JPH1156373A - 糖転移酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、新規糖転移酵素及びそれをコード
する遺伝子を提供する。 【解決手段】 本発明は、新規糖転移酵素であるβ1,3-
ガラクトシルトランスフェラーゼ(EC 2.4.1.-)(β1,3Ga
l-T)のアミノ酸配列、及びそれをコードする遺伝子の塩
基配列を見出した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、糖転移酵素及びそ
れをコードする遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】ガングリオシドは、シアル酸を含む両親
媒性糖脂質分子であり、脊椎動物の神経組織（ Suzuki,
K. (1965) J. Neurochem. 12,969-979）に豊富に見出
される。すでにガングリオシドについては多くの研究が
なされており、それらが神経系の発達、維持、及び修復
において重要な役割を果たしていること（Schaal, H.,W
ille, C., and Wille, W. (1985) J. Neurochem. 45,54
4-551）、ガングリオシドの生物学的機能は神経栄養因
子（Ferrari, G., Anderson, B. L., Stephens,R. M.,
Kaplan,D. R., and Greene, L. A. (1995) J. Biol. Ch
em. 270,3074-3080）、神経栄養因子のレセプター及
び、成長因子のレセプターのモディファイヤー(Modifie
rs)Bremer, E.G., Hakomori, S., Bowen-Pope, D. F.,
Raines, E.,andROSS, R. (1984) J. Biol. Chem. 259,
6818-6825）であること等が知られている。さらに、体
内へガングリオシドを全身的に投与すると、種々の病理
的条件において神経栄養性効果を示すことも知られてい
る。

【０００３】一方、ガングリオシドが神経系の機能に影
響し、細胞成長と分化を制御する分子メカニズムについ
てはいまだ明らかでない。従来は、培養細胞、又は実験
動物にガングリオシドを外因的に添加してその効果を観
察する方法のみがなされていた。これらの問題は、いく
つかのグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子が単離(Joz
iasse, D. H., Shaper, J. H., Van den Eijnden, D.
H., VanTunen, A. J.,and Shaper, N. L. (1989) J. Bi
ol. Chem. 264,14290-14297、 Narimatsu, H.,Sinha,
S., Brew, K., Okayama, H., and Qasba, P.K. (1986)
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 4720-4724)され、
それらの遺伝子操作により細胞の糖化の型を改変するこ
とが可能となり著明に解決されてきた(Ikematsu, S., K
aname, T., Ozawa, M., Yonezawa, S., Sato, E.,Uehar
a, F., Obama, H., Yamamura. K., and Muramatsu, T.
(1993) Glycobiology. 3, 575-580、 Ioffe, E., and S
tanley, P. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 91,
728-732、 Metzler, M., Gertz, A., Sarkar, M., Sch
achter, H., Schrader, J. W., and Marth, J.D. (199
4) EMBO J. 13, 2056-2065)。例えば、培養細胞におい
て炭水化物をリモデルし、実験動物において炭水化物を
遺伝子的に修飾することが試みられ(Takamiya,K., Yama
moto, A-, Furukawa, K., Yamashiro, S., Shin,M., Ok
ada, M., Fukumoto, S., Haraguchi, M., Takeda, N.,F
ujimura, K., Sakae, M., Kishikawa,M., Shiku, H., F
urukawa,K., and Aizawa, S. (1996) Proc. Natl. Aca
d. Sci.U.S.A. 93,10662-10667)、予想されなかった又
は明確には知られていなかった炭水化物の新規な機能が
見出された。

【０００４】複合型ガングリオシドのうち、GM1は最も
研究されているものであり、脊椎動物の脳に存在する主
なガングリオシドである。GM1はまた、コレラトキシンB
サブユニットと特異的に結合してcAMP応答(Holmgren,
J., Lonnroth, I., Mansson,J. E., and Svennerholm,
L.(1975) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 2520-25
24)のような重要な生物学的現象をもたらすことが知ら
れている。さらに、GM1はFSH及びLHのようなペプチドホ
ルモンのレセプター機能に関与していること、及び神経
系の多くの病理的状況に対する治療応用に効果的である
ということも知られている。

【０００５】しかしながら、複合型ガングリオシドの生
理学的機能についての詳細な分析にとって、個々の構造
の合成にあずかるグリコシルトランスフェラーゼの遺伝
子についていまだ利用可能となっていないという問題が
あった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、以上の
問題に鑑み鋭意研究し、複合型ガングリオシドの生理学
的機能の詳細な分析のために、個々の構造の合成にあず
かるグリコシルトランスフェラーゼの遺伝子を利用可能
とすることに成功したものである。すなわち、本発明者
等は、β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ(EC 2.4.
1.-)(β1,3Gal-T)遺伝子であって、その産物がGD1bの発
現を決定するようなcDNAクローンの単離に成功した。さ
らに、該cDNAを適当なプレカーサー構造を有する種々の
細胞系に導入することにより、また、該cDNA遺伝子を導
入された細胞からの抽出液を用いたインビトロアッセイ
から、該酵素が、GM1及びアシアロ-GM1(GA1)の合成を触
媒することを見出した。また、該酵素のラット組織間、
及びラット脳における遺伝子の発現パターンについても
重要な知見を得、係る知見に基づき本発明を完成するに
至った。

【０００７】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明におい
ては、抗GD1bモノクローナル抗体を用いて、β1,3-ガラ
クトシルトランスフェラーゼ遺伝子（β1,3-galactosyl
transferase gene）（EC 2.4.1.62）のcDNAの発現クロ
ーニングを行うものである。このため、ポリオーマＴ抗
原遺伝子とGM2/GD2シンターゼcDNAを用いて遺伝子導入
されたマウスメラノーマ株B16であるKF4Cが、cDNAライ
ブラリー遺伝子導入のための受容細胞株として使用され
る。また、GD3シンターゼのcDNAクローンであるpD3T-31
は、ラット脳RNAとpcDNAI発現ベクターを用いて調製し
たcDNAライブラリーと共に共-遺伝子導入(co-transfec
t, co-transfection)する。

【０００８】さらに、本発明によれば、単離されたcDNA
クローンpM1T-9は、その遺伝子産物がサイトプラスミッ
クドメインの４アミノ酸、トランスメンブレンドメイン
の２１アミノ酸、及び大きな触媒ドメイン(catalytic d
omain)の３４６アミノ酸を有するタイプIIの膜タンパク
質であることを示唆するものである。

【０００９】また、本発明において、GM2/GD2シンター
ゼ遺伝子を導入したマウスメラノーマ株B16に該cDNAを
導入することにより、GM1の新合成(neo-synthesis)をも
たらす。

【００１０】さらに、本発明において、該細胞系にpM1T
-9及びGD3シンターゼcDNAをco-transfectした場合にGM1
同様GD1bも発現することを見出した。さらに、pM1T-9
の、あらかじめGM2/GD2シンターゼ遺伝子を遺伝子導入
したL細胞株（GM3シンターゼ欠失）への導入は、アシア
ロ-GM1（asialo-GM1)を発現することを見出した。上記
本発明における知見によれば、酵素分析により示唆され
たように、GD1b/GM1/GA1シンターゼが同一であることを
確認するものである。

【００１１】さらに、本発明においては、β1,3-ガラク
トシルトランスフェラーゼ遺伝子の、ラット組織からの
全RNAを用いたノーザンブロットにおいて、1.6kb mRNA
が、脾臓、胸線、腎臓、および精巣において強く発現さ
れるという知見を得た。さらに、成体ラットの脳組織に
おける遺伝子の発現レベルは特に高くない一方、該遺伝
子は、胎生１２日のラット胎仔脳においては高いレベル
であり、出生とともにピークに達し、その後成体ラット
の脳と同程度の低レベルへ落ちるという知見を得た。

【００１２】すなわち、本発明は、配列表の配列番号１
に記載のアミノ酸配列のうち２６位のSerから３７１位
のSerまでのアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列に対
して１以上、通常１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換
又は付加されたアミノ酸配列を含んでなる、β1,3-ガラ
クトシルトランスフェラーゼ活性を有する糖転移酵素を
提供するものである。

【００１３】また、本発明は、配列表の配列番号１に記
載のアミノ酸配列のうち１位のMetから３７１位のSerま
でのアミノ酸配列、又は前記アミノ酸配列に対して１以
上、通常１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加
されたアミノ酸配列を含んでなる、β1,3-ガラクトシル
トランスフェラーゼ活性を有する糖転移酵素を提供する
ものである。

【００１４】さらに、上記記載の糖転移酵素をコードす
るポリヌクレオチドを提供するものである。

【００１５】また、本発明は、配列表の配列番号２に記
載の塩基配列のうち２７０位のTから１３０７位のTまで
の塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供するもので
ある。

【００１６】また、本発明は、配列表の配列番号２に記
載の塩基配列のうち１９５位のAから１３０７位のTまで
の塩基配列を有するポリヌクレオチドを提供するもので
ある。

【００１７】さらに、本発明は、配列表の配列番号２に
記載の塩基配列とハイブリダイズし、かつβ1,3-ガラク
トシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質（糖転移
酵素）をコードするポリヌクレオチドを提供するもので
ある。このようなハイブリダイズするDNA又はRNAは、好
ましくはβ1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を
保持しているものであり、ストリンジェントな条件下、
例えば50%ホルムアミド、5xSSC、10% Na-デキストラ
ン、 20mM Na-ホスフェート(pH6.5)、42℃のハイブリダ
イゼーション条件下で前記ポリヌクレオチドとハイブリ
ダイズするものである。

【００１８】以下、本発明を実施の形態に即してより詳
細に説明する。なお、本明細書および図面において、塩
基やアミノ酸等などの略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ
−ＩＵＢによる略号あるいは当該分野における慣用の略
号を使用した。

【００１９】 （核酸） ＤＮＡ デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ 相補的ＤＮＡ ＲＮＡ リボ核酸 ｍＲＮＡ メッセンジャーＲＮＡ Ａ アデニン Ｃ シトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン （その他） ＴＬＣ thin layer chromatography Trf transfectionまたはtransfectant β-1,4 GalNAc-T β1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase β-1,3 Gal-T β1,3-galactosyltransferase α2,8S-T α2,8 sialyltransferase CMP-NeuAc cytocine monophosphate-N-acetylneuraminic acid UDP-GalNAc uridine diphosphate-N-acetylgalactosamine UDP-Gal uridine diphosphate galactose CT-B cholera toxin B Et.Br. Ethydium bromide

【００２０】

【発明の実施の形態】材料及び方法 （細胞及び抗体）マウス細胞株KF4Cは、KF3027(Nagata,
Y., Yamashiro, S., Yodoi, J., Lloyd, K. O., Shik
u, H., and Furukawa, K. (1992) J. Biol. Chem. 267,
12082-12089)のプラスミドpMIK-Hyg/M2T1-1（pMIK/Hyg
ベクターにGM2/GD2シンターゼcDNAをインサートしたも
の）の安定な遺伝子導入体である。B78-2は、B78（B16
のサブライン）へのpM2T1-1の安定な遺伝子導入体であ
る(Nagata, Y., Yamashiro, S., Yodoi, J., Lloyd, K.
O., Shiku, H., and Furukawa, K. (1992) J. Biol.Ch
em. 267, 12082-12089)。これらの細胞は、ハイグロマ
イシン(hygromycin,250μg/ml)（Calbiochem-Novabioch
em、ラホヤ,CA）添加又は無添加のDulbecco改良イーグ
ル最小必要培地(D-MEM)7.5%牛胎児血清(FCS)及び300μg
/mlのG418(Sigma、セントルイス,Mo）中で保持できる。

【００２１】L1-17は、GM2/GD2シンターゼcDNAクローン
の遺伝子導入L細胞である。すなわちpCDM8(Nagata, Y.,
Yamashiro, S., Yodoi, J., Lloyd, K. O., Shiku,
H.,and Furukawa, K. (1992) J. Biol. Chem. 267, 120
82-12089)に組込まれたpM2T1-1と、pSV2neoの遺伝子導
入体であり、アシアロ-GM2発現性である。GD1bと特異的
に反応するモノクローナル抗体(mAb370)及び、抗アシア
ロ-GM1モノクローナル抗体(mAb229)は本発明者等により
以下のように作製可能である。

【００２２】すなわち、リポソームにそれぞれのガング
リオシドを組込んでAKRマウスに２週間隔で免疫後、そ
の脾臓細胞をNS-1ミエローマ細胞と融合する。HAT培地
で選択後、培養上清を用いてガングリオシドに対するEL
ISAを行い、特異的抗体をピックアップする。

【００２３】（プラスミド及びcDNAライブラリー）ラッ
ト脳cDNAライブラリーはpoly(A)⁺RNAと、pcDNAI発現ベ
クター(Invitrogen, サンジエゴ、CA)を用いて作製可能
である。このライブラリーは、3.5x10⁶個以上の独立し
たコロニーを含んでいるものが好ましい。

【００２４】宿種バクテリアとしてはE.Coli MC1061/P3
を使用可能である。

【００２５】プラスミドpMIK/D3T-31は、GD3シンターゼ
cDNAクローンであるpD3T-31(Haraguchi, M., Yamashir
o, S., Yamamoto, A., Furukawa, K.,Takamiya, K.,Llo
yd, k. 0., Shiku, H., and Furukawa, K.(1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 10455-10459)のXhoIフ
ラグメントを、pMIK/Neo発現ベクター（東京医科歯科大
学、丸山博士より提供。新細胞工学実験プロトコール、
「発現プラスミドの構築」254-259ページ、東京大学医
科学研究所編、秀潤社、1993年）へインサートして作製
することが可能である。

【００２６】（β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ
のcDNAクローンの単離）cDNAライブラリーのプラスミド
は従来方法に基づき(Davis, L. G., Dibner, M. D., an
d Battey, J. F.(1986) Methods in Molecular Biolog
y, Elsevier Science. 285-289)、一度増殖し、プラス
ミドpMIK/D3T-31と共にDEAEデキストラン（Pharmacia B
iotech,Uppsala)を用いてKF4C細胞へ遺伝子導入するこ
とが可能である。

【００２７】例えば、10cm皿（Corning, Corning,NY)の
サブコンフルエントKF4C細胞1.5x10⁶個に、8μgずつのc
DNAライブラリープラスミド及びpMIK/D3T-31を共-遺伝
子導入することで可能である。さらに、60分後、10%DMS
O/PBSにて２分間処理した後、２日間培養し、遺伝子導
入した細胞をプレートから剥がし、1:200希釈でmAb370
と氷上45分間インキュベートする。細胞をヤギ抗マウス
IgM(Cappel, Durham, NC)でコートした皿に移す（Wysoc
ki, L. J., and Sato, V. L. (1978) Proc. Natl. Aca
d.Sci. U.S.A. 75, 2844-2848)。プラスミドDNAは、パ
ンニングされた細胞から、Hirt抽出液を作製することに
より採りだし可能であり、MC1061/P3へ形質転換するこ
とが可能である。拡張したプラスミドDNAを再度遺伝子
導入し、同じ操作を繰返す（例えば４回）。その後、そ
れぞれ30コロニーを含む96群を調製し、mAb370結合活性
の発現によりスクリーニングすることが可能となる。い
くつかの陽性群（例えば２つ）から適当数（例えば17）
のクローンをスクリーニングし、KF4C上でGD1bを発現す
る単一コロニー（例えば３つ）をミクロスケールDEAEデ
キストラン遺伝子導入及び免疫蛍光(IF)アッセイを用い
て単離することが可能である。

【００２８】（DNAシークエンス）単離したcDNAプラス
ミドはXhoI及びHindIIIで消化し、ファージミドブルー
スクリプト(pBSK)KS(+)ベクターにクローニングするこ
とが可能である。このクローンの欠失変異体は、例え
ば、Kilo-Sequence欠失キット(Takara, Kyoto)により調
製できる。

【００２９】ダイデオキシヌクレオチドターミネション
塩基配列決定方法としては、T3/T7ダイプライマー又
は、４種類の追加のカスタムプライマーとＰＲＩＳＭダ
イターミネーターサイクルシークエンスキットを用い
て、モデル377DNAシークエンサー(Applied Biosystems,
Foster City,CA)により行うことが可能である。

【００３０】（β1,3Gal-T遺伝子）マウスメラノーマ細
胞株、KF-4C及びGM2発現細胞株78-2を、トランジエント
及び安定な発現システムのための受容細胞として用いる
ことが可能である。

【００３１】GM1のトランジエントな発現のために、pM1
T-9/cDNAIベクターをKF-4CへDEAE-デキストランにより
遺伝子導入する。

【００３２】GD1bのトランジエント発現のために、KF-4
CへpMIK-neo／D3T-31とpM1T-9/cDNAIとをco-transfect
する。

【００３３】GA1のトランジエント発現のために、GA2発
現L1-17細胞に、pM1T-9/cDNAIを遺伝子導入する。これ
らのガングリオシドの発現は例えば、IFアッセイとフロ
ーサイトメトリーにより検出可能である。

【００３４】GM1とGD1b発現の安定遺伝子導入体調製の
ために、pM1T-9/cDNAI及びpMIK-Hyg/D3T-31を、例えば
リン酸カルシウム沈殿法(Davis, L. G., Dibner, M.
D., andBattey, J. F.(1986) Methods in Molecular Bi
ology, Elsevier Science. 290-292)によりB78-2にco-t
ransfection可能である。遺伝子導入体を選択するた
め、細胞は、G418(300μg/ml)及びハイグロマイシン(25
0μg/ml）を含むD-MEM/7.5%FCS中で培養する。これらの
安定遺伝子導入体のガングリオシドの発現はIFアッセイ
及びフローサイトメトリーにより行う。

【００３５】（フローサイトメトリー分析）ガングリオ
シド発現はマウスmAb370(抗GD1b)、mAb229(抗GA1)及びF
ITC結合コレラトキシンBサブユニット(List Biological
Laboratories, Cambell, CA)(GM1)を用いて行う。具体
的には、mAbs370及び229では細胞をmAbsと45分間氷上で
インキュベートし、FITC結合ウサギ抗マウスIgMと氷上4
5分間、染色する。

【００３６】また、細胞表面のGM1を分析するため、細
胞はFITC結合コレラトキシンBサブユニットと45分間イ
ンキュベートし、FACScan（Becton Dickinson, Mountai
n View, CA)上でフローサイトメトリーにより分析す
る。染色の強度は具体的には蛍光強度の対数として任意
単位で測定され、４桁スケールで表示する。

【００３７】フローサイトメトリーのコントロール細胞
としては、例えばGD1bとGA1に関しては２次抗体のみ用
いて調整することが可能である。GM1発現のためには、
ベクターのみの遺伝子導入細胞をFITC結合コレラトキシ
ンBサブユニットで染色して用いる。

【００３８】（RNA単離及びノーザンブロット）RNAは成
体ラット組織及び胎仔ラット脳から、酸フェノールを用
いて抽出可能である(Chomczynski, P., and Sacchi, N.
(1987) Anal. Biochem.162, 156-159)。具体的には、
全RNA(20μg）を1.2%アガロース-ホルムアルデヒドゲル
上で分離し、GeneScreenPlus膜(Dupont, Boston,MA)上
へ移す。［α-³²P］-dCTP標識ラットβ1,3Gal-T cDNA
(pM1T-9)、又はβアクチンcDNA(ヌクレオチド69-814)プ
ローブとのハイブリダイズは公知の条件(Nagata, Y., Y
amashiro, S., Yodoi, J.,Lloyd, K. O., Shiku, H., a
nd Furukawa, K. (1992) J. Biol. Chem. 267, 12082-1
2089)で可能であり、分析は、BAS2000Bio-Imaging分析
機(Fuji film、Tokyo）等の使用により可能である。

【００３９】（糖脂質の抽出及び薄層クロマトグラフィ
(TLC)免疫染色）β1,3Gal-T遺伝子の安定遺伝子導入体
は、B78-2メラノーマへのクローン化プラスミド及びpMI
K-Hyg/D3T-31（α2,8シアリルトランスフェラーゼ(α2,
8S-T)cDNA）の、リン酸カルシウム沈殿によるco-transf
ectionにより得られる。G418とハイグロマイシン耐性ク
ローンのうち、GD1b発現クローンを、IFアッセイ及びフ
ローサイトメトリーの結果に基づいて選択することが可
能である。糖脂質は従来の方法により単離可能である(F
urukawa, K., Clausen, H., Hakomori, S., Sakamoto,
J., Look,K., Lundblad, A., Mattes, M. J., and Lloy
d, K. O. (1985)Biochemistry. 24, 7820-7826)。具体
的には、約300μｌの遺伝子導入細胞のパックされた細
胞塊と、Hyg遺伝子のみを含むコントロールクローンか
ら、クロロホルム/メタノール(2:1,1:1,1:2)で順に抽出
できる。脱塩後、ガングリオシドはDEAEーセファデック
スA-50(Pharmacia LKB)イオン交換クロマトグラフィに
より分離できる。TLCは、具体的には高精度TLCプレート
(Merck,Darmstdt)により、クロロホルム/メタノール/2.
5N NH₄OH(60:35:8)を用いて行いうる。成分はレゾルシ
ノールを噴霧して可視化できうる。新規合成ガングリオ
シドは、アルミニウム板上のシリカゲルプレート(Merc
k)によりTLC免疫染色が可能である(Furukawa, K.,Claus
en, H., Hakomori, S., Sakamoto, J., Look,K., Lundb
lad, A., Mattes,M. J., and Lloyd, K. O. (1985)Bioc
hemistry. 24, 7820-7826)。TLC後、プレートを乾燥
し、ポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜上に移す。プ
レートは非特異的吸着をブロックするため1%ウシ血清ア
ルブミンを含むリン酸緩衝液／食塩水中で１時間インキ
ュベートした後、mAbsと１時間室温でインキュベート
し、さらにビオチン化ウサギ抗マウスIgG及びアビジン
ービオチン複合体とインキュベートする。この目的で例
えばVectastain ABC-POキット（Vector laboratories,
CA)を使用可能である。

【００４０】（酵素アッセイ）β1,3Gal-Tは、公知の方
法で測定できる(Ruan, S., and Lloyd, K. O. (1992)Ca
ncer Res. 52, 5725-5731)。具体的には、膜分画を調製
するために、サンプルを窒素空洞化装置を用いて溶解す
る。核は低速遠心で除去し、上清を105,000gで１時間４
℃で遠心する。

【００４１】β1,3Gal-Tの酵素活性を分析するには、具
体的には反応混合物は次の成分を50μｌに含むものであ
る。150mM MnCl₂、0.375% TritonCF-54(Sigma)、UPD-［
¹⁴C］Gal（2.0x10⁵dpm）(NEN、Boston、MA）、及び100
μgのタンパク質を含む膜分画である。これを２時間３
７℃でインキュベートした後、生成物はC18Sep-Packカ
ートリッジ(Waters,Milford,MA)で単離し、さらにTLC及
びフルオログラフィ(Yamashiro, S., Ruan, S., Furuka
wa, K., Tai, T., Lloyd, K. O.,Shiku, H., and Furuk
awa, K. (1993) Cancer Res. 53, 5395-5400)で分析す
る。

【００４２】（ホモロジー検索）ヌクレオチド及びアミ
ノ酸配列ホモロジー検索は、インターネットプログラム
BLAST(Natioal Center for Biotechnology Informatio
n)を用いて行うことが可能である。またアミノ酸配列と
疎水/親水性分析は、ソフトウヱアGENTYX-MACver6.1.0
(Software Development、Tokyo）で行うことができる。

【００４３】

【実施例】（GD1bシンターゼcDNAの発現クローニングの
方法）GD1bシンターゼ遺伝子のcDNAクローンを単離する
ために、β1,4-N-アセチルガラクトサミニルトランスフ
ェラーゼ(β1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase,
β1,4GalNAc-T）cDNAであるpM2T1-1のKF3027への遺伝
子導入体を調製して、GM2発現の新規細胞株を得、この
株をKF4Cと命名した。図１に示されるようにα2、8S-T
cDNA、pD3T-31及びライブラリーに含まれるβ1、3Gal-T
cDNAのco-transfectionの後、GD1bの発現が可能とな
る。

【００４４】（GD1bシンターゼ遺伝子のcDNAクローンの
単離）cDNAライブラリーの遺伝子導入と、抗GD1b mAb37
0によるパニング及びHirt抽出を５サイクルの後、pM1T-
9というcDNAクローンが単離された。pM1T-9のpD3T-31と
KF4Cへのco-transfectionの後、GD1bの新規発現が図２
Ｂに示されるように観察された。これらのトランジエン
ト遺伝子導入細胞において、図２Ａに示すようにFITC結
合コレラトキシンBにより染色した際、GM1もまた新しく
発現された。

【００４５】従って、GD1bシンターゼとGM1シンターゼ
は同一であり、単一の遺伝子によりコードされているこ
とが強く示唆される（Iber, H., Kaufmann, R., Pohlen
tz,G., Schwarzmann, G., and Sandhoff, K. (1989) FE
BS Lett. 248, 18-22)。さらに確認するために、KF4Cに
pM1T-9のみを遺伝子導入し、GD1bとGM1の発現を調べ
た。これらの遺伝子導入体はGM1は発現したがGD1bはし
なかった。このことは想定されているガングリオシド合
成経路(Iber, H., Kaufmann, R., Pohlentz, G., Schwa
rzmann, G., and Sandhoff, K. (1989) FEBS Lett. 24
8, 18-22)と一致するものである。さらに、この酵素
は、アシアロ-GM2(GA2)からアシアロ-GM1(GA1)の合成を
触媒するGA1シンターゼと同一であると考えられてき
た。そこで、このcDNAの遺伝子導入によるGA1の合成の
有無を調べるために、pM2T1-1により遺伝子導入されたL
細胞を、pM1T-9の受容細胞として用いた。L細胞は、GM3
シンターゼ活性(Yamashiro, S., Haraguchi, M., Furuk
awa, K., Takamiya, K-,yamamoto, A., Nagata, Y., Ll
oyd, K. O., Shiku, H., and Furukawa, K. (1995) J.
Biol. Chem. 270, 6149-6155)を欠いているために、す
べての複合型ガングリオシドを欠いている。図２に示す
ように、pM2T1-1（安定）とpM1T-9（トランジエント）
によるL細胞への遺伝子導入は、GA1特異的mAb229により
検出されるように明確にGA1を発現した。

【００４６】（β1,3Gal-T活性及びその生成物の確認）
本発明により、B78-2（pM2T1-1によるB78の遺伝子導入
細胞株）を用いて、pM1T-9又はpM1T-9とpMIK/D3T-31の
安定な遺伝子導入細胞を確立した。フローサイトメトリ
ーはGM1（図３Ｂ）又はGM1/GD1b（図３Ｄ）の新規なそ
して有意な合成レベルを示した。親細胞（B78/M2T1-
1）、及び二重の遺伝子導入体（B78/M2T1-1/M1T-9/D3T-
31）から抽出されたグリコスフィンゴリピド(glycosphi
ngolipid)がTLCにより分析され、糖脂質成分の変換が予
想の通り見出された（図４）。 また、二重遺伝子導入
細胞中に、特異的GD1bバンドがTLC-免疫染色により示さ
れた。この結果より、クローン化されたcDNA pM1T-9
は、GD1b/GM1/GA1シンターゼ遺伝子から由来するという
ことが示された。

【００４７】（pM1T-9のインサートの配列）図５に、該
クローンのHindIIIとXhoIサイト間のHindIII-XhoIフラ
グメントを有するpBSKを構築しその塩基配列分析により
決定されたpM1T-9のインサートの全配列を示した（配列
表の配列番号２参照）。これまで単離された他のグリコ
シルトランスフェラーゼcDNAと比較して、このcDNAは相
対的に小さいサイズであり、全サイズは1613bpである。
194bpの5'-非翻訳領域と、1113bpの連続オープンリーデ
ィングフレームと、306bpの3'-非翻訳領域で成ってい
る。単一のポリアデニル化シグナルと、70以上のポリア
デニル化領域が存在する。

【００４８】オープンリーディングフレームの最初にあ
る開始コドンはKozak共通開始配列(Kozak, M. (1986) C
ell. 44, 283-292)と似た配列内に埋め込まれている。
このオープンリーディングフレームは、分子量40,976.1
ダルトンの371のアミノ酸からなるタンパク質を予想さ
せる（配列表の配列番号１参照）。最近の利用可能なタ
ンパク質及び核酸データベースの検索によっても、該cD
NAと有意のホモロジーを有する他の遺伝子は見出されな
かった。４つの他のガラクトシルトランスフェラーゼ遺
伝子、即ちα1、3Gal-T(Joziasse, D. H., Shaper, J.
H., Van den Eijnden, D. H., Van Tunen, A. J., and
Shaper, N. L. (1989) J. Biol. Chem.264,14290-1429
7)、β1,4Gal-T(Narimatsu, H., Sinha, S., Brew, K.,
Okayama, H., and Qasba, P.K. (1986) Proc. Natl. A
cad. Sci. U.S.A. 83, 4720-4724)、GalCer-Gal-T(Schu
lte, S., and Stoffel, W. (1993) Proc. Natl. Acad.
Sci.U.S.A. 90, 10265-10269；Stahl, N., Jurevics,
H., Morell, P., Suzuki, K., and Popko, B.(1994) J.
Neurosci. Res. 38, 234-242）及び血液型Ｂシンター
ゼα1、3Gal-T（Yamamoto, F., Marken, J., Tsuji,
T., White, T., Clausen, H.,and Hakomori, S. (1990)
J. Biol. Chem. 265, 1146-1151）でさえ、わずか10-1
6%程度のアミノ酸配列におけるホモロジーを示すだけで
あった。

【００４９】予想されるアミノ酸配列の検索及びハイド
ロパシー解析は、このタンパク質が今まで知られたグリ
コシルトランスフェラーゼと同様の構造上の特徴を有す
ることを示唆している。アミノ末端近傍に単一の疎水的
セグメントがあり、これは21のアミノ酸からなる。この
推定されるシグナルアンカー配列はサイトゾル内に４残
基を配置し、346アミノ酸をゴルジ体内腔に触媒領域と
して配置すると考えられる。予想されるアミノ酸配列
は、単一のN-グリコシル化部位が143位-145位に存在
し、プロリン豊富領域が42位-71位(11/30)に存在するこ
とを示す。以上の結果から、該酵素活性発現に必要な最
小部位は、細胞膜貫通部位と細胞質領域を除く、２６位
のアミノ酸から末端の３７１位までである。

【００５０】（β1,3Gal-TcDNAの産物はガラクトースを
GD2、GM2及びGA2に転移する）pM1T-9のトランジエント
及び安定遺伝子導入の結果により、この遺伝子は、３つ
の構造、すなわちGD1b、GM1およびGA1の合成を触媒する
単一のβ1,3Gal-Tをコードするものであることが強く示
唆された。

【００５１】安定な遺伝子導入細胞のメンブレンフラク
ションの酵素活性を調べた。図６Ａに示すように、B78
のpMIK/M1T-9及びpD3T-31による安定遺伝子導入体から
のメンブレンフラクションは、20,000units(pmol/h/mg
タンパク質）のGM1シンターゼ活性を示し、一方アクセ
プターを加えない場合は、有意の生成物が検出されなか
った。予想されるように、pMIKベクター自体による遺伝
子導入体はほぼゼロ活性であった。GD2、GA2、GlcCer、
GD1b、GM3及びGD1aを基質として調べた場合、GD2とGA2
はUDP-Galの有意の取込レベルを示した（図６Ｂ）。

【００５２】（ノーザンブロット分析）種々のラット組
織においてβ1,3Gal-T遺伝子の発現レベルを全RNAを用
いてノーザンブロットにより調べた。種々の組織のう
ち、腎臓、精巣、脾臓及び胸線が相対的に高いレベルの
発現を示し、また一方調べたほぼ全ての組織がある程度
のレベルの遺伝子転写物を含んでいた（図７Ａ）。

【００５３】成体ラットの脳組織での遺伝子発現は高く
なかった。すなわち、遺伝子発現を、ラット脳の成長段
階で分析した結果、該遺伝子はすでに１２日胎仔脳に検
出され、生まれるまでは高レベルで維持されたが（図７
Ｂおよび図８）、成体ラット脳では発現レベルは低く維
持される。

【００５４】

【発明の効果】本発明により、GD1/GM1/GA1シンターゼ
遺伝子の同一性が示される。すなわち、GD1bシンターゼ
cDNAを単離し、その遺伝子産物が、GalNAcβ1->4Gal-、
GalNAcβ1->4(NeuAcα2->3）Gal-又はGalNAcβ1->4(Neu
Acα2->8NeuAcα2->3)Gal-のいずれの末端配列を有する
糖脂質をもアクセプターとして使うことを示すものであ
る。

【００５５】GM2/GD2シンターゼ(Yamashiro, S., Harag
uchi, M., Furukawa, K., Takamiya, K-,yamamoto, A.,
Nagata, Y., Lloyd, K. O., Shiku, H., and Furukaw
a, K.(1995) J. Biol. Chem. 270, 6149-6155)の基質特
異性分析の場合、GA2合成は相対的に低いものである
が、これと比較して、本発明に基づき、β1,3 Gal-T
の、GM2,GD2,GA2に対するアクセプター活性はそれほど
異ならないことが示唆された（図６Ｂ）。

【００５６】さらに本発明に基づき、係るガングリオシ
ドの生理学的重要性はそれらのグリコシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子の遺伝的改変により、より生理学的に研究
され得ることとなる。すなわち、β1,3Gal-T遺伝子の遺
伝子操作により最終的には、GD1b/GM1/GA1より高級の複
合型ガングリオシドの役割の解明を可能とするものであ
る。

【００５７】例えば、既に述べたように、ガングリオシ
ドは脊椎動物の神経系の発達上、重要な役割をする分子
であり、特にGM1はインビボ及びインビトロでその生理
的効果が活発に研究されている。例えば毒物剤、神経外
傷、虚血性損傷、変性疾患および機械的侵襲などによる
障害に対する修復効果等である(Sabel, B. A., Slavin,
M.D., and Stein, D. G. (1984) Science. 225, 340-3
42, Kapriak, S. E. (1984) Adv. Exp. Med. Biol. 17
4, 489-497,Svennerholm, L. (1994) Life Sci.55, 212
5-2134)。また、インビトロ培養系においてのGM1ガング
リオシドの添加は、神経細胞の神経突起の伸張を誘導又
は亢進させうる(Facci, L., Leon, A.,Toffano, G., So
nnino, S., Ghidoni, R., and Tettamanti, G. (1984)
J. Neurochem. 42,299-305)。実際、複合ガングリオシ
ドを欠くβ1,4GalNAc-T遺伝子の破壊されたマウスは、
神経伝達速度の減少(Takamiya, K., Yamamoto, A-, Fur
ukawa, K., Yamashiro, S., Shin,M., Okada, M., Fuku
moto, S., Haraguchi, M.,Takeda, N.,Fujimura, K., S
akae, M., Kishikawa, M., Shiku, H., Furukawa,K., a
nd Aizawa, S. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
93,10662-10667)や行動異常等の明確な神経系の機能障
害を示す。これらの効果に対応する生理学的機能の解明
のため、本発明において見出された、ラット脳の発達段
階にのみ見られるβ1,3Gal-T遺伝子の高い発現は、脳組
織の分化におけるガングリオシド生成物の重要な役割を
示唆するものであり、ガングリオシドやその合成酵素遺
伝子の治療方法、治療薬への応用を可能とするものであ
る。

【００５８】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：371 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Pro Leu Ser Leu Phe Arg Arg Leu Leu Leu Ala Val Leu Leu 5 10 15 Leu Val Ile Ile Trp Thr Leu Phe Gly Pro Ser Gly Leu Gly Glu 20 25 30 Glu Leu Leu Ser Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Pro Ala Pro Ala 35 40 45 Ser Pro Gly Pro Pro Leu Ala Leu Pro Arg Leu Leu Ile Pro Asn 50 55 60 Pro Gln Ala Cys Gly Gly Ser Gly Pro Pro Pro Phe Leu Leu Ile 65 70 75 Leu Val Cys Thr Ala Pro Glu His Leu Asn Gln Arg Asn Ala Ile 80 85 90 Arg Gly Ser Trp Gly Ala Ile Arg Glu Ala Arg Gly Phe Arg Val 95 100 105 Gln Thr Leu Phe Leu Leu Gly Glu Pro Met Gly Gln Gln Phe Ala 110 115 120 Asp Leu Ala Ser Glu Ser Ala Ala Gln Gly Asp Val Leu Gln Ala 125 130 135 Ser Phe Gln Asp Ser Tyr Arg Asn Leu Thr Leu Lys Thr Leu Thr 140 145 150 Gly Leu Asn Trp Val Asn Lys Tyr Cys Pro Met Ala Arg Tyr Ile 155 160 165 Leu Lys Thr Asp Asp Asp Val Tyr Val Asn Val Pro Glu Leu Val 170 175 180 Ser Glu Leu Ile Gln Arg Gly Gly Pro Ser Glu Gln Trp Gln Lys 185 190 195 Gly Lys Glu Pro Gln Glu Glu Thr Thr Ala Val His Lys Glu His 200 205 210 Lys Gly Gln Ala Val Pro Leu Leu Tyr Leu Gly Arg Val His Trp 215 220 225 Arg Val Arg Pro Thr Arg Thr Pro Glu Ser Arg His His Val Ser 230 235 240 Glu Glu Leu Trp Pro Glu Asn Trp Gly Pro Phe Pro Pro Tyr Ala 245 250 255 Ser Gly Thr Gly Tyr Val Leu Ser Ile Ser Ala Val Gln Leu Ile 260 265 270 Leu Lys Val Ala Ser Arg Ala Pro Tyr Leu Pro Leu Glu Asp Val 275 280 285 Phe Val Gly Val Ser Ala Arg Arg Val Gly Leu Ala Pro Thr His 290 295 300 Cys Val Lys Leu Ala Gly Ala Thr His Tyr Pro Leu Asp Arg Cys 305 310 315 Cys Tyr Gly Lys Phe Leu Leu Thr Ser His Lys Val Asp Pro Trp 320 325 330 Lys Met Gln Glu Ala Trp Lys Leu Val Arg Gly Leu Asn Gly Arg 335 340 345 Arg Thr Glu Pro Phe Cys Ser Trp Leu Gln Gly Phe Leu Gly Thr 350 355 360 Leu Arg Cys Arg Phe Ile Ala Trp Leu Asn Ser 365 370 配列番号：2 配列の長さ：1613 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GGCGAGGGGA ACCAAGCTGT CCCCGGGGCC GGCTGCGGTG GGTCGGGACC GGAGTGCATG 60 AGACTGACTG CATCTCATGA TGCTACCGGG CCCGTGCATG GCTCACCCCG TCTCTGCTGC 120 AGCAGCTGGT TAGGGCCGCT CTCGCAGCTC CCAGCGCTCT TAACAGCTCT GCCCACAGGT 180 CTCTGCGGCT CACC ATG CCC CTC AGC CTC TTC CGG CGC CTC CTT CTG GCG 230 GTC CTA CTA CTG GTG ATC ATC TGG ACA CTG TTT GGA CCA TCG GGT 275 TTG GGG GAG GAG CTG CTG AGC CTG TCC CTG GCG TCC CTT CTG CCA 320 GCC CCA GCC TCG CCA GGA CCA CCC CTG GCC CTG CCC CGC CTC TTG 365 ATT CCT AAC CCC CAG GCC TGT GGT GGC TCC GGA CCC CCT CCT TTC 410 TTG CTC ATC CTG GTG TGT ACG GCC CCG GAG CAC CTG AAC CAG AGA 455 AAC GCC ATT CGG GGA TCT TGG GGC GCC ATT CGC GAG GCC CGC GGT 500 TTC AGG GTG CAG ACG CTC TTC CTC CTG GGA GAA CCT ATG GGA CAG 545 CAG TTT GCT GAC CTG GCC TCA GAG TCA GCA GCA CAG GGG GAT GTC 590 TTG CAG GCC TCC TTC CAG GAT TCC TAC CGC AAC CTC ACC CTC AAG 635 ACC CTC ACC GGA CTG AAC TGG GTG AAC AAA TAC TGT CCT ATG GCC 680 CGG TAC ATC CTC AAG ACA GAT GAT GAC GTG TAT GTC AAT GTC CCA 725 GAG CTG GTG TCA GAA CTG ATA CAG AGA GGG GGG CCT TCA GAG CAA 770 TGG CAG AAG GGC AAA GAG CCA CAG GAA GAG ACA ACA GCT GTC CAC 815 AAA GAG CAC AAA GGC CAG GCA GTG CCC CTT CTG TAT TTA GGC CGG 860 GTG CAC TGG AGG GTG AGG CCC ACT CGA ACA CCA GAG TCC CGG CAT 905 CAC GTG TCA GAA GAA CTG TGG CCA GAA AAC TGG GGT CCT TTC CCA 950 CCC TAC GCC TCT GGC ACG GGG TAT GTA TTG TCT ATC TCT GCT GTG 995 CAG CTC ATT CTG AAG GTG GCC AGC CGG GCC CCA TAT CTA CCT CTG 1040 GAG GAT GTC TTT GTG GGA GTA AGC GCA AGG CGA GTG GGC CTT GCC 1085 CCC ACA CAC TGT GTC AAG TTG GCT GGT GCT ACC CAC TAC CCA CTG 1130 GAT AGG TGC TGT TAC GGG AAG TTC CTG CTG ACG TCC CAC AAG GTG 1175 GAT CCT TGG AAA ATG CAG GAA GCC TGG AAG CTG GTG AGA GGA CTG 1220 AAT GGG AGA AGG ACT GAG CCC TTT TGT TCC TGG CTC CAG GGA TTT 1265 CTG GGT ACC TTG AGG TGC CGG TTC ATA GCC TGG CTC AAT AGT 1307 TGAGAGCCTG GGGCCACAGA AAACAAGACA GCACCTCAGG AACTTTTGCC 1357 CCAAAATCAG TGCCCAGGCT GCAGCTCCCC GTGGTGATCT ATTTCCCCAC 1407 AGCAGACTCT GAAGCTGCTA CTGACCAAGG ATAGATAGGG GGCTTGGGGC 1457 CTGGCCTGCC ATCTCCAAAG ACCAGGGAGG GACGAAGCAC AGGGTGTGGG 1507 GAAGACTCAA GAGCCCAATA AACACGTCTC TCTACAAAAA AAAAAAAAAA 1557 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1607 AAAAAA 1613

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、β1,3Gal-Tの抗GD1bmAbを用いたcDNA
クローニングを示す図であり、KF4CはpolyomaT抗原とβ
1,4GalNAc-T遺伝子を導入されており、α2,8シアル酸転
移酵素とβ1,3Gal転移酵素のcDNAが共に発現すると、GD
1bが発現し得ることを示す図である。

【図２】図２は、B78-2及びL1-17において新規ガングリ
オシドのトランジエント発現を示す図である。クローン
化されたcDNA pM1T-9は、GD3シンターゼcDNA、pD3T-31
あり（右）またはなし（左）の条件でDEAE-デキストラ
ン法により遺伝子導入した。GM1,GD1bおよびGA1は60時
間後、フローサイトメトリーにより特異的プローブを用
いて分析した。細線は特異的プローブありの条件での結
果を示し、実線はコントロールを示す。

【図３】図３は、安定遺伝子導入細胞でのGM1/GD1bの発
現を示す図である。B78-2細胞は、pM1T-9のみ（左）ま
たはpM1T-9とpD3T-31（右）により遺伝子導入された。G
M1はＡおよびＢともに発現し、一方GD1bはＤにのみ発現
した。細線はmAbs添加サンプルを、また実線は二次抗体
のみで処理したものを示す。

【図４】図４は、安定遺伝子導入細胞から抽出されたガ
ングリオシドのＴＬＣの結果を示す図である。 Ａ：レーン１及び２はB78から、レーン３はB78-2、レー
ン４はB78-2/M1T-9/D3T-31からの抽出したものである。
レーン１は、10mgのウエット組織から、レーン２〜４は
5mgのウエット組織からのガングリオシドである。標準
は、ウシ脳からのガングリオシドである。使用溶媒は、
クロロホルム/メタノール/2.5N NH₄Cl(60:35:8)であ
る。レゾルシノール噴霧をバンド検出に使用する。 Ｂ：ガングリオシドフラクションのTLC-免疫染色。レー
ン３および４はＡと同様に調製した後、PVDF膜にブロッ
トし、抗GD1b mAb370により染色した（発色にはABCキッ
トを用いた）。

【図５】図５は、クローン化β1,3Gal-T pM1T-9の核酸
配列を示す図である。 上：単一のオープンリーディングフレームに対する演繹
されたアミノ酸配列を塩基配列に加えて示す図である。
２１アミノ酸を有する推定トランスメンブラン領域は二
重線で示す。N-グリコシル化の可能性部位が下線で示さ
れる。ポリアデニル化シグナルが四角でかこまれる。 下：コード領域の演繹されたアミノ酸配列に対する、Ky
te、Doolittle(Kyte, J., and Doolittle, R. F. (198
2) J. Mol. Biol. 157, 105-132)に基づくハイドロパシ
ー分析を示す図である。

【図６】図６は、cDNAの安定遺伝子導入体からの抽出物
のβ1,3Gal-T活性を示す図である。ここでＡは、GM2ア
クセプターを用いた場合の酵素活性（UPD-［¹⁴C］-Gala
ctoseをドナーとして用いる）を示す 。メンブランフラ
クションが親株B78-2とB78-2/M1T-9/D3T-31から調製さ
れ、酵素活性がGM2をアクセプターとして用いて決定さ
れた。GM1バンドが生成物のTLCで観測された。Ｂは、種
々のアクセプター構造に対する相対的β1,3Gal-T活性。
GM2アクセプターの場合を100%とした。

【図７】図７は、β1,3Gal-T遺伝子のノーザンブロット
の結果を示す写真である。Ａは、ラット各組織からの全
RNA20μgをアガロースゲルで分離し、ナイロンメンブレ
ンにブロットする。pM1T-9から調整した³²Ｐ-標識プロ
ーブとのハイブリダイズがなされたものである。Ｂは、
全ラット胎仔（レーン１）、ラット胎仔脳（レーン２〜
３）、またはラット脳（レーン４）のRNAが分離され、
Ａと同様にブロットされたものである。レーン５および
６は脳からのRNA30μgを用いたものである。

【図８】図８は、図７で得られたバンド強度を、エチジ
ウムブロミドで染色された18SrRNAバンド（デンシトグ
ラフ（Signal Analysis, Vienna, VA)にて測定）を用い
て補正し、プロットした図である。繰返し実験の結果を
+-SDで表現した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡田 雅彦 長崎県西彼杵郡長与町嬉里郷1093−５− 401 (72)発明者 古川 圭子 三重県安芸郡河芸町大字影重2963−４ ト ミーハイム202号 (72)発明者 古川 鋼一 愛知県名古屋市北区名城３丁目１−５ 名 城住宅５−402

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列のうち２６位のSerから３７１位のSerまでのアミノ酸
   配列、又は前記アミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸
   の欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含んでな
   る、β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有す
   る糖転移酵素。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
   列のうち１位のMetから３７１位のSerまでのアミノ酸配
   列、又は前記アミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸の
   欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を含んでなる、
   β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有する糖
   転移酵素。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の糖転移酵素を
   コードするポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号２に記載の塩基配列の
   うち２７０位のTから１３０７位のTまでの塩基配列を有
   するポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号２に記載の塩基配列の
   うち１９５位のAから１３０７位のTまでの塩基配列を有
   するポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号２に記載の塩基配列と
   ハイブリダイズし、かつβ1,3-ガラクトシルトランスフ
   ェラーゼ活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオ
   チド。