JP2000312587A - ガラクトース転移酵素及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 キシロースにガラクトース残基を転移するガ
ラクトース転移酵素Ｉ（ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトース：Ｄ
−キシロース β−１，４−Ｄ−ガラクトシルトランス
フェラーゼ）をコードするＤＮＡを単離し、精製された
同酵素を提供する。 【解決手段】 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド
をコードするＤＮＡ。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であ
るβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基
を転移する酵素活性を有するポリペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ガラクトース転移
酵素及びそれをコードするＤＮＡに関し、詳しくは、プ
ロテオグリカンのグリコサミノグリカン−タンパク質結
合部位の合成に関与する、ヒト由来のガラクトース転移
酵素Ｉ（ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトース：Ｄ−キシロース
β−１，４−Ｄ−ガラクトシルトランスフェラーゼ）及
びそれをコードするＤＮＡを提供する。

【０００２】

【従来の技術】複合糖質は、主に細胞表面に糖タンパク
質、糖脂質及びプロテオグリカンの糖成分として存在
し、細胞外からの成長／分化因子によって引き起こされ
る細胞シグナルに対しての、認識分子、共−受容体、及
び調節因子として働いている。

【０００３】プロテオグリカンには、異なるコアタンパ
ク質、異なる種類、数、及び長さを有するグリコサミノ
グリカン（GAGs）を含んでなる陰性電荷に富んだ様々な
種類が存在し、細胞表面のみではなく、様々な組織の細
胞外マトリックスにも存在する（The Biochemistry of
Glycoproteins and Proteoglycans (Lennarz,W.J.,ed),
pp.267-371, Plenum Publishing, New York (198
0)）。特徴的に硫酸化されたGAG鎖を含むプロテオグリ
カンの多様性は、細胞種それぞれの特定の態様によって
生じ、分化の段階におけるプロテオグリカンの厳密に調
節された発現パターンは、細胞増殖／分化（Mol.Cell.B
iochem.,1(2),211-28 (1973)）、組織の発達及び分化
（Science 260(5104),103-6 (1993)）、ウイルスやバク
テリアの感染（J.Virol.,63(1),52-8 (1989), Infect.I
mmun.,65(1),1-8 (1997)）の調節におけるプロテオグリ
カンの役割を示唆している。

【０００４】プロテオグリカンの硫酸化GAGsの生合成
は、コアタンパク質中のセリン残基へのキシロースの付
加から始まり、その後２個のガラクトース残基、そして
グルクロン酸残基の付加が連続的に起こる（The Bioche
mistry of Glycoproteins andProteoglycans (Lennarz,
W.J.,ed), pp.267-371, Plenum Publishing, New York
(1980)）。

【０００５】上述の共通の結合構造にN-アセチルグルコ
サミンが結合するか、あるいはN-アセチルガラクトサミ
ンが結合するかによって、ヘパリン／ヘパラン硫酸が形
成されるか、あるいはコンドロイチン硫酸／デルマタン
硫酸が形成されるかのいずれかが決定される。そして、
連続した個々の糖の転移は、特定の糖転移酵素によって
触媒されるが、グルクロン酸転移酵素ＩのcDNA（J.Bio
l.Chem.,273(12),6615-6618 (l998), J.Biol.Chem.,274
(12),7857-7864 (1999)）以外の遺伝子は未だに単離さ
れていない。

【０００６】また、キシロースにガラクトース残基を転
移するガラクトース転移酵素Ｉ（ＵＤＰ−Ｄ−ガラクト
ース：Ｄ−キシロース β−１，４−Ｄ−ガラクトシル
トランスフェラーゼ；EC 2.4.1.133）については、同酵
素を欠失したCHOの変異体の研究（J.Biol.Chem.,262(2
5),12189-95 (1987)）、又はデルマタン硫酸プロテオグ
リカンの生合成の遺伝的疾患の観察の臨床事例の研究
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87(4),1342-1346 (1990)）
により、その性質がある程度調べられている。また、同
酵素は、抽出、部分精製がなされているが（J.Biol.Che
m.,250(13), 5200-5207(1975)、J.Biol.Chem.,244(10),
2790-2798 (1969)）、未だ実質的に均一なまでには精
製されておらず、詳細な性質や一次構造は知られていな
い。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
らなされたものであり、キシロースにガラクトース残基
を転移するガラクトース転移酵素Ｉ（ＵＤＰ−Ｄ−ガラ
クトース：Ｄ−キシロース β−１，４−Ｄ−ガラクト
シルトランスフェラーゼ）をコードするＤＮＡを単離
し、精製された同酵素を提供することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、線虫ケノルハ
ブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）
sqv-3遺伝子を使用した発現配列タグ（EST(s): express
ed sequence tag(s)）のBLAST解析（Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA, 96(3), 974-979 (1999)）に基づき、複合糖質の
共通の結合構造（GlcAβ1,3Galβ1,3Galβ1,4Xylβ1-O-
Ser（The Biochemistry of Glycoproteins and Proteog
lycans (Lennarz,W.J.,ed), pp.267-371, Plenum Publi
shing,New York (1980)）の生合成に関与するヒトのガ
ラクトース転移酵素ＩをコードするcDNAクローンを単離
した。そして、cDNAクローン産物の基質特異性をインビ
トロで確認し、また、このcDNAを含む発現ベクターをガ
ラクトース転移酵素Ｉを欠失したチャイニーズハムスタ
ー卵巣細胞（CHO）の変異株に導入してGAGの発現回復を
確認した。かくして、前記ｃＤＮＡがガラクトース転移
酵素Ｉをコードすることを確認し、本発明を完成するに
至った。

【０００９】すなわち本発明は、下記性質を有する、ガ
ラクトース転移酵素（以下「本発明酵素」ともいう）で
ある。 （１）作用 ガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロ
ース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する。 （２）基質特異性 ガラクトース供与体から、以下の受容体にはガラクトー
ス残基を転移しない。Ｎ−アセチルグルコサミン残基、
Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、ガラクトース残基、
α−Ｄ−キシロース残基、およびグルコシルセラミド残
基。

【００１０】本発明のガラクトース転移酵素の好ましい
態様は、さらに下記の性質を有するガラクトース転移酵
素である。 （３）ミカエリス定数 約３．４ｍＭ（パラニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピ
ラノシドを受容体とした場合）

【００１１】本発明のガラクトース転移酵素の具体的態
様は、ヒト由来であるガラクトース転移酵素である。

【００１２】本発明のガラクトース転移酵素としてより
具体的には、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドで
あるガラクトース転移酵素が挙げられる。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であ
るβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基
を転移する酵素活性を有するポリペプチド。

【００１３】また本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）の
ポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下、「本発明ＤＮ
Ａ」ともいう）を提供する。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であ
るβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基
を転移する酵素活性を有するポリペプチド。

【００１４】上記ＤＮＡとして具体的には、配列番号１
において、塩基番号４１〜１０２１で表される塩基配列
を含むＤＮＡが挙げられる。さらに本発明は、前記ＤＮ
Ａを保持する組換えベクターを提供する。本発明はま
た、前記ＤＮＡ又は前記組換えベクターを宿主細胞に導
入することにより得られる形質転換細胞を提供する。宿
主細胞としては、線維芽細胞株が挙げられる。本発明は
さらに、前記形質転換細胞を培養し、該培養物中に前記
ポリペプチドを生成蓄積させ、同培養物から前記ポリペ
プチドを採取することを特徴とするガラクトース転移酵
素の製造法を提供する。また本発明は、配列番号２のア
ミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置
換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列をコード
するＤＮＡを提供する。

【００１５】以下、上記性質を有するガラクトース転移
酵素Ｉ（ＵＤＰ−Ｄ−ガラクトース：Ｄ−キシロース
β−１，４−Ｄ−ガラクトシルトランスフェラーゼ）
を、単に「ガラクトース転移酵素」又はXGalT-1という
ことがある。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
なお、以下特にことわりがない限り、Galはガラクトー
スを、GlcNAcはN-アセチルグルコサミンを、GAGはグリ
コサミノグリカンを、CHOはチャイニーズハムスター卵
巣細胞を、D-MEMはダルベッコ改変イーグル最少必須培
地を、FCSはウシ胎児血清を、PBSはリン酸緩衝生理食塩
液を、GAPDHはグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナ
ーゼを、kbはキロベースペアを、bpはベースペアを、HP
LCは高性能液体クロマトグラフィーを、NMRは核磁気共
鳴を、p-Nph-β-D-Xylはp-ニトロフェニル−β−Ｄ−キ
シロピラノシドを、XGalT-1はガラクトース転移酵素Ｉ
（UDP-D-ガラクトース：D-キシロースβ-1,4-D-ガラク
トシルトランスフェラーゼ；EC 2.4.1.133）を、それぞ
れ示す。

【００１７】＜１＞本発明酵素 本発明酵素は、下記性質を有するガラクトース転移酵素
である。

【００１８】（１）作用 ガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロ
ース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する。 （２）基質特異性 ガラクトース供与体から、以下の受容体にはガラクトー
ス残基を転移しない。Ｎ−アセチルグルコサミン残基、
Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、ガラクトース残基、
α−Ｄ−キシロース残基、およびグルコシルセラミド残
基。

【００１９】本発明のガラクトース転移酵素の好ましい
態様は、さらに下記の性質を有するガラクトース転移酵
素である。 （３）ミカエリス定数 約３．４ｍＭ（パラニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピ
ラノシドを受容体とした場合） なお、測定条件によってミカエリス定数の値が多少変化
することは当業者の常識である。従って、ここで示した
ミカエリス定数の値はあくまで指標であり、当業者にと
って実質的に同一であろうと認識される範囲のミカエリ
ス定数の値が包含されると理解されたい。

【００２０】本発明のガラクトース転移酵素として具体
的には、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドである
ガラクトース転移酵素が挙げられる。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であ
るβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基
を転移する酵素活性を有するポリペプチド。

【００２１】この中でも、（ａ）のポリペプチドが好ま
しい。なお本明細書中において、「１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であ
るβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基
を転移する酵素活性を有するポリペプチド」とは、ガラ
クトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロース
残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する活性を実質
的に害さない１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠
失、挿入又は転位を有していてもよいことを示す。

【００２２】すなわち、天然に存在するポリペプチドに
は、それをコードするDNAの多形や変異の他、生成後の
ポリペプチドの生体内および精製中の修飾反応などによ
ってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿入
又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず
変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、生
物学的活性を示すものがあることが知られている。この
ように構造的に若干の差違があってもその機能について
は大きな違いが認められないものも、本発明酵素に包含
される。人為的にポリペプチドのアミノ酸配列に上記の
ような変異を導入した場合も同様であり、この場合には
さらに多種多様の変異体を作製することが可能である。
例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ
酸配列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポ
リペプチドがインターロイキン２活性を保持することが
知られている(Science,224,1431(1984))。また、ある種
のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド領域を
有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌
されるポリペプチドに存在するシグナルペプチドや、プ
ロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列などがこれに
あたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、または活性
型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このよう
なポリペプチドは、一次構造上は異なった形で存在して
いるが、最終的には同等の機能を有するポリペプチドで
あり、本発明酵素に包含されるものである。

【００２３】なお本明細書における「数個のアミノ酸」
とは本発明酵素の活性が失われない程度の変異を起こし
てもよいアミノ酸の数を示し、例えば４００アミノ酸残
基からなるポリペプチドの場合、２０程度以下の数を示
す。

【００２４】ガラクトース供与体から、受容体であるβ
−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基を転
移する酵素活性は、後記実施例に示すように、p-Nph-β
-D-Xylへのガラクトースの転移反応を利用した測定方法
を用いることによって測定できる。よって当業者であれ
ば、本発明酵素活性の有無を指標として、該活性を実質
的に害さない１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、挿
入又は転位を容易に選択することができる。

【００２５】本発明酵素は、もともとはヒトcDNAをマウ
スの線維芽細胞であるマウスＬ細胞で発現させることに
より得られたものであるが、他の宿主を用いた遺伝子工
学的手法や化学合成等により製造されたポリペプチドも
当然に包含される。

【００２６】本発明酵素は、本発明によりそのアミノ酸
配列や性質が開示されたので、天然物からの単離・精製
や、化学合成等によって製造することも可能であるが、
後述の本発明DNAを用いて製造することが好ましい。本
発明DNAを用いた本発明酵素の製造方法については後述
する。なお本発明酵素は、必ずしも単独のポリペプチド
でなくてもよく、必要により融合タンパク質の一部とな
っていてもよい。例えば、本発明酵素のポリペプチドと
他のポリペプチド、例えばプロテインＡ、を含む融合ポ
リペプチドが例示される。

【００２７】本発明酵素は、ガラクトース供与体から、
受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラク
トース残基を転移する酵素活性を有する限り、ポリペプ
チドのみからなるものであってもよいし、糖鎖等を有し
ていてもよい。

【００２８】本発明酵素はβ−Ｄ−キシロース残基のＣ
４位にガラクトース残基を転移する作用を有しているの
で、キシロース残基のＣ４位特異的ガラクトシル化や糖
鎖等の合成に利用できる。

【００２９】＜２＞本発明ＤＮＡ 本発明ＤＮＡは、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチ
ドをコードするＤＮＡである。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であ
るβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基
を転移する酵素活性を有するポリペプチド。

【００３０】この中でも（ａ）のポリペプチドをコード
するDNAが好ましい。上記ＤＮＡとして具体的には、例
えば配列番号１において塩基番号４１〜１０２１で表さ
れる塩基配列を含むＤＮＡが例示される。

【００３１】上記配列番号１記載の塩基配列を有するDN
Aは、もともとはヒト由来のものであるが、その由来は
限定されず遺伝子工学的手法や化学合成等により製造さ
れたDNAも当然に包含される。なお、遺伝暗号の縮重に
よる異なった塩基配列を有するDNAも本発明DNAに包含さ
れることは、当業者であれば容易に理解されるところで
ある。

【００３２】本発明DNAには、本発明DNAに相補的なDNA
又はRNAも包含される。さらに本発明DNAは、本発明酵素
をコードするコード鎖のみの一本鎖であってもよく、こ
の一本鎖およびこれと相補的な塩基配列を有するDNA鎖
またはRNA鎖からなる二本鎖であってもよい。

【００３３】本発明ＤＮＡは、後記実施例に示すよう
に、線虫ケノルハブディティス・エレガンス（C. elega
ns）のsqv-3遺伝子の、動物細胞におけるホモログをデ
ータ・ベース検索し、見出されたヒト発現配列タグ（ex
pressed sequence tag）に相当するヒトｃＤＮＡとして
単離されたものであり、XGalT-I遺伝子と命名した。

【００３４】具体的には、前記タグに基づいて作製した
オリゴヌクレオチド、例えば配列番号３及び４に示す塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用
い、ヒト由来のmRNA又はcDNAライブラリーを鋳型とする
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（PCR）を行
い、本発明ＤＮＡの一部を取得する。次に、得られたＤ
ＮＡの塩基配列に基づいて、5'RACEにより5'-末端領域
を取得する。その際に用いられるプライマーとしては、
配列番号５及び６に示す塩基配列を有するオリゴヌクレ
オチドが挙げられる。

【００３５】上記のようにして得られる増幅産物をプロ
ーブに用い、ヒトcDNAライブラリーをハイブリダイゼー
ションによりスクリーニングすると、本発明ＤＮＡを含
むクローンが得られる。

【００３６】上記のようにして得られる本発明ＤＮＡの
塩基配列の一例を、配列表の配列番号１に、アミノ酸配
列のみを配列番号２に示す。本発明ＤＮＡは、上記のよ
うにして得られたものであるが、本発明ＤＮＡの塩基配
列が明らかになったので、同塩基配列に基づいて作製し
たオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲによっ
てヒト由来mRNAもしくはcDNAライブラリー、または染色
体ＤＮＡから、あるいは前記塩基配列にもとづいて作製
したオリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイ
ゼーションによりcDNAライブラリーまたは染色体ＤＮＡ
ライブラリーから、単離することもできる。前記プライ
マーとしては、配列番号７及び８に示す塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドが挙げられる。

【００３７】尚、染色体ＤＮＡから本発明ＤＮＡを得た
場合には、イントロンを含むことが予想されるが、その
ようなイントロンを含むＤＮＡであっても、本発明ＤＮ
Ａに包含される。

【００３８】本発明ＤＮＡは、ガラクトース供与体か
ら、受容体であるβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガ
ラクトース残基を転移する酵素活性を有するポリペプチ
ドをコードする限り、配列表の配列番号１に記載の塩基
配列のうち、少なくとも塩基番号４１〜１０２１からな
る塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズするＤＮＡであってもよい。ここでいう「ストリンジ
ェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが
形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件
をいう（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning A L
aboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harb
or Laboratory Press (1989)等参照）。

【００３９】本発明ＤＮＡを導入した細胞を、好適な培
地で培養し、本発明ＤＮＡがコードするポリペプチドを
培養物中に生成蓄積させ、その培養物から同ポリペプチ
ドを採取することによって、本発明酵素を製造すること
ができる。

【００４０】本発明ＤＮＡを導入した細胞は、公知の発
現ベクターに本発明ＤＮＡの断片を挿入して組換プラス
ミドを構築し、この組換プラスミドを細胞に移入するこ
とによって得ることができる。ここで用いる本発明DNA
は、本発明DNAである限りにおいて特に限定されない
が、配列番号１における塩基番号４１〜１０２１で表さ
れる塩基配列を含むDNAが好ましい。

【００４１】細胞としては、大腸菌等の原核細胞や、哺
乳類細胞等の真核細胞が例示される。大腸菌などの原核
細胞を用いた際は、本発明ＤＮＡの発現によって生じる
ポリペプチドに糖鎖の付加が起こらないため、糖鎖が付
加されていない本発明酵素を得ることが可能であり、ま
た、哺乳類細胞等の真核細胞を用いた場合は、本発明Ｄ
ＮＡの発現によって生じるポリペプチドに糖鎖が付加し
うるため、糖鎖を含むポリペプチドの形態で得ることも
可能である。

【００４２】本発明を導入する宿主細胞として具体的に
は、例えばマウスの線維芽細胞であるＬ細胞が挙げられ
る。また、ベクターとしては、pcDNA3発現ベクター(イ
ンビトロジェン(Invitrogen)社)、pMIKneo、pCD-SA等が
挙げられる。培地や培養条件は、用いる宿主すなわち細
胞に合わせて適宜選択される。

【００４３】本発明ＤＮＡは直接発現させてもよいし、
他のポリペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させ
てもよい。また、本発明ＤＮＡは全長を発現させてもよ
いし、一部を部分ペプチドとして発現させてもよい。

【００４４】本発明ＤＮＡを宿主細胞に導入する方法と
しては、例えば、DEAE-デキストラン法(DEAE-dextran m
ethod)（J.Biol.Chem.,267, 12082-12089 (1992)）を用
いてトランスフェクションを行う方法がある。

【００４５】培養物からの本発明酵素の採取は、公知の
ポリペプチドの抽出、精製方法によって行うことができ
る。なお培養物には、培地および当該培地中の細胞が包
含される。

【００４６】本発明酵素の抽出方法として具体的には、
窒素キャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイ
ズ、ガラスビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、
凍結融解法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、
またはこれらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。

【００４７】本発明ＤＮＡを発現させると、本発明酵素
は細胞の膜画分に局在する。また、本発明ＤＮＡを、本
発明酵素の一部、例えばN-末端の53アミノ酸を欠く本発
明酵素と他のポリペプチドとの融合タンパク質として、
可溶性の形態で発現させると、同融合タンパク質は細胞
質中に局在する。尚、N-末端の53アミノ酸を欠く本発明
酵素をコードするＤＮＡは、配列番号９及び１０に示す
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとす
るＰＣＲによって、ヒト由来mRNAもしくはcDNAライブラ
リー、または染色体ＤＮＡから単離することができる。

【００４８】抽出液からの本発明酵素の精製方法として
具体的には、例えば硫酸アンモニウム(硫安)や硫酸ナト
リウム等による塩析、遠心分離、透析、限外濾過法、吸
着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィー、電気泳動法等や、これら
の組み合わせ等の処理操作が挙げられる。

【００４９】精製されたポリペプチドのアミノ酸配列、
作用、基質特異性等を分析し、前記＜１＞で説明した本
発明酵素の物性と比較することにより、本発明酵素の製
造が確認できる。

【００５０】本発明によりクローニングされたXGalT-I
遺伝子は、線虫ケノルハブディティス・エレガンス（C.
elegans）のsqv-3遺伝子を使用した発現配列タグのBLA
ST解析により、β4-ガラクトース転移酵素ファミリーに
属するであろうと考えられた。sqv-3遺伝子は、C. eleg
ansの糖質の一部を合成する、保存された糖質付加経路
の構成要素をコードする一遺伝子として特定された遺伝
子であり、陰門の陥入に必要な遺伝子である（Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA, 96(3), 974-9 (1999)、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA, 96(3),968-73 (1999)）。

【００５１】ところで、sqv-3は、ほ乳類及びニワトリ
のβ4-ガラクトース転移酵素とのアミノ酸配列の相同性
から、ガラクトースβ1,4-N-アセチルグルコサミンの結
合を形成するβ1,4ガラクトース転移酵素であると考え
られていた（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96(3), 974-9
(1999))。しかし、XGalT-I遺伝子から予測されたアミノ
酸配列は、他のほ乳類のβ4-ガラクトース転移酵素より
もsqv-3と高い相同性を有していることから、XGalT-I遺
伝子は、糖脂質や糖タンパク質中のGal-β-1,4GlcNAc
（又はGlc）構造の合成に関与する公知のβ4-ガラクト
ース転移酵素とは異なるβ4-ガラクトース転移酵素をコ
ードしていると考えられた。そして予測されたとおり、
XGalT-I遺伝子は、プロテオグリカンのグリコサミノグ
リカンとタンパク質の結合部の生合成に関与するガラク
トース転移酵素Ｉをコードしていることが基質特異性の
分析によって明らかとなった。本発明は、グリコサミノ
グリカンの生合成に関与するβ4-ガラクトース転移酵素
の遺伝子をクローニングした初めての例である。

【００５２】また、種々の組織におけるXGalT-I遺伝子
の発現をノザンブロッティングにより解析したところ、
遍在的な発現パターンを示した。このことは、同遺伝子
産物は普遍的な重要性を有していることを示唆してい
る。細胞増殖におけるプロテオグリカンの発現促進及び
抑制効果が明らかとされているため（Cell,64(4), 841-
8 (1991)、Science, 252(5013),1705-8 (1991)、Cell,8
3(3),357-60 (1995)）、プロテオグリカンのGAGの役割
の重要性がますます認識されてきている。C. elegansに
おけるsqv-3遺伝子の欠失の所見は、ほ乳類組織におけ
る形態形成及び成長におけるその対応遺伝子産物の特別
な重要性を強く示唆している。従って、C. elegansの遺
伝子及びほ乳類の糖鎖生物学的研究の連携により、プロ
テオグリカンのGAGの生物学的重要性及び機能的メカニ
ズムのより深い理解が促進されることが期待される。

【００５３】また、XGalT-I遺伝子は、早老症（progero
id syndrome）患者において、その遺伝子の異常が報告
されており（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 87(4),1342-134
6 (1990)）、本発明ＤＮＡは、このような疾患の遺伝子
治療のツールとして利用できることが期待される。ま
た、本発明ＤＮＡ、例えば配列番号２のアミノ酸配列に
おいて、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入
もしくは転位したアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、
上記のような遺伝子疾患の検出等に利用できることが期
待される。

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。

【００５４】はじめに、以下の実施例で用いた試薬及び
細胞について説明する。UDP-Gal、p-ニトロフェニル-β
-D-キシロピラノシド(p-Nph-β-D-Xyl)、p-ニトロフェ
ニル-β-D-ガラクトピラノシド(p-Nph-β-D-Gal)、p-ニ
トロフェニル-N-アセチル-β-D-ガラクトサミニド(p-Np
h-β-D-GalNAc)、p-ニトロフェニル-N-アセチル-β-D-
グルコサミニド(p-Nph-β-D-GlcNAc)およびp-ニトロフ
ェニル-α-D-キシロピラノシド(p-Nph-α-D-Xyl)は、シ
グマ(Sigma；St.Louis, MO)より購入した。また、[α-
³²P]dCTPはICN(Costa Mesa, CA)より購入した。ヘパラ
ン硫酸に特異的なモノクローナル抗体(HepSS-1)は、生
化学工業株式会社より購入した。

【００５５】以下の実施例に用いたマウスの線維芽細胞
であるＬ細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞
(CHO-K1)は、7.5％ウシ胎児血清(FCS)を添加したD-MEM
（Dulbecco's modified Eagle minimum essential medi
um）中で、37℃、５％ CO₂条件下で生育させた。Ｌ細胞
は、Memorial Sloan Kettering Cancer CenterのA.Albi
no博士より恵与された。CHO変異株pgsB-761（ガラクト
ース転移酵素Ｉ-欠損）（J.Biol.Chem.,262(25),12189-
95 (1987)）は、アメリカン・タイプカルチャー・コレ
クション（American Type Culture Collection）より入
手し、10％ FCSを添加したF-12K培地（Life Technologi
es, Inc.）中で生育させた。

【００５６】

【実施例１】ヒト・ガラクトース転移酵素(XGalT-1)遺
伝子のクローニング （１）線虫sqv-3遺伝子に対するホモログの検索 線虫ケノルハブディティス・エレガンス（C. elegans）
において、sqv-3は、ヒトや脊椎動物のβ1,4 ガラクト
ース転移酵素（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96(3), 974-9
(1999)）群ファミリーのアミノ酸配列に類似してお
り、陰門の陥入や卵母細胞の分化に必要であると報告さ
れている（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 96(3),968-73 (19
99)）。動物細胞における sqv-3遺伝子の類似体を見出
すために、ケノルハブディティス・エレガンスsqv-3遺
伝子のコード配列（GenBank, accession number AJ0058
67）から推定されるアミノ酸配列について、データ・ベ
ース検索を行った。データ・ベース検索は、The Nation
al Center for Biotechnology Information(NCBI)の発
現配列tag（expressed sequence tag）データ・ベース
（dbEST）に対し、tBLASTnアルゴリズムを用いて行っ
た。その結果、４つのヒト発現配列tag（GenBank, acce
ssion number AI040029, AA100869, AA442547およびT82
170）が見つかった。

【００５７】（２）sqv-3ヒトホモログｃＤＮＡの単離 見い出されたtagに相当するｃＤＮＡを単離するため
に、下記塩基配列を有するプライマーを合成し、ヒト大
腸癌細胞株 Lovoから調製した全RNAを鋳型として用いた
逆転写ポリメラーゼ・チェイン・リアクションを行っ
た。ＰＣＲは、以下の条件：94℃で１分間、次いで（94
℃で１分間、55℃で１分間、72℃で１分間）を２５サイ
クル、次いで72℃で１分間、で行った。

【００５８】（センスプライマー） 4GT5GSP1 5'-GGCATCCTGCTGCTCTCCAA-3'（配列番号３）
（配列番号１において塩基番号644-663に相当) （アンチセンスプライマー） 4GT3GSP1 5'-GCCACTCCACATCCTGTCAG-3'（配列番号４）
（配列番号１において塩基番号1126-1107に相当）

【００５９】その結果、重複するいくつかの部分長cDNA
クローンが得られた。これらのうち、583塩基対のcDNA
は、pCR 2.1-TOPOベクター（Invitrogen, San Diego, C
A）にクローン化した。

【００６０】次に、上記ｃＤＮＡの5'-末端領域を取得
するために、5'RACEキット（Life Technologies, In
c.）を用い、同キットの説明書に従って、RACE（rapid
amplification of cDNA ends）を行った。すなわち、ヒ
トLovo細胞株由来の0.4μgの全RNAと、配列番号５に示
す塩基配列（5'-CAGGTGGCGAAATGTCTT-3'、配列番号１に
おいて塩基番号814-797に相当）からなる遺伝子特異的
プライマー１（gene-specific primer 1；GSP1）を用い
て、最初のcDNA鎖合成を行った。続いて、Nested PCR
を、アダプタープライマーと、配列番号６に示す塩基配
列（5'-CCCCAGAAGCGGTTGGACAT-3'、配列番号１において
塩基番号708-689に相当）からなる遺伝子特異的プライ
マー２（gene-specific primer 2；GSP2）を用いて行っ
た。その結果、Kozakの規則（Cell, 44, 283-292 (198
6)）に適合する開始コドンを有する、679bpの断片が得
られた。

【００６１】（３）ハイブリダイゼーションによるヒト
cDNAライブラリーのスクリーニング 上記のようにして得られた5'RACE産物（配列番号１にお
いて塩基番号29-687に相当）を、Megaprime^TM DNAラベ
リングシステム（Megaprime^TM DNA labeling system；A
mersham）を用いて³²P-ラベルし、ヒトメラノーマ細胞
株SK-MEL-37（Sloan-Kettering Cancer CenterのL. J.
Old博士より恵与）cDNAライブラリーのスクリーニング
に用いた。SK-MEL-37細胞cDNAライブラリー由来の約4×
10⁵のEscherichia coli MC1061/P3を、コロニーハイブ
リダイゼーションによりスクリーニングした。コロニー
ハイブリダイゼーションは、GeneScreen Plus membrane
（NEN）を用いて行った。その結果、５個の独立した陽
性クローンが得られた。

【００６２】上記の陽性クローンからｃＤＮＡを取り出
し、ABI PRISM 310遺伝子解析装置(ABI PRISM 310 Gene
tic Analyzer(Applied Biosystems)を用いて、ジデオキ
シ・ターミネーション法（dideoxy termination metho
d）により塩基配列を決定したところ、３個のクローン
は全オープンリーディングフレームを含んでいた。決定
された塩基配列及び同塩基配列によってコードされるア
ミノ酸配列を配列表の配列番号１に、アミノ酸配列のみ
を配列番号２に示す。AUG開始コドンの位置はコザック
（Kozak)のコンセンサス配列（Cell, 44, 283-292 (198
6)）に従って決定された。

【００６３】こうしてクローニングされた遺伝子を、XG
alT-1遺伝子と命名した。同遺伝子は、327アミノ酸から
構成されるタンパク質をコードし、その分子量は37,405
ドルトンと計算された。

【００６４】上記タンパク質には、一つの強力なN-リン
ク糖鎖結合部位が存在している。KyteとDoolittle 法
（J.Mol.Biol.,157, 105-132 (1982)）によって決定さ
れた疎水性（hydropathy）は、アミノ末端部位の（Val
³¹-Ala⁵⁸）に渡る28アミノ酸残基の顕著な疎水性領域が
一カ所あることを示しており、今までクローニングされ
てきた多くの他の糖転移酵素と同様に、２型膜貫通構造
を持つタンパク質と推定された（図１）。

【００６５】同定されたcDNAの一次構造と、ヒトβ4-ガ
ラクトース転移酵素Ｉ（β4GalT-1）と略記；GenBank a
ccession number X14085）（Biochem.Biophys.Res.Comm
un.,157(2), 657-63 (1988)）の構造を比較すると、327
アミノ酸のうち82残基（25%）が同一であることが明ら
かとなった。同様な結果は、この新しくクローン化され
た遺伝子とこれまでクローン化されてきた他のヒトβ4-
ガラクトース転移酵素（β4GalT-II,III,IV,V,and VI）
（J.Biol.Chem.,272(51), 31979-91 (1997) 、J.Biol.C
hem.,273(45),29331-40 (1998)、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA, 95(2), 472-7 (1998)）、J.Biol.Chem.,273(22),13
570-7 (1998)、Glycobiology 8(5),517-26 (1998)）と
の間にも見出された。対照的に、この遺伝子は、線虫の
sqv-3遺伝子と38%のホモロジー（327アミノ酸中127残
基）を有していることは、この遺伝子がヒトにおけるsq
v-3のオーソログ（異なる種における対応する遺伝子。
進化的に同じ起源を持ち、同様な構造と機能を持つ他の
種の遺伝子）であることを示唆してる。これらの結果
は、この新しくクローン化された遺伝子産物がβ4-ガラ
クトース転移酵素遺伝子ファミリーの新規な一員である
ことを示している。

【００６６】

【実施例２】ヒト・ガラクトース転移酵素（XGalT-1）
の製造及び性質 ＜１＞XGalT-1遺伝子産物の酵素活性 （１）XGalT-1発現ベクターの構築 ヒトsqv-3オーソログであるガラクトース転移酵素の活
性を測定するために、前記のクローン化されたcDNAをL
細胞に導入し、発現産物を調製した。

【００６７】まず、前記cDNAを発現させるための発現ベ
クターを、次のようにして構築した。XhoI部位を有する
5'プライマー 5'-CTCGAGACGATGTTCCCCTCGCGGAGG-3'（配
列番号７）(配列番号１において塩基番号38-58に相
当)、及び、SpeI部位を有する3'プライマー 5'-TCTAGAA
GCTCAGCTGAATGTGCACCA-3'（配列番号８）（配列番号１
において塩基番号1027-1007に相当）をプライマーと
し、クローニングされたcDNA断片を鋳型に用いたPCRに
より、XGalT-1のオープンリーディングフレームをコー
ドするcDNA断片を調製した。PCR産物を、pMIKneoベクタ
ー（東京医科歯科大学の丸山 和夫博士より恵与）のXh
oI部位およびSpeI部位に挿入し、XGalT-1発現ベクターp
MIKneo-XGalT-1を得た。尚、pMIKneoは、マーカーとし
てネオマイシン耐性遺伝子を含み、SRαプロモーターを
含んでいる。

【００６８】次に、N-末端の53アミノ酸を欠くXGalT-1
を発現させるための発現ベクターを、以下のようにして
構築した。EcoRI部位を有する5'プライマー 5'-CAGCTCG
AATTCTCTGGGGACGTGGCCCGG-3'（配列番号９）（配列番号
１において塩基番号200-217)、及び、XhoI部位を有する
3'プライマー 5'-TGTCCACTCGAGTCAGCTGAATGTGCACCA-3'
（配列番号１０）（配列番号１において塩基番号1024-1
007に相当）をプライマーとし、クローニングされたcDN
A断片を鋳型に用いたPCRにより、N-末端の53アミノ酸を
欠くXGalT-1をコードするＤＮＡ断片を調製した。PCR産
物をEcoRIとXhoIで消化し、pCD-SAベクター（理化学研
究所の辻 崇一博士より恵与）のこれらの制限酵素部位
にサブクローニングし、pCDSA-XGalT-1を得た。pCD-SA
ベクターは、SRαプロモーターを含んでいる。pCD-SAの
EcoRIとXhoIに挿入されたＤＮＡ断片は、同プロモータ
ーによりプロテインＡ（protA）との融合タンパク質と
して発現する。

【００６９】（２）XGalT-1遺伝子産物の調製 (i)不溶性のXGalT-1（膜画分）の調製 トランスフェクションの少なくとも48時間前に、マウス
の線維芽細胞であるマウスＬ細胞3×10⁶個を10cmのディ
ッシュにまいた。DEAE-デキストラン法(DEAE-dextran m
ethod)（J.Biol.Chem.,267, 12082-12089 (1992)）によ
り、XGalT-1遺伝子発現ベクターpMIKneo-XGalT-1(4μg)
をＬ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトし
た細胞を、7.5％ FCSを含有するD-MEM中で48時間培養し
た後、トリプシンで細胞をはがして回収した。得られた
細胞をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄後、1mM フ
ェニルメチルスルフォニルフルオリド(PMSF)を含有する
氷冷したPBS中で、窒素キャビテーション装置（nitroge
n cavitation apparatus；Parr Instrument Co.）を用
いて400psi、30分間、細胞溶解させた（Cancer Res.,4
9, 6258-6264 (1989)）。低速遠心により核を除去し、
上清を４℃、100,000gで１時間遠心分離した。沈殿物を
氷冷した100mM カコジル酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)に
再懸濁させた。

【００７０】上記のようにして得られた細胞溶解抽出液
を、 UDP-[¹⁴C]Galを供与体とし、いろいろな受容体基
質を使ったガラクトース転移酵素活性の測定に供した。
ガラクトース転移酵素活性は、Lugemwaらの方法（J.Bio
l.Chem., 271(32),19159-65(1996)）を若干改変して行
った。アッセイ混合液(25μl)は、1μlのMe₂SO、15mMMn
Cl₂、50mM KCl、1％ Triton X-100、100mM MES緩衝液(p
H6.0)、0.6mM UDP-Gal、5,000dpm/μl UDP-[¹⁴C]Gal（D
u Pont-New England Nuclear）、1μgの酵素溶液及び2m
Mの基質を含有する。37℃で30分間インキュベートした
後、1mlの水を添加することにより反応を終了させ、Sep
-Pak C₁₈カートリッジ(Waters)にアプライした。カート
リッジを10mlの水で洗浄し、5mlのメタノールで溶出さ
せた。メタノール溶出液中の[¹⁴C]Galの量は、液体シン
チレーションカウンター(Beckman)で測定した。結果を
表１に示す。活性は、１分間当りに1mgの酵素タンパク
質が転移するGalの量(nmol)で示した。

【００７１】

【表１】 表１ ────────────────────────────── カ゛ラクトース転移酵素活性(nmol/mg/min) 基質 ──────────────────── 偽遺伝子(mock) pMIKneo-XGalT-1 ────────────────────────────── p-Nph-β-D-GlcNAc 0.5 0.1 p-Nph-β-D-GalNAc 0.1 0.0 p-Nph-β-D-Gal 0.0 0.0 p-Nph-β-D-Xyl 0.0 0.5 p-Nph-β-D-Xyl 0.0 19.3 GlcCer 0.3 0.1 ──────────────────────────────

【００７２】その結果、グリコサミノグリカン糖鎖形成
のプライマーである、p-Nph-β-D-Xylに対しては確実な
転移酵素活性がみられた。しかし、通常糖タンパク質や
糖脂質でガラクトース転移酵素の基質となるはずのp-Np
h-β-D-GlcNAcを含む、他の全ての基質は、全く受容体
とならなかった。尚、XGalT-1の代わりに偽遺伝子(moc
k)を導入した細胞からの抽出液ではほとんど酵素活性を
示さなかった。

【００７３】p-Nph-β-D-Xyl基質でのおおよそのKm値は
3.4 mMであった。これらの結果は発現タンパク質がガラ
クトース転移酵素Ｉ（UDP-D-ガラクトース: D-キシロー
スβ-1,4-D-ガラクトシルトランスフェラーゼ; EC 2.4.
1.133)（J.Biol.Chem.,250(13), 5200-7 (1975)）であ
ることを示唆している。同様な結果は、下記の可溶性の
融合酵素（XGalT-1-protA）によっても得られている。

【００７４】(ii)可溶性のXGalT-1の調製 上記と同様にして、DEAE-デキストラン法により、pCDSA
-XGalT-1（4μg）をＬ細胞(10cmディッシュ)にトランス
フェクトし、7.5％ FCSを含有するD-MEM中で16時間培養
した。その後、培地を無血清ITS（インスリン、トラン
スフェリン及び亜セレン酸）培地（Becton Dickinson）
に置換し、さらに32時間培養した。トランスフェクショ
ンの48時間後に培養培地を回収し、Molcut-L（ミリポ
ア）を用いて100倍に濃縮し、100mM カコジル酸ナトリ
ウム緩衝液(pH6.0)に対して透析し、可溶性酵素（XGalT
-1-protA）溶液を得た。

【００７５】NMR分析用のサンプルを調製するために、
可溶性酵素をIgG-セファロース（Amersham Pharmacia B
iotech）を用いてさらに精製し、酵素が結合したビーズ
を酵素源として用いた。具体的には、100倍に濃縮した
培養培地25μlを、IgG-セファロース 10μlと共に４℃
で一晩インキュベートした。遠心により回収したビーズ
を100mM MES緩衝液(pH6.0)で洗浄し、この緩衝液に再懸
濁させた。

【００７６】＜２＞XGalT-1反応産物の解析 ガラクトース転移酵素反応生成物を同定するために、可
溶性融合酵素 XGalT-1-protAを酵素源として用い、p-Np
h-β-D-Xylを[¹⁴C]Galでアイソトープラベルした。生成
した標識産物[¹⁴C]Galβ1-4Xylβ1-p-Nph １μgを、50m
M Tris-HCl(pH7.3)、50mM NaClおよび20μgのβ-ガラク
トシダーゼ（E. coli由来；BoehringerMannheim）を含
有する200μlの溶液に溶解し、37℃で７時間インキュベ
ートした。その結果、前記標識産物の99%以上は分解さ
れた。

【００７７】一方、前記標識産物[¹⁴C]Galβ1-4Xylβ1-
p-Nphを、結合様式に特異的なβ-ガラクトシダーゼを用
いて処理した。具体的には、100mM NaClおよび100μg/m
l BSAを含有する50mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH6.
0）100μl中で、1μgの標識産物を20mUのdiplococcal
（双球菌由来）β-ガラクトシダーゼ(Boehringer Mannh
eim)で、37℃、23時間消化することにより行った。消化
産物を1mlの水で希釈して、上述のようにSep-Pak C₁₈カ
ートリッジを用いて分離し、放射活性を液体シンチレー
ションカウンターで測定した。その結果、標識産物は、
末端β-1,4ガラクトース結合構造の加水分解を特異的に
触媒するdiplococcalβ-ガラクトシダーゼ分解でも完全
に切断された。

【００７８】上記の結果は、XGalT-1-protA融合タンパ
ク質が、UDP-Galからガラクトースをβ-1,4結合構造を
持つ受容体への転移を触媒することを示している。

【００７９】＜３＞XGalT-1反応産物の構造決定 反応生成物のβ-1,4-結合を確定するために、酵素源と
してIgG-Sepharoseに固定化したXGalT-1-protA融合タン
パク質を用い、反応産物を大量に調製した。

【００８０】50μlの酵素結合IgG-セファロース、2.7mg
のp-Nph-β-D-Xyl、10μlのMe₂SO、15mM MnCl₂、50mM K
Cl、1% Triton X-100、100mM MES緩衝液（pH6.0）およ
び75mM UDP-Galを含有する250μlの混合液中で反応を行
った。反応物の生成は、エタノール／ピリジン／n-ブタ
ノール／酢酸／水(100：10：10：3：30)の溶媒系を用い
た高速薄層クロマトグラフィーによりモニターし、終了
するまで24時間行った。反応産物は、上述のようにSep-
Pak C₁₈カートリッジを用いて精製し、さらにDevelosil
ODS HG-5カラム（4.6mmφx250mm；Nomura Chemical）
を用いたHPLC（Jasco 880-PUポンプおよびMD915検出器
を使用）により精製した。カラムへの過剰負荷を避ける
ため、４回に分けてサンプルを負荷した。溶出は300nm
の吸光度によりモニターした。溶離液として10％アセト
ニトリル水溶液(溶液Ａ)と30％アセトニトリル水溶液
(溶液Ｂ)を用い、次の濃度勾配により行った。なお流速
は1ml/分、温度40℃で行った。

【００８１】 0〜 2分 溶液Ｂの0％〜30％の直線濃度勾配 2〜30分 溶液Ｂ30％で保持 30〜40分 溶液Ｂの30％〜100％の直線濃度勾配

【００８２】主要な産物を含む画分を回収し、NMRによ
る解析に用いた。NMRによる解析の前に、サンプルをD₂O
(99.9 atom ％ D)に溶解し、減圧乾燥し、最終的に600
μlのD ₂O(99.96 atom％ D)に溶解した。

【００８３】プロトン核磁気共鳴（¹H NMR）スペクトル
(600 MHz)は、JEOL JMNα-600（日本電子製）を用い
て、25℃で測定した。D₂Oを測定溶媒、t-ブタノール(δ
1.23)を内部標準とし、1D、1D-HOHAHA、NOE差スペクト
ルおよびCOSYはppmで記録した。FABMSデータは、m-ニト
ロベンジルアルコールをマトリックスとして用い、JEOL
MSTATION（日本電子製）を用いて記録した。

【００８４】FAB MS（高速原子衝撃質量分析）によっ
て、434m/z(M+1)と456m/z(M+Na⁺)でのシグナルから、そ
の生成物の分子量は433であると決定された。これは、
出発物質Xylβ1-p-Nphのガラクトース結合生産物と帰属
できる。

【００８５】¹H-NMR スペクトルは、p-ニトロフェニル
部分と２個のグリコシル残基（の存在を）示した。糖成
分の全てのシグナルは、それぞれのアノマー位のシグナ
ル（δ=4.49とδ=5.25）で照射した1D-HOHAHAスペクト
ルとCOSYによって同定された（図２）。p-Nph-β-D-Xyl
部分の構造は出発分子のスペクトルとの比較から確定さ
れた。ガラクトース残基の（スピン）結合定数(J_1,2=7.
7 Hz, J_2,3=9.9 Hz, J _3,4=3.7 Hz, J_4,5=0 Hz)は、この
ガラクトシドがβ-ピラノシドであることを示してい
る。ガラクトシドの結合はNOE差スペクトルによって決
定された。Gal H1への照射により、強いNOE（相互作
用）がXyl H-4, GalH-3及びGal H-5位で観測され、また
Xyl H-4への照射により、Gal H-1（スペクトル）が強
く増加された。これらのことから、生成物の構造はGal
β1-4Xylβ1-p-Nph（Eur.J.Biochem.,247(3),1083-90
(1997)）であることが示された。

【００８６】＜３＞グリコサミノグリカン欠損変異細胞
におけるクローン化XGalT-1によるグリコサミノグリカ
ン合成の回復 本発明の酵素が、in vivoにおいてグリコサミノグリカ
ンの生合成に関わっていることを確認するために、変異
CHO細胞 pgsB-761（ガラクトース転移酵素Ｉ-欠損）
に、pMIKneo-XGalT-1を一過性に導入（トランスフェク
ト）した。そのトランスフェクト細胞を、ヘパラン硫酸
に特異的なHepSS-1モノクローナル抗体で染色後、フロ
ーサイトメーターで分析した。

【００８７】2×10⁶個のCHO pgsB-761細胞を10cmディッ
シュにまき、翌日、45μlのLipofectamine^TM試薬（Life
Technologies, Inc.）を用い、その試薬の説明書に従
って10μgのプラスミドDNAをトランスフェクトした。３
日後、細胞を0.5mM EDTAおよび0.25％トリプシンを含有
するPBSではがし、約1×10⁶個の細胞を、1:25に希釈し
たHepSS-1モノクローナル抗体（40μg/ml）と共に、氷
中で30分間インキュベートした。２回洗浄した後、1:20
0に希釈した、フルオレセインイソチオシアネート(FIT
C)結合ヤギ抗マウスIgM(μ鎖特異的)(Zymed Laboratori
es)で細胞を染色した。氷中で30分間インキュベートし
た後、細胞を２回洗浄し、Cell Quest^TMバージョン3.1f
ソフトウエアを用いたFACSCalibur(Becton Dickinson)
によって解析した。

【００８８】その結果、約50%の細胞がモノクローナル
抗体HepSS-1によって染色されるが、偽遺伝子(mock)を
導入した細胞は陰性であった（図３）。このことは、本
発明のＤＮＡは、グリコサミノグリカン鎖形成を促進す
るガラクトース転移酵素Ｉをコードする遺伝子であるこ
とを示している。

【００８９】＜４＞各種組織におけるXGalT-1遺伝子の
発現の解析 XGalT-1の遺伝子発現を解析するために、cDNAの全長フ
ラグメントをプローブとして使い、ノーザンブロット解
析を行った。

【００９０】Human Multiple Tissue Northern Blot^TM
（Clontech Laboratories）を用い、その説明書に従っ
て、ゲル精製した[α-³²P]dCTP-標識XGalT-1 cDNA、ま
たはグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
(GAPDH)をプローブとして、各種ヒト成人組織（心臓、
脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓）由来のポリ
A⁺ RNAに対してノーザンブロッティングを行った。ブロ
ットをイメージングプレートに露出させ、BAS2000イメ
ージングアナライザー(富士写真フィルム)で解析した。

【００９１】その結果、XGalT-1遺伝子は、調べた限り
の全てのヒト組織に発現しており、1.8 kbの転写産物
（mRNA）が検出された。

【００９２】

【発明の効果】本発明酵素は、プロテオグリカンやグリ
コサミノグリカンの製造ツールとして有用である。本発
明ＤＮＡは、本発明ポリペプチドの大量調製ツールとし
て有用である。また、本発明酵素の遺伝子異常や発現が
低下した疾患患者への遺伝子治療への応用も期待され
る。

【００９３】本発明の組換えベクターは、本発明酵素の
大量調製ツール、遺伝子治療等に有用である。また、本
発明の形質転換細胞は、本発明酵素の大量調製ツールと
して有用である。

【００９４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 生化学工業株式会社 古川 鋼一 <120> ガラクトース転移酵素及びそれをコードするＤＮＡ <130> P-6509 <140> <141> 1999-04-28 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００９５】 <210> 1 <211> 1669 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (41)..(1021) <400> 1 ctgcgagcgc ctgccccatg cgccgccgcc tctccgcacg atg ttc ccc tcg cgg 55 Met Phe Pro Ser Arg 1 5 agg aaa gcg gcg cag ctg ccc tgg gag gac ggc agg tcc ggg ttg ctc 103 Arg Lys Ala Ala Gln Leu Pro Trp Glu Asp Gly Arg Ser Gly Leu Leu 10 15 20 tcc ggc ggc ctc cct cgg aag tgt tcc gtc ttc cac ctg ttc gtg gcc 151 Ser Gly Gly Leu Pro Arg Lys Cys Ser Val Phe His Leu Phe Val Ala 25 30 35 tgc ctc tcg ctg ggc ttc ttc tcc cta ctc tgg ctg cag ctc agc tgc 199 Cys Leu Ser Leu Gly Phe Phe Ser Leu Leu Trp Leu Gln Leu Ser Cys 40 45 50 tct ggg gac gtg gcc cgg gca gtc agg gga caa ggg cag gag acc tcg 247 Ser Gly Asp Val Ala Arg Ala Val Arg Gly Gln Gly Gln Glu Thr Ser 55 60 65 ggc cct ccc cgc gcc tgc ccc cca gag ccg ccc cct gag cac tgg gaa 295 Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Pro Glu Pro Pro Pro Glu His Trp Glu 70 75 80 85 gaa gac gca tcc tgg ggc ccc cac cgc ctg gca gtg ctg gtg ccc ttc 343 Glu Asp Ala Ser Trp Gly Pro His Arg Leu Ala Val Leu Val Pro Phe 90 95 100 cgc gaa cgc ttc gag gag ctc ctg gtc ttc gtg ccc cac atg cgc cgc 391 Arg Glu Arg Phe Glu Glu Leu Leu Val Phe Val Pro His Met Arg Arg 105 110 115 ttc ctg agc agg aag aag atc cgg cac cac atc tac gtg ctc aac cag 439 Phe Leu Ser Arg Lys Lys Ile Arg His His Ile Tyr Val Leu Asn Gln 120 125 130 gtg gac cac ttc agg ttc aac cgg gca gcg ctc atc aac gtg ggc ttc 487 Val Asp His Phe Arg Phe Asn Arg Ala Ala Leu Ile Asn Val Gly Phe 135 140 145 ctg gag agc agc aac agc acg gac tac att gcc atg cac gac gtt gac 535 Leu Glu Ser Ser Asn Ser Thr Asp Tyr Ile Ala Met His Asp Val Asp 150 155 160 165 ctg ctc cct ctc aac gag gag ctg gac tat ggc ttt cct gag gct ggg 583 Leu Leu Pro Leu Asn Glu Glu Leu Asp Tyr Gly Phe Pro Glu Ala Gly 170 175 180 ccc ttc cac gtg gcc tcc ccg gag ctc cac cct ctc tac cac tac aag 631 Pro Phe His Val Ala Ser Pro Glu Leu His Pro Leu Tyr His Tyr Lys 185 190 195 acc tat gtc ggc ggc atc ctg ctg ctc tcc aag cag cac tac cgg ctg 679 Thr Tyr Val Gly Gly Ile Leu Leu Leu Ser Lys Gln His Tyr Arg Leu 200 205 210 tgc aat ggg atg tcc aac cgc ttc tgg ggc tgg ggc cgc gag gac gac 727 Cys Asn Gly Met Ser Asn Arg Phe Trp Gly Trp Gly Arg Glu Asp Asp 215 220 225 gag ttc tac cgg cgc att aag gga gct ggg ctc cag ctt ttc cgc ccc 775 Glu Phe Tyr Arg Arg Ile Lys Gly Ala Gly Leu Gln Leu Phe Arg Pro 230 235 240 245 tcg gga atc aca act ggg tac aag aca ttt cgc cac ctg cac gac cca 823 Ser Gly Ile Thr Thr Gly Tyr Lys Thr Phe Arg His Leu His Asp Pro 250 255 260 gcc tgg cgg aag agg gac cag aag cgc atc gca gct caa aaa cag gag 871 Ala Trp Arg Lys Arg Asp Gln Lys Arg Ile Ala Ala Gln Lys Gln Glu 265 270 275 cag ttc aag gtg gac agg gag gga ggc ctg aac act gtg aag tac cat 919 Gln Phe Lys Val Asp Arg Glu Gly Gly Leu Asn Thr Val Lys Tyr His 280 285 290 gtg gct tcc cgc act gcc ctg tct gtg ggc ggg gcc ccc tgc act gtc 967 Val Ala Ser Arg Thr Ala Leu Ser Val Gly Gly Ala Pro Cys Thr Val 295 300 305 ctc aac atc atg ttg gac tgt gac aag acc gcc aca ccc tgg tgc aca 1015 Leu Asn Ile Met Leu Asp Cys Asp Lys Thr Ala Thr Pro Trp Cys Thr 310 315 320 325 ttc agc tgagctggat ggacagtgag gaagcctgta cctacaggcc atattgctca 1071 Phe Ser ggctcaggac aaggcctcag gtcgtgggcc cagctctgac aggatgtgga gtggccagga 1131 ccaagacagc aagctacgca attgcagcca cccggccgcc aaggcaggct tgggctgggc 1191 caggacacgt ggggtgcctg ggacgctgct tgccatgcac agtgatcaga gagaggctgg 1251 ggtgtgtcct gtccgggacc ccccctgcct tcctgctcac cctactctga cctccttcac 1311 gtgcccaggc ctgtgggtag tggggagggc tgaacaggac aacctctcat cacccccact 1371 tttgttcctt cctgctgggc tgcctcgtgc agagacacag tgtaggggcc atgcagctgg 1431 cgtaggtggc agttgggcct ggtgagggtt aggacttcag aaaccagagc acaagcccca 1491 cagaggggga acagccagca ccgctctagc tggttgttgc catgccggaa tgtgggccta 1551 gtgttgccag atcttctgat ttttcgaaag aaactagaat gctggattct taagtgatat 1611 cttctgattt tttaaatgat agcacctaaa tgaaactttc aaaaagtaaa aaaaaaaa 1669

【００９６】 <210> 2 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Phe Pro Ser Arg Arg Lys Ala Ala Gln Leu Pro Trp Glu Asp Gly 1 5 10 15 Arg Ser Gly Leu Leu Ser Gly Gly Leu Pro Arg Lys Cys Ser Val Phe 20 25 30 His Leu Phe Val Ala Cys Leu Ser Leu Gly Phe Phe Ser Leu Leu Trp 35 40 45 Leu Gln Leu Ser Cys Ser Gly Asp Val Ala Arg Ala Val Arg Gly Gln 50 55 60 Gly Gln Glu Thr Ser Gly Pro Pro Arg Ala Cys Pro Pro Glu Pro Pro 65 70 75 80 Pro Glu His Trp Glu Glu Asp Ala Ser Trp Gly Pro His Arg Leu Ala 85 90 95 Val Leu Val Pro Phe Arg Glu Arg Phe Glu Glu Leu Leu Val Phe Val 100 105 110 Pro His Met Arg Arg Phe Leu Ser Arg Lys Lys Ile Arg His His Ile 115 120 125 Tyr Val Leu Asn Gln Val Asp His Phe Arg Phe Asn Arg Ala Ala Leu 130 135 140 Ile Asn Val Gly Phe Leu Glu Ser Ser Asn Ser Thr Asp Tyr Ile Ala 145 150 155 160 Met His Asp Val Asp Leu Leu Pro Leu Asn Glu Glu Leu Asp Tyr Gly 165 170 175 Phe Pro Glu Ala Gly Pro Phe His Val Ala Ser Pro Glu Leu His Pro 180 185 190 Leu Tyr His Tyr Lys Thr Tyr Val Gly Gly Ile Leu Leu Leu Ser Lys 195 200 205 Gln His Tyr Arg Leu Cys Asn Gly Met Ser Asn Arg Phe Trp Gly Trp 210 215 220 Gly Arg Glu Asp Asp Glu Phe Tyr Arg Arg Ile Lys Gly Ala Gly Leu 225 230 235 240 Gln Leu Phe Arg Pro Ser Gly Ile Thr Thr Gly Tyr Lys Thr Phe Arg 245 250 255 His Leu His Asp Pro Ala Trp Arg Lys Arg Asp Gln Lys Arg Ile Ala 260 265 270 Ala Gln Lys Gln Glu Gln Phe Lys Val Asp Arg Glu Gly Gly Leu Asn 275 280 285 Thr Val Lys Tyr His Val Ala Ser Arg Thr Ala Leu Ser Val Gly Gly 290 295 300 Ala Pro Cys Thr Val Leu Asn Ile Met Leu Asp Cys Asp Lys Thr Ala 305 310 315 320 Thr Pro Trp Cys Thr Phe Ser 325

【００９７】 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 3 ggcatcctgc tgctctccaa 20

【００９８】 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 4 gccactccac atcctgtcag 20

【００９９】 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 5 caggtggcga aatgtctt 18

【０１００】 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 6 ccccagaagc ggttggacat 20

【０１０１】 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 7 ctcgagacga tgttcccctc gcggagg 27

【０１０２】 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 8 tctagaagct cagctgaatg tgcacca 27

【０１０３】 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 9 cagctcgaat tctctgggga cgtggcccgg 30

【０１０４】 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer for PCR <400> 10 tgtccactcg agtcagctga atgtgcacca 30

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトガラクトース転移酵素（XGalT-1）タン
パク質のハイドロパシープロット。

【図２】 本発明の酵素標品のプロトン核磁気（¹H NM
R）共鳴スペクトルを示す図。 Ａ：クローン化されたcDNA産物によって調製された生成
物の構造。 Ｂ：ガラクトース残基およびキシロース残基について測
定した¹H ケミカルシフト(ppm)および¹H-¹Hカップリン
グ定数(Hz)を要約して示す。

【図３】 XGalT-1発現ベクターでトランスフェクトし
たCHO変異株pgsB-761細胞のフローサイトメトリー分析
を示す図。薄い線はモノクローナル抗体を用いた結果
を、実線は対照を示す。 Ａ：CHO-K1細胞（陽性対照） Ｂ：pgsB-761細胞（陰性対象） Ｃ：cDNAを含まないベクターMIKneoを導入したXGalT-1
欠損CHO変異株pgsB-761細胞。 Ｄ：XGalT-1 cDNAを含むpMIKneoを導入したpgsB-761細
胞。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡島 徹也 愛知県名古屋市守山区町南14−25 (72)発明者 古川 圭子 愛知県名古屋市北区名城３−１−５ 名城 住宅５−402 (72)発明者 浦野 健 愛知県名古屋市熱田区大宝２−４−43 白 鳥住宅４−47 (72)発明者 福本 敏 長崎県西彼杵長与町三根郷53−131−５− 52 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA10 CA04 CA06 CA07 DA02 EA04 FA02 GA18 HA01 HA03 HA17 4B050 CC01 CC03 DD07 FF05E FF16E LL05 4B065 AA90X AA90Y AA91X AB01 AC14 BA02 CA29 CA44 CA60

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記性質を有する、ガラクトース転移酵
   素。 （１）作用 ガラクトース供与体から、受容体であるβ−Ｄ−キシロ
   ース残基のＣ４位にガラクトース残基を転移する。 （２）基質特異性 ガラクトース供与体から、以下の受容体にはガラクトー
   ス残基を転移しない。Ｎ−アセチルグルコサミン残基、
   Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、ガラクトース残基、
   α−Ｄ−キシロース残基、およびグルコシルセラミド残
   基。
2. 【請求項２】 さらに下記の性質を有することを特徴と
   する、請求項１記載のガラクトース転移酵素。 （３）ミカエリス定数 約３．４ｍＭ（パラニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピ
   ラノシドを受容体とした場合）
3. 【請求項３】 ヒト由来である、請求項１又は２に記載
   のガラクトース転移酵素。
4. 【請求項４】 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチ
   ド。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
   ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
   ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
   列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であ
   るβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基
   を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
5. 【請求項５】 以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド
   をコードするＤＮＡ。 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチ
   ド。 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１もしくは数個のア
   ミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配
   列からなり、かつガラクトース供与体から、受容体であ
   るβ−Ｄ−キシロース残基のＣ４位にガラクトース残基
   を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
6. 【請求項６】 配列番号１において、塩基番号４１〜１
   ０２１で表される塩基配列を含む請求項５記載のＤＮ
   Ａ。
7. 【請求項７】 請求項５記載のＤＮＡを保持する組換え
   ベクター。
8. 【請求項８】 請求項５記載のＤＮＡ又は請求項７記載
   の組換えベクターを宿主細胞に導入することにより得ら
   れる形質転換細胞。
9. 【請求項９】 宿主細胞が線維芽細胞株である請求項８
   記載の形質転換細胞。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の形質転換細胞を培養
    し、該培養物中に請求項４記載のポリペプチドを生成蓄
    積させ、同培養物から前記ポリペプチドを採取すること
    を特徴とするガラクトース転移酵素の製造法。
11. 【請求項１１】 配列番号２のアミノ酸配列において、
    １もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは
    転位したアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。