JP2004121260A - 生物学的に活性なα−ガラクトシダーゼAのクローニング及び発現 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 本発明は、真核宿主細胞発現系にα-GalAコード配列をクローニングして、そこで発現させることによるヒトα-GalAの大量生産に関する。ここに記載する真核細胞発現系、特に哺乳動物宿主細胞発現系は適切なプロセシング(例えば、グリコシル化、リン酸化など)に必要とされる適当な翻訳と同時の修飾および翻訳後の修飾ならびに発現産物の選別を提供し、かくして活性酵素が産生される。ここに記載する方法を用いると、遺伝子工学的に作製された宿主細胞から組換えα-GalAが分泌され、かくして良好な収量で培養培地から回収される。本発明により産生されたα-GalAは、制限するものではないが、ファブリー病の治療において、糖複合体中のα-ガラクトシル残基の加水分解のために、および/または赤血球上の血液型B抗原の血液型O抗原への変換のために使用することができる。
【選択図】 なし
Description
本発明は、生物学的に活性なヒトα−ガラクトシダーゼ(α−GalA)の製造も関し、発現産物の正確な翻訳後修飾及びプロセシングを提供する真核性発現系内でのα−Gal Aの遺伝子コード配列のクローニング及び発現を包含する製造に関する。
2. 発明の背景
1970年代初め、数人の研究者が、4−MU−及び/又はρ−NP−α−D−ガラクトピラノシド中のα−ガラクトシド結合を加水分解するA及びBと呼ばれる2種のα−ガラクトシダーゼアイソザイムの存在を証明した(Kint, 1971, Arch. Int. Physiol. Biochem. 79: 633-644;Beutler & Kuhl, 1972, Amer. J. Hum. Genet. 24: 237-249;Romeoら, 1972, FEBS Lett. 27: 161-166;Wood & Nadler, 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 250-255;Hoら, 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 256-266;Desnickら,1973, J. Lab. Clin. Med. 81: 157-171;及び Desnickら,1989, The MetabolicBasis of Inherited Disease, Scriver, C.R.Beaudet, A.L. Sly, W.S. 及びValle, D.編, pp.1751-1796, McGraw Hill, New York)。組織中では、総α−ガラクトシダーゼ(α−Gal)活性の約80〜90%が熱不安定性のミオイノシトール阻害可能α−Gal Aアイソザイムによるもので、その残りは比較的熱安定性のα−Gal Bが占めていた。これら2種の“アイソザイム”は、電気泳動、等電点電気泳動、及びイオン交換クロマトグラフィーにより分離可能であった。ノイラミニダーゼ処理後は、α−Gal A及びBの電気泳動移動度及びpI値が類似していた(Kint, 1971, Arch. Int. Physiol. Biochem. 79: 633-644)。これは最初にこれら2種の酵素がグリコシル化が異なる同じ遺伝子の産物であることを示すものであった。精製したこの糖タンパク質酵素が、サブユニット分子量(=46kDa)、ホモダイマーの構造、及びアミノ酸組成を含む類似の物性を有したという発見も、それらの構造的関連性を示した(Beutler & Kuhl, 1972, J. Biol. Chem. 247: 7195-7200;Callahanら, 1973, Biochem. Med. 7: 424-431;Deanら, 1977, Biochem. Biophys. Res. Comm. 77: 1411-1417;Schramら, 1977, Biochem. Biophys. Acta. 482: 138-144;Kusiakら, 1978, J. Biol. Chem. 253: 184-190;Deanら, 1979, J. Biol. Chem. 254: 10001-10005;及びBishopら, 1980, Enzyme Therapy in Genetic Disease: 2, Desnick, R.J. 編, pp.17-32,Alan R, Liss, Inc.,New York)。しかしながら、α−Gal A又はBに対するポリクローナル抗体が他方の酵素と交叉反応しなかったこと(Beutler & Kuhl, 1972, J. Biol. Chem. 247: 7195-7200;及び Schram ら, 1977, Biochem. Biophys. Acta. 482: 138-144);α−Gal A活性だけがファブリー病のヘミ接合体に不足していたこと(Kint, 1971, Arch. Int. Physiol. Biochem. 79: 633-644;Beutler & Kuhl, 1972, Amer. J. Hum. Genet. 24: 237-249;Romeoら, 1972, FEBS Lett. 27: 161-166;Wood & Nadler, 1972, Am. J. Hum. Genet. 24: 250-255;Hoら, 1972, Am. J. Hum.Genet. 24: 256-266;Desnickら, 1973, J. Lab. Clin. Med. 81: 157-171;Desnickら, 1989, The MetabolicBasis of Inherited Disease, Scriver, C.R. Beaudet, A.L. Sly, W.S.及びValle, D.編, pp.1751-1796, McGraw Hill, New York;及び Beutler & Kuhl, 1972, J. Biol. Chem. 247: 7195-7200);及びα−Gal A及びBの遺伝子が異なる染色体にマッピングされたこと(Desnickら, 1989, The MetabolicBasis of Inherited Disease, Scriver, C.R. Beaudet, A.L. Sly, W.S.及びValle,D.編, pp.1751-1796, McGraw Hill, New York;deGrootら, 1978, Hum. Genet. 44: 305-312)がその後に明らかにされ、これら酵素が遺伝的に別異であることが明確に証明された。
2.1. α−Gal A及びファブリー病
ファブリー病、つまりα−Gal Aの活性が不足していることから生じるリソソーム蓄積症では、1967年にこの酵素欠損症が同定された(Bradyら, 1967, N. Eng. J. Med. 276: 1163)ことが、それぞれ1969年及び1970年におけるα−Gal A置換の最初のinvitro(Dawsonら, 1973, Pediat. Res. 7: 694-690m)及びin vivo(Mapesら, 1970, Science 169: 987)療法の試行を導いた。これら及びその後の試行(Mapesら,1970, Science 169: 987;Desnickら, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5326;及びBradyら, 1973, N. Eng. J. Med.289: 9)により、この疾患について直接酵素置換の生化学的有効性が証明された。精製した脾性及び血漿性α−Gal Aを反復注射(100,000U/注射)して、4ヵ月間にわたってヘミ接合体に影響を与えた(Desnickら, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5326)。これら研究の結果により、(a)脾型の血漿クリアランスは、血漿型の血漿クリアランスよりも7倍速かった(70分に対して10分);(b)この酵素の脾型に比べて、血漿型は際立って長い時間にわたり(1時間に対して48時間)25倍大きな血漿基質の消耗をもたらした;(c)影響を与えた2つのヘミ接合体に対して4ヵ月間にわたって両方の型を6回静脈投与したが免疫応答の形跡がなかったことが証明され;そして(d)蓄積された組織基質が、この酵素の脾型によってではなく血漿型によって消耗後に血行内に可動化したことを示す示唆的証拠が得られた。かくして、この投与酵素は、血行(蓄積の主要域)から基質を減らしただけでなく、おそらくは、前に蓄積されていた基質をその後のクリアランスのために他の貯留槽から血行中に可動化した。これら研究は、反復酵素置換により異常な糖脂質蓄積を取り除くか又は有意に低下させる可能性を示した。
2.2. α−Gal A酵素
α−Gal Aヒト酵素は、約101,000Daの分子量を有する。SDSゲル電気泳動で、それは約49,000Daの単一バンドとして移動する。これは、この酵素がホモダイマーであることを示している(Bishop & Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1307)。α−Gal Aは、リン酸化されたエンドグリコシダーゼH感受性オリゴ糖を含有する50,500Da前駆体として合成される。この前駆体は、その合成後3〜7日以内に約46,000Daの成熟型にプロセスされる。このプロセシングの中間体は特定されていない(Lemanskyら, J. Biol. Chem. 262: 2062)。多くのリソソーム酵素と同じく、α−Gal Aは、マンノース−6−ホスフェートレセプターを介してリソソームを標的にする。これは、この酵素のムコリピドーシスII細胞内及びNH4Clで処理した線維芽細胞内での高分泌速度により証明される。
2.3. リソソーム酵素:生合成及び標的化
リソソーム酵素は、粗面小胞体内の膜結合ポリソーム上で合成される。各タンパク質は、疎水性アミノ末端シグナルペプチドを含有するより大きな前駆体として合成される。このペプチドは、シグナル認識粒子、つまり11Sリボヌクレオタンパク質と相互作用し、それによって、小胞体膜を通ってその内腔に至る発生期のタンパク質のベクター輸送を開始する(Ericksonら, 1981, J. Biol. Chem. 256: 11224;Ericksonら, 1983, Biochem. Biophys. Res. Commun. 115: 275;Rosenfeldら, 1982, J. Cell. Biol. 93: 135)。リソソーム酵素は、脂質結合中間体から発生期ポリペプチド中のコンセンサス配列Asn−X−Ser/ThrのAsn残基への大きな前生成オリゴ糖、つまりグルコース−3、マンノース−9、N−アセチルグルコサミン−2の総括的転移により、翻訳時にグリコシル化される(Kornfeld, R. & Kornfeld,S., 1985, Annu. Rev. Biochem. 54: 631)。小胞体内では、シグナルペプチドが切り離され、そしてそのオリゴ糖鎖からの3個のグルコース残基と1個のマンノースの切り取りによりこのAsn結合オリゴ糖のプロセシングが始まる。
3. 発明の要旨
本発明は、真核宿主細胞発現系内でヒトα−Gal Aコード配列をクローニング及び発現することにより、大量のヒトα−Gal Aを製造することを包含する。ここに記載する真核性発現系、特に哺乳動物宿主細胞発現系が、正確なプロセシングに、例えば、グリコシル化、シアリル化、リン酸化等に、及び活性な酵素が産生されるよう発現産物を選別するのに要求される適切な翻訳時及び翻訳後修飾を提供する。また、容易に精製できるα−ガラクトシダーゼA融合タンパク質の発現も記載されている。これら融合タンパク質は、α−ガラクトシダーゼA部分をその融合タンパク質から簡単に切り離して回収できるように工学的に作られている。
3.1. 定義
ここで用いる場合、次の用語及び略号は、以下に示した意義を有するものとする。
α−ガラクトシダーゼA α−Gal A
α−N−アセチルガラクトサミニダーゼ α−GalNAc
塩基対 bp
チャイニーズ・ハムスター卵巣 CHO
相補的DNA cDNA
分当たりの数 cpm
デオキシリボ核酸 DNA
ダルベッコ修飾イーグル培地 DMEM
ウシ胎児血清 FCS
キロベースペア kb
キロダルトン kDa
マンノース−6−ホスフェート M−6−P
メトトレキセート MTX
4−メチルウンベリフェリル− 4−MU−α−Gal
α−D−ガラクトシド
4−メチル−ウンベリフェリル−α− 4−MU−α−
N−アセチルガラクトサミニド GalNAc
マイクログラム μg
マイクロメーター μm
ナノグラム ng
ナノメーター nm
ヌクレオチド nt
p−ニトロフェニル−α− pNP−α−
N−アセチルガラクトサミニド GalNAc
ポリアクリルアミドゲル電気泳動 PAGE
ポリメラーゼ連鎖反応 PCR
リボ核酸 RNA
ドデシル硫酸ナトリウム SDS
ユニット U
5.発明の詳細な説明
本発明は生物学的に活性なヒトα−Gal Aの産生に関し、この酵素のヌクレオチドコード配列のクローン化および真核細胞発現系における発現を含む。ここに記述され例証される、精製された生物学的に活性なこの酵素の上首尾な発現と産生は、多くの理由により特に重要である。例えば、α−Gal Aをコードする全長cDNAを種々の原核細胞発現ベクターを用いて発現しようとする過去の努力は、無傷な微生物宿主細胞の酵素アッセイおよび炭素源としてのメリビオースを用いての増殖によって実証されるこの酵素の発現をもたらした。しかし、ヒトα−Gal Aは低レベルでしか発現されず、また細菌から精製することは不可能であった。これらの結果は、微生物系において発現されるこの組換え酵素が、正常なグリコシル化の欠如および/または内因性の細胞質または細胞周辺プロテアーゼの存在により不安定であったことを示している。
5.1.α−Gal Aコード配列
α−Gal Aのヌクレオチドコード配列および推定されるアミノ酸配列を図1A−1Cに示す。このヌクレオチド配列、またはその断片あるいは機能的等価物は、適切な宿主細胞において上記酵素産物、またはその機能的に活性なペプチドあるいは機能的等価物の発現を引き出す組換えDNA分子を作成するのに使用できる。
生物学的に活性なα−Gal Aを発現するため、上記第5.1節に記述されているこの酵素のコード配列、機能的等価物、または修飾された配列は適切な真核細胞発現ベクターに挿入される。すなわち、適切なプロセシング(シグナル開裂、グリコシル化、リン酸化、シアリル化、およびタンパク質選別)のための細胞機械およびエレメントを有する適切な真核宿主細胞における、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入される。適切に折り畳まれプロセシングされた生物学的に活性な酵素の発現には、哺乳動物宿主細胞発現系が好ましい。ヒトに投与した時に、このような発現産物は適切な組織標的設定を示すべきで、有害な免疫学的反応は何ら示してはならない。
5.2.1.発現ベクターの構築、およびトランスフェクタント(transfectant)の調製
α−Gal Aコード配列および適切な転写/翻訳調節シグナルを含有する発現ベクターの構築には、当業者に周知の方法を用いることができる。これらの方法には、in vitro組換え/遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatisら、1982, MolecularCloning A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.,12章に記述されている技法を参照されたい。
5.2.2. α-Gal A産物を発現するトランスフェクタントまたは形質転換体の同定
少なくとも4つの一般的なアプローチ:(a)DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーション;(b)“マーカー”遺伝子機能の存在あるいは不存在;(c)宿主細胞におけるα-Gal A mRNA 転写物の発現により測定されるような転写レベルの評価;および()d免疫検定または生物学的活性により測定されるような遺伝子産物の検出により、α-Gal Aコード配列を含み、生物学的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞を同定しうる。
5.2.3. α-Gal A遺伝子産物の精製
ひとたび高レベルの生物学的に活性なα-Gal Aを産生するクローンが同定されると、そのクローンを増殖させ、当業界で周知の技術を用いて精製しうる大量の酵素を生産するために使用することができる。そのような技術としては、イムノアフィニティー精製、高性能液体クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー法などを挙げることができるが、これらに限定されない。酵素が培養細胞により分泌される場合には、培養培地からα-Gal Aを容易に回収しうる。
5.2.4. 組換え酵素の特性付け
ここに記載した哺乳類発現系(例えば、CHO 発現系)中で生産されたこの精製組換え酵素は、ヒト血漿から精製された酵素(Bishop, et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta. 525: 399; Bishop and Desnick, 1981, J. Biol. Chem., 256: 1307)と本質的に同一の分子量、至適pH、kmおよび等電点値を有していた。この酵素の糖質部分の分析により、α-Gal Aポリペプチドにおける3つのオリゴ糖鎖の存在が明らかになった。これらの鎖は、エンドグリコシダーゼおよびQAE Sephadex試験により証明されるように、複合体、ハイブリッドおよび高マンノース型の混合物であった。たいへん重要なことに、この組換え酵素は、また、末端のシアル酸部分を有する(Bishop & Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1307)点でα-Gal Aの自然血漿型に類似していた。上記した限られた分析的試行において、この酵素の血漿型は、脾臓型のものよりも循環GbOse3Cerを分解(degrade)するのに効果的であることが示された。従って、この組換え酵素または修飾組換え酵素(その糖質鎖またはアミノ酸配列の修飾を含むが、これらに限定されない。)は、ファブリー病の酵素置換治療のために最も適した型でありうる。確かに、ファブリーおよび正常繊維芽細胞による組換えα-Gal Aの飽和しうる取り込みは、ここで実施例において実証され、2mMのマンノース−6−リン酸により特異的に阻害されることが示される。
5.2.5. ファブリー病の酵素治療用の修飾グリコフォームの組換えα-Gal A
マウスにおける組換えα-Gal Aのクリアランス動力学および組織分布を評価するための初期の実験により、50% が肝臓を標的とし、残りの酵素は多くの他の組織に分布され、これには腎臓、心臓および皮膚を有意に標的とすることが含まれることが明らかとなった。この分布は、マウスにおけるヒトα-Gal Aの血漿型について以前に観察されたものと類似しているが、この酵素を変化した組織標的化のために修飾することが適当であるかもしれない。組織標的化を増強するための組換えα-Gal Aの修飾は、複合体、および、この組換え酵素に共有結合した高マンノース糖質部分の選択的脱グリコシル化を含む。特に、本発明は、シアリル化およびアシアリル化したグリコフォーム(両者とも、容易に精製しうる。(以下のセクション9を参照されたい。))の前記酵素の発現を可能にする宿主細胞の修飾を含む。例えば、CHO細胞を使用してα-Gal Aを発現する場合、シアリル化したグリコフォームのα-Gal Aを発現するために、欠けた機能をCHO細胞に与えるシアリルトランスフェラーゼ遺伝子構築物でCHO細胞を同時トランスフェクトしてもよい。
5.3 組換え体α-Gal Aの使用
本発明により得られた精製生成物は、リソソーム貯蔵障害、ファブリー病を有する患者における酵素置換治療に有利に使用することができる。あるいは、本発明により得られた精製生成物は、種々の方法においてインビトロでα-D-ガラクト-グリココンジュゲートを改変するのに使用でき、例えば血液型B 赤血球を血液型Oに変換することに使用でき、糖の変換、例えばラフィノースのシュクロースへの、あるいはメリビオースのガラクトース及びグルコースへの変換を必要とする産業上の方法等に使用することができる。これらについては以下の項にさらに詳細に記載する。
5.3.1 ファブリー病におけるα-Gal A酵素治療
代謝の先天的欠陥の中で、リソソーム貯蔵障害を有する患者の研究によりリソソームの器官の生物学及びそのヒドロラーゼ、その生合成及びプロセシング(Rosenfeld, et al., 1982, J. CellBiol. 93: 135; Lemansky,et al., 1984, J. Biol. Chem. 259: 10129)、そのリソソームへの輸送のメカニズム(Neufeld, et al., 1975, Ann. Rev. Biochem. 44: 357; Sly et al., 1982, J. Cell Biochem. 18:67; Kornfeld,S., 1986, J. Clin. Invest. 77: 1)、及びそのコファクター要求性(Verheijen, et al., 1985. Eur. J. Biochem. 149: 315; d'Azzo, et al., 1982, Eur.J. Biochem. 149: 315; Mehl, et al., 1964, Physiol. Chem. 339: 260; Conzelman,et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3979)の基本的理解が得られた。30を越えるリソソーム貯蔵障害のうち、ファブリー病は、本明細書に記載した組換え体DNA法を適用してモデルシステムで種々の治療方法を評価及び使用し、酵素構造及び機能における部位特異的変化の効果を関連付けるのに理想的な候補である。この疾患には中枢神経系は関与せず、従って血液脳関門が酵素置換治療に障害を与えることはない。いくつかのリソソーム酵素は例えばβ−ヘキソサミニダーゼAのように異なるサブユニットを有する(Mahuran, et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 1602)のに対し、欠陥酵素α-Gal Aはホモダイマーである(Bishop & Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1307)。従って、単一の遺伝子産物のみが得られるはずである。ファブリー病からの培養された繊維芽細胞の代謝欠陥は、培養培地への外来酵素の添加によりインビトロで修正された(Cline, et al., 1986, DNA 5: 37)。また、ファブリー病を有する非典型的な変異種が同定されたが、これらの雄は臨床的には無症候であり、前記疾患の主要な病的発現からそれらを保護するのに十分な残留α-Gal A活性(3〜10%)を有している(Lemansky, et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 2062;Clarke, et al., 1971, N. Engl. J. Med. 284: 233; Romeo, et al., 1975, Biochem. Genet. 13: 615; Bishop, et al., 1981, Am. J. Hum. Genet. 71:217A; Bach, et al., 1982, Clin. Genet. 21: 59;及びKobayashi, et al., 1985, J. Neurol. Sci. 67: 179)。さらに上記したように、限られたものであるがヒトの試験により、血管析出ならびに免疫合併症の不存在に先立って循環する基質を消滅させる、酵素置換の生化学的有効性が示された(Brady, et al., 1973, N. Engl. J. Med. 289: 9; Desnick, et al., 1979, Proc. Natl.Acad.Sci. USA 76:5326; Bishop, et al., 1981, Enzyme Therapy XX: In: Lysosomes and Lysosomal Storage Diseases, Callahan,J.W. and Lowden, J.A., (eds.), Raven Press, New York, pp. 381; Desnick, et al., 1980, Enzyme Therapy XVII: In: EnzymeTherapy in Genetic Disease: 2, Desnick, R.J. (ed.), Alan, R. Liss, Inc., New York, pp. 393)。
5.3.2 α-Gal Aのインビトロでの使用
α-Gal Aは、末端α−ガラクトシド結合を有する種々のオリゴ糖、糖タンパク、糖ペプチド及び糖脂質に対する活性を有するガラクトシルヒドロラーゼである。従って、この酵素はこれらのα−ガラクトグリココンジュゲートをインビトロで改変するのに使用できる。例えば、本発明の組換え体α-Gal Aは種々の所望される改変に使用することができ、そのような改変としては、限定するものではないが、(a)血液型B 赤血球の血液型O 抗原を発現する細胞への変換(Harpaz, et al., 1977, Eur. J. Biochem. 77:419-426);及び(b)スタキオース(stacchyose)のラフィノースへの加水分解、ラフィノースから二糖シュクロースへの加水分解、あるいはメリビオースのガラクトース及びグルコースへの加水分解(Silman, et al., 1980, Biotechnol. Bioeng. 22:533)が挙げられる。このような加水分解は、酵母製造のための基質としての糖蜜の分解におけるような産業上の用途を有する(Liljestrom-Suominen, et al., 1988, Appl. Environ. Micro. 54: 245-249)。
6. 例: 哺乳類細胞系による生物活性型α-ガラクトシダーゼAの過剰発現と特異的発現
以下のサブセクションでヒト組換えα-Gal Aの大量生産を記載する。ヒトα-Gal Aをコードする全長cDNAを、増幅可能なジヒドロ葉酸リダクターゼ(DHFR)cDNA前の発現ベクターp91023(B)に挿入した。cDNA構築物(p91-AGA)の機能的完全性は、約150U/mgの4-MU- α-D-ガラクトピラノシド活性の内在量に対するCOS-1細胞;650U/mg(nmol/時)中の活性型酵素の過渡的発現により確認された。p91-AGA 構築物は電気穿孔法によりDG44 dhfr CHO 細胞中に導入した。ヌクレオチドを欠いている培地での陽性コロニー選択の結果、300〜2,000 U/mgの範囲量の活性型酵素を発現するクローンが単離された。DHFR cDNA とα-Gal A cDNAを共に増幅するためにメトトレキセート(MTX、0.02〜1.3μM)の濃度を高めて培養した選択サブクローンは5,000〜25,000U/mgの細胞内レベルのα-Gal A活性を発現した。注目すべきは、高い細胞内レベルのα-Gal Aを発現したサブクローンDG44.5は、産生された全組換え酵素の80%以上を分泌したことである。500μMのMTX濃度で、107個の細胞が一日あたり約15,000U/培養培地mlを分泌した。注目すべきは、β-ヘキソサミニダーゼ、α-マンノシダーゼ、β-ガラクトシダーゼおよびβ-グルコロニダーゼ等の内在性CHOリソソーム酵素は分泌されず、この分泌はα-Gal Aに特異的であり、マンノース-6-リン酸受容体媒介経路の飽和によるものではないことを示した。中空の繊維バイオリアクターを用いて、1日1リットルあたり5mgまでの組換えα-Gal A酵素が産生された。多様な物理的と反応速度的性質の特性付けのために、この分泌α-Gal Aをアフィニティークロマトグラフィーで精製した。組換えα-Gal Aは、ヒト血漿から精製された酵素に似たpI、電気泳動移動度およびKm値を有していた。さらに、32P標識による研究で、リソソームの形と分泌された形の両方で、おそらくそれらのオリゴ糖部分でリン酸化されていることが明らかとなった。現在の研究は、この組換え酵素のさらに別の反応速度的および物理的性質、オリゴ糖部分および結晶構造の特性付けに向けられている。さらに、大量の可溶性活性型酵素が手に入るようになったことで、ファブリー病を有する半接合体での臨床試験前に動物系で酵素置換の評価が可能となるであろう。
6.1. 材料と方法
6.1.1. 材料
制限エンドヌクレアーゼ、DNA ポリメラーゼIのクレノウ断片、T4ポリメラーゼおよびT4リガーゼはNew England Biolabsから入手し、αおよびγ-32[P]dNTP(3000Ci/モル)およびα35[S]dATP(100 Ci/モル)はAmershamから入手した。COS-1細胞系はATCC(Rockville, MD)から購入した。CHO DG44 dhfr細胞系は記載がある(Urlaug, et al., 1986, Somat. Cell Genet. 12:555-566)。
6.1.2. 発現ベクターp91-AGA の構築
全長α-Gal A cDNAを含有するプラスミドpcDAG126(Bishop, et al., 1988, Lipid Storage Disorders, Salvaryre,R., Douste-Blazy, L. Gatt, S. Eds. Plenum Publishing Corporation, New York, pp. 809 to 822)をBam HIとPst Iにより消化し、1.45kb挿入断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。次に、このcDNAをプラスミドpGEM-4のBam HI部位とPst I部位に強制サブクローン化して、pGEM-AGA126 を得た。次に、このプラスミドをHind IIIで消化し、クレノウを用いて末端を満たし、Eco RIリンカーに連結させた。Eco RIによる消化後、1.45kb断片を上記のように精製し、哺乳動物の発現ベクターp91023(B)のEco RI部位にクローン化し(Wong et al., 1985, Science 228: 810)、p91-AGAを得た(図1G)。
6.1.3. 細胞培養、エレクトロトランスフェクションおよび遺伝子増幅
COS-1とDG44 CHO細胞は、10%ウシ胎児血清(FCS)と抗生物質を含有するダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)に5%CO2で37℃に維持した。DG44(dhfr)細胞は0.05mMヒポキサンチンと0.008mMチミジンを培地に添加することにより維持した。トランスフェクション後、組換えCHO系を、10%の透析FCSを加えたDMEMでMTXの非存在下または存在下に培養した。
6.1.4. 酵素とタンパク質のアッセイ
酵素アッセイのために、100mm培養皿中の細胞を5mlのリン酸緩衝溶液(PBS)で2回洗浄し、ゴム製ポリスマンを用いてかき取って12mlのコニカルチューブに入れた。800 X gで10分間遠心した後、細胞を1mlの25mM NaPO4緩衝液(pH6.0)に再度懸濁し、次にブランソンカップソニケーターを用いて70%の出力で15秒間の超音波処理を3回行なって破壊した。この超音波処理物を10,000 X gで15分間4℃で遠心し、上清を分離して、これを直ぐにアッセイにかけた。もしくは、迅速なスクリーニングのために、細胞を上記のように洗浄し、1mlの溶解用緩衝液(150mM NaCl 、1mM EDTA、1% NP-40および0.2mM PMSFを含む50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.5)を皿に加えた。溶解した細胞を4℃で30分間インキュベートし、溶解物を集めて1.5mlチューブに移し、マイクロ遠心機で遠心し、次にその上清をアッセイのために取り出した。
6.2. 結果
6.2.1. COS-1 細胞によるヒトα-Gal Aの発現
全長ヒトα-Gal A cDNAを発現ベクターp91023(B)(Wong, et al., 1985, Science 228: 810)にクローン化し、p91-AGAと命名されたこの構築物を電気穿孔法によりCOS-1細胞中に導入した。増加レベルのα-Gal A活性がトランスフェクションの24、48および72時間後に検出され(図2A)、p91-AGA構築物の機能的完全性を示した。トランスフェクションの72時間後にα-Gal A活性は約4倍増加した一方で、α-Gal A cDNAをアンチセンスの向きで含有するp91023(B)ベクターでトランスフェクトされた細胞中にも、DNAを受容しなかった細胞中にもα-Gal A活性の増加は観察されなかった。さらに、リソソーム酵素のコントロールとして測定されたβ-ガラクトシダーゼ量は変化しなかった(図2B)。
6.2.2. DHFR CHO細胞によるα-Gal Aのトランスフェクションと増幅
ヒトα-Gal Aを安定に発現する組換えクローンは、p91-AGA構築物をDG44 dhfr CHO細胞中にエレクトロトランスフェクションおよび増加MTX濃度での選択による組込みベクターDNAの増幅により得られた。ヌクレオシドを欠いた培地での初期の培養の結果、α-Gal Aを100〜1,800U/mgタンパク質の量で発現する100個以上のクローンが同定された(表I)。最大のα-Gal A量を有するクローンは0.02〜0.08μMのMTXの存在下で培養され、組込みp91-AGA DNA を増幅した。代表的な増幅クローン中の細胞内α-Gal A量は0.02μMのMTXで2 〜6 倍まで増加し、さらに0.08μM のMTX で増幅されたときに10倍まで増加したことを表IIは示している。
0.08μMのMTXの存在下で増幅された陽性クローンの中で、クローン5.3は最大の細胞内α-Gal A量を有していたため(表II)、これを選択してさらに増幅した。1.3μMのMTXの存在下で培養したとき、クローンDG5.3の生育培地中のGal A活性は、2,500U/mlである(つまりトランスフェクトされていない親DG44細胞(50〜100U/ml)中レベルよりも25倍高い)と測定された。高めた濃度のMTXの存在下での培養の結果、細胞内分泌α-Gal A活性の上昇がもたらされた(表III)。興味深いことに、産生された全α-Gal Aの80%以上が分泌され、高められたMTX濃度での生育は、分泌された酵素のパーセントを増加させ続けた。表IIIに示されたデータは、細胞が、示されたMTX濃度の存在下で増幅され、MTXの非存在下(選択圧下での生育中よりも低い細胞内活性の原因となる)で3週間生育させた後にそれらのα-Gal A活性を検定した後に得られたものであることに注意されたい(Pallavicini,et al., 1990, Mol. Cell Biol. 10: 401; Kaufman, R. J., 1990, Meth. Enzymol, 185: 537; Kaufman, R. J., 1990, Meth. Enzymol, 185: 487)。
α-Gal Aの分泌がリソソーム標的に対するレセプターの飽和によるものかどうかを決定するために、クローンDG5.3 の培養培地に他のリソソーム酵素が存在するかどうかを調べた。
生育培地の血清濃度が組換えα-Gal A分泌のレベルに効果を持つかどうかを決定するために、クローンDG5.3を100mmの培養皿に1皿あたり5 X 106個の細胞密度で、0%〜10%の透析FCSの存在下に5日間培養した。2.5%〜10%血清を用いて培養した細胞中ではα-Gal A分泌に対する明らかな効果はなかった(図3A〜3B)。0%と1%の血清中で培養したDG5.3細胞による分泌の減少レベルはこれら細胞の不十分な生育を反映したものであろう。
6.2.6. バイオリアクターによる生産
大量の組換えヒトα-Gal Aの生産のため、500μMのMTXの存在下に培養したクローンDG5.3(DG5.3500)の108個の細胞を用いて中空繊維バイオリアクターに接種した。図4に示されているように、α-Gal Aの産生量は1日あたり約10,000U/mlまで増加した。この量は約3ヵ月間一定であった。さらに、バイオリアクター中でこれらの細胞により必要とされる血清濃度は、α-Gal A産生をひどく減少させることなく1%まで段階的に減少した(図4)。このバイオリアクターの90日間の一回の操作の結果、培養培地中に分泌された350mgを超える活性型組換えα-Gal Aが得られた。
6.3. 考察
ヒトα-Gal Aに関して、翻訳後修飾は安定性と活性に不可欠であるように思われ、これは大腸菌で発現された非グリコシル化酵素が不安定であり迅速に分解されるということから証拠付けられている(Hantzopoulos & Calhoun, 1987, Gene 57: 159)。さらに潜在的な4つのN-グリコシル化部位を有するα-Gal Aサブユニットはリソソーム輸送のために炭水化物修飾とリン酸化を受ける(Lemansky, et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 2062)。血漿と組織から精製されたα-Gal Aのこれまでの特性付けにより、異なる炭水化物組成が同定され、血漿の糖型はさらに多いシアル酸残基を有していた(Bishop, et al., 1978, Biochim. Biophys. Acta 524: 109; Bishop, et al., 1980, Birth Defects 16:1; p. 17; Bishop and Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256:1307)。さらに、酵素治療の臨床試験では、組織由来の形のものに比較して、血漿の糖型は循環に長く保持され、ファブリー病の患者に静脈内投与した後に循環する蓄積基質を激減させるのにさらに効果的であることが明らかとなった(Desnick, et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5326)。従って、CHO細胞によるヒトα-Gal Aの増幅発現を、天然の組成がガラクトシル残基とシアル酸残基を有するこの組換え酵素の発現のために選択した(Ledonne, et al., 1983, Arch. Biochem. Biophys. 224:186)。
7. 例 : 組換えα-ガラクトシダーゼA の精製、特性付けおよびプロセシング
以下のサブセクションでは増幅可能な真核発現ベクターのp91023(B)中にクローン化され、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で過剰発現されたヒトα-ガラクトシダーゼAの精製を記載する。この組換え酵素タンパク質は培養培地中に選択的に分泌され、200mg以上がα-ガラクトシルアミン-セファロースによるアフィニティークロマトグラフィー等のファーストプロテインリキッドクロマトグラフィー法により均一に精製された。この精製された分泌酵素は、それぞれ約110kDaと57kDaの天然のサブユニット分子量を有するホモ2量体糖タンパク質であった。組換え酵素は3.7のpI、4.6の至適pH、4-メチルウンベリフェリル-α-D-ガラクトピラノシドに対して1.9mMのkmを有していた。それは、酵素産生CHO細胞のリソソームに対してアポリポタンパク質Eとともに標的にされる天然のグリコスフィンゴ脂質基質の蛍光標識類似体であるピレン-ドデカノイル-スフィンゴシル-トリヘキソシドを迅速に加水分解した。パルスを追う研究では、3分以内にジスルフィドで定められた二次構造を取った組換え酵素が5分までにゴルジ内に存在し、ここでエンドH抵抗性となり、45〜60分までに培地に分泌された。細胞内の形と分泌された形の両者がリン酸化されていた。分泌された酵素サブユニットは細胞内サブユニットよりもわずかに大きかった。しかし、エンドグリコシダーゼ処理後、両サブユニットはSDS-PAGEで同じ移動を示し、この二つの形のものはオリゴ糖部分が異なることを示した。放射能標識の分泌酵素を多様なエンドグリコシダーゼで処理することで、三種類のN結合オリゴ糖鎖、二種類の高マンノースタイプ(エンドH 感受性)および一種類の複合体タイプが明らかとなり、後者のものはエンドHとF感受性であった。エンドH放出オリゴ糖の分析は、一つが固定化マンノース-6-リン酸受容体に特異的に結合した二つのリン酸残基を有し、他のものはシアル酸を含有するハイブリッド構造物であることを明らかにした。これらの物理的および反応速度的性質および組換え分泌酵素上の複合物タイプのオリゴ糖鎖の存在は、ヒト血漿から精製された天然酵素のものと類似していた。α-Gal Aの分泌形は、2mMのマンノース-6-リン酸の存在下にブロックされた飽和可能なプロセスにより培養ファブリー繊維芽細胞によって吸収され、結合とインターナリゼーションがマンノース-6-リン酸受容体により仲介されることを示した。固定化受容体に対する組換え分泌酵素の結合的特徴とNH4Cl処理のヒト繊維芽細胞により分泌されるα-Gal Aの結合的特徴は同一であった。血漿から単離された天然酵素に構造が類似する、本発明による大量の可溶性活性型組換えα-Gal Aの産生により、天然酵素形との比較およびファブリー病での酵素置換の臨床的評価が可能となるであろう。
7.1. 材料と方法
7.1.1. 材料
エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼH(エンドH)、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼD(エンドD)、エンドグリコシダーゼF(エンドF)およびペプチド:N-グリコシダーゼF(PNGase F)はBoeringer Mannheim(Indianapolis, IN)から入手した。[35S]-メチオニン(>1,000 Ci/mmol)、D-[2,6-3H]-マンノース(60Ci/mmol)、32P-リン(10 mCi/ml)およびアンプリファイ(Amplify)はAmersham(Arlington Heights, IL)から入手した。パンソルビンはCalbiochem(San Diego, CA)から入手した。4-MUグリコシドはGenzyme(Cambridge, MA)から入手した。フロイントアジュバント、スフィンゴミエリン(脳由来)およびフェニルメチルスルフォニルフルオライド(PMSF)はSigma(St. Louis, MO)から入手した。QAEセファデックス、セファデックスG-25、オクチルセファロースおよびスーパーローズ6はPharmacia-KLB(Piscataway, NJ)から入手した。TLCシリカプレート(cat. 5626)はEM Science(Gibbstown, NJ)から購入した。COS-1細胞系はATCCから入手した。すべての組織培養試薬はGibco(Grand Island, NY)から入手した。Siti Verse IシンチレーションカクテルはFisher(Pittsburgh, PA)から購入した。固定化マンノース-6-リン酸受容体はワシントン大学(St. Louise, MO)のDr. Stuart Kornfeldから得られた。プレン-ドデカノイル-スフィンゴシル-トリヘキソシド(P-C12STH)はヘブライ大学(Israel)のDr. Shimon Gattから入手した。アポリポタンパク質EはBTG社(Nessziona, Israel)から入手した。
7.1.2. 細胞培養
10%ウシ胎児血清(FCS)と抗生物質を含有するダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)に5%CO2で37℃に細胞を維持した。HT(ヒポキサンチン、チミジン、Sigma)を加えたDMEMでDG44系を培養する一方で、組換えCHO系DG5.3は10%の透析FCSを加えたDMEMを受けさせた(Kaufman, et al., 1988, J. Biol. Chem. 263: 6352)。
7.1.3. 組換えGal-Aの精製
組換えCHO培養培地を集め(20リットル)、10,000ダルトンの排除分子量を有するペリコンカセット接線流濃縮器(Millipore, MA)を用いて500mlまで濃縮した。濃縮液のpHは10NのHClで4.7〜5.0に調節し、次にRC-5冷却遠心機を用いて10分間10,000 X gで遠心して清澄にした。
7.1.4.酵素及びタンパク質アッセイ
4-メチルウンベリフェリル-α-D--ガラクトピラノシド(4-MU-α-Gal)を用いて、(Bishop, et al., 1980, In Enzyme Therapy in Genetic Diseases:2. Desnick, R. J. (Ed.). Alan R. Liss, Inc. New York, p.17)に記載されたようにしてα-Gal Aをアッセイした。要約すれば、5mM 4-MUのストック溶液を、超音波槽内で可溶化した0.1Mクエン酸−リン酸緩衝液(pH4.6)中に調製した。10〜50μlの酵素調製物又は細胞抽出物及び150μlの基質を含む反応混合物を、37℃で10〜30分インキュベートした。反応を、2.33mlの0.1Mエチレンジアミンを添加することにより停止させた。活性の1単位は、1時間あたり1nmolの基質を加水分解する酵素の量である。
このアッセイのため、30nmoleのP-C12STH及び70nmoleのスフィンゴミエリンをクロロホルム:メタノール溶液(1:1)中に混合し、窒素下で蒸発させ、そしてSpeed-Vac(Savant)中で乾燥した。ペレットを2mlの生理食塩水に再懸濁し、Heat Systems Ultrasonics社のMicrosonソニケーター(sonicator)を用いて、40%の出力で3〜5分超音波処理し、そして1時間室温で静置した。
以下のようにして調整したフロイント完全アジュバント中の精製脾臓のα-Gal A 150μlを、ニュージーランドホワイトウサギ(2kg)に注射した:150μgのα-Gal Aをガラスシリンジ内の0.5mlのPBS に添加し、ステンレススチール21ゲージ針を用いて、PBS/α-Gal A溶液をフロイント完全アジュバントとともに別のガラスシリンジ中に均一なエマルジョンが得られるまで混合した。かかるエマルジョンを8か所の異なる皮下部位(背)及び1か所の筋内部位(腿)に注射した。初回注射から2月後、上記のようにフロイント不完全アジュバント内のα-Gal Aの50μgを用いて、ウサギに追加免疫した。追加免疫後8及び12日目に、血清を耳静脈から回収した。標準ELISAアッセイを用いて力価をチェックした(Johnstone & Thorpe, 1982, Immunochemistry in Practice. BalckwellScientific Publications, Oxford)。その後の追加免疫は、約2か月ごとに行い、その10日後に採血した。典型的な採血は、30〜40mlの血液の収量であった。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を10%アクリルアミドを含む1.5mm厚のスラブ内でLaemmliに記載されたようにして(Laemmli, U.K., 1970, Nature 227: 680)、適切な場合には還元条件のもとで行った。ゲルを10%酢酸及び20%メタノール中で30分固定し、次いで、攪拌しながらAmplify中に30分浸漬した。ゲルを90分減圧乾燥し(Hoffer)、コダックX Omat ARに4〜72時間露出した。
Yang及びLangerによって本質的に記載されているように(Yang& Langer, 1987, Biotechniques 5: 1138)、QAEセファデックスを用いて等電点を測定した。最適pHは、25mMリン酸ナトリウム緩衝液中、37℃で測定した。
アフィゲル(Affigel)-10に結合した215kDaのマンノース-6-リン酸受容体(M-6-P受容体)は、パックされたゲルの0.4mg/mlの濃度であった。結合緩衝液(50mMイミダゾール(pH7.0),150mM NaCl,0.05%Triton X-100,5mM β-グリセロールリン酸ナトリウム,0.02%アジ化ナトリウム)中の試料を、流速0.3ml/分で1.5×0.8cmのカラムにアプライした。試料の添加(5ml)に続き、カラムを5mlの結合緩衝液で洗浄し、結合緩衝液中のマンノース-6-リン酸の非線形勾配(0〜5mM) で溶出した。この指数関数的勾配(Dong, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 4210)を、直径2.5cm及び直径1cmの2つの小室からなる装置により形成した。画分を回収し(0.5ml)、10μlのアリコートを、α-Gal A活性については4-MU-α-Galを用いて、放射活性については10mlのSinti Verse Iシンチレーションカクテルを用いてアッセイした。
7.1.10. [ 35 S]-メチオニン、[ 3 H]-マンノース及び[ 32 P]-リンを用いた細胞の標識
100mm皿中の集密培養物を5mlのメチオニン不含のDMEMで1回洗浄した。この培地(5ml)の新鮮なアリコートを各皿にまき、培養物を37℃インキュベーター中で30分インキュベートした。培地を皿から除き、10%の透析したFCS 及び50〜100μCiの[35S]-メチオニンを補ったメチオニン不含DMEM(1ml)の新鮮なアリコートを添加した。細胞を37℃で3〜5分インキュベートし、放射活性培地を除き、FCSを加えたDMEMで2回洗浄した。2mMメチオニンを含むFCSを加えたDMEMの5ml中で、表示された時間について細胞を追跡した。一晩の標識については、透析したFCS、グルタミン、抗生物質、10mM NH4Cl及び200μCiの[35S]-メチオニンを補ったメチオニン不含のDMEM5mlを培地に加えた。
100mmの培養皿で生育した細胞を5mlのリン酸緩衝溶液(PBS)で2回洗浄し、ゴム製のポリスマン(policeman)及び10mlのPBSを用いて12mlの円錐形のチューブにかき集めた。2,500rpmで10分遠心した後、細胞を1mlの25mM NaPO4(pH6.0)に再懸濁し、Bransonカップソニケーター中で15秒の破裂を3回行った。遠心(10,000×gで4℃で15分)により細胞の残骸を除去した。これとは別に、細胞を上記のように洗浄し、1mlの溶解緩衝液(50mMリン酸ナトリウム(pH6.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、1% NP-40、0.2mM PMSF)を皿に添加した。培養皿を4℃で30分インキュベートし、細胞を1.5mlのマイクロ遠心チューブに移した。細胞残骸を上記のようにして除去した。
7.2.結果
7.2.1.精製
細胞のバイオリアクター中で生成された組換えα-Gal Aを、α-GalNH2-C12-セファロースでのアフィニティークロマトグラフィー(Bishop & Desnick, 1981, J. Biol. Chem. 256: 1307)、続いてオクチルセファロースでの疎水クロマトグラフィー及び100cmのスーパーロース6カラムでのゲルろ過によって、上記のように粗製培地から精製した。表VIは、20mgロットの組換えα-Gal Aの典型的な精製及び精製の各段階での酵素の特異的活性を示す。組換え酵素は、ゲルろ過段階後では本質的に均一であり、SDS-PAGEによる判定で>98%純粋であった(図5)。ウシ血清アルブミンの微小混入は、さらにブルー−セファロース(Travis, et al., 1976, Biochem. J. 157: 301)のカラムでのゲルろ過段階によって除去され、SDS-PAGEで20μg のα-Gal Aを泳動することにより99%以上も純粋であると判定された酵素調製の結果を得た。
組換えα-Gal Aは、SDS-PAGEに基づき、約57Kdの分子量のサブユニットを持つことが分かった(図5)。人工基質である4-MU-α-D--ガラクトピラノシドに対するKmは1.9 mMであり(図7A)、最適pH及び等電点はそれぞれ4.6及び3.7であった(図7B及び7C)。
小胞体を横切る発生期のポリペプチドは、翻訳とともに又はそれらの合成が完了した直後に二次構造の形態を呈する(Gething, et al., 1989, Meth. Cell. Biol. 32: 185)。α-GalAを[32S]-メチオニンで3分間標識し、表示された時間について非標識メチオニンとともに追跡した。免疫沈降α-Gal AをSDS-PAGEで可視化した。追跡の間形成し、二次構造の形態を示すかもしれないジスルフィド架橋を維持するため、試料をDTTなしで調製した。ジスルフィド結合及び二次構造を破壊するためDTTの存在下で60の微小な試料のアリコートを煮沸することにより、対照(+DTT)を調製した。追跡の0分(標識3分後)では、既にこの酵素の移動度に変化が生じ、このことは形態の変化が、翻訳とともに又は合成終了直後に起こっていることを示唆する(図9)。
7.2.4. 組換えα-Gal Aによる炭水化物部分の解析
cDNA配列によって予測されたα-Galサブユニット内に、4つのN-グリコシル化コンセンサス配列(Asn-X-Ser/Thr)がある。第4番目の部位は、X部位にプロリン残基を含むので、恐らく利用されないであろう。組換えα-Gal AをエンドH、エンドF、エンドD及びPNGase Fで消化した。PNGase Fを用いた消化は、SDS-PAGEでの移動度においてα-GalAの半分のTM7kDaを引き起こした(図13)。分子量におけるこの変化は、3つのN-結合炭水化物部分の除去に帰するものとし得る。エンドH、エンドF及びPNGase Fのカクテルを用いた組換え酵素の消化によって、更なる分子量の減少を何らもたらさなかった。これは、酵素の全てが3つのN-結合炭水化物部分を含むことを示唆する。
組換えα-Gal Aは高マンノース部分を含んだため、その組換え酵素はM-6-Pを含むことができ、そして受容体媒介取り込みについて有能であった。クローンDG5.3からの細胞を[32P]-オルトリン酸で12時間代謝標識し、次いでその細胞抽出物及び培地を免疫沈降にかけてSDS-PAGEで可視化した。図16に示すように、細胞結合及び分泌α-Gal Aは、両方とも、恐らく上記in vitroの実験により示唆されたそれらの炭水化物部分でリン酸化された。
エンドHを用いて免疫沈降[3H]-マンノース標識α-Gal Aを処理することにより、高マンノースオリゴ糖を回収した。これらのオリゴ糖をQAEセファデックスでのクロマトグラフィーにより解析した(Varki & Kornfeld, 1983, J. Biol. Chem. 258: 2808;及び、Varki & Kornfeld, 1980, J. Biol. Chem. 255: 10847)。これらオリゴ糖の2つの主要な型を検出し、一つの型は2つの負電荷を持ち、一つは4つの負電荷を持つ(図17A)。この負電荷はホスホジエステル部分(-1)、ホスホモノエステル部分(-2)又はシアル酸(-1)によって寄与され得る。希釈HClでのこれら糖の処置により、いずれのピークのプロフィールをもシフトしなかった。これは、これら糖にはホスホジエステルがないことを示す (図17B)(Varki & Kornfeld, 1983, J. Biol. Chem. 258: 2808)。ノイラミニダーゼで処理すると、0及び-1負電荷での2つの新しいピークをもたらすシフトを引き起こす(図17C)。従って、-2ピークの電荷はシアル酸、おそらく2つの部分によって寄与される。ノイラミニダーゼ処理後の-1ピークの結果は、おそらく酵素による-2ピークの部分的消化によるものであろう。アルカリホスファターゼでこれらオリゴ糖を処理すると、-4ピークから0負電荷へのシフトを引き起こす(図17D)。-2ピークでは何ら効果はなく、これは、-4ピークの電荷が2つのホスホモノエステル結合により寄与され、一方、-2ピークは何らこのような結合を含まないことを示す。従って、これらの結果から、エンドHは、組換えα-Gal Aから2つのタイプの高マンノースオリゴ糖を放出し、一つはシアル酸を含み(恐らく、ハイブリッドオリゴ糖)、もう一つは2つのホスホモノエステル結合(思うに、マンノース-6-リン酸として)を含むことが明白である。
7.2.7. α-Gal Aとマンノース-6-リン酸受容体との相互作用
組換えα-Gal Aがマンノース-6-リン酸部分を含んでいることが示されたので、これが正常なヒトα-Gal Aでも真実であるかどうかを確かめることが重要であった。CHOタンパク質をNH4Clの存在下で[35S]-メチオニンを用いて標識し、新たに合成されたリソソーム酵素(Dean, et al., 1984, Biochem. J. 217: 27)を定量的に分泌させた。培地を集め、固定化マンノース-6-リン酸受容体のカラムのクロマトグラフィーにかけた。カラムを上記のマンノース-6-リン酸の勾配で溶出した。この溶出実験によりリソソーム酵素を高および低親和性受容体結合配位子に分離できる(Dong & Sahagian, 1990, J. Biol Chem. 265: 4210)。
7.2.8. ファブリー繊維芽細胞での組換えα-Gal Aの受容体仲介取り込み
ファブリー繊維芽細胞を種々の量の組換え酵素と6時間インキュベートした(図21)。取り込み培地にM-6-P 2mMを添加すると酵素取り込みが飽和に達し、そして特異的に阻害されたが、これは取り込みが細胞表面のM-6-P受容体を介していることを示唆している。
8. 実施例:哺乳類の細胞により発現されたα-Gal Aタンパク質A融合
以下のサブセクションには、ヒトα-ガラクトシダーゼA cDNAとCOS-1細胞により発現され、そしてIgGアフィニティークロマトグラフィーにより明らかに均質に精製されたブドウ球菌タンパク質A IgG結合ドメインEの融合構築物が記載されている。融合構築物をPCR 技術を使用して処理し、α-Gal Aとタンパク質AドメインE配列の間に16ヌクレオチドコラゲナーゼ切断認識配列(recognition sequence)を挿入した。さらに、終止コドンをα-Gal cDNAから欠失させ、ドメインE配列の末端に挿入した。COS-1細胞による融合構築物の一時的な発現により、α-Gal A活性が内在的レベルより6-7倍に増加し、培地中に有意に分泌された(4,000ユニット;nmol/時間)。培地からの融合タンパク質をIgGセファロースクロマトグラフィーにかけ均質に精製した。コラゲナーゼ処理後、遊離のα-Gal AをIgGクロマトグラフィーによりタンパク質Aペプチドから分離した。この方法により分泌されたα-Gal A融合タンパク質の85%以上が活性なグリコシル化ホモダイマータンパク質として精製された。この方法は正常および突然変異体タンパク質の発現法および迅速な精製法として有用であろう。さらに、多量の分泌組換え酵素が生産でき、そして迅速かつ効果的に精製できるためにこの構築物をCHO DG44細胞に挿入した。
8.1. 材料と方法
8.1.1. 材料
制限酵素、Taqポリメラーゼ、T4リガーゼおよびpGemプラスミドはプロメガ社(Promega)(ウイスコンシン州マディソン)から入手した。ベクターpRIT5およびIgG-セファロースはファルマシア社(ニュージャージー州ピスカットウェイ)から購入した。シークエナーゼ配列決定キット(sequenase sequencingkit)はユナイテッドステートバイオケミカルコーポレーション(オハイオ州クリーブランド)から入手した。コラゲナーゼはシグマ社(ミズリー州セント・ルイス)から入手した。オリゴヌクレオチドはアプライドバイオシステム DNA合成機モデル380Bを使用して合成した。
8.1.2. 細胞培養およびトランスフェクション
COS-1細胞はATCC(メリーランド州ロックビル)から入手した。細胞を子牛胎児血清10%および抗生物質を添加したダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)中で標準技術により培養した。
8.1.3. PCR、DNA配列決定およびベクター構築
融合構築物を最近述べられたPCR技術(Ho, et al., 1989, Gene 77:51; Kadawaki,et al., 1989, Gene 76:161)を使用して合成した。手短に言えば、全長α-Gal A cDNAをpGEMプラスミドにサブクローン化し、そして生じたpG6-AGAプラスミドを、終止コドンを欠失するようにデザインされたプライマーを用いたα-Gal A配列のPCR増幅に使用し、cDNAの3’末端にコラゲナーゼ切断コンセンサス配列を加え、5’末端にEco RI認識配列を含ませた(図22)。センスプライマーは5'-CCGAATTCATGCTGTCCGGTCACCGTG-3'であり、アンチセンスプライマーは5'-CGCCGGACCAGCCGGAAGTAAGTCTTTTAATG-3'であった。タンパク質A ドメインE(Nilsson, et al., 1985, EMBO J. 4: 1075)を同様に5’オリゴヌクレオチドのコラゲナーゼコンセンサス配列を用いて増幅した;センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドはそれぞれ5'-CCGGCTGGTCCGGCGCAACACGATGAAGCT-3'および5'-GGCCGAATTCCGGGATCCTTATTTTGGAGCTTGAGA-3であった。α-Gal Aおよびタンパク質Aポリメラーゼ連鎖(PCR)反応の1323ntおよび201nt 生成物を0.8%アガロースゲルにかけゲル精製し、融合ポリメラーゼ連鎖反応のために混合した。α-Gal A反応からのセンスプライマーとタンパク質A 反応からのアンチセンスプライマーを最終融合反応に使用した。この反応の生成物をEco RIを用いて消化し、Eco RI消化プラスミドpGEM4Zに連結した。タンパク質A ドメインE および、リンカーとα-Gal Aおよびタンパク質A 間の接合部をサンガーのジデオキシヌクレオチド鎖終結配列決定法(Hanahan & Meselson, 1985, Mthods Enzymol. 100:333) で確証した。その後、確証した融合配列をEco RIで消化し、そして真核生物の発現ベクターp91023(B)にサブクローン化した。
8.2. 結果
8.2.1. α−Gal A−タンパク質A(AGA-PA)融合の構築
図22は、α−Gal A−タンパク質AドメインE融合配列の構築に用いた戦略を示す。完全長のα−Gal A cDNA(1323 nt)及びタンパク質AドメインE配列(201nt)を別々に増幅させ、次いで5'-α−Gal A cDNAセンスプライマー(P1)及び3'タンパク質Aアンチセンスプライマー(P4)を用いる第二のPCR増幅(図22)により融合した。プライマーは、(a)α−Gal A TAA終止コドンを除去し;(b)α−Gal Aとタンパク質A cDNA配列の間にPro Ala Gly Proをコードする16ntのコラゲナーゼ開裂コンセンサス認識配列を挿入し;(c)タンパク質AドメインEの3'末端にTAA終止コドンを導入するために設計された。この構築物が完全であることは、タンパク質Aドメイン、リンカー及びα−Gal A cDNAの3'を配列決定することにより確認された(図23)。
8.2.2. COS-1細胞におけるpAGA-PA の発現
pAGA-PA構築物によるトランスフェクションの72時間後、細胞抽出物及び使用済み培地において4MU α−Gal 活性の最高レベルを検出した(表VIII)。
8.2.3. α−Gal Aのアフィニティー精製
COS-1細胞の100mm培養皿1個から、トランスフェクションの72時間後に使用済み培地を採集し、IgG-セファロースカラムにアプライした。試料のアプライ(通り抜け(flow-through))中、又は緩衝液による洗浄中には、最小のα−Gal A活性がカラムを通過した(表IX)。しかしながら、結合したα−Gal A融合タンパク質の95%以上が0.5M酢酸(溶出緩衝液)の添加により溶出された。
アフィニティー精製した融合タンパク質をコラゲナーゼで1時間処理し、その反応生成物についてIgGアフィニティーカラムで再度クロマトグラフィーを行った(表X)。タンパク質AドメインEは速やかにIgGカラムに結合したが、ヒトα−Gal Aは通り抜け画分中に溶出した。アプライした活性の約90%が溶出した。精製された酵素の比活性に基づき、この手順により90%純化された酵素が生じたと判断した。
ここに示された実施例は、ヒトα−GalA酵素の天然の糖結合形態に一層良く似た形態で組換えヒトα−GalA酵素を生産させるための方法に関する。詳しく述べれば、生産されたα−GalAタンパク質がシアリル化されるようにα−2,6−シアリルトランスフェラーゼ遺伝子を含有させたCHO細胞株においてヒトα−GalAが生産される。下記に示す結果によれば、かかる細胞株を用いて生産された生物学的に活性なα−GalA酵素はより広い組織内分布を示すことがわかるが、これはこの組換えα−GalAの治療学的価値を向上させ得るものである。
9.1.材料および方法
9.1.1.α−2,6−シアリルトランスフェラーゼ発現ベクターpST26の構築
β−ガラクトシド−α−2,6−シアリルトランスフェラーゼ(Gal−α2,6ST;Weinstein等, 1987, J. Biol. Chem. 262: 17735)の完全なアミノ酸配列をコードする1.6kbのラットCDNA(ST3)をスミス・クライン・アンド・フレンチ・ラボラトリーズ(Smith, Kline and French Laboratories)からの寄贈品である哺乳類発現ベクターpRLDNのBamHI部位にサブクローン化することにより、pST26と呼ばれるベクターを得た。電気穿孔法により、この構築物をヒトα−ガラクトシダーゼAの高度過剰発現体であるCHO細胞株DG5.3−1000Mx中に導入した。500μg/mlのG418を含有する培地中において増殖させることにより、pST26のneo遺伝子の発現に関してクローンを選択した。クローニングリングを用いて陽性のクローンを個別に分離し、次いで各々を全分泌組換えヒトα−ガラクトシダーゼAの発現に関して分析した。更にまた、リー(Lee)等(1989, J. Biol. Chem. 264:13848-13855)によって記載されたようなSNAセファロースカラム上におけるニワトコ(Sambucus nigra)凝集素(SNA)クロマトグラフィーにより、α−2,6−シアル酸残基を含有する分泌組換えヒトα−ガラクトシダーゼAの割合を決定した。
9.1.2.SNA−レクチン蛍光顕微鏡検査
蛍光顕微鏡検査のためには、12mmのカバーガラス上において陽性のDG5.3−1000Mx−ST26クローンを増殖させ、次いで前記(Lee等, 1989, J. Biol. Chem. 264:13848-13855)のごとくにしてフルオレセインイソチオシアネート(FITC)で標識したSNAで染色した。簡単に述べれば、リン酸塩緩衝食塩水(PBS、pH7.0)中に2%のパラホルムアルデヒドおよび0.1%のグルタルアルデヒドを溶解して成る新鮮な溶液によって細胞を固定し、次いでPBS中の50mM−NH4 Clを用いて23℃で30分間にわたりブロッキングを行った。PBS中に25mg/mlの濃度で存在するFITC−SNAと共に、細胞を23℃で30分間にわたりインキュベートした。PBS中で洗った後、100mMトリス(pH8.5)中に15%のビノール(vinol)205ポリビニルアルコール、33%のグリセロールおよび0.1%のアジ化ナトリウムを溶解して成る溶液を用いてカバーガラスを封入した。ツァイス・フォトマート(Zeiss Photomat)III蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察すると共に、コダック・ゴールド(Kodak Gold)カラーフィルム(ASA25)を用いて写真撮影した。
9.1.3.α−2,6−シアル酸残基を有する放射性同位体標識ヒトα−GalAおよびそれを有しない放射性同位体標識ヒトα−GalAの精製
10%の透析ウシ胎児血清〔ジブコ(GIBCO)社、グランドアイランド、ニューヨーク州〕および500μCiの[35S]−メチオニンを含有する125mlのDMEMを入れた1リットルの回転瓶(細胞数約5×108個)内において、DG5.3−1000Mx親細胞およびDG5.3−ST26.1変異細胞を増殖させた。放射性培地は3日間にわたって毎日交換し、また各々の細胞株からの使用済み培地は回収してプールした後に攪拌細胞濃縮器〔アミコン(Amicon)社、ベバリー、マサチューセッツ州〕を用いて濃縮した。DG5.3−1000MxおよびDG5.3−1000Mx−ST26.1細胞株からそれぞれ分泌された約2mg(4×106U)の組換え酵素を、酵素1U当り100cpmの比活性に達するまで個別に精製した。精製された放射性同位体標識済みの分泌組換えα−ガラクトシダーゼA製剤(各0.5mg)を5単位の酸性ホスファターゼ〔シグマ(Sigma)社〕で個別に処理し、そして脱リン酸化された形態もまた静脈内注射のために使用した。
9.1.4.組換えα−GalAの生体内半減期および組織内分布
血漿内半減期測定のため、各々の放射性同位体標識α−GalA形態を2匹の雌CDIマウスの尾静脈に注射した。10〜20分間にわたり、各々の動物の洞静脈叢から所定の間隔で放血した。血液試料をIECマイクロヘマトクリット(Microhematocrit)遠心機で遠心分離し、そして50μlの血漿を計数用の水性シンチレーション液〔アクアゾル(AquaSol)、NEN社、ボストン、マサチューセッツ州〕に添加した。様々な酵素形態の組織内分布を評価するためには、各々の酵素について2匹のマウスを酵素注射から4時間後に断頭して殺し、そして所定の組織を取出した。様々な組織中の放射能を測定し、そして組織湿量1グラム当りの値で表した。各々の値は2つの独立した実験の平均値である。
9.2.結果
9.2.1.DG5.3−1000Mx株CHO細胞中へのpST26の導入およびG418選択クローンにおけるα−2,6−シアリルトランスフェラーゼ活性の証明
電気穿孔法によってDG5.3−1000Mx株CHO細胞中にpST26プラスミドを導入した後、抗生物質G418に対して耐性を示す形質転換細胞を選択した。耐性細胞のプールから10個の個別クローンを単離し、そして以後の研究のために増殖させた。これらのクローンはDG5.3−1000Mx−ST26.1〜ST26.10と呼ばれた。これらの細胞中におけるα−2,6−シアリルトランスフェラーゼ活性の存在の証拠として、各々の細胞株をFITC−SNAで染色し、次いで位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡によって検査した。10のDG5.3−1000Mx−ST26細胞株はいずれも蛍光レクチンによって明確に染色されたが、これは各種の細胞膜糖タンパク質が発現されたα−2,6−シアリルトランスフェラーゼに対する受容体として役立つことを示している。それに対し、DG5.3−1000Mx親細胞はFITC−レクチンによって染色されなかった。
9.2.2.α−2,6−シアリル化された組換えヒト分泌α−GalAの特性決定
100mmのペトリ皿を使用しながら、10のDG5.3−1000Mx−ST26細胞株の各々およびDG5.3−1000Mx親細胞を同じ細胞密度で増殖させた。各々細胞株に関し、全培養細胞のタンパク質1mg当りの分泌ヒトα−GalAの活性を測定した。DG5.3−1000Mx−ST26細胞株は、親細胞株によって分泌されたα−GalA(16000U/mg、表XI)の28〜100%を分泌した。
α−2,6−シアリル化された組換えヒトα−GalAの生体内クリアランスがα−2,6−シアリル化されない酵素の場合と異なるかどうかを判定するため、各々の形態の酵素をマウスに注射し、そしてそれらの循環半減期を測定した。図24Aに示されるごとく、α−2,6−シアル酸部分の存在は循環中における酵素の半減期を14分からほぼ30分に増加させた。更にまた、α−2,6−シアリル化された組換え酵素およびα−2,6−シアリル化されない組換え酵素を酸性ホスファターゼで処理したところ、生体内におけるα−2,6−シアリル化されない酵素の血漿内半減期(T1/2)は(14分から24分に)増加した。それに対し、α−2,6−シアリル化された酵素をホスファターゼで処理した場合の血漿内半減期は同じレベル(約28分)に留まった(図24B)。
10.実施例:ヒトリソソームタンパク質の過剰発現によるそれらの細胞内凝集、リソソーム内結晶化および選択的分泌
ここに示された実施例は、本来は細胞内に目標を有する特定のタンパク質を組換えにより分泌状態で発現させるための方法に関する。この方法は本発明に固有の特徴を成すものであって、α−GalAの過剰発現に際して初めて見出されたものである。数種の組換えリソソーム酵素を用いて得られた結果によれば、CHO細胞におけるこれらのタンパク質の過剰発現は恐らくそれらの凝集をもたらすことがわかる。かかる凝集の結果、本来ならば細胞内小胞(この場合にはリソソーム)に送られるタンパク質が分泌されることになる。この意外な分泌特性により、生産された組みタンパク質の容易な精製が可能となるのである。
10.1.材料および方法
10.1.1.リソソーム酵素の過剰生産用のプラスミドの構築
α−GalA発現用構築物であるp91−AGAの構築は前記(第6.1.2節)の通りである。なお、ヒトα−N−アセチルガラクトサミニダーゼおよび酸性スフィンゴミエリナーゼに関する類似の発現用構築物(それぞれp91−AGBおよびp91−ASMと呼ばれる)並びにCOS−1細胞におけるそれらの一過性発現は、文献中に記載されている(Wang等, 1990, J. Biol. Chem. 265:21859-21866; Schuchman等, 1991, J. Biol. Chem. 266:8535-8539)。
10.1.2.細胞培養、エレクトロトランスフェクションおよび遺伝子増幅
前記(第6.1.3節)のごとくにしてCHO細胞を増殖させかつ維持した。同様に、前記(第6.1.3節)のごとくにして電気穿孔法を実施した。
10.1.3.超微細構造および免疫標識の研究
100mmのペトリ皿中においてDG5.3−1000Mx細胞を集密状態にまで増殖させた。トリプシン処理(0.25%トリプシン、EDTA)の後、リン酸塩緩衝食塩水(PBS)中で細胞を2回洗い、次いで室温下において1500gで5分間にわたりペレット化した。次に、PBS中に3%のグルタルアルデヒドを溶解して成る溶液を用いて細胞を1時間にわたり固定し、次いでPBS緩衝1%OsO4を用いて室温で30分間にわたり固定した。その後、試料をエタノールで段階的に脱水し、プロピレンオキシドを浸透させ、そしてエンベッド(Embed)812〔エレクトロン・マイクロスコーピー・サイエンシズ(Electron Microscropy Sciences)社、フォートワシントン、ペンシルヴェニア州〕中に包埋した。代表的な領域から1μmの切片を切り出した。超薄切片を作製した後、酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、そして電子顕微鏡(JEM100CX、ジェオルUSA(JeolUSA) 社、ピーバディ、マサチューセッツ州)で観察した。
10.1.4.SDS−PAGEおよびオートラジオグラフィー
10%のアクリルアミドを含有する厚さ1.5mmのスラブゲルを使用しながら、レムリ(Laemmli)[1970, Nature(London)277:680-685]によって記載されたような還元条件下でPAGEゲル電気泳動を行った。10%酢酸および20%メタノール中においてゲルを固定し、次いで撹拌しながらアンプリファイ(Amplify)〔アマシャム社(Amersham Corp.)〕中に30分間にわたり浸漬した。90分間にわたってゲルを真空乾燥し〔ホッファー・サイエンティフィック・インストルメンツ(Hoffer ScientificInstruments)社、サンフランシスコ、カリフォルニア州〕、次いでコダックXオマートAR(Kodak X Omat AR)フィルム〔イーストマン・コダック社(Eastman Kodak Co.)〕を用いて4〜24時間にわたりオートラジオグラフィーを行った。
10.1.5.α−GalA凝集の試験管内研究
様々な酵素および水素イオン濃度における不溶性α−GalA凝集物の生成の可能性を調べた。精製された分泌α−GalAの保存溶液〔10mMトリス緩衝液(pH7.0)中において16mg/ml〕を使用しながら、適当なアリコートをホウケイ酸ガラス製の試験管に入れ、そして蒸留水で全量を200μlに調整した。このようにして、100μlの適当な緩衝液〔0.5M−2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸、pH5.0、5.5、6.0、6.5または7.0〕を添加した場合、特定のpH値において最終のα−GalA濃度(0.1〜10mg/ml)が得られるようにした。室温で10分間にわたりインキュベートした後、光路長1cmのセルを使用しながら分光光度計〔スペクトロニック(Spectronic)1201、ミルトン・ロイ社(Milton RoyCo.)、ロチェスター、ニューヨーク州〕で650nmのODを測定することによって各溶液の濁度を求めた。対照として、1mg/mlの精製された分泌α−GalAを増加する濃度(0.1〜10mg/ml)のBSAと混合し、そして各溶液の濁度を求めた。また、α−GalA(10mg/ml)およびBSA(2mg/ml)の溶液に関し、7.0から5.0までpHを低下させながら同様な実験を行った。上記のごときインキュベーションおよび遠心分離の後、上澄みおよぴペレットについてSDS−PAGEを行った。
10.1.6.酵素およびタンパク質の定量
5mMの4−メチルウンベリフェリル−α−D−ガラクトピラノシド(4MU−α−Gal)〔ジェンザイム社(Genzyme Corp.)、ケンブリッジ、マサチューセッツ州〕を使用しながら、以前の論文(Bisho and Desnik, 1981, J. Biol. Chem. 256:1307-1316)に記載されたごとくにして細胞溶解物および培養液中におけるα−GalA活性を測定した。簡単に述べれば、0.1Mクエン酸塩/0.2Mリン酸塩緩衝液(pH4.6)を使用しながら、超音波浴中において5mM−4MU−α−Galの保存溶液を調製した。10〜50μlの細胞抽出液および150μlの基質保存溶液を含有する反応混合物を37℃で10〜30分間にわたりインキュベートした。2.3mlの0.1Mエチレンジアミンの添加によって反応を停止させた後、レイショ2・システム・フルオロメーター(Ratio-2 System Fluorometer)〔オプティカル・テクノロジー・デバイシズ(Optical TechnologyDevices)社、エルムスフォード、ニューヨーク州〕を用いて蛍光を測定した。1Uの活性は、1時間当り1ナノモルの基質を加水分解する酵素量を意味する。α−マンノシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ヘキソサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、酸性ホスファターゼおよびα−N−アセチルガラクトサミニダーゼの活性は、対応する4−メチルウンベリフェリル基質を用いて測定した。酸性スフィンゴミエリナーゼの活性は、ガル(Gal)等(1975, N. Eng. J.Med.293:632-636)の方法に従って測定した。タンパク質濃度は、フルオレサミン法(Bohlen 等, 1973, Arch. Biochem. Biophys. 155:213-220)のビショップ(Bishop)等(1978, Biochem. Biophys. Acta 524:109-120)による変法によって測定した。
10.2 結果
10.2.1 過剰発現の結果、ヒトα−GalAを含有する結晶構造が、膜で包まれた小胞中で生じる
安定的に増幅されたDG5.3−1000Mx細胞の超微細構造を調べたところ、秩序正しい三角形の格子を有する0.25−1.5μmの結晶体が、細胞質じゅうの膜で包まれた小胞中に多数認められた(図26Aならびに26B)。これらの結晶構造中の反復は、約20nmであった。これらの結晶構造は、リソソーム(図28A)、ならびにTGNが拡がったもの思われる小胞(図28B)に特に多く見られた(Hand and Oliver, 1984, J. Histochem. Cytochem.42: 403-442; Griffith and Simons, 1986, Science 234: 438-443; McCracken, 1991, in Intracellular Traficking of Proteins,Steer and Hanover, eds., Cambridge University Press, New York pp. 461-485)。なお、親細胞であるDG44ではゴルジ複合体が容易に特定されたのに対し(図26E、差し込み図)、これらの細胞では通常のゴルジ構造が観察されなかった。DG5.3−1000Mx細胞をオスミウム−グルタルアルデヒドで固定した切片を、アフィニティー精製したウサギの抗ヒトα−GalA抗体とともにインキュベートし、次に、タンパク質Aに結合した金とともにインキュベートしたところ、これらの結晶構造が、金粒子によって特異的に染色された(図26Cおよび26D)。切片の固定をオスミウム−グルタルアルデヒド中で行ったにもかかわらず、結晶構造が金で免疫学的に標識されたことから、これらの結晶構造が、仮に単独ではないにせよ、主にヒトの酵素から構成されていることが示唆された。
10.2.2 α−GalAならびにα−N−アセチルガラクトサミニダーゼは、高濃度かつ低pHで凝集する
α−GalAが過剰発現された結果、TGN中で、M6PRおよび/またはスルホトランスフェラーゼに結合しない、あるいは非効率的に結合される可溶性で粒状の凝集体が形成されると推測されたので、α−GalAの可能な凝集を、インビトロで、酵素濃度ならびに水素イオン濃度を変化させて調べた。図27Aに示すように、pH5.0では、α−GalAの沈殿量は約30%(>2X106U)にものぼった。TGNのpHであると推定されるpH6.0では(Griffith and Simons, 1986, Science 234: 438-443)、酵素の約12%が、15,000xgで遠心分離が可能な粒状の凝集体を形成した。図27Bには、0.1−10mg/mlのα−GalAを含有するpH5.0あるいはpH7.0の溶液の凝集の尺度としての濁度が(Halper and Stere, 1977, Arch. Biochem. Biophys. 184: 529-534)、酵素濃度の関数として増大することが示されている。また、1mg/mlのα−GalA溶液の濁度は、pH5.0でアルブミンを存在させ、このアルブミンの濃度を0.1mg/mlから10mg/mlまで増大させても、本質的に影響を受けなかった(図27B、対照)。最後に、各種の水素イオン濃度でインキュベートしたα−GalA(10mg/ml)およびウシ血清アルブミン(BSA)(2mg/ml)を含有する溶液からの上清およびペレット分画の電気泳動を行ったところ、BSAはこのpH範囲では沈殿しなかったので、pHの低下にともなって生じるα−GalAの沈殿の増大というのは酵素特異的なものであることが明らかとなった(図27C)。
10.3 考察
「凝集−分泌」モデルを提案して、過剰生産された、リソソームに送り込まれるタンパク質の典型例であるヒトα−GalAの経路変更について説明する。図28に描かれているように、過剰生産された酵素は、通常、合成され、プロセシングされてから、トランスゴルジネットワークに到達する。この構造で、過剰生産された酵素は蓄積され、酸性度のはるかに高い環境(約pH6.0)におかれることとなり、その結果、タンパク質−タンパク質相互作用が増大して、可溶性で粒状のα−GalA凝集体が生成される。こうした凝集の結果、酵素のM6P部分が、MGPRとの結合に際して、接近不能あるいは接近困難となる。MGP部分が接近不能である凝集体は、デフォルトによって、構成的な分泌経路に変更される(Helms et al., 1990, J. Biol. Chem. 265:20, 027-20, 032)。
11.微生物の寄託
表に示すプラスミドを有する下記の大腸菌の系統は、イリノイ州、ペオリア(Peoria)の農業研究菌株保存機関(Agricultural Research Culture Collection, NRRL)に寄託してあり、これらの系統は、下記の受託番号を付されている。
宿主細胞 系統 プラスミド 受託番号
大腸菌 k12 p91.AGA B 18722
大腸菌 k12 pAGA−PA B 18723
寄託を行った実施態様は、本発明の個別の観点を例示するために示したものであり、これらと機能的に同等な任意の微生物あるいは構築物も本発明の範囲内であるので、本発明の範囲は、寄託を行った微生物によって限定されるものではない。実際、当業者には、以上の記載ならびに添付図面から、本明細書に示し、記載した実施態様以外にも、さまざまな本発明の変更例が明らかとなるはずである。そうした変更例も、添付の請求の範囲の範囲内であると考えるものである。
国際出願番号:PCT/
Form PCT/ro/134(続き)
アグリカルチュラル リサーチ カルチャー コレクション
(NRRL)
国際寄託機関
アメリカ合衆国 61604 イリノイ州
ペオリア, ユニバーシティー ストリート 1815N
寄託番号 寄託日
B 18723 1990年10月5日
Claims (9)
- (a)哺乳動物細胞がペプチドをシアリル化する能力を有するように、β-ガラクトシドα2,6-シアリルトランスフェラーゼを発現するβ-ガラクトシドα2,6-シアリルトランスフェラーゼ遺伝子で形質転換されており、さらに遺伝子発現を調節するヌクレオチド配列に機能しうる状態で結合されたヒトα-ガラクトシダーゼAをコードする、染色体に組み込まれた異種ヌクレオチド配列および同じまたは異なる調節配列によって制御される選択マーカーを含んでいる形質転換哺乳動物細胞を培養し、こうしてα-ガラクトシダーゼAヌクレオチド配列を安定して過剰に発現させ、そしてα-ガラクトシダーゼA酵素の酵素的に活性なシアリル化グリコフォームを該哺乳動物細胞から分泌させ、そして
(b)該哺乳動物細胞培地から酵素的に活性なα-ガラクトシダーゼA酵素を単離する、ことを含む、ヒトα-ガラクトシダーゼAの産生方法。 - α-ガラクトシダーゼAをコードする前記のヌクレオチド配列が図1A−1Cに示したヌクレオチド番号1から1299までの配列を含むものである、請求項1に記載の方法。
- α-ガラクトシダーゼAをコードする前記のヌクレオチド配列
が図1A−1Cに示したヌクレオチド番号91から1299までの配列を含むものである、請求項1に記載の方法。 - 遺伝子発現を調節する前記のヌクレオチド配列がウイルスのプロモーターを含むものである、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子発現を調節する前記のヌクレオチド配列が誘導プロモーターを含むものである、請求項1に記載の方法。
- 選択物質の存在下で、染色体に組み込まれた前記のヌクレオチド配列が増幅される、請求項1に記載の方法。
- 選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼである、請求項1に記載の方法。
- 選択マーカーがジヒドロ葉酸レダクターゼであり、選択物質がメトトレキセートである、請求項6に記載の方法。
- 哺乳動物細胞がチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞系である、請求項1に記載の方法。
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