido. A selecção pode ocorrer em todos os passos cromatográficos do processo, permitindo a obtenção gradual da população de glicoformas pretendida ou pode estar limitada a um ou mais passos particulares se a eficiência do passo de fraccionamento for elevado. O fraccionamento pode também ocorrer após completado o processo de purificação, numa resina cromato-gráfica particular selectivamente optimizada para o fraccionamento e selecção da população de glicoformas pretendida . O fraccionamento e selecção de glicoformas altamente carregadas e/ou de maior peso molecular de α-Gal A pode ser efectuado com qualquer preparação de α-Gal A, como seja a derivada de células geneticamente modificadas por métodos convencionais de engenharia genética ou por activação de genes (GA). Pode ser efectuada em linhas celulares crescidas em sistemas optimizados para proporcionar maior sialilação e fosforilação como descrito atrás, ou a-Gal A PEGilada como descrito abaixo.

Por exemplo, no processo de purificação de a-Gal A como aqui descrito, o fraccionamento das glicoformas de α-Gal A pode ocorrer em vários passos no processo. Na resina hidrofóbica, Butyl Sepharose® Fast Flow, as 46 ΡΕ2186902 glicoformas de α-Gal A mais altamente carregadas eluem primeiro, seguidas das espécies menos altamente carregadas. Para a Heparin Sepharose®, as espécies mais altamente carregadas também eluem primeiro no pico de eluição, seguido das espécies menos altamente carregadas. 0 oposto ocorre com Q-Sepharose®, onde as espécies menos altamente carregadas eluem primeiro, seguido das glicoformas mais altamente carregadas. Na cromatografia de exclusão por tamanho em Superdex® 200, as glicoformas com peso molecular mais elevado eluem primeiro seguidas das espécies de a-Gal A menos glicosiladas de peso molecular mais baixo. Para permitir o fraccionamento eficiente das populações de glicoformas particulares de α-Gal A, podem ser combinados múltiplos passos cromatográficos, todos eles fraccionando por métodos fisicos diferentes. Por exemplo, para obter as glicoformas de α-Gal A contendo o pi mais baixo (as possuidoras de carga mais negativa) limitando a reunião das fracções butilo que eluem mais cedo aumentará a quantidade de α-Gal A mais altamente carregada. Prosseguindo com este conjunto de fracções na coluna de Heparina e novamente limitando a reunião de fracções às espécies de α-Gal A mais carregadas negativamente aumenta mais a proporção de glicoformas de α-Gal A de baixo pi no conjunto de fracções. Uma maior optimização da população de glicoformas pode ser conseguida em vários passos do processo de purificação através da monitorização da distribuição de tamanho e carga dos conjuntos de fracções eluidas por SDS-PAGE e focagem isoeléctrica. Um exemplo de fraccionamento pelo tamanho e carga está descrito abaixo no Exemplo 2.4. 47 ΡΕ2186902 A segunda abordagem para a remodelação de açúcares envolve a modificação de determinadas glicoformas na α-Gal A purificada através da ligação de um residuo de açúcar adicional terminal, usando uma transferase de glicosilo purificada e o açúcar dador de nucleótidos adequado. Este tratamento afecta apenas as glicoformas possuidoras de um residuo de açúcar adequado terminal livre para actuar como um aceitador da transferase de glicosilo usada. Por exemplo, a transferase de a2,6-sialino adiciona ácido siálico numa ligação 2,6 a um aceitador terminal de Gaipi, 4GlcNAc-R, usando ácido CMP-siálico como dador do açúcar de nucleótido. As enzimas comerciais e as suas espécies de origem incluem: transferases III, V e VI (humanas) de fucose al,3; transferase de galactose al,3 (porcina); transferase de galactose βΐ,4 (bovina); transferase de manose al,2 (levedura); transferase de ácido siálico a2,3 (rato); e transferase de ácido siálico a2,6 (rato). Após completada a reacção, a transferase de glicosilo pode ser removida da mistura de reacção através de uma coluna de afinidade específica de transferases de glicosilo consistindo no nucleótido adequado ligado a um gel através de um espaçador de 6 carbonos através de uma ligação de pirofosfato (GDP, UDP) ou fosfato (CMP)ou através de outros métodos cromatográficos conhecidos na área. De entre as transferases de glicosilo descritas trás, as transferases de sialilo são particularmente úteis para a modificação de enzimas, tais α-Gal A, para terapia de substituição com enzimas em doentes humanos. A utilização 48 ΡΕ2186902 de qualquer uma das transferases de sialilo com ácido CMP-5-fluoresceinil-neuramínico como dador do açúcar de nucleótidos dá uma qlicoproteína marcada com fluorescência, cuja incorporação e localização no tecido podem ser facilmente monitorizadas. A terceira abordagem para a remodelação de açúcares envolve a glico-engenharia, e.g., introdução de genes que afectam mecanismos de glicosilação da célula, da célula produtora de α-Gal A para modificar o processamento pós-traducional no aparelho de Golgi é uma abordagem preferida. A quarta abordagem para a remodelação de açúcar envolve o tratamento de α-Gal A com glicosidases adequadas para reduzir o número das diferentes formas presentes. Por exemplo, o tratamento sequenciado de cadeias de glicano complexas com neuraminidase, β-galactosidase e β-hexosa-minidase cliva o oligossacárido até ao núcleo de trimanose. A estrutura de um glicano ligado em N depende da acessibilidade da cadeia de glicano às manosidases de processamento do Golgi, após as proteinas terem-se enrolado, e da presença no Golgi de uma família de transferases de glicosilo e dos nucleótidos dadores de açúcar adequados Muitas das transferases de glicosilo catalisam reacções de competição, que podem resultar na cadeia de glicano ser alongada de várias maneiras diferentes e compatíveis, dependendo das enzimas que reagem 49 ΡΕ2186902 primeiro. Isto resulta em micro-heterogeneidade e na formação de uma familia complexa de glicoformas. Algumas estruturas são únicas de um único tecido, como seja a modificação de determinadas hormonas pituitárias através da adição de GalNAc-4-SC>4 ou estão limitadas a alguns órgãos.

Um exemplo desta última é a formação do chamado GlcNAc bissector (GlcNAc ligado em Pi ,4 ao resíduo β-manose do núcleo) em glicanos complexos de glutamiltranspeptidase no rim, mas não no fígado. Uma estrutura biantenária bissectada na γ-glutamiltranspeptidase está apresentada abaixo: ±p«çai56 SAct2, 3/6Ga ip 1 ?4GIcNAcp 1,2Maiicú ,6 \ j €1 cN AepMMarrp! ,4G.lcNAcp 154G1cNAc-Aso S Aa2,3/6GaI pI>4GlcNÀc p 1, 2Mana 1,3 /

Nos mamíferos, a enzima responsável, transferase III de GlcNAc (GnT-III), é encontrada em determinadas células do cérebro e do rim e em determinadas células do fígado em doentes com hepatocarcinomas. GnT-III catalisa a adição de N-acetilglucosamina em ligação Pi -4 ao núcleo de trimanosilo de cadeias de açúcar ligadas em N, para produzir um resíduo GlcNAc bissectado. Os genes para GnT-III de ratinho, rato e humanos foram clonados. Ihara et al., J. Biochem. (Tokyo) 113:692-698 (1993). A presença de mais actividade GlcNAc T-III em células humanas pode produzir um aumento dos glicanos híbridos monofosforilados à custa de glicanos complexos bi-, 50 ΡΕ2186902 tri- e tetra-ternários. Isto não deverá afectar adversamente a semi-vida no plasma, mas poderá aumentar o direccionamento para células endoteliais. Está apresentada abaixo uma estrutura representativa: P»M»tial,6 \ GlcNAcpÍT4

Manalt6 \ f

Manai 3 / Man β 1 AGlcNÂcp 1,4G!eNÂc«Âsn SAa2,3/6Gaip l^GIcNAcpl^MaRa!^ /

Alguma α-Gal A é incorporada pelo rim e resulta num decréscimo significativo dos glicolípidos armazenados. Devido ao rim poder formar N-glicanos com resíduos GlcNAc bissectores, as células do epitélio renal podem reconhecer glicoproteínas com este epitopo com uma especificidade particularmente elevada. A elevada actividade de GnT-III pode causar um desequilíbrio na ramificação do núcleo trimanosilo através da inibição de posterior ramificação por GnT-II, IV, V e transferase de Gal β1,4 ao nível do substrato. Recentemente, foi criada uma linha celular de ovário de hamster Chinês (CHO) capaz de produzir oligossacáridos bissectados em glicoproteínas, através da sobre-expressão de GnT-III recombinante. Sburlati et al., Biotechnol. Progr. 14:189-192 (1998). 0 interferão β (IFN-β) foi escolhido como modelo e proteína heteróloga secretada com potencial terapêutico, sobre a qual poderá ser avaliado o efeito da expressão de GnT-III no glicosilação do produto. IFN-β com oligossacáridos bissectados foi produzido pelas 51 ΡΕ2186902 células CHO manipuladas geneticamente de forma a produzir GnT-III, mas não pela linha celular parental não modificada . A produção de glicoproteinas para fins terapêuticos requer a caracterização de glicosilação relativamente à consistência de lote para lote. A "carga de N- glicanos hipotética Z" foi usada como parâmetro para

caracterizar a glicosilação de proteínas num forma simples e eficiente. A determinação de Z foi avaliada em múltiplas experiências repetitivas e provou ser altamente precisa e fiável. Hermentin et al., Glycobiology 6:217-230 (1996). A carga hipotética de N-glicano de uma determinada glico-proteína é deduzida a partir do perfil de mapeamento de N-glicano, obtido através da cromatografia de permuta aniónica de alta resolução (HPAEC)/detecção amperimétrica pulsada (PAD). Em HPAEC, os N-glicanos são claramente separados de acordo com a sua carga, e.g., o seu número de resíduos de ácido siálico, proporcionando regiões distintas para estruturas neutras assim como para os N-glicanos mono-, di-, tri- e tetra-sialilados. Z é definido como a soma dos produtos das respectivas áreas (A) na região asialo, mono-sialo, di-sialo, tri-sialo e penta-sialo, cada um multiplicado pela carga correspondente: 2 - A(asialo)* + A(MS) *1 + A(díS) *2 + A(TrÍS) *3 + A(TetraS) ‘4 í+ A(peníaS) *S] Ζ-ΣΑ(ί)*(0 52 ΡΕ2186902 em que i é 0 na região asialo, 1 na região mono-sialo (MS), 2 na região di-sialo (DiS), 3 na região tri-sialo (TriS), 4 na região tetra-sialo (TetraS) e 5 na região penta-sialo (PentaS).

Assim, uma glicoproteína essencialmente com estruturas C4-4* dará Z = 400, uma glicoproteína essencialmente com estruturas C2-2* originará Z = 200 e uma glicoproteína tendo apenas estruturas do tipo teor de manose elevado ou truncadas darão Z = 0.

As preparações de α-Gal A humana glicosilada aqui descritas possuem uma carga de oligossacárido, conforme medido pelo número Z, superior a 100, de preferência superior a 150 e, mais de preferência superior a 170.

Alteração da semi-vida no soro de α-Gal A através de fosforilação A fosforilação de α-Gal A pode ser alterada para afectar a semi-vida no sangue de α-Gal A e o nível de a-Gal A que entra nas células. A fosforilação é preferencialmente conseguida na célula que expressa a-Gal A. É especificamente contemplada a obtenção de uma preparação de α-Gal A glicosilada com maior grau de fosforilação através da introdução de uma sequência de DNA que codifica transferases de fosforilo na célula produtora de α-Gal A ou através da introdução de uma sequência 53 ΡΕ2186902 reguladora por recombinação homóloga que regula a expressão de um gene de transferase de fosforilo endógeno. A célula produtora de α-Gal A é então crescida em condições de cultura que resultam na expressão de a- Gal A e de transferase de fosforilo. Pode ser então efectuado o isolamento de uma preparação de a-Gal A com maior grau de fosforilação comparativamente com a α-Gal A produzida numa célula sem o polinucleótido. Tais transferases de fosforilo são conhecidas na área. Ver, por exemplo, patentes dos Estados Unidos 5804413 e 5789247.

As acções concertadas das enzimas ligadas à membrana do Golgi são necessárias para gerar uma marca de reconhecimento de Man-6-fosfato numa pró-enzima lisossomal. A primeira, UDP-N-acetilglucosamina: glicoproteina N-acetilglucosamina-l-fosfotransferase (fosfotransferase de GlcNAc) requer um determinante de reconhecimento proteico nas enzimas lisossomais que consiste em dois residuos de o lisina distando exactamente 34 A e na relação espacial correcta com uma cadeia de elevado teor de manose. A segunda, N-acetilglucosamina-1-fosfodiéster a-N-acetilglu-cosaminidase (fosfodiéster a-GlcNAcase), hidrolisa a ligação a-GlcNAc-fosfato expondo o local de reconhecimento de Man-6-fosfato.

De acordo com os métodos aqui descritos, as preparações de α-Gal A produzidas possuem múltiplas glicoformas contendo entre 16 e 50%, mais de preferência pelo menos 30%, de glicoformas fosforiladas. 54 ΡΕ2186902

Alteração da semi-vida no soro de α-Gal A através do aumento de sialilação 0 aumento de sialilação dos glicanos subsiali-lados com resíduos de galactose terminais pode ser conseguido através da transfecção de células de mamífero, de preferência humanas, com o gene da transferase de sialilo.

Proporcionamos uma preparação de α-Gal A glico-silada tendo uma maior carga de oligossacárido produzido através da introdução de polinucleótido, que codifica a transferase de sialilo, numa célula produtora de α-Gal A, ou introduzindo uma sequência reguladora, através de recombinação homóloga, que regula a expressão de um gene da transferase de sialilo. As células produtoras de α-Gal A são então crescidas em condições de cultura que resultam na expressão de α-Gal A e transferase de sialilo. 0 passo que se segue consiste no isolamento da preparação de α-Gal A com maior carga de oligossacárido. As transferases de sialilo preferidas incluem uma transferase de a2,3-sialilo e uma transferase de a2,6-sialilo. Estas transferases de sialilo são conhecidas. Por exemplo, ver patente U.S. 5858751.

Numa realização preferida, este método de aumento da sialilação inclui o passo adicional de selecção de glicoformas de α-Gal A com aumento de tamanho ou aumento 55 ΡΕ2186902 de carga através do fraccionamento ou purificação da preparação (como discutido abaixo).

Como alternativa, proporcionamos aumento de sialilação através da manutenção das células num ambiente de baixa concentração de amónio. Em particular, uma preparação de α-Gal A glicosilada com maior sialilação é obtida através do contacto de uma célula produtora de a-Gal A com um meio de cultura tendo uma concentração de amónio abaixo de 2 mM. 0 aumento de sialilação pode ser conseguido através da perfusão das células produtoras, através da qual os metabolitos tóxicos, tais como amónia, são periodicamente removidos do meio de cultura. Numa realização preferida, um ambiente com baixa concentração de amónio é conseguido através da adição do gene ou cDNA da sintetase de glutamina às células produtoras. Como alternativa, um ambiente com uma baixa concentração de amónia é conseguido através da perfusão da célula produtora de α-Gal A com meio de cultura de fresco para manter a concentração de amónio abaixo de 10 mM, mais de preferência abaixo de 2 mM. As células produtoras podem ser sujeitas a perfusão continuamente com meio de cultura fresco com uma concentração de amónio abaixo de 10 mM. Como alternativa, as células produtoras podem ser sujeitas a perfusão intermitentemente com meio de cultura fresco. A perfusão intermitente, como aqui é usada, refere-se a perfusão regular, em intervalos periódicos de tempo ou após uma medição da concentração de amónio aproximando-se da concentração alvo (i.e., 10 mM, mais de preferência abaixo de 2 56 ΡΕ2186902 mM) . As perfusões intermitentes deverão ser em intervalos suficientemente frequentes para que a concentração de amónio nunca exceda a concentração alvo. As células produtoras são sujeitas a perfusão durante um período de tempo necessário para se obter uma preparação de α-Gal A com 50 a 70%, de preferência 60%, dos qlicanos totais a serem sialilados.

Alimento da semi-vida em circulação de α-Gal A sérica através da PEGilação de α-Gal A A semi-vida em circulação de uma preparação de α-Gal A humana qlicosilada é aumentada através da formação de complexos de α-Gal A com polietilenoglicol. 0 poli- (etileno gi icol) (PEG) é um polímero solúvel em água que quando covalentemente ligado a proteínas, altera as suas propriedades para estender o seu potencial de utilização. A modificação com polietilenoglicol ("PEGilação") é uma técnica bem estabelecida que possui a capacidade de solucionar ou melhorar muitos dos problemas dos fármacos proteicos e peptídicos. 0 desempenho farmacológico melhorado das PEG-proteínas quando comparado com as suas contrapartes não modificadas levou ao desenvolvimento deste tipo de conjugados como um agente terapêutico. As deficiências em enzimas para as quais a terapia com a enzima nativa foi ineficaz (devido à rápida eliminação e/ou reacções imunológicas) podem agora ser tratadas com PEG-enzimas 57 ΡΕ2186902 equivalentes. Por exemplo, PEG-desaminase de adenosina já conseguiu aprovação da FDA. Delgado et al., Crit. Ver. Ther. Drug Carrier Syst. 9:249-304 (1992). A ligação covalente de PEG a α-galactosidase dos grãos de café verdes altera as propriedades catalíticas da enzima ao mascarar locais determinantes específicos na molécula. Isto resulta num aumento do Km e num decréscimo dos valores de Vmax contra análogos do substrato p-nitrofenilo. Wieder & Davis, J. Appl. Biochem. 5:337-47 (1983). A α-galactosidase ainda foi capaz de clivar os resíduos de galactose terminais da substância B do grupo sanguíneo da saliva humana. A ligação ao anticorpo e à lectina específica foram perdidas na PEG-a-galactosidase. Os anticorpos gerados a partir da α-galactosidase nativa podem bloquear a actividade da enzima e esta inibição é gradualmente perdida quando testada contra preparações da enzima com quantidades progressivamente superiores de PEG. Pelo contrário, os anti-soros de animais imunizados com PEG-a-galactosidase não inibiram a actividade enzimática em qualquer preparação de α-galactosidase ou de PEG-a-galactosidase. Estes resultados indicam que PEG tende a cobrir os grupos de açúcar específicos de lectinas e determinante antigénico e que estes locais provavelmente permanecem crípticos durante o processamento in vivo de PEG-enzimas. A ligação covalente de PEG às proteínas requer activação do grupo hidroxilo terminal do polímero com um 58 ΡΕ2186902 grupo migrante adequado que pode ser substituído por ataque nucleofílico do ε-amina terminal da lisina e do grupo a-amina do extremo N. Vários grupos químicos podem ser explorados para activar PEG. Para cada aplicação particular, diferentes métodos de acoplagem proporcionam vantagens distintas. Diferentes métodos de PEGilação possuem um impacto surpreendente e dramático em factores tais como retenção de bioactividade, estabilidade e imunogenicidade das proteínas e péptidos PEGilados resultantes. Francis et al., Int. J. Hematol. 68(1):1-18 (1998). Por exemplo, uma técnica de PEGilação sem elemento de ligação apenas liga PEG à molécula alvo. Mais especificamente, a aplicação de uma técnica de PEGilação biologicamente optimizada, usando tresil-monometeoxi-PEG (TMPEG), a uma variedade de proteínas alvo revela, como descrito por Francis et al., Int. J. Hematol. 68(1):1-18 (1998), um excepcional capacidade de conservar a actividade biológica do alvo. Isto e o benefício de adicionar apenas PEG (que se demonstrou ser seguro para usar na terapia humana), à proteína torna o método ideal para a modificação de α-Gal A.

Quatro locais possíveis para a acoplagem de PEG a proteínas são (1) grupos amina (extremo N e lisina); (2) grupos carboxilo (ácido aspártico e ácido glutâmico); (3) grupos sulfidrilo (císteina); e (4) grupos de açúcar (aldeídos gerados após tratamento com periodato). A acoplagem dos grupos carboxilo das proteínas aos grupos aldeído nos açúcares requer um reagente de PEG com um grupo amina nucleofílico. Esta química altera o pi de α-Gal A após os grupos carboxilo carregados negativamente serem ligados por 59 ΡΕ2186902 PEG. Quaisquer alterações no pi podem afectar a actividade biológica de α-Gal A. Ainda, a acoplagem de PEG às cadeias de açúcar pode afectar a captura de α-Gal A pelo receptor de M6P, o qual é critico para a actividade biológica. A quimica de sulfidrilo também afecta a estrutura fisica da molécula e não é recomendada.

Os métodos normalmente usados para a PEGilação formam uma ligação amida entre os grupos amina de uma proteina e o grupo metoxi em monometoxi-PEG. NHS-PEG pode ser adquirido comercialmente e resulta numa ligação amida entre a proteina e PEG. No entanto, a formação da ligação amida altera o pi devido à perda da carga positiva do grupo -NH2. Tresil-PEG é acoplado através de grupos amina e forma uma amina secundária estável. As aminas secundárias oferecem a vantagem de reterem a carga positiva do grupo amina. O reagente tresil-PEG pode ser comprado e é estável como um pó liofilizado e desidratado. Tresil-PEG foi extensivamente caracterizado e a reacção e produtos secundários estão bem compreendidos. Assim, numa realização preferida, a preparação de α-Gal A é complexada usando tresil-monometoxi-PEG (TMPEG) para formar uma α-Gal A PEGilada. A α-Gal A PEGilada é então purificada para dar uma α-Gal A PEGilada isolada. ESQUEMA. DE REACÇÁO CH3 (OCH2CH2) rOS02CH2CF3+H2N-proteinas i CH3 (OCH2CH2) n—HN-proteína-monometoxi-PEG tresilado 60 ΡΕ2186902 α-Gal A contem 18 grupos amina, 17 grupos s-amina (lisina) e um grupo α-amina (extremo N) . A reacção pode ser controlada para produzir α-Gal A com substituições mínimas e depois as moléculas com um PEG por molécula, ou um número médio inferior de grupos PEG por molécula, podem ser purificadas a partir de formas não substituídas e multiplamente substituídas. As substituições múltiplas em α-Gal A podem não afectar significativamente a actividade biológica; assim o produto final pode consistir numa mistura heterogénea de uma a 18 moléculas de PEG ligadas. O nível de substituição dependerá do nível da actividade enzimática retida. Deverá ser notado gue um decréscimo na actividade enzimática pode ser compensado por um aumento do efeito terapêutico derivado do aumento da semi-vida em circulação e da redução do reconhecimento imune de a-Gal A. Assim, no desenvolvimento de um produto PEG-a-Gal A, a proporção de PEG relativamente a α-Gal A deverá estar dependente da actividade biológica e não apenas da actividade enzimática. A reacção de PEGilação requer um pH, composição de tampão e concentração proteica adequados. As condições de reacção adequadas podem ser conseguidas através de um passo de ultrafiltração/diafiltração, que é normalmente usado no processo de produção. Imediatamente antes da reacção, tresil-PEG é rapidamente solubilizado em água com agitação contínua. Esta solução é então adicionada à a-Gal 61 ΡΕ2186902 A preparada e deixada a reagir durante um periodo de tempo controlado e a uma temperatura controlada (e.g., 2 horas a 250 °C) . A PEGilação pode ocorrer antes do processo de purificação final, o qual eliminará passos adicionais a juntar ao processo de purificação. Após completada a acoplagem, PEG-a-Gal A é processada através dos restantes passos do processo de purificação. A realização da reacção antes da coluna Q (permuta aniónica) permite que em dois passos de purificação sejam removidos os produtos secundários da reacção. Uma vez que PEG não possui qualquer carga negativa, não será retido pela Q Sepharose® e eluirá no volume da fase móvel. A quantidade de PEGilação pode ser medida por técnicas conhecidas. Por exemplo, a fluorescamina fluoresce quando ligada aos grupos α-amina e ε-amina das proteínas. A percentagem de perda de fluorescência após PEGilação está correlacionada com a percentagem de PEG ligado a α-Gal A. O ensaio BCA da Pierce para proteína total pode ser usado para determinar a concentração proteica. 0 ensaio de actividade de metilumbeliferil-a-D-galactopiranósido (4-MUF-a-Gal) foi usado para avaliar o efeito da actividade enzimática de PEG-a-Gal A. α-Gal A contem M6P, o qual é necessário para a internalização nos lisossomas. A interferência de PEG no reconhecimento do receptor de M6P pode ser avaliada usando um ensaio baseado em células para monitorizar a internalização de α-Gal A nos lisossomas. 62 ΡΕ2186902

Métodos de administração da preparação de α-Gal A

As composições compreendendo várias glicoformas de α-Gal A podem ser administradas através de qualquer via que seja compatível com a preparação de α-Gal A. A preparação de α-Gal A purificada pode ser administrada a indivíduos que produzem proteína α-Gal A insuficiente ou defectiva ou que possam beneficiar de terapia com α-Gal A. As preparações terapêuticas do presente invento podem ser administradas a um indivíduo através de quaisquer meios, directamente (e.g., localmente, como seja por injecção, implantação ou administração tópica num tecido) ou sistemicamente (e.g., por via oral ou parentérica). A via de administração pode ser oral ou parentérica, incluindo intravenosa, subcutânea, intra-arterial, intraperitoneal, oftálmico, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intra-orbital, intracerebral, intradér-mica, intracranial, intraspinal, intraventricular, intrate-cal, intracisternal, intracapsular, intrapulmonar, intrana-sal, transmucosal, transdérmica ou através de inalação. Os métodos, sistemas e preparações de fármacos para administração intrapulmonar estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5785049, 5780019 e 5775320. Um método preferido de administração intradérmica é através de administração iontoforética com pensos; um exemplo de tal administração está descrito na Patente U.S. 5843015. 63 ΡΕ2186902

Uma via de administração particularmente útil é por injecção subcutânea. Uma preparação de α-Gal A é formulada para que a dose total necessária possa ser administrada numa única injecção de um a dois mililitros. Para permitir um volume de injecção de um ou dois mililitros, uma preparação de α-Gal A pode ser formulada numa concentração para que a dose preferida seja administrada num volume de um a dois mililitros, ou a preparação de α-Gal A possa ser formulada numa forma liofi-lizada, a qual é reconstituída em água ou num tampão adequado, fisiolgicamente compatível, antes da administração. As injecções subcutâneas das preparações de α-Gal A têm as vantagens de serem convenientes para o doente, em particular ao permitir a auto-administração, ao mesmo tempo que resultam numa semi-vida no plasma prolongada comparativamente com, por exemplo, a administração intravenosa. O prolongamento da semi-vida no plasma resulta na manutenção de niveis plasmáticos de α-Gal A eficazes durante maiores periodos de tempo, cujo beneficio é aumentar a exposição dos tecidos clinicamente afectados à α-Gal A injectada, como resultado aumenta a captura de α-Gal A pelos tecidos. Isto permite um efeito mais benéfico para o doente e/ou uma redução na frequência de administração. Ainda, uma variedade de sistemas projectados para conveniência do doente, como sejam canetas de injecção recarregáveis e sistemas de injecção sem agulha, podem ser usados com as preparações de α-Gal A da presente invenção como aqui discutido. 64 ΡΕ2186902 A administração pode ser através de injecções periódicas de um bólus da preparação ou pode ser administrada por via intravenosa ou intraperitoneal a partir de um reservatório que é externo (e.g., um saco IV) ou interno (e.g., um implante biodegradável, um órgão bioartificial, ou uma população de células produtoras de α-Gal A implantadas). Ver, e.g., Patentes U.S. 4407957 e 5798113. Os métodos e sistemas de administração intrapulmo-nar estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5654007, 5780014 e 5814607. Outros sistemas de administração parentérica úteis incluem partículas de copolímeros de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusão implantáveis, distribuição com bombas, distribuição de células encapsuladas, distribuição lipossomal, injecção através de agulha, injecção sem agulha, nebulizador, aerossolizador, electroporação e penso transdérmico. Os sistemas de injecção sem agulha estão descritos nas patentes U.S. 5879327; 5520639; 5846233 e 5704911. Qualquer uma das preparações de α-Gal A descritas pode ser administrada nestes métodos. A vida de administração e a quantidade de proteína administrada podem ser determinadas por factores facilmente avaliados pelos familiarizados com a matéria. Ainda, os familiarizados com a matéria saberão que a via de administração e a dosagem de uma proteína terapêutica pode variar para um determinado doente até ser obtido o nivel de dosagem terapêutico. 65 ΡΕ2186902

Formulação farmacêutica de proteína α-Gal A

Ainda, proporcionamos novas formulações de uma preparação de α-Gal A substancialmente isentas de proteínas não α-Gal A, como seja albumina, proteínas a-Gal A produzidas pela célula hospedeira ou proteínas isoladas a partir de tecido ou fluido animal. A preparação, preferencialmente, compreende parte de uma suspensão ou solução aquosa ou num fluido fisiologicamente compatível. 0 transportador ou veículo é f isiologicamente compatível para que, para além da administração da preparação pretendida ao doente, não afecte adversamente o equilíbrio de electrólito e/ou volume do doente. Soluções úteis para administração parentérica podem ser preparadas através de qualquer um dos métodos conhecidos na área farmacêutica. Ver, e.g., REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Gennaro, A., ed.), Mack Pub. , 1990. Pode também ser usada formulação não parentérica, tal como supositórios e formulação oral.

De preferência, a formulação possui um excipi-ente. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis para a-Gal A que podem ser incluídos na formulação são tampões tais como tampão citrato, tampão fosfato, tampão acetato e tampão bicarbonato, aminoácidos, ureia, álcoois, ácido ascórbico, fosfolípidos; proteínas, tais como albumina sérica bovina, colagénio e gelatina; sais tais como EDTA ou EGTA, e cloreto de sódio; lipossomas; polivinilpirrolidona; 66 ΡΕ2186902 açúcares, tais como dextrano, manitol, sorbitol e glicerol; propilenoglicol e polietilenoglicol (e.g., PEG-4000, PEG-6000); glicerol; glicina ou outros aminoácidos; e lipidos. Os sistemas tampão para usar com as preparações de α-Gal A incluem tampões citrato; acetato; bicarbonato; e fosfato (todos disponíveis na Sigma). O tampão fosfato é uma realização preferida. Uma gama de pH preferida para as preparações de α-Gal A é pH 4,5-7,4. A formulação também, preferencialmente, contem um detergente não iónico. Os detergentes não iónicos preferidos incluem Polysorbate 20, Polysorbate 80, Triton X-100, Triton X-114, Nonidet P-40, Octil a-glucósido, Octil β-glucósido, Brij 35, Pluronic e Tween 20 (todos disponíveis na Sigma).

Uma formulação particularmente preferida, contem detergente não iónico Polysorbate 20 ou Polysorbate 80 e soro fisiológico tamponado com fosfatos, mais de preferência a pH 6.

Para a liofilização de preparações de α-Gal A, a concentração proteica pode ser 0,1-10 mg/ml. Os agentes de enchimento, tais como glicina, manitol, albumina e dextrano, podem ser adicionados à mistura de liofilização. Ainda, crioprotectores possíveis, tais como dissacáridos, aminoácidos e PEG, podem ser adicionados à mistura de liofilização. Qualquer um dos tampões, excipientes e detergentes apresentados atrás, pode igualmente ser adicionado. 67 ΡΕ2186902

Numa formulação preferida, α-Gal A para injecção está numa concentração de 1 mg/ml.

As formulações para administração podem incluir glicerol e outras composições de elevada viscosidade para ajudar a manter o agente no local pretendido. Os polímeros biocompatíveis, de preferência polímeros biocompatíveis bio-reabsorvíveis (incluindo, e.g., ácido hialurónico, colagénio, polibutirato, polímeros de lactido e glicolido e copolímeros de lactido/glicolido) podem ser excipientes úteis para controlar a administração do agente in vivo. As formulações para administração parentérica podem incluir glicolato para administração bucal, metoxi-salicilato para administração rectal ou ácido cútrico para administração vaginal. Os supositórios para administração rectal podem ser preparados misturando uma preparação de α-Gal A com um excipiente não irritante como seja manteiga de cacau ou outras composições que sejam sólidas à temperatura ambiente e líquidas à temperatura do corpo.

As formulações para administração por inalação podem conter lactose e outros excipientes ou podem ser soluções aquosas que podem conter éter de polioxietileno-9-laurilo, glicocolato ou desoxicocolato. Um aerossol para inalação preferido caracteriza-se por ter partículas de baixa densidade e grande tamanho. As partículas com densidades de massa inferiores a 0,4 gramas por centímetro cúbico e diâmetros médios excedendo 5 μιη entregam eficientemente os fármacos inalados na circulação sistémica. Tais 68 ΡΕ2186902 partículas são profundamente inspiradas para os pulmões e escapam aos mecanismos de eliminação natural pelos pulmões até as partículas inaladas libertarem a sua carga útil terapêutica. (Edwards et al., Science 276:1868-1872 (1997)). As preparações de α-Gal A da presente invenção podem ser administradas na forma de aerossol, por exemplo usando métodos de preparação e formulações como descrito nas Patentes U.S. 5654007, 5780014 e 5814607. A formulação para administração intranasal pode incluir soluções oleosas para administração na forma de gotas nasais ou como um gel a ser aplicado por via intranasal.

As formulações para administração tópica na superfície da pele podem ser preparadas através da dispersão da preparação de α-Gal A com um veículo derma-tologicamente aceitável, como seja uma loção, creme, pomada ou sabão. São particularmente úteis os veículos capazes de formar um filme ou camada sobre a pele para localizar a aplicação e inibir a remoção. Para a administração tópica nas superfícies dos tecidos internos, a preparação de a-Gal A pode ser dispersa num adesivo de tecido líquido ou outra substância que aumente a adsorção a uma superfície do tecido. Por exemplo, vários adesivos das mucosas e comprimidos bucais foram descritos para administração trans-mucosal de fármacos, como seja nas Patentes U.S. 4740365, 4764378 e 5780045. Podem igualmente ser incorporadas soluções de hidroxipropilcelulose ou de fibrinogénio/trom-bina. Como alternativa, podem ser usadas soluções de revestimento de tecidos, como seja formulação contendo 69 ΡΕ2186902 pectina. AS preparações podem ser acondicionadas em recipientes adequados para a manutenção da esterilidade, protecção da actividade dos ingredientes activos durante a distribuição e armazenamento adequados e conferindo acessibilidade conveniente e efectiva da preparação para administração a um doente. Uma formulação injectável de uma preparação de α-Gal A deve ser acondicionada num recipiente fechado adequado à remoção do conteúdo usando uma agulha e seringa. 0 recipiente destinar-se-á a ser usado uma única vez ou várias vezes. A preparação pode também ser fornecida como uma seringa pré-cheia. Nalguns casos, os conteúdos serão fornecidos como formulação liquida, enquanto que noutros serão fornecidos num estado seco ou liofilizado que, nalguns casos, necessitará de reconstituição com um diluente, convencional ou fornecido, para ficar num estado liquido. Quando a preparação é fornecida como liquido para administração intravenosa, deverá ser fornecida num saco ou recipiente estéril adequado para a ligação a uma linha ou cateter de administração intravenosa. Nas realizações preferidas, as preparações do invento são fornecidas em formulações liquidas ou em pó, em dispositivos que convenientemente administram uma dose pré-determinada da preparação; exemplos de tais dispositivos incluem um injector sem agulha para injecção subcutânea ou intramuscular, e um sistema de libertação de aerossol com medição. Noutros casos, a preparação pode ser fornecida numa forma adequada para a libertação controlada, como seja num penso ou 70 ΡΕ2186902 compressa a ser aplicado na pele para administração transdérmica ou através de sistemas degradáveis para a administração transmucosal. Nos casos em que a preparação é administrada oralmente na forma de comprimido ou pílula, a preparação deverá ser fornecida num frasco com uma tampa removível. Os recipientes podem ser rotulados com informação relativa, por exemplo, ao tipo de preparação, nome do Fabricante ou distribuidor, indicações, dosagem sugerida, instruções para correcto armazenamento ou instruções para administração.

Dosagens para administração da preparação de α-Gal A

Ainda, proporcionamos métodos para administração de uma preparação de α-Gal A a um doente com doença de Fabry, variante atípica da doença de Fabry ou qualquer condição em que um nível reduzido ou forma mutante de a-Gal A esteja presente. A dose de administração é, preferencialmente, 0,05-5,0 mg, mais de preferência, entre 0,1-0,3 mg da preparação de α-Gal A por quilograma de peso de corpo e é administrada semanalmente ou cada duas semanas. Numa realização preferida, uma dose de aproxi-madamente 0,2 mg/Kg é administrada cada duas semanas. As dosajens repetidas regularmente da proteína são necessárias ao longo da vida do doente. As injecções subcutâneas podem ser usadas para manter exposição sistémica, a longo prazo, ao fármaco. A dosagem subcutânea pode ser entre 0,01 e 10,0 mg, de preferência 0,1 a 5,0 mg, da preparação de α-Gal A por kg de peso de corpo, cada duas semanas ou semanalmente. 71 ΡΕ2186902

As dosagens das preparações de α-Gal A que são administradas através de injecções intramusculares podem ser as mesmas ou diferentes das injectadas subcutaneamente; numa realização preferida, as dosagens intramusculares são mais pequenas e administradas menos frequentemente. A preparação de α-Gal A pode também ser administrada intravenosamente, e.g., numa injecção de bólus intravenoso, numa injecção intravenosa lenta ou através de injecção intravenosa continua. A infusão iv continua (e.g., ao longo de 2-6 horas) permite a manutenção de níveis específicos no sangue.

Um método alternativo preferido para a administração de uma preparação de α-Gal A a um doente envolve a administração de uma dose preferida de uma preparação de α-Gal A semanalmente ou cada duas semanas durante um período de vários anos, e.g., até três anos, durante o qual o doente é monitorizado clinicamente para avaliar a situação da sua doença. A medição dos progressos clínicos através, por exemplo, da melhoria da função renal ou cardíaca ou do bem-estar geral do doente (e.g., dor) e os progressos laboratoriais medidos, por exemplo, através de reduções dos níveis de CTH na urina, plasma ou tecidos, podem ser usados para avaliar o estado de saúde do doente. No caso do progresso clínico ser observado após este período de tratamento e de monitorização, a frequência de administração de α-Gal A pode ser reduzida. Por exemplo, um doente que receba injecções semanais de uma preparação de α-Gal A pode mudar para injecções bissemanais. Como 72 ΡΕ2186902 alternativa, um doente que receba injecções bissemanais de uma preparação de α-Gal A pode mudar para injecções mensais. Após tal alteração na frequência de dosaqem, o doente deverá ser monitorizado durante mais alguns anos, e.g., um período de três anos, para avaliar parâmetros clínicos e laboratoriais relacionados com a doença de Fabry. Numa realização preferida, a dose administrada não é alterada se for feita uma mudança na frequência de dosagem. Isto assegura que determinados parâmetros farmacocinéticos (e.g., concentração máxima no plasma [Cmax] , tempo até à concentração máxima no plasma [Tmax] , semi-vida [11/2] e exposição conforme medido pela área sob a curva [AUC]) permanecem relativamente constantes após cada dose administrada. A manutenção destes parâmetros farmacocinéticos resultará em níveis relativamente constantes de incorporação de α-Gal A mediada por receptor pelos tecidos à medida que muda as frequências de dose.

Um doente com variante atípica da doença de Fabry, e.g., apresentando predominantemente anormalidades cardiovasculares ou envolvimento renal, é tratado com estes mesmos regimes de dosagem, i.e., entre 0,05 mg/kg a 5 mg/kg semanalmente ou bissemanalmente. A dose é ajustada conforme necessário. Por exemplo, um doente com o fenótipo da variante cardíaca que seja tratado com terapia de substituição com a enzima α-galactosidase A terá uma alteração na composição do seu coração e melhor função cardíaca após terapia. Esta alteração pode ser medida com ecocardiografia convencional, a qual é capaz de detectar o aumento da 73 ΡΕ2186902 espessura da parede ventricular esquerda em doentes com doença de Fabry (Goldman et al., J. Am. Coll. Cardiol 7:1157-1161 (1986)). Medições ecocardiográficas seriadas da espessura da parede ventricular esquerda serão realizadas durante a terapia e um decréscimo no tamanho da parede ventricular é indicativo de uma resposta terapêutica. Os doentes em terapia de substituição com a enzima α-Gal A podem também ser seguidos com imagiologia de ressonância magnética cardiaca (MRI). MRI tem a capacidade de avaliar a composição relativa de um determinado tecido. Por exemplo, MRI cardiaca em doentes com doença de Fabry revela lípidos depositados dentro do miocárdio comparativamente com doentes testemunha (Matsui et al., Am. Heart J 117:472-474 (1989)). As avaliações seriadas por MRI cardiaca, num doente em terapia de substituição com enzimas, podem revelar uma alteração no depósito de lipidos no coração de um doente. Os doentes com o fenótipo da variante renal podem também beneficiar da terapia de substituição com a α-galactosidase A. 0 efeito da terapia pode ser medido por testes convencionais da função renal, como seja o nivel da proteína na urina de 24 horas, a eliminação de creatinina e a velocidade de filtração glomerular. Os exemplos que seguem são apresentados para melhor ilustrar as realizações preferidas do invento.

Exemplo 1 Preparação e utilização de construções projec-tadas para administrar e expressar α-Gal A

Foram construídos dois plasmídeos de expressão, - 74 - ΡΕ2186902 pXAG-16 e pXAG-28. Estes plasmídeos possuem um cDNA de a-Gal A humana, codificador de 398 aminoácidos da enzima a-Gal A (sem o péptido sinal de α-Gal A) ; a sequência de DNA genómico do péptido sinal da hormona de crescimento humana (hGH), que é interrompida pelo primeiro intrão do gene de hGH; e a sequência não traduzida (UTS) 3' do gene de hGH, a qual possui um sinal de poliadenilação. 0 plasmídeo pXAG-16 possui o promotor precoce imediato de citomegalovirus humano (CMV IE) e o primeiro intrão (flanqueado por sequências de exão não codificadoras) , enquanto que pXAG-28 é controlado pelo promotor e exão 1 de colagénio Ia2 e também contem a UTS5' do gene da β-actina, que contem o primeiro intrão do gene da β-açcão. 1.1 Clonagem do cDNA completo de α-Gal A e construção do plasmídeo de expressão de α-Gal A, pXAG-16 0 cDNA de α-Gal A humano foi clonado a partir de uma biblioteca de cDNA de fibroblastos humanos que foi construída como se segue. mRNA poli-A+ foi isolado a partir de RNA total e a síntese de cDNA foi realizada usando reagentes para o sistema lambda ZapII® de acordo com as instruções do Fabricante (Stratagene Inc., LaJolla, CA). Resumidamente, a "primeira cadeia" do cDNA foi gerado por transcrição reversa na presença de uma sequência iniciadora oligo-dT contendo um local interno da endonuclease de restrição Xhol. Após tratamento com RNase Η, o cDNA foi sujeito a translação de corte ("nick-translated") com DNA-polimerase I para gerar cDNA de cadeia dupla. Este cDNA foi 75 ΡΕ2186902 dotado de extremos cerses com DNA-polimerase de T4 e ligado a adaptadores EcoRI. Os produtos desta ligação foram tratados com DNA-cinase de T4 e digerido com Xhol. 0 cDNA foi fraccionado por cromatografia em Sephacryl®-400. As fracções de tamanhos grandes e médios foram reunidas e os cDNAs ligados aos braços de Lambda ZapII digeridos com Xhol. Os produtos desta ligação foram então encapsidados e titulados. A biblioteca primária tinha um titulo de 1,2 x 107 pfu/ml e um tamanho médio do inserto de 925 pb.

Uma sonda de 210 pb do exão 7 do gene de α-Gal A humano (FIG. 1, SEQ ID NO:l) foi usada para isolar o cDNA. A própria sonda foi isolada a partir do DNA genómico por reacção em cadeia com polimerase (PCR) usando os seguintes oligonucleótidos: 5'-CTGGGCTGTAGCTATGATAAA-3' (Oligo 1; SEQ ID NO:6) e 5'-TCTAGCTGAAGCAAAACAGTG-3' (Oligo 2; SEQ ID NO:7). O produto de PCR foi então usado na triagem da biblioteca de cDNA de fibroblastos e os clones positivos foram isolados e caracterizados. Um clone positivo, fago 3A, foi sujeito ao protocolo de excisão do sistema lambda ZapII® (Stratagene, Inc., LaJolla, CA), de acordo com as instruções do Fabricante. Este procedimento deu origem ao plasmideo pBSAG3A, o qual contem a sequência de cDNA de α-Gal A na estrutura do plasmideo pBluescriptSK-™. A sequenciação de DNA revelou que este plasmideo não possui o extremo 5' completo da sequência de cDNA. Assim, o extremo 5' foi reconstruído

usando um fragmento de PCR amplificado a partir de DNA genómico humano. Para conseguir isto, um fragmento de DNA 76 ΡΕ2186902 genómico de 268 pb (FIG. 2, SEQ ID NO:2) foi amplificado usando os seguintes oligonucleótidos: 5' -ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-3' (Oligo 3; SEQ ID NO: 8) e 5'-TGATGCAGGAATCTGGCTCT-3' (Oligo 4; SEQ ID N0:9). Este fragmento foi subclonado num plasmídeo de clonagem "TA" (Invitrogen Corp., San Diego, CA) para gerar o plasmideo pTAAGEI. 0 plasmídeo pBSAG3A, que contem a maioria da sequência de cDNA de α-Gal A e pTAAGEI, contem o extremo 5' do cDNA de α-Gal A, foram digeridos com SacII e Ncol. As posições dos locais relevantes SacII e Ncol dentro do fragmento amplificado estão apresentadas na FIG.2. O fragmento SacII-Ncol de 0,2 Kb de pTAAGEI foi isolado e ligado a pBSAG3A digerido de forma equivalente. Este plasmídeo, pAGAL, contem a sequência de cDNA completa de α-Gal A, incluindo a sequência codificadora do péptido sinal de α-Gal A. O cDNA foi totalmente sequenciado (apresentado na FIG. 3 incluindo o péptido sinal de a-Gal A; SEQ ID NO:3) e encontrou-se ser idêntico à sequência publicada para o cDNA de α-Gal A humana (GenBank sequência HUMGALA). 0 plasmídeo pXAG-16 foi construído através de vários intermediários, como se segue. Primeiro, pAGAL foi digerido com SacII e Xhol e dotado de extremos cerses. Segundo, os extremos do cDNA completo de α-Gal A foram ligados a adaptadores Xbal e subclonados em pEF-BOS digerido com Xbal (Mizushima et al., Nucl. Acids Res. 18:5322, 1990), criando pXAG-1. Esta construção possui a UTS 3' do factor estimulador de colónias de granulócitos humano (G-CSF) e o promotor do factor de elongação humano 77 ΡΕ2186902 la (EF-la) flanqueando o cDNA codificador de α-Gal A mais o péptido sinal de α-Gal A, de forma que o extremo 5' do cDNA de α-Gal A fica fundido com o promotor de EF-la. Para criar uma construção com o promotor IE de CMV e o primeiro intrão, o cDNA de α-Gal A e a UTS 3' de G-CSF foram removidos de pXAG-1 como um fragmento Xbal-BamHI de 2 Kb. 0 fragmento foi dotado de extremos cerses, ligado aos adaptadores BamHI e inserido em pCMVflpNeo digerido com BamHI (que foi construido como descrito abaixo) . A orientação foi de forma a que o extremo 5' do cDNA de a-Gal A ficasse fundido com a região do promotor IE de CMV. pCMVflpNeo foi criado como se segue. Um fragmento do promotor do IE de CMV foi amplificado por PCR usando DNA genómico de CMV como matriz e os oligonucleótidos: 5'-TTTTGGATCCCTCGAGGACATTGATTATTGACTAG-3' (SEQ ID NO:10) e 5'-TTTTGGATCCCGTGTCAAGGACGGTGAC-3' (SEQ ID NO:ll). O produto resultante (um fragmento de 1,6 Kb) foi digerido com BamHI, dando um fragmento contendo o promotor de CMV com extremos coesivos BamHI. A unidade de expressão neo foi isolada a partir do plasmideo pMClneopA (Stratagene Inc., La Jolla, CA) como um fragmento Xhol-BamHI de 1,1 Kb. Os fragmentos contendo o promotor de CMV e neo foram inseridos num plasmideo digerido com BamHI e Xhol (pUC12). Notavelmente, pCMVflpNeo possui a região do promotor IE de CMV, começando no nucleótido 546 e terminando no nucleótido 2105 (da sequência GenBank HS5MIEP) e o gene de resistência da neomicina dirigido pelo promotor da timidina cinase do virus Herpes simples (HSV) (o gene Tkneo) imediatamente 5' 78 ΡΕ2186902 relativamente ao fragmento do promotor IE de CMV. A direcção da transcrição do gene neo é a mesma do fragmento do promotor de CMV. Esta construção intermediária foi designada pXAG-4.

Para adicionar a UTS 3' de hGH, a UTS 3' de GCSF foi removida de pXAG-4 como um fragmento Xbal-Smal e os extremos de pXAG-4 foram dotados de extremos cerses. A UTS 3' de hGH foi removida de pXGH5 (Selden et al., Mol. Cell. Biol. 6:3173-3179, 1986) como um fragmento Smal-EcoRI de 0,6 Kb. Após dotar este fragmento de extremos cerses, ligou-se a pXAG-4 imediatamente após o local Xbal cerse de pXAG-4. Este intermediário foi designado pXAG-7. O fragmento Tkneo foi removido deste plasmídeo como um fragmento HindIII-Clal e os extremos do plasmídeo foram tornados cerses por preenchimento com o fragmento Klenow da DNA-polimerase I. Um gene de resistência à neomicina dirigido pelo promotor precoce de SV40 foi ligado como um fragmento Clal-BsmBI cerse derivado da digestão de pcDNeo (Chen et al., Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752, 1987), colocando a unidade de transcrição neo na mesma orientação da unidade de transcrição α-Gal A. Este intermediário foi designado pXAG-13.

Para completar pXAG-16, que tem o péptido sinal de hGH de 2 6 aminoácidos e o primeiro intrão do gene hGH, um fragmento EcoRI-BamHI de 2,0 Kb de pXAG-13 foi primeiro removido. Este fragmento incluia o cDNA de α-Gal A e a UTS 3' de hGH. Este fragmento grande foi substituído com 3 79 ΡΕ2186902 fragmentos. 0 primeiro fragmento consistiu num produto de PCR de 0,3 Kb de pXGH5 que contem a sequência codificadora do péptido sinal de hGH e inclui a sequência do primeiro intrão de hGH, desde um local BamHI sintético imediatamente a jusante da sequência de consenso Kozak até ao extremo da sequência codificadora do péptido sinal de hGH. Os seguintes oligonucleótidos foram usados para amplificar este fragmento (Fragmento 1): 5'-TTTTGGATCCACCATGGCTA-3' (Oligo HGH 101; SEQ ID NO:12) e 5'-TTTTGCCGGCACTGCCCTCTTGAA-3' (Oligo HGH102; SEQ ID NO:13). O segundo fragmento consistiu num produto de PCR de 0,27 Kb contendo sequências correspondendo ao inicio do cDNA codificador da enzima a-Gal A de 398 aminoácidos (i.e., sem o péptido sinal de a-Gal A) até ao local Nhel. Os oligonucleótidos que se seguem foram usados para amplificar este fragmento (Fragmento 2): 5'-TTTTCAGCTGGACAATGGATTGGC-3' (Oligo AG10; SEQ ID NO:14) e 5'-TTTTGCTAGCTGGCGAATCC-3' (Oligo AG11; SEQ ID NO:15). O terceiro fragmento consistiu no fragmento Nhel-EcoRI de pXAG-7 contendo a restante sequência de α-Gal A assim como a UTS 3' de hGH (Fragmento 3). O Fragmento 1 (digerido com BamHI e Nael), o Fragmento 2 (digerido com PvuII e Nhel) e o Fragmento 3 foram misturados com o fragmento BamHI-EcoRI de 6,5 Kb de pXAG-13, contendo o gene neo e o promotor IE de CMV, e ligados para gerar o plasmídeo pXAG-16 (FIG. 4). 1.2 Construção do plasmídeo de expressão α-Gal A, pXAG-28 O promotor do colagénio Ia2 humano foi isolado 80 ΡΕ2186902 para usar na construção de expressão de α-Gal A, pXAG-28, como se segue. Um fragmento de PCR de 408 pb de DNA genómico humano contendo parte do promotor de colagénio Ia2 humano foi isolado usando os seguintes oligonu-cleótidos: 5._TTTTGGATCCGTGTCCCATAGTGTTTCCAA_3, (Oligo 72; SEQ ID NO:16) e 5'-TTTTGGATCCGCAGTCGTGGCCAGTACC-3' (Oligo 73; SEQ ID NO:17) .

Este fragmento foi usado para a triagem de uma biblioteca de leucócitos humanos em EMBL3 (Clontech Inc.,

Paio Alto , CA). Um clone positivo (fago 7H) contendo um fragmento de EcoRI de 3,8 Kb foi isolado e clonado em pBSIISKf (Stratagene Inc., La Jolla, CA) no local EcoRI (criando pBS/7H.2). Um local Avrll foi introduzido em pBSIISK+ por digestão com Spel, o qual cliva no poli-adaptador de pBSIISKf, preenchimento com o fragmento Klenow da DNA-polimerase I e inserção do oligonucleótido 5'-CTAGTCCTAGGA-3' (SEQ ID NO:18). Esta variante de pBSIISK+ foi digerida com BamHI e Avrll e ligada ao fragmento BamHI-Avrll de 121 pb do fragmento de PCR do promotor de colagénio Ia2 descrito atrás, criando pBS/121COL.6. 0 plasmideo pBS/121COL.6 foi digerido com Xbal, a qual cliva no poli-adaptador de pBSIISKf, preenchido com o fragmento Klenow da DNA-polimerase I e digerido com Avrll. 81 ΡΕ2186902 O fragmento BamHI-AvrlI de 3,8 Kb de pBS/7H.2 foi isolado e o local BamHI dotado de extremos cerses por tratamento com a enzima Klenow. 0 fragmento foi então digerido com Avrll e ligado ao vector digerido com Avrll, criando assim o plasmideo pBS/121pbCOL7H.18 com o promotor do colagénio.

Em seguida, o promotor do colagénio foi fundido com a UTS 5' do gene da β-acção humano, o qual possui o primeiro intrão do gene da β-acção humano. Para isolar esta sequência, um fragmento de PCR de 2 Kb foi isolado a partir de DNA genómico humano usando os seguintes oligonu-cleótidos: 5'-TTTTGAGCACAGAGCCTCGCCT-3' (Oligo BA1; SEQ ID NO:19) e 5'-TTTTGGATCCGGTGAGCTGCGAGAATAGCC-3' (Oligo BA2; SEQ ID NO:20).

Este fragmento foi digerido com BamHI e BsiHKAI para libertar um fragmento de 0,8 Kb contendo a UTS 5' de β-acção e intrão. Um fragmento SalI-SfrI de 3,6 Kb foi então isolado a partir do plasmideo contendo o promotor do colagénio, pBS/12lpbCOL7H.18 como se segue. pBS/121pbCOL7H.18 foi parcialmente digerido com BamHI (o local BamHI situa-se no extremo 5' do fragmento do promotor do colagénio Ia2), foi dotado de extremos cerses por tratamento com o fragmento Klenow e ligado ao adaptador Sall (5'-GGTCGACC-3')/ colocando assim um local Sall a montante do promotor do colagénio Ia2. Este plasmideo foi então digerido com 82 ΡΕ2186902

Sall e Sefl (o local Srfl situa-se 110 pb a montante do local CAP do promotor de colagénio Ia2) e o fragmento de 3,6 Kb foi isolado. Os fragmentos de 0,8 e 3,6 Kb foram combinados com pBSIISK- digerido com Sall e BamHI (Stratagene Inc., La Jolla, CA) e um fragmento composto pelos quatro oligonucleótidos que se seguem emparelhados uns com os outros (formando um fragmento com um extremo cerse e um extremo BsiHKAI): 5' “GGGCCCCCAGCCCC AQCCCT CC CATTGGTGQ A.GGCCCTTTT QGAG GC AC CCTAGGGCCA.GGAAACTTTTGCCGTAT-3’ (Oligo COL-1; SEQID NO:21), 5UAAATAGGGCAGATCCCGGCTTTATTATTTTAGCACCACG6CCGCCGAGA CCGCGTCCGCCCCGCGAGCA^ (Oligo COL-2; SEQ ID NO:22>, 5t^(XCTÀTTTATACGGCAAAAOTIl!CCTGOC€CTA<sGGTGCCrCCAAAAG GGC CTCCACCÂÀTGCjGAGGGCTGGGGGFGGGGGCCCd^ (Oligo OOL-3; SEQ Φ e CGGATCA' (Oligo COL 4; SEQ ID HO:24).

Estes quatro oligonucleótidos, quando emparelhados, correspondem à região que começa no local Srfl do promotor do colagénio e continuam através do local BsiHKAI do promotor da β-actina. O plasmideo resultante foi designado pCOL/p-actina.

Para completar a construção de pXAG-28, foi isolado o fragmento SalI-BamHI de pCOL/p-actina, contendo o promotor Ia2 do colagénio e a UTS 5' da β-actina. Este 83 ΡΕ2186902 fragmento foi ligado a dois fragmentos de pXAG-Ιβ (ver

Exemplo 1.1 e FIG. 4) : (1) o fragmento BamHI de 6,0 Kb

(contendo o gene neo, estrutura do plasmídeo, o cDNA codificador de 398 aminoácidos da enzima α-Gal A e a UTS 3' de hGH) ; e (2) o fragmento BamHI-Xhol de 0,3 Kb (que possui a sequência poli A de SV40 derivada de pcDneo) . pXAG-28 contem o promotor do colagénio Ia2 fundido com a UTS5' de β-actina humana, o péptido sinal de hGH (o qual é interrompido pelo primeiro intrão de hGH), o cDNA codificador da enzima α-Gal A e a UTS3' de hGH. Na FIG. 5 está apresentado um mapa da construção de expressão completa pXAG-28.

1.3 Transfecção e selecção de fibroblastos electroporados com os plasmideos de expressão de α-Gal A

Para expressar α-Gal A em fibroblastos, fibroblastos secundários foram cultivados e transfectados de acordo com procedimentos publicados /Selden et al., WO 93/09222) .

Os plasmideos pXAG-13, pXAG-16 e pXAG-28 foram transfectados por electroporação para fibroblastos de prepúcio humano para gerar estirpes de células clonais estavelmente transfectadas e os niveis de expressão de a-Gal A resultantes foram monitorizados como descrito no Exemplo 1.4. A secreção de α-Gal A pelos fibroblastos de prepúcio normais está na gama de 2-10 unidades/106 células/24 horas. Pelo contrário, os fibroblastos trans- 84 ΡΕ2186902 fectados apresentaram níveis de expressão médios como se mostra na Tabela 2.

Tabela 2 Níveis médios de expressão de α-Gal A (± desvio padrão) pXAG-13: 420 ± 344 U/106 células/dia N = 26 estirpes clonais (gama 3-1133 U/106 células/dia) pXAG-16: 2,051 ± 1253 U/106 células/dia N = 24 estirpes clonais (gama 422-5200 U/106 células/dia) pXAG-28: 141 ± 131 U/106 células/dia N = 38 estirpes clonais (gama 20-616 U/106 células/dia)

Estes dados mostram que as três construções de expressão são capazes de aumentar a expressão de α-Gal A muitas vezes relativamente aos fibroblastos não transfe-ctados. A expressão pelos fibroblastos estavelmente trans-fectados com pXAG-13, que codifica α-Gal A ligada ao péptido sinal de α-Gal A, foi substancialmente inferior à expressão de fibroblastos transfectados com pXAG-16, que difere apenas no péptido sinal ser o péptido sinal de hGH, a sequência codificadora do qual está interrompida pelo primeiro intrão do gene hGH. 85 ΡΕ2186902

Cada vez que as células transfectadas foram passadas, a actividade de α-Gal A secretada foi determinada, as células foram contadas e a densidade celular foi calculada. Com base no número de células colhidas e no tempo de secreção de α-Gal A, a taxa de expressão especifica de α-Gal A foi determinada e está descrita nas Tabelas 3 e 4 como unidades secretadas (de α-Gal A) por 106 células, num período de 24 horas. As estirpes celulares desejáveis para terapia génica ou para usar na geração de material para purificação de α-Gal A deverão apresentar crescimento e expressão estáveis ao longo de várias passagens. Os dados das estirpes celulares apresentados nas Tabelas 3 e 4, que foram estavelmente transfectadas com a construção de expressão de α-Gal A, pXAG-16, ilustram o facto de a expressão de α-Gal A ser estavelmente mantida durante a passagem seriada.

Tabela 3

Crescimento e expressão de células BRS-11 contendo a construção de expressão de α-Gal A, pXAG-16 Passagem Expressão Densidade celular (unidades/106 (células/cm2) _células/24 hr)_ 13 2601 4,80 x 104 14 1616 4,40 x 104 15 3595 4,40 x 104 86 ΡΕ2186902

Tabela 4

Crescimento e expressão de células HF503-242 contendo a construção de expressão de α-Gal A, pXAG-16 Passagem Expressão Densidade celular (unidades/106 (células/cm2) células/24 hr) 5 4069 2,80 x 10 6 7585 3, 55 x 10 7 5034 2,48 x 10

1.4 Quantificação da expressão de α-Gal A A actividade de α-Gal A foi medida usando o substrato solúvel em água 4-metilumbeliferil-a-D-galacto-piranósido (4-MUF-gal; Research Products, Inc.) através de uma modificação do protocolo descrito por Ionnou et al., J. Cell Biol. 119:1137-1150 (1992). 0 substrato foi dissolvido em tampão de substrato (citrato-fosfato 0,1M, pH 4,6) para uma concentração de 1,69 mg/ml (5 mM) . Tipicamente, 10 ml de sobrenadante de cultura foram adicionados a 75 ml da solução de substrato. Os tubos foram cobertos e deixados a incubar num banho-Maria a 37°C, durante 60 minutos. No final do periodo de incubação, 2 ml de tampão glicina-carbonato (glicina 130 mM, carbonato de sódio 83 mM, a pH 10,6), foram usados para parar a reacção. A fluorescência relativa de cada amostra foi medida usando um fluorimetro modelo TK0100 (Hoefer Scientific Instruments) que tem um comprimento de onda de excitação fixo de 365 nm e detecta um comprimento de onda fixo de 4 60 nm. As leituras das 87 ΡΕ2186902 amostras foram comparadas com padrões preparados a partir de um stock lmM de metilumbeliferona (Sigma Chemical Co.) e calculada a quantidade de substrato hidrolizada. A activi-dade de α-Gal A é expressa em unidades; uma unidade de actividade de α-Gal A é equivalente a uma nanomole de substrato hidrolisado por hora a 37°C. Os dados de expressão celular foram geralmente expressos como unidades de actividade de α-Gal A secretada/106 células/24 horas. Este ensaio foi igualmente usado para medir a quantidade de actividade α-Gal A em lisados celulares e em amostras de vários passos de purificação de α-Gal A, como discutido abaixo. 1.5 Preparação de α-Gal A como gene activado (GA-GAL) A produção de α-Gal A como gene activado (GA-GAL) ocorreu por inserção de sequências de DNA reguladoras e estruturais a montante da sequência codificadora de a-Gal A humana, usando a tecnologia GA substancialmente como descrito na Patente U.S. 5733761, aqui incluído como referência. A inserção precisa da sequência activadora do gene ocorre como resultado de recombinação homóloga entre DNA presente num fragmento de DNA testado e sequências de DNA genómicas a montante do locus de α-Gal A numa célula humana. A sequência de activação do gene contem ela própria a sequência codificadora de α-Gal A até ao local de clivagem do péptido sinal mas não o incluindo. As células possuidoras de um locus α-Gal A activado foram isoladas e 88 ΡΕ2186902 sujeitas a selecção com drogas para isolar células com maior produção de GA-GAL.

Um fragmento de DNA de transferência contendo uma sequência activadora de gene adequada foi introduzido em linhas celulares hospedeiras humanas por electroporação. Uma dessas linhas é HT-1080, uma linha celular certificada que pode ser adquirida à ATCC (Rockville, Maryland) . 0 plasmídeo de activação do gene (construção de transferência) pGA213C contendo tal fragmento de DNA está apresentado na FIG.9. Este plasmídeo possui sequências projectadas para activar uma porção do locus α-Gal A endógeno na linha celular hospedeira e possui sequências codificadoras do péptido sinal, mas não α-Gal A humana. A construção de transferência também contem cassetes de expressão para o gene neo bacteriano e para o gene dhfr de ratinho. Estes permitem a selecção de fragmentos de transferência estavelmente integrados (através do gene neo) e subsequente selecção do gene dhfr usando a selecção gradual com metotrexato (MTX).

Ainda, pGAG213C possui sequências destinadas a atingir sequências cromossómicas a montante do locus a-Gal A endógeno através de recombinação homóloga. A recombinação homóloga entre o locus α-Gal A endógeno e o fragmento de DNA de 9,6 Kb de pGA213C está apresentada na FIG. 10. pGA213C foi construído para eliminar 962 pb de sequências genómicas estendendo-se entre as posições -1183 89 ΡΕ2186902 e -222 relativamente ao codão de iniciação da metionina de α-Gal A, quando da recombinação homóloga do fragmento pGA213C com o locus α-Gal A do cromossoma X. A activação da transcrição do locus α-Gal A ocorre através da transferência precisa das sequências reguladoras exógenas a montante da região codificadora de α-Gal A. O locus α-Gal A resultante faz com que a transcrição se inicie a partir do promotor de CMV e prossiga através do exão 1 de CMV, do intrão da aldolase e de sete exões e seis intrões da sequência codificadora de α-Gal A. O processamento do mRNA precursor grande liga o exão de CMV (inserido por recombinação) ao primeiro exão completo endógeno do transcrito de α-Gal A. A tradução do mRNA de GA-GAL resulta em pré-GA-GAL com um péptido sinal de trinta e um aminoácidos. Quando da secreção pela célula hospedeira, o péptido sinal é removido. Linhas celulares trasnfectadas e e recombinantes são primeiro identificadas por reacção em cadeia da polimerase para detectar a presença de mRNA de GA-GAL. Também se observou que os clones produtores do mRNA de GA-GAL secretam α-Gal A enzimaticamente activa para o meio de cultura. A subsequente confirmação dos casos de recombinação é conseguido por digestão de restrição e análise de hibridação do DNA genómico em membrana Southern.

As células foram expostas gradualmente a selecção com metotrexato ("MTX") . Após selecção em MTX 0,05 μΜ, um clone de células foi isolado e sujeito a selecção com MTX 0,1 μΜ. Através deste processo foi isolado, expandido e cultivado um conjunto de células resistente a MTX 0,1 μΜ (linha celular RAG001). 90 ΡΕ2186902

Exemplo 2 Purificação de α-Gal A

Segue-se um método preferido para a produção, purificação e ensaio de α-Gal A. 0 processo de purificação mantém α-Gal A numa forma nativa, activa e solúvel ao longo do processo de purificação. A proteina não é exposta a condições extremas de pH, solventes orgânicos ou detergentes, não é clivada proteoliticamente durante o processo de purificação e não forma agregados. 0 processo de purificação é projectado para não alterar a distribuição das glicoformas de α-Gal A.

2.1 Purificação de α-Gal A 0 Exemplo 2.1 ilustra que α-Gal A pode ser purificada até quase à homogeneidade a partir do meio condicionado de estirpes de células humanas em cultura que foram estavelmente transfectadas para produzir a enzima. α-Gal A é isolada a partir do meio contendo α-Gal A usando uma série de cinco passo cromatográficos. Os cinco passos utilizam vários princípios de separação que tiram partido de diferentes propriedades físicas da enzima para separar α-Gal A do material contaminante. Estão incluídos croma-tografia de interacção hidrofóbica em Butyl Sepharose®, interacção iónica em hidroxiapatite, cromatografia de permuta iónica em Q Sepharose® e cromatografia de exclusão por tamanho em Superdex®200. Para além de ser o passo final no processo de purificação, a cromatografia de exclusão por tamanho também serve como um meio eficaz de transferir a 91 ΡΕ2186902 proteína purificada para um tampão compatível com a formulação.

A. Utilização de cromatografia em Butyl Sepharose® como primeiro passo na purificação de a-Gal A

Meio condicionado frio (1,34 litros) foi clarificado por centrifugação e filtrado através de um filtro de acetato de celulose de 0,45 μιη usando pré-filtros de fibra de vidro. Com agitação, o pH do meio frio filtrado foi ajustado a 5, 6 através da adição gota a gota de HC1 IN e adicionou-se sulfato de amónio para uma concentração final de 0, 66M através da adição, gota a gota, de uma solução stock (temperatura ambiente) de sulfato de amónio ultrapuro 3, 9 M. 0 meio foi agitado durante mais 5 minutos a 4°C, filtrado como anteriormente e aplicado a uma coluna de Butyl Sepharose® 4 Fast Flow (81 ml de volume de coluna, 2,5 x 16,5 cm; Pharmacia, Uppsala, Suécia) gue estava equilibrada em MES-Tris 10 mM, pH 5,6, contendo sulfato de amónio 0,66M (tampão A). A cromatografia foi efectuada a 4°C num sistema Gradi-Frac™ (Pharmacia, Uppsala, Suécia) equipado com monitores de UV (280 nm) e de condutividade para avaliar a proteína total e a concentração de sal, respectivamente. Após aplicação da amostra a um fluxo de 10 ml/min, a coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de tampão A. A α-Gal A foi eluída da coluna de Butyl

Sepharose® com 14 volumes de coluna de um gradiente linear do tampão A (contendo sulfato de amónio) até MES-Tris 10 mM, pH 5, 6 (sem sulfato de amónio) . As fracções foram avaliadas relativamente à actividade de α-Gal A pelo 92 ΡΕ2186902 ensaio 4-MUF-gal e as que continham actividade enzimática apreciável foram reunidas. Como se pode ver na Fig. 8 e no resumo da purificação (Tabela 5), este passo remove aproximadamente 99% da proteína contaminante (amostra da pré-coluna = 8,14 g de proteína total; amostra pós-coluna = 0,0638 g de proteína total).

Tabela 5: Purificação de α-Gal A a partir do meio condicionado de fibroblastos humanos estavelmente transfectados

Passo de Volume Actividade Proteína Actividade Grau de Percentagem purificação (ml) α-Gal A total específica purificação de (xlO6 (mg) (x 106 (cumulativo) recuperação Unidades) Unidades/mg) Sobrenadante de 1340 14, 6 8140 0,0018 = 1 = 100 cultura Butyl Sepharose® 417 14,1 63,8 0,221 123 96, 6 Heparin 134 12,1 14, 6 0,829 436 82, 9 Sepharose® Hidroxiapatite 47 9,73 4,46 2,18 1220 66, 6 Q Sepharose® 31, 5 8,91 3,31 2,69 1503 61, 0 Superdex® 200 10 8,58 2, 93 2,2 1634 59, 0

B. Utilização de cromatografia em Heparin Sepharose® como um passo de purificação de g-Gal A

As fracções do pico da coluna de Butyl Sepharose® foram dialisadas, a 4°C,contra (4 litros) de MES-Tris 10 mM, pH 5, 6 (mudado uma vez) . A condutividade do dialisato foi ajustada a 1,0 mMHO, a 4°C, através da adição de H20 ou NaCl, conforme necessário. Em seguida, a amostra foi aplicada numa coluna de Heparin Sepharose® 6 Fast Flow (Pharmacia, Uppsala, Suécia; 29 ml de volume de coluna, 2,5 93 ΡΕ2186902 χ 6 cm) que tinha sido equilibrada em MES-Tris 10 mM, pH 5, 6, contendo NaCl 9 mM (tampão B) . Isto foi efectuado a 4°C, a um fluxo de 10 ml/min. Os monitores de UV (280 nm) e condutividade mediram a proteina total e a concentração salina. Após a amostra ser aplicada, a coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de tampão B seguido de um gradiente linear de 3 volumes de coluna até 8% de tampão C/92% de tampão B (em que o tampão C é MES-Tris 10 mM, pH 5, 6, contendo NaCl 250 mM) e lavagem com 10 volumes de coluna de Tampão C a 8%. Isto foi seguido de eluição de a-Gal A com um gradiente linear de 1,5 volumes de coluna até 2 9% de tampão C e um subsequente gradiente linear de 10 volumes de coluna até 35% de tampão C. As fracções foram testadas relativamente à actividade de α-Gal A e foram reunidas as possuidoras de actividade apreciável.

C. Utilização de cromatografia em hidroxiapatite como um passo de purificação de α-Gal A O conjunto de fracções da coluna de heparina foi filtrado e aplicado directamente numa coluna de Ceramic Hydroxyapatite HC (40 μπι; American International Chemical, Natick, MA; 12 ml de volume de coluna, 1,5 x 6,8 cm) que tinha sido equilibrada em fosfato de sódio 1 mM, pH 6,0 (tampão D) . A cromatografia foi efectuada à temperatura ambiente num Gradi-Frac™/FPLC® System (Pharmacia, Uppsala, Sweden) equipado com monitores de UV (280 nm) e condutividade. Após a amostra ser aplicada (5 ml/min), a coluna foi lavada com 10 volumes de coluna de tampão D. A α-Gal A foi eluida com um gradiente linear de 7 volumes de 94 ΡΕ2186902 coluna até 42% de tampão E/58% de tampão D (em que o tampão E é fosfato de sódio 250 mM, pH 6,0) seguido de um gradiente de 10 volumes de coluna até 52% de tampão E. As fracções foram testadas relativamente à actividade de a-Gal A e as fracções contendo actividade apreciável foram reunidas.

D. Utilização de cromatografia de permuta aniónica em Q Sepharose® como um passo para a purificação de a-Gal A O conjunto de fracções da coluna de hidroxi-apatite foi diluído aproximadamente 1,5 vezes com H20 para uma condutividade final de 3,4-3,6 mMHO à temperatura ambiente. Após filtração, a amostra foi aplicada numa coluna de Q Sepharose® HP (Pharmacia, Uppsala, Sweden; 5,1 ml de volume de coluna, 1,5 x 2,9 cm) equilibrada em 10% de tampão G/90% de tampão F, em que o tampão F é fosfato de sódio 25 M, pH 6,0 e tampão G é fosfato de sódio 25 mM, pH 6,0, NaCl 250 mM. A cromatograf ia foi efectuada à temperatura ambiente num sistema híbrido Gradi-Frac™/FPLC® (Pharmacia, Uppsala Sweden) as concentrações de proteína total e sal foram monitorizadas por monitores. A amostra foi aplicada a um fluxo de 5 ml/min, depois foram efec-tuados os seguintes passos: (1) uma lavagem com 5 volumes de coluna a 10% de tampão G, (2) uma lavagem com 7 volumes de coluna a 12% de tampão G, (3) um gradiente linear de 3 volumes de coluna até 50% de tampão G, (4) um gradiente linear de 10 volumes de coluna até 53% de tampão G, (5) um gradiente de 3 volumes de coluna até 100% de tampão G e (6) 95 ΡΕ2186902 uma lavagem de 10 volumes de coluna a 10 0% de tampão G. A α-Gal A eluiu essencialmente durante os passos 3 e 4. As fracções contendo actividade apreciável foram reunidas (o "conjunto de fracções Q").

E. Utilização de cromatografia de filtração em gel Superdex®-200 como um passo para a purificação de α-Gal A O conjunto de fracções Q foi concentrado até aproximadamente 5 vezes usando unidades de concentração por centrifugação Centriprep®-10 (Amicon, Beverly, MA) e aplicado numa coluna de Superdex® 200 (Pharmacia, Uppsala, Sweden; 189 ml de volume de coluna, 1,6 x 94 cm). A coluna foi equilibrada e eluida com fosfato de sódio 25 mM, pH 6,0, contendo NaCl 150 mM. A cromatograf ia foi realizada num sistema de FPLC® (Pharmacia, Uppsala, Sweden) à temperatura ambiente equipado com um monitor de UV (280 nm) para seguir a eluição da proteina. O volume da amostra aplicada na coluna foi < 2ml., o fluxo foi de 0,5 ml/min e o tamanho da fracção foi de 2 ml. Foram efectuadas múltiplas corridas da coluna; as fracções foram testadas relativamente à actividade de α-Gal A e as fracções contendo actividade apreciável foram reunidas.

As fracções reunidas da coluna Superdex® 200 foram concentradas usando 10 unidades de Centriprep, distribuídas por aliquotas, congeladas rapidamente e guardadas a -80°C durante curtos periodos de tempo. Um sumário deste exemplo de purificação de α-Gal A está 96 ΡΕ2186902 apresentado na Tabela 5. 0 rendimento final de α-Gal A foi de 59% da actividade do material de partida e a actividade especifica do produto purificado foi de 2,92 x 106 unidades/mg de proteína. 0 produto resultante mostrou um elevado nível de pureza após electroforese, em condições redutoras, num gel de 4-15% de SDS-poliacrilamida, que foi subsequentemente corado com prata.

Sumário 0 processo de purificação proporciona α-Gal A com elevado grau de pureza. A maioria da purificação ocorre nos primeiros 2 passos do processo, enquanto que os três passos finais servem optimizar o material removendo os restantes contaminantes presentes em quantidades pequenas. O último passo, cromatografia de exclusão por tamanho em Superdex® 200, também serve para transferir a α-Gal A para tampão compatível com a formulação. 2.2 Tamanho de α-Gal A produzido por células humanas estavelmente transfectadas em cultura

As propriedades estruturais e funcionais de a-Gal A humana purificada foram estudadas. O produto resultante mostrou um elevado de pureza após electroforese em condições redutoras num gel de 4-15% SDS-poliacrilamida, o qual foi subsequentemente corado com prata. A massa molecular de α-Gal A foi estimada por 97 ΡΕ2186902 espectrometria de massa MALDI-TOF. Estes resultados demonstram que a massa molecular do dímero é de 102353 Da, enquanto que a do monómero é de 510002 Da. A massa molecular esperada para o monómero, baseado na composição de aminoácidos, é de 45400 Da. Assim, o teor de açúcar da enzima corresponde a 5600 Da do peso molecular. 2.3 Modificação com açúcares da α-Gal A produzida pelas células humanas estavelmente transfectadas O padrão de glicosilação de α-Gal A produzida de acordo com o invento foi igualmente avaliado. A glicosilação correcta é importante para a actividade óptima in vivo de α-Gal A; α-Gal A expressa em sistemas de não glicosilação é inactiva ou instável. Hantzopolous et al., Gene 57:159 (1987). A glicosilação é igualmente importante para a internalização de α-Gal A nas células alvo pretendidas e afecta a semi-vida em circulação da enzima in vivo. Em cada subunidade de α-Gal A existem quatro locais disponíveis para adição de cadeias de açúcar ligadas a asparagina, dos quais apenas três estão ocupados. Desnick et al.r In THE METABOLIC AND MOLECULAR BASES OF INHERITED DISEASE, (McGraw Hill, New York, 1995) pp 2741-2780.

Uma amostra de α-Gal A produzida por células estavelmente transfectadas foi tratada com neuraminidase, a qual foi isolada a partir de A. urafaciens, (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) para remover o ácido siálico. Esta reacção foi realizada através do tratamento de 5 mg de 98 ΡΕ2186902 α-Gal A, durante a noite, com 10 mU de neuraminidase à temperatura ambiente num volume total de 10 ml de soro fisiológico tamponado com acetato (ABS, acetato de sódio 20 mM, pH 5,2, NaCl 150 mM). α-Gal A purificada produzida por células esta-velmente transfectadas foi também desfosforilada usando fosfatase alcalina (fosfatase alcalina de intestino de vitela, Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), através do tratamento de 5 mg de α-Gal A durante a noite à temperatura ambiente com 15 U de fosfatase alcalina em ABS (pH aumentado para 7,5 com Tris 1M) .

As amostras foram analisadas por SDS-PAGE e/ou focagem isoeléctrica seguido de Western em membrana com anticorpo especifico de α-Gal A. 0 anticorpo usado foi um anticorpo policlonal de coelho anti-péptido, o qual foi produzido usando como imunogénio um péptido representando os aminoácidos 68-81 de α-Gal A. Após transferência da proteina para PVDF (Millipore, Bedford, MA), a membrana foi testada com uma diluição a 1:2000 do anti-soro, em 2,5% de leite em pó desnatado em Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, 0,05% Tween-20). Isto foi seguido da detecção com anticorpos de cabra anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase de rábano silvestre (Organo Technique/Cappella, Durham, NC; diluição a 1:5000) e reagentes do kit de quimioluminescência ECL (Amersham, Arlington Heights, IN). O tratamento de α-Gal A com neuraminidase 99 ΡΕ2186902 seguido de análise por SDS-PAGE resultou numa mudança da massa molecular (aproximadamente 1500-2000 Da ou 4-6 ácidos siálicos/monómero), sugerindo que existe extensa modificação de α-Gal A com ácido siálico. Para referência, a forma plasmática de α-Gal A possui 5-6 resíduos de ácido siálico por monómero e a forma placentária tem 0,5-1,0 resíduos de ácido siálico por monómero. Bishop et al., J. Biol. Chem. 256:1307 (1981).

Um outro método usado para examinar as modificações de ácido siálico e M6P de α-Gal A foi a focagem isoeléctrica (IEF) , em que as amostras foram separadas com base no seu ponto isoeléctrico (pi) e carga global. Assim, seria de esperar que a remoção dos resíduos carregados tais como ácido siálico ou fosfato de α-Gal A alterasse a mobilidade da proteína no sistema de IEF.

Para efectuar a experiência de IEF, as amostras de α-Gal A produzidas de acordo com o invento foram tratadas com neuraminidase e/ou fosfatase alcalina, misturadas a 1:1 com tampão de amostra Novex 2X (com ureia 8M, pH 3,0-7,0) e aplicadas num gel de IEF com ureia 6M (5,5% de poliacrilamida) preparado usando Pharmalyte® (Pharmacia, Uppsala, Suécia; pH 3,0-6,5; Pharmalyte® 4-6,5 e 2,5-5,5, 0,25 ml cada por gel). Padrões de ponto isoeléctrico (Bio-Rad) foram igualmente incluídos. Após electroforese, o gel foi transferido para PVDF e a análise Western realizada como descrito atrás. 100 ΡΕ2186902 O tratamento da enzima com neuraminidase aumentou o pi das três isoformas, indicando que todas apresentavam algum grau de modificação com ácido siálico. Estes dados sugerem que as preparações de α-Gal A produzidas como aqui descrito deverão ter uma semi-vida no plasma desejável, indicando que este material é adequado para utilização farmacológica. Ainda, o tratamento com fosfatase alcalina de α-Gal A tratada com neuraminidase aumenta o pi de uma porção da proteína até aproximadamente 5,0-5,1, indicando que a enzima é portadora de um ou mais resíduos M6P. Esta modificação é necessária para a internalização eficiente de α-Gal A pelas células alvo.

As cadeias de açúcar ligadas em N de α-Gal A foram analisadas por HPLC de permuta iónica (Glyco-Sep C) e marcação do extremo não redutor com o composto fluorescente 2-aminobenzamida (AB) . Os resultados da análise dos AB-glicanos de três preparações separadas de α-Gal A estão resumidos na Tabela 6. As três preparações possuem um número Z superior a 170. Ainda, cerca de 67% dos glicanos estavam silalilados, cerca de 16% dos glicanos estavam fosforilados e menos de 16% eram neutros. Estes resultados são muito favoráveis quando comparados com resultados de trabalhos anteriores. Por exemplo, Desnick et al., (Patente U.S. 5356804) descreveu que cerca de 60% dos glicanos eram neutros, com apenas 11% sialilados. 101 ΡΕ2186902

Tabela 6

Resultados da análise dos AB-glicanos derivados de GA-GAL

Tratamento Número Z % de Neutros % de Mono- % de Di- % de Tri- % de Tetra- Nenhum 170,04 16,83 22,8 39,45 15,34 5,58 Nenhum 177,71 14,22 20,63 44,62 14,3 6,31 Nenhum 171,68 15,81 20,73 43,2 14,33 5,39 Média (n=3) 173,14 15,62 21,39 42,42 14,62 5,76 Neuraminidase 24,36 85,25 5,14 9,61 nd nd Fosfatase alcalina 150,93 23,38 24,47 34,28 13,58 4,29 Percentagem do total Preparações GA.-GAL do Denick et al., Patente presente invento U.S. 5356804 Total de P-glicanos 16,62 24,1 Total de sialilados 67,57 11 Total de neutros 15,62 62,9 (hih-^manose e híbridos)

Na Tabela 7 estão apresentados caracterizações detalhadas das preparações de GA-GAL purificadas

Tabela 7 GA-GAL purificada global

Ensaio 40-173-KH 42-202-KH Actividade específica 2,75 2,80 SDS-PAGE Coomassie 100% 100% SDS-PAGE coloração com prata 99, 6% 100% HPLC em fase reversa 100% 99, 94 Cromatografia de exclusão 0% 0,01% por tamanho Internalização por 123,6% 94,3% fibroblastos de prepúcio 102 ΡΕ2186902

2.4 A\imento da proporção de α-Gal A carregada através do fraccionamento das espécies de α-Gal A

Como discutido atrás, o fraccionamento das glicoformas de α-Gal A pode ocorrer em vários passos no processo de purificação como aqui descrito. No presente exemplo, as glicoformas de α-Gal A foram fraccionadas pelo tamanho e pela carga. É igualmente possível fraccionar a-Gal A através de uma combinação destas ou de outras técnicas cromatográficas como descrito atrás.

Para o fraccionamento de acordo com tamanho das glicoformas de α-Gal A, realizou-se cromatografia de exclusão por tamanho numa coluna de Superdex®200 (Pharmacia, 1,6 cm por 94,1 cm) equilibrada em soro fisiológico tamponado com fosfatos a pH 6. α-Gal A (2,6 mg em 1 ml) foi aplicada na coluna e esta eluída a 0,35 ml/min. As fracções foram colhidas ao longo do perfil de eluição e as fracções compreendendo o pico largo de eluição de α-Gal A foram analisados por SDS-PAGE, depois visualizadas por coloração com prata. As fracções na fase ascendente do pico continham α-Gal A com maior peso molecular e depois, à medida que as fracções continuaram ao longo do pico, o peso molecular aparente da α-Gal A decresceu gradualmente. As fracções de α-Gal A foram então seleccionadas e reunidas para proporcionar a preparação de α-Gal A nas gamas de pesos moleculares pretendidos. 103 ΡΕ2186902

Para o fraccionamento das glicoformas de α-Gal A pela carga, α-Gal A foi fraccionada por cromatografia em Q-Sepharose®. A coluna de Q-Sepharose® (1,5 cm por 9,4 cm) foi equilibrada em fosfato de sódio 20 mM, pH 6,0, contendo NaCl 30 mM e o fluxo foi mantido a 5 ml/min. α-Gal A (130 mg em 166 ml) foi aplicada na coluna, lavada com tampão de equilíbrio, depois eluida com fosfato de sódio 20 mM, pH 6,0, contendo NaCl 130 mM. Para um f raccionamento mais extensivo, pode ser usado um gradiente de eluição (e.g., 10 volumes de coluna) do tampão de equilíbrio até ao tampão de eluição. As fracções foram colhidas ao longo do perfil de eluição e as fracções compreendendo o pico de eluição de α-Gal A foram analisadas por SDS-PAGE, depois visualizadas por coloração com prata. As espécies de peso molecular mais baixo observadas no gel eluiram na lavagem e no lado ascendente do pico, as glicoformas de peso molecular mais elevado eluiram para o final do pico. As espécies de peso molecular mais baixo corresponderam às glicoformas menos carregadas negativamente de α-Gal A, que se ligam menos fortemente à coluna de Q-Sepahrose® carregada positivamente (constituída por uma resina substituída com aminas quaternárias). As espécies de α-Gal A com carga negativa mais elevada eluiram mais tarde no perfil de eluição e tinham um peso molecular mais elevado, conforme analisado por SDS-PAGE. O fraccionamento de acordo com a carga foi confirmado por focagem isoeléctrica das fracções eluídas ou conjuntos de fracções seleccionadas.

Assim, tanto o fraccionamento pelo tamanho como o 104 ΡΕ2186902 fraccionamento pela carga permitiram a selecção de glicoformas de α-Gal A altamente carregadas. 2.5 Internalização de α-Gal A mediada por manose ou manose-6-fosfato (M6P)

Para a α-Gal A produzida por células estavel-mente transfectadas ser um agente terapêutico eficaz para as deficiências de α-Gal A, a enzima deverá ser internalizada pelas células afectadas. α-Gal A é

minimamente activa em niveis de pH fisiológicos, por exemplo, no sangue ou nos fluidos intersticiais. α-Gal A metaboliza substratos lipidicos acumulados, optimamente apenas quando internalizados no ambiente ácido do lisossoma. Esta internalização é mediada pela ligação de α-Gal A aos receptores de M6P, que são expressos na superfície celular e encaminham a enzima para o lisossoma pela via de endocitose. 0 receptor de M6P é ubíquo; a maior parte das células somáticas expressa em maior ou menor grau M6P. 0 receptor de manose, que é específico para os resíduos de manose expostos nas glicoproteínas, é menos importante. Os receptores de manose são, de um modo geral, encontrados apenas nos macrófagos e em células do tipo macrófago, e proporcionam um meio adicional de entrada de α-Gal A nestes tipos de células.

Para demonstrar a internalização de α-Gal A 105 ΡΕ2186902 mediada por M6P, os fibroblastos da pele de um doente com doença de Fabry (NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository) foram cultivados durante a noite na presença de concentrações crescentes da α-Gal A purificada do invento. Algumas das amostras continham M6P solúvel 5 mM, que competitivamente inibe a ligação ao receptor de M6P e internalização pelo mesmo. Outras amostras continham 30 mg/ml de manano, que inibe a ligação e internalização pelo receptor de manose. Após incubação, as células foram lavadas e colhidas por raspagem para tampão de lise (Tris 10 mM, pH 7,2, NaCl 100 mM, EDTA 5 mM, Pefabloc™ 2 mM (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) e 1% NP-40). As amostras lisadas foram então testadas relativamente à concentração proteica e actividade de α-Gal A. Os resultados são expressos como unidades de actividade de a-Gal A/mg de proteína celular. As células de Fabry internalizaram α-Gal A numa forma dependente de dose. Esta internalização foi inibida por M6P, mas não houve inibição com manano. Assim, a internalização de α-Gal A em fibroblastos de Fabry é mediada pelo receptor de M6P, mas não pelo receptor de manose. α-Gal A é igualmente internalizada in vitro pelas células endoteliais, células alvo importantes para o tratamento da doença de Fabry. Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foram cultivadas durante a noite com 7500 unidades de α-Gal A; alguns dos alvéolos continham M6P. Após o período de incubação, as células 106 ΡΕ2186902 foram colhidas e testadas relativamente a α-Gal A como atrás descrito. As células incubadas com α-Gal A tinham niveis de enzimas quase dez vezes os das células testemunha (sem incubação com α-Gal A). M6P inibiu a acumulação intracelular de α-Gal A, sugerindo que a internalização de α-Gal A por HUVECs seja mediada pelo receptor M6P. Assim, a α-Gal A humana do invento foi internalizada pelas células relevantes em termos clínicos.

Conhecem-se poucas linhas celulares humanas que expressem o receptor de manose. No entanto, uma linha celular do tipo macrófago de ratinho (J774.E), portadora dos receptores de manose mas sem ou com poucos receptores de M6P pode ser usada para determinar se a α-Gal A purificada do invento é internalizada via receptores da manose. Diment et al., J. Leukocyte Biol. 42:485-490 (1987). As células J774.E foram cultivadas durante a noite na presença de 10000 unidades/ml de α-Gal A. As amostras seleccionadas também continham M6P 2 mM e outras continham 100 mg/ml de manano. As células foram lavadas e colhidas como descrito atrás e determinadas a proteína total e a actividade de α-Gal A de cada amostra. M6P não inibe a internalização de α-Gal A por estas células, enquanto que manano decresce em 75% os níveis de α-Gal A acumulada. Assim, a α-Gal A do invento pode ser internalizada pelo receptor de manose nos tipos celulares que expressam este receptor particular da sua superfície. 107 ΡΕ2186902

Exemplo 3 Formulação farmacêutica Preparação de soluções tampão e formulações α-Gal A purificada global foi diluída para uma concentração final com Diluente de α-Gal A. Baseado no volume da proteína purificada a ser formulada, na concentração de α-Gal A (mg/ml) e na concentração pretendida de α-Gal A na formulação final, foi determinado o volume de diluente de α-Gal A. 0 diluente de α-Gal A é preparado nas 24 horas antes da utilização misturando quantidades adequadas de WFI, cloreto de sódio e fosfato de sódio monobásico e ajustando o pH a 6,0 com solução de hidróxido de sódio. A composição do Diluente de α-Gal A está apresentada na Tabela 8.

Tabela 8

Composição do diluente de α-Gal A (por litro)

Componente

Cloreto de sódio (USP) Hidróxido de sódio, 5N Fosfato de sódio, monobásico (USP) Água para injecção (USP) Número da Quantidade parte_ 100-1916 8, 8 g 200-1903 qs para ajustarpH6, 0 100-1913 3,5 g 100-2301 qs ad 1,0 1

Um litro ou volumes mais pequenos de diluente de α-Gal A foram filtrados por filtração com vácuo usando filtros de nylon estéreis de 0,2 mm (Nalge Nunc International, Rochester, NY) . Volumes maiores foram filtrados 108 ΡΕ2186902 por pressão positiva usando uma bomba peristáltica e filtros de cápsula de 0,2 mm Supor® (Pall, Port Washington, NY). Todos os filtros são sujeitos a testes de integridade por determinação do ponto de bolha pós-filtração. Os passos de mistura e filtração são realizados numa câmara de fluxo laminar certificada Classe 100. O diluente de α-Gal A é adicionado a α-Gal A purificada num vaso de mistura para dar uma solução final de 1 mg/ml. Em seguida, o volume adequado de Polysorbate 20 (Tween 20, Spectrum) é adicionado para uma concentração final de 0,02%.

Exemplo 4 α-Gal A desialilada e desgalactosilada

Para explorar o efeito da glicosilação na biodis-tribuição de α-Gal A, uma preparação purificada de α-Gal A foi sequencialmente desglicosilada e cada uma das formas injectadas num ratinho. Os órgãos do ratinho foram colhidos às quatro horas pós-injecção e realizou-se imuno-histo-quimica nos tecidos para visualizar possíveis alterações na biodistribuição da proteina. A α-Gal A foi primeiro tratada com neuraminidase (sialidase) para remover os residuos de ácido siálico, deixando grupos de galactose expostos. Uma porção desta a-Gal A tratada com sialidase reagiu ainda com β-galactosidase para remover os residuos de galactose; isto deixou expostos os residuos de N-acetilglucosamina (GlcNAC). As GlcNACs foram então removidas por N-acetilglucosaminidase, deixando os grupos de manose na 109 ΡΕ2186902 proteína. α-Gal A não tratada (testemunha) ou uma das formas tratadas da proteína foram injectadas na veia da cauda de ratinhos. Quatro horas após as injecções, o fígado, baço, coração, rim e pulmões do ratinho foram colhidos, preservados e imunocorados para detecção de a-Ga 1 A.

Quando comparado com os animais testemunha que receberam proteína não tratada, os ratinhos que receberam a enzima tratada com sialidase (resíduos de galactose expostos) tinham mais α-Gal A localizada no fígado e, correspondentemente, menos enzima noutros órgãos examinados. Ainda, o padrão de coloração no fígado foi muito diferente. Nos animais testemunha, a α-Gal A localizou-se principalmente nas células de Kupffer e nas células endoteliais, com coloração moderada dos hepatócitos. Nos animais que receberam a α-Gal A tratada com sialidase, a enzima localizou-se apenas nos hepatócitos, consistente com a biodistribuição conhecida do receptor de asialoglico-proteína. Este efeito da desglicosilação na biodistribuição foi invertido quando os resíduos de galactose foram removidos pela β-galactosidase. 0 padrão de coloração observado no fígado do ratinho que recebeu esta proteína sem grupos de galactose foi semelhante ao dos animais testemunha; a maioria da coloração surgiu nas células de Kupfer e nas células endoteliais, com coloração mínima dos hepatócitos. Posterior tratamento da α-Gal A com N- acetilglucosaminidase não alterou o padrão de coloração observado para a proteína tratada com β-galactosidase; ou 110 ΡΕ2186902 seja, a remoção dos resíduos de N-acetilglucosamina pareceu ter pouco efeito na biodistribuição de α-Gal A.

Exemplo 5 Correcção de fibroblastos de Fabry por fibro-blastos humanos expressando α-Gal A

Para a terapia génica, um implante de células autólogas produtoras de α-Gal A deverá produzir a enzima numa forma modificada adequadamente para "corrigir" a deficiência de α-Gal A em células alvo. Para avaliar o efeito da produção de α-Gal A, pelos fibroblastos humanos transfectados, nas células de Fabry, fibroblastos colhidos de doentes com doença de Fabry (NIGMS Human Genetics Mutant Cell Repository) foram cocultivados com uma estirpe de células produtoras de α-Gal A (BRS-11) em Transwells® (Costar, Cambridge, MA) . As células de Fabry foram cultivadas em placas de cultura de tecidos de 12 alvéolos, alguns dos quais continham insertos (Transwells®, 0,4 mm de tamanho de poro) tendo uma superfície na qual as células podem crescer. A matriz de crescimento do inserto é porosa e permite que as macromoléculas passem do meio de cima para o meio de baixo. Uma série de insertos continha fibroblastos de prepúcio humano (HF) normal, que secretam níveis mínimos de α-Gal A, enquanto uma outra série continha a estirpe de fibroblastos humanos estavelmente transfectados, BRS-11, a qual secreta grandes quantidades de α-Gal A. Nos alvéolos cocultivados com células produtoras de α-Gal A, α-Gal A pode entrar no meio que envolve as células de 111 ΡΕ2186902

Fabry e potencialmente ser internalizada pelas células de Fabry.

Os dados na Tabela 9 mostram que as células de Fabry internalizaram a α-Gal A secretada. Os níveis intracelulares de α-Gal A foram monitorizados durante 3 dias. As células cultivadas por si sós (sem inserto) ou na presença de fibroblastos de prepúcio não transfectados (inserto HF) tinham níveis intracelulares de actividade a-Gal A muito baixos. As células de Fabry cultivadas com as células produtoras de α-Gal A (BRS-11), no entanto, apresentaram níveis de enzima semelhantes aos das células normais no final do dia 2 (os fibroblastos normais possuem 25-80 unidades de α-Gal A/mg de proteína) . O facto de a correcção ser atribuída à α-Gal A internalizada via receptor de M6P é demonstrado pela inibição com M6P (inserto DRS-11 + M6P).

Tabela 9 CORRECÇÃO DE FIBROBLASTOS DE FABRY POR FIBROBLASTOS HUMANOS EXPRESSANDO ACTIVIDADE DE α-GAL A (unidades/mg de proteína total)

Tempo Sem Inserto HF Inserto Inserto inserto BRS-11 BRS-11 +

M6P

Dia 1 2 ± 1 2 ± 1 13 ± 1 4 ± 1 Dia 2 2 ± 1 2 ± 1 40 ± 1 6 ± 1 Dia 3 2 ± 1 5 ± 1 85 ± 1 9 ± 1 112 ΡΕ2186902 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Shire Human Genetic Therapies, Inc.

<12 0> PREPARAÇÕES MÉDICAS PARA O TRATAMENTO PARA A DEFICIÊNCIA EM ALFA-GALACTOSIDASE A

<130> PE785886EPB <140> <141> 2000-03-09 <150> USSN 09/266014 <151 1999-03-08 <160> 24 <170> Patentln ver. 2.0

<210> 1 <211> 210 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> Descrição de sequência artificial: sonda biblioteca de fibroblastos humanos: exão 7, incluindo sequências iniciadoras para amplificação. <400> 1 etgggetgta gctatgataa atcggcagga gattggtgga cctqjctctt ataccatcgc 60 aqftgtttcc ctqggtaaaq gagtggcctg taatcctgcc tgcttcatca câcagctcct 120 ccctgtgaaa aggaagctag ggttctatga atggacttta aggttaagaa gtcacataaa ISO tcccacaggt actgttttgc ttcagctaga 210 <210> 2 <211> 268

<212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: extremo 5' do clone de cDNA incluindo sequências iniciadoras de amplificação. <400> 2 113 ΡΕ2186902 attggtccgc ccctgaggtt aatcttaaaa gcccaqgtta cccgcgqaaa tttatgctgt 60 ccggtcaccg tgacaatgca gctgaggaae ccagaictac atctgggctg cgcgcttgeg 120 cttcgcttcc tggccctcgt ttcctgggac atccctgggg ctagagcact ggacaatgga ISO ttggcaaqga cgcctaccat gggctggctg cactgggagc gcttcatgtg caaccttgac 240 tgecaggaag agccagattc ctgcatca 26S <210> 3 <211> 1343

<212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ccgcgggaaa tttatgctgt eeggtcaccg tgacaatgca gctgaggaae ccagaactac 60 atctgggctg cgcgcttgcg cttcgcttcc tggccctcgt ttcctgggac atccctgggq 120

ctagagcact ggacaatgga ttggcaagga cgcctaccat gggctggctg caetgggagc ISO gcttcatgtg caaccttgac tgecaggaag agccagattc ctgcatcagt gagaagctct 240 tcatggagat ggeagagctc atggtctcag aaqgctggaa ggatgcaggt tatgagtacc 300 tctgcattga tgactgttgg atggctcccc aaàgagattc agaaggcaga cttcaggcag 360 accctcagcg ctttcctcat gggattegec agctagctaa ttatgttcac agcaaaggac 420 tgaagctagg gatttatgca gatgttggaa ataaaacctg cgcaggcttc cctgggagtt 480 ttggatacta cgacattgat gcccagacct ttgctgactg gggagtagat cfcgctaaaat 540 ttgatggttg ttactgtgac agtttggaaa atttggcaqa tggttataag cacatgtcct 600 tggccctgaa taggactggc agaagcattg tgtactcctg tgagtggcct ctttatatgt 660 ggccctttca aaagcceaat tatacagaaa tccgacagta ctgcaatcac tggcgaaatt 720 ttgctgacat tgatgattcc tggaaaagta taaagagtat cttggactgg acatctttta 7S0 attaggagag aattgttgat gttgctggac cagggggttg gaatgaccca gatatgttag 840 tgattggcaa ctttggcctc agctggaatc agcaagtaac tcagatggcc ctctgggcta 000 tcatggctgc tcctttattc atgtctaatg acctccgaca catcagccct caagccaaag 060

ctctccttca ggataaggac gtaattgcca tcaatcagga ccccttgggc aageaagggt 102C

accagcttag acagggagac aactttgaag tgtgggaaeg acctctctca ggcttagcct 108C

gggctgtagc tatgataaac cggcaggaga ttggtggacc tcgctcttat accatcgcag 114C

ttgcttccct gggtaaagga gtggcctgta atcctgcctg cttcatcaca cagctcctcc 120C

ctgtgaaaag gaagctaggg ttctatgaat ggacttcaag gttaagaagt cacataaatc 125C ccacagqcac tqttttgctt cagctagaaa atacaatgca gatgtcatta aaagacttac 132C tttaaaâaaa aàaaaaactc gag 1343

<210> 4 <211> 398 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 ΡΕ2186902 114

Leu Asp Asm Gly Ley Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp 1 5 10 Glu Glu 15 Gl ií Arg Phe Met Τ|Λ cys Asn Leu ASp Cys 25 Gin Pro ASg Ser Cys ile Ser Glu 4y Lys teu phe Met GlU Met Ala Glu Leu Met val Ser Gl u 35 40 45 Gly Trp Lys ASp Ala Gly Tyr GlU Tyr Leu Cys ile ASp ASp cys Trp 50 55 60 Met Ala Pro Gin Arg ASP Ser Glu Gly Arg Leu Gin Ala ASP Pro Gin 65 70 75 80 Arg phe pro His Gly ile Arg Gin Leu Ala Asn Tyr val HÍS ser Lys 85 90 95 Gly Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp vai Gly Asn Lys Thr Cys Ala 100 105 110 Gly Phe Pro Gly ser phe Gl y Tyr Tyr Asp ile ÃSp Ala Gin Thr Phe 115 120 125 Ala Asp Trp Gly vai ASp Leu Leu tys phe ASp Gly cys Tyr cys Asp 130 135 140 Ala ser teu Glu Asn teu Ala Asp Gly Tyr Lys HlS Met Ser Leu Leu 145 150 15 5 160 Aso Ara Thr Gly Arg Ser Ile Vai Tyr Ser cys Glu Trp pro Leu Tyr 165 170 175 Met irp pro Phe Gin Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gin Tyr cys 180 Phe Ala 185 190 Asn HÍS trp Arg Asn Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys ser ile 195 200 205 Lys Ser Ile Leu ASp Trp Thr Ser Phe Asn Gin Glu 220 Arg Ile val Asp 210 21S vai Ala Gly pro Gly Gly rrp Asn Asp Pro Asp Met Leu val ile Gly 225 230 235 240 Asn Phe Gly Ley ser Trp ASO Gin Gin val 'Thr Gin Met Ala Leu Trp 245 250 255 ile .Ala lia Met Ala Ala pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg HÍS 260 265 27Ô Ser Pr o Gin Ala Lys Ala Leu Leu Gin ASp Lys ASp Val Ile Ala Ile 275 280 285 Asn Gin Asp Pro Leu Gly !-** Gin Gly Tyr 61η Leu Arg Gin Gly Asp 290 295 300 Α5Π Phe Gl U vai Trp Glu Arg pro Leu ser Gly Leu Ala Trp Ala val 305 310 315 Ala «et He Asn Arg Gin Glu ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile 325 330 335 Ala vai Ala Ser Lèu Gly Lys Gly vai Ala cys Asn pro Ala cys Phe 340 345 350 He Thr Gin Leu Leu Pro Vai Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp 355 360 365 Thr ser Arg Leu Arg ser HÍS ile Asn Pro Thr Gly rhr Val Leu Leu 370 375 380 Gin Leu Glu Asrt Thr Met Gin Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu 385 390 395 <210> 5 <211> 1197

<212> DNA <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 5 115 ΡΕ2186902 ctggacaatg gattggcaag gacgcctacc atgggctgge tgcactggga gcgcttcatg 60 tgcaaccttg aetgccagga agagccagat tcctgcatca gtgagaagct cttcatggas 120 atggcagagc tcatggtctc agaaggctgg aaggatgcag gttatgagta cctctgcàtt 180 gatgactgtt ggatggctcc ccaaagagat tcagaaggca gacttcaggc agaccctcag 240 cgctttcctc atgggattcg ccagctagct aattatgttc acagcaaàgg actgaagcta 300 gggatttatg cagatgttog aaataaaacc tgcgcaggct tccctgggag ttttggatac 360 tacgacattg atgcccagac ctttgctgac tggggagtag atctgctaaa atttgatggt 420 tgttactgtg acagtttgga aaatttggca gatggttata ageacatgtc cttggccctg 480 aâtaggactg gcagaagcat tgtgtactcc tgtgagtggc ctctttatat gtggcccttt 540 caaaagccca àttatacaga aatccgacag tactgcaatc actggcgaaa ttttgctgac 600 attgatgatt cctggaaaag tataaagagt attttggaet ggacatcttt taaccaggag 660 agaattgttg atgttgctgg accagggggt tggaatgacc cagatatgtt agtgattggc 720 aactttggcc tcagctggaa tcagcaagta actcagatgg ccctctgggc tatcatggct 780 gctcctttat tcatgtctaa tgacctccga eaeatcagce ctcaagccaa agctctcctt 840 caggataagg acgtaattgc catcaatcag gaccccttgg gcaagcaagg gtaccagctt 900 agàcagqgag acaactttga agtgtgggaa cgacctctct caggcttagc ctgggctgra 960 gctatgataa accggcagga gattggtgga cctcgctctt atàccatcgc agttgcttcc 1020 ctgggtaaag gagtsgcctg taatcctgcc tgcttcatca cacagctcct ccctgtgaaa 1080 aggaagctag ggttctatga atggacttea aggttaagaa gtcaeataaa tcccacaggc 1140 actgttttgc ttcagctaga aaatacaatg cagatgtcat taaaagactt actttaa 1197

<210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência artificial <400> 6 ctggctgta gctatgataa ac 22

<210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora de PCR <400> 7 tctagctgaa gcaaaacagt g 21

<210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora de PCR <400> 8 attggtccgc ccctgaggt 19

<210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência artificial 116 ΡΕ2186902 <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora de PCR <400> 9 tgatgcagga atctggctct 20 <210> <211> 10 35 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora de PCR <400> 10 ttttggatcc ctcgaggaca ttgattattg actag 35 <210> <211> 11 28 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora de PCR <400> 11 ttttggatcc cgtgtcaagg acggtgac 28 <210> <211> 12 20 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora de PCR <400> 12 ttttggatcc accatggcta 20 <210> <211> 13 24 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora de PCR <400> 13 24 ttttgccggc actgccctct tgaa 117 ΡΕ2186902 <210> <211> 14 24 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora de PCR <400> 14 ttttcagctg gacaatggat tggc 24 <210> <211> 15 20 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora de PCR <400> 15 20 ttttgctagc tggcgaatcc 20 <210> <211> 16 30 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora de PCR <400> 16 ttttggatcc gtgtcccata gtgtttccaa 30 <210> <211> 17 28 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora de PCR <400> 17 ttttggatcc gcagtcgtgg ccagtacc 28 <210> <211> 18 12 <212> <213> DNA Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: inserção oligo 118 ΡΕ2186902 <400> 18 ctagtcctag 12

<210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora de PCR <400> 19 ttttgagcac agagcctcgc ct 22

<210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: promotor parcial do colagénio <400> 20 ttttggatcc ggtgagctgc gagaatagcc 30

<210> 21 <211> 76 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: promotor parcial do colagénio <400> 21 gggcccccag ccccagccct cccattggtg gaggcccttt tggaggcace ctagggccag 60 gaaacttttg ccgtat ' 76

<210> 22 <211> 69 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: promotor parcial do colagénio <400> 22 aaatagggca gatccgggct ttattatttt agcaccacgg ecgccgagac cgcgtccgcc 60 ccgcgagca 69

<210> 23 <211> 86 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> 119 ΡΕ2186902 <223> Descrição da sequência artificial: promotor parcial do colagénio <400> 23 tgccctattt atacggcaaa agtttcctgg ecetagggtg cctccaaaag ggcctccacc 60 aatgggaggg ctggggctgg gggcec 86

<210> 24 <211> 55 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição da sequência artificial: sequência iniciadora de PCR <400> 24 cgcggggcgg acgcggtctc ggcggccgtg gtgctaaaat aataaagccc ggatc 55

Lisboa, 22 de Agosto de 2012

Claims

ΡΕ2186902 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição farmacêutica de α-Gal A onde pelo menos 50% do total de glicanos da referida preparação de α-Gal A são glicanos do tipo complexo para o uso no tratamento de uma deficiência em a-Gal A com uma dose semanal ou quinzenal entre 0,05 mg e 5,0 mg de uma preparação de α-Gal A por kg de peso corporal de um sujeito.
2 . A composição farmacêutica para uso no tratamento de uma deficiência em α-Gal A de acordo com a reivindicação 1, em que a deficiência de α-Gal A é a doença de Fabry.
3. A composição farmacêutica para uso no tratamento de uma deficiência em α-Gal A de acordo com a reivindicação 2, em que a doença de Fabry é uma variante atípica da doença de Fabry.
4. A composição farmacêutica para uso no tratamento de uma deficiência em α-Gal A de acordo com as reivindicações 2 ou 3, em que o referido indivíduo sofre de uma anomalia cardiovascular.
5. A composição farmacêutica para uso no tratamento de uma deficiência em α-Gal A de acordo com a 2 ΡΕ2186902 reivindicação 4, onde a referida anomalia cardiovascular é hipertrofia ventricular esquerda (LVH).
6. A composição farmacêutica para uso no tratamento de uma deficiência em α-Gal A de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a referida dose está entre 0,1 mg e 0,3 mg da referida preparação de α-Gal A por kg de peso corporal de um sujeito.
7 . A composição farmacêutica para uso no tratamento de uma deficiência em α-Gal A de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida dose é formulada para administração subcutânea.
8. A composição farmacêutica para uso no tratamento de uma deficiência em α-Gal A de acordo com a reivindicação 6, em que a referida dose é cerca de 0,2 mg da referida preparação de α-Gal A por kg de peso corporal de um sujeito.
9. A composição farmacêutica para uso no tratamento de uma deficiência em α-Gal A de acordo com as reivindicações 1, 6 ou 8, em que a referida dose é formulada para administração por via intramuscular, oral, rectal, subcutânea, intra-arterial, intraperitoneal, intracerebral, intranasal, intratecal, trasmucosal, trans-dérmica ou inalação.
10. A composição farmacêutica para uso no 3 ΡΕ2186902 tratamento de uma deficiência em α-Gal A de acordo com as reivindicações 1-6 ou 8, em que a referida dose é formulada para administração usando um sistema de distribuição seleccionado a partir do grupo consistindo em distribuição com bomba, células encapsuladas, lipossomas, injecção com agulha, injecção sem agulha, nebulizador, aerossolizador, electroporação e penso transdérmico.
11. A composição farmacêutica para uso no tratamento de uma deficiência em α-Gal A de acordo com qualquer uma das reivindicações 2-10, em que o individuo apresenta sintomas da doença de Fabry.
12. A composição farmacêutica para uso no tratamento de uma deficiência em α-Gal A de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, ou 6-10, em que o individuo apresenta um sintoma da doença de Fabry clássica.
13. A composição farmacêutica para uso no tratamento de uma deficiência em α-Gal A de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, ou 6-10, em que o individuo apresenta um sintoma de uma variante atípica da doença de Fabry.
14. A composição farmacêutica para uso no tratamento de uma deficiência em α-Gal A de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 6-10, em que o indivíduo apresenta um sintoma de disfunção cardíaca. 4 ΡΕ2186902
15. A composição farmacêutica para uso no tratamento de uma deficiência em α-Gal A de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 6-10, em que o indivíduo apresenta um sintoma de disfunção renal.
16. A composição farmacêutica para uso no tratamento de uma deficiência em α-Gal A de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 6-10, em que o indivíduo apresenta pelo menos um sintoma seleccionado a partir do qrupo que consiste em distrofia corneai, an-gioqueratoma neuropatia dolorosa, doença vascular cerebral, cardiomiopatia, hipertrofia ventricular esquerda, dispneia de esforço, hipertrofia septal assimétrica, enfarte do miocárdio, e infiltração do miocárdio. Lisboa, 22 de Agosto de 2012