JPH08196279A - 蛋白質及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 β−１，４−ガラクトシルトランスフェラー
ゼ関連蛋白質をコードする構造遺伝子の提供。 【構成】 配列番号１または２で示されるＤＮＡ配列。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生体の受精、発生、分
化、ガン化等に関与し、各種疾患の診断薬として或いは
細胞生物学研究の試薬として用いうる新規なβ−１，４
−ガラクトシルトランスフェラーゼ関連蛋白質及びその
遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】β−１，４−ガラクトシルトランスフェ
ラーゼはＵＤＰ−ガラクトースからガラクトース残基
を、Ｎ−アセチルグルコサミン残基を代表とする鎖糖残
基に転移し、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ結合を形成す
る反応を触媒する酵素である。

【０００３】また糖鎖残基のみならず、スフィンゴシ
ン、セラミド、ジアシルグリセロール、ヒドロキシリジ
ンなどの各種受容体のヒドロキシル基にガラクトースを
転移する反応も司る。それ故糖蛋白質や糖脂質の様々な
糖鎖構造の生合成に本酵素は関与する。一方、ラクトア
ルブミン存在下では、本酵素はグルコースを受容体とし
て作用してラクトースを生成する。

【０００４】本発明のβ−１，４−ガラクトシルトラン
スフェラーゼは、細胞表層に存在し、細胞表面の複合糖
質の糖鎖非還元末端のＮ−アセチルグルコサミンを受容
体として認識し、受精や胚細胞移動や細胞接着などをは
じめとする様々な生体運動・機能過程に関与する酵素と
して重要視されてきた。

【０００５】だが、生体機能を様々に持つと考えられて
いるにもかかわらず、本酵素をコードする遺伝子は現在
までのところ１つしか知られておらず、従来のあるいは
癌細胞中に特異的に発現するβ−１，４−ガラクトシル
トランスフェラーゼは、１本のｍＲＮＡから、それぞれ
異なるプロセッシングにより翻訳、生成されるものと考
えられてきた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、細胞生
物学研究を長年行ってきた中で、他の多くの糖関連酵素
が組織によって多くの分子種が存在し、それぞれ役割、
性質が様々異なるものであるのと同様に、β−１，４−
ガラクトシルトランスフェラーゼの多岐にわたる機能か
ら考えて、従来知られてきた遺伝子とは異なる遺伝子由
来の本酵素が存在しても不思議ではないと考えてきた。
そして本酵素の新たな分子種を分離・同定し、その遺伝
子をクローニングしたいと企図した。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らはマウスの初
期胚で、多分化能を持つ細胞のモデルとなるＥＣ細胞を
多年研究してきた。ＥＣ細胞には高分子量のポリ−Ｎ−
アセチルラクトサンミン（エンブリオグリカン）が多量
に存在し、それらは各種の細胞表面糖鎖マーカーとして
利用することが出来ると考えられる。

【０００８】本発明者らはこのポリ−Ｎアセチルラクト
サミンの生合成に既知のβ−１，４−ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼ以外の文献未知の分子種の酵素も関与す
る可能性もあると想到し、Ｆ９ＥＣ細胞より本酵素或い
は関連蛋白質を単離・精製することを企てた。そして鋭
意研究を進め、本酵素類の蛋白質としての本態を明らか
にし、その遺伝子をクローニングすることに成功し、本
発明を完成した。

【０００９】（β−１，４−ガラクトシルトランスフェ
ラーゼの単離）Ｆ９細胞よりβ−１，４−ガラクトシル
トランスフェラーゼ関連蛋白質の単離は細胞破砕後、遠
心分離した沈殿物をさらにトリトン−Ｘ等の適当な界面
活性剤の存在下目的の蛋白質を可溶化し、遠心した上清
を、通常のカラムクロマトグラフィー法を用いて分離精
製することが出来る（文献１：Muramatsu 他、(1987)J.
Biochem.102,665-671）。

【００１０】更に詳しくは、この遠心上清をイオン交換
担体、親和性担体を用いて繰り返し純化することにより
純化された該酵素を得る。特に好ましくは、この上清
を、陽イオン交換担体、陰イオン担体、親和性担体上で
精製する。

【００１１】担体としてはそれぞれSP-sephadex, DEAE-
Sephadex, 等が使用でき、親和性担体としては、Ｎ−ア
セチルグルコサミン固定セファロース、またはα−ラク
トアルブミン固定セファロースを用いることが出来る。

【００１２】β−１，４−ガラクトシルトランスフェラ
ーゼの活性分析はＮ−アセチルグルコサミンを受容体と
して使用し、UDP-[¹⁴C]galactose を基質として使用す
る方法（文献１）を用いることが出来る。

【００１３】精製の結果ガラクトース転移活性を有する
分子量 6,800、及び 5,900 の純粋な蛋白質を得ること
が出来る。

【００１４】（抗β−１，４−ガラクトシルトランスフ
ェラーゼ抗体の作製）抗β−１，４−ガラクトシルトラ
ンスフェラーゼ抗体の作製は文献２（Ozawa,M.,(1988),
J.Biol.Chem.,263,3059-3062）の方法に従って作製する
ことが出来る。

【００１５】すなわち、１，４−ガラクトシルトランス
フェラーゼを抗原蛋白として投与したウサギより採取し
た血清を１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ蛋白
質を固定した親和性カラム上で純化する事により、純度
の非常に高い該抗体を作製することが出来る。

【００１６】（Ｆ９細胞ｃＤＮＡライブラリーより抗β
−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ抗体陽性の
クローン単離とその配列）Ｆ９細胞より文献３（Miyauc
hi,T et al,(1990)J.Biochem.107,316-323）と同一の方
法に基づいて作製されたλＧＴ１１発現ライブラリよ
り、上記作製抗体を用いてコロニーを免疫特異的に選抜
することにより、陽性コロニーを取得し、このコロニー
のｃＤＮＡ挿入部分の配列を、通常のサンガー法（文
献：Sanger etal,(1977),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.74,5
463-5467）を用いて配列を決定することが出来る。

【００１７】（β−１，４−ガラクトシルトランスフェ
ラーゼの大腸菌での発現）上記により得られたｃＤＮＡ
は、通常の遺伝子組換え手法（文献４：Huynh,T.V. et
al., (1985),DNA Cloning,a Practical Approach,vol.
1,(Glover,D.M, ed),pp49-78., IRL Press,Washington,
D.C.）を用いて大腸菌で発現する発現用プラスミドに挿
入し該目的蛋白質として発現させることが出来るが、蛋
白質の安定性や精製の容易さなど考慮し融合蛋白質とし
て発現させるのが好ましい。

【００１８】融合蛋白質としては、プロテインＡやマル
トース結合性蛋白質（文献２）等が挙げられる。精製し
たβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ融合蛋
白質のガラクトース転移能の活性分析はＮ−アセチルグ
ルコサミンを受容体として使用し、UDP-[¹⁴C]galactose
を基質として使用する方法（文献１）を用いて分析確
認することが出来る。

【００１９】

【実施例】

実施例１ cDNA クローニンク゛と塩基配列の解析 β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼは、F9
ガン細胞より、文献１の方法に従って精製した。ウサキ゛抗
カ゛ラクトシルトランスフェラーセ゛血清は、文献２の方法に従い、200
μgのカ゛ラクトシルトランスフェラーセ゛を吸着させた 1 ml の セファロースC
L-4Bを用いて、アフィニティー精製した。

【００２０】λ gt 11 発現ライフ゛ラリーは F9 細胞より作成
し、Miyauchi らの方法（文献３）に従い、アフィニティー精製
された抗体を用いてスクリーニンク゛した。フ゜ラークハイフ゛リタ゛イセ゛ーショ
ンは、Huynh らの方法 （文献４：Huynh,T.V. et al.,
(1985),DNA Cloning,a Practical Approach,vol.1,(Glo
ver,D.M, ed),pp49-78., IRL Press,Washington,D.C.）
に従い行ったところ２種の陽性クローンを得た。

【００２１】これらのクローンの DNA 塩基配列の決定
は、[35S]-dATP (Dupont - New England Nuclear) を
用いて、シ゛テ゛オキシチェーンターミネーション法（文献５）に従い両方
の鎖について行った。塩基配列テ゛ータは、GENETEX (Softw
are Development Co. Tokyo)を用いて解析した。

【００２２】これにより得られたβ−１，４−ガラクト
シルトランスフェラーゼ関連蛋白質２種の塩基配列を配
列表の配列番号１、配列番号２にそれぞれ示す。

【００２３】実施例２ SDS ケ゛ル電気泳動とイムノフ゛ロッテインク゛ 7.5% SDS ホ゜リアクリルアミト゛ケ゛ル電気泳動は Laemmli らの方法
（文献６：Laemmli,U.K.(1970),Nature,227,680-685）
に従い行った。蛋白質のハ゛ント゛はクマシーフ゛ルー染色により検
出した。イムノフ゛ロッテインク゛のために、蛋白質をニトロセルロースフィルタ
ーに電気的にトランスファーした。トランスファーハ゛ッファーからメタノールを除
外した以外は文献７（Towbin,H et al (1979),Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,76,4350-4354）に従った。

【００２４】フィルターはウシスキムミルクによりフ゛ロッキンク゛し、1/100
〜1/1000 倍に希釈した抗血清によりインキュヘ゛ートした。結
合した抗体は、西洋わさびハ゜ーオキシタ゛ーセ゛でラヘ゛ル化したヤキ゛
抗ウサキ゛IgG (Jackson) により検出した。これにより得ら
れた フ゛ロッティンク゛ の結果を図４に示す。

【００２５】実施例３ノーサ゛ンハイフ゛リタ゛イセ゛ーション 総 RNA もしくは poly(A)+ RNA を、ク゛リオキサルとチ゛メチルスルフ
ォオキサイト゛により 50。Cで変性し、ク゛リオキサルとチ゛メチルスルフォオキサイ
ト゛を含む1% アカ゛ロースケ゛ルで電気泳動した。RNAをナイロンメンフ゛ラ
ンにトランスファーし、0.5% SDS を加えたフ゜レハイフ゛リタ゛イセ゛ーション、
ハイフ゛リタ゛イセ゛ーション 溶液（文献８：Uehara,K et al,(199
2),J.Biochem.111,536-567）を用いて、Wahl らの方法
（文献９：Wahl,G.M. et al (1979),Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,76,3683-3687）に従い、フ゜レハイフ゛リタ゛イセ゛ーション、ハイフ
゛リタ゛イセ゛ーションを行った。

【００２６】ニックトランスレーション法によりラヘ゛ル化（放射活性；
約 10 8 cpm / μg )した GT2, 3をフ゜ローフ゛に用いた。メン
フ゛ランの洗浄は 2 x SSC, 0.1% SDS 溶液の中で、室温で
軽く 2 回行い、次に15 分間 3 回行った。さらに、1 x
SSC, 0.1% SDS 溶液の中で、50。C, 30 分間 2 回行っ
た。メンフ゛ランは軽く乾燥させた後、レーサ゛ーイメーシ゛アナライサ゛ー (B
AS200, FUJIFILM) を用いて解析した。結果を図３に記
す。

【００２７】実施例４マルトース 結合蛋白質との融合蛋白質の作成と解析 Aki-H ( GT1, 2 と 2-1 によりコート゛される蛋白質)、Aki
-U ( GT3, 3-1, 3-2,3-3, 3-4 と 3-5 によりコート゛され
る蛋白質) の カ゛ラクトシルトランスフェラーセ゛活性を解析する目的
で、 Aki-H, U の酵素活性部位と予想される領域を、発
現ヘ゛クター pMAL-c2(New England Biolab) を用いてマルトース
結合蛋白質との融合蛋白質として発現させた。

【００２８】インフレームで遺伝子を結合させるために、GT2-
1 DNA を制限酵素 SmaI （図１）で部分的に切断し DNA
断片を 1% アカ゛ロースケ゛ルで精製し、さらに制限酵素 HindI
IIで切断し DNA 断片を 1% アカ゛ロースケ゛ルで精製した。次
に、ヘ゛クター DNA を制限酵素 PstI で切断し末端を T4 DN
A ホ゜リメラーセ゛を用いて平衡化した後制限酵素 HindIIIで切
断し、GT2-1 DNAの 2.3 kb 断片とライケ゛ーションを行い pAki
-H を作成した。

【００２９】GT3-1 DNA は制限酵素 NotI （図２）で部
分的に切断し、次に 制限酵素 SalIで切断した。ヘ゛クター
DNA を制限酵素 EcoRI で切断し末端を T4 DNA ホ゜リメラーセ
゛を用いて平衡化した後制限酵素 SalI で切断し、GT3-1
DNA の 3.0 kb 断片とライケ゛ーションを行い pAki-U を作成
した。陰性コントロールとして、制限酵素 EcoRI で切断したヘ
゛クター DNA に、ユニハ゛ーサルトランスレーションターミネーション (Pharmacia)
を導入した物を作成した。 大腸菌 NM522 を pAki-H,
D で形質転換した後、最も大量の融合蛋白質を発現して
いるクローンを選択した。これらのクローンを 100 ml のアンヒ゜シリ
ンを含む LB培地で一晩、37。C で培養し、次に 1000 ml
のアンヒ゜シリンを含む LB 培地 25。C でOD650 が 1 に達する
まで培養した。さらに、イソフ゜ロヒ゜ルチオ-ァ-カ゛ラクトシト゛を 50 オ
Mになるように加え誘導を行い一晩培養した。

【００３０】菌体を集め、 融合蛋白質を指示 (New Eng
land Biolab) に従い精製した。蛋白質濃度は Bradford
らの方法（文献１０：Bradford,M.M.,(1976),Anal.Bio
chem.72,248-254）に従い、OD280 の吸収により測定し
た。ウサキ゛抗 MBP 融合蛋白質を作成し、文献２の方法に
従い精製した。得られた蛋白質を以下の活性測定に用い
た。

【００３１】実施例５カ゛ラクトシルトランスフェラーセ゛ 活性の測定 2 μg のマルトース結合蛋白質と融合させたトランスフェラーセ゛様蛋
白質を25 mM MnCl₂, 0.15 M NaCl, 0.1% Triton X-100
を含む 25 mM Tris-HCl ハ゛ッファー (pH 7.0) に対して透析
し、β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ活性
を、200 μM UDP-[¹⁴C] カ゛ラクトース (11.46 GBq/mmol, Dup
ont-New England Nuclear), 15 mM N-acetyl-D-glucosa
mine を含む上記のハ゛ッファーで測定した。

【００３２】N-acetyllactosamine の合成は 29.4% chl
oroform 70.0% ethanol 0.6% H₂Oを溶出ハ゛ッファーに用いて
Nucleosil 100, 5 μM, 4 x 250 mm (GL-PACK) HPLC
で分離ご定量した。その結果 Aki-H 由来の融合タンパ
ク質の転移活性として 0.6n mole/h,mg protein の活性
が検出された。

【００３３】（図面の詳細な説明）図１は、pAki-H発現
フ゜ラスミト゛の作製図である。

【００３４】図２は、pAki-U発現フ゜ラスミト゛の作製図であ
る。

【００３５】図３は、マウスにおける関連タンパク質の
発現のノーザンブロット解析を示す図である。レーン１
はＦ９細胞の全ＲＮＡである。レーン３は分泌乳腺、レ
ーン４は腎臓、レーン５は脳、レーン６は精のうであ
り、レーン２はＦ９細胞のpoly(A)⁺ＲＮＡである。メン
ブランはそれぞれＧＴ２（Ａ）およびＧＴ（３）プロー
ブでラベルされた〔³²P〕dCTPでハイブリダイズされ
た。Ｃにおいてコントロールとして電気泳動ゲルをエチ
ジウムブロマイドで染色した。

【００３６】図４は、β−１，４−ガラクトシルトラン
スフェラーゼ関連タンパク質の分子量を決定するための
ウエスタンブロット分析の結果を示す図である。レーン
Ａ，Ｃ，Ｄはクマシーブルー染色の結果であり、レーン
Ｂ，Ｅ，ＦはＦ９細胞酵素調製物の異なる抗体を用いた
ウエスタンブロッティングの結果である。

【００３７】レーンＡはＦ９細胞の精製酵素標品であ
る。レーンＢは本酵素に対する抗体で染色したＦ９酵素
である。レーンＣはＭＢＰ-Aki-H融合タンパク質であ
る。レーンＤはＭＢＰ-Aki-U融合タンパク質である。レ
ーンＥはＭＢＰ-Aki-H融合タンパク質に対する抗体で染
色したＦ９酵素である。レーンＦはＭＢＰ-Aki-U融合タ
ンパク質に対する抗体で染色したＦ９酵素である。

【００３８】図５は、ガラクトシルトランスフェラーゼ
関連タンパク質をコードするｃＤＮＡの制限酵素地図お
よびシークエンスストラテジーを示す図である。Ｘｂ，
Ｓａ，Ｘｈ，ＣｌおよびＡｃはそれれぞれＸｂａＩ，Ｓ
ａｃＩＩ，ＸｈｏＩ，ＣｌａＩおよびＡｃｃＩ制限酵素
サイトを示す。部分制限酵素地図中の太線はクローン中
のコーデイン部分を示す。

【００３９】

【発明の効果】上記により得られたｃＤＮＡまたはタン
パク質は、その発現部位等より生体の受精・発生と関与
していると考えられるので、不妊等の診断や、生体の受
精を助けたり、或いは妨げる手段として用いる事が出来
ると予想される。

【００４０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：2686 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル：Ｎ アンチセンス：Ｎ 起源： ・生物名：Mus musculus ・分化の程度：ジャームライン ・セルライン：Ｆ９ 配列の特徴 ・特徴を決定した方法：Ｅ (A) NAME/KEY: mRNA (B) LOCATION: 1..2686 (A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 376..1635 配列： GCGGCCGCAG ACAACATAGG CATCTCTGTC CCACCAGGAG CCACAAGTGA CAAGATCTTT 60 TTCCATCACC TAGACAACCT GAGGCCTTCC CTAACGCCTG TGAAAGAACT CAAAGAGCCT 120 GTGGGGCAAA TCGTGTGCAC GGATAAAGGC ATTCTCGCCG TGGAGCAGAA CAAGGTACTC 180 ATCCCGCCCG CGTGGAACAA GACCTTCGCC TGGGGCTACG CAGACCTCAG CTGCAGACTG 240 GGGACCTATG AGTCAGACAA GGCAGTGACT GTTTATGAGT GCTTATCTGA ATGGGGCCAG 300 ATCCTCTGCG CCGTTTGCCC CAACCCCAAG CTTGTCATCA CAGGCGGAAC AAGCACAGTG 360 GTGTGTGTCT GGGAG ATG GGC ACC TCC AAA GAA AAG GCC AAG CCC CTC ACG 411 Met Gly Thr Ser Lys Glu Lys Ala Lys Pro Leu Thr 1 5 10 CTC AAG CAG GCT CTC CTT GGC CAC ACT GAT ACT GTC ACC TGT GCC AGA 459 Leu Lys Gln Ala Leu Leu Gly His Thr Asp Thr Val Thr Cys Ala Arg 15 20 25 GCA TCC CTG GCC TAC CAC ATA ATT GTC AGC GGG TCC CGG GAC CGA ACC 507 Ala Ser Leu Ala Tyr His Ile Ile Val Ser Gly Ser Arg Asp Arg Thr 30 35 40 TGC ATC ATC TGG GAC CTG AAC AAA CTG TCA TTC CTA ACC CAG CTC CGC 555 Cys Ile Ile Trp Asp Leu Asn Lys Leu Ser Phe Leu Thr Gln Leu Arg 45 50 55 60 GGC CAC CGA GCT CCC GTC TCC GCT CTT TGC ATT AAT GAG CTA ACA GGG 603 Gly His Arg Ala Pro Val Ser Ala Leu Cys Ile Asn Glu Leu Thr Gly 65 70 75 GAC ATT GTG TCC TGC GCA GGC ACG TAC ATC CAC GTG TGG AGC ATC AAT 651 Asp Ile Val Ser Cys Ala Gly Thr Tyr Ile His Val Trp Ser Ile Asn 80 85 90 GGG AAT CCC ATC GTG AGT GTG AAC ACA TTC ACG GGC CGG AGC CAG CAG 699 Gly Asn Pro Ile Val Ser Val Asn Thr Phe Thr Gly Arg Ser Gln Gln 95 100 105 ATT GTC TGC TGC TGC ATG TCC GAG ATG AAC GAG TGG GAC ACG CAG AAT 747 Ile Val Cys Cys Cys Met Ser Glu Met Asn Glu Trp Asp Thr Gln Asn 110 115 120 GTC ATC GTG ACA GGA CAC TCA GAT GGA GTG GTC CGG TTC TGG AGA ATG 795 Val Ile Val Thr Gly His Ser Asp Gly Val Val Arg Phe Trp Arg Met 125 130 135 140 GAA TTC CTG CAG GTT CCT GAA ACA CCA GCT CCT GAG CCT GTG GAA GAC 843 Glu Phe Leu Gln Val Pro Glu Thr Pro Ala Pro Glu Pro Val Glu Asp 145 150 155 CTG GAG ATG CAG GAG GGC TGC CCA GAA GCA CAG ATA GGG CAG CAA GCC 891 Leu Glu Met Gln Glu Gly Cys Pro Glu Ala Gln Ile Gly Gln Gln Ala 160 165 170 CAA GAT GAC GAC AGC AGT GAT TCT GAA ACA GAA GAG CCC AGT GTC AGC 939 Gln Asp Asp Asp Ser Ser Asp Ser Glu Thr Glu Glu Pro Ser Val Ser 175 180 185 CAG GAC CCC AAG GAC ACG TCC AGC CAG CCC AGC AGC ACC AGC CAC AGG 987 Gln Asp Pro Lys Asp Thr Ser Ser Gln Pro Ser Ser Thr Ser His Arg 190 195 200 CCG CGG GCA GCC TCC TGC AGG GCC ACC GCC ACA TGG TGT ACC GAC AGC 1035 Pro Arg Ala Ala Ser Cys Arg Ala Thr Ala Thr Trp Cys Thr Asp Ser 205 210 215 220 GGC TCC GAC GAC TCC AGG CGC TGG TCC GAC CAG CTC AGT CTA GAT GAG 1083 Gly Ser Asp Asp Ser Arg Arg Trp Ser Asp Gln Leu Ser Leu Asp Glu 225 230 235 AAA GAT GGC TTC ATA TTT GTG AAC TAC TCT GAG GGC CAG ACC AGA GCA 1131 Lys Asp Gly Phe Ile Phe Val Asn Tyr Ser Glu Gly Gln Thr Arg Ala 240 245 250 CAT CTG CAG GGC CCC CTC GCC CAC CCG CAC CCC AAC CCC ATC GAA GCG 1179 His Leu Gln Gly Pro Leu Ala His Pro His Pro Asn Pro Ile Glu Ala 255 260 265 CGC AGT TAC AGC AGA TTG AAA CCC GGG TAC CGT TGG GAG CGG CAG CTG 1227 Arg Ser Tyr Ser Arg Leu Lys Pro Gly Tyr Arg Trp Glu Arg Gln Leu 270 275 280 GTA TTC AGA AGC AAA CTG ACT ATG CAC ACA GCC TTT GAT CGA AAG GAC 1275 Val Phe Arg Ser Lys Leu Thr Met His Thr Ala Phe Asp Arg Lys Asp 285 290 295 300 AAC ACG CAC CCA GCC GAG GTC ACC GCG TTG GGT GTA TCC AAG GAT CAC 1323 Asn Thr His Pro Ala Glu Val Thr Ala Leu Gly Val Ser Lys Asp His 305 310 315 AGC AGG ATC CTC GTG GGT GAC AGT CGA GGC CGA GTG TTC AGC TGG TCT 1371 Ser Arg Ile Leu Val Gly Asp Ser Arg Gly Arg Val Phe Ser Trp Ser 320 325 330 GTG AGT GAC CAG CCT GGT CGT TCT GCC GCT GAC CAC TGG GTG AAG GAT 1419 Val Ser Asp Gln Pro Gly Arg Ser Ala Ala Asp His Trp Val Lys Asp 335 340 345 GAA GGC GGC GAC AGC TGC TCG GGA TGC TCC GTA CGC TTC TCC CTC ACA 1467 Glu Gly Gly Asp Ser Cys Ser Gly Cys Ser Val Arg Phe Ser Leu Thr 350 355 360 GAG AGG AGG CAC CAT TGC AGG AAC TGT GGG CAG CTC TTC TGT CAG AAG 1515 Glu Arg Arg His His Cys Arg Asn Cys Gly Gln Leu Phe Cys Gln Lys 365 370 375 380 TGC AGT CGG TTT CAG TCA GAA ATC AAG CGC CTG AAA ATC TCG TCC CCA 1563 Cys Ser Arg Phe Gln Ser Glu Ile Lys Arg Leu Lys Ile Ser Ser Pro 385 390 395 GTG GGT GTC TGT CAG AAC TGT TAC TAT AGC TTG CAG CAT GAG AGG GGG 1611 Val Gly Val Cys Gln Asn Cys Tyr Tyr Ser Leu Gln His Glu Arg Gly 400 405 410 GCA GAA GAT GGA CCT CGG AAC TGC TGAGATGGAG GGACTGGCGA GAGACCACAG 1665 Ala Glu Asp Gly Pro Arg Asn Cys 415 420 CCTAGGAGGC TCTTCACATC CTGCCGGGAC TCCAGAGGCA CTGAAGCAGT CTCCGTTTAC 1725 ACGGCTCTTC ACTGAGTGTT GGAAGTGCTG AGTGTAAAGG AATCATTGGA TCACGGCTTC 1785 CGAGGCCAGT GACCGGCACG GGTACTGTGC AGTGAACAGC ACAAGAGGAA GTGGCTCCCA 1845 GGAGCATCTC AGACCTGAGT CTCCCCTAGT GTAGCTGTCT CCAAGAACAA ACCCCGTGCT 1905 CCCCAACTGT CTTTCTTGCA TCTCATTTTT ATAGAGCTAT TCATCCTTAT TTGGAAAAAT 1965 TAACAAAAAC TTAAAAAAAG GCTTCTAGAA AATGGTTGTA AATCTGACTT CTTTACAAGG 2025 AGCTGTGTAT ATTGTAAATA GGTATAAAGG CCTTTTTTTT TCTAAATAAG GACCTAATTG 2085 CCTGTAACAT GAGACTTCAA ACTAAGCCAC TAACTCAATG AACCATCTAA GGTCTGTCTA 2145 ACGTCTCGCA ATTAATAAAT ATGGGTTGGG TTTTTTTTTT TTCCTCAAAG ACATTATCTG 2205 TACTATTTTT TTTCTTGTTC AGACCAAGCC TGTGTGCCTG ATATCATTCT TCAAGTTGCC 2265 CACAGTGTCT CCACTTAAAT AGGCTAGTAA CCAAAACGAT GTAGCCCTGC TTTAGGGGCC 2325 AGGGTGGGAT AAGAGGTCTG CTCCTAAGGT AACGTGTAAA TAGCCAATGG TCTGAGGCTG 2385 TGTACCGCTA CAGTGTTGCA GTTCTGTGAC AGCACCAGTC TGAGGCTGTA TACCATCAGC 2445 TACAGTGTTG CAGTTCTGTG GCAGCCCCCT TCAGTGACCT GTGAGATGTG CGGACCCAGC 2505 ACCTCAGCAG CACAGATAGG GGTCACACAT CGATAGATGT CAGGCGGGAC ACAGCTCCGC 2565 CTCAGTTAAT GGAAATATAT TTGCATGTTA CCCCAAATTA GCTTCTCTGC ATAGAACATA 2625 AGTATGTGTC TTTGGGGACA CGTGTGTTCT ACTACAGCTT ATTTAAAAAA AACGCGGCCG 2685 C 2686

【００４１】配列番号：２ 配列の長さ：3298 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA ハイポセティカル：Ｎ アンチセンス：Ｎ 起源： ・生物名：Mus musculus ・分化の程度：ジャームライン ・セルライン：Ｆ９ 配列の特徴 ・特徴を決定した方法：Ｅ (A) NAME/KEY: mRNA (B) LOCATION: 1..3298 (A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 83..1078 配列： CGCGGCCGCC CTAACCAAAG CCCATGTATT TGAGTGCAAC TTAGAGAGCA GTGTGGAGAG 60 CATCATCTCA CCAAAGGTGA AG ATG GCG CTG CGG ACG TCA GGA CAC CTT CTC 112 Met Ala Leu Arg Thr Ser Gly His Leu Leu 1 5 10 CTG GGA GTA GTC CGC ATC TAT CAC AGG AAA GCC AAA TAC CTC CTC GCA 160 Leu Gly Val Val Arg Ile Tyr His Arg Lys Ala Lys Tyr Leu Leu Ala 15 20 25 GCA TGT AAT GAA GCA TTT ATT AAA ATA AAG ATG GCG TTT CGG CCA GGT 208 Ala Cys Asn Glu Ala Phe Ile Lys Ile Lys Met Ala Phe Arg Pro Gly 30 35 40 GTT GTC GAT CTA CCT GAG GAA AAT CGG GAA GCA GCT TAT AAT GCC ATT 256 Val Val Asp Leu Pro Glu Glu Asn Arg Glu Ala Ala Tyr Asn Ala Ile 45 50 55 ACT TTA CCT GAG GAA TTC CAC GAT TTT GAT CAG CCA CTG CCA GAT TTA 304 Thr Leu Pro Glu Glu Phe His Asp Phe Asp Gln Pro Leu Pro Asp Leu 60 65 70 GAT GAT ATT GAC GTC GCC CAG CAG TTC AGC CTG AAC CAA AGC AGA GTA 352 Asp Asp Ile Asp Val Ala Gln Gln Phe Ser Leu Asn Gln Ser Arg Val 75 80 85 90 GAA GAG ATA ACC ATG AGA GAA GAA GTC GGA AAC ATC AGT ATC CTA CAG 400 Glu Glu Ile Thr Met Arg Glu Glu Val Gly Asn Ile Ser Ile Leu Gln 95 100 105 GAA AAT GAC TTT GGT GAC TTC GGA ATG GAT GAC CGT GAA ATA ATG AGA 448 Glu Asn Asp Phe Gly Asp Phe Gly Met Asp Asp Arg Glu Ile Met Arg 110 115 120 GAA GGC AGT GCT TTC GAG GAT GAC GAC ATG TTA GTG AGC ACC AGC GCT 496 Glu Gly Ser Ala Phe Glu Asp Asp Asp Met Leu Val Ser Thr Ser Ala 125 130 135 TCC AAC CTT CTC CTC GAG CCA GAG CAG AGC ACC AGC AAC CTG AAT GAA 544 Ser Asn Leu Leu Leu Glu Pro Glu Gln Ser Thr Ser Asn Leu Asn Glu 140 145 150 AAG ATG AAT CAC TTA GAG TAC GAA GAC CAG TAC AAA GAT GAC AAT TTT 592 Lys Met Asn His Leu Glu Tyr Glu Asp Gln Tyr Lys Asp Asp Asn Phe 155 160 165 170 GGA GAA GGA AAT GAT GGC GGT ATA TTA GAT GAC AAA CTT ATA AGT AAT 640 Gly Glu Gly Asn Asp Gly Gly Ile Leu Asp Asp Lys Leu Ile Ser Asn 175 180 185 AAT GAT GGT GGC ATC TTT GAC GAT CCC CCT GCC TTG TCT GAG GCA GGG 688 Asn Asp Gly Gly Ile Phe Asp Asp Pro Pro Ala Leu Ser Glu Ala Gly 190 195 200 GTC ATG TTG CCA GAG CAA CCT GCA CAT GAT GAC ATG GAT GAA GAT GAC 736 Val Met Leu Pro Glu Gln Pro Ala His Asp Asp Met Asp Glu Asp Asp 205 210 215 AAT GGC TCA CTG GGT GGG CCG GAT AGT CCC GAC TCT GTG GAT CCT GTC 784 Asn Gly Ser Leu Gly Gly Pro Asp Ser Pro Asp Ser Val Asp Pro Val 220 225 230 GAA CCG ATG CCA ACT ATG ACT GAT CAG ACA ACT CTC GTC CCA AAC GAG 832 Glu Pro Met Pro Thr Met Thr Asp Gln Thr Thr Leu Val Pro Asn Glu 235 240 245 250 GAA GAA GCT TTT GCG TTG GAG CCC ATT GAT ATA ACT GTC AAA GAG ACA 880 Glu Glu Ala Phe Ala Leu Glu Pro Ile Asp Ile Thr Val Lys Glu Thr 255 260 265 AAA GCC AAG ACC AAG AGG AAG CTG ATT GTT GAC AGT GTC AAA GAA TTG 928 Lys Ala Lys Thr Lys Arg Lys Leu Ile Val Asp Ser Val Lys Glu Leu 270 275 280 GAT AGT AAA ACC ATT AGA GCC CAG CTT AGC GAT TAT TCT GAT ATT GTT 976 Asp Ser Lys Thr Ile Arg Ala Gln Leu Ser Asp Tyr Ser Asp Ile Val 285 290 295 ACG ACT CTG GAC CTG GCT CCG CCA ACC AAG AAG CTT ATG ATG TGG AAA 1024 Thr Thr Leu Asp Leu Ala Pro Pro Thr Lys Lys Leu Met Met Trp Lys 300 305 310 GAG ACC AGG AGG AGT GGA AAA GCT CTT CTC CTT ACC AGC ACA GCC CCT 1072 Glu Thr Arg Arg Ser Gly Lys Ala Leu Leu Leu Thr Ser Thr Ala Pro 315 320 325 330 GTG GAA TAACCGGCTA CTGAAGACTT TCACACGCTG CCTTACCCCA CTTGTACCAG 1128 Val Glu AAGACCTTAG GAAGAGAAGG AAAGGGGGAG AGGCAGATAA TCTGGATGAG TTCCTCAAAG 1188 AGTTTGAGAA TCCAGAGGTT CCCAGAGAGG AGCAGCAGCC ACAGCAGCAG CAGCCACAGC 1248 CGCAGCGAGA TGTCATCGAT GAGCCCATTA TAGAAGAGCC AAGCCGCCTC CAGGACTCAG 1308 TGATGGAGGC CAGCAGAACA ACCATAGAAG AATCAGCCAT GCCCCCACCA CCCCCTCAAG 1368 GAGTTAAGCG GAAAGCCGGG CAAATAGACC CAGAGCCTTC GATACCTCCT CAGCAGGTAG 1428 AGCAAATGGA AATACCACCA GTAGAACTTC CCCCAGAGGA GCCTCCAAAT ATCTGTCAGC 1488 TGATCCCGGA GTTAGAGCTC CTACCGGAGA AGGAGAAGGA AAAAGAGAAG GAGAAGGAAG 1548 AGGAGGAGGA GGAGGAGGAT GAAGATGCTT CAGGGGGTGA TCAGGATCAA GAGGAAAGAA 1608 GATGGAACAA ACGCACTCAG CAGATGCTTC ATGGTCTTCA GCGAGCTCTT GCTAAAACTG 1668 GAGCAGAGTC TATCAGTTTG CTTGAGCTGT GTCGAAACAC AAACCGAAAG CAGGCAGCAG 1728 CAAAGTTCTA CAGCTTATTG GTTCTTAAGA AGCAGCAAGC CATCGAGCTC ACACAGGAAG 1788 AGCCGTACAG TGACATCATT GCAACCCCTG GACCACGGTT CCATATTATC TGAGGAGCTA 1848 GATGTGTTCG AGCTAGTGAT AACTCACTAG TACATACAAA TTGCCCCCGT GTGCAGGGCA 1908 CCAAAACCCT TTAAGAAAGT TTTTAGATTT CTGTTTGTAC AAAAATCTTT GCCTTTTCTT 1968 TCTTCTTTTT TCCCCCCAGT GTTCCTATTT TTGTCAACCA TATTTTTAAG GGAAACTGCT 2028 TATTTGGGTT GGGTTTGTAT TCCTGGAGAA AACAGATGCC CAAGAACCCA GAAGACTTTT 2088 AACAGTTCAG AACAGATGTG TGCAATATTG GTGCATGTAA GAATATGGAG TAACAGTCAA 2148 AAGGCACCAT TTTTAATGTT AGTTTTCCAT TACTATGTTG AAAGGAAAAC CTGCCTAGAA 2208 ATGCCTGACA CTTTAAGAAC TGTGGTTTGA GTCCCTTGAC TGGAAGAGAA AAATGTCTTC 2268 CCATCAGTGA AACCACGGTC TGGTTAACCA CTGTAGTAGG GATAGTGTGT GAAGCATCGT 2328 GCTTGTCTTC TTGATCATGT TTAAAGTAAA TCCACACTGA GCAAGAATTT GTGAGGTTGT 2388 GCTGACTGAT CTTCTTCGGC TATTATGTTC TGAAATCATT CCGTGAGTCT TAGGACCTCT 2448 GATGCTATGC ACCGCAGCTC AGAACGATCA GACGTCTACA GTGGCGTGAC TCCTCAGGGG 2508 CTGCAGATCA CTCTCAGAGG TGTTTGGATG TTTGCTTGAA TAATGAGATC ATGGAAGCAG 2568 ACATTCCCCT GCCTGCTGAA GGGCAGACCA ATGAGAGACT ACCCCAGATT GACTTCCTTT 2628 AAGCAAACAG TGCTGTAAAA ACTAATGGCT TCTCTGATAT TTATTATAAA TGTTAGTACT 2688 CATCTTTTTC CAAGGCTGCA CACTCCTGTA TTTGCAACTT ATTTTTAATA ACTTTGCAAC 2748 TATAATCCTG TATCAGTTTC CTATAATTTA AGTGGAGAAA AACATCCTAA TAAAGGCTTT 2808 ATTATTAACA GACCAGATAG CACCAGAAAT TATGTGACTA TATAAATATC AAAACATGTT 2868 CACTTTGTAG GACAAAATTA TGTTGAAAAG TTCTAGCTTA AGTGTTGGCA CTTTTATGGG 2928 GGGGAAATCA GTTTTAAAAC TAAGACTTCC ATGTATACCC CAGTAATTTA AAATTATGTG 2988 AAATATTTTA AATTTGAGAA CTCGTAATTA CTACTTTAAT GATTCAGTTT CTCGAGAATG 3048 GTAATTGTAT AAAATTGCTC TTGCAGTTTT CTTTTCAATA CGACGTGCCT GTAACCATGG 3108 ATGTCCCCTT TGTAAAAAGA CACTGTAGAT AATTGAATGT TTGATTAGAT AAACGTCGTT 3168 AGTTTCTTGT TAAACATTTT GTTAGTCCAG TTTTTGTCGC TTATTGGGTT TAATATTGTT 3228 CTTGAAAATA GTCGATGCTA TGTTATGTAT AACTTTTCTA ATAAAAGTTG TGTTTCAAGC 3288 TGTAAAAAAA 3298

【図面の簡単な説明】

【図１】pAki-H発現プラスミドの作製図。

【図２】Aki-U発現プラスミドの作製図。

【図３】マウスにおける関連タンパク質の発現のノーザ
ンブロット解析を示す図。

【図４】β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ
関連タンパク質の分子量を決定するためのウエスタンブ
ロット分析の結果を示す図。

【図５】ガラクトシルトランスフェラーゼ関連タンパク
質をコードするｃＤＮＡの制限酵素、地図およびシーク
ェンスストラテジーを示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 上原 一芳 愛知県名古屋市中区富士見町２−28 (72)発明者 粟屋 昭 神奈川県横浜市戸塚区矢部町4978

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＤＮＡ配列がβ−１，４−ガラクトシル
   トランスフェラーゼ関連蛋白質をコードする構造遺伝子
   を含み、微生物或いは動物細胞において、該蛋白質を発
   現することが出来ることを特徴とするＤＮＡ配列。
2. 【請求項２】 配列が、配列番号１のアミノ酸配列を有
   するガラクトシルトランスフェラーゼ関連蛋白質をコー
   ドする構造遺伝子を含むことを特徴とする請求項１のＤ
   ＮＡ配列。
3. 【請求項３】 配列番号１下のヌクレチオド配列を含む
   請求項２のＤＮＡ配列。
4. 【請求項４】 配列が、配列番号２のアミノ酸配列を有
   するガラクトシルトランスフェラーゼ関連蛋白質をコー
   ドする構造遺伝子を含むことを特徴とする請求項１のＤ
   ＮＡ配列。
5. 【請求項５】 配列番号２ヌクレオチド配列を含む請求
   項４のＤＮＡ配列。