ES2634317T3 - Preparaciones médicas para el tratamiento de deficiencia de alfa-galactosidasa A - Google Patents
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Abstract
Una preparación de α-Gal A glicosilada humana que tiene una carga de oligosacáridos aumentada, en donde entre el 35% y el 85% de los oligosacáridos se cargan por la adición de : (i) uno a cuatro residuos de ácido siálico en glicanos complejos, (ii) uno a dos restos de fosfato en glicanos alta-manosa, o (iii) un único fosfato y un único ácido siálico en glicanos híbridos, para su uso en el tratamiento de deficiencia de α-Gal A a una dosis semanal o bisemanal de entre 0,05 mg a 5,0 mg de la preparación de α-Gal A por kg de peso corporal de un sujeto.
Description
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Preparaciones medicas para el tratamiento de deficiencia de alfa-galactosidasa A
DESCRIPCION
CAMPO DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere a composiciones para su uso en el tratamiento de la deficiencia de a- galactosidasa A.
Antecedentes de la invencion
La enfermedad de Fabry es una enfermedad de almacenamiento lisosomal hereditaria ligada al cromosoma X caracterizada por disfuncion renal grave, angioqueratomas y anomaUas cardiovasculares, incluyendo dilatacion ventricular e insuficiencia de la valvula mitral. La enfermedad de Fabry tambien afecta al sistema nervioso periferico, provocando episodios de dolor angustioso, ardiente en las extremidades. La enfermedad de Fabry esta provocada por una deficiencia de la enzima a-galactosidasa A (a-Gal A). La a-Gal A es la glicohidrolasa lisosomal que escinde los restos a-galactosilo terminales de diversos glicoconjugados. La enfermedad de Fabry da como resultado un bloqueo del catabolismo del glicoesfingolfpido neutro, trihexosido de ceramida (CTH) y la acumulacion de este sustrato enzimatico dentro de las celulas y en el torrente sangumeo.
Debido al patron de herencia ligada al cromosoma X de la enfermedad, la mayona de los pacientes con la enfermedad de Fabry son hombres. Aunque se han observado mujeres heterocigoticas gravemente afectadas, las mujeres heterocigoticas son a menudo asintomaticas o tienen smtomas relativamente leves (tales como una opacidad caractenstica de la cornea). Una variante atfpica de la enfermedad de Fabry, que muestra baja actividad residual de la a-Gal A y o bien smtomas muy leves o bien aparentemente ningun otro smtoma caractenstico de la enfermedad de Fabry, se correlaciona con la hipertrofia ventricular izquierda y enfermedad cardiaca. Nakano et al., New Engl. J. Med. 333: 288-293 (1995). Una reduccion en la a-Gal A puede ser la causa de tales anomalfas cardiacas.
El ADNc y el gen que codifica para la a-Gal A humana se han aislado y secuenciado. La a-Gal A humana se expresa como un polipeptido de 429 aminoacidos, de los cuales los 31 aminoacidos N-terminales son el peptido senal. La enzima humana se ha expresado en celulas de ovario de hamster chino (CHO) (Desnick et al., patente estadounidense 5.356.804; loannou et al., J. Cell Biol. 119: 1137 (1992)); y celulas de insecto (Calhoun et al., documento WO 90/11353).
Sin embargo, las preparaciones actuales de a-Gal A tienen eficacia limitada. La a-Gal A producida por los procedimientos del estado de la tecnica es eliminada rapidamente por el tngado.
Por tanto, sigue habiendo una necesidad en la tecnica de preparaciones de a-Gal A con una semivida en circulacion aumentada y captacion aumentada en tejidos espedficos diferentes del tngado.
SUMARIO DE LA INVENCION
La invencion proporciona preparaciones de a-Gal A con carga alterada. Las alteraciones de carga se logran aumentando el contenido de acido sialico de a-Gal A y/o aumentando la fosforilacion de a-Gal A.
Las preparaciones de a-Gal A de la presente invencion son utiles para el tratamiento de individuos con enfermedad de Fabry o variantes atfpicas de la enfermedad de Fabry, por ejemplo, poblaciones espedficas de pacientes de Fabry con anomalfas predominantemente cardiovasculares, como agrandamiento ventricular, por ejemplo, hipertrofia ventricular izquierda (LVH), y/o insuficiencia de la valvula mitral, o pacientes de Fabry con afectacion predominantemente renal.
Espedficamente, la invencion se refiere a una preparacion de a-Gal A glicosilada humana que tiene una carga de oligosacaridos aumentada, en donde entre el 35% y el 85% de los oligosacaridos se cargan por la adicion de :
(i) uno a cuatro residuos de acido sialico en glicanos complejos,
(ii) uno a dos restos de fosfato en glicanos alta-manosa, o
(iii) un unico fosfato y un unico acido sialico en glicanos hnbridos,
para su uso en el tratamiento de deficiencia de a-Gal A a una dosis semanal o bisemanal de entre 0,05 mg a 5,0 mg de la preparacion de a-Gal A por kg de peso corporal de un sujeto.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 es una representacion de la sonda de 210 pb que se uso para aislar un ADNc de a-Gal A a partir
de una biblioteca de ADNc de fibroblastos humanos (SEQ ID NO: 1). La secuencia es desde el exon 7 del
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gen de a-Gal A. La sonda se aislo a partir de ADN genomico humano mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Las regiones subrayadas en la figura corresponden a las secuencias de los cebadores de amplificacion.
La figura 2 es una representacion de la secuencia del fragmento de ADN que completa el extremo 5' del clon de ADNc de a-Gal A (SEQ ID NO: 2). Este fragmento se amplifico a partir de ADN genomico humano mediante PCR. Las regiones subrayadas corresponden a las secuencias de los cebadores de amplificacion. Tambien se muestran las posiciones de los sitios de endonucleasas de restriccion Ncol y SacII, que se usaron para la subclonacion tal como se describe en el ejemplo 1.
La figura 3 es una representacion de la secuencia de ADNc de a-Gal A, incluyendo la secuencia que codifica para el peptido senal (SEQ ID NO: 3).
La figura 4 es un mapa esquematico de pXAG-16, un constructo de expresion de a-Gal A que incluye el promotor de CMV (citomegalovirus), el exon 1 y el primer intron, la secuencia que codifica para el peptido senal de hGH y el primer intron, el ADNc de a-Gal A (que carece de la secuencia del peptido senal de a-Gal A) y la UTS en 3' de hGH. pcDNeo indica la posicion del gen neo derivado del plasmido pcDNeo.
La figura 5 es un mapa esquematico de pXAG-28, un constructo de expresion de a-Gal A que incluye el promotor Ia2 del colageno y el primer exon, un intron de p-actina, la secuencia que codifica para el peptido senal de hGH y el primer intron, el ADNc de a-Gal A (que carece de la secuencia de peptido senal de a-Gal A) y la UTS en 3'de hGH. pcDNeo indica la posicion del gen neo derivado del plasmido pcDNeo.
La figura 6 es una representacion de la secuencia de aminoacidos de a-Gal A humana (SEQ ID NO: 4).
La figura 7 es una representacion de la secuencia de ADNc que codifica para la a-Gal A humana (sin peptido senal) (SEQ ID NO 5).
La figura 8 es un cromatograma de la etapa de purificacion de a-Gal A usando resina de butil-Sepharose®. Se muestra la absorbancia a 280 nm (lmea sencilla) y la actividad a-Gal A (lmea de puntos) de las fracciones seleccionadas.
La figura 9 es un mapa esquematico de pGA213C.
La figura 10 es una representacion esquematica del constructo de seleccion como diana, pGA213C, y la recombinacion homologa con el locus de a-galactosidasa A endogena. pGA213C se representa como secuencias de seleccion como diana alineadas por encima con secuencias correspondientes en el locus de a- galactosidasa A del cromosoma X. Las posiciones relativas respecto al codon de iniciacion de metionina, ATG, se indican mediante los numeros por encima de los mapas lineales. La unidad de activacion que contiene las secuencias de dhfr murina, neo bacteriana y promotor de CMV/intron de aldolasa se muestran por encima de la posicion (-221) en la que se insertaron mediante clonacion de ADN. Las secuencias que codifican para a-galactosidasa A se indican mediante los recuadros oscurecidos. Las secuencias genomicas que no codifican para a-galactosidasa A se indican mediante recuadros ligeramente rellenados. Las flechas grandes indican la direccion de la transcripcion para los casetes de expresion de neo y dhfr. El corte y empalme del ARNm de GA-GAL tras la activacion genica y seleccion como diana satisfactorias se indican mediante la lmea segmentada por debajo del mapa del locus de a-galactosidasa A activada (GA-GAL).
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
Introduccion
La invencion proporciona preparaciones de a-Gal A que tienen a-Gal A con carga alterada. Las preparaciones pueden incluir diferentes glicoformas de a-Gal A. Las alteraciones de carga se logran aumentando el contenido de acidos sialico de las preparaciones de a-Gal A y/o aumentando la fosforilacion de las preparaciones de a-Gal A. Espedficamente, la invencion se refiere a una preparacion de a-Gal A glicosilada humana que tiene una carga de oligosacaridos aumentada, en donde entre el 35% y el 85% de los oligosacaridos se cargan por la adicion de :
(i) uno a cuatro residuos de acido sialico en glicanos complejos,
(ii) uno a dos restos de fosfato en glicanos alta-manosa, o
(iii) un unico fosfato y un unico acido sialico en glicanos dbridos,
para su uso en el tratamiento de deficiencia de a-Gal A a una dosis semanal o bisemanal de entre 0,05 mg a 5,0 mg de la preparacion de a-Gal A por kg de peso corporal de un sujeto.
El contenido en acido sialico de las preparaciones de a-Gal A puede aumentarse mediante (i) el aislamiento de las glicoformas de la a-Gal A de peso molecular superior y/o sumamente cargadas durante o tras el procedimiento de purificacion; (ii) la adicion de residuos de acido sialico usando celulas modificadas geneticamente (o bien mediante procedimientos de ingeniena genetica convencionales o bien mediante activacion genica) para expresar un gen o ADNc de la sialil transferasa; o (iii) la fermentacion o crecimiento de celulas que expresan la enzima en un entorno con bajo contenido en amonio.
La fosforilacion de las preparaciones de a-Gal A se aumenta mediante (i) la adicion de residuos de fosfato usando celulas modificadas geneticamente (o bien mediante procedimientos de ingeniena genetica convencionales
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o bien mediante activacion genica) para expresar un gen o ADNc de la fosforil transferasa; o (ii) la adicion de inhibidores de fosfatasa a las celulas cultivadas.
Usando los procedimientos, se obtienen preparaciones de a-Gal A glicosilada humana, en las que entre el 35% y el 85% de los oligosacaridos estan cargados. En una realizacion preferida, al menos el 35% de los oligosacaridos estan cargados. En una realizacion mas preferida, al menos el 50% de los oligosacaridos estan cargados.
En una realizacion, se produce una preparacion de a-Gal A glicosilada que tiene una carga de oligosacaridos aumentada introduciendo en primer lugar un polinucleotido, que codifica para la GlcNAc transferasa III (GnT-III), en una celula de produccion de a-Gal A, o introduciendo una secuencia reguladora mediante recombinacion homologa que regula la expresion de un gen de Gnt-III endogeno. Entonces se cultiva la celula de produccion de a-Gal A en condiciones de cultivo que dan como resultado la expresion de a-Gal A y GnT-III. La etapa final consiste en aislar la preparacion de a-Gal A con carga de oligosacaridos aumentada.
En una realizacion alternativa, se produce una preparacion de a-Gal A glicosilada que tiene una carga de oligosacaridos aumentada introduciendo en primer lugar un polinucleotido, que codifica para una sialil transferasa, en una celula de produccion de a-Gal A, o introduciendo una secuencia reguladora mediante recombinacion homologa que regula la expresion de un gen de sialil transferasa endogeno. Entonces se cultiva la celula de produccion de a-Gal A en condiciones de cultivo que dan como resultado la expresion de a-Gal Ay la sialil transferasa. La etapa final consiste en aislar la preparacion de a-Gal A con carga de oligosacaridos aumentada. Las sialil transferasas preferidas incluyen una a2,3-sialil transferasa y una a2,6-sialil transferasa. En una realizacion preferida, este procedimiento incluye la etapa adicional de seleccionar las glicoformas de la a-Gal A con tamano aumentado o carga aumentada mediante fraccionamiento o purificacion de la preparacion.
En otra realizacion, se obtiene una preparacion de a-Gal A glicosilada con sialilacion aumentada poniendo en contacto una celula de produccion de a-Gal A con un medio de cultivo que tiene una concentracion de amonio inferior a 10 mM, mas preferiblemente inferior a 2 mM. En una realizacion preferida, se logra el entorno con bajo contenido en amonio mediante la adicion de glutamina sintetasa al medio de cultivo. En una realizacion preferida alternativa, se logra el entorno con bajo contenido en amonio mediante perfusion continua o intermitente de la celula de produccion de a-Gal A con medio de cultivo nuevo para mantener la concentracion de amonio inferior a 10 mM, mas preferiblemente inferior a 2 mM.
En otra realizacion mas, se obtiene una preparacion de a-Gal A glicosilada con fosforilacion aumentada introduciendo en primer lugar en una celula de produccion de a-Gal A un polinucleotido que codifica para la fosforil transferasa, o introduciendo una secuencia reguladora mediante recombinacion homologa que regula la expresion de un gen de fosforil transferasa endogeno. Entonces se cultiva la celula de produccion de a-Gal A en condiciones de cultivo que dan como resultado la expresion de a-Gal A y fosforil transferasa. Entonces se afsla la preparacion de a-Gal A con fosforilacion aumentada en comparacion con la a-Gal A producida en una celula sin el polinucleotido. En una realizacion preferida, las preparaciones de a-Gal A producidas mediante los procedimientos tienen multiples glicoformas, estando entre el 16-50%, preferiblemente el 25-50%, mas preferiblemente al menos el 30% de las glicoformas fosforiladas. En una realizacion preferida, este procedimiento incluye la etapa adicional de seleccionar las glicoformas de a-Gal A con tamano aumentado o carga aumentada mediante fraccionamiento o purificacion de la preparacion.
En otra realizacion mas, se obtiene una preparacion de a-Gal A glicosilada con fosforilacion aumentada anadiendo un inhibidor de fosfatasa, por ejemplo, bromotetramisol, a las celulas cultivadas. Pueden estar presentes niveles bajos de fosfatasa alcalina de plasma bovino en el suero de ternero fetal usado como aditivo de crecimiento para las celulas cultivadas. Esto eleva la posibilidad de que los epftopos de Man-6-P expuestos sobre la a-Gal A secretada puedan ser un sustrato para la fosfatasa alcalina serica. Se ha mostrado que el bromotetramisol es un potente inhibidor de la fosfatasa alcalina; Ki = 2,8 mM (Metaye et al., Biochem. Pharmacol. 15: 4263-4268 (1988)) y se logra inhibicion completa a una concentracion de 0,1 mM (Borgers & Thone, Histochemistry 44: 277-280 (1975)). Por tanto, puede anadirse un inhibidor de fosfatasa, por ejemplo, bromotetramisol, a las celulas cultivadas en una realizacion para maximizar la forma de captacion alta de la a-Gal A presente en el medio de cultivo impidiendo la hidrolisis de los grupos ester de Man-6-P.
La sialilacion mejorada de las preparaciones de a-Gal A mejora la semivida en circulacion de la a-Gal A exogena. Ademas, la sialilacion mejorada de la a-Gal A mejora su captacion, con respecto a la de los hepatocitos, en celulas que no son hepatocitos tales como celulas endoteliales hepaticas, celulas sinusoidales hepaticas, celulas pulmonares, celulas renales, celulas neurales, celulas endoteliales o celulas cardiacas.
La fosforilacion de las preparaciones de a-Gal A tambien mejora el nivel de a-Gal A que entra en las celulas. La fosforilacion se produce dentro de las celulas que expresan la a-Gal A.
Los niveles de sialilacion pueden variar dependiendo del tipo de celula usada. Por tanto, en otra realizacion
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preferida, puede potenciarse la sialilacion de a-Gal A explorando para seleccionar celulas de mairnfero, por ejemplo celulas humanas, que tienen actividad sialil transferasa relativamente alta y usando tales celulas como celulas de produccion de a-Gal A.
Las formulaciones de una preparacion de a-Gal Adivulgadas en la presente estan sustancialmente libres de protemas que no son a-Gal A, tales como albumina, protemas que no son a-Gal A producidas por la celula huesped o protemas aisladas del tejido o fluido animal. La formulacion puede comprender ademas un excipiente. Los excipientes preferidos incluyen manitol, sorbitol, glicerol, aminoacidos, lfpidos, EDTA, EGTA, cloruro de sodio, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, dextrano o combinaciones de cualquiera de estos excipientes. En otra realizacion, la formulacion comprende ademas un detergente no ionico. Los detergentes no ionicos preferidos incluyen polisorbato 20, polisorbato 80, Triton X-100, Triton X-114, Nonidet P-40, Octil-a-glucosido, Octil-b-glucosido, Brij 35, Pluronic y Tween 20. En una realizacion preferida, el detergente no ionico comprende Polisorbato 20 o Polisorbato 80. Una formulacion preferida comprende ademas solucion salina tamponada con fosfato, preferiblemente a pH 6.
La preparacion de a-Gal A es una preparacion de a-Gal A con carga alterada. La dosis de administracion esta entre 0,05-5,0 mg, mas preferiblemente entre 0,1-0,3 mg de la preparacion de a-Gal A por kilogramo de peso corporal semanal o quincenalmente. En una realizacion preferida, la dosis de administracion es de aproximadamente 0,2 mg por kilogramo de peso corporal quincenalmente. En estos procedimientos, la dosis puede administrarse por via intramuscular, por via oral, por via rectal, por via subcutanea, por via intraarterial, por via intraperitoneal, por via intracerebral, por via intranasal, por via intradermica, por via intratecal, por via intramucosa, por via transdermica o mediante inhalacion. En una realizacion, el procedimiento para administrar la preparacion de a-Gal A a un sujeto comprende administrar por via subcutanea una dosis que oscila entre 0,01-10,0 mg, preferiblemente 0,1-5,0 mg de la preparacion de a-Gal A por kg de peso corporal quincenal o semanalmente. La preparacion de a-Gal A tambien puede administrarse por via intravenosa, por ejemplo en una inyeccion de bolo intravenoso, en una inyeccion intravenosa de empuje lento o mediante inyeccion intravenosa continua. En cualquiera de los procedimientos anteriores, la preparacion de a-Gal A puede administrarse usando un sistema de administracion tal como una administracion con bomba, administracion de celulas encapsuladas, administracion liposomal, inyeccion administrada con aguja, inyeccion sin aguja, nebulizador, pulverizador, electroporacion y parche transdermico. Cualquiera de las preparaciones de a-Gal A descritas anteriormente puede administrarse mediante estos procedimientos.
Puede tratarse a un individuo que se sospecha que tiene, o se sabe que tiene la enfermedad de Fabry mediante la administracion de la preparacion de a-Gal A descrita anteriormente, usando los procedimientos de administracion y dosis descritos anteriormente. La presente invencion contempla el tratamiento de individuos con enfermedad de Fabry en general (“pacientes con Fabry”), asf como variantes atfpicas de la enfermedad de Fabry, por ejemplo, poblaciones espedficas de pacientes con Fabry con anomalfas predominantemente cardiovasculares, definidos en este caso como pacientes con Fabry con dilatacion ventricular, por ejemplo, hipertrofia ventricular izquierda (HVI) y/o insuficiencia de la valvula mitral, o pacientes con Fabry con afectacion predominantemente renal.
a-Gal A
La a-Gal A es una glicoprotema homodimerica que hidroliza los restos a-galactosilo terminales de glicolfpidos y glicoprotemas
Los terminos “a-Gal A” madura y “GA-GAL” y “SEQ ID NO: 5” (vease la figura 7) se refieren a a-Gal A sin un peptido senal (para a-Gal A con el peptido senal, vease la figura 3 y la SEQ ID NO: 3). La expresion “preparacion de a-Gal A”, tal como se define en el presente documento, se usa de manera intercambiable con la expresion “preparacion de a-Gal A glicosilada” y comprende diversas glicoformas de a-Gal A glicosilada.
Un “peptido senal” es una secuencia peptfdica que dirige un polipeptido recien sintetizado al que esta fijado el peptido senal hacia el retmulo endoplasmatico (RE) para su procesamiento postraduccional adicional y distribucion.
Un “peptido senal heterologo”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de a-Gal A, significa un peptido senal que no es el peptido senal de la a-Gal A humana, normalmente el peptido senal de alguna protema de mamffero diferente de a-Gal A.
Los expertos reconoceran que la secuencia de ADN de a-Gal A humana (o bien ADNc [SEQ ID NO: 5] o bien ADN genomico), o secuencias que difieren del ADN de a-Gal A humana debido o bien a cambios silenciosos de codones o a cambios de codones que producen sustituciones de aminoacidos conservadoras, pueden usarse para modificar geneticamente celulas humanas cultivadas de modo que sobreexpresen y secreten la enzima. Ciertas mutaciones en la secuencia de ADN de a-Gal A pueden codificar para polipeptidos que conservan o muestran actividad enzimatica de a-Gal A mejorada. Por ejemplo, podna esperarse que las sustituciones de aminoacidos conservadoras tengan poco o ningun efecto sobre la actividad biologica, particularmente si representan menos del 10% del numero total de los residuos en la protema. Las sustituciones conservadoras incluyen normalmente
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sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; acido aspartico, acido glutamico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Vease, por ejemplo, la patente estadounidense 5.356.804.
Enfermedad de Fabry
La enfermedad de Fabry es un trastorno genetico provocado por la actividad deficiente de la enzima a-Gal A. Por “deficiencia de a-Gal A”, se quiere decir cualquier deficiencia de la cantidad o actividad de esta enzima en un paciente, que da como resultado acumulaciones anomalas de glicolfpidos neutros (por ejemplo, globotriaosilceramida) en histiocitos de las paredes de los vasos sangumeos, con angioqueratomas en los muslos, nalgas y genitales, hipohidrosis, parestesia en las extremidades, cornea verticillata y cataratas subcapsulares posteriores de tipo rayo. Los depositos de este material pueden dar como resultado dolor, enfermedad renal y cardiovascular grave y accidente cerebrovascular. La acumulacion de glicolfpidos puede inducir smtomas graves tal como se observa normalmente en varones que padecen la enfermedad de Fabry. Alternativamente, la acumulacion puede inducir smtomas relativamente leves, tal como puede observarse algunas veces en mujeres heterocigoticas que portan el gen defectuoso. Los individuos afectados tienen una esperanza de vida acortada en gran medida; la muerte resulta normalmente de complicaciones renales, cardiacas o cerebrovasculares a aproximadamente 40 anos de edad. No existen tratamientos espedficos para esta enfermedad. La enfermedad de Fabry, clasificada como trastorno de almacenamiento lisosomal, afecta a mas de 15.000 personas en todo el mundo.
La enfermedad de Fabry tal como se definio anteriormente es un smdrome clmico complejo caracterizado por una afectacion multiorganica y multisistemica. Los pacientes que manifiestan la combinacion de distrofia de la cornea, lesiones cutaneas (angioqueratoma), neuropatfa dolorosa, enfermedad vascular cerebral, cardiomiopatfa y disfuncion renal se clasifican como que presentan el fenotipo “clasico”. Sin embargo, existen pacientes que manifiestan algunos, pero no todos, los aspectos del fenotipo clasico. Estos pacientes se clasifican como “variantes atfpicas de la enfermedad de Fabry”. Existen varios fenotipos de variantes atfpicas asociados con deficiencia de a- galactosidasa. Por ejemplo, algunos pacientes con deficiencia de a-galactosidasa tienen una variacion de la enfermedad de Fabry con solo afectacion cardiaca, por ejemplo, hipertrofia ventricular izquierda (HVI). Existe tambien otro fenotipo de variante en el que los pacientes presentan solo afectacion renal. Aunque ambos de estos fenotipos de variante se han definido en hombres hemicigoticos, las formas variantes de la enfermedad de Fabry tambien se han descrito en mujeres heterocigoticas.
Los pacientes con la variante cardiaca atfpica presentan generalmente enfermedad asintomatica mas tarde en su vida. La edad media de diagnostico para los pacientes con el fenotipo de variante cardiaca es de aproximadamente 52 anos en comparacion con aproximadamente 29 anos para el fenotipo clasico (Desnick, et al., en The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 6a edicion (1996). Scriver, et al., (eds), McGraw-Hill (Nueva York). pags. 2741-2784; Meikle, et al., J. Am. Med. Assoc. 281: 249 - 254 (1999)). Los pacientes con este smdrome presentan a menudo smtomas sutiles de disfuncion cardiaca tales como disnea por esfuerzo. Habitualmente, un analisis ecocardiografico convencional revela que los pacientes con el fenotipo de variante cardiaca tienen hipertrofia ventricular izquierda (HVI) o hipertrofia septal asimetrica. Sin embargo, los pacientes tambien pueden presentar infarto de miocardio o cardiomiopatfa (Scheidt, et al., New Engl. J. Med. 324: 395 - 399 (1991); Nakao, et al., New Engl. J. Med. 333: 288 - 293 (1995)). Estos pacientes se someten a menudo a biopsias de miocardio, y la patologfa del smdrome de la variante es esencialmente similar a la enfermedad de Fabry clasica: infiltracion de miocardio por glicolfpido depositado. Los ensayos enzimaticos de a-galactosidasa A en estos pacientes revelan un amplio intervalo de niveles enzimaticos. Por ejemplo, se ha notificado que pacientes con la variante cardiaca tienen niveles de hasta al 30% de los normales de actividad enzimatica de a-galactosidasa A, y, por tanto, hasta ahora no se han considerado como candidatos para una terapia sustitutiva de a-Gal A.
Los inventores han descubierto ahora de manera inesperada que, aunque los pacientes con la variante cardiaca atfpica o la variante renal atfpica pueden tienen niveles de actividad enzimatica de a-galactosidasa A que son relativamente altos en comparacion con pacientes con el fenotipo clasico de la enfermedad de Fabry, estos pacientes tambien pueden beneficiarse de la terapia con la enzima a-galactosidasa A. Por ejemplo, los pacientes pueden tener una mutacion que produce una enzima a-Gal A cineticamente inestable en la celula, y en estos pacientes pueden aumentarse significativamente los niveles de enzima a-Gal A mediante la administracion de preparaciones de a-Gal A de la presente invencion. Ademas, se ha notificado que algunos pacientes con el fenotipo de variante cardiaca atfpica tienen una mutacion puntual en el aminoacido 215 de la a-galactosidasa A. Este aminoacido en la protema no mutada es una asparagina que esta glicosilada (Eng, et al., Am. J. Hum. Genet. 53: 1186 - 1197. (1993)). Por tanto, la terapia sustitutiva con la enzima a-Gal A con una preparacion de a-galactosidasa A apropiadamente glicosilada de la presente invencion puede ser eficaz en estos pacientes. Ademas, se han notificado pacientes con la variante renal atfpica cuya unica manifestacion clmica de la enfermedad de Fabry es proteinuria leve. Sin embargo, la biopsia renal revela las inclusiones tfpicas de glicolfpidos de la enfermedad de Fabry y el ensayo enzimatico de a-Gal A revela niveles de a-Gal A inferiores a los normales. Sin embargo, debido a que puede detectarse trihexosido de ceramida depositado en el rinon en celulas tubulares renales desprendidas en el sedimento de la orina de estos pacientes, la administracion de preparaciones de a-Gal A de la presente invencion puede reducir sustancialmente estos niveles. Enzimas lisosomales tales como a-Gal A se
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dirigen al compartimento lisosomal de una celula a traves de la interaccion con el receptor de manosa-6-fosfato (M6P), que se une a residuos de M6P presentes en los restos de oligosacaridos de enzimas destinadas al compartimento lisosomal. Komfeld & Mellman, Ann. Rev. Cell Biol. 5: 483-525 (1989). La interaccion primaria se produce en el aparato de Golgi, en el que las enzimas unidas a receptores de M6P del aparato de Golgi se segregan para su transporte hasta los lisosomas. Se cree que tiene lugar un tipo de interaccion secundario entre la a-Gal A extracelular y los receptores de M6P en la superficie celular. Las enzimas que escapan del sistema de encaminamiento se secretan por la celula mediante la ruta secretora constitutiva y a menudo vuelven a capturarse por los receptores de M6P de la superficie celular que devuelven la a-galactosidasa A al lisosoma mediante la ruta endoctica. Las sustancias extracelulares internalizadas por las celulas se transportan a traves del citoplasma en vesmulas endodticas, que se fusionan con lisosomas primarios y vadan su contenido en los lisosomas. En este proceso, los receptores de M6P de la superficie celular tambien se incorporan en las vesfculas endodticas y se transportan hasta los lisosomas. En particular, las preparaciones de a-Gal A en las que estan presentes altos niveles de sialilacion y/o fosforilacion, se prefieren para el tratamiento de pacientes con variantes atfpicas de la enfermedad de Fabry. Tales preparaciones, por ejemplo, minimizan la fraccion de la a-Gal A inyectada que se elimina por los hepatocitos y permiten altos niveles de captacion de a-Gal A por celulas que no son hepaticas, tales como celulas renales, celulas vasculares, celulas tubulares, celulas glomerulares, miocitos cardiacos y celulas vasculares cardiacas.
La a-Gal A extracelular que lleva residuos de M6P puede unirse a receptores de M6P de la superficie celular y transportarse en el compartimento lisosomal. Una vez en el compartimento lisosomal, una a-Gal A puede llevar a cabo la funcion apropiada. Es este aspecto del trafico enzimatico lisosomal el que hace que la terapia sustitutiva con la enzima a-galactosidasa A sea un tratamiento terapeutico viable para los pacientes con la enfermedad de Fabry. Por tanto, incluso si una celula es geneticamente deficiente en la produccion de a-Gal A, la celula puede captar a-Gal A extracelular si la a-Gal A esta adecuadamente glicosilada y la celula deficiente lleva receptores de M6P. En pacientes con la enfermedad de Fabry, las celulas endoteliales vasculares del rinon y del corazon presentan anomalfas histopatologicas graves y contribuyen a la patologfa clmica de la enfermedad. Estas celulas, que portan receptores de M6P, son una diana terapeutica particular de a-Gal A. Se proporciona una preparacion de a-Gal A en la que esta presente M6P en los oligosacaridos unidos en N.
El grado en el que los oligosacaridos unidos en N de a-Gal A se modifican mediante la sialilacion tiene un efecto sustancial sobre la farmacocinetica y biodistribucion de a-Gal A. En ausencia de sialilacion apropiada, a-Gal A se aclara rapidamente de la circulacion debido a la union mediante receptores de asialoglicoprotema hepaticos (receptores Ashwell), seguido por la internalizacion y degradacion por los hepatocitos. Ashwell & Harford, Ann. Rev. Biochem. 51: 531-554 (1982). Esto disminuye la cantidad de a-Gal A disponible en la circulacion para su union a receptores de M6P sobre las celulas, lo que contribuye a la patologfa clmica de la enfermedad de Fabry, tal como las celulas endoteliales vasculares del rinon y corazon. La a-Gal A secretada por celulas humanas modificadas geneticamente tiene propiedades de glicosilacion que son adecuadas para el tratamiento de la enfermedad de Fabry o bien mediante la administracion farmaceutica convencional de la protema secretada purificada o bien mediante terapia genica, sin requerir modificacion enzimatica adicional tal como se ha notificado que se requiere para la enzima lisosomal, glucocerebrosidasa, en la que la captacion de enzima glucocerebrosidasa purificada mediante celulas clmicamente relevantes requiere modificacion enzimatica compleja de la enzima tras la purificacion a partir de placenta humana. Beutler, New Engl. J. Med. 325: 1354-1360 (1991).
Celulas adecuadas para la produccion de a-Gal A
Un individuo que se sospecha que tiene una deficiencia de a-Gal A tal como enfermedad de Fabry puede tratarse con a-Gal A humana purificada obtenida a partir de celulas cultivadas, geneticamente modificadas, preferiblemente celulas humanas.
Cuando las celulas deben modificarse geneticamente para los fines de tratamiento de la enfermedad de Fabry, las celulas pueden modificarse mediante procedimientos de ingeniena genetica convencionales o mediante activacion genica.
Segun procedimientos convencionales, una molecula de ADN que contiene una secuencia de ADNc o ADN genomico de a-Gal A puede estar contenida dentro de un constructo de expresion y transfectarse en celulas primarias, secundarias o inmortalizadas mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, transfeccion mediada por liposomas, polibreno o DEAE dextrano, electroporacion, precipitacion con fosfato de calcio, microinyeccion o micropoyectiles impulsados por velocidad (“biolfstica”) (vease, por ejemplo, una solicitud copendiente, USNN 08/334.797).
Alternativamente, puede usarse un sistema que suministre la informacion genetica mediante un vector viral. Los virus que se sabe que son utiles para la transferencia genica incluyen adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, virus de las paperas, poliovirus, retrovirus, virus Sindbis y virus vaccinia tal como virus de la viruela del canario.
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Alternativamente, las celulas pueden modificarse usando un enfoque de activacion genica (“GA”), tal como se describe en las patentes estadounidenses 5.733.761 y 5.750.376. La a-Gal A preparada mediante activacion genica se denomina en el presente documento GA-GAL.
Por consiguiente, se pretende que la expresion “geneticamente modificado”, tal como se usa en el presente documento en referencia a celulas, abarque celulas que expresan un producto genico particular tras la introduccion de una molecula de ADN que codifica para el producto genico y/o elementos reguladores que controlan la expresion de una secuencia codificante para el producto genico. La molecula de ADN puede introducirse mediante seleccion como diana de genes o recombinacion homologa, es decir, introduccion de la molecula de ADN en un sitio genomico particular. La recombinacion homologa puede usarse para sustituir el propio gen defectuoso (puede sustituirse el gen de a-Gal A defectuoso o una parte del mismo en las propias celulas del paciente con la enfermedad de Fabry por el gen completo o una parte del mismo).
Tal como se usa en el presente documento, la expresion “celula primaria” incluye celulas presentes en una suspension de celulas aisladas de una fuente de tejido de vertebrado (antes de sembrarse en placas, es decir, fijadas a un sustrato de cultivo de tejidos tal como una placa o frasco), celulas presentes en un explante derivado del tejido, ambos tipos previos de celulas sembradas en placa por primera vez y suspensiones de celulas derivadas de estas celulas sembradas en placa.
“Celulas secundarias” se refiere a celulas en todas las etapas posteriores de cultivo. Es decir, la primera vez que se retira una celula primaria sembrada en placa del sustrato de cultivo y se vuelve a sembrar en placa (pase), se denomina celula secundaria, como todas las celulas en pases posteriores.
Una “cepa celular” consiste en celulas secundarias que se han pasado una o mas veces; presentan un numero finito de duplicaciones medias de la poblacion en cultivo; presentan las propiedades de crecimiento inhibido por contacto, dependiente de anclaje (excepto para celulas propagadas en cultivo en suspension); y no estan inmortalizadas.
Por “celula inmortalizada” se quiere decir una celula de una lmea celular establecida que presenta una vida util aparentemente ilimitada en cultivo.
Los ejemplos de celulas primarias o secundarias incluyen fibroblastos, celulas epiteliales incluyendo celulas epiteliales mamarias e intestinales, celulas endoteliales, elementos formados de la sangre incluyendo linfocitos y celulas de la medula osea, celulas gliales, hepatocitos, queratinocitos, celulas musculares, celulas neurales o los precursores de estos tipos de celulas. Los ejemplos de lmeas celulares humanas inmortalizadas utiles en los presentes procedimientos incluyen, pero no se limitan a, celulas de melanoma de Bowes (numero de acceso de la ATCC CRL 9607), celulas Daudi (numero de acceso de la ATCC CCL 213), celulas HeLa y derivados de celulas HeLa (numeros de acceso de la ATCC CCL 2, CCL 2,1, y CCL 2,2), celulas HL-60 (numero de acceso de la ATCC CCL 240), celulas HT-1080 (numero de acceso de la ATCC CCL 121), celulas Jurkat (numero de acceso de la ATCC TIB 152), celulas de carcinoma KB (numero de acceso de la ATCC CCL 17), celulas de leucemia K-562 (numero de acceso de la ATCC CCL 243), celulas de cancer de mama MCF-7 (numero de acceso de la ATCC BTH 22), celulas MOLT-4 (numero de acceso de la ATCC 1582), celulas Namalwa (numero de acceso de la ATCC CRL 1432), celulas Raji (numero de acceso de la ATCC CCL 86), celulas RPMI 8226 (numero de acceso de la ATCC CCL 155), celulas U-937 (numero de acceso de la ATCC CRL 1593), celulas 2R4 sublmea WI-38VA13 (numero de acceso de la ATCC CLL 75.1), celulas CCRF-CEM (numero de acceso de la ATCC CCL 119) y celulas de carcinoma de ovario 2780AD (Van der Blick et al., Cancer Res. 48: 5927-5932, 1988), asf como celulas de heterohibridoma producidas mediante fusion de celulas humanas y celulas de otras especies.
Tras la modificacion genetica de celulas humanas para producir una celula que secreta a-Gal A, puede generarse una cepa celular clonal que consiste esencialmente en una pluralidad de celulas humanas primarias cultivadas geneticamente identicas o, cuando las celulas estan inmortalizadas, una lmea celular clonal que consiste esencialmente en una pluralidad de celulas humanas inmortalizadas geneticamente identicas. En una realizacion, las celulas de la cepa celular clonal o lmea celular clonal son fibroblastos. En una realizacion preferida, las celulas son fibroblastos humanos secundarios, por ejemplo, celulas BRS-11.
Tras la modificacion genetica, las celulas se cultivan en condiciones que permiten la secrecion de a-Gal A. La protema se afsla de las celulas cultivadas recogiendo el medio en el que se hacen crecer las celulas, y/o lisando las celulas para liberar su contenido, y aplicando luego tecnicas de purificacion de protemas.
Purificacion de a-Gal A a partir de medio condicionado de celulas transfectadas de manera estable.
La protema a-Gal A se afsla de las celulas cultivadas (“celulas de produccion de a-Gal A”) recogiendo el medio en el que se hacen crecer las celulas, o lisando las celulas para liberar su contenido, y aplicando luego tecnicas de purificacion de protemas sin el uso de cromatograffa de afinidad de lectina. El procedimiento de purificacion preferido se expone en el ejemplo 2 a continuacion.
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Tambien pueden usarse para purificar a-Gal A resinas de interaccion hidrofoba alternativas, tales como Source Iso (Pharmacia), Macro-Prep® Methyl Support (Bio-Rad), TSK Butyl (Tosohaas) o fenil-Sepharose® (Pharmacia). La columna puede equilibrarse en una concentracion relativamente alta de una sal, por ejemplo sulfato de amonio 1 M o cloruro de sodio 2 M, en un tampon de pH 5,6. La muestra que va a purificarse se prepara ajustando el pH y la concentracion de sal hasta las del tampon de equilibrado. Se aplica la muestra a la columna y se lava la columna con tampon de equilibrado para eliminar el material no unido. Se eluye la a-Gal A de la columna con un tampon de fuerza ionica inferior, agua o disolvente organico en agua, por ejemplo etanol al 20% o propilenglicol al 50%. Alternativamente, puede hacerse que la a-Gal A fluya a traves de la columna usando una concentracion inferior de sal en el tampon de equilibrado y en la muestra o usando un pH diferente. Pueden unirse otras protemas a la columna, dando como resultado la purificacion de la muestra que contiene a-Gal A que no se unio a la columna. Una primera etapa de purificacion preferida es el uso de una columna de hidroxiapatito.
Una etapa alternativa de purificacion puede usar una resina de intercambio cationico, por ejemplo SP Sepharose® 6 Fast Flow (Pharmacia), Source 30S (Pharmacia), CM Sepharose® Fast Flow (Pharmacia), MacroPrep® CM Support (Bio-Rad) o Macro-Prep® High S Support (Bio-Rad), para purificar la a-Gal A. La “primera etapa de cromatograffa” es la primera aplicacion de una muestra a una columna de cromatograffa (se excluyen todas las etapas asociadas con la preparacion de la muestra). La a-Gal A puede unirse a la columna a pH 4,4. Puede usarse para equilibrar la columna un tampon, tal como acetato de sodio 10 mM, pH 4,4, citrato de sodio 10 mM, pH 4,4 u otro tampon con capacidad de tamponamiento adecuada a aproximadamente pH 4,4. La muestra que va a purificarse se ajusta hasta el pH y la fuerza ionica del tampon de equilibrado. Se aplica la muestra a la columna y se lava la columna tras la carga para eliminar el material no unido. Puede usarse una sal, tal como cloruro de sodio o cloruro de potasio, para eluir la a-Gal A de la columna. Alternativamente, la a-Gal A puede eluirse de la columna con un tampon de pH superior o una combinacion de concentracion de sal superior y pH superior. La a-Gal A tambien puede hacerse fluir a traves de la columna durante la carga aumentando la concentracion de sal en el tampon de equilibrio y en la carga de la muestra, haciendo correr la columna a un pH superior o mediante una combinacion tanto de aumento de sal como de pH superior.
Otra etapa de purificacion puede usar una resina Q Sepharose® 6 Fast Flow para la purificacion de a-Gal A. Q Sepharose® 6 Fast Flow es una resina de intercambio anionico relativamente fuerte. Tambien puede usarse una resina de intercambio anionico mas debil, tal como DEAE Sepharose® Fast Flow (Pharmacia) o Macro-Prep® DEAB (Bio-Rad), para purificar a-Gal A. La columna se equilibra en un tampon, por ejemplo, fosfato de sodio 10 mM, pH 6. El pH de la muestra se ajusta hasta pH 6 y se obtiene una fuerza ionica baja mediante dilucion o diafiltracion de la muestra. Se aplica la muestra a la columna en condiciones que unen la a-Gal A. Se lava la columna con tampon de equilibrado para eliminar el material no unido. Se eluye la a-Gal A con aplicacion de sal, por ejemplo, cloruro de sodio o cloruro de potasio, o aplicacion de un tampon de pH inferior, o una combinacion de aumento de sal y de pH inferior. La a-Gal A tambien puede hacerse fluir a traves de la columna durante la carga aumentando la concentracion de sal en la carga o haciendo correr la columna a un pH inferior, o mediante una combinacion tanto de aumento de sal como de pH inferior.
Otra etapa de purificacion puede usar una cromatograffa de exclusion molecular Superdex® 200 (Pharmacia) para la purificacion de a-Gal A. Otras resinas de cromatograffa de exclusion molecular tales como Sephacryl® S-200 HR o Bio-Gel® A-1.5 m tambien pueden usarse para purificar la a-Gal A. El tampon preferido para la cromatograffa de exclusion molecular es fosfato de sodio 25 mM, pH 6,0, que contiene cloruro de sodio 0,15 M. Tambien pueden usarse otros tampones compatibles con la formulacion, por ejemplo, citrato de potasio o de sodio 10 mM. El pH del tampon puede estar entre pH 5 y pH 7 y debe contener una sal, por ejemplo, cloruro de sodio o una mezcla de cloruro de sodio y cloruro de potasio.
Otra etapa de purificacion puede usar una resina de cromatoenfoque tal como Polybuffer Exchanger PBE 94 (Pharmacia) para purificar la a-Gal A. La columna se equilibra a pH relativamente alto (por ejemplo, pH 7 o superior), el pH de la muestra que va a purificarse se ajusta hasta el mismo pH y se aplica la muestra a la columna. Se eluyen las protemas con un gradiente de pH decreciente hasta un pH tal como pH 4, usando un sistema de tampon, por ejemplo, Polybuffer 74 (Pharmacia), que se habfa ajustado hasta pH 4.
Alternativamente, puede usarse cromatograffa de inmunoafinidad para purificar la a-Gal A. Puede inmovilizarse un anticuerpo policlonal o monoclonal apropiado frente a a-Gal A (generado mediante inmunizacion con a-Gal A o con un peptido derivado de la secuencia de a-Gal A usando tecnicas convencionales) sobre una resina de acoplamiento activada, por ejemplo Sepharose® 4 Fast Flow (Pharmacia) activada con NHS o Sepharose® 4 Fast Flow (Pharmacia) activada con CNBr. La muestra que va a purificarse puede aplicarse a la columna con anticuerpo inmovilizado a aproximadamente pH 6 o pH 7. Se lava la columna para eliminar el material no unido. Se eluye la a-Gal A de la columna con reactivos ffpicos utilizados para elucion de columna de afinidad tales como pH bajo, por ejemplo, pH 3, desnaturalizante, por ejemplo, guanidina HCl o tiocianato, o disolvente organico, por ejemplo, propilenglicol al 50% en un tampon a pH 6. El procedimiento de purificacion tambien puede usar una resina de afinidad de quelatos de metal, por ejemplo, Sepharose® Fast Flow (Pharmacia) quelante para purificar la a-Gal A. La columna se carga previamente con iones metalicos, por ejemplo Cu2+, Zn2+, Ca2+, Mg2+ o
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Cd2+. La muestra que va a purificarse se aplica a la columna a un pH apropiado, por ejemplo, de pH 6 a pH 7,5 y se lava la columna para eliminar las protemas no unidas. Se eluyen las protemas unidas mediante elucion competitiva con imidazol o histidina o disminuyendo el pH usando citrato de sodio o acetato de sodio hasta un pH inferior a 6, o introduciendo agentes quelantes, tales como EDTA o EGTA.
Segun los protocolos anteriores, se proporcionan preparaciones con una preparacion de a-Gal A de pureza superior a la preparada en la tecnica anterior, purificada hasta al menos una homogeneidad del 98%, mas preferiblemente hasta al menos una homogeneidad del 99% y lo mas preferiblemente hasta al menos una homogeneidad del 99,5%, tal como se mide mediante SDS-PAGE o HPLC en fase inversa. Las preparaciones de a- Gal A pueden comprender numerosas glicoformas de la a-Gal A. Por consiguiente, el termino “homogeneidad”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de preparaciones de a-Gal A, se refiere a preparaciones que estan sustancialmente libres (<2% de las protemas totales) de protemas diferentes de a-Gal A. Ejemplos de protemas que no son a-Gal A tales como albumina, protemas que no son a-Gal A producidas por la celula huesped y protemas que no son a-Gal A aisladas de tejido o fluido animal. La actividad espedfica de las preparaciones de a- Gal A de la presente invencion es preferiblemente al menos de 2,0 x 106 unidades/mg de protema, mas preferiblemente al menos de 3,0 x 106 unidades/mg de protema y lo mas preferiblemente al menos de 3,5 x 106 unidades/mg de protema.
Mejora de la semivida en circulacion de preparaciones de a-Gal A mediante remodelacion con glucanos para aumentar la carga de oligosacaridos
Se proporciona un programa de modificacion con glicoprotema para lograr un aumento de la captacion de una enzima terapeutica en tejidos espedficos diferentes de hngado y macrofagos usando los procedimientos divulgados en el presente documento, se obtienen preparaciones de a-Gal A glicosilada humana, en las que entre el 35% y el 85% de los oligosacaridos estan cargados, estando preferiblemente al menos el 50% de los oligosacaridos cargados.
La N-glicosilacion de protemas funciona modificando residuos de asparagina apropiados de protemas con estructuras de oligosacaridos, influyendo asf en sus propiedades y bioactividades. Kukuruzinska & Lennon, Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 9: 415-48 (1998). Se proporciona una preparacion de a-Gal A aislada en la que un alto porcentaje de los oligosacaridos estan cargados negativamente, principalmente mediante la adicion de uno a cuatros residuos de acido sialico sobre glucanos complejos, o de uno a dos restos fosfato sobre glucanos con alto contenido en manosa, o de un unico fosfato y un unico acido sialico sobre glucanos hfbridos. Tambien pueden estar presentes cantidades mas pequenas de glucanos complejos sulfatados. Una alta proporcion de estructuras cargadas sirve para dos funciones principales. En primer lugar, la limitacion ocupacion de los penultimos residuos de galactosa mediante acido sialico unido en 2,3 o en 2,6 evita la eliminacion prematura de la circulacion mediante el receptor de asialoglicoprotema presente en hepatocitos. Este receptor reconoce glicoprotemas con residuos de galactosa terminales. El aumento de la semivida en circulacion de a-Gal A da a organos diana importantes tales como el corazon y el rinon la oportunidad de endocitar mayores cantidades de enzima del plasma tras la infusion de la enzima. En segundo lugar, la presencia de Man-6-fosfato en glucanos hfbridos o con alto contenido en manosa proporciona una oportunidad para la captacion mediada por receptor mediante el receptor de Man-6-fosfato independiente de cation (CI-MPR). Esta captacion mediada por receptor se produce sobre la superficie de muchas celulas, incluyendo celulas endoteliales vasculares, que son un sitio de almacenamiento importante de CTH en pacientes con Fabry. Las moleculas de enzima con dos residuos de Man-6-fosfato tienen una afinidad mucho mayor por el CI-MPR que las que tienen un unico Man-6-fosfato. Se proporcionan estructuras de glucano representativas en la tabla 1.
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Tabla 1
_______________________________Estructuras de glucano representativas_________
Un glucano con dos antenas:
±Fucal,6
SAa2,3/6Galpl,4GlcNAcpi,2Manal,6 \ |
ManP 1,4GlcNAcP 1,4GlcNAc-Asn S Aa2,3/6Gaip 1,4GlcNAcp 1,2ManaI,3 /
Un glucano con cuatro antenas:
SAct2,3/6Galp 1,4GlcNAcP 1,6 \ ±Fucal,6
SAa2,3/6Galpl,4GlcNAcpi,2Manal,6 \ |
ManI3 l,4GlcNAcf31,4GlcNAc-Asn S Aa2,3/6Galp 1,4GlcNAcp 1,2Manctl,3 /
SAa2,3/6Gaipi,4GlcNAcpl,4 /
Un glucano con alto contenido en manosa:
Mana 1,2Manal,6 \
Manal,6 \
Mana 1,2Mana 1,3/ Manpi,4GlcNAcP 1,4GlcNAc-Asn
Manal,2Manal,2Manal,3 /
Un glucano hlbrido fosforilado:
P-Manal,6 \
Manal,6 \
Mana 1,3 / Manpi,4GlcNAcpi,4G1cNAc-Asn
SAa2,3/6Galpl,4GlcNAcpi,2Manal,3 /
Un glucano bifosforilado:
P-Manal,2Manal,6 \
Manal,6 \
Mana 1,3 / Manpi,4GlcNAcpi,4GlcNAc-Asn P-Manal,2Manal,3 /
La biosfntesis de N-glicoprotefnas implica una multitud de enzimas, glicosiltransferasas y glicosidasas. La mayona de estas enzimas funcionan en el retfculo endoplasmatico (RE) y aparato de Golgi de una manera ordenada y bien orquestada. La complejidad de la N-glicosilacion aumenta por el hecho de que pueden modificarse diferentes residuos de asparagina dentro del mismo polipeptido con diferentes estructuras de oligosacaridos, y se distinguen diversas protemas entre s^ mediante las caractensticas de sus restos de hidratos de carbono. Recientes avances en la genetica molecular han acelerado la identification, aislamiento y caracterizacion de los genes de N-glicosilacion. Como resultado, ha surgido information referente a las relaciones entre la N-glicosilacion y otras funciones celulares.
El procesamiento de glicoprotemas unidas en N en la celula comienza cuando se anade una cadena de oligosacarido con Glc3Man9GlcNAc2 a una asparagina aceptora en un peptido naciente en el lumen del RE como una unica unidad. Se construye una cadena de oligosacarido de catorce azucares que consiste en Glc3Man9GlcNAc2 en dolicol, un alcohol alifatico de cadena muy larga:
Manal,2Manal,6 \
Manal,6 \
Manal,2Mana 1,3 / ManPl,4GlcNAc(il,4GlcNAc-PP- Dolicol Glca 1,2Glca 1,3Glca 1,3Mana 1,2Mana 1,2Mana 1,3 /
Este oligosacarido se transfiere como una unica unidad a un residuo de asparagina aceptora en una cadena de peptido naciente en el lumen del RE. El gran tamano del glucano en relacion con el peptido puede guiar el plegado de la protema. Los tres residuos de glucosa sirven como una senal de que el oligosacarido esta completo
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y listo para su transferencia mediante la oligosacaril transferasa. Esta enzima tambien transferira oligosacaridos no glucosilados pero solo a una fraccion de la tasa de la cadena completada debido a que estos son sustratos inferiores a los optimos. Se ha mostrado que una forma de smdrome de glicoprotema deficiente en hidratos de carbono en seres humanos esta provocada por una deficiencia de Dolicol-P-Glc: MangGlcNAc2-PP-Dolicol glucosil transferasa, la primera enzima en la ruta de adicion de glucosa, que da como resultado la hipoglicosilacion de protemas sericas. Korner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13200-13205 (1998). Tras la eliminacion de los tres residuos de glucosa y lograr la conformacion correcta, la glicoprotema recien sintetizada se exporta al aparato de Golgi. Dependiendo de la accesibilidad del glucano a manosidasas del aparato de Golgi tras el plegamiento de la protema, la cadena de glucano puede permanecer como una cadena con alto contenido en manosa con 5-9 residuos de manosa. Alternativamente, la cadena de glucano puede procesarse adicionalmente para dar un nucleo de trimanosilo, y convertirse en un aceptor para otras glicosil transferasas que forman cadenas complejas mediante la adicion de mas residuos de GlcNac, seguido por Gal, NeuAc y Fuc. Una tercera posibilidad, si la protema tiene dos residuos de lisina separados exactamente por 34 angstroms y en la relacion espacial correcta respecto a una cadena con alto contenido en manosa, es la adicion de GlcNAca-1-PO4 sobre el carbono 6 de uno, o algunas veces dos, residuos de manosa. Cuozzo et al., J. Biol. Chem. 273: 21069-21076 (1998). Tras la eliminacion de la GlcNac unida en a mediante una enzima espedfica, se genera un epftopo de M6P terminal que se reconoce por un receptor de M6P en la red de Golgi en trans que luego dirige estas enzimas hacia lisosomas en celulas de origen mesenquimal.
Para dirigir a-Gal A a tantos tejidos diferentes como sea posible, son utiles muchas estructuras de hidratos de carbono diferentes (glicoformas). Matsuura et al., Glycobiology 8: 329-339 (1998) notificaron que las estructuras de glucano en a-Gal A humana preparada en celulas CHO teman un 41% de glucanos con alto contenido en manosa y el nivel de fosforilacion era del 24%. Sin embargo, el nivel de glucanos complejos sialilados era de solo el 11%. Por tanto, 2/3 de las cadenas complejas no estaban sialiladas, lo que da como resultado la rapida eliminacion de la a-Gal A por el hffgado. La a-Gal A producida en las celulas humanas de la invencion tienen un porcentaje superior de oligosacaridos cargados que la a-Gal A de la tecnica anterior producida en celulas CHO. Por ejemplo, la a-Gal A sintetizada en celulas HT-1080 descrita en el presente documento es particularmente adecuada, debido a que la a-Gal A producida en celulas HT-1080 contiene aproximadamente un 15% de estructuras neutras (con alto contenido en manosa e hffbridas), aproximadamente un 16% de glucanos fosforilados y aproximadamente un 67% de glucanos complejos con de 2 a 4 residuos de acido sialico. Por tanto, esencialmente todas las cadenas complejas estan sialiladas en comparacion con la a-Gal A producida en celulas CHO. La a-Gal A de celulas HT-1080 tiene tres sitios de glicosilacion unidos en N. Dos sitios se procesan para dar glucanos complejos en el aparato de Golgi, mientras que el tercer sitio esta ocupado por un glucano con alto contenido en manosa, el 50% del cual esta modificado mediante fosforilacion espedfica de enzimas lisosomales para producir tanto especies monofosforiladas como difosforiladas.
Se proporcionan cuatro enfoques para la remodelacion con hidratos de carbono en una protema que contiene cadenas de glucano unidas en N. En primer lugar, puede aumentarse la proporcion de a-Gal A cargada mediante el aislamiento selectivo de glicoformas durante el procedimiento de purificacion. La presente invencion proporciona el aumento de la proporcion de glicoformas de a-Gal A sumamente cargadas y de peso molecular superior mediante el fraccionamiento de especies de a-Gal A en resinas de columna de cromatograffa durante y/o tras el procedimiento de purificacion. Las especies de glicoformas de a-Gal A mas sumamente cargadas contienen mas acido sialico y/o mas fosfato, y las glicoformas de peso molecular superior tambien contendran las especies completamente glicosiladas, lo mas sumamente ramificadas y sumamente cargadas. La seleccion de especies cargadas, o la eliminacion de las especies de a-Gal A no glicosiladas, escasamente glicosiladas o escasamente sialiladas y/o fosforiladas dara como resultado una poblacion de glicoformas de a-Gal A con mas acido sialico y/o mas fosfato, proporcionando por tanto una preparacion de a-Gal A con semivida superior y eficacia terapeutica potencial.
Este procedimiento de fraccionamiento puede producirse en, pero no se limita a, resinas de columna cromatograficas adecuadas utilizadas para purificar o aislar a-Gal A. Por ejemplo, el fraccionamiento puede producirse en, pero no se limita a, resinas de intercambio cationico (tales como SP-Sepharose®), resinas de intercambio anionico (Q-Sepharose®), resinas de afinidad (Heparina-Sepharose®, columnas de lectina), columnas de exclusion molecular (Superdex® 200) y columnas de interaccion hidrofoba (Butil-Sepharose®) y otras resinas de columna cromatograficas conocidas en la tecnica.
Dado que se produce a-Gal A en las celulas como una mezcla heterogenea de glicoformas que difieren en el peso molecular y la carga, a-Gal A tiende a eluir en picos relativamente anchos de las resinas de cromatograffa. Dentro de estas eluciones, las glicoformas se distribuyen de una manera particular dependiendo de la naturaleza de la resina que esta utilizandose. Por ejemplo, en la cromatograffa de exclusion molecular, las glicoformas mas grandes tenderan a eluirse mas pronto en el perfil de elucion que las glicoformas mas pequenas.
En la cromatograffa de intercambio ionico, las glicoformas cargadas mas negativamente tenderan a unirse a una resina cargada positivamente (tal como Q-Sepharose®) con afinidad superior que las glicoformas cargadas menos negativamente, y por tanto tenderan a eluirse mas tarde en el perfil de elucion. En cambio, estas glicoformas cargadas de manera sumamente negativa pueden unirse menos fuertemente a una resina cargada negativamente,
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tal como SP Sepharose®, que las especies cargadas menos negativamente, o incluso puede no unirse en absoluto.
El fraccionamiento de las especies de glicoformas en resinas cromatograficas puede verse influido mediante el pH, fuerza ionica, seleccion de la sal del tampon, viscosidad y/u otros parametros tales como la eleccion del tipo de resina. El uso de diversos tipos de eluciones en gradiente (gradientes lineales en lmea recta, curvada, por ejemplo, gradientes exponenciales) o el uso de una serie de eluciones en etapas cortas para eluir selectivamente especies de a-Gal A de la columna de cromatograffa tambien pueden optimizarse para el fraccionamiento de a-Gal A. Todos estos factores, solos o en combinacion, pueden optimizarse para lograr un fraccionamiento eficaz de las glicoformas. El fraccionamiento tambien puede producirse tras completarse el procedimiento de purificacion, en una resina cromatografica particular optimizada selectivamente para el fraccionamiento y seleccion de la poblacion de glicoformas deseada.
La seleccion de poblaciones de glicoformas a partir de las especies de a-Gal A fraccionadas puede lograrse tras el analisis de las glicoformas de a-Gal A elrndas. El pico de elucion puede analizarse mediante diversas tecnicas tales como, pero sin limitarse a, SDS-PAGE, isoelectroenfoque, electroforesis capilar, HPLC de intercambio ionico analftica y/o HPLC de exclusion molecular analftica. Pueden seleccionarse fracciones particulares que tienen hacia el tamano o perfil de carga deseados. La seleccion puede producirse en cualquier etapa cromatografica del procedimiento, permitiendo la consecucion gradual de la poblacion de glicoformas deseada, o puede limitarse a una etapa o etapas particulares si la eficacia de fraccionamiento de la(s) etapa(s) es alta. El fraccionamiento tambien puede producirse tras completarse el procedimiento de purificacion, en una resina cromatografica particular optimizada selectivamente para el fraccionamiento y seleccion de la poblacion de glicoformas deseada.
El fraccionamiento y seleccion de glicoformas de a-Gal A sumamente cargadas y/o de peso molecular superior puede realizarse en cualquier preparacion de a-Gal A, tal como la derivada de celulas modificadas geneticamente tales como celulas modificadas mediante procedimientos de ingeniena genetica convencionales o mediante activacion genica (GA). Puede realizarse sobre lrneas celulares que se hacen crecer en sistemas optimizados para proporcionar sialilacion y fosforilacion superiores tal como se describio anteriormente, o a-Gal A pegilada tal como se describe a continuacion.
Por ejemplo, en el procedimiento de purificacion de a-Gal A tal como se describe en el presente documento, el fraccionamiento de las glicoformas de a-Gal A puede producirse a diversas etapas en el procedimiento. En la resina hidrofoba, butil-Sepharose® Fast Flow, las glicoformas de a-Gal A mas sumamente cargadas eluyen en primer lugar, seguidas por las especies menos sumamente cargadas. Para la Heparina- Sepharose®, las especies mas sumamente cargadas eluyen tambien en primer lugar en el pico de elucion, seguidas por las especies menos sumamente cargadas. Se produce lo contrario con QSepharose ®, en la que las especies menos sumamente cargadas eluyen en primer lugar, seguidas por las glicoformas mas sumamente cargadas. En la cromatograffa de exclusion molecular sobre Superdex® 200, las glicoformas de peso molecular superior eluyen en primer lugar seguidas por las especies de a-Gal A de peso molecular inferior, menos glicosiladas. Para permitir un fraccionamiento eficaz de poblaciones de glicoformas de a-Gal A particulares, pueden combinarse multiples etapas cromatograficas, todas las cuales fraccionan segun procedimientos ffsicos diferentes. Por ejemplo, para obtener las glicoformas de a-Gal A que contienen el pi inferior (las que contienen la carga mas negativa), la limitacion de la combinacion de las fracciones de butilo que eluyen de manera temprana potenciara la a-Gal A mas sumamente cargada. Continuando con esta combinacion seleccionada en la columna de heparina, y limitando de nuevo la combinacion al mas temprano, las especies de a-Gal A mas sumamente cargadas de manera negativa potencian ademas la proporcion de glicoformas de a-Gal A con pi bajo en la combinacion. El ajuste fino adicional de la poblacion de glicoformas puede realizarse en diversas etapas del procedimiento de purificacion monitorizando la distribucion de carga y tamano de las combinaciones de elucion mediante SDS-PAGE e isoelectroenfoque. Un ejemplo de fraccionamiento por tamano y carga se expone a continuacion en el ejemplo 2.4.
El segundo enfoque para la remodelacion con hidratos de carbono implica modificar ciertas glicoformas en la a-Gal A purificada mediante la fijacion de un residuo de azucar terminal adicional usando una glicosil transferasa purificada y el donador de azucar de nucleotido apropiado. Este tratamiento afecta solo a aquellas glicoformas que tienen un residuo de azucar terminal libre apropiado para actuar como un aceptor para la glicosil transferasa que esta usandose. Por ejemplo, la a2,6-sialil transferasa anade acido sialico en un enlace 2,6 en un aceptor de Galp1,4GlcNAc-R, usando CMP-acido sialico como el donador de azucar de nucleotido. Las enzimas disponibles comercialmente y sus especies de origen incluyen: fucosa a1,3 transferasas III, V y VI (seres humanos); galactosa a1,3 transferasa (porcina); galactosa (31,4 transferasa (bovina); manosa a1,2 transferasa (levaduras); acido sialico a2,3 transferasa (rata); y acido sialico a2,6 transferasa (rata). Tras completarse la reaccion, puede eliminarse la glicosil transferasa de la mezcla de reaccion mediante una columna de afinidad espedfica por glicosil transferasa que consiste en el nucleotido apropiado unido a un gel a traves de un espaciador de 6 carbonos mediante un enlace de pirofosfato (GDP, UDP) o fosfato (CMP) o mediante otros procedimientos cromatograficos conocidos en la tecnica. De las glicosil transferasas enumeradas anteriormente, las sialil transferasas son particularmente utiles para la modificacion de enzimas, tales como a-Gal A, para la terapia sustitutiva con enzimas en pacientes humanos. El uso de cualquier sialil transferasa con acido CMP-5-fluoresceinil-neurammico como donador de azucar de nucleotido produce una glicoprotema marcada de manera fluorescente cuya captacion y ubicacion tisular pueden monitorizarse
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facilmente.
El tercer enfoque para la remodelacion con hidratos de carbono implica la glico-modificacion por ingenieria, por ejemplo, la introduction de genes que afectan a los mecanismos de glicosilacion de la celula, de la celula de production de a-Gal A para modificar el procesamiento postraduccional en el aparato de Golgi es un enfoque preferido.
El cuarto enfoque para la remodelacion con hidratos de carbono implica tratar la a-Gal A con glicosidasas apropiadas para reducir el numero de glicoformas diferentes presentes. Por ejemplo, el tratamiento secuencial de cadenas de glucano complejas con neuraminidasa, p-galactosidasa y p-hexaminidasa escinde el oligosacarido en el nucleo de trimanosa.
La estructura de un glucano unido en N depende de la accesibilidad de la cadena de glucano para las manosidasas de procesamiento del aparato de Golgi despues de que la protema se haya plegado, y la presencia en el aparato de Golgi de una familia de glicosil transferasas y los donadores de azucar de nucleotido apropiados. Muchas de las glicosil transferasas catalizan reacciones de competition, que pueden dar como resultado que la cadena de glucano se alargue de varias formas diferentes y compatibles, dependiendo de que enzima reacciona en primer lugar. Esto da como resultado una microheterogeneidad y la formation de una familia compleja de glicoformas. Algunas estructuras son unicas para un unico tejido, tal como la modificacion de ciertas hormonas hipofisarias mediante la adicion de GalNAc-4-SO4, o estan limitadas a unos pocos organos.
Un ejemplo de lo ultimo es la formacion de una denominada GlcNac biseccionada (GlcNAc unida en p1,4 al nucleo del residuo de p-manosa) en glucanos complejos de la glutamiltranspeptidasa en el rinon, pero no en el higado. Se muestra a continuation una estructura con dos antenas biseccionada en la y-glutamiltranspeptidasa:
±Fucal,6
SAoc2, 3/6Galpl,4GlcNAcpi,2Manctl,6 \ |
G1 cN AcP 1,4ManP 1,4GlcN AcP 1,4GlcN Ac-Asn SAa2,3/6Gaipi,4GlcNAcpl,2Manal,3/
En mamiferos, la enzima responsable, GlcNAc transferasa III (GnT-III), se encuentra en ciertas celulas del cerebro y el rinon y en ciertas celulas del higado en pacientes con hepatocarcinomas. La GnT-III cataliza la adicion de N-acetilglucosamina en enlace p 1-4 a la manosa p-unida del nucleo de trimanosilo de cadenas de azucar unidas en N para producir un residuo de GlcNac biseccionado. Se han clonado los genes de raton, rata y ser humano para la GnT-III. Ihara et al., J. Biochem. (Tokyo) 113: 692-698 (1993).
La presencia de actividad GlcNAc T-III adicional en celulas humanas puede producir un aumento en glucanos hforidos monofosforilados a expensas de los glucanos complejos con dos, tres o cuatro antenas. Esto no debe afectar a la semivida en plasma de manera adversa, pero puede aumentar el direccionamiento hacia celulas endoteliales vasculares. Se muestra a continuacion una estructura representativa:
P-Manal,6\ GlcNAcPl,4
Manal,6 \ |
Manal,3 / Manpi,4GIcNAcpi,4GlcNAc-Asn SAa2>3/6Gaip 1,4GlcNAcP 1,2Manal,3 /
El rinon capta algo de la a-Gal A y da como resultado un descenso significativo en los glicolipidos almacenados. Debido a que el rinon puede formar N-glucanos con residuos de GlcNac biseccionados, las celulas epiteliales renales puede reconocer glicoproteinas con este epftopo con una especificidad particularmente alta.
La actividad GnT-III elevada puede provocar un desequilibrio en la ramification del nucleo de trimanosilo inhibiendo la ramificacion adicional mediante GnT-II, IV, V y Gal p1,4-transferasa al nivel del sustrato. Recientemente, se creo una lmea de celulas de ovario de hamster chino (CHO) que puede producir oligosacaridos biseccionados en glicoprotemas mediante la sobreexpresion de GnT-III recombinante. Sburlati et al., Biotechnol. Progr. 14: 189-192 (1998). Se eligio el interferon p (IFN-p) como proteina heterologa secretada terapeutica potencial y modelo sobre la que podria evaluarse el efecto de la expresion de GnT-III sobre la glicosilacion del producto. Se produjo IFN-p son oligosacaridos biseccionados mediante las celulas CHO modificadas por ingenieria genetica con GnT-III, pero no mediante la lrnea celular original no modificada.
La produccion de productos terapeuticos de glicoprotema requiere la caracterizacion de la glicosilacion con
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respecto a la regularidad lote a lote. Se ha usado la “carga Z de N-glucano hipotetica” como parametro para caracterizar la glicosilacion de protemas de una manera sencilla y eficaz. Se ha validado la determination de Z en multiples experimentos repetitivos y se ha probado que es sumamente precisa y fiable. Hermentin et al, Glycobiology 6: 217-230 (1996). La carga de N-glucano hipotetica de una glicoprotema dada se deduce a partir del perfil de mapeo de N-glucano obtenido mediante cromatografia de intercambio anionico de alta resolution (HPAEC)/deteccion amperometrica pulsada (PAD). En la HPAEC, los N-glucanos se separan claramente segun su carga, por ejemplo, su numero de residuos de acido sialico, proporcionando distintas regiones para estructuras neutras asi como para los N-glucanos mono, di, tri y tetrasialilados. Z se define como la suma de los productos de las areas respectivas (A) en la region asialo, monosialo, disialo, trisialo, tetrasialo y pentasialo, multiplicada cada una por la carga correspondiente:
Z = A(asialo)* + A(MS) *1 + A(DiS) *2 + A(TriS) *3 + A(TetraS) *4 [+ A(pentaS) *5]
Z = ZA(i) • (0
en la que i es 0 en la region asialo, 1 en la region monosialo (MS), 2 en la region disialo (DiS), 3 en la region trisialo (TriS), 4 en la region tetrasialo (TetraS) y 5 en la region pentasialo (PentaS).
Por tanto, una glicoprotema con la mayoria de las estructuras C4-4* proporcionara Z = 400, una glicoprotema que porta en gran parte estructuras C2-2* ascendera a Z = 200 y una glicoprotema que porta solo estructuras truncadas o de tipo con alto contenido en manosa proporcionara Z = 0.
Las preparaciones de a-Gal A glicosilada humana descritas en el presente documento tienen una carga de oligosacaridos, tal como se mide mediante el numero Z, superior a 100, preferiblemente superior a 150 y mas preferiblemente superior a 170.
Alteration de la semivida de a-Gal A en suero mediante fosforilacion
Puede alterarse la fosforilacion de a-Gal A para afectar a la semivida en circulation de a-Gal A y el nivel de a-Gal A que entra en las celulas. La fosforilacion se logra preferiblemente dentro de la celula que expresa a-Gal A. Se contempla espetificamente obtener una preparation de a-Gal A glicosilada con fosforilacion aumentada introduciendo en primer lugar en una celula productora de a-Gal A una secuencia de ADN que codifica para la fosforil transferasa, o introduciendo una secuencia reguladora mediante recombination homologa que regula la expresion de un gen de la fosforil transferasa endogena. Entonces se cultiva la celula de production de a-Gal A en condiciones de cultivo que dan como resultado la expresion de a-Gal A y fosforil transferasa. Entonces puede realizarse el aislamiento de la preparacion de a-Gal A con fosforilacion aumentada en comparacion con la a-Gal A producida en una celula sin el polinucleotido. Tales fosforil tranferasas se conocen bien en la tecnica. Veanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.804.413 y 5.789.247.
Se necesitan las acciones concertadas de dos enzimas del aparato de Golgi unidas a la membrana para generar un marcador de reconocimiento de Man-6-fosfato en una proenzima lisosomal. La primera, UDP-N- acetilglucosamina: glicoprotema N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa (GlcNAc fosfotransferasa), requiere un determinante de reconocimiento de protema en enzimas lisosomales que consiste en dos residuos de lisina separados exactamente por 34 A y en la relation espacial correcta con respecto a una cadena con alto contenido en manosa. La segunda, N-acetilglucosamina-1-fosfodiester a-N-acetilglucosaminidasa (fosfodiester a-GlcNAcasa), hidroliza la union a-GlcNAc-fosfato exponiendo el sitio de reconocimiento de Man-6-fosfato.
Las preparaciones de a-Gal A producidas por los procedimientos de la presente tienen multiples glicoformas, estando entre el 16-50%, preferiblemente el 25-50%, mas preferiblemente al menos el 30% de las glicoformas fosforiladas.
Alteracion de la semivida de a-Gal A en suero mediante el aumento de la sialilacion.
El aumento de la sialilacion de los glucanos subsialilados con residuos de galactosa terminales puede lograrse mediante transfection de celulas de mamifero y preferiblemente humanas con el gen de la sialil transferasa.
La presente invention proporciona una preparacion de a-Gal A glicosilada que tiene una carga de oligosacaridos aumentada producida introduciendo en primer lugar un polinucleotido, que codifica para la sialil transferasa, en una celula productora de a-Gal A, o introduciendo una secuencia reguladora mediante recombinacion homologa que regula la expresion de un gen de la sialil transferasa endogeno. Entonces se cultiva la celula de produccion de a-Gal A en condiciones de cultivo que dan como resultado la expresion de a-Gal A y sialil transferasa. La siguiente etapa consiste en el aislamiento de la preparacion de a-Gal A con carga de oligosacaridos aumentada. Las sialil transferasas preferidas incluyen una a2,3-sialil transferasa y una a-2,6-sialil transferasa. Estas sialil transferasas se conocen bien. Por ejemplo, vease la patente estadounidense 5.858.751.
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En una realizacion preferida, este procedimiento de aumento de la sialilacion incluye la etapa adicional de seleccionar glicoformas de la a-Gal A con tamano aumentado o carga aumentada mediante fraccionamiento o purificacion de la preparacion (tal como se trata a continuacion).
Alternativamente, la sialilacion puede aumentarse manteniendo las celulas en un entorno con bajo contenido en amonio. En particular, se obtiene una preparacion de a-Gal A glicosilada con aumento de la sialilacion poniendo en contacto una celula de produccion de a-Gal A con un medio de cultivo que tiene una concentracion de amonio inferior a 10 mM, mas preferiblemente inferior a 2 mM. El aumento de la sialilacion puede lograrse mediante la perfusion de celulas de produccion mediante lo cual se retiran periodicamente metabolitos toxicos, tales como amoniaco, del medio de cultivo. En una realizacion preferida, se logra el entorno con bajo contenido en amonio mediante la adicion del ADNc o gen de la glutamina sintetasa a las celulas de produccion. Alternativamente, se logra el entorno con bajo contenido en amonio mediante la perfusion de la celulas de produccion de a-Gal A con medio de cultivo nuevo para mantener la concentracion de amonio inferior a 10 mM, mas preferiblemente inferior a 2 mM. Las celulas de produccion puede perfundirse continuamente con medio de cultivo nuevo con una concentracion de amonio inferior a 10 mM, mas preferiblemente inferior a 2 mM. Alternativamente, las celulas de produccion pueden perfundirse de manera intermitente con medio de cultivo nuevo. La perfusion intermitente, tal como se usa en el presente documento, se refiere a o bien la perfusion a intervalos regulares, periodicos de tiempo, o bien tras una medicion de la concentracion de amonio que se aproxima a la concentracion diana (es decir, 10 mM, mas preferiblemente inferior a 2 mM). Las perfusiones intermitentes deben ser a intervalos suficientemente frecuentes de modo que la concentracion de amonio nunca supere la concentracion diana. Las celulas de produccion se perfunden durante un periodo de tiempo necesario para obtener una preparacion de a-Gal A con entre el 50-70%, preferiblemente el 60% de los glucanos totales sialilados.
Aumento de la semivida en circulacion de a-Gal A en suero mediante pegilacion de la a-Gal A
La semivida en circulacion de una preparacion de a-Gal A glicosilada humana se potencia complejando la a-Gal A con polietilenglicol. El polietilenglicol (PEG) es un polfmero soluble en agua que cuando se une de manera covalente a protemas, altera sus propiedades de maneras que aumentan sus usos potenciales. La modificacion con polietilenglicol (“pegilacion”) es una tecnica bien establecida que tiene la capacidad de resolver o mejorar muchos de los problemas de productos farmaceuticos de protemas y peptidos.
El funcionamiento farmaceutico mejorado de PEG-protemas en comparacion con sus equivalentes sin modificar origino el desarrollo de este tipo de conjugados como agente terapeutico. Las deficiencias de enzimas para las que la terapia con la enzima nativa era ineficaz (debido al rapido aclaramiento y/o reacciones inmunologicas) pueden tratarse ahora con PEG-enzimas equivalentes. Por ejemplo, la PEG-adenosina desaminasa ya ha obtenido la aprobacion de la FDA. Delgado et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9: 249-304 (1992).
La fijacion covalente de PEG a la a-galactosidasa de granos de cafe verde altera las propiedades catalfticas de la enzima enmascarando sitios de determinantes espedficos en la molecula. Esto da como resultado un aumento de los valores Km y una disminucion de los de Vmax frente a analogos de sustrato de p-nitrofenilo. Wieder & Davis, J. Appl. Biochem. 5: 337-47 (1983). La a-galactosidasa todavfa podfa escindir residuos de galactosa terminales de sustancia B del grupo de la sangre y la saliva humana. Se perdieron la union espedfica a anticuerpos y lecitina en la PEG-a-galactosidasa. Los anticuerpos generados a partir de la a-galactosidasa nativa pueden bloquear la actividad enzimatica, y esta inhibicion se pierde gradualmente cuando se somete a prueba frente a preparaciones de la enzima con cantidades progresivamente superiores de PEG. En cambio, los antisueros de animales inmunizados con PEG-a-galactosidasa no inhibieron la actividad enzimatica en ninguna preparacion de a-galactosidasa ni de PEG-a-galactosidasa. Estos resultados indican que el PEG tiende a cubrir los restos de hidratos de carbono espedficos para lecitina y determinantes antigenicos y que estos sitios probablemente permanecen cnpticos durante el tratamiento in vivo de PEG-enzimas.
La fijacion covalente de PEG a protemas requiere la activacion del grupo terminal de hidroxilo del polfmero con un grupo saliente adecuado que puede desplazarse mediante ataque nucleofilo del extremo £-amino-terminal de la lisina y el grupo a-amino del extremo N-terminal. Se han explotado varios grupos qrnmicos para activar PEG. Para cada aplicacion particular, diferentes procedimientos de acoplamiento proporcionan distintas ventajas. Diferentes procedimientos de pegilacion tienen un impacto sorprendente y drastico sobre factores tales como retencion de la bioactividad, estabilidad e inmunogenicidad de los peptidos y protemas pegiladas resultantes. Francis et al., Int. J. Hematol. 68(1): 1-18 (1998). Por ejemplo, una tecnica de pegilacion sin ligador fija solo PEG a la molecula diana. Mas espedficamente, la aplicacion de una tecnica de pegilacion biologicamente optimizada, usando tresil- monometoxi-PEG (TMPEG), a una variedad de protemas diana revela, tal como se describe por Francis et al., Int. J. Hematol. 68(1): 1-18 (1998), una capacidad excepcional para conservar la actividad biologica de la diana. Esto, y el beneficio de no anadir nada mas que PEG (que se ha mostrado que es seguro para su uso en productos terapeuticos para seres humanos), a la protema hace que el procedimiento sea ideal para la modificacion de a-Gal A.
Cuatro posibles sitios para el acoplamiento de PEG a protemas son los (1) grupos amino (extremo N-
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terminal y lisina); (2) grupos carboxilo (acido aspartico y acido glutamico); (3) grupos sulfhidrilo (cistema); y (4) grupos de hidratos de carbono (aldelmdos generados tras un tratamiento con peryodato). El acoplamiento a los grupos carboxilo de protemas y a grupos aldehudo sobre los hidratos de carbono requiere un reactivo de PEG con un grupo amino nucleofilo. Esta qmmica cambia el pi de la a-Gal A tras unirse los grupos carboxilo cargados negativamente mediante PEG. Cualquier cambio en el pi puede afectar a la actividad biologica de la a-Gal A. Ademas, el acoplamiento de PEG a las cadenas de hidratos de carbono puede afectar a la captacion de a-Gal A por el receptor de M6P, lo que es cntico para la actividad biologica. La qmmica con sulfhidrilo tambien afecta a la estructura ffsica de la molecula y no se recomienda.
Los procedimientos comunmente usados para la pegilacion forman un puente amida entre los grupos amino de una protema y el grupo metoxilo en monometoxi-PEG. NHS-PEG esta disponible comercialmente y da como resultado un puente amida entre la protema y PEG. Sin embargo, la formacion de puentes amida cambia el pi debido a la perdida de la carga positiva en el grupo NH2.
Un procedimiento para acoplar PEG a a-Gal A sin afectar a su pi utiliza tresil-PEG. Tresil-PEG se acopla mediante grupos amino y forma una amina secundaria estable. Las aminas secundarias ofrecen la ventaja de conservar la carga positiva del grupo amino. El reactivo de tresil-PEG esta disponible comercialmente y es estable en un polvo liofilizado y desecado. Tresil-PEG se ha caracterizado extensamente y se entienden bien la reaccion y los subproductos. En consecuencia, en una realizacion preferida, la preparacion de a-Gal A se compleja usando tresil-monometoxi-PEG (TMPEG) para formar una a-Gal A pegilada. Entonces se purifica la a-Gal A pegilada para proporcionar una a-Gal A pegilada, aislada.
__________ESQUEMA DE LA REACCION__________
CH3(OCH2CH2)rOSO2CH2CF3 + H2N-protema l
CH3(OCH2CH2)n-HN-protema-monometoxi-PEG tresilado
a-Gal A contiene 18 grupos amino, 17 grupos £-amino (lisina) y un grupo a-amino (extremo N-terminal). La reaccion puede controlarse para producir a-Gal A con sustituciones mmimas y entonces las moleculas con un PEG por molecula, o un numero medio menor de restos PEG por molecula, pueden purificarse de las formas no sustituidas y con sustituciones multiples. Las sustituciones multiples sobre a-Gal A pueden no afectar significativamente a la actividad biologica; por tanto el producto final puede consistir en una mezcla heterogenea de una a 18 moleculas de PEG fijadas. El nivel de sustitucion dependera del nivel de actividad enzimatica conservada. Debe observarse que una reduccion de la actividad enzimatica puede compensarse por un efecto terapeutico potenciado derivado de la prolongacion de la semivida en circulacion y la reduccion del reconocimiento inmunitario de a-Gal A. Por tanto, al desarrollar un producto de PEG-a-Gal A, la razon de PEG con respecto a a-Gal A debe depender de la actividad biologica, y no unicamente de la actividad enzimatica.
La reaccion de pegilacion requiere un control del pH, composicion tampon y concentracion de protema. Pueden lograrse condiciones de reaccion apropiadas mediante una etapa de ultrafiltracion/diafiltracion, que actualmente se usa en el procedimiento de fabricacion. Inmediatamente antes de la reaccion, se solubiliza rapidamente tresil-PEG en agua con agitacion continua. Entonces se anade esta disolucion a la a-Gal A preparada y se deja reaccionar durante una cantidad de tiempo controlada y a una temperatura controlada (por ejemplo, 2 horas a 250°C). La pegilacion puede producirse antes del procedimiento de purificacion final, lo que eliminara anadir etapas al procedimiento de purificacion. Tras completar el acoplamiento, se trata PEG-a-Gal A mediante las etapas restantes del procedimiento de purificacion. Realizar la reaccion antes de la columna Q (intercambio anionico) permite dos etapas de purificacion para eliminar los subproductos de reaccion. Ya que el PEG no contiene ninguna carga negativa, no se retendra en la Q Sepharose®, y se eluira en el volumen inicial.
La cantidad de pegilacion puede medirse mediante tecnicas conocidas. Por ejemplo, la fluorescamina fluoresce cuando esta unida a grupos a-amino y £-amino de protemas. La perdida en porcentaje de fluorescencia tras la pegilacion se correlaciona con el porcentaje de PEG unido a a-Gal A. Puede usarse el ensayo BCA de Pierce para detectar la protema total para determinar la concentracion de protema. El ensayo de actividad de metilumbeliferil-a-D-galactopiranosido (4-MUF-a-Gal) se usa para evaluar el efecto de la actividad enzimatica de PEG-a-Gal A. a-Gal A contiene M6P, lo que se requiere para su captacion en lisosomas. Puede evaluarse la interferencia de PEG con el reconocimiento por el receptor de M6P usando un ensayo basado en celulas para monitorizar la captacion de PEG-a-Gal A en lisosomas.
Procedimientos de administracion de una preparacion de a-Gal A
Pueden administrarse composiciones de la presente invencion mediante cualquier via que sea compatible con la preparacion de a-Gal A. Puede administrarse la preparacion de a-Gal A purificada a individuos que producen protema a-Gal A insuficiente o defectuosa o que pueden beneficiarse de la terapia con a-Gal A. Las preparaciones terapeuticas de la presente invencion pueden proporcionarse a un individuo mediante cualquier medio adecuado,
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directamente (por ejemplo, localmente, tal como mediante inyeccion, implantacion o administracion topica a un sitio de tejido) o sistematicamente (por ejemplo, por v^a oral o por via parenteral).
La via de administracion puede ser oral o parenteral, incluyendo intravenosa, subcutanea, intraarterial, intraperitoneal, oftalmica, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intradermica, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsular, intrapulmonar, intranasal, transmucosa, transdermica o mediante inhalacion. Los procedimientos de administracion intrapulmonar, aparatos y preparacion de farmaco se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 5.785.049, 5.780.019 y 5.775.320. Un procedimiento preferido de administracion intradermica es mediante administracion iontoforetica mediante parches, un ejemplo de tal administracion se ensena en la patente estadounidense 5.843.015.
Una via de administracion particularmente util es mediante inyeccion subcutanea. Una preparacion de a- Gal A se formula de tal manera que la dosis requerida total puede administrarse en una unica inyeccion de uno o dos mililitros. Con el fin de permitir un volumen de inyeccion de uno o dos mililitros, puede formularse una preparacion de a-Gal A a una concentracion en la que la dosis preferida se administra en un volumen de uno a dos mililitros, o la preparacion de a-Gal A puede formularse en forma liofilizada, que se reconstituye en agua o un tampon fisiologicamente compatible apropiado antes de la administracion. Las inyecciones subcutaneas de preparaciones de a-Gal A tienen las ventajas de ser convenientes para el paciente, en particular permitiendo la propia administracion, mientras que tambien dan como resultado una semivida en plasma prolongada en comparacion con, por ejemplo, la administracion intravenosa. Una prolongacion de la semivida en plasma da como resultado el mantenimiento de niveles de a-Gal A en plasma eficaces a lo largo de periodos de tiempo mayores, cuyo beneficio es aumentar la exposicion de tejidos clmicamente afectados a la a-Gal A inyectada y, como resultado, aumentar la captacion de a- Gal A en tales tejidos. Esto permite un efecto mas beneficioso par el paciente y/o una reduccion de la frecuencia de administracion. Ademas, puede usarse una variedad de dispositivos disenados para la conveniencia del paciente, tales como plumas de inyeccion recargables y dispositivos de inyeccion sin aguja, con las preparaciones de a-Gal A tal como se tratan en el presente documento.
La administracion puede ser mediante inyecciones periodicas de un bolo de la preparacion, o puede administrarse mediante administracion intravenosa o intraperitoneal desde un deposito que es externo (por ejemplo, una bolsa de IV) o interno (por ejemplo, un implante bioerosionable, un organo bioartificial o una poblacion de celulas de produccion de a-Gal A implantadas). Veanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 4.407.957 y 5.798.113. Se describen procedimientos y aparatos de administracion intrapulmonar, por ejemplo, en las patentes estadounidenses 5.654.007, 5.780.014 y 5.814.607. Otros sistemas de administracion parenteral utiles incluyen partmulas de copolfmero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmoticas, sistemas de infusion implantables, administracion con bomba, administracion de celulas encapsuladas, administracion liposomal, inyeccion administrada con aguja, inyeccion sin agua, nebulizador, pulverizador, electroporacion y parche transdermico. Se describen dispositivos inyectores sin aguja en las patentes estadounidenses 5.879.327; 5520.639; 5.846.233 y 5.704.911. Cualquiera de las preparaciones de a-Gal A descritas anteriormente puede administrarse en estos procedimientos.
La via de administracion y la cantidad de protema administrada pueden determinarse mediante factores que caen dentro de la capacidad de evaluacion del experto en la tecnica. Ademas, los expertos en la tecnica son conscientes de que la via de administracion y la dosificacion de una protema terapeutica pueden variarse para un paciente dado hasta que se obtiene un nivel de dosificacion terapeutico.
Formulacion farmaceutica de protema a-Gal A
Se proporcionan ademas formulaciones de una preparacion de a-Gal A que estan sustancialmente libres de protemas distintas de a-Gal A, tales como albumina, protemas distintas de a-Gal A producidas por la celula huesped o protemas aisladas de fluido o tejido animal.
La preparacion comprende preferiblemente parte de una disolucion o suspension de fluido acuosa o fisiologicamente compatible. El soporte o vehmulo es fisiologicamente compatible de manera que, ademas de administrar la preparacion deseada al paciente, no afecta adversamente de otro modo al equilibrio de electrolito y/o volumen del paciente. Las disoluciones utiles para la administracion parenteral pueden prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la tecnica farmaceutica. Vease, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Gennaro, A., ed.), Mack Pub., 1990. Tambien pueden usarse formulaciones no parenterales, tales como supositorios y formulaciones orales.
Preferiblemente la formulacion contiene un excipiente. Los excipientes farmaceuticamente aceptables para a-Gal A que pueden incluirse en la formulacion son tampones tales como tampon citrato, tampon fosfato, tampon acetato y tampon bicarbonato, aminoacidos, urea, alcoholes, acido ascorbico, fosfolfpidos; protemas, tales como albumina serica, colageno y gelatina; sales tales como EDTA o EGTA, y cloruro de sodio; liposomas; polivinilpirrolidona; azucares, tales como dextrano, manitol, sorbitol y glicerol; propilenglicol y polietilenglicol (por ejemplo, PEG-4000, PEG-6000); glicerol; glicina u otros aminoacidos; y lfpidos. Los sistemas de tampon para su uso
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con preparaciones de a-Gal A incluyen tampones citrato; acetato; bicarbonato; y fosfato (todos disponibles de Sigma). El tampon fosfato es una realizacion preferida. Un intervalo de pH preferido para preparaciones de a- Gal A es de pH 4,5-7,4.
La formulacion tambien contiene preferiblemente un detergente no ionico. Los detergentes no ionicos preferidos incluyen Polisorbato 20, Polisorbato 80, Triton X-100, Triton X-114, Nonidet P-40, Octil-a-glucosido, Octil- p-glucosido, Brij 35, Pluronic y Tween 20 (todos disponibles de Sigma).
Una formulacion particularmente preferida contiene detergente no ionico polisorbato 20 o polisorbato 80 y solucion salina tamponada con fosfato, lo mas preferiblemente a pH 6.
Para la liofilizacion de preparaciones de a-Gal A, la concentracion de protema puede ser de 0,1-10 mg/ml. Pueden anadirse agentes de carga, tales como glicina, manitol, albumina y dextrano, a la mezcla de liofilizacion. Ademas, pueden anadirse posibles crioprotectores, tales como disacaridos, aminoacidos y PEG a la mezcla de liofilizacion. Tambien puede anadirse cualquiera de los tampones, excipientes y detergentes enumerados anteriormente.
En una formulacion preferida la a-Gal A para inyeccion esta a una concentracion de 1 mg/ml.
Las formulaciones para su administracion pueden incluir glicerol y otras composiciones de alta viscosidad para ayudar a mantener el agente en el sitio deseado. Los polfmeros biocompatibles, preferiblemente polfmeros biocompatibles, bioerosionables, (incluyendo, por ejemplo, polfmeros de acido hialuronico, colageno, polibutirato, lactida y glicolida, y copolfmeros de lactida/glicolida) pueden ser excipientes utiles para controlar la liberacion del agente in vivo. Las formulaciones para la administracion parenteral pueden incluir glicocolato para la administracion bucal, metoxisalicilato para la administracion rectal o acido cttrico para la administracion vaginal. Pueden prepararse supositorios para la administracion rectal mezclando una preparacion de a-Gal A con un excipiente no irritante tal como manteca de cacao u otras composiciones que son solidas a temperatura ambiente y lfquidas a la temperatura corporal.
Las formulaciones para la administracion por inhalacion pueden contener lactosa u otros excipientes, o pueden ser disoluciones acuosas que pueden contener polioxietilen-9-lauril eter, glicocolato o desoxicocolato. Un aerosol de inhalacion preferido se caracteriza por tener partfculas de pequena densidad de masa y gran tamano. Las partfculas con densidades de masa inferiores a 0,4 gramos por centimetro cubico y diametros medios superiores a 5 pm administran eficazmente productos terapeuticos inhalados a la circulacion sistemica. Tales partfculas se inspiran de manera profunda en los pulmones y escapan a los mecanismos de aclaramiento natural de los pulmones hasta que las partfculas inhaladas administran su carga terapeutica. (Edwards et al., Science 276: 1868-1872 (1997)). Pueden administrarse preparaciones de a-Gal A en forma de aerosol, por ejemplo, usando procedimientos de preparacion y formulaciones tal como se describe en las patentes estadounidenses 5.654.007, 5.780.014 y 5.814.607. La formulacion para administracion intranasal puede incluir disoluciones aceitosas para su administracion en forma de gotas nasales, o como gel para aplicarse por via intranasal.
Las formulaciones para administracion topica a la superficie de la piel pueden prepararse dispersando la preparacion de a-Gal A con un soporte dermatologicamente aceptable tal como una locion, crema, pomada o jabon. Son particularmente utiles los soportes que pueden formar una pelfcula o capa sobre la piel para localizar la aplicacion e inhibir su eliminacion. Para la administracion topica a superficies de tejido internas, la preparacion de a- Gal A puede dispersarse en un adhesivo tisular lfquido u otra sustancia que se sabe que potencia la adsorcion a una superficie de tejido. Por ejemplo, se han descrito diversos adhesivos mucosos y comprimidos bucales para la administracion transmucosa de farmacos, tales como en las patentes estadounidenses 4.740.365, 4.764.378 y 5.780.045. Tambien pueden incorporarse disoluciones de hidroxipropilcelulosa o fibrinogeno/trombina. Alternativamente, pueden usarse disoluciones de recubrimiento de tejidos, tales como formulaciones que contienen pectina.
Las preparaciones de la invencion pueden proporcionarse en recipientes adecuados para mantener la esterilidad, proteger la actividad de los principios activos durante su distribucion y almacenamiento apropiados y proporcionar una accesibilidad conveniente y eficaz de la preparacion para su administracion a un paciente. Puede suministrarse una formulacion inyectable de una preparacion de a-Gal A en un vial con tapon adecuado para extraer el contenido usando una aguja y una jeringuilla. El vial estara previsto o bien para un unico uso o bien para multiples usos. La preparacion tambien puede suministrarse como una jeringuilla precargada. En algunos casos, el contenido se suministrara en una formulacion lfquida, mientras que en otros se suministrara en un estado seco o liofilizado, que en algunos casos requerira su reconstitucion con un diluyente convencional o suministrado para dar un estado lfquido. Cuando la preparacion se suministra como un lfquido para su administracion intravenosa, puede proporcionarse en una bolsa esteril o recipiente adecuado para su conexion a un cateter o lmea de administracion intravenosa. En realizaciones preferidas, las preparaciones de la invencion se suministran o bien en formulaciones lfquidas o bien en polvo en dispositivos que administran de manera conveniente una dosis predeterminada de la preparacion; ejemplos de tales dispositivos incluyen inyector sin aguja para inyeccion o bien subcutanea o bien
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intramuscular, y un dispositivo de administracion por aerosol medido. En otros casos, la preparacion puede suministrarse en una forma adecuada para su liberacion sostenida, tal como en un parche o aposito para aplicarse a la piel para su administracion transdermica, o mediante dispositivos erosionables para su administracion transmucosa. En casos en los que la preparacion se administra por via oral en forma de comprimido o pastilla, la preparacion puede suministrarse en una botella con una cubierta desmontable. Los recipientes pueden etiquetarse con informacion tal como el tipo de preparacion, el nombre del fabricante o distributor, la indicacion, la dosificacion sugerida, instrucciones para su almacenamiento apropiado o instrucciones para su administracion.
Dosificaciones para la administracion de una preparacion de a-Gal A
La presente divulgacion proporciona ademas procedimientos para administrar una preparacion de a-Gal A a un paciente con enfermedad de Fabry, una variante atfpica de la enfermedad de Fabry o cualquier estado en el que este presente un nivel reducido o una forma mutante de a-Gal A. La dosis de administracion es preferiblemente de 0,05-5,0 mg, mas preferiblemente de entre 0,1-0,3 mg de la preparacion de a-Gal A por kilogramo de peso corporal y se administra semanal o quincenalmente. En una realizacion preferida, se administra quincenalmente una dosis de aproximadamente 0,2 mg/kg. Se necesitan dosis regularmente repetidas de la protema a lo largo de la vida del paciente. Pueden usarse inyecciones subcutaneas para mantener una exposicion sistemica a mayor plazo al farmaco. La dosificacion subcutanea puede ser de entre 0,01-10,0 mg, preferiblemente de 0,1-5,0 mg de la preparacion de a-Gal A por kg de peso corporal quincenal o semanalmente. Las dosificaciones de preparaciones de a-Gal A que se administran mediante inyecciones intramusculares pueden ser las mismas o diferentes de las inyectadas por via subcutanea; en una realizacion preferida, las dosificaciones intramusculares son inferiores y se administran con menor frecuencia. La preparacion de a-Gal A tambien puede administrarse por via intravenosa, por ejemplo, en una inyeccion en bolo intravenosa, en una inyeccion intravenosa de empuje lento, o mediante inyeccion intravenosa continua. La infusion i.v. continua (por ejemplo, a lo largo de 2-6 horas) permite el mantenimiento de niveles espedficos en la sangre.
Un procedimiento preferido alternativo para administrar una preparacion de a-Gal A a un paciente implica administrar semanal o quincenalmente una dosis preferida de una preparacion de a-Gal A durante un periodo de varios anos, por ejemplo, hasta tres anos, tiempo durante el cual se monitoriza clmicamente a un paciente para evaluar el estado de su enfermedad. Puede usarse la mejora clmica medida mediante, por ejemplo, mejora en la funcion renal o cardiaca o bienestar global del paciente (por ejemplo, dolor), y mejora de laboratorio medida mediante, por ejemplo, reducciones en los niveles de CTH en orina, plasma o tejido, para evaluar el estado de salud del paciente. En el caso de que se observe una mejora clmica tras este periodo de tratamiento y monitorizacion, puede reducirse la frecuencia de administracion de a-Gal A. Por ejemplo, un paciente que recibe inyecciones semanales de una preparacion de a-Gal A puede cambiar a inyecciones quincenales. Alternativamente, un paciente que recibe inyecciones quincenales de una preparacion de a-Gal A puede cambiar a inyecciones mensuales. Tras un cambio de este tipo en la frecuencia de la dosificacion, debe monitorizarse al paciente durante otros varios anos, por ejemplo, un periodo de tres anos, con el fin de evaluar medidas clmicas y de laboratorio relacionadas con la enfermedad de Fabry. En una realizacion preferida, la dosis administrada no cambia si se realiza un cambio en la frecuencia de la dosificacion. Esto garantiza que ciertos parametros farmacocineticos (por ejemplo concentracion maxima en plasma [Cmax], tiempo hasta la concentracion maxima en plasma [tmax], plasma, semivida [t1/2] y exposicion segun se miden mediante el area bajo la curva [AUC]) permanecen relativamente constantes tras cada dosis administrada. El mantenimiento de estos parametros farmacocineticos dara como resultado niveles relativamente constantes de captacion de a-Gal A mediada por el receptor en tejidos a medida que cambian las frecuencias de la dosis.
A un paciente con variante atfpica de la enfermedad de Fabry, por ejemplo, que muestra anomalfas predominantemente cardiovasculares o afectacion renal, se le trata con estos mismos regfmenes de dosificacion, es decir, desde 0,05 mg/kg hasta 5 mg/kg semanal o quincenalmente. La dosis se ajusta segun se necesite. Por ejemplo, un paciente con el fenotipo de variante cardiaca a quien se le trata con terapia sustitutiva con enzima a- galactosidasa A tendra un cambio en la composicion de su corazon y una mejora de la funcion cardiaca tras la terapia. Este cambio puede medirse con ecocardiograffa convencional que puede detectar el aumento del espesor de la pared del ventnculo izquierdo en pacientes con enfermedad de Fabry (Goldman et al., J Am Coll Cardiol 7: 1157 - 1161 (1986)). Pueden realizarse mediciones ecocardiograficas en serie del espesor de la pared del ventnculo izquierdo durante la terapia, y una reduccion del tamano de la pared del ventnculo es indicativa de una respuesta terapeutica. A los pacientes que se someten a terapia sustitutiva con enzima a-gal A tambien se les puede realizar un seguimiento con formacion de imagenes por resonancia magnetica (IRM) cardiaca. La IRM tiene la capacidad para evaluar la composicion relativa de un tejido dado. Por ejemplo, la IRM cardiaca en pacientes con enfermedad de Fabry revela lfpidos depositados dentro del miocardio en comparacion con pacientes control (Matsui et al., Am Heart J 117: 472 - 474. (1989)). Evaluaciones por IRM cardiaca en serie en un paciente que se somete a terapia sustitutiva con enzima pueden revelar un cambio en la deposicion de lfpidos dentro del corazon de un paciente. Los pacientes con el fenotipo de variante renal tambien pueden beneficiarse de la terapia sustitutiva con enzima a- galactosidasa A. Tambien puede medirse el efecto de la terapia mediante pruebas convencionales de la funcion renal, tales como nivel de protemas en orina de 24 horas, aclaramiento de creatinina y tasa de filtracion glomerular. Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar mas completamente las realizaciones preferidas de la
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invencion.
Ejemplo 1 Preparacion y uso de constructos disenados para administrar y expresar a-Gal A
Se construyeron dos plasmidos de expresiOn, pXAG-16 y pXAG-28. Estos plasmidos contienen ADNc de a- Gal A humana que codifica para los 398 aminoacidos de la enzima a-Gal A (sin el peptido senal de a-Gal A); la secuencia de ADN genOmico del peptido senal de la hormona de crecimiento humana (hGH), que esta interrumpida por el primer intrOn del gen de la hGH; y la secuencia no traducida en 3' (UTS) del gen de la hGH, que contiene una senal para la poliadenilaciOn. El plasmido pXAG-16 tiene el promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano (CMV IE) y el primer intrOn (flanqueado por secuencias de exones no codificantes), mientras que pXAG-28 esta impulsado por el promotor Ia2 del colageno y el exOn 1, y tambien contiene la UTS en 5' del gen de la p-actina, que contiene el primer intrOn del gen de la p-actina.
1.1 Clonacion del ADNc completo de la a-Gal A y construccion del plasmido de expresion de a-Gal A pXAG- 16
Se clonO el ADNc de la a-Gal humana a partir de una biblioteca de ADNc de fibroblastos humanos que se construyO tal como sigue. Se aislO ARNm de poli-A+ a partir de ARN total, y se realizO la smtesis de ADNc usando reactivos del sistema Lambda ZapII® segun las instrucciones del fabricante (Stratagene Inc., La Jolla, CA). En resumen, se generO ADNc de “primera cadena” mediante transcripciOn inversa en presencia de un cebador de oligo- dT que contema el sitio de endonucleasa de restricciOn Xhol interno. Tras el tratamiento con ARNasa H, se realizO el traslado de mellas del ADNc con ADN polimerasa I para generar ADNc bicatenario. Se hicieron romos los extremos de este ADNc con ADN polimerasa de T4, y se ligO con adaptadores de EcoRI. Se trataron los productos de esta ligaciOn con ADN cinasa de T4 y se digirieron con XhoI. Se fraccionO el ADNc mediante cromatograffa con Sephacryl®-400. Se combinaron las fracciones de tamano grande y medio y se ligaron los ADNc a brazos de Lambda ZapII digeridos con EcoRI y XhoI. Entonces se envasaron y titularon los productos de esta ligaciOn. La biblioteca primaria tema un tftulo de 1,2 x 107 ufp/ml y un tamano de inserto promedio de 925 pb.
Se usO una sonda de 210 pb a partir del exOn 7 del gen de la a-Gal A humana (figura 1, SEQ ID NO: 1) para aislar el ADNc. Se aislO la propia sonda usando ADN genOmico mediante la reacciOn en cadena de la polimerasa (PCR) usando los siguientes oligonucleOtidos: 5'-CTGGGCTGTAGCTATGATAAAC-3' (Oligo 1; SEQ ID NO: 6) y 5'-TCTAGCTGAAGCAAAACAGTG-3' (Oligo 2; SEQ ID NO: 7). Entonces se usO el producto de PCR para explorar la biblioteca de ADNc de fibroblastos, y se aislaron los clones positivos y se caracterizaron adicionalmente. Se sometiO un clon positivo, el fago 3A, al protocolo de escisiOn con el sistema Lambda ZapII® (Stratagene, Inc., La Jolla, CA), segun las instrucciones del fabricante. Este procedimiento proporcionO el plasmido pBSAG3A, que contiene la secuencia de ADNc de la a-Gal A en el esqueleto del plasmido pBluescriptSK-™. La secuenciaciOn de ADN revelO que este plasmido no contema el extremo en 5' completo de la secuencia de ADNc. Por tanto, se reconstruyO el extremo en 5' usando un fragmento de PCR amplificado a partir de ADN genOmico humano. Para lograr esto, se amplificO un fragmento de ADN genOmico de 268 pb (figura 2, SEQ ID NO: 2) usando los siguientes oligonucleOtidos: 5'- ATTGGTCCGCCCCTGAGGT-3' (Oligo 3; SEQ ID NO: 8) y 5'-TGATGCAGGAATCTGGCTCT-3' (Oligo 4; SEQ ID NO: 9). Se subclonO este fragmento en un plasmido de clonaciOn “TA” (Invitrogen Corp., San Diego, CA) para generar plasmido pTAAGEI. El plasmido pBSAG3A, que contiene la mayor parte de la secuencia de ADNc de la a-Gal A, y pTAAGEI, que contiene el extremo en 5' del ADNc de la a-Gal A, se digirieron cada uno con SacII y NcoI. Las posiciones de los sitios de SacII y NcoI relevantes dentro del fragmento de ADN amplificado se muestran en la figura 2. Se aislO el fragmento de SacII-NcoI de 0,2 kb a partir de pTAAGEI y se ligO con pBSAG3A digerido de manera equivalente. Este plasmido, pAGAL, contiene la secuencia de ADNc de la a-Gal A completa, incluyendo la secuencia que codifica para el peptido senal de la a-Gal A. Se secuenciO completamente el ADNc (mostrado en la figura 3 incluyendo el peptido senal de la a-Gal A; SEQ ID NO: 3) y se encontrO que era identico a la secuencia publicada para el ADNc de la a-Gal A humana (secuencia de Genbank HUMGALA).
Se construyO el plasmido pXAG-16 mediante varios productos intermedios, tal como sigue. En primer lugar, se digiriO pAGAL con SacII y XhoI y se hicieron romos sus extremos. En segundo lugar, se ligaron los extremos del ADNc completo de la a-Gal A con ligadores Xbal y se subclonO en pEF-BOS digerido con XbaI (Mizushima et al., Nucl. Acids Res. 18: 5322, 1990), creando pXAG-1. Este constructo contiene la UTS en 3' del factor estimulante de colonias de granulocitos humano (G-CSF) y el promotor del factor de elongaciOn humano-1a (EF-1a) que flanquea al ADNc que codifica para la a-Gal A mas el peptido senal de la a-Gal A, de tal manera que el extremo en 5' del ADNc de la a-Gal A esta fusionado al promotor de EF-1a. Para crear un constructo con el promotor CMV IE y el primer intrOn, el ADNc de la a- Gal A y UTS en 3' de G-CSF se retirO de pXAG-1 como un fragmento de XbaI-BamHI de 2 kb. Se hicieron romos los extremos del fragmento, se ligO con ligadores BamHI y se insertO en pCMVflpNeo digerido con BamHI (que se construyO tal como se describe a continuaciOn). La orientaciOn fue tal que el extremo en 5' del ADNc de la a-Gal A estaba fusionado a la regiOn del promotor CMV IE.
Se creO pCMVflpNeo tal como sigue. Se amplificO un fragmento del promotor del gen CMV IE mediante PCR usando ADN genOmico de CMV como molde y los oligonucleOtidos: 5'-
TTTTGGATCCCTCGAGGACATTGATTATTGACTAG-3' (SEQ ID NO: 10) y 5'-
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TTTTGGATCCCGTGTCAAGGACGGTGAC-3' (SEQ ID NO: 11). Se digirio el producto resultante (un fragmento de 1,6 kb) con BamHI, dando un fragmento que contema el promotor de CMV con extremos cohesivos digeridos con BamHI. Se aislo la unidad de expresion neo del plasmido pMC1neopA (Stratagene Inc., La Jolla, CA) como un fragmento de XhoI-BamHI de 1,1 kb. Se insertaron los fragmentos neo y el que contema el promotor de CMV en un plasmido digerido con BamHI y XhoI (pUC12). Notablemente, pCMVflpNeo contiene la region de promotor CMV IE, que comienza en el nucleotido 546 y termina en el nucleotido 2105 (de la secuencia de Genbank HS5MIEP), y el gen de resistencia a la neomicina impulsado por el promotor de la timidina cinasa del virus del herpes simple (VHS) (el gen TKneo) inmediatamente en 5' con respecto al fragmento de promotor CMV IE. La direccion de transcripcion del gen neo es la misma que la del fragmento de promotor CMV. Este constructo intermedio se denomino pXAG-4.
Para anadir la UTS en 3' de la hGH, la UTS en 3' del GCSF se retiro de pXAG-4 como un fragmento de XbaI-SmaI y se hicieron romos los extremos de pXAG-4. La UTS en 3' de la hGH se retiro de pXGH5 (Selden et al., Mol. Cell. Biol. 6: 3173-3179, 1986) como un fragmento de SmaI-EcoRI de 0,6 kb. Tras hacer romos los extremos de este fragmento, se ligo en pXAG-4 inmediatamente despues el sitio XbaI de extremos romos de pXAG-4. Este producto intermedio se denomino pXAG-7. Se retiro el fragmento de TKneo de este plasmido como un fragmento de HindIII-ClaI y se hicieron romos los extremos del plasmido “completando” con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. Se ligo un gen de resistencia a la neomicina impulsado por el promotor temprano del SV40 como un fragmento de ClaI-BsmBI romo de un digesto de pcDNeo (Chen et al., Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752, 1987), colocando la unidad de transcripcion neo en la misma orientacion que la unidad de transcripcion de a-Gal A. Este producto intermedio se denomino pXAG-13.
Para completar pXAG-16, que tiene la secuencia que codifica para el peptido senal de la hGH de 26 aminoacidos y el primer intron del gen de la hGH, se retiro en primer lugar un fragmento de EcoRI-BamHI de 2,0 kb de pXAG-13. Este fragmento inclma el ADNc de la a-Gal A y la UTS en 3' de la hGH. Se sustituyo este fragmento grande por 3 fragmentos. El primer fragmento consistfa en un producto de PCR de 0,3 kb de pXGH5, que contiene la secuencia que codifica para el peptido senal de la hGH e incluye la secuencia del primer intron de la hGH, desde un sitio BamHI sintetico situado justo en sentido 5' de la secuencia consenso Kozak hasta el extremo de la secuencia que codifica para el peptido senal de la hGH. Se usaron los siguientes oligonucleotidos para amplificar este fragmento (fragmento 1): 5'- TTTTGGATCCACCATGGCTA-3' (Oligo HGH101; SEQ ID NO: 12) y 5'- TTTTGCCGGCACTGCCCTCTTGAA-3' (Oligo HGH102; SEQ ID NO: 13). El segundo fragmento consist en un producto de PCR de 0,27 kb que contiene secuencias correspondientes al inicio del ADNc que codifica para la enzima a-Gal A de 398 aminoacidos (es decir, que carece del peptido senal de la a-Gal A) hasta el sitio NheI. Se usaron los siguientes oligonucleotidos para amplificar este fragmento (fragmento 2): 5'-
TTTTCAGCTGGACAATGGATTGGC-3' (Oligo AG10; SEQ ID NO: 14) y 5'-TTTTGCTAGCTGGCGAATCC-3' (Oligo AG11; SEQ ID NO: 15). El tercer fragmento consistio en el fragmento de NheI-EcoRI de pXAG-7 que contiene el resto de la secuencia de a-Gal A asf como la UTS en 3' de la hGH (fragmento 3).
Se mezclaron el fragmento 1 (digerido con BamHI y NaeI), fragmento 2 (digerido con PvuII y NheI) y fragmento 3 con el fragmento de BamHI-EcoRI de 6,5 kb de pXAG-13 que contiene el gen neo y el promotor CMV IE y se ligaron juntos para generar el plasmido pXAG-16 (figura 4).
1.2 Construccion del plasmido de expresion de la a-Gal A pXAG-28
Se aislo el promotor de Ia2 del colageno humano para su uso en el constructo de expresion de la a-Gal A pXAG-28 tal como sigue. Se aislo un fragmento de PCR de 408 pb de ADN genomico humano que contiene parte del promotor Ia2 del colageno humano usando los siguientes oligonucleotidos:
5'-TTTTGGATCCGTGTCCCATAGTGTTTCCAA-3' (Oligo 72; SEQ ID NO: 16) y 5'-TTTTGGATCCGCAGTCGTGGCCAGTACC-3' (Oligo 73; SEQ ID NO: 17).
Se uso este fragmento para explorar una biblioteca de leucocitos humanos en EMBL3 (Clontech Inc., Palo Alto, CA). Se aislo un clon positivo (fago 7H) que contema un fragmento de EcoRI de 3,8 kb y se clono en pBSIISK+ (Stratagene Inc., La Jolla, CA) en el sitio EcoRI (creando pBS/7H.2). Se introdujo un sitio AvrII en pBSIISK+ digiriendo con SpeI, que escinde dentro del poliligador pBSIISK+, “completando” con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I e insertando el oligonucleotido 5'-CTAGTCCTAGGA-3' (SEQ ID NO: 18). Se digirio esta variante de pBSIISK+ con BamHI y AvrII y se ligo al fragmento de BamHI-AvrII de 121 pb del fragmento de PCR del promotor Ia2 del colageno de 408 pb original descrito anteriormente, creando pBS/121COL.6.
Se digirio el plasmido pBS/121COL.6 con XbaI, que escinde dentro de la secuencia de poliligador de pBSIISK+, se “completo” con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I y se digirio con AvrII. Se aislo el fragmento de BamHI-AvrII de 3,8 kb de pBS/7H.2 y se hicieron romos los extremos del sitio BamHI mediante tratamiento con la enzima Klenow. Entonces se digirio el fragmento con AvrII y se ligo al vector digerido con AvrII, creando asf el plasmido de promotor del colageno pBS/121bpCOL7H.18.
A continuacion se fusiono el promotor del colageno a la UTS en 5' del gen de la p-actina humano, que
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contiene el primer intron del gen de la p-actina humano. Para aislar esta secuencia, se aislo un fragmento de PCR de 2 kb a partir de ADN genomico humano usando los siguientes oligonucleotidos:
5'-TTTTGAGCACAGAGCCTCGCCT-3' (Oligo BA1; SEQ ID NO: 19) y 5'-TTTTGGATCCGGTGAGCTGCGAGAATAGCC-3' (Oligo BA2; SEQ ID NO: 20).
Se digirio este fragmento con BamHI y BsiHKAI para liberar un fragmento de 0,8 kb que contiene el intron y la UTS en 5' de la p-actina. Entonces se aislo un fragmento de SaII-SrfI de 3,6 kb a partir del plasmido promotor del colageno pBS/121bpCOL7H.18 tal como sigue. Se digirio parcialmente pBS/121bpCOL7H.18 con BamHI (el sitio BamHI se encuentra en el extremo 5' del fragmento del promotor Ia2 del colageno), se hicieron romos sus extremos mediante tratamiento con el fragmento Klenow y se ligo a un ligador de SalI (5'-GGTCGACC-3'), colocando asf un sitio SalI en sentido 5' del promotor Ia2 del colageno. Entonces se digirio este plasmido con SalI y SrfI (el sitio SrfI se encuentra 110 pb en sentido 5' del sitio CAP del promotor Ia2 del colageno), y se aislo el fragmento de 3,6 kb. Se combinaron los fragmentos de 0,8 y 3,6 kb con pBSIISK digerido con SalI y BamHI (Stratagene Inc., La Jolla, CA), y un fragmento compuesto por los cuatro siguientes oligonucleotidos hibridados juntos (formando un fragmento con un extremo romo y un extremo de BsiHKAl):
5'-GGGCCCCCAGCCCCAGCCCTCCCATTGGTGGAGGCCCTTTTGGAGGCACCCTAGGGCCAGGAAACTTTTGC CGTAT-3' (Oligo COL-1; SEQ ID NO: 21),
5'-AAATAGGGCAGATCCGGGCTTTATTATTTTAGCACCACGGCCGCCGAGACCGCGTCCGCCCCGCGAGCA-3' (Oligo COL-2; SEQ ID NO: 22),
5'-TGCCCTATTTATACGGCAAAAGTTTCCTGGCCCTAGGGTGCCTCCAAAAGGGCCTCCACCAATGGGAGGGC TGGGGCTGGGGGCCC-3' (Oligo COL-3; SEQ ID NO: 23), y
5'-CGCGGGGCGGACGCGGTCTCGGCGGCCGTGGTGCTAAAATAATAAAGCCCGGATC-3' (Oligo COL-4; SEQ ID NO: 24).
Estos cuatro oligonucleotidos, cuando se hibridan, corresponden a la region que comienza en el sitio Srfl del promotor del colageno y continua a traves del sitio BsiHKAI del promotor de la p-actina. El plasmido resultante se denomino pCOL/p-actina.
Para completar la construccion de pXAG-28, se aislo el fragmento de SaII-BamHI de pCOL/p-actina, que contiene el promotor Ia2 del colageno y la UTS en 5' de la p-actina. Se ligo este fragmento a dos fragmentos de pXAG-16 (vease el ejemplo 1,1 y la figura 4): (1) el fragmento de BamHI de 6,0 kb (que contiene el gen neo, esqueleto de plasmido, el ADN que codifica para la enzima a-Gal A de 398 aminoacidos y la UTS en 3' de la hGH); y (2) el fragmento de BamHI-XhoI de 0,3 kb (que contiene la secuencia de poli-A de SV40 de pcDneo). pXAG-28 contiene el promotor Ia2 del colageno humano fusionado a la UTS en 5' de la p-actina humana, el peptido senal de la hGH (que esta interrumpido por el primer intron de la hGH), el ADNc que codifica para la enzima a-Gal A, y la UTS en 3' de la hGH. En la figura 5 se muestra un mapa del constructo de expresion completado pXAG-28.
1.3 Transfeccion y seleccion de fibroblastos sometidos a electroporacion con plasmidos de expresion de la a-Gal A
Con el fin de expresar a-Gal A en fibroblastos, se cultivaron fibroblastos secundarios y se transfectaron segun procedimientos publicados (Selden et al., documento WO 93/09222).
Se transfectaron mediante electroporacion los plasmidos pXAG-13, pXAG-16 y pXAG-28 en fibroblastos de prepucio humano para generar cepas de celulas clonales transfectadas de manera estable, y se monitorizaron los niveles de expresion de a-Gal A resultantes tal como se describe en el ejemplo 1.4. La secrecion de a-Gal A por fibroblastos de prepucio normales esta en el intervalo de 2-10 unidades/106 celulas/24 horas. En cambio, los fibroblastos transfectados presentaron niveles medios de expresion tal como se muestran en la tabla 2.
Tabla 2
Niveles medios de expresion de a-Gal A (± desviacion estandar)
- pXAG-13:
- 420 ± 344 U/106 celulas/dfa N=26 cepas clonales (intervalo 3 -1133 U/106 celulas/dfa)
- pXAG-16:
- 2,051 + 1253 U/106 celulas/dfa N=24 cepas clonales (intervalo 422 - 5200 U/106 celulas/dfa)
- pXAG-28:
- 141 + 131 U/106 celulas/dfa N=38 cepas clonales (intervalo 20 - 616 U/106 celulas/dfa)
Estos datos muestran que los tres constructos de expresion pueden aumentar la expresion de a-Gal A
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muchas veces la de fibroblastos no transfectados. La expresion por fibroblastos transfectados de manera estable con pXAG-13, que codifica para a-Gal A unido al peptido senal de la a-Gal A, fue sustancialmente inferior a la expresion por fibroblastos transfectados con pXAG-16, que se diferencia solo en que el peptido senal es el peptido senal de la hGH, cuya secuencia codificante esta interrumpida por el primer intron del gen de la hGH.
Cada vez que se hicieron pasar las celulas transfectadas, se determino la actividad de a-Gal A secretada, se contaron las celulas y se calculo la densidad celular. Basandose en el numero de celulas recogidas y el tiempo permitido para la secrecion de a-Gal A, se determino la tasa de expresion espedfica de a-Gal A y se notifica en las tablas 3 y 4 como unidades secretadas (de a-Gal A) por 106 celulas por periodo de 24 horas. Las cepas celulares deseables para la terapia genica o para su uso en la generacion de material para la purificacion de a-Gal A deben presentar una expresion y crecimiento estables a lo largo de varios pases. Los datos de las cepas celulares mostrados en las tablas 3 y 4, que se transfectaron de manera estable con el constructo de expresion de la a-Gal A pXAG-16, ilustran el hecho de que la expresion de la a-Gal A se mantiene de manera estable durante los pases en serie.
Tabla 3
Crecimiento y expresion de celulas BRS-11 que contienen el constructo de expresion de la a-Gal A pXAG-
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Pase Expresion (unidades/106 celulas/24 h) Densidad celular (celulas/cm2)
13 2601 4,80 x 104
14 1616 4,40 x 104
15 3595 4,40 x 104
Tabla 4
Crecimiento y expresion de celulas HF503-242 que contienen el constructo de expresion de la a-Gal A
PxAG-16
Pase Expresion (unidades/106 celulas/24 h) Densidad celular (celulas/cm2)
5 4069 2,80 x 104
6 7585 3,55 x 104
7 5034 2,48 x 104
1.4 Cuantificacion de la expresion de la a-Gal A
Se midio la actividad de la a-Gal A usando el sustrato soluble en agua 4-metilumbeliferil-a-D- galactopiranosido (4-MUF-gal; Research Products, Inc.) mediante una modificacion del protocolo descrito por loannou et al., J. Cell Biol. 119: 1137-1150 (1992). Se disolvio el sustrato en tampon sustrato (citrato-fosfato 0,1 M, pH 4,6) hasta una concentracion de 1,69 mg/ml (5 mM). Normalmente, se anadieron 10 ml de sobrenadante de cultivo a 75 ml de la disolucion de sustrato. Se cubrieron los tubos y se dejo incubar en un bano de agua a 37°C durante 60 minutos. Al final del periodo de incubacion, se usaron 2 ml de tampon glicina-carbonato (glicina 130 mM, carbonato de sodio 83 mM, a pH 10,6), para detener la reaccion. Se midio la fluorescencia relativa de cada muestra usando un fluorometro modelo TKO100 (Hoefer Scientific Instruments) que tiene una longitud de onda de excitacion fijada de 365 nm y detecta una longitud de onda de emision fijada de 460 nm. Se compararon las lecturas de las muestras con patrones preparados a partir de una disolucion madre 1 mM de metilumbeliferona (Sigma Chemical Co.), y se calculo la cantidad de sustrato hidrolizado. La actividad de a-Gal A se expresa en unidades; una unidad de actividad de a-Gal A equivale a un nanomol de sustrato hidrolizado por hora a 37°C. Los datos de expresion celular se expresan generalmente como unidades de actividad de a-Gal A secretadas/106 celulas/24 horas. Tambien se uso este ensayo para medir la cantidad de actividad de a-Gal en lisados celulares y en muestras de diversas etapas de purificacion de a-Gal, tal como se trata a continuacion.
1.5 Preparacion de a-Gal A activada por genes (GA-GAL)
La produccion de a-Gal A activada por genes (GA-GAL) se produjo mediante insercion de secuencias de ADN reguladoras y estructurales en sentido 5' de la secuencia que codifica para la a-Gal A humana, usando la tecnologfa de GA sustancialmente tal como se describe en la patente estadounidense numero 5.733.761.
La insercion precisa de la secuencia activadora de genes se produce como resultado de la recombinacion homologa entre ADN presente en un fragmento de ADN transfectado y secuencias de ADN genomico en sentido 5' del locus de la a-Gal A en una celula humana. La propia secuencia de activacion de genes contiene la secuencia que codifica para la a-Gal A hasta, pero sin incluir, el sitio de escision del peptido senal. Se aislaron celulas que conteman un locus de a-Gal A activada y se sometieron a seleccion con farmacos para aislar celulas con una produccion aumentada de GA-GAL.
Se introdujo un fragmento de ADN de seleccion como diana que contema una secuencia de activacion de
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genes apropiada en lmeas de celulas humanas huespedes mediante electroporacion. Una de tales lmeas celulares es HT-1080, una lmea celular certificada disponible de la ATCC (Rockville, Maryland). En la figura 9 se muestra el plasmido de activacion de genes (constructo de seleccion como diana) pGA213C que contiene un fragmento de ADN de este tipo. Este plasmido contiene secuencias disenadas para activar una parte del locus de a-Gal A endogeno en la lmea de celulas huespedes, y contiene secuencias que codifican para el peptido senal, pero no para a-Gal A humana. El constructo de seleccion como diana tambien contiene casetes de expresion para los genes neo bacteriano y dhfr de raton. Estos permiten la seleccion de fragmentos de seleccion como diana integrados de manera estable (mediante el gen neo) y para la seleccion posterior del gen dhfr usando una seleccion con metotrexato (MTX) gradual.
Ademas, pGA213C contiene secuencias disenadas para seleccionar como diana secuencias cromosomicas en sentido 5' del locus de a-Gal A endogeno mediante recombinacion homologa. La recombinacion homologa entre el locus de a-Gal A endogeno y el fragmento de ADN de 9,6 kb de pGA213C se muestra en la figura 10.
Se construyo pGA213C para delecionar 962 pb de secuencias genomicas que se extienden desde las posiciones -1183 a -222 con respecto al codon de iniciacion de metionina de a-Gal A, tras la recombinacion homologa del fragmento de pGA213C con el locus de a-Gal A del cromosoma X. La activacion transcripcional del locus de a-Gal A se produce mediante una seleccion como diana precisa de las secuencias reguladoras exogenas en sentido 5' de la region que codifica para la a-Gal A. El locus de GA-GAL resultante hace que la transcripcion se inicie desde el promotor de CMV y avance por el exon 1 del CMV, el intron de la aldolasa y los siete exones y seis intrones de la secuencia que codifica para la a-Gal A. El corte y empalme del ARNm de precursor grande une el exon de CMV exogeno (insertado mediante seleccion como diana) con el primer exon endogeno entero del transcrito de a-Gal A. La traduccion del ARNm de GA-GAL da como resultado GA-GAL previa con un peptido senal de treinta y un aminoacidos. Tras la secrecion a partir de la celula huesped, se elimina el peptido senal. En primer lugar se identifican lmeas celulares seleccionadas correctamente como diana mediante reaccion en cadena de la polimerasa explorando para detectar la presencia del ARNm de GA-GAL. Tambien se encuentra que los clones que producen ARNm de GA-GAL secretan a-Gal A enzimaticamente activa en el medio de cultivo. La confirmacion posterior de acontecimientos de seleccion como diana se logra mediante digestion con enzimas de restriccion y analisis de hibridacion por transferencia de tipo Southern de ADN genomico.
Se expusieron las celulas a seleccion con metotrexato (“MTX”) gradual. Tras la seleccion en MTX 0,05 jM, se aislo un clon de celulas y se sometio a seleccion con MTX 0,1 jM. A partir de este procedimiento se aislo una combinacion de celulas resistentes a MTX 0,1 jM (lmea celular RAG001), se expandio en cultivo y se caracterizo.
Ejemplo 2 Purificacion de a-Gal A
Lo siguiente es un procedimiento preferido para producir, purificar y someter a prueba a-Gal A. El procedimiento de purificacion mantiene a-Gal A en una forma soluble, activa, nativa a lo largo de todo el procedimiento de purificacion. La protema no se expone a extremos de pH, disolventes organicos ni detergentes, y no se escinde proteolfficamente durante el procedimiento de purificacion, y no forma agregados. El procedimiento de purificacion esta disenado para no alterar la distribucion de glicoformas de a-Gal A.
2.1 Purificacion de a-Gal A
El ejemplo 2.1 ilustra que a-Gal A puede purificarse hasta casi la homogeneidad a partir de un medio condicionado de cepas de celulas humanas en cultivo que se han transfectado de manera estable para producir la enzima. a-Gal A se afsla de medios que contienen a-Gal A usando una serie de cinco etapas cromatograficas. Las cinco etapas utilizan diversos principios de separacion que aprovechan diferentes propiedades ffsicas de la enzima para separar a-Gal A del material contaminante. Se incluye la cromatograffa de interaccion hidrofoba sobre butil- Sepharose®, interaccion ionica sobre hidroxiapatito, cromatograffa de intercambio anionico sobre Q Sepharose®, y cromatograffa de exclusion molecular sobre Superdex® 200. Ademas de ser la etapa final del procedimiento de purificacion, la cromatograffa de exclusion molecular tambien sirve como medio eficaz para intercambiar la protema purificada en un tampon compatible con la formulacion.
A. Uso de cromatograffa con butil-Sepharose® como primera etapa en la purificacion de a-Gal A
Se aclaro medio condicionado fffo (1,34 litros) mediante centrifugacion y se filtro a traves de un filtro de acetato de celulosa de 0,45 jm usando prefiltros de fibra de vidrio. Mientras se agitaba, se ajusto el pH del medio fffo, filtrado hasta 5,6 mediante la adicion gota a gota de HCl 1 N, y se anadio sulfato de amonio hasta una concentracion final de 0,66 M mediante la adicion gota a gota de una disolucion madre (temperatura ambiente) de sulfato de amonio ultrapuro 3,9 M. Se agito el medio durante otros 5 minutos a 4°C, se filtro como anteriormente y se aplico a una columna de butil-Sepharose® 4 Fast Flow (volumen de columna de 81 ml, 2,5 x 16,5 cm; Pharmacia, Uppsala, Suecia) que se habfa equilibrado en MES-Tris 10 mM, pH 5,6, que contema sulfato de amonio 0,66 M (tampon A). Se realizo la cromatograffa a 4°C sobre un sistema Gradi-Frac™ (Pharmacia, Uppsala, Suecia) equipado con monitores en lmea de UV (280 nm) y conductividad para evaluar la concentracion de protema total y
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sal, respectivamente. Tras la aplicacion de la muestra a una velocidad de flujo de 10 ml/min, se lavo la columna con 10 volumenes de columna de tampon A. Se eluyo la a-Gal A de la columna de butil-Sepharose® con un gradiente lineal de 14 volumenes de columna desde tampon A (que contiene sulfato de amonio) hasta MES-Tris 10 mM, pH
5,6 (sin sulfato de amonio). Se sometieron a ensayo fracciones para detectar actividad de a-Gal A mediante el ensayo de 4-MUF-gal, y se combinaron las que conteman una actividad de enzima apreciable. Tal como se observa en la figura 8 y el resumen de purificacion (tabla 5), esta etapa elimina aproximadamente el 99% de la protema contaminante (muestra de antes de la columna = 8,14 g de protema total; muestra de despues de la columna = 0,0638 g de protema total).
Tabla 5: Purificacion de a-Gal A a partir de medio condicionado de fibroblastos humanos transfectados
de manera estable
- Etapa de
- Volumen Actividad de Protema Actividad Purificacion Recuperacion
- purificacion
- (ml) a-Gal A 106 unidades) (x total en (mg) espedfica (x 106 unidades/mg) en veces (acumulativa) en porcentaje
- Sobrenadante de cultivo
- 1340 14,6 8140 0,0018 =1 =100
- Butil-Sepharose ® Heparina- Sepharose®
- 417 14,1 63,8 0,221 123 96,6
- 134
- 12,1 14,6 0,829 436 82,9
- Hidroxiapatito
- 47 9,73 4,46 2,18 1220 66,6
- Q Sepharose®
- 31,5 8,91 3,31 2,69 1503 61,0
- Superdex® 200
- 10 8,58 2,93 2,92 1634 59,0
B. Uso de cromatografia con Heparina-Sepharose® como etapa para la purificacion de a-Gal A
Se dializaron las fracciones pico de la columna de butil-Sepharose® a 4°C frente a (4 litros) de MES-Tris 10 mM, pH 5,6 (cambiado una vez). Se ajusto la conductividad del dializado hasta HO 1,0 mM a 4°C mediante adicion de H2O o NaCl segun fuera necesario. Posteriormente, se aplico la muestra a una columna de Heparina- Sepharose® 6 Fast Flow (Pharmacia, Uppsala, Suecia; volumen de columna de 29 ml, 2,5 x 6 cm) que se habfa equilibrado en MES-Tris 10 mM, pH 5,6, que contema NaCl 9 mM (tampon B). Esto se realizo a 4°C a una velocidad de flujo de 10 ml/min. Monitores en lmea de UV (280 nm) y conductividad midieron la concentracion de protema total y sal.
Tras aplicar la muestra, se lavo la columna con 10 volumenes de columna de tampon B seguido por un gradiente lineal de 3 volumenes de columna hasta un 8% de tampon C/92% de tampon B (en el que tampon C es MES-Tris 10 mM, pH 5,6, que contiene NaCl 250 mM) y un lavado de 10 volumenes de columna con un 8% de tampon C. Esto se siguio por elucion de a-gal A con un gradiente lineal de 1,5 volumenes de columna hasta un 29% de tampon C y un gradiente lineal posterior de 10 volumenes de columna hasta un 35% de tampon C. Se sometieron a ensayo las fracciones para detectar actividad de a-gal A, y se combinaron las que conteman actividad apreciable.
C. Uso de cromatografia con hidroxiapatito como etapa para la purificacion de a-Gal A
Se filtro la combinacion de heparina y se aplico directamente a una columna de hidroxiapatito de ceramica HC (40 pm; American International Chemical, Natick, MA; volumen de columna de 12 ml, 1,5 x 6,8 cm) que se habfa equilibrado en fosfato de sodio 1 mM, pH 6,0 (tampon D). Se realizo la cromatografia a temperatura ambiente sobre un sistema hfibrido Gradi-Frac™/FPLC® (Pharmacia, Uppsala, Suecia) equipado con monitores en lmea de UV (280 nm) y conductividad. Tras aplicar la muestra (5 ml/min), se lavo la columna con 10 volumenes de columna de tampon D. Se eluyo la a-Gal A con un gradiente lineal de 7 volumenes de columna hasta un 42% de tampon E/58% de tampon D (en el que el tampon E es fosfato de sodio 250 mM, pH 6,0) seguido por un gradiente de 10 volumenes de columna hasta un 52% de tampon E. Se sometieron a ensayo las fracciones para detectar actividad de a-Gal A, y se combinaron las fracciones que conteman actividad apreciable.
D. Uso de cromatografia de intercambio anionico Q Sepharose® como etapa para la purificacion de a-Gal A
Se diluyo la combinacion de hidroxiapatito aproximadamente 1,5 veces con H2O hasta una conductividad final de HO 3,4-3,6 mM a temperatura ambiente. Tras filtrar, se aplico la muestra a una columna de Q Sepharose® HP (Pharmacia, Uppsala, Suecia; volumen de columna de 5,1 ml, 1,5 x 2,9 cm) equilibrada en un 10% de tampon G/90% de tampon F, en el que el tampon F es fosfato de sodio 25 M, pH 6,0, y el tampon G es fosfato de sodio 25 mM, pH 6,0, NaCl 250 mM. Se realizo la cromatografia a temperatura ambiente en el sistema hbrido Gradi- Frac™/FPLC® (Pharmacia, Uppsala, Suecia), y se monitorizaron las concentraciones de protema total y sal mediante los monitores en lmea. Se aplico la muestra a una velocidad de flujo de 5 ml/min, despues se realizaron las siguientes etapas: (1) un lavado de 5 volumenes de columna al 10% de tampon G, (2) un lavado de 7 volumenes de
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columna al 12% de tampon G, (3) un gradiente lineal de 3 volumenes de columna hasta el 50% de tampon G, (4) un gradiente lineal de 10 volumenes de columna hasta el 53% de tampon G, (5) un gradiente de 3 volumenes de columna hasta el 100% de tampon G y (6) un lavado de 10 volumenes de columna al 100% de tampon G. La a-Gal A se eluyo principalmente durante las etapas 3 y 4. Se combinaron las fracciones que conteman actividad apreciable (la “combinacion Q”).
E. Uso de cromatografia de filtracion en gel de Superdex®-200 como etapa para la purificacion de a-Gal A
Se concentro la combinacion Q aproximadamente 5 veces usando unidades de concentracion centnfuga Centriprep®-10 (Amicon, Beverly, MA), y se aplico a una columna de Superdex® 200 (Pharmacia, Uppsala, Suecia; volumen de columna de 189 ml, 1,6 x 94 cm). Se equilibro la columna y se eluyo con fosfato de sodio 25 mM, pH 6,0, que contema NaCl 150 mM. Se realizo la cromatograffa en un sistema FPLC® (Pharmacia, Uppsala, Suecia) a temperatura ambiente usando un monitor en lmea de UV (280 nm) para seguir la elucion de la protema. El volumen de la muestra aplicado a la columna fue de < 2 ml, la velocidad de flujo fue de 0,5 ml/min y el tamano de fraccion fue de 2 ml. Se realizaron multiples series de columnas; se sometieron a ensayo las fracciones para determinar la actividad de a-Gal A y se combinaron las fracciones que conteman actividad apreciable.
Se concentraron las fracciones combinadas de la columna Superdex® 200 usando unidades Centriprep 10, se prepararon almuotas, se congelaron instantaneamente y se almacenaron a -80°C durante cortos periodos de tiempo. En la tabla 5 se muestra un resumen de este ejemplo de purificacion de a-Gal A. El rendimiento final de a- Gal A fue del 59% de la actividad del material de partida, y la actividad espedfica del producto purificado fue de 2,92 x 106 unidades/mg de protema. El producto resultante mostro un alto nivel de pureza tras la electroforesis en condiciones reductoras en un gel de de SDS-poliacrilamida al 4-15%, que posteriormente se tino con plata.
Sumario
El procedimiento de purificacion proporciona a-Gal A sumamente purificada. La mayor parte de la purificacion se produce en las 2 primeras etapas del procedimiento, mientras que las tres etapas finales sirven para pulir el material eliminando los contaminantes minoritarios restantes. La ultima etapa, la cromatograffa de exclusion molecular en Superdex® 200, tambien sirve para intercambiar la a-Gal A en un tampon compatible con la formulacion.
2.2 Tamano de a-Gal A producida por celulas humanas transfectadas de manera estable en cultivo
Se investigaron las propiedades estructurales y funcionales de la a-Gal A humana purificada. El producto resultante mostro un alto nivel de pureza tras la electroforesis en condiciones reductoras en un gel del 4-15% de SDS-poliacrilamida, que posteriormente se tino con plata.
Se estimo la masa molecular de a-Gal A mediante espectrometna de masas de MALDI-TOF. Estos resultados demuestran que la masa molecular del dfmero es de 102.353 Da, mientras que la del monomero es de
51.002 Da. La masa molecular esperada del monomero, basandose en la composicion de aminoacidos, es de 45.400 Da. Por tanto, el contenido en hidratos de carbono de la enzima representa hasta 5.600 Da del peso molecular.
2.3 Modificacion de hidratos de carbono de a-Gal A producida por celulas humanas transfectadas de forma estable
Tambien se evaluo el patron de glicosilacion de a-Gal A producida segun la invencion. La glicosilacion apropiada es importante para una actividad in vivo optima de la a-Gal A; la a-Gal A expresada en sistemas no glicosilantes es inactiva o inestable. Hantzopolous et al., Gene 57: 159 (1987). La glicosilacion tambien es importante para la internalizacion de la a-Gal A en las celulas diana deseadas, y afecta a la semivida en circulacion de la enzima in vivo. En cada subunidad de a-Gal A, hay cuatro sitios disponibles para la adicion de cadenas de hidratos de carbono unidas a asparagina, de los cuales solo tres estan ocupados. Desnick et al., en THE METABOLIC AND MOLECULAR BASES OF INHERITED DISEASE, (McGraw Hill, Nueva York, 1995) pags. 2741-2780.
Se trato con neuraminidasa una muestra de a-Gal A producida por celulas transfectadas de forma estable, que se afsla de A. urafaciens, (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) para eliminar el acido sialico. Se realizo esta reaccion tratando 5 mg de a-Gal A durante la noche con 10 mU de neuraminidasa a temperatura ambiente en un volumen total de 10 ml de solucion salina tamponada con acetato (ABS, acetato de sodio 20 mM, pH 5,2, NaCl 150 mM).
Tambien se desfosforilo a-Gal A purificada producida por celulas transfectadas de manera estable usando fosfatasa alcalina (fosfatasa alcalina de intestino de ternero, Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN), tratando 5 mg de a-Gal A durante la noche a temperatura ambiente con 15 U de fosfatasa alcalina en ABS (pH aumentado hasta 7,5 con Tris 1 M).
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Se analizaron las muestras mediante SDS-PAGE y/o isoelectroenfoque seguido por inmunotransferencia de tipo Western con un anticuerpo espedfico anti-a-Gal A. El anticuerpo usado era un anticuerpo policlonal de conejo anti-peptido, que se produjo usando un peptido que representa los aminoacidos 68-81 de a-Gal A como un inmunogeno. Tras la transferencia de la protema a PVDf (Millipore, Bedford, MA), se detecto con sondas la membrana con una dilucion 1:2000 del antisuero en un 2,5% de Blotto (leche en polvo desnatada en TrisHCl 20 mM, pH 7,5, Tween-20 al 0,05%). Esto se siguio por la deteccion con IgG de cabra anti-conejo conjugada con peroxidasas del rabano (Organo Technique/Cappella, Durham, NC; dilucion 1:5000) y reactivos del kit de quimioluminiscencia ECL (Amersham, Arlington Heights, IN).
El tratamiento de a-Gal A con neuraminidasa seguido por analisis de SDS-PAGE dio como resultado un desplazamiento en la masa molecular (de aproximadamente 1500-2000 Da o 4-6 acidos sialicos/monomero), lo que sugiere que hay una modificacion amplia de la a-Gal A con acido sialico. Para referencia, la forma en plasma de a- Gal A tiene 5-6 residuos de acido sialico por monomero, y la forma en placenta tiene 0,5-1,0 residuos de acido sialico por monomero. Bishop et al., J. Biol. Chem. 256: 1307 (1981).
Otro procedimiento usado para examinar las modificaciones con acido sialico y M6P de a-Gal A fue el isoelectroenfoque (IEF), en el que se separan las muestras basandose en su punto isoelectrico (pi) o carga neta. Por tanto, se espera que la eliminacion de residuos cargados tales como acido sialico o fosfato de la a-Gal A altere la movilidad de la protema en el sistema de IEF.
Para realizar el experimento de IEF, se trataron con neuraminidasa y/o fosfatasa alcalina muestras de a-Gal A producidas segun la invencion, se mezclaron 1:1 con 2 X tampon de muestra Novex (con urea 8 M, pH 3,0-7,0) y se cargaron sobre un gel de IEF de urea 6 M (5,5% de poliacrilamida) preparado usando Pharmalyte® (Pharmacia, Uppsala, Suecia; pH 3,0-6,5; Pharmalyte® 4-6,5 y 2,5-5,5, 0,25 ml de cada uno por gel). Tambien se incluyeron patrones de punto isoelectrico (Bio-Rad). Tras la electroforesis, se transfirio el gel a PVDF y se realizaron analisis de inmunotransferencia de tipo Western tal como se describio anteriormente.
El tratamiento con neuraminidasa de la enzima aumento el pI de las tres isoformas, lo que indica que todas se modificaron en cierto grado mediante acido sialico. Estos datos sugieren que las preparaciones de a-Gal A producidas tal como se describe en el presente documento deben tener una semivida en plasma deseable, lo que indica que este material es bastante adecuado para su uso farmacologico. Ademas, el tratamiento con fosfatasa alcalina de a-Gal A tratada con neuramidasa aumento adicionalmente el pI de una parte de la protema hasta aproximadamente 5,0-5,1, lo que indica que la enzima lleva uno o mas residuos de M6P. Esta modificacion se requiere para una internalizacion eficaz de a-Gal A por las celulas diana.
Se analizaron las cadenas de hidratos de carbono de a-Gal A unidas en N mediante HPLC de intercambio ionico (Glyco-Sep C) y marcaje del extremo no reductor con el compuesto fluorescente 2-aminobenzamida (AB). Los resultados del analisis de AB-glucanos a partir de tres preparaciones de a-Gal A separadas se resumen en la tabla 6. Las tres preparaciones teman un numero Z superior a 170. Ademas, mas del 67% de los glucanos estaban sialilados, mas del 16% de los glucanos estaban fosforilados y menos del 16% eran neutros. Estos resultados resultaron muy favorables en comparacion con los resultados notificados en la tecnica anterior. Por ejemplo, Desnick et al., (patente estadounidense 5.356.804) notificaron que mas del 60% de los glucanos eran neutros, estando sialilados solo el 11 %.
Tabla 6
Resultados del analisis de AB-glucanos a partir de GA-GAL Tratamiento Numero Z % de % de % de di % de tri % de
neutros mono tetra
- Ninguno
- 170,04 16,83 22,8 39,45 15,34 5,58
- Ninguno
- 177,71 14,22 20,63 44,62 14,2 6,31
- Ninguno
- 171,68 15,81 20,73 43,2 14,33 5,39
- Media (N=3)
- 173,14 15,62 21,39 42,42 14,62 5,76
- Neuraminidasa
- 24,36 85,25 5,14 9,61 ND ND
- Fosfatasa alcalina
- 150,93 23,38 24,47 34,28 13,58 4,29
- Porcentaje del total:
- Preparaciones de GA-GAL de Desnick et al., patente
la presente invencion estadounidense 5.356.804
- P-glucanos totales
- 16,62 24,1
- Sialilados totales
- 67,57 11
- Neutros totales (hih-manosa e hibridos)
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En la tabla 7 se proporcionan caracterizaciones mas detalladas de las preparaciones de GA-GAL purificada.
Tabla 7 Preparacion a granel purificada de GA-GAL
- Ensayo
- 40-173-KH 42-202-KH
- Actividad espedfica
- 2,75 2,80
- SDS-PAGE y Coomassie
- 100% 100%
- SDS-PAGE y tincion con plata
- 99,6% 100%
- HPLC de fase inversa
- 100% 99,94
- Cromatograffa de exclusion molecular
- 0% 0,01%
- Internalizacion por fibroblastos del prepucio
- 123,6% 94,3%
2.4 Parte creciente de a-Gal A cargada mediante fraccionamiento de especies de a-Gal A
Tal como se trato anteriormente, el fraccionamiento de glicoformas de a-Gal A puede producirse en diversas etapas en el procedimiento de purificacion tal como se describe en el presente documento. En el presente ejemplo, se fraccionaron glicoformas de a-Gal A por tamano y por carga. Tambien es posible fraccionar a-Gal A mediante una combinacion de estas u otras tecnicas cromatograficas tal como se describio anteriormente.
Para el fraccionamiento por tamano de glicoformas de a-Gal A, se realizo cromatograffa de exclusion molecular en una columna Superdex® 200 (Pharmacia, 1,6 cm por 94,1 cm) equilibrada en solucion salina tamponada con fosfato a pH 6. Se cargo a-Gal A (2,6 mg en 1 ml) sobre la columna y se eluyo la columna a 0,35 ml/min. Se recogieron fracciones a lo largo del perfil de elucion y se analizaron mediante SDS-PAGE las fracciones que comprendfan el pico de elucion ancho de a-Gal A, despues se visualizaron mediante tincion con plata. Las fracciones en el primer borde del pico conteman a-Gal A del mayor peso molecular y, a medida que las fracciones continuaron a lo largo del pico, el peso molecular aparente de la a-Gal A disminuyo gradualmente. Entonces se seleccionaron las fracciones de a-Gal A y se combinaron para proporcionar una preparacion de a-Gal A de los intervalos de peso molecular deseados.
Para el fraccionamiento de glicoformas de a-Gal A por carga, se fracciono la a-Gal A mediante cromatograffa con Q-Sepharose®. Se equilibro la columna Q-Sepharose® (1,5 cm por 9,4 cm) en fosfato de sodio 20 mM, pH 6,0, que contema NaCl 30 mM y se mantuvo la velocidad de flujo a 5 ml/min. Se cargo a-Gal A (130 mg en 166 ml) sobre la columna, se lavo con tampon de equilibrado y despues se eluyo con fosfato de sodio 20 mM, pH 6,0, que contema NaCl 130 mM. Para un fraccionamiento mas amplio, puede usarse una elucion en gradiente (por ejemplo, 10 volumenes de columna) desde el tampon de equilibrado hasta el tampon de elucion. Se recogieron fracciones a lo largo del perfil de elucion y se analizaron mediante SDS-PAGE las fracciones que comprendfan el pico de elucion de a-Gal A, despues se visualizaron mediante tincion con plata. La especie de menor peso molecular observada sobre el gel eluyo en el lavado y en el primer borde del pico, las glicoformas del mayor peso molecular eluyeron hacia el final del pico. La especie de menor peso molecular corresponde a las glicoformas menos negativamente cargadas de a-Gal A, que se unen menos fuertemente a la columna de Q-Sepharose® cargada positivamente (compuesta por una resina sustituida con amina cuaternaria). La especie de a-Gal A de la mayor carga negativa eluyo despues en el perfil de elucion y tiene un peso molecular superior, segun se analizo mediante SDS-PAGE. El fraccionamiento por carga se confirmo mediante isoelectroenfoque de las fracciones elrndas o de combinaciones seleccionadas.
Por tanto, tanto el fraccionamiento por tamano como el fraccionamiento por carga permitieron la seleccion de glicoformas sumamente cargadas de a-Gal A.
2.5 Internalizacion de a-Gal A mediada por manosa o manosa-6-fosfato (M6P)
Para que la a-Gal A producida por celulas transfectadas de manera estable sea un agente terapeutico eficaz para deficiencias de a-Gal A, debe internalizarse la enzima por las celulas afectadas. a-Gal A es mmimamente activa a niveles fisiologicos de pH, por ejemplo, en la sangre o fluidos intersticiales. a-Gal A solo metaboliza de manera optima los sustratos lipfdicos acumulados cuando se internaliza en el entorno acido del lisosoma. Esta internalizacion esta mediada por la union de a-Gal A a receptores de M6P, que se expresan sobre la superficie celular y administran la enzima al lisosoma mediante la ruta endodtica. El receptor de M6P se expresa de manera ubicua; la mayor parte de las celulas somaticas expresan M6P en algun grado. El receptor de manosa, que es espedfico para residuos de manosa expuestos sobre glicoprotemas, es menos prevalente. Generalmente, los receptores de manosa solo se encuentran sobre macrofagos y celulas similares a macrofagos, y proporcionan un medio adicional de entrada de a-Gal A en estos tipos celulares.
Con el fin de demostrar la internalizacion de a-Gal A mediada por M6P, se cultivaron durante la noche en presencia de concentraciones crecientes de a-Gal A purificada de la invencion fibroblastos de la piel de un paciente
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con enfermedad de Fabry (NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository). Algunas de las muestras conteman M6P soluble 5 mM, que inhibe de manera competitiva la union a, e internalizacion por, el receptor de M6P. Otras muestras conteman 30 mg/ml de manano, que inhibe la union a, e internalizacion por, el receptor de manosa. Tras la incubacion, se lavaron las celulas y se recogieron mediante rascando en tampon de lisis (Tris 10 mM, pH 7,2, NaCl 100 mM, EDTA 5 mM, Pefabloc™ 2 mM (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) y nP-40 al 1%). Entonces se sometieron a ensayo las muestras lisadas para determinar la concentracion de protema y la actividad de la a-Gal A. Los resultados se expresan como unidades de actividad a-Gal A/mg de protema celular. Las celulas de Fabry internalizaron a-Gal A de una manera dependiente de la dosis. Esta internalizacion se inhibio por M6P, pero no hubo inhibicion con manano. Por tanto, la internalizacion de a-Gal A en fibroblastos de Fabry esta mediada por el receptor de M6P, pero no por el receptor de manosa.
Tambien se internalizo a-Gal A in vitro por celulas endoteliales, celulas diana importantes para el tratamiento de la enfermedad de Fabry. Se cultivaron celulas endoteliales de la vena umbilical humanas (HUVEC) durante la noche con 7500 unidades de a-Gal A; algunos de los pocillos conteman M6P. Tras el periodo de incubacion, se recogieron las celulas y se sometieron a ensayo para detectar a-Gal A tal como se describio anteriormente. Las celulas incubadas con a-Gal A teman niveles de enzima de casi 10 veces los de las celulas control (sin incubacion con a-Gal A). M6P inhibio la acumulacion intracelular de a-Gal A, lo que sugiere que la internalizacion de a-Gal A por HUVEC esta mediada por el receptor de M6P. Por tanto, la a-Gal A humana de la invencion se internaliza por celulas clmicamente relevantes.
Se conocen pocas lmeas celulares humanas cultivadas que expresen el receptor de manosa. Sin embargo, puede usarse una lmea celular similar a macrofagos de raton (J774.E) que lleva receptores de manosa pero pocos, si lleva alguno, receptores de M6P para determinar si la a-Gal A purificada de la invencion se internaliza mediante el receptor de manosa. Diment et al., J. Leukocyte Biol. 42: 485-490 (1987). Se cultivaron celulas J774.E durante la noche en presencia de 10.000 unidades/ml de a-Gal A. Las muestras seleccionadas tambien conteman M6P 2 mM, y otras conteman 100 mg/ml de manano. Se lavaron las celulas y se recogieron tal como se describio anteriormente, y se determinaron la protema total y la actividad de la a-Gal A de cada muestra. M6P no inhibe la captacion de a-Gal A por estas celulas, mientras que el manano reduce los niveles de a-Gal A acumulada en un 75%. Por tanto, la a- Gal A de la invencion puede internalizarse por el receptor de manosa en tipos celulares que expresan este receptor de superficie celular particular.
Ejemplo 3 Formulacion farmaceutica
Preparacion de formulaciones y disoluciones tampon
Se diluye una preparacion a granel purificada de a-Gal A hasta una concentracion final con diluyente de a- Gal A. Basandose en el volumen de preparacion a granel purificada que va a formularse, la concentracion de a-Gal A (mg/ml) y la concentracion deseada de a-Gal A en la formulacion final, se determina el volumen de diluyente de a- Gal A requerido. El diluyente de a-Gal A se prepara en el plazo de 24 horas de uso mezclando cantidades apropiadas de WFI, cloruro de sodio y fosfato de sodio monobasico, y ajustando el pH hasta 6,0 con disolucion de hidroxido de sodio. La composicion de diluyente de a-Gal A se menciona en la tabla 8.
Tabla 8
COMPOSICION DE DILUYENTE DE a-GAL A (por litro)
Componente__________________
Cloruro de sodio (USP)
Hidroxido de sodio, 5 N
Fosfato de sodio, monobasico (USP) Agua para inyeccion (USP)
Numero de partes_____Cantidad__________________
100-1916 8,8 g
200-1903 cantidad suficiente para ajustar
el pH hasta 6,0
100-1913 3,5 g
100-2301 cantidad suficiente hasta 1,0 l
Se filtran volumenes de un litro o menores de diluyente de a-Gal A mediante Tiltracion a vacio usando filtros de nylon de 0,2 mm esteril (Nalge Nunc International, Rochester, NY). Se filtran volumenes mayores mediante presion positiva usando una bomba peristaltica y filtros de capsula Supor® de 0,2 mm (Pall, Port Washington, NY). Se someten todos los filtros a pruebas de integridad de punto de burbujeo tras la filtracion. Se realizan etapas de mezclado y filtracion en una campana de flujo laminar de clase 100 certificada. Se anade diluyente de a-Gal A a la preparacion a granel purificada de a-Gal A en un vaso de mezclado para dar una disolucion final de 1 mg/ml. Despues se anade el volumen apropiado de polisorbato 20 (Tween 20, Spectrum) para alcanzar una concentracion final del 0,02%.
Ejemplo Comparativo 4 a-Gal A desgalactosilada desialilada
Para explorar el efecto de la glicosilacion sobre la biodistribucion de a-Gal A, se desglicosilo secuencialmente una preparacion purificada de a-Gal A y se inyecto cada forma a ratones. Se recogieron los
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organos de los ratones a las cuatro horas tras las inyecciones y se realizo la inmunohistoqmmica sobre los tejidos para visualizar posibles cambios en la biodistribucion de la protema.
En primer lugar se trato la a-Gal A con neuraminidasa (sialidasa) para eliminar residuos de acido sialico, dejando los restos de galactosa expuestos. Una parte de esta forma tratada con sialidasa se hizo reaccionar adicionalmente con p-galactosidasa para eliminar residuos de galactosa; esto dejo los residuos de N- acetilglucosamina (GlcNAC) expuestos. Despues se eliminaron los GlcNAC mediante N-acetilglucosaminidasa, dejando los grupos de manosa del nucleo en la protema. Se inyectaron a-Gal A sin tratar (control) o una de las formas tratadas de la protema en ratones a traves de la vena de la cola. Cuatro horas tras las inyecciones, se recogieron el hngado, bazo, corazon, rinon y pulmones de los ratones, se conservaron y se inmunotineron para la deteccion de a-Gal A.
Cuando se comparo con animales control que recibieron protema sin tratar, los ratones que recibieron la enzima tratada con sialidasa (residuos de galactosa expuestos) teman mas a-Gal A localizada en el tngado y de manera correspondiente menos enzima en otros organos examinados. Adicionalmente, el patron de tincion en el tngado fue bastante diferente. En animales control, la a-Gal A se localizo principalmente en celulas de Kupffer y celulas endoteliales solo con tincion de hepatocitos moderada. En animales que recibieron la a-Gal A tratada con sialidasa, la enzima se localizo solo en los hepatocitos, de manera coherente con la biodistribucion conocida del receptor de asialoglicoprotema. Este efecto de la desglicosilacion sobre la biodistribucion se invirtio cuando se eliminaron los residuos de galactosa mediante p-galactosidasa. El patron de tincion observado en el hngado de los ratones que recibieron esta protema sin restos de galactosa fue similar al de los animales control; la mayor parte de la tincion estaba en las celulas de Kupffer y celulas endoteliales, con tincion de hepatocitos minima. El tratamiento adicional de la a-Gal A con N-acetilglucosaminidasa no altero el patron de tincion del observado para la protema tratada con p-galactosidasa; es decir, la eliminacion de residuos de N-acetilglucosamina parecio tener poco efecto sobre la biodistribucion de a-Gal A.
Ejemplo 5 Correccion de fibroblastos de Fabry por fibroblastos humanos que expresan a-Gal A
Para la terapia genica, un implante de celulas autologas que producen a-Gal A debe producir la enzima en una forma modificada de manera apropiada para “corregir” la deficiencia de a-Gal A en celulas diana. Para evaluar el efecto de la produccion de a-Gal A por fibroblastos humanos transfectados sobre celulas de Fabry, se cultivaron conjuntamente fibroblastos recogidos de pacientes con enfermedad de Fabry (NIGMS Human Genetics Mutant Cell Repository) con una cepa celular de produccion de a-Gal A (BRS-11) en Transwells® (Costar, Cambridge, MA). Se cultivaron celulas de Fabry en placas de cultivo tisular de 12 pocillos, algunas de las cuales conteman insertos (Transwells®, 0,4 mm de tamano de poro) que teman una superficie sobre la que pueden crecer las celulas. La matriz de crecimiento del inserto es porosa y permite que las macromoleculas pasen desde el medio superior hasta el inferior. Un conjunto de insertos conteman fibroblastos de prepucio humano (HF) normales, que secretan niveles mmimos de a-Gal A, mientras que otro conjunto contema la cepa de fibroblastos humanos transfectados de manera estable, BRS-11, que secreta grandes cantidades de a-Gal A. En los pocillos cultivados conjuntamente con celulas de produccion de a-Gal A, la a-Gal A puede entrar en el medio que bana las celulas de Fabry y potencialmente puede internalizarse por las celulas de Fabry.
Los datos en la tabla 9 muestran que las celulas de Fabry internalizaron la a-Gal A secretada. Se monitorizaron los niveles intercelulares de a-Gal A durante 3 dfas. Las celulas cultivadas solas (sin inserto) o en presencia de fibroblastos de prepucio no transfectados (inserto de HF) tuvieron niveles intracelulares muy bajos de actividad a-Gal A. Sin embargo, las celulas de Fabry cultivadas con las celulas de produccion de a-Gal A (inserto de BRS-11), mostraron niveles de enzimas similares a los de las celulas normales al final del dfa 2 (los fibroblastos normales tienen 25-80 unidades de a-Gal A/mg de protema). El que la correccion pueda atribuirse a la captacion de a-Gal A mediante el receptor de M6P se demuestra mediante la inhibicion con M6P (inserto de BRS-11 + M6P).
Tabla 9
CORRECCION DE FIBROBLASTOS DE FABRY POR FIBROBLASTOS HUMANOS QUE EXPRESAN ACTIVIDAD a-Gal A (unidades/mg de protema total)
- Tiempo
- N° de inserto Inserto de HF Inserto de BRS-11 Inserto de BRS-11 + M6P
- Dfa 1
- 2 ± 1 2 ± 1 13 ± 1 4 ± 1
- Dfa 2
- 2 ± 1 2 ± 1 40 ± 11 6 ± 2
- Dfa 3
- 2 ± 1 5 ± 1 85 ± 1 9 ± 1
La descripcion anterior se ha presentado solamente con propositos de ilustracion y no se pretende que limite la invencion a la forma precisa divulgada.
En esta especificacion, las formas singulares incluyen referencias plurales, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.
Claims (6)
- 5101520253035404550556065Reivindicaciones1. Una preparacion de a-Gal A glicosilada humana que tiene una carga de oligosacaridos aumentada, en donde entre el 35% y el 85% de los oligosacaridos se cargan por la adicion de :(i) uno a cuatro residuos de acido sialico en glicanos complejos,(ii) uno a dos restos de fosfato en glicanos alta-manosa, o(iii) un unico fosfato y un unico acido sialico en glicanos hforidos,para su uso en el tratamiento de deficiencia de a-Gal A a una dosis semanal o bisemanal de entre 0,05 mg a 5,0 mg de la preparacion de a-Gal A por kg de peso corporal de un sujeto.
- 2. La preparacion de a-Gal A para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde al menos el 50% de los oligosacaridos estan cargados.
- 3. La preparacion de a-Gal A para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en donde la enzima a-Gal A contiene aproximadamente un 15% de estructuras neutras (alta-manosa e hforidas), aproximadamente un 16% de glicanos fosforilados, y aproximadamente un 67% de glicanos complejos con de 2 a 4 residuos de acido sialico.
- 4. La preparacion de a-Gal A para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la enzima a-Gal A contiene tres sitios de glicosilacion N-enlazados, de los que dos sitios de glicosilacion N-enlazados han sido procesados a glicanos complejos y el tercer sitio esta ocupado por un glicano alta-manosa, el 50% de los cuales ha sido modificado por fosforilacion espedfica del encima para producir tanto especies monofosforiladas como difosforiladas.
- 5. La preparacion de a-Gal A para el uso de acuerdo con la reivindicacion 3 o 4, en donde dicha preparacion de a- Gal A se produce en celulas HT-1080.
- 6. La preparacion de a-Gal A para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la preparacion de a-Gal A se purifica a al menos un 99,5% de homogeneidad, como se mide por SDS-PAGE o HPLC de fase inversa, en donde dicha preparacion comprende varias glicoformas de a-Gal A y tiene una actividad espedfica de al menos 3.0 x 106 unidades/mg de protema.
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