MXPA01012806A - Hialuronidasa de hirudinaria manillensis, aislamiento, purificacion y metodo recombinante de produccion. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con el aislamiento la purificacion y caracterizacion de una nueva hialuronidasa que deriva de la sanguijuela tropical Hirudinaria manillensis. Por lo tanto, de acuerdo con la invencion la nueva enzima se llamo "manilasa". La invencion se relaciona ademas con el metodo recombinante de produccion de manilasa que incluye la revelacion de secuencias de ADN y de aminoacidos, asi como de vectores de expresion y sistemas de hospedantes. Finalmente, la invencion se relaciona con el uso de la manilasa para fines terapeuticos, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades del miocardio, eventos tromboticos y tumores.

Description

HIALURONIDASA DE HIRUDINARIA MANILLENSIS , AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN Y MÉTODO RECOMBINANTE DE PRODUCCIÓN Descripción de la invención La presente invención se relaciona con el aislamiento, la purificación y la caracterización de una nueva hialuronidasa que deriva de la sanguijuela tropical Hírudinari a manill ensi s . Por lo tanto, de acuerdo con esta invención la nueva enzima se llama "manilasa" . La invención se relaciona además con el método recombinante de producción de la manilasa que incluye la revelación de secuencias de ADN y aminoácidos asi como de vectores de expresión y sistemas de hospedantes. Finalmente, la invención se relaciona con el uso de la mamlasa para fines terapéuticos, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades del miocardio, eventos trombóticos y tumores. El ácido hialurónico o hialuronano (HA) es un glucosaminoglicano lineal no ramificado de elevado peso molecular (2-6 x 10°) compuesto de una estructura disacárida que se repite GlcNAc (ßl-4 ) GlcUA. Sus grupos carboxilo están totalmente ionizados en el pH que prevalece en los fluidos extracelulares, ya sea normales o patológicos. El HA - . . ^ ece junto con ios salfatos de condroitina, sulfatos de REF. :133998 jüjfe"***,**-*^ ¿¿i^sejij^y^j?^^^^^^ ^ queratano y las heparinas al grupo de los glucosaminoglicanos (Jeanloz R. W., Arthr Rheum . , 1960, 3, 233-237) . A diferencia de otros glucosaminoglicanos no modificados (GAG) no presenta sustitución de sulfato ni péptido unido covalentemente, y su largo de cadena y peso molecular son usualmente mucho más grandes. El HA está ubicuamente distribuido en los tejidos conectivos y se ha encontrado en virtualmente todas las partes del cuerpo después de la introducción de un método de fijación mejorado (Hellstrom S. et al., 1990, His tochem . J. , 22, 677-682) y el método histoquimico especifico con el uso de péptidos que ligan hialuronano (PLHA). También está presente durante el aesarrollo y la maduración en tejidos de origen neuroectodérmico . El término hialuronidasa se refiere en general y de acuerdo con esta invención a una enzima que actúa sobre ei ácido hialurónico, irrespectivamente de la actividad frente a otros sustratos. La hialuronidasa se aisló por primera vez de microorganismos y luego de testículo de mamíferos, que constituye actualmente la principal fuente (Meyer K. en The Er.zyme , 1971, 307) . De acuerdo con el mecanismo de reacción la hialuronidasa se divide en tres grupos principales. En el primer grupo se combinan enzimas microbianas que actúan sobre sus sustratos por ß-eliminación produciendo disacáridos ?-4 , 5-insaturados . Por lo tanto, la enzima se deberá llamar hialuronato liasa, EC 4.2.99.1. El segundo grupo, la hialuronoglucosaminidasa o hialuronidasa de tipo testicular (EC 3.2.1.35) actúa como una endo-N-acetil-ß-D-hexosaminidasa que degrada el HA en fragmentos más pequeños, en primer lugar tetrasacáridos con la porción hexosamina en el extremo reductor libre. Se han obtenido enzimas con propiedades similares a la hialuronidasa de testículo de renacuajos, veneno de vibora, veneno de abejas, numerosos tejidos animales, suero humano y otras fuentes. Se sabe muy bien que la hialuronidasa de testículo también presenta actividad de transglicosilasa (Weissman B. et al., J. Biol . Chem . , 1954, 208, 417-429). Las enzimas pertenecientes a este grupo de hialuronidasas presentan actividad enzimática no sólo frente al hialuronato sino también frente al condroitin-4-sulfato, condro?tin-6-sulfato, la condroitina y el sulfato de dermatano. El tercer grupo está compuesto de hialuronoglucuronidasas (EC 3.2.1.36) que actúan como una ¿&d.üL&- LÍahfciÍafc ÉfaSMkltUr* - - -*»**>—• - '-?~ *?rik i*. f>«- -'-f lflf'-f ll ' j?'*!t^i»^??ka?tt?iß i??^ endo-ß-glucuronidasa . Esta enzima se ha aislado de las sanguijuelas Hirudo medicinalis (Yuki H. & Fishman W.H.; J. Biol . Chem . 1963, 238, 1877-79) y es absolutamente especifica para el HA. El sulfato de condroitina, el dermatano y la heparina no son sustratos para esta hialuronidasa . Solo degrada ácido hialurónico en tetrasacáridos con el ácido glucurónico en el extremo reductor libre (Linker A. et al., J. Biol . Chem . , 1960, 235, 924-27) . A diferencia de las endo-ß-glucosaminidasas de mamíferos, ia heparina no influye sobre la actividad de esta hialuronidasa de sanguijuela. Por lo tanto, se puede coadministrar a un paciente junto con una heparina y sus derivados que se usan extensivamente como anticoagulantes. Una endo-beta-glucuronidasa especifica de ácido hialurónico (llamada "orgelasa") de la especie ( Poecilobdella granulosa) de la subfamilia Hirudinariinae (que incluye el género Hirudinaria, Illebdella, Poecilodbella, Sanguisoga) de sanguijuelas de búfalo se da a conocer en la patente europea EP 0193 330 y presenta un peso molecular de aproximadamente 28.5. Las hialuror ; dasas tienen muchas aplicaciones prácticas m vivo e in vitro. Se ha propuesto la administración intravenosa de la hialuronidasa para el > llélU-Mnu-* *J^¿.*uiiu*-**>*¿¿* tratamiento de una infartación del miocardio (Kloner R.A et al . , Circulaci ón, 1978, 58, 220-226; Wolf R.A. et al., Am. J. Cardi ol . , 1984, 53, 941-944; Taira A. et al . , Angi ol ogy, 1990, 41, 1029-1036) . La infracción del miocardio representa una forma común de daño no mecánico; específicamente daño celular severo y muerte, causado en este caso por una hipoxia celular repentina. En una infracción experimental del miocardio inducida en ratas (Waldenstrom A. et al., 1991, J. Clin . Invest . , 88 , 1622-1628), aumentó el contenido de HA del músculo cardiaco dañado (área con infracción) dentro de las 24 h hasta alcanzar casi tres veces el valor normal después de 3 dias y estuvo acompañado por edema intersticial. También aumentó progresivamente el contenido relativo de agua de las áreas con infartación alcanzando un valor máximo en el dia 3 y guardó una correlación estrecha con la acumulación ae HA. Se ha observado la misma asociación de contenido de HA incrementado con edema en el rechazo experimental de transplantes de corazón y riñon (Hallgren R. et al., J. Clin . Invest . , 1990, 85, 668-673; Hallgren R. et al., J. Exp . Med. , 1990, 171, 2063-2076), en el rechazo de transpiantes renales humanos (Wells A. et al. Transplanta ti ón , 1990, 50, 240-243), en enfermedades pulmonares (Bjermer A. et al., Bp t . Med. J. , 1987, 295, É^ttita^JAfa^Aut^iiH^^^..jügdf»*»^»»*,--^^¡ta "-- J-^..AaM—«*J.»«a**^*?. 801-806) y en fibrosis intersticial idiopática (Bjermer A. et al., Thorax, 1989, 44, 126-131). Todos estos estudios no sólo proporcionan evidencia de un HA incrementado en una inflamación aguda, sino demuestran su parte en la retención local de fluido que la principal responsable de la hinchazón del tejido y que influye tanto sobre las funciones mecánicas como electrofisiológicas del corazón. Estos resultados pueden explicar el mecanismo de la acción de las hialuronidasas usadas en ensayos clínicos. Se ha informado que el tratamiento con hialuronidasa limitaba el daño celular durante la isquemia de miocardio en ratas, perros y en el hombre (Maclean D. et al. Science, 1976, 194, 199) . La degradación del HA se puede seguir por medio de la reducción de la acumulación de agua en los tejidos, la reducción de la presión de los tejidos y finalmente una mejor perfusión. Se ha mostrado que se pueden usar hialuronidasas y extractos que contengan hialuronidasa para otros fines terapéuticos. Por lo tanto, una terapia con hiasa, sola o combinada con ciclosporina lleva a una sobrevida prolongada del transplante (Johnsson C. et al. Transplan t ín ter , m press}. Las hiasas ("factor de dispersión") en el sentido más amplio se usan para incrementar la permeabilidad de ^ .? ?íi..,.ia¡¡jíii :^.a^.A^.,^.a<-feigg> ~Í s**MÍ¿iAt..?í M ¡d^M^átt^ tejidos para aumentar la difusión de otros agentes farmacológicos (por ejemplo en combinación con citostáticos en el tratamiento de tumores cancerígenos) . Además, se pudo demostrar que las hialuronidasas son útiles en la terapia de tumores donde actúan como inhibidores de la angiogénesis y como una ayuda a la liberación local de drogas en el tratamiento de tumores, para el tratamiento de glaucoma y otros desórdenes del ojo y como adyuvante para otros agentes terapéuticos tales como anestésicos locales y antibióticos. Una revisión general del uso terapéutico y la importancia se presenta en el articulo de revisión de Farr et al. (1997, Wiener Medizinische Wochenschrift , 15, p.347) y en la literatura que se cita alli. Por lo tanto, existe una necesidad por encontrar un compuesto activo tal como la hialuronidasa . Sin embargo, las hialuronidasas conocidas y disponibles no son estables (hialuronidasa de Hirudo medicinalis, Linker et. al., 1960, J. Biol. Chem. 235, p.924; Yuki and Fishman, 1963, J. Biol. Chem. 238, p. 1877) o presentan una actividad especifica más bien baja (EP 0193 330, Budds et al., 1987, Comp. Biochem. Physiol., 87B, 3, p. 497). Además ninguna de las hialuronidasas conocidas está disponible en forma recombinante que es un pre-requisito ^="~cial para el uso comercia^ :.-?.-s:v;. k.H:.:ílíLi.íf f.Mfj¿?,¿?w¿,¿ . ,".vi i-fii, ?nii Esta invención da a conocer ahora por primera vez una nueva hialuronidasa que se aisló y purificó ae Hirudonaria mannilensis y una versión recombinante de dicha enzima obtenida mediante técnicas de ingeniería genética. Por lo tanto, un objeto de esta invención consiste en proporcionar una proteina purificada aislada de la especie de sanguijuela Hirudinaria manil lensis con la actividad biológica de una hialuronidasa que no es influenciada en su actividad por la heparina y se caracteriza por presentar un peso molecular de 53 - 60 kD dependiendo de la glicosilación. La nueva proteina, que se llama "manilasa" es glicosilada en su forma nativa y presenta un peso molecular de aprox. 58 kD ( + 2kD) y cuatro glicoformas. Sin embargo, la proteina no glicosilada también es objeto de la invención y se obtiene por escisión enzimática o química de los residuos azúcar de acuerdo con técnicas estándar. La enzima no glicosilada de la invención presenta un peso molecular de aprox. 54 (+ 2) según mediciones de SDS-PAGE. Una comparación directa muestra que la hialuronidasa que se da a conocer en la patente europea EP 0193 330 ("orgelasa") presenta bajo las mismas condiciones un peso molecular de aprox. 28 y contiene una serie de impurezas t_les como hemoglobina. La manilasa . Mfa¿tá.? ..F .i. ^.l^iHAA, ^».**- tr* V , .?íl&&±éí'>- f'<¿ .-f<:'-"*->*<* .>-? Sí*.-*. i nativa de acuerdo con la invención presenta un pH óptimo de 6.0 - 7.0, un punto isoeléctrico de 7.2 - 8.0 y una secuencia de aminoácidos que se ilustra en la Fig. 7. Sorprendentemente la manilasa obtenida por medio de procedimientos de purificación preparativa (ver más abajo) presenta una actividad especifica extremadamente alta de 100 - 150, preferentemente de 110 - 140 (WHO) kU/mg de proteina mientras que la actividad especifica de la orgelasa es de aproximadamente sólo 1.2 kU/ mg . Además, la orgelasa presenta un pH óptimo menor (5.2 - 6.0) comparado con la manilasa. A diferencia de la orgelasa, la manilasa no es influenciada por la heparina. Además un objeto de la invención consiste en proporcionar un proceso para el aislamiento y la purificación de la manilasa que comprende las siguientes :tapas (i) homogenización de cabezas de sanguijuelas de la especie Hirudmaria mani llensis con un amortiguador ácido y centrifugación, (n) precipitación con sulfato de amonio del sobrenadante de la etapa (i), (ni) cromatografía de intercambio catiónico, (ív) cromatografía de afinidad de concanavalina A, (v) cromatografía de interacción hidrofóbica (vi) cromatografía de afinidad sobre matrices recubiertas con fragmentos de ácido hialurónico (vii) cromatografía de permeación de gel, y opcionalmente (viii) desgiicosilación enzimática o química de la proteina purificada. Las etapas del proceso que se han dado a conocer anteriormente garantizan que la proteina de acuerdo con la invención se pueda obtener con una actividad enzimática biológica elevada. Por lo tanto, otro objeto de esta invención consiste en proporcionar una proteina con la actividad biológica de una hialuronidasa que no sea influenciada en su actividad por la heparina y que presente un peso molecular de 53 - 60 dependiendo de la glicosilación y que se puede obtener por medio de las etapas del proceso indicadas anteriormente y en las reivindicaciones y que presenta preferentemente una actividad enzimática especifica ae > 100 kU/ mg de proteina. El término "unidad" se refiere más adelante y anteriormente a "unidades internacionales" (Ul) . «^^«faA^ki-J La invención da a conocer un proceso para preparar manilasa recombinante que incluye las respectivas moléculas de ADN, vectores y células hospedantes transformadas. Por lo tanto, es un objeto de esta invención proporcionar una secuencia de ADN codificante de la proteina con las propiedades de la manilasa nativa. Asimismo se ha podido mostrar que fue posible seleccionar al menos tres otros clones con secuencias de ADN levemente diferentes codificantes de proteinas con propiedades de la manilasa (hialuronidasa) con secuencias de aminoácidos levemente diferentes. Los clones específicos presentan las secuencias de ADN que se indican en las Fig. 8, 9 y 10 (secuencia superior) que son un objeto de esta invención asi como los vectores de expresión que contienen dichas secuencias y células hospedantes que se transforman con dichos vectores. Además, un objeto de esta invención consiste en proporcionar una proteina recombinante con la actividad biológica de una hialuronidasa y un peso molecular de 55 - 59 kD dependiendo de la glicosilación con cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se ilustra en las Fig. 8, 9 y 10 (secuencia inferior) o una secuencia con una homología respecto de dichas secuencias de al menos 80 %. El término "manilasa" incluye todas estas proteinas con las propiedades especificadas anteriormente. La(s) proteina (s) nativa (s) así como la(s) recombinante (s) se pueden usar como medicamento que se puede aplicar directamente a pacientes o dentro de composiciones farmacéuticas. Por lo tanto, otro aspecto de esta invención consiste en proporcionar una proteína recombinante o nativa de acuerdo con lo definido anteriormente y con los que se definirá más adelante como un medicamento y una composición farmacéutica correspondiente que comprenda dicha proteína y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable . La composición farmacéutica de la invención puede contener además otros compuestos farmacéuticos de una gran diversidad. Agentes preferidos son anticoagulantes que no inhiban ni influencien la actividad biológica ni farmacológica de la proteina de acuerdo con la invención. Tales anticoagulantes pueden ser, por ejemplo, heparma, hirudma o dicumarina, preferentemente heparina. Por lo tanto, un objeto de la presente invención consiste en proporcionar una composición farmacéutica que comprenda adicionalmente un compuesto farmacológicamente activo, preferentemente heparina. á?^ ? J. já? ,.Í.ÍF-F. .,F..já ,.i*..ra...X&< *S..*.¿*i?tH.. if*tí.lt¿ ljA??lU¡ En relación con el uso en terapia humana o veterinaria la proteina de acuerdo con esta invención actúa preferentemente como agente de dispersión (factor "dispersante") o contribuye a la penetración a través de tejido y piel. Por lo tanto, se puede usar la manilasa como un adyuvante de otras sustancias (tales como un anestésico local) por ejemplo en el campo de la quimioterapia de tumores, para el tratamiento de desórdenes y enfermedades relacionadas con una isquemia aguda o infarto de miocardio, para el tratamiento de glaucoma y otros desórdenes del ojo, por ejemplo para mejorar la circulación de fluidos fisiológicos en el ojo, para el tratamiento de transplantes de piel y tejido para eliminar la congestión y mejorar la circulación, como sistema de liberación de drogas a través de la piel, membranas, otro tejido, como un agente para remover la cápsula de ácido hialurónico que rodea a ciertos microorganismos patogénicos o ciertos tumores y tejidos cancerosos, y como un inhibidor de la angiogénesis que se puede usar como agente antitrombótico y antitumoral. Por lo tanto, un objeto de esta invención es el uso de la manilasa así como se definió anteriormente y co o se definirá más adelante en la preparación de un medicamento para tratar especialmente desórdenes miocardiales, ^^MMSÉk&^j^riÉj áa.afaMg^^ cardiovasculares y trombóticos y tumores. Asi como se usa aquí el término "portador farmacéuticamente aceptable" significa un agente de relleno, diluyente o material de encapsulación inerte, no tóxico, sólido o liquido, que no reacciona adversamente con el compuesto activo o con el paciente. Portadores adecuados, preferentemente líquidos son conocidos en el arte y comprenden agua estéril, solución salina, dextrosa acuosa, soluciones de azúcar, etanol, glicoles y aceites, inclusive aquellos de petróleo, o de origen animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de mani, aceite de soya y aceite mineral. Las formulaciones de acuerdo con la invención se pueden administrar como dosis unitarias que contienen los portadores, diluyentes, adyuvantes y vehículos convencionales, no tóxicos, farmacéuticamente aceptables que son típicos para la administración parenteral. El término "parenteral" incluye aqui la inyección subcutánea, intravenosa, intra-articular e intratraqueal y técnicas de infusión. También son apropiadas otras vías de administración tales como la administración oral y la aplicación tópica. Las composiciones y combinaciones parenterales se administran de preferencia por vía li - j - ajaijai- " TtÍtrtf8lftlteftJfcfa**ifei a-^^ intravenosa ya sea como bolo o como una fusión constante de acuerdo con procedimientos conocidos. Comprimidos y cápsulas para la administración oral contienen excipientes convencionales tales como agentes ligantes, de relleno, diluyentes, agentes para comprimidos, lubricantes, desintegrantes y agentes humectantes. Los comprimidos se pueden recubrir de acuerdo con métodos conocidos en el arte. Las preparaciones liquidas orales pueden ser en forma de suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires, o se pueden presentar como producto seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Tales preparaciones liquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos y conservantes. Las aplicaciones tópicas pueden ser en forma de suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, gelatinas o de preferencia ungüentos de emulsión. Las dosis unitarias de acuerdo con la invención pueden contener las cantidades diariamente requeridas de la proteína de acuerdo con la invención o sub-múltiplos de la misma para llegar a la dosis deseada. La dosificación óptima terapéuticamente aceptable y la frecuencia de dosis para un paciente dado (mamífero, inclusive el hombre) depende de una serie de factores, tales como la actividad del material activo especifico empleado, la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la dieta, el momento y la via de administración, la velocidad de evacuación, la actividad enzimática (unidades/mg de proteina), el objeto del tratamiento, o sea terapia o profilaxis y la naturaleza de la enfermedad. Por lo tanto, en composiciones y combinaciones tales como aquellas con anticoagulantes del tipo heparina en un paciente tratado (m vivo) una dosis diaria farmacéuticamente efectiva de la proteina de esta invención (manilasa) oscila entre aprox. 0.01 y 100 mg/ kg de peso corporal (basado en una actividad especifica de 100 kU/ mg) , de preferencia entre 0.1 y 10 mg/ kg de peso corporal. De acuerdo con la forma de aplicación una única dosis puede contener entre 0.5 y 10 mg de manilasa. La concentración de, por ejemplo, heparina cuando se administra junto con la manilasa oscila tipicamente entre 500 -4000 U (Ul) durante un día, sin embargo, se puede incrementar o disminuir si fuera necesario. La purificación de la manilasa de la invención se logró de acuerdo como se describe en detalle en los ejemplos. La Tabla 1 ilustra un esquema de purificación preparativa de la manilasa. La Tabla 2 muestra ei proceso de enriquecimiento de la proteína de acuerdo con la invención y en la Tabla 3 se compara la manilasa con hialuronidasas conocidas de sanguijuela. Se ha aislado una enzima, llamada manilasa, que escinde el ácido hialurónico, de cabezas de sanguijuelas Hirudinaria manillensis y se purificó hasta homogeneidad. Esta hialuronidasa se purificó usando una extracción acida, una precipitación con sulfato de amonio, seguido por sucesivas cromatografías en columnas de intercambiado catiónico, de concanavalina-A-sefarosa, propil-fractogel, de fragmentos de hialuronano-Sefarosa y de Diol-LiChrospher . Los fragmentos de hialuronano se prepararon por medio de escisión del hialuronano con hiauronidasa de testículo bovino. Después de la purificación y caracterización de los fragmentos, se prepararon matrices de afinidad de acuerdo con lo indicado más abajo. Tales matrices de afinidad se usaron por primera vez para la purificación de la hialuronidasa. Esta cromatografía de alta resolución es una técnica para purificación rápida y eficiente de proteínas que ligan hialuronano. La recuperación de la actividad enzimática después de cada etapa de purificación fue h-ii¿ t«rt?^fe^-jj^^^'***fc-*--*jjg?-Mtártt?iri--^?,ñí p"^^ -• * razonablemente elevada. Los resultados de las tres purificaciones preparativas independientes fueron comparables. Llevaron a muestras altamente activas con entre 20 y 160 kU/ mg dependiendo del grado -de purificación. En experimentos de comparación se aislaron hialuronidasas conocidas de acuerdo con lo indicado en el arte anterior y se compararon sus propiedades con la proteina de acuerdo con la invención (Tabla 3) . La hialuronidasa purificada de acuerdo con el esquema de la Tabla 1 difiere de otras hialuronidasas de sanguijuela descritas por otros autores. Se obtuvo un peso molecular similar bajo condiciones de no disociación (ningún beta mercaptoetanol) lo que indica que la manilasa es una enzima de una única subunidad que coincide con un amplio rango de preparaciones de hialuronidasas de fuentes de mamíferos. Esta preparación final es una enzima de una única subunidad (Fig. 1) de peso molecular aparente 58 + 2 determinado por medio de MALDI, con un punto isoeléctrico de 7.2 a 8.0.

Tabla 1 : Purifi ca ción prepara tiva de la manila sa Preparación del material inicial Sanguijuelas de - Bangladesh - -15 kg i f„,í*,íf?. ?,?t, jWtr tiitH?Í Separación de los animales vivos Congelación de estos animales i Preparación de las cabezas ~lkg de cabezas de sanguijuela Homogenización y Extracción* Precipitación acida centrifugación** Etapa I - muestra precipitación de los sobrenadantes con sulfato de amonio al 36 % centrifugación, diálisis** Etapa II - muestra Intercambio catiónico EMD (S03-)* Cromatografía Diálisis*** i Cromatografía de afinidad Con A Diálisis**** i Cromatografía Propyl - Fractogel * Diálisis**** Cromatografía de afinidad -- fragmentos de ácido hialurónico (HA) Diálisis**** Cromatografía de Diol- iChrospher **** 140 000 unidades WHO á ¿t. F. * Cromatografía de Fase Reversa- Analítica***** Tabla 2 : Purificación de manilasa (enriquecimiento) de 1 kg de cabezas de sanguijuelc ii aí:..i..i-i ?¿?a t ttJtFM**w.?«??s.?.xs? r?r*. tí i .yáwMiitf «k'fa* ti jm Tabla 3 : Comparación entre la manilasa y hialuromdasas conocidas de sanguijuelas ÍÉKÍMf-"*~- "?L*?~ - - -^ri^-^^-»*^--»^i^-a*?^--^'-^"*^"^^*-^^"2'-*-^'jl^ Los asteriscos en las tablas significan información sobre la determinación de actividad y caracterización bioquímica (* - ***** Los métodos de determinación de la actividad y caracterización bioquímica usados dependen de la concentración de manilasa en las muestras analizadas. Por lo tanto, se extendieron sucesivamente por medio de las técnicas apropiadas en las sucesivas etapas de purificación.

* Determinación de la actividad - prueba de reducción de la turbiedad ** Determinación de la actividad - prueba de reducción de la turbiedad. - Determinación del contenido de proteina (E2so método BCA Pierce) - SDS - PAGE (SDS - Electroforesis en gel de poliacplamida) - Determinación de hemoglobina *** Determinación de la actividad - prueba de reducción de la turbiedad Determinación del contenido de proteina (E2so, método BCA Pierce) - SDS - PAGE - Manchado Western (anticuerpo anti- hemoglobina humana) *** Determinación de la actividad - prueba de reducción de la turbiedad Determinación del contenido de protema (E28o^ método BCA Pierce) - SDS - PAGE - Manchado Western anticuerpo anti hemoglobina humana, - SDS - PAGE - Manchado Western anticuerpo anti Con A SDS - PAGE - Manchado Western - anticuerpos anti péptido ***** MALDI - Determinación del contenido de proteina (método BCA Pierce; SDS - PAGE - Manchado Western - anticuerpos anti peptido . La unión de la manilasa la concanavalina A muestra que esta hialuronidasa es una glicoproteina cuyos componentes azúcar terminan con a-D-manopiranosilo o a-D-glucopiranosilo y residuos esféricamente relacionados. Muestras manilasa activas presentaron dos bandas con valores de RF casi idénticos en la SDS-PAGE. Para lograr una mejor separación de las bandas se usó una SDS-PAGE más larga y diferentes condiciones de corrida. En estos experimentos se pudieron detectar bandas mas débiles (Fig. 2) . Se secuenció individualmente la parte N-termmal de todos ellos (30 aminoácidos) y tampoco mostró ninguna diferencia en el extremo N-terminal. Después de la glicosilación con la endoF-glicosidasa (PNGasa) se observó que las cuatro bandas formaban una sola banda con una reducción del peso molecular de alrededor de 3. Por lo tanto, es muy probable que las diferencias observ^ a- - rr^-üidad electroforética se deben a diferencias en el patrón de glicosilación de las moléculas de manilasa. Los tratamientos con neuraminidasa, O-endo-glicosidasa y neuraminidasa más O-glicosidasa no influyen sobre el peso molecular de la enzima purificada (Fig. 30) . Estos resultados han mostrado que la maniiasa contiene al menos una cadena de oligosacáridos con N-unión. Las cadenas de carbohidratos 0-unidas no se pudieron detectar con el método usado. Como etapa de purificación final se llevó a cabo una cromatografía de fase reversa. Aunque no se pudo detectar más la actividad enzimática, fue posible remover las sales y los inhibidores de la proteasa de péptidos (Fig. 4) . Las fracciones que contienen la proteína se siguieron caracterizando por medio de MALDI . El peso molecular de la manilasa determinado por medio de MALDI fue de 58.3. La heparina no influye sobre la actividad de la hialuronidasa (Fig. 5). La manilasa es varias veces más estable que la hialuronidasa de Hirudo medicinalis (Fig. 6). Además, las muestras de manilasa parcialmente purificada mostraron una estabilidad muy alta en plasma de perros y ratas dentro de un rango de -20 y +37. La preparación de matrices de afinidad HA se ha descrito en la literatura (Tengblad A., Biochim . Biophys .

Acta , 1979, 57B, 281-289) . Esta matriz se usó para la purificación de las proteínas que ligan hialuronato de cartílago o el núcleo de queratano sulfato - proteoglicano proteina (Christner J.E., Anal . Biochein . , 1978, 90, 22-32) de la misma fuente. La proteína que liga HA (HABP) purificada por medio de esta matriz de afinidad se usó también en estudios histoquímicos relacionados con la distribución de los receptores de hialuronato (Green S.J. et al., J. Cell Science , 1988, 89, 145-156; Chan F.L. et al., J. Cell . Biol . , 1997, 107, 289-301) o hialuronano (Waldenstr?m A. et al., 1991, J. Clin . Invest . , 88, 1622-1628; Waldenstrom A. et al., Eur . J. Clin . Invest . , 1993, 23, 277-282) en los tejidos. Sin embargo, el método de preparación de este gel desarrollado en nuestro laboratorio permite a uno producir geles de concentración exactamente definida de fragmentos de HA (1 hasta 15 mg/ml) . Esto a su vez nos permite usar tales geles no sólo para purificación de proteinas que ligan hialuronano sino también para su separación, aprovechando su diferente afinidad por el hialuronano, esta separación selectiva se puede controlar usando fragmentos de HA de diferente largo. Tal separación permite lograr una mejor caracterización de muchos receptores de relevancia biológica .HL?* &...- ± .1.... ^*.i&jl||feJMi|^t .»*^¡--p^g-^^ (por ejemplo en oncología) . Las matrices de HA preparadas de acuerdo con el método descrito se pueden aplicar para: 1) la purificación de proteínas conocidas que ligan HA 2) la purificación de proteínas desconocidas que ligan HA 3) la identificación de nuevas proteínas que ligan HA 4) la purificación de hialuronidasas. Los fragmentos de HA obtenidos por medio del método descrito en la presente invención se pueden caracterizar por medio de métodos analíticos modernos (NMR, MALDI-MS) y se pueden aplicar en la investigación sobre interacciones proteína-proteína. Además, estos fragmentos se pueden usar en la investigación sobre angiogénesis y procesos de neovasculapzación .

Breve descripción de las figuras: Fig. 1: SDS-Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS PAGE - tinción de CBB) de la proteína estándar, muestra de manilasa (después de cromatografía Diol-LiChrospher) . 1- estándar de proteína de rango amplio ^ÍFt.. £ld*F*3¿¿.lAS3L*r¿¿. 2- Manilasa, 4 µg 3- Orgelasa, 6 µg 4- Hemoglobina, 40 µg Fig. 2: a) SDS-PAGE (tinción de CBB) y b) SDS-PAGE - Manchado Western de cuatro muestras de mamlasa-activas (lineas 3-6) tras cromatografía de afinidad-HA. El anticuerpo anti- péptido policlonal P3-2A de conejo se usó en este experimento . Fig. 3: SDS-PAGE (CBB) de las siguientes muestras: 1- LW-MM-marcador molecular de bajo peso molecular (BioRad) 2- Manilasa 3- N-Glicosidasa F (PNGase F) 4-Man?lasa después del tratamiento con PNGase F 5- Manilasa después del tratamiento con O-glicosidasa 6- Manilasa después del tratamiento con O-glicosidasa y neuraminidasa 7- O-glicosidasa y neurammidasa 8- marcador del peso molecular (MWM-BioRad precoloreado) Fig. 4: Cromatografía de Fase Reversa de a) estándar de ribonucleasa b) muestra de manilasa (actividad específica 140 kü/mg) Fig. 5: Influencia de la heparina sobre la actividad de hialuronidasa de la manilasa (- o -) y hialuronidasa de testículo bovino eje X: Ul de heparina; e j e Y de actividad remanente Fig . 6 : Medición de la estabilidad de hialuronidasas en amortiguador y plasma: (a) manilasa (4°C), (b) manilasa (-20°C) (c) manilasa (37 °C) , (d) hialuronidasa de testículo bovino (Y) y hialuronidasa de Hirudo medicinalis (A) eje X: días de incubación; eje Y: unidades de WHO (Ul) Fig . 7 : Secuencia de aminoácidos de la manilasa nativa obtenida por secuenciado de la proteina aislada y purificada de Hirudinaria manillensis de acuerdo con la invención (corresponde a SEC ID No. 1) Fig. 8: Secuencia de nucleótidos (lineas superiores) y aminoácidos de un clon recombinante de manilasa clon 21); (corresponde a las SEC ID No. 2, 3) Fig . 9 : Secuencia de nucleótidos (lineas superiores) y aminoácidos de un clon recombinante de manilasa (clon 31) ; (corresponde a las SEC ID No. 4, 5) Fig. 10: Secuencia de nucleótidos (líneas superiores) y aminoácidos de un clon recombinante de manílasa (clon 31); (corresponde a las SEC ID No. 6, 7) Fig. 11: Vector de expresión de E. coli para manilasa Fig. 12: Plásmido báculo dador para manilasa Fig. 13: Vector de expresión en levaduras para manilasa La invención se describe en detalle por medio de los siguientes ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos no limitan la invención a los materiales generales, métodos, parámetros físicos, compuestos, materiales biológicos, vectores de expresión y hospedantes etc. usados en los experimentos e indicados en los ejemplos. Sí no se menciona lo contrario se usaron las técnicas estándar conocidas en el arte anterior y los materiales generalmente disponibles.

Ejemplo 1 ( Observa ciones generales) : Se llevaron a cabo una serie de experimentos preliminares usando extractos crudos de Hirudinaria manillensis para establecer el procedimiento de purificación. Se seleccionaron y verificaron los siguientes métodos: procedimiento de precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio catiónico y aniónico, cromatografía de afinidad con Heparina-Fractogel, Con A-Sefarosa, cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) en O'-til-Seíarosa, -_op±_- F^n -, Butil-Fractogel , enfoque fc*te*~»'«*HÍíÍÉHá*frtHr- mr-Hi <t r, isoeléctrico preparativo y electroforesis preparativa. Los resultados muestran que la precipitación acida y con amonio, la cromatografía de intercambio catiónico, la Con A-Sefarosa, la cromatografía Propil-Fractogel HIC y Diol-LiChrospher y de fragmentos de ácido hialurónico- Sefarosa (HA-Sefarosa) son adecuados para la purificación de la manilasa. La matriz de HA-Sefarosa preparada en nuestro laboratorio se usó con éxito para la purificación de esta glicosidasa. Todas las preparaciones se llevaron a cabo en frió salvo que se indique lo contrario. La purificación se llevó a cabo de acuerdo con el esquema indicado anteriormente (Tabla 1).

Ejemplo 2: - Prepara ción del Ma terial de partida para la Purifi ca ción ; Prepara ción de cabezas de sanguij uela . Sanguijuelas de Hirudinaria manillensis recolectadas en Bangladesh se congelaron inmediatamente por golpe y luego se almacenaron a una temperatura entre -40° y -80°. Luego se decapitaron en estado congelado. El peso de las cabezas era de aproximadamente el 5 % del peso del cuerpo .

Ejemplo 3: - Procedimien to de extra cción de manilasa de las cabezas de sanguij uela En una purificación representativa, se homogenizó 1 kg de cabezas de sanguijuela congeladas en un homogenizador Waring con 2500 ml de amortiguador de ácido acético 0.1 M pH 4.0 conteniendo 0.025% de timerosal y 17 mg/ml de trealosa (Merck KGaA, Art . No. 1.08216). El homogenato se agitó suavemente e inmediatamente se agregaron los siguientes inhibidores de proteasa: 1. PMSF 1.7 mg/ml 10.0 2. Leupeptin 10.0 µg/ml 20.0 µM 3. Pepstatm A 0.7 µg/ml 1 µM EGTA 380.35 µg/ml 1.0 mM 5. p-APMSF 40.0 µg/ml 20.0 µM Se continuó agitando durante 4 horas en frío y se centrífugo a 4900 rpm durante 20 minutos. La solución de sobrenadante (sobrenadante 1) se recolectó y se juntó con el sobrenadante II obtenido subsiguientemente por extracción de la pelotilla de tejidos. Los sobrenadantes reunidos representan el material de la etapa 1. El procedimiento se resume en el siguiente esquema : Material de partida Cabezas de sanguijuela i Homogenización i Extracción 1* Precipitación acida Centrifugación sobrenadante I' Pelotilla Diálisis* ' Desalinización] i Extracción II* Precipitación acida i Centrifugación Y. M Sobrenadante II* Pelotilla [desechado) * La. determinación de la actividad y caracterización bioquímica de las muestras se llevó a cabo por medio de la prueba de determinación de actividad - reducción de la turbiedad y determinación del contenido de proteína (E2so> método BCA Pierce, SDS - PAGE) . Fue imposible medir la actividad enzimática en el homogenato de sanguijuela, debido al muy elevado contenido de hemoglobinas (medida con el equipo de determinación de hemoglobina, Merck KGaA, 13851) y otras proteínas. Además, no se pudo medir la actividad de la hialuronidasa en la etapa anterior a la precipitación acida. Las actividades específicas finales (actividad por mg de proteína) de estos extractos fue de alrededor de 10-30 unidades WHO. De acuerdo con la SDS- PAGE, los extractos crudos contenían grandes cantidades de diferentes proteínas, las principales con un peso molecular de ~ 120, 55 -60, 45, 31, 28, 22, 15 y 14-10.

Ejemplo 4 : - Procedimien to de Precipi ta ción con sulfa to de amonio del ma teria l de la Etapa I A continuación se seleccionó el procedimiento de precipitación con sulfato de amonio como primera etapa de la purificación de manilasa, lo que llevó a un enriquecimiento de aproximadamente 5 veces de esta enzima.

Se precipitó material enzimáticamente inerte del extracto crudo de la Etapa I agregando lentamente sulfato de amonio sólido (Merck KGaA) a 36% p/v a +4°C. Esta mezcla se agitó durante 1 h y se centrifugó. • El precipitado se desechó. El sobrenadante se dializó contra agua desionizada corriente durante la noche y 24 horas contra amortiguador fosfato 20 pH 6.0. Las actividades específicas finales de estos extractos fueron de aproximadamente 40 - 150 unidades WHO. De acuerdo con la SDS-PAGE, los extractos de la etapa II contenían grandes cantidades de proteínas diferentes.

Ejemplo 5: Croma tografía de in tercambio ca tiónico El intercambiador catiónico se usó en un modo de adsorción de lotes. Se incubó una muestra dializada rica en enzimas (etapa II) durante la noche con 1 1 de intercambiador catiónico Fractogel EMD S03~ 650 (5), Merck KGaA, Art. No. 16882. Después finalizar la incubación por centrifugación, se lavó el intercambiador catiónico con el amortiguador, se volvió a centrifugar y se llenó la columna de HPLC Superresolución con el gel. Después de lavar la columna con amortiguador fosfato 20 mM pH 4,9 se eluyeron de la columna las proteinas unidas con el mismo amortiguador fosfato pH 6.0 conteniendo un gradiente lineal de 0 a 1 M de NaCl. Las fracciones se recolectaron cada 3 minutos (9 ml) y se monitoreó la absorbancia a 280 nm. La manilasa se eluyó con concentraciones de 0.15 a 0.18 M de NaCl. Se midieron las actividades y los contenidos de proteínas de todas las fracciones y se reunieron las fracciones y se dializaron durante la noche contra amortiguador fosfato 20 mM pH 6.0 conteniendo azida sódica y 17 mg/ml de trealosa. Se llevó a cabo la determinación de la concentración de proteínas, las actividades específicas de los "pozos" y el análisis de SDS-PAGE. A pesar de obtener muy buenos rendimientos (actividad) y una actividad específica elevada (unidades de actividad WHO por mg de proteína, que corresponde a Ul) , todavía se presentaba una mezcla de muchas proteínas en los resultados del análisis de SDS-PAGE de las muestras. Con la cromatografía de intercambio catiónico con la ayuda de Fractogel EMD S03 650 (5) ® (Merck KGaA, Alemania) se obtuvo un factor de purificación muy alto de ~ 10 a 50. Esta etapa es muy efectiva para reducir las impurezas de hemoglobina. Además encontramos que el procedimiento de lotes fue una etapa inicial muy útil para el manipuleo de grandes volúmenes de sobrenadantes de la etapa II 5 - 16 1) . - ~" .-g^feaj-^. .•^a«i-hjMi^.^^¡ <?M,tM1¡J^aAt¡¿t^M)t&i t , ..t, -'"J»-Jfc-?¡i fc1?fr? Ejemplo 6: - Croma tografía de afinidad de Concanavalina A - Sefarosa Se realizó otra purificación de los pozos ricos en enzimas después del intercambiador catiónico por medio de una cromatografía de afinidad de Con A lectina. Se lavó Con A-Sefarosa® de Pharmacia Biotech, Art . 17-0440-01, disponible comercialmente con un amortiguador acético 0.1 M + NaCl 0.5 M pH 8.0; ácido bórico 0.1 M + 0.1 % de Tritón X 100 pH 6.0 y finalmente con amortiguador acético 0.1 M + NaCl 0.5 M pH 6.0. La muestra se dializó durante la noche contra amortiguador acético 20 mM + NaCl 0.50 mM + CaCl2 1 mM ^ MgCl: 1 mM pH 6.0 + MnCl2 1 mM, aplicado a temperatura ambiente a una columna Con A de 1000 ml y eluido durante 2 h con 510 ml de amortiguador de ácido acético 100 mM + NaCl 0.5 M + CaCl2 1 mM +MgCl2 1 mM pH 6.0 + MnCl2 1 mM Luego se realizó una desorción con el mismo amortiguador conteniendo metil-a-D-manopiranosida 0.5 M. La elución se monitoreó continuamente a 280 nm. En las 3 fracciones que se recolectaron se analizó la actividad de la hialuronidasa . Se formó un pozo con las fracciones activas y se dializó durante la noche contra amortiguador fosfato 20 mM pH 6.0 conteniendo azida sódica y 17 mg/ ml de trealosa. Se llevó a cabo la determinación de la .^.*ia»i? ,-l.í...*áMÉM,.<t¿tda¿^,_i fc fcjlMltHüaj concentración de proteínas, las actividades especificas de los "pozos" y el análisis de SDS-PAGE. Esta etapa fue muy efectiva en remover el resto de hemoglobina. La cromatografía de Con A llevó a un factor de purificación de 5 4-10. Este factor varió dependiendo de la calidad del material de partida.

Ej emplo 7 : - Croma tografía de In tera cción Hidrofóbí ca de Propil Fra ctogel 10 A Pozos-Con A hialuronidasa activos se agregó sulfato de amonio a una concentración final de 2 M. Las muestras de incubaron entonces durante l h a temperatura ambiente con 150 ml de Propyl-Fractogel EMD Propyl 650 (S)®, Merck KgaA, Alemania, Art . No. 1.10085, equilibrado con 15 amortiguador fosfato 0.1 M pH 7.0, conteniendo sulfato de amonio 2 M. Después de finalizada la incubación se lavó dos veces el gel con el mismo amortiguador y se preparó la columna de HPLC-Super-resolución (2.6 cm x 60 cm) . Las proteínas unidas se eluyeron con amortiguador fosfato 0.1 M 20 pH 7.0. Las 6 fracciones se recolectaron cada 3 minutos, se dializaron directamente contra agua desionizada (2 - 3 h) y luego contra amortiguador fosfato 20 mM pH 6.0. En las fracciones se analizó la actividad de hialuronidasa. Las fracciones activas se reunieron en un pozo y se dializaron durante la noche contra amortiguador fosfato 20 mM pH 6.0 conteniendo azida sódica y 17 mg/ml de trealosa. Se llevó a cabo la determinación de proteínas y de actividad de los pozos . El factor de purificación en esta etapa de cromatografía es de aproximadamente 3 a 5. Se removió una pequeña cantidad de Con A liberada del gel portador en la etapa previa junto con otras impurezas de proteína.

Ejemplo 8: - Prepara ción de la col umna de afinidad de oligosa cárido de ácido hial urónico (a) Hidról isis de hial uronano (HA) con hia l uronidasa de tes tí cul o bovino Se disolvieron 7 g de ácido hialurónico en 1.25 1 de amortiguador acetato de sodio 0.1 M conteniendo 0.15 NaCl y EDTA 0.5 mM, pH 5.2 mediante mezcla durante la noche a 4 °C en la presencia de tolueno. Luego se ajustó el pH de la solución que contiene HA en 5.2 y después de calentar a 37 °C se agregó la hialuronidasa de testículo bovino (Merck KGaA; 700 unidades WHO/ mg) . Por cada 7 g de HA, se usaron 210 mg de enzima disueltos inmediatamente antes del uso en 50 ml del amortiguador anterior. La hidrólisis se deja proceder iik- á?fcA ;M ftjtaw.?rr|,..„Jhja?. durante. 30 minutos a 37 °C con constante agitación y se finaliza calentando durante 5 mm a 100 °C en un baño de agua en ebullición. La mezcla de reacción se clarificó mediante centrifugación durante 30 mm a 10 000 g, la proteína desnaturalizada conteniendo sedimento se desechó y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0.2 µm, sobre el cual se colocó un prefiltro de fibra de vidrio. La solución clarificada con oligosacáridos de HA (HAOS) se fraccionó por medio de filtración a través de tres membranas de ultrafiltración Diaflo (Amicon) con diferentes valores de separación molecular de la siguiente manera. (b) Fra ccionamíen tro de HAOS por ul tra fil tración La solución conteniendo HAOS de la etapa anterior se filtró a través de una membrana de ultrafiltración Diaflo 30 YM. Se guardó el material retenido para otros estudios, mientras que el filtrado se sometió a la segunda ultrafíltración a través de una membrana de ultrafiltración Diaflo 30 YM. Nuevamente se guardó el material retenido para otros estudios, mientras que la solución que pasa a través de 10 YM se sometió a la última ultrafiltración a través de una membrana de ultrafíltración Diaflo 3 YM. Luego el material retenido que contenía HA-OS, alrededor de 10 ml de la solución, se usó para purificación adicional. Esta fracción: HAOS 3-10 se purificó de la siguiente manera y se siguió usando para acoplamiento a Sefarosa. (c) Purifi ca ción de HAOS 3-10 Se purificó RA-OS 3-10 (desalinizado) en una columna Biogel P2®. Esta columna (4 cm x 100 cm) se empaquetó con medio Biogel 2®, 200 - 400 de malla (BioRad) , y se lavó con 5 volúmenes de columna de agua (Milu Q, Millipore) . La fracción de HAOS 3-10 obtenida de la etapa anterior (15 ml; 1.5 g de oligosacáridos) se aplicó a esta columna. La columna se eluyó con agua; se recolectaron fracciones de 25 ml y se analizó la presencia de oligosacáridos de HA. Las fracciones conteniendo oligosacáridos que eluyeron antes que las sales (estas últimas se detectaron con AgN03) se combinaron y volvieron a concentrar sobre una membrana Diaflo 3 YM (d) Análisis de HAOS 3 - 10 Para determinar la eficiencia de acoplamiento de la Sefarosa, se lavó el gel (el mismo lote) y se suspendió en agua como para preparar una suspensión al 50 %. De la suspensión de Sefarosa-HAOS 3 - 10 se usaron conjugado y Sefarosa como control, se tomaron alícuotas de 100 µl por triplicado y se agregaron a 2.5 ml de ácido trifluoroacético 2.2 N (TFA, Merck KgaA) en un tubo de tapa a rosca de teflón. Para la hidrólisis se trató la mezcla con argón y se incubó a 100°C durante 16 h. Al final de ia hidrólisis se secaron las muestras bajo nitrógeno, se resuspendieron en agua y se usaron para la determinación de glucosamina y ácido urónico. Para determinar el grado de descomposición de ácido urónico y glucosamina para cada una de las hidrólisis, se incluyeron muestras de control que contenían cantidades conocidas de UA o GlcNAc y se incubaron bajo las mismas condiciones . Bajo las condiciones que se describen más bajo se acoplaron 5, 8, 9, 11 y 15 mg de HAOS 3 - 10 por 1 ml de gel de Sefarosa drenado en dos experimen tos independien tes . Estos resultados se basan en la UA y ensayos de glucosamina . (e) Ensayo usado El contenido de ácido urónico en las muestras se analizó de acuerdo con Bitter T. and Muir H. M. , Anal . Biochem . , 1962, 4, 330 - 334. Las cantidades de hexosamina se analizaron con el método de Rondle C.J.M. and Morgan W.T.J., Biochem . J. , 1955, 61, 586 - 593.

-»Jhat4a-w.^^,.-.i-a,..-Ma...a^A,fc ' i ? , Ejemplo 9: - Croma tografía de Sefarosa de Fragmen tos de Ácido Hial uróni co (Croma tografía de HA-Sefarosa) Se prepararon las matrices de cromatografía conteniendo 8 a 10 mg/ml de acuerdo con lo indicado anteriormente. La muestra que contiene enzima se dializó contra amortiguador acético 20 mM + NaCl 0.15 M pH 4.0 y se aplicó a la columna de HA-Sefarosa. Después de lavar con el mismo amortiguador se eluyó con amortiguador acético 20 mM con un gradiente de 0.15 a 1 M de NaCl. Las fracciones de 1 ml se analizaron en la prueba de determinación de actividad de hialuronidasa, se reunieron en un pozo, se dializaron durante la noche contra amortiguador fosfato 20 mM pH 6.0 conteniendo azida sódica y 17 mg/ ml de trealosa. Se llevó a cabo la determinación de proteína y actividad de los pozos. El factor de purificación de esta etapa de cromatografía fue de alrededor de 3.

Ejemplo 10: - Croma tografía Diol -LiChrospher Una muestra activa de 20 ml dializada contra Milli-Q-H20 se aplicó sobre una columna Diol-LiChrospher . La columna se equilibró entonces con 15 ml de Milli-Q-H20 y se lavó durante 5 min con 2 ml de agua. La elución de la muestra activa se realizó durante 15 mm con amortiguador acético 20 mM pH 5.9 (gradiente, 0 a 5 mM de NaCl) y durante 35 min con un gradiente de 20 mM a 100 mM de amortiguador ácido acético pH 5.5 conteniendo NaCl 5 mM. En las fracciones se analizó la actividad de la hialuronidasa. Las fracciones activas se reunieron en un pozo y se dializaron durante la noche contra amortiguador fosfato 20 mM pH 6.0 conteniendo azída sódica 17 mg/ml de trealosa. Se llevó a cabo la determinación de proteína y actividad de los pozos. El factor de purificación fue de 3.

Ejemplo 11: - Croma tografía de Fase Reversa RP 18e Esta etapa de purificación sólo se puede usar como última etapa y tiene por objeto obtener la muestra libre de sales y otras impurezas de proteína (por ejemplo inhibidores de proteasa peptídica). La actividad de la hialuronidasa se perdió completamente, porque la manilasa no es resistente a los solventes orgánicos usados en esta etapa. La muestra con manilasa se aplicó a la columna de RP 18e. Se recolectaron las fracciones de 0.25 ml/min. La elución se llevó a cabo en presencia de 0.1 % de TFA y se usó un gradiente de agua a 99 % de acetonitrilo. Las muestras sí- purificadas de la RP se pueden usar directamente para el secuenciado de aminoácidos, la medición de MALDI, el análisis de la estructura de carbohidratos y como estándar para la purificación de otros lotes de manilasa.

E emplo 12 : - Determina ción de la a ctividad Prueba de Reducción de la Turbiedad La determinación de la actividad de la hialuronidasa se realizó por medio de mediciones de la reducción de la turbiedad. Se usaron preparaciones de hialuronano comercialmente disponibles (aisladas de diferentes tejidos y íluidos animales, por ejemplo tendón humano, cresta de gallo) y hialuronidasas (endo-ß- glucosaminidasas de testículo bovino, de testículo porcino, de veneno de abejas; de liasas de Streptomyces hyalurolyticus ) para establecer las condiciones adecuadas para los ensayos de actividad. La endo-ß-glucuronidasa de Hirudo medicinalis se purificó parcialmente en nuestro laboratorio . Se preparó una solución de hialuronano (conc. 2 mg/ml) disolviendo HA amortiguador fosfato 0.3 M pH 5.3. Esta solución se diluyó con el mismo amortiguador hasta obtener una concentración de 0.2 mg/ml directamente antes de ®¡M?& ¡&t?i¡i¡?áiAá6í¡¡ la prueba. Las muestras que contienen enzima se diluyeron para obtener una cantidad apropiada de enzima (0.5 - 5 unidades WHO) con amortiguador fosfato 20 mM conteniendo 0.01 % de albúmina bovina y 77 mM de NaCl (amortiguador de dilución de enzima) . A 0.1 ml de estas muestras se agregó 0.1 ml de solución de hialuronano (0.2 mg/ml), se mezcló y se incubó durante 45 minutos a 37 °C . La prueba se realizó por duplicado. La reacción se detuvo por dilución con 1.0 ml de reactivo de albúmina (0.1% de albúmina disuelta en ácido acético 80 mM/amortiguador acetato de sodio 40 mM, pH 3.75). Después de 10 mm de incubación a temperatura ambiente o 37°C se leyó la densidad óptica a 600 nm y se expresó la actividad en unidades WHO (Ul) por comparación con un estándar (programa SLT) . Como estándar se usó la preparación de WHO de hialuronidasa testicular bovina (Humphrey J. H., Bull. World Health Org. 1957, 16, 291-294).

Ejemplo 13: - Estima ción de proteínas El contenido de proteína de los eluyentes de las columnas se determinó mediante medición de la absorbancia ultravioleta de las soluciones a 280 nm. Se determinó la concentración de proteina de las fracciones reunidas en un pozo por medio del micrométodo Pierce. La solución BSA se usó como una proteína de referencia.

Ejemplo 14: - Electroforesi s SDS-PAGE La electroforesis se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento de Laem li (Nature, 1970, 227, 680-685) . Se usaron los siguientes geles: 4 a 20 % de gradiente o 12.5% de geles separadores con 4 % de gel "agrupado". Las muestras se sometieron a electroforesis en la presencia de dodecil sulfato de sodio y ß-mercaptoetanol . Las proteínas se visualizaron después de la tinción con azul brillante de Coomassie y/o tinción con plata (de acuerdo con la instrucción de Pharmacia).

Ejemplo 15: - Enfoque isoeléctri co Para seguir los estudios de enfoque isoeléctrico en la preparación de manilasa, se adoptó el protocolo proporcionado por el proveedor (Pharmacia). Después del enfoque se fijó el gel y se tiñó con plata (de acuerdo con el protocolo de pharmacia) .

Ejemplo 16: - Prepara ción de Inmunoglobulina de Sueros Inmunes de Conej os (an ti -ConA, an ti -hemoglobina y an ti cuerpos de conej o an ti -péptido) .^feJnil *teiteÍÍ-A»tl¡-¿->l4-it?i¿ii.-lt t&nnJ . ..^ f, A,lAÁÁ Los sueros de conejo se prepararon con el uso de os siguientes inmunógenos : concanavalina A lectina, mezcla de hemoglobinas y conjugados de péptido-KLH. La secuencia peptídica fue idéntica a la de la parte N-terminal de 14 aminoácidos de la manilasa (KEIAVTIDDKNVIA) . Los sueros se purificaron en una columna de Proteína A Sefarosa (Pharmacia, 17-0780-01) de acuerdo con la instrucción estándar de Pharmacia. Se chequeó la pureza de las muestras de IgG por medio de una SDS-PAGE y una prueba de ELISA.

Ejemplo 17: - Ensayo de Inmunotransferencia Western ( Inmunomanchado-Western) . Alícuotas adecuadas de las muestras y marcador de proteína precoloreado de peso molecular conocido se sometieron a una SDS-PAGE de acuerdo con lo descrito anteriormente. Se usó un marcador de peso molecular BioRad pre-coloreado. La proteína se transfirió electroforéticamente de geles de poliacrilamida (0.8 mA/cm2) a membranas de polivinildifluoruro inmóvil (PVDF) en la presencia de amortiguador de transferencia durante 100 min. La membrana de PVDF se incubó con solución de bloqueo (PBS, pH 7.5 + 2% de leche descremada) durante una hora a temperatura ambiente. A continuación se incubó la membrana durante 2 h a temperatura ambiente con el anticuerpo y se diluyó apropiadamente con la solución de bloqueo. La membrana se lavó con TBS + 0.05% de Tween 20, pH 7.5 y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con un conjugado de fosfato alcalino anti-conejo de cabra (un segundo anticuerpo) , BioRad. La membrana se lavó dos veces con TBS + Tween 20 y se incubó durante 10 min con una solución de sustrato de fosfatasa alcalina BCIP. Por medio del agregado de un amortiguador de detención se finalizó la reacción.

Ejemplo 18: - Secuenciado de aminoácidos La secuencia de los residuos de 33 aminoácidos N-terminales de la manilasa se obtuvo por degradación Edman. Después de una SDS-PAGE de las muestras manilasa-activas, se transfirieron las bandas sobre una membrana de PDVF, se tiñeron con azul de Coomassie, se recortaron y se secuenciaron. Se encontró la misma secuencia de aminoácidos para la muestra obtenida después de la última etapa de purificación por medio de una cromatografía en columna de fase reversa (RP) . a-Afcaft^.

Ejemplo 19: - Dependencia del pH de la Actividad Enzimá tica (para hial uronidasa aislada' de cabezas de sanguij uelas Hírudinaria manillensis e Hirudo medi cinalis) Las muestras de hialuronidasa usadas en este experimento se extrajeron ya sea de cabezas de la sanguijuela Hirudinaria manillensis o de la sanguijuela Hirudo medicinalis y se purificaron parcialmente mediante precipitación con sulfato de amonio y cromatografía de intercambio catiónico. Cada muestra con 500 unidades WHO /ml se incubó a 20°C, +4°C y 37°C en un rango de pH entre 2.6 y 9.0 (20 mM acético para pH 2.6 a 5; amortiguador fosfato 20 mM para pH 5 a 9) . La actividad enzimática se midió después de 1 , 2 y 7 días de incubación. Tanto en el extremo ácido como en el alcalino de pH se observó una inhibición de la actividad de la misma magnitud para ambas hialuronidasas. Sin embargo durante periodos de incubación más largos la manilasa fue más estable que la hialuronidasa de Hirudo medicinalis: por ejemplo después de 7 días de incubación a pH 7.0 y a una temperatura entre +4°C y 37°C, la manilasa retuvo 75% y 60% de la actividad inicial, respectivamente. La hialuronidasa de Hirudo medicinalis incubada bajo las mismas condiciones era casi inactiva después del dia 12.

Ejemplo 20: Medi ción de la estabilidad de hial uronidasas en la presencia de suero de perro (para hial uronidasa aislada de cabezas de sanguij uela de Hírudmaría manillensis e Hirudo medi cinalis) . Las muestras de 5 kU/ml manilasa, de hialuronidasa de Hirudo medicinalis y de testículo bovino se diluyeron con plasma cifrado de perro o rata hasta una concentración final de 250 U/ml. Luego se incubaron estas soluciones a -20°C, + 4°C y +37°C durante 0 a 7 días. En este experimento se incluyeron los controles conteniendo las mismas hialuronidasas diluidas en amortiguador. Finalmente se midió la actividad de la hialuronidasa.

Ejemplo 21 : -Actividades enzimá ti cas contaminan tes En cada etapa del procedimiento de purificación para hialuronidasa de sanguijuela se chequeó la preparación para determinar la presencia de otras enzimas capaces de degradar proteína por medio del sustrato universal de proteasa (Boehringer Mannheim, cat. no. 1080 733) de acuerdo con Twining 5. 5. (Anal. Biochem., 1984, 143, 30-34).

Ejemplo 22: - Infl uencia de la Heparina sobre la Acti vidad de la Hial uronidasa La escisión de una hialuronona por hialuronidasas lleva a la liberación de azúcares reductores. La cantidad de azúcares reductores liberados se midió colorimétricamente por medio del método de Park (Park J.& Johnson M.; J. Biol. Chem. 25 1949, 181 , 149) . Para la medición de la influencia de la heparina sobre la actividad de la manilasa y hialuronidasa de testículo bovino, se llevaron a cabo dos determinaciones de actividad: una en la presencia de heparina y la segunda sin heparina. Se incubaron las muestras de hialuronidasa 25 µl (3.2 unidades WHO) durante 30 mm a 37°C con 25 µl de solución de heparina (Liquemin, Fa . Hoffmann LaRoche) , conteniendo 0 a 24 unidades de heparina. Luego se agregaron 50 µl de hialuronano (2.5 mg/ml) y se continuó la incubación durante 30 mm a 37°C. La reacción se terminó calentando durante 2 mm a 100°C. Luego se agregaron 100 µl de solución de carbonato-cianuro y 100 µl de solución de ferricianuro de potasio al digerido inactivado. Las muestras se calentaron en un baño de agua en ebullición durante 15 min y luego se enfriaron en un baño de hielo. A continuación, se agregaron 0.75 µl de solución de sulfato de amonio férrico a las mezclas de reacción. Después de 15 mm de incubación a temperatura ambiente, se midió el color desarrollado a 690 nm en un espectrofotómetro Shimadzu. En cada ensayo se incluyeron blancos adecuados y controles no- enzimáticos. Como estándar se usó el azúcar reductor esperado (ácido glucurónico o N-acetil-glucosamina, 1 a 15 µg) para el tipo de muestra bajo análisis.

Ejemplo 23: - Desgli cosi la ción de la manilasa Las muestras de manilasa se desglicosilaron por medio de la enzima PNGasa F (BioLabs Art . No. 701 L) de acuerdo con la instrucción del proveedor. La desglicosilación se llevó a cabo bajo condiciones de desnaturalización y nativas. Los tratamientos con 0- glicanasa, neuraminidasa y neuraminidasa + O-glicanasa se llevaron a cabo de acuerdo con las prescripciones estándar de Boehringer Mannheim. Todas las muestras se caracterizaron por medio de una SDS-PAGE y una prueba de determinación de actividad.

Ejemplo 24 : - Construcción del vector de expresión de E . coli (Fig. 11) . Para la expresión en E . coli se usó una versión modificada del plásmido pASK75, que porta la región promotora tet. (Skerra 1994 ID: 1360). Realizamos una modificación donando un nuevo enlazador entre los sitios Xbal e Hind III. El nuevo enlazador contiene la secuencia lider ompA, otro sitio de clonación y un extremo 6xHis en lugar del extremo strep. Secuencia enlazadora que se clonó en el pASK75. xtai 119 CTACATAACC ACCCCAAAAA ATCAAAAAGA CACCTATCGC GATTGCAGTG CCACTGCCTC TATTC TCCCCTTTTT TACTTTTTCT GTCGATAGCG CTAACCTCAC CC GACCCAC i^ stLvsLvsT prAi an eA i an eAi avaí Ai aieuAi ac cía EOORI sso Kpn s?ta Barmí 179 CTTTCCCTA CCTACCCCAC CC AT CCA TOA Ap CCA GCT CGG TAC CCG GGG CAAAGCGATG GCATCGCGTC CG TA CCT ACT TAA GCT CGA CCC ATG GCC CCC 14> l yP eAl aTh rvaiAi acm Al a xna sai RSI EOM7HI 230 ATC CCT CGA CCT CGA CCT GCA CCC AGC GCTATCAGAGGATCGCATCACCATCACCA TAG GGA CCT CCA CCT CGA CCT CCC TCC CCATACTCTCCTAGCGTACTCGTAGTCGT Hind lll 1*AlaMetAr?Gl ySerHI SH>sHI SHI $HI 286 TCACTAATAGA ACTGATTATCTTCGA 10* SHI S Para construir el vector de expresión para la manilasa fue necesario incluir los sitios de restricción 51 Cía I y 3' Eco47III por medio del método de PCR. Por lo tanto se usaron los dos cebadores 5' ATC GAT AAA GAG ATT GCC GTG AC y 3' GTT GTT TCC GAT GCT AAA GCG CT . El producto de la PCR se clonó primero dentro del sistema del vector PCR II (Invitrogen) y se secuenció. En una segunda etapa se clonó el gen de la manilasa dentro del vector pASK75 modificado usando los sitios de restricción 5' Clal y 3' Eco47III.

Después de expresar y proveer la actividad de esta manilasa recombinante, se removió en una segunda reacción de PCR el extremo His y el codón de iniciación del gen de la manilasa se fusionó directamente a la secuencia líder omp A. Los cebadores de esta reacción de PCR fueron: 5' ACC GTA GCG CAG GCC AAA GAG ATT GCC GTG y 3' CAC GGC AAT CTC TTT GGC CTG CGC TAC GGT.

Ejemplo 25: Construcción del plásmido Ba culo- Dador (Fig. 12) Para la expresión de la manilasa en el sistema de expresión del baculovirus, se usó el sistema de expresión de baculovirus Bac-To-Bac™ de Gibco Life Technologies. Para obtener un sistema de sección se fusionó la secuencia líder de melitma de abeja al gen de la manilasa y para introducir los sitios de restricción 5' BamHI y 3' Kpnl se llevó a cabo una única reacción de PCR. Cebador 5 ' : CGG ATC CAT GAA ATT CTT AGT CAÁ CGT TGC CCT TGT TTT TAT GGT CGT ATA CAT TTC TTA CAT CTA TGC GAA AGA GAT TGC CGT GAC Cebador 3 ' : AAT GTT GAA GCA TAA GGT ACC El producto de la PCR se clonó dentro del vector PCR II (Invitrogen) y se secuenció. Luego se clonó la fusión de Melitina - Manilasa dentro del vector pFastBac usando los sitios de restricción 5' BamHI y 3' Kpnl (Fig. 12).

Ejemplo 26: - Construcción del Vector de Expresión de levaduras (Fig. 13) Para la expresión en levaduras usamos el sistema de expresión de multicopias "pichia" ( Invitrogen) . Para construir el vector de expresión para la manilasa usamos el método de amplificación de PCR del gen de la manilasa de tal manera de generar extremos de restricción compatibles (5' EcoR I, 3 ' Not Y) para la unión dentro del vector apropiado (pPIC9K) . Por lo tanto se usaron los siguientes cebadores: 5' GTA GAA TTC AAA GAG ATT GCC GTG ACÁ 3' GAT GCT AAT GTT GAA GCA TAA TGA GCG GCC GC Antes de transformar los Pichia Speroplasts se linearizó el vector de expresión con Sal I.

Ejemplo 27: - Expresión en E . coli El vector de expresión pRG72, que contiene el gen estructural de Sarastatm fusionado a la secuencia líder ompA, se transformó dentro de células competentes W3110. Las células se cultivaron hasta una fase simid-log y entonces se indujo el promotor agregando 200 µg de aTC / 1. Una hora más tarde se pudo detectar claramente la manilasa recombinante.

Ejemplo 28: - Genera ción de Ba culovirus recombinan tes y Expresión de la Manilasa con el Sistema de Expresión Ba c-To-Ba c El plásmido dador pTD13 se transformó dentro de células competentes DHlOBac que contienen el bacmido con un sitio de blanco mini-attTn7 y el plásmido auxiliador. El elemento m?ni-Tn7 en el plásmido dador puede transposar a un sitio de blanco mini-attTn7 objetivo sobre el bacmido en la presencia de proteínas de transposición proporcionadas por el plásmido auxiliador. Se identificaron las colonias que contenían bacmidos recombinantes por disrupción del gen la cZ . Entonces se usó ADN de mini-prep. de elevado peso molecular preparado de clones de E. coli seleccionados conteniendo al bacmido recombinante y este ADN para la transfección de células de insectos. Una descripción detallada se puede encontrar en el manual de instrucciones del equipo de expresión.

Ejemplo 29: - Expresión en levaduras Para estar seguro de haber integrado el gen de la manilasa se deben rastrear las colonias para encontrar mutantes His" Mut~ . Usando una única colonia se inoculan 100 ml de medio en un frasco de 1 1. Las condiciones de crecimiento son: 28 - 30°C, 250 rpm, hasta OD 2-6. Para inducir la expresión, primero se centrifuga el cultivo, se deja decantar y se resuspende la pelotilla de células en un nuevo medio usando 1/5 del volumen del cultivo original. Se agrega 100% de metanol hasta una concentración final del 0.5% cada 24 horas para mantener la inducción. Después de máximo 6 días se analiza el sobrenadante mediante SDS-PAGE y el ensayo de actividad.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la practica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

LISTADO BE SECUENCIAS <110> Merck Patent GmbH <120> Hialuronidasa de la Hirudmana manillens s, aislamiento, purificación y método recombinante de producción <130> Manilasa <1 0> <1 1> <160> 15 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 488 <212> PRT <213> Sanguijuela <400> 1 lys Glu lie Ala Val Thr lie Asp Asp Lys Asn Val He Ala Ser Val 1 5 10 15 Ser Glu Ser Phe His Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser Pro 20 25 30 Lys Gly Leu Trp Ser Phe Val Asp He Thr Ser Pro Lys Leu Phe Lys 35 40 5 Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr Phe 50 55 60 Ala Asn Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys Asp 65 70 75 80 Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr He Thr Arg 85 90 95 Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gln Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Glu Asp 100 105 110 Asp Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe Asp 115 120 125 Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu He Gly Lys Lys Met Thr 130 135 140 Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys Val 145 150 155 160 Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn He Asp Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro 165 170 175 Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr Glu Lys Gln Val Gly Glu Asp 180 185 190 Phe Lys Ala Leu His Lys Val Leu Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn Lys 195 200 205 Gly Ser Leu Val Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Tyr Val 210 215 220 Lys Gly Leu Ala Asp Gly Ala Gly Asp Leu Val Thr Ala Phe Thr Leu 225 230 235 240 His Gln Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Thr Ser Asp Val Ser Thr Tyr Leu 245 250 255 Asp Ala Thr Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Gln Leu Phe Asp Lys Val Lys 260 265 270 Asp Val Leu Lys Asn Ser Gln His Lys Asp Lys Pro Leu Trp Leu Gly 275 280 285 Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Asn Ser Gly Thr Lys Asp Val Ser Asp Arg 290 295 300 Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala Ala 305 310 315 320 Asn Asn Val Lys Val Val lie Arg Gln Thr He Tyr Asn Gly Tyr Tyr 325 330 335 Gly Leu Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp Leu 340 345 350 Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val Asp 355 360 365 Val Ser Asp Pro Thr Asn Lys Ala Arg Val Tyr Ala Gln Cys Thr Lys 370 375 380 Thr Asn Ser Lys His Thr Gln Ser Arg Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Thr 385 390 395 400 He Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu Asp Val Thr Leu Lys He Asp 405 410 415 Gln Tyr Gly Gly Lys Lys He Tyr Ser Tyr He Leu Thr Pro Glu Gly 420 425 430 Gly Gln Leu Thr Ser Gln Lys Val Leu Leu Asn Gly Lys Glu Leu Lys 435 440 445 Leu Val Ser Asp Gln Leu Pro Glu Leu Asn Ala Asn Glu Ser Lys Thr 450 455 460 Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe Gly Phe Phe Val Val Ser Asp 465 470 475 480 Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys 485 <210> 2 <211> 1464 <212> ADN <213> Sanguijuela <220> <221> CDS <222> (1) . (1464) <220> <221> variación <222> (667) .. (669) <223> Xaa - Tyr o Asn <400> 2 aaa gag att gcc gtg acá att gac gat aag aat gtg att gca tet gcc 48 Lys Glu He Ala Val Thr He Asp Asp Lys Asn Val He Ala Ser Ala 1 5 10 15 agt ggg tet ttc ctt gga gtt gcc ttt gat gcg tet cta ttt tcg ccc 96 Ser Gly Ser Phe Leu Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser Pro 20 25 30 aag ggt ctt tgg age ttt gtt -gat att acc tet cea aaa ttg ttc aaa 144 Lys Gly Leu Trp Ser Phe Val Asp He Thr Ser Pro Lys Leu Phe Lys 35 40 45 ttg ctg gaa gga ctt tet cct gga tac ttc agg gtt ggc gga acg ttt 192 Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr Phe 50 55 60 gcc aat tgg ctg ttt ttt gac ttg gac gaa aat aat aag tgg aag gat 240 Ala Asn Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys Asp 65 70 75 80 tat tgg gct ttt aaa gac aaa acc ccc gaa act gcg acá ata acá agg 288 Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr A^a Thr He Thr Arg 85 90 95 aga tgg ctg ttc aga aaa caá aat aat ctg aaa aag gag act ttt gac 336 Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gln Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Phe Asp 100 105 110 aat tta gtg aaa cta acá aag gga age aag atg aga ttg tta ttc gat 384 Asn Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe Asp 115 120 125 ttg aat gcc gaa gtg agg act ggt tat gaa att gga aag aag atg acá 432 Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu He Gly Lys Lys Met Thr 130 135 140 tec act tgg gat tca tcg gag gct gaa aag tta ttt aaa tat tgt gtg 480 Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys Val 145 150 155 160 tca aaa ggt tac gga gac aat atc gat tgg gaa ctt gga aat gaa ccg 528 Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn He Asp Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro 165 170 175 gac cae acc tca gct cae aat tta act gaa aa? 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A .JX»? eJ«fcÍ< lJ His Gln Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Xaa Ser Asp Val Ser He Tyr Leu 245 250 ' 255 Asp Ala Thr Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Gln Leu Phe Asp Lys Val Lys 260 265 270 Asp Val Leu Lys Asp Ser Pro His Lys Asp Glu Pro Leu Trp Leu Gly 275 280 285 Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Asn Ser Gly Thr Glu Asp Val Ser Asp Arg 290 295 300 Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala Ala 305 310 315 320 Asn Asn Val Lys Val Val He Arg Gln Thr He Tyr Asn Gly Tyr Tyr 325 330 335 Gly Leu Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp Leu 340 345 350 Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val Asp 355 360 365 Val Ser Asp Pro Thr Asn Lys Ala Arg Val Tyr Ala Gln Cys Thr Lys 370 375 380 Thr Asn Ser Lys His Thr Gln Ser Arg Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Thr 385 390 395 400 He Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Gly Asp Val Thr Leu Lys He Gly 405 410 415 Gln Tyr Ser Gly Lys Lys He Tyr Ser Tyr He Leu Thr Pro Glu Gly 420 425 430 Gly Gln Leu Thr Ser Gln Lys Val Leu Leu Asn Gly Lys Glu Leu Asn 435 440 445 Leu Val Ser Asp Gln Leu Pro Glu Leu Asn Ala Asp Glu Ser Lys Thr 450 455 460 Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe Gly Phe Phe Val Val Ser Asp 465 470 475 480 Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys 485 <210> 4 <211> 1464 <212> ADN <213> Sanguijuela <220> <221> CDS <222> (1) .. (1464) <220> <221> variación <222> (1348) .. (1350) <223> Xaa - Val o Met <400> 4 aaa gag att gcc gtg acá att gac gat aag aat' gtg att gca tet gcc 48 Lys Glu He Ala Val Thr He Asp Asp Lys Asn Val He Ala Ser Ala 1 5 10 15 agt gag tet ttc cat gga gtt gcc ttt gat gcg tet cta ttt tcg ccc 96 Ser Glu Ser Phe His Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser Pro 20 25 30 aag ggt ctt tgg age ttt gtt gat att acc tet cea aaa ttg ttc aaa 144 Lys Gly Leu Trp Ser Phe Val Asp He Thr Ser Pro Lys Leu Phe Lys 35 40 45 ttg ctg gaa gga ctt tet cct gga tac ttc agg gtt ggc gga acg ttt 192 Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr Phe 50 55 60 gcc aat cgg ctg ttt ttt gac ttg gac gaa aat aat aag tgg aar gat 240 Ala Asn Arg Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys Asp 65 70 75 80 tat tgg gct ttt aaa gac aaa acc ccc gaa act gcg acá ata acá agg 288 Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr He Thr Arg 85 90 95 aga tgg ctg ttc aga aaa caá aat aat ctg aaa aag gag act ttt gac 336 Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gln Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Phe Asp 100 105 110 aat tta gtg aaa cta acá aag gga age aag atg aga ttg tta ttc gat 384 Asn Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe Asp 115 120 125 ttg aat gcc gaa gtg agg act ggt tat gaa att gga aag aag atg acá 432 Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu He Gly Lys Lys Met Thr 130 135 140 tec act tgg gat tca tcg gag gct gaa aag tta ttt aaa tat tgt gtg 480 Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys Val 145 150 155 160 tca aaa ggt tac gga gac aat atc gat tgg gaa ctt ggg aat gga ccg 528 Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn He Asp Trp Glu Leu Gly Asn Gly Pro 165 170 175 gac cae acc tca gct cae aat tta act gaa aag cag gtt gga gaa gat 576 Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr Glu Lys Gln Val Gly Glu Asp 180 185 190 ttt aaa gca ctg cat aaa gtt cta gag aaa tat cea act ctt aac aag 624 Phe Lys Ala Leu His Lys Val Leu Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn Lys 195 200 205 gga tcg etc gtt ggt cea gat gta ggg tgg atg ggc gtc agt tac gtc 672 Gly Ser Leu Val Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Tyr Val 210 215 220 aag gga ttg gca gac gag gca ggt gac cat gta act gct ttt acá etc 720 Lys Gly Leu Ala Asp Glu Ala Gly Asp His Val Thr Ala Phe Thr Leu 225 230 235 240 :aa tat tat ttc gat gga aac acc tet gat gta tca ata tat ctt 768 His Gln Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Thr Ser Asp Val Ser He Tyr Leu 245 250 255 gat gcc acá tac ttt aag aag ctg caá caá cta ttt gat aaa gtg aaa 816 Asp Ala Thr Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Gln Leu Phe Asp Lys Val Lys 260 265 270 gat gtt ttg aaa gat tet cea cat aaa gac aaa cea tta tgg ctt gga 864 Asp Val Leu Lys Asp Ser Pro His Lys Asp Lys Pro Leu Trp Leu Gly 275 280 285 gaa acá agt tet gga tac aac age ggc acá gaa gat gta tec gat cga 912 Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Asn Ser Gly Thr Glu Asp Val Ser Asp Arg 290 295 300 tat gtt tca gga ttt cta acá tta gac aag ttg ggt etc agt gca gcc 960 Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala Ala 305 310 315 320 aac aat gta aag gtt gtt ata aga cag acá ata tac agt gga tat tat 1008 Asn Asn Val Lys Val Val He Arg Gln Thr He Tyr Ser Gly Tyr Tyr 325 330 335 ggt ccc ctt gac aaa aac act tta gag cea aat ccg gat tac tgg tta 1056 Gly Pro Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp Leu 340 345 350 atg cat gtt cat aat tet ttg gtc gga aat acá gtt ttt aaa gtt gac 1104 Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val Asp 355 360 365 gtt agt gat cea act aat aaa gca aga gtt tac gcg caá tgt acc aaa 1152 Val Ser Asp Pro Thr Asn Lys Ala Arg Val Tyr Ala Gln Cys Thr Lys 370 375 380 acá aat age aaa cat act caá age aga tat tac aag ggc tet ttg acá 1200 Thr Asn Ser Lys His Thr Gln Ser Arg Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Thr 385 390 395 400 atc ttt gca ctt aat gtt gga gat gaa gat gta acg tta aag atc ggt 1248 He Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu Asp Val Thr Leu Lys He Gly 405 410 415 caá tac age ggt aaa aaa att tat tca tac att ctg acá cct gaa gga 1296 Gln Tyr Ser Gly Lys Lys He Tyr Ser Tyr He Leu Thr Pro Glu Gly 420 425 430 gga caá ctt acá tca cag aaa gtt etc ttg aat gga aag gaa ttg aac 1344 Gly Gln Leu Thr Ser Gln Lys Val Leu Leu Asn Gly Lys Glu Leu Asn 435 440 445 tta rtg tet gat cag tta cea caá cta aat gca gat gaa tec aaa acá 1392 Leu Xaa Ser Asp Gln Leu Pro Gln Leu Asn Ala Asp Glu Ser Lys Thr 450 455 460 tet ttc acc tta tec cea aag acá ttt ggt ttt ttt gtt gtt tec gat 1440 Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe Gly Phe Phe Val Val Ser Asp 465 470 475 480 gct aat gtt gaa gca tgy aar aar 1464 Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys 485 .. ,*¿¡ ¡sÍ,& <210> 5 <211> 488 <212> PRT <213> Sanguijuela <400> 5 Lys Glu He Ala Val Thr He Asp Asp Lys Asn Val He Ala Ser Ala 1 5 10 15 Ser Glu Ser Phe His Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser Pro 20 25 30 Lys Gly Leu Trp Ser Phe Val Asp He Thr Ser Pro Lys Leu Phe Lys 35 40 45 Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr Phe 50 55 60 Ala Asn Arg Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys Asp 65 70 75 80 Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr He Thr Arg 55 90 95 Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gln Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Phe Asp 100 105 110 Asn Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe Asp 115 120 125 Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu He Gly Xys Lys Met Thr 130 135 140 Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys Val 145 150 155 160 Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn He Asp Trp Glu Leu Gly Asn Gly Pro 165 170 175 Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr Glu Lys Gln Val Gly Glu Asp 180 185 190 Phe Lys Ala Leu His Lys Val Leu Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn Lys 195 200 205 Gly Ser Leu Val Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Tyr Val 210 215 220 Lys Gly Leu Ala Asp Glu Ala Gly Asp His Val Thr Ala Phe Thr Leu 225 230 235 240 His Gln Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Thr Ser Asp Val Ser He Tyr Leu 245 250 255 Asp Ala Thr Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Gln Leu Phe Asp Lys Val Lys 260 265 270 Asp Val Leu Lys Asp Ser Pro His Lys Asp Lys Pro Leu Trp Leu Gly 275 280 285 Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Asn Ser Gly Thr Glu Asp Val Ser Asp Arg 290 295 300 Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala Ala 305 310 315 • 320 Asn Asn Val Lys Val Val He Arg Gln Thr He Tyr Ser Gly Tyr Tyr 325 330 335 Gly Pro Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp Leu 340 345 350 Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val Asp 355 360 365 Val Ser Asp Pro Thr Asn Lys Ala Arg Val Tyr Ala Gln Cys Thr Lys 370 375 380 Thr Asn Ser Lys His Thr Gln Ser Arg Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Thr 385 390 395 400 He Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu Asp Val Thr Leu Lys He Gly 405 410 415 Gln Tyr Ser Giy Lys Lys He Tyr Ser Tyr He Leu Thr Pro Glu Gly 420 425 430 Gly Gln Leu Thr Ser Gln Lys Val Leu Leu Asn Gly Lys Glu Leu Asn 435 440 445 Leu Xaa Ser Asp Gln Leu Pro Gln Leu Asn Ala Asp Glu Ser Lys Thr 450 455 460 Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe Gly Phe Phe Val Val Ser Asp 465 470 475 480 Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys 485 <210> 6 <211> 1464 <212> ADN <213> Sanguijuela <220> <221> CDS <222> (1) .. (1464) <400> 6 aaa gag att gcc gtg acá att gac gat aag aat gtg att gca tet gtc 48 Lys Glu He Ala Val Thr He Asp Asp Lys Asn Val He Ala Ser Val 1 5 10 15 agt gag tet ttc eat gga gtt gcc ttt gat gcg tet cta ttc tcg ccc 96 Ser Glu Ser Phe His Gly Val Ala Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser Pro 20 25 30 aag ggt cct tgg age ttt gtt aat att acc tet cea aaa ttg ttc aaa 144 Lys Gly Pro Trp Ser Phe Val Asn He Thr Ser Pro Lys Leu Phe Lys 35 40 45 ttg ctg gaa gga ctt tet cct gga tac ttc agg gtt ggc gga acg ttt 192 Xeu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr Phe 50 55 60 gcc aat tgg ctq ttt ttt gac t gac gaa aat aat aag tgg aag gat 240 Ala Asn Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Asn Lys Trp Lys Asp 65 70 75 80 tat tgg gct ttt aaa gac aaa acc ccc gaa act gcg acá ata acá agg 288 Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr He Thr Arg 85 90 95 aga tgg ctg ttc aga aaa caá aat aat ctg aaa aag gag act ttt gac 336 Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gln Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Phe Asp 100 105 110 gat tta gtg aaa cta acá aag gga age aag atg aga ttg tta ttc gat 384 Asp Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe Asp 115 120 125 ttg aat gcc gaa gtg agg act ggt tat gaa att gga aag aag acg acá 432 Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu He Gly Lys Lys Thr Thr 130 135 140 tec act tgg gat tca tcg gag gct gaa aag tta ttt aaa tat tgt gtg 480 Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys Val 145 150 155 160 tca aaa ggt tac gga gac aat atc gat tgg gaa ctt gga aat gaa ccg 528 Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn He Asp Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro 165 170 175 gac cae acc tca gct cae aat tta act gaa aag cag gtt gga gaa gat 576 Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr Glu Lys Gln Val Gly Glu Asp ttc aaa gca ctg cat aaa gtt tta gag aaa tat cea act ctt aac aag 624 Phe Lys Ala Leu Hia Lya Val Leu Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn Lys 195 200 205 gga tcg ccc gtt ggt cea gat gta ggg tgg atg ggc gtc age tac gtc 672 Gly Ser Pro Val Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Tyr Val 210 215 220 aag gga ttg gca gac ggg gca ggt gac ctt gta act gct ttt acá cta 720 Lys Gly Leu Ala Asp Gly Ala Gly Asp Leu Val Thr Ala Phe Thr Leu 225 230 235 240 cae caá tat tat ttc gat gga aac acc tet gat gta tca acá tat ctt 768 His Gln Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Thr Ser Asp Val Ser Thr Tyr Leu 245 250 255 gat gcc tca tac ttt aaa aag ctg caá cag ctg ttt gat aaa gtg aaa 816 Asp Ala Ser Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Gln Leu Phe Asp Lys Val Lys 260 265 270 gat gtt ttg aaa aat tet cea cat aaa gac aaa cea tta tgg ctt gga 864 Asp Val Leu Lys Asn Ser Pro His Lys Asp Lys Pro Leu Trp Leu Gly 275 280 285 gag acá agt tet gga tgc aac age ggc acá aaa gat gta tec gat cga 912 Glu Thr Ser Ser Gly Cys Asn Ser Gly Thr Lys Asp Val Ser Asp Arg 290 295 300 tat gtt tca gga ttt cta acá tta gac aag ttg ggt etc agt gca gcc 960 Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala Ala 305 310 315 320 aac aat gta aag gtt gtt ata aga Sg acá ata tac aat gga tat tat 1008 Asn Asn Val Lys Val Val He Arg ?f» Thr He Tyr Asn Gly Tyr Tyr 325 330 335 ggt etc ctt gat aaa aac act tta gag cea aat cct gat tac tgg tta 1056 Gly Leu Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp Leu 340 345 350 atg cat gtt cae aat tet ttg gt? gga aat acá gtt ttt aaa gtt gac 1104 Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val Asp 355 360 365 gtt ggt gat cea aet aat aaa acg aga gtc tat gca caá tgt acc aag 1152 Val Gly Asp Pro Thr Asn Lys Thr Arg Val Tyr Ala Gln Cys Thr Lys 370 375 380 acá aat age aaa cae act caá ggc aag tat tac aag ggc tet ttg acá 1200 Thr Asn Ser Lys His Thr Gln Gly Lys Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Thr 385 390 395 400 atc ttt gca ctt aat gtt gga gat gaa gaa gta acg tta aag atc gat 1248 He Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu Glu Val Thr Leu Lys He Asp 405 410 415 caá tac ggc ggt aaa aaa att tat tca tac att ctg acá cct gaa gga 1296 Gln Tyr Gly Gly Lys Lys He Tyr Ser Tyr He Leu Thr Pro Glu Gly 420 425 430 gga caá ctt acá tca cag aaa gtt etc ttg aat gga aag gaa ttg aac 1344 Gly Gln Leu Thr Ser Gln Lys Val Leu Leu Asn Gly Lys Glu Leu Asn 435 440 445 tta gtg tet gat cag tta cea gaa cta aat gca gat gaa tec aaa acá 1392 Leu Val Ser Asp Gln Leu Pro Glu Leu Asn Ala Asp Glu Ser Lys Thr 450 455 460 tet ttc acc tta tec cea aag acá ttt ggt ttt ttt gtt gtt tec gat 1440 Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe Gly Phe Phe Val Val Ser Asp 46S 470 475 480 gct aat gtt gaa gca tgy aar aar 1464 Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys 485 <210> 7 <211> 488 <212> PRT <213> Sanguijuela <400> 7 Lys Glu He Ala Val Thr He Asp Asp Lys Asn Val He Ala Ser Val 1 5 10 15 Ser Glu Ser Phe His Gly Val Aia Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ser Pro 20 25 30 Lys Gly Pro Trp Ser Phe Val Asn He Thr Ser Pro Lys Leu Phe Lys 35 40 45 Leu Leu Glu Gly Leu Ser Pro Gly Tyr Phe Arg Val Gly Gly Thr Phe 50 55 60 Ala Asn Trp Leu Phe Phe Asp Leu Asp Glu Asn Xsn Lys Trp Lys Asp 65 70 75 80 Tyr Trp Ala Phe Lys Asp Lys Thr Pro Glu Thr Ala Thr He Thr Arg 85 90 95 Arg Trp Leu Phe Arg Lys Gln Asn Asn Leu Lys Lys Glu Thr Phe Asp 100 105 110 Asp Leu Val Lys Leu Thr Lys Gly Ser Lys Met Arg Leu Leu Phe Asp 115 120 125 Leu Asn Ala Glu Val Arg Thr Gly Tyr Glu He Gly Lys Lys Thr Thr 130 135 140 Ser Thr Trp Asp Ser Ser Glu Ala Glu Lys Leu Phe Lys Tyr Cys Val 145 150 155 160 Ser Lys Gly Tyr Gly Asp Asn He Asp Trp Glu Leu Gly Asn Glu Pro 165 170 175 Asp His Thr Ser Ala His Asn Leu Thr Glu Lys Gln Val Gly Glu Asp 180 185 190 Phe Lys Ala Leu His Lys Val Leu Glu Lys Tyr Pro Thr Leu Asn Lys 195 200 205 Gly Ser Pro Val Gly Pro Asp Val Gly Trp Met Gly Val Ser Tyr Val 210 215 220 Lys Gly Leu Ala Asp Gly Ala Gly Asp Leu Val Thr Ala Phe Thr Leu 225 230 235 240 His Gln Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Thr Ser Asp Val Ser Thr Tyr Leu 245 250 255 Asp Ala Ser Tyr Phe Lys Lys Leu Gln Gln Leu Phe Asp Lys Val Lys 260 265 270 Asp Val Leu Lys Asn Ser Pro His Lys Asp Lys Pro Leu Trp Leu Gly 275 280 285 Glu Thr Ser Ser Gly Cys Asn Ser Gly Thr Lys Asp Val Ser Asp Arg 290 295 300 Tyr Val Ser Gly Phe Leu Thr Leu Asp Lys Leu Gly Leu Ser Ala Ala 305 310 315 320 Asn Asn Val Lys Val Val He Arg Gln Thr He Tyr Asn Gly Tyr Tyr 325 330 335 Gly Leu Leu Asp Lys Asn Thr Leu Glu Pro Asn Pro Asp Tyr Trp Leu 340 345 350 Met His Val His Asn Ser Leu Val Gly Asn Thr Val Phe Lys Val Asp 355 360 365 Val Gly Asp Pro Thr Asn Lys Thr Arg Val Tyr Ala Gln Cys Thr Lys 370 375 380 Thr Asn Ser Lys His Thr Gln Gly Lys Tyr Tyr Lys Gly Ser Leu Thr 385 390 395 400 He Phe Ala Leu Asn Val Gly Asp Glu Glu Val Thr Leu Lys He Asp 405 410 ' 415 Gln Tyr Gly Gly Lys Lys He Tyr Ser Tyr He Leu Thr Pro Glu Gly 420 425 430 Gly Gln Leu Thr Ser Gln Lys Val Leu Leu Asn Gly Lys Glu Leu Asn 435 440 445 Leu Val Ser Asp Gln Leu Pro Glu Leu Asn Ala Asp Glu Ser Lys Thr 450 455 460 Ser Phe Thr Leu Ser Pro Lys Thr Phe Gly Phe Phe Val Val Ser Asp 465 470 475 480 Ala Asn Val Glu Ala Cys Lys Lys 485 <210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebo 5' <400> 8 atcgataaag agattgccgt gac 23 <210> 9 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebo 3' <400> 9 gttgtttccg atgctaaagc gct 23 <210> 10 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebo 5' <400> 10 accgtagcgc aggccaaaga gattgccgtg 30 <210> 11 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebo 3' <400> 11 cacggcaatc tctttggcct gcgctacggt 30 <210> 12 <211> 87 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebo 5' <400> 12 cggatccatg aaattcttag tcaacgttgc ccttgttttt atggtcgtat acatttctta 60 catctatgcg aaagagattg ccgtgac ?"> <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebo 3' <400> 13 aatgttgaag cataaggtac c 21 <210> 14 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebo 5' <400> 14 gtagaattca aagagattgc cgtgaca 27 <210> 15 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descri-pción de la secuencia artificial: cebo 3' <400> 15 gatgctaatg ttgaagcata atgagcggcc ge 32 í«i*&mm

Claims (20)

REIVINDICACIONES Habiéndose aescpto la invención co o antecede, se reclama como propiedaa lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una protema purificada aislada de sanguijuelas de la especie Hirudmaria manill ensí s con actividad biológica de una hialuronidasa que no es influenciada en su actividad por la heparina, caracterizada porque presenta un peso molecular de 53 - 60 dependiendo de la glicosilacion .

2. Una protema glicosilada de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene un peso molecular de 58 (+2) .

3. Una protema no-glicosilada de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene un peso molecular de 54 (+2) .

4. Una protema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque tiene un punto isoeléctrico de 7.2 - 8.0.

5. Una protema A de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, caracterizada porque tiene la secuencia ae aminoácidos que se indica en la Fig. 7 y SEC ID o. 1. •*-w- ,*

6. Una proteina de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 5, caracterizada porque tiene una actividad enzimatica especifica de > 100 kU/mg protema.

7. Un proceso para el aislamiento y la purificación de la protelna definida de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 6, caracterizado porque comprende las siguientes etapas (i) homogenizacion de cabezas de sanguijuelas de la especie Hirudmapa manill ensi s con un amortiguador acido y centrifugación, (n) precipitación con sulfato de amonio del sobrenadante de la etapa (i), (m) cromatografía de intercambio catiónico, (iv) cromatografía de afinidad de concanavalma A, (v) cromatografía de interacción hidrofóbica (vi) cromatografía de afinidad sobre matrices recubiertas con fragmentos de ácido hialuronico (vii) cromatografía de permeación de gel, y opclonalmente (vm) desglicosilacion enzimatica o química de la protema purificada. ?.? ¿ fará *?ÍÉihtrfMrttif

8. Una proteina con ia actividad biológica de una hialuronidasa que no es influenciada en su actividad por la heparina y que presenta un peso molecular de 53 - 60 dependiendo de la glicosilación, caracterizada porque se puede obtener por medio de las etapas del proceso de la reivindicación 7.

9. Una proteina de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque tiene una actividad enzimática de > 100 kU/mg proteina.

10. Una secuencia de ADN codificante, caracterizada porque es para una proteina de la reivindicación 1 y 9.

11. Una secuencia de ADN codificante para una proteina de la reivindicación 8, caracterizada porque comprende cualquier secuencia de nucleótidos ilustrada en la Fig. 8 (SEQ. ID No. 2), Fig. 9 (SEQ. ID No.4) y Fig. 10 (SEQ. ID NO. 6) .

12. Una proteina recombinante con la actividad biológica de una hialuronidasa, caracterizada porque es codificada por cualquiera de las secuencias de ADN de la reivindicación 11. JÉÜtÉWil " -- ^•^.><-A ^j|la^...«M.w5,.*,.

13. Una proteina recombinante con la actividad biológica de una hialuronidasa y un peso molecular de 55 -59 dependiendo de la glicosilación, caracterizada porque presenta cualquiera de las secuencias de aminoácidos ilustradas en la Fig. 8, 9 y (SEQ. ID No. 3,5,7) o una secuencia que tiene una homología con respecto a dichas secuencias de al menos 80%.

14. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende una secuencia de ADN de la reivindicación 10 u 11.

15. Una célula hospedante adecuada para la expresión de una proteina de la reivindicación 12 o 13, caracterizada porque se transformó con un vector de la reivindicación 14.

16. Una proteina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 6, 8, 9, 12 o 13 como medicamento.

17. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende la proteina de la reivindicación 16 y un diluyente, portador o excipiente del mismo farmacéuticamente aceptable .

18. Una composición farmacéutica, caracterizada porque adicionalmente comprende un compuesto farmacológicamente activo.

19. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizada porque el compuesto farmacológicamente activo es la heparina.

20. El uso de una proteina de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1 a 6, 8, 9, 12, y 13 en la preparación de un medicamento para tratar desórdenes miocardiales, cardiovasculares y trombóticos y tumores. taAai -a ii, OA*.