JPH1156373A - 糖転移酵素遺伝子 - Google Patents
糖転移酵素遺伝子Info
- Publication number
- JPH1156373A JPH1156373A JP9246176A JP24617697A JPH1156373A JP H1156373 A JPH1156373 A JP H1156373A JP 9246176 A JP9246176 A JP 9246176A JP 24617697 A JP24617697 A JP 24617697A JP H1156373 A JPH1156373 A JP H1156373A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- acid sequence
- gene
- ser
- leu
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
する遺伝子を提供する。 【解決手段】 本発明は、新規糖転移酵素であるβ1,3-
ガラクトシルトランスフェラーゼ(EC 2.4.1.-)(β1,3Ga
l-T)のアミノ酸配列、及びそれをコードする遺伝子の塩
基配列を見出した。
Description
れをコードする遺伝子に関する。
媒性糖脂質分子であり、脊椎動物の神経組織( Suzuki,
K. (1965) J. Neurochem. 12,969-979)に豊富に見出
される。すでにガングリオシドについては多くの研究が
なされており、それらが神経系の発達、維持、及び修復
において重要な役割を果たしていること(Schaal, H.,W
ille, C., and Wille, W. (1985) J. Neurochem. 45,54
4-551)、ガングリオシドの生物学的機能は神経栄養因
子(Ferrari, G., Anderson, B. L., Stephens,R. M.,
Kaplan,D. R., and Greene, L. A. (1995) J. Biol. Ch
em. 270,3074-3080)、神経栄養因子のレセプター及
び、成長因子のレセプターのモディファイヤー(Modifie
rs)Bremer, E.G., Hakomori, S., Bowen-Pope, D. F.,
Raines, E.,andROSS, R. (1984) J. Biol. Chem. 259,
6818-6825)であること等が知られている。さらに、体
内へガングリオシドを全身的に投与すると、種々の病理
的条件において神経栄養性効果を示すことも知られてい
る。
響し、細胞成長と分化を制御する分子メカニズムについ
てはいまだ明らかでない。従来は、培養細胞、又は実験
動物にガングリオシドを外因的に添加してその効果を観
察する方法のみがなされていた。これらの問題は、いく
つかのグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子が単離(Joz
iasse, D. H., Shaper, J. H., Van den Eijnden, D.
H., VanTunen, A. J.,and Shaper, N. L. (1989) J. Bi
ol. Chem. 264,14290-14297、 Narimatsu, H.,Sinha,
S., Brew, K., Okayama, H., and Qasba, P.K. (1986)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 4720-4724)され、
それらの遺伝子操作により細胞の糖化の型を改変するこ
とが可能となり著明に解決されてきた(Ikematsu, S., K
aname, T., Ozawa, M., Yonezawa, S., Sato, E.,Uehar
a, F., Obama, H., Yamamura. K., and Muramatsu, T.
(1993) Glycobiology. 3, 575-580、 Ioffe, E., and S
tanley, P. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 91,
728-732、 Metzler, M., Gertz, A., Sarkar, M., Sch
achter, H., Schrader, J. W., and Marth, J.D. (199
4) EMBO J. 13, 2056-2065)。例えば、培養細胞におい
て炭水化物をリモデルし、実験動物において炭水化物を
遺伝子的に修飾することが試みられ(Takamiya,K., Yama
moto, A-, Furukawa, K., Yamashiro, S., Shin,M., Ok
ada, M., Fukumoto, S., Haraguchi, M., Takeda, N.,F
ujimura, K., Sakae, M., Kishikawa,M., Shiku, H., F
urukawa,K., and Aizawa, S. (1996) Proc. Natl. Aca
d. Sci.U.S.A. 93,10662-10667)、予想されなかった又
は明確には知られていなかった炭水化物の新規な機能が
見出された。
研究されているものであり、脊椎動物の脳に存在する主
なガングリオシドである。GM1はまた、コレラトキシンB
サブユニットと特異的に結合してcAMP応答(Holmgren,
J., Lonnroth, I., Mansson,J. E., and Svennerholm,
L.(1975) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 2520-25
24)のような重要な生物学的現象をもたらすことが知ら
れている。さらに、GM1はFSH及びLHのようなペプチドホ
ルモンのレセプター機能に関与していること、及び神経
系の多くの病理的状況に対する治療応用に効果的である
ということも知られている。
理学的機能についての詳細な分析にとって、個々の構造
の合成にあずかるグリコシルトランスフェラーゼの遺伝
子についていまだ利用可能となっていないという問題が
あった。
問題に鑑み鋭意研究し、複合型ガングリオシドの生理学
的機能の詳細な分析のために、個々の構造の合成にあず
かるグリコシルトランスフェラーゼの遺伝子を利用可能
とすることに成功したものである。すなわち、本発明者
等は、β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ(EC 2.4.
1.-)(β1,3Gal-T)遺伝子であって、その産物がGD1bの発
現を決定するようなcDNAクローンの単離に成功した。さ
らに、該cDNAを適当なプレカーサー構造を有する種々の
細胞系に導入することにより、また、該cDNA遺伝子を導
入された細胞からの抽出液を用いたインビトロアッセイ
から、該酵素が、GM1及びアシアロ-GM1(GA1)の合成を触
媒することを見出した。また、該酵素のラット組織間、
及びラット脳における遺伝子の発現パターンについても
重要な知見を得、係る知見に基づき本発明を完成するに
至った。
ては、抗GD1bモノクローナル抗体を用いて、β1,3-ガラ
クトシルトランスフェラーゼ遺伝子(β1,3-galactosyl
transferase gene)(EC 2.4.1.62)のcDNAの発現クロ
ーニングを行うものである。このため、ポリオーマT抗
原遺伝子とGM2/GD2シンターゼcDNAを用いて遺伝子導入
されたマウスメラノーマ株B16であるKF4Cが、cDNAライ
ブラリー遺伝子導入のための受容細胞株として使用され
る。また、GD3シンターゼのcDNAクローンであるpD3T-31
は、ラット脳RNAとpcDNAI発現ベクターを用いて調製し
たcDNAライブラリーと共に共-遺伝子導入(co-transfec
t, co-transfection)する。
クローンpM1T-9は、その遺伝子産物がサイトプラスミッ
クドメインの4アミノ酸、トランスメンブレンドメイン
の21アミノ酸、及び大きな触媒ドメイン(catalytic d
omain)の346アミノ酸を有するタイプIIの膜タンパク
質であることを示唆するものである。
ゼ遺伝子を導入したマウスメラノーマ株B16に該cDNAを
導入することにより、GM1の新合成(neo-synthesis)をも
たらす。
-9及びGD3シンターゼcDNAをco-transfectした場合にGM1
同様GD1bも発現することを見出した。さらに、pM1T-9
の、あらかじめGM2/GD2シンターゼ遺伝子を遺伝子導入
したL細胞株(GM3シンターゼ欠失)への導入は、アシア
ロ-GM1(asialo-GM1)を発現することを見出した。上記
本発明における知見によれば、酵素分析により示唆され
たように、GD1b/GM1/GA1シンターゼが同一であることを
確認するものである。
トシルトランスフェラーゼ遺伝子の、ラット組織からの
全RNAを用いたノーザンブロットにおいて、1.6kb mRNA
が、脾臓、胸線、腎臓、および精巣において強く発現さ
れるという知見を得た。さらに、成体ラットの脳組織に
おける遺伝子の発現レベルは特に高くない一方、該遺伝
子は、胎生12日のラット胎仔脳においては高いレベル
であり、出生とともにピークに達し、その後成体ラット
の脳と同程度の低レベルへ落ちるという知見を得た。
に記載のアミノ酸配列のうち26位のSerから371位
のSerまでのアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列に対
して1以上、通常1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換
又は付加されたアミノ酸配列を含んでなる、β1,3-ガラ
クトシルトランスフェラーゼ活性を有する糖転移酵素を
提供するものである。
載のアミノ酸配列のうち1位のMetから371位のSerま
でのアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列に対して1以
上、通常1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加
されたアミノ酸配列を含んでなる、β1,3-ガラクトシル
トランスフェラーゼ活性を有する糖転移酵素を提供する
ものである。
るポリヌクレオチドを提供するものである。
載の塩基配列のうち270位のTから1307位のTまで
の塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供するもので
ある。
載の塩基配列のうち195位のAから1307位のTまで
の塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供するもので
ある。
記載の塩基配列とハイブリダイズし、かつβ1,3-ガラク
トシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質(糖転移
酵素)をコードするポリヌクレオチドを提供するもので
ある。このようなハイブリダイズするDNA又はRNAは、好
ましくはβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を
保持しているものであり、ストリンジェントな条件下、
例えば50%ホルムアミド、5xSSC、10% Na-デキストラ
ン、 20mM Na-ホスフェート(pH6.5)、42℃のハイブリダ
イゼーション条件下で前記ポリヌクレオチドとハイブリ
ダイズするものである。
細に説明する。なお、本明細書および図面において、塩
基やアミノ酸等などの略号で表示する場合、IUPAC
−IUBによる略号あるいは当該分野における慣用の略
号を使用した。
Y., Yamashiro, S., Yodoi, J., Lloyd, K. O., Shik
u, H., and Furukawa, K. (1992) J. Biol. Chem. 267,
12082-12089)のプラスミドpMIK-Hyg/M2T1-1(pMIK/Hyg
ベクターにGM2/GD2シンターゼcDNAをインサートしたも
の)の安定な遺伝子導入体である。B78-2は、B78(B16
のサブライン)へのpM2T1-1の安定な遺伝子導入体であ
る(Nagata, Y., Yamashiro, S., Yodoi, J., Lloyd, K.
O., Shiku, H., and Furukawa, K. (1992) J. Biol.Ch
em. 267, 12082-12089)。これらの細胞は、ハイグロマ
イシン(hygromycin,250μg/ml)(Calbiochem-Novabioch
em、ラホヤ,CA)添加又は無添加のDulbecco改良イーグ
ル最小必要培地(D-MEM)7.5%牛胎児血清(FCS)及び300μg
/mlのG418(Sigma、セントルイス,Mo)中で保持できる。
の遺伝子導入L細胞である。すなわちpCDM8(Nagata, Y.,
Yamashiro, S., Yodoi, J., Lloyd, K. O., Shiku,
H.,and Furukawa, K. (1992) J. Biol. Chem. 267, 120
82-12089)に組込まれたpM2T1-1と、pSV2neoの遺伝子導
入体であり、アシアロ-GM2発現性である。GD1bと特異的
に反応するモノクローナル抗体(mAb370)及び、抗アシア
ロ-GM1モノクローナル抗体(mAb229)は本発明者等により
以下のように作製可能である。
リオシドを組込んでAKRマウスに2週間隔で免疫後、そ
の脾臓細胞をNS-1ミエローマ細胞と融合する。HAT培地
で選択後、培養上清を用いてガングリオシドに対するEL
ISAを行い、特異的抗体をピックアップする。
ト脳cDNAライブラリーはpoly(A)+RNAと、pcDNAI発現ベ
クター(Invitrogen, サンジエゴ、CA)を用いて作製可能
である。このライブラリーは、3.5x106個以上の独立し
たコロニーを含んでいるものが好ましい。
を使用可能である。
cDNAクローンであるpD3T-31(Haraguchi, M., Yamashir
o, S., Yamamoto, A., Furukawa, K.,Takamiya, K.,Llo
yd, k. 0., Shiku, H., and Furukawa, K.(1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 10455-10459)のXhoIフ
ラグメントを、pMIK/Neo発現ベクター(東京医科歯科大
学、丸山博士より提供。新細胞工学実験プロトコール、
「発現プラスミドの構築」254-259ページ、東京大学医
科学研究所編、秀潤社、1993年)へインサートして作製
することが可能である。
のcDNAクローンの単離)cDNAライブラリーのプラスミド
は従来方法に基づき(Davis, L. G., Dibner, M. D., an
d Battey, J. F.(1986) Methods in Molecular Biolog
y, Elsevier Science. 285-289)、一度増殖し、プラス
ミドpMIK/D3T-31と共にDEAEデキストラン(Pharmacia B
iotech,Uppsala)を用いてKF4C細胞へ遺伝子導入するこ
とが可能である。
サブコンフルエントKF4C細胞1.5x106個に、8μgずつのc
DNAライブラリープラスミド及びpMIK/D3T-31を共-遺伝
子導入することで可能である。さらに、60分後、10%DMS
O/PBSにて2分間処理した後、2日間培養し、遺伝子導
入した細胞をプレートから剥がし、1:200希釈でmAb370
と氷上45分間インキュベートする。細胞をヤギ抗マウス
IgM(Cappel, Durham, NC)でコートした皿に移す(Wysoc
ki, L. J., and Sato, V. L. (1978) Proc. Natl. Aca
d.Sci. U.S.A. 75, 2844-2848)。プラスミドDNAは、パ
ンニングされた細胞から、Hirt抽出液を作製することに
より採りだし可能であり、MC1061/P3へ形質転換するこ
とが可能である。拡張したプラスミドDNAを再度遺伝子
導入し、同じ操作を繰返す(例えば4回)。その後、そ
れぞれ30コロニーを含む96群を調製し、mAb370結合活性
の発現によりスクリーニングすることが可能となる。い
くつかの陽性群(例えば2つ)から適当数(例えば17)
のクローンをスクリーニングし、KF4C上でGD1bを発現す
る単一コロニー(例えば3つ)をミクロスケールDEAEデ
キストラン遺伝子導入及び免疫蛍光(IF)アッセイを用い
て単離することが可能である。
ミドはXhoI及びHindIIIで消化し、ファージミドブルー
スクリプト(pBSK)KS(+)ベクターにクローニングするこ
とが可能である。このクローンの欠失変異体は、例え
ば、Kilo-Sequence欠失キット(Takara, Kyoto)により調
製できる。
塩基配列決定方法としては、T3/T7ダイプライマー又
は、4種類の追加のカスタムプライマーとPRISMダ
イターミネーターサイクルシークエンスキットを用い
て、モデル377DNAシークエンサー(Applied Biosystems,
Foster City,CA)により行うことが可能である。
胞株、KF-4C及びGM2発現細胞株78-2を、トランジエント
及び安定な発現システムのための受容細胞として用いる
ことが可能である。
T-9/cDNAIベクターをKF-4CへDEAE-デキストランにより
遺伝子導入する。
CへpMIK-neo/D3T-31とpM1T-9/cDNAIとをco-transfect
する。
現L1-17細胞に、pM1T-9/cDNAIを遺伝子導入する。これ
らのガングリオシドの発現は例えば、IFアッセイとフロ
ーサイトメトリーにより検出可能である。
ために、pM1T-9/cDNAI及びpMIK-Hyg/D3T-31を、例えば
リン酸カルシウム沈殿法(Davis, L. G., Dibner, M.
D., andBattey, J. F.(1986) Methods in Molecular Bi
ology, Elsevier Science. 290-292)によりB78-2にco-t
ransfection可能である。遺伝子導入体を選択するた
め、細胞は、G418(300μg/ml)及びハイグロマイシン(25
0μg/ml)を含むD-MEM/7.5%FCS中で培養する。これらの
安定遺伝子導入体のガングリオシドの発現はIFアッセイ
及びフローサイトメトリーにより行う。
シド発現はマウスmAb370(抗GD1b)、mAb229(抗GA1)及びF
ITC結合コレラトキシンBサブユニット(List Biological
Laboratories, Cambell, CA)(GM1)を用いて行う。具体
的には、mAbs370及び229では細胞をmAbsと45分間氷上で
インキュベートし、FITC結合ウサギ抗マウスIgMと氷上4
5分間、染色する。
胞はFITC結合コレラトキシンBサブユニットと45分間イ
ンキュベートし、FACScan(Becton Dickinson, Mountai
n View, CA)上でフローサイトメトリーにより分析す
る。染色の強度は具体的には蛍光強度の対数として任意
単位で測定され、4桁スケールで表示する。
としては、例えばGD1bとGA1に関しては2次抗体のみ用
いて調整することが可能である。GM1発現のためには、
ベクターのみの遺伝子導入細胞をFITC結合コレラトキシ
ンBサブユニットで染色して用いる。
体ラット組織及び胎仔ラット脳から、酸フェノールを用
いて抽出可能である(Chomczynski, P., and Sacchi, N.
(1987) Anal. Biochem.162, 156-159)。具体的には、
全RNA(20μg)を1.2%アガロース-ホルムアルデヒドゲル
上で分離し、GeneScreenPlus膜(Dupont, Boston,MA)上
へ移す。[α-32P]-dCTP標識ラットβ1,3Gal-T cDNA
(pM1T-9)、又はβアクチンcDNA(ヌクレオチド69-814)プ
ローブとのハイブリダイズは公知の条件(Nagata, Y., Y
amashiro, S., Yodoi, J.,Lloyd, K. O., Shiku, H., a
nd Furukawa, K. (1992) J. Biol. Chem. 267, 12082-1
2089)で可能であり、分析は、BAS2000Bio-Imaging分析
機(Fuji film、Tokyo)等の使用により可能である。
(TLC)免疫染色)β1,3Gal-T遺伝子の安定遺伝子導入体
は、B78-2メラノーマへのクローン化プラスミド及びpMI
K-Hyg/D3T-31(α2,8シアリルトランスフェラーゼ(α2,
8S-T)cDNA)の、リン酸カルシウム沈殿によるco-transf
ectionにより得られる。G418とハイグロマイシン耐性ク
ローンのうち、GD1b発現クローンを、IFアッセイ及びフ
ローサイトメトリーの結果に基づいて選択することが可
能である。糖脂質は従来の方法により単離可能である(F
urukawa, K., Clausen, H., Hakomori, S., Sakamoto,
J., Look,K., Lundblad, A., Mattes, M. J., and Lloy
d, K. O. (1985)Biochemistry. 24, 7820-7826)。具体
的には、約300μlの遺伝子導入細胞のパックされた細
胞塊と、Hyg遺伝子のみを含むコントロールクローンか
ら、クロロホルム/メタノール(2:1,1:1,1:2)で順に抽出
できる。脱塩後、ガングリオシドはDEAEーセファデック
スA-50(Pharmacia LKB)イオン交換クロマトグラフィに
より分離できる。TLCは、具体的には高精度TLCプレート
(Merck,Darmstdt)により、クロロホルム/メタノール/2.
5N NH4OH(60:35:8)を用いて行いうる。成分はレゾルシ
ノールを噴霧して可視化できうる。新規合成ガングリオ
シドは、アルミニウム板上のシリカゲルプレート(Merc
k)によりTLC免疫染色が可能である(Furukawa, K.,Claus
en, H., Hakomori, S., Sakamoto, J., Look,K., Lundb
lad, A., Mattes,M. J., and Lloyd, K. O. (1985)Bioc
hemistry. 24, 7820-7826)。TLC後、プレートを乾燥
し、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜上に移す。プ
レートは非特異的吸着をブロックするため1%ウシ血清ア
ルブミンを含むリン酸緩衝液/食塩水中で1時間インキ
ュベートした後、mAbsと1時間室温でインキュベート
し、さらにビオチン化ウサギ抗マウスIgG及びアビジン
ービオチン複合体とインキュベートする。この目的で例
えばVectastain ABC-POキット(Vector laboratories,
CA)を使用可能である。
法で測定できる(Ruan, S., and Lloyd, K. O. (1992)Ca
ncer Res. 52, 5725-5731)。具体的には、膜分画を調製
するために、サンプルを窒素空洞化装置を用いて溶解す
る。核は低速遠心で除去し、上清を105,000gで1時間4
℃で遠心する。
体的には反応混合物は次の成分を50μlに含むものであ
る。150mM MnCl2、0.375% TritonCF-54(Sigma)、UPD-[
14C]Gal(2.0x105dpm)(NEN、Boston、MA)、及び100
μgのタンパク質を含む膜分画である。これを2時間3
7℃でインキュベートした後、生成物はC18Sep-Packカ
ートリッジ(Waters,Milford,MA)で単離し、さらにTLC及
びフルオログラフィ(Yamashiro, S., Ruan, S., Furuka
wa, K., Tai, T., Lloyd, K. O.,Shiku, H., and Furuk
awa, K. (1993) Cancer Res. 53, 5395-5400)で分析す
る。
ノ酸配列ホモロジー検索は、インターネットプログラム
BLAST(Natioal Center for Biotechnology Informatio
n)を用いて行うことが可能である。またアミノ酸配列と
疎水/親水性分析は、ソフトウヱアGENTYX-MACver6.1.0
(Software Development、Tokyo)で行うことができる。
方法)GD1bシンターゼ遺伝子のcDNAクローンを単離する
ために、β1,4-N-アセチルガラクトサミニルトランスフ
ェラーゼ(β1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase,
β1,4GalNAc-T)cDNAであるpM2T1-1のKF3027への遺伝
子導入体を調製して、GM2発現の新規細胞株を得、この
株をKF4Cと命名した。図1に示されるようにα2、8S-T
cDNA、pD3T-31及びライブラリーに含まれるβ1、3Gal-T
cDNAのco-transfectionの後、GD1bの発現が可能とな
る。
単離)cDNAライブラリーの遺伝子導入と、抗GD1b mAb37
0によるパニング及びHirt抽出を5サイクルの後、pM1T-
9というcDNAクローンが単離された。pM1T-9のpD3T-31と
KF4Cへのco-transfectionの後、GD1bの新規発現が図2
Bに示されるように観察された。これらのトランジエン
ト遺伝子導入細胞において、図2Aに示すようにFITC結
合コレラトキシンBにより染色した際、GM1もまた新しく
発現された。
は同一であり、単一の遺伝子によりコードされているこ
とが強く示唆される(Iber, H., Kaufmann, R., Pohlen
tz,G., Schwarzmann, G., and Sandhoff, K. (1989) FE
BS Lett. 248, 18-22)。さらに確認するために、KF4Cに
pM1T-9のみを遺伝子導入し、GD1bとGM1の発現を調べ
た。これらの遺伝子導入体はGM1は発現したがGD1bはし
なかった。このことは想定されているガングリオシド合
成経路(Iber, H., Kaufmann, R., Pohlentz, G., Schwa
rzmann, G., and Sandhoff, K. (1989) FEBS Lett. 24
8, 18-22)と一致するものである。さらに、この酵素
は、アシアロ-GM2(GA2)からアシアロ-GM1(GA1)の合成を
触媒するGA1シンターゼと同一であると考えられてき
た。そこで、このcDNAの遺伝子導入によるGA1の合成の
有無を調べるために、pM2T1-1により遺伝子導入されたL
細胞を、pM1T-9の受容細胞として用いた。L細胞は、GM3
シンターゼ活性(Yamashiro, S., Haraguchi, M., Furuk
awa, K., Takamiya, K-,yamamoto, A., Nagata, Y., Ll
oyd, K. O., Shiku, H., and Furukawa, K. (1995) J.
Biol. Chem. 270, 6149-6155)を欠いているために、す
べての複合型ガングリオシドを欠いている。図2に示す
ように、pM2T1-1(安定)とpM1T-9(トランジエント)
によるL細胞への遺伝子導入は、GA1特異的mAb229により
検出されるように明確にGA1を発現した。
本発明により、B78-2(pM2T1-1によるB78の遺伝子導入
細胞株)を用いて、pM1T-9又はpM1T-9とpMIK/D3T-31の
安定な遺伝子導入細胞を確立した。フローサイトメトリ
ーはGM1(図3B)又はGM1/GD1b(図3D)の新規なそ
して有意な合成レベルを示した。親細胞(B78/M2T1-
1)、及び二重の遺伝子導入体(B78/M2T1-1/M1T-9/D3T-
31)から抽出されたグリコスフィンゴリピド(glycosphi
ngolipid)がTLCにより分析され、糖脂質成分の変換が予
想の通り見出された(図4)。 また、二重遺伝子導入
細胞中に、特異的GD1bバンドがTLC-免疫染色により示さ
れた。この結果より、クローン化されたcDNA pM1T-9
は、GD1b/GM1/GA1シンターゼ遺伝子から由来するという
ことが示された。
クローンのHindIIIとXhoIサイト間のHindIII-XhoIフラ
グメントを有するpBSKを構築しその塩基配列分析により
決定されたpM1T-9のインサートの全配列を示した(配列
表の配列番号2参照)。これまで単離された他のグリコ
シルトランスフェラーゼcDNAと比較して、このcDNAは相
対的に小さいサイズであり、全サイズは1613bpである。
194bpの5'-非翻訳領域と、1113bpの連続オープンリーデ
ィングフレームと、306bpの3'-非翻訳領域で成ってい
る。単一のポリアデニル化シグナルと、70以上のポリア
デニル化領域が存在する。
る開始コドンはKozak共通開始配列(Kozak, M. (1986) C
ell. 44, 283-292)と似た配列内に埋め込まれている。
このオープンリーディングフレームは、分子量40,976.1
ダルトンの371のアミノ酸からなるタンパク質を予想さ
せる(配列表の配列番号1参照)。最近の利用可能なタ
ンパク質及び核酸データベースの検索によっても、該cD
NAと有意のホモロジーを有する他の遺伝子は見出されな
かった。4つの他のガラクトシルトランスフェラーゼ遺
伝子、即ちα1、3Gal-T(Joziasse, D. H., Shaper, J.
H., Van den Eijnden, D. H., Van Tunen, A. J., and
Shaper, N. L. (1989) J. Biol. Chem.264,14290-1429
7)、β1,4Gal-T(Narimatsu, H., Sinha, S., Brew, K.,
Okayama, H., and Qasba, P.K. (1986) Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A. 83, 4720-4724)、GalCer-Gal-T(Schu
lte, S., and Stoffel, W. (1993) Proc. Natl. Acad.
Sci.U.S.A. 90, 10265-10269;Stahl, N., Jurevics,
H., Morell, P., Suzuki, K., and Popko, B.(1994) J.
Neurosci. Res. 38, 234-242)及び血液型Bシンター
ゼα1、3Gal-T(Yamamoto, F., Marken, J., Tsuji,
T., White, T., Clausen, H.,and Hakomori, S. (1990)
J. Biol. Chem. 265, 1146-1151)でさえ、わずか10-1
6%程度のアミノ酸配列におけるホモロジーを示すだけで
あった。
ロパシー解析は、このタンパク質が今まで知られたグリ
コシルトランスフェラーゼと同様の構造上の特徴を有す
ることを示唆している。アミノ末端近傍に単一の疎水的
セグメントがあり、これは21のアミノ酸からなる。この
推定されるシグナルアンカー配列はサイトゾル内に4残
基を配置し、346アミノ酸をゴルジ体内腔に触媒領域と
して配置すると考えられる。予想されるアミノ酸配列
は、単一のN-グリコシル化部位が143位-145位に存在
し、プロリン豊富領域が42位-71位(11/30)に存在するこ
とを示す。以上の結果から、該酵素活性発現に必要な最
小部位は、細胞膜貫通部位と細胞質領域を除く、26位
のアミノ酸から末端の371位までである。
GD2、GM2及びGA2に転移する)pM1T-9のトランジエント
及び安定遺伝子導入の結果により、この遺伝子は、3つ
の構造、すなわちGD1b、GM1およびGA1の合成を触媒する
単一のβ1,3Gal-Tをコードするものであることが強く示
唆された。
ションの酵素活性を調べた。図6Aに示すように、B78
のpMIK/M1T-9及びpD3T-31による安定遺伝子導入体から
のメンブレンフラクションは、20,000units(pmol/h/mg
タンパク質)のGM1シンターゼ活性を示し、一方アクセ
プターを加えない場合は、有意の生成物が検出されなか
った。予想されるように、pMIKベクター自体による遺伝
子導入体はほぼゼロ活性であった。GD2、GA2、GlcCer、
GD1b、GM3及びGD1aを基質として調べた場合、GD2とGA2
はUDP-Galの有意の取込レベルを示した(図6B)。
織においてβ1,3Gal-T遺伝子の発現レベルを全RNAを用
いてノーザンブロットにより調べた。種々の組織のう
ち、腎臓、精巣、脾臓及び胸線が相対的に高いレベルの
発現を示し、また一方調べたほぼ全ての組織がある程度
のレベルの遺伝子転写物を含んでいた(図7A)。
なかった。すなわち、遺伝子発現を、ラット脳の成長段
階で分析した結果、該遺伝子はすでに12日胎仔脳に検
出され、生まれるまでは高レベルで維持されたが(図7
Bおよび図8)、成体ラット脳では発現レベルは低く維
持される。
遺伝子の同一性が示される。すなわち、GD1bシンターゼ
cDNAを単離し、その遺伝子産物が、GalNAcβ1->4Gal-、
GalNAcβ1->4(NeuAcα2->3)Gal-又はGalNAcβ1->4(Neu
Acα2->8NeuAcα2->3)Gal-のいずれの末端配列を有する
糖脂質をもアクセプターとして使うことを示すものであ
る。
uchi, M., Furukawa, K., Takamiya, K-,yamamoto, A.,
Nagata, Y., Lloyd, K. O., Shiku, H., and Furukaw
a, K.(1995) J. Biol. Chem. 270, 6149-6155)の基質特
異性分析の場合、GA2合成は相対的に低いものである
が、これと比較して、本発明に基づき、β1,3 Gal-T
の、GM2,GD2,GA2に対するアクセプター活性はそれほど
異ならないことが示唆された(図6B)。
ドの生理学的重要性はそれらのグリコシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子の遺伝的改変により、より生理学的に研究
され得ることとなる。すなわち、β1,3Gal-T遺伝子の遺
伝子操作により最終的には、GD1b/GM1/GA1より高級の複
合型ガングリオシドの役割の解明を可能とするものであ
る。
ドは脊椎動物の神経系の発達上、重要な役割をする分子
であり、特にGM1はインビボ及びインビトロでその生理
的効果が活発に研究されている。例えば毒物剤、神経外
傷、虚血性損傷、変性疾患および機械的侵襲などによる
障害に対する修復効果等である(Sabel, B. A., Slavin,
M.D., and Stein, D. G. (1984) Science. 225, 340-3
42, Kapriak, S. E. (1984) Adv. Exp. Med. Biol. 17
4, 489-497,Svennerholm, L. (1994) Life Sci.55, 212
5-2134)。また、インビトロ培養系においてのGM1ガング
リオシドの添加は、神経細胞の神経突起の伸張を誘導又
は亢進させうる(Facci, L., Leon, A.,Toffano, G., So
nnino, S., Ghidoni, R., and Tettamanti, G. (1984)
J. Neurochem. 42,299-305)。実際、複合ガングリオシ
ドを欠くβ1,4GalNAc-T遺伝子の破壊されたマウスは、
神経伝達速度の減少(Takamiya, K., Yamamoto, A-, Fur
ukawa, K., Yamashiro, S., Shin,M., Okada, M., Fuku
moto, S., Haraguchi, M.,Takeda, N.,Fujimura, K., S
akae, M., Kishikawa, M., Shiku, H., Furukawa,K., a
nd Aizawa, S. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
93,10662-10667)や行動異常等の明確な神経系の機能障
害を示す。これらの効果に対応する生理学的機能の解明
のため、本発明において見出された、ラット脳の発達段
階にのみ見られるβ1,3Gal-T遺伝子の高い発現は、脳組
織の分化におけるガングリオシド生成物の重要な役割を
示唆するものであり、ガングリオシドやその合成酵素遺
伝子の治療方法、治療薬への応用を可能とするものであ
る。
クローニングを示す図であり、KF4CはpolyomaT抗原とβ
1,4GalNAc-T遺伝子を導入されており、α2,8シアル酸転
移酵素とβ1,3Gal転移酵素のcDNAが共に発現すると、GD
1bが発現し得ることを示す図である。
オシドのトランジエント発現を示す図である。クローン
化されたcDNA pM1T-9は、GD3シンターゼcDNA、pD3T-31
あり(右)またはなし(左)の条件でDEAE-デキストラ
ン法により遺伝子導入した。GM1,GD1bおよびGA1は60時
間後、フローサイトメトリーにより特異的プローブを用
いて分析した。細線は特異的プローブありの条件での結
果を示し、実線はコントロールを示す。
現を示す図である。B78-2細胞は、pM1T-9のみ(左)ま
たはpM1T-9とpD3T-31(右)により遺伝子導入された。G
M1はAおよびBともに発現し、一方GD1bはDにのみ発現
した。細線はmAbs添加サンプルを、また実線は二次抗体
のみで処理したものを示す。
ングリオシドのTLCの結果を示す図である。 A:レーン1及び2はB78から、レーン3はB78-2、レー
ン4はB78-2/M1T-9/D3T-31からの抽出したものである。
レーン1は、10mgのウエット組織から、レーン2〜4は
5mgのウエット組織からのガングリオシドである。標準
は、ウシ脳からのガングリオシドである。使用溶媒は、
クロロホルム/メタノール/2.5N NH4Cl(60:35:8)であ
る。レゾルシノール噴霧をバンド検出に使用する。 B:ガングリオシドフラクションのTLC-免疫染色。レー
ン3および4はAと同様に調製した後、PVDF膜にブロッ
トし、抗GD1b mAb370により染色した(発色にはABCキッ
トを用いた)。
配列を示す図である。 上:単一のオープンリーディングフレームに対する演繹
されたアミノ酸配列を塩基配列に加えて示す図である。
21アミノ酸を有する推定トランスメンブラン領域は二
重線で示す。N-グリコシル化の可能性部位が下線で示さ
れる。ポリアデニル化シグナルが四角でかこまれる。 下:コード領域の演繹されたアミノ酸配列に対する、Ky
te、Doolittle(Kyte, J., and Doolittle, R. F. (198
2) J. Mol. Biol. 157, 105-132)に基づくハイドロパシ
ー分析を示す図である。
のβ1,3Gal-T活性を示す図である。ここでAは、GM2ア
クセプターを用いた場合の酵素活性(UPD-[14C]-Gala
ctoseをドナーとして用いる)を示す 。メンブランフラ
クションが親株B78-2とB78-2/M1T-9/D3T-31から調製さ
れ、酵素活性がGM2をアクセプターとして用いて決定さ
れた。GM1バンドが生成物のTLCで観測された。Bは、種
々のアクセプター構造に対する相対的β1,3Gal-T活性。
GM2アクセプターの場合を100%とした。
の結果を示す写真である。Aは、ラット各組織からの全
RNA20μgをアガロースゲルで分離し、ナイロンメンブレ
ンにブロットする。pM1T-9から調整した32P-標識プロ
ーブとのハイブリダイズがなされたものである。Bは、
全ラット胎仔(レーン1)、ラット胎仔脳(レーン2〜
3)、またはラット脳(レーン4)のRNAが分離され、
Aと同様にブロットされたものである。レーン5および
6は脳からのRNA30μgを用いたものである。
ウムブロミドで染色された18SrRNAバンド(デンシトグ
ラフ(Signal Analysis, Vienna, VA)にて測定)を用い
て補正し、プロットした図である。繰返し実験の結果を
+-SDで表現した。
Claims (6)
- 【請求項1】 配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配
列のうち26位のSerから371位のSerまでのアミノ酸
配列、又は前記アミノ酸配列に対して1以上のアミノ酸
の欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含んでな
る、β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有す
る糖転移酵素。 - 【請求項2】 配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配
列のうち1位のMetから371位のSerまでのアミノ酸配
列、又は前記アミノ酸配列に対して1以上のアミノ酸の
欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含んでなる、
β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する糖
転移酵素。 - 【請求項3】 請求項1または2に記載の糖転移酵素を
コードするポリヌクレオチド。 - 【請求項4】 配列表の配列番号2に記載の塩基配列の
うち270位のTから1307位のTまでの塩基配列を有
するポリヌクレオチド。 - 【請求項5】 配列表の配列番号2に記載の塩基配列の
うち195位のAから1307位のTまでの塩基配列を有
するポリヌクレオチド。 - 【請求項6】 配列表の配列番号2に記載の塩基配列と
ハイブリダイズし、かつβ1,3-ガラクトシルトランスフ
ェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオ
チド。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP24617697A JP3889863B2 (ja) | 1997-08-27 | 1997-08-27 | 糖転移酵素遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP24617697A JP3889863B2 (ja) | 1997-08-27 | 1997-08-27 | 糖転移酵素遺伝子 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH1156373A true JPH1156373A (ja) | 1999-03-02 |
JP3889863B2 JP3889863B2 (ja) | 2007-03-07 |
Family
ID=17144655
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP24617697A Expired - Fee Related JP3889863B2 (ja) | 1997-08-27 | 1997-08-27 | 糖転移酵素遺伝子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3889863B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000050608A1 (fr) * | 1999-02-25 | 2000-08-31 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouveau polypeptide |
-
1997
- 1997-08-27 JP JP24617697A patent/JP3889863B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000050608A1 (fr) * | 1999-02-25 | 2000-08-31 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouveau polypeptide |
US7241605B1 (en) | 1999-02-25 | 2007-07-10 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Polypeptide |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP3889863B2 (ja) | 2007-03-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Haraguchi et al. | Isolation of GD3 synthase gene by expression cloning of GM3 alpha-2, 8-sialyltransferase cDNA using anti-GD2 monoclonal antibody. | |
Hagen et al. | Purification, cloning, and expression of a bovine UDP-GalNAc: polypeptide N-acetyl-galactosaminyltransferase. | |
JP3193301B2 (ja) | 生理活性タンパク質p160 | |
US5541095A (en) | Glycosaminoglycan specific sulfotransferases | |
US6423514B1 (en) | Mammalian hyaluronan synthases, nucleic acids and uses thereof | |
US20070238651A1 (en) | Nucleic acids and proteins of a rat ganglioside GM1-specific alpha1-2fucosyltransferase and uses thereof | |
US20090269802A1 (en) | Alpha 1,4-galactosyltransferase and dna encoding thereof | |
WO1993025659A9 (en) | Glycosaminoglycan specific sulfotransferases | |
JP2002530071A (ja) | UDPガラクトース:β−N−アセチル−グルコサミンβ1,3ガラクトシルトランスフェラーゼ、β3Gal−T5 | |
JP2810635B2 (ja) | 新規糖鎖合成酵素 | |
US6323332B1 (en) | Sulfotransferase for HNK-1 glycan | |
CA2421088A1 (en) | Novel polypeptide | |
JP2003047467A (ja) | コンドロイチン合成酵素 | |
JPH11313684A (ja) | N−アセチルグルコサミン−6−o−硫酸基転移酵素のポリペプチド及びそれをコードするdna | |
US5780284A (en) | Ceramide glucosyltransferase | |
JP3889863B2 (ja) | 糖転移酵素遺伝子 | |
JPH10313867A (ja) | グルクロン酸転移酵素をコードするdna | |
US6764844B1 (en) | DNA sequence encoding a novel glucuronyl C5-epimerase | |
US6489151B1 (en) | Biologically active alternative form of the IKKα IκB kinase | |
JP4101976B2 (ja) | ヒト由来シアル酸転移酵素及びそれをコードするdna | |
US20030190739A1 (en) | Tankyrase2 materials and methods | |
JP2942813B2 (ja) | 新規なヒアルロン酸合成酵素のポリペプチド及びそれをコードするdna | |
JP3219585B2 (ja) | 新規糖鎖合成酵素 | |
JP4451036B2 (ja) | 新規コンドロイチン合成酵素 | |
JP2002085069A (ja) | β1,3−N−アセチルガラクトサミン転移酵素の製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20040811 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040906 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060725 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060925 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20061121 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20061201 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101208 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111208 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121208 Year of fee payment: 6 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |