JP2021168693A - オリゴ糖の大規模酵素合成方法 - Google Patents

オリゴ糖の大規模酵素合成方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2021168693A
JP2021168693A JP2021122971A JP2021122971A JP2021168693A JP 2021168693 A JP2021168693 A JP 2021168693A JP 2021122971 A JP2021122971 A JP 2021122971A JP 2021122971 A JP2021122971 A JP 2021122971A JP 2021168693 A JP2021168693 A JP 2021168693A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
substituted
unsubstituted
fucose
alkyl group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2021122971A
Other languages
English (en)
Other versions
JP7376136B2 (ja
Inventor
ウォン，チ−フェイ
Chi-Huey Wong
ウ，チュン−イ
Chung-Yi Wu
ツァイ，ツゥン−イ
Tsung-I Tsai
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Academia Sinica
Original Assignee
Academia Sinica
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Academia Sinica filed Critical Academia Sinica
Publication of JP2021168693A publication Critical patent/JP2021168693A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7376136B2 publication Critical patent/JP7376136B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/99—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01006—Galactokinase (2.7.1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/0104—Pyruvate kinase (2.7.1.40)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07009—UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase (2.7.7.9), i.e. UDP-glucose-pyrophosphorylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/0701—UTP--hexose-1-phosphate uridylyltransferase (2.7.7.10)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

【課題】オリゴ糖の大規模酵素合成方法を提供する。【解決手段】本発明は、ＵＤＰ−Ｇａｌ再生の方法及びそれとガラクトース基転移酵素の組合せ使用を提供し、ガラクトースを好適な受容体基質に添加する。本発明は、さらにＧｌｏｂｏ系列オリゴ糖を大規模に生産する合成方法を掲示し、その中、前記方法は、糖基転移酵素反応とヌクレオチド糖再生方法の組合せに係るものである。【選択図】図１

Description

本発明は、ＵＤＰ−Ｇａｌ再生の方法及びそれとガラクトース基転移酵素の組合せ使用を提供し、ガラクトースを好適な受容体基質に添加する。本発明は、さらにＧｌｏｂｏ系列オリゴ糖を大規模に生産する合成方法を掲示し、その中、前記方法は、糖基転移酵素反応とヌクレオチド糖再生方法の組合せに係るものである。
Ｇｌｏｂｏ五糖（Ｇｌｏｂｏｐｅｎｔａｏｓｅ（Ｇｂ５））、フコース−Ｇｂ５（Ｇｌｏｂｏ Ｈ）及びシアル酸−Ｇｂ５（ＳＳＥＡ４）は、Ｇｌｏｂｏ系列のスフィンゴ糖脂質であり、それは１９８３年に初めて培養したヒト奇形癌腫細胞株中から発見され［１］、その後続々と数種の悪性腫瘍中から発見される［２，３］。報告によると、乳がん患者の身の上にＧｌｏｂｏ Ｈの過剰発現は６１％まで高く達し、Ｇｂ５の過剰発現は７７．５％まで達し、ＳＳＥＡ４ の過剰発現は９５％まで達することになる。［４］一方、遺伝子ＨＥＲ２（治療性トラスツズマブＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の標的であり、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を妨害する）では、乳がん患者の身の上の過剰発現は僅か２５％である。［５］この比較によれば、スフィンゴ糖脂質抗原（Ｇｂ５及びその誘導体、Ｇｌｏｂｏ Ｈ及びＳＳＥＡ４）は、がんワクチン発展のより好ましい選択であることが明白に示されている。そのため、今、幾つかの国では、既にＧｌｏｂｏ Ｈをアオガイヘモシアニンタンパク（ＫＬＨ）に共役してがんワクチンとし、第３期臨床試験を開始したところである［６］。
現在、Ｇｂ５、Ｇｌｏｂｏ Ｈ及びＳＳＥＡ４を合成するための方法には、幾つかの欠点が存在する。伝統的な化学合成法は、非常に煩雑で手間がかかる上、高純度及び正確な形式を獲得するためには幾つかの保護及び脱保護ステップを必要とするので、往々にして収量が著しく低下していく。今まで、Ｇｌｏｂｏ Ｈの化学合成に関する数多くの関連報告が発表された［７］ ［８］ ［９］ ［１０］ ［１１］ ［１２］ ［１３］ ［１４］ 。だが、ＳＳＥＡ４ の合成に関する報告がわずか２件である。Ｈｓｕ氏らが発表された方法はワンポット（ｏｎｅ−ｐｏｔ）化学合成法でＳＳＥＡ−４の多糖部分を準備し、収率は２４％［１５］ であり、Ｚｈｅｎ氏らが発表された方法は化学酵素方法を利用してミリグラム規模ＳＳＥＡ−４を合成するものである。［１６］一方、Ｌｅｌｏｉｒ−ｔｙｐｅ糖基転移酵素のＧｌｏｂｏ Ｈの酵素的な合成に基づいて、ただヌクレオチド糖を供与体として活化して触媒化糖化反応を行うだけで済む。しかし、糖ヌクレオチドのコストが高すぎるため、大規模合成に適していない。さらに、副産物であるピロリン酸塩（ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）及びヌクレオシド二リン酸（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）により、ホスホリラーゼ及びＬｅｌｏｉｒ−ｔｙｐｅ 糖基のヌクレオチド糖における形成を抑制することになる。したがって、従来の技術の制限を克服するために、新たな手段を発展させると共に、ヌクレオチドを再びチャージして反応を続行するためにヌクレオチド糖産物の構成を達成する必要がある。過去数年間において、数多くのチームが糖ヌクレオチド再生の主要問題の解決に力を尽くしており、かつ糖ヌクレオチド再生に関する問題の大部分が既に解決した。しかしながら、糖ヌクレオチド再生に関する技術はまだ改善する余地が残されており、特に、ＵＤＰ−Ｇａｌの再生については非常に困難が伴う。例えば、初めてのＵＤＰ−Ｇａｌの再生は、１９８２年に、Ｗｏｎｇ及びＷｈｉｔｅｓｉｄｅから提出し、それはＵＤＰ−Ｇｌｃ Ｃ４ エピメラーゼ（ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）により、ＵＤＰ−ＧｌｃとＵＤＰ−Ｇａｌを相互に転換するものである。［１７］１０年が過ぎた後、本発明チームから第２級ＵＤＰ−Ｇａｌ再生方法を見出し、それはＵＤＰ−Ｇｌｃ Ｃ４ エピメラーゼを使用せずに、その代わりに大腸桿菌ラクトースオペロン中に位置するＧｌｃ−１−リン酸ウリジル転移酵素（ｕｒｉｄｙｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）を利用してＧａｌ−１−リン酸塩及びＵＤＰ−ＧｌｃＧｌｃ−１−リン酸塩及びＵＤＰ−Ｇａｌに交換するものである。［１８］しかし、適合な酵素の欠乏のせいで、直接にＵＴＰ 及びＧａｌ−１−リン酸塩をＵＤＰ−Ｇａｌに縮合形成するステップが最後までできなかった。標的化合物Ｇｂ５、Ｇｌｏｂｏ Ｈ及びＳＳＥＡ４がＧａｌ関連分子であるので、如何にしてＵＤＰ−Ｇａｌ再生の主要困難を克服すると共に、その効率を増加することが、Ｇｂ５、Ｇｌｏｂｏ Ｈ及びＳＳＥＡ４の大規模酵素合成の決め手となる。
以上を総合すると、現在、Ｇｂ５、Ｇｌｏｂｏ Ｈ及びＳＳＥＡ４の大規模合成方法は、依然として諸多の制限が存在している。そのため、より効率的にＧｂ５、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ＳＳＥＡ４及びその中間物を準備するための新規な合成方法を提供する必要がある。
本発明は、ヌクレオチド糖再生の方法及びそれにおける糖類合成の応用に関するものである。前記糖類合成方法は、少なくとも１種のヌクレオチド糖再生システム（例えば本文に記述するＵＤＰ−Ｇａｌ再生システム）及び少なくとも１種の糖基転移酵素（例えばガラクトース基転移酵素）の組合せに係り、かつ前記糖類合成方法は、予期不可な高効率で、アリル基−末端Ｇｂ３、Ｇｂ４、Ｇｂ５（ＳＳＥＡ３としても認識される）、フコース−Ｇｂ５（Ｇｌｏｂｏ Ｈとしても認識される）及びシアル酸−Ｇｂ５（ＳＳＥＡ４としても認識される）を含む各種のオリゴ糖（末端（ｔａｉｌｅｄ））を合成するために用いられる。具体的に言えば、本発明の合成方法は、連鎖式反応で例えばＧｌｏｂｏ Ｈ及びＳＳＥＡ４などの最終産物を生成することを許容し、中間物を純化する必要がない。
そのため、本発明の一態様は、ガラクトース転移酵素とＵＤＰ−Ｇａｌ再生方法の反応を連結することでガラクトース残基を基質中に添加する方法に関し、その方法は、（ｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群の存在下、ガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを生成し、その中、前記ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群は、ガラクトースキナーゼ、ＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼ（ＵＤＰ−ｓｕｇａｒ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）、ピルビン酸キナーゼ及び状況に応じるピロホスファターゼを含むことと、（ｉｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌと基質分子（例えば多糖、オリゴ糖、糖タンパク、糖脂またはアグリコン（ａｇｌｙｃｏｎｅ））をガラクトース転移酵素（例えばα１，４−ガラクトース転移酵素、β１，４−ガラクトース転移酵素、α１，３−ガラクトース転移酵素またはβ１，３−ガラクトース転移酵素）により、反応を行い、前記基質分子上にガラクトース残基を添加することと、必要に応じて（ｉｉｉ）生成するガラクトース化産物を分離することとを含む。ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）は、前記ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群、前記ガラクトース転移酵素、前記基質分子、ガラクトース、ＡＴＰ及びＵＴＰを含む反応混合物中に行われる。幾らかの実例中において、前記基質分子は、セラミドまたはグリコスフィンゴリピドである。
本発明の別の態様は、オリゴ糖を合成する方法に関し、それは少なくとも１種のヌクレオチド糖再生方法（例えばＵＤＰ−Ｇａｌ再生）及び少なくとも１種の糖基転移酵素（例えばガラクトース転移酵素、フコース転移酵素、シアル酸転移酵素またはＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素）の活性により、単糖（例えばガラクトース（Ｇａｌ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）及びシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ））を適切な受容体に添加する反応に係る。
幾らかの実例中において、本発明の方法は、ラクトース（例えば末端）を出発物として利用して酵素的な方式でオリゴ糖を合成する。前記方法は、（ｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群の存在下、ガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを生成し、その中、前記ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群は、ガラクトースキナーゼ（例えば大腸桿菌から由来する）、ＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼ（例えばシロイヌナズナ（Ａ． ｔｈａｌｉａｎａ）から由来する）、ピルビン酸キナーゼ（例えば大腸桿菌から由来する）及び状況に応じるピロホスファターゼ（例えば大腸桿菌から由来する）を含むことと、（ｉｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ及びα−１，４ガラクトース転移酵素（例えばＬｇｔＣ（例えばナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）から由来する）の存在下、Ｌａｃ−ＯＲ１ＡをＧｂ３−ＯＲ１Ａに転換し、その中、Ｒ１Ａは、水素、置換または未置換されたアルキル基、置換または未置換されたアルケニル基、置換または未置換されたアルキニル基、置換または未置換された炭素環基、置換または未置換された複素環基、置換または未置換されたアリール基、置換または未置換されたヘテロアリール基または酸素保護基団であることとを含む。
Ｒ１Ａの実例は、水素、アリル基、ビオチン、セラミド、または非水素基団（例えばアルキル基）を含むが、これらに限らず、それはさらに置換または未置換されたチオ、置換または未置換されたアミン基、カルボニル基（例えば、カルボン酸）、アジド、アルケニル基（例えば、アリル基）、アルキニル基（例えば、プロパルギル基）、ビオチンまたはセラミドで置換される。幾らかの特定の実例中において、Ｒ１Ａは、水素、アリル基、置換されたアルキル基、ビオチンまたはセラミドである。
必要であれば、Ｇｂ３−ＯＲ１Ａは反応混合物中から分離されてもよい。
ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）は、Ｇｂ３−合成反応混合物中に行われ、前記Ｇｂ３−合成反応混合物は、ガラクトース、ＰＥＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｌａｃ−ＯＲ１Ａ、α−１，４−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群を含む。一実施例中に、いかなる酵素反応発生前において、Ｌａｃ−ＯＲ１ＡとガラクトースのＧｂ３−合成反応混合物中のモル比が１：１である。
上記いずれか１つの方法は、さらに（ｉｉｉ）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ及びβ−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素（例えばヘモフィルス・インフルエンザ桿菌（Ｈ．
ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）等の好適な生物体から由来するＬｇｔＤ）の存在下、Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換することを含み、前記ステップはステップ（ｉｖ）と結合してもよく、ステップ（ｉｖ）は、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生酵素群の存在下、ＧａｌＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを生成し、その中、前記ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生酵素群は、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｎｅ
１−ｋｉｎａｓｅ）（例えばロンガム菌（Ｂ． ｌｏｎｇｕｍ）から由来する）、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−リン酸ウリジル転移酵素（例えば大腸桿菌から由来する）及びピルビン酸キナーゼ（例えば大腸桿菌から由来する）、及び必要に応じるピロホスファターゼ（例えば大腸桿菌から由来する）を含むことを含む。ステップ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は、Ｇｂ−４合成反応混合物中に行われ、前記反応混合物は、ＧａｌＮＡｃ、ＰＥＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｇｂ３−ＯＲ１Ａ、β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生酵素群を含む。本発明の一実例中に、Ｇｂ４−合成反応混合物は、Ｇｂ３−合成反応混合物を少なくともＧａｌＮＡｃ、β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素と混合することで作製される。必要であれば、Ｇｂ４−ＯＲ１Ａは反応混合物中から分離されてもよい。
Ｇｂ４−ＯＲ１Ａ合成の後に、上記方法は、さらに（ｖ）ＵＤＰ−Ｇａｌ及びβ１，３−ガラクトース転移酵素（例えばヘモフィルス・インフルエンザ桿菌から由来するＬｇｔＤ）の存在下、Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを含み、前記ステップはステップ（ｖｉ）と結合してもよく、ステップ（ｖｉ）は、本発明に係るＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群の存在下、ガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを生成することを含む。本発明の一実例中に、ステップ（ｖ）及び（ｖｉ）は、Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記反応混合物は、ガラクトース、ＰＥＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｇｂ４−ＯＲ１Ａ、β１，３−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群を含む。産物Ｇｂ５−ＯＲ１Ａは反応混合物中から分離されてもよい。
上記方法は、さらにＧｂ５−ＯＲ１Ａを転換するステップを含むことによって、フコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ（Ｇｌｏｂｏ Ｈ）またはシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ（ＳＳＥＡ４）を獲得する。
Ｇｌｏｂｏ Ｈの合成について、本発明の方法は、さらに（ｖｉｉ）ＧＤＰ−Ｆｕｃ及びα１，２−フコース基転移酵素（例えばヘリコバクター・ピロリ（Ｈ． ｐｙｌｏｒ）から由来する）の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをフコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを含み、前記ステップはステップ（ｖｉｉｉ）と結合してもよく、ステップ（ｖｉｉｉ）は、ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群の存在下、フコースからＧＤＰ−Ｆｕｃを生成し、その中、前記ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群は、Ｌ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ（例えばバクテロイデス・フラジリス（Ｂ． ｆｒａｇｉｌｉｓ）から由来する）、ピルビン酸キナーゼ（例えば大腸桿菌から由来する）及びピロホスファターゼ（例えば大腸桿菌から由来する）を含むことを含む。本発明の一実例中において、ステップ（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）は、フコース基−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記反応混合物は、フコース、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ、α−１，２−フコース基転移酵素及びＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群を含む。フコース基−Ｇｂ５−合成反応混合物は、Ｇｂ５−合成反応混合物を少なくともフコース、ＧＴＰ、α−１，２−フコース基転移酵素及びＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼと混合して得られる。必要であれば、産物フコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａは反応混合物中から分離されてもよい。
ＳＳＥＡ４の合成について、本発明の方法は、さらに（ｉｘ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ及びα−２，３−シアル酸転移酵素（例えば海洋細菌（Ｍ． ｂａｃｔｅｒｉａ）から由来する）の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することと、（ｘ）：ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群の存在下、Ｎｅｕ５ＡｃからＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを生成し、その中、前記ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群は、シチジン一リン酸キナーゼ（例えば大腸桿菌から由来する）、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（例えばパスツレラ・ムルトシダ（Ｐ． ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）から由来する）、ピルビン酸キナーゼ（例えば大腸桿菌から由来する）及び必要に応じるピロホスファターゼ（例えば大腸桿菌から由来する）を含むこととを含む。ステップ（ｉｘ）及び（ｘ）は、シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物中に実施され、前記反応混合物は、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ、α−２，３−シアル酸転移酵素及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群を含む。シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物は、Ｇｂ５−合成反応混合物を少なくともＮｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、α−２，３−シアル酸転移酵素、シチジン一リン酸キナーゼ及びＣＭＰ−シアル酸シンターゼと混合して得られる。シアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａは反応混合物中から分離されてもよい。
本発明の一実例中において、Ｇｌｏｂｏ Ｈ合成方法の実施方式は以下のように：（ｉ）本発明に係るＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群の存在下、ガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを生成することと、（ｉｉ）Ｇｂ３−合成反応混合物中に本発明に係るＬａｃ−ＯＲ１ＡをＧｂ３−ＯＲ１Ａに転換し、その中、前記反応混合物は、少なくともＵＤＰ−Ｇａｌ、α−１，４ガラクトース基転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素を含むことと、（ｉｉｉ）Ｇｂ３−合成反応混合物を少なくともＧａｌＮＡｃ、β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素と混合することによりＧｂ４−合成混合物に形成することと、（ｉｖ）Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ４−合成反応混合物を培養することと、（ｖ）さらにＧｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、１，３−ガラクトース転移酵素の存在下、Ｇｂ４−合成反応混合物を培養することと、（ｖｉ）Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを含有する反応混合物を少なくともフコース、ＧＴＰ、α−１，２−フコース転移酵素及びＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼと混合することによりフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物に形成することと、（ｖｉｉ）Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、フコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物を培養することと、必要に応じて（ｖｉｉｉ）フコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することとを含む。
本発明の別の実例中において、Ｇｌｏｂｏ Ｈの合成方法の実施方式は以下のように：（ｉ）本発明に述べるように、ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群の存在下、ガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを生成することと、（ｉｉ）本発明に述べるように、Ｇｂ３−合成反応混合物中にＬａｃ−ＯＲ１ＡをＧｂ３−ＯＲ１Ａに転換し、その中、前記反応混合物は、少なくともＵＤＰ−Ｇａｌ、α−１，４ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素を含むことと、（ｉｉｉ）Ｇｂ３−合成反応混合物を少なくともＧａｌＮＡｃ、β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素と混合することによりＧｂ４−合成反応混合物に形成することと、（ｉｖ）Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ４−合成反応混合物を培養することと、（ｖ）Ｇｂ４−ＯＲ１Ａを分離することと、（ｖｉ）Ｇｂ４−ＯＲ１Ａをβ１，３−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群と混合することによりＧｂ５−合成反応混合物に形成することと、（ｖｉｉ）Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ５−合成反応混合物を培養することと、（ｖｉｉｉ）Ｇｂ５−合成反応混合物を少なくともフコース、ＧＴＰ、α１，２−フコース転移酵素及びＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼと混合することによりフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物に形成することと、（ｉｘ）Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、フコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物を培養することと、必要に応じて（ｘ）フコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することとを含む。
ＳＳＥＡ４を合成する方法の実施方式は以下のように：（ｉ）本発明に述べるように、ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群の存在下、ガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを生成することと、（ｉｉ）本発明に述べるように、Ｇｂ３−合成反応混合物中にＬａｃ−ＯＲ１ＡをＧｂ３−ＯＲ１Ａに転換し、その中、前記反応混合物は、少なくともＵＤＰ−Ｇａｌ、α−１，４ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素を含むことと、（ｉｉｉ）Ｇｂ３−合成反応混合物を少なくともＧａｌＮＡｃ、β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素と混合することによりＧｂ４−合成反応混合物に形成することと、（ｉｖ）Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ４−合成反応混合物を培養することと、（ｖ）Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、１，３−ガラクトース転移酵素の存在下、さらにＧｂ４−合成反応混合物を培養することと、（ｖｉ）Ｇｂ４−合成反応混合物を少なくともＮｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、α２，３−シアル酸転移酵素、シチジン一リン酸キナーゼ及びＣＭＰ−シアル酸シンターゼと混合することによりシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物に形成することと、（ｖｉｉ）Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、シアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物を培養することと、必要に応じて（ｖｉｉｉ）シアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することとを含む。
一方、ＳＳＥＡ４を合成する方法の実施方式は以下のように：（ｉ）本発明に述べるように、ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群の存在下、ガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを生成することと、（ｉｉ）本発明に述べるように、Ｇｂ３−合成反応混合物中にＬａｃ−ＯＲ１ＡをＧｂ３−ＯＲ１Ａに転換し、その中、前記反応混合物は、少なくともＵＤＰ−Ｇａｌ、α−１，４ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素を含むことと、（ｉｉｉ）Ｇｂ３−合成反応混合物を少なくともＧａｌＮＡｃ、β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素と混合することによりＧｂ４−合成反応混合物に形成することと、（ｉｖ）Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ４−合成反応混合物を培養することと、（ｖ）Ｇｂ４−ＯＲ１Ａを分離することと、（ｖｉ）Ｇｂ４−ＯＲ１Ａをβ１，３−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群と混合することによりＧｂ５−合成反応混合物に形成することと、（ｖｉｉ）Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ５−合成反応混合物を培養することと、（ｖｉｉｉ）Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをα−２，３シアル酸転移酵素及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群と混合することによりシアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物に形成し、その中、前記ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群は、シチジン一リン酸キナーゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、ピルビン酸キナーゼ及びピロホスファターゼを含むことと、（ｉｘ）Ｇｂ４−ＯＲ１Ａをシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物を培養することと、必要に応じて（ｘ）シアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することとを含む。
幾つかの実例中において、本発明に係る方法は、Ｇｂ３（例えば、末端）を酵素的な合成オリゴ糖の出発材料として使用する。前記方法は、（ｉ）前記のように、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生酵素群の存在下、ＧａｌＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを生成すると共に、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ及びβ１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の存在下、Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換し、その中、Ｒ１Ａは、水素、置換または未置換されたアルキル基、置換または未置換されたアルケニル基、置換または未置換されたアルキニル基、置換または未置換された炭素環基、置換または未置換された複素環基、置換または未置換されたアリール基、置換または未置換されたヘテロアリール基または酸素保護基団である。Ｒ１Ａの実例は、水素、アリル基、ビオチン、セラミド、または非水素基団（例えばアルキル基）を含むが、これらに限らず、それはさらに置換または未置換されたチオ、置換または未置換されたアミン基、カルボニル基（例えば、カルボン酸）、アジド、アルケニル基（例えば、アリル基）、アルキニル基（例えば、プロパルギル基）、ビオチンまたはセラミド基団で置換される。幾らかの特定の実例中において、Ｒ１Ａは、水素、アリル基、置換されたアルキル基、ビオチンまたはセラミドである。ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）は、Ｇｂ４−合成反応混合物中に行われ、その中、前記反応混合物は、ＧａｌＮＡｃ、ＰＥＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｇｂ３−ＯＲ１Ａ、β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生酵素群を含む。必要であれば、Ｇｂ３−ＯＲ１Ａは分離されてもよい。
上記方法は、さらに：（ｉｉｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ及びβ−１，３−ガラクトース転移酵素の存在下、Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを含み、前記ステップはステップ（ｉｖ）と結合してもよく、ステップ（ｉｖ）と結合してもよく、ステップ（ｉｖ）は、本発明に述べるように、（ｉｖ）ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群の存在下、ガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを生成することを含む。ステップ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は、Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、その中、前記反応混合物は、ガラクトース、ＰＥＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｇｂ４−ＯＲ１Ａ、β−１，３−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群を含む。産物Ｇｂ５−ＯＲ１Ａは反応混合物中から分離されて得られる。
本発明の一実例によれば、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを再びフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換し、その方法は以下のように：（ｖ）ＧＤＰ−Ｆｕｃ及びα−１，２−フコース転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換し、前記ステップはステップ（ｖｉ）と結合してもよく、ステップ（ｖｉ）は、本発明に係るＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群の存在下、フコースからＧＤＰ−Ｆｕｃを生成することを含む。ステップ（ｖ）及び（ｖｉ）は、フコース−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記反応混合物は、フコース、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ、α−１，２−フコース転移酵素及びＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群を含む。必要であれば、フコース−Ｇｂ５−合成反応混合物は、Ｇｂ５−合成反応混合物を少なくともフコース、ＧＴＰ、α−１，２−フコース転移酵素及びＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼと混合して得られる。本発明の方法は、さらにフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することを含む。
本発明の別の実例は、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを再びシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換し、その方法は以下のように：（ｖｉｉ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ及びα−２，３−シアル酸転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換し、前記ステップはステップ（ｖｉｉｉ）と結合してもよく、ステップ（ｖｉｉｉ）は、本発明に係るＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群の存在下、Ｎｅｕ５ＡｃからＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを生成することを含む。ステップ（ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）は、シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記反応混合物は、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ４−ＯＲ１Ａ、α−２，３−シアル酸転移酵素及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群を含む。特定の実例中において、シアル酸−Ｇｂ５−生成反応混合物は、Ｇｂ５−合成反応混合物を少なくともＮｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、α−２，３−シアル酸転移酵素、シチジン一リン酸キナーゼ及びＣＭＰ−シアル酸シンターゼと混合して得られる。産物シアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａは反応混合物中から分離されてもよい。
本発明の他の実例によれば、ここで述べる方法は、Ｇｂ４（例えば、末端）を出発物として使用してオリゴ糖を合成することに関する。前記方法は、（ｉ）本発明に述べるようなＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群の存在下、ガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを生成することと、（ｉｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ及びβ−１，３−ガラクトース転移酵素の存在下、Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換し、その中、Ｒ１Ａは、水素、置換または未置換されたアルキル基、置換または未置換されたアルケニル基、置換または未置換されたアルキニル基、置換または未置換された炭素環基、置換または未置換された複素環基、置換または未置換されたアリール基、置換または未置換されたヘテロアリール基または酸素保護基団である。Ｒ１Ａの実例は、水素、アリル基、ビオチン、セラミドまたは非水素基団（例えばアルキル基）を含むが、これらに限らず、それはさらに置換または未置換されたチオ、置換または未置換されたアミン基、カルボニル基（例えば、カルボン酸）、アジド、アルケニル基（例えば、アリル基）、アルキニル基（例えば、プロパルギル基）、ビオチンまたはセラミド基団で置換される。幾らかの特定の実例中において、Ｒ１Ａは、水素、アリル基、置換されたアルキル基、ビオチンまたはセラミド基団である。本発明の方法によれば、ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）は、Ｇｂ５−合成反応混合物中に実施され、前記反応混合物は、ガラクトース、ＰＥＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｇｂ４−ＯＲ１Ａ、β−１，３−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群を含む。他方としてまたは必要であれば、得られたＧｂ５−ＯＲ１Ａを分離することもできる。
上記方法は、さらに（ｉｉｉ）ＧＤＰ−Ｆｕｃ及びα−１，２−フコース基転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１に転換することを含み、前記ステップはステップ（ｉｖ）と結合してもよく、ステップ（ｉｖ）は、本発明に述べるようなＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群の存在下、フコースからＧＤＰ−Ｆｕｃを生成することを含む。ステップ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は、フコース−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記反応混合物は、フコース、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ、α−１，２−フコース転移酵素及びＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群を含む。フコース−Ｇｂ５−合成反応混合物は、Ｇｂ５−合成反応混合物を少なくともフコース、ＧＴＰ、α１，２−フコース転移酵素及びＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼと混合して得られる。産物フコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａは反応混合物中から分離されてもよい。
一方、上記方法は、さらに（ｖ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ及びα−２，３−シアル酸転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを含み、前記ステップはステップ（ｖｉ）と結合してもよく、ステップ（ｖｉ）は、本発明に述べるようなＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素キットの存在下、Ｎｅｕ５ＡｃからＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを生成することを含む。ステップ（ｖ）及び（ｖｉ）は、シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記反応混合物は、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ、α−２，３−シアル酸転移酵素及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群を含む。シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物は、Ｇｂ５−合成応混合物を少なくともＮｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、α−２，３−シアル酸転移酵素、シチジン一リン酸キナーゼ及びＣＭＰ−シアル酸シンターゼと混合して得られる。本発明の方法により得られるシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａは反応混合物中から分離されてもよい。
本発明の他の実例によれば、ここで述べる方法は、Ｇｂ５からフコース−Ｇｂ５オリゴ糖（Ｇｌｏｂｏ Ｈ）を合成することに関する。前記方法は、（ｉ）本発明に述べるようなＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素キットの存在下、フコースからＧＤＰ−Ｆｕｃを生成することと、（ｉｉ）ＧＤＰ−Ｆｕｃ及びα−１，２−フコース転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することと、必要に応じて（ｉｉｉ）フコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａはを分離することとを含む。ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）は、フコース−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記反応混合物は、フコース、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ、α−１，２−フコース転移酵素及びＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群を含む。
本発明の他の実例によれば、ここで述べる方法は、Ｇｂ５からシアル酸−Ｇｂ５オリゴ糖（Ｇｌｏｂｏ Ｈ）を合成することに関する。前記方法は、（ｉ）本発明に述べるようなＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素キットの存在下、Ｎｅｕ５ＡｃからＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを生成することと、（ｉｉ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ及びα−２，３−シアル酸転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することと、必要に応じて（ｉｉｉ）シアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することとを含む。ステップ（ｉ）及び（ｉｉ）は、シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記反応混合物は、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ５−ＯＲ、α−２，３−シアル酸転移酵素及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群を含む。
前述いずれか１つの合成方法において、係る少なくとも１つの酵素、または反応中の少なくとも１つの基質（例えば、ラクトース、Ｇｂ３、Ｇｂ４またはＧｂ５）のいずれかは、支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ ｍｅｍｂｅｒ）上に固定することができる。
本発明の他方は、本発明のオリゴ糖合成方法に用いれる酵素反応器（ｅｍｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｏｒ）に関する。前記酵素反応器は、１つまたは多数個の下記の反応室（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｈａｍｂｅｒ）を含む。
（ａ）α−１，４−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群を含み、それらはガラクトースキナーゼ、ＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含む、Ｇｂ３−ＯＲ１Ａを合成する反応室。
（ｂ）β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素及びＵＤＰ−ＧａｌＡｃ再生酵素群を含み、それらはＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含む、Ｇｂ４−ＯＲ１Ａを合成する反応室。
（ｃ）β−１，３−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群を含む、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを合成する反応室。
（ｄ）α−１，２−フコース転移酵素及びＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群を含み、それらはＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含む、フコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを合成する反応室。及び。
（ｅ）α−２，３−シアル酸転移酵素及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群を含み、それらはシチジン一リン酸キナーゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含む、シアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを合成する反応室。
本発明の幾つかの実例によれば、前記酵素反応器に備える反応室は以下のように：（ａ）及び（ｂ）と、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）と、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）と、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）と、（ｂ）及び（ｃ）と、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）と、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）と、（ｃ）及び（ｄ）または（ｃ）及び（ｅ）がある。
本発明の他の実例によれば、ここで述べる酵素反応器は、反応室を備え、前記反応室は、ガラクトース転移酵素（例えば、α−１，４−ガラクトース転移酵素、β−１，４−ガラクトース転移酵素、α−１，３−ガラクトース転移酵素またはβ−１，３−ガラクトース転移酵素）及び本発明に係るＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群を含み、それらはガラクトースキナーゼ、ＵＤＰピロホスホリラーゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含む。
いずれか１つの反応室中において、１つまたは多種の酵素は、支持体上に固定される。本発明の特定の実例によれば、前記１つまたは多数個のＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生酵素群、ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群は、各自に支持体上に固定される。本発明の他の実例によれば、１つの反応室中の全ての酵素は、１つの支持体上に固定される。
本発明も、上記合成方法により作製されるオリゴ糖を包含する。
本願発明の１つまたは多種の実例は、以下の実施するための形態中に詳記する。本発明の他の特徴、目的及び優勢については、以下の定義、図面、実例及び特許請求の範囲中に明白に掲示される。
化学式の定義
本発明の関連する特定の官能基団及び化学用語の定義については以下に説明する。化学元素の鑑別は周期表（ＣＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ， ７５ｔｈ Ｅｄ．）のカバーページの内部に基づいて、特定の官能基団もこれにより定義される。なお、有機化学の一般原則及び特殊官能基団及びその活性は、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｔｈｏｍａｓ Ｓｏｒｒｅｌｌ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ， Ｓａｕｓａｌｉｔｏ， １９９９； Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｍａｒｃｈ Ｍａｒｃｈ’ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ
Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ２００１； Ｌａｒｏｃｋ， Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，
ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９； ａｎｄ Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ， Ｓｏｍｅ Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， １９８７に記述するものである。
本発明に係る化合物は、１つまたは多数個の非対称中心を含むので、多種の異性体形式が存在し、例えばエナンチオ体及び／または非エナンチオ異性体である。例えば、本発明に係る化合物は、個別エナンチオ体、非エナンチオ異性体または幾何異性体などの形式を呈してもよく、あるいは混合異性体形式を呈してもよく、ラセミ混合物及び１つまたは多種の異性体を富む混合物を含む。キラル高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及びキラル塩類の形成と結晶など既知の技術を利用して混合物中から同分異性体を分離してもよく、または非対称合成法を利用して好適な異性体を準備してもよい。Ｊａｃｑｕｅｓ氏ら，Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ， Ｒａｃｅｍａｔｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８１）； Ｗｉｌｅｎ氏ら， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３３：２７２５（１９７７）； Ｅｌｉｅｌ， Ｅ．Ｌ． Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， ＮＹ， １９６２）； ａｎｄ Ｗｉｌｅｎ， Ｓ．Ｈ．
Ｔａｂｌｅｓ ｏｆ Ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｐ． ２６８（Ｅ．Ｌ． Ｅｌｉｅｌ， Ｅｄ．， Ｕｎｉｖ． ｏｆ Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｏｔｒｅ Ｄａｍｅ， ＩＮ １９７２）を参照する。本発明は、また実質上に他の異性体を含まない個別異性体を含み、一方、本発明は、多種の異性体の混合物を含む。
本願の明細書に記載の数値の範囲によれば、それは夫々各別の数値及び前記範囲内のサブ範囲を含むことを意味する。例えば、“Ｃ１−６アルキル基”は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ１−６、Ｃ１−５、Ｃ１−４、Ｃ１−３、Ｃ１−２、Ｃ２−６、Ｃ２−５、Ｃ２−４、Ｃ２−３、Ｃ３−６、Ｃ３−５、Ｃ３−４、Ｃ４−６、Ｃ４−５及びＣ５−６アルキル基を含むことを意味する。
本文に示す「アルキル基」は、１から３０個の炭素原子を有する直鎖または分岐鎖の飽和ヒドロカルビル基団（“Ｃ１−３０アルキル基”）である。幾らかの特定の実例に、前記アルキル基は、１から２０個の炭素原子（“Ｃ１−２０アルキル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキル基は、１から１０個の炭素原子（“Ｃ１−１０アルキル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキル基は、１から９個の炭素原子（“Ｃ１−９アルキル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキル基は、１から８個の炭素原子（“Ｃ１−８アルキル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキル基は、１から７個の炭素原子（“Ｃ１−７アルキル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキル基は、１から６個の炭素原子（“Ｃ１−６アルキル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキル基は、１から５個の炭素原子（“Ｃ１−５アルキル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキル基は、１から４個の炭素原子（“Ｃ１−４アルキル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキル基は、１から３個の炭素原子（“Ｃ１−３アルキル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキル基は、１から２個の炭素原子（“Ｃ１−２アルキル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキル基は、１個の炭素原子（“Ｃ１アルキル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキル基は、２から６個の炭素原子（“Ｃ２−６アルキル基”）を有する。Ｃ１−６アルキル基の実例は、メチル基（Ｃ１）、エチル基（Ｃ２）、ノルマルプロピル基（Ｃ３）、イソプロピル基（Ｃ３）、ノルマルブチル基（Ｃ４）、第３級ブチル基（Ｃ４）、第２級ブチル基（Ｃ４）、イソブチル基（Ｃ４）、ノルマルペンチル基（Ｃ５）、３−ペンチル基（Ｃ５）、ペンチル基（Ｃ５）、ネオペンチル基（Ｃ５）、３−メチル−２−ブチル基（Ｃ５）、第３級ペンチル基（Ｃ５）及びノルマルヘキシル基（Ｃ６）を含む。アルキル基の他の実例は、ノルマルヘプチル基（Ｃ７）、ノルマルオクチル基（Ｃ８）及びその類似物を含む。別途定義されない限り、そうでなければ本文に示すアルキル基は、各自独立に未置換された（未置換されたアルキル基）か、または１つまたは多数個の置換基で置換された（置換されたアルキル基）ものであろう。幾らかの特定の実例に、アルキル基は、未置換されたＣ１−１０アルキル基（例えば−ＣＨ３）である。他の特定の実例に、アルキル基は、置換されたＣ１−１０アルキル基である。
本文に示す「アルケニル基」または「アルケン類」は、２から３０個の炭素原子及び１つまたは多数個の二重結合（例えば１、２、３または４個の二重結合）を有する直鎖または分岐鎖のヒドロカルビル基団である。幾らかの特定の実例に、前記アルケニル基は、２から２０個の炭素原子（“Ｃ２−２０アルケニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルケニル基は、２から１０個の炭素原子（“Ｃ２−１０アルケニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルケニル基は、２から９個の炭素原子（“Ｃ２−９アルケニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルケニル基は、２から８個の炭素原子（“Ｃ２−８アルケニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルケニル基は、２から７個の炭素原子（“Ｃ２−７アルケニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルケニル基は、２から６個の炭素原子（“Ｃ２−６アルケニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルケニル基は、２から５個の炭素原子（“Ｃ２−５アルケニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルケニル基は、２から４個の炭素原子（“Ｃ２−４アルケニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルケニル基は、２から３個の炭素原子（“Ｃ２−３アルケニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルケニル基は、２個の炭素原子（“Ｃ２アルケニル基”）を有する。その中、１つまたは多数個のＣ＝Ｃ二重結合は、内部（例えば２−ブテニル基）または末端（例えば例えば１−ブテニル基）に存在してもよい。Ｃ２−４アルケニル基は、ビニル基（Ｃ２）、１−アリル基（Ｃ３）、２−アリル基（Ｃ３）、１−ブテニル基（Ｃ４）、２−ブテニル基（Ｃ４）、ブタジエニル基（Ｃ４）及びその類似物を含む。Ｃ２−６アルケニル基の実例は、前述のＣ２−４アルケニル基及びペンテン基（Ｃ５）、ペンタジエン基（Ｃ５）、ヘキセン基（Ｃ６）及びその類似物を含む。アルケニル基の他の実例は、ヘプテン基（Ｃ７）、オクテン基（Ｃ８）、オクタトリエン基（Ｃ８）及びその類似物を含む。別途定義されない限り、そうでなければ本文に示すアルケニル基は、各自独立に未置換された（未置換されたアルケニル基）か、または１つまたは多数個の置換基で置換された（置換されたアルケニル基）ものであろう。幾らかの特定の実例に、アルキル基は、未置換されたＣ２−１０アルケニル基である。他の特定の実例に、アルケニル基は、置換されたＣ２−１０アルケニル基である。
本文に示す「アルキニル基」または「アルキン類」は、２から３０個の炭素原子及び１つまたは多数個の三重結合（例えば１、２、３または４個の二重結合）を有する直鎖または分岐鎖のヒドロカルビル基団（“Ｃ２−１０アルキニル基”）である。幾らかの特定の実例に、前記アルキニル基は、２から２０個の炭素原子（“Ｃ２−２０アルキニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキニル基は、２から１０個の炭素原子（“Ｃ２−１０アルキニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキニル基は、２から９個の炭素原子（“Ｃ２−９アルキニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキニル基は、２から８個の炭素原子（“Ｃ２−８アルキニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキニル基は、２から７個の炭素原子（“Ｃ２−７アルキニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキニル基は、２から６個の炭素原子（“Ｃ２−６アルキニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキニル基は、２から５個の炭素原子（“Ｃ２−５アルキニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキニル基は、２から４個の炭素原子（“Ｃ２−４アルキニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキニル基は、２から３個の炭素原子（“Ｃ２−３アルキニル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記アルキニル基は、２個の炭素原子（“Ｃ２アルキニル基”）を有する。その中、１つまたは多数個のＣ≡Ｃ三重結合は、内部（例えば２−アルキニル基）または末端（例えば例えば１−アルキニル基）に存在してもよい。Ｃ２−４アルキニル基の実例は、アセチレン基（Ｃ２）、１−プロパルギル基（Ｃ３）、２−プロパルギル基（Ｃ３）、１−ブタジエン基（Ｃ４）、２−ブタジエン基（Ｃ４）及びその類似物を含むが、これらに限らない。Ｃ２−６アルキニル基の実例は、前述のＣ２−４アルキニル基及びペンチン基（Ｃ５）、ヘキシン基（Ｃ６）及びその類似物を含む。アルキニル基の他の実例は、ヘプチン基（Ｃ７）、オクチン基（Ｃ８）及びその類似物を含む。別途定義されない限り、そうでなければ本文に示すアルキニル基は、各自独立に未置換された（未置換されたアルキニル基）か、または１つまたは多数個の置換基で置換された（置換されたアルキニル基）ものであろう。幾らかの特定の実例に、アルキニル基は、未置換されたＣ２−１０アルキニル基である。他の特定の実例に、アルキニル基は、置換されたＣ２−１０アルキニル基である。
本文に示す「炭素環基」は、３から１０個の環炭素原子を有する非芳香族環ヒドロカルビル基団（“Ｃ３−１０炭素環基”）であり、かつ前記非芳香族環システム中にヘテロ原子を含まない。幾らかの特定の実例に、前記炭素環基は、３から８個の環炭素原子（“Ｃ２−８炭素環基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記炭素環基は、３から７個の環炭素原子（“Ｃ２−７炭素環基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記炭素環基は、３から６個の環炭素原子（“Ｃ２−６炭素環基”）を有する。幾らかの特定の実例に、前記炭素環基は、５から１０個の環炭素原子（“Ｃ５−１０炭素環基”）を有する。Ｃ３−６炭素環基の実例は、シクロプロピル基（Ｃ３）、シクロアリル基（Ｃ３）、シクロブチル基（Ｃ４）、シクロブテニル基（Ｃ４）、シクロペンチル基（Ｃ５）、シクロペンテン基（Ｃ５）、シクロヘキシル基（Ｃ６）、シクロヘキセン基（Ｃ６）、シクロヘキサジエン基（Ｃ６）及びその類似物を含むが、これらに限らない。Ｃ３−８炭素環基の例は、前述のＣ３−６炭素環基及びシクロヘプチル基（Ｃ７）、シクロヘプテン基（Ｃ７）、シクロヘプタジエン基（Ｃ７）、シクロヘプタレン基（Ｃ７）、シクロオクチル基（Ｃ８）、シクロオクテン基（Ｃ８）、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル基（Ｃ７）、ビシクロ［２．２．２］オクチル基（Ｃ８）及びその類似物を含むが、これらに限らない。Ｃ３−１０炭素環基の実例は、前述のＣ３−８炭素環基及びシクロノニル基（Ｃ９）、シクロノネニル基（Ｃ９）、シクロデシル基（Ｃ１０）、シクロデセン基（Ｃ１０）、オクタヒドロ−１Ｈ−インデニル基（Ｃ９）、デカヒドロナフチル基（Ｃ１０）、スピロ［４．５］デシル基（Ｃ１０）及びその類似物を含むが、これらに限らない。前述の実例に例示するもののように、幾らかの特定の実例に、炭素環基は、単環（“単環炭素環基”）または多環（例えば縮合環、スピロ環または架橋環システムを含み、例えば双環システム（“双環炭素環基”）または三環システム（“三環炭素環基”））であり、かつそれは飽和を呈するか、または１つまたは多数個の炭素−炭素二重結合または三重結合を含んでもよい。「炭素環基」は環システムも含み、その中、前述のような環炭素を１つまたは多数個のアリール基またはヘテロアリール基と縮合し、かつその中、接合点は前記環炭素上に位置し、このような場合、前記環炭素システム下にその炭素数を継続的に表記する。別途定義されない限り、そうでなければ本文に示す炭素環基は、各自独立に未置換された（未置換された炭素環基）か、または１つまたは多数個の置換基で置換された（置換された炭素環基）ものであろう。幾らかの特定の実例に、炭素環基は、未置換されたＣ３−１０炭素環基である。他の特定の実例に、炭素環基は、置換されたＣ３−１０炭素環基である。
幾らかの特定の実例に、「炭素環基」は、３〜１０個の環炭素原子（“Ｃ３−１０シクロアルキル基”）を有する飽和単環である。幾らかの特定の実例に、シクロアルキル基は、３から８個の環炭素原子（“Ｃ３−８シクロアルキル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、シクロアルキル基は、３から６個の環炭素原子（“Ｃ３−６シクロアルキル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、シクロアルキル基は、５から６個の環炭素原子（“Ｃ５−６シクロアルキル基”）を有する。幾らかの特定の実例に、シクロアルキル基は、５から１０個の環炭素原子（“Ｃ５−１０シクロアルキル基”）を有する。Ｃ５−６シクロアルキル基の実例は、シクロペンチル基（Ｃ５）及びシクロヘキシル基（Ｃ６）を含む。Ｃ３−６シクロアルキル基の実例は、前述のＣ５−６シクロアルキル基及びシクロプロピル基（Ｃ３）及びシクロブチル基（Ｃ４）を含む。Ｃ３−８シクロアルキル基の実例は、前述のＣ３−６シクロアルキル基及びシクロヘプチル基（Ｃ７）及びシクロオクチル基（Ｃ８）を含む。別途定義されない限り、そうでなければ本文に示すシクロアルキル基は、各自独立に未置換された（未置換されたシクロアルキル基）か、または１つまたは多数個の置換基で置換された（置換されたシクロアルキル基）ものであろう。幾らかの特定の実例に、シクロアルキル基は、未置換されたＣ３−１０シクロアルキル基である。他の特定の実例に、シクロアルキル基は、置換されたＣ３−１０シクロアルキル基である。
本文に示す「複素環基」は、１から４個のヘテロ原子を有する３−から１４−員非芳香族環システムであり、その中、夫々のヘテロ原子は、各自独立に窒素、酸素及びチオから選ばれる（“３〜１４員複素環基”）。１つまたは多数個の窒素原子を含む複素環基において、その接合点は炭素原子または窒素原子であってもよく、価数を許容するものであればよい。複素環基は、単環または多環（例えば縮合環、架橋環またはスピロ環で形成される双環システムまたは三環システム）であってもよく、かつ前記複素環基は、飽和するか、または１つまたは多数個のＣ＝Ｃ二重結合またはＣ≡Ｃ三重結合を含んでもよい。多環複素環システムは、その中の１つまたは２個の環中に、１つまたは多数個のヘテロ原子を含む。複素環基も、以上に定義されるような環システムを含み、それを１つまたは多数個の炭素環基と縮合し、その中、接合点は炭素環基または複素環上に位置してもよい。
多環の複素環基システムは、その１つまたは２個の環システム上に、１つまたは多数個のヘテロ原子を含む。「複素環基」も、環システムを含み、その中、前述のような複素環を１つまたは多数個の炭素環基と縮合し、かつその中、接合点は環炭素上または複素環基環上に位置するか、または前に定義されるような環システムは、その中の前記複素環を１つまたは多数個のアリール基またはヘテロアリール基と縮合し、かつその中、接合点は複素環上に位置し、このような場合、前記複素環システム下にその炭素数を継続的に表記する。別途定義されない限り、そうでなければ本文に示す複素環基は、各自独立に未置換された（未置換された複素環基）か、または１つまたは多数個の置換基で置換された（置換された複素環基）ものであろう。幾らかの特定の実例に、複素環基は、未置換された３〜１４員複素環基である。他の特定の実例に、複素環基は、置換された３〜１４員複素環基である。
幾らかの特定の実例中に、前記複素環基は、環炭素原子及び１〜４個の複素環原子を有する５〜１０員非芳香族環システムであり、その中、前記複素環原子は、独立に窒素、酸素及びチオから選ばれる。幾らかの特定の実例中に、前記複素環基は、環炭素原子及び１〜４個の複素環原子を有する５〜８員非芳香族環システムであり、その中、前記複素環原子は、独立に窒素、酸素及びチオから選ばれる。幾らかの特定の実例中に、前記複素環基は、環炭素原子及び１〜４個の複素環原子を有する５〜６員非芳香族環システムであり、その中、前記複素環原子は、独立に窒素、酸素及びチオから選ばれる。幾らかの特定の実例中に、前記５〜６原複素環基は、１〜３個の窒素、酸素及びチオから選ばれる複素環原子を有する。幾らかの特定の実例中に、前記５〜６原複素環基は、１〜２個の窒素、酸素及びチオから選ばれる複素環原子を有する。幾らかの特定の実例中に、前記５〜６原複素環基は、１個の窒素、酸素及びチオから選ばれる複素環原子を有する。
１個のヘテロ原子を含む３員複素環基の実例は、アジリジニル基（ａｚｉｒｄｉｎｙｌ）、オキシラニル基（ｏｘｉｒａｎｙｌ）、チオレニル基（ｔｈｉｏｒｅｎｙｌ）を含むが、これらに限らない。４員複素環基（１つのヘテロ原子を含む）の実例は、アゼチジニル基（ａｚｅｔｉｄｉｎｙｌ）、オキセタニル基（ｏｘｅｔａｎｙｌ）及びチエタニル基（ｔｈｉｅｔａｎｙｌ）を含むが、これらに限らない。５員複素環基（１つのヘテロ原子を含む）の実例は、テトラヒドロフラニル基、ジヒドロフラニル基、テトラヒドロチオフェニル基、ジヒドロチオフェニル基、ピロリジニル基、ジヒドロピロリル基及びピロリル基−２，５−ジケトンを含むが、これらに限らない。５員複素環基（２個のヘテロ原子を含む）の実例は、ジオキソラニル基（ｄｉｏｘｏｌａｎｙｌ）、オキサチオラニル基（ｏｘａｔｈｉｏｌａｎｙｌ）及びジチオラニル（ｄｉｔｈｉｏｌａｎｙｌ）を含むが、これらに限らない。５員複素環基（２個のヘテロ原子を含む）の実例は、トリアゾリニル基（ｔｒｉａｚｏｌｉｎｙｌ）、 オキサジアゾリニル基（ｏｘａｄｉａｚｏｌｉｎｙｌ）、チアジアゾリニル基（ｔｈｉａｄｉａｚｏｌｉｎｙｌ）を含むが、これらに限らない。６員複素環基（１個のヘテロ原子を含む）の実例は、ピペリジニル基、テトラヒドロピラニル基、ジヒドロピラニル基及びチエニル基（ｔｈｉａｎｙｌ）を含むが、これらに限らない。６員複素環基（２個のヘテロ原子を含む）の実例は、ピペラジニル基、モルフォリニル基、ジチアニル基（ｄｉｔｈｉａｎｙｌ）及びジオキサニル基（ｄｉｏｘａｎｙｌ）を含むが、これらに限らない。６員複素環基（２個のヘテロ原子を含む）の実例は、チアジナニル基を含むが、これらに限らない。７員複素環基（１個のヘテロ原子を含む）の実例は、アゼバニル基（ａｚｅｐａｎｙｌ）、オキセタニル基（ｏｘｅｐａｎｙｌ）及びチエパニル基（ｔｈｉｅｐａｎｙｌ）を含むが、これらに限らない。８員複素環基（１個のヘテロ原子を含む）の実例は、アゾカニル基（ａｚｏｃａｎｙｌ）、オキセカニル基（ｏｘｅｃａｎｙｌ）及びチオカニル基（ｔｈｉｏｃａｎｙｌ）を含むが、これらに限らない。双環複素環基の実例は、インドリニル基（ｉｎｄｏｌｉｎｙｌ）、イソインドリニル基、ジヒドロベンゾフラニル基、ジヒドロベンゾチオフェネイル基、テトラヒドロベンゾチオフェネイル基、テトラヒドロベンゾフラニル基、テトラヒドロインドリル基、テトラヒドロキノリニル基、テトラヒドロイソキノリニル基、デカヒドロキノリニル基、デカヒドロイソキノリニル基、オクタヒドロベンゾピラニル基、オクタヒドロイソベンゾピラニル基、デカヒドロナフチリジニル基、デカヒドロ−１，８−ナフチリジニル基、オクタヒドロピロロ［３，２−ｂ］ピロール、インドリル基、フタルイミドイル基、ナフタルイミジル基、クロマニル基（ｃｈｒｏｍａｎｙｌ）、クロメニル基（ｃｈｒｏｍｅｎｙｌ）、１Ｈ−ベンゾ［ｅ］［１，４］ジアゼニル（１Ｈ−ｂｅｎｚｏ［ｅ］［１，４］ｄｉａｚｅｐｉｎｙｌ）、１，４，５，７−テトラヒドロ−ピラノ［３，４−ｂ］ピロリル基、５，６−ジヒドロ−４Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピロリル基、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−フロ［３，２−ｂ］ピラニル基、５，７−ジヒドロ−４Ｈ−チエノ［２，３−ｃ］ピラニル基、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニル基、２，３−ジヒドロフロ［２，３−ｂ］ピリジニル基、４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニル基、４，５，６，７−テトラヒドロフロ［３，２−ｃ］ピリジニル基、４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［３，２−ｂ］ピリジニル基、１，２，３，４−テトラヒドロ−１，６−ナフチリジニル基及びその類似物を含むが、これらに限らない。
本文に示す「アリール基」は、６〜１４個の環炭素原子を有し、かつヘテロ原子を含まない単または多（例えば双環または三環）の４ｎ＋２芳香環システム（例えば６、１０または１４個の電子を１個の環状アレー中に共有する）の“Ｃ６−１４アリール基”を指す。幾らかの特定の実例中に、前記アリール基は、６個の環炭素原子（“Ｃ６アリール基”、例えばフェニル基）を有する。幾らかの特定の実例中に、前記アリール基は、１０個の環炭素原子（“Ｃ１０アリール基”、例えばナフチル基、特定に例えば１−ナフチル基またはに２−ナフチル基）を有する。幾らかの特定の実例中に、前記アリール基は、１４個の環炭素原子（“Ｃ１４アリール基”、例えばアントラシル基（ａｎｔｈｒａｃｙｌ））を有する。「アリール基」は環システムも含み、前に定義されるもののように、前記アリール基環を１つまたは多数個の炭素環基または複素環基と縮合し、その中、前記接合点はアリール基環上に位置し、このような場合、前記芳香環システム下にその炭素数を継続的に表記する。別途定義されない限り、そうでなければ本文に示すアリール基は、各自独立に未置換された（未置換されたアリール基）か、または１つまたは多数個の置換基で置換された（置換されたアリール基）ものであろう。幾らかの特定の実例中に、アリール基は、未置換されたＣ６−１４アリール基である。他の特定の実例中に、アリール基は、置換されたＣ６−１４アリール基である。
本文に示す「ヘテロアリール基」は、５〜１４員単または多環（例えば双環）の４ｎ＋２芳香族環システム（例えば６、１０または１４個の電子を１個の環状アレー中に共有する）を指す。前記芳香族環システムは、炭素原子及び１〜４個のヘテロ原子を有し、その中、前記ヘテロ原子は、各自独立に窒素、酸素及びチオから選ばれる。（“５〜１４員ヘテロアリール基”）。１つまたは多数個の窒素原子を含むヘテロアリール基中に、価数を許容するものであれば、その接合点は炭素原子または窒素原子であってもよい。多環ヘテロアリール基環システムは、その中の１つまたは２個の環中に１つまたは多数個のヘテロ原子を含む。「ヘテロアリール基」は環システムも含み、その中、以上に述べるようなヘテロ芳香環を１つまたは多数個の炭素環または複素環基と縮合し、その中、接合点はヘテロアリール基環上に位置し、かつこのような場合、前記ヘテロ芳香環システム下にその炭素数を継続的に表記する。「ヘテロアリール基」は環システムも含み、その中、以上に述べるようなヘテロ芳香環を１つまたは多数個のアリール基と縮合し、その中、接合点はアリール基またはヘテロアリール基環上に位置し、かつこのような場合、前記縮合した多環（アリール基／ヘテロアリール基）システム下にその炭素数を継続的に表記する。その中、一環はヘテロ原子を含まない多環ヘテロアリール基団（例えばインドリル基、キノリニル基、カルバゾリル基（ｃａｒｂａｚｏｌｙｌ）及びその類似物）であり、その接合点は環上に位置してもよく、即ち、前記環はヘテロ原子を含む（例えば２−インドリル基）か、または前記環はヘテロ原子を含まない（例えば５−インドリル基）。
幾らかの特定の実例中に、前記ヘテロアリール基は５〜１０員芳香族環システムであり、環炭素原子及び１〜４個の複素環原子を有し、その中、前記複素環原子は、各自独立に窒素、酸素及びチオから選ばれる（“５〜１０員ヘテロアリール基”）。幾らかの特定の実例中に、前記ヘテロアリール基は５〜８員芳香族環システムであり、環炭素原子及び１〜４個の複素環原子を有し、その中、前記複素環原子は、各自独立に窒素、酸素及びチオから選ばれる（“５〜８員ヘテロアリール基”）。 幾らかの特定の実例中に、前記ヘテロアリール基は５〜６員芳香族環システムであり、環炭素原子及び１〜４個の複素環原子を有し、その中、前記複素環原子は、各自独立に窒素、酸素及びチオから選ばれる（“５〜６員ヘテロアリール基”）。幾らかの特定の実例中に、５〜６員ヘテロアリール基は、１〜３個の各自独立に窒素、酸素及びチオから選ばれる複素環原子を有する。幾らかの特定の実例に、５〜６員ヘテロアリール基は、１〜２個の各自独立に窒素、酸素及びチオから選ばれる複素環原子を有する。幾らかの特定の実例に、５〜６員ヘテロアリール基は、１個の窒素、酸素及びチオから選ばれる複素環原子を有する。別途定義されない限り、そうでなければ本文に示すヘテロアリール基は、各自独立に未置換された（未置換されたヘテロアリール基）か、または１つまたは多数個の置換基で置換された（置換されたヘテロアリール基）ものであろう。幾らかの特定の実例に、ヘテロアリール基は、未置換された５〜１４員ヘテロアリール基である。他の特定の実例に、ヘテロアリール基は、置換された５〜１４員ヘテロアリール基でである。
５員ヘテロアリール基（１つのヘテロ原子を含む）の実例は、ピロリル基、フラニル基及びチオフェネイル基を含むが、これらに限らない。２個のヘテロ子を含有する５員ヘテロアリール基の実例は、イミダゾリル基、ピラゾリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基及びイソチアゾリル基を含むが、これらに限らない。３個のヘテロ子を含有する５員ヘテロアリール基の実例は、トリアゾール、オキサジアゾール及びチアジアゾリル基を含むが、これらに限らない。４個のヘテロ子を含有する５員ヘテロアリール基の実例は、テトラゾリル基を含むが、これらに限らない。１個のヘテロ子を含有する６員ヘテロアリール基の実例は、ピリジニル基を含むが、これらに限らない。２個のヘテロ子を含有する６員ヘテロアリール基の実例は、ピリダジニル基、ピリミジニル基及びピラジニル基を含むが、これらに限らない。３または４個のヘテロ子を含有する６員ヘテロアリール基の実例は、トリアジニル基及びテトラジニル基をそれぞれ含むが、これらに限らない。１個のヘテロ子を含有する７員ヘテロアリール基の実例は、アゼピニル基、オキセピニル基及びチエピニル基を含むが、これらに限らない。５，６−双環ヘテロアリール基の実例は、インドリル基、イソインドリル基、インダゾリル基、ベンゾトリゾリル基、ベンゾチオフェネイル基、イソベンゾチオフェネイル基、ベンゾフラニル基、ベンゾイソフラニル基、ベンゾイミダゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、ベンゾイソキサゾリル基、ベンゾオキサジアゾリル基、ベンゾチアゾリル基、ベンゾイソチアゾリル基、ベンゾチアジアゾリル基、インドリジニル基（ｉｎｄｏｌｉｚｉｎｙｌ）及びプリニル基を含むが、これらに限らない。６，６−双環ヘテロアリール基の実例は、ナフチリジニル基、プテリジニル基、キノリニル基、イソキノリニル基、シンノニル基、キノキサリニル基、フタラジニル基及びキナゾリニル基を含むが、これらに限らない。三環ヘテロアリール基の実例は、フェナントリジニル基、ジベンゾフラニル基、カルバゾリル基、アクリジニル基、フェノチアジニル基、フェノキサジニル基及びフェナジニル基を含むが、これらに限らない。
本文に用いられる技術用語の「一部不飽和」は、一環部分は、少なくとも１個の二重結合または１個の三重結合を含むことを意味し、前記技術用語の「一部不飽和」は、多箇所の不飽和位置を有する環を含意するように意図されるが、本文に定義されるようなアリール基（例えばフェニル基またはヘテロアリール基部分）を含まない。
本文に用いられる技術用語の「飽和」は、一環部分は、いずれか１つの二重結合または三重結合を有さず、即ち、前記環構造は全て単結合である。
本文に示すアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、炭素環基、複素環基、アリール基及びヘテロアリール基は、必要に応じて置換された（例えば、置換または未置換されたアルキル基、置換または未置換されたアルケニル基、置換または未置換されたアルキニル基、置換または未置換されたヘテロアルキル基、置換または未置換されたヘテロアルケニル基、置換または未置換されたヘテロアルキニル基、置換または未置換された炭素環基、置換または未置換された複素環基、置換または未置換されたアリール基または置換または未置換されたヘテロアリール基）。一般に言えば、本文に用いられる「置換」の技術用語（文前に「必要に応じる」という技術用語が付されるかどうかに拘らない）は、基団中に少なくとも１個の水素原子は許容の置換基で置換されたことを意味し、例えば置換の過程中に、置換基から安定化合物を引き出すことができ、前記安定化合物は、例えば再配列、環化、脱離または他の転化反応を自動的に行うことになくなる。別途定義されない限り、そうでなければ１つの置換された基団は１つまたは多数個の好適な位置に置換基を有し、かつ１個の位置を超えて置換された時に、各置換位置の置換基は同一または不同である。本文に用いられる「置換」の技術用語は、全ての許容可能な有機化合物、いかなる本文に示す安定化合物を形成するように引き出すことができるいかなる置換基を含む。本発明は、いかなる及び全ての組合せで安定化合物を獲得することを含む。本発明の目的に基づいて、例えば窒素のヘテロ原子は、水素及び／またはいかなる本文に述べるような好適な置換基で置換され、それは前記ヘテロ原子の価数を満足することで、安定基団が形成される。
炭素原子の置換基の実例は、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲａａ、−ＯＮ（Ｒｂｂ）２、−Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｎ（Ｒｂｂ）３ ＋Ｘ−、−Ｎ（ＯＲｃｃ）Ｒｂｂ、−ＳＨ、−ＳＲａａ、−ＳＳＲｃｃ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＨＯ、−Ｃ（ＯＲｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＯＣＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＮＲｂｂＣＯ２Ｒａａ、−ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＮＲｂｂＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、−ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＳＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２ＯＲａａ、−ＯＳＯ２Ｒａａ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＯＳ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｓｉ（Ｒａａ）３、−ＯＳｉ（Ｒａａ）３ −Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｓ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−ＯＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）ＯＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−ＯＰ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２、−ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２、−Ｐ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（Ｒｃｃ）３、−ＯＰ（Ｒｃｃ）２、−ＯＰ（Ｒｃｃ）３、−Ｂ（Ｒａａ）２、−Ｂ（ＯＲｃｃ）２、−ＢＲａａ（ＯＲｃｃ）、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０ペルハロアルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ１−１０ヘテロアルキル基、Ｃ２−１０ヘテロアルケニル基、Ｃ２−１０ヘテロアルキニル基、Ｃ３−１４炭素環基、３〜１４員複素環基、Ｃ６−１４アリール基及び５〜１４員ヘテロアリール基を含むが、これらに限らず、その中、各アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、炭素環基、複素環基、アリール基及びヘテロアリール基は、各自独立に０、１、２、３、４または５個のＲｄｄ基団で置換された。
または炭素原子上の２個の相接する水素原子は、以下の基団で置換される。＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮ（Ｒｂｂ）２、＝ＮＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、＝ＮＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）ＯＲａａ、＝ＮＮＲｂｂＳ（＝Ｏ）２Ｒａａ、＝ＮＲｂｂまたは＝ＮＯＲｃｃである。
各Ｒａａは、独立にＣ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０ペルハロアルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ１−１０ヘテロアルキル基、Ｃ２−１０ヘテロアルケニル基、Ｃ２−１０ヘテロアルキニル基、Ｃ３−１０炭素環基、３〜１４員複素環基、Ｃ６−１４アリール基及び５〜１４員ヘテロアリール基から選ばれ、または２個のＲａａ基団を結合して１個の３〜１４員複素環基または５〜１４員ヘテロアリール基環に形成し、その中、各アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、炭素環基、複素環基、アリール基及びヘテロアリール基は、各自独立に０、１、２、３、４または５個のＲｄｄ基団で置換された。
各Ｒｂｂは、独立に水素、−ＯＨ、−ＯＲａａ、−Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｒｃｃ、−ＳＯ２ＯＲｃｃ、−ＳＯＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｃｃ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｃｃ）２、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０ペルハロアルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ１−１０ヘテロアルキル基、Ｃ２−１０ヘテロアルケニル基、Ｃ２−１０ヘテロアルキニル基、Ｃ３−１０炭素環基、３〜１４員複素環基、Ｃ６−１４アリール基及び５〜１４員ヘテロアリール基から選ばれ、または２個のＲｂｂ基団を結合して１個の３〜１４員複素環基または５〜１４員ヘテロアリール基環に形成し、その中、各アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、炭素環基、複素環基、アリール基及びヘテロアリール基は、各自独立に０、１、２、３、４または５個のＲｄｄ基団で置換された。
各Ｒｃｃは、独立に水素、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０ペルハロアルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ１−１０ヘテロアルキル基、Ｃ２−１０ヘテロアルケニル基、Ｃ２−１０ヘテロアルキニル基、Ｃ３−１０炭素環基、３〜１４員複素環基、Ｃ６−１４アリール基及び５〜１４員ヘテロアリール基から選ばれ、または２個のＲｃｃ基団を結合して１個の３〜１４員複素環基または５〜１４員ヘテロアリール基環に形成し、その中、各アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、炭素環基、複素環基、アリール基及びヘテロアリール基は、各自独立に０、１、２、３、４または５個のＲｄｄ基団で置換された。
各Ｒｄｄは、独立にハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲｅｅ、−ＯＮ（Ｒｆｆ）２、 −Ｎ（Ｒｆｆ）２、−Ｎ（Ｒｆｆ）３ ＋Ｘ−、−Ｎ（ＯＲｅｅ）Ｒｆｆ、−ＳＨ、−ＳＲｅｅ、−ＳＳＲｅｅ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒｅｅ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−ＯＣＯ２Ｒｅｅ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＮＲｆｆＣ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−ＮＲｆｆＣＯ２Ｒｅｅ、−ＮＲｆｆＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−Ｃ（＝ＮＲｆｆ）ＯＲｅｅ、−ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｒｅｅ、−ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）ＯＲｅｅ、−Ｃ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＯＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＮＲｆｆＣ（＝ＮＲｆｆ）Ｎ（Ｒｆｆ）２，−ＮＲｆｆＳＯ２Ｒｅｅ、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｆｆ）２、−ＳＯ２Ｒｅｅ、−ＳＯ２ＯＲｅｅ、−ＯＳＯ２Ｒｅｅ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒｅｅ、−Ｓｉ（Ｒｅｅ）３、−ＯＳｉ（Ｒｅｅ）３、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｆｆ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｅｅ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｅｅ、−ＳＣ（＝Ｓ）ＳＲｅｅ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒｅｅ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒｅｅ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒｅｅ）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲｅｅ）２、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６ペルハロアルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ１−６ヘテロアルキル基、Ｃ２−６ヘテロアルケニル基、Ｃ２−６ヘテロアルキニル基、Ｃ３−１０炭素環基、３〜１０員複素環基、Ｃ６−１０アリール基及び５〜１０員ヘテロアリール基から選べれ、その中、各アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、炭素環基、複素環基、アリール基及びヘテロアリール基は、各自独立に０、１、２、３、４または５個のＲｇｇ基団で置換されたか、または２個の相接するＲｄｄ基団を結合して＝Ｏまたは＝Ｓに形成することができる。
各Ｒｅｅは、独立にＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６ペルハロアルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ１−６ヘテロアルキル基、Ｃ２−６ヘテロアルケニル基、Ｃ２−６ヘテロアルキニル基、Ｃ３−１０炭素環基、３〜１０員複素環基、Ｃ６−１０アリール基及び３〜１０員ヘテロアリール基から選ばれ、その中、各アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、炭素環基、複素環基、アリール基及びヘテロアリール基は、各自独立に０、１、２、３、４または５個のＲｇｇ基団で置換された。
各Ｒｆｆは、独立に水素、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６ペルハロアルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ１−６ヘテロアルキル基、Ｃ２−６ヘテロアルケニル基、Ｃ２−６ヘテロアルキニル基、Ｃ３−１０炭素環基、３〜１０員複素環基、Ｃ６−１０アリール基及び５〜１０員ヘテロアリール基から選ばれ、または２個のＲｆｆ基団を結合して１個の３〜１４員複素環基または５〜１４員ヘテロアリール基環に形成し、その中、各アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、炭素環基、複素環基、アリール基及びヘテロアリール基は、各自独立に０、１、２、３、４または５個のＲｇｇ基団で置換された。及び。
各Ｒｇｇは、独立にハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＯＣ１−６アルキル基、−ＯＮ（Ｃ１−６アルキル基）２、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル基）２、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル基）３ ＋Ｘ−、−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル基）２ ＋Ｘ−、−ＮＨ２（Ｃ１−６アルキル基）＋Ｘ−、−ＮＨ３ ＋Ｘ−、−Ｎ（ＯＣ１−６アルキル基）（Ｃ１−６アルキル基）、−Ｎ（ＯＨ）（Ｃ１−６アルキル基）、−ＮＨ（ＯＨ）、−ＳＨ、−ＳＣ１−６アルキル基、−ＳＳ（Ｃ１−６アルキル基）、−Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−６アルキル基）、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２（Ｃ１−６アルキル基）、−ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−６アルキル基）、−ＯＣＯ２（Ｃ１−６アルキル基）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル基）２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１−６アルキル基）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１−６アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル基）Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１−６アルキル基）、−ＮＨＣＯ２（Ｃ１−６アルキル基）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル基）２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１−６アルキル基）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｏ（Ｃ１−６アルキル基）、−ＯＣ（＝ＮＨ）（Ｃ１−６アルキル基）、−ＯＣ（＝ＮＨ）ＯＣ１−６アルキル基、−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル基）２、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（Ｃ１−６アルキル基）、−Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＯＣ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル基）２、−ＯＣ（ＮＨ）ＮＨ（Ｃ１−６アルキル基）、−ＯＣ（ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（ＮＨ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル基）２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−６アルキル基）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−６アルキル基）２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−６アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２，−ＳＯ２Ｃ１−６アルキル基、−ＳＯ２ＯＣ１−６アルキル基、−ＯＳＯ２Ｃ１−６アルキル基、−ＳＯＣ１−６アルキル基、−Ｓｉ（Ｃ１−６アルキル基）３、−ＯＳｉ（Ｃ１−６アルキル基）３ −Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｃ１−６アルキル基）２、Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ（Ｃ１−６アルキル基）、Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｓ（Ｃ１−６アルキル基）、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＣ１−６アルキル基、−ＳＣ（＝Ｓ）ＳＣ１−６アルキル基、−Ｐ（＝Ｏ）２（Ｃ１−６アルキル基）、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｃ１−６アルキル基）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（Ｃ１−６アルキル基）２、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＣ１−６アルキル基）２、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６ペルハロアルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ１−６ヘテロアルキル基、Ｃ２−６ヘテロアルケニル基、Ｃ２−６ヘテロアルキニル基、Ｃ３−１０炭素環基、３〜１０員複素環基、Ｃ６−１０アリール基及び５〜１０員ヘテロアリール基から選ばれ、または２個の相接するＲｇｇ置換基を結合して＝Ｏまたは＝Ｓに形成することができ、その中、Ｘ−は対イオンである。
本文に示す「ハロゲノ基」または「ハロゲン」は、フルオロ基（−Ｆ）、クロロ基（−Ｃｌ）、ブロモ基（−Ｂｒ）またはヨード基（−Ｉ）を指す。
本文に示す「対イオン」は負電荷基団を指し、それを正電荷の第４級アミンと連結することでその電気的中性を維持する。対イオンの実例は、ハライド梨（例えば、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−）、ＮＯ３ −、ＣｌＯ４ −、ＯＨ−、Ｈ２ＰＯ４ −、ＨＳＯ４ −、スルホン酸イオン（例えば、メタンスルホネート、トリフルオロメタンスルホネート、ｐ−トシレート、ベンゼンスルホネート、１０−カンファースルホネート、ナフタレン−２−スルホネート、ナフタレン−１−スルホン酸−５−スルホネート、エタン−１−スルホン酸−２−スルホネート及びその類似物）及びカルボン酸イオン（例えば、エタン酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、安息香酸塩、グリセリン酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩及びその類似物）を含む。
本文に示す「カルボニル基」は一基団を指し、その中、親分子に直接に連結する炭素はｓｐ２ハイブリダイズド（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）であり、かつ酸素、窒素またはチオ原子で置換され、例えばケトン類（−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ）、カルボン酸類（−ＣＯ２Ｈ）、アルデヒド類（−ＣＨＯ）、エステル類（−ＣＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲａａ）、アミド類（−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｂｂ）２）及びイミン類（−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ）、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２）から選ばれる基団であり、その中、Ｒａａ及びＲｂｂは本文に定義されるものである。
本文に示す「アジド」又は「アジド基」は−Ｎ３基団を指す。
本文に示す「チオール」または「チオ」は−ＳＨ基団を指す。「置換されたチオール」または「置換されたチオ」をチオ基団として意味拡張し、その中、親分子上に直接に付着するチオ原子は置換され（但し置換基は水素ではない）、かつ−ＳＲａａ、−Ｓ＝ＳＲｃｃ、−ＳＣ（＝Ｓ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−ＳＣ（＝Ｏ）ＯＲａａ及び−ＳＣ（＝Ｏ）Ｒａａから選ばれる基団を含み、その中、Ｒａａ及びＲｃｃは本文に定義されるものである。
本文に示す「アミノ」または「アミン」は−ＮＨ２基団を指す。「置換された」アミノまたはアミンを単一置換のアミン基、双置換のアミン基または三置換のアミン基として意味拡張する。幾らかの特定の実例中に、「置換されたアミン基」は、単一置換のアミン基または双置換のアミン基基団である。
本文に示す「単一置換されたアミン基」または「単一置換されたアミノ基」はアミン基基団を指し、その中、親分子上に直接に付着する窒素原子は１個の水素原子及び１個の非水素の基団で置換され、それは−ＮＨ（Ｒｂｂ）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＮＨＣＯ２Ｒａａ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＮＨＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＮＨＳＯ２Ｒａａ、−ＮＨＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２及び−ＮＨＰ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２から選ばれる基団を含み、その中、Ｒａａ、Ｒｂｂ及びＲｃｃは本文に定義されるものであり、かつその中、−ＮＨ（Ｒｂｂ）基団のＲｂｂ部分は水素ではない。
本文に示す「双置換されたアミン基」はアミン基基団を指し、その中、親分子上に直接に付着する窒素原子は２個の非水素の基団で置換され、それは−Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＮＲｂｂ Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＮＲｂｂＣＯ２Ｒａａ、−ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＮＲｂｂＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、−ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２及び−ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２から選ばれる基団を含み、その中、Ｒａａ、Ｒｂｂ及びＲｃｃは本文に定義されるものであり、その制限条件は、親分子上に直接に付着する前記窒素原子は、水素で置換されないことである。
本文に示す「三置換されたアミン基」はアミン基基団を指し、その中、親分子上に直接に付着する窒素原子は３個の基団で置換され、それは−Ｎ（Ｒｂｂ）３及び−Ｎ（Ｒｂｂ）３ ＋Ｘ−から選ばれる基団を含み、その中、Ｒｂｂ及びＸ−は本文に定義されるものである。
本文に示す「ビオチン」は、例えばＲ１Ａ基団であり、それは以下の構造を含み：
Figure 2021168693
本文に示す「セラミド」は、例えばＲ１Ａ基団であり、それは以下の構造を含み：
Figure 2021168693
その中、Ｒ’は、必要に応じて置換されたＣ６−Ｃ３０アルキル基（例えばＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９またはＣ３０アルキル基）、必要に応じて置換されたＣ６−Ｃ３０アルケニル基（例えばＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９またはＣ３０アルケニル基）または必要に応じて置換されたＣ６−Ｃ３０アルキニル基（例えばＣ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９、Ｃ２０、Ｃ２１、Ｃ２２、Ｃ２３、Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、Ｃ２９またはＣ３０アルキニル基）基団である。
価数を許容する下、窒素原子は置換または未置換されてもよく、かつそれは第１級、第２級、第３級及び第４級の窒素原子を含む。窒素原子置換基の実例は、水素、−ＯＨ、−ＯＲａａ、 −Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｒｃｃ、−ＳＯ２ＯＲｃｃ、−ＳＯＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｃｃ、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｃｃ）２、Ｃ１−１０アルキル基、Ｃ１−１０ペルハロアルキル基、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ１−１０ヘテロアルキル基、Ｃ２−１０ヘテロアルケニル基、Ｃ２−１０ヘテロアルキニル基、Ｃ３−１０炭素環基、３〜１４員複素環基、Ｃ６−１４アリール基及び５〜１４員ヘテロアリール基を含むが、これらに限らず、または２個のＲｃｃ基団を結合して１個の３〜１４員複素環基または５〜１４員ヘテロアリール基環に形成し、その中、各アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、炭素環基、複素環基、アリール基及びヘテロアリール基は、各自独立に０、１、２、３、４または５個のＲｄｄ基団で置換され、かつその中、Ｒａａ、Ｒｂｂ、Ｒｃｃ及びＲｄｄは本文に定義されるものである。
幾らかの特定の実例中に、窒素原子上に位置する置換基は窒素保護基団（本文中にアミン基保護基団とも称する）である。窒素保護基団は、−ＯＨ、−ＯＲａａ、 −Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＣＯ２Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、−ＳＯ２Ｒｃｃ、−ＳＯ２ＯＲｃｃ、−ＳＯＲａａ、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｃｃ、Ｃ１−１０アルキル基（例えば、芳アルキル基またはヘテロ芳香アルキル基）、Ｃ２−１０アルケニル基、Ｃ２−１０アルキニル基、Ｃ１−１０ヘテロアルキル基、Ｃ２−１０ヘテロアルケニル基、Ｃ２−１０ヘテロアルキニル基、Ｃ３−１０炭素環基、３−１４員複素環基、Ｃ６−１４アリール基及び５−１４員ヘテロアリール基を含むが、これらに限らず、その中、各アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、ヘテロアルケニル基、ヘテロアルキニル基、炭素環基、複素環基、アリール基及びヘテロアリール基は、各自独立に０、１、２、３、４または５個のＲｄｄ基団で置換され、かつその中、Ｒａａ、Ｒｂｂ、Ｒｃｃ及びＲｄｄは本文に定義されるものである。窒素保護基団は、当該技術を熟練する者が熟知しており、かつＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓに掲示され、その詳細も参考のため本文中に併記する。
例えば、窒素保護基団は、例えばアミド基団（如−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ）であり、それはホルムアミド、アセトアミド、クロロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、トリフルオロアセトアミド、ベンゼンアセトアミド、３−フェニルプロパンアミド、ピコリンアミド（ｐｉｃｏｌｉｎａｍｉｄｅ）、３−ピリジンカルボアミド、Ｎ−ベンゾイルフェニルアラニン誘導体、ベンゼンホルムアミド、ｐ−ベンゾイルアニリン、ｏ−ニトロベンゼンアセトアミド、ｏ−ニトロフェノキシアセトアミド、アセチルアセトアミド、（Ｎ’−ジチオベンジルオキシアミンアシル）アセトアミド、３−（ｐ−ヒドロキシフェニル）プロピオンアミド、３−（ｏ−ニトロフェニル）プロピオンアミド、２−メチル−２−（ｏ−ニトロフェノキシ）プロピオンアミド、２−メチル−２−（ｏ−フェニルアゾフェノキシ）プロピオンアミド、４−クロロブチルアミド、３−メチル−３−ニトロブチルアミド、ｏ−ニトロシンナムアミド、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、ｏ−ニトロベンゼンホルムアミド及びｏ−（ベンゾイルオキシメチル）ベンゼンホルムアミドを含む（但しこれらに限らない）。
窒素保護基団は、例えばカルバメート基団（例えば−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａａ）であり、それはカルバミン酸メチルエステル、カルバミン酸エチルエステル、９−フルオレニルメチルカルバメート（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ ｃａｒｂａｍａｔｅ；（Ｆｍｏｃ））、９−（２−スルホ）フルオレニルメチルカルバメート、９−（２，７−ジブロモ）フルオレニルメチルカルバメート、２，７−二−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキシド−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオキサンチル）］メチルカルバメート（ＤＢＤ−Ｔｍｏｃ）、４−メトキシルフェナシルカルバメート（Ｐｈｅｎｏｃ）、２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（Ｔｒｏｃ）、２−トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、２−フェニルエチルカルバメート（ｈＺ）、１−（１−アダマンチル）−１−メチルエチルカルバメート（Ａｄｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−ハロエチルカルバメート、１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエチルカルバメート（ＤＢ−ｔ−ＢＯＣ）、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルカルバメート（ＴＣＢＯＣ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エチルカルバメート（Ｂｐｏｃ）、１−（３，５−ジ−ｔ−ブチルフェニル）−１−メチルエチルカルバメート（ｔ−Ｂｕｍｅｏｃ）、２−（２’−４’−ピリジル）エチルカルバメート（Ｐｙｏｃ）、２−（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボキサミド）エチルカルバメート、ｔ−ブチルカルバメート（ＢＯＣ）、１−アダマンチルカルバメート（Ａｄｏｃ）、ビニルカルバメート（Ｖｏｃ）、アリルカルバメート（Ａｌｌｏｃ）、１−イソプロピルアリルカルバメート（Ｉｐａｏｃ）、シンナミルカルバメート（Ｃｏｃ）、４−ニトロシンナミルカルバメート（Ｎｏｃ）、８−キノリルカルバメート、Ｎ−ヒドロキシピペリジニルカルバメート、アルキルジチオカルバメート、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）、ｐ−メトキシベンジルカルバメート（Ｍｏｚ）、ｐ−ニトロベンジルカルバメート、ｐ−ブロモベンジルカルバメート、ｐ−クロロベンジルカルバメート、２，４−ジクロロベンジルカルバメート、４−メチルスルフィニルベンジルカルバメート（Ｍｓｚ）、９−アントリルメチルカルバメート、ジフェニルメチルカルバメート、２−メチルチオエチルカルバメート、２−メチルスルホニルエチルカルバメート、２−（ｐ−トルエンスルホニル）エチルカルバメート、［２−（１，３−ジチアニル）］メチルカルバメート（Ｄｍｏｃ）、４−メチルチオフェニルカルバメート（Ｍｔｐｃ）、２，４−ジメチルチオフェニルカルバメート（Ｂｍｐｃ）、２−ホスホニオエチルカルバメート（Ｐｅｏｃ）、２−トリフェニルホスホニオイソプロピルカルバメート（Ｐｐｏｃ）、１，１−ジメチル−２−シアノエチルカルバメート、ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジルカルバメート、ｐ−（ジヒドロキシボリル）ベンジルカルバメート、５−ベンズイソオキサゾリルメチルカルバメート、２−（トリフルオロメチル）−６−クロモニルメチルカルバメート（Ｔｃｒｏｃ）、ｍ−ニトロフェニルカルバメート、３，５−ジメトキシベンジルカルバメート、ｏ−ニトロベンジルカルバメート、３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジルカルバメート、フェニル（ｏ−ニトロフェニル）メチルカルバメート、ｔ−ペンチルカルバメート、Ｓ−ベンジルチオカルバメート、ｐ−シアノベンジルカルバメート、シクロブチルカルバメート、シクロヘキシルカルバメート、シクロペンチルカルバメート、シクロプロピルメチルカルバメート、ｐ−デシルオキシベンジルカルバメート、２，２−ジメトキシカルボニルビニルカルバメート、ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）ベンジルカルバメート、１，１−ジメチル−３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド）プロピルカルバメート、１，１−ジメチルプロピニルカルバメート、ジ（２−ピリジル）メチルカルバメート、２−フラニルメチルカルバメート、２−ヨードエチルカルバメート、イソボルニルカルバメート、イソブチルカルバメート、イソニコチニルカルバメート、ｐ−（ｐ’−メトキシフェニルアゾ）ベンジルカルバメート、１−メチルシクロブチルカルバメート、１−メチルシクロヘキシルカルバメート、１−メチル−１−シクロプロピルメチルカルバメート、１−メチル−１−（３，５−ジメトキシフェニル）エチルカルバメート、１−メチル−１−（ｐ−フェニルアゾフェニル）エチル カルバメート、１−メチル−１−フェニルエチル カルバメート、１−メチル−１−（４−ピリジル）エチルカルバメート、フェニルカルバメート、ｐ−（フェニルアゾ）ベンジルカルバメート、２，４，６−トリ−ｔ−ブチルフェニルカルバメート、４−（トリメチルアンモニウム）ベンジルカルバメート及び２，４，６−トリメチルベンジルカルバメートを含む（但しこれらに限らない）。
窒素保護基団は、例えばスルホンアミド基団（例えば−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒａａ）であり、それはｐ−トルエンスルホンアミド（Ｔｓ）、ベンゼンスルフェンアミド、２，３，６，−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルフェンアミド（Ｍｔｒ）、２，４，６−トリメトキシベンゼンスルフェンアミド（Ｍｔｂ）、２，６−ジメチル−４−メトキシベンゼンスルフェンアミド（Ｐｍｅ）、２，３，５，６−テトラメチル−４−メトキシベンゼンスルフェンアミド（Ｍｔｅ）、４−メトキシベンゼンスルフェンアミド（Ｍｂｓ）、２，４，６−トリメチルベンゼンスルフェンアミド（Ｍｔｓ）、２，６−ジメトキシ−４−メチルベンゼンスルフェンアミド（ｉＭｄｓ）、２，２，５，７，８−ペンタメチル・基−６−スルホンアミド（Ｐｍｃ）、メタンスルホンアミド（Ｍｓ）、β−トリメチルシリルエタンスルホンアミド（ＳＥＳ）、９−アントラセンスルホンアミド、４−（４’，８’−ジメトキシナフチルメチル）ベンゼンスルフェンアミド（ＤＮＭＢＳ）、ベンジルスルホンアミド、トリフルオロメチルスルホンアミド、及びフェナシルスルホンアミドを含む（但しこれらに限らない）。
他の窒素保護基団は、フェノチアジニル基−（１０）−カルボニル誘導体、Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニルアミノカルボニル誘導体、Ｎ’−フェニルアミノチオカルボニル誘導体、Ｎ−ベンゾイルフェニルプロピオンアミド誘導体、Ｎ−アセチルメチオニン誘導体、４，５−ジフェニル−３−オキサゾリン−２−オン、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ジチアスクシンイミド（Ｄｔｓ）、Ｎ−２，３−ジフェニルマレイミド、Ｎ−２，５−ジメチルピロール、Ｎ−１，１，４，４−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加物（ＳＴＡＢＡＳＥ）、５−置換１，３−ジメチル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、５−置換 １，３−ジベンジル−１，３，５−トリアザシクロヘキサン−２−オン、１−置換３，５−ジニトロ−４−ピリドン、Ｎ−メチルアミン、Ｎ−アリルアミン、Ｎ−［２−（トリメチルシリル）エトキシ］メチルアミン（ＳＥＭ）、Ｎ−３−アセトキシプロピルアミン、Ｎ−（１−イソプロピル−４−ニトロ−２−オキソ−３−ピロリン−３−イル）アミン、第４級アンモニウム塩類、Ｎ−ベンジルアミン、Ｎ−ジ（４−メトキシフェニル）メチルアミン、Ｎ−５−ジベンゾスベリルアミン、Ｎ−トリフェニルメチルアミン（Ｔｒ）、Ｎ−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミン（ＭＭＴｒ）、Ｎ−９−フェニルフルオレニルアミン（ＰｈＦ）、Ｎ−２，７−ジクロロ−９−フルオレニルメチレンアミン、Ｎ−フェロセニルメチルアミン（Ｆｃｍ）、Ｎ−２−ピコリルアミノＮ’−オキシド、Ｎ−１，１−ジメチルチオメチレンアミン、Ｎ−ベンジリデンアミン（ｉｄｅｎｅａｍｉｎｅ）、Ｎ−ｐ−メトキシベンジリデンアミン、Ｎ−ジフェニルメチレンアミン、Ｎ−［（２−ピリジル）メシチル］メチレンアミン、Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメチレン）アミン、Ｎ，Ｎ’−イソプロピリデンジアミン、Ｎ−ｐ−ニトロベンジリデンアミン、Ｎ−サリチリデンアミン、Ｎ−５−クロロサリチリデンアミン、Ｎ−（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）フェニルメチレンアミン、Ｎ−シクロヘキシリデンアミン、Ｎ−（５，５−ジメチル−３−オキソ−１−シクロヘキセニル）アミン、Ｎ−ボラン誘導体、Ｎ−ジフェニルボリニック酸誘導体、Ｎ−［フェニル（ペンタカルボニルクロム−またはタングステン）カルボニル］アミン、Ｎ−銅キレート、Ｎ−亜鉛キレート、Ｎ−ニトロアミン、Ｎ−ニトロソアミン、アミンＮ−オキシド、ジフェニルホスフィンアミド（Ｄｐｐ）、ジメチルチオホスフィンアミド（Ｍｐｔ）、ジフェニルチオホスフィンアミド（Ｐｐｔ）、ジアルキルホスホロアミダート、ジベンジルホスホロアミダート、ジフェニルホスホロアミダート、ベンゼンスルフェンアミド、ｏ−ニトロベンゼンスルフェンアミド（Ｎｐｓ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェンアミド、ペンタクロロベンゼンスルフェンアミド、２−ニトロ−４−メトキシルベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド及び３−ニトロピリジンスルフェンアミド（Ｎｐｙｓ）を含む（但しこれらに限らない）。
幾らかの特定の実例に、酸素原子上に位置する置換基は酸素保護基団（本文中にヒドロキシ基保護基団とも称する）である。酸素保護基団は、−Ｒａａ、−Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＣＯ２Ｒａａ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、−ＳＯ２Ｒａａ、−Ｓｉ（Ｒａａ）３、−Ｐ（Ｒｃｃ）２、−Ｐ（Ｒｃｃ）３、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｒａａ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、−Ｐ（＝Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）２及び−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＲｂｂ）２を含むが、これらに限らず、その中、Ｒａａ、Ｒｂ、及びＲｃｃは本文に定義されるものである。酸素保護基団は、当該技術を熟練する者が熟知しており、かつＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ， ３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓに掲示され、その詳細も参考のため本文中に併記する。
酸素保護基団の実例は、メチル、メトキシルメチル（ＭＯＭ）、メチルチオメチル（ＭＴＭ）、ｔ−ブチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシルメチル（ＳＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、（４−メトキシフェノキシ）メチル（ｐ−ＡＯＭ）、グアイアコールメチル（ＧＵＭ）、ｔ−ブトキシメチル、４−ペンテニルオキシメチル（ＰＯＭ）、シロキシメチル、２−メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、２，２，２−トリクロロエトキシメチル基、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭＯＲ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、３−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１−メトキシシクロヘキシル、４−メトキシテトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ）、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ−ジオキシド、１−［（２−クロロ−４−メチル）フェニル］−４−メトキシピペリジン−４−イル（ＣＴＭＰ）、１，４−ジオキサン−２−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ−オクタヒドロ−７，８，８−トリメチル−４，７−メタノベンゾフラン−２−イル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシエチル、１−メチル−１−ベンジルオキシ−２−フルオロエチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−（フェニルセレニル）エチル、ｔ−ブチル、アリル、ｐ−クロロフェニル、ｐ−メトキシフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル（Ｂｎ）、ｐ−メトキシベンジル、３，４−ジメトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ｐ−シアノベンジル、ｐ−フェニルベンジル、２−ピコリル、４−ピコリル、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’−ジニトロベンズヒドリル、５−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチル、４−（４’−ブロモモフェナシルオキシフェニル）ジフェニルメチル、４，４′，４”−トリス（４，５−ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４′，４”−トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４′，４”−トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３−（イミダゾール−１−イル）ビス（４′，４”−ジメトキシフェニル）メチル、１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１′−ピレニルメチル、９−アントリル、９−（９−フェニル）キサンテニル基、９−（９−フェニル−１０−オキソ）アントリル、１，３−ベンゾジチオラン−２−イル、ベンズイソチアゾリルＳ，Ｓ−ジオキシド、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ジメチルイソプロピルシリル（ＩＰＤＭＳ）、ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ）、ジメチルセキシルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ）、ｔ−ブチルメトキシフェニルシリル（ＴＢＭＰＳ）、ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、３−フェニルプロピオネート、４−オキソペンタノエート（レブリネート）、４，４−（エチレンジチオ）ペンタノエート（レブリノイルジチオアセタール）、ピバロエート（ｐｉｖａｌｏａｔｅ）、アダマントエート、クロトネート（ｃｒｏｔｏｎａｔｅ）、４−メトキシルクロトネート、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、２，４，６−トリメチルベンゾエート（ｍｅｓｉｔｏａｔｅ）、アルキルメチルカーボネート、９−フルオレニルメチルカーボネート（Ｆｍｏｃ）、アルキルエチルカーボネート、アルキル２，２，２−トリクロロエチルカーボネート（Ｔｒｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エチルカーボネート（ＴＭＳＥＣ）、２−（フェニルスルホニル）エチルカーボネート（Ｐｓｅｃ）、２−（トリフェニルホスホニオ）エチルカーボネート（Ｐｅｏｃ）、アルキルイソブチルカーボネート、アルキルビニルカーボネート、アルキルアリルカーボネート、アルキルｐ−ニトロフェニルカーボネート、アルキルベンジルカーボネート、アルキルｐ−メトキシベンジルカーボネート、アルキル３，４−ジメトキシベンジルカーボネート、アルキルｏ−ニトロベンジルカーボネート、アルキルｐ−ニトロベンジルカーボネート、アルキルＳ−ベンジルオカーボネート、４−エトキシ−１−ナフチルカーボネート、メチル ジチオカーボネート、２−ヨードベンゾエート、４−アジドブチレート、４−ニトロ−４−メチルペンタノエート、ｏ−（ジブロモメチル）ベンゾエート、２−ホルミルベンゼンスルホネート、２−（メチルチオメトキシ）エチル、４−（メチルチオメトキシ）ブチレート、２−（メチルチオメトキシメチル）ベンゾエート、２，６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテート、２，６−ジクロロ−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシアセテート、２，４−ビス（１，１−ジメチルプロピル）フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、イソブチレート、モノスクシノエート、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノエート、ｏ−（メトキシカルボニル）ベンゾエート、α−ナフトエート、ニトレート、アルキル Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルホスホロジアミダート、アルキルＮ−フェニルカルバメート、ボレート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル２，４−ジニトロフェニルスルフェネート、サルフェート、メタンスルホネート（メシレート）、ベンジルスルホネート及びトシレート（Ｔｓ）を含むが、これらに限らず、
置換基の他の実例は、本文の発明説明、実施例及び特許請求の範囲にさらに詳細に掲示される。上記で例示された置換基でいかなる方式で本発明の範疇を制限するべきではない。
本文に示す「塩」は、いかなる及び全ての塩類を指す。
本文に示す「医薬学的に容認される塩」は、良好な医薬学的評価下、過度の毒性、刺激性、過敏反応及類似する反応を伴わずにヒト及び下等動物の組織と接触させて用いるのに適し、かつ合理的なベネフィット／リスク比に相称性のある塩類を指す。医薬学的に容認される塩は、例えばＢｅｒｇｅ氏ら， ｄｅｓｃｒｉｂｅｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｓａｌｔｓ ｉｎ ｄｅｔａｉｌ ｉｎ Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７） ６６：１−１９といった既知の技術の範疇に属する。本発明の化合物による医薬学的に容認される塩は、好適な無機及び有機酸及びアルカリなどから誘導されるものを含む。医薬学的に容認される塩の実例は無毒の酸付加塩を含み、それは例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸及び過塩素酸などの無機酸、または例えばエタン酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸またはマロン酸などの有機酸、もしくは既知の技術における他の方法、例えばイオン交換法を利用することによって形成したアミン基基団の塩である。他の医薬学的に容認される塩は、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、亜硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩及びその類似物を含む。好適なアルカリから誘導された医薬学的に容認される塩は、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム及びＮ＋（Ｃ１〜４アルキル基）４塩類を含む。代表的なアルカリ金属またはアルカリ土類金属は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム及びその類似物を含む。適切な状況下、医薬学的に容認される塩は、さらに無毒性のアンモニウム、第４級アンモニウム及びアミン陽イオンを含み、それは、例えばハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、亜硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩及びアリールスルホン酸塩の対イオンを使用して形成されるものである。
末端アリル基Ｇｂ３、Ｇｂ４、Ｇｂ５、Ｇｌｏｂｏ Ｈ及びＳＳＥＡ４を示す化学構造式である。 ヌクレオチド糖再生と組み合わせたグリコシル化反応およびＴＬＣによって観察した合成結果を示す。Ａ：アリル基−Ｇｂ３合成のためのガラクトース化反応とＵＤＰ−Ｇａｌ再生との組み合わせ。 ヌクレオチド糖再生と組み合わせたグリコシル化反応およびＴＬＣによって観察した合成結果を示す。Ｂ：アリル基−Ｇｂ４合成のためのアセチルガラクトサミン化反応とＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生との組み合わせ。 ヌクレオチド糖再生と組み合わせたグリコシル化反応およびＴＬＣによって観察した合成結果を示す。Ｃ：アリル基−Ｇｂ５合成のためのガラクトース化反応とＵＤＰ−Ｇａｌ再生との組み合わせ。 ヌクレオチド糖再生と組み合わせたグリコシル化反応およびＴＬＣによって観察した合成結果を示す。Ｄ：アリル基−Ｇｌｏｂｏ Ｈ合成のためのフコース化反応とＧＤＰ−Ｆｕｃ再生との組み合わせ。 ヌクレオチド糖再生と組み合わせたグリコシル化反応およびＴＬＣによって観察した合成結果を示す。Ｅ：アリル基−ＳＳＥＡ４合成のためのシアル酸反応とＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生との組み合わせ。 グリコスフィンゴリピドの生物合成ルートを示し、それはガラクトース残基の付加に係り、本発明に係るガラクトース転移酵素の組合せとＵＤＰ−Ｇａｌ再生方法を経由して触媒化し得る。 ヌクレオチド糖再生システムを利用し、酵素的な合成方法でＬａｃ→Ｇｂ３→Ｇｂ４→Ｇｂ５ルートを経由してＧｌｏｂｏ Ｈを準備することを示す。 ヌクレオチド糖再生システムを利用し、酵素的な合成方法でＬａｃ→Ｇｂ３→Ｇｂ４→Ｇｂ５ルートを経由してＳＳＥＡ４を準備することを示す。 ヌクレオチド糖再生システムを利用し、酵素的な合成方法でアリル基−Ｌａｃ→アリル基−Ｇｂ３→アリル基−Ｇｂ４→アリル基−Ｇｂ５ルートを経由してアリル基−Ｇｌｏｂｏ Ｈを準備することを示す。 ヌクレオチド糖再生システムを利用し、酵素的な合成方法でアリル基−Ｌａｃ→アリル基−Ｇｂ３→アリル基−Ｇｂ４→アリル基−Ｇｂ５ルートを経由してアリル基−ＳＳＥＡ４を準備することを示す。 生化学合成過程中に得られる高純度の中間物のアリル基−Ｇｂ３、アリル基−Ｇｂ４及びアリル基−Ｇｂ５を示す。 未修飾及び修飾されたＦｕｔＣを利用し、生化学合成を経由して高純度のアリル基−Ｇｌｏｂｏ Ｈを得ることを示す。 ＪＴ−ＦＡＪ−１６を利用し、生化学合成を経由して高純度のアリル基−ＳＳＥＡ４を得ることを示す。
以下は、新規なヌクレオチド糖再生方法、及びそれを好適な糖基転移酵素の反応により、糖基を好適な受容体に添加する方法に関する。本発明が採る手段は、中間物を純化する必要がない場合、即ち、鎖反応で例えばＧｂ３、Ｇｂ４、Ｇｂ５、Ｇｌｏｂｏ Ｈ及びＳＳＥＡ４などのオリゴ糖のようなグリコシル化分子を合成することを許容し、これにより迅速かつ大量にグリコシル化産物を生成する。なお、本発明の方法は、大規模に所望のオリゴ糖及び複合糖質（ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）の準備に用いられる。
ＵＤＰ−Ｇａｌ再生システム及びそのガラクトース化の用途
ＵＤＰ−Ｇａｌ再生システムは図２Ａに例示され、かつ係る酵素は下記表１に示されるように：
Figure 2021168693
Figure 2021168693
本文に定義されるようなＵＤＰ−Ｇａｌ再生システムに用いられる酵素は野生型酵素であってもよい。本文に示す野生型酵素は、好適な生物種に見出され、自然に存在する酵素である。幾らかの特定の実例中に、ＧａｌＫ、ＵＳＰ、ＰｙｋＦ及びＰＰＡ酵素は、それぞれ大腸桿菌、シロイヌナズナ、大腸桿菌及び大腸桿菌に見出される。これらの生物種から由来する酵素の実例は、既に表１に見られる。その他は、当該技術を熟練する者により確定できるものであり、例えば公開の遺伝子データベースを検索し、例えばＧｅｎＢａｎｋがある。本発明の他の実例によれば、酵素は上記酵素の相同物（ｈｏｍｏｌｏｇｓ）であってもよく、それは当該技術を熟練する者が既知される範囲でもある。例えば、これらの相同物は、一実例の酵素のアミノ酸配列または符号化ヌクレオチド配列を検索索引として遺伝子プールと相互比較して得られる。
一方、係るＵＤＰ−Ｇａｌ再生システムの酵素は、対応野生型の機能性変異体であってもよい。本文に示す対応野生型の機能性変異体では、対応野生型と同じの酵素活性を有し、かつ基本的に前記対応野生型とは高度なアミノ酸配列相似性を有し、例えば少なくとも対応野生型と８０％、８５％、９０％、９５または９８％のアミノ酸配列同一性を有する。両アミノ酸配列の「同一性パーセント」は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌの演算方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４−６８， １９９０）を利用して獲得され、またはＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌの修飾した演算方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−７７， １９９３）を利用して獲得される。この種の演算方法は既にＮＢＬＡＳＴ 及びＸＢＬＡＳＴ プログラム（２．０版）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，氏ら Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−１０， １９９０）に併合された。ＸＢＬＡＳＴプログラム（ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３）を使用してＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことにより、所望のアミノ酸配列の類似物が獲得される。２個の配列の間に分断がある場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌ氏ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５（１７）：３３８９−３４０２， １９９７）が掲示されたＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを使用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを使用する時に、個別プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＮＢＬＡＳＴ）が提供するプリセットパラメータを使用することができる。
機能性変異体は多種の突然変異を有し、それは１つまたは多数個のアミノ酸残基の埋め込み、削除または置き換えを含む。前記変異体の突然変異は、通常、野生型酵素の活性に対して決定的な影響力を与えない部位に位置し、即ち、機能性領域では突然変異を生じないか、または保守アミノ酸の置換しか含まない。当該技術を熟練する者の理解のように、リポ酸リガーゼ突然変異体に対して保守アミノ酸置換を行って効果相当の変異体が獲得され、即ち、これらの変異体は、前記特定のリポ酸リガーゼの突然変異体の効果を保有する。本文に示す「保守アミノ酸置換」は、アミノ酸置換で前記タンパク質の相対電荷またはその大きさ特徴を変化させないことを指す。当該技術を熟練する者であれば、既知の方法を利用してポリペプチド配列を変更することで変異体を準備することができ、それらの準備方法は以下の文献が参照される：例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， 氏ら， ｅｄｓ．， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ，氏ら， ｅｄｓ．， Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。アミノ酸の保守的な置換は、以下のアミノ酸の間の置換を含む：（ａ） Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ） Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ） Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ） Ａ、Ｇ；（ｅ） Ｓ、Ｔ；（ｆ） Ｑ、Ｎ及び（ｇ） Ｅ、Ｄ。
いかなる係るＵＤＰ−Ｇａｌ再生システムの酵素は、いずれも一般的な技術で作製される。本発明の実例によれば、酵素は自然資源から分離される。本発明の他の実例によれば、酵素は一般的な再編成技術で作製される。必要であれば、標的酵素のコード配列は、その宿主細胞に基づいて最適化した符号化調整を行う。例えば、大腸桿菌細胞を宿主として酵素を準備する時に、前記酵素の遺伝子を符号化して修飾されれば、それに含まれる暗号を大腸桿菌細胞中に適用させるようにする。
図２Ａに示すように、ＵＤＰ−Ｇａｌ再生システムは、ガラクトース化反応と共役し、ガラクトース転移酵素の活性により、ガラクトース残基を好適な基質上に添加する。ガラクトース転移酵素の実例は表２に例示される。
Figure 2021168693
Figure 2021168693
前述のような野生型ガラクトース転移酵素及び機能性変異体は、いずれも本願説明の範疇に属する。前記ガラクトース転移酵素は一般的な方法で作製される。
ＵＤＰ−Ｇａｌ再生システムを１つまたは多種のガラクトース転移酵素との組合せは、高収率で、ガラクトース残基を好適な基質（受容体）に添加するために使用できる。ガラクトース転移酵素に用いられる基質は、当業者が熟知している（上記表２に示すものを参照）。好ましくは、前記基質は、１個の末端糖残基（例えば、Ｇａｌ、ＧａｌＮＡｃまたはＧｌｃＮＡｃ）を有するので、ガラクトース残基をその上に添加することができる。幾らかの実例中に、前記基質は、多糖（５０個よりも多い単糖ユニットを有する）、オリゴ糖（２〜５０個の単糖ユニットを有する）、糖タンパクまたは糖ポリペプチドまたは糖脂質である。本文に述べるガラクトース化方法に用いられるガラクトース転移酵素の形式は、所望の最終産物及び前記最終産物を合成する基質によって定められ、それは当業者が熟知している範疇である。本文に述べるＵＤＰ−Ｇａｌ再生システム／ガラクトース転移酵素の組合せに関する手段は、の合成に用いられる。実例は図３に例示される。
他の実例中に、これらのＵＤＰ−Ｇａｌ再生システム／ガラクトース転移酵素の組合せの手段は、Ｇｌｏｂｏ系列オリゴ糖を合成するために用いられ、例えばラクトースから Ｇｂ３を合成し、またはＧｂ４からＧｂ５を合成する。図２Ａ及び２Ｃが参照される。以下の説明も参照される。
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生システム及びそのＮ−アセチルガラクトサミン化の用途
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生システムをＮ−アセチルガラクトサミン転移酵素（ＧａｌＮＡｃＴ）（例えばβ−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素）と合併使用することができ、好適な受容体上にＧａｌＮＡｃ残基を付加する。
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生システムに係る酵素の例は表３に示されるように：
Figure 2021168693
Figure 2021168693
Ｎ−エチレンガラクトサミン転移酵素（例えば、β−１，３−ＧａｌＮＡｃＴまたはβ−１，４−ＧａｌＮＡｃＴ）は、触媒化反応の酵素に用いられ、前記反応は、例えばペプチドまたはオリゴ糖のようなＧａｌＮＡｃ残基を好適な受容体に添加する。実例は、ヘモフィルス・インフルエンザ桿菌（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． Ｌ４２０２３．１．）から由来するＬｇｔＤを含む。他の実例は、ボレリア・ガリニ（Ｂ． ｇａｒｉｎｉｉ）（例えばＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＥＷ６８９０５）のＬｇｔＤ、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎ． ｌａｃｔａｍｉｃａ）（例えばＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＡＮ０８５１２）のＬｇｔＤ及びリケッチア・フェリス（Ｒ． ｆｅｌｉｓ）（例えばＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．
ＹＰ＿２４６７０２）のＬｇｔＤを含むが、これらに限らない。
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生システム／ＧａｌＮＡｃＴの組合せの手段中に用いられるいかなる酵素は、本文に述べるような野生型酵素またはその機能性変異体であってもよい。いかなる伝統的な方法はこれらの酵素の準備に用いることができる。本発明の一実例によれば、前記手段はＧｂ３からＧｂ４を合成するために用いられ、図２Ｂが参照される。
ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生システム及びそのフコース化の用途
ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生システムをフコース転移酵素（例えば、α−１，２−フコース転移酵素、α−１，３−フコース転移酵素またはα−２，６−フコース転移酵素）と合併使用することができ、フコース残基を好適な受容体（例えばオリゴ糖）に添加し、前記受容体を例えば脂肪またはポリペプチドのような別の分子に共役することができる。
ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生システムに係る酵素の例は表４に示されるように：
Figure 2021168693
フコース転移酵素は、ＧＤＰ−フコース（グアノシン二リン酸塩−フコース）から由来する供与体基質のＬ−フコースを好適な受容体に転移することができ、前記受容体は別の糖であってもよい。Ｎ−連結糖化反応において、フコース転移酵素は、フコース残基を核心のＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）糖に添加することができ、またはＯ−連結糖化反応において、前記フコースをタンパク質に添加する。フコース転移酵素は、α−１，３−フコース転移酵素、α−１，２−フコース転移酵素及びα−１，６−フコース転移酵素を含む。本発明の実例によれば、大腸桿菌（例えばＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． Ｕ０００９６．２）から由来するα−１，２−フコース転移酵素、バクテロイデス・フラジリス（例えばＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＹＰ＿２１３４０４）から由来するα−１，３−フコース転移酵素及びツメガエル（Ｘ． ｌａｅｖｉｓ）（例えばＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＮＰ＿００１０８３６６４）から由来するα−１，６−フコース転移酵素を含む。ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生システム／ＦｕｃＴの組合せの手段中に使用されるいかなる酵素は、本文に述べるような野生型酵素またはその機能性変異体であってもよい。これらの酵素は伝統的な方法で準備することができる。本発明の実例によれば、前記手段はＧｂ３からＧｂ４を合成するために用いられ、図２Ｄが参照される。
ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生システム及びそのシアル酸化（Ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）の用途
ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生システムｗｐシアル酸転移酵素（例えばα−２，３−シアル酸転移酵素）と組合せることができることで、シアル酸残基（Ｎｅｕ５Ａｃ）を好適な受容体基質（例えばオリゴ糖）にかえる。
ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生システムに係る酵素は表５に例示され：
Figure 2021168693
Figure 2021168693
シアル酸転移酵素は、シアル酸を初期（ｎａｓｃｅｎｔ）オリゴ糖に転移する酵素である。前記酵素家族は、シアル酸をシアル酸化糖脂（ガングリオシド）に添添加する末端部位を糖タンパクのＮ−またはＯ−連糖鎖に添加する。約２０種の異なるシアル酸転移酵素を有し、α２，３で結合しているシアル酸からガラクトースへのシアル酸転移酵素（例えば、α−２，３−シアル酸転移酵素）及びα２，６で結合しているシアル酸からガラクトースまたはＮ−アセチルガラクトサミンげのシアル酸転移酵素（例えば、α−２，６−シアル酸転移酵素）を含む。本発明の実例によれば、海洋細菌（Ｍ． ｂａｃｔｅｒｉａ）（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＢ３０８０４２．１）、イエハツカネズミ（例えばＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＢＡＡ０６０６８）またはパスツレラ・ムルトシダ（例えばＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＥＴ１７０５６）から由来するα−２，３−シアル酸転移酵素、及びウシ（Ｂ． Ｔａｕｒｕｓ）（例えばＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＮＰ＿００１００８６６８）、チャイニーズハムスター（Ｃ． ｇｒｉｓｅｕｓ）（例えばＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＮＰ＿００１２３３７４４）またはドブネズミ（例えばＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． ＡＡＣ４２０８６）から由来するα−２，６−シアル酸転移酵素を含む。
ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生システム／シアル酸転移酵素の組合せの手段に使用される酵素は、本文に述べるよな野生型酵素またはその機能性変異体であってもよい。これらの酵素はいかなる伝統的な方法で準備することができる。本発明の実例によれば、前記手段はＧｂ３からＧｂ４を合成するために用いられ、図２Ｅが参照される。
Ｇｌｏｂｏ系列オリゴ糖の合成
上記組合せの手段は、ＵＤＰ−Ｇａｌ再生／ガラクトース転移酵素、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生／ＧａｌＮＡｃＴ、ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生／フコース転移酵素及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生／シアル酸転移酵素を含み、それらは単独にまたは組合せて応用することで、Ｇｂ３、Ｇｂ４、Ｇｂ５、Ｇｌｏｂｏ Ｈ（フコース−Ｇｂ５）及びＳＳＥＡ４（シアル酸−Ｇｂ５）を含むＧｌｏｂｏ系列オリゴ糖を合成する。下記の更なる詳細な説明の通り、全ての Ｇｌｏｂｏ−系列オリゴ糖は未置換されてもよく、または置換されてもよい。
ステップＳ−１
生物合成方法中の第１ステップ（Ｓ−１）は、式（Ｉ）化合物またはその塩を酵素的な反転して式（ＩＩ）化合物またはその塩になり：
Figure 2021168693
その中、Ｒ１Ａは、水素、置換または未置換されたアルキル基、置換または未置換されたアルケニル基、置換または未置換されたアルキニル基、置換または未置換された炭素環基、置換または未置換された複素環基、置換または未置換されたアリール基、置換または未置換されたヘテロアリール基または酸素保護基団である。Ｒ２Ａ、Ｒ３Ａ、Ｒ５Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ｂ、Ｒ５Ｂ、Ｒ２Ｃ、Ｒ４Ｃ及びＲ５Ｃは、各自独立に水素、置換またはまたは置換されたＣ１−６アルキル基または酸素保護基団である。
そのため、本発明の一方面は、式（Ｉ）化合物またはその塩を式（ＩＩ）化合物またはその塩に酵素的な合成する方法を提供し、それはウリジン二リン酸−Ｇａｌ（ＵＤＰ−Ｇａｌ）及びα−１，４ガラクトース転移酵素の存在下、式（Ｉ）化合物を式（ＩＩ）化合物に転換すること、及び上記表１に示す酵素群の存在下、ガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを生成することを含み、図２Ａが参照される。前記酵素的な反応を実施するために、必要成分（例えばガラクトース、ガラクトース転移酵素、ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群、ＡＴＰ、ＵＴＰ及びその他（例えばＭｇ＋＋））を反応混合物に混成し、式（ＩＩ）化合物を生成することを許容する条件下に置いて培養する。これらの条件は、当業者が熟知しているものである。以下の実例を参照して説明する。
Ｒ１Ａ基団を機能性基団とすることができ、Ｇｌｏｂｏ−系列オリゴ糖を例えばタンパク質または脂質のような別の分子に共役することを許容する。一方、それを保護基団とすることができる。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは水素である。
他の実例中に、Ｒ１Ａは、置換または未置換されたアルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１−６アルキル基、置換または未置換されたＣ２−６アルキル基、置換または未置換されたＣ３−６アルキル基、置換または未置換されたＣ４−６アルキル基、置換または未置換されたＣ５−６アルキル基、置換または未置換されたＣ２−５アルキル基、置換または未置換されたＣ２−４アルキル基、置換または未置換されたＣ２−３アルキル基、置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。本文に定義されるようなビオチン及びセラミドは、置換されたアルキル基により含まれる。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、未置換されるアルキル基である。例えば幾つかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、第２級ブチル基、イソブチル基または第３級ブチル基である。一方、幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、置換されたアルキル基である。幾つかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、さらに置換または未置換されたチオ、置換または未置換されたアミン基、カルボニル基（例えば、カルボン酸）、アジド、アルケニル基（例えば、アリル基）、アルキニル基（例えば、プロパルギル基）、ビオチンまたはセラミド基団で置換される。幾らかの特定の実例中に、これらの置換基的置換位置は、アルキル基の末端（最後１個の炭素原子）に位置する。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、１つまたは多数個のアミン基（−ＮＨ２）基団で置換されたアルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、末端位置（最後１個の炭素原子）にアミン基（−ＮＨ２）基団で置換されたアルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２であり、その中、ｎは１、２、３、４、５または６である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、５−アミルアミン基（−（ＣＨ２）５−ＮＨ２）である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、置換または未置換されたアルケニル基であり、例えば置換または未置換されたＣ２−６アルケニル基、置換または未置換されたＣ３−６アルケニル基、置換または未置換されたＣ４−６アルケニル基、置換または未置換されたＣ５−６アルケニル基、置換または未置換されたＣ２−５アルケニル基、置換または未置換されたＣ２−４アルケニル基、置換または未置換されたＣ２−３アルケニル基、置換または未置換されたＣ２アルケニル基、置換または未置換されたＣ３アルケニル基、置換または未置換されたＣ４アルケニル基、置換または未置換されたＣ５アルケニル基または置換または未置換されたＣ６アルケニル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ＝ＣＨ２であり、その中、ｎは１、２または３である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、アリル基（−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、さらに置換または未置換されたチオ、置換または未置換されたアミン基、カルボニル基（例えば、カルボン酸）、アジド、アルケニル基（例えば、アリル基）、アルキニル基（例えば、プロパルギル基）、ビオチンまたはセラミド基団で置換されたアルケニル基である。幾らかの特定の実例中に、これらの置換基の置換位置は、アルケニル基の末端（最後１個の炭素原子）に位置する。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、置換または未置換されたアルキニル基であり、例えば置換または未置換されたＣ２−６アルキニル基、置換または未置換されたＣ３−６アルキニル基、置換または未置換されたＣ４−６アルキニル基、置換または未置換されたＣ５−６アルキニル基、置換または未置換されたＣ２−５アルキニル基、置換または未置換されたＣ２−４アルキニル基、置換または未置換されたＣ２−３アルキニル基、置換または未置換されたＣ２アルキニル基、置換または未置換されたＣ３アルキニル基、置換または未置換されたＣ４アルキニル基、置換または未置換されたＣ５アルキニル基または置換または未置換されたＣ６アルキニル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、さらに置換または未置換されたチオ、置換または未置換されたアミン基、カルボニル基（例えば、カルボン酸）、アジド、アルケニル基（例えば、アリル基）、アルキニル基（例えば、プロパルギル基）、ビオチンまたはセラミド基団で置換されたアルキニル基である。幾らかの特定の実例中に、これらの置換基の置換位置は、アルキニル基の末端（最後１個の炭素原子）に位置する。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、置換または未置換された複素環基であり、例えば置換または未置換された５−から８−員複素環基、置換または未置換された５−から７−員複素環基、置換または未置換された５−から６−員複素環基、置換または未置換された５−員複素環基、置換または未置換された６−員複素環基、置換または未置換された７−員複素環基または置換または未置換された８−員複素環基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、さらに置換または未置換されたチオ、置換または未置換されたアミン基、カルボニル基（例えば、カルボン酸）、アジド、アルケニル基（例えば、アリル基）、アルキニル基（例えば、プロパルギル基）、ビオチンまたはセラミド基団で置換された複素環基である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、置換または未置換された炭素環基であり、例えば置換または未置換されたＣ３−６炭素環基、置換または未置換されたＣ３−５炭素環基、置換または未置換されたＣ３−４炭素環基、置換または未置換されたＣ３炭素環基、置換または未置換されたＣ４炭素環基、置換または未置換されたＣ５炭素環基または置換または未置換されたＣ６炭素環基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、さらに置換または未置換されたチオ、置換または未置換されたアミン基、カルボニル基（例えば、カルボン酸）、アジド、アルケニル基（例えば、アリル基）、アルキニル基（例えば、プロパルギル基）、ビオチンまたはセラミド基団で置換された炭素環基である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、置換または未置換されたアリール基であり、例えば置換または未置換されたＣ６アリール基（フェニル基）または置換または未置換されたＣ１０アリール基（ナフチル基）である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、さらに置換または未置換されたチオ、置換または未置換されたアミン基、カルボニル基（例えば、カルボン酸）、アジド、アルケニル基（例えば、アリル基）、アルキニル基（例えば、プロパルギル基）、ビオチンまたはセラミド基団で置換されたアリール基である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、置換または未置換されたヘテロアリール基であり、例えば置換または未置換された５−員ヘテロアリール基または置換または未置換された６−員ヘテロアリール基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、さらに置換または未置換されたチオ、置換または未置換されたアミン基、カルボニル基（例えば、カルボン酸）、アジド、アルケニル基（例えば、アリル基）、アルキニル基（例えば、プロパルギル基）、ビオチンまたはセラミド基団で置換されたヘテロアリール基である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、水素、アリル基、置換されたアルキル基、ビオチンまたはセラミドである。
さらに、Ｒ１Ａは、上記のいずれか１つの非水素基団の混合物であってもよいことに関し、例えば置換または未置換されたアルキル基、置換または未置換されたアルケニル基、置換または未置換されたアルキニル基、置換または未置換された炭素環基、置換または未置換された複素環基、置換または未置換されたアリール基、置換または未置換されたヘテロアリール基であり、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の異なる基団を含んで組合せる結合基団が提供される。非制限性の一実例に、Ｒ１Ａは、アルキル基及びアリール基団を含んで組合せる結合基団であってもよく、例えばアルキル基−アリール基−アルキル基であり、かつそれは必要に応じてさらに前記結合基団のいずれか１つの位置（例えば末端位置）に置換または未置換されたチオ、置換または未置換されたアミン基、カルボニル基（例えば、カルボン酸）、アジド、アルケニル基（例えば、アリル基）、アルキニル基（例えば、プロパルギル基）、ビオチンまたはセラミド基団で置換される。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは本文に定義されるような酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ａは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ａは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ａは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ３Ａは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ３Ａは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ３Ａは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ５Ａは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ５Ａは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ５Ａは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ｂは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ｂは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ｂは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ３Ｂは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ３Ｂは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ３Ｂは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ５Ｂは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ５Ｂは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ５Ｂは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ｃは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ｃは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ｃは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ４Ｃは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ４Ｃは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ４Ｃは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ５Ｃは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ５Ｃは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ５Ｃは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ａ、Ｒ３Ａ、Ｒ５Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ｂ、Ｒ５Ｂ、Ｒ２Ｃ、Ｒ４Ｃ及びＲ５Ｃは、各自独立に水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、置換または未置換されたアルケニル基であり、かつＲ２Ａ、Ｒ３Ａ、Ｒ５Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ｂ、Ｒ５Ｂ、Ｒ２Ｃ、Ｒ４Ｃ及びＲ５Ｃは、各自独立に水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ａは、置換または未置換されたアルキル基であり、かつＲ２Ａ、Ｒ３Ａ、Ｒ５Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ｂ、Ｒ５Ｂ、Ｒ２Ｃ、Ｒ４Ｃ及びＲ５Ｃは、各自独立に水素である。
式（Ｉ）化合物の実例はその塩類を含むが、これらに限らない。
式（ＩＩ）化合物の実例は以下を含むが、これらに限らない：
Figure 2021168693
Figure 2021168693
Figure 2021168693
ステップＳ−２
生物合成方法の第２ステップ（Ｓ−２）は、式（ＩＩ）化合物またはその塩を酵素的な反転して式（ＩＩＩ）化合物またはその塩になり：
Figure 2021168693
その中、Ｒ１Ａ、Ｒ２Ａ、Ｒ３Ａ、Ｒ５Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ｂ、Ｒ５Ｂ、Ｒ２Ｃ、Ｒ４Ｃ及びＲ５Ｃは、本文に定義されるものであり、かつその中、Ｒ４Ｄ及びＲ５Ｄは、各自独立に水素、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基または酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ｄは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ｄは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ｄは窒素保護基団であり、例えばアセチル基（Ａｃ、−Ｃ＝ＯＣＨ３）である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ４Ｄは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ４Ｄは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ４Ｄは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ５Ｄは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ５Ｄは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ５Ｄは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ４Ｄ及びＲ５Ｄとも水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ｄは窒素保護基団であり、例えばアセチル基（Ａｃ、−Ｃ＝ＯＣＨ３）であり、かつＲ４Ｄ及びＲ５Ｄは各自に水素である。
式（ＩＩＩ）化合物の実例は以下を含むが、これらに限らない：
Figure 2021168693
Figure 2021168693
Figure 2021168693
ステップ（Ｓ−２）の方法は、適切な条件下、式（ＩＩ）化合物またはその塩を式（ＩＩＩ）化合物またはその塩に酵素的な合成を行う。式（ＩＩ）化合物の基質は、いかなる当該技術における既知の方法または本文に述べる方法で作製される。幾らかの実例中に、式（ＩＩ）化合物は、上記ステップＳ−１中の反応混合物から分離される。他の実例中に、式（ＩＩ）化合物を純化する必要がない場合、ステップＳ−１の反応混合物全体を直接に使用することができる。ＧａｌＮＡｃＴ（例えば、β−１，３−ＧａｌＮＡｃＴ）の存在及び下、式（ＩＩ）化合物を、式（ＩＩ）化合物を式（ＩＩＩ）化合物に転換することを許容する条件下、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃと培養することができる。幾らかの実例中に、前記ＧａｌＮＡｃＴ−触媒化反応を、本文に述べるようなＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生方法と結合する。図２Ｂが参照される。以下の実例説明が参照される。
ステップＳ−３
生物合成方法の第３ステップ（Ｓ−１）は、式（ＩＩＩ）化合物またはその塩を酵素的な反転して式（ＩＶ）化合物またはその塩になり：
Figure 2021168693
その中、Ｒ１Ａ、Ｒ２Ａ、Ｒ３Ａ、Ｒ５Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ｂ、Ｒ５Ｂ、Ｒ２Ｃ、Ｒ４Ｃ、Ｒ５Ｃ、Ｒ２Ｄ、Ｒ４Ｄ及びＲ５Ｄは本文に定義されるものであり、かつＲ２Ｅ、Ｒ３Ｅ、Ｒ４Ｅ及びＲ５Ｅは、各自独立に水素、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基または酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ｅは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ｅは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例に、Ｒ２Ｅは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ３Ｅは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ３Ｅは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例に、Ｒ３Ｅは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ４Ｅは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ４Ｅは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ４Ｅは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ５Ｅは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ５Ｅは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ５Ｅは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ３Ｅは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ３Ｅは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例に、Ｒ３Ｅは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ｅ、Ｒ３Ｅ、Ｒ４Ｅ及びＲ５Ｅは各自に水素である。
式（ＩＶ）化合物の実例は以下を含むが、これらに限らない：
Figure 2021168693
Figure 2021168693
Figure 2021168693
ステップＳ−３は、β−１，３−ガラクトース転移酵素の活性による酵素反応に係り、それは当業者が既知する条件下で行う。式（ＩＩＩ）化合物の基質は、例えばＧｂ４は、いかなる当該技術における既知の方法または本文に述べる方法で作製される。幾らかの実例中に、式（ＩＩＩ）化合物は、上記ステップＳ−２中の反応混合物から分離される。他の実例中に、式（ＩＩＩ）化合物を純化する必要がない場合、ステップＳ−２の反応混合物全体を直接に使用することができる。β−１，３−ガラクトース転移酵素の存在下、式（ＩＩＩ）化合物を、式（ＩＩＩ）化合物を式（ＩＶ）化合物に転換することを許容する条件下、ＵＤＰ−Ｇａｌと培養することができる。幾らかの実例中に、前記ＧａｌＴ−触媒化反応を、本文に述べるようなＵＤＰ−Ｇａｌ再生方法と結合する。図２Ａが参照される。以下の実例説明が参照される。
幾らかの特定の実例中に、β−１，３−ＧａｌＮＡｃＴ／β−１，３−ＧａｌＴ二機能性酵素（例えばヘモフィルス・インフルエンザ桿菌から由来するＬｇｔＤを参照）は、ステップＳ−２及びステップＳ−３に用いられる。
ステップＳ−４
式（ＩＶ）化合物をその末端環Ｅの異なる位置上に置換を行う。例えば、式（ＩＶ）化合物の幾らかの特定の態様として、その中、Ｒ２Ｅは水素であり、ステップＳ−４の生物合成過程での必要に応じるステップは、式（ＩＶ−ａ）化合物またはその塩を式（Ｖ）化合物またはその塩に転換することに係る。
Figure 2021168693
その中、Ｒ１Ａ、Ｒ２Ａ、Ｒ３Ａ、Ｒ５Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ｂ、Ｒ５Ｂ、Ｒ２Ｃ、Ｒ４Ｃ、Ｒ５Ｃ、Ｒ２Ｄ、Ｒ４Ｄ、Ｒ５Ｄ、Ｒ３Ｅ、Ｒ４Ｅ及びＲ５Ｅは、本文に定義されるものであり、かつＲ１Ｆ、Ｒ２Ｆ及びＲ３Ｆは、各自独立に水素、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基または酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ｆは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ｆは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ｆは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ｆは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ｆは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ２Ｆは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ３Ｆは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ３Ｆは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ３Ｆは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ１Ｆ、Ｒ２Ｆ及びＲ３Ｆは各自に水素である。
式（Ｖ）化合物の実例は以下を含むが、これらに限らない：
Figure 2021168693
Figure 2021168693
Figure 2021168693
ステップＳ−４は、α−１，２−フコース転移酵素の活性による酵素反応に係り、それは当業者が既知する条件下で行う。式（ＩＶ）化合物の基質は、例えばＧｂ５は、いかなる当該技術における既知の方法または本文に述べる方法で作製される。幾らかの実例中に、式（ＩＶ）化合物は、上記ステップＳ−３中の反応混合物から分離される。他の実例中に、式（ＩＶ）化合物を純化する必要がない場合、ステップＳ−３の反応混合物全体を直接に使用することができる。フコース転移酵素の存在下、式（ＩＶ）化合物を、式（ＩＶ）化合物を式（Ｖ）化合物に転換することを許容する条件下、ＧＤＰ−Ｆｕｃと培養することができる。幾らかの実例中に、前記ＦｕｃＴ−触媒化反応を、本文に述べるようなＵＤＰ−Ｆｕｃ再生方法と結合する。図２Ｄが参照される。以下の実例説明が参照される。
ステップＳ−５
式（ＩＶ）化合物の他の態様として、その中、Ｒ３Ｅは水素であり、ステップＳ−５の生物合成過での必要に応じるステップは、式（ＩＶ−ｂ）化合物またはその塩を式（ＶＩ）化合物またはその塩に転換することに係る：
Figure 2021168693
その中、Ｒ１Ａ、Ｒ２Ａ、Ｒ３Ａ、Ｒ５Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ｂ、Ｒ５Ｂ、Ｒ２Ｃ、Ｒ４Ｃ、Ｒ５Ｃ、Ｒ２Ｄ、Ｒ４Ｄ、Ｒ５Ｄ、Ｒ２Ｅ、Ｒ４Ｅ及びＲ５Ｅは、本文に定義されるものであり、Ｒ３Ｇは、水素、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基または窒素保護基団であり、かつＲ６Ｇ、Ｒ７Ｇ、Ｒ８Ｇ及びＲ９Ｇは各自独立に水素、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基または酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ３Ｇは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ３Ｇは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ３Ｇは窒素保護基団であり、例えばアセチル基（Ａｃ、−Ｃ＝ＯＣＨ３）である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ６Ｇは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ６Ｇは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ６Ｇは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ７Ｇは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ７Ｇは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ７Ｇは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ８Ｇは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ８Ｇは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ８Ｇは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ９Ｇは水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ９Ｇは、置換または未置換されたＣ１−６アルキル基であり、例えば置換または未置換されたＣ１アルキル基、置換または未置換されたＣ２アルキル基、置換または未置換されたＣ３アルキル基、置換または未置換されたＣ４アルキル基、置換または未置換されたＣ５アルキル基または置換または未置換されたＣ６アルキル基である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ９Ｇは酸素保護基団である。
幾らかの特定の実例中に、Ｒ６Ｇ、Ｒ７Ｇ、Ｒ８Ｇ及びＲ９Ｇは各自に水素である。幾らかの特定の実例中に、Ｒ９Ｇは窒素保護基団であり、例えばアセチル基（Ａｃ、−Ｃ＝ＯＣＨ３）であり、かつＲ６Ｇ、Ｒ７Ｇ、Ｒ８Ｇ及びＲ９Ｇは各自に水素である。
式（Ｖ）化合物の実例は以下を含むが、これらに限らない：
Figure 2021168693
Figure 2021168693
Figure 2021168693
ステップＳ−５は、α−２，３−シアル酸転移酵素の活性による酵素反応に係り、それは当業者が既知する条件下で行う。式（ＩＶ）化合物の基質は、例えばＧｂ５は、いかなる当該技術における既知の方法または本文に述べる方法で作製される。幾らかの実例中に、式（ＩＶ）化合物は、上記ステップＳ−３中の反応混合物から分離される。他の実例中に、式（ＩＶ）化合物を純化する必要がない場合、ステップＳ−３の反応混合物全体を直接に使用することができる。シアル酸転移酵素の存在下、式（ＩＶ）化合物を、式（ＩＶ）化合物を式（Ｖ）化合物に転換することを許容する条件下、ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃと培養することができる。幾らかの実例中に、前記シアル酸転移酵素−触媒化反応を、本文に述べるようなＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生方法と結合する。図２Ｅが参照される。以下の実例説明が参照される。
ステップＳ−１からＳ−５の個別及び以上に述べるようないかなる組合せは、いずれも本発明に掲示される範疇に属する。本発明は、上記いかなる合成方法で作製されるいかなる化合物も含み、例えば以上に述べる化合物を含む。
本発明の幾らかの特定の実例によれば、本発明は、ラクトースから上記ステップＳ−１、Ｓ−２、Ｓ−３及びＳ−４を経由することを含む鎖反応を掲示し、または上記ステップＳ−１、Ｓ−２、Ｓ−３、Ｓ−４またはＳ−５を経由してＧｌｏｂｏ ＨまたはＳＳＥＡ４を合成する。前記Ｇｌｏｂｏ ＨまたはＳＳＥＡ４は、非末端（ｕｎｔａｉｌｅｄ）（Ｒ１Ａは水素で、図３及び４を参照）または末端（例えば、Ｒ１Ａはアリル基で、図５及び６を参照）である。各ステップ中に、ガラクトース転移酵素反応を対応のヌクレオチド糖再生方法と結合することができる。図３〜６を参照する。本発明の実例によれば、上記方法は、ワンポット式（ｏｎｅ−ｐｏｔ ｍａｎｎｅｒ）で実施され、即ち、各１個の前反応混合物は、次段階の反応に直接に用いられ、前の反応に得られる基質を純化する必要がない。言い換えれば、前記ワンポット式方法によれば、いかなる中間物を純化するステップを免除することができる。または、ステップＳ−１及びステップＳ−２は、ワンポット式でいかなる中間物を純化する必要がない場合で実施される。ステップＳ−２の後に、Ｇｂ４は反応混合物から分離され、かつ前記純化のＧＢ４は、続いてのステップＳ−３、Ｓ−４及び／またはＳ−５に用いられる。他の中間物をさらに純化する必要がない。
各反応ステップに用いられる酵素は、各自に反応混合物中に溶解することができ、または１つまたは多数個の支持体上に固定される。必要であれば、鎖反応過程中に付加的な酵素を添加してもよい。
酵素反応器
上記２つまたはそれ以上のステップのいかなる組合せの酵素的な鎖反応を含み、酵素反応器中に行うことができ、前記反応器は１つまたは多数個の反応室を含む。各個の反応器は、前記鎖反応の１個のステップを行うように設計される。具体的に言えば、各個の反応器は、各自に上記ステップＳ−１からＳ−５中に係る酵素を含む。
幾らかの実例中に、各個の反応器中の１つまたは多種の酵素、または全部Ｎ酵素は、好適な支持体上（例えば支持膜）に固定される。必要であれば、連続反応ステップの反応室を連結してもよく、これにより現時点の反応室の酵素反応が完了した後に、得られる反応混合物を次の反応室へ流動して次段階の反応ステップを行うことができる。幾らかの実例中に、前反応の産物を純化せずに、産物を含む反応混合物全体を次の反応室中に添加して次段階の酵素的な反応を行う。図３及び４が参照される。
例えば、ステップＳ−１の反応は、酵素反応器中の第１個の反応室中に行うことができ、その中、係るステップ１−Ｓの１つまたは多種の酵素は、支持体上に肯定される。ステップ１−Ｓ終了後に、第１反応室中の反応混合物（Ｇｂ３産物を含む）を第２反応室（ステップＳ−２にてＧｂ４の合成に要する全ての酵素及び試剤を含む）に置く。一実例中に、Ｇｂ４を純化してから、次段階の反応ステップに用いる。別の実例中に、第２反応室中の反応混合物全体（Ｇｂ４を含む）を第３反応室（ステップＳ−３にてＧｂ５の合成に要する全ての酵素及び試剤を含む）に置く。その後、第３反応室中の反応混合物を第４反応室（ステップＳ−４に要する全ての酵素及び試剤を含む）に置き、または第５反応室（ステップＳ−５に要する全ての酵素及び試剤を含む）に置く。
他の実例中に、酵素反応器は１個の反応室を備え、前記反応室は、上記合成ステップに要する酵素、試剤及び好適な基質を含有する。前記基質は、支持体上に固定される。本発明の特定の実例によれば、反応室は、ステップＳ−１に要する酵素及び試剤を含有し、その中、基質（Ｌａｃ−アリル基）は、支持体上に固定される。Ｇｂ３−アリル基がステップＳ−１中に合成された後に、反応室中の反応混合物が第２反応混合物で置換され、前記第２反応混合物は、ステップＳ−２に要する酵素及び試剤を含む。Ｇｂ４−アリル基がステップＳ−２中に合成された後に、第２反応混合物がステップＳ−３（Ｇｂ５−アリル基の合成）に要する全ての酵素及び試剤を含む第３反応混合物で置換される。その後、前記第３反応混合物は、ステップＳ−４（Ｇｌｏｂｏ Ｈ−アリル基の合成）に要する酵素及び試剤を含む第４反応物、またはステップ５−４（ＳＳＥＡ４−アリル基の合成）に要する酵素及び試剤を含む第５反応物で置換される。
さらなる詳述がなくても、当該技術を熟練する者であれば、上記の説明に基づいて本発明を最も広汎な範囲まで実施される。したがって、以下、特定の実例は、単に説明するためのものであり、いかなる方式で本発明を制限するものではない。本文中に掲示される全ての参照文献は、その目的または内容に基づいて引用方式で本文中に併記する。
実施例
以下に提供する実例は、本発明のこの部分及び他の部分をさらに理解できるように助けるものであり、これらの実例は、本発明の特定の実施態様を説明するためのものであり、本願が提出する特許請求の範囲を制限するものではない。
実施例１：Ｇｌｏｂｏ系列オリゴ糖の合成
ＵＤＰ−Ｇａｌ再生の新方法
２００４年に、Ｋｏｔａｋｅ氏らは、トウミョウからＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼを発見し、前記酵素は、異なる単糖−１−リン酸に対して広い基質特異性を有し、ＵＤＰ−糖を形成することができる。［１９］その２年後、Ｋｏｔａｋｅ氏ら及びＳｏｍｅｒｓ氏らは、それぞれ類似機能の酵素を発表し、ＵＳＰは、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）中に存在する。［２０］，［２１］最近、同源酵素も寄生生物のリーシュマニア原虫（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）及びトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）中に存在することが実証される。［２２］，［２３］ＵＳＰ酵素が注目を集めているのは、それはＵＴＰとＧｌｃ−１−リン酸及びＧａｌ−１−リン酸を濃縮（ｃｏｎｄｅｎｓｅ）させる能力を保つのみならず、また他の単糖−１−Ｐ、ＧｌｃＡ−１−リン酸及びＸｙｌ−１−リン酸を濃縮させる能力を有する。そのため、我々がＵＳＰを選択して直接にＧａｌ−１−リン酸とＵＴＰを濃縮させた後にＵＤＰ−Ｇａｌ再生を行うことにより、ＵＤＰ−Ｇａｌ合成の第３再生が達成される。
アリル基−Ｇｂ３の合成
反応混合物（２００ ｍＬ）は、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．０）中に溶けていたアリル基−Ｌａｃ（１０ ｍｍｏｌ）、ガラクトース（１０ ｍｍｏｌ）、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）（２２ ｍｍｏｌ）、ＡＴＰ（０．０５ ｍｍｏｌ）、ＵＴＰ（０．１２５ ｍｍｏｌ）及び１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む。１，４−ガラクトース転移酵素（ＬｇｔＣ）（１００ Ｕ）、ガラクトースキナーゼ（ＧａｌＫ）（５０ Ｕ）、ＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼ（ＡｔＵＳＰ）（１５０ Ｕ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）（２００ Ｕ）及びピロホスファターゼ（ＰＰＡ）（２００ Ｕ）をその中に添加して反応を起動させる。フラスコを２５ｏＣ下に置いて培養すると共に、ＴＬＣで反応過程をモニターすることにより、アニスアルデヒドを発色させて表記する。もしいずれか１つの反応がまだ完了していないと、より多くの酵素を反応が完了するまでに添加する。ＴＬＣ及びＥＳＩ−ＭＳで産物を確定する。
アリル基−Ｇｂ４の合成
アリル基−Ｇｂ３の合成後に、さらに他の成分を添加し、前記成分は、２２０ｍＬ溶液中に溶けていたＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）（９．９ ｍｍｏｌ）、ＰＥＰ（２２ ｍｍｏｌ）、１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素（１，３ＧａｌＮＡｃＴ， ＬｇｔＤ）（１００ Ｕ）、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ（ＮａｈＫ）（５０ Ｕ）、Ｎ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素（ＧｌｍＵ）（２００ Ｕ）、ＰＫ（１００ Ｕ）及びＰＰＡ（１００ Ｕ）を含む。混合物を２５ｏＣ下に置いて培養すると共に、ＴＬＣ及びＥＳＩ−ＭＳで 完全反応になるまでにモニターする。さらにＣ−１８ゲルカラムで前記産物を純化すると共に、ＮＭＲで特徴を確定する。
アリル基−Ｇｂ５の合成
反応混合物（２５０ ｍＬ）は、１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．０）中に溶けていたアリル基−Ｇｂ４（９ ｍｍｏｌ）、ガラクトース（９ ｍｍｏｌ）、ＰＥＰ（２２ ｍｍｏｌ）、ＡＴＰ（０．０５ ｍｍｏｌ）、ＵＴＰ（０．１２５ ｍｍｏｌ）及び１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む。反応混合物中に１，３−ガラクトース転移酵素（１，３ＧａｌＴ， ＬｇｔＤ）（２００ Ｕ）、ＧａｌＫ（５０ Ｕ）、ＵＳＰ（１５０ Ｕ）、ＰｙｋＦ（１００ Ｕ）及びＰＰＡ（１００ Ｕ）を添加して反応を起動させると共に、完全反応になるまでに２５ｏＣ下に置いて培養する。
アリル基−Ｇｌｏｂｏ Ｈの合成
アリル基−Ｇｂ５反応産物の半量（〜４．５ ｍｍｏｌ）は、付加的な純化をせずに直接にアリル基−ｇｌｏｂｏ Ｈを準備するために用いられる。フコース（５ ｍｍｏｌ）、ＡＴＰ（０．０５ ｍｍｏｌ）、ＧＴＰ（０．５ ｍｍｏｌ）及びＰＥＰ（１１ ｍｍｏｌ）（１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 緩衝液（ｐＨ ７．０）に溶けている）を含む溶液をＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ（ＦＫＰ）（２００ Ｕ）、ＰｙｋＦ（２００ Ｕ）、ＰＰＡ（２００ Ｕ）及び１，２−フコース転移酵素（ＦｕｔＣ）（２００ Ｕ）中に添加すると共に、完全反応になるまでに２５ｏＣ下に置いて培養し、またＣ−１８ゲルクロマトグラフィーで前記産物を純化すると共に、その特徴を確定する。
アリル基−ＳＳＥＡ４の合成
アリル基−Ｇｂ５反応混合物の他の半量（４．５ ｍｍｏｌ）は、アリル基−ＳＳＥＡ４を合成するために用いられる。その中に１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．０）中に溶けていたＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）（５ ｍｍｏｌ）、ＡＴＰ（０．０５ ｍｍｏｌ）、ＣＴＰ（０．２５ ｍｍｏｌ）、ＰＥＰ（１１ ｍｍｏｌ）及び１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を添加し、そしてシチジン一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）（５０ Ｕ）、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（Ｃｓｓ）（１２０ Ｕ）、ＰｙｋＦ（１００ Ｕ）、ＰＰＡ（１００ Ｕ）及びα−２，３−シアル酸転移酵素（ＪＴ−ＦＡＪ−１６）（１５０ Ｕ）を添加する。その過程は、ＴＬＣでモニターし、かつ上記のような方法で純化すると共に、前記産物の特徴を確定する。
オリゴ糖の純化と特性評価
反応混合物を９０ｏＣまで加熱して３０分間を維持し、次に遠心分離（５０００ ｒｐｍ、２０分間）を行うことで、反応混合物中のタンパク質を除去する。続いて濾過液をＣ−１８ゲルクロマトグラフィー法で純化すると共に、グラジエント送液（１００％水から１０％メタノール（水中））で洗滌する。留分を収集すると共に、ＴＬＣ［ブタノール／水酸化アンモニウム／水＝５：３：２（ｖ／ｖ／ｖ）］でモニターし、アリル基−オリゴ糖の留分を収集してフリーズドライする。ＨＰＬＣ（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５ＳＬ−ＩＩカラム使用、（Ｈ２Ｏ／アセトニトリル＝１９／８１）により、アイソクラチックモード（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｍｏｄｅ）下）で純度が９９％よりも高い産物が獲得される。１Ｈ
ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ 及び質量分析装置（Ａｖａｎｃｅ ６００及びＡＰＥＸ−ｕｌｔｒａ ９．４ Ｔ ＦＴＩＣＲ−ＭＳ， Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）で、アリル基−Ｌａｃ、アリル基−Ｇｂ３、アリル基−Ｇｂ４、アリル基−Ｇｂ５、アルケニル基プロピル−Ｇｌｏｂｏ Ｈ及びアリル基−ＳＳＥＡ４の構造を分析する。
ヌクレオチド糖合成、糖基転移酵素及びＡＴＰ再生に用いられる遺伝子のクローニング
全ての遺伝子は、遺伝子組のＤＮＡまたはｃＤＮＡプールにより、個別プライマー（表６）でＰＣＲを経て獲得され、かつ前記ＰＣＲ産物を修飾されたｐＥＴ４７ｂ担体に接合する。ＡＴＧの後、続いてＨｉｓ−ｔａｇ、ＡｃＴＥＶ プロテアーゼのために位置を切断し、及び特別の制限識別酵素のｃｃｄＢ正の選択遺伝子（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｇｅｎｅ）、またはＣ−末端Ｈｉｓ−ｔａｇにおけるｐＥＴ２８ａを側接する。遺伝子発現量を増加するために、大腸桿菌に対して最適化した暗号を使用して前記４個の糖基転移酵素を合成する。化学形質転換方法により、正確な配列を有するプラスミドをＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ／ＲＩＬコンピテント細胞にクローニングする。単一の菌そうを選ぶと共に、それをカナマイシンを有するＴＢ培地に接種し、終夜培養後に新鮮なＴＢ培地を使用して細胞培養物を更新する。ＯＤ６００が０．５に達する時に、最中濃度０．１ ｍＭのＩＰＴＧで標的タンパク質の表現を誘発する。そして１６ｏＣ下、継続的に２４時間成長する。前記大腸桿菌を収集すると共に、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ塩化ナトリウム及び１０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液中に、マイクロ液化器で細胞を破壊する。前記細胞を４℃及び１０，０００ ｒｐｍ下、３０分間遠心分離する。懸濁液を平衡したＮｉ−ＮＴＡに注ぎ込み、かつ沈澱物を捨てる。同一の緩衝液（ただイミダゾールを含む濃度がより高い（２５０ｍＭ））を使用して結合していたタンパク質を洗い出す。Ｑｕｂｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ）を使用してタンパク質濃度を測定すると共に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてその純度を確認する。
Figure 2021168693
Figure 2021168693
酵素分析
常定な分析条件を維持するために、全ての活性測定は、いずれも３７°Ｃ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ Ｔｒｉｓで、及びｐＨが７．５である条件下で行う。
（ｉ）ガラクトースキナーゼ（ＧａｌＫ）、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ（ＧａｌＮＡｃＫ）、フコースキナーゼ（ＦＫＰ）及びシチジン一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）の活性測定
蛍光分析法は、ＡＤＰ生産量（ＡＴＰ消耗量）のモニターに基づいて、それはＮＡＤＨ消耗量を測定するピルビン酸キナーゼ／Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ結合酵素を使用する分析である。例えば、Ｍｕｒｒａｙ氏ら， “Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｈｕｍａｎ α−１，３−Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ： Ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｏｃｃｕｒｓ Ｐｒｉｏｒ ｔｏ Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ Ａｔｔａｃｋ” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９７） ３６：８２３−８３１； 及びＧｏｓｓｅｌｉｎ氏ら， “Ａ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ” Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４） ２２０：９２−９７が参照される。ＮＡＤＨの蛍光特性は、３４０ ｎｍの励起波長及び４５０ ｎｍの放射波長を有する。１００ ｕＬの反応混合物を調製し、それは１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）中の前記結合酵素（ウサギ筋肉由来のピルビン酸キナーゼ（５単位）及びＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ（７単位））、基質及び補助因子（０．２ ｍＭ ＮＡＤＨ、０．８ ｍＭ ＰＥＰ及び１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２）を含有する。個別の糖を添加することにより、反応を起動させる。Ｋｃａｔ及びＫｍ動力学的パラメーターは、Ｇｒａｆｉｔ ｖｅｒｓｉｏｎ ７（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ， ＵＫ）の理論方プログラムを使用し、前記実験データに適した曲線によって計算される。１単位の糖キナーゼ活性は、２５°Ｃで１分間ごとに１ ｕｍｏｌ糖−１−Ｐを形成する量として定義される。
（ｉｉ）ＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼ（ＵＳＰ）、Ｎ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素（ＧｌｍＵ）、ＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ（ＦＫＰ）及びＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（Ｃｓｓ）の活性の測定
ピロリン酸塩の生産量は、ＥｎｚＣｈｅｃｋ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）を使用して測定する。分析成分は：ＵＶ−Ｓｔａｒマイクロタイタープレー（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ ）中の２００ ｕＭ ２−アミン基−６−メルカプト−７−メチルプリンヌクレオシド、１単位のヌクレオシドホスホリラーゼ、０．０３単位の無機ピロホスファターゼ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２及び５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５於１００ｕＬ規模）を含む。ＦＫＰを除いて、全ての成分をマイクロタイタープレー中に混合して平基準線を形成することを目的としてそれを平衡化する。酵素を添加することにより、反応を起動させる。ＣＭＰ−シアル酸シンターゼを除いて、１単位の酵素活性は、２５°Ｃで１分間ごとに個別糖−１−Ｐから１ ｕｍｏｌヌクレオチド糖を形成する量として定義される。ＣＭＰ−シアル酸シンターゼについては、その１単位の酵素活性は、２５°Ｃで１分間ごとに１ ｕｍｏｌカラメル酸を形成する量として定義される。
（ｉｉｉ）糖基転移酵素の測定：α−１，４−ガラクトース転移酵素（ＬｇｔＣ）、β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素（β１，３ＧａｌＮＡｃＴ，ＬｇｔＤ）、β−１，３−ガラクトース転移酵素（ＬｇｔＤ），α−１，２−フコース転移酵素（ＦｕｔＣ）及びα−２，３−シアル酸転移酵素（ＪＴ−ＦＡＪ−１６）。蛍光分析法を使用してＵＤＰ、ＧＤＰまたはＣＤＰの生産をモニターし、それはＮＡＤＨ消耗量を測定するピルビン酸キナーゼ／Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼ結合酵素を使用する分析である。例えば、Ｍｕｒｒａｙ氏ら， “Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｈｕｍａｎ α−１，３−Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｖ： Ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｏｃｃｕｒｓ Ｐｒｉｏｒ ｔｏ Ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉｃ Ａｔｔａｃｋ” Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９７） ３６：８２３−８３１； 及びＧｏｓｓｅｌｉｎ氏ら， “Ａ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ” Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４） ２２０：９２−９７が参照される。ヌクレオチド糖を除いて、全ての分析成分を２５℃で、同時に多孔プレート蛍光放射測定器（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２ Ｒｅａｄｅｒｓ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）中に培養する。対応するヌクレオチド糖を添加することにより、反応を起動させる。Ｋｃａｔ及びＫｍ動力学的パラメーターは、Ｇｒａｆｉｔ ｖｅｒｓｉｏｎ ７（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ， ＵＫ）の理論方プログラムを使用し、前記実験データに適した曲線によって計算される。１単位の活性は、２５°Ｃで１分間ごとに各別のヌクレオチド糖中に１ ｕｍｏｌ糖を受容体に触媒化転移する量として定義される。
（ｉｖ）ピルビン酸キナーゼ（ＰｙｒＫ）の測量
ピルビン酸キナーゼ分析法は、前述した糖基酵素を少々変更して得られ、かつＮＡＤＨの消耗量に基づくものでもある。１００ ｕＬの反応混合物を準備し、それは１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）中の０．８ ｍＭ ＡＤＰ、０．８ ｍＭ ＰＥＰ、０．２ ｍＭ ＮＡＤＨ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２及びウサギ筋肉由来のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ（５単位）を含み、前記混合物を黒色多孔プレートに置く。ＮＡＤＨは、３４０ ｎｍの励起波長及び４５０ ｎｍの放射波長を有する。適当量の再編成大腸桿菌ピルビン酸キナーゼを添加することにより、反応を起動させる。１単位の酵素活性は、２５°Ｃで１分間ごとに個別糖−１−Ｐから１ ｕｍｏｌヌクレオチド糖を形成する量として定義される。ＣＭＰ−シアル酸シンターゼについては、その１単位のピルビン酸キナーゼは、２５°Ｃで１分間ごとに１ ｕｍｏｌリン酸（エノール）ピルビン酸からピルビン酸に変換する量として定義される。
（ｖ）ピロホスファターゼ（ＰＰＡ）の測量
ピロホスファターゼ分析法は、ＥｎｚＣｈｅｃｋ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）キットから提供するホスホリラーゼ測定法を、少々変更して得られる。分析成分は：１ｍＭピロリン酸塩、２００ ｕＭ ２−アミン−６−メルカプト−７−メチルプリンヌクレオシド、１単位のヌクレオシドホスホリラーゼ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２及び５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ｏｆ ７．５）を含み、それを適当量の再編成大腸桿菌ピロホスファターゼと１００ ｕＬ規模でＵＶ−Ｓｔａｒマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ Ｏｎｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ ）中に置く。１単位のピロホスファターゼ活性は、２５°Ｃで１分間ごとに１．０ ｕｍｏｌｅ無機ピロリン酸塩を釈放する量として定義される。
（ｖｉ）最適ｐＨの測量
酵素活性の最適ｐＨは、４．０〜１０．０の範囲内で、前述した標準酵素分析方法を使用して測量し、それは酢酸ナトリウム、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及びＣＨＥＳ緩衝液を含む。前記緩衝液のｐＨ値は培養温度によって調整される。全ての反応は、統計的な評価の便宜のため、いずれも３回反復実験する。
（ｖｉｉ）最適二価金属イオンの測量
所要の金属の分析は、標準分析条件下で行う。ＥＤＴＡの存在または不存在下、酵素を金属イオン（Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋またはＮｉ２＋）と混合する（最終濃度１０ ｍＭ）。全ての反応は、統計的な評価の便宜のため、いずれも３回反復実験する。
（ｖｉｉｉ）最適温度の測量
温度が酵素活性に対する影響力の評価は、適当量の純酵素をＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ ７．０）、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２及び個別基質中に培養する。分析の一致性を維持するために、まず全ての成分を混合しておき、かつ分析温度で５分間予熱し、それから定常温度で酵素を添加して反応を起動させると共に、マルチモードプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で記録する。温度範囲は２０から６０ｏＣの間である。全ての反応は、統計的な評価の便宜のため、いずれも３回反復実験する。
酵素組合せ物
ＵＤＰ−Ｇａｌ再生／ガラクトース基化
１．ＧａｌＫ：大腸桿菌から由来するガラクトースキナーゼ
２．ＵＳＰ：シロイヌナズナから由来するＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼ
３．ＬｇｔＣ：ナイセリア・メニンジティディスから由来する１，４ガラクトース転移酵素、但しその暗号は大腸桿菌に対し最適化したもの
４．ＰｙｋＦ：大腸桿菌から由来するピルビン酸キナーゼ
５．ＰＰＡ：大腸桿菌から由来するピロホスファターゼ。
暗号最適化したＬｇｔＣ酵素のコード配列は下記のとおりである（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７）：
ＡＴＧＧＡＣＡＴＣＧＴＴＴＴＣＧＣＧＧＣＧＧＡＣＧＡＣＡＡＣＴＡＣＧＣＧＧＣＧＴＡＣＣＴＧＴＧＣＧＴＴＧＣＧＧＣＧＡＡＡＴＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＧＧＣＧＣＡＣＣＣＧＧＡＣＡＣＣＧＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴＣＣＡＣＧＴＴＣＴＧＧＡＣＧＣＧＧＧＴＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＣＧＡＡＣＣＧＴＧＣＧＧＣＧＧＴＴＧＣＧＧＣＧＡＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＡＣＡＴＣＣＧＴＴＴＣＡＴＣＧＡＣＧＴＴＡＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＧＣＧＧＧＴＴＴＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＡＴＣＣＧＴＣＡＣＡＴＣＴＣＴＡＴＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＧＣＧＣＧＴＣＴＧＡＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＴＡＣＡＴＣＧＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＣＡＡＡＧＴＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣＧＡＣＧＴＴＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＡＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＴＧＧＧＡＣＡＣＣＧＡＣＣＴＧＧＧＴＧＡＣＡＡＣＴＧＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＴＧＣＡＴＣＧＡＣＣＴＧＴＴＣＧＴＴＧＡＡＣＧＴＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＡＴＣＧＧＴＡＴＧＧＣＧＧＡＣＧＧＴＧＡＡＴＡＣＴＡＣＴＴＣＡＡＣＧＣＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＡＡＡＡＡＴＧＧＣＧＴＣＧＴＣＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＡＡＴＧＴＣＴＴＧＣＧＡＡＴＧＧＧＴＴＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＴＴＡＴＧＣＡＧＴＡＣＣＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＣＧＧＴＣＴＧＴＴＣＡＡＡＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＣＴＡＣＧＣＧＡＡＣＴＣＴＣＧＴＴＴＣＡＡＣＴＴＣＡＴＧＣＣＧＡＣＣＡＡＣＴＡＣＧＣＧＴＴＣＡＴＧＧＣＧＡＡＣＣＧＴＴＴＣＧＣＧＴＣＴＣＧＴＣＡＣＡＣＣＧＡＣＣＣＧＣＴＧＴＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＴＴＡＴＧＣＣＧＧＴＴＧＣＧＧＴＴＴＣＴＣＡＣＴＡＣＴＧＣＧＧＴＣＣＧＧＣＧＡＡＡＣＣＧＴＧＧＣＡＣＣＧＴＧＡＣＴＧＣＡＣＣＧＣＧＴＧＧＧＧＴＧＣＧＧＡＡＣＧＴＴＴＣＡＣＣＧＡＡＣＴＧＧＣＧＧＧＴＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＣＣＧＴＴＣＣＧＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣＧＴＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＣＡＣＣＧＴＡＴＧＴＴＣＴＣＴＡＣＣＡＡＡＣＧＴＡＴＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＴＧＧＣＧＴＣＧＴＡＡＡＣＴＧＴＣＴＧＣＧＣＧＴＴＴＣＣＴＧＣＧＴＡＡＡＡＴＣＴＡＣＴＧＡ。
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生／アセチルガラクトサミン化
１．ＧａｌＮＡｃＫ：ロンガム菌から由来するＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ
２．ＧｌｍＵ：大腸桿菌から由来するＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素
３．ＬｇｔＤ：ヘモフィルス・インフルエンザ桿菌から由来するβ１，３ガラクトー ス転移酵素、但しその暗号は大腸桿菌に対して最適化したもの
４．ＰｙｋＦ：大腸桿菌から由来するピルビン酸キナーゼ
５．ＰＰＡ：大腸桿菌から由来するピロホスファターゼ。
暗号最適化したＬｇｔＤ酵素のコード配列は下記のとおりである（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８）：
ＡＴＧＧＡＡＡＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＧＧＴＴＴＣＴＧＴＴＡＴＣＧＴＴＴＧＣＧＣＧＴＡＣＡＡＣＧＣＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＴＣＧＡＣＧＡＡＴＣＴＡＴＣＴＣＴＴＣＴＡＴＣＡＴＣＡＡＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＧＡＡＡＡＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＧＡＣＧＧＴＴＣＴＡＣＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＡＴＣＴＣＴＡＡＡＣＴＧＧＡＣＡＡＡＣＧＴＡＴＣＡＡＡＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＡＣＡＡＡＴＡＣＡＡＣＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡＴＣＡＡＣＴＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＣＧＧＴＣＴＧＧＧＴＴＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＴＡＡＡＴＡＣＴＴＣＧＣＧＣＧＴＡＴＧＧＡＣＧＣＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＧＣＧＡＡＡＣＣＧＴＣＴＴＧＧＡＴＣＧＡＡＡＡＡＡＴＣＧＴＴＡＣＣＴＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＡＣＧＡＣＣＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＧＡＴＧＧＧＴＴＣＴＴＡＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＴＣＧＴＴＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＴＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＡＡＡＣＣＧＧＴＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＡＡＡＡＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＧＡＡＧＣＧＡＴＧＣＴＧＴＴＣＴＡＣＡＡＣＣＣＧＡＴＣＣＡＣＡＡＣＡＡＣＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＣＧＴＧＣＧＡＡＣＧＴＴＴＡＣＣＧＴＧＡＡＣＡＣＡＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＡＣＴＡＣＣＣＧＴＡＣＧＣＧＧＡＡＧＡＣＴＡＣＡＡＡＴＴＣＴＧＧＴＣＴＧＡＡＧＴＴＴＣＴＣＧＴＣＴＧＧＧＴＴＧＣＣＴＧＧＣＧＡＡＣＴＡＣＣＣＧＧＡＡＧＣＧＣＴＧＧＴＴＡＡＡＴＡＣＣＧＴＣＴＧＣＡＣＧＧＴＡＡＣＣＡＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＡＣＡＡＣＣＡＣＧＡＡＣＡＧＡＡＣＧＡＡＡＣＣＧＣＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＡＣＧＴＧＡＡＡＡＣＡＴＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＡＴＣＧＧＴＡＴＣＧＡＣＡＴＣＡＡＡＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＣＴＧＴＴＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＴＡＣＣＡＣＧＴＴＧＡＣＡＡＡＴＣＴＡＡＣＡＡＡＧＴＴＣＴＧＡＡＡＴＣＴＡＴＣＣＴＧＴＡＣＧＡＡＡＴＧＴＡＣＡＴＧＴＣＴＣＴＧＧＡＣＡＡＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＴＴＣＧＡＣＣＴＧＡＡＡＣＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＣＡＴＣＣＧＴＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＴＴＡＴＣＴＴＣＴＡＧ。
ＧＤＰ−ＦＫＰ再生／フコース基化
１．ＦＫＰ：バクテロイデス・フラジリスから由来するＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ
２．ＦｕｔＣ：ヘリコバクター・ピロリから由来するα−１，２フコース転移酵素、但しその暗号は大腸桿菌に対して最適化したもの
３．ＰｙｋＦ：大腸桿菌から由来するピルビン酸キナーゼ
４．ＰＰＡ：大腸桿菌から由来するピロホスファターゼ。
暗号最適化したＦｕｔＣ酵素のコード配列は下記のとおりである（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９）：
ＡＴＧＧＣＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＧＴＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＴＧＧＴＣＴＧＧＧＴＡＡＣＣＡＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＴＡＣＧＣＧＴＴＣＧＣＧＡＡＡＴＣＴＣＴＧＣＡＧＡＡＡＣＡＣＴＣＴＡＡＣＡＣＣＣＣＧＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＣＴＴＴＣＧＡＣＴＧＧＴＣＴＧＡＣＣＧＴＡＡＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＴＴＣＣＣＧＡＴＣＧＡＣＣＴＧＣＣＧＴＡＣＧＣＧＴＣＴＧＣＧＡＡＡＧＡＡＡＴＣＧＣＧＡＴＣＧＣＧＡＡＡＡＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＣＣＧＡＡＡＣＴＧＧＴＴＣＧＴＧＡＣＧＣＧＣＴＧＡＡＡＴＧＣＡＴＧＧＧＴＴＴＣＧＡＣＣＧＴＧＴＴＴＣＴＣＡＧＧＡＡＡＴＣＧＴＴＴＴＣＧＡＡＴＡＣＧＡＡＣＣＧＡＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＡＣＣＧＴＣＴＣＧＴＣＴＧＡＣＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＧＧＴＴＡＣＴＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣＧＣＧＴＴＡＣＴＴＣＧＡＣＧＣＧＡＴＣＴＣＴＣＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＣＡＧＡＣＣＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＴＡＣＣＡＧＴＧＣＡＡＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧＡＡＡＡＡＣＴＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＡＣＡＴＣＣＧＴＣＧＴＧＧＴＧＡＣＴＡＣＧＴＴＧＧＴＡＴＣＧＧＴＴＧＣＣＡＧＣＴＧＧＧＴＡＴＣＧＡＣＴＡＣＣＡＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＣＴＧＧＡＡＴＡＣＡＴＧＧＣＧＡＡＡＣＧＴＧＴＴＣＣＧＡＡＣＡＴＧＧＡＡＣＴＧＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＣＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＴＴＡＣＣＣＧＴＴＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＣＣＡＣＣＣＧＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＴＡＣＴＧＧＧＡＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＡＧＴＣＴＴＧＣＣＡＧＣＡＣＧＧＴＡＴＣＡＴＣＧＣＧＡＡＣＴＣＴＡＣＣＴＡＣＴＣＴＴＧＧＴＧＧＧＣＧＧＣＧＴＡＣＣＴＧＡＴＣＧＡＡＡＡＣＣＣＧＧＡＡＡＡＡＡＴＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＣＣＧＡＡＡＣＡＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＧＧＴＣＡＣＧＡＡＡＡＣＡＴＣＣＴＧＴＧＣＡＡＡＧＡＡＴＧＧＧＴＴＡＡＡＡＴＣＧＡＡＴＣＴＣＡＣＴＴＣＧＡＡＧＴＴＡＡＡＴＣＴＣＡＧＡＡＡＴＡＣＡＡＣＧＣＧＴＡＡ。
ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生／シアル酸化
１．ＣＭＫ：大腸桿菌から由来するシチジン一リン酸キナーゼ
２．Ｃｓｓ：パスツレラ・ムルトシダから由来するＣＭＰ−シアル酸シンターゼ
３．ＪＴ−ＦＡＪ−１６：海洋細菌から由来するα２，３シアル酸転移酵素、但しその暗号は大腸桿菌に対して最適化したもの
４．ＰｙｋＦ：大腸桿菌から由来するピルビン酸キナーゼ
５．ＰＰＡ：大腸桿菌から由来するピロホスファターゼ。
暗号最適化したＪＴ−ＦＡＪ−１６酵素のコード配列は下記のとおりである（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０）：
ＡＴＧＡＡＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＣＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＴＡＣＧＴＴＧＡＣＣＧＴＧＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＡＣＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＡＡＴＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＡＣＴＧＡＴＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＣＧＴＴＡＣＣＣＧＡＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＡＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＣＧＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＣＡＡＡＧＡＡＣＡＧＴＴＣＧＡＡＣＴＧＡＣＣＧＡＡＴＣＴＣＴＧＡＡＡＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＡＡＡＡＣＡＴＣＧＡＣＡＡＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＧＧＴＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＧＧＴＣＴＡＴＣＧＡＣＧＴＴＧＴＴＧＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＴＴＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＴＡＡＡＡＡＣＡＴＣＣＣＧＡＴＣＧＡＡＣＴＧＣＡＣＴＴＣＴＡＣＧＡＣＧＡＣＧＧＴＴＣＴＧＣＧＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＧＴＡＴＣＴＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴＡＡＡＣＴＧＣＣＧＧＡＡＴＣＴＧＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡＣＡＡＡＡＣＣＴＣＴＣＴＧＴＣＴＡＡＡＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＡＡＴＴＣＴＣＴＡＴＣＧＡＣＧＧＴＡＣＣＧＡＣＴＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＡＡＡＣＡＴＣＴＡＣＧＧＴＴＴＣＴＣＴＣＡＧＣＴＧＴＡＣＣＣＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＣＡＣＡＴＧＣＴＧＣＧＴＧＣＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＧＡＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＣＧＣＴＧＣＧＴＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＣＴＡＡＣＡＡＣＡＴＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＧＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＡＡＧＡＣＴＴＣＡＡＣＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＡＣＴＴＣＡＡＣＣＣＧＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＧＧＴＴＣＴＡＡＣＴＣＴＧＣＧＡＣＣＧＣＧＡＣＣＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＡＧＡＴＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＣＴＴＣＴＡＴＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＴＣＴＡＴＣＴＣＴＧＡＣＴＡＣＧＡＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＡＡＧＧＴＣＡＣＣＣＧＴＣＴＧＣＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＧＡＡＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＣＧＣＡＣＧＡＣＡＴＧＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＣＣＣＧＴＴＣＧＡＡＧＣＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＡＣＣＧＧＴＡＴＣＣＴＧＣＣＧＧＡＣＧＣＧＧＴＴＧＧＴＧＧＴＡＴＧＧＧＴＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＴＣＴＴＣＴＣＴＡＴＣＣＣＧＡＡＡＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＡＡＡＣＡＡＣＴＣＴＣＴＧＡＴＣＣＡＧＧＴＴＡＴＧＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＴＣＡＡＣＣＧＴＧＡＣＡＡＣＡＴＣＡＡＡＣＴＧＡＴＣＴＣＴＧＡＣＡＴＣＴＡＡ。
材料及び化学品 全てのヌクレオチド、糖、ヌクレオチド糖及び化学品は、いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から購入されたものである。制限酵素及びＴ４
ＤＮＡ結合酵素は、またはＮＥＢ（Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ）からのものである。プライマーは、Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｐｔｅ Ｌｔｄ（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）から注文購入されたものである。Ｎｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ， ＣＡ）からのものである。Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ２ゲルは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）から購入されたものである。プラスミドｐＥＴ２８ａ、ｐＥＴ４７ｂ及び保護したＴＬＣガラスプレート（厚さが０．２５ ｍｍのＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０及びＦ２５４により被覆される）はＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｉｎｃ（Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）から購入されたものである。ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ／ＲＩＬコンピテント細胞は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）から獲られるものである。以上に言及されていない他の物質は、全てできるだけ高品質ものを買い付けている。
全ての反応は、いずれも薄層クロマトグラフィー法（ＴＬＣ）でモニターする（流動相：ブタノール：アセテート：水＝５：３：２）。ＴＬＣは、ｐ−メトキシベンズアルデヒドで染色する。
アリル基−Ｌａｃの合成
リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を有する異なるラクトースは、学術的なレポートの方法［Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００４， ３３９， ２４１５−２４２４．］に基づいて合成する。１Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） δ ６．０１（ｍ， １Ｈ）， ５．４０−５．３７（ｄｄ， Ｊ ＝ １７．３， １．４ Ｈｚ，
１Ｈ）， ５．３０−５．２８（ｄ， Ｊ ＝ １０．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５４（ｄ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４６（ｄ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４１−４．３８（ｍ， １Ｈ）， ４．２５−４．２２（ｍ， １Ｈ）， ４．００−３．９７（ｄｄ， Ｊ ＝ １２．３， ２．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９３（ｄ， Ｊ ＝ ３．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８０−３．７１（ｍ， ４ Ｈ）， ３．６７−３．５３（ｍ， ５Ｈ）， ３．３５−３．３３（ｍ， １Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） δ １３３．３， １１８．７， １０２．９， １０１．０， ７８．３， ７５．３， ７４．７， ７４．４， ７２．８， ７２．５， ７０．９， ７０．６， ６８．５， ６０．９， ６０．１； ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ， ＭＮａ＋） Ｃ１５Ｈ２６Ｏ１１Ｎａ＋ 計算値 ４０５．１３６７， 測定値４０５．１３４６。
リンカーを有するＧｂ３の大規模準備
５ ｍｍｏｌリンカーを有するラクトース、５ ｍｍｏｌガラクトース、１２ ｍｍｏｌホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、０．２５ ｍｍｏｌ ＡＴＰ、０．２５ ｍｍｏｌ ＵＴＰ及び１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ ７．５）に添加する。適当量のα−１，４−ガラクトース転移酵素（ＬｇｔＣ）、ガラクトースキナーゼ（ＧａｌＫ）、ＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼ（ＵＳＰ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰｙｋＦ）及びピロホスファターゼ（ＰＰＡ）を添加することにより、反応を起動させる。三角フラスコを穏やかに揺らし、１６〜５０ｏＣの培養器中に置く。ＴＬＣを利用して反応を観察する。もし反応が停止すると、さらに多くの酵素を添加する。ＴＬＣでその中に出発物がないことを発見した時に、前記反応が停止したことを示す。１８Ｃ逆相カラムを使用して前記Ｇｂ３産物を分離し、その収率が９９％である。
アリル基−Ｇｂ３： １Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） δ ６．００（ｍ， １Ｈ）， ５．４２（ｄ， Ｊ ＝ １７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．３２（ｄ，
Ｊ ＝ １０．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．９７（ｄ， Ｊ ＝ ３．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５６（ｄ， Ｊ ＝ ７．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５３（ｄ， Ｊ ＝
７．７ Ｈｚ， １Ｈ）、４．４３−４．３７（ｍ， ２Ｈ）， ４．２７−４．２４（ｍ， １Ｈ）， ４．０６−３．５８（ｍ， １６Ｈ）， ３．３７−３．３４（ｔ，
Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） δ １３３．３， １１８．７， １０３．３， １００．９， １００．３， ７８．６， ７７．３， ７５．４， ７４．８， ７４．５， ７２．９， ７２．２， ７０．９， ７０．８， ７０．６， ６９．１， ６８．９， ６８．５， ６０．５，
６０．４， ６０．０； ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ， ＭＮａ＋） Ｃ２１Ｈ３６Ｏ１６Ｎａ＋計算値５６７．１８９６， 測定値５６７．１８５８。
Figure 2021168693
１Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） ａ ４．９７（ｄ， Ｊ ＝ ３．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５６（ｄ， Ｊ ＝ ７．９ Ｈｚ， １Ｈ）、４．５４−４．５０（ｍ， ２Ｈ）， ４．３７（ｄｄ， Ｊ ＝ ６．０ Ｈｚ， Ｊ ＝ ０．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２７−４．２４（ｍ， １Ｈ）， ４．０６−３．５９（ｍ， １８Ｈ）， ３．３５（ｔ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．０３（ｔ， Ｊ
＝ ７．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７５−１．６８（ｍ， ４Ｈ）， １．５１−１．４６（ｍ， ２Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） ａ １０３．３， １０１．９， １００．３， ７８．７， ７７．３， ７５．４， ７４．８，
７４．５， ７２．９， ７２．２， ７０．９， ７０．８， ７０．６， ６９．１， ６８．９， ６８．５， ６０．５， ６０．４， ６０．０， ３９．３， ２８．１， ２６．４， ２２．１。
リンカーを有するＧｂ４の大規模準備
５ ｍｍｏｌリンカーを有するＧｂ３、５ ｍｍｏｌ Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、１２ ｍｍｏｌホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、０．２５ ｍｍｏｌ ＡＴＰ、０．２５ ｍｍｏｌ ＵＴＰ及び１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を１００ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ ７．５）に添加する。適当量のβ−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素（ＬｇｔＤ）、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ（ＧａｌＮＡｃＫ）、Ｎ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素（ＧｌｍＵ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰｙｋＦ）及びピロホスファターゼ（ＰＰＡ）を添加することにより、反応を起動させる。三角フラスコを穏やかに揺らし、１６〜５０ｏＣの培養器中に置く。ＴＬＣを利用して反応を観察する。もし反応が停止すると、さらに多くの酵素を添加する。ＴＬＣでその中に出発物がないことを発見したときに、前記反応が停止したことを示す。１８Ｃ逆相カラムを使用して前記Ｇｂ４産物を分離し、その収率が９６％である。
アリル基−Ｇｂ４： １Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） δ ６．０１（ｍ， １Ｈ）， ５．４０−５．３８（ｄｄ， Ｊ ＝ １７．３， １．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．３０（ｄ， Ｊ ＝ １０．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．９２（ｄ， Ｊ ＝ ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６４（ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５４（ｄ， Ｊ ＝ ７．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５３（ｄ， Ｊ ＝ ７．８
Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４２−４．３８（ｍ， ２Ｈ）， ４．２６−４．２２（ｍ，
２Ｈ）， ４．０５（ｄ， Ｊ ＝ ２．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０１−３．９９（ｄｄ， Ｊ ＝ １２．３， １．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９８−３．８９（ｍ，
５Ｈ）， ３．８６−３．７４（ｍ， ７Ｈ）， ３．７２−３．５７（ｍ， ７Ｈ）， ３．３７−３．３４（ｔ， Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．０５（ｓ， ３Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） δ １３３．２， １１８．７， １０３．３， １０３．２， １００．９， １００．４， ７８．７， ７８．６， ７７．２， ７５．４， ７４．９， ７４．８， ７４．５， ７２．９， ７２．１， ７０．９， ７０．８， ７０．６， ７０．２， ６８．９， ６７．７，
６７．６， ６０．９， ６０．５， ６０．３， ６０．２， ６０．０， ５２．６， ２２．２； ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ， ＭＮａ＋） Ｃ２９Ｈ４９ＮＯ２１Ｎａ＋計算値７７０．２６８９， 測定値７７０．２６５４。
リンカーを有するＧｂ５の大規模準備
５ ｍｍｏｌアリル基−Ｇｂ４、５ ｍｍｏガラクトース、１２ ｍｍｏｌホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、０．２５ ｍｍｏｌ ＡＴＰ、０．２５ ｍｍｏｌ ＵＴＰ、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５）に添加する。適当量のβ−１，３−ガラクトース転移酵素、ガラクトースキナーゼ（ＧａｌＫ）、ＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼ（ＵＳＰ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰｙｋＦ）及びピロホスファターゼ（ＰＰＡ）を添加することにより、反応を起動させる。三角フラスコを穏やかに揺らし、１６〜５０ｏＣの培養器中に置く。ＴＬＣを利用して反応を観察する。もし反応が停止すると、さらに多くの酵素を添加する。ＴＬＣでその中に出発物がないことを発見したときに、前記反応が停止したことを示す。１８Ｃ逆相カラムを使用して前記Ｇｂ５産物を分離し、その収率が９５％である。
アリル基−Ｇｂ５： １Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） δ ６．０１（ｍ， １Ｈ）， ５．４１−５．３８（ｄｄ， Ｊ ＝ １７．３， １．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．３１（ｄ， Ｊ ＝ １０．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．９３（ｄ， Ｊ ＝ ４．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．７１（ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５５（ｄ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５３（ｄ， Ｊ ＝ ７．８
Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４７（ｄ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４２−４．３９（ｍ， ２Ｈ）， ４．２７−４．２３（ｍ， ２Ｈ）， ４．２０（ｄ， Ｊ
＝ ３．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０９−３．９０（ｍ， ８Ｈ）， ３．８７−３．５９（ｍ， １７Ｈ）， ３．５５−３．５２（ｍ， １Ｈ）， ３．３６−３．３３（ｔ， Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．０４（ｓ， ３Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） δ １７５．１， １３３．２， １１８．７， １０４．８， １０３．３， １０２．９， １００．９， １００．４， ７９．６， ７８．７， ７８．６， ７７．２， ７５．４， ７４．９， ７４．８， ７４．６， ７４．５， ７２．９， ７２．４， ７２．１， ７０．９， ７０．６（２Ｃ）， ７０．２， ６８．９， ６８．５， ６７．９， ６７．６， ６０．９（２Ｃ）， ６０．３３， ６０．２８， ６０．０， ５１．５， ２２．２； ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ， ＭＮａ＋） Ｃ３５Ｈ５９ＮＯ２６Ｎａ＋計算値９３２．３２１８， 測定値９３２．３２３５。
Figure 2021168693
１Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ）， ４．４７（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．４２ Ｈｚ）， ４．３０（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．９ Ｈｚ）， ４．２８（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．１ Ｈｚ）， ４．２４（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ）， ４．１９（ｔ， １Ｈ Ｊ ＝ ７．０ Ｈｚ）， ４．０４（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ２．８ Ｈｚ）， ３．９７（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ２．９８ Ｈｚ）， ３．８７−３．３５（ｍ， ３２Ｈ）， ３．３０（ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ）， ３．０９（ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ）， ２．７９（ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）， １．８２（ｓ， ３Ｈ）， １．５１−１．４３，（ｍ， ４Ｈ）， １．２８−１．２１（ｍ， ２Ｈ） １３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ）， ａ １７５．０， １０４．７， １０３．１， １０２．８， １０１．８， １００．２， ７９．４， ７８．５， ７８．４， ７６．９， ７５．３， ７４．８， ７４．７， ７４．４， ７４．３， ７２．８， ７２．２， ７１．９，
７０．６， ７０．４， ７０．０， ６９．９， ６８．７， ６８．４， ６７．８， ６７．４， ６０．８２， ６０．７７， ６０．１３， ６０．１， ５９．８， ５１．３， ３９．１， ２８．０， ２６．３， ２２．１， ２１．９ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ： Ｃ３７Ｈ６６Ｎ２Ｏ２６ ［Ｍ＋Ｈ］＋計算値９５５．３９０４； 測定値９５５．３９７２。
リンカーを有するＧｌｏｂｏ Ｈの大規模準備
５ ｍｍｏｌリンカーを有するＧｂ５、５ ｍｍｏｌ フコース、１２ ｍｍｏｌホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、０．２５ ｍｍｏｌ ＡＴＰ、０．２５ ｍｍｏｌ ＧＴＰ と１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５）に添加する。α−１，２−フコース転移酵素、Ｌ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ（ＦＫＰ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰｙｋＦ）及びピロホスファターゼ（ＰＰＡ）を添加することにより、反応を起動させる。三角フラスコを穏やかに揺らし、１６〜５０ｏＣの培養器中に置く。ＴＬＣを利用して反応を観察する。もし反応が停止すると、さらに多くの酵素を添加する。ＴＬＣでその中に出発物がないことを発見したときに、前記反応が停止したことを示す。１８Ｃ逆相カラムを使用して前記Ｇｌｏｂｏ Ｈ産物を分離し、その収率が９４％である。
アリル基−Ｇｌｏｂｏ Ｈ： １Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） δ ６．０１（ｍ， １Ｈ）， ５．４１−５．３８（ｄｄ， Ｊ ＝ １７．３， １．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．３１（ｄ， Ｊ ＝ １０．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．２４（ｄ， Ｊ ＝ ４．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．９１（ｄ， Ｊ ＝ ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．６３（ｄ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５６−４．５２（ｍ， ３Ｈ）， ４．４２−４．４０（ｍ， ２Ｈ）， ４．２６−４．２３（ｍ， ３Ｈ）， ４．１２（ｄ， Ｊ ＝ ２．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０５（ｄ， Ｊ ＝ ３．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０３−３．５９（ｍ， ２８ Ｈ）， ３．３６−３．３３（ｔ， Ｊ ＝ ８．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．０６（ｓ， ３Ｈ）， １．２４（ｄ， Ｊ ＝ ６．５ Ｈｚ， ３Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） δ １７４．３， １３３．２， １１８．７，１０３．９， １０３．２， １０２．０， １００．９， １００．４， ９９．３， ７８．７， ７８．３， ７７．１， ７６．３， ７６．１， ７５．５， ７５．０， ７４．８， ７４．６， ７４．５， ７３．５， ７２．９， ７２．１， ７１．８， ７０．８， ７０．６， ７０．１， ６９．５， ６９．２， ６９．１， ６８．５， ６８．０， ６７．８， ６６．８， ６０．９５， ６０．９３， ６０．３（２Ｃ）， ６０．０， ５１．６， ２２．２， １５．３； ＨＲＭＳ（ＭＡＬＤＩ， ＭＮａ＋） Ｃ４１Ｈ７０ＮＯ３０Ｎａ＋計算値１０７９．３８７５， 測定値１０７８．４１４５。
Figure 2021168693
１Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） ａ５．１２（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．９ Ｈｚ）， ４．７８（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．６ Ｈｚ ）， ４．５０（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ），４．４３（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ）， ４．４０（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ）， ４．３７（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ）， ４．３０（ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６．２ Ｈｚ）， ４．１５−４．１０（ｍ， ２Ｈ）， ３．９９（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １．８ Ｈｚ），
３．９２（ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ２．２ Ｈｚ）， ３．９０−３．４７（ｍ， ３３Ｈ）， ３．１９（ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．３ Ｈｚ）， ２．８９（ｔ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ）， １．９４（ｓ， ３Ｈ）， １．６０−１．５５（ｍ，
４Ｈ）， １．３８−１．３１（ｍ， ２Ｈ）， １．１１（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ）． １３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ ） ａ１７６．１， １０５．７， １０５．０， １０３．７４， １０３．６５， １０２．１， １００．９７， ８０．５， ７９．９， ７８．８， ７８．０， ７７．８， ７７．２，
７６．７６， ７６．５， ７６．３， ７６．２， ７５．３， ７４．６， ７３．８， ７３．５， ７２．５， ７１．８１， ７１．７８， ７１．２， ７１．１， ７０．９， ７０．８， ７０．２， ６９．７， ６９．５， ６８．５， ６２．６６， ６２．６４， ６２．０， ６１．７， ５３．３， ４１．０， ２９．９， ２８．１， ２３．９， ２３．８， １７．０ ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ： Ｃ４３Ｈ７６Ｎ２Ｏ３０ ［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値１１２３．４３８１， 測定値１１２３．４３８５。
リンカーを有するＳＳＥＡ４の大規模準備
５ ｍｍｏｌリンカーを有するＧｂ５、５ ｍｍｏｌフコース、１２ ｍｍｏｌホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、０．２５ ｍｍｏｌ ＡＴＰ、０．２５ ｍｍｏｌ ＣＴＰ與１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５）に添加する。適当量のα−２，３−シアル酸転移酵素、シチジン一リン酸キナーゼ（ＣＭＫ）、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（Ｃｓｓ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰｙｋＦ）及びピロホスファターゼ（ＰＰＡ）を添加することにより、反応を起動させる。三角フラスコを穏やかに揺らし、１６〜５０ｏＣの培養器中に置く。ＴＬＣを利用して反応を観察する。もし反応が停止すると、さらに多くの酵素を添加する。ＴＬＣでその中に出発物がないことを発見したときに、前記反応が停止したことを示す。１８Ｃ逆相カラムを使用して前記ＳＳＥＡ４産物を分離し、その収率が４５％である。
アリル基−ＳＳＥＡ４： １Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） δ ６．００（ｍ， １Ｈ）， ５．４０−５．３７（ｄ， Ｊ ＝ １７．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．３０−５．２８（ｄ， Ｊ ＝ １０．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．９２（ｄ， Ｊ
＝ ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．７０（ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， １Ｈ），
４．５４−４．５１（ｍ， ３Ｈ）、４．４０−４．３８（ｍ， ２Ｈ）， ４．２５−４．１８（ｍ， ３Ｈ）， ４．１０−３．５２（ｍ， ３４ Ｈ）， ３．３５−３．３２（ｔ， Ｊ ＝ ８．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．７７（ｄｄ， Ｊ ＝ １２．５， ４．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．０３（ｓ， ６Ｈ）， １．８０（ｔ， Ｊ ＝
１２．１ Ｈｚ， １Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） δ １７５．２， １７５．１， １７４．１， １３３．４， １２１．６， １１８．９，
１０４．７，１０３．４， １０３．１， １０１．１， １００．５， ９９．８，
７９．９， ７８．９， ７８．８， ７７．３， ７５．７， ７５．５， ７５．０， ７４．７， ７４．６， ７３．０， ７２．９，７２．２， ７２．１， ７１．９， ７１．０， ７０．８， ７０．４， ６９．１， ６９．０， ６８．５， ６８．２， ６８．０， ６７．７， ６７．５， ６２．６， ６１．１， ６０．５， ６０．４， ６０．１， ５１．７，５１．４， ３９．８， ２２．４， ２２．１； ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ， Ｍ−Ｈ） Ｃ４６Ｈ７５Ｎ２Ｏ３４−計算値１１９９．４１９６， 測定値１１９９．４２０８。
Figure 2021168693
１Ｈ ＮＭＲ（６００ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） ｄ ４．９４（ｄ， Ｊ ＝ ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．７２（ｄ， Ｊ ＝ ８．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．５４−４．５０（ｍ， ３Ｈ）， ４．４０（ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２７（ｄ， Ｊ ＝ ２．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２０（ｄ， Ｊ ＝ ２．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１０−３．５４（ｍ， ３７ Ｈ）， ３．３４−３．３１（ｍ， １Ｈ）， ３．０２（ｔ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．７８（ｄｄ， Ｊ
＝ １２．４， ４．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．０５（ｍ， ６Ｈ）， １．８０（ｔ， １２．２ Ｈｚ， １Ｈ）， １．７４−１．６７（ｍ， ４Ｈ）， １．５１−１．４５（ｍ， ２Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ（１５０ ＭＨｚ， Ｄ２Ｏ） ｄ１７５．０， １７４．９， １７３．９，１０４．５， １０３．２， １０２．９， １０１．９， １００．３， ９９．６， ７９．７， ７８．８、７８．７， ７７．１， ７５．５， ７５．４， ７４．８， ７４．７， ７４．６， ７４．５， ７２．９， ７２．７， ７２．１， ７１．８， ７０．８， ７０．２， ７０．０， ６８．９， ６８．９， ６８．３， ６８．０， ６７．８， ６７．５， ６７．３， ６２．４， ６０．９， ６０．３， ６０．３， ６０．０， ５１．６， ５１．３， ３９．７， ３９．３， ２８．１， ２６．５， ２２．３， ２２．０， ２２．０； ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ， ＭＮａ＋）計算値Ｃ４８Ｈ８３Ｎ３Ｏ３４Ｎａ １２６８．４７５６， 測定値１２６８．４７６０。
Figure 2021168693
Figure 2021168693
実施例２：アリル基−ラクトースから一ステップ（Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ）でアリル基−Ｇｂ５（ＳＳＥＡ３）の合成
いかなる中間物を純化する必要がない場合、アリル基−ラクトースから一ステップ（ｏｎｅ−ｓｔｅｐ）でアリル基−Ｇｂ５を合成する鎖反応は、図６に例示される。
三角フラス平中に、５ ｍｍｏｌアリル基−ラクトース、５ ｍｍｏｌ ガラクトース、１２ ｍｍｏｌ ＰＥＰ、０．２５ ｍｍｏｌ ＡＴＰ、０．２５ ｍｍｏｌ ＵＴＰ及び１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５）中に混合する。三角フラスコ中に適当のα１，４−ガラクトース転移酵素（ＬｇｔＣ）、ＧａｌＫ、ＵＳＰ、ＰｙｋＦ及びＰＰＡを添加して酵素反応を起動させると共に、アリル基−Ｇｂ３を合成する。反応混合物を含有する三角フラスコを穏やかに揺らし、１６〜５０ｏＣの培養器中に置く。ＴＬＣ分析法を利用して合成過程をモニターする。もしアリル基−Ｇｂ３の合成が見当たらないと、さらに多くの酵素を添加する。
アリル基−Ｇｂ３の合成後に、他の組の成分（５ ｍｍｏｌ ＧａｌＮＡｃ、１２ ｍｍｏｌ ＰＥＰ及び適当量のＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ（ＧａｌＮＡｃＫ）、Ｎ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素（ＧｌｍＵ）、ＰｙｋＦ、ＰＰＡ 及びβ・ １，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素（ＬｇｔＤ）を含む）を三角フラスコ中に添加する。アリル基−Ｇｂ３の合成と同じ条件下、形成された反応混合物を培養する。アリル基−Ｇｂ４の合成が見当たらないと、さらに多くの酵素を添加する。
アリル基−Ｇｂ４の合成後に、アリル基−Ｇｂ４の純化をしない場合、５ ｍｍｏｌガラクトース及び１２ ｍｍｏｌ ＰＥＰを三角フラスコ中に添加する。適当のβ １，３−ガラクトース転移酵素（ＬｇｔＤ）、ＧａｌＫ、ＵＳＰ、ＰｙｋＦ及びＰＰＡを添加することにより、次段階のガラクトースグリコシド化反応を起動させてアリル基−Ｇｂ５を合成する。反応混合物を含有する三角フラスコを穏やかに揺らし、１６〜５０ｏＣの培養器中に置く。ＴＬＣ分析法を利用して合成過程をモニターする。もしアリル基−Ｇｂ５の合成が見当たらないと、さらに多くの酵素を添加する。アリル基−ラクトースから一ステップでアリル基−Ｇｂ５を合成する収率が約４０％である。
１．Ｋａｎｎａｇｉ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ（ＳＳＥＡ−３ ａｎｄ −４） ａｒｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｇｌｏｂｏ−ｓｅｒｉｅｓ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ． ＥＭＢＯ Ｊ， １９８３． ２（１２）： ｐ． ２３５５−６１． ２．Ｓｈｅｎｇｌｅ， Ｚ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ａｔｔａｃｋ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ｉ． Ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， １９９７． ７３（１）： ｐ． ４２−４９． ３．Ｓｈｅｎｇｌｅ， Ｚ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｓ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ａｔｔａｃｋ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： ＩＩ． Ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ−ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， １９９７． ７３（１）： ｐ． ５０−５６． ４．Ｃｈａｎｇ， Ｗ．−Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｌｏｂｏ Ｈ ａｎｄ ＳＳＥＡ３ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｆｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ １ ａｎｄ ２ ｉｎ Ｇｌｏｂｏ Ｈ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２００８． １０５（３３）： ｐ． １１６６７−１１６７２． ５．Ｓｌａｍｏｎ， Ｄ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｕｓｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｐｌｕｓ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ＨＥＲ２ ｆｏｒ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈａｔ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｓ ＨＥＲ２． Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２００１． ３４４（１１）： ｐ． ７８３−７９２． ６．Ｗａｎｇ， Ｚ．−Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｇｌｏｂｏ Ｈ−ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ ｖａｃｃｉｎｅ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｏｔａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， ２０００． ９７（６）： ｐ． ２７１９−２７２４． ７．Ｂｉｌｏｄｅａｕ， Ｍ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １９９５． １１７（２９）： ｐ． ７８４０−７８４１． ８．Ｐａｒｋ， Ｔ．Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｏｆ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｔｕｍｏｒ（Ｇｌｏｂｏ−Ｈ） Ａｎｔｉｇｅｎ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １９９６． １１８（４６）： ｐ． １１４８８−１１５００． ９．Ｓｌｏｖｉｎ， Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ： Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｆｕｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｌｏｂｏ Ｈ ｈｅｘａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｉｎ ｍａｎ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ， １９９９． ９６（１０）： ｐ． ５７１０−５７１５． １０．Ｂｏｓｓｅ， Ｆ．， Ｌ．Ａ． Ｍａｒｃａｕｒｅｌｌｅ， ａｎｄ Ｐ．Ｈ． Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ， Ｌｉｎｅａｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ Ｇｌｏｂｏ−Ｈ， ＳＳＥＡ−３， ａｎｄ Ｇｂ３． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００２． ６７（１９）： ｐ． ６６５９−６６７０． １１．Ｗｅｒｚ， Ｄ．Ｂ．， Ｂ． Ｃａｓｔａｇｎｅｒ， ａｎｄ Ｐ．Ｈ． Ｓｅｅｂｅｒｇｅｒ， Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ Ｇｂ−３ ａｎｄ Ｇｌｏｂｏ−Ｈ： Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｉｃ Ｌｉｎｋａｇｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， ２００７． １２９（１０）： ｐ． ２７７０−２７７１． １２．Ｗａｎｇ， Ｚ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｏｎｅ−Ｐｏｔ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｇｌｏｂｏ−Ｈ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｐｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｓｙｌ Ｄｏｎｏｒｓ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００７． ７２（１７）： ｐ． ６４０９−６４２０． １３．Ｊｅｏｎ， Ｉ．， Ｋ． Ｉｙｅｒ， ａｎｄ Ｓ．Ｊ． Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｏｔａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｏｂｏ−Ｈ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００９． ７４（２１）： ｐ． ８４５２−８４５５． １４．Ｆｒｅｄ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｌｏｂｏ Ｈ Ｈｅｘａｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ−Ｂａｓｅｄ Ｏｎｅ−Ｐｏｔ Ｓｔｒａｔｅｇｙ． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１． ４０（７）： ｐ． １２７４−１２７７． １５．Ｈｓｕ， Ｃ．−Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｇｈｌｙ Ａｌｐｈａ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｉａｌｙｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｏｎｏｒｓ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｉａｌｏｓｉｄｅｓ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ − Ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２０１０． １６（６）： ｐ． １７５４−１７６０． １６．Ｚｈｅｎ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｇｌｏｂｏ−Ｈ ａｎｄ Ｓｔａｇｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ ４． Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＆ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ， ２００８． ３５０（１１−１２）： ｐ． １７１７−１７２８． １７．Ｗｏｎｇ， Ｃ．Ｈ．， Ｓ．Ｌ． Ｈａｙｎｉｅ， ａｎｄ Ｇ．Ｍ． Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ， Ｅｎｚｙｍｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ ｗｉｔｈ ｉｎ ｓｉｔｕ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒｉｄｉｎｅ ５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｕｒｉｄｉｎｅ ５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇａｌａｃｔｏｓｅ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９８２． ４７（２７）： ｐ． ５４１６−５４１８． １８．Ｗｏｎｇ， Ｃ．Ｈ．， Ｒ． Ｗａｎｇ， ａｎｄ Ｙ． Ｉｃｈｉｋａｗａ， Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒ ｅｎｚｙｍｉｃ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： ｕｓｅ ｏｆ Ｇａｌ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｕｒｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＵＤＰ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ， ＵＤＰ−２−ｄｅｏｘｙｇａｌａｃｔｏｓｅ， ａｎｄ ＵＤＰ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９２． ５７（１６）： ｐ． ４３４３−４３４４． １９．Ｋｏｔａｋｅ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， ＵＤＰ−ｓｕｇａｒ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｗｉｔｈ Ｂｒｏａｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ Ｔｏｗａｒｄ Ｖａｒｉｏｕｓ Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ １−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｅａ Ｓｐｒｏｕｔｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００４． ２７９（４４）： ｐ． ４５７２８−４５７３６． ２０．Ｌｉｔｔｅｒｅｒ， Ｌ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＵＤＰ−ｓｕｇａｒ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００６． ４４（４）： ｐ． １７１−１８０． ２１．Ｋｏｔａｋｅ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＵＤＰ−Ｓｕｇａｒ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ． Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００７． ７１（３）： ｐ． ７６１−７７１． ２２．Ｄａｍｅｒｏｗ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ＵＤＰ−ｓｕｇａｒ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１０． ２８５（２）： ｐ． ８７８−８８７． ２３．Ｙａｎｇ， Ｔ． ａｎｄ Ｍ． Ｂａｒ Ｐｅｌｅｄ， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＵＤＰ−ｓｕｇａｒ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｗｉｔｈ ａ ｂｒｏａｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ， ２０１０． ４２９（３）： ｐ． ５３３−５４３． ２４．Ｐｅｒｓｓｏｎ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｔａｉｎｉｎｇ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＬｇｔＣ ｆｒｏｍ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｄｏｎｏｒ ａｎｄ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｓｕｇａｒ ａｎａｌｏｇｓ． Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００１． ８（２）： ｐ． １６６−１７５． ２５．Ｋｏｔｏ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｉｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｌｋｙｌ ａｎｄ ｃｙｃｌｏａｌｋｙｌ ａ−ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ ｏｆ ｍａｌｔｏｓｅ， ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ， ａｎｄ ｌａｃｔｏｓｅ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００４． ３３９（１４）： ｐ． ２４１５−２４２４． ２６．Ａｎｔｏｉｎｅ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｇｌｏｂｏｔｒｉｏｓｅ ａｎｄ ｇｌｏｂｏｔｅｔｒａｏｓｅ ｂｙ ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ， ２００５． ８７（２）： ｐ． １９７−２０３． ２７．Ｚｈａｎｇ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｇｌｏｂｏｔｒｉｏｓｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ［ａｌｐｈａ］−（１−−＞４）−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００２． ３３７（１１）： ｐ． ９６９−９７６． ２８．Ｓｈａｏ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｇｌｏｂｏｓｉｄｅ ａｎｄ ｉｓｏｇｌｏｂｏｓｉｄｅ ｔｅｔｒａｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａ（１→３）Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ／ＵＤＰ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ Ｃ４ ｅｐｉｍｅｒａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２００３（１２）： ｐ． １４２２−１４２３． ２９．Ｓｈａｏ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｏｎｏｒ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｇｌｏｂｏｔｅｔｒａｏｓｅ ａｎｄ Ｉｓｏｇｌｏｂｏｔｅｔｒａｏｓｅ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２００２． ６８（１１）： ｐ． ５６３４−５６４０． ３０．Ｖａｎｅｓｓａ， Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ＧａｌＮＡｃ ａｎｄ ＵＴＰ． ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ， ２００７． ８（１）： ｐ． ３７−４０． ３１．Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ， Ｍ． ａｎｄ Ｍ． Ｋｉｔａｏｋａ， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｎｅ １−Ｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｌａｃｔｏ−Ｎ−Ｂｉｏｓｅ Ｉ／Ｇａｌａｃｔｏ−Ｎ−Ｂｉｏｓｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２００７． ７３（２０）： ｐ． ６４４４−６４４９． ３２．Ｆａｎｇ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｂｒｏａｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｕｒｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２． Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２００９． １９（２２）： ｐ． ６４２９−６４３２． ３３．Ｈｏｏｄ， Ｄ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｇｌｏｂｏｔｅｔｒａｏｓｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｆｒｏｍ Ｈ． ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｓｔｒａｉｎ Ｒｄ（ＲＭ１１８）． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２００１． １１（１１）： ｐ． ９５７−９６７． ３４．Ｓｈａｏ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ［ｂｅｔａ］−１，３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＬｇｔＤ ｆｒｏｍ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｓｔｒａｉｎ Ｒｄ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２００２． ２９５（１）： ｐ． １−８． ３５．Ｒａｎｄｒｉａｎｔｓｏａ， Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｇｌｏｂｏｐｅｎｔａｏｓｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ［ｂｅｔａ］１，３−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ［ｂｅｔａ］１，３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ＬｇｔＤ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２００７． ５８１（１４）： ｐ． ２６５２−２６５６． ３６．Ｃｏｙｎｅ， Ｍ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｓｙｍｂｉｏｎｔｓ Ｕｓｅ ａ Ｈｏｓｔ−Ｌｉｋｅ Ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００５． ３０７（５７１６）： ｐ． １７７８−１７８１． ３７．Ｗａｎｇ， Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍｏｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ＧＤＰ−ｌ−ｆｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌｅｗｉｓ Ｘ ｇｌｙｃａｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２００９． １０６（３８）： ｐ． １６０９６−１６１０１． ３８．Ｋｏｉｚｕｍｉ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＤＰ−ｆｕｃｏｓｅ ａｎｄ Ｌｅｗｉｓ Ｘ ｂｙ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０００． ２５（４）： ｐ． ２１３−２１７． ３９．Ｓｔｅｉｎ， Ｄａｎｉｅｌ Ｂ．， Ｙ．−Ｎ． Ｌｉｎ， ａｎｄ Ｃ．−Ｈ． Ｌｉｎ， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ ａｌｐｈａ１，２−Ｆｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｏｒ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＆ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ， ２００８． ３５０（１４−１５）： ｐ． ２３１３−２３２１． ４０．Ｔａｎｎｅｒ， Ｍ．Ｅ．， Ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００５． ３３（３）： ｐ． ２１６−２２８． ４１．Ｌｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ＣＭＰ−ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ ＣＭＰ−ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１１： ｐ． １−１３． ４２．Ｋｕｓｈｉ， Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ｏｆ ｍａｒｉｎｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｕｔｉｌｉｚｅ ｇｌｙｃｏｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１０． ２０（２）： ｐ． １８７−１９８． ４３．Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｔ．， Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ． Ｍａｒｉｎｅ Ｄｒｕｇｓ， ２０１０． ８（１１）： ｐ． ２７８１−２７９４． ４４．Ｔａｋａｋｕｒａ， Ｙ．， Ｈ． Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ， ａｎｄ Ｔ． Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｎ ａ／ａ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ ａ２，３−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ． ＪＴ−ＦＡＪ−１６． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２００７． １４２（３）： ｐ． ４０３−４１２。
他の実施態様
上下文中に反対または他の説明がない限り、特許請求の範囲中に記載の「１つ」、「１個」及び「前記」は、１つまたは１個よりも多いことを表す。上下文中に別途に産物または方法に関する反対または他の説明がない限り、特許請求の範囲または明細書中に、１組の１つまたは多数個の構成要素の間に「または」が現出されると、その中に１個、１個よりも多いまたは全ての構成要素が現出・使用されることと見なす。本発明が提供する産物または方法中の態様について、ちょうど１個の構成要素が現出・使用されることを含む。本発明が提供する産物または方法中の態様について、１個よりも多いまたは全ての構成要素が現出・使用されることを包含する。
さらに、本発明は、全ての変異物、組合せ及び取替えを含み、列挙される請求項中の１つまたは多数個の制限、素子、語句及び記述の技術用語も、別の請求項中に引用することができる。例えば、別の請求項に従属するいかなるいかなる請求項は、修飾することによって同一の基礎請求項に従属する他の請求項中の１つまたは多数個の制限を含むようになる。請求項中に素子がリストとして（例えばマーカッシュ形式）提示される場合、全ての素子の各下位群もその内に包含し、かつ任意の素子も前記群中から取り除くことができる。理解すべきことは、一般的に、発明または発明態様は、特定の素子及び／または特徴、前記発明の特定の態様、または前記素子及び／または特徴から構成されるか、実質的に構成される発明態様を包含することが理解されるべきであろう。簡素化の目的を果たすために、これらの特定に掲示されていない態様も本発明中に包含する。また、注意すべきのは、用語「含む」および「備える」は、開放式用語であり、付加的な素子またはステップを含むことを許容することが特記される。範囲が提供されると、エンドポイントの値が含まれる。さらに、上下文中に別途に反対または他の説明がない限り、当業者であれば、異なる発明態様において、前記数値範囲は、特定の値またはかかる範囲内の部分範囲を含み、かつ上下文中に別途に反対または他の説明がない限り、前記範囲の最低値の単位の１０分の１までその中に含むことが理解されるであろう。
本願中に言及されている相違特許案件、公開された特許出願、文献資料及び他の公開は、いずれも全文方式で本願に併記される。例え併記された参照書類のいずれかと本願明細書との間に矛盾が存在する場合、本願明細書の内容を準拠とする。さらに、先行技術の内に該当する本発明のいかなる特定の態様は、本願の１つまたは多数個の請求項中から除外される。前記態様は、当業者であれば公知であるため、それが明確的に除外されていなくとも、それらは除外され得る。何の理由に基づくか、または先行技術に関連するか否かに関わらず、本発明中のいかなる特定の態様を除外することができる。
１ 酵素的な方式でオリゴ糖を合成する方法であって、
（ｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群の存在下、ガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを作製し、その中、前記ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群は、ガラクトースキナーゼ、ＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼ及びピルビン酸キナーゼを含むことと、
（ｉｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ及びα−１，４ガラクトース転移酵素の存在下、Ｌａｃ−ＯＲ１ＡをＧｂ３−ＯＲ１Ａに転換し、その中、Ｒ１Ａは、水素、置換または未置換されたアルキル基、置換または未置換されたアルケニル基、置換または未置換されたアルキニル基、置換または未置換された炭素環基、置換または未置換された複素環基、置換または未置換されたアリール基、置換または未置換されたヘテロアリール基または酸素保護基団であることとを含むことを特徴とする、方法。
２ 前記ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群は、ピロホスファターゼを含むことを特徴とする、上記１に記載の方法。
３ （ｉ）及び（ｉｉ）は、Ｇｂ３−合成反応混合物中に発生され、前記Ｇｂ３−合成反応混合物は、ガラクトース、ＰＥＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｌａｃ−ＯＲ１Ａ、α−１，４−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群を含むことを特徴とする、上記１または２に記載の方法。
４ いかなる酵素反応発生前においても、Ｌａｃ−ＯＲ１ＡとガラクトースのＧｂ３−合成反応混合物中のモル比が１：１であることを特徴とする、上記３に記載の方法。
５ Ｒ１Ａは、水素、アリル基、置換されたアルキル基、ビオチンまたはセラミドであることを特徴とする、上記１〜４のいずれか１項に記載の方法。
６ 前記α−１，４ガラクトース転移酵素はナイセリア・メニンジティディスのＬｇｔＣから由来し、前記ガラクトースキナーゼは大腸桿菌から由来し、前記ＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼはシロイヌナズナから由来し、前記ピルビン酸キナーゼは大腸桿菌から由来し、または前記ピロホスファターゼは大腸桿菌から由来することを特徴とする、上記１〜５のいずれか１項に記載の方法。
７ さらにＧｂ３−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、上記１〜６のいずれか１項に記載の方法。
８ さらに（ｉｉｉ）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ及びβ−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の存在下、Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換することを含むことを特徴とする、上記１〜６のいずれか１項に記載の方法。
９ さらに（ｉｖ）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生酵素群の存在下、ＧａｌＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを作製し、その中、前記ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生酵素群は、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−リン酸ウリジル転移酵素及びピルビン酸キナーゼ、及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことを含むことを特徴とする、上記８に記載の方法。
１０（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は、Ｇｂ−４合成反応混合物中に行われ、前記Ｇｂ−４合成反応混合物は、ＧａｌＮＡｃ、ＰＥＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｇｂ３−ＯＲ１Ａ、β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生酵素群を含むことを特徴とする、上記９に記載の方法。
１１ 前記Ｇｂ−４合成反応混合物は、Ｇｂ３−合成反応混合物をＧａｌＮＡｃ、β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素と混合することで作製されることを特徴とする、上記１０に記載の方法。
１２ 前記β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素はヘモフィルス・インフルエンザ桿菌のＬｇｔＤから由来し、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼはロンガム菌から由来し、または前記Ｎ−アセチルヘキソサミン１−リン酸ウリジル転移酵素は大腸桿菌から由来することを特徴とする、上記８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
１３ さらにＧｂ４−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、上記８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
１４ さらに（ｖ）ＵＤＰ−Ｇａｌ及びβ １，３−ガラクトース転移酵素の存在下、Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを含むことを特徴とする、上記８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
１５ さらに（ｖｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群の存在下、ガラクトースをＵＤＰ−Ｇａに作製することを含むことを特徴とする、上記１４に記載の方法。
１６ （ｖ）及び（ｖｉ）は、Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記Ｇｂ５−合成反応混合物は、ガラクトース、ＰＥＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｇｂ４−ＯＲ１Ａ、β１，３−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群を含むことを特徴とする、上記１５に記載の方法。
１７ 前記β１，３−ガラクトース転移酵素はヘモフィルス・インフルエンザ桿菌のＬｇｔＤから由来することを特徴とする、上記１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
１８ さらにＧｂ５−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、上記１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
１９ さらに（ｖｉｉ）ＧＤＰ−Ｆｕｃ及びα１，２−フコース基転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをフコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを含むことを特徴とする、上記１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
２０ さらに（ｖｉｉｉ）ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群の存在下、フコースからＧＤＰ−Ｆｕｃを生成し、その中、前記ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群は、Ｌ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことを含むことを特徴とする、上記１９に記載の方法。
２１ （ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）は、フコース基−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記フコース基−Ｇｂ５−合成反応混合物は、フコース、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ５−ＯＲ、α−１，２−フコース基転移酵素及びＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群を含むことを特徴とする、上記２０に記載の方法。
２２ 前記フコース基−Ｇｂ５−合成反応混合物は、Ｇｂ５−合成反応混合物を少なくともフコース、ＧＴＰ、α−１，２−フコース基転移酵素及びＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼと混合して得られることを特徴とする、上記２０に記載の方法。
２３ 前記Ｌ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼはバクテロイデス・フラジリスから由来し、または前記α１，２−フコース転移酵素はヘリコバクター・ピロリから由来することを特徴とする、上記１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
２４ さらにフコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、上記１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
２５ さらに（ｉｘ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ及びα−２，３−シアル酸転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを含むことを特徴とする、上記１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
２６ さらに（ｘ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群の存在下、Ｎｅｕ５ＡｃからＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを生成し、その中、前記ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群は、シチジン一リン酸キナーゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことを含むことを特徴とする、上記２５に記載の方法。
２７ （ｉｘ）及び（ｘ）は、シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物は、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ、α−２，３−シアル酸転移酵素及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群を含むことを特徴とする、上記２６に記載の方法。
２８ 前記シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物は、Ｇｂ５−合成反応混合物を少なくともＮｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、α−２，３−シアル酸転移酵素、シチジン一リン酸キナーゼ及びＣＭＰ−シアル酸シンターゼと混合して得られることを特徴とする、上記２７に記載の方法。
２９ 前記α−２，３−シアル酸転移酵素は海洋細菌（Ｍ．ｂａｃｔｅｒｉａ）から由来し、前記シチジン一リン酸キナーゼは大腸桿菌から由来し、または前記ＣＭＰ−シアル酸シンターゼはパスツレラ・ムルトシダから由来することを特徴とする、上記２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
３０ シアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、上記２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
３１ さらに（ａ）Ｇｂ３−合成反応混合物を少なくともＧａｌＮＡｃ、β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素と混合することによりＧｂ４−合成反応混合物に形成することと、
（ｂ）Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ４−合成反応混合物を培養することと、
（ｃ）Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、β１，３−ガラクトース転移酵素の存在下、さらにＧｂ４−合成反応混合物を培養することと、
（ｄ）（ｃ）中に準備するＧｂ５−ＯＲ１Ａを含有する反応混合物を少なくともフコース、ＧＴＰ、α１，２−フコース基転移酵素及びＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼと混合することによりフコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物に形成することと、
（ｅ）Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをフコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、フコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物を培養することとを含むことを特徴とする、上記３に記載の方法。
３２ さらに（ａ）Ｇｂ３−合成反応混合物を少なくともＧａｌＮＡｃ、β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素と混合することによりＧｂ４−合成反応混合物に形成することと、
（ｂ）Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ４−合成反応混合物を培養することと、
（ｃ）Ｇｂ４−ＯＲ１Ａを分離することと、
（ｄ）Ｇｂ４−ＯＲ１Ａをβ１，３−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群と混合することによりＧｂ５−合成反応混合物に形成することと、
（ｅ）Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ５−合成反応混合物を培養することと、
（ｆ）Ｇｂ５−合成反応混合物を少なくともフコース、ＧＴＰ、α１，２−フコース転移酵素及びＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼと混合することによりフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物に形成することと、
（ｇ）Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、フコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物を培養することとを含むことを特徴とする、上記３に記載の方法。
３３ さらに（ａ）Ｇｂ３−合成反応混合物を少なくともＧａｌＮＡｃ、β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素と混合することによりＧｂ４−合成反応混合物に形成することと、
（ｂ）Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ４−合成反応混合物を培養することと、
（ｃ）Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、β１，３−ガラクトース転移酵素の存在下、さらにＧｂ４−合成反応混合物を培養することと、
（ｄ）（ｃ）中に準備するＧｂ５−ＯＲ１Ａを含有する反応混合物を少なくともＮｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、α２，３−シアル酸転移酵素、シチジン一リン酸キナーゼ及びＣＭＰ−シアル酸シンターゼと混合することによりシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物に形成することと、
（ｅ）Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、シアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ反応混合物を培養することとを含むことを特徴とする、上記３に記載の方法。
３４ さらに（ａ）Ｇｂ３−合成反応混合物を少なくともＧａｌＮＡｃ、β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素と混合することによりＧｂ４−合成反応混合物に形成することと、
（ａ）Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ４−合成反応混合物を培養することと、
（ｂ）Ｇｂ４−ＯＲ１Ａを分離することと、
（ｃ）Ｇｂ４−ＯＲ１Ａをβ１，３−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群と混合することによりＧｂ５−合成反応混合物に形成することと、
（ｄ）Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、Ｇｂ５−合成反応混合物を培養することと、
（ｅ）Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをα−２，３シアル酸転移酵素及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群と混合することによりシアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物に形成し、その中、前記ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群は、シチジン一リン酸キナーゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことと、
（ｆ）Ｇｂ４−ＯＲ１Ａをシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを許容する条件下、シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物を培養することとを含むことを特徴とする、上記３に記載の方法。
３５ 酵素的な方式でオリゴ糖を合成する方法であって、
（ｉ）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生酵素群の存在下を含み、ＧａｌＮＡｃからＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃを生成し、その中、前記ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生酵素群は、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、Ｎ−アセチルヘキソサミン１−リン酸ウリジル転移酵素、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことと、
（ｉｉ）ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ及びβ１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の存在下、Ｇｂ３−ＯＲ１ＡをＧｂ４−ＯＲ１Ａに転換し、その中、Ｒ１Ａは、水素、置換または未置換されたアルキル基、置換または未置換されたアルケニル基、置換または未置換されたアルキニル基、置換または未置換された炭素環基、置換または未置換された複素環基、置換または未置換されたアリール基、置換または未置換されたヘテロアリール基または酸素保護基団であることとを含むことを特徴とする、方法。
３６ （ｉ）及び（ｉｉ）は、Ｇｂ４−合成反応混合物中に行われ、その中、前記反応混合物は、ＧａｌＮＡｃ、ＰＥＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｇｂ３−ＯＲ１Ａ、β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素及びＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生酵素群を含むことを特徴とする、上記３５に記載の方法。
３７ 前記β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素はヘモフィルス・インフルエンザ桿菌のＬｇｔＤから由来し、前記Ｎ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼはロンガム菌から由来し、前記Ｎ−アセチルヘキソサミン１−リン酸ウリジル転移酵素は大腸桿菌から由来し、前記ピルビン酸キナーゼは大腸桿菌から由来し、または前記ピロホスファターゼは大腸桿菌から由来することを特徴とする、上記３５または３６に記載の方法。
３８ Ｒ１Ａは、水素、アリル基、置換されたアルキル基、ビオチンまたはセラミドであることを特徴とする、上記３５〜３７のいずれか１項に記載の方法。
３９ さらにＧｂ４−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、上記３５〜３８のいずれか１項に記載の方法。
４０ さらに（ｉｉｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ及びβ−１，３−ガラクトース転移酵素の存在下、Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを含むことを特徴とする、上記３５〜３９のいずれか１項に記載の方法。
４１ さらに（ｉｖ）ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群の存在下、ガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを生成し、その中、前記ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群は、ガラクトースキナーゼ、ＵＤＰ−ピロホスホリラーゼ、ピルビン酸キナーゼ及び状況に応じるピロホスファターゼを含むことを含むことを特徴とする、上記４０に記載の方法。
４２ （ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は、Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、その中、前記反応混合物は、ガラクトース、ＰＥＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｇｂ４−ＯＲ１Ａ、β−１，３−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群を含むことを特徴とする、上記４１に記載の方法。
４３ 前記β−１，３−ガラクトース転移酵素はヘモフィルス・インフルエンザ桿菌のＬｇｔＤから由来し、前記ガラクトースキナーゼは大腸桿菌から由来し、前記ＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼはシロイヌナズナから由来し、前記ピルビン酸キナーゼは大腸桿菌から由来し、または前記ピロホスファターゼは大腸桿菌から由来することを特徴とする、上記４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
４４ さらにＧｂ５−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、上記４０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
４５ さらに（ｖ）ＧＤＰ−Ｆｕｃ及びα−１，２−フコース転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを含むことを特徴とする、上記４０〜４４のいずれか１項に記載の方法。
４６ さらに（ｖｉ）ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群の存在下、フコースからＧＤＰ−Ｆｕｃを生成し、その中、前記ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群は、Ｌ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことを含むことを特徴とする、上記４５に記載の方法。
４７ （ｖ）及び（ｖｉ）は、フコース−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記反応混合物は、フコース、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ、α−１，２−フコース転移酵素及びＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群を含むことを特徴とする、上記４６に記載の方法。
４８ 前記フコース−Ｇｂ５−合成反応混合物は、Ｇｂ５−合成反応混合物を少なくともフコース、ＧＴＰ、α−１，２−フコース転移酵素及びＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼと混合して得られることを特徴とする、上記４７に記載の方法。
４９ 前記Ｌ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼはバクテロイデス・フラジリスから由来し、または前記α−１，２−フコース転移酵素はヘリコバクター・ピロリから由来することを特徴とする、上記４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
５０ さらにフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、上記４５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
５１ さらに（ｖｉｉ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ及びα−２，３−シアル酸転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを含むことを特徴とする、上記４０〜４４のいずれか１項に記載の方法。
５２ さらに（ｖｉｉｉ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群の存在下、Ｎｅｕ５ＡｃからＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを生成し、その中、前記ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群は、シチジン一リン酸キナーゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことを含むことを特徴とする、上記５１に記載の方法。
５３ （ｖｉｉ）及び（ｖｉｉｉ）は、シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記反応混合物は、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ４−ＯＲ１Ａ、α−２，３−シアル酸転移酵素及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群を含むことを特徴とする、上記５２に記載の方法。
５４ 前記シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物は、Ｇｂ５−合成反応混合物を少なくともＮｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、α−２，３−シアル酸転移酵素、シチジン一リン酸キナーゼ及びＣＭＰ−シアル酸シンターゼと混合して得られることを特徴とする、上記５３に記載の方法。
５５ 前記α−２，３−シアル酸転移酵素は海洋細菌（Ｍ．ｂａｃｔｅｒｉａ）から由来し、前記シチジン一リン酸キナーゼは大腸桿菌から由来し、または前記ＣＭＰ−シアル酸シンターゼはパスツレラ・ムルトシダから由来することを特徴とする、上記５１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
５６ シアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、上記５１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
５７ 酵素的な方式でオリゴ糖を合成する方法であって、
（ｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群の存在下、ガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを生成し、その中、前記ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群は、ガラクトースキナーゼ、ＵＤＰ−ピロホスホリラーゼ、ピルビン酸キナーゼ及び状況に応じるピロホスファターゼを含むことと、
（ｉｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ及びβ１，３−ガラクトサミン転移酵素の存在下、Ｇｂ４−ＯＲ１ＡをＧｂ５−ＯＲ１Ａに転換し、その中、Ｒ１Ａは、水素、置換または未置換されたアルキル基、置換または未置換されたアルケニル基、置換または未置換されたアルキニル基、置換または未置換された炭素環基、置換または未置換された複素環基、置換または未置換されたアリール基、置換または未置換されたヘテロアリール基または酸素保護基団であることとを含むことを特徴とする、方法。
５８ （ｉ）及び（ｉｉ）は、Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記反応混合物は、ガラクトース、ＰＥＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、Ｇｂ４−ＯＲ１Ａ、β１，３−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群を含むことを特徴とする、上記５７に記載の方法。
５９ 前記β１，３−ガラクトサミン転移酵素はヘモフィルス・インフルエンザ桿菌のＬｇｔＤから由来し、前記ガラクトースキナーゼは大腸桿菌から由来し、前記ＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼはシロイヌナズナから由来し、前記ピルビン酸キナーゼは大腸桿菌から由来し、または前記ピロホスファターゼは大腸桿菌から由来することを特徴とする、上記５７または５８に記載の方法。
６０ Ｒ１Ａは、水素、アリル基、置換されたアルキル基、ビオチンまたはセラミドであることを特徴とする、上記５７〜５９のいずれか１項に記載の方法。
６１ さらにＧｂ５−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、上記５７〜６０のいずれか１項に記載の方法。
６２ さらに（ｉｉｉ）ＧＤＰ−Ｆｕｃ及びα１，２−フコース基転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをフコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１に転換することを含むことを特徴とする、上記５７〜６１のいずれか１項に記載の方法。
６３ さらに（ｉｖ）ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群の存在下、フコースからＧＤＰ−Ｆｕｃを生成し、その中、前記ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群は、Ｌ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことを含むことを特徴とする、上記６２に記載の方法。
６４ （ｉｉｉ）及び（ｉｖ）は、フコース基−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記反応混合物は、フコース、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ５−ＯＲ、α−１，２−フコース基転移酵素及びＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群を含むことを含むことを特徴とする、上記６３に記載の方法。
６５ 前記フコース基−Ｇｂ５−合成反応混合物は、Ｇｂ５−合成反応混合物を少なくともフコース、ＧＴＰ、α−１，２−フコース基転移酵素及びＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼと混合して得られることを特徴とする、上記６４に記載の方法。
６６ 前記Ｌ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼはバクテロイデス・フラジリスから由来し、または前記α１，２−フコース基転移酵素はヘリコバクター・ピロリから由来することを特徴とする、上記６２〜６５のいずれか１項に記載の方法。
６７ さらにフコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、上記６２〜６６のいずれか１項に記載の方法。
６８ さらに（ｖ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ及びα−２，３−シアル酸転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することを含むことを特徴とする、上記５７〜６１のいずれか１項に記載の方法。
６９ さらに（ｖｉ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群の存在下、Ｎｅｕ５ＡｃからＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを生成し、その中、前記ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群は、シチジン一リン酸キナーゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことを含むことを特徴とする、上記６８に記載の方法。
７０ （ｖ）及び（ｖｉ）は、シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記反応混合物は、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ、α−２，３−シアル酸転移酵素及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群を含むことを特徴とする、上記６９に記載の方法。
７１ 前記シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物は、Ｇｂ５−合成反応混合物を少なくともＮｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、α−２，３−シアル酸転移酵素、シチジン一リン酸キナーゼ及びＣＭＰ−シアル酸シンターゼと混合して得られることを特徴とする、上記７０に記載の方法。
７２ 前記α−２，３−シアル酸転移酵素は海洋細菌（Ｍ．ｂａｃｔｅｒｉａ）から由来し、前記シチジン一リン酸キナーゼは大腸桿菌から由来し、または前記ＣＭＰ−シアル酸シンターゼはパスツレラ・ムルトシダから由来することを特徴とする、上記６８〜７１のいずれか１項に記載の方法。
７３ さらにシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、上記６８〜７１のいずれか１項に記載の方法。
７４ 酵素的な方式でフコース基−Ｇｂ５オリゴ糖を合成する方法であって、
（ｉ）ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群の存在下、フコースからＧＤＰ−Ｆｕｃを生成し、その中、前記ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群は、Ｌ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことと、
（ｉｉ）ＧＤＰ−Ｆｕｃ及びα−１，２−フコース転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換することとを含むことを特徴とする、方法。
７５ （ｉ）及び（ｉｉ）は、フコース−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記反応混合物は、フコース、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ、α−１，２−フコース転移酵素及びＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群を含むことを特徴とする、上記７４に記載の方法。
７６ Ｒ１Ａは、水素、アリル基、置換されたアルキル基、ビオチンまたはセラミドであることを特徴とする、上記７４または７５に記載の方法。
７７ 前記Ｌ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼはバクテロイデス・フラジリスから由来し、前記α１，２−フコース基転移酵素はヘリコバクター・ピロリから由来し、前記ピルビン酸キナーゼは大腸桿菌から由来し、または前記ピロホスファターゼは大腸桿菌から由来することを特徴とする、上記７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
７８ さらにフコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、上記７４〜７７のいずれか１項に記載の方法。
７９ 酵素的な方式でシアル酸−Ｇｂ５オリゴ糖を合成する方法であって、
（ｉ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群の存在下、Ｎｅｕ５ＡｃからＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを生成し、その中、前記ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群は、シチジン一リン酸キナーゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことと、
（ｉｉ）ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ及びα−２，３−シアル酸転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換し、その中、Ｒ１Ａは、水素、置換または未置換されたアルキル基、置換または未置換されたアルケニル基、置換または未置換されたアルキニル基、置換または未置換された炭素環基、置換または未置換された複素環基、置換または未置換されたアリール基、置換または未置換されたヘテロアリール基または酸素保護基団であることとを含むことを特徴とする、方法。
８０ （ｉ）及び（ｉｉ）は、シアル酸−Ｇｂ５−合成反応混合物中に行われ、前記反応混合物は、Ｎｅｕ５Ａｃ、ＣＴＰ、ＰＥＰ、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ、α−２，３−シアル酸転移酵素及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群を含むことを特徴とする、上記７９に記載の方法。
８１ Ｒ１Ａは、水素、アリル基、置換されたアルキル基、ビオチンまたはセラミドであることを特徴とする、上記７９または８０に記載の方法。
８２ 前記α−２，３−シアル酸転移酵素は海洋細菌（Ｍ．ｂａｃｔｅｒｉａ）から由来し、前記シチジン一リン酸キナーゼは大腸桿菌から由来し、または前記ＣＭＰ−シアル酸シンターゼはパスツレラ・ムルトシダから由来し、前記ピルビン酸キナーゼは大腸桿菌から由来し、または前記ピロホスファターゼは大腸桿菌から由来することを特徴とする、上記７９〜８１のいずれか１項に記載の方法。
８３ さらにシアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することを含むことを特徴とする、上記７９〜８２のいずれか１項に記載の方法。
８４ 少なくとも１個の酵素は、支持体上に固定されることを特徴とする、上記１〜８３のいずれか１項に記載の方法。
８５ 前記Ｌａｃ−ＯＲ１Ａ、Ｇｂ３−ＯＲ１Ａ、Ｇｂ４−ＯＲ１ＡまたはＧｂ５−ＯＲ１Ａは、支持体上に固定されることを特徴とする、上記１〜８３のいずれか１項に記載の方法。
８６ 酵素反応器であって、
（ａ）Ｇｂ３−ＯＲ１Ａを合成するための反応室であり、その中、前記室は、α−１，４−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群を含み、それらはガラクトースキナーゼ、ＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことと、
（ｂ）Ｇｂ４−ＯＲ１Ａを合成するための反応室であり、その中、前記室は、β−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素及びＵＤＰ−ＧａｌＡｃ再生酵素群を含み、それらはＮ−アセチルヘキソサミン１−キナーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン１−リン酸ウリジル転移酵素、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことと、
（ｃ）Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを合成するための反応室であり、その中、前記室は、β−１，３−ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群を含むことと、
（ｄ）フコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを合成するための反応室であり、その中、前記室は、α−１，２−フコース転移酵素及びＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群を含み、それらはＬ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことと、
（ｅ）シアル酸−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを合成するための反応室であり、その中、前記室は、α−２，３−シアル酸転移酵素及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群を含み、それらはシチジン一リン酸キナーゼ、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことと、または
（ｆ）それらの組合せを含むことを特徴とする、酵素反応器。
８７ 少なくとも１個の前記反応室中の少なくとも１個の酵素は、支持体上に固定されることを特徴とする、上記８６に記載の酵素反応器。
８８ 前記反応器は、（ｉ）反応室（ａ）及び（ｂ）と、（ｉｉ）反応室（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）と、（ｉｉｉ）反応室（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）と、（ｉｖ）反応室（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）と、（ｖ）反応室（ｂ）及び（ｃ）と、（ｖｉ）反応室（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）と、（ｖｉｉ）反応室（ｂ）、（ｃ）及び（ｅ）と、（ｖｉｉｉ）反応室（ｃ）及び（ｄ）または、（ｉｘ）反応室（ｃ）及び（ｅ）を備えることを特徴とする、上記８６または８７に記載の酵素反応器。
８９ １個または多数個のＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ再生酵素群、ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群及びＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ再生酵素群は、各自に支持体上に固定されることを特徴とする、上記８８に記載の酵素反応器。
９０ 各反応室中の全ての酵素は、支持体上に固定されることを特徴とする、上記８６〜８９に記載の酵素反応器。
９１ ガラクトース残基を基質中に添加する方法であって、
（ｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群の存在下、ガラクトースからＵＤＰ−Ｇａｌを生成し、その中、前記ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群は、ガラクトースキナーゼ、ＵＤＰ−糖ピロホスホリラーゼ及びピルビン酸キナーゼを含むことと、
（ｉｉ）ＵＤＰ−Ｇａｌと基質分子をガラクトース転移酵素により反応を行い、前記基質分子上にガラクトース残基を添加することとを含むことを特徴とする、方法。
９２ 前記ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群は、さらにピロホスファターゼを含むことを特徴とする、上記９１に記載の方法。
９３ （ｉ）及び（ｉｉ）は、前記ＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群、前記ガラクトース転移酵素、前記基質分子、ガラクトース、ＡＴＰ及びＵＴＰを含む反応混合物中に行われることを特徴とする、上記９１または９２に記載の方法。
９４ 前記基質分子は、多糖、オリゴ糖、糖タンパク、糖脂またはアグリコン（ａｇｌｙｃｏｎｅ）であることを特徴とする、上記９１〜９３のいずれか１項に記載の方法。
９５ 前記基質分子は、セラミドまたはスフィンゴ糖脂質であることを特徴とする、上記９１〜９３のいずれか１項に記載の方法。
９６ 前記ガラクトース転移酵素は、（例えばα１，４−ガラクトース転移酵素、β１，４−ガラクトース転移酵素、α１，３−ガラクトース転移酵素またはβ１，３−ガラクトース転移酵素であることを特徴とする、上記９１〜９４のいずれか１項に記載の方法。
９７ 反応室を備える酵素反応器であって、前記反応室には、ガラクトース転移酵素及びＵＤＰ−Ｇａｌ再生酵素群を含み、それらはガラクトースキナーゼ、ＵＤＰ−ピロホスホリラーゼ、ピルビン酸キナーゼ及び必要に応じるピロホスファターゼを含むことを特徴とする、酵素反応器。
９８ 前記ガラクトース転移酵素は、α−１，４−ガラクトース転移酵素、β−１，４−ガラクトース転移酵素、α−１，３−ガラクトース転移酵素またはβ−１，３−ガラクトース転移酵素であることを特徴とする、上記９７に記載の酵素反応器。
９９ 少なくとも１個の酵素は、支持体上に固定されることを特徴とする、上記９７または９８に記載の酵素反応器。

Claims (8)

  1. 酵素的な方式でフコース基−Ｇｂ５オリゴ糖を合成する方法であって、
    （ｉ）ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群、フコース、ＡＴＰ、ＧＴＰおよびＰＥＰの存在下、フコースからＧＤＰ−Ｆｕｃを生成し、この際、前記ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群は、Ｌ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼ、ピルビン酸キナーゼ及びピロホスファターゼを含むことと、
    （ｉｉ）ＧＤＰ−Ｆｕｃ及びα−１，２−フコース転移酵素の存在下、Ｇｂ５−ＯＲ１Ａをフコース−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａに転換し、この際、Ｒ１Ａは、水素、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルケニル基、置換または非置換のアルキニル基、置換または非置換の炭素環基、置換または非置換の複素環基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のヘテロアリール基、酸素保護基、ビオチンまたはセラミドであることと、
    を含み、
    この際、前記方法は、中間物を純化することなく実施される、方法。
  2. （ｉ）及び（ｉｉ）をフコース−Ｇｂ５−合成反応混合物中で行い、前記反応混合物は、前記フコース、前記ＡＴＰ、前記ＧＴＰ、前記ＰＥＰ、前記Ｇｂ５−ＯＲ１Ａ、前記α−１，２−フコース転移酵素及び前記ＧＤＰ−Ｆｕｃ再生酵素群を含む、請求項１に記載の方法。
  3. Ｒ１Ａは、水素、アリル基、置換されたアルキル基、ビオチンまたはセラミドである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記Ｌ−フコースキナーゼ／ＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼはバクテロイデス・フラジリスから由来し、前記α１，２−フコース基転移酵素はヘリコバクター・ピロリから由来し、前記ピルビン酸キナーゼは大腸桿菌から由来し、または前記ピロホスファターゼは大腸桿菌から由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. さらにフコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａを分離することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記フコース基−Ｇｂ５−ＯＲ１Ａは、支持体上に固定される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 少なくとも１個の酵素は、支持体上に固定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記Ｇｂ５−ＯＲ１Ａは、支持体上に固定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
JP2021122971A 2012-08-20 2021-07-28 オリゴ糖の大規模酵素合成方法 Active JP7376136B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261684974P 2012-08-20 2012-08-20
US61/684,974 2012-08-20
JP2020003624A JP6925658B2 (ja) 2012-08-20 2020-01-14 オリゴ糖の大規模酵素合成方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020003624A Division JP6925658B2 (ja) 2012-08-20 2020-01-14 オリゴ糖の大規模酵素合成方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2021168693A true JP2021168693A (ja) 2021-10-28
JP7376136B2 JP7376136B2 (ja) 2023-11-08

Family

ID=50100297

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015528573A Active JP6125637B2 (ja) 2012-08-20 2013-08-20 オリゴ糖の大規模酵素合成方法
JP2017075480A Active JP6462756B2 (ja) 2012-08-20 2017-04-05 オリゴ糖の大規模酵素合成方法
JP2018245600A Active JP6647382B2 (ja) 2012-08-20 2018-12-27 オリゴ糖の大規模酵素合成方法
JP2020003624A Active JP6925658B2 (ja) 2012-08-20 2020-01-14 オリゴ糖の大規模酵素合成方法
JP2021122971A Active JP7376136B2 (ja) 2012-08-20 2021-07-28 オリゴ糖の大規模酵素合成方法

Family Applications Before (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2015528573A Active JP6125637B2 (ja) 2012-08-20 2013-08-20 オリゴ糖の大規模酵素合成方法
JP2017075480A Active JP6462756B2 (ja) 2012-08-20 2017-04-05 オリゴ糖の大規模酵素合成方法
JP2018245600A Active JP6647382B2 (ja) 2012-08-20 2018-12-27 オリゴ糖の大規模酵素合成方法
JP2020003624A Active JP6925658B2 (ja) 2012-08-20 2020-01-14 オリゴ糖の大規模酵素合成方法

Country Status (11)

Country Link
US (2) US9340812B2 (ja)
EP (1) EP2885416B8 (ja)
JP (5) JP6125637B2 (ja)
KR (1) KR101685628B1 (ja)
CN (6) CN108504702B (ja)
AU (3) AU2016206315B2 (ja)
CA (4) CA2882294C (ja)
ES (1) ES2974096T3 (ja)
HK (6) HK1207668A1 (ja)
TW (5) TWI563092B (ja)
WO (1) WO2014031602A1 (ja)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7960139B2 (en) 2007-03-23 2011-06-14 Academia Sinica Alkynyl sugar analogs for the labeling and visualization of glycoconjugates in cells
US8680020B2 (en) 2008-07-15 2014-03-25 Academia Sinica Glycan arrays on PTFE-like aluminum coated glass slides and related methods
US10087236B2 (en) 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
US11377485B2 (en) 2009-12-02 2022-07-05 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
WO2011130332A1 (en) 2010-04-12 2011-10-20 Academia Sinica Glycan arrays for high throughput screening of viruses
US10130714B2 (en) 2012-04-14 2018-11-20 Academia Sinica Enhanced anti-influenza agents conjugated with anti-inflammatory activity
CA2880701A1 (en) 2012-08-18 2014-02-27 Academia Sinica Cell-permeable probes for identification and imaging of sialidases
US10086054B2 (en) 2013-06-26 2018-10-02 Academia Sinica RM2 antigens and use thereof
US9981030B2 (en) 2013-06-27 2018-05-29 Academia Sinica Glycan conjugates and use thereof
KR102298172B1 (ko) 2013-09-06 2021-09-06 아카데미아 시니카 변화된 글리코실 그룹을 갖는 당지질을 사용한 인간 iNKT 세포 활성화
WO2015109180A2 (en) 2014-01-16 2015-07-23 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
US10150818B2 (en) 2014-01-16 2018-12-11 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
EP3129767B1 (en) 2014-03-27 2021-09-01 Academia Sinica Reactive labelling compounds and uses thereof
CN107074945B (zh) 2014-05-27 2021-08-24 中央研究院 增进抗体功效的通用糖型的组合物及方法
WO2015184002A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Academia Sinica Anti-her2 glycoantibodies and uses thereof
US10118969B2 (en) 2014-05-27 2018-11-06 Academia Sinica Compositions and methods relating to universal glycoforms for enhanced antibody efficacy
CA2950415A1 (en) 2014-05-27 2015-12-03 Academia Sinica Anti-cd20 glycoantibodies and uses thereof
WO2015184001A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Academia Sinica Anti-tnf-alpha glycoantibodies and uses thereof
NZ729243A (en) 2014-08-22 2018-08-31 Academia Sinica Novel glycan conjugates and use thereof
WO2016040369A2 (en) 2014-09-08 2016-03-17 Academia Sinica HUMAN iNKT CELL ACTIVATION USING GLYCOLIPIDS
US10495645B2 (en) 2015-01-16 2019-12-03 Academia Sinica Cancer markers and methods of use thereof
US9975965B2 (en) 2015-01-16 2018-05-22 Academia Sinica Compositions and methods for treatment and detection of cancers
JP6779887B2 (ja) 2015-01-24 2020-11-04 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ 新規なグリカンコンジュゲートおよびその使用方法
TWI710571B (zh) 2015-01-24 2020-11-21 中央研究院 腫瘤標記及其使用方法
CN114702581A (zh) 2015-01-30 2022-07-05 台湾地区“中央研究院” 增进抗体功效的通用糖型组合物及方法
WO2017156192A1 (en) 2016-03-08 2017-09-14 Academia Sinica Methods for modular synthesis of n-glycans and arrays thereof
JP7213549B2 (ja) 2016-08-22 2023-01-27 シーエイチオー ファーマ インコーポレイテッド 抗体、結合性断片、および使用の方法
JP7331919B2 (ja) 2019-03-14 2023-08-23 日油株式会社 潤滑油用添加剤、潤滑油用添加剤組成物およびこれらを含有する潤滑油組成物
CN110195043A (zh) * 2019-05-15 2019-09-03 武汉格莱利生物科技有限公司 一种高水溶性的cgta酶及其制备方法和应用
CN113166770A (zh) * 2019-11-15 2021-07-23 中粮营养健康研究院有限公司 重组大肠杆菌系统及其构建方法和其在合成α-1,2-岩藻糖基化寡糖中的应用
WO2022256920A1 (en) * 2021-06-07 2022-12-15 The University Of British Columbia Acholetin biopolymers and methods for enzymatic synthesis
WO2023039090A1 (en) * 2021-09-11 2023-03-16 Academia Sinica Synthetic compound, kit comprising the same, and uses thereof

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06505638A (ja) * 1991-03-18 1994-06-30 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート オリゴ糖酵素基質及びインヒビター：方法及び組成物
US5369017A (en) * 1994-02-04 1994-11-29 The Scripps Research Institute Process for solid phase glycopeptide synthesis
JP2002085069A (ja) * 2000-09-08 2002-03-26 Seikagaku Kogyo Co Ltd β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の製造方法
WO2002055723A1 (en) * 2001-01-10 2002-07-18 Wayne State University Glycoconjugate and sugar nucleotide synthesis using solid supports
JP2002530087A (ja) * 1998-11-18 2002-09-17 ネオーズ テクノロジーズ， インコーポレイテッド オリゴ糖の安価な産生
JP2002335988A (ja) * 2001-05-22 2002-11-26 Yamasa Shoyu Co Ltd オリゴ糖の製造法
US20070202578A1 (en) * 2005-08-26 2007-08-30 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Production of globosides oligosaccharides using metabolically engineered microorganisms
JP2009534034A (ja) * 2006-04-19 2009-09-24 ノヴォ ノルディスク アクティーゼルスカブ 原核微生物におけるｏ−グリコシル化治療用タンパク質の発現
JP2011032206A (ja) * 2009-07-31 2011-02-17 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology Ｓｓｅａ系新規糖鎖化合物

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6319695B1 (en) * 1991-10-15 2001-11-20 The Scripps Research Insitute Production of fucosylated carbohydrates by enzymatic fucosylation synthesis of sugar nucleotides; and in situ regeneration of GDP-fucose
US5545553A (en) * 1994-09-26 1996-08-13 The Rockefeller University Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them
US6030815A (en) * 1995-04-11 2000-02-29 Neose Technologies, Inc. Enzymatic synthesis of oligosaccharides
CA2237849C (en) * 1996-09-17 2009-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Processes for producing sugar nucleotides and complex carbohydrates
US7244601B2 (en) * 1997-12-15 2007-07-17 National Research Council Of Canada Fusion proteins for use in enzymatic synthesis of oligosaccharides
US6194178B1 (en) * 1998-09-03 2001-02-27 Synsorb Biotech Inc. Method for the production of sialylated oligosaccharides
WO2001038536A1 (fr) * 1999-11-19 2001-05-31 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. POLYPEPTIDE GlmU ET ADN CODANT POUR CE POLYPEPTIDE
EP1689348B1 (en) * 2003-12-05 2013-05-15 Children's Hospital Medical Center Oligosaccharide compositions and use thereof in the treatment of infection
KR100888513B1 (ko) * 2006-12-15 2009-03-12 주식회사 진켐 신규 ｎ―아세틸글루코사민―２―에피머라아제 및 이를이용한 ｃｍｐ―ｎ―아세틸뉴라민산의 제조방법
AU2008206885B2 (en) * 2007-01-18 2011-02-03 Glykos Finland Oy Novel carbohydrate from human cells and methods for analysis and modification thereof
US8507660B2 (en) * 2009-03-27 2013-08-13 Academia Sinica Alpha-selective sialyl phosphate donors for preparation of sialosides and sialoside arrays for influenza virus detection
CN102443598A (zh) * 2010-10-15 2012-05-09 天津赛科瑞德生物科技有限公司 利用糖基转移酶大量制备Globo系列抗原的方法
CN102443597A (zh) * 2010-10-15 2012-05-09 天津赛科瑞德生物科技有限公司 糖核苷酸的酶法制备

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06505638A (ja) * 1991-03-18 1994-06-30 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート オリゴ糖酵素基質及びインヒビター：方法及び組成物
US5369017A (en) * 1994-02-04 1994-11-29 The Scripps Research Institute Process for solid phase glycopeptide synthesis
JP2002530087A (ja) * 1998-11-18 2002-09-17 ネオーズ テクノロジーズ， インコーポレイテッド オリゴ糖の安価な産生
JP2002085069A (ja) * 2000-09-08 2002-03-26 Seikagaku Kogyo Co Ltd β１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素の製造方法
WO2002055723A1 (en) * 2001-01-10 2002-07-18 Wayne State University Glycoconjugate and sugar nucleotide synthesis using solid supports
JP2002335988A (ja) * 2001-05-22 2002-11-26 Yamasa Shoyu Co Ltd オリゴ糖の製造法
US20070202578A1 (en) * 2005-08-26 2007-08-30 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) Production of globosides oligosaccharides using metabolically engineered microorganisms
US20110236934A1 (en) * 2005-08-26 2011-09-29 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs Production of globosides oligosaccharieds using metabolically engineered microorganisms
JP2009534034A (ja) * 2006-04-19 2009-09-24 ノヴォ ノルディスク アクティーゼルスカブ 原核微生物におけるｏ−グリコシル化治療用タンパク質の発現
JP2011032206A (ja) * 2009-07-31 2011-02-17 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology Ｓｓｅａ系新規糖鎖化合物

Also Published As

Publication number Publication date
EP2885416B1 (en) 2024-01-03
CN104822837A (zh) 2015-08-05
CN108546643B (zh) 2022-02-25
WO2014031602A1 (en) 2014-02-27
JP2017118883A (ja) 2017-07-06
JP6925658B2 (ja) 2021-08-25
HK1254772A1 (zh) 2019-07-26
AU2013305937A1 (en) 2015-02-19
CA2882294C (en) 2019-10-22
CA2882294A1 (en) 2014-02-27
CN108504702A (zh) 2018-09-07
TWI573876B (zh) 2017-03-11
CN108611384B (zh) 2022-02-25
HK1254775A1 (zh) 2019-07-26
KR101685628B1 (ko) 2016-12-12
ES2974096T3 (es) 2024-06-25
HK1254776A1 (zh) 2019-07-26
AU2016206315A1 (en) 2016-08-11
AU2018200094A1 (en) 2018-01-25
JP2015529461A (ja) 2015-10-08
AU2019203313A1 (en) 2019-05-30
CN108611384A (zh) 2018-10-02
HK1254773A1 (zh) 2019-07-26
KR20150042859A (ko) 2015-04-21
CA3129035C (en) 2023-03-07
CA3052909C (en) 2021-10-19
TWI567200B (zh) 2017-01-21
CA3052909A1 (en) 2014-02-27
JP2020054389A (ja) 2020-04-09
US9340812B2 (en) 2016-05-17
JP2019047822A (ja) 2019-03-28
TW201602352A (zh) 2016-01-16
EP2885416A4 (en) 2016-05-18
HK1207668A1 (en) 2016-02-05
CN108588151B (zh) 2022-05-13
TWI563091B (en) 2016-12-21
TW201602353A (zh) 2016-01-16
JP6462756B2 (ja) 2019-01-30
US20160230201A1 (en) 2016-08-11
TWI563092B (en) 2016-12-21
CA3187148A1 (en) 2014-02-27
AU2016206315B2 (en) 2017-12-14
EP2885416A1 (en) 2015-06-24
JP6125637B2 (ja) 2017-05-10
HK1254774A1 (zh) 2019-07-26
CN108546643A (zh) 2018-09-18
CN108504703A (zh) 2018-09-07
JP7376136B2 (ja) 2023-11-08
CN104822837B (zh) 2018-06-05
CN108588151A (zh) 2018-09-28
JP6647382B2 (ja) 2020-02-14
TW201602354A (zh) 2016-01-16
CN108504702B (zh) 2021-05-04
TW201602351A (zh) 2016-01-16
CA3129035A1 (en) 2014-02-27
US20140051127A1 (en) 2014-02-20
AU2018200094B2 (en) 2019-02-14
CN108504703B (zh) 2021-06-29
TW201418467A (zh) 2014-05-16
EP2885416B8 (en) 2024-02-14
AU2019203313B2 (en) 2020-04-30
TWI510627B (zh) 2015-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6925658B2 (ja) オリゴ糖の大規模酵素合成方法
AU2013305937B2 (en) Large scale enzymatic synthesis of oligosaccharides

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210819

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210819

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220726

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20221013

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230207

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230426

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230704

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20231003

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20231019

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7376136

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150