JP2002085069A - β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の製造方法 - Google Patents
β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 Ｇｂ４合成酵素をコードするＤＮＡを単離
し、その利用法を提供する。 【解決手段】 特定のＤＮＡを細胞に導入し、次いで該
細胞を生育させてβ１,３−Ｎ−アセチルガラクトサミ
ン転移酵素を発現させ、これを採取する工程を少なくと
も含む、酵素活性を維持しているβ１,３−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン転移酵素の製造方法。
し、その利用法を提供する。 【解決手段】 特定のＤＮＡを細胞に導入し、次いで該
細胞を生育させてβ１,３−Ｎ−アセチルガラクトサミ
ン転移酵素を発現させ、これを採取する工程を少なくと
も含む、酵素活性を維持しているβ１,３−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン転移酵素の製造方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、β１,３−Ｎ−ア
セチルガラクトサミン転移酵素をコードするＤＮＡを利
用した該酵素の製造方法、該酵素を利用したグロボシド
(Ｇｂ４)をはじめとする各種糖脂質の糖鎖の製造方法等
に関する。
セチルガラクトサミン転移酵素をコードするＤＮＡを利
用した該酵素の製造方法、該酵素を利用したグロボシド
(Ｇｂ４)をはじめとする各種糖脂質の糖鎖の製造方法等
に関する。
【０００２】
【従来の技術】グリコスフィンゴ脂質は糖転移酵素の連
続した作用により合成される。ラクトシルセラミド(Lac
Cer；Galβ1,4Glc-Cer)に、異なる３種の糖の内の一つ
が付加されると、３種の主要な糖脂質系、すなわち、ラ
クト／ネオラクト系（β1,3-Ｎ-アセチルグルコサミン
が付加）、ガングリオ系（α2,3-シアル酸が付加）、お
よびグロボ系（α1,4-ガラクトースが付加）のいずれか
１種となる。グロボ系糖脂質の一種であるグロボトリア
オシルセラミド(Ｇｂ３；Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer)
は、LacCerにガラクトースが転移してα1,4-結合するこ
とにより生成する。この反応を触媒するGb3/CD77合成酵
素(α1,4-ガラクトース転移酵素)の遺伝子は、本発明者
らによって既にクローニングされている(J.Biol.Chem.,
275(20), p15152-15156 (2000))。
続した作用により合成される。ラクトシルセラミド(Lac
Cer；Galβ1,4Glc-Cer)に、異なる３種の糖の内の一つ
が付加されると、３種の主要な糖脂質系、すなわち、ラ
クト／ネオラクト系（β1,3-Ｎ-アセチルグルコサミン
が付加）、ガングリオ系（α2,3-シアル酸が付加）、お
よびグロボ系（α1,4-ガラクトースが付加）のいずれか
１種となる。グロボ系糖脂質の一種であるグロボトリア
オシルセラミド(Ｇｂ３；Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer)
は、LacCerにガラクトースが転移してα1,4-結合するこ
とにより生成する。この反応を触媒するGb3/CD77合成酵
素(α1,4-ガラクトース転移酵素)の遺伝子は、本発明者
らによって既にクローニングされている(J.Biol.Chem.,
275(20), p15152-15156 (2000))。
【０００３】一方、グロボ系糖脂質の一種であるグロボ
シド(Ｇｂ４；GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer)
は、Ｇｂ３にN-アセチルガラクトサミンが転移してβ1,
3-結合することにより生成するが、この反応を触媒する
Ｇｂ４合成酵素(β1,3-N-アセチルガラクトサミン転移
酵素)の遺伝子のクローニングについては報告されてい
ない。
シド(Ｇｂ４；GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer)
は、Ｇｂ３にN-アセチルガラクトサミンが転移してβ1,
3-結合することにより生成するが、この反応を触媒する
Ｇｂ４合成酵素(β1,3-N-アセチルガラクトサミン転移
酵素)の遺伝子のクローニングについては報告されてい
ない。
【０００４】フォルスマン抗原(GalNAcα1,3GalNAcβ1,
3Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer)は、 Ｇｂ４にN-アセチルガ
ラクトサミンが転移してα1,3-結合することにより生成
する。この反応を触媒するフォルスマン抗原合成酵素
(α1,3-N-アセチルガラクトサミン転移酵素)の遺伝子の
クローニングは既に報告されている（J.Biol.Chem., 27
4(41), p29390-29398 (1999)）。
3Galα1,4Galβ1,4Glc-Cer)は、 Ｇｂ４にN-アセチルガ
ラクトサミンが転移してα1,3-結合することにより生成
する。この反応を触媒するフォルスマン抗原合成酵素
(α1,3-N-アセチルガラクトサミン転移酵素)の遺伝子の
クローニングは既に報告されている（J.Biol.Chem., 27
4(41), p29390-29398 (1999)）。
【０００５】従って、これらグロボ系糖脂質の合成酵素
のなかでクローニングされていないのは、Ｇｂ４合成酵
素の遺伝子のみである。
のなかでクローニングされていないのは、Ｇｂ４合成酵
素の遺伝子のみである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｇｂ４合成
酵素、すなわちβ1,3-N-アセチルガラクトサミン転移酵
素をコードするＤＮＡを単離し、さらにその利用法を提
供することを課題とする。
酵素、すなわちβ1,3-N-アセチルガラクトサミン転移酵
素をコードするＤＮＡを単離し、さらにその利用法を提
供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、β1,3-N-アセ
チルガラクトサミン転移酵素をコードするＤＮＡを単離
してその塩基配列を明らかにし、さらにこのＤＮＡが、
β1,3-N-アセチルガラクトサミン転移酵素を発現するこ
とを確認して、本発明を完成した。
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、β1,3-N-アセ
チルガラクトサミン転移酵素をコードするＤＮＡを単離
してその塩基配列を明らかにし、さらにこのＤＮＡが、
β1,3-N-アセチルガラクトサミン転移酵素を発現するこ
とを確認して、本発明を完成した。
【０００８】すなわち本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）
に示すＤＮＡを細胞に導入し、次いで該細胞を生育させ
てβ１,３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素を発
現させ、これを採取する工程を少なくとも含む、β１,
３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素（Ｇｂ４合成
酵素）の製造方法（以下、「本発明酵素製造方法」とい
う）を提供する。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。ここで（ｂ）に示すＤＮＡは、Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖
中のガラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラク
トサミン残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド
をコードしているものであることが好ましい。
に示すＤＮＡを細胞に導入し、次いで該細胞を生育させ
てβ１,３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素を発
現させ、これを採取する工程を少なくとも含む、β１,
３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素（Ｇｂ４合成
酵素）の製造方法（以下、「本発明酵素製造方法」とい
う）を提供する。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。ここで（ｂ）に示すＤＮＡは、Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖
中のガラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラク
トサミン残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド
をコードしているものであることが好ましい。
【０００９】また本発明は、以下の（Ａ）又は（Ｂ）の
ポリペプチド、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体およ
びＧｂ３糖鎖を接触させて酵素反応させる工程を少なく
とも含む、Ｇｂ４糖鎖の製造方法（以下、「本発明Ｇｂ
４製造方法１」という）を提供する。 （Ａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３３１で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチド。 （Ｂ）アミノ酸配列（Ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配
列からなり、かつＮ−アセチルガラクトサミン供与体か
ら、受容体であるＧｂ３糖鎖中のガラクトース残基のＣ
３位に、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を転移する酵
素活性を有するポリペプチド。
ポリペプチド、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体およ
びＧｂ３糖鎖を接触させて酵素反応させる工程を少なく
とも含む、Ｇｂ４糖鎖の製造方法（以下、「本発明Ｇｂ
４製造方法１」という）を提供する。 （Ａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３３１で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチド。 （Ｂ）アミノ酸配列（Ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配
列からなり、かつＮ−アセチルガラクトサミン供与体か
ら、受容体であるＧｂ３糖鎖中のガラクトース残基のＣ
３位に、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を転移する酵
素活性を有するポリペプチド。
【００１０】また本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）に示
すＤＮＡをＧｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次いで該細胞
を生育させる工程を少なくとも含む、Ｇｂ４糖鎖の製造
方法（以下、「本発明Ｇｂ４製造方法２」という）を提
供する。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。ここで（ｂ）に示すＤＮＡは、Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖
中のガラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラク
トサミン残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド
をコードしているものであることが好ましい。
すＤＮＡをＧｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次いで該細胞
を生育させる工程を少なくとも含む、Ｇｂ４糖鎖の製造
方法（以下、「本発明Ｇｂ４製造方法２」という）を提
供する。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。ここで（ｂ）に示すＤＮＡは、Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖
中のガラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラク
トサミン残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド
をコードしているものであることが好ましい。
【００１１】また本発明は、下記（ａ）又は（ｂ）に示
すＤＮＡと、フォルスマン抗原合成酵素をコードするｃ
ＤＮＡとを共にＧｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次いで該
細胞を生育させる工程を少なくとも含む、フォルスマン
抗原糖鎖の製造方法（以下、「本発明フォルスマン製造
方法」という）を提供する。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。ここで（ｂ）に示すＤＮＡは、Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖
中のガラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラク
トサミン残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド
をコードしているものであることが好ましい。
すＤＮＡと、フォルスマン抗原合成酵素をコードするｃ
ＤＮＡとを共にＧｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次いで該
細胞を生育させる工程を少なくとも含む、フォルスマン
抗原糖鎖の製造方法（以下、「本発明フォルスマン製造
方法」という）を提供する。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。ここで（ｂ）に示すＤＮＡは、Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖
中のガラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラク
トサミン残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド
をコードしているものであることが好ましい。
【００１２】また本発明は、β１,３−Ｎ−アセチルガ
ラクトサミン転移酵素（Ｇｂ４合成酵素）の発現のため
の、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡの使用（以下、
「本発明使用」という）を提供する。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。
ラクトサミン転移酵素（Ｇｂ４合成酵素）の発現のため
の、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡの使用（以下、
「本発明使用」という）を提供する。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において共通して用いる略号は以下の通りであ
る。 Gal：ガラクトース Glc：グルコース GalNAc：N-アセチルガラクトサミン Cer：セラミド LacCer：ラクトシルセラミド(Galβ1,4Glc-Cer) Gb3：グロボトリアオシルセラミド(Galα1,4Galβ1,4Gl
c-Cer) Gb3糖鎖：Gb3の糖鎖(Galα1,4Galβ1,4Glc)。「Gb3糖
鎖」といった場合、Gb3糖鎖を有しているあらゆる物質
（例えば、Gb3自体(Gb3糖鎖にCerが結合した物質)等）
も包含する。 Gb4：グロボシド(GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc-Ce
r) Gb4糖鎖：Gb4の糖鎖(GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Gl
c)。「Gb4糖鎖」といった場合、Gb4糖鎖を有しているあ
らゆる物質（例えば、Gb4自体(Gb4糖鎖にCerが結合した
物質)等）も包含する。 フォルスマン抗原：GalNAcα1,3GalNAcβ1,3Galα1,4Ga
lβ1,4Glc-Cer フォルスマン抗原糖鎖：フォルスマン抗原の糖鎖(GalNA
cα1,3GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc)。「フォルス
マン抗原糖鎖」といった場合、フォルスマン抗原糖鎖を
有しているあらゆる物質（例えば、フォルスマン抗原自
体(フォルスマン抗原糖鎖にCerが結合した物質)等）も
包含する。 GM3：SAα2,3Galβ1,4Glc-Cer (SAはシアル酸) GD3：SAα2,8SAα2,3Galβ1,4Glc-Cer (SAはシアル酸) UDP：ウリジン-5'-ジリン酸 なお、ガングリオシドの命名法は、Svennerholm (J. N
eurochem. 10, p455-463, (1963))に従った。
本明細書において共通して用いる略号は以下の通りであ
る。 Gal：ガラクトース Glc：グルコース GalNAc：N-アセチルガラクトサミン Cer：セラミド LacCer：ラクトシルセラミド(Galβ1,4Glc-Cer) Gb3：グロボトリアオシルセラミド(Galα1,4Galβ1,4Gl
c-Cer) Gb3糖鎖：Gb3の糖鎖(Galα1,4Galβ1,4Glc)。「Gb3糖
鎖」といった場合、Gb3糖鎖を有しているあらゆる物質
（例えば、Gb3自体(Gb3糖鎖にCerが結合した物質)等）
も包含する。 Gb4：グロボシド(GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc-Ce
r) Gb4糖鎖：Gb4の糖鎖(GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Gl
c)。「Gb4糖鎖」といった場合、Gb4糖鎖を有しているあ
らゆる物質（例えば、Gb4自体(Gb4糖鎖にCerが結合した
物質)等）も包含する。 フォルスマン抗原：GalNAcα1,3GalNAcβ1,3Galα1,4Ga
lβ1,4Glc-Cer フォルスマン抗原糖鎖：フォルスマン抗原の糖鎖(GalNA
cα1,3GalNAcβ1,3Galα1,4Galβ1,4Glc)。「フォルス
マン抗原糖鎖」といった場合、フォルスマン抗原糖鎖を
有しているあらゆる物質（例えば、フォルスマン抗原自
体(フォルスマン抗原糖鎖にCerが結合した物質)等）も
包含する。 GM3：SAα2,3Galβ1,4Glc-Cer (SAはシアル酸) GD3：SAα2,8SAα2,3Galβ1,4Glc-Cer (SAはシアル酸) UDP：ウリジン-5'-ジリン酸 なお、ガングリオシドの命名法は、Svennerholm (J. N
eurochem. 10, p455-463, (1963))に従った。
【００１４】また本明細書において、Ｎ−アセチルガラ
クトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖中のガ
ラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラクトサミ
ン残基を転移してβ1,3-結合を形成する反応を触媒する
酵素を、「β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移
酵素」という。本明細書において、「Ｇｂ４合成酵素」
と表記することもある。
クトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖中のガ
ラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラクトサミ
ン残基を転移してβ1,3-結合を形成する反応を触媒する
酵素を、「β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移
酵素」という。本明細書において、「Ｇｂ４合成酵素」
と表記することもある。
【００１５】また、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体
から、受容体であるＧｂ３糖鎖中のガラクトース残基の
Ｃ３位に、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を転移して
β1,3-結合を形成する酵素活性を、「β１，３−Ｎ−ア
セチルガラクトサミン転移酵素活性」という。本明細書
において、「Ｇｂ４合成酵素活性」と表記することもあ
る。
から、受容体であるＧｂ３糖鎖中のガラクトース残基の
Ｃ３位に、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を転移して
β1,3-結合を形成する酵素活性を、「β１，３−Ｎ−ア
セチルガラクトサミン転移酵素活性」という。本明細書
において、「Ｇｂ４合成酵素活性」と表記することもあ
る。
【００１６】＜１＞本発明酵素製造方法 本発明酵素製造方法は、下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤ
ＮＡを細胞に導入し、次いで該細胞を生育させてＧｂ４
合成酵素を発現させ、これを採取する工程を少なくとも
含む、Ｇｂ４合成酵素の製造方法である。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。
ＮＡを細胞に導入し、次いで該細胞を生育させてＧｂ４
合成酵素を発現させ、これを採取する工程を少なくとも
含む、Ｇｂ４合成酵素の製造方法である。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。
【００１７】本発明酵素製造方法により製造されるＧｂ
４合成酵素は、酵素活性を維持しているものが好まし
い。（ａ）について、配列番号１における塩基番号１０
９〜１１０１からなる部分はＧｂ４合成酵素をコードし
ている領域であることから、この領域を含むＤＮＡを細
胞に導入し、次いで該細胞を生育させることにより、Ｇ
ｂ４合成酵素を発現させることができる。
４合成酵素は、酵素活性を維持しているものが好まし
い。（ａ）について、配列番号１における塩基番号１０
９〜１１０１からなる部分はＧｂ４合成酵素をコードし
ている領域であることから、この領域を含むＤＮＡを細
胞に導入し、次いで該細胞を生育させることにより、Ｇ
ｂ４合成酵素を発現させることができる。
【００１８】また（ｂ）について、配列番号１に記載の
塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列又はこ
れらの塩基配列の一部を有するＤＮＡとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、上記（ａ）
と同様の構造・機能・作用等を有していると考えられる
ことから、上記（ａ）に代えて上記（ｂ）のＤＮＡを用
いることができる。すなわち、上記（ｂ）のＤＮＡは、
Ｇｂ４合成酵素活性を有するポリペプチドをコードして
いると考えられ、このようなＤＮＡも、上記（ａ）のＤ
ＮＡと同様に用いることができる。よって（ｂ）に示す
ＤＮＡは、Ｇｂ４合成酵素活性を有するポリペプチドを
コードしているものであることが好ましい。
塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列又はこ
れらの塩基配列の一部を有するＤＮＡとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、上記（ａ）
と同様の構造・機能・作用等を有していると考えられる
ことから、上記（ａ）に代えて上記（ｂ）のＤＮＡを用
いることができる。すなわち、上記（ｂ）のＤＮＡは、
Ｇｂ４合成酵素活性を有するポリペプチドをコードして
いると考えられ、このようなＤＮＡも、上記（ａ）のＤ
ＮＡと同様に用いることができる。よって（ｂ）に示す
ＤＮＡは、Ｇｂ４合成酵素活性を有するポリペプチドを
コードしているものであることが好ましい。
【００１９】ここで「ストリンジェントな条件」とは、
いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的な
ハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J.
etal., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Se
cond Edition, Cold SpringHarbor Laboratory Press
(1989)等参照）。「ストリンジェントな条件」として具
体的には、50％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、50mMＨＥＰ
ＥＳ（pH7.0）、10×Denhardt's solution、100μg/ml
サケ精子DNAを含む溶液中、42℃でハイブリダイズさ
せ、次いで室温で２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液、50℃
下で0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙
げられる。
いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的な
ハイブリッドが形成されない条件をいう（Sambrook, J.
etal., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Se
cond Edition, Cold SpringHarbor Laboratory Press
(1989)等参照）。「ストリンジェントな条件」として具
体的には、50％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、50mMＨＥＰ
ＥＳ（pH7.0）、10×Denhardt's solution、100μg/ml
サケ精子DNAを含む溶液中、42℃でハイブリダイズさ
せ、次いで室温で２×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液、50℃
下で0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ溶液で洗浄する条件が挙
げられる。
【００２０】Ｇｂ４合成酵素活性は、例えば後記実施例
に示すように、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体とし
てUDP-GalNAcを用い、Ｇｂ３糖鎖へのGalNAcの転移反応
を利用した測定方法を用いることによって測定できる。
に示すように、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体とし
てUDP-GalNAcを用い、Ｇｂ３糖鎖へのGalNAcの転移反応
を利用した測定方法を用いることによって測定できる。
【００２１】上記（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡは、例えば
後述の実施例に記載した方法で製造することができ、こ
の方法で製造されたものを用いることが好ましい。また
これらのＤＮＡのうち、（ａ）のＤＮＡを用いることが
好ましい。なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配
列を有するＤＮＡを用いてもよいことは、当業者であれ
ば容易に理解されるところである。
後述の実施例に記載した方法で製造することができ、こ
の方法で製造されたものを用いることが好ましい。また
これらのＤＮＡのうち、（ａ）のＤＮＡを用いることが
好ましい。なお、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配
列を有するＤＮＡを用いてもよいことは、当業者であれ
ば容易に理解されるところである。
【００２２】上記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡを細胞
に導入し、次いでこの細胞（形質転換細胞）を生育させ
てＧｂ４合成酵素を発現させ、これを採取することによ
り、酵素活性を維持しているＧｂ４合成酵素を製造する
ことができる。ＤＮＡは、直接発現させてもよいし、Ｇ
ｂ４合成酵素活性を維持している限りにおいて他のポリ
ペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させてもよ
い。また、ＤＮＡは全長を発現させてもよいし、Ｇｂ４
合成酵素活性を維持している限りにおいて部分ペプチド
として発現させてもよい。
に導入し、次いでこの細胞（形質転換細胞）を生育させ
てＧｂ４合成酵素を発現させ、これを採取することによ
り、酵素活性を維持しているＧｂ４合成酵素を製造する
ことができる。ＤＮＡは、直接発現させてもよいし、Ｇ
ｂ４合成酵素活性を維持している限りにおいて他のポリ
ペプチドとの融合ポリペプチドとして発現させてもよ
い。また、ＤＮＡは全長を発現させてもよいし、Ｇｂ４
合成酵素活性を維持している限りにおいて部分ペプチド
として発現させてもよい。
【００２３】宿主細胞は、上記（ａ）又は（ｂ）に示さ
れたＤＮＡ又はこれらＤＮＡを組み込んだ組換えベクタ
ーの機能を発揮できる限りにおいて特に限定されず、動
物細胞、植物細胞、微生物細胞（菌体）が包含され、エ
シェリヒア・コリ等の原核細胞や、哺乳類細胞等の真核
細胞が具体的に例示される。エシェリヒア・コリなどの
原核細胞を用いた場合は、ＤＮＡの発現によって生じる
ポリペプチドに糖鎖の付加が起こらないため、糖鎖が付
加されていないＧｂ４合成酵素を得ることが可能であ
り、また、哺乳類細胞等の真核細胞を用いた場合は、Ｄ
ＮＡの発現によって生じる酵素に糖鎖が付加しうるた
め、糖鎖を含むＧｂ４合成酵素の形態で得ることも可能
である。
れたＤＮＡ又はこれらＤＮＡを組み込んだ組換えベクタ
ーの機能を発揮できる限りにおいて特に限定されず、動
物細胞、植物細胞、微生物細胞（菌体）が包含され、エ
シェリヒア・コリ等の原核細胞や、哺乳類細胞等の真核
細胞が具体的に例示される。エシェリヒア・コリなどの
原核細胞を用いた場合は、ＤＮＡの発現によって生じる
ポリペプチドに糖鎖の付加が起こらないため、糖鎖が付
加されていないＧｂ４合成酵素を得ることが可能であ
り、また、哺乳類細胞等の真核細胞を用いた場合は、Ｄ
ＮＡの発現によって生じる酵素に糖鎖が付加しうるた
め、糖鎖を含むＧｂ４合成酵素の形態で得ることも可能
である。
【００２４】上記（ａ）又は（ｂ）に示されるＤＮＡを
導入する宿主細胞としてより具体的には、マウスの線維
芽細胞であるＬ細胞や、このＬ細胞をSV40のラージＴ抗
原とGb3/CD77合成酵素をコードするcDNAとでトランスフ
ェクトして得られる１Ｂ９細胞が例示される。
導入する宿主細胞としてより具体的には、マウスの線維
芽細胞であるＬ細胞や、このＬ細胞をSV40のラージＴ抗
原とGb3/CD77合成酵素をコードするcDNAとでトランスフ
ェクトして得られる１Ｂ９細胞が例示される。
【００２５】上記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡを細胞
（宿主細胞）に導入するには、例えば、ＤＮＡを適当な
ベクターに組み込んで組換えベクターを作製し、この組
換えベクターを用いてＤＮＡを宿主細胞に導入すればよ
い。ベクターとしては、発現ベクターが好ましい。具体
的には、pcDNA3.1発現ベクター（インビトロジェン社）
等が挙げられる。
（宿主細胞）に導入するには、例えば、ＤＮＡを適当な
ベクターに組み込んで組換えベクターを作製し、この組
換えベクターを用いてＤＮＡを宿主細胞に導入すればよ
い。ベクターとしては、発現ベクターが好ましい。具体
的には、pcDNA3.1発現ベクター（インビトロジェン社）
等が挙げられる。
【００２６】ＤＮＡを細胞に導入する方法としては、例
えば、DEAE-デキストラン法（J. Biol. Chem., 267, p1
2082-12089 (1992)）を用いてトランスフェクションを
行う方法が例示される。
えば、DEAE-デキストラン法（J. Biol. Chem., 267, p1
2082-12089 (1992)）を用いてトランスフェクションを
行う方法が例示される。
【００２７】細胞の生育は、ＤＮＡを導入することによ
って形質転換された細胞を好適な培地中で培養すること
により行っても良く、また、形質転換された細胞を生体
内で生育させてもよい。
って形質転換された細胞を好適な培地中で培養すること
により行っても良く、また、形質転換された細胞を生体
内で生育させてもよい。
【００２８】発現した酵素は、形質転換細胞の培養物か
ら採取できるが、酵素が形質転換細胞の細胞質中又は膜
画分に生成、蓄積する場合は形質転換細胞から、また、
培地中に蓄積する場合は、培地から、採取する。さら
に、酵素が発現した細胞を利用する場合は、形質転換細
胞又はその処理物をそのまま、又は適当な固相に結合
し、もしくはゲルに包括させ、固定化して、利用するこ
とができる。なお培養物には、培地および当該培地中で
培養された形質転換細胞が包含される。
ら採取できるが、酵素が形質転換細胞の細胞質中又は膜
画分に生成、蓄積する場合は形質転換細胞から、また、
培地中に蓄積する場合は、培地から、採取する。さら
に、酵素が発現した細胞を利用する場合は、形質転換細
胞又はその処理物をそのまま、又は適当な固相に結合
し、もしくはゲルに包括させ、固定化して、利用するこ
とができる。なお培養物には、培地および当該培地中で
培養された形質転換細胞が包含される。
【００２９】培養物からの酵素の採取は、酵素について
の公知の抽出、精製方法によって行うことができる。
の公知の抽出、精製方法によって行うことができる。
【００３０】酵素の抽出方法として具体的には、窒素キ
ャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラ
スビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解
法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、またはこ
れらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
ャビテーション装置を用いる方法、ホモジナイズ、ガラ
スビーズミル法、音波処理、浸透ショック法、凍結融解
法等の細胞破砕による抽出、界面活性剤抽出、またはこ
れらの組み合わせ等の処理操作が挙げられる。
【００３１】ＤＮＡとして、前記（ａ）で示されるＤＮ
Ａを１Ｂ９細胞で発現させると、Ｇｂ４合成酵素は細胞
の膜画分に局在する。またＤＮＡを、Ｇｂ４合成酵素の
ポリペプチド又はその一部を欠くポリペプチドと他のポ
リペプチドとの融合タンパク質として、可溶性の形態で
発現させると、同融合タンパク質は細胞質中に局在し得
る。また、ＤＮＡを、Ｇｂ４合成酵素のポリペプチド又
はその一部を欠くポリペプチドと分泌シグナルとの融合
タンパク質として発現させると、培地中に分泌し得る。
尚、Ｇｂ４合成酵素のポリペプチドの一部を欠くポリペ
プチドをコードするＤＮＡは、そのように設計されたプ
ライマーを用いてＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応法)を行
うことにより、ヒト由来mRNAもしくはcDNAライブラリ
ー、または染色体ＤＮＡから単離することができる。
Ａを１Ｂ９細胞で発現させると、Ｇｂ４合成酵素は細胞
の膜画分に局在する。またＤＮＡを、Ｇｂ４合成酵素の
ポリペプチド又はその一部を欠くポリペプチドと他のポ
リペプチドとの融合タンパク質として、可溶性の形態で
発現させると、同融合タンパク質は細胞質中に局在し得
る。また、ＤＮＡを、Ｇｂ４合成酵素のポリペプチド又
はその一部を欠くポリペプチドと分泌シグナルとの融合
タンパク質として発現させると、培地中に分泌し得る。
尚、Ｇｂ４合成酵素のポリペプチドの一部を欠くポリペ
プチドをコードするＤＮＡは、そのように設計されたプ
ライマーを用いてＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応法)を行
うことにより、ヒト由来mRNAもしくはcDNAライブラリ
ー、または染色体ＤＮＡから単離することができる。
【００３２】細胞又は培地から抽出されるＧｂ４合成酵
素の精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウ
ム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、
透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆
相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気
泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げら
れる。なおＧｂ４合成酵素は、必ずしも完全精製する必
要もなく、酵素活性を維持している限りにおいて部分精
製に止めてもよい。
素の精製方法として具体的には、例えば硫酸アンモニウ
ム（硫安）や硫酸ナトリウム等による塩析、遠心分離、
透析、限外濾過法、吸着クロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆
相クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気
泳動法等や、これらの組み合わせ等の処理操作が挙げら
れる。なおＧｂ４合成酵素は、必ずしも完全精製する必
要もなく、酵素活性を維持している限りにおいて部分精
製に止めてもよい。
【００３３】このようにして得られたＧｂ４合成酵素の
アミノ酸配列、分子サイズ、作用、基質特異性等を分析
することによって、Ｇｂ４合成酵素の製造が確認でき
る。
アミノ酸配列、分子サイズ、作用、基質特異性等を分析
することによって、Ｇｂ４合成酵素の製造が確認でき
る。
【００３４】＜２＞各種グロボ系糖脂質の製造方法 (1)本発明Ｇｂ４製造方法１ 本発明Ｇｂ４製造方法１は、以下の（Ａ）又は（Ｂ）の
ポリペプチド、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体およ
びＧｂ３糖鎖を接触させて酵素反応させる工程を少なく
とも含む、Ｇｂ４糖鎖の製造方法である。 （Ａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３３１で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチド。 （Ｂ）アミノ酸配列（Ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配
列からなり、かつＧｂ４合成酵素活性を有するポリペプ
チド。
ポリペプチド、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体およ
びＧｂ３糖鎖を接触させて酵素反応させる工程を少なく
とも含む、Ｇｂ４糖鎖の製造方法である。 （Ａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３３１で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチド。 （Ｂ）アミノ酸配列（Ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配
列からなり、かつＧｂ４合成酵素活性を有するポリペプ
チド。
【００３５】（Ａ）について、配列番号２のアミノ酸番
号１〜３３１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドは、Ｇｂ４合成酵素のポリペプチドそのものであ
り、触媒部位を含んでいる。したがって、このポリペプ
チド、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体およびＧｂ３
糖鎖を接触させて酵素反応させることにより、Ｇｂ４糖
鎖を製造することができる。
号１〜３３１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプ
チドは、Ｇｂ４合成酵素のポリペプチドそのものであ
り、触媒部位を含んでいる。したがって、このポリペプ
チド、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体およびＧｂ３
糖鎖を接触させて酵素反応させることにより、Ｇｂ４糖
鎖を製造することができる。
【００３６】また（Ｂ）について、「１もしくは数個の
アミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配
列からなり、かつＧｂ４合成酵素活性を有するポリペプ
チド」とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体から、
受容体であるＧｂ３糖鎖中のガラクトース残基のＣ３位
に、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を転移する酵素活
性（β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素活
性）を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸残基
の置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよいポリペ
プチドを意味する。
アミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配
列からなり、かつＧｂ４合成酵素活性を有するポリペプ
チド」とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体から、
受容体であるＧｂ３糖鎖中のガラクトース残基のＣ３位
に、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を転移する酵素活
性（β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素活
性）を実質的に害さない１もしくは数個のアミノ酸残基
の置換、欠失、挿入又は転位を有していてもよいポリペ
プチドを意味する。
【００３７】すなわち、天然に存在するポリペプチドに
は、それをコードするＤＮＡの多形や変異の他、生成後
のポリペプチドの細胞内および精製中の修飾反応などに
よってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿
入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわら
ず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、
生物学的活性を示すものがあることが知られている。こ
のように構造的に若干の差違があってもその機能につい
ては大きな違いが認められないものも、ここで用いられ
るポリペプチドに包含される。人為的にポリペプチドの
アミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様
であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製す
ることが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２
（IL-2）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセ
リンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性
を保持することが知られている(Science,224,1431(198
4))。また、ある種のポリペプチドは、活性には必須で
ないペプチド領域を有していることが知られている。例
えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグ
ナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプ
ロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは
翻訳後、または活性型ポリペプチドへの転換に際して除
去される。このようなポリペプチドは、一次構造上は異
なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有
するポリペプチドである。したがってこのようなポリペ
プチドも、上記（Ａ）のポリペプチドと同様に用いるこ
とができる。
は、それをコードするＤＮＡの多形や変異の他、生成後
のポリペプチドの細胞内および精製中の修飾反応などに
よってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の置換、欠失、挿
入又は転位等の変異が起こりうるが、それにもかかわら
ず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、
生物学的活性を示すものがあることが知られている。こ
のように構造的に若干の差違があってもその機能につい
ては大きな違いが認められないものも、ここで用いられ
るポリペプチドに包含される。人為的にポリペプチドの
アミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様
であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製す
ることが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２
（IL-2）のアミノ酸配列中の、あるシステイン残基をセ
リンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性
を保持することが知られている(Science,224,1431(198
4))。また、ある種のポリペプチドは、活性には必須で
ないペプチド領域を有していることが知られている。例
えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグ
ナルペプチドや、プロテアーゼの前駆体等に見られるプ
ロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは
翻訳後、または活性型ポリペプチドへの転換に際して除
去される。このようなポリペプチドは、一次構造上は異
なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を有
するポリペプチドである。したがってこのようなポリペ
プチドも、上記（Ａ）のポリペプチドと同様に用いるこ
とができる。
【００３８】なお本明細書における「数個のアミノ酸」
とは、Ｇｂ４合成酵素活性が失われない程度の変異を起
こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば４００アミノ
酸残基からなるポリペプチドの場合、２〜２０程度、好
ましくは２〜１０、より好ましくは２〜５以下の数を示
す。
とは、Ｇｂ４合成酵素活性が失われない程度の変異を起
こしてもよいアミノ酸の数を示し、例えば４００アミノ
酸残基からなるポリペプチドの場合、２〜２０程度、好
ましくは２〜１０、より好ましくは２〜５以下の数を示
す。
【００３９】Ｇｂ４合成酵素活性は、例えば後記実施例
に示すように、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体とし
てUDP-GalNAcを用い、Ｇｂ３糖鎖へのGalNAcの転移反応
を利用した測定方法を用いることによって測定できる。
よって当業者であれば、Gb4合成酵素活性の有無を指標
として、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸
残基の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択すること
ができる。
に示すように、Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体とし
てUDP-GalNAcを用い、Ｇｂ３糖鎖へのGalNAcの転移反応
を利用した測定方法を用いることによって測定できる。
よって当業者であれば、Gb4合成酵素活性の有無を指標
として、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸
残基の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択すること
ができる。
【００４０】上記（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドは、
例えば本発明酵素製造方法により製造することができ、
この方法で製造されたものを用いることが好ましい。ま
たこれらのポリペプチドのうち、（Ａ）のポリペプチド
を用いることが好ましい。ここで用いる「Ｎ−アセチル
ガラクトサミン供与体」としては、UDP-GalNAc等の糖ヌ
クレオチド化したGalNAcが例示され、かつ好ましい。
この供与体は、目的に応じて放射性標識等されていても
よく、例えばUDP-[3H]GalNAc等を用いてもよい。
例えば本発明酵素製造方法により製造することができ、
この方法で製造されたものを用いることが好ましい。ま
たこれらのポリペプチドのうち、（Ａ）のポリペプチド
を用いることが好ましい。ここで用いる「Ｎ−アセチル
ガラクトサミン供与体」としては、UDP-GalNAc等の糖ヌ
クレオチド化したGalNAcが例示され、かつ好ましい。
この供与体は、目的に応じて放射性標識等されていても
よく、例えばUDP-[3H]GalNAc等を用いてもよい。
【００４１】Ｇｂ３糖鎖は、ここではGalNAcの受容体と
して用いている。Ｇｂ３糖鎖は市販のものを用いること
もできる。上記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチド、Ｎ
−アセチルガラクトサミン供与体およびＧｂ３糖鎖の接
触のさせ方は、これら三者の分子が相互に接触して酵素
反応が生ずる限りにおいて特に限定されない。例えば、
これら三者が溶解した溶液中で接触させてもよい。また
（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを適当な固相（ビーズ
等）に結合させた固定化酵素や、限外濾過膜、透析膜等
を用いる膜型リアクター等を用いて連続的に酵素反応さ
せることもできる。また、Ｎ−アセチルガラクトサミン
供与体を再生（合成）するバイオリアクターを組み合わ
せて用いてもよい。
して用いている。Ｇｂ３糖鎖は市販のものを用いること
もできる。上記の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチド、Ｎ
−アセチルガラクトサミン供与体およびＧｂ３糖鎖の接
触のさせ方は、これら三者の分子が相互に接触して酵素
反応が生ずる限りにおいて特に限定されない。例えば、
これら三者が溶解した溶液中で接触させてもよい。また
（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチドを適当な固相（ビーズ
等）に結合させた固定化酵素や、限外濾過膜、透析膜等
を用いる膜型リアクター等を用いて連続的に酵素反応さ
せることもできる。また、Ｎ−アセチルガラクトサミン
供与体を再生（合成）するバイオリアクターを組み合わ
せて用いてもよい。
【００４２】酵素反応させる条件は、Ｇｂ４合成酵素が
作用する条件である限りにおいて特に限定されないが、
中性ｐＨ付近（例えばpH6.5程度）で反応させることが
好ましく、該ｐＨ下で緩衝作用を有する緩衝液中で反応
を行うことがより好ましい。またこの時の温度は、Ｇｂ
４合成酵素の活性が保持されている限りにおいて特に限
定されないが、30〜40℃程度が例示される。またＧｂ４
合成酵素の活性を増加させる物質がある場合にはその物
質を添加してもよい。例えばＭｎ+等を共存させること
が好ましい。反応時間は、用いるＧｂ３糖鎖、GalNAc供
与体およびＧｂ４合成酵素の量、並びにその他の反応条
件に応じて当業者が適宜決定することができる。
作用する条件である限りにおいて特に限定されないが、
中性ｐＨ付近（例えばpH6.5程度）で反応させることが
好ましく、該ｐＨ下で緩衝作用を有する緩衝液中で反応
を行うことがより好ましい。またこの時の温度は、Ｇｂ
４合成酵素の活性が保持されている限りにおいて特に限
定されないが、30〜40℃程度が例示される。またＧｂ４
合成酵素の活性を増加させる物質がある場合にはその物
質を添加してもよい。例えばＭｎ+等を共存させること
が好ましい。反応時間は、用いるＧｂ３糖鎖、GalNAc供
与体およびＧｂ４合成酵素の量、並びにその他の反応条
件に応じて当業者が適宜決定することができる。
【００４３】Ｇｂ４合成酵素の作用により、GalNAc供与
体からＧｂ３糖鎖にGalNAcが転移され、Ｇｂ４糖鎖が生
成する。生成したＧｂ４糖鎖を回収するには、通常の糖
鎖または糖脂質の分離、精製の手法を用いることができ
る。例えば吸着クロマトグラフィー、疎水性クロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過
法、ゲル浸透クロマトグラフィー、濾紙電気泳動法、濾
紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、有機
溶媒（例えばアルコール、アセトン等）による分画、あ
るいはこれらの組み合わせ等の操作により行うことがで
きる。このようにして得られたＧｂ４糖鎖の、薄層クロ
マトグラフィー上での移動度や、Ｇｂ４糖鎖に対するモ
ノクローナル抗体への反応性等を分析することによっ
て、Ｇｂ４糖鎖の製造が確認できる。
体からＧｂ３糖鎖にGalNAcが転移され、Ｇｂ４糖鎖が生
成する。生成したＧｂ４糖鎖を回収するには、通常の糖
鎖または糖脂質の分離、精製の手法を用いることができ
る。例えば吸着クロマトグラフィー、疎水性クロマトグ
ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過
法、ゲル浸透クロマトグラフィー、濾紙電気泳動法、濾
紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、有機
溶媒（例えばアルコール、アセトン等）による分画、あ
るいはこれらの組み合わせ等の操作により行うことがで
きる。このようにして得られたＧｂ４糖鎖の、薄層クロ
マトグラフィー上での移動度や、Ｇｂ４糖鎖に対するモ
ノクローナル抗体への反応性等を分析することによっ
て、Ｇｂ４糖鎖の製造が確認できる。
【００４４】モノクローナル抗体を用いた確認は、公知
の免疫学的手法を用いることができる。例えばイムノブ
ロッティング法、標識化免疫測定法(例えばEIA法、ELIS
A法、ラジオイムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ法
等)を用いることができる。もちろん、公知の糖鎖構造
解析技術を用いて確認することもできる。
の免疫学的手法を用いることができる。例えばイムノブ
ロッティング法、標識化免疫測定法(例えばEIA法、ELIS
A法、ラジオイムノアッセイ法、蛍光イムノアッセイ法
等)を用いることができる。もちろん、公知の糖鎖構造
解析技術を用いて確認することもできる。
【００４５】(2)本発明Ｇｂ４製造方法２ 本発明Ｇｂ４製造方法２は、下記（ａ）又は（ｂ）に示
すＤＮＡをＧｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次いで該細胞
を生育させる工程を少なくとも含む、Ｇｂ４糖鎖の製造
方法である。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。
すＤＮＡをＧｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次いで該細胞
を生育させる工程を少なくとも含む、Ｇｂ４糖鎖の製造
方法である。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。
【００４６】ここで（ｂ）に示すＤＮＡは、Ｇｂ４合成
酵素活性を有するポリペプチドをコードしているもので
あることが好ましい。（ａ）又は（ｂ）で示されるＤＮ
Ａの説明は、前記した「本発明酵素製造方法」における
（ａ）又は（ｂ）で示されるＤＮＡと同じである。
酵素活性を有するポリペプチドをコードしているもので
あることが好ましい。（ａ）又は（ｂ）で示されるＤＮ
Ａの説明は、前記した「本発明酵素製造方法」における
（ａ）又は（ｂ）で示されるＤＮＡと同じである。
【００４７】宿主細胞は、Ｇｂ３糖鎖を発現する細胞で
ある限りにおいて特に限定されないが、後述の実施例に
示す１Ｂ９細胞が好ましい。
ある限りにおいて特に限定されないが、後述の実施例に
示す１Ｂ９細胞が好ましい。
【００４８】上記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡをＧｂ
３糖鎖発現細胞に導入する方法、その際に用いるベクタ
ー、ＤＮＡが導入された細胞を生育させる方法等は、前
記した「本発明酵素製造方法」と同様である。上記
（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡをＧｂ３糖鎖発現細胞に
導入し、次いで該細胞を生育させることにより、Ｇｂ４
合成酵素が発現し、この作用によってＧｂ３糖鎖にGalN
Acが転移してβ1,3-結合が形成され、細胞の表面にＧｂ
４糖鎖が発現する。
３糖鎖発現細胞に導入する方法、その際に用いるベクタ
ー、ＤＮＡが導入された細胞を生育させる方法等は、前
記した「本発明酵素製造方法」と同様である。上記
（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡをＧｂ３糖鎖発現細胞に
導入し、次いで該細胞を生育させることにより、Ｇｂ４
合成酵素が発現し、この作用によってＧｂ３糖鎖にGalN
Acが転移してβ1,3-結合が形成され、細胞の表面にＧｂ
４糖鎖が発現する。
【００４９】Ｇｂ４糖鎖の採取は、公知の糖鎖または糖
脂質の抽出、精製方法によって行うことができる。
脂質の抽出、精製方法によって行うことができる。
【００５０】糖脂質の抽出方法として具体的には、メタ
ノール、クロロホルム等による有機溶媒抽出、ホモジナ
イズ、音波処理等の細胞破砕による抽出、またはこれら
の組み合わせ等の処理操作が挙げられる。培養物中の細
胞に対してこのような抽出操作を行うことによりＧｂ４
糖鎖を含有する抽出物を得ることができる。抽出液から
のＧｂ４糖鎖の分離、精製は、通常の糖鎖または糖脂質
の分離、精製の手法を用いることができる。例えば吸着
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロ
マトグラフィー、濾紙電気泳動法、濾紙クロマトグラフ
ィー、薄層クロマトグラフィー、有機溶媒（例えばアル
コール、アセトン等が好ましい）による分画、あるいは
これらの組み合わせ等の操作により行うことができる
が、これらに限定されるものではない。
ノール、クロロホルム等による有機溶媒抽出、ホモジナ
イズ、音波処理等の細胞破砕による抽出、またはこれら
の組み合わせ等の処理操作が挙げられる。培養物中の細
胞に対してこのような抽出操作を行うことによりＧｂ４
糖鎖を含有する抽出物を得ることができる。抽出液から
のＧｂ４糖鎖の分離、精製は、通常の糖鎖または糖脂質
の分離、精製の手法を用いることができる。例えば吸着
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水性クロマトグラフィー、ゲルろ過法、ゲル浸透クロ
マトグラフィー、濾紙電気泳動法、濾紙クロマトグラフ
ィー、薄層クロマトグラフィー、有機溶媒（例えばアル
コール、アセトン等が好ましい）による分画、あるいは
これらの組み合わせ等の操作により行うことができる
が、これらに限定されるものではない。
【００５１】なお、Ｇｂ４糖鎖は必ずしも細胞から分
離、精製する必要はなく、Ｇｂ４糖鎖が細胞表面に発現
した細胞自体を所望の場合は、培養物中の細胞を採取し
てそのまま用いることもできる。
離、精製する必要はなく、Ｇｂ４糖鎖が細胞表面に発現
した細胞自体を所望の場合は、培養物中の細胞を採取し
てそのまま用いることもできる。
【００５２】製造されたＧｂ４糖鎖は、前記の「本発明
Ｇｂ４製造方法１」に記載の方法と同様に確認すること
ができる。また、Ｇｂ４糖鎖が細胞表面に発現された細
胞における当該Ｇｂ４糖鎖を確認する場合は、抗体等を
用いて、フローサイトメトリー等の手法により行うこと
ができる。
Ｇｂ４製造方法１」に記載の方法と同様に確認すること
ができる。また、Ｇｂ４糖鎖が細胞表面に発現された細
胞における当該Ｇｂ４糖鎖を確認する場合は、抗体等を
用いて、フローサイトメトリー等の手法により行うこと
ができる。
【００５３】(3)本発明フォルスマン製造方法 本発明フォルスマン製造方法は、下記（ａ）又は（ｂ）
に示すＤＮＡと、フォルスマン抗原合成酵素をコードす
るｃＤＮＡとを共にＧｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次い
で該細胞を生育させる工程を少なくとも含む、フォルス
マン抗原糖鎖の製造方法である。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。
に示すＤＮＡと、フォルスマン抗原合成酵素をコードす
るｃＤＮＡとを共にＧｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次い
で該細胞を生育させる工程を少なくとも含む、フォルス
マン抗原糖鎖の製造方法である。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。
【００５４】ここで（ｂ）に示すＤＮＡは、Ｇｂ４合成
酵素活性を有するポリペプチドをコードしているもので
あることが好ましい。（ａ）又は（ｂ）で示されるＤＮ
Ａの説明、用いる宿主細胞、ＤＮＡをＧｂ３糖鎖発現細
胞に導入する方法、その際に用いるベクター、ＤＮＡが
導入された細胞を生育させる方法等は、前記した「本発
明酵素製造方法」と同様である。本発明フォルスマン製
造方法は、フォルスマン抗原合成酵素をコードするｃＤ
ＮＡを、（ａ）又は（ｂ）で示されるＤＮＡと共に宿主
細胞に導入する点に特徴がある。フォルスマン抗原合成
酵素をコードするｃＤＮＡは公知のもの（例えば、J.Bi
ol.Chem., 274(41), p29390-29398 (1999)）を用いるこ
とができる。
酵素活性を有するポリペプチドをコードしているもので
あることが好ましい。（ａ）又は（ｂ）で示されるＤＮ
Ａの説明、用いる宿主細胞、ＤＮＡをＧｂ３糖鎖発現細
胞に導入する方法、その際に用いるベクター、ＤＮＡが
導入された細胞を生育させる方法等は、前記した「本発
明酵素製造方法」と同様である。本発明フォルスマン製
造方法は、フォルスマン抗原合成酵素をコードするｃＤ
ＮＡを、（ａ）又は（ｂ）で示されるＤＮＡと共に宿主
細胞に導入する点に特徴がある。フォルスマン抗原合成
酵素をコードするｃＤＮＡは公知のもの（例えば、J.Bi
ol.Chem., 274(41), p29390-29398 (1999)）を用いるこ
とができる。
【００５５】上記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡと、フ
ォルスマン抗原合成酵素をコードするｃＤＮＡとを共に
Ｇｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次いで該細胞を生育させ
ることにより、Ｇｂ４合成酵素の作用によりＧｂ４糖鎖
が発現し、これにフォルスマン抗原合成酵素の作用によ
ってGalNAcが転移してα1,3-結合が形成され、細胞の表
面にフォルスマン抗原糖鎖が発現する。
ォルスマン抗原合成酵素をコードするｃＤＮＡとを共に
Ｇｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次いで該細胞を生育させ
ることにより、Ｇｂ４合成酵素の作用によりＧｂ４糖鎖
が発現し、これにフォルスマン抗原合成酵素の作用によ
ってGalNAcが転移してα1,3-結合が形成され、細胞の表
面にフォルスマン抗原糖鎖が発現する。
【００５６】フォルスマン抗原糖鎖の採取および、製造
されたフォルスマン抗原糖鎖の確認は、前記の「本発明
Ｇｂ４製造方法２」と同様に行うことができる。この
際、フォルスマン抗原に対するモノクローナル抗体等を
用いればよい。
されたフォルスマン抗原糖鎖の確認は、前記の「本発明
Ｇｂ４製造方法２」と同様に行うことができる。この
際、フォルスマン抗原に対するモノクローナル抗体等を
用いればよい。
【００５７】＜３＞本発明使用 本発明使用は、Ｇｂ４合成酵素の発現のための、下記
（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡの使用である。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。
（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡの使用である。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。
【００５８】ここで（ｂ）に示すＤＮＡは、Ｇｂ４合成
酵素活性を有するポリペプチドをコードしているもので
あることが好ましい。（ａ）又は（ｂ）で示されるＤＮ
Ａの説明は、前記した「本発明酵素製造方法」と同様で
ある。
酵素活性を有するポリペプチドをコードしているもので
あることが好ましい。（ａ）又は（ｂ）で示されるＤＮ
Ａの説明は、前記した「本発明酵素製造方法」と同様で
ある。
【００５９】本発明使用は、上記（ａ）又は（ｂ）に示
すＤＮＡが、Ｇｂ４合成酵素の発現のために使用される
限りにおいて、あらゆる態様を包含する。すなわち、上
記酵素活性を利用する際に上記ＤＮＡを利用するあらゆ
る態様が包含される。例えば、本発明酵素製造方法、本
発明Ｇｂ４製造方法２および本発明フォルスマン製造方
法は、いずれも上記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡがＧ
ｂ４合成酵素の発現のために使用されていることから、
本発明使用に包含される。またＧｂ４合成酵素の発現
は、生体外で行われる場合のみならず、生体内で行われ
る場合をも包含する。例えば、上記（ａ）又は（ｂ）に
示すＤＮＡを生体内の細胞に導入して、生体内でＧｂ４
合成酵素を発現させる態様も、本発明使用に包含され
る。
すＤＮＡが、Ｇｂ４合成酵素の発現のために使用される
限りにおいて、あらゆる態様を包含する。すなわち、上
記酵素活性を利用する際に上記ＤＮＡを利用するあらゆ
る態様が包含される。例えば、本発明酵素製造方法、本
発明Ｇｂ４製造方法２および本発明フォルスマン製造方
法は、いずれも上記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡがＧ
ｂ４合成酵素の発現のために使用されていることから、
本発明使用に包含される。またＧｂ４合成酵素の発現
は、生体外で行われる場合のみならず、生体内で行われ
る場合をも包含する。例えば、上記（ａ）又は（ｂ）に
示すＤＮＡを生体内の細胞に導入して、生体内でＧｂ４
合成酵素を発現させる態様も、本発明使用に包含され
る。
【００６０】Ｇｂ３はベロ毒素に対するレセプターであ
ることが知られていることから、Ｇｂ４合成酵素をコー
ドするＤＮＡを細胞に導入して発現させることによって
Ｇｂ３糖鎖をＧｂ４糖鎖に変換し、これによってベロ毒
素の細胞への結合性を失わせることができる可能性もあ
り、このような実施態様も本発明使用に包含される。
ることが知られていることから、Ｇｂ４合成酵素をコー
ドするＤＮＡを細胞に導入して発現させることによって
Ｇｂ３糖鎖をＧｂ４糖鎖に変換し、これによってベロ毒
素の細胞への結合性を失わせることができる可能性もあ
り、このような実施態様も本発明使用に包含される。
【００６１】
【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。しかしながら、これにより本発明の技術的
範囲が限定されるべきものではない。
に説明する。しかしながら、これにより本発明の技術的
範囲が限定されるべきものではない。
【００６２】まず、本実施例で用いた試薬等について説
明する。UDP-GalNAc、LacCer、Ｇｂ３およびＧｂ４は、
シグマ(Sigma)社より購入した。ＧＭ３およびＧＤ３
は、雪印乳業株式会社より購入した。UDP-[3H]GalNAc
は、NENライフサイエンスプロダクツ社(NEN Life Scien
ce Products, Inc)より入手した。抗-フォルスマン糖脂
質(anti-Forssman glycolipid)モノクローナル抗体であ
るM1/22.25.8.HLは、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション(American Type Culture Collection)か
ら入手したハイブリドーマ(ATCC TIB-121)の培養上清か
ら調製した。
明する。UDP-GalNAc、LacCer、Ｇｂ３およびＧｂ４は、
シグマ(Sigma)社より購入した。ＧＭ３およびＧＤ３
は、雪印乳業株式会社より購入した。UDP-[3H]GalNAc
は、NENライフサイエンスプロダクツ社(NEN Life Scien
ce Products, Inc)より入手した。抗-フォルスマン糖脂
質(anti-Forssman glycolipid)モノクローナル抗体であ
るM1/22.25.8.HLは、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション(American Type Culture Collection)か
ら入手したハイブリドーマ(ATCC TIB-121)の培養上清か
ら調製した。
【００６３】ＳＶ４０のラージＴ抗原の発現ベクターで
あるｐＢＳ-ＳＶＴは、ＪＣＲＢ(Japanese Cancer Rese
arch Resources Bank) より入手した。
あるｐＢＳ-ＳＶＴは、ＪＣＲＢ(Japanese Cancer Rese
arch Resources Bank) より入手した。
【００６４】フォルスマン抗原合成酵素(Forssman anti
gen synthase；FS)の発現ベクターは、ｐＦＳ-３５(14)
のHindIII/XhoI-消化断片をｐＣＤＭ８（インビトロジ
ェン社）に挿入することにより構築し、pCDM8/FSと命名
した。
gen synthase；FS)の発現ベクターは、ｐＦＳ-３５(14)
のHindIII/XhoI-消化断片をｐＣＤＭ８（インビトロジ
ェン社）に挿入することにより構築し、pCDM8/FSと命名
した。
【００６５】Gb3/CD77合成酵素の発現ベクターは、ｐＶ
ＴＲ-１(J.Biol.Chem. 275, p15152-15156 (2000))のXh
oI断片をｐＣＤＮＡ3.1(インビトロジェン社)のXhoIサ
イトに挿入することにより構築し、pCDNA3.1/VTR-1と命
名した。
ＴＲ-１(J.Biol.Chem. 275, p15152-15156 (2000))のXh
oI断片をｐＣＤＮＡ3.1(インビトロジェン社)のXhoIサ
イトに挿入することにより構築し、pCDNA3.1/VTR-1と命
名した。
【００６６】マウスの繊維芽細胞（Ｌ１細胞）は、 ス
ローン−ケタリング（Sloan-Kettering）癌センターの
Ａ．Ｐ．アルビノ（Albino）博士により恵与され、ウシ
胎仔血清(fetal bovine serum；ＦＣＳ)を7.5％含有す
る、ダルベッコの改変イーグル最小必須培地（Dulbecc
o's modified Eagle's minimal essential medium；D-M
EM）で培養した。Ｌ細胞はα1,4-ガラクトース転移酵素
活性を有しておらず、また、Gb3/CD77も発現しないが、
大量のLacCerを発現する。
ローン−ケタリング（Sloan-Kettering）癌センターの
Ａ．Ｐ．アルビノ（Albino）博士により恵与され、ウシ
胎仔血清(fetal bovine serum；ＦＣＳ)を7.5％含有す
る、ダルベッコの改変イーグル最小必須培地（Dulbecc
o's modified Eagle's minimal essential medium；D-M
EM）で培養した。Ｌ細胞はα1,4-ガラクトース転移酵素
活性を有しておらず、また、Gb3/CD77も発現しないが、
大量のLacCerを発現する。
【００６７】一過性の発現系でレシピエント細胞として
用いたマウスの繊維芽細胞株（１Ｂ９）は、Ｌ細胞を、
pBS-SVT(SV40のラージＴ抗原)およびpCDNA3.1/VTR-1(Gb
3/CD77合成酵素をコードするcDNA)でトランスフェクト
し、ネオマイシン(neo)耐性細胞のうち、Ｇｂ３および
ＳＶ４０ラージＴ抗原の発現が陽性のものをスクリーニ
ングすることにより確立した。 Ｇｂ３およびＳＶ４０
ラージＴ抗原の発現は、それぞれラット抗Gb3モノクロ
ーナル抗体 38.13(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78,p6485-
6488 (1981))およびマウス抗SV40ラージＴ抗原モノクロ
ーナル抗体 Pab101 (Santa Cruz. Biotechnology, In
c)を用い、それぞれ間接免疫蛍光アッセイおよびフロー
サイトメトリーにより行った。安定なトランスフェクタ
ントは、7.5％ ＦＣＳおよび300μg/ml Ｇ４１８を含有
するD-MEM中で培養した。
用いたマウスの繊維芽細胞株（１Ｂ９）は、Ｌ細胞を、
pBS-SVT(SV40のラージＴ抗原)およびpCDNA3.1/VTR-1(Gb
3/CD77合成酵素をコードするcDNA)でトランスフェクト
し、ネオマイシン(neo)耐性細胞のうち、Ｇｂ３および
ＳＶ４０ラージＴ抗原の発現が陽性のものをスクリーニ
ングすることにより確立した。 Ｇｂ３およびＳＶ４０
ラージＴ抗原の発現は、それぞれラット抗Gb3モノクロ
ーナル抗体 38.13(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 78,p6485-
6488 (1981))およびマウス抗SV40ラージＴ抗原モノクロ
ーナル抗体 Pab101 (Santa Cruz. Biotechnology, In
c)を用い、それぞれ間接免疫蛍光アッセイおよびフロー
サイトメトリーにより行った。安定なトランスフェクタ
ントは、7.5％ ＦＣＳおよび300μg/ml Ｇ４１８を含有
するD-MEM中で培養した。
【００６８】１Ｂ９は、Ｇｂ３を大量に含有するが、Ｇ
ｂ４とフォルスマン抗原は無視できる程度にしか含有し
ていないのが特徴である。
ｂ４とフォルスマン抗原は無視できる程度にしか含有し
ていないのが特徴である。
【００６９】
【実施例１】＜１＞１，３−Ｎ―アセチルガラクトサミ
ン転移酵素 cDNAの発現クローニング 成人ヒト腎臓cDNAライブラリーのプラスミド(インビト
ロジェン社)を、pCDM8/FSと共に、ＤＥＡＥ-デキストラ
ン法(J. Biol. Chem., 267, p12082-12089 (1992))によ
って１Ｂ９細胞（ＳＶ４０ラージＴ抗原およびＧｂ３を
発現している）にトランスフェクトした。４８時間後、
トランスフェクトされた細胞をトリプシン処理してはが
し、ラットモノクローナル抗体 M1/22.25.8.HLと共に氷
冷下で１時間インキュベートした。細胞を洗浄後、細胞
をヤギ抗ラットIgM(ICN)でコートしたディッシュ(Proc.
Natl.Acad.Sci.USA, 84, p3365-3369 (1987))に播い
た。panned cellからHirt抽出によってプラスミドＤＮ
Ａを回収し、E.coli XL-1 Blue (ストラタジーン社)を
形質転換した。この工程を４回繰り返した。小規模の免
疫蛍光アッセイによって、約１０００個のバクテリアの
コロニーが陽性として同定された。このコロニーから抽
出したcDNAとpCDM8/FSとを共に１Ｂ９細胞に移入した場
合にフォルスマン抗原を発現するクローンを選択した結
果、３つの独立したクローンが同定された。
ン転移酵素 cDNAの発現クローニング 成人ヒト腎臓cDNAライブラリーのプラスミド(インビト
ロジェン社)を、pCDM8/FSと共に、ＤＥＡＥ-デキストラ
ン法(J. Biol. Chem., 267, p12082-12089 (1992))によ
って１Ｂ９細胞（ＳＶ４０ラージＴ抗原およびＧｂ３を
発現している）にトランスフェクトした。４８時間後、
トランスフェクトされた細胞をトリプシン処理してはが
し、ラットモノクローナル抗体 M1/22.25.8.HLと共に氷
冷下で１時間インキュベートした。細胞を洗浄後、細胞
をヤギ抗ラットIgM(ICN)でコートしたディッシュ(Proc.
Natl.Acad.Sci.USA, 84, p3365-3369 (1987))に播い
た。panned cellからHirt抽出によってプラスミドＤＮ
Ａを回収し、E.coli XL-1 Blue (ストラタジーン社)を
形質転換した。この工程を４回繰り返した。小規模の免
疫蛍光アッセイによって、約１０００個のバクテリアの
コロニーが陽性として同定された。このコロニーから抽
出したcDNAとpCDM8/FSとを共に１Ｂ９細胞に移入した場
合にフォルスマン抗原を発現するクローンを選択した結
果、３つの独立したクローンが同定された。
【００７０】結果的に、異なった5'-非翻訳領域を有
し、グロボシド合成酵素遺伝子と推定される２つのクロ
ーン（「タイプ１」と「タイプ２」と命名した）を同定
した。エキソン-イントロン結合部における全てのイン
トロン配列は、GT-AGコンセンサスに合致していた。タ
イプ１および２ともに、オープン・リーディング・フレ
ームのヌクレオチド配列が本質的に一致していたので、
タイプ１のクローンを以後の解析に用いることとし、こ
れをβ1,3GalNAcT-1と命名した。
し、グロボシド合成酵素遺伝子と推定される２つのクロ
ーン（「タイプ１」と「タイプ２」と命名した）を同定
した。エキソン-イントロン結合部における全てのイン
トロン配列は、GT-AGコンセンサスに合致していた。タ
イプ１および２ともに、オープン・リーディング・フレ
ームのヌクレオチド配列が本質的に一致していたので、
タイプ１のクローンを以後の解析に用いることとし、こ
れをβ1,3GalNAcT-1と命名した。
【００７１】＜２＞配列の解析 クローニングされたcDNAのヌクレオチド配列は、PRISM
dye terminator cyclesequencing kitおよびモデル310
ＤＮＡシーケンサー(Applied Biosystems)を用いたジデ
オキシヌクレオチド・ターミネーション法により決定し
た。アミノ酸配列およびヒドロパシー解析は、Genetyx-
Macソフトウエア バージョン8.0(ソフトウエア開発)を
用いて行った。β1,3GalNAcT-1のタイプ１についての配
列解析結果を結果を図１に示す。AUG開始コドンの位置
は、Kozakのコンセンサス配列(Cell 44, p283-292 (198
6))に従って決定した。その結果、クローニングされたc
DNAのヌクレオチド配列は単一のオープンリーディング
フレームを有していた。図１中、推定アミノ酸配列をヌ
クレオチド配列の下に示した。このオープンリーデイン
グから、３３１アミノ酸からなる分子量39,511のタンパ
ク質が推定された。また推定される膜貫通疎水ドメイン
を下線で示し、Ｎ−結合グリコシレーションされる可能
性がある部位（５箇所）は四角で囲った。ポリアデニル
化シグナルも下線で示した。
dye terminator cyclesequencing kitおよびモデル310
ＤＮＡシーケンサー(Applied Biosystems)を用いたジデ
オキシヌクレオチド・ターミネーション法により決定し
た。アミノ酸配列およびヒドロパシー解析は、Genetyx-
Macソフトウエア バージョン8.0(ソフトウエア開発)を
用いて行った。β1,3GalNAcT-1のタイプ１についての配
列解析結果を結果を図１に示す。AUG開始コドンの位置
は、Kozakのコンセンサス配列(Cell 44, p283-292 (198
6))に従って決定した。その結果、クローニングされたc
DNAのヌクレオチド配列は単一のオープンリーディング
フレームを有していた。図１中、推定アミノ酸配列をヌ
クレオチド配列の下に示した。このオープンリーデイン
グから、３３１アミノ酸からなる分子量39,511のタンパ
ク質が推定された。また推定される膜貫通疎水ドメイン
を下線で示し、Ｎ−結合グリコシレーションされる可能
性がある部位（５箇所）は四角で囲った。ポリアデニル
化シグナルも下線で示した。
【００７２】驚くべきことに、このアミノ酸配列をデー
タベースを用いて他のcDNAと比較した結果、Amadoら(J.
Biol.Chem. 273, p12770-12778 (1998))により報告され
ているヒトβ3GalT-3と同一であることが判明した。ヒ
トβ3GalT-3は、β3-カ゛ラクトース転移酵素遺伝子ファミリー
に属すると考えられてきているが、ガラクトース転移酵
素活性は報告されていない。
タベースを用いて他のcDNAと比較した結果、Amadoら(J.
Biol.Chem. 273, p12770-12778 (1998))により報告され
ているヒトβ3GalT-3と同一であることが判明した。ヒ
トβ3GalT-3は、β3-カ゛ラクトース転移酵素遺伝子ファミリー
に属すると考えられてきているが、ガラクトース転移酵
素活性は報告されていない。
【００７３】β1,3GalNAcT-1のタイプ２についての5'-
非翻訳部位のヌクレオチド配列を図２に示す。エキソン
-イントロン結合を併せて示した。また、KyteとDoolitt
leの方法(J.Mol.Biol. 157, p105-132 (1982))により、
1７アミノ酸のウインドウでハイドロパシープロットを
行った。結果を図３に示す。なお図３中の "Hydrophobi
city" は 疎水性の程度を意味する。この結果から、ア
ミノ末端側に、２３アミノ酸残基からなる顕著な疎水性
領域が１箇所存在することが示された。このことからこ
のタンパク質は、現在知られている他の多くのグリコシ
ルトランスフェラーゼと同様に、II型の膜貫通トポロジ
ーを有していることが推定される。
非翻訳部位のヌクレオチド配列を図２に示す。エキソン
-イントロン結合を併せて示した。また、KyteとDoolitt
leの方法(J.Mol.Biol. 157, p105-132 (1982))により、
1７アミノ酸のウインドウでハイドロパシープロットを
行った。結果を図３に示す。なお図３中の "Hydrophobi
city" は 疎水性の程度を意味する。この結果から、ア
ミノ末端側に、２３アミノ酸残基からなる顕著な疎水性
領域が１箇所存在することが示された。このことからこ
のタンパク質は、現在知られている他の多くのグリコシ
ルトランスフェラーゼと同様に、II型の膜貫通トポロジ
ーを有していることが推定される。
【００７４】＜３＞膜抽出物の調製 ８０％コンフレントに達したＬ細胞を、ＤＥＡＥ-デキ
ストラン法によって発現ベクターでトランスフェクトし
た。８０時間後に細胞を回収し、この細胞を、1mMフェ
ニルメチルスルフォニルフルオリドを含有する氷冷した
リン酸緩衝生理食塩水中で、窒素キャビテーション装置
を用いて破砕した(J.Biol.Chem., 270,p6149-6155 (199
5))。核を低速の遠心分離で除去し、この上清を４℃
下、100,000 xｇで１時間遠心分離した。沈殿を氷冷し
た100mM MES緩衝液(pH 6.5)で再懸濁し、酵素源として
用いた。
ストラン法によって発現ベクターでトランスフェクトし
た。８０時間後に細胞を回収し、この細胞を、1mMフェ
ニルメチルスルフォニルフルオリドを含有する氷冷した
リン酸緩衝生理食塩水中で、窒素キャビテーション装置
を用いて破砕した(J.Biol.Chem., 270,p6149-6155 (199
5))。核を低速の遠心分離で除去し、この上清を４℃
下、100,000 xｇで１時間遠心分離した。沈殿を氷冷し
た100mM MES緩衝液(pH 6.5)で再懸濁し、酵素源として
用いた。
【００７５】＜４＞酵素アッセイ β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素アッセ
イは、10mM MnCl2、0.3％ Triton X-100、100mM MES緩
衝液(pH6.5)、0.1mM UDP-[3H]GalNAc (160dpm/pmol：Ga
lNAcの供与体)、200μgの下記膜抽出物、および20μgの
基質(受容体)を含む混合液(全量50μl)中で行った。３
７℃で３時間インキュベートした後、0.5mlの水を添加
することによって酵素反応を停止させた。生成物をC18
Sep-Pakカートリッジ(Waters社)を用いて単離し、almin
ium-backed シリカゲル-60 HPTLCプレート(メルク社)に
スポットし、クロロホルム/メタノール/水(65:25:5)の
溶媒系で展開することにより、薄層クロマトグラフィー
（ＴＬＣ）を行った。その後プレートを乾燥させ、En3H
anceTM(NEN Life Science Products社)でスプレーし、
放射標識された産物をオートラジオグラフィーによって
可視化した。なお、ＴＬＣにおける移動度のスタンダー
ドとしては、LacCer、Gb3およびGb4を用いた。
イは、10mM MnCl2、0.3％ Triton X-100、100mM MES緩
衝液(pH6.5)、0.1mM UDP-[3H]GalNAc (160dpm/pmol：Ga
lNAcの供与体)、200μgの下記膜抽出物、および20μgの
基質(受容体)を含む混合液(全量50μl)中で行った。３
７℃で３時間インキュベートした後、0.5mlの水を添加
することによって酵素反応を停止させた。生成物をC18
Sep-Pakカートリッジ(Waters社)を用いて単離し、almin
ium-backed シリカゲル-60 HPTLCプレート(メルク社)に
スポットし、クロロホルム/メタノール/水(65:25:5)の
溶媒系で展開することにより、薄層クロマトグラフィー
（ＴＬＣ）を行った。その後プレートを乾燥させ、En3H
anceTM(NEN Life Science Products社)でスプレーし、
放射標識された産物をオートラジオグラフィーによって
可視化した。なお、ＴＬＣにおける移動度のスタンダー
ドとしては、LacCer、Gb3およびGb4を用いた。
【００７６】膜抽出物として、pCDNA3.1ベクター(コン
トロール)、またはpCDNA3.1ベクターに挿入したβ1,3Ga
lNAcT-1（pCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1）でトランスフェク
トしたＬ細胞からの膜抽出物を用い、基質(受容体)とし
てＧｂ３糖脂質を用いてアッセイした。その結果、この
酵素は[3H]GalNAcをＧｂ３に有効に転移(79pmol/時間/m
gタンパク質)し、スタンダードであるGb4と同じ移動度
の新たな成分を生成することが明らかとなった。一方、
基質(受容体)として種々の糖脂質(LacCer、ＧＭ３、Ｇ
Ｄ３またはＧｂ４)を用いてアッセイした結果、[3H]Gal
NAcは、LacCer、GM3、GD3およびGb4には転移されなかっ
た。このことから、この酵素はGA2/GM2/GD2合成酵素や
フォルスマン抗原合成酵素とは異なることが示された。
なお、pCDNA3.1ベクター(コントロール)をトランスフェ
クトした細胞の抽出物では、活性は検出されなかった。
トロール)、またはpCDNA3.1ベクターに挿入したβ1,3Ga
lNAcT-1（pCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1）でトランスフェク
トしたＬ細胞からの膜抽出物を用い、基質(受容体)とし
てＧｂ３糖脂質を用いてアッセイした。その結果、この
酵素は[3H]GalNAcをＧｂ３に有効に転移(79pmol/時間/m
gタンパク質)し、スタンダードであるGb4と同じ移動度
の新たな成分を生成することが明らかとなった。一方、
基質(受容体)として種々の糖脂質(LacCer、ＧＭ３、Ｇ
Ｄ３またはＧｂ４)を用いてアッセイした結果、[3H]Gal
NAcは、LacCer、GM3、GD3およびGb4には転移されなかっ
た。このことから、この酵素はGA2/GM2/GD2合成酵素や
フォルスマン抗原合成酵素とは異なることが示された。
なお、pCDNA3.1ベクター(コントロール)をトランスフェ
クトした細胞の抽出物では、活性は検出されなかった。
【００７７】＜５＞糖脂質の抽出 糖脂質は、Biochemistry 24, p7820-7826 (1985)に記載
の方法で単離した。すなわち、 pCDNA3.1のみでトラン
スフェクトされた１Ｂ９細胞、またはpCDNA3.1/β1,3Ga
lNAcT-1でトランスフェクトされた１Ｂ９細胞(いずれも
パックされた状態で約0.24ml)から、クロロホルム/メタ
ノール(2:1、1:1、1:2の順)を用いて脂質を抽出した。
アセチル化した後、フロリジル(Florisil)カラムを用い
て糖脂質画分を単離した。脱アセチル化および脱塩した
後、全糖脂質をクロロホルム/メタノール(2:1)に溶解
し、ＴＬＣプレートにスポットした。ヒトＢ赤血球細胞
から抽出した中性糖脂質、およびＧｂ４も同様にスポッ
トし、展開後、オルシノール(orcinol)またはプリムリ
ン(primulin)をスプレーしてバンドを検出した結果、ヒ
トＢ赤血球細胞から抽出した中性糖脂質をスポットした
レーンにおいては、Ｇｂ４の移動位置に極めて濃いバン
ドが、LacCerおよびＧｂ３の移動位置には中程度のバン
ドが検出された。Ｇｂ４をスポットしたレーンにはＧｂ
４の移動位置にのみ濃いバンドが検出された。
の方法で単離した。すなわち、 pCDNA3.1のみでトラン
スフェクトされた１Ｂ９細胞、またはpCDNA3.1/β1,3Ga
lNAcT-1でトランスフェクトされた１Ｂ９細胞(いずれも
パックされた状態で約0.24ml)から、クロロホルム/メタ
ノール(2:1、1:1、1:2の順)を用いて脂質を抽出した。
アセチル化した後、フロリジル(Florisil)カラムを用い
て糖脂質画分を単離した。脱アセチル化および脱塩した
後、全糖脂質をクロロホルム/メタノール(2:1)に溶解
し、ＴＬＣプレートにスポットした。ヒトＢ赤血球細胞
から抽出した中性糖脂質、およびＧｂ４も同様にスポッ
トし、展開後、オルシノール(orcinol)またはプリムリ
ン(primulin)をスプレーしてバンドを検出した結果、ヒ
トＢ赤血球細胞から抽出した中性糖脂質をスポットした
レーンにおいては、Ｇｂ４の移動位置に極めて濃いバン
ドが、LacCerおよびＧｂ３の移動位置には中程度のバン
ドが検出された。Ｇｂ４をスポットしたレーンにはＧｂ
４の移動位置にのみ濃いバンドが検出された。
【００７８】pCDNA3.1のみでトランスフェクトされた１
Ｂ９細胞から抽出した糖脂質をスポットしたレーンにお
いては、Ｇｂ３の移動位置にのみバンドが検出された。
pCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1でトランスフェクトされた１
Ｂ９細胞から抽出した糖脂質をスポットしたレーンにお
いては、Ｇｂ３およびＧｂ４の移動位置にバンドが検出
された。
Ｂ９細胞から抽出した糖脂質をスポットしたレーンにお
いては、Ｇｂ３の移動位置にのみバンドが検出された。
pCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1でトランスフェクトされた１
Ｂ９細胞から抽出した糖脂質をスポットしたレーンにお
いては、Ｇｂ３およびＧｂ４の移動位置にバンドが検出
された。
【００７９】＜６＞ＴＬＣ―免疫染色 ＴＬＣ―免疫染色は、Anal.Biochem. 221, p312-316 (1
994)に記載の方法に従い、Biochemistry 24, p7820-782
6 (1985)に記載の方法で行った。すなわち、上記と同様
に脂質を抽出してＴＬＣプレートにスポットして展開し
た後、ＴＬＣプレートをポリビニリデンジフルオリド膜
にヒート・ブロット(heat-blot)した。この膜を、1:100
希釈したヒト抗 Gb4 モノクローナル抗体(９Ｈ６)と共
に１時間インキュベートして洗浄した後、ビオチン化ヤ
ギ抗ヒトIgM(シグマ社)と共に１時間インキュベートし
た。抗体の結合は、ＡＢＣ−ＰＯTM（ベクター社）およ
びＨＲＰ−１０００TM（コニカ）を用い、これらの説明
書に従って検出した。Ｇｂ４をスポットしたレーン、ヒ
トＢ赤血球細胞から抽出した中性糖脂質をスポットした
レーン、およびpCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1でトランスフ
ェクトした１Ｂ９の抽出物をスポットしたレーンには、
Ｇｂ４に相当する移動位置にのみバンドが検出された。
994)に記載の方法に従い、Biochemistry 24, p7820-782
6 (1985)に記載の方法で行った。すなわち、上記と同様
に脂質を抽出してＴＬＣプレートにスポットして展開し
た後、ＴＬＣプレートをポリビニリデンジフルオリド膜
にヒート・ブロット(heat-blot)した。この膜を、1:100
希釈したヒト抗 Gb4 モノクローナル抗体(９Ｈ６)と共
に１時間インキュベートして洗浄した後、ビオチン化ヤ
ギ抗ヒトIgM(シグマ社)と共に１時間インキュベートし
た。抗体の結合は、ＡＢＣ−ＰＯTM（ベクター社）およ
びＨＲＰ−１０００TM（コニカ）を用い、これらの説明
書に従って検出した。Ｇｂ４をスポットしたレーン、ヒ
トＢ赤血球細胞から抽出した中性糖脂質をスポットした
レーン、およびpCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1でトランスフ
ェクトした１Ｂ９の抽出物をスポットしたレーンには、
Ｇｂ４に相当する移動位置にのみバンドが検出された。
【００８０】これに対し、LacCerをスポットしたレー
ン、Ｇｂ３をスポットしたレーン、およびpCDNA3.1のみ
でトランスフェクトした１Ｂ９の抽出物をスポットした
レーンでは、バンドは全く検出されなかった。これらの
ことから、pCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1でトランスフェク
トした１Ｂ９の抽出物をスポットしたレーンに現れたバ
ンドは、Ｇｂ４であることが確認された。
ン、Ｇｂ３をスポットしたレーン、およびpCDNA3.1のみ
でトランスフェクトした１Ｂ９の抽出物をスポットした
レーンでは、バンドは全く検出されなかった。これらの
ことから、pCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1でトランスフェク
トした１Ｂ９の抽出物をスポットしたレーンに現れたバ
ンドは、Ｇｂ４であることが確認された。
【００８１】＜７＞フローサイトメトリー解析 ＤＥＡＥ―デキストラン法により、１Ｂ９細胞をpCDNA
3.1、pCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1、pCDM8/FS、またはpCDN
A3.1/β1,3GalNAcT-1とpCDM8/FSで一過性にトランスフ
ェクトした。２日後に細胞をAb M1/22.25.8.HLと共にイ
ンキュベートし、次いでフルオレセインイソチオシアネ
ート結合ヤギ抗ラットIgM(薄い線で示す)で染色し、フ
ォルスマン抗原の発現の程度をフローサイトメトリーで
解析した。結果を図４に示す。なお図４中の濃い線は、
二次抗体のみを反応させたコントロールを示す。また、
図４中の "ＭＯＣＫ"、"β1,3GalNAc-T"、"ＦＳ" およ
び "β1,3GalNAc-T＋ＦＳ" は、それぞれ、pCDNA3.1、p
CDNA3.1/β1,3GalNAcT-1、pCDM8/FS、およびpCDNA3.1/
β1,3GalNAcT-1とpCDM8/FSでトランスフェクトしたもの
であることを示す。また図４中、Relative fluorescenc
e intensity" は、相対蛍光強度を意味する。
3.1、pCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1、pCDM8/FS、またはpCDN
A3.1/β1,3GalNAcT-1とpCDM8/FSで一過性にトランスフ
ェクトした。２日後に細胞をAb M1/22.25.8.HLと共にイ
ンキュベートし、次いでフルオレセインイソチオシアネ
ート結合ヤギ抗ラットIgM(薄い線で示す)で染色し、フ
ォルスマン抗原の発現の程度をフローサイトメトリーで
解析した。結果を図４に示す。なお図４中の濃い線は、
二次抗体のみを反応させたコントロールを示す。また、
図４中の "ＭＯＣＫ"、"β1,3GalNAc-T"、"ＦＳ" およ
び "β1,3GalNAc-T＋ＦＳ" は、それぞれ、pCDNA3.1、p
CDNA3.1/β1,3GalNAcT-1、pCDM8/FS、およびpCDNA3.1/
β1,3GalNAcT-1とpCDM8/FSでトランスフェクトしたもの
であることを示す。また図４中、Relative fluorescenc
e intensity" は、相対蛍光強度を意味する。
【００８２】この結果、pCDNA3.1/β1,3GalNAcT-1とpCD
M8/FSとを共にトランスフェクトした細胞、すなわちＧ
ｂ４合成酵素をコードするcDNAとフォルスマン抗原合成
酵素をコードするcDNAとを共に導入した１Ｂ９細胞にの
み、フォルスマン抗原の明確な発現が見られた。β1,3G
alNAcT-1またはpCDM8/FSを単独で導入した場合には、い
ずれもフォルスマン抗原の発現は見られなかった。これ
らのデータから、β1,3GalNAcT-1はＧｂ４の発現に必要
であることが示された。
M8/FSとを共にトランスフェクトした細胞、すなわちＧ
ｂ４合成酵素をコードするcDNAとフォルスマン抗原合成
酵素をコードするcDNAとを共に導入した１Ｂ９細胞にの
み、フォルスマン抗原の明確な発現が見られた。β1,3G
alNAcT-1またはpCDM8/FSを単独で導入した場合には、い
ずれもフォルスマン抗原の発現は見られなかった。これ
らのデータから、β1,3GalNAcT-1はＧｂ４の発現に必要
であることが示された。
【００８３】ノーザンブロッティング Multiple ChoiceTM ノーザンブロットメンブレン（OriG
ene Technologies社）、並びにヒトの脳、結腸、心臓、
腎臓、肝臓、肺、筋肉、胎盤、小腸、脾臓、胃および精
巣のポリ(Ａ)+ＲＮＡ(2μg)を用いて、ノーザンブロッ
ティングを行った。ハイブリダイズは、[32P]dCTPラベ
ルしたβ1,3GalNAcT-1のcDNAプローブ（配列番号１の塩
基番号１〜８１８で示される配列からなる）または、ア
クチンのプローブ（コントロール）を用いて行った。
ene Technologies社）、並びにヒトの脳、結腸、心臓、
腎臓、肝臓、肺、筋肉、胎盤、小腸、脾臓、胃および精
巣のポリ(Ａ)+ＲＮＡ(2μg)を用いて、ノーザンブロッ
ティングを行った。ハイブリダイズは、[32P]dCTPラベ
ルしたβ1,3GalNAcT-1のcDNAプローブ（配列番号１の塩
基番号１〜８１８で示される配列からなる）または、ア
クチンのプローブ（コントロール）を用いて行った。
【００８４】この結果、脳および心臓において強い遺伝
子発現が見られた。また中程度の発現が肺、胎盤および
精巣で見られ、弱い発現が腎臓、肝臓、脾臓および胃で
見られた。
子発現が見られた。また中程度の発現が肺、胎盤および
精巣で見られ、弱い発現が腎臓、肝臓、脾臓および胃で
見られた。
【００８５】
【発明の効果】本発明により、新規なＧｂ４合成酵素の
製造方法、Ｇｂ４糖鎖の製造方法およびフォルスマン抗
原糖鎖の製造方法等が提供される。本発明酵素製造方法
は、Ｇｂ４合成酵素の大量調製に有用であり、またこれ
により製造されたＧｂ４合成酵素は本発明Ｇｂ４製造方
法に利用できることから極めて有用である。本発明Ｇｂ
４製造方法および本発明フォルスマン製造方法は、これ
らのグロボ系糖脂質の大量調製に有用である。また本発
明使用は、Ｇｂ４合成酵素をコードするＤＮＡを、Ｇｂ
４合成酵素発現のために使用する方法である。本発明使
用によれば、例えばＧｂ４合成酵素をコードするＤＮＡ
を細胞に導入して発現させることによってＧｂ３糖鎖
（ベロ毒素に対するレセプター）をＧｂ４糖鎖に変換
し、これによってベロ毒素の細胞への結合性を失わせる
ことができる可能性もある。
製造方法、Ｇｂ４糖鎖の製造方法およびフォルスマン抗
原糖鎖の製造方法等が提供される。本発明酵素製造方法
は、Ｇｂ４合成酵素の大量調製に有用であり、またこれ
により製造されたＧｂ４合成酵素は本発明Ｇｂ４製造方
法に利用できることから極めて有用である。本発明Ｇｂ
４製造方法および本発明フォルスマン製造方法は、これ
らのグロボ系糖脂質の大量調製に有用である。また本発
明使用は、Ｇｂ４合成酵素をコードするＤＮＡを、Ｇｂ
４合成酵素発現のために使用する方法である。本発明使
用によれば、例えばＧｂ４合成酵素をコードするＤＮＡ
を細胞に導入して発現させることによってＧｂ３糖鎖
（ベロ毒素に対するレセプター）をＧｂ４糖鎖に変換
し、これによってベロ毒素の細胞への結合性を失わせる
ことができる可能性もある。
【配列表】 SEQUENCE LISTING 生化学工業株式会社 古川 鋼一 <120> β１,３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の製造方法 <130> J200002500 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1897 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (109)..(1104) <220> <221> N_region <222> (322)..(330) <220> <221> N_region <222> (568)..(576) <220> <221> N_region <222> (700)..(708) <220> <221> N_region <222> (742)..(750) <220> <221> N_region <222> (1084)..(1092) <220> <221> polyA_signal <222> (1157)..(1162) <400> 1 gtagatagtc agatgtcttt tgaaaatgtg ttttcggtgt ggaatattaa cccaatcttt 60 gataactctt ccagaacctt cggctcgcgt gcttctgagc tgctgtgg atg gcc tcg 117 Met Ala Ser 1 gct ctc tgg act gtc ctt ccg agt agg atg tca ctg aga tcc ctc aaa 165 Ala Leu Trp Thr Val Leu Pro Ser Arg Met Ser Leu Arg Ser Leu Lys 5 10 15 tgg agc ctc ctg ctg ctg tca ctc ctg agt ttc ttt gtg atg tgg tac 213 Trp Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ser Phe Phe Val Met Trp Tyr 20 25 30 35 ctc agc ctt ccc cac tac aat gtg ata gaa cgc gtg aac tgg atg tac 261 Leu Ser Leu Pro His Tyr Asn Val Ile Glu Arg Val Asn Trp Met Tyr 40 45 50 ttc tat gag tat gag ccg att tac aga caa gac ttt cac ttc aca ctt 309 Phe Tyr Glu Tyr Glu Pro Ile Tyr Arg Gln Asp Phe His Phe Thr Leu 55 60 65 cga gag cat tca aac tgc tct cat caa aat cca ttt ctg gtc att ctg 357 Arg Glu His Ser Asn Cys Ser His Gln Asn Pro Phe Leu Val Ile Leu 70 75 80 gtg acc tcc cac cct tca gat gtg aaa gcc agg cag gcc att aga gtt 405 Val Thr Ser His Pro Ser Asp Val Lys Ala Arg Gln Ala Ile Arg Val 85 90 95 act tgg ggt gaa aaa aag tct tgg tgg gga tat gag gtt ctt aca ttt 453 Thr Trp Gly Glu Lys Lys Ser Trp Trp Gly Tyr Glu Val Leu Thr Phe 100 105 110 115 ttc tta tta ggc caa gag gct gaa aag gaa gac aaa atg ttg gca ttg 501 Phe Leu Leu Gly Gln Glu Ala Glu Lys Glu Asp Lys Met Leu Ala Leu 120 125 130 tcc tta gag gat gaa cac ctt ctt tat ggt gac ata atc cga caa gat 549 Ser Leu Glu Asp Glu His Leu Leu Tyr Gly Asp Ile Ile Arg Gln Asp 135 140 145 ttt tta gac aca tat aat aac ctg acc ttg aaa acc att atg gca ttc 597 Phe Leu Asp Thr Tyr Asn Asn Leu Thr Leu Lys Thr Ile Met Ala Phe 150 155 160 agg tgg gta act gag ttt tgc ccc aat gcc aag tac gta atg aag aca 645 Arg Trp Val Thr Glu Phe Cys Pro Asn Ala Lys Tyr Val Met Lys Thr 165 170 175 gac act gat gtt ttc atc aat act ggc aat tta gtg aag tat ctt tta 693 Asp Thr Asp Val Phe Ile Asn Thr Gly Asn Leu Val Lys Tyr Leu Leu 180 185 190 195 aac cta aac cac tca gag aag ttt ttc aca ggt tat cct cta att gat 741 Asn Leu Asn His Ser Glu Lys Phe Phe Thr Gly Tyr Pro Leu Ile Asp 200 205 210 aat tat tcc tat aga gga ttt tac caa aaa acc cat att tct tac cag 789 Asn Tyr Ser Tyr Arg Gly Phe Tyr Gln Lys Thr His Ile Ser Tyr Gln 215 220 225 gag tat cct ttc aag gtg ttc cct cca tac tgc agt ggg ttg ggt tat 837 Glu Tyr Pro Phe Lys Val Phe Pro Pro Tyr Cys Ser Gly Leu Gly Tyr 230 235 240 ata atg tcc aga gat ttg gtg cca agg atc tat gaa atg atg ggt cac 885 Ile Met Ser Arg Asp Leu Val Pro Arg Ile Tyr Glu Met Met Gly His 245 250 255 gta aaa ccc atc aag ttt gaa gat gtt tat gtc ggg atc tgt ttg aat 933 Val Lys Pro Ile Lys Phe Glu Asp Val Tyr Val Gly Ile Cys Leu Asn 260 265 270 275 tta tta aaa gtg aac att cat att cca gaa gac aca aat ctt ttc ttt 981 Leu Leu Lys Val Asn Ile His Ile Pro Glu Asp Thr Asn Leu Phe Phe 280 285 290 cta tat aga atc cat ttg gat gtc tgt caa ctg aga cgt gtg att gca 1029 Leu Tyr Arg Ile His Leu Asp Val Cys Gln Leu Arg Arg Val Ile Ala 295 300 305 gcc cat ggc ttt tct tcc aag gag atc atc act ttt tgg cag gtc atg 1077 Ala His Gly Phe Ser Ser Lys Glu Ile Ile Thr Phe Trp Gln Val Met 310 315 320 cta agg aac acc aca tgc cat tat taa cttcacattc tacaaaaagc 1124 Leu Arg Asn Thr Thr Cys His Tyr 325 330 ctagaaggac aggatacttt gtggaaagtg ttaaataaag taggtactgt ggaaaattca 1184 tggggaggtc agtgtgctgg cttacactga actgaaactc atgaaaaacc cagactggag 1244 actggagggt tacacttgtg atttattagt caggcccttc aaagatgata tgtggaggaa 1304 ttaaatataa aggaattgga ggtttttgct aaagaaatta ataggaccaa acaatttgga 1364 catgtcattc tgtagactag aatttcttaa aagggtgtta ctgaattata agctcactag 1424 gctgtaaaaa caaaacaatg tagagtttta tttattgaac aatgtagtca cttgaaggtt 1484 ttgtgtatat cttatgtgga ttaccaattt aaaaatatat gtagttctgt gtcaaaaaac 1544 ttcttcactg aagttatact gaacaaaatt ttacctgttt ttggtcattt ataaagtact 1604 tcaagatgtt gcagtatttc acagttatta ttatttaaaa ttacttcaac tttgtgtttt 1664 taaatgtttt gacgatttca atacaagata aaaaggatag tgaatcattc tttacatgca 1724 aacattttcc agttacttaa ctgatcagtt tattattgat acatcactcc attaatgtaa 1784 agtcataggt cattattgca catcagtaat ctcttggact ttgttaaata ttttactgtg 1844 gtaatataga gaagaattaa agcaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1897 <210> 2 <211> 331 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ser Ala Leu Trp Thr Val Leu Pro Ser Arg Met Ser Leu Arg 1 5 10 15 Ser Leu Lys Trp Ser Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ser Phe Phe Val 20 25 30 Met Trp Tyr Leu Ser Leu Pro His Tyr Asn Val Ile Glu Arg Val Asn 35 40 45 Trp Met Tyr Phe Tyr Glu Tyr Glu Pro Ile Tyr Arg Gln Asp Phe His 50 55 60 Phe Thr Leu Arg Glu His Ser Asn Cys Ser His Gln Asn Pro Phe Leu 65 70 75 80 Val Ile Leu Val Thr Ser His Pro Ser Asp Val Lys Ala Arg Gln Ala 85 90 95 Ile Arg Val Thr Trp Gly Glu Lys Lys Ser Trp Trp Gly Tyr Glu Val 100 105 110 Leu Thr Phe Phe Leu Leu Gly Gln Glu Ala Glu Lys Glu Asp Lys Met 115 120 125 Leu Ala Leu Ser Leu Glu Asp Glu His Leu Leu Tyr Gly Asp Ile Ile 130 135 140 Arg Gln Asp Phe Leu Asp Thr Tyr Asn Asn Leu Thr Leu Lys Thr Ile 145 150 155 160 Met Ala Phe Arg Trp Val Thr Glu Phe Cys Pro Asn Ala Lys Tyr Val 165 170 175 Met Lys Thr Asp Thr Asp Val Phe Ile Asn Thr Gly Asn Leu Val Lys 180 185 190 Tyr Leu Leu Asn Leu Asn His Ser Glu Lys Phe Phe Thr Gly Tyr Pro 195 200 205 Leu Ile Asp Asn Tyr Ser Tyr Arg Gly Phe Tyr Gln Lys Thr His Ile 210 215 220 Ser Tyr Gln Glu Tyr Pro Phe Lys Val Phe Pro Pro Tyr Cys Ser Gly 225 230 235 240 Leu Gly Tyr Ile Met Ser Arg Asp Leu Val Pro Arg Ile Tyr Glu Met 245 250 255 Met Gly His Val Lys Pro Ile Lys Phe Glu Asp Val Tyr Val Gly Ile 260 265 270 Cys Leu Asn Leu Leu Lys Val Asn Ile His Ile Pro Glu Asp Thr Asn 275 280 285 Leu Phe Phe Leu Tyr Arg Ile His Leu Asp Val Cys Gln Leu Arg Arg 290 295 300 Val Ile Ala Ala His Gly Phe Ser Ser Lys Glu Ile Ile Thr Phe Trp 305 310 315 320 Gln Val Met Leu Arg Asn Thr Thr Cys His Tyr 325 330
【図１】 β1,3GalNAcT-1(Ｇｂ４合成酵素)のタイプ１
についての配列解析結果を示す図である。
についての配列解析結果を示す図である。
【図２】 β1,3GalNAcT-1(Ｇｂ４合成酵素)のタイプ２
についての5'-非翻訳部位のヌクレオチド配列を示す図
である。
についての5'-非翻訳部位のヌクレオチド配列を示す図
である。
【図３】 Ｇｂ４合成酵素の推定アミノ酸配列のハイド
ロパシープロットを示す図である。
ロパシープロットを示す図である。
【図４】 １Ｂ９細胞に各種ＤＮＡを導入した場合の、
フォルスマン抗原の発現の程度を示す図である。
フォルスマン抗原の発現の程度を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 BA80 DA02 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD07 KK07 LL05 4B064 AF21 CA10 CA19 CA21 CC03 CC24 CD12 DA01
Claims (8)
- 【請求項１】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡを細
胞に導入し、次いで該細胞を生育させてβ１,３−Ｎ−
アセチルガラクトサミン転移酵素を発現させ、これを採
取する工程を少なくとも含む、β１,３−Ｎ−アセチル
ガラクトサミン転移酵素の製造方法。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。 - 【請求項２】 前記（ｂ）に示すＤＮＡが、Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖
中のガラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラク
トサミン残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド
をコードしていることを特徴とする、請求項１に記載の
製造方法。 - 【請求項３】 以下の（Ａ）又は（Ｂ）のポリペプチ
ド、 Ｎ−アセチルガラクトサミン供与体およびＧｂ３
糖鎖を接触させて酵素反応させる工程を少なくとも含
む、Ｇｂ４糖鎖の製造方法。 （Ａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３３１で表される
アミノ酸配列を有するポリペプチド。 （Ｂ）アミノ酸配列（Ａ）において、１もしくは数個の
アミノ酸が置換、欠失、挿入または転位したアミノ酸配
列からなり、かつＮ−アセチルガラクトサミン供与体か
ら、受容体であるＧｂ３糖鎖中のガラクトース残基のＣ
３位に、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基を転移する酵
素活性を有するポリペプチド。 - 【請求項４】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡをＧ
ｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次いで該細胞を生育させる
工程を少なくとも含む、Ｇｂ４糖鎖の製造方法。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。 - 【請求項５】 前記（ｂ）に示すＤＮＡが、Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖
中のガラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラク
トサミン残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド
をコードしていることを特徴とする、請求項４に記載の
製造方法。 - 【請求項６】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡと、
フォルスマン抗原合成酵素をコードするｃＤＮＡとを共
にＧｂ３糖鎖発現細胞に導入し、次いで該細胞を生育さ
せる工程を少なくとも含む、フォルスマン抗原糖鎖の製
造方法。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。 - 【請求項７】 前記（ｂ）に示すＤＮＡが、Ｎ−アセチ
ルガラクトサミン供与体から、受容体であるＧｂ３糖鎖
中のガラクトース残基のＣ３位に、Ｎ−アセチルガラク
トサミン残基を転移する酵素活性を有するポリペプチド
をコードしていることを特徴とする、請求項６に記載の
製造方法。 - 【請求項８】 β１,３−Ｎ−アセチルガラクトサミン
転移酵素の発現のための、下記（ａ）又は（ｂ）に示す
ＤＮＡの使用。 （ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１
０９〜１１０１からなる塩基配列を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列番号１に記載の塩基配列もしくは同塩基配列
に相補的な塩基配列又はこれらの塩基配列の一部を有す
るＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するＤＮＡ。
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|---|---|---|---|---|
| WO2004065605A1 (ja) * | 2003-01-23 | 2004-08-05 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | β１，３－Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン転移酵素タンパク質及びそれをコードする核酸、並びにそれを用いた癌化検定方法 |
| JP2021168693A (ja) * | 2012-08-20 | 2021-10-28 | アカデミア シニカAcademia Sinica | オリゴ糖の大規模酵素合成方法 |
-
2000
- 2000-09-08 JP JP2000273835A patent/JP4619500B2/ja not_active Expired - Fee Related
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