JPH06505638A - オリゴ糖酵素基質及びインヒビター：方法及び組成物 - Google Patents

オリゴ糖酵素基質及びインヒビター：方法及び組成物

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JPH06505638A JP4508819A JP50881992A JPH06505638A JP H06505638 A JPH06505638 A JP H06505638A JP 4508819 A JP4508819 A JP 4508819A JP 50881992 A JP50881992 A JP 50881992A JP H06505638 A JPH06505638 A JP H06505638A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴ糖酵素基質及びインヒビター：方法及び組成物共同未決出願の相互参照 本件出願は１９９１年７月３０Ｂ１こ出願された米国特許出願第０７／７３８． ２１１号の一部継続出願であり、その米国特許出願それ自体は１９９１年３月１ ８８１こ出願された米国特許出願第０７／６７０．７０１号及び１９９１年５月 ３０田こ出願された米国特許出願第０７／７０７゜６００号の一部継続出願であ る。
技術分野 本発明はオリゴ糖化合物、更に詳しくは、グリコジルトランスフェラーゼ酵素及 びグリコシダーゼ酵素の基質またはインヒビターである三糖、三糖及び四糖、そ れらの製造並びに使用に関する。
背景技術 複雑な保護／脱保護、活性化及びカップリングの方法に基くオリゴ糖の立体制御 合成が良く確立されていた。例えば、ダニシエフスキイ（Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋ ｙ）ら著、Ｊ、Ａｍ、　Ｃｈｅａ　Ｓａｃ、　、　１１１：６６５６（１９８９ ）；才力モトら著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、　４６：５８３５（１９X０）； 及 びイトウら著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、　４６：８９（１９９０）を参照のこ と。その化学合成の有益な別法はグリコジルトランスフェラーゼ酵素またはグリ コシダーゼ酵素に基く酵素的オリゴ糖合成である。トーン（Ｔｏｏｎｅ）ら著、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、　４５：５３６５（１９８９）を参照のこと。このよ うな酵素的合成の一つの利点は、徹底的な保護工程及び脱保護工程の欠如である 。このような酵素的合成の欠点は、グリコジルトランスフェラーゼ酵素及びグリ コシダーゼ酵素の特異性により生じる生産物生成の明らかな制限である。
グリコジルトランスフェラーゼは、アクセプターサツカリドへの活性化されたド ナー単糖の転移を触媒作用する高度に特異的な酵素である。その転移はオリゴ糖 または多糖の伸長または合成をもたらす。
シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトラ ンスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセ チルグルコサミニルトランスフェラーゼ等を含む幾つかのグリコジルトランスフ ェラーゼ型が記載されていた。ベイヤー（Ｂｅｙｅｒ）ら著、Ａｄｖ、　Ｅｎｚ ｙｍｏｌ、　５２：２３（１９８１）を参照のこと。これらの酵素の表示はドナ ー基質の性質を示す。こうして、例えば、シアリルトランスフェラーゼはシアル 酸部分をアクセプター分子に転移する。
上記の全般の酵素型の夫々の中で、特異的トランスフェラーゼ酵素は、形成され たグリコシド連鎖の型により更に表示される。例えば、β１．　４−ガラクトシ ルトランスフェラーゼはガラクトシル部分をアクセプター分子に転移して、この ようなアクセプターによるβ１．　４−グリコシド連鎖を形成する。
更に、グリコジルトランスフェラーゼは、ドナーグリコジル化合物が転移される アクセプター分子により特徴付けられる。牛乳からのβｌ、４−ガラクトシルト ランスフェラーゼ（Ｇａｉｔ、　ＥＣ２，４，１，２２）はアクセプター基質と してＮ−アセチルグリコサミン（ＧＩｃＮＡｃ）及びそのグリコシド（βがα− グリコシドよりも良好である）を受容することが知られている。例えば、ジャン パチャー（Ｓｃｈａｎｂａｃｈｅｒ　）ら著、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　 、　２４５．５０５７（１９７０）；バーリナ−（Ｂｅｒｌｉｎｅｒ）ら著、Ｍ ｏ１．　Ｃｅｌ　１．@Ｂｉｏｃ− ｈｅｕ　６２：３７（１９８４）；ヌネッッ（Ｎｕｎｅｚ）ら著、Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ、　１９：４９５（１９８０）；ベイヤーら著、Ａｄｖ、Ｅｎｚｙ ｍｏｌ、５２：２３（１９８１）；バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）ら著、Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　、　２４７：７１３５（１９７２）；及びババッド（Ｂａ ｂａｄ）ら著、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２４１．２６７２（１９６ ６）を参照のこと。また、グルコース並びにそのα−グリコシド及びβ−グリコ シドが受容し得るが、ラクトアルブミンがα−グリコシドに関して必要とされる 。ベイヤーらの上記の文献を参照のこと。
上記のドナー及び連鎖特異性と一緒に採用して、このようなアクセプター特異性 はグリコジルトランスフェラーゼ活性の特異な生産物を特定するのに使用される 。
オリゴ糖は、還元末端のサツカリドが実際に還元糖であるか否かを問わないで、 還元性末端及び非還元性末端を有すると考えられる。容認された命名法に従って 、オリゴ糖は左に非還元性末端、そして右に還元性末端を有して本明細書に記載 される。
こうして、本明細書に記載された全てのオリゴ糖は、非還元性サツカリドの名称 または略号（例えば、Ｇａ１）、続いてグリコシド形成の配置（αまたはβ）、 その結合に関与した非還元性サツカリドの環位置（ｌまたは２）、その結合に関 与した還元性サツカリドの環位置（２，３，４，６または８）、そして次に還元 性サツカリドの名称または略号（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）で記載される。
自然に起こる合成経路を、その合成反応を抑制することにより研究するのに使用 し得る合成サツカリドをつくることは、しばしば極めて困難である。このような 合成インヒビターの欠如は、炭水化物生産及び回転に関する代謝変化の効果を調 べようとする試みを妨げる。
また、薬剤用の担体または可溶化剤として有益である新規な非天然産のオリゴ糖 及び多糖を調製することは、しばしば困難であり、またこれらは、それらの非天 然構造のために、生体内で分解に対して抵抗性である。
°　それ故、トランスフェラーゼ酵素及びグリコシダーゼ酵素の基質またはイン ヒビターとして利用できるオリゴ糖化合物及びその有効な製造方法に対する緊急 の要望がある。
発明の簡単な要約 本発明は、幾つかのグリコシルトランスフエラーセの基質であり、またその他の グリコジルトランスフェラーゼ酵素及びグリコシダーゼ酵素を抑制する新規なオ リゴ糖、並びにこのようなオリゴ糖の製造方法を提供する。また、これらのオリ ゴ糖はシアリルＬｅ’及びその類縁体の如きその他のオリゴ糖の合成におけるビ ルディング・ブロックとして有益である。
−局面において、本発明は構造式Ｉ： に相当するオリゴ糖を意図している。
［式中、 Ｘは０．Ｓ、ＳＯ，ＳＯ２またはＮＲ＋ｓ（式中、Ｒｌｓは水素、ｃｌ−ｃ１！ アシル、Ｃｌ−Ｃ＋ｔフルキル、Ｃｌ−Ｃ４７にコキシカルポニルであり、また は＞ＮＲ＋ｓはＣｌ−ＣｕアルキルＮ−オキサイドである）であり；Ｒ−よ不在 （存在しないこと）、水素、ヒドロキシル、Ｃ，−Ｃ，アシル、Ｃｌ−Ｃ４アル コキシカルボニルオキシ、５個までの炭素原子を含む飽和もしくは不飽和アルコ キシドもしくはアルコキシアルコキシドまたはグリコシド連鎖サツカリドであり ： Ｒ１″は水素であり、またはえとＲ３°は一緒になってオキソ基を形成し；Ｒ１ は不在、水素、ヒドロキシル、ハライド、Ｃｌ−Ｃｓアルコキシまたは、ＮＲ０ ７Ｒ１，（式中、Ｒｌｔは水素またはＣｌ−Ｃ４アルキルであり、かっＲＩｓは 水素、Ｃ，−Ｃ，アルキル、Ｃｌ−Ｃ４アシル、またはＣ，−Ｃ，アルコキシカ ルボニルであり、またはＮＲ＋ｖＲ＋ｓは一緒になって４〜８個の炭素原子を含 む環状イミド基を形成する）であり： Ｒ３及びＲ１は独立に水素、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、ヒドロキシル、チオフェニル 、Ｃ，−Ｃ，アルキルチオ、５個までの炭素原子を含む飽和もしくは不飽和アル コキシドもしくはアルコキシアルコキシド、グリコシド連鎖のグルコシル基、Ｎ −アセチルグルコサミニル基、ガラクトシル基、Ｎ−アセチルガラクトサミニル 基、フコシル基、マンノシル基、ラムノシル基、シアリル基またはこれらの三糖 であり、またはＲ８及びＲ１は一緒になってオキソ基を形成し、但し、（ｉ）Ｒ ｓ及びＲ１が一緒になってオキソ基を形成する場合、（ｉｉ）Ｒｙ及びＲ８が不 在であり、それらの結合がエチレン性不飽和を形成する場合または（ｉｉｉ）　 ＸがＮＲ，、である場合を除いて、Ｒ３及びＲ４の少な（とも一つが水素である ことを条件とする；Ｒ３は不在、水素、ヒドロキシル、メチル、Ｃ、−Ｃ，アシ ルまたはＣｌ−Ｃａアルコキシカルボニルオキシであり； Ｒ６は不在、ヒドロキシメチル、メチル、トリヒドロキシプロピル、メチレンＣ ｌ−Ｃ４アシルオキシまたはベンジルオキシであり；Ｒ１は水素またはカルボキ シルであり；Ｒ，は水素、ヒドロキシルまたはアセトアミドであり：Ｒ１はヒド ロキシメチル、メチル、トリヒドロキシプロピル、メチレンＣｌ−Ｃ４アシルオ キシまたはベンジルオキシであり、またＲ８が水素であり、かっＲ１１がＮ−ア セチルアミノである場合には３−アセトキシ−１，２−ジヒドロキシプロピル、 ３−ラクチルオキシ−１，２−ジヒドロキシプロピル、３−アジド−１゜２−ジ ヒドロキシプロピル、及び３−フルオロ−１，２−ジヒドロキシプロピルであり ； Ｒ１゜は不在、ヒドロキシルまたはアセトアミドであり：Ｒ０は不在、ヒドロキ シルまたはアセトアミドであり；Ｒ１！はヒドロキシルまたはアセトアミドであ り：Ｒ１３はヒドロキシメチルまたはトリヒドロキシプロピルであり、またＲ４ が水、素であり、かつＲ１，がＮ−アセチルアミノである場合には３−アセトキ シ−１゜２−ジヒドロキシプロピル、３−ラクチルオキシ−１，２−ジヒドロキ シプロピル、３−アジド−１，２−ジヒドロキシプロピル、及び３−フルオロ− １，２−ジヒドロキシプロピルであり； Ｒｔ４は水素またはカルボキシルであり；Ｒｌｓは水素、ヒドロキシルまたはア セトアミドであり：かつｍは０またはＩであり、その結果、ｍが０である場合に は、環Ｃは不在であり、またｍが１である場合には、環Ｃは存在する；但し、（ ａ）置換基Ｒ，，Ｒ，及びＲ３の一つまたはＲ６のヒドロキシル基が環Ｂから不 在であり、また環Ｂが不在置換基の環Ｂ炭素へのグリコシド結合により環Ａに結 合され、また番号を付された置換基またはヒドロキシルのみが不在であること（ 環へがここに列挙された以外のその置換基またはヒドロキシルの位置で環Ｂに結 合されている場合）；（ｂ）ｍがｌである場合、置換基Ｒｈｏ及びＲｕの一つま たはＲ９のヒドロキシル基が環Ａから不在であり、また環Ｃがその不在置換基ま たはヒドロキシルの環Ａ炭素へのグリコシド結合により環へに結合されており、 また番号を付された置換基またはヒドロキシルのみ力坏在であり（環Ｃがその置 換基またはヒドロキシルの位置で環Ａに結合されている場合）、またはＲいＲｔ 　、Ｒｓのうちの第二の置換基またはＲ６のヒドロキシプロピルであり、また環 Ｃがその第二の不在置換基またはヒドロキシルの環Ｂ炭素へのグリコシド結合に より環Ｂに結合されていること；（Ｃ）下記の構造の一つが存在する場合にのみ Ｘが０であること；（ｉ）Ｒ＋とＲ１′が一緒になってオキソ基を形成する、（ ｉｉ）Ｒ１とＲ１またはＲ４とがヒドロキシルではない、（ｉｉｉ）　ＲｓとＲ ４が一緒になってオキソ基を形成する、（ｊｖ）ＲｓとＲ１のどちらもがＣｌ− Ｃ＊アシルルチオである、または（ｖ）　ＲｓとＲ８力坏在であり、かつそれら の結合がエチレン性不飽和を形成し、またＲ＋　、Ｒｓ　、ＲｓまたはＲ１のい ずれかがヒドロキシルではなく、またはＲ６がヒドロキシメチルではない】また （ｄ）　ＲｔとＲ８力坏在であり、またＸが０である場合にのみそれらの結合が エチレン性不飽和を形成することを条件とする］ 別の局面において、本発明は構造式ＩＩに相当するオリゴ糖を意図している。
［式中、 Ｘは０、ｓ、ｓｏ、ｓｏｔまたはＮＲ＋ａ（式中、Ｒ１６は水素、Ｃｌ−Ｃｌｔ アシル、Ｃｌ−Ｃｕアルキル アルキルＮ−オキサイドである）であり；Ｒ，は不在、水素、ヒドロキシル、Ｃ ．−Ｃ．アシル、Ｃｌ−Ｃｓアルコキシカルボニルオキシ、５個までの炭素原子 を含む飽和もしくは不飽和アルコキシドもしくはアルコキシアルコキシドまたは グリコシド連鎖サツカリドであり；Ｒ１は水素であり、またはＲ１とＲ１′は一 緒になってオキソ基を形成し：Ｒｔは不在、水素、ヒドロキシル、ハライド、Ｃ ｌ−ＣｓアルコキシまたはＮ　Ｒ＋　ｔ　Ｒ１ｇ　（式中、Ｒ＋ｔは水素または Ｃｌ−Ｃ４アルキルであり、かつＲＩＩは水素、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、Ｃｌ−Ｃ ４アシル、またはＣｌ−Ｃ４アルコキシカルボニルであり、またはＮＲ＋ｔＲｒ ａは一緒になって４〜８個の炭素原子を含む環状イミド基を形成する）であり； Ｒｓ及びＲ１は独立に水素、Ｃ，−Ｃ，アルキル、ヒドロキシル、チオフェニル 、Ｃｌ−Ｃｓアルキルチオ、５個までの炭素原子を含む飽和もしくは不飽和アル コキシドもしくはアルコキシアルコキシド、グリコシド連鎖のグルコシル基、Ｎ −アセチルグルコサミニル基、ガラクトシル基、Ｎ−アセチルガラクトサミニル 基、フコシル基、マンノシル基、ラムノシル基、シアリル基またはこれらの三糖 であり、またはＲ１及びＲ１は一緒になってオキソ基を形成し、但し、（ｉ）Ｒ ｓ及びＲ４が一緒になってオキソ基を形成する場合、（ｉｉ）Ｒｗ及びＲ５が不 在であり、それらの結合がエチレン性不飽和を形成する場合または（ｉｉｉ）　 ＸがＮＲ＋ｓである場合を除いて、Ｒ１及びＲ４の少な（とも一つが水素である ことを条件とする；Ｒ５は不在、水素、ヒドロキシル、メチル、Ｃｌ−Ｃａアシ ルまたはＣｌ−Ｃ４アルコキシカルボニルオキシであり； 、Ｒｓは不在、ヒドロキシメチル、メチル、トリヒドロキシプロピル、メチレン Ｃ０二Ｃ４アシルオキシまたはベンジルオキシであり；Ｒ７は水素またはカルボ キシルであり；Ｒ，は水素、ヒドロキシルまたはアセトアミドであり：Ｒ９はヒ ドロキシメチル、メチル、トリヒドロキシプロピル、メチレンＣ０二Ｃ４アシル オキシまたはベンジルオキシであり、またＲ８が水素であり、かつＲ１１がＮ− アセチルアミノである場合には３−アセトキシ−１，２−ジヒドロキシプロピル 、３−ラクチルオキシ−１，２−ジヒドロキシプロピル、３−アジド−１゜２− ジヒドロキシプロピル、及び３−フルオロ−１，２−ジヒドロキシプロピルであ り； Ｒ＋＋はヒドロキシルまたはアセトアミドであり；但し、（ａ）置換基Ｒ＋　、 Ｒｔ　、Ｒｓの一つまたはＲ８のヒドロキシル基が環Ｂから不在であり、また環 Ｂがその不在置換基の環Ｂ炭素へのグリコシド結合により環Ａに結合され、また 番号を付された置換基またはヒドロキシルのみが不在であること（環Ａがここに 列挙された以外のその置換基またはヒドロキシルの位置で環Ｂに結合されている 場合）；（ｂ）下記の構造の一つが存在する場合にのみＸがＯであること；（ｉ ）Ｒ１とＲ＋’が一緒になつてオキソ基を形成する、（ｉｉ）Ｒ＋とＲ１または Ｒ４とがヒドロキシルではない、（ｉｉｉ）　ＲｓとＲ４が一緒になってオキソ 基を形成する、（ｉｖ）ＲｓまたはＲ４のいずれかがＣｌ−Ｃｓアルキルチオで ある、または（ｖ）ＲｔとＲ３が不在であり、かつそれらの結合がエチレン性不 飽和を形成し、またＲ＋　、Ｒｓ　、ＲｓまたはＲ１のいずれかがヒドロキシル ではなく、またはＲ６がヒドロキシメチルではない：また（Ｃ）　Ｒ１とＲ１が 不在であり、またＸが０である場合にのみそれらの結合がエチレン性不飽和を形 成することを条件とする］ 別の局面において、本発明は、水性媒体中で活性化されたドナー単糖を活性化さ れたドナー単糖とアクセプターサツカリドの両方に対して特異性を有する触媒量 のグリコジルトランスフェラーゼの存在下で上記の式ＩＩ、または下記の式Ｉ１ １のアクセプターサツカリドと混合して反応混合物を生成する工程、及びその反 応混合物を、アクセプターサツカリドがグリコジル化され、そしてグリコジル化 されたアクセプターサツカリドを生成するのに充分な期間及び条件下に保つ工程 を含むグリコジル化の方法を提供する。
（式中、式ＩＩＩのＸ及びＲ３−Ｒ６は上記の式１１に定義されたとおりである ）好ましい実施態様において、グリコジル化の方法は、（ａ）水性媒体中で、 （ｉ）アクセプターサツカリド： （ｉｉ）ドナー単糖； （ｉｉｉ）　トナー単糖に対して特異性を有する活性化ヌクレオチド：（ｉｖ） 活性化されたドナー単糖を再生する系；（Ｖ）ピロホスフェート脱除剤；及び （ｖｌ）ドナー単糖の活性化された形態及びアクセプターサツカリドの両方に対 して特異性を有する触媒量のグリコジルトランスフェラーゼと、ドナー単糖及び 活性化ヌクレオチドの両方に対して特異性を有する触媒量のヌクレオチド−糖− ピロホスホリラーゼ を互いの存在下で混合して反応混合物を生成する工程；及び（ｂ）その反応混合 物を、アクセプターサツカリドがグリコジル化され、そしてグリコジル化された アクセプターサツカリドを生成するのに充分な期間及び条件下に保つ工程 を含む。
アクセプターサツカリドはアクセプター単糖またはアクセプターオリゴ糖であり 得る。アクセプターオリゴ糖それ自体は反応混合物中で調製でき、その反応混合 物は ＜ａ）第二のアクセプターサツカリド；（ｂ）第二のドナー単糖： （Ｃ）第二のドナー単糖に対して特異性を有する第二の活性化ヌクレオチド；（ ｄ）第二の活性化されたドナー単糖を再生する系；（ｅ）（ｉ）第二のドナー単 糖の活性化された形態及び第二のアクセプターサツカリドの両方に対して特異性 を有する触媒量のグリコジルトランスフェラーゼと、（ｉｉ）第二のドナー単糖 及び第二の活性化ヌクレオチドの両方に対して特異性を有する触媒量のヌクレオ チド−糖−ピロホスホリラーゼを更に含む。
そのグリコジル化の方法に使用される活性化されたドナー単糖再生系は、ホスフ ェートドナー及び触媒量のキナーゼ（これはホスフェートドナーから活性化ヌク レオチドへのホスフェートの転移を触媒作用する）を含む。
また、本発明はフ７−ゲミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ＣＭＰＳＩＬ−１（このファ ーゲミドは、修飾されたＣＭＰ−シアル酸シンセターセ酵素を暗号化する遺伝子 を含む）で形質転換さ更に、本発明は上記の式ＩＩＩのアクセプターサツカリド を意図している。
また、水性媒体中に分散されたグリコジルトランスフェラーゼまたはグリコシダ ーゼ抑制量の前記のオリゴ糖化合物を含む組成物が本発明により意図されている 。水性媒体は医薬上杵されることが好ましい。
図面の簡単な説明 明細書の一部を形成する図面において、図１はＧａ１Ｔ遺伝子並びにその他の成 分の配置を示すプラスミドｐｌＮ−ＧＴの略図である。
図２は、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ構造遺伝子を含むだけでなく、上流の Ｌａｃ２プロモーターと、Ｅｃｏ　Ｒ１制限部位（下線が施されている）、リポ ソーム結合部位（Ｒｉｂ、下線が施された配列）及びＡＴＧ　（下線が施されて いる）開始シグナルを有するリンキングＤＮＡと、ｔａｇペプチドの下流のアミ ノ酸残基配列及び開Ａ停止シグナル（箱形で示されている）、続いて下流にＸｂ ａ　Ｉ制限部位及びＮｏｔ　Ｉ制限部位と、実施例２に記載のλＬｃｌベクター からのアームを含む１．３ｋｂのＰＣＲ増幅増幅度物を含むＤＮＡインサートの 構成を示す略図である。
図３はファーゲミドＣＭＰＳＩＬ−１の主要な特徴を示す略図である。図２から のＰＣＲ増幅生産物インサートが上に示されている。また、インサート及びその 他の遺伝子の配向が示されている。
本発明の化合物は、オリゴ糖、即ち、２〜ｌＯのサツカリド単位を含む化合物、 好ましくは三糖、三糖または四糖である。
一実施態様において、本発明のオリゴ糖は構造式Ｉに相当する。
［式中、 ＸはＯ，Ｓ、ＳＯ，ＳＯ２またはＮＲｔｓ（式中、ＲＩ６は水素、Ｃｒ−Ｃｕア シル、Ｃｔ−Ｃｔｔアルキル、Ｃｌ−Ｃ４アルコキシカルボニルであり、または ＞ＮＲ、ｓはＣｔ−Ｃ＋ｔアルキルＮ−オキサイドである）であり；Ｒ８は不在 、水素、ヒドロキシ、Ｃｌ−Ｃ４アシル、Ｃ，−Ｃ，アルコキシカルボニルオキ シ、５個までの炭素原子を含む飽和もしくは不飽和アルコキシドもしくはアルコ キシアルコキシドまたはグリコシド連鎖サツカリドであり；Ｒ５”は水素であり 、またはＲ３とＲ＋’は一緒になってオキソ基を形成し：Ｒ１は不在、水素、ヒ ドロキシル、ハライド、Ｃ，−Ｃ，アルコキシまたはＮＲ＋ｔＲ＋＊　（式中、 Ｒｌｔは水素またはＣｌ−Ｃ４アルキルであり、かつＲ１，は水素、Ｃ，−Ｃ， アルキル、Ｃｌ−Ｃ４アシル、またはＣｌ−Ｃ４アルコキシカルボニルであり、 またはＮＲ＋ｔＲ＋＊は一緒になって４〜８個の炭素原子を含む環状イミド基を 形成する）であり； Ｒ１及びＲ４は独立に水素、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、ヒドロキシル、チオフェニル １、Ｃ，−Ｃ，アルキルチオ、５個までの炭素原子を含む飽和もしくは不飽和ア ルコキシドもしくはアルコキシアルコキシド、グリコシド連鎖のグルコシル基、 Ｎ−アセチルグルコサミニル基、ガラクトシル基、Ｎ−アセチルガラクトサミニ ル基、フコシル基、マンノシル基、ラムノシル基、シアリル基またはこれらの三 糖であり、またはＲ１及びＲ１は一緒になってオキソ基を形成し、但し、（ｉ） Ｒｓ及びＲ４が一緒になってオキソ基を形成する場合、（ｉｉ）Ｒｚ及びＲ８力 坏在であり、それらの結合がエチレン性不飽和を形成する場合または（ｉｉｉ） 　ＸがＮＲｌｓである場合を除いて、Ｒ１及びＲ１の少な（とも一つが水素であ ることを条件とする：Ｒ３は不在、水素、ヒドロキシル、メチル、Ｃｌ−Ｃ４ア シルまたはＣ，−Ｃ，アルコキシカルボニルオキシであり： Ｒ６は不在、ヒドロキシメチル、メチル、トリヒドロキシプロピル、メチレンＣ ，−Ｃ４アンルオキシまたはベンジルオキシであり。
Ｒ７は水素またはカルボキシルであり。
Ｒ１は水素、ヒドロキシルまたはアセトアミドであり。
Ｒ９はヒドロキシメチル、メチル、トリヒドロキシプロピル、メチレンＣｌ−Ｃ ４アシルオキシまたはベンジルオキシであり、またＲ３が水素であり、がっＲ１ １がＮ−アセチルアミノである場合には３−アセトキシ−１，２−ジヒドロキシ プロピル、３−ラクチルオキシ−１，２−ジヒドロキシプロピル、３−アジド− １゜２−ジヒドロキシプロピル、及び３−フルオロ−１，２−ジヒドロキシプロ ピルであり； Ｒ１゜は不在、ヒドロキシルまたはアセトアミドであり；Ｒｌｔは不在、ヒドロ キシルまたはアセトアミドであり；Ｒｔｔはヒドロキシルまたはアセトアミドで あり；Ｒ１３はヒドロキシメチルまたはトリヒドロキシプロピルであり、またＲ １８が水素であり、かつＲ１！がＮ−アセチルアミノである場合には３−アセト キシ−１゜２−ジヒドロキシプロピル、３−ラクチルオキシ−１，２−ジヒドロ キシプロピル、３−アジド−１，２−ジヒドロキシプロピル、及び３−フルオロ −１，２−ジヒドロキシプロピルであり； Ｒ１４は水素またはカルボキシルであり；、　ＲＩｌｌは水素、ヒドロキシルま たはアセトアミドであり；かっｍはＯまたはｌであり、その結果、ｍが０である 場合には、環Ｃは不在であり、またｍが１である場合には、環Ｃは存在する；但 し、（ａ）置換基Ｒ＋　、Ｒｔ及びＲ６の一つまたはＲ６のヒドロキシル基が環 Ｂから不在であり、また環Ｂが不在置換基の環Ｂ炭素へのグリコシド結合により 環へに結合され、また番号を付された置換基またはヒドロキシルのみが不在であ ること（環Ａがここに列挙された以外のその置換基またはヒドロキシルの位置で 環Ｂに結合されている場合）；（ｂ）ｍが１である場合、置換基Ｒ１゜及びＲｏ の一つまたはＲ１のヒドロキシル基が環へから不在であり、また環Ｃがその不在 置換基またはヒドロキシルの環Ａ炭素へのグリコシド結合により環へに結合され ており、また番号を付された置換基またはヒドロキシルのみが不在であり（環Ｃ がその置換基またはヒドロキシルの位置で環Ａに結合されている場合）、または Ｒ１、Ｒ，、Ｒ，のうちの第二の置換基またはＲ６のヒドロキシルが不在であり 、また環Ｃがその第二の不在置換基またはヒドロキシルの環Ｂ炭素へのグリコシ ド結合により環Ｂに結合されていること：（Ｃ）下記の構造の一つが存在する場 合にのみＸが０であること；（ｉ）ＲｔとＲｌｏが一緒になってオキソ基を形成 する、（ｉｉ）Ｒ１とＲ５またはＲ４とがヒドロキシルではない、（ｉｉｉ）　 Ｒ，とＲ１が一緒になってオキソ基を形成する、（ｉｖ）ＲｓとＲ４のどちらも がＣｒ−Ｃｓアルキルチオである、または（ｖ）ＲｔとＲ３力坏在であり、かつ それらの結合がエチレン性不飽和を形成し、またＲｔ　、Ｒｓ　、ＲｓまたはＲ ，のいずれかがヒドロキシルではな（、またはＲｓがヒドロキシメチルではない ；また（ｄ）　ＲｔとＲ８力坏在であり、またＸが０である場合にのみそれらの 結合がエチレン性不飽和を形成することを条件とする」 本発明のその他のオリゴ糖化合物は構造式ＩＩに相当する。
［式中１ 、Ｘはｏ、ｓ、ｓｏ、ＳＯ，またはＮＲｔｓ（式中、Ｒｔｔは水素、Ｃｒ−Ｃ＋ ズアシル、０ｌ−Ｃ１ｆアルキル、Ｃ，−Ｃ，アルコキシカルボニルであり、ま たは＞ＮＲｔｓはＣｒ−Ｃ＋ｔアルキルＮ−オキサイドである）であり；Ｒ１は 不在、水素、ヒドロキシル、Ｃ，−Ｃ，アシル、Ｃｌ−Ｃ４アルコキシカルボニ ルオキシ、５個までの炭素原子を含む飽和もしくは不飽和アルコキシドもしくは アルコキシアルコキシドまたはグリコシド連鎖サツカリドであり：Ｒ＋’は水素 であり、またはＲ，とＲ３゛は一緒になってオキソ基を形成し；Ｒ７は不在、水 素、ヒドロキシル、／％ライド、ＣｒＣｓアルコキシまたはＮＲ，□Ｒ＋ａ（式 中、ＲＩ　７は水素またはＣ，−Ｃ，アルキルであり、かつＲｔｔは水素、Ｃ， −Ｃ，アルキル、Ｃｒ−Ｃ４アンル、またはＣｌ−Ｃ４アルコキシカルボニルで あり、またはＮＲ＋ｔＲ＋ａは一緒になって４〜８個の炭素原子を含む環状イミ ド基を形成する）であり： Ｒ１及びＲ４は独立に水素、ＣＩ−Ｃ＜アルキル、ヒドロキシル、チオフェニル 、Ｃ，−Ｃ，アルキルチオ、５個までの炭素原子を含む飽和もしくは不飽和アル コキシドもしくはアルコキシアルコキシド、グリコシド連鎖のグルコシル基、Ｎ −アセチルグルコサミニル基、ガラクトシル基、Ｎ−アセチルガラクトサミニル 基、フコシル基、マンノシル基、ラムノシル基、シアリル基またはこれらの三糖 であり、またはＲ８及びＲ４は一緒になってオキソ基を形成し、但し、（ｉ）Ｒ ｓ及びＲ４が一緒になってオキソ基を形成する場合、（ｉｉ）Ｒ，及びＲ３力坏 在であり、それらの結合がエチレン性不飽和を形成する場合または（ｉｉｉ）　 ＸがＮＲｔｓである場合を除いて、Ｒ８及びＲ４の少なくとも一つが水素である ことを条件とする；Ｒ３は不在、水素、ヒドロキシル、メチル、Ｃｌ−Ｃ４アシ ルまたはＣ，−Ｃ，アルコキシカルボニルオキシであり； Ｒ１は不在、ヒドロキシメチル、メチル、トリヒドロキシプロピル、メチレンＣ ｌ−Ｃ４アシルオキシまたはベンジルオキシであり；Ｒ１は水素またはカルボキ シルであり；Ｒ１は水素、ヒドロキシルまたはアセトアミドであり；Ｒｏはヒド ロキシメチル、メチル、トリヒドロキシプロピル、メチレンＣ，−Ｃ。
アシルオキシまたはベンジルオキシであり、またＲ１が水素であり、かつＲ１１ がＮ−アセチルアミノである場合には３−アセトキシ−１，２−ジヒドロキシプ ロピル、３−ラクチルオキシ−１，２−ジヒドロキシプロピル、３−アジド−１ ゜２−ジヒドロキシプロピル、及び３−フルオロ−１，２−ジヒドロキシプロピ ルであり； Ｒｏはヒドロキシルまたはアセトアミドであり；但し、（ａ）置換基Ｒ１，Ｒ１ 、Ｒｓの一つまたはＲ６のヒドロキシル基が環Ｂから不在であり、また環Ｂがそ の不在置換基の環Ｂ炭素へのグリコシド結合により環Ａに結合され、また番号を 付された置換基またはヒドロキシルのみ力坏在であること（環Ａがここに列挙さ れた以外のその置換基またはヒドロキシルの位置で環Ｂに結合されている場合） ；（ｂ）下記の構造の一つが存在する場合にのみＸが０であること；（ｉ）Ｒｔ とＲ１が一緒になってオキソ基を形成する、（ｉｉ）ＲｔとＲ１またはＲ４とが ヒドロキシルではない、（ｉｉｉ）　Ｒ３とＲ４が一緒になってオキソ基を形成 する、（ｉｖ）ＲｓまたはＲ４のいずれか力’Ｃ＋−Ｃｓアルキルチオである、 または（ｖ）ＲｚとＲ８力坏在であり、かつそれらの結合がエチレン性不飽和を 形成し、またＲｔ　、Ｒｓ　、ＲｓまたはＲ１のいずれかがヒドロキシルではな く、またはＲ，がヒドロキシメチルではない；また（Ｃ）　Ｒ１とＲ３力坏在で あり、またＸが０である場合にのみそれらの結合がエチレン性不飽和を形成する ことを条件とする］ サツカリド（糖）単位の例として、６員環が挙げられ、また普通の天然産の糖、 例えば、グルコース（Ｇｌｃ）　、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ） 、ガラクトース（Ｇａｌ）　、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、 マンノース（Ｍａｎ）　、ラムノース（Ｒｈａ）　、フコース（Ｆｕｃ）　、シ アル酸（ＮｅｕＡｃ）　、等の置換構造、及びそれらの２−デオキシ誘導体が挙 げられる。
サツカリド単位はグリコシド結合により一緒に結合される。典型的には、グリコ シド結合は非還元性の末端糖（式■またはＩＩの環へ）の１位の炭素原子と、還 元性の末端糖（式ＩまたはＩＩの環Ｂ）の２位、３位、４位または６位の炭素原 子の間にある。非還元性の末端糖がシアル酸である場合、そのグリコシド結合は シアル酸の２位の炭素原子と、還元性の末端糖の２位、３位、４位、６位または ８位の炭素原子の間にある。
グリコシド結合はα配置またはβ配置を有し得る。β１．　４−結合、αｌ、３ −結合及びＣ２，６−結合が本明細書で例示として使用され、これらが好ましい 。
また、その他の結合配置が意図されている。
上記の式、及び本明細書で使用されるその他の式において、典型的には、環炭素 原子の夫々における唯一の基が示されている。これらの環炭素の夫々に結合され た第四の示されていない基は、未置換の炭水化物中に存在するような水素原子で ある。“第四の基”として示された二つの基は、こうしてオキソ基が存在するこ とを認めるように示される。更に、Ｒ１及びＲ４が水素及びヒドロキシルである 場合、両方のアノマーが意図されている。
上記の構造式及び以下に示される構造式はまた環の平面に対する基Ｒ１〜Ｒｌｓ の配向を示さない。α配向及びβ配向の夫々がＲ１〜Ｒ＋　ｓの夫々につき意図 され、こうしてこれらの置換基が一般に示される。
置換基の配向は前駆体分子の関数であり、またその置換基配向は所望により変化 し得る。以下に説明されるように、Ｒ１〜Ｒ＋ｓの特別な配向が好ましい。
式Ｉに関して、ｍが１である場合に環Ｃが存在し、またｍが０である場合に環Ｃ 力坏在であることが最初に注目される。こうして、ｍが０である場合、式Ｉは式 ｔｉに変わる。ｍが１である場合、環Ｃは環Ａ（機構ｌ及び２）または環Ｂ（機 構３及び表１ａ）に結合でき、その結果、夫々、直線状または分枝オリゴ糖が式 中の結合されていないように示された酸素により形成される。環Ａは常に式■及 び１１の両方で環Ｂに結合されている。それ故、Ｒ１、ＲいＲ８の一つまたは環 ＢＲ［株］のヒドロキシルは常に不在であり、環Ａへのグリコシド結合により置 換されている。
その他に、環Ｃか存在しくｍ＝１）、また環Ｂにグリコシド結合されている場合 、Ｒ１、Ｒ１、Ｒ，の第二の基またはＲ６のヒドロキシメチル在であり、また環 Ｃへの別の第二のグリコシド結合により置換されている。環Ｃが存在し、また環 Ａにグリコシド結合されている場合、Ｒｏ、ＲＩ！の−っまたはＲ９のヒドロキ シメチル在であり、また環Ｃへのグリコシド結合により置換されている。
たはＲ３がグリコシド結合により置換されている。しがしながら、環ＡまたはＣ １のいずれかがシアリルである場合、Ｒ６またはＲ１のヒドロキシメチル基のヒ ドロキシルがグリコシド結合により置換されている。
式ｎ中でＡ及びＢと標識された環は、左の括弧の左に示された環Ａのグリコシド 結合の酸素により一緒に結合されている。その酸素原子は、ＲＩ　、Ｒｔ　、Ｒ ｓまたはＲ６に結合されていると示される環Ｂの炭素原子の一つに結合でき、従 って適当なＲＩ、Ｒｔ　、ＲｓまたはＲ６のヒドロキシル基力坏在である。こう して、例えば、Ｒフが水素である場合、１．　３−結合、ｌ、２−結合、１．　 ４−結合、または１．６−結合が夫々Ｒ１，Ｒｔ　、ＲｓまたはＲ６の位置で環 Ａと環Ｂの間に形成でき、そして相当するＲＩ　、Ｒｔ　、ＲｓまたはＲ６置換 基力坏在である。
Ｒ７がカルボキシルである場合、その形成は夫々２，３−結合、２．２−結合、 ２．４−結合、または２．６−結合であり得る。
更に詳しくは、式Ｉ及びＩＩにもどって、環Ｂの置換基ＸはＯ，Ｓ、Ｓｏ、Ｓｏ ｗまたはＮＲＩｓであり得ることがわかる。ＲＩ６基は水素（これが好ましい） 、並び１：Ｃｌ−Ｃｌ、アシル基、ＣＩ−ＣＩｔフル＋ル基であッテもよく、ま たは＞ＮＲ＋ｓはＣＩ−ＣｕアルキルＮ−オキサイドであってもよい。
Ｒ＋ｓＣ＋−ＣＩ−アシル基は、相当するＣｔ−Ｃ＋ｔカルボン酸の残基または 反応生成物であり、こうして窒素原子とアミドを形成する。意図されるＣＩ−Ｃ ＋ｔアシル基として、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブタノイル、イソ− ブタノイル、ヘキサノイル、オクタノイル、ノナノイル、デカノイル、ドデカノ イル（ラウロイル）、シクロヘキサンカルボニル及びベンゾイルが挙げられる。
＞ＮＲ＋ｓはＣＩ−Ｃ＋ｔアルキルＮ−オキサイドである。ここで、そのアルキ ル基は以下に説明されるとおりであり、そのアルキル化三級窒素原子は酸化され てＮ−オキサイドを形成する。記号“〉”は、環炭素原子に結合されている窒素 原子の残りの原子価を示すのに使用される。
ＣＩ−Ｃ＋ｔアルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソ−プロピル 基、ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、ヘ プチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基及びドデシル基により例示される。
ＲＩ　、ＲｓもしくはＲ１，；またはＲ６及びＲ，のＣ１−Ｃ４アシルオキシ基 として存在し得るＣｌ−Ｃ４アシル基は、エステル基のアシル［ＲＣ（０）−］ 部分または、　アシルオキシ［ＲＯＣ（０）　−］部分（式中、Ｒはアシル基の 炭化水素部分である）である。Ｃ，−Ｃ，アシル基として、ホルミル、アセチル 、プロピオニル、ブタノイル及びイソ−ブタノイルが挙げられる。
飽和アルコキシドは、炭化水素部分が飽和されているエーテルである。ＣＩ−Ｃ ｓアルコキシドは、その基中に１〜６個の原子の長さを含むことができ、その炭 化水素部分はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基また はペンチル基であってもよい。また、２−トリメチルシリルエチル“炭化水素” 基が含まれてもよい。メトキシ基が好ましい。
不飽和アルコキシドは、炭化水素基中にエチレン性不飽和を更に含むアルコキシ ドのようなエーテルである。また、不飽和アルコキシドは、その基中に６個まで の原子の長さを有することができ、そのうちの５個の原子が炭素であってもよく 、またその炭化水素部分として、ビニル基、アリル基（プロペン−２−イル）、 メチルビニル基（プロペン−１−イル）、２−ブテニル基及び２−ペンテニル基 が挙げられる。アリル炭化水素基（アリルオキシ）が好ましい。
アルコキシアルコキシドは、別のエーテル基を含むエーテルである。また、アル コキシアルコキシドはその基中に６個の原子の長さを有することができ、そのう ちの５個が炭素である。６原子のアルコキシアルコキシドの例として、メトキシ ルメチオキシ（−０−ＣＨＩ−０−ＣＨＩ）、エトキシルメチオキシ（−０−Ｃ Ｈｔ−０−ＣｔＨｓ）　及Ｕｘトキシルエチオキシ（−０−ｃｚｎｓ−ｏ−ｃｔ ｕｓ　）が挙げられる。
飽和アルコキシド基、不飽和アルコキシド基及びアルコキシアルコキシド基は夫 々６個までの原子の鎖長（そのうちの５個が炭素である）を含むことができるの で、これらの三つの部分は５個までの炭素を含む飽和または不飽和のアルコキシ ドまたはアルコキシアルコキシドど総称される。
Ｒ１及びＲｓはまたＣ、−Ｃ，アルコキシカルボニル基を含むことができ、一方 、ＲＩｓ及びＲ１，はＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニルを含むことができる。前 者はカーボネートであり、一方、後者はウレタンである。夫々が、Ｒ，基もしく はＲ３基、またはＲ１８基もしくはＲ１８基の夫々の形成に関して、ＣＩ−Ｃ， アルコキシ（前記のとおり）クロロホルメートとアルコールまたはアミンの反応 により調製し得る。
Ｒ１はまたＮ　Ｒ＋　ｔ　ＲＩｓ　（式中、ＮＲｌｔＲ＋ｓは一緒になって４〜 ８個の炭素原子を含む環状イミド基を形成する）であってもよい。意図される環 状イミド基として、スクシンイミド、メチルスクシンイミド、２．２−ジメチル スクシンイミド、２．３−ジメチルスクシンイミド、マレイミド、フタルイミド 、ヘキサヒドロフタルイミド及びジメチルフタルイミドが挙げられる。
オキソ基はカルボニル基であり、そして上記の式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩのＢ環中 に環Ｂの３位（Ｒ１及びＲ１’）ではケトンとして、また環Ｂの１位（Ｒｓ及び Ｒ４）ではラクトン、チオラクトンまたはラクタムのカルボニル部分として存在 し得る。
ＣｒＣｓアルキルチオ基は、アルコキシドのエーテル酸素が硫黄原子により置換 されているチオエーテルである。ＣＩ−Ｃｓアルキルチオの炭化水素部分は、飽 和アルコキシド基及び不飽和アルコキシド基に関して上記された基と同じであっ てもよい。
また、Ｒ７基とＲ３基は不在であってもよく、それらの結合か環の１位と２位の 間でエチレン性不飽和を形成する。それにより、得られたＢ環すツカリド単位は グリカールである。
特に好ましい三糖に関して、Ｒ８はヒドロキシルである。また、環へがＮ−アセ チル−グルコサミニル基である場合には、Ｒ８はＮ−アセトアミド基であっても よい。
三糖が所望される場合、Ｒ１はグリコシド結合により上記のサツカリドに結合さ れている別のサツカリドであってもよい。こうして結合し得るサツカリドの例と して、前記のものが注目される。
上記の式ＩのＡ環とＢ環の結合だけでなくＣ環とＢ環の結合を説明するＲ０基、 Ｒ，基、Ｒ３基またはＲ，基の上記の不在に加えて、二つのその他の条件が式Ｉ 及び式ＩＩの化合物に当てはまる。これらの条件の両方は、ＸがＯである化合物 に関するものであり、それによりこれらの化合物を限定する。
第一に、環Ｂの５つの置換基配置の一つが存在する場合にのみＸは０である。
これらの配置の二つはオキソ基（Ｒ１及びＲ１″）と（Ｒ１及びＲ，）である。
第三は、Ｒ１またはＲ４のいずれかがアルキルチオである場合である。Ｒ１とＲ ３またはＲ１のいずれかとがヒドロキシルではない場合に、第四の条件が生じる 。
Ｒ２とＲ３が不在であり、それらの結合がエチレン性不飽和を形成しく環Ｂはグ 、　リカールである）、またＲ１．Ｒｓ　、ＲｓまたはＲ１のいずれかがヒドロ キシルではな（、またはＲ６がヒドロキシメチルではない場合に、第五の条件が 生じる。
第二に、ＸがＯである場合にのみ、Ｒ７とＲ３が不在であり、エチレン性不飽和 により置換される。こうして、グリカールのみが意図される。
好ましい実施態様において、Ｘは５ＳＳＯまたはＳｏｗであり、環Ｂはチオ糖ま たはその酸素化誘導体である。環Ｂがチオ糖である場合、好ましくは、Ｒ３、Ｒ １及びＲ６はヒドロキシルであり、Ｒ１は水素、ヒト泊キシルまたはメトキシで あり、Ｒ４は水素、ヒドロキシルまたはメトキンであり、但し、Ｒ８とＲ４の一 つが水素であり、かつＲ６がヒドロキシメチルであることを条件とする。
更に別の好ましい実施態様において、ＸはＮＲｌｅであり、環Ｂはアザ糖を形成 する。ＮＲ，、がＮＨである場合、好ましくは、Ｒ１がヒドロキシルであり、Ｒ ＋”が水素であり、Ｒ７がヒドロキシルまたはアセトアミドであり、Ｒ８とＲ１ が両方とも水素であり、またはＲ３とＲ１が一緒になってオキソ基を形成し、Ｒ ６がヒドロキシメチルであり、かつＢがＲ６でグリコシド結合により環Ａに結合 されている。
ってもよい。環Ｂが１．　６−ジデオキシアザピラノースである場合、好ましく は、Ｒ１が水素またはヒドロキシルであり、Ｒ１が水素、ヒドロキシル、Ｃｌ− Ｃｓアルコキシ、ハライドまたはＮ　Ｒｒ　ｔ　Ｒｔ　ｓ　Ｃ式中、Ｒ１７は水 素またはＣｌ−Ｃ４アルキルであり、か”）Ｒ＋　ｓ　Ｉｔ水素、Ｃｌ−Ｃ４７ にキル、Ｃｌ−Ｃａ　７　シｋ、Ｃｌ−０４アルコキシカルボニルであり、また はＮＲ＋ｔＲＩｓは一緒になって４〜８個の炭素原子を含む環状イミド基を形成 する）であり、Ｒ１とＲ４が両方とも水素であり、Ｒ６が水素、ヒドロキシルま たはメチルであり、Ｒ１が水素またはメチルであり（但し、Ｒ５とＲ６の一つの みがメチルであることを条件とする）、Ｒ＋ｓが水素、Ｃ，−Ｃ，□アルキル、 Ｃｌ−Ｃ＋ｔアシルであり、または＞ＮＲＩｓがＣｌ−Ｃ＋ｔアルキルＮ−オキ サイドであり、そしてそのジデオキシアザピラノースは少なくとも２個のヒドロ キシル基１．６−ジデオキシアザピラノースは１位及び６位の炭素原子でヒドロ キシル基を欠いているので、形成されるオリゴ糖は三糖であり、還元性末端でジ ブオキ、ジアザピラノースを含み、そのアザピラノースはＲ＋　、Ｒ１またはＲ ８でグリコシド結合により非還元性末端（環Ａ）でサツカリドに結合されている 。
本発明のオリゴ糖化合物は特別な空間上の配向を有することが好ましい。上記の 式ＩＩに相当するオリゴ糖に好ましい空間上の配向はβであり、以下に式ＩＶで 示（式中、基Ｘ、及びＲ１”””Ｒｅは上記の式ＩＩに関して定義されたものと 同じである） 別の好ましい実施態様は、Ａ環及びＣ環の両方が式ＩのＢ環に結合されている式 Ｉの化合物を含む。ここで、Ｒ，とＲｓは両方とも不在であり、グリコリル連鎖 サツカリドにより置換されている。このような化合物の一般構造式が構造式Ｖと して示される。
（式中、存在する種々のＲ１〜ＲＨ基及びＸは先に定義されたとおりである）好 ましい実施態様において、環Ｃはα一連鎖フコシル基であり、また環Ａはβ、一 連鎖ガラクトシル基（Ｇａｌ）である。一つのこのような特に好ましい実施態様 において、ＸはＳであり、Ｒ７はヒドロキシルであり、またＲ３及びＲ４は水素 及びヒドロキシルであり、Ｒ６はヒドロキシメチルであり、また環Ｂはグルコー ス構造を有する。
別の特に好ましい実施態様において、環Ｃはα一連鎖フコシル基であり、また環 ＡとＢはβ１，４一連鎖Ｎ−アセチル−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）ｔである 。更に別の実施態様において、環Ｃはα一連鎖フコシルであり、また環ＡとＢは ガラクトシルβ１．３−Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｇａｌβ１．３−ＧｌｃＮ Ａｃ）であり、または環Ｃがα一連鎖フコシルであり、環へとＢがガラクトシル βｌ、４−Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｇａｌβ１．４−ＮＡｃＧａｌ　）で ある。
■、方法 本発明の別の局面はグリコジル化の方法に関する。そのグリコジル化の方法によ れば、活性化されたドナー単糖が水性媒体中で活性化されたドナー単糖とアクセ プターサツカリドの両方に対して特異性を有する触媒量のグリコジルトランスフ ェラーゼの存在下で下記の式ＩＩまたはＩＩＩのアクセプターサツカリドと混合 さく式中、Ｘ、Ｒ＋　、ＲＩ’、Ｒｔ　、Ｒｓ　、Ｒ４、Ｒｓ及びＲｓ　（Ｒ＋ 　−ｓ　）は式ＩＩ中で定義されたとおりである） そして反応混合物が、アクセプターサツカリドがグリコジル化され、グリコジル 化されたアクセプターサツカリドを生成するのに充分な期間及び条件下に保たれ る。
本明細書に使用される“活性化されたドナー単糖”という用語は、活性化ヌクレ オチドに結合されたドナー単糖を意味する。ドナー単糖の例として、Ｇｌｃ、Ｇ ＩｃＮＡｃ、　Ｇａｌ　、　Ｇａ１ＮＡｃ、　Ｍａｎ　、　Ｆｕｃ　、　Ｎｅｕ ＡＣ及びこれらの誘導体、例えば、下記の表５の化合物２０１〜２０４が挙げら れる。当業界でドナー単糖に対して特異性を有することが知られている活性化ヌ クレオチドとして、ウリジンジホスフェート（ＵＤＰ）　、アデノシンジホスフ ェート（ＡＤＰ）　、グアノシンジホスフエ−１−（ＧＤＰ）、シチジンモノホ スフェート（ＣＭＰ）及びシチジンジホスフェート（ＣＤＰ）が挙げられる。
トナー単糖がＧｌｃ　、　ＧｌｃＮＡｃ、　ＧａｌまたはＧａ１ＮＡｃである場 合、好ましい活性化ヌクレオチドはＵＤＰである。ドナー単糖がＭａｎまたはＦ ｕｃである場合、好ましい活性化ヌクレオチドはＧＤＰである。ドナー単糖がＮ ｅｕＡＣである場合、好ましい活性化ヌクレオチドはＣＭＰである。本発明の方 法に使用するのに好ましい活性化されたドナー単糖はＵＤＰ−Ｇａｌ　、　ＵＤ Ｐ−ＧａｌＮＡｃ、　ＵＤＰ−Ｇｌｃ　、　ＵＤＰ−ＧＩｃＮＡｃ及びＣＭＰ− ＮｅｕＡＣである。
活性化されたドナー単糖は市販の源（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍ　Ｃｈｅｍ 、　Ｃｏ、　、　Ｓｔ。
Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））から入手でき、または活性化ヌクレオチドとリン酸化され た単糖から調製し得る。活性化されたドナー単糖は、リン酸化されたドナー単糖 を触媒量のヌクレオチド−糖−ピロホスホリラーゼにの酵素は活性化されたドナ ー単糖の生成を触媒作用する）の存在下で活性化ヌクレオチドと反応させること により調製される。
特別なヌクレオチド−糖−ピロホスホリラーゼの選択は、リン酸化されたドナー 単糖及び使用される活性化ヌクレオチドの性質に依存する。こうして、例えば、 ＵＤＰ−ＧｌｃピロホスホリラーゼはＵＴＰとリン酸化されたＧｌｃからのＵＤ Ｐ−Ｇｌｃの生成を触媒作用する。その他のピロホスホリラーゼは当業界で公知 であり、Ｃｌ１ｌＰ−ＮｅｕＡＣシンセターセが挙げられ、これはＣＴＰとＮｅ ｕＡＣからのＣＭＰ−ＮｅｕＡＣの生成を触媒作用する。
ヌクレオチド−糖−ピロホスホリラーゼは市販の源から入手でき、また動物組織 から単離でき、または知られているように遺伝子工学の通常の技術を使用して組 換え形態で得ることができる。
、　アクセプターの選択はオリゴ糖の所望の構造に依存する。典型的には、アク セプターの置換基配置は式Ｉまたは１１のオリゴ糖の環Ｂの置換基の性質に合致 する。
下記の表１に示されたデータは、特別なアクセプターサ・ソカリトと、β１，４ −ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）を使用して調製された合成オリ ゴ糖の合致を示す。表１で先に示された反応はアクセプターとしてのグルコシル 誘導体（化合物１ａ−ｚ）の使用を例示する。更に別の番号を付されたアクセプ ターが下記の表に示される。
表１ （ＧｌｃＮＡｃｌ。
化合物１ｂ−１ｇに関する反応速度は化合物１ａ（１００％）と較べて相対的に 換算して示される。化合物１ｕ−６、キシロース及びＧ１ｃＮＡｃポリマーに関 する反応速度は化合物Ｉｔ（１００％）と較べて相対的に換算して示される。Ｒ １及びＲ４に関して括弧書きされた）−１１Ｈは、これらの基に関する立体化学 が帰属されないことを示す。
°はアシル移動を示す。
アクセプターサツカリドの調製は、このようなサツカリドの性質により変化する 。デオキシ−アザ糖は、アルドラーゼ触媒反応及び還元アミン化に基く化学−・ 酵素的方法によりつくられる。このような方法によれば、アジドアルデヒドとホ スフェートドナー基質が触媒量のアルドラーゼの存在下で反応させられてアジド 置換ケトースホスフェートを生成する。次いでアジド置換ケトースホスフェート が通常のパラジウム触媒の存在下で水素化により還元的に環化される。その水素 化は通常の水素化溶媒、例えば、水、エタノールもしくはメタノールまたはこれ らの混合物を使用して大気圧より大きい圧力で行われる。
また、アジド置換ケトースホスフェートは水素化の前に脱リン酸化される。この ような脱リン酸化が起こる場合、得られるアサ糖は、先の脱リン酸化を行わない 水素化から生じる！、６−デオキシ構造と較べてｌ−デオキシ構造を有する。
アサ糖の置換基配置は、アジドアルデヒドの配置により決定される。環窒素原子 の修飾は典型的には還元的環化の後に行われる。例えば、Ｃ１−Ｃ＋ｔフルキル 基は相当するアルデヒドまたはケトンの還元的アルキル化により付加し得る。脱 離基置換アルカンがまたアルキル化に使用し得る。脱離基の例として、／Ｘライ ド、メタンスルホニル（メジｌり基及びｐ−）ルエンスルホニル（トシル）基が 挙げられる。Ｎ−アルキル化の方法は当業界で公知である。
Ｃ＋−Ｃ＋ｔアシル基は、適当な酸無水物または酸ハライド、例えば、塩化ラウ ロイルにより付加し得る。また、アシル化の方法は公知である。
Ｎ−オキサイド誘導体は、過酸化水素による酸化によりＮ−アルキル誘導体から 容易に調製される。調製の例が以下に示される。
チオグルコースの如きチオ糖アクセプターサツカリドは市販の源（シグマ社）か ら入手し得る。このような千オ糖の環炭素原子の置換基配置が当業界で公知の通 常の化学技術を使用してつくられる。環Ｓ原子からスルホキシド（ＳＯ）及びス ルホン（ＳＯｘ）へのＨｌｏ、による酸化は室温で行われる。メチルチオグリコ シドとしてのアノマー中心の保護が開環を防止するのに必要とされる。
天然産の糖の誘導体であるアクセプター単糖は、当業界で公知の通常の化学技術 を使用して調製される。アクセプターサツカリドの調製の例が以下に実施例５に 記載される。
また、表１に関して示された反応から調製された生成物は、その表に使用された アクセプター基質及びその他のサツカリドと同様に、更なるグリコジルトランス フェラーゼ反応のアクセプター基質またはインヒビターであり得る。このような 化合物を使用する反応及び相対速度の例が、下記の表１ａに示され、この場合、 三糖または単糖反応体化合物（アクセプター基質）は表１のアクセプターまたは 生成物化合物し化合物１ａ、　Ｉｔ、２ａ、２１．２ｔ、３．５．６及び（Ｇｌ ｃＮＡｃ）ｔ　］または本明細書のいずれかに説明された化合物（化合物７．８ 及びｌｏｇ）と同じ番号を有し、また使用されたトランスフェラーゼはフコシル α１，３／１．４　）ランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ；ＥＣ２，４，１，６５）で あった。こうして、表１ａに示された反応の如き反応は構造式Ｉｌｌ及びｉｖに より示された化合物の如き化合物を使用して構造式Ｌｌ＋及び■の化合物の如き 化合物を調製する。分枝三糖生成反応の例が上記の表に示されている。また、表 １ａのデータが、その他のデータと同様に、デュマス（［）ｕｍａｓ）ら著、Ｂ ｉｏＭｅｄ、　Ｃｈｅｍ、　Ｌｅｔｔ、　、　Ｉ：４２５−４２８（１９９１） に報告されている。
表１ａ グリコジル化の方法に使用されるグリコジルトランスフェラーゼは、活性化され た単糖及びアクセプターサツカリドの両方に対して特異性を有する。即ち、グリ コジルトランスフェラーゼは、活性化されたドナー単糖をアクセプターサツカリ ドに転移し、所定の構造のグリコシド結合されたオリゴ糖を生成し得る。
グリコジルトランスフェラーゼの例として、下記の表２中の生成物の生成を触媒 作用する酵素が挙げられる。また、ベイヤーら著、Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、 　、　５２：２３−１６１（１９１１１１）を参照のこと。更に、以下に例示さ れたグリコジルトランスフェラーゼは非天然産のオリゴ糖を使用し得る。
表２ ■、シアリルトランスフェラーゼ Ｓｉａ　α２，６Ｇａｌ Ｓｉａ　ａ２，３Ｇａｌ Ｓｉａ　ａ２，６ＧａｌＮＡｃ Ｓｉａ　ａ２．６ＧｌｃＮＡｃ Ｓｉａ　ａ２，８Ｓｉａ Ｓｉａ　ａ２．４Ｇａｌ Ｓｉａ　（Ｚ２，４ＧＩＣＮＡＣ Ｓｉａ　ａ２．６Ｍａｎ Ｉｌ、フコシルトランスフェラーゼ Ｐｕｃ　α１．２Ｇａｌβ Ｆｕｃ　（Ｚｌ、４ＧＩＣＮＡＣβ Ｆｕｃ　ａ　ｌ、　３ＧｌｃＮＡｃβ Ｆｕｃ　（２１，３Ｇｌｃ Ｆｕｃ　ａ　Ｉ、　６ＧｌｃＮＡｃβ Ｆｕｃ　αｌ、６Ｇａｌβ Ｆｕｃ　α１．３Ｇａｌβ Ｆｕｃ　ａｌ、３Ｆｕｃ 好ましく、約７．０〜約７．５であることが更に好ましい。ｐＨ値は水性溶媒中 で緩衝剤により保たれる。緩衝剤は、Ｍｇ＋１または動１の如き酵素コファクタ ーを結合するキレータ−を含まない。緩衝剤の選択は、緩衝剤がｐＨ値を所定の レベルに保つ能力に基く。ｐＨ値が約７．５である場合、好ましい緩衝剤はＨＢ ＰＢＳである。
水性媒体の容量オスモル濃度及びイオン組成は、反応混合物の成分を可溶化し、 かつ反応混合物に含まれる酵素のコファクターを与えるように設計され、選択さ れる。緩衝剤を含む水性媒体の容量オスモル濃度は約１１００ｍＯｓ〜約３００ ｍＯｓ＋ｎであることが好ましい。
オリゴ糖の合成の反応時間及び条件は、単糖アクセプターの性質により変化する 。単糖誘導体が表１の化合物５である場合、その反応時間は約４８時間であり、 その反応は約３７℃の温度で緩衝水溶液中で起こる（実施例ＩＡ）。単糖アクセ プターが表１の化合物１ｅまたはｌｉである場合、その反応時間は同温度で約９ ６時間である（実施例ＩＢ及びＩＣ）。
成る状況下で、単糖アクセプターが２位の炭素原子でα−配向で水素原子または ヒドロキシル基を有する場合（即ち、Ｒ２が式ＩＩＩで水素原子またはヒドロキ 、　シルである場合）、その反応条件はラクトアルブミン、好ましくはα−ラク トアルブミンを含む。
本発明の合成方法はＧａ１Ｔで調製される３−０−アシルオリゴ糖を与えないこ とが注目される。３−０−アシル単糖アクセプターが使用される場合、生成され る生成物は６−０−アシル化オリゴ糖である。例えば、３−０−アセチル−Ｎ− アセチルグルコサミンが単糖アクセプターとして使用された場合、表１の化合物 ２ｅが得られ、これはＮ−アセチルグルコサミン部分の６位へのアセチル基の移 動を示す。その他の副生物は得られなかった。
アセチル基の他に、メトキシカルボニル基、クロロアセチル基、及びアリルオキ シカルボニル基がまた３位から６位への０−アシル移動を示した。これらの移動 の夫々の半減期は、閣により測定して、室温でｐＨ１，０で、アセチル基、メト キシカルボニル基、及びアリルオキシカルボニル基に関して約３時間であり、ク ロロアセチル基に関して３時間未満であった。
３−０−アシル−ＧＩｃＮＡｃの合成は直接的である。容易に入手し得る４、６ −ベンジリデン誘導体から開始して、種々のアシル基が３−０位に導入し得る。
この予測されないアシル移動を更に研究するために、３−０−アセチル−Ｎ−ア セチルグルコサミンをＧａ１Ｔ酵素の不在下ＱＨ７，０でインキュベートし、’ Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定した。１．８２ｐｐｍの新しいピークの強さが増加 するが、１．９ｐｐｍのシグナル（ＣＨ３ＣＯＮＨ−）が減少することが観察さ れ、またＨ−６の低磁場へのシフト及びト３の高磁場へのシフトが同時に観察さ れた。２４時間後に、最初の化合物の９０％が新しい生成物（これは別途調製さ れた基準６−０−メトキシカルボニル−Ｎ−アセチルグルコサミンに一致する） に変換された。更にその同一性が高分解能質量スペクトル分析により確認された 。
次いで６−０−アセチル−Ｎ−アセチルグルコサミン力Ｃａ１Ｔの基質として研 究され、それは同一条件下で３−〇−アシル異性体の約１０倍有効であることが わかった。次いで６−０−アセチルニ糖の別途合成が基質として６−０−アセチ ル−Ｎ−アセチルグルコサミンを使用して７０％の単離収率で行われた。６−０ −アセチル−Ｎ−アセチルグルコサミンがズブチリシンにより触媒作用を受けて 無水ジメチルホルムアミド中Ｔｈ１ｃＮＡｃ及びイソプロペニルアセテートから ８２％の収率で容易に調製されたことは、注目・　に値する。
グリコジル化の方法の反応速度及び収率は、活性化されたドナー単糖のその場の 再生を与えることにより高めることができる。
好ましい実施態様において、グリコジル化の方法は、（ａ）水性媒体中で、 （ｉ）アクセプターサツカリド； （ｉｉ）ドナー鞠； （ｉｉｉ）ドナー単糖に対して特異性を有する活性化ヌクレオチド；（ｉｖ）活 性化されたドナー単糖を再生する系；（Ｖ）ピロホスフェート脱除剤；及び （ｖｉ）ドナー単糖の活性化された形態及びアクセプターサツカリドの両方に対 して特異性を有する触媒量のグリコジルトランスフェラーゼと、ドナー単糖及び 活性化ヌクレオチドの両方に対して特異性を有する触媒量のヌクレオチド−糖− ピロホスホリラーゼ を互いの存在下で混合して反応混合物を生成する工程；及び（ｂ）その反応混合 物を、アクセプターサツカリドがグリコジル化され、そしてグリコジル化された アクセプターサツカリドを生成するのに充分な期間及び条件下に保つ工程 を含む。
この好ましい方法に使用されるドナー単糖、活性化ヌクレオチド、グリコジルト ランスフェラーゼ及びヌクレオチド−糖−ピロホスホリラーゼは、上記のものと 同じである。
活性化されたドナー単糖再生系は、ホスフェートドナーと、ホスフェートドナー から活性化ヌクレオチドへのホスフェートの転移を触媒作用する触媒量のキナー ゼを含む。
再生系のホスフェートドナーは、リン酸化された化合物であり、そのホスフェー ト基はＡＤＰまたはＣＤＰの如きヌクレオシドジホスフェートをリン酸化するの に使用し得る。ホスフェートドナーの選択に関する唯一の制限は、ホスフェート ドナーのリン酸化された形態または脱リン酸化された形態のいずれもがグリコジ ル・　化されたアクセプターサツカリドの生成に関与する反応のいずれをも実質 的に妨害し得ないことである。好ましいホスフェートドナーはホスホエノールピ ルベート（ＰＥＰ）及びアセチルホスフェートである。特に好ましいホスフェー トドナーはＰＥＰである。
本発明による使用のための特別なキナーゼの選択は、使用されるホスフェートド ナーに依存する。アセチルホスフェートがホスフェートドナーとして使用される 場合、キナーゼはアセチルキナーゼである。ＰＥＰがホスフェートドナーとして 使用される場合、キナーゼはピルベートキナーゼである。当業者に公知であるよ うに、その他のキナーゼがその他のホスフェートドナーと共に使用し得る。キナ ーゼは市販されている（シグマ社；ベーリンガー・マンハイム社）。
本明細書に使用される“ピロホスフェート脱除剤”という用語は、本発明の反応 混合物から無機ピロホスフェートを除去するのに利用できる物質を表す。無機ピ ロホスフェ−）（ＰＰｉ）は成る種の活性化されたドナー単糖の副生物である。
生成されたＰＰｉはフィードバックしてその他の酵素を阻害することがあり、そ の結果、グリコジル化が低下される。しかしながら、ＰＰｉは異化作用の如き代 謝手段またはＰＰｉ結合物質による金属イオン封鎖の如き物理的手段により除去 し得る。ＰＰｉは、無機ピロホスファターゼである市販のＰＰｉ異化酵素（シグ マ社；べ一リンガー・マンハイム社）等を使用して代謝手段により除去されるこ とが好ましく、また同様の酵素がピロホスフェート脱除剤として利用できる。
好ましいグリコジル化の方法に使用されるアクセプターサツカリドは、構造式Ｉ ＩＩにより特定されるようなアクセプター単糖、天然産の単糖もしくはオリゴ糖 、または構造式ＩＩ、または更に特別には、構造式Ｉｖを有するオリゴ糖であり 得る。
例えば、シアリル化されたグリコジル化合物の如きオリゴ糖が、下記の機構１（ 以下、サイクルＡとも称される）によるＣＩＩＩＰ−シアル酸のその場の再生で もって合成し得る。このような合成は、構造式■の環Ｃが環Ａに結合され、また 環Ａが環Ｂに結合されている直線状オリゴ糖を生じる。
以下に表５中に示される化合物２０１−２０４の一種の如き化合物が、ＮｅｕＡ Ｃに代えて使用し得る。このような化合物の使用は、３−置換−１，２−ジヒド ロキシプロピル基を有する構造式Ｌ　ＩＩ及びＩＶの化合物を与える。
機構１ 機構１によれば、ＣＭＰがＡＴＰの存在下でヌクレオシドモノホスフェートキナ ーゼ（ＮＭＫ）により触媒作用を受けてＣＤＰに変換され、ＡＴＰがホスホエノ ールピルベート（ＰＥＰ）の存在下でピルベートキナーゼ（ＰＫ）により触媒作 用を受けてその副生物ＡＤＰから再生される。ＣＤＰは更にＰＫにより触媒作用 を受けてＣＴＰに変換される。
ＣＴＰはＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼにより触媒作用を受けてＮｅｕＡｃと 反応してＣ１Ｉｔｐ−ＮｅｕＡｃを生成する。副生物の無機ピロホスフェートは ピロホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）により脱除される。Ｇａｌβ１．４ＧｌｃＮ Ａｃのシアリル化はＣｔｉｌＰ−ＮｅｕＡｃ及びＳｉａ　Ｃ２，６Ｇａｌシアリ ルトランスフエラーゼにより行われる。遊離されたＣＭＰは再度ＣＤＰ　、　Ｃ ＴＰそしてＣＵＰ−ＮｅｕＡｃに変換される。
それ故、このような方法によれば、ドナー単糖としてのＮ−アセチルノイラミン 酸（ＮｅｕＡｃ）　；アクセプター三糖としてのＧａｌβｌ、　４ＧｌｃＮＡｃ （Ｎ−アセチルラクトサミン；　ＬａｃＮＡｃ）　；活性化されたドナー単糖再 生系としての簿−シアル酸再生系；無機ピロホスファターゼの如きピロホスフェ ート脱除剤、並びにヌクレオチド−糖−ピロホスホリラーゼとしての触媒量の簿 −シアル酸シンセターゼ及びアクセプターサツカリドに対して基質特異性を有す るグリコジルトランスフェラーゼとしての触媒量のシアリルトランスフェラーゼ が反応させられる。
本明細書に使用される“シアル酸”という用語は、ノイラミン酸（５−アミノ− ３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−〇−ガラクトー２−ツメロン酸）、及びノ イラミン酸のＮ−アセチル誘導体またはＯ−アセチル誘導体の如き誘導体を意味 する。シアル酸はノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）のＮ−アセチル誘導体であること が好ましく、これは種々の動物種で天然に産出するシアル酸として報告されてい た。
シャウェル（Ｓｃｈａｕｅｒ）著、Ａｃｂ＋、　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｃｈｅ ｕ　Ｂｉｏｃｈｃｎ　、　４０：　１３１（１９１）を参照■ こと。
シアル酸誘導体は、ここに特定されたシアル酸の４位、５位、７位、８位または ９位の炭素原子の位置で置換し得る。上記の位置における例示の誘導体は、５位 、７位、８位または９位のフルオロ基またはデオキシ基、アミノ酸からのアミノ のＣ＋−Ｃｔアシルまたはアミノアシル、及びホスホリルを含む。また、５位ま たは９位がアジド基で置換し得る。特に好ましいシアル酸は、ＮｅｕＡＣ、Ｎ− ラクチルノイラミン酸、９−０−アセチル−ＮｅｕＡＣ，９−デオキシ−９−フ ルオロ−ＮｅｕＡＣ１及び９−アジド−９−デオキシ−ＮｅｕＡＣである。本発 明により使用されるシアル酸は商業上入手でき（シグマ・ケミカル社）、または 種々の動物組織から単離し得る。シャウェルら著、Ｂｉｏｃｈｅａ　Ｓａｃ、　 Ｓｙｍｐ、　、　４０：８７（１９７４）を参照のこと。
本明細書に使用される“グリコジル化合物”という用語は、１個以上のグリコジ ル残基を有する有機化合物を表す。好ましいグリコジル残基はＧａｌ　、　Ｇｌ ｃＮＡｃ、Ｇａ１ＮＡｃ、　ＮｅｕＡｃＧａｌβ１．４Ｇ１ｃＮＡｃである。グ リコジル残基はシアル酸のアクセプターとして作用し、それ故、シアル酸基を受 容するのに利用できる適当なヒドロキシル基を有する必要がある。
本発明において使用されるαトシアル酸再生系として、シチジンモノホスフェー ト（ＣＭＰ）　、ヌクレオシドトリホスフェート、ホスフェートドナー、ホスフ ェートをホスフェートドナーからヌクレオシドジホスフェートに転移できるキナ ーゼ、及び末端ホスフェートをヌクレオシドトリホスフェートからＣＭＰに転移 できるヌクレオシドモノホスフェートキナーゼが挙げられる。
αトシアル酸再生系により使用に適したヌクレオシドトリホスフェートは、アデ ノシントリホスフェート（ＡＴＰ）　、シチジントリホスフェート（ＣＴＰ）　 、ウリジントリホスフェート（ＵＴＰ）　、グアノシントリホスフェ−）（ＧＴ Ｐ）　、イノシントリホスフェート（ＩＴＰ）及びチミジントリホスフェート（ ＴｒＰ）である。好ましいヌクレオシドトリホスフェートはＡＴＰである。
ヌクレオシドモノホスフェートキナーゼは、ヌクレオシドモノホスフェートのリ ン酸化を触媒作用する酵素である。本発明のＣＭＰ−シアル酸再生系により使用 されるヌクレオシドモノホスフェートキナーゼ（顯）及びミオキナーゼ（胤）は 、闇のリン酸化を触媒作用するのに使用される。顯は市販されている（シグマ・ ケミカル社；ベーリンガー・マンハイム社）。
このグリコジル化の方法の自蔵されたサイクル的特徴のために、全ての反応体及 び酵素が存在すると、ホスフェートドナー、ドナー単糖またはアクセプターサツ カリドの最初のものが消費されるまで反応が続く。
・　こうして、シアリル化の例では、ＣＭＰがＣＤＰに変換され、その変換は添 加ＡＴＰの存在下でヌクレオシドモノホスフェートキナーゼにより触媒作用され る。ＡＴＰは添加ホスホエノールピルベーＭＰＥＰ）の存在下でピルベートキナ ーゼ（ＰＫ）によりその副生物であるＡＤＰから触媒により再生される。ＣＤＰ は更にＣＴＰに変換され、その変換はＰＥＰの存在下でＰＫにより触媒作用され る。ＣＴＰはシアル酸と反応してＰＰｉ及びＣＭＰ−シアル酸を生成し、この反 応はＣＭＰ−シアル酸シンセターゼにより触媒作用される。グリコジル化合物の シアリル化に続いて、遊離された０伊が再生系に再度入ってＣＤＰ　、　ＣＴＰ そしてＣＭＰ−シアル酸を再生する。生成されたＰＰｉは前記のように脱除され 、副生物として無機ホスフェｈ（Ｐｉ）を生成する。また、ピルベート（ＰＹＲ ）が副生物である。
本発明のグリコジル化の方法に使用される種々の反応体の濃度または量は、温度 及びｐＨ値の如き反応条件、並びにグリコジル化されるアクセプターサツカリド の量を含む多数の因子に依存する。本発明のグリコジル化の方法は、活性化ヌク レオチド及び活性化されたドナー単糖の再生と、触媒量の酵素の存在下で生成さ れたＰＰｉの脱除とを可能にするので、その方法はドナー単糖、ホスフェートド ナー及びアクセプターサツカリドの濃度または量により制限される。本発明の方 法に使用し得る反応体の濃度に関する上限は、このような反応体の溶解性により 決められる。
好ましい実施態様において、グリコジル化はドナー単糖の濃度により制限される 。このような実施態様によれば、活性化ヌクレオチド、ホスフェートドナー、ア クセプターサツカリド及び酵素の濃度は、ドナー単糖が消費されるまでグリコジ ル化が進行するように選択される。
例えば、シアル酸の濃度が約２０ミリモルである場合、その他の非酵素反応体の 好ましい濃度は、グリコジル化合物に関して約２０ミリモル、ＣＭＰに関して約 ２０〜２００μＭ、ヌクレオシドトリホスフェートに関して約２〜２０μＭまた ホスフェートドナーに関して約４０ミリモルである。こうして、これらの反応体 の濃度対シアル酸の濃度の比は、グリコジル化合物に関して約０．Ｏ１〜０．１ ：１．ＣＭＰに関して約０．００１〜０．０１：１、ヌクレオシドトリホスフェ ートに関して約０．００１〜０．０１　：　１またホスフェートドナーに関して 約２＝１であることが好ましい。
グリコジル化の方法は、グリコジル化されたアクセプターサツカリドを単離する ことを更に含む。単離は、反応混合物からグリコジル化されたアクセプターサツ カリドを回収することを含む。グリコジル化されたアクセプターサツカリドを回 収する手段として、ゲル濾過、カラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグ ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、抽出、沈殿等が挙げられる。
好ましい実施態様において、単離は反応混合物を凍結乾燥して反応混合物の容積 を減少し、凍結乾燥された反応混合物を約２００〜４００メツシユのゲル濾過カ ラムに適用し、その濾過カラムからシアリル化されたグリコジル化合物を溶離す ることにより行われる。このような実施態様がシアリル化されたグリコジル化合 物を単離するのに使用される場合、このような化合物は約９７％の収率で回収し 得る（実施例２を参照のこと）。
アクセプターサツカリドがアクセプターオリゴ糖である場合、このようなアクセ プターサツカリドそれ自体はグリコジル化の方法の反応混合物中で調製し得る。
このような実施態様において、反応混合物は、（ａ）第二のアクセプターサツカ リド；（ｂ）第二のドナー単糖； （Ｃ）第二のドナー単糖に対して特異性を有する第二の活性化ヌクレオチド；（ ｄ）第二の活性化されたドナー単糖を再生する系：及び（ｅＸｉ）第二のドナー 単糖の活性化された形態及び第二のアクセプターサツカリドの両方に対して特異 性を有する触媒量の第二のグリコジルトランスフェラーゼと、（ｉｉ）第二のド ナー単糖及び第二の活性化ヌクレオチドの両方に対して特異性を有する触媒量の 第二のヌクレオチド−糖−ピロホスホリラーゼを更に含む。
また、第二のアクセプターサツカリドはアクセプターオリゴ糖であってもよい。
第二のグリコジルトランスフェラーゼは上記の表２に示された酵素の群から選ば れることが好ましい。
第二のドナー単糖、第二の活性化ヌクレオチド、第二のグリコジルトランスフェ ラーゼ及び第二のヌクレオチド−糖−ピロホスホリラーゼは、上記のドナー単糖 、活性化ヌクレオチド、グリコジルトランスフェラーゼ及びヌクレオチド−糖・ 　−ピロホスホリラーゼと同じであってもよく、また異なっていてもよい。
更に、第二の活性化されたドナー単糖再生系は、上記の活性化されたドナー単糖 再生系と完全に同じであってもよく、また一部同じであってもよい。
例えば、上記の機構ｌのシアリル化の方法のアクセプターサツカリド（Ｇａｌβ １゜４Ｇ１ｃＮＡｃ；Ｉ、ａｃＮＡｃ）は、下記の機構２に示されるように同じ 反応混合物中で調製でき、この場合、破線並びに文字Ａ、Ｂ及びＣは、単一容器 中の単一の水性反応混合物中で起こる三つの反応サイクルを分離し、同定するの に使用される。また、この合成は、環へが環Ｂ及びＣの夫々に結合されている直 線状オリゴ糖の生成をもたらす。
機構２ 機構２中のサイクルＣによるＬａｃＮＡＣの調製は、上記のシアリル化の方法（ 機構２においてＡ＋Ｂ）と組み合わされる。
機構２に示されるように、反応混合物中に含まれるサイクルＣの成分は、第二の ドナー単糖（Ｇａｌ）、第二のアクセプターサツカリド（ＧｌｃＮＡｃ）、第二 の活性化ヌクレオチド（ＵＤＰ）　、第二の活性化されたドナー単糖再生系（ホ スフェートドナー−ＰＥＰ、キナーゼ−ＰＫ）　（これは機構ｌ　（サイクルＡ ）の活性化されたドナー単糖再生系の一部と同じである）、第二のグリコジルト ランスフェラーゼ（β１，４ガラクトシルトランスフエラーゼ）及び第二のヌク レオチド−糖−ピロホスホリラーゼ（ＵＤＰ−Ｇｌｃピロホスホリラーゼ）であ る。
機構２では、活性化された第二のドナー単糖（ＵＤＰ−Ｇａｌ　）が、ＵＤＰ− Ｇｌｃのエピメラーゼ触媒作用を受けた変換により調製され、これは順にＵＴＰ とグルコースｌ−ホスフェｈ（Ｇｌｃ−１−Ｐ）から合成される。活性化された ガラクトース（ＵＤＰ−Ｇａｌ）の生成のこのような改良はグリコジル化の方法 の更に別の実施態様に相当する。
更に別の実施態様は、１ｉｌａｎＮＡｃからのシアル酸の生成（サイクルＢ、機 構２）を含む。
・　酵素的アルドール反応（機構２中のＢ）が最初に機構ｌに導入される。Ｍａ ｎＮＡｃがピルビン酸の存在下でＮｅｕＡＣアルドラーゼ（ＥＣ４，１，３，３ ）により触媒作用を受けてＮｅｕＡＣに変換される。ＮｅｕＡＣアルドラーゼは また逆反応（ＮｅｕＡＣからＭａｎＮＡｃ及びピルベートへ）を触媒作用するが 、生成されたＮｅｕＡＣは、遊離された無機ピロホスフェートの無機ピロホスフ ァターゼ（ＰＰａｓｅ）により触媒作用を受けた分解と対にされたＣｌ１ｌＰ〜 シアル酸シンセターゼにより触媒作用を受けたＣＭＰ−ＮｅｕＡＣを経由してサ イクルＡに不可逆的にとり込まれる。シアリルＬａｃＮＡｃがパイオーゲルＰ− ２カラムクロマトグラフィー後に得られる。
機構２に示された方法の詳細が実施例３で与えられる。
グリコジル化されたアクセプターサツカリドは、順に、付加的なグリコジル化反 応のアクセプターサツカリドとして利用できる。例えば、機構２により生成され たシアリルＬａｃＮＡｃは、下記の機構３に示されるように更にグリコジル化さ れてシアリルＬｅ”を生成でき、この機構中、破線及び大文字のＡ−Ｄは前記の とおりである。この合成は、環Ａ及びＣの夫々が環Ｂに結合されている分枝オリ ゴ糖をもたらし、これはここでは三糖である。
機構３ このような更なるグリコジル化（サイクルＤ、機構３）によれば、シアリルＬａ ｃＮＡｃは、α１，３フコシルトランスフエラーゼ、フコースｌ−ホスフェート （Ｆｕｃ−１−Ｐ）、ＧＴＰ及びＧＤＰ−Ｆｕｃピロホスホリラーゼを更に含む 機構２の反応混合物中でアクセプターサツカリドとして利用できる。
機構３に例示されるような上記の全ての反応は、使用されるグリコジルトランス フェラーゼ酵素とピロホスホリラーゼ酵素の特有の特異性のために互いの存在下 で（即ち、同じ反応器中で）進行し得る。例えば、ＧａｌはＧｌｃＮＡｃ以外の その他のアクセプターサツカリドに転移されない。何となれば、使用されるβ１ ，４ガラクトシルトランスフエラーゼ酵素はこのようなその他のアクセプターサ ツカリドに対して特異性を有していないからである。こうして、特異なオリゴ糖 が、特異的な酵素を選択し、使用することにより本発明のグリコジル化の方法に 従って設計され、合成し得る。
上記のように、アクセプターサツカリドはデオキシ−アザ糖の如きアザ糖であり 得る。幾つかのジデオキシ−アザ糖及びそれらの誘導体の合成は、ＦＤＰアルド ラーゼ、ラムノロース−ｌ−ホスフェートアルドラーゼ、もしくはツクロース− ｔ−ホスフェートアルドラーゼにより触媒作用を受けた（ＲＳ）３−アジド−２ −ヒドロキシプロパナールとＤＨＰＡのアルドール縮合、またはＤＥＲＡの場合 には（ＲＳ）３−アジド−２−ヒドロキシプロパナール＋アセトアルデヒド、ア セトン、もしくはプロピオンアルデヒドのアルドール縮合で開始する。（Ｒ３） ３−アジド−２〜ヒドロキシプロパナールは、デュールワチタ−（Ｄｕｒｎｖａ ｃｈｔｅｒ）ら著、Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｂｅｍ、５３：４１７５（１９８Ｂ）に記載 されているような３−アジド−２−ヒドロキシプロパナールジエチルアセクール の酸加水分解により調製される。（ＲＳ）３−アジド−２−ヒドロキシプロパナ ール＋ＤＨＡＰへの上記のアルドラーゼの一種の添加は、下記の機構４の左側に 示されているように化合物１０１．１０４または１０８を与えた。ラムフロース −１−ホスフェートアルドラーゼ及びツクロース−ｌ−ホスフェートアルドラー ゼの両方が基質として（Ｓ）−アルデヒドを受容し、一方、ＦＤＰ−アルドラー ゼは（Ｒ）−鏡像体に対して選択的である［ペダーソン（Ｐｅｄｅｒｓｏｎ）ら 著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、２９；６４５（１９８８）］　ａリ ミリンされた化合物１０４及び１０８のパラジウム（Ｐｄ）媒介還元的アミン化 は、夫々的９０％の全収率で化合物１０６．１０９及び１１０（約１・１の比で ）を夫々与えた。
同様に、リン酸化された化合物１０１ｃはまた高収率で化合物１０３ｃに直接水 素化された。これらの生成物が機構４の右側に示される。
機構４ ラムヌＯ−ス＝＋−Ｐアルドラーゼ生産物機構４のアザ糖のＮ−アセチル誘導体 の合成は、Ｄ）ＩＡＰと（Ｒ３）３−アジド−２−アセトアミドプロパナールジ エチルアセクール（これはペダーソンら著、Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ。
５５：４８９７（１９９０）に記載されたように３−アジド−２−ヒドロキシプ ロノくナールから調製される）の反応から同様に進行する。Ｎ−アセチルジデオ キシ−アザ糖の合成の重要な要素は、下記の機構５に示されるような化合物ｔＶ 及びその鏡像体の調製であり、その機構中、ローマ数字はアジドα−ケトースホ スフェートをもたらす中間体化合物に使用される。
機構５ １　■ ＩＩＩｄ、　Ｒ＝　Ｍｅ３ＳｉＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２−１０１ｂ　１０３ｂ こうして、前もって調製された化合物１　（＞９８％ｅｅ）　［フォノ・デル・ オステン（ｖｏｎ　ｄｅｒ　０ｓｔｅｎ）ら著、Ｊ、　Ａｍ、　ＣｈｅＩＬＳｏ ｃ、　、　１１１：３９２４（１９８９）；ペダーソンら著、Ｈｅｔｅｒｏｃｙ ｃｌｅｓ、２８：４７７（１９８９）　］を工程ａで化合物ＩＩ［ペダーソンら 著、Ｊ、　Ｏｒｇ。
Ｃｈｅｕ、５５：４８９（１９９０）］に変換し、続いてＮ−アセチル化により 化合物１１１ａ（９５％ｅｅ）に変換した。工程Ｃで塩化亜鉛（ＺｎＣ１ｔ）の 存在下でアジリジン化合物１１１ａをアジ化ナトリウムで核開環して６０％の収 率で化合物ＩＶａを得た。その他の保護“Ｒ“基が機構５に示されている。その 他の保護基（例えば、ｌ１ｌｂ−１１［ｄ；Ｃｂｘ＝カルボベンゾキシ、Ｔｓ＝ ｐ−トルエンスルホニル）で更に高い収率（７５〜８６％）を得た。ｌ１ｌｄの 保護基はフッ化物により除去し得る［ワインレブ（Ｗｅｉｎｒｅｂ）ら著、Ｔｅ ｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　、　２０９９（１９８６）］。
酸加水分解を使用して化合物ＩＶａのアルデヒド保護基をはずした。工程ｄで化 合物ｔＶａのマスクされていない生成物（３当量）をＦＤＰアルドラーゼの存在 下でｐｕ６．５でジヒドロキシアセトンホスフェート（ｏＨＡＰ）１当量と縮合 して化合物１０１ｂ（収率６０％）を得た。工程ｅで化合物１０１ｂをパラジウ ム触媒で環化して化合物１０３ｂを得た。
・　同様にして化合物１０１ｄを化合物Ｉの鏡像体から調製した。こうして、ラ セミ化合物■で出発して、１２：ｌの比の化合物１０３ｂと１０３ｄの混合物を 得た。
鏡像体上純粋なアルデヒド基質で出発して、化合物１０３ｂと１０３ｄを別々に 得た。
還元的アミン化は全てジアステレオ選択的であり、水素が面選択的な様式でイミ ン中間体を攻撃して還元中に発生されるねじり歪みを避けるという従来の知見［ フォノ・デル・オステンら著、Ｊ、　Ａａ　ＣｈｅＩｎ、Ｓｏｃ、　、　ｌ　１ １　：３９２４（１９８９）　］と一致する（例えば、化合物１０１ａ−１０１ ｆと化合物１０４の反応）。この研究の付加的な知見は、水素が常にアキシアル 置換基と反対の側から接近しく例えば、化合物１０１ａ、　１ｏ１ｂ、１０１ｅ 、　１０４及び１０８との反応）、この立体効果がねじり歪み効果を（つがえず ように思われることである。Ａ１４歪み（例えば、化合物１０１または１０４） は還元の立体化学的経路に影響しないように思われる。
化合物１０３ｃをＮ−メチル化して化合物１１７を得た。同様に、ラウリルまた はブチルの如き更に長いアルキル基でアルキル化すると、夫々化合物１２０及び １２１を生じる。
過酸化水素（Ｔｏｏｔ）による化合物１１７のＮ−酸化は、化合物１１８に示さ れるようなエカトリアル位にＮ−メチル（ＣＨｓ　）基を有する単一の立体異性 体を生じた。立体化学の帰属は、モデル化合物の種々の基の間で観察された強い 核オーバーハウザー（Ｄｖｅｒｈａｕｓｅｒ）効果（ＮＯＥ）に基いた。
また、化合物１１４ａ−ｃの合成は３−アジド−２−ヒドロキシプロパナールで 開始し、前駆体アザケトースの生成がＤＥＲＡにより触媒作用される。ＤＥＲＡ は、それが二種のアルデヒドのアルドール縮合を触媒作用し得る点で特異である 。それ故、化合物１１４ａの場合、化合物１１３ａを得るために、反応体は（Ｒ Ｓ）３−アジド−２−ヒドロキシプロパナールとアセトアルデヒドであった。化 合物１１３ｂを生成する（ＲＳ）３−アジド−２−ヒドロキシプロパナールとア セトンの反応を経由して化合物１１４ｂを生成し、また（ＲＳ）３−アジド−２ −ヒドロキシプロパナールをプロピオンアルデヒドと反応させて化合物１１３ｃ を生成することにより化合物１１４ｃを生成した。得られるアジドケトースまた はアジドアルドースのいずれもがホスフェート基を含んでおらず、こうして還元 的環化は親化合物１１３ａ−ｃから直接に化合物１１４ａ−ｃを生じた。化合物 １１３ａ−ｃ及び１１４ａ−ｃが以下に示される。
（ｉ）ヌクレオチド−糖−ピロホスホリラーゼ上記のように、ヌクレオチド−糖 −ピロホスホリラーゼは市販の源から得ることができ、また組織から単離、精製 でき、または組換え形態で得ることができる。
例えば、αトシアル酸シンセターゼは、当業界で公知の方法によりシンセターゼ 酵素を含む細胞及び組織から単離し、精製し得る。例えば、グロス（Ｇｒｏｓｓ ）ら著、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅａ　、　１６８：５９５（１９８７）； 　ビジャイ（Ｖｉｊａｙ）ら著、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、@、　２５０ （＋　）：　１６４（１９７５）；ザパタ（Ｚａｐａｔａ）ら著、Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　ＣｈｅｒＬ、　２６４（２５）：　１４７６９（１９W９）及びヒ ガ（Ｈｉｇａ）ら著、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ　、　２６０（１５）：８８ ３８（１９８５）を参照のこと。
一実施態様において、ウシの脳からの灰白質を均質化し、ホモジネートを遠心分 離してペレット及び上澄みを生成し、上澄みを凍結乾燥して粉末を得る。凍結、 乾燥粉末を蒸留水中で再構成し、均質化し、遠心分離して上澄み及びαトシアル 酸シンセターゼを含む綿毛状のペレットを得る。そのシンセターゼ酵素を綿毛状 のペレットからＫＣＩで２回抽出して手積製抽出物を得る。汚染量のヌクレオシ ドホスファターゼ及び０−アセチルエステラーゼを連続硫酸アンモニウム沈殿及 び透析により手積製抽出物から除去する。ヒガら著、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｌＬ、　２６０（１５）：８８３８（１９８５）を参照のこと。
別の実施態様において、遺伝子工学技術及び組換えＤＮＡ技術を使用して形質転 換宿主細胞からＣＭＰ−シアル酸シンセターゼを得る。ＣＭＰ−シアル酸シンセ ターゼを得る一つのこのような方法がザパタら著、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ 、　、　２６４（２５）：　１４７６９（１９８９）に報告されている。この実 施態様では、堕並■天然ＣＭＰ−シアル酸シンセターゼの遺伝子を含むプラスミ ドｐＳＲ３５をＥｃｏ　Ｒ１及びＨｉｎｄ　ＩＩＩで消化して２．７ｋｂの断片 を得、これをＥｃｏ　Ｒ１−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩで消化したベクターｐＫＫ２２３ −３　（）７−マシアＬＫＢバイオテクノロジー社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫ Ｂ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、　））に挿入してプラスミドｐＷＡ 　１を生成する。次いでプラスミドｐＷＡ１を使用してＥ、　ｃａｌ　ｉ、を形 質転換する。形質転換Ｅ、ｃｏｌｉは天然齋−シアル酸シンセターゼを形質転換 されていない細菌の場合よりも１０〜３０倍高いレベルまで発現すると報告され ている。ザパタら著、Ｊ、Ｂｉｏｌ。
ＣｈｅＩＬ、　２６４（２５）：１４７６９（１９８９）を参照のこと。
別の好ましい実施態様では、天然または修飾簿−シアル酸シンセターゼを、フセ ら著、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４６：１２７５（１９８９）に最近記載された新規 バクテリオファージスベクター系で形質転換した宿主細胞から得る。天然または 修飾Ｇ伊−シアル酸シンセターゼを得るこの方法の詳細な説明が、実施例２及び ｌｏに示される。
この好ましい実施態様の一局面によれば、ゲノムＤＮＡがＥ、ｃｏｌｉ株に２３ ５（ＡＴＣＣ１３２０７）から抽出され、モして四トシアル酸シンセターセの遺 伝子が二種の注文設計されたポリヌクレオチドプライマーの存在下でポリメラー ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により単離される（実施例２を参照のこと）。一種の プライマーは、Ｅｃｏ　Ｒ１制限部位、リポソーム結合配列、開始コドン、及び 酵素のＮ末端へキサペプチドに相当するオリゴヌクレオチドを含む。第二のプラ イマーは、３′から５′に向かって、Ｘｂａ　Ｉ制限部位、停止コドン、デカペ プチドｔａｇ配列、及び酵素のＣ末端へキサＥｃｏ　Ｒ１部位及びＸｂａ　１部 位でλＺＡＰ（商標）（ストラタゲン・クローニング・システムズ（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））にク ローン化された。
デカペプチドｔａｇは陽性クローンの選択を容易にするマーカーとして利用でき 、また天然酵素が所望される場合には、デカペプチドｔａｇ配列を含まないプラ イマーによる別のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により除去し得る。
天然酵素及び修飾酵素はＮｅｕＡｃ及びＣＴＰに関して同様のＫ。、及ＵＫ、を 有する。修飾酵素は高ｐＨ値で天然酵素よりも活性である（以下の実施例９を参 照のこと）。特異性に関する研究は、両方の酵素が中性ｐｏて’Ｃ−９修飾Ｎｅ ｕＡｃ誘導体に対して高い比活性を有することを示す（以下の実施例９を参照の こと）。
天然または修飾ＣＭＰ−シアル酸シンセターゼと同程度に大きい酵素をコードす るＤＮＡがこのファージベクターに首尾よ（クローン化され、このファージベク ターから翻訳し得ることは、特に驚くべきことであった。従来の論文は、抗体Ｆ ａｂ断片（約５０．０００ｋｄ）　にれは本ＤＮＡ及びタンパク質のサイズの約 １５〜２０％である］をコードするＤＮＡの使用を記載していたにすぎない。
形質転換されたＥ、ｃｏｌｉは、野生型の形質転換されていない株に関する＜０ ．１０／Ｌと較べて、修飾酵素としてのＣＭＰ−シアル酸シンセターゼ約１００ ０／Ｌを生産し、これは酵素活性の＞１．０００倍の増加に相当する。このよう な形質転換されたＥ、ｃｏｌｉが、１９９１年２月１９日にアメリカン・タイプ ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃ−ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｄ）に寄 託され、ＡＴＣＣ受理番号６８５３１を指定された。
（ｉｉ）グリコジルトランスフェラーゼグリコシルトランスフェラーゼはまた種 々の源から得ることができる。例えば、牛乳からのβ１，４ガラクトシルトラン スフエラーゼ（ＧａｌＴ）は組換え形態で生産し得る。Ｇａ１Ｔは、多くのその 他のグリコジルトランスフェラーゼと同様に、主として膜結合形態でゴルジ装置 中に存在し、これは、タンパク質分解後に可溶性活性形態、所謂“触媒領域”を 生じ、この可溶性形態はミルク及び血清の如き体液中に現れる。ボールソン（Ｐ ａｕｌｓｏｎ）ら著、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２６４　：　１７６ １５（１９８９）を参照の、　こと。
ウシＧａ１Ｔの触媒領域は、無傷の４０２のアミノ酸の膜結合酵素のＣ末端配列 に相当する３２４のアミノ酸を含む。ヒトＧａ１Ｔの触媒領域または活性領域は 配列（〉９０％生物の主リポタンパク質であるａｍｐ　Ａのシグナル配列とＧａ １Ｔの触媒領域の融合を移入し、その結果、その酵素はべりプラズム間隙に輸送 され、そこでそれはシグナルペプチダーゼの作用によりシグナル配列から放出さ れて酵素活性Ｇａ１Ｔを与える。アオキら著、ＥＭＢｏ、　９・３１７！（１９ ９０）を参照のこと。
この発現系により生産された組換えＧａ１Ｔ酵素は、可溶性Ｇａ１ＴのＮ末端Ｔ ｈｒ残基に付着された付加的なトリペプチドＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕを含む。発 現レベルを改善するＢｉｏｅｎｇ、　、　６８ニア５（１９８９）を参照のこと 。
約２ＸｌＯ−”ＵのＧａ１Ｔが１５０　ｍＬの醗酵から得ることができ、これは ５Ｂ２２１中の従来の発現と較べて３５倍の活性の増加に相当する。上記のアオ キらの文献を参照のこと。酵素はクロロホルム抽出されたペリプラズム画分中に 主として現れた。何となれば、その媒体中に排出された活性の有意差が観察され なかったからである。
同様に、シアリルトランスフェラーゼ酵素は市販の源（シグマ・ケミカル社；ベ ーリンガー・マンハイム社及びゲンザイム社）から得ることができ、またウシ顎 下腺及びラット肝臓の如き動物組織がら単離、精製でき［例えば、グロス（Ｇｒ −ｏｓｓ）ら著Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１６８　：５９５（１ ９８７）及びヒガら著、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６０（P５）。
８８３８（１９８５）を参照のことコ、または組換え形態で得ることができる［ 例えば、エルンスト（Ｅｒｎｓｔ）ら著、Ｊ、　Ｂｉａｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　 ２６４：３４３６（１９８９）；７シベイ（Ｍａｓｉｂａｙ）ら著、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８６：５７３３（１９８９）； 　）フロール（Ｔｏｇｈｒｏｌ　）ら著、Ｂｉｏ| ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２９：２３４９（１９９０）；アパート（Ａｐｐｅｒｔ ）ら著、ＥＭＢｏ、　９：３１７１（１９９０）及びジョジアッセ（Ｊｏｚｉａ ｓｓｅ）ら著、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１９１ニア５（１９９ ０）を参照のこと］。
Ｂ、グリコシダーゼ法 本発明のオリゴ糖の生産の別の合成方法は、酵素β−ガラクトシダーゼを使用す る。このような方法によれば、本発明の単糖アクセプターがβ−ガラクトシド誘 導体と反応させられる。好ましいβ−ガラクトシド誘導体はｐ−ニトロフェニル β−ガラクトシドである。
こうして、例えば、表２の化合物５が下記の機構６に従ってβ−ガラクトシダー ゼ（Ｅ、ｃｏｌｉからのＥＣ３，２，１，２３）の存在下でｐ−ニトロフェニル β−ガラクトシドと反応させられる場合に、化合物９が得られる（実施例１．Ｆ ）。
化合物９はβ１，６連鎖を有する。こうして、グリコジルトランスフェラーゼを 使用する方法と対照的に、グリコシダーゼ法は１．６グリコシド連鎖を有する化 合物を生成する。
本発明の単糖アクセプターの全てがβ−ガラクトシダーゼに適した基質であると は限らない。例えば、表２の化合物３または４が基質として使用される場合、生 産物は得られなかった。いずれのアザ糖もβ−ガラクトシダーゼのインヒビター ではなかった。ｐ−ニトロフェニルβ−ガラクトシドはアザ糖の不在下、またそ の存在下で同じ速度で酵素により加水分解された。
合成されたオリゴ糖化合物の構造及び連鎖の確認は、’ＨＮＭＲデータ及び”Ｃ ＮＭＲデータ（夫々、３００Ｍ）１ｚまたは５００ＭＨｚ、及び１２５ＭＨ７） を使用して核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光学により行われる。夫々のプロトンに関す る’　Ｈ−ＮＭＲ化学シフトの帰属は、徹底的な脱カップリング実験により確立 される。
典型的には、出発単糖に対して、グリコシド連鎖中の炭素に結合されたプロトン に関する大きな低磁場シフト（０，１〜０．３ｐｐｍ）が観察される。従って、 その他のプロトンは殆どシフトを受けない。ＩＨ核オーバーハウザー効果（ＮＯ Ｅ）実験が連鎖・　及び立体配座を更に確認するのに使用される。
例えば、ガラクトースのＨ−１が照射された場合、化合物９は５−チオグルコー スの１（−６共鳴の一つの４％の増大を示し、これはガラクトース部分のＨ−１ への５−チオグルコースのＨ−６の接近を示す。更に、”Ｃ−ＮＭＲスペクトル では、Ｃ−６共鳴の低磁場シフトが観察されると共に、その他の炭素シグナルに 関するかなりのシフトが観察されなかった。このようなデータは、化合物９が１ ．６連鎖を有することを示す。
三糖連鎖の位置化学の帰属の更なる実証が、ｐｅｒ−アセチル化された三糖の１ Ｈスペクトルの分析により与えられる。こうして、５−チオーＤ−グルコース部 分（表２の化合物５）のＨ−１−Ｈ−４共鳴はアセチル化後に１．３〜１．８ｐ ｐｍの大きな低磁場シフト（遊離三糖に対して）を受ける。従って、Ｈ−５共鳴 及びトロ共鳴はアセチル化後にごくわずかなシフト（−０，３３〜＋０．３８ｐ ｐｍ）を受ける。
また、本発明は、水性媒体中に分散されたグリコシダーゼまたはグリコジルトラ ンスフェラーゼ抑制量の前記のオリゴ糖を含む組成物を意図している。水性媒体 は、医薬上杵される無毒性媒体、例えば、当業界で公知であるような通常の生理 食塩水、食塩前リン酸緩衝液、リンゲル液等であることが好ましい。また、水性 媒体は、哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌまたはヒ トの血液、血清、血漿またはリンパ液（これらにはアザピラノースが投与される ）を含むことができる。
グリコシダーゼまたはグリコジルトランスフェラーゼ抑制量は、前もって選択さ れたグリコシダーゼまたはグリコジルトランスフェラーゼ酵素を少なくとも２５ ％、更に好ましくは約５０％、最も好ましくは約７５％以上抑制する量である。
グリコシダーゼインヒビターは別のグリコシダーゼ（例えば、β−ガラクトシダ ーゼ）の基質として使用し得ることが明らかである。例えば、表１の化合物５は α−グルコシダーゼのインヒビターである。
表１の化合物３．４．５及び６はエキソグルコシダーゼ（例えば、β−グルコシ ダーゼ）の強力なインヒビターであり、またそれらのグリコシドはエンドグル・ 　コシダーゼのインヒビターである。この型の幾つかの天然及び合成の生産物は 強力なエンドグリコシダーゼのインヒビターである。例えば、カシモトら著、Ｊ 、Ａｍ。
Ｃｈｅ＋ｕ、Ｓｏｃ、、　１１３：６１８７（１９９１）；及びリオッタ（Ｌｉ ｏｔｔａ）ら著、Ｊ、Ａｍ、ＣｈｅＩＬＳａｃ、、ｉｌｌニア８３（１９８９） を参照のこと。
更に、表１の化合物２１及び２ｏは、適当に配向された３−ＯＨ基の欠如のため にα−１、３／４−フコシルトランスフェラーゼを抑制し得る。ロウ（Ｌｏｖｅ 　）ら著、Ｃｅｌ　Ｉ、　６３：４７５（１９９０）を参照のこと。表１ａのデ ータは、化合物８が化合物２１と同様の抑制能であり、一方、化合物１０ａがい ずれの化合物よりも抑制性であることを示す。これらの研究に使用したＦｕｃＴ はミシガン大学（Ｍｉ　ｃｈ　ｉｇａｎ、　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ、　Ｍｌ　）の Ｊ、　Ｂ、ロウ博士により提供された。
表１の化合物２ｊは、機構３に記載されたようなＬｅ”　［Ｇａｌβ１，４（Ｆ ｕｃ　αｌ、３）ＧｌｃＮＡｃ　］及びシアリルＬｅ”　［ＮｅｕＡｃ　β２． ３Ｇａｌβ１，４（Ｆｕｃ　αｌ、３）ＧｌｃＮＡｃ］の合成に有益である。シ アリルＬｅ”の化学酵素的合成は、表１の化合物２ｊのｐｅｒアセチル化、続い てフコシル化のために３−ＯＨ基を遊離するＲｕ触媒による３−ｏ−アリル基の 選択的脱保護［コレイ（Ｃｏｒｅｙ）ら著、Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｕ、３８：３２ ２４（１９７３）　］により行うことができる。
デオキシ−アザ糖は表３に示されるようにグリコシダーゼ活性を抑制することが 知られている。
表３ グリコシダーゼ抑制 醸造酵母（ＢＹ） （Ｅｆｉ　またはスィートアーモンド（ＳＡ）　Ｋｌ　（Ｍ）１０３ｃ　ａ−グ ルコシダーゼ（ＢＹ）　１．５６　Ｘ　１０−”β−グルコシダーゼ（ＳＡ）　 ７．８　Ｘ　１０−’１１７　ａ−グルコシダーゼ（ＢＹ）　１．７８　Ｘ　１ ０−”β−グルコシダーゼ（ＳＡ）　１．４　Ｘ　１０−’１１８　ａ−グルコ シダーゼ（ＢＹ）　６．９５　Ｘ　１０−”β−グルコシダーゼ（ＳＡ）　１． ４９　Ｘ　１０−”叩 １１９　ａ−グルコシダーゼ（ＢＹ）　３．６９　Ｘ　１０−’型Ｉ　（ウシ肝 臓）　７．０Ｘ１０−’β−グルコシダーゼ（ＳＡ）　４．３　Ｘ　１０−’１ ２２　α−グルコシダーゼ（ＢＹ）　＞１．ＯＸ　１０−”。
β−グルコシダーゼ（ＳＡ）　８．ＯＸ　１０−’１２３　α−グルコシダーゼ （ＢＹ）　８．６７　Ｘ　１０−’型１　（ウシ肝臓）　■、０ＸＩＯ−”Ｂ　 ’Ｉルコ’ｔターセ（ＳＡ）　１．８　Ｘｌ０−”α−Ｄ−マンノシダーゼ （タチナタマメ＞　４．０ＸｌＯ−’ β−Ｄ−ガラクトシダーゼ １シユウエーデン（Ｓｃｈｗｅｄｅｎ）ら著、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　、　２４８：３３５（１９８６）ゝゾール（Ｄａｌｅ）ら著 、Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ、　２４：３５３０（１９８５）６有意な抑制が そのアッセイでＩＯミリモルのインヒビターで観察されなかった。
前記のオリゴ糖は水性媒体中に分散される。このような分散液は懸濁液を含むだ けでなく、真の溶液を含み、これは水性媒体中の極限の分散液である。
以下の実施例は本発明の特別な実施態様を説明するものであり、明細書及び特許 請求の範囲を何ら限定するものではない。
惠穫聾 実施例１：オリゴ糖の合成 Ａ、（β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１，４）−５−千オー〇−グルコビラノ ース）、のＭｎＣＩｔを含む５０ミリモルのナトリウムコカジレート（ｐＨ７， ０）１０ｍｌ、中で５ＵのＧａ１Ｔ（シグマ・ケミカル社）　、ＵＤＰ−グルコ ース（３５０ｍｇ、　５００ミリモル）、α−ラクトアルブミン（０，１■／ｍ Ｌ）及び’ＵＤＰ−グルコースエピメラーゼ（ＩＯＵ）と反応させた。
Ｇａ　ＩＴは４〜７Ｕ／■（ｌＵ＝毎分転移されたυＤＰ−Ｇａ１　１ミリモル ）の比活性を有していた。精製酵素は、アクセプターとしてＧｌｃＮＡｃを使用 して１５Ｕ／■の報告された比活性を有していた。ＵＤＰ−Ｇａｌのに、値は０ ．５ミリモルである。その反応混合物を３７℃で２日間インキュベートした。生 成物をダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）１ホルメートカラム、続いてゲル濾過（バイ オゲルＰ−２）により単離して５０％の収率で表題化合物９０ｍｇを得た。
’Ｈ−ＮＭＲ（Ｄｔｏ、　５００ＭＨｚ）δ４．９５（ｄ、　Ｊ　＋、　ｔ□３ 　Ｈｚ、　Ｈ−１ａ　５チオＧ１ｃ）、　４．５１（ｄ、　i　１．　ｔ＝８ Ｈｚ、Ｈ−Ｉ　Ｇａ１）、４．０５（ｄｄ、Ｊｓ、　ｒ　□５　Ｈｚ、Ｊａ、　 ｒ　＝１２　Ｈｚ　Ｈ−６’５チオＧｌｃ　Ｈｚ）、　３．W３−３．９ （Ｈ−４Ｇａｌ；　Ｈ−４５チオＧｌｃ；Ｈ−６５チオＧｌｃ）、　３．８（ｄ ｄ、　Ｊｔ、　ｓ：９．６Ｈ２，Ｈ−２５チオＧｌｃ）。
３、６５−３．７５（Ｈ−５Ｇａ１．　Ｈ−６Ｇａｌ　；　Ｈ−６’　Ｇａ１． 　Ｈ−３５チオＧｌｃ）、　３．６２（ｄｄ、　Ｊｔ、　５S０Ｈ２，Ｊｓ、　 ４” ３、５Ｈ２，Ｈ−３Ｇａ１）、　３．５３（ｄｄ、　Ｈ−２Ｇａｌ　）、　３． ３２（ｄｄｄ、　Ｊａ、ａ□ｌＯ，５Ｈｚ、　ＪＨ，ｓ＝２D５Ｈ２，Ｊｓ、　 ｒ ＝５ｂ、Ｈ−５　５チオＧｌｃ）　；　”ＣＮＭＲ（１２５Ｍ）ｌｚ、　ｏｔｏ ）δ　Ｇａｌに関して１０３．２（Ｃ−１）。
？１．７（Ｃ−２）、　７２．７（Ｃ−３）、　６９．０（Ｃ−４）、　７５． ８（Ｃ−５）、　６１．５（Ｃ−６）　；　５チオＧｌｃに■■■ ７３、３（Ｃ−１）、　７５．７（Ｃ−２）、　７３．０（Ｃ−３）、　８２． ４（Ｃ−４）、　４２．５（Ｃ−５）、　５９．７（Ｃ−６j Ｒ応（Ｍ＋Ｃｓ”　）計算値４９０．９９８８、実測値４９１．００２２゜Ｂ、 β−Ｄ−ガラクトピラノシル＝（１，４）−２−アセトアミド−６−〇−アセチ ルー２−デオキシーＤ−グルコビラノース、化合物２ｅ３−０−アセチノ凶１ｃ ＮＡｃ、表１の化合物ｉｆ約２０ｍｇ（７５ミリモル）を、０．０５ミリモルの ＮＡＤ　”　、１０ミリモルのＤＴＴ、及び５ミリモルのＭｎＣ１，を含む０． ０５モルのＮａコカジレー）／）ＩｃＩ　（ｐＨ７，０）　ｌ　ｗＬ中で約１当 量のＵＤＰＧＩＣ（５０，５ｍｇ）と反応させた。ＵＤＰＧｌｃエピメラーゼ（ ＩＵ）及びガラクトシルトランスフェラーゼ（２Ｕ）を添加した。その混合物を ３７℃で振とうし、２日後にガラクトシルトランスフェラーゼ更に２Ｕを添加し た。４日後にその溶液を凍結乾燥し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ ーで精製して表題化合物６■を得た。
’Ｈ−ＮＭＲ（ＤｔＯ）δ１．９８（ｓ、　３）１．　ＮＡｃ）、　２．０８（ ｓ、　３Ｈ，０Ａｃ）、　３．５０−３．５７（ａ　ＩＨ，Q−Ｈ。
°（ｇｌｃＮＡｃ）、　３．６３−３．８２（ｍ、　６Ｈ，２°−Ｈ（ｇａｌ　 ）、　３°−Ｈ，４’　−Ｈ，５’　−Ｈ，３−８，４−Ｈj、　３．８５−３ ．９７　（＆　２ Ｈ，６′−Ｈｌ）、　４．０１（ｄｄｄ、　Ｊ＝７　Ｈ２，Ｊ＝４　Ｈ２，Ｊ＝ ２．２８Ｚ、　５−Ｈａ）、　４．１０−４．１９（ａ　５|Ｈｂ）、　４．２ １ （ｄｄ、　Ｊ＝１２　Ｈｚ、　Ｊ＝４　Ｈｚ、　６−Ｈ，ａ）、　４．２２（ｄ 、　Ｊ＝７．８　Ｈｚ、　１−Ｈａ）、　４．２３（ｄ、　i＝７．８　Ｈｚ、 　１−　Ｈｂ）。
４、２９（ｄｄ、　Ｊ＝２．２　Ｈｚ、　Ｊ＝１２　Ｈｚ、　６−Ｈｂ　ｂ）、 　４．３５−４．４８（ｍ、　６−Ｈｔｂ）、　’　”ＣＮlＲδ２１．０．２ ２．７ （２ＣＨｓ　）、　５４．４．５６．８（Ｃ−２’　）、　６１．８．６３．８ （Ｃ−６，Ｃ−６°）、６９．３．７０．１，７１．７，７R．３，７６．３　 （Ｃ−２’。
Ｃ−３’　、　Ｃ−４°、Ｃ−５°、　Ｃ−３，Ｃ−４，Ｃ−５）、　７９．４ （Ｃ−４）、　９１．４．９６．１（Ｃ−１）、　１０４．O（Ｃ−１’　）、 　１７４．５゜ １７５、０（２ＣＯ）。
ＨＲＭＳ　（Ｃ＋＆ｔＯ＋ｔＮ＋Ｃ５”　）としての計算値：　５５８．０５８ ８　；実測値５５８．０５９０Ｃ，アリルβ−ローガラクトピラノシル−（１， ４）−２−アセトアミド−２，３−ジデオキシ−β−〇−グルコピラノシド、化 合物２１アリル−１，３−デオキシ−ＧｌｃＮＡｃ　、表１の化合物１ｉを、０ ．０５ミリモルのＮＡＤ　”、ｌＯミリモルのＤＴｒ、及び５ミリモルの−Ｃ１ ｔを含む０．０５モルのＮａコカジレート／ＨＣＩ（ｐＨ７，０）　ｌ　ｍＬ中 でＵＤＰＧｌｃど反応させた。ＵＤＰＧＩｃ−ｎピメラーゼ（ＩＵ）及びガラク トシルトランスフェラーゼ（２Ｕ）を添加した。その混合物を３７℃で振とうし 、２日後にガラクトシルトランスフェラーゼ更に２Ｕを添加した。４日後にその 溶液を凍結乾燥し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して表題 化合物を得た。
’ＨＮＭＲ（０，０）δ１．６２（１８，ｑ、　Ｊ＝１２．１８　Ｈｚ、　Ｈ− ３ａｘ）、　１．９４（３Ｈ，ｓ、　ＮＨＡｃ）、　２．４U（ＩＨ，ｂｒ ｄｔ、　Ｊ＝４．６１．１２．５７Ｈｚ、　Ｈ−３ｅｑ）、　３．４４（ＩＨ， ｄｄ、　Ｊ＝８．０４．９．９２Ｈｚ、　Ｈ−２’　）、　S．４１（ＩＨ，ｄ 、　Ｊ＝ ７、８２　Ｈｚ＋　ｕ−ｔ’　）、　４．５１（ＩＨ，ｄ、　Ｊ’８．３８　Ｈ ｚ、　Ｈ−１）　；　’　３ＣＮＭＲ（ＤｔＯ）δ２２．４T．３５．７８゜ ４９．２３．６１．０３．６１．２６．６８．８９．７０．５５．７１．２６． ７３．０３．７４．１９．７５．５２．７８．８５゜１０２．０１．１０４．２ １．１１８．６０．１３３．８１．１７４．１２ＨＲＭＳ　Ｃ＋ｔＨｔｓＮＯ＋ ｏＣ３（Ｍ＋Ｃｓ　”　）としての計算値：　５４０．０８４６　、実測値５４ ０．０８４６Ｄ、β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１，４）−Ｄ−グルカール、 化合物８表１の化合物６を、Ｏ，ＯＳ　ミリモルのＮＡＤ＋、ｌＯミリモルのＤ Ｔｒ、及び５ミリモルの１Ｍｎｃ１．を含む０．０５モルのＮａコカジレート／ ＨＣＩ　（ｐＨ７，０）　ｌ　ｍＬ中でＵＤＰＧｌｃと反応させた。ＵＤＰＧｌ ｃエピメラーゼ（ＩＵ）及びガラクトシルトランスフェラーゼ（２Ｕ）を添・　 加した。その混合物を０℃で振とうし、４日後にガラクトシルトランスフェラー ゼ更に２ｕを添加した。４日後にその溶液を凍結乾燥し、残渣をシリカゲルカラ ムクロマトグラフィーで精製して表題化合物を得た。
’Ｈ−ＦＪＭＲ（５００ＭＨｚ、　ＤｔＯ）δ６．４（ｄｄ、　Ｊｔ、　ｔ”６ 　Ｈｚ、　Ｊｔ、　ｓ”１．６　Ｈ２，Ｈ−１グルカール）B ４、７（ｄｄ、　Ｊｔ、　ｓ”２．６　Ｈ２，Ｈ−２グルカール）、４．４９（ ｄ、Ｊｔ、　ｔ・７．８　Ｈｚ、Ｈ−Ｉ　Ｇａ１）、４．３T（ｂｒ　ｄｔ。
Ｊｔ、　＊＝２．６　Ｈｌ、　Ｊｓ、　４＝６．５Ｈｚ、　Ｈ−３グルカーノリ 、３．９９（ｄ、Ｊ４．５＝９．３　Ｈ２，Ｊｓ、　５＝Ｊ刀A　ｒ　＝３．７ Ｈｚ、　Ｈ−５グルカール）、　３．８５−３．９（Ｈ−４Ｇａｌ　；１（−６ 及びトロ′グルカール）、　３．８２（ｄｄ、　）ｌ−４グルカール）、　３． ６８−３．７５（Ｈ−５，８−６，Ｈ−６’　Ｇａｌ　）、　３．６３（ｄｄ、 　Ｊｔ、　ｓ”ｌＯＨ２，Ｊｓ、　４”R．４Ｈｚ、　Ｈ−３ Ｇａｌ　）、　３．５（ｄｄ、　Ｊ　１．　ｔ＝８．６　Ｈｚ、　Ｈ−２Ｇａｌ 　）、　’　”Ｃ−ＮＭＲ（１２５Ｍ１（ｚ、　ＤｔＯ）δ@Ｇａｌに関して１ ０３．９ （Ｃ−１）、　７１．９（Ｃ−２）、　７３．５（Ｃ−３）、　６９．５（Ｃ− ４）、　７６、３（Ｃ−５）、　６２．０（Ｃ−６）　；グ泣Jールに関 して１４４．９（Ｃ−１）、１０２．７（Ｃ−２）、　６８．３（Ｃ−３）、　 ７８．４（Ｃ−４）、　７７、７（Ｃ−５）、　６０．６（b−６） ＨＲｌｉｌｓ　（Ｍ＋Ｃｓ”　）計算値４４１．０１６２、実測値４４１．０１ ２１゜表１の化合物６を、０．０５　ミリモルの間ν、ｌＯミリモルのＤＴｒ、 及び５ミリモルのＭｎＣ１，を含０．０５モルのＮａコカジレー）／ＨＣＩ　（ ｐＨ７，０）　１ｍＬ中でＵＤＰＧｌｃと反応させた。ＵＤＰＧ１ｃエピメラー ゼ（ＩＵ）及びガラクトシルトランスフェラーゼ（２Ｕ）を添加した。その混合 物を３７℃で振とうし、４日後にガラクトシルトランスフェラーゼ更に２ｕを添 加した。４日後にその溶液を凍結乾燥し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラ フィーで精製して表題化合物を得た。
’Ｈ−ＮＭＲ（ＤｔＯ，５００ＭＨｚ）６４．３（ｄ、Ｊｔ、　ｔ・７．５　Ｈ ｚ、Ｈ−Ｉ　Ｇａ１）、３．７６（ｄｄ、Ｊｉ、　＠’　＝R．。
Ｈｚ、　Ｊｔ　ａ・：１２．５　Ｈｚ、　Ｈ−６’　ＤＮＪ）、　３．７４（ｂ ｒ　ｄ、　Ｊｓ、　４”３　Ｈｌ、　Ｈ−４Ｇａｌ　）、　R．７（ｄｄ、　Ｊ ｓ、　ｓ”５．０ Ｈ−６ＤＮＪ）、３．５２−３．６５（ｍ、　Ｈ−６Ｇａｌ、　Ｈ−６’　Ｇａ １．　Ｈ−５Ｇａｌ、　Ｈ−２ＤＮＪ、　Ｈ−４ＤＮＪ）、R．５ （ｄｄ、　Ｊｔ、　５＝ＩＯ，５Ｈｚ、　Ｈ−３Ｇａ１）、　３．３９（ｔ、　 Ｊｔ、　＊”Ｊｓ、　４”９．５　Ｈｚ、　Ｈ−３ＤＮＪ）A　３．３８（ｄｄ 、　Ｈ−２ Ｇａｌ　）、　３．１３（ｄｄ、　Ｊｔ−−、＋　−−＝１２．５　Ｈｚ、　Ｊ ｔ　−−、ｔ：５．０　Ｈｚ、　Ｈ−１ｅＱ　ＤＮＪ）、　Q．８５−２．９０ （ａ　Ｈ− ５ＤＮＪ）、２．５６（ｂｒ　ｔ、Ｊｌａｍ、　ｔ”１２　Ｈｚ、　Ｈ−１ａｘ 　ＤＮＪ）、　”Ｃ−ＩＧＩＲ（１２５！ａｚ、０．０）δfａｌに 関して１０３．７　（Ｃ−１）、　７１．７（Ｃ−２）、　７３．２（Ｃ−３） 、　６９．２（Ｃ−４）、　７６、３（Ｃ−５）、　６１．W（Ｃ−６）　； ＤＮＪに関して４７．４（Ｃ−１）、　６９．０４（Ｃ−２）、　７６、２（Ｃ −３）、　７８．９（Ｃ−４）、　５９．４（Ｃ−５）、　U０．０（Ｃ−６） ＨＲＭＳ　（Ｍ＋Ｃｓ”　）計算値４５８．０４２７、実測値４５８．０４４４ ４゜ＭｇＣ１，緩衝液（ＮａｔＨＸの０．　ＩＯＭの溶液４ｍＬ及びＭｇＣ１， １０ミリモル、ｐＨ７，０）及びトリス（ＴｒｉｓＸＯ，０５Ｍの溶液１　ｍＬ 、　ｐＨ７，３）中の４−二トロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（１５０ ■、０．５０ミリモル）及び５−チオ−ローグルコース（４９■、０．２５ミリ モル）の溶液に２３℃で添加した。その反応をＴＬＣにより定期的に監視しなが ら２３℃に保った。５８時間後、その反応を１００℃で３０分間加熱することに より停止した。
その溶液を濾過し、凍結乾燥し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 、３：２：１の酢酸エチル−酢酸−水）により精製した。三糖を含む画分を、バ イオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｔ）Ｐ−２カラム（２ｘ４０ｃＩＩｌ、２００〜４０ ０メツシユ）を使用するゲル濾過クロマトグラフィーにより更に精製し、Ｈ，Ｏ で溶離して表題化合物（２６，４■、５−チオ−ローグルコースを基準として２ ９．５％）を白色の無定形の固体（Ｒ，＝０．４４、シリカゲル、３：２：ｌの ＢｔＯＡｃ−ＨＯＡｃ−ＨｔＯ）として得た。また、そのシリカゲルクロマトグ ラフィーはガラクトース及び５−チオ−ローグルコースを与えた。三糖の分析は １１：１の比のαアノマーとｂアノマーの混合物を示した。Ａアノマー：（“Ａ ”は５−チオグルコース部分を表し、一方、“Ｂ”はガラクトース部分を表す） カップリング定数の差は丸めの誤差による。
’ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ、　ＤｔＯ）δ４．８２（ｄ、　Ｊ＝３．０　Ｈｚ、 　ＩＨ，Ｈｌ−Ａ）、　４．２２（ｄ、　Ｊ＝８．０　ＨｚA　ＩＨ，Ｈｌ− ８）、　４．０１（ｄｄ、　Ｊ□２．５．１１．　ＯＨｚ、　ＩＨ，Ｈ６−Ａ） 、　３．８２（ｄｄ、　Ｊ＝５．５．１１．０　Ｈｚ、　Ｉg，Ｈ６−Ａ）、　 ３．７４ （ｄ、　Ｊ＝３．０　Ｈｚ、　ＩＨ，Ｈ４−Ｂ）、　３．６３−３．５４（ａ　 ３Ｈ，Ｈ２−Ａ、　Ｈ３−Ａ、　Ｈ５−Ｂ）、　３．５０（煤A　Ｊ＝１０．５ 　Ｈｚ、　ＩＨ。
Ｈ４−Ａ）、　３．４８−３．４５（ａ　２Ｈ，Ｈ６−Ｂ）、　３．４６（ｄｄ 、　Ｊ＝３．５．１０．　ＯＨｚ、　ＩＨ，Ｈ３−Ｂ）、　R．３６（ａｐｐ、 　ｔ。
Ｊ＝９．０　Ｈｚ、　ＩＨ，Ｈ２−Ｂ）、　３．２０−３．１４（ｃ　ＩＨ，Ｈ ５−Ａ）　；　’　”ＣＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、　ＤｔＯ）■P０３．８゜ ？５．６．　７４．０．　７３．７．　７３．６．　７３．１．　７１．１．　 ６９．１．　６８．８　（ＣＨり、　旺４　（ＣＨｔ）、４P．６； 正確な質量Ｃ＋ｔＨｔｔＯ＋ｅＳＣ８（Ｍ＋Ｃｓ　”　）とし”ｃ−ノ計算値４ ９０．９９８８、実測値４９１．００１３ピリジン（０，９ｍＬ、１１．１ミリ モル）　、ＡｃｔＯ（０，１４ｍＬ、１．４８ミリモル）、及び（ＧＩＣＮＡＣ ）１表１（３３■、０．０９ミリモル）を０℃で混合した。その反応混合物を２ ３℃に温め、２３時間保ち、酢酸エチル（１０ｍＬ）で希釈した。有機相をＩＮ のＨＣＩ（１０ｍＬ）ですすぎ、酸性画分を酢酸エチル（２ｘ　２０　ｍＬ）で 抽出した。合わせた有機相を食塩水（１０ｍＬ）ですすぎ、乾燥しくＭｇ５Ｏ， ）　、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、３：ｌのＥｔ ＯＡｃ−）ルエン）により精製してｐｅｒ−アセチル化された表題三糖（２４■ 、９３％）を無色のガラス（Ｒ，＝０．６１　、シリカゲル、３：１のＥｔＯＡ ｃ−トルエン）として得た。三糖の分析は６：ｌの比のαアノマーとβアノマー の混合物を示した。
αアノマー：　’ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ、　ＣＤＣｌり６６．１２（ｄ、　Ｊ ＝３．５　Ｈｚ、　ＩＨ，Ｈｌ−Ａ）、　５．４２（ａｐｐｔ、　Ｊ＝ｌＯ，Ｏ Ｈ２，ＩＨ，Ｈ３−Ａ）、　５．３８（ｄｄ、　Ｊ＝１．０．３．５Ｈｚ、　１ １（、Ｈ４−Ｂ）、　５．２１（ｄｄ、@Ｊ＝３．０．１０．０ Ｈｚ、　ＩＨ，Ｈ２−Ａ）、　５．１９（ａｐｐｔ、　Ｊ＝１１．　ＯＨ２，Ｉ Ｈ，８４−Ａ）、　５．１８（ｄｄ、　Ｊ＝８．０．１０．T　Ｈｚ、　ＩＨ， Ｈ２− Ｂ）、　４．９９（ｄｄ、　Ｊ＝３．５．１０．５１（ｚ、　ＩＨ，Ｈ３−８） 、　４．４０（ｄ、　Ｊ＝９．０　Ｈｚ、　ＩＨ，８ｌ−Ｂj、　４．１６（ｄ ｄ、　Ｊ＝６．５゜ １１、０Ｈｚ、　ＩＨ，Ｈ６−８）、　４．１０（ｄｄ、　Ｊ＝６．５．１１． 　ＯＨｚ、　ＩＨ，Ｈ６−８）、　４．０５（ｄｄ、　Ｊ＝R．５．１０．０　 Ｈｚ。
１Ｈ，Ｈ６−Ａ）、３．８８（ｄｔ、Ｊ＝１．０．７．０　Ｈｚ、ＩＨ，Ｒ５− Ｂ）、３．５７（ｄｄｄ、Ｊ＝３．５．７．０．　ＩＯ，５gｚ、ｌＨ。
Ｒ５−Ａ）、　３．４９（ｄｄ、　Ｊ＝７．５．１０．５　Ｈｚ、　ＩＨ，Ｈ６ −Ａ）、　２．１８（ｓ、　３Ｈ，０Ａｃ）、　２．１４（刀A　３Ｈ，０Ａｃ ）。
２．０９（ｓ、３Ｈ，０Ａｃ）、２．０５２（ｓ、３Ｈ，０Ａｃ）、２．０４６ （ｓ、３Ｈ，０Ａｃ）、２．０１（ｓ、３Ｈ，０Ａｃ）、１D９９ （ｓ、３Ｈ，０Ａｃ）、１．９８（ｓ、３Ｈ，０Ａｃ）　；”ＣＭ　（６２ＭＨ ｘ、ＣＤＣ１ｔ）δ１７０．３．１７０．２．１７０．１゜１６９．７．１６９ ．６．１６９．４．１６９．１．１０１．２．７３．１．７２．３．７０．８． ７０．４．６８．１．６７．３（ＣＨ，）、　６６．８．６１．０　（ＣＨｔ） 、　４０．８．２０．９．２０．８．２０．６．２０．５；正確な質量ＣｔａＨ ｓｍＯ＋５ＳＣｓ　（Ｍ＋Ｃｓ　”　）としての計算値８２７．０８３３、実測 値８２７．０８２３これらの合成は、Ｇａ１Ｔ及びβ−ガラクトシダーゼか弱い アクセプター基質を使用してミリグラムスケールで三糖の調製に触媒として使用 し得ることを実証する。
酵素が比較的安定であると仮定すると、Ｇａ１Ｔ　（及びおそらくその他のグリ コジルトランスフェラーゼ）は幾つかの特異なオリゴ糖の小規模合成に使いやす いと思われる。
全ての主題三糖は、Ｈ−１’とＨ−４の間のかなりのＮ０Ｅ（６〜１０％）によ り証明されるように同様のグリコシドのねじり角を有する。この観察は、グリコ シドのねじり角が主としてエキソ−アノマー効果により決定されるというレミエ ウクス（Ｌｅ−・　ｍ１ｅｕｘ）により報告された観察と一致する。
実施例２ニジアリルＮ−アセチルラクトサミンの合成シアリルＮ−アセチルラク トサミン（ＮｅｕＡｃ　ａ　２．６Ｇａ　ｌβｌ、　４ＧＩｃＮＡｃ）を、上記 の機構４に従って１トシアル酸のその場の再生により酵素触媒法で合成した。
ノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）　、ＣＭＰ　、　ＡＴＰ　、　ＰＥＰ（モノナトリ ウム塩）　、ＭｇＣ１，−６Ｈ，０、ＭｎＣＩｔ　−４Ｈ１Ｏ１ＫＣＩ　、ピル ベートキナーゼ（ＰＫ、　ＥＣ２，７，１，４０）　、ヌクレオシドモノホスフ ェートキナーゼ（ＮＭＫ、　ＥＣ２，７，４，４）及び無機ピロホスファターゼ （ＰＰａｓｅ。
ＥＣ３，６，１，１）をシグマ・ケミカル社から購入した。Ｓｉａα２．６Ｇａ ｌシアリルトランスフエラーゼ（ＥＣ２，４，９９，１）を気前のよい贈り物と して得たが、これはシグマ・ケミカル社から購入し得る。ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシ ンセターゼ（ＥＣ２，７，７，４３）を下記の方法によりＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ遺 伝子で形質転換したＥ、ｃｏｌｉから得た。
ＮｅｕＡｃ（０，９２ｇ、３ミリモル）　、Ｇａｌβ１．４ＧＩｃＮＡｃ（１， １ｇ、３ミリモル）、ＣＭＰ（０，１ｇ、３０ｇモル）　、ＡＴＰ（１６■、３ μモル）　、ＰＥＰ（２，８ｇ、６ミリモル）、ＭｇＣｌ２　・６Ｈ＊０（０， ６１ｇ、３ミリモ／ｌ／）　、ＭｎＣ１ｔ　”　４ＨｔＯ（０，１５ｇ、　０． ８ミリモ／Ｌ／）　、ＫＣＩ（０，２２ｇ　。
３ミリモル）、［またはＭＫ（４５０Ｕ）、ＰＫ（６，０ＯＯＵ）、ＰＰａｓｅ （３０００）　、口（Ｐ−ＮｅｕＡｃ　シンセターゼ（２４Ｕ）　、及びＳｉａ 　β２．６ｃａｌシアリルトランスフエラーゼ（４Ｕ）をＨＢＰＢＳ緩衝液（０ ，２Ｍ　５ｐＨ７，５）１５０　ｍｌと混合して反応混合物を生成し、その反応 混合物をアルゴン雰囲気下で約２５℃で約４８時間保った。ＮｅｕＡｃの消失（ 薄層クロマトグラフィーにより測定）後、その反応混合物を凍結乾燥により２０ ＋ｎｌまで容積を減少し、凍結乾燥した反応混合物を移動相としての水と共にバ イオゲルＰ２（２００〜４００メツシユ）カラムに適用した。三糖を含む画分を 溶離し、回収し、凍結乾燥して９７％の収率で純粋なＮｅｕ　β２，６Ｇａｌβ ｌ、　４Ｇ１ｃＮＡｃを得た。
’Ｈ−ＮＭＲδ１．７０１（ＩＨ，ｔ、　Ｊ＝１２．５　Ｈｚ、　ＮｅｕＡｃの Ｈ−３、、）、２．００７（３Ｈ，ｓ、ＧｌｃＮＡｃのＮＨ`ｃ）。
２．００４（３Ｈ，ｓ、　ＮｅｕＡｃのＮ）ＩＡｃ）、　２．６４９（ＩＨ，ｄ ｄ、　Ｊ＝５．０及び１２．５　Ｈｚ、　ＮｅｕＡｃのＨ−R、、。
４．４３１．ｄ、Ｊ＝８．ＯＨｚ、　ＣａｌのＨ−１）、　４．７３（０，５Ｈ ，ｄ、　Ｊ＝８．０　Ｈｚ、　ＧｌｃＮＡｃのＨ−１ｂ）　A及び ５、１７８（０，５Ｈ，ｄ、　Ｊ＝２．５　Ｈｚ、　ＧｌｃＮＡｃのＨ−１ａ） 。
ＡＴＰ　（７）回転数は約１０００テあり、ＣＭＰ　、ＣＤＰ　、　ＣＴＰ及び ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ　（Ｄ回転数ハ約１００であった。
、これらのデータは、グリコジル化合物がαトシアル酸のその場の再生に関与す る有効な酵素触媒による自蔵のサイクル合成方法でシアリル化し得ることを示す 。
この合成方法はシアリル化されたグリコジル化合物の大規模調製の新規な高収率 （９７％）機構を与える。
Ａ１組換えＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの調製ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラ ミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）シンセターゼ（ＥＣ２，７，７，４３）をコード する遺伝子を、プライマー誘導ポリメラーゼ連鎖反応によりＢ、ｃｏｌｉ株に− ２３５の全ＤＮＡから増幅した。その遺伝子を最初のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセ ターゼ遺伝子の修飾リポソーム結合部位及びデカペプチドｔａｇ配列（これは発 現タンパク質のスクリーニングのマーカーとして利用できる）と融合した。その 遺伝子をＢｃｏ　ＲＩ部位及びＸｂａ　Ｉ部位でλＺＡＰ（商標）ベクターにク ローン化し、Ｅ、ｃｏｌｉ　５ｕｒｅ中で野生型の約１０００倍のレベルで過剰 発現した。
Ｅ、ｃｏｌｉ株に２３５（ＡＴＣＣ１３２０７）をアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクションから入手し、ＬＢ（ルリアーバータ＝（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒ ｔａｎｉ　））培地（１リツトルはバクトドリブトン２５ｇ、酵母エキス１０ｇ 　、　ＮａＣ１３ｇを含む、ｐＨ７，０）で維持した。ゲノムＤＮＡをマニアチ ス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らにより記載された方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａ−ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏ秩AＮＹ（１９８９）） に従ってＥ、ｃｏｌｉから抽出した。
Ｃ１１ｌＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ遺伝子を二種の注文設計したプライマー（ 表４）の存在下でＰＣＲ増幅により単離した。
表４ プライマーＣＭＰ５ （配列番号２） プライマーＣＭＰ５は、Ｅｃｏ　ＲＩ制限部位、リポソーム結合配列、開始コド ン及び酵素のＮ末端へキサペプチドに相当するオリゴヌクレオチド（上で下線が 施されている）を含んでいた。プライマーＣＭＰ３は、Ｘｂａ　Ｉ制限部位、停 止コドン、デカペプチドｔａｇ配列及び酵素のＣ末端へブタペプチドに相当する 配列（また、上で下線が施されている）を含んでいた。
ＰＣＲ増幅を、Ｅ、ｃｏｌｉ株に２３５ＤＮＡ　２　μＬ（２μｇ）、ブライｖ −Ｃ１ｉｌＰ５及びＣＭＰ３４００ｎモル、種々のｄＮＴＰ２００μＭ、ＫＣｌ ５０ミリモル、トリス−ＨＣｌ　（＋）Ｈ８，３）１０ミリモル、ＭｇＣ１ｔ　 ２ミリモル、０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、０．１％（ｖ／ｖ）のトリトン Ｘ−１００、及びテルムス・アクアチフス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕ ｓ）　ＤＮＡポリメラーゼ２単位を含む反応混合物１００μＬ中で行った。その 反応液を鉱油で覆い、３５サイクルの増幅にかけた。サイグル条件を、９４℃で １分間の変性、６０℃で２分間のアニーリング、そして７２℃で１．５分間の伸 長にセットした。プライマーを９４℃で２分間にわたってＢ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡ でアニル化し、続いてＰＣＲ増幅の前に徐々に室温に冷却した。
Ｅ、ｃｏｌｉ中の酵素の発現のためのファーゲミドの構成のために、増幅遺伝子 をＢｃｏ　Ｒ１部位及びＸｂａ　１部位でλＺＡＰ（商標）ＩＩベクターにクロ ーン化した。
λＺａｐ（商標）ＩＩは、６の特有のクローニング部位を含む最初のλＺａｐ（ 商標）、融合タンパク質発現、及びインサートをファーゲミド（ブルースクリプ ト５Ｋ−）の形態で迅速に切除する能力の全ての特性を維持しているが、ＳＡＭ １００突然変異を欠いており、ＸＬＩ−ブルーを含む多くのＮｏｎ−５ｕｐ　Ｆ 株の増殖を可能にする最初のλＺａ９（商標）ベクター（ＡＴＣＣ１４０，２９ ８）の誘導体である。λＺａｐ（商標）ＩＩベクターを、ショート（Ｓｈｏｒｔ ）ら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　１６：７５８３（１９８ ８）に記載されたようにしてλＺａｐ（商標）を制限酵素Ｎｃｏ　Ｉで消化する ことにより生産した４２５４の塩基対（ｂｐ）のＤＮＡ断片中に含まれたλＳ遺 伝子を置換することによりつくった。この４２５４のｂｐのＤＮＡ断片を、ベク ターを制限酵素Ｎｃｏ　Ｉで消化した後に、λｇｔｌＯ（ＡＴＣＣ１４０、１７ ９）から単離されたλＳ遺伝子を含む４２５４ｂＤの［ｌＮＡ断片で置換した。
λｇｔｌＯから単離された４２５４ｂｐのＤＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及 びＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編集、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ 　５ｏｎｓ、　Ｉｆｆ。
１９８７に記載されたこのような方法のための通常のプロトコルを使用して最初 のλＺａｐ（商標）ベクターにつないだ。
ＰＣＲ増幅から得られたＤＮＡを０．６％のアガロースゲルで精製した。１．３ ｋｂに相当するＤＮＡバンドをアガロースから分離し、電気溶離した。次いでＤ ＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、２０℃で一夜にわたってエタノール で沈殿させた。
沈殿したＤＮＡを、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル社（インジアナ ポリス、ＩＮ）により供給された適当な制限酵素緩衝液中で顕示し、３７℃で２ 時間にわたって４０単Ｖμｇ　ＤＮＡのＥｃｏ　ＲＩ及びＸｂａ　Ｉで消化した 。次いで消化したＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿に より回収し、π緩衝液（ｐＨ７，５）中に再度懸濁させた。このＤＮＡをインサ ートとして使用した。また、アームを２０単’ｔｌｊｍｇ　ＤＮＡのＥｃｏ　Ｒ Ｉ及汎ｂａ　ＩによるベクターλＬｃｌの消化により調製し、フェノール／クロ ロホルムによる抽出後にエタノール沈殿で回収した。べフタ−λＬｃｌをレーナ ー（Ｒ，んＬｅｒｎｅｒ　）博士（Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｃ１１ｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎ−ｄａｔｉｏｎ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）から の気前のよい贈り物として得た。次いでインサートをアームとつなぎ、製造業者 （ストラタゲン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｏ、　、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、 　ＣＡ））により提案されたように包装キットで包装した。λＬｃｌアームを含 むＰＣＲ増幅生産物インサートが図２に示される。
包装後、ファージ溶液を使用して宿主株ＸＬＩ−ブルー（ストラタゲン社）を感 染させ、３７℃でＬＢ寒天プレートに塗布した。プラーク形成が観察された後、 ０．５ミリモルのｔｐｔｃ　＜イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド ）溶液で前もって浸軟したニトロセルロース膜を寒天の上に注意して置き、２５ ℃で一夜（約１５時間）にわたってインキュベートした。次いでニトロセルロー ス膜を、抗デカペプチドｔａｇ抗体と接合されたアルカリホスファターゼによる スクリーニングのために使用した。濃い青色のプラークを含む陽性クローンを寒 天プレートから採取し、漣緩衝液５００　μｌ及びＣＨＣｌ５２０　μｌを含む 無菌ミクロヒュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）管に移した。延長のために、その柏 原液ｚｏｏμ＋をｘＬｌ−ブルー細胞（ＯＤｓｓｅ＝１．０）２００μＬ及び旧 ０８ヘルパーファージ（ストラタゲン社から、ｌ　ｘ　１０”ｐｆｕ／ｍ１）２ μＬと混合・　し、その混合物を３７℃で１０分間インキュベートした。切除し たプラスミドを使用してＸＬＩ−ブルー細胞［ショートら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ　 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１６：７５８３（１９８８）］を感染させ、塗布し、 ＥＬＩＳＡアッセイ及び酵素活性アッセイにより酵素の発現につき分析した。
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを多（生産した一種のクローンを単離し、株５ ＩＬ−８３と称し、その中に含まれたファーゲミドをＣＭＰＳＩＬ−１と称した （図３）。ファーゲミド０１１ＰｓＩＬ−１を、プラスミド単離キット（キアゲ ン社（Ｑｉａｇｅｎ　Ｉｎｃ、、５ｔｕｄｉｏ　Ｃ１ｔｙ。
ＣＡ））を使用して株５ＩＬ−８３から単離し、Ｅ、　（０１ｉｓｕｒｅ受容細 胞（ストラタゲン社）に形質転換した。形質転換細胞を、２５０μｇ／ｍＬのア ンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して多 量酵素生産につきスクリーンした。
Ｅ、　ｃｏｌｉｓＩＬ−３２２と称される成る種の株は、培養ブロース１リツト ル当たり約１００単位のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を生じた。このＣ ＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの生産は、野生型の形質転換されていないＢ、ｃ ｏｌｉにより生産される０ｉｌＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの量の１０００倍以 上であり、またザパタら著、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩＬ、　２６４（２５） ：　１４７６９（１９８９）に記載された形質転換細胞により生産されるＣＭＰ −ＮｅｕＡｃシンセターゼの量の３０倍以上である。
Ｂ、ｃｏｌｉ株５ＩＬ−３２２を、２５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ に富む培地で中間対数増殖期（ＯＤｓｓｓ約０．６〜０．７）まで増殖させ、３ ０℃で１０時間にわたって０．５ミリモルの１円℃で誘導した。培養ブロースを ４℃で２０分間にわたって１０．０００　ｘ　ｇで遠心分離し、得られる細胞ペ レットを、０．２Ｍのトリス（ｐｌ（７，５）、０．２ミリモルのジチオスレイ トール及び２０ミリモルの！ｉ１ｇｃ　ｌ　ｔを含む緩衝液で洗浄した。洗浄後 、細胞ペレットを同緩衝液中に再度懸濁させ、フレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）加圧セ ルにより１６．０００ポンド／平方インチで分断し、２３．０００　ｘ　ｇで６ ０分間にわたって遠心分離した。得られる上澄みを、発色物がシクロヘキサノン で抽出される以外は、パン（Ｖａｎ）らの方法（Ｊ、Ｂｆｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２ ６２：１７５５６（１９８７））に従って酵素活性アッセイに関して分析した。
酵素を、５．５ミリモルのＣＴＰ、２．８ミリモルのＮ−アセチルノイラミン酸 、０．２モルのトリス、２０ミリモルのＭｇＣ１，及び０．２ミリモルのＤＴｒ を含む２５０μｌの緩衝液（ｐＨ９，０）中でインキュベートした。その混合物 を３７℃で３０分間インキュベー、トシた後、１．６ＭのＮａＢＨ４５０μｌを 添加して過剰のＮｅｕＡｃを室温で１５分間分解した。
次いでその混合物を水浴に入れ、ＨｓＰＯ，ｓｏμＩを添加してＮａＢＨ，を分 解した。その混合物を０℃で５分間保ち、次いで３７℃で１０分間インキュベー トして生成されたＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸のホスホエステル結合を開 裂した。遊動−アセチルノイラミン酸を室温で１０分間にわたって０．２ＭのＮ ａ１Ｏｎ５０μｌで酸化し、０．５ＮのＨＣｌ中の４％のＮａＡｓ０ｔ４００　 ｕ　Ｉを添加した。次いでその溶液を、０．５ＭのＮａ１ＳＯａ中に０．６％の チオバルビッール酸１ｎｌを含む試験管に移し、沸騰水中で１５分間加熱した。
その溶液を冷却した後、その溶液１ｍｌを取り出し、シクロへキサノン１ｍｌと 混合した。その混合物を振とうし、遠心分離し、上層を５４９ｎｍにおける測定 のために採取した。
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを、リガンドとして抗デカペプチド抗体またはオレンジＡ（ アミコン社（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃ，、Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＭＡ））を使用するアフ ィニティークロマトグラフィー、続いてゲル濾過により単離した。フセら著、５ ｃｉｅｎｃｅ、　２４６：１２７５（１９８９）を参照のこと。上記のようにし て得られた細胞遊離抽出物（３０ｍＬ）をオレンジＡ色素カラム（１，５ｍｇ／ ｍ　ｌのゲル、３ｃｍ　ｘ　３０ｃｍ）に通し、トリス緩衝液（０，２Ｍのトリ ス、０．２ミリモルのＤＴｒ及び２ミリモルのＭｇＣ１，、ｐＨ７，５）２００ 　ｍｌで洗浄した。酵素を同緩衝液中ＯＭのＫＣＩからＩＭのＫＣＩまでの線形 勾配で溶離した。活性画分を溜め、限外濾過により５ｍｌまで濃縮した。次いで 濃縮酵素液をＦＰＬＣゲル濾過カラム（スペロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）１２　 ｈ　１０／３０、ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｃｏ、　））に０．２ ｍｌ／分の流量で通し、活性画分を回収した。タンパク質濃度をＯＣＡアッセイ キット（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｏ、　、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）） により測定した。タンパク質の純度をＳＤＳ　ＰＡＧＥ（ファストシステム（Ｐ ｈａｓｔｓｙｓｔｅＩＩ＋）　、フ７−マシア社）により判定した。
実施例３ニジアリル三糖の合成 二つの方法を組み合わせてシアリル三糖を合成した。まず、酵素的アルドール反 応（機構２のサイクルＢ）を機構ｌに導入した。ＭａｎＮＡｃをピルビン酸の存 在下でＮｅｕＡｃアルドラーゼ（ＥＣ４，１，３，３）により触媒作用を受けて ＮｅｕＡｃに変換した。
また、ＮｅｕＡｃアルドラーゼは逆反応（ＮｅｕＡｃからＭａｎＮＡｃ及びピル ベートへ）を触媒作用するが、生成されたＮｅｕＡｃは、放出された無機ピロホ スフェートの無機ピロ、　ホスファターゼ（ＰＰａｓｅ）触媒作用の分解と対に された０伊−シアル酸シンセターゼにより触媒作用を受けてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ を経由して機構２のサイクルＡに不可逆的にとり込まれる。パイオーゲルＰ−２ カラムクロマトグラフィー後に、シアリルＬａｃＮＡｃを８９％の収率で得た。
実験方法は以下のとおりである。
１、６５ｇ＋ｌのＨＥＰＥＳバッフｙ　（２００ｍＭ、　ｐＨ７，５）にＭａｎ ＮＡｃ（４３■、ｔＳＯミリモル）　、ＬａｃＮＡｃ　（２２ｍｇ、６０ミリモ ル）、ＣＭＰ（２，０＋ｎｇ、　６ミリモル”）　、ＡＴＰ　（０，３２■、０ ．６ミリモル）、ＰＥＰナトリウム塩（５６■、２４０ミリモル）、ＭｇＣ１ｔ ・６Ｈ＊０（１２，２■、６０ミリモル）、ＭｎＣ１ｔ　”　４ＨｔＯ（３，Ｏ ｎｌｇ、１６ミリモル）　、ＫＣＩ（４，４■、６０ミリモル）、ピルビン酸ナ トリウム塩（３３■、３００ミリモル）　、ＮｅｕＡｃアルドラーゼ（ＥＣ４， １，３，３；　４５０）、ＭＫ（ＥＣ２，７，４，３、１０００）、ＰＫ（ＥＣ ２，７，１，４０；１２００）、ＰＰａｇｅ（ＥＣ３，６，１，１；　６Ｕ）、 メルカプトエタノール（０，２２ａ＋１）、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ（ ＥＣ２，７，７，４３；　１ｍｌの０．１Ｍ　トリスバッファー、ｐＨ９中０． ３Ｕ）及びａ（２，６）シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２，４，９９，ｌ； ０．０８Ｕ）を加えた。反応混合液の最終容量は、３ｍｌであった。反応は、ア ルゴン下室温で２日間行った。出発物質の消失がＴＬＣにより判定された（Ｒｆ ：ＬａｃＮＡｃ、０．６３；ＮｅｕＡｃ、０．３１；　シアリルＬａ　ｃＮＡｃ 、　０．３０　；ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、０．１９、ＩＭＮＨａＯＡｃ／１ＰｒＯ Ｈ１：２．４．ｖ／ｖ）後、反応混合液をＢｉｏ−Ｇｅｔ　Ｐ−２（２００−４ ００メツシユ）カラム（２ｘ３６ｃｍ）に直接加え、水で溶離した。三糖含有画 分をプールし、凍結乾燥してシアリルＬ　ａ　ｃ　ＮＡｃを得た（３７■、８９ ％）。
ＬａｃＮＡｃ合成サイクル（スキーム（機構）２のＣ）と上記サイクル（スキー ム２のＡ＋Ｂ）も組合わせた。実験手順は次の通りである：２．６ｍｌのＨＥＰ ＥＳバッファー（２００ｍＭ、ｐＨ７，５）にＭａｎＮＡｃ　（４３■、１８０ ミリモル）　、Ｇｌ　ｃＮＡｃ　（１３，３［，６０ミリモル）、Ｇｌｃ−１− Ｐ（２１，５■、６０ミリモル）　、ＣＭＰ　（２，０■、６ミリモル）、ＵＤ Ｐ（２，８■、６ミリモル）、ＡＴＰ（０，３２■、０．６ミリモル）、ＰＥＰ ナトリウム塩（７５■、３２０ミリモル）、ＭｇＣ１ｔ・６１（！Ｏ（１６，３ ｍｇ、８０ミリモル）、ＭｎＣ１ｔ・４Ｈ１０（４，０■、２０ミリモノリ、Ｋ ＣＩ（６，０■、８０ミリモル）、ピルビン酸ナトリウム塩（３３■、３００ミ リモル）　、ＮｅｕＡＣアルドラーゼ（４５Ｕ）、（１００υ）、ＰＫ　（１２ ０Ｕ）、ＰＰａｓｅ　（１２０）、メルカプトエタノール（０，３３ｍ１）　、 ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ　Ｃ２，４，１，２２，Ｉ　Ｕ）、ＵＤＰ −Ｇｌｃピロホスホリラーゼ（ＥＣ２，７，７，９；　ＩＵ）、ＵＤＰ−Ｇａ　 １４−エピメラーゼ（ＥＣ５，１，３，２，ＩＵ）、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセ ターゼ（ｌｎｌのＯ，１Ｍトリスバッファー、ｐＨ９中０．３０）及びａ（２， ６）シアリルトランスフェラーゼ（０，０８０）を加えた。反応混合液の最終容 量は、４ｍｌであった。反応は２日間で完結し、上記手順に基づいて純粋なシア リルＬａｃＮＡｃ　（９■；２２％）を単離した。
これらのデータは、ＧｌｃＮＡｃＳＭａｎＮＡｃ、Ｇｌｃ−１−Ｐ及び触媒量の ＣＭＰ、ＵＤＰ　（各々０．１当量）及びＡＴＰ　（０，０１当量）から出発す るシアリル三糖類の効率のよい合成を示しており、煩雑な別の糖ヌクレオチド標 品はその場で再生されていない。ＰＥＰから生成されたピルビン酸塩は、Ｎｅｕ Ａｃアルドラーゼ反応において基質として用いられる。
実施例４：単糖受容体の合成 Ａ、２−アセトアミド−３−０？アセチル−２−デオキシ−Ｄ−グルコビラノー ス、化合物Ｉｆ ２−アセトアミド−３−〇−アセチルー２−デオキシーＤ−グルコビラノース、 化合物ｉｆの合成を下記スキームにより行った。
ｆ 化合物１１から標準法により調製した化合物１２（２ｇ、５ミリモル）を２０ｍ １の乾燥ピリジンに溶解し、４当量（２，６ｇ）の酢酸無水物で処理した。この 混合液を１０時間還流し、次いで、氷で急冷し、クロロホルムで抽出した。抽出 液を２ＮＨＣＩ　（２ｘ１００＋ｎｌ）、水（５０＋ｎｌ）及び食塩水（５０ａ ＋１）　テ洗浄した。
Ｍｇ５Ｏａで乾燥し、蒸発した後、酢酸エチルで結晶化して生成物、ベンジル２ −アセトアミド−３−０−アセチル−４，６−０−ベンジリデン−２−デオキシ −α−Ｄ−グルコピラノシド、化合物１３ａ、ｔ、４３ｇ（６５％）を得た。
’ＨＮＭＲ（ｄ−６アセトン）δ１．９３（ｓ、　３Ｈ，ＮＨＡｃ）、　２．０ ６（ｓ、　３Ｈ，α）ＣＨｓ　）、　３．７２−４．２８（hｌｌ。
５Ｈ，Ｈ−２，４，５，６ａ、　６ｂ）、　４．４４．４．６８（２ｄ、Ｊ　＝ 　１４　Ｈｚ、２Ｈ，ＣＨｔＰｈ）、　４．７９（ｄ、Ｊ　＝@４　Ｈｚ、　Ｉ Ｈ，Ｈ −１）、　５．０８　（ｓ、　ＩＬベンジル）、５．２７（ｄｄ、Ｊ　＝　１０ 　Ｈｚ、Ｊ　＝　９．５　Ｈｚ、ＩＨ，３−Ｈ）、７．２５|７．４０ （ａ５Ｈ，Ａｒ）、　８．５０（ｄ、Ｊ　＝　９　Ｈｚ、　ＩＨ，ＮＨ）。
化合物１３ａ（８００■、２ミリモル）を１００ａ＋１のエタノール及び２０ｍ １の酢酸に溶解し、２５０■の５％Ｐｄ／Ｃを用いて５０ｐｓｉ下室温でこの混 合液を水素化した。セライトでろ過し、蒸発し、カラムクロマトグラフィー処理 した後、化合物Ｉｆ（３５０■、６７％）を得、更にメタノール／エチルエーテ ルで結晶、化した。
’ＨＮＭＲ（ＤｔＯ）δ１．９４（ｓ、　３Ｈ，０Ａｃ）、　２．０６（ｓ、　 ３Ｈ，ＮＡｃ）、　３．３６（ｄｄｄ、　Ｊ　＝　９．５及■Q．５ Ｈ２，Ｈ−５ｂ）、　３．５１（ｔ、Ｊ　＝　９．５　Ｈｚ、Ｈ−４ｂ）、　３ ．５６（ｔ、　Ｊ　＝　９．５　Ｈｚ、　Ｈ−４ａ）、　３D７２　（ｄｄ、　 Ｊ　＝１２゜ ５Ｈｚ、　Ｈ−６，ａ）、３．７８（ｄｄ、Ｊ　＝　１２．２．５　Ｈｚ、　Ｈ −６ｈａ）、３．８７（ｄｄｄ、Ｊ　＝　９．５．５及び２D５Ｈｚ。
Ｈ−５ａ）、　４．０５（ｄｄ、Ｊ　＝　１０．５．３．５１（ｚ、Ｈ−２ａ） 、４．７２（ｄ、Ｊ　＝　９　Ｈｘ、Ｈ−１ｂ）、４．９５iｄｄ、Ｊ　＝ １０、５．９　ｌｘ、Ｈ−３ｂ）、　５．０７（ｄ、　Ｊ　＝　３．５　Ｈｚ、 Ｈ−１ａ）、　５．１８（ｄｄ、　Ｊ　＝　１０．５．９　gｚ、　Ｈ−３ａ） 。
”ＣＮＭＲ（Ｄｙｅ）δ２１．３．２２．７（２ＣＨ，）、　５３．２（Ｃ−２ ）、　６１．３（Ｃ−６）、　６８．７．７２．３．７４．W゜ ７６．７（Ｃ−３，Ｃ−４，Ｃ−５）、　９１．９．９５．９（Ｃ−１）、　１ ７４．８．１７５．３（２ＣＯ）。
８、　２−アセトアミド−２−デオキシ−３−０−プロピル−Ｄ−グルコピラノ −！３ｂ肌ａ７リル 化合物１２（２ｇ、５ミリモル）を３０ｍ１のＴＨＦに溶解した。ＮａＨ（２４ ０■、６０％鉱油分散液、１．２当量）を０℃で加え、引き続き０．５２ｍｌの 臭化アリル（ｌ、２当量）を加えた。この混合液を１２時間加熱還流し、次いで 、氷及び、ＮＨ４Ｃｌ溶液で急冷した。水（１００ｍｌ）及び食塩水（５０ｍｌ ）で抽出した後、ＭｇＳＯ４で乾燥し、蒸発した。酢酸エチル／ヘキサンで再結 晶して１．３２　ｇのベンジル２−アセトアミド−３−０−アリル−４，６−０ −ベンジリデン−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシド、化合物１３ｂ（６ ０％）を得た。
’ＨＮＭＲ（ｄ−６アセトン）δ１．８５（ｓ、　３Ｈ，ＮＨＡｃ）、　３．０ ６−４．３０（ｍ、　８Ｈ，Ｈ−２，３，４，５，６ａ、　U ｂ、アリルのＣＨＩ）、　４．５０．４．７２（２ｄ、　Ｊ　＝　１５　Ｈｚ、 　ＣＨ，Ｐｈ）、　４．８１（ｄ、　ＩＨ，Ｊ　＝　４　Ｈ噤A　ＩＨ，Ｉ（− １）。
５、０３−５．２５（ａ　２Ｈ，アリルのＣＨｔ＝Ｃ）、　５．１３（ｓ、　Ｉ Ｈ，ベンジル）、　５．７５−５．９６（ｍ、　ＩＨ，アリルのＣＨ＝）、　７ ．３０−７．５０（ｍ、５８．　Ａｒ）、　８．１２（ｄ、　Ｊ　＝　９　Ｈｚ 、　ＩＦＩ、　ＮＨ）。
化合物１３ｂ（４４０■）を１０ｍ１のエタノール及び５ｍｌのシクロヘキサン に溶解した。１００■のＰｄＯを加え、この混合液を１６時間還流した。触媒を ろ過で除き、ろ液を蒸発させた。シリカゲル（ＣＨＣｌ、／メタノール／ヘキサ ン６：２：ｌ）を用いてカラムクロマトグラフィー処理した後、化合物１ｈを得 た（１２０■、４６％）。
’ＨＮ！ｉ！Ｒ（ＤｔＯ）　６０．９２（ｔ、　Ｊ　＝　７　Ｈｚ、　３Ｈ，Ｃ Ｈ２）、　１．５６（ｍ、　２Ｈ，Ｈ−２’　ｔ）、１．９U（ｓ、　３Ｈ。
ＮＨＡｃ）、３．２３−３．８５（＆７Ｈ，Ｈ−３．４．５，６．１’　）、３ ．９３（ｄｄ、　Ｊ　＝　９　Ｈｚ、　Ｊ　＝　４　Ｈｚ、jｌ−２ａ）、　４ ．５８ （ｄ、Ｊ　＝　８　Ｈｚ、Ｈ−１ｂ）、５．０２　（ｄ、Ｊ　＝　４１ｘ、Ｈ− １ａ）。
Ｃ、メチル２−アセトアミド−３−０−アリル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコ 化合物１ｇの合成を下記スキームにより行った。
化合物１４から化合物１５を経て保護及びアルキル化標準方法により調製した化 合物１６（５００■、１．１５ミリモル）を４ｍｌの濃酢酸に溶解した。この溶 液を８０℃で１２時間攪拌した。酢酸を蒸発した後、残留物をシリカゲルによる カラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール２０：ｌ）で精製して、１ ５７■（５０％）の化合物１ｇを得た。
’ＨＮＭＲ（ｄ−５ピリジン）δ２．１６（ｓ、　３Ｈ，Ｎ）ｔＡｃ）、　３． ３２（ｓ、　３Ｈ，Ａｒ−ＯＭｅ）、　３．６６（ｓ、　３■i、Ｃ −１−ＣＩＩ！ｅ）、　３．８０−４．０８（ａ　５Ｈ，３−Ｈ，４−Ｈ，５− Ｈ，６−Ｈｚ）、　４．３５（ｄｄ、　Ｊ　＝　９．５　Ｈ噤A　Ｊ　＝　４． ５　Ｈｚ、　Ｉ Ｈ，２−Ｈ）、　４．１６−４．６０（ａ　２Ｈ，アリルのＣＨｔ　）、　４． ７８−４．９０（ｍ、　ＩＨ，５−Ｈ）、　５．０４−５．S０（ａ　２Ｈ，Ｃ Ｈｔ ＝Ｃ）、　５．７４（ｓ、ＩＨ，ベンジリデン）、　ｓ、　９０−６．１０　（ Ｉｎ、ＩＨ，アリルのＣＨ＝Ｃ）、　７．００−７．７０（■ ４Ｈ，ａｒ）、８．９５　（ｄ、Ｊ　＝９　Ｈｚ、　ＮＨ）。
Ｄ、アリル２−アセトアミド−２，３−ジデオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド 、化合物１１の合成は、下記スキームにより行った。
ＭｅＯＨ（２０ｍ１）中アリル２，３−ジデオキシー２−フタルイミド−β−Ｄ −グルコピラノシド、化合物２２（１００ｍｇ、０．３０ミリモル）及びＢ　ｕ 　ＮＨｔ（４ｍ１）の混合液を１０時間還流した後、冷却し、蒸発した。ＭｅＯ Ｈ（ｌ　０ｗ１）中１残留物の溶液に酢酸無水物（２ｍｌ）を０−５℃で加え、 この混合液を０−５℃で３時間攪拌した。この混合液を濃縮し、残留物をＭｅＯ Ｈ中でＥｔｔＯと摩砕して化合物１ｉ（４０■、５４％）を得た。
’ＨＮＭＲ（Ｄ、０）δ１．５２（１８，ｑ、　Ｊ　＝　１２．３５８Ｚ、　Ｈ −３ａｘ）、　１．９８（３１（、ｓ、　ＮＨＡｃ）、　２D２５（ＩＦＩ、　 ｄｔ。
Ｊ　＝　４．７６、１２．３８　Ｈｚ、Ｈ−３ｅｑ）、３．３９（ＩＨ，ｄｄｄ 、Ｊ　＝　２．３０．６．４４．９．４５　Ｈｚ、Ｈ−５）A　３．５９ （ＩＨ，ｄｔ、Ｊ　＝　４．７９．９．４５　Ｈｚ、Ｈ−４）、３．６５（ＩＩ （、ｄｄ、Ｊ　・６．４４．１２．３０．Ｈｚ、Ｈ−６ａ）A３．７３（Ｉ Ｈ，ｄｄｄ、Ｊ　＝　４．７６、８．４５．１２．９０　Ｈｚ、Ｈ−２）、３． ８４　（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　２．３０．１２．３０　ＨｚAＨ−６ｂ）。
４．４９　（ＬＨ，Ｊ　＝　８．４５　Ｈｚ、）ｌ−１）　；　”ＣＮ）ＩＩＲ （Ｄ２０）δ２２．３０．３６．５２．４９．２４．６１．Q２゜ ６４．５７．８０．０９．１０２．０３．１１８．５４．　１１３．６７、１７ ４．０３：ＣｕＨｎＮＯｓＣ３（Ｍ＋Ｃｓ　”　）に対するＨＲＭＳ　計算値： 　３７８．０３１８．実測値：　３７８．０３１８゜Ｅ、アリル２−アセトアミ ド−２−デオキシ−３−〇−メトキシカルボニルーβ−Ｄ−グルコピラノシド、 化合物１に 化合物１にの合成を下記スキームにより行った。
ｐ−メトキシベンズアルデヒド（３０ｍｌ）を５ｇの乾燥ＺｎＣ１ｔで処理した 。１時間攪拌した後、この混合液に化合物１７（４ｇ、１５ミリモル）を室温で 加えた。反応混合液を１６時間攪拌し、次いで１００ｍ１のＣＨＣｌ１とｌｏＯ ｍｌの水で処理した。合わせた有機溶液を１００ｍｌの食塩水で洗浄し、ＭｇＳ Ｏ４で乾燥した。
溶媒を減圧下で除去した。生成物を酢酸エチル／ヘキサンで再結晶して４．２ｇ （７４％）のアリル２−アセトアミド−２−デオキシ−４，６−０−ｐ−メトキ シベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド、化合物１８を得た。
’ＨＮＭＲ（ｄ−５ピリジン）δ２．０８（ｓ、　３Ｈ，ＮＨＡｃ）、　３．６ ７（ｓ、　３Ｈ，ＯＣＨ３）、　３．７０（ｄｄｄ、　Ｊ　■ ９　Ｈ２，Ｊ　＝　４　Ｈｚ、Ｊ　＝　２　Ｈ２，ＩＨ，５−Ｈ）、　３．９８ −４．０３（ａ　２Ｈ，６−Ｈｔ）、４．２７（ｄｄｄ、　i　＝　１２．５　 Ｈｚ。
Ｊ　＝５　Ｈｚ、Ｊ　：Ｉ　Ｈｚ、　ＩＨ，ＣＨｔ−−Ｃ；Ｃ）、４．４６（ｄ ｄ、Ｊ　＝１２　Ｈｚ、Ｊ　＝　４　Ｈｚ、　ＩＨ，ＣＨｔａ@−Ｃ ＝Ｃ）、　４．５２−４．７０（ｍ、　３Ｈ，２−Ｈ，３−Ｈ，４−Ｈ）、　５ ．１３（ｄ、　Ｊ　＝　８．５　Ｈｚ、　１）１．１−Ｈ）A　５．１８（ｄｄ 、　Ｊ　＝　９ Ｈｚ、Ｊ　＝　ｌ　Ｈｚ、　ｌＨ，ＣＨｔ−・Ｃ）、５．４８（ｄｄ、Ｊ　＝　 １７　）１ｚ、Ｊ　□　２　Ｈｚ、　ＬＨ，ＣＨｔｂ　□Ｃj、５．７７（ｓ。
ＩＨ，ベンジリデン）、　５．９８−６．１４（＆ＩＨ，Ｃ１（＝Ｃ）、　６． ９５−７．６０（ｍ、　４Ｈ，ＣＩ、　ａｒ）、　９．１０iｄ、　Ｊ　＝ ８　Ｈｚ、　ＩＨ，ＮＨ）。
化合物１８（４００■、１．０６　ミリモル）を３＋ｎｌのピリジンに溶解した 。０℃において、３８０■（４当量）のメチルクロロホーメートを加えた。１４ 時間撹拌した後、反応液を氷水で急冷した。沈澱をろ別し、水とエーテルで十分 に洗浄した。残存する固形物を乾燥し、精製せずに用いて３９５■のアリル２− アセトアミド−２−デオキシ−３−〇−メトキシカルボニルー４．６−０−ｐ− メトキシベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド、化合物１９ａ（８６，５％ ）を得た。
’ＨＮＭＲ（ｄ−５ピリジン）δ２．１２（ｓ、　３８．　ＮＨＡｃ）、　３． ６０（ｓ、　３Ｈ，α）ＯＣＨｓ　）、　３．６６−３．８O（ｍ。
ＩＨ，５−Ｈ）、　３．８５−４．０８（ｍ、　２Ｈ，６−）１ｔ　）、　４． ２３−４．４７（ｍ、　２Ｈ，Ｃ）Ｉｔ−Ｃ：Ｃ）、　４．S５−４．５５（ｍ 、　ＩＨ，４ −Ｈ）、　４．６２（ｄｄｄ、　Ｊ　＝　９　Ｈｚ、　Ｊ　＝　８　Ｈｚ、　Ｉ Ｈ，１−Ｈ）、　５．１５−５．５０（ｍ、　２Ｈ，ＣＴｏ≠b）、　５．２０ （ｄ、　Ｊ　＝ ８　Ｈ２，ＩＨ，１−Ｈ）、　５．７０（Ｓ、　１８．ベンジリデン）、５．８ ４（ｄｄ、Ｊ　＝　９．５　Ｈ２，Ｊ　＝　９．５　Ｈｚ、@ＩＨ，３ −Ｈ）、　５．９５（ａ　ＩＨ，ＣＨ＝Ｃ）、　６．９０−７．６ベａ４Ｈ，Ｃ Ｈ，Ａｒ）、９．４０（ｄ、Ｊ　＝　８　Ｈｚ、　ｌＨ，Ｎg）。
化合物１９ａ（０，！＋ミリモル）を２ｍｌの氷酢酸で処理し、６０℃で５時間 攪拌した。酢酸を減圧下で除去し、粗生成物、化合物１ｋをカラムクロマトグラ フィー（シリカゲル、クロロホルム／ＭｅＯＨ／ヘキサン＝　６：１：ｌ）で精 製した。
’ＨＦＪＭＲ（Ｄ！０）δ１．８２（ｓ、　３８．　Ｎｆ（Ａｃ）、　３．３８ （ｄｄｄ、　Ｊ　＝　１０　Ｈｚ、　Ｊ　＝　４．５　ＨｚA　Ｊ　＝　２　Ｈ ｚ。
ＩＨ，５−Ｈ）、　３．５３（ｄｄ、　Ｊ　＝　９．５　Ｈｚ、　Ｊ　＝　９　 Ｈｚ、　ＩＨ，２−）１）、　３．５６−３．８２（ａ　３g，４−Ｈ，６−Ｈ ｔ）、　４．０２ （ｄｄ、　Ｊ　＝　１３　Ｈｚｊ　＝　６　Ｈｚ、　１８．ＣＨｔ、−Ｃ＝Ｃ） 、　４．２０（ｄｄ、　Ｊ　＝　１３　Ｈｚ、　Ｊ　＝　５@Ｈｚ、　ＩＨ，Ｃ Ｈ２ｂ−Ｃ 、＝Ｃ）、４．５７（ｄ、Ｊ　＝　８Ｈｚ、　ＩＨ，１−Ｈ）、４．６６（ｄｄ 、Ｊ　＝　１０　Ｈ２，Ｊ　＝　９．５１（ｚ、　ＩＨ，３|Ｈ）、５．０７− ５．２２ （乳２Ｈ，ＣＨｔ＝Ｃ）、　５．６２−５．８３　（ｆｆｌ、　ＩＨ，ＣＨ＝Ｃ ）。収量：１１２■、７０％。
Ｆ、アリル２−アセトアミド−３−〇−アリルオキシカルボニルー２−デオキシ −β−Ｄ−グルコピラノシド、化合物１１化合物１１の合成を上記実施例５Ｅと 同様のスキームにより行った。
４００■の化合物１８と４８０■のアリルクロロホーメートで出発して、アリル ２−アセトアミド−３−〇−アリルオキシカルボニルー２−デオキシ−４，６− 〇−Ｐ−メトキシベンジリデンーβ−Ｄ−グルコピラノシド、化合物１９ｂを得 た。
収量：３４７■、７１％。
’ＨＮＭＲ（ｄ−５ピリジン）δ２．１６（ｓ、　３Ｈ，ＮＨＡｃ）、　３．６ ５（ｓ、　３Ｈ，ＯＣＨ３）、　３．６５−３．７５（ａ　h Ｈ，５−Ｈ）、　３．８４−３．９４（ａ　２）１．６Ｈｔ　）、　４．２０− ４．６５（ａ　６Ｈ，２−Ｈ，４−Ｈ，２ＣＨｔ−Ｃ＝Ｃ）A　４．９５−５． ４９（ｍ。
５Ｈ，２ＣＨｘ＜、　３−）１）、５．２２（ｄ、　Ｊ　・８　Ｈｚ、　ＩＨ， １−Ｈ）、　５．７２（ｓ、　ＩＨ，ベンジリデン）、　５D９５−６．１３ （ｍ、　２Ｈ，２ＣＨ＝Ｃ）、　７．００−７．７０（ａ　４Ｈ，Ｃ１（、Ａｒ ）、　９．２０（ｄ、　Ｊ　＝　８　Ｈｚ、　ＩＨ，ＮＨ）B 化合物１９ｂ（０，５ミリモル）を２ｍｌの氷酢酸で処理し、６０℃で５時間攪 拌した。酢酸を減圧下で除去し、粗生成物化合物１１をカラムクロマトグラフィ ー（シリカゲル、クロロホルム／ＭｅＯＨ／ヘキサン＝６＋ｌ：ｌ）で精製した 。
’ＨＮＭＲ（Ｄ、Ｏ）δ１．７６（ｓ、　３１（、ＮＨＡｃ）、　３．２８−３ ．３８（ａ　ＩＨ，５−Ｈ）、　３．４２−３．７６（ｍ、@４Ｈ，２−Ｈ。
４−Ｈ，６−Ｈｚ）、　３．９６（ｄｄ、Ｊ　＝　１３　）１ｚ、Ｊ　＝　６　 Ｈｚ、　ＩＨ，ＣＨｔ、−Ｃ＝Ｃ）、４．１４（ｄｄ、Ｊ　＝@１３　Ｈ２，Ｊ 　＝ ５Ｈｚ、　１８．　ＣＨｔ　ｂ−Ｃ＜）、　４．５０（ｄ、　Ｊ　：８　Ｈｚ、 　ＩＨ，１−１（）、　４．３５−４．７０（ｍ、２Ｈ，Ｃgｔ−Ｃ＝Ｃ，ａｌ 　１ｏｃ）。
５、０−５．１８（ｍ、　５Ｈ，２ＣＨ，＝Ｃ，３−Ｈ）、　５．６０−５．８ ４（ｍ、　２Ｈ，ＣＨ＝Ｃ）。収量：１０８ｍｇ、６６％。
Ｇ、アリル２−アセトアミド−２−デオキシ−３−０−メトキシメチル−β−Ｄ −グルコピラノシド、化合物１ｍ 化合物１ｍの合成を上記実施例５Ｅと同様のスキームにより行った。
１０ｍ１（ＤＴＨＦ中化合物化合物１８０ｍｇ、１，０５ミリモル）の溶液Ｇ： ５０ｍｇ＋７）ＮａＨ（油中６０％）を０℃で加えた。１時間攪拌した後、反応 混合液を１７０■のクロロメチルメチルエーテルで処理した。１６時間後に反応 が完了し、水で急冷した。アリル２−アセトアミド−２−デオキシ−３−０−メ トキシメチル−４，６−０−Ｐ−メトキシベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノ シド、化合物１９ｃの沈澱をろ別し、水及びエーテルで洗浄し、精製せずに用い た。収量：２８５■１．６４％。
’ＨＮＭＲ（ｄ−５ピリジン）６２．１６（ｓ、　３Ｈ，ＮＨＡｃ）、　３．４ ５（ｓ、　３Ｈ，０ＣＨｓ　）、　３．６５（ｓ、　３Ｈ，≠秩| Ｃ−ＯＣＨｉ　）、　３．６５（ｓ、　３）１．　ａｒ−Ｃ−ＯＣＨａ　）、　 ３．５５−３．　ＴＯ（ａ　ＩＨ，５−Ｈ）、　３．８０−R．９４（ａ　２Ｈ ，６Ｈｚ　）、　４．１８−４．５５（ａ　４Ｈ，２−Ｈ，４−Ｈ，ＣＨｔ−Ｃ ＝Ｃ）、　４．８０−５．４５（ｍ、　６１（、ＣＨｔ＝Ｃ，０ＣＨｔＯ，ｌ− Ｈ，３|Ｈ）、　５．６６（ｓ、　Ｉ Ｈ，ベンジリデン）、　５．９２−６．１０（ａ　１８．　ＣＨ＝Ｃ）、　６． ９０−７．６５（ａ　４Ｈ，ＣＨ，Ａｒ）、　９．２５　（пA　Ｊ　＝　８ Ｈｚ、ｌＨ，ＩＩＪＨ）。
化合物１９ｃ（０，５ミリモル）を２ｍｌの氷酢酸で処理し、６０℃で５時間攪 拌した。酢酸を減圧下で除去し、化合物１ｍの粗生成物をカラムクロマトグラフ ィー（シリカゲル、クロロホルム／ＭｅＯＨ／ヘキサン＝６：１：１）で精製し た。
’ＨＮＭＲ（Ｄ、０）δ１．８０（ｓ、　３Ｈ，ＮＨＡｃ）、　３．１４（ｓ、 　３Ｈ，０ＣＩ（ｓ　）、　３．２０−３．７０（ｍ、　４g，３−Ｈ，４−Ｈ 。
６−１ｔ）、　３．９２（ｄｄ、Ｊ　＝　１３　Ｈｚ、Ｊ　＝　６　）ＩＺ、　 ｌＨ，ｃＨ，、−Ｃ＝Ｃ）、４．１０（ｄｄ、　Ｊ　＝　１R　Ｈｚ、　Ｊ　＝ 　５　Ｈｚ。
ＩＨ，ＣＩ、、−Ｃ＝Ｃ）、　４．３５（ｄ、　Ｊ　＝　８　Ｈｚ、　ＩＨ，１ −Ｈ）、　４．５０（ｄ、　Ｊ　＝　７．５　Ｈｚ、　ＩＨCＯＣＲ，、Ｏ）、 　４．６０ （ｄ、　Ｊ　＝　７．５　Ｈｚ、　ＩＨ，０ＣＨｔｂ　Ｏ）、　４．９８−５． １４（ｍ、　２１（、ＣＨｔ＝Ｃ）、　５．５７−５．７４@（ａ　ＩＨ，ＣＨ ＝Ｃ）。
収量：１１０■、７２％。
Ｈ，２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−アロピラノース、化合物■０化合物 １０の合成を下記スキームにより行った。
アセトン（８０ｍｌ）中アリル２−アセトアミドー２−デオキシ−α−Ｄ−グル コピラノシド、化合物２３　（２，９５ｇ、１１．３ミリモル）　、２．２−ジ メトキシプロパン（２，３５ｇ、２２．６ミリモル；　２．７８ｍ１）及びｐ− ）ルエンスルホン酸ｌ水和物（１７２ｍｇ、０．９０　ミリモル）の溶液を室温 で２日間攪拌した。この間（こ、別置の２，２−ジメトキシプロパン（２，３５ ｇ、２２．６ミリモル；２．７８ｍ１）を混合液に加えた。ＥｈＮ　（１ｍｌ） を加えた後、混合液を減圧下で濃縮した。残留物をトルエン−Ｅ　ｔＯＡｃ（１ ：２１：３）を用いたシリカゲルでクロマトグラフィー処理してアリル２−アセ トアミド−２−デオキシ−４，６−０−イソブロピＩＪデンーａ−Ｄ−グルコピ ラノシド、化合物２４（２，２６ｇ、６６％）　；ｍｐｌ　０８．５−１０９． ０°Ｃ（ＥｔＯＡｃ−ヘキサンから）を得た。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１，）δ１．４４．１．５３（３Ｈ，ｓ、ＣＨｓ　）、　２ ．０４（３１（、ｓ、ＮＨＡｃ）、　４．８４（ＩＬ　ｄ、@Ｊ・３．７８ Ｈｚ、Ｈ（）；　”ＣＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）δ１９．０１．２３．２４．２９． ０１．５４．００．６２．１４．６３．４４゜６８．３４．７０．５６．７４． ６２．９６．９４．９９．８７．１１８．０５．１３３．２９．１７１．３７； 　Ｃ＋ＪｔｓＮＯａ　（Ｍh） に対するＨＲＭＳ　計算値：　４３４．０５８０．実測値：　４３４．０６００ ゜ＤＭＳ　Ｏ（ｌ　０ｗ１）中孔合物２４（１，０ｇ、３．３２ミリモル）及び ＡＣ！Ｏ（５ｍｌ）の混合液を室温で１０時間攪拌し、氷冷水性Ｎａ０Ａｃに注 ぎ入れた。この混合液を３時間攪拌し、ＣＨＣｌ５で抽出した。抽出液を水性Ｎ ａＨＣＯａ及び水で順次洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。ＣＨｔＣ １＊　（ｌ　０１ｎｌ）中残留物、Ｅ　ｔ　ＯＨ（１０ｍ１）及び水（２ｍｌ） の冷却溶液にＮａＢＨ，（３８０ｍｇ、１０．１ミリモル）を０−５℃で加え、 この混合液を０−５℃で２０分間攪拌した。この混合液にアセトン（５ｍｌ）及 び飽和ＮＨａ　Ｃ１（５ｍｌ）を加え、この混合液を１０分間攪拌した。この混 合液を濃縮し、残留物をＣＨＣｌ５及び水に溶解し、水層をＣＨＣｌ５で抽出し た。抽出液を水で洗浄し、無水Ｍｇ５Ｏａで乾燥し、濃縮した。残留物をトルエ ン−Ｅ　ｔ　ＯＡ　ｃ（１：３）を用いたシリカゲルでクロマトグラフィー処理 してアリル２−アセトアミド−２−デオキシ−４，６−０−イソプロピリデン− α−Ｄ−アロピラノシド、化合物２５（６’１２ｍｇ、６１％）；ｍｐｌ　１３ ．５−１１４．５℃（ＥｔＯＡｃ−ヘキサンから）を得た。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩりδ１．４５．１．５２（３Ｈ，ｓ、　ＣＨｓ）、　２． ０４（３Ｈ，ｓ、　ＮＨＡｃ）、　２．７８（ＩＨ，ｄ、　i　＝　６．７８ 、Ｈｚ、　ＯＨ）、　３．６８（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ　＝２．７７、９．７０　Ｈ ｚ、　Ｈ−６ａ）、　３．７３−３．８４（ＩＨ，ｍ）、　R．９０−４．０４ （４Ｈ，ａ Ｈ−３，４，６ｂ、アリル）、４．２４（ＩＨ，ｂｒ　ｄｔ、　Ｊ　＝３．５２ ．８．９７　Ｈｚ、　Ｈ−２）、　４．８６（ｌＨ，ｄ、Ｊ@：３．９７ ８ｘ、Ｈ−１）、５．２１−５．３４（２１（、ａ　アリルのビニル）、５．８ １−５．８７（ＩＨ，ｍ、アリルのビニル）。
６．３８（１）１．ｄ、Ｊ　＝９．１３　Ｈｚ、Ｎ）ｌ）；　”ＣＮＭＲ（ＣＤ ＣＩｓ）δ１９．０１．２３．１６．２８．９５．４９．４Q゜ ５８Ｊ６．６２．３３．６８．３８．６９．０６．７１．０６．９７．１５．９ ９．６２．１１８．３２．１３３．１７．１６９．６６；Ｃ＋５ＨｔｓＮＯＣｓ （Ｍ＋Ｃｓ”）　ニ対するＨＲＭＳ　計算値：　４３４．０５８０．実測値：　 ４３４．０５５１゜ＡｃＯＨ（ｌ　０ｍ１）及び水（０，５ｍ１）中孔合物２５ （４８９ｍｇ、１．６２ミリモル）、ｐｃｔｃ＋ｔ　（３１７■、１．７９ミリ モル）及びＮａ０Ａｃ（３２０ｍｇ、３．９０ミリモル）の混合液を８０℃で１ ０時間加熱した。冷却後、この混合液をセライトパッドでろ過し、ろ液を濃縮し た。残留物をＣＨＣｌ５　ＥｔＯＡｃ　ＭｅＯＨ（５：２：１）を用いたシリカ ゲルでクロマトグラフィー処理して主生成物を得、これをＡｃｔＯ（５ｍｌ）及 びピリジン（５ｍｌ）でアセチル化して、ＥｔＯＡｃ−ヘキサンで再結晶した後 、２−アセトアミド−１，３，４，６−テトラ−０−アセチル−２−デオキシ− β−Ｄ−アロピラノース、化合物２６（１４２ｍｇ、２３％）；ｍｐ１７０．５ −１７１．０℃を得た。
’Ｈ！ｌｉＭＲ（ＣＤＣＩｓ）δ１．９６．１．９８．２．０８．２．１３．２ ．１８（３Ｈ，ｓ、４ＸＯＡｃ、　ＮＨＡｃ）、４．０８−４、２７（３Ｈ，ｍ 、　Ｈ−５，６ａ、　６ｂ）、　４．４８（ＬＨ，ｄｔ、　Ｊ　＝　２．９８． ９．２０　Ｈｚ、　Ｈ−２）、　４．９W（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ　＝ ２．８１．９．８７　Ｈｚ、Ｈ−４）、　５．５７（ＩＨ，ｂｒ　ｔ、Ｊ＝　２ ．９３　Ｈｚ、Ｈ−３）、５．５６−５．６１（ＬＨ，ｂｒ@ｓ、ＮＨ）。
５．８９（ＩＨ，ｄ、Ｊ・８．７２　Ｈｚ、Ｈ−１）；　１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣ Ｉｓ）δ２０．４２．２０．７１．２０．９３．２３．０１K ４９．３９．６１．９４．６６．１８．６９．６２．７０．９６．９１．３５． １６９．０４．１６９．５１．１６９．７１．１６９．９８K １７０．６８；　Ｃ＋５ＨｔｓＮＯＣｓ（Ｍ＋Ｃｓ＋）に対するＨＲＭＳ　計算 値＝５２２．０３７６、実測値：５２２、０３７６゜ ＭｅＯＨ（ｌ　０ｍ１）中孔合物２６　（７７ｍｇ、０．２０ミリモル）及びメ タノール性ＮａＯＭｅ　（１ｍｌ；Ｍ溶液）の混合液を室温で３時間攪拌し、ダ ウエックス５０Ｗ−ｘａ［Ｈ″″］″］樹脂した。樹脂をろ過で除去し、ろ液を 濃縮した。残留物をＭｅＯＨ及びＥｔｔＯで摩砕して化合物１ｏ（４０■、９０ ％）を起毛状固形物として得た（α／β＝１：２．８）。
’Ｉ　Ｎ１１ｌＲ（Ｃ２０）６２．００（ｓ、β−異性体のＮＨＡｃ）、２．０ ２（ｓ、　ａ−異性体の？Ｊｔ（Ａｃ）、　４．９１（ｄ、Ｊ　＝　８．７２　 Ｈｚ、β−異性体のＨ−１）、　５．０９（ｄ、　Ｊ　＝　３．５０　Ｈｚ、　 ａ＝異性体のＨ−１）；・　”ＣＮＭＲ（Ｃ２０）δ（β−異性体＞　５４．７ ．６１．６．６６．９．７０．２．７４．２．９２．８．１７１．５゜ＣａＨ＋ ５ＮＯｓＣ５（Ｍ＋Ｃｓ”　）に対するＨＲｌｉｌＳ　計算値：　３５３．９９ ５４．実測値：　３５３．９９７５゜■、メチル２−アセトアミドー２−デオキ シ−Ｄ−グルコピラン−３−ウロシド化合物１ｑの合成を下記スキームにより行 った。
；フ　１１４ ＤＭＳＯ（１ｈｌ）中孔合物２４（６９０ｍｇ、２．３ミリモル）とＡｃ、０（ ５ｏ１）の混合液を室温で１０時間攪拌し、氷冷水性Ｎａ０Ａｃに注ぎ入れた。
この混合液を室温で３時間攪拌し、ＣＨＣｌ！で抽出した。抽出液を水性ＮａＨ ＣＯｓ及び水で順次洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥し、濃縮した。残留物をトル エン−ＥｔＯＡｃ（１：　４）を用いたシリカゲルでクロマトグラフィー処理し て生成物を得、これをＥｔＯＡｃ−ヘキサンで結晶化してアリル２−アセトアミ ド−２−デオキシ−４，６−０−イソプロピリデン−α−Ｄ−グルコピランー３ −ウロシド、化合物２７（３４３ｍｇ、５０％）　；ｍｐｌ　５６．０−１５６ ．５℃を得た。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１，）δ１．５１．１．５３（３Ｈ，ｓ、　ＣＨｓ　）、　 ２．０７（３Ｈ，ｓ、　ＮＨＡｃ）、　３．９２−４．０３i４Ｈ，Ｈ−５゜ ６ａ、　６ｂ、アリル）、４．１１−４．２０（ＩＨ，ｍ、アリル）、　４．３ ９−４．５１（１）１．　ａ　Ｈ−４）、　４．９５（１）P．　ｄｄｄ、　Ｊ ＝　１．０５．４．２５．７．９８　Ｈｚ、Ｈ−２）、５．１８−５．３４（２ Ｈ，＆アリルのビニル）、　５．３２（ＩＨ，ｄ、　Ｊ　＝４、２５　Ｈｚ、　 Ｈ−１）、　５．７３−５．９１（１０，ａアリルのビニル）、６．３４（ＩＨ ，ｄ、Ｊ　＝　７．９８　Ｈｚ、　ＦＪg）　； ”ＣＮＭＲ（ＣＤＣＩＩ）δ１８．７２．２２．９８．２ｇ、７７、５８．７２ ．６２．６５．６６．９４．６８．８０．７６．１５゜１００．１５．１００． ４６．１１８．３２．１３２．７３．１７０．０４．１９６．３０；　Ｃ，Ｈｔ ＋Ｎ０ｓＣｓ　（Ｍ＋Ｃｓ”　）に対する■瀾Ｓ　計算値：　４３２．０４２３ ．実測値：　４３２．０４３８゜酢酸（ｌｏｍｌ）及び水（０，５ｍ１）中孔合 物２７（１７０ｍｇ、０．５７　ミＩＪ　モル）、ＰｄＣ１ｙ　（１２１ｍｇ、 ０．６８ミリモル）　、Ｎａ０Ａｃ　（１１２＠、１．３６ミリモル）の混合液 を８０℃で１０時間加熱した。冷却後、この混合液をセライトパッドでろ過し、 ろ液を濃縮した。残留物をＣＨＣｌ５　Ｅ　ｔ　ＯＡ　ｃ　Ｍｅ　０Ｈ（５：２ ：１）を用いたシリカゲルでクロマトグラフィー処理し、カラムクロマトグラフ ィーでメチルグリコシドが生成されて生成物を得、これを水に溶解し、凍結乾燥 して化合物１ｑ（５５■、４４％）を得た。
’ＨＮＭＲ（Ｄ、０）δ２．０４２（３Ｈ，ｓ、　Ｎ）ｔＡｃ）、　３．３６（ ３Ｈ，ｓ、　ＯＭｅ　）、　３．７６−３．９４（３Ｈ，ｍA　Ｈ−５，６ａ、 　６ ｂ）、４．４３（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　０．９５．９．５８　）ＩＺ、Ｈ−４） 、　４．９０（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　０．９８．４．１２　g２，Ｈ−２）。
５、１６（ＩＨ，ｄ、Ｊ　・４．０８　Ｈｚ、Ｈ−１）；　”ＣＮＭＲ（ＤｔＯ ）δ２２．００．５５．６８．５９．５３．６１．００゜７２．４９．７５．０ ８．１００．８５．１７４．８３．２０４．６５；　ＣＪ＋ｉＮＯｇＣｓ（Ｍ＋ ｃｓ　”　）に対するＨＲＭＳ計算値＋　３６５．９９５４．実測値：　３６５ ．９９６０゜Ｊ、メチル２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−アロピラノ シド、化合物ＣＴｏＣｌｔ　（１０１１１１）及び水（０，５ｉ＋１）中メチル ２−アジドー４．６−０−ベンジリデン−２−デオキシ−α−Ｄ−アロピラノシ ド（２００ｍｇ、０．６５ミリモル）及びＰＰｈ３　（２０８■、０．７９ミリ モル）の溶液を室温で４時間攪拌し、この混合液を減圧下で濃縮した。ＭｅＯＨ （１０ｍ１）中残留物の溶液に活性無水物（２ｍｌ）を０−５℃で加え、この混 合液を０−５℃で２時間攪拌した。この混合液を濃縮した後、残留物をトルエン −ＥｔＯＡｃ（１：２）を用いたシリカゲルでクロマトグラフィー処理して化合 物２１の４．６−０−ベンジリデン誘導体（１１０■、７２％）を得、これを８ ０％ＡｃＯＨ（ｌ　ｈｌ）で８０℃において３時間処理した。この混合液を濃縮 した後、ＥｔｔＯ及び水に溶解した。水層をＥｔｔＯで洗浄し、水層を濃縮した 。残留物をＭｅＯＨ及びＥｔｔＯで摩砕してＩ　Ｓ（５０■、４５％）を得た； 　［ａ］　Ｄ　＋７７．９°（ｃ　Ｏ，６８、Ｈｚ０）。
’ＨＮＭＲ（ＤｔＯ）δ２．００（３８，ｓ、　ＮＨＡｃ）、　３．３３（３Ｈ ，ｓ、　（＆）、　３．６２（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ　＝　２．U４．９．３９ Ｈｚ、Ｈ−４）、　３．６９−３．８９（３Ｈ，ａＨ−５，６ａ、６ｂ）、　３ ．９６−４．０２（２Ｈ，ｍ、Ｈ−２，３）、　４．７１（kＨ，ｄ、Ｊ　＝ ３．７６Ｈｚ、Ｈ（；　”ＣＮＭＲ（ＤＩＯ）　δ２２．２２．５０．２９．５ ５．８４．６１．１９．６６．４４．６７．３３゜６９．６３．９８．２０．１ ７４．１９゜・　Ｋ、（２Ｒ）−メチル−（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−トリヒドロキ シピペリジン；　（１，５゜６−ドリデオキシー１．５−イミノ−Ｄ−グルシト ール）、化合物１０３ｃｌＯミリリツトル（ｍｌ）の塩化水素（ＨＣＩ；ｐＨ１ ）バッファー溶液中（Ｒ）−３−アジド−２−ヒドロキシプロパナールジエチル アセクール（化合物Ｉ；４８０ミリグラム（■）　、２．５４ミリモル（Ｉｍｏ ｌ））の溶液を７０℃で４時間攪拌した。ガスクロマトグラフィー分析［Ｊ＆Ｗ サイエンティフィックＤＢ−５カラム（１５ｍ　ｘＱ、　５２２ｎｎ）、１分間 ４０℃で２５０℃まで、２０℃／分］は、アセクールの完全な加水分解を示した （出発物質の保持時間６．３３分、対応するアルデヒド２．６５分）。この溶液 をｐＨ７に調整し、次いで、ＤＨＡＰ　（２ミリモル）を加え、この溶液をｐＨ ７に再調整した。次いで、ウサギ筋ＦＤＰアルドラーゼ（４００単位）を加え、 この溶液を３６時間ゆっくりと攪拌した。酵素アッセイは残存するＤＨＡＰを示 さなかった。
この溶液に塩化バリウム（ＢａＣ１ｔ−２８１０）［１，２２グラム（ｇ）、４ ．８０ミリモル〕及び２当量のアセトンを加えた。この溶液を一２０℃で約１８ 時間維持した。沈澱を回収し、２０＋ｎｌの水中ダウエックスＸ　５０　（Ｈ” 　）で処理してバリウムカチオンを除去した。ろ過後、溶液をｐＨ７に調整し、 次いで、凍結乾燥しテ化合物１０１　ｃ　（５５０ｍｇ、１．７９　ミＩＪモ／ ｌ／、ＤＨＡＰｉ、、対して９０％）を吸湿性白色固形物として得た：Ｒ１＝０ ．４６［２−プロパツール：水酸化゛アンモニウム（ＮＨ，ＯＨ：Ｈｌｏ　＝　 ６：３：２］。
’ＨＮＭＲ（ＤｔＯ）６３．３６（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　１３．２５．５．８８ 　Ｈｘ）、３．４８（ＬＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　１３．２５゜３、２８Ｈｚ　）、　 ３．６８−３．８９（ＩＨ，ｍ）、　４．０３−４．０７（ＩＨ，ｍ）、　４． ２５−４．３３（ＩＨ，ｍ）ｐｐｍ；@’　”ＣＮＭＲ（ＤｔＯ） δ５０．６５．６６．３５．７４．８２．７６．３２．７９．９６．１０１．２ ５（ｄ、Ｊ　＝　８．５　Ｈｚ）　ｐｐａ＋、　ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈａ計算値　３ ０７．１３１９、実測値　３０７．１３２１゜１０＋＋＋１の水中化合物１０１ Ｃ（５５０［，１，７９ミリモル）ノ溶液を１平方インチ当たり４５ポンド（ｐ ｓｉ）の水素（Ｈｌ）下５ｏ■の１０％パラジウム／炭素（Ｐｄ／Ｃ）を用いて １８時間水素化した。ろ過で触媒を除去し、ろ液を濃縮し、短いシリカゲルカラ ム［クロロホルム（ＣＨＣｌ３）：メタノール（ＭｅＯＨ）：Ｈ，０・５：５： ２］でクロマトグラフィー処理して標記化合物、化合物１０３ｃ（２５０■、９ ５％）を起毛状白色固形物として得た：Ｒ１・０．６０（２−プロ、パノール： 　ＮＨ４ＯＨ：Ｈｔｏ　・６：３：２）　；　［α］　ｏ”　＋１２．０’　（ ｃ　２．５、ＨｔＯ）　；’ＨＮＭＲ（Ｄ、０）δ１．１０（３Ｈ，ｄ、Ｊ　＝ 　６．４　Ｈｘ、ＣＨｓ）、　１．２７（３Ｈ，ｄ、Ｊ　＝　６．８　Ｈｚ、　 ５−エsマー −Ｃ１，）、２．４８（ＩＨ，ｔ、Ｊｌ−、＋　−”　Ｊｌ−、ｔ　”　１２　 Ｈｚ、Ｈ−１ａ）、２．６３（ＩＨ，ｄｄ、Ｊｓ、　ｓ”　U．４．　Ｊｓ、　 ４” ３、６　Ｈｚ、　Ｈ−５）、　３．０３（ＩＨ，ｔ、　Ｊｓ、　ａ　□　δ４． 　ｓ□　９Ｈｚ、　Ｈ−４）、　３．４７−３．５２（ＩＨCａ　Ｈ−２）Ｉ） ｐａ＋；　”　Ｃ ＮＭＲ（ＤＩＯ）δ１６．８２．４８．２２．５５．７６、６９．９８．７５． ３７．７７．８３ｐｐｍ、、　）ｔＲＭｓ（Ｍ＋Ｈ”　）計算値　１４ｇ、　１ ００１．実測値　１４８．０９７９゜Ｌ、（２Ｒ）−メチル−（３Ｒ，４Ｒ，５ Ｒ）−トリヒドロキシピペリジン；　（１，５゜６−ドリデオキシー１，５−イ ミノ−Ｄ−マンニトール）、化合物１０１０３ａ１０のＩ）Ｈｌバッフ７−溶液 中（Ｓ）−又は（ＲＳ）−３−アジドー２−ヒドロキシプロパナールジエチルア セクール（４８０■、２．５４ミリモル）の溶液を７０℃で４時間攪拌した。ガ スクロマトグラフィー分析［Ｊ＆ＷサイエンティフィックＤＢ−５カラム（１５ ｍ　ｘＯ，５２２ｎｎ）、１分間４０℃で２５０℃まで、２０℃／分］は、アセ クールの完全な加水分解を示した（出発物質の保持時間６．３３分、対応するア ルデヒド２．６５分）。この溶液をｐＨ７に調整し、次いで、ＤＨＡＰ　（２ミ リモル）を加え、この溶液をｐＨ７に再調整した。次いで、ウサギ筋ＦＤＰアル ドラーゼ（４００単位）を加え、この溶液を３６時間ゆっくりと攪拌した。酵素 アッセイは残存するＤＨＡＰを示さなかった。
この溶液に塩化バリウム（ＢａＣ１ｔ　＊　２）１ｔＯ）　（１，２２ｇ、　４ ．８０ミリモル）及び２当量のアセトンを加えた。この溶液を一２０℃で約１８ 時間維持した。沈澱を回収し、２０ｍ１水中ダウエツクスＸ　５０　（Ｈ”　） で処理してバリウムカチオンを除去した。ろ過後、溶液をｐＨ７に調整し、次い で、凍結乾燥してリン酸化アジドケトースを得た。
１０ｍ１の水中このアジドα−ケトースリン酸塩の溶液を４５ｐｓ　ｉの水素下 ５０■の１０％Ｐｄ／Ｃを用いて１８時間水素化した。ろ過で触媒を除去し、ろ 液を濃縮し、短いシリカゲルカラム（ＣＨＣＩｓ：ＭｅＯＨ：ＨｔＯ”５：５： ２］でクロマトグラフィー処理して標記化合物、化合物１０３ａを得た：Ｒ，＝ ０．１２（ＣＨＣＩｓ：ＭｅＯＨ：ＨｔＯ”５：５：１．５）；　［Ｊｌ　Ｄ” 　４’　（ｃｍ２．５、Ｈ２Ｏ）。
’ＨＮＩ＋ｌＲ（ＤｔＯ）δ１．２１３（３８，ｄ、　Ｊ　＝　６．５　Ｈｚ、 ＣＨｓ）、　２．８９３（１８，ｄｄ、　δ４．　＊”　９D５Ｈｚ、　Ｊｓ、 　ｓ ”　６．５　Ｈｚ、Ｈ−５）、３．００（１Ｂ、ｄ、Ｊｌａ、　ｌ＊　”　１３ ．５　Ｈｚ、Ｈ−１ａ）、３．１６（ＩＨ，ｄｄ、Ｊｌ−、秩|”　１３．５ ・Ｈｚ、Ｊｌ−、ｔ　”　３　Ｈｚ、Ｈ−１ｅ）、３．４５（ＩＨ，ｔ、Ｊｌｓ 、　ｔ　”　Ｊｔ、　ｓ”　３　Ｈｚ、）Ｉ−２）、３．４U（ＩＨ，ｔ、、ｙ 　”　９．５ Ｈｚ、Ｈ−４）、３．６７５（ＩＨ，ｄｄ、Ｊｓ、　ａ　＝　９．５　Ｈｚ、　 Ｊｔ、　ｓ＝　３　Ｈｚ、Ｈ−３）　Ｉｌｌ）ｍ；　”ＣＮlＲ（ＤｚＯ）δ １５．２４（ＣＨｓ）、　４８．３１（Ｃ−１）、　５６．１７（Ｃ−５）、　 ６６．７４．７０．８８．７２．９２ｐｐｍ、　ＨＲＭＳ（l＋Ｈ”　） 計算値　１４８．０９７４、実測値　１４８．０９００゜Ｍ、（２Ｒ）−メチル −（３Ｒ，４Ｒ）−（ＳＲ）−Ｎ−アセチルピペリジン；（ｌ。
５、６−　トリデオキシ−１，５−イミノ−Ｎ−アセチルグルコサミン：化合物 １０３ｂ及び（２Ｒ）−メチル−（３Ｒ，４Ｒ）−ジヒドロキシ−（５Ｓ）−Ｎ −アセチルピペリジン；（１，５，６−ドリデオキシー１．５−イミノ−Ｎ−ア セチルグルコサミン；化合物１０１０ ３ｄ１００のジクロロメタン（ＣＨｔＣＩｔ）、５．２７ｇ（３６，３ミリモノ りの（Ｒ）−２−（ジェトキシメチル）アジリジン（化合物１１．９５％ｅｅ） 及び４０．０ｇ（２８９，４ミリモル）の炭酸カリウム（Ｋ＊Ｃ０５）の混合液 に４．０ｍｌ　（４２，４ミリモル）の酢酸無水物を加えた。この混合液を室温 で１０時間攪拌し、ろ過し、ろ液を減圧下で除去した。残留物をシリカゲルカラ ムクロマトグラフィーで精製して４．２７　ｇの化合物１１１ａ　：収率６３％ を得た；［α］♂”＋８４．２３°（Ｃ１，５、ＣＨＣｌ５）。
ＩＨＮＭＲ（ＣＤＣ１，）δ１．２２．１．２５　（各々３Ｈ，ｔ、　Ｊ　＝７ ．　ＯＨｚ、　ＣＨｔＣＨｓ）、　２．１７（３）１．　ＳB ＣＨｓＣＯ）、　２．２８（ＩＬ　ｄ、　Ｊ　＝　３．３　Ｈｚ、アジリジンの ＣＨｔ）、　２．３５（ＩＨ，ｄ、Ｊ　＝６　Ｈｚ、アジリジンのＣＨｚ）、　 ２．６８（ＩＨ，ａアジリジンのＣＨ）、　３．５１−３．７８（４Ｈ，ｍ、０ ＣＨｔ）、　４．４０（ＩＨ，ｄ。
Ｊ　”　４．５　Ｈｚ、　ＣＨ（ＯＢｔ）＊）　ｐｌｍ　；　”ＣＮＭＲ（ＣＤ ＣＩｓ）６１５．６（２Ｃ）、　２３．８．２７．７．３８D３゜ ６３．２．６３．３．１０１．６．１８３．２　ｐｐｍ＋ｏ　ＨＲＭＳ　（Ｍ＋ Ｈ”　）計算値　１８８．１２８６、実測値１８８、１２９０゜ 化合物ｌ１１ｂ、ｌ１ｌｃ及びｌ１ｌｄを適切な保護基を用いて同様に調製した 。
１８ｉ＋１のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中４２３．０■（２，２６ミリモ ル）の化合物１１１ａ及び１．９ｇ（２９，５ミリモル）のアジドナトリウムを 含む混合液に１８、ｈｌの塩化亜鉛［エーテル中１．０Ｍ溶液］を加え、この反 応混合液を７５℃で３日間攪拌した。この混合液を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で 抽出し、有機層を水洗し、硫酸マグネシウム（Ｍ　ｇ　Ｓ　０４　）で乾燥し、 濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝３ ：２）で精製して３１８．６■の化合物ＩＶａ　［収率６１％、［α］　ｏ”　 ２３．８°（ｃ　Ｏ，１５、ＣＨＣｌ５）］を得た。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１，）δ１．２３（６Ｈ，ｔ、　Ｊ　”　？、　ＩＨｚ、　 ＣＨｔＣＨｓ　）、　２．０３（３Ｈ，Ｓ、　ＣＨｓＣＯ）A　３．４５−３． ６１ 及び３．６１ｒ３．７６（６１（、Ｉｎ）、　４．２４（ＩＨ，ＩＩ、　−ＣＩ ＦＪＨ）、　４．５３（ＩＨ，ｄ、　Ｊ　・３．９　Ｈｚ、@−ＣＩ（（ＯＢｔ ）ｓ　）、　５．８３（ＩＨ，ｄ、Ｊ　＝　７．８　Ｈｚ、−ＮＨ）　ｐｐｍ； 　”ＣＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）δ１５．５．１５．６．２３．７．５０．８．５１ ．O゜ ６３．７．６４．４．１０１．３．１７０．５　ｐｐｍｏ　ＨＲＭＳ　（Ｍ＋Ｃ ｓ”　）計算値　３６３．０４３３、実測値３６３、０４５０゜ ラセミ化合物ＩＶａ（ｌ　ｇ）から遊離したアルデヒドを１８ｍ１のＤＨＡＰ（ ７１，３ミリモル）と混合し、ｐＨを１規定（Ｎ）水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ ）で６．５に調整した。この溶液に、ウサギ筋ＦＤＰアルドラーゼ（４００単位 ）を加え、この混合液を４．５時間ゆっくりと攪拌した。この混合液をダウエッ クス１（ＨＣＯｔ−）に通過させ、水（４００ｍ１）、０．１モル（Ｍ）塩化ナ トリウム（ＮａＣ１；　２５０ｍ１）、０、４Ｍ　Ｎａ　Ｃ１（７００ｍ１）及 び０．５ＭＮａＣ１溶液で順次溶離した。
０、４Ｍ　Ｎａ　Ｃ１（７００ｍ１）で溶離した化合物１０１ｂを含む画分に２ ００ｍ１の水を加えた後、Ｐｄ／Ｃ（１０３，０■）を加え、この混合液を５０ ｐｓｉの圧力下で１日間水素化した。触媒をろ別し、ろ液を凍結乾燥した。残留 物を混合溶媒［クロロホルム（ＣＨＣＩｓ）：メタノール（ＭｅＯＨ）：ＨｔＯ ”６：４：１Ｆで処理した。可溶分を集め、シリカゲルクロマトグラフィー（Ｃ ＨＣＩｓ：ＭｅＯＨ：Ｒ３０・６：４：０．７）で精製して化合物１０３ｂ及び １０３ｄを１２：１比で得た。
鏡像体的に純粋なアルデヒド基質で出発して、化合物１０３ｂ及び１０３ｄを別 々に得た。
化合物１０３　ｄ　：　’ＨＮＭＲ（Ｄ、０）６１．３３（３Ｈ，ｄ、Ｊ　＝　 ６．３　Ｈｚ、Ｈ−６）、　１．９４（３Ｈ，ｓ。
ＣＨ，ＣＯ）、２．８５（ＩＨ，ｔ、Ｊ　＝　１２．５　Ｈｚ、Ｈ−１ａ）、３ ．１０（ＩＨ，ｍ、Ｈ−５）、３．３６（１８，ｄｄ、Ｊ　＝@１２．５及 び４．９　）１ｘ、Ｈ−１ｅ）、３Ｊ９．３．５１（各々ＩＨ，ｔ、Ｊ　＝　９ ．８　Ｈｚ、Ｈ−３，４）、３．９９（ＬＨ，ｄｄｄ、Ｊ　＝@１２．５゜ ９．８及び４．９Ｈｚ、Ｈ−２）　ｐｐＨ；　”Ｃ！Ｇ！Ｒ（ＤｔＯ）δ１４． ８．２２．３．４４．０．４８．２．５４．９．７２．９．７３．１．１７４． ２　ｐｐｎｏ　ＨＲＭＳ　（Ｍ＋Ｎａ”　）計算値　２１１．１０５９、実測値 　２１１．１０５３゜化合物１０３　ｂ　：　’ＨＮＭＲ（ＤｔＯ）δ１．３４ （３Ｈ，ｄ、Ｊ　＝　６．６　Ｈｚ、Ｈ−６）、　１．９７（３Ｈ，ｓ。
ＣＨｓＣＯ）、３．１０（ｌＨ，＆Ｈ−５）、　３．１５．３．４３（各々ＩＨ ，ｄｄ、Ｊ　＝　１３．７及び３．０　Ｈｚ、　Ｈ−１）、@３．６２ （ＩＨ，ｔ、Ｊ　＝　９．４　Ｈｚ、Ｈ−４）、　３．８０（ＬＨ，ｄｄ、Ｊ　 ＝　９．４及び４．６　Ｈｚ、　Ｈ−３）、　４．３２（Ｉg，ｄｔ、　Ｊ　＝ ・４．６及び３．０　Ｈｚ、Ｈ”２）　ｐｐｍ；　”ＣＮＭＲ（ＤｔＯ）δ１４ ．５．２２．４．４４．４．４７．６．５５．０゜６９．９．７０．０．１？４ ．７ｐｐｍｏ　ＨＲｌｉｌＳ　（Ｍ＋Ｎａ”　）計算値　２１１．１０５９、実 測値　２１１．１０５０゜Ｎ、（１，２Ｒ）−ジメチル−（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ） −トリヒドロキシピペリジン＝（Ｎ−メチル−１，５，６−ドリデオキシー１， ５−イミノ−Ｄ−グルシトール）、化合物１１７ 化合物１０３ｃ（４７■、０．３２ミリモル）、ホルムアルデヒド（３００ｍｌ 、３７重量％溶液）及び１０ｍｇのｌＯ％Ｐｄ／Ｃを４５ｐｓ　ｉの水素下１０ ｍ１のＭｅＯＨ／ＨｙＯ（１：ｌ）溶液中で１日間水素化した。ろ過後、溶媒を 減圧下で除去して化合物１１７（５２■、量的収量）を吸湿性物質として得た： Ｒ１・０．６５（２−プロパツール：　Ｎ）１４０Ｈ：ＨｚＯ＝　６：３：２） 　；　［α］Ｄ”　＋４．５８°（Ｃ１，７５、Ｈｌｏ）。
’ＨＮＭＲ（Ｄ、０）δ１．１２（３Ｈ，ｄ、Ｊ　＝　６．５Ｈｚ）、２．３６ （ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　１１．５．６．５　Ｈｚ）、　２．U３ （１８，ｄ、Ｊ　＝　５　Ｈｚ）、　３．０２−３．０６（２８，ｍ）、　３． １８（ＩＨ，ｔ、Ｊ　＝　９．５　）１ｚ）、　３．４８−R．５３（ＩＨ，ｍ ） ｐｐｍ；　”ＣＮＭＲ（ＤｔＯ）δ１６．９６．４３．８７．６１．１７．６５ ．９６．７０．６８．７６．６４．７９．９５　ｐｐｍ。
）［Ｒ１１ｔｓ　（Ｍ＋Ｈ”　）計算値　１６１．１０５２、実測値　１６２． １１２９゜０、（１，２Ｒ）−ジメチル−（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）　−）リヒドロ キシピベリジンオキシド；　（Ｎ−１，５，６−）リゾオキシ−ｉ、ｓ−イミノ −Ｄ−グルシトールオキ化合物１１７（１０■、０．０６２　ミリモノりを含む １ｍｌのＨ１Ｏ溶液に過酸化水素（４２■、５０重量％溶液）を加え、この混合 液を室温で３日間攪拌した。溶媒を減圧下で除去して純粋な化合物１１８（１０ ■、９１％）を吸湿性白色化合物の単一立体異性体として得た：Ｒ１・０．５３ （２−プロパツール：ＮＨ，ＯＨ：ＨｔＯ＝　６：３：２）　；　［（Ｅｌ　ｏ ”！　＋５．４０°（ｃ　３．　ＯＯ１■、０）。
’ＨＮＭＲ（Ｄ、Ｑ）δ１．１２（３Ｈ，ｄ、　Ｊ　”　６．５　Ｈｚ、　ＣＨ ｓ）、　３．１４（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊｓ、　ｓ　”　１０．@’５．ＣＨｓ ＝　６．５　Ｈｚ、Ｈ−５）　、３．２０（ＩＨ，ｔ、Ｊｔ、　ｓ”　Ｊｓ、　 ４　”　１０　Ｈｚ、Ｈ−３）、　３．２８（ＩＨ，ｔＪ＋|、Ｉｓ　”　Ｊｌ −。
ｔ　＝　ＩＱ　Ｈｚ、Ｈ−１ａ）、３．３９（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊｔｓ、　１ｍ　 ＝　１０．　Ｊｌ＠、　ｔ　＝　５　Ｈｚ、Ｈ−１ｅ）、３D４１（ＩＨ，ｔ、 Ｊｓ、　。
＝　Ｊａ、　ｓ　＝１０　Ｈｚ、Ｈ−４）、３．８８（ＬＨ，ｔｄ、Ｊ　＝　、 Ｌ−、ｔ　＝　Ｊｔｓ　・１０．Ｊｔ、　Ｉｓ　”　５　Ｈ噤AＨ−２）ｐｐｍ ； １”ｃ　ＮＭＲ（０，０）δ８．６５．５５．８９．６７．８５．６４．５２． ７０．２１．７０．６０．７５．４４　ｐｐ＆ＨＲＭＳ　（Ｍ＋Ｈ”　）計算値 　１７７、２００９、実測値　１７？、　２０１４゜・　Ｐ、（２Ｓ）−メチル −（３Ｓ、　４Ｓ、　５　Ｓ）　−）リヒドロキシピペリジン；［１，６−Ｌ− ラムナノシリマイシン（ラムノジリマイシン）］、化合物１０６ｐＨ１，０バッ ファー（４０ｍｌ）中３−アジドー２−ヒドロキシプロパナールジエチルアセク ール（１，１ｇ、５．８ミリモル）の懸濁液を４５℃で１２時間加熱することに より調製した（Ｒ８）又は（Ｒ）−３−アジド−２−ヒドロキシプロパナールの 水溶液にＤＨＡＰ　（１，９ミリモル）とトリスバッファー（６７５ａＭ、ＫＣ ｔ　？　５　Ｇ＋ｏＭ、　ｐＨ＝７．５　；５．０ｍ１）を加え、得られた溶液 のｐＨ値をｌＮＮａＯＨで７．５に調整した。ラムノロース−ｌ−ホスフェート アルドラーゼ源を調製するために、大腸菌に４０株をリゾチーム（卵白由来；１ ０ｍｇ）でトリスバッフｙ−（４５ｍＭ、塩化カリウム（ＫＣＩ）５０ｍ、ｐＨ ＝７．５　；　２０ｍ１）中３５℃で１時間処理した。この大腸菌標品１ｇを上 記ｐＨ調整溶液に加え、混合液をＤＨＡＰの９０％が消費されるまでゆっくりと 攪拌した。
反応後、この溶液をｐＨ７，０に調製し、ＢａＣＩｔ・２ＨｔＯ（９５０ｍｇ、 ３．９ミリモル）を加え、得られた沈澱を遠心分離で除去した。アセトン（２倍 量）を上清に加えた。この混合液を冷蔵庫で２時間保持し、新しく生じた沈澱を 集めた。
バリウムイオンを除（ために、ダウエックス５０（Ｈ”　）を攪拌しながら加え 、次いでろ過した。この溶液を凍結乾燥し、残留物をシリカゲルクロマトグラフ ィー（ＣＨＣＩｓ　：　Ｍｅ　ＯＨ：　ＨｔＯ□　８：２：Ｏ，ｌ）で精製して リン酸化アジドケトース、化合物１０４を得た。
Ｐｄ／Ｃ（２０［）を含むエタノール（３０ｍｌ）中化合物１０４を５０ｐｓｉ で１日間水素化した。触媒をろ別し、ろ液を濃縮した。残留物をシリカゲルクロ マトグラフィー　（ＣＨＣＩｓ　：　Ｍｅ　ＯＨ：　ＨｔＯ＝　６：４：ｌ〜５ ：５：２）で精製して化合物１０６を得た。
化合物１０４ａ　（脱リン酸化）：収率５５％（ＤＨＡＰに対して）、”ＣＮＭ Ｒ（ＣＤ、ＯＤ）δ５４．６．６４．２．７６．８．７７．６．８１．１．１０ ３．３　ｐｐｍ。
化合物ｌｏ　ｅ　：　’ＨＮＭＲ（ＤｔＯ）δ１．００（３Ｈ，ｄ、　Ｊ　：６ ．５．５−ＣＨｓ）、　２．３０（ＬＨ，ａ　Ｈ−５）。
２、５６（ＩＨ，ｄ、　Ｊ　＝１４．４．　）ｌ−１ａ）、　２．７８（ＩＨ， ｄｄ、　Ｊ　＝　１４．４．２．３．Ｈ−１ｅ）、　３．４P（ＩＨ，ｔ、Ｊ　 □　９．９゜ Ｈ−４）、３．３５（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　９．９．２．９．Ｈ−３）、３．８ ２９１Ｈ，ｂｓ、Ｈ−２）　Ｉ）ｐＩＩＩ；　”ＣＩＧＩＲiＤｔＯ）δ １７．４．４８．６．５５．６．６９．８．７４．３．７４．５　ｐｐｍ、　Ｈ ＲＭＳ　（Ｍ＋Ｃｓ”　）計算値　２７９．９９５０１、　実測値　２７９．９ ９５０゜ Ｑ、（２Ｒ）−メチル−（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−トリヒドロキシピペリジン；　 （Ｄ−１，６−Ｄ−ジデオキシガラクトシリマイシン）及び（２Ｓ）−メチル− （３Ｓ、４Ｒ，５Ｓ）−トリヒドロキシピペリジン；（Ｌ−１，６−シデオキシ アルトロジリマイシン）、化合物１１０及び１０９ｐＨ１，０バツフアー（４０ ０１１）中３−アジドー２−ヒドロキシブロノぐナールジエチルアセクール（１ ，１ｇ、５．８ミリモル）の懸濁液を４５℃で１２時間加熱することにより調製 した（Ｒ８）−又は（Ｒ）−３−アジド−２−ヒドロキシプロパナールの水溶液 にＤＨＡＰ　（１，９ミリモル）とトリスバッファー（６７５ｎＭ、ＫＣＩ　７ ５０ｍＭ、　ｐＨ＝７．５　；　５．０ｍ１）を加え、ｐｉ−１を１ＮＮａＯＨ で７．５に調整した。ツクロース−１−ホスフェートアルドラーゼ源を調製する ために、大腸菌に５８株をリゾチーム（卵白由来、１０■）でトリスバッファー （４５−１塩化カリウム（ＫＣＩ）５０ｎｅ、　ｐＨ＝７．５　；　２０ｍ１） 中３５℃で１時間処理した。この大腸菌標品ｔｇを上記ｐＨ調整溶液に加え、混 合液をＤＨＡＰの９０％が消費されるまでゆっくりと攪拌した。大腸菌ツクロー ス−１−ホスフェートアルドラーゼは、クローン化及び過剰発現されており、代 替酵素源を与える［　０ｚａｋｉ等、Ｊ、　Ａｎ　ＣｈｅＩＬＳｏｃ、　、　１ １２：４９ＴＯ（１９９０）１゜反応後、この溶液をｐＨ７，０に調製し、Ｂａ Ｃ１ｔ’　２Ｈ！０　（９５ｏｍｇ、３．９ミリモル）を加え、得られた沈澱を 遠心分離で除去した。アセトン（２倍量を上清に加えた。この混合液を冷蔵庫で ２時間保持し、新しく生じた沈澱を集めた。
バリウムイオンを除（ために、ダウエックス５０（Ｈ”　）を攪拌しながら加え 、次いでろ過した。この溶液を凍結乾燥し、残留物をシリカゲルクロマトグラフ ィー（ＣＨＣＩ！　：　Ｍｅ　ＯＨ：　ＨｔＯ・８：２：０．１）で精製してリ ン酸化アジドケトース、化合物ｉｏｇを２０％（ＤＨＡＰに対して）で得た。化 合物１０８：　”ｃＮＭＲ（ＣＤ、ＯＤ）δ５２．７．６６．７．７１．９．７ ２．８．８０．１．１０４．４　ｐＩ＆Ｐｄ／Ｃ（２０［）を含むエタノール（ ３０ｍｌ）中化合物１０８の溶液を５０ｐｓｉで１日間水素化した。触媒をろ別 し、ろ液を濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィ（ＣＨＣＩｓ　：　 Ｍｅ　ＯＨ：　ＨｔＯ：６：４：ｌ〜５：５：２）で精製して化合物１０９及び １１０のほぼ等モル混合物を得た。
化合物１１０　：　［１１１１ｏ　＋１８，２°　（ｃｌ、ｌ、ＭｅＯＨ）、’ ＨＮＭＲ（ＤｔＯ）δ１．２０（３Ｈ，ｄ、Ｊ　＝　６．７．５−ＣＨｓ）、２ ．７１（ＩＨ，ｔ、Ｊ　＝　１２．０．Ｈ−１ａ）、３．３０（ＩＨ，ｑｄ、Ｊ 　”　６．V．１．５．Ｈ −５）、３Ｊｌ（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　１２．０．５．５．Ｈ−１ｅ）、３．５ ０（ＬＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　９．７．３．０．Ｈ−３）、３．W７（ＩＨ。
ｄｄ、Ｊ　＝　３．０．１．５．Ｈ−４）、３．９０　（ＩＨ，ｄｄｄ、Ｊ　＝ 　１１．５．９．５．５．５　Ｈｚ、）Ｉ−２）　＋）ｐＩ氏G　”Ｃ ＮＭＲ（ＤｔＯ）δ１４．４．４６．５．５５．３．６４．８．７０．３．７３ ．５　ｐｐｍ６ＨＲＭＳ　（Ｍ＋Ｈ”　）計算値　１４８．０９７４、実測値　 １４８．０９７４゜Ｒ，（２Ｒ）−メチル−５−フルオロ−（３Ｒ，４Ｒ，Ｓ　 Ｒ）　−トリヒドロキシピペリジン；（２，６−シデオキシー２−フルオロマン ノジリマイシン）、化合物０３ｅ 乾燥ベンゼン（５０ｍｌ）中３−アジドー２−ヒドロキシプロパナールジエチル アセタール（７，３２ｇ、３８．７３ミリモル）の攪拌溶液にジエチルアミノサ ルファトリフルオリド（ＤＡＳＴ；　２０．６ｍ１）を−７８℃で加えた。添加 後、この溶液を室温で１時間攪拌し、次いで７０℃で１２時間加熱した。この反 応液を０℃でメタノールを加えることにより急冷し、水で希釈した。ジクロロメ タン抽出した後、有機層をＭｇ５Ｏａで乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物を シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：エーテル＝９＝１、容【容量 ）で精製して３−アジド−２−フルオロプロパナールジエチルアセタールを油状 物として得た（６５％）；Ｒ＋”０．８４　ＥｔＯＡｃ：ヘキサン＝　２：３） 。
’ＨＮＭＲ（ＣＤ、ＣＩ）δ１．２１５−１．２１９（６Ｈ，ｍ）、　３．５２ ６（２Ｈ，ｄａ　Ｊ　＝　１５．３　Ｈｚ）、　３．６４２|３．６７０ （２Ｈ，ｍ）、　３．６８０−３．８０８（２Ｈ，ｍ）、　４．５１４（ＩＨ， ｄａ　Ｊ　＝　４５．９　Ｈｚ）ｐｐｍ。
ラセミ体３−アジド−２−フルオロプロパナールジエチルアセクール（７５０ｍ ｇ、３．９３ミリモル）とＩＮ　ＨＣＩ（２０ｍｌ）の混合液を６５℃で３０時 間加熱した。この混合液を室温まで冷却し、ＤＨＡＰ　（１ミリモル）を加え、 ｐＨ値を１　ＯＮ　ＮａＯＨで７に調整した。このｐＨ調整溶液にウサギ筋ＦＤ Ｐアルドラーゼ（５００単位）を加え、得られた溶液を３６時間ゆっくりと攪拌 した。酵素分析は、ＤＨＡＰの全部が消費されたことを示した。次いで、この溶 液をろ過し、凍結乾燥した。この黄色シロップをメタノールで処理し、ろ過して 不溶物質を除去した。メタノールを減圧下で除去して化合物１０１ｅを得た。
１０ｍ１のメタノール中本生成物（２０■）及びｌＯ％Ｐｄ／Ｃ（５■）を含む ・　溶液を５０ｐｓｉで１日間水素化した。触媒をろ別し、溶媒を減圧下で除去 した。
粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣＩｓ：ＭｅＯＨ＝３＋１）で 精製して２．６−シデオキシー２−フルオロマンノジリマイシン、化合物１０３ ｅを得た。
Ｓ、Ｉ、６−シデオキシヨードジリマイシン；化合物１１１（Ｓ）−３−アジド −２−ヒドロキシプロパナールをＤＨＡＰとラムノロース−１−ホスフェートア ルドラーゼと使用する以外は化合物１０６（実施例５）の調製と同様の方法を用 いて、化合物ｉｌｌを調製する。
Ｔ、（３Ｓ、４Ｓ）−ジヒドロキシピペリジン、化合物１１４ａ　；　（３Ｒ， ４Ｒ）−ジヒドロキシ−（６Ｒ）−メチピペリジン、化合物１１４ｂ；　（３Ｒ ，４Ｓ）−ジヒドロキシ−（５Ｒ）−メチピペリジン、化合物１１４ｃ上記のよ うに調製した（Ｒ３）３−アジド−２−ヒドロキシプロパナールとアセトアルデ ヒドのＤＥＲＡ触媒縮合により、化合物１１４ａを製造した。得られた化合物１ １３ａを回収し、前記のようにＰｄ／Ｃで水素化して化合物１１４ａを得た。
化合物１１４　ａ　：　’ＨＮＭＲ（ＤｔＯ）δ１．５１（２Ｈ，ａＨ−２）、 ２．５５（ＩＨ，ｄｄｄ、Ｊ　＝　１３．１．、７．６゜４．８．Ｈ−１）、２ ．６７（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　１３．４．３．０．Ｈ−５）、２．９０（ＩＨ， ｄｄ、Ｊ　＝　１３．４．５．７．Ｈ|５）、２．８６ −２．９６（ＩＨ，ａＨ−１）、３．６７（ＩＨ，ｄｔ、Ｊ　＝　５．９．２． ５．Ｈ−４）、３．７４（ｌＨ，ｄｄｄ、Ｊ　＝　７．６．S．６．３．０ Ｈ−３）Ｉ）ｐＩＩ；　’″ＣＮＭＲ（Ｄｔ０）　６２９．９（Ｃ−２）、　４ １．９（Ｃ−１）、　４８．１（Ｃ−５）、　６８．８．６X．３ （Ｃ−３，ＣＣ−４）ｐｐ、　ＨＲｌｉｌＳ　（Ｍ”　）：計算値：　１１７． ０７９０、実測値　１１７．０７８５゜上記のように調製した（Ｒ８）３−アジ ド−２−ヒドロキシプロパナールとアセトンのＤＥＲＡ触媒縮合により、化合物 １１４ａを製造した。得られた化合物１１３ｂを回収し、上記のようにＰｄ／Ｃ で水素化して化合物１１４ｂを得た。
化合物１１４　ｂ　：　ＩＨＮＭＲ（ＣＤＣ１ｌ）δ１．０５（３Ｈ，ｄ、Ｊ　 ＝　６．３．Ｈ−１）、　１．２７（ＩＨ，ｑ、Ｊ・１２、４．　Ｈ−３ａ）、 　１．６７（ＬＨ，ｄｄｄ、　Ｊ　＝　１２．５．４．７．２．５．　Ｈ−３ｅ ）、　２．５５（ＩＨ，ｄｄｑ、@１２．６．６．３．２．５゜ ）１−２）、２．６２（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　１３．４．１．３．　Ｈ−６ａ） 、３．０６（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　１３．４．２．９．Ｈ−Uｅ）、３．２５ （３Ｈ，ｂｒ　ｓ、　２０Ｈ，ＮＨ）、３．５３（ＩＨ，ｄｄｄ、　Ｊ　＝１１ ．９．４．７．３．　ＯＨ−４）、　３．６９（１）１．　ｂ秩@ｓ、Ｈ−５） ｐｐｍ；　”ＣＮＭＲ（ＣＤＣＩＳ）＋５２２．１（Ｃ−１）、　３７．７（Ｃ −３）、　５０．１．５０．５（Ｃ−２，Ｃ−６）、　６７D２６ ９．９　（Ｃ−４，Ｃ−５）　ｐｐｍ、、　ＨＲＭＳ　（Ｍ＋Ｃｓ”　）：計算 値：　２６４．０ｏｏｔ、実測値　２６４．００００゜・　上記のように調製し た（ＲＳ）３−アジド−２−ヒドロキシプロパナールとプロピオンアルデヒドの ＤＥＲＡ触媒縮合により、化合物１１４ｃを製造した。得られた化合物１１３ｃ を回収し、上記のようにＰｄ／Ｃで水素化して化合物１１４ｃを得た。
化合物１１４　ｃ　：　’ＨＮＭＲ（ＤｔＯ）δ０．９１（３Ｈ，ｄ、Ｊ　・７ ．０．ＣＨｓ）、１．７７−１．８２（ｌＨ，ａＨ−２）、　２．４５（ＩＨ， ｔ、Ｊ　＝　１２．４．Ｈ−１ａ）、　２．６７（ＩＨ，ｔ、　Ｊ　＝　１１． ７．Ｈ−５ａ）、　２．７０（hＨ，ｄｄ、　Ｊ　＝　１２．４゜ ４．８．　Ｈ−１ｅ）、２．９０（ｌＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　１１．９．４．６．Ｈ −５ｅ）、３．７２（ＩＨ，ｄｄｄ、Ｊ　＝　１１．７．５D１．３．０゜ Ｈ−４）、３．８５（ＩＨ，ｂｒ　ｓ、Ｈ−３）　ｐｐｌ［ｌ；　”ＣＮＭＲ（ Ｄｔのδ１５．４（ＣＨｚ）、　３５．５（Ｃ−２）、　４S．８゜ ４５．７（Ｃ−１，Ｃ−５）、　６７．０　？２．６　（Ｃ−３，Ｃ−４）Ｉ） ｐ＆ＨＲ１ｉｌＳ　（Ｍ＋Ｃｓ”　）：計算値：　２６４．O００１、 実測値　２６４．０００３゜ 材料二バッファー、酵素及び基質は、全てシグマ社から購入し、受は取ったまま で用いた。これらには、ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸） （ＰＩＰＥＳ）、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）　、エチレンジアミン四酢酸（ ＥＤＴＡ）　、β−Ｄ−グルコシダーゼ（スウィートアーモンド由来）、ｐ−ニ トロフェニルβ−Ｄ−グルコシド、ｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコシダーゼ 、ｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコシド、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミ ンダーゼ、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド、α−Ｄ −マンノシダーゼ及びｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−マンノシドを含めた。
Ｂ、溶液の調製： （ａ）ＰＩＰＥＳバッフｙ−（０，０５に０．０１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ６，５） ：　１リツトル（１）の脱イオンＨｔＯに１５．１ｇＰＩＦＥＳと３５．７■Ｅ ＤＴＡを加えた。
ｐＨをＮａＯＨ（ｌ　ＯＭ）で６．５に調整した。
（ｂ）ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＡｃバッフｙ　（０，０１Ｍ　ＰＩＰＥＳ、０．２Ｍ Ｎａ０Ａｃ及び０．０１＋ｍＥＤＴＡ、ｐＨ６，５）：本バッファーは、文献方 法に従って調製した［Ｄａｌｅ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２４：３５ ３０　（１９８５月。
（Ｃ）β−Ｄ−グルコシダーゼ＝１５■の固形タンパク質（４単位／■）を１ｍ ｌのＰＩＰＥＳ−ＮａＯＡｃバッファー溶液に溶解することにより酵素原液を調 製・　した。本酵素原液は、酵素アッセイに対して５倍に希釈した。
（ｄ）α−Ｄ−グルコシダーゼ＝１．５■の固形タンパク質（７０単位／■）を １ｍｌのＰＩＰＥＳ−ＮａＯＡｃバッファー溶液に溶解し、希釈せずにアッセイ に用いた。
（ｅ）β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニダーゼ＝２５単位のタンパク質をシ グマ社より入手した０、５５ｍ１の３．２Ｍ硫酸アンモニウム［（ＮＨ４）！Ｓ Ｏ４］溶液に懸濁した。
（ｆ）α−Ｄ−マンノシダーゼ：５■の固形タンパク質をシグマ社より入手した １ｍｌの３．０Ｍ（１＆）ｔｓｏｎ及び０．１酢酸亜鉛（ＺｎＯＡｃ）に懸濁し た。
（ｇ）基質溶液：酵素アッセイ用に全ての基質を対応するバッファー溶液に懸濁 した。
Ｃ１酵素アッセイの一般方法 一般的には、各阻害剤に対して、０〜３倍に一二ある５種の阻害剤濃度を用いて に１値をめた。各阻害剤濃度において、０．４〜４に、にある６種の基質濃度を 用いてＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ単一プロットを得た。各アッセイにおい て添加される酵素量は、最低基質濃度を含む１０％より低い基質が４５秒以内に 消費されるように調整した。基質の全てが脱離基としてｐ−ニトロフェノールを 有するので、アッセイを４００ナノメーター（ｒＩＩＤ）でモニターし、分子吸 光係数εがｐＨ６，５において３２０４．５　ｔ’ａｎ−’となるように検定し た。以下に詳細な方法を示す。
１ｍｌの使い捨てキュベツトに９５０ミクロリツトル（μｌ）のＮａ０Ａｃ−Ｐ ＩＰＥＳバッファー溶液、２０μｌの阻害剤溶液及び２０μｌのｐ−ニトロフェ ニルβ−Ｄ−グルコシド溶液（ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＡｃバッファー、ｐＨ６，５ 中１０（ｌｄ４）を加えた。この溶液を十分混合し、２０μｌのβ−Ｄ−グルコ シダーゼをキュベツトに注入して反応を開始した。この反応をベックマンＤＯ− ７０分光光度計により４００Ｈｍで４５秒間モニターし、加水分解の初速度を計 算した。同様の方法を他の５種の基質濃度で繰り返した。初速度を全て蓄積した 後、その阻害剤濃度の対応するＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットを作成 した。
ＰＩＰＥＳバッファーを用いるβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニダーゼを除 く全ての酵素に対してＰＩＰＥＳ−ＮａＯＡｃバッファーを用いた。具体的なに 、データは上記表３に示されている。
実施例７：Ｇａ１Ｔの大腸菌ＪＭ１０９株における発現大腸菌５Ｂ２２１株のプ ラスミドｐＩＮ−ＧＴ（実施例１参照）を単離し、周知のプロトコールを用いて ＪＭ１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）に形質転換した。形質転換細胞を１５０ｍ １のＬＢ培地に直接加え、誘発なしで３７℃で一晩増殖させた。細胞を４．００ ０Ｘｇ、４℃で遠ｌＣルで回収した。細胞を３ｍｌのＬＢ培地に再び懸濁し、１ ｍｌのクロロホルムを加えた。この混合液を室温で１５分間放置した後、３０ｍ １の５Ｍ１１ＨＥＰＥＳバツフアー、ｐＨ７，４を加えた。同様に、５Ｂ２２１ 株を新たに形質転換し、対照として増殖させた。酵素を単離し、発表されている 方法に従って活性をめた。
実施例８：フコシルトランスフェラーゼを用いた実験更に、オリゴ糖類を用いた 阻害実験のように、供与体としてＵＤＰ−フコース、フコシルトランスフェラー ゼ及び受容体としてＮ−アセチルラクトサミン（Ｇａｌβ１，４Ｇ１ｃＮＡｃ） を用いて、合成及び阻害実験を行った。これらの実験を以下に述べる。
Ａ、結果 ０．２ｄＧＤＰ−フコースにおけるＮ−アセチルラクトサミンのに、が６±３− であることがめられた。ガラクトースβ１，４−グルカール（表１、化合物６） 及び３−デオキシ−Ｎ−アセチルラクトサミン（表１、化合物１ｙ）は、記載の 条件下５０■／ｍｌの濃度まで阻害作用を示さなかった。ガラクトースβ１，４ −５−チオグルコース（表１、化合物５）は、５ｄｌの本化合物との反応がＮ− アセチルラクトサミンより２−５倍速（反応する点でフコシルトランスフェラー ゼの良好な基質であることがわかった。ガラクトースβ１．４−デオキシシリマ イシン（表１、化合物４）は、ＩＣ５ａ約４０−を有するフコシルトランスフェ ラーゼの阻害剤であった。これらの実験過程で、ＧＤＰ−フコースが三糖類の合 成に対して極めて強い基質阻害を示すことが認められた。
フコシルトランスフェラーゼのアッセイフコシルトランスフェラーゼ活性をめる アッセイは、実質的にＬｏｗｅ等、　Ｇｅｎｅｓａｎｄ　Ｄｅｖｅ１ｏｐａｌｅ 吐４：１２８８（１９９０）；Ｌｏｗｅ等、　Ｃｅ１ｌ、　６３：４７５（１９ ９０）に記載されている方・　法をわずかに変更した。
実験としては、１ｄＧＤＰ−フコース、６７５００ｃｐｍ　”Ｃ−ＧＤＰ−フコ ース（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃａｒｐ、　、　２９０　ｍＣｉ／ミリモル）、２５ ｍＭＡＴＰ、５０酬フコース及び２５０−カコジル酸ナトリウムバッファー、ｐ Ｈ６，２を含む原液（混合液Ａ）を使用日に新しく混合し、氷上で貯蔵した。
第２セツトの溶液（混合液Ｂ　１−Ｂ　６）は、変動濃度１．５〜５０−のＮ− アセチルラクトサミン及び１００ｍｌ＋１Ｍｎ　Ｃ１ｔを含めた。これらの溶液 も毎日新しく作成し、氷上で貯蔵した。２μｍの混合液Ａと２μｌのＢ混合液の １つとを混合してアッセイを進めた。本溶液に５μｌの水を加え、次いでｌμＩ の酵素溶液を加えて反応を開始した。本アッセイ混合液を穏やかに混合し、３７ ℃で３０分間インキュベートした。
結果が表１ａに示されている組換え体フコシルα１．３／４１−ランスフェラー ゼ（ＥＣ２，４，１，６５）を用いるもののような他の実験の場合、０．２５ｄ ”Ｃ−ＧＤＰ−フコース（５０００ｃｐｍ／μｌ）、６．２５酬ＡＴＰ、２５　 酬Ｍｎ　Ｃ１を及び６２．５ｄ１４カコジル酸塩バツフアー、ｐＨ６，２を含む 原液を使用用こ新しく混合し、氷上で貯蔵した。使用直前に、Ｆｕｃ　Ｔをこの 混合液に加え、１６μｌのこの混合液を４μＩの１００ｍ受容体基質と結合させ て反応を開始した。次いで、得られた混合液を３７℃で３０−２４０分インキュ ベートしたが、実験下の受容体基質（反応体化合物）に左右される。
これらのアッセイと同時に、もう１つのアッセイを行い、実験に固有の又は混入 ホスファターゼの作用によるＩ４０−フコースの生成からのバックグラウンド放 射能をめるためにラクトサミンなしで同様に処理した。
インキュベーションの完了時に、ＱＡＥ−セファデックスの２０％（Ｖ／Ｖ）懸 濁液４００μｌを加えた。これらの懸濁液を室温で１ｏ分間穏やかに混合した後 、１３、００　Ｏｒｐｍで１分間遠心した。上清液から１００μｌを抽出し、ｌ ｈ＋１のシンチレーション反応混液と混合した。ベックマンＬＳＩ７０１シンチ レーシヨンカウンターで放射能含量を測定した。３０分のインキュベーションで 酵素反応が１０％より多く起きないように注意した。
０．２ｍＭＧＤＰ−フコースの存在下のラクトサミンのミカエリス定数（Ｋ、） は、・　非直線回帰分析によりデータを式１にあてはめてめた。
ｖ　＝　（Ｖ、、、　）Ｓ／（Ｋ、　＋　Ｓ）　式ｌ上記式中、Ｖ＝反応速度、 ■１．８・最大速度及び５＝Ｎ−アセチルラクトサミン濃度。
阻害実験は、２ｍ１ｉｌＮ−アセチル−ラクトサミン及び変動濃度１〜５０　ｍ ｇ／ｍｌの（ａ）ガラクトシルβ１，４グルカール（化合物８）、　（ｂ）ガラ クトシルβ１，４デオキシノジリマイシン（化合物１０ａ）、（Ｃ）ガラクトシ ルβ１．４−５−チオグルコース（化合物７）及び（ｄ）３−デオキシ−Ｎ−ア セチルラクトサミン（化合物２ｉ）の存在下、同様な方法で行った。阻害％は、 阻害活性の阻害されない反応率に対する割合として計算した。これらの割合を阻 害剤濃度に対してプロットした。データを直線回帰により直線（式２）にあては め、５０％阻害濃度（ＩＣｉｏ）をフコシルトランスフェラーゼ反応の５０％阻 害を示す阻害剤濃度として本直線から推定した。式中、ｍ・勾配及びｂ＝ｙ−切 片。
阻害％＝ｍ（［阻害剤］）＋ｂ　式２ これらのアッセイの結果を表１ａに示す。
鋳型として図１に示されるｐＷＡｌプラスミドを含むプライマーを用いたＰＣＲ により、未変性ＣＭＰ−シアル酸シンセターゼをコードする１、３ｋｂＮｅｕＡ ｃ遺伝子を増幅した。　Ｉｎｎ１ｓ等、ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ　ｇｕｉ ｄｅ　ｔｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄａｐｐｌ　１ｃａｔｉｏｎｓ　；Ａｃａｄ ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ（１９９０）ｏ　Ｐ　Ｃ Ｒ生成物をフェノ[ル 抽出で精製し、次いで、ＴＥバッファー中Ｂｉｏ　Ｇｅｌ　Ｐ−１０スピンカラ ムでゲルろ過した。精製オリゴ糖をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌｌで消化し、低 融点アガロース中アガロースゲル電気泳動で精製した。次いで、この断片をｔａ ｃプロモーターの制御下でプラスミドｐＫＫ２３３−３に結合した。Ｚａｐａｔ ａ等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。
２６４：１４７６９　（１９８９）及びＴａｂｏｒ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、５ｃＬＵＳＡ、８２：１０７４　（１９８５）。こ■ プラスミドをｐＷＧ１２３と称した。次いで、プラスミドｐｗｃ　１２３をＳｔ ｒａｔａｇｅｎｅ社から入手した大腸菌５ｕｒｅ株に形質転換した。
変性ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ遺伝子を含むプラスミドＣＭＰＳＩＬ−１ の構築は、Ｉｃｈｉｋａｗａ等、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　、　 １１３　：４６９８（１９９１）の方法により行った。
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ遺伝子は、Ｃ−末端のデカペプチド標識配列Ｔ ｙｒ−Ｐｒｅ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｓ ｅｒ（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：３）と融合し、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａ１部位のｌａ ｍｂｄａ　ＺＡＰ”ベクターにクローン化し、大腸菌５ｕｒｅ株で過剰発現した 。
プラスミドＣＭＰＳＩＬ−１への未変性ＣＭＰ−シアル酸シンセターゼ遺伝子挿 入断片（デカペプチド標識配列を含まない）をサブクローン化するために、前記 ＰＣＲの表４のプライマーを用いた。
次いで、増幅ＰＣＲ挿入断片及びＣＭＰＳＩＬ−１プラスミドをＥｃｏＲＩ及び Ｘｂ　ａ　Ｉ　（４００／ｍｇＤＮＡ）で３７℃において１時間消化し、消化Ｄ ＮＡを１％アガロースゲルで精製した。精製未変性ＣＭＰ−シアル酸シンセター ゼ遺伝子挿入断片及び消化ＣＭＰＳＩＬ−１プラスミド（標識酵素挿入断片を含 む）を１４ＤＮＡリガーゼ（４Ｕ　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）と４℃で一晩（ 約１８時間）結合した。次いで、結合ＤＮＡを大腸菌５ｕｒｅ株に形質転換し、 ２５０■／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに塗布した。
プラスミドを組込んだ細菌を２５０■Ａｎｌアンピシリンを含むＬＢに富む培地 （Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎ、　１リットル中２５ｇ；酵母エキス、１０ｇ； ＮａＣ１，３ｇ；ｐＨ７，０）　で３７℃において中間対数期（ＯＤｓｓｏ約０ ．６−０．７）まで増殖し、次いで、０．５ｍＩＰＴＧ　（イソプロピルβ−Ｄ −チオガラクトピラノシド）を用いて３０℃で１０時間振盪しながら誘発した。
細胞を遠心（１０，０００Ｘｇ、２０分、４℃）により回収し、１６．０００　 ｌｂ／ｉｎ”のフレンチ加圧セルで破壊した。
細胞片を遠心２３，０００Ｘｇ、６０分により除き、上清（細胞を含まない抽出 液）を酵素精製に用いた。
１リツトルの培養の細胞を含まない抽出液（３０＋ａｌ）をＯｒａｎｇｅ　Ａ　 Ｄｙｅカラム（１，５ｍｇ／ｍｌゲル、３　ｃｍＸ　３０　ｃｍ）　ｊ’：、、 通過させ、０．０２ＭＭｇＣ１を及び０．２ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ） 　、ｐＨ７，５を含む２００ｍｌノ０．２Ｍ　トリス／ＨＣ１バッファーで洗浄 した。酵素を同一バッファー中直線勾配０−ＩＭＫＣＩ（全量２００ｍ１）で溶 離した。活性画分ヲプールシ、０．０２Ｍ　Ｍｇ　Ｃ’ｌＪｉヒ０．２ｍＭＤＴ Ｔを含む０．２Ｍ）リス／ＨＣＩバッファー２リットルで透析した。この酵素標 品を合成に直接用いた。この酵素を更に、ファーマシア社の５ｕｐｅｒｏｓｅ　 １２　）ｔＲ１０／３０を用いたＦＰＬＣで純度約９５％まで精製した。
２、動力学的実験 未変性又は変性ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの活性をＶａｎｎ等、　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　。
２６２：１７５５６　（１９８７）に記載されているチオバルビッール酸法を用 いてアッセイした。
簡単に言えば、５．５ｍＭＣＴＰ、２．８ｍＭＮ−７（ｒチルノイラミン酸、０ ．２Ｍトリス、２０ｍＭＭｇＣ１ｔ及び０．２ｎＭＤＴＴ、ｐＨ９，０を含む２ ５０ｍ１バツフアーニ酵素を加えて混合液を生成した。この混合液を３７℃で３ ０分間インキュベートした後、５０ｍ１の１．６Ｍ　Ｎａ　ＢＩ３を加えて過剰 のＮｅｕＡｃを破壊し、この混合液を室温で更に１５分間加熱した。次いで、こ の混合液を水浴に入れ、５０ｍ１のＨ３ＰＯ３を加えてＮａＢＨ，を破壊した。
得られた混合液を０℃で５分間保持した後、３７℃で１０分間インキュベートし て生成ＣＴＰ−ＮｅｕＡｃのリン酸エステルを切断した。遊離ＮｅｕＡｃを５０ ｍ１の０．２Ｍ　Ｎａ　１０４を用いて室温で１０分間酸化し、０．５Ｎ　ＨＣ Ｉ中４％のＮａＡｓ０ｔ４００＋ｏｌを加えた。次イテ、コノ溶液混合液を０． ５ＭＮａｔＳＯ４中０．６％トリバルビッール酸１ｍｌを含む試験管に移し、沸 騰水中で１５分間加熱した。
この溶液を冷却した後、溶液１ｍｌを取り出し、１ｍｌのシクロヘキサノンと混 合した。この混合液を振盪し、遠心し、上層を５４９ｍｍ　（ｅ　＝　４．１１ 　ｍＭ−’ｃｍ−９の測定に用いた。
種々の濃度のＣＴＰ　（１，２５−５ｄ４）及びＮｅｕＡｃ　（２−８ｍ）で動 力学的実験の初速度を測定した。このデータを以下に示される連続ｂｉ−ｂｉ基 質速度式３にあてはめ、シグマ社のシグマプロットプログラムを用いてミカエリ ス定数及び最大速度（Ｖ）を得た。
式中、Ａは［ＣＴＰ］であり、Ｂは［ＮｅｕＡｃ］であり、Ｋ１及びに、は各々 ＣＴＰ及びＮｅｕＡｃのミカエリス定数であり、Ｋ２はＣＴＰの解離定数（又は 阻害定数）である。
・　２種の酵素の比活性及び速度定数は、極めて類似していることが判明した。
未変性及び変性酵素は、各々比活性２．ＩＵ／■及び２．３Ｕ／■であった。未 変性酵素の場合、Ｋ□、は１．８　ｓ−’であり、２種の基質、ＮｅｕＡｃ及び ＣＴＰのに、値は、各々４−及び０．３１−であった。標識酵素のＬａｔは１． ９　ｓ−’であり、ＮｅｕＡｃ及びＣＴＰのに、は各々４．８−及び１．９９ｍ Ｍであった。
３、酵素安定性 ０、０２Ｍ　ＭｇＣ１＊及び０．２鯛ジチオトレイトールを含む０．２Ｍ　トリ スバッファー、ｐＨ７，５中室温で未変性及び変性酵素をインキュベートした。
所定の時間おきに、３０ｍ１分を除去し、上記活性をアッセイした。酵素安定性 を３日間実験した。未変性酵素は、リン酸塩バッファー（ｐＨ７，５）中室温で 半減期約８００時間であった。一方、変性酵素は半減期約８０時間で未変性、野 生型より約１０倍安定性が低かった。
４、ｐＨプロファイル ０．２Ｍ　トリスバッファー、ｐＨ８〜１Ｏ３８及び５０−カコジル酸ナトリウ ムバッファー、Ｉ）Ｈ４，５〜７．５における両酵素の活性をアッセイした。０ ．２ｍＭジチオトレイトールを含むこれらのバッファーは、２０ｍＭＭｇＣ１ｇ 及び６ｒＩｊＡＭｎＣ１ｔを別々に存在させて調製した。５．５ｍＣＴＰ及び２ ．８ｍＭＮｅｕＡｃを含むアッセイ溶液を３７℃で３０分間インキュベートし、 生成したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ量をチオバルビッール酸アッセイに基づいてめた。
酵素活性に影響することが既知である２種の異種金属イオン、Ｍｇ！＋及びＭｎ ”の存在下で酵素活性を種々のｐＨ値、４．５〜ｌ０１５において実験した。哺 乳動物組織から単離した酵素と同様に、未変性微生物ＣＭＰ−シアル酸シンセタ ーゼは、Ｍｎ”の存在下ではｐＨ７，５及びＭｇｔ＋の存在下では１）Ｈ９，５ が最適ｐＨであることが判明した。しかしながら、標識酵素は、Ｍｇ”又はＭｎ ”の存在下でｐＨ９，５において最適活性を示した。
５、基質特異性 ２５０ｍ１アツセイ溶液には、２．８ｍＭの各基質、５．５ｍＭＣＭＰＳＣＭＰ −ＮｅｕＡｃシンセターゼ並びに２０ｍＭＭｇＣ１ｔ及び０．２ｍＭＤＴＴを含 むｐＨ７，５及びｐＨ９，０の０．２Ｍトリスバッファーを含有した。インキュ ベーション時間を、１５分から５時間変動させるが、基質類縁体に対する酵素の 活性に左右される。
チオバルビッール酸アッセイによりＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ誘導体の生成をめた。
種々の哺乳動物組織からのＣＭＰ−シアル酸シンセターゼがＣＴＰ及びシアル酸 に特異的であることが判明した。これは、９位に結合した蛍光プローブを含む数 種のＣ−９及びＣ−８変性シアル酸類縁体を受容する。哺乳動物系からの酵素も ＫＤＮ及び５−Ｎ−グリコリルノイラミン酸のようなＣ−５変性基質を基質とと して受容する。例えば、Ｓｈａｍｅｓ等、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、１：８７ （１９９１）；　Ａｕｇｅ等。
Ｔｅｔｒａｈｅｄ、　Ｌｅｔｔ、　、　２９ニア８９（１９８８）；Ｋｅａｎ等 、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　、　８：２０８（P９６６）；　Ｒｏ ｓｅｍａｎ。
Ｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　４８：４３７（１ ９６２）；Ｇｒｏｓｓ等、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ＝@、　１６８：５ ９５（１９８７）； 及びＧｒｏｓｓ等、　ＩＩ！ｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１１７：５ ８３　（１９８８）参照。
未変性及び変性組換え体ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ酵素に対する基質特異 性の結果を下記表５に纏める。
標識化合物　未変性酵素 大腸菌系由来クローン化酵素は、哺乳動物系由来酵素と同様な基質特異性を有す る。数種のシアル酸類縁体を合成し、Ｉ）Ｈ７，５及び９．０における未変性及 び標識酵素の基質として試験した。
両酵素は、Ｃ−９変性シアル酸類縁体（９−０−アセチル、９−０−ラクチル、 ９−デオキシ−９−フルオロ及び９−アジド−９−デオキシＮｅｕＡｃ）に対し て高い活性を有するが、Ｃ−５変性類縁体（ＫＤＮ、５−デオキシＫＤＮ及び５ −デアモトアミド−５−エビ−５−フルオロＮｅｕＡｃ）は基質ではながった。
これらの結果は、シアル酸の５−アセトアミド基が微生物酵素による基質認識に 重要であることを示している。
両微生物酵素はｐＨ７，５で極めて類似した基質特異性を有するが、１）Ｈ９， ０では異なった特異性を有する。ｐＨ７，５では、未変性酵素はＮｅｕＡｃに特 異的であることが判明し、Ｃ−９変性ＮｅｕＡｃ誘導体に対する相対速度は約５ ０％に減少した。反対に、標識酵素に対するＣ−９変性類縁体の相対速度は、Ｎ −アセチルノイラミン酸より高い（表５）。
本実験で用いられるＣ−５及びＣ−９変性シアル酸誘導体は、下記実施例１゜に 示されるようにＣ−２及びＣ−６変慣−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ） 誘導体とピルビン酸塩とのシアル酸アルドラーゼ触媒縮合により調製した。
６−０−アシル化ＭａｎＮＡｃ誘導体は、有機溶媒中で安定であるように操作さ れたズブチリシン変異体（８３９９又は８３９７）が触媒するＤＭＦ中でのエス テル転移反応により調製した。Ｚｈｏｎｇ等、　Ｊ、　Ａａ　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ 、　、　１１３：６８３　（１９９１）。変異体は野生型より約１００倍（８３ ９９の場合）から１０００倍（８３９７の場合）安定であるので、野生型酵素（ ＢＰＮ’）を用いることもできるが多量の酵素を必要とする。ここに記載される ６−０−アシル糖を調製する酵素方法は、発表されている化学方法よりかなり有 効であると考えられる。［９−０−アセチル−Ｎ−アセチルノイラミン酸及び９ −０−ラクチルＮ−アセチルノイラミン酸の場合：（ａ）Ａｕｇｅ等、Ｔｅｔｒ ａｈｅｄ、Ｌｅｔｔ、、２５：４６６３（１９８４）（６−０−アセチル−Ｍａ ｎＮＡｃは化学的に調製されている）；　（ｂ）　Ｋｉｍ等、　Ｊ、　Ａｍ、　 ＣｈｅｒＬＳｏｃ、　、　１１０：６４８１（１９８ｇ）（６−０−アセチル− ＭａｎＮＡｃはプロテアーゼＮ反応により調製されている）。
（ｃ）Ａｕｇｅ等、Ｎｅｗ　Ｊ、ＣｈｅＩＬ、　１２ニア３３（１９８８Ｘ化学 的に合成された６−０−ラクチル−ＭａｎＮＡｃからの９−〇−ラクチルーＮｅ ｕＡｃとして）］；［］９−アジドー９−デオキシーＮ−アセチルノイラミンの 場合：　（ｄ）　Ｂｒｏｓｓｍｅｒ等、　ＢｉｏｃｈｅｚＢｉｏｐｈｙｓ、　Ｒ ｅｓ、　ｃｏＩＩＩＬ、　９６：１２８２（１９８０Ｘ物理的データが報告され ていない）］；［］３−デオキシし一グリセローし一ガラクトノヌロソン酸（Ｋ ＤＮ）の場合：　（ｅ）Ａｕｇｅ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４６：２０１　 （１９９０）］　；　［３，５−ジデオキシ−し−グリ七〇−Ｌ−ガラクトノヌ ロソン酸（５−デオキシ−ＫＤＮ）の場合：（ｆ）Ａｕｇｅ等。
Ｔｅｔｒａｈｅｄ、　Ｌｅｔｔ、　、　３０＋２２１７（１９８９）］。
実施例１Ｏニジアル酸類縁体の調製 実施例９で記載したシンセターゼ実験に用いられるＣ−５及びＣ−９変性シアル 酸誘導体を、Ｃ−２及びＣ−６変性ドアセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）誘 導体とピルビン酸塩とのシアル酸アルドラーゼ触媒縮合により調製した。６−０ −アシル化ＭａｎＮＡｃ誘導体は、有機溶媒中で安定であるように操作されたズ ブチリシン変異体（８３９９又は８３９７）が触媒するＤＭＦ中でのエステル転 移反応により調製した。Ｚｈｏｎｇ等、　Ｊ、　ＡＩＬＣｈｅａ　Ｓｏｃ、　、 　１１３：６８３　（１９９１）。変異体は野生型より約１００倍（８３９９の 場合）から１０００倍（８３９７の場合）安・　定であるので、野生型酵素（Ｂ ＰＮ’　）を用いることもできるが多量の酵素を必要とする。
Ａ、９−０−アセチル−Ｎ−アセチルノイラミン酸（化合物２０１）５００■（ ２，２ミリモル）のＮ−アセチルマンノサミンを２ｍｌのＤＭＦに懸濁した。次 いで、酢酸ビニル（１ｍｌ、５当量）及び１６０■のズブチリシン変異体８３９ ９［Ｚｈｏｎｇ等、Ｊ、ＡＩＬＣｈｅｕＳｏｃ、、　１１３：６８３　（１９９ １）］を加え、この懸濁液を室温で激しく攪拌した。反応の進行は、酢酸エチル ／メタノール（２／１）を用いたＴＬＣでモニターした。ジアセチル化誘導体の 生成が始まった５時間後に、酢酸ビニル及びＤＭＦを蒸発して反応を止めた。次 いでメタノールを加えて糖を溶解した。酵素と塩をろ別した後、ろ液を濃縮した 。残留シロップを酢酸エチル／メタノール（１０／１）を用いたシリカゲルでク ロマトグラフィー処理して６−０−アセチルＮ−アセチルマンノサミン（９２％ ）をＮＭＲスペクトルに基づいてα／β混合物（３１）として得た。
α−アノ？　−：　’ＨＮＭＲ（Ｄ、Ｏ）δ１．９８（３Ｈ，Ｓ、　ＮＡｃ）、 　２．０６（３Ｈ，Ｓ、　０Ａｃ）、　３．５８（ｌ）Ｉ、@ｄｄ。
Ｊ　＝　９．９　Ｈｚ、Ｈ−４）、３．９６（ｌＬｄｄ、Ｊ　＝　３．５．９　 Ｈｚ、Ｈ−３）、４．１５−４．４（４）ＬＩＬＨ−２，５C６，６’　）。
５．０４（ｄ、Ｊ　＝　０．９　Ｈｚ、Ｈ−１ａ）　、　α／β混合物：”ＣＮ ＭＲ（ＤｔＯ）δ２３．１．２４．７．５６．１゜５６．７．６６．５．６６． ６．６９．７．６９．８．７１．３．７２．４．７４．６．７６．６．９５．８ ．９５．９．１７６．７゜１７６．８．１７７．６．　１７８．４゜生成物は、 プロテアーゼＮ反応で調製したものと同一であった。
１０ｍＤＴＴ、０．５Ｍピルビン酸塩、ｉｏｏ■の上記のように調製した６−０ −アセチルマンノサミン及び１．５■のＮｅｕＡｃアルドラーゼ（３６０）をＩ Ｏ＋ｏｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７，５）に溶解した。反応 混合液を３７℃で８日間インキュベートした後、凍結乾燥した。凍結乾燥米を少 量の水に溶解し、Ｂｉｏ　Ｇｅｌ　Ｐ−２カラム（３Ｘ９０ｃｍ）に直接加え、 ４℃において流速６ｍｌ／４０分で溶離した。生成物の加水分解による微量の混 入ＮｅｕＡｃを除くために、他にゲルろ過を必要とした。化合物２０１を収率４ ７％で得た。その物理的データは、発表されているデータと一致した。
８．９−０−ラクチル−Ｎ−アセチルノイラミン酸（化合物２ｏ２）ＭａｎＮＡ ｃ　（２００■）及び５０■のズブチリシン変異体８３９９を乳酸エチルエステ ル（４ｍｌ）と４００ｍ１の０．５Ｎリン酸塩バフ７７　（ｐＨ７，５）（７） 混合液に加えた。この混合液を５０℃で３日間振盪した。次いで、溶媒を蒸発し 、残留物にメタノールを加えた。不溶物質をろ別した後、ろ液を濃縮した。残留 物を酢酸エチル／メタノール（５／１）を用いたシリカゲルでクロマトグラフィ ー処理して６−０−ラクチルＮ−アセチルマンノサミンを収率５ｏ％で得た。
’ＨＮＭＲ（ＤｚＯ）δ１．２９（３Ｂ、　ｄ、　Ｊ　＝　７８Ｚ、ラクチル− ＣＨ，）、１．９１（３Ｈ，ｓ、０Ａｃ）、　３．５１（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　 ９．５．９．５　Ｈｚ、Ｈ−４）、３．９２（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　９．５．４ ．２　Ｈｘ、Ｈ−３）、４．１６（hＨ，ｄｄ、Ｊ ＝　１．８．４．３　Ｈｚ、Ｈ−２）、　４．２−４．４（３Ｈ，ａＨ−５，６ ）、　４．８８（ｄ、　Ｊ　＝　０．９Ｈｚ、Ｈ−１ａ）、@４．９７（ｄ、　 Ｊ　＝ １、３　ＨＬ　Ｈ−１ｂ）。”ＣＮＭＲ（ＤｔＯ）δ２０．１０．２２．７６、 ２２．９３．５４．１７．５４．８１．６５．１゜６７．６．６７．９１．６９ ．４３．７０．６１．９３．８７゜Ｃｔ＋Ｈ＋ｓＮＯｔ（Ｍ”　）　ニ対するＨ ＲＭＳ　：計算値　２９３．　ｆｉｌｌ　；実測値　２９３．１０９１゜化合物 ２０２を調製するために用いられる手順は、６−０−アセチルＮ−アセチルマン ノサミンの代わりに６−０−ラクチルＮ−アセチルマンノサミンを用いる以外は 化合物２０１を調製するために用いたものと同様とした。ＮｅｕＡｃから生成物 を分離するために、別にゲルろ過積製を必要として化合物２０２を収率１８％で 得た。生成物の物理的データは発表されている値と一致した。
Ｃ，７，９−ジフルオロ−７−エビ−５−デアミノノイラミン酸（化合物２ｏ５ ）基質として４．６−シデオキシー４．６−ジフルオログルコースを用いた以外 は本明細書で記載したアルドラーゼ反応を用いて化合物２０５を調製した。
ＨＲＭＳ　：計算値　２７１．０６２５；実測値　２７１．０６４９゜’ＨＮＭ Ｒ（５００１ｌｌ）Ｉｚ、　ＤｔＯ）δ４、７（ａＨ−７）、４．５（ｄｄ、Ｈ −９，Ｊｌｌ−Ｆ　”　４７．５　Ｈｚ、　ＪＨ−Ｈ□　３　Ｈｚ）、４．２０ （ｔｄ、Ｈ−８，Ｊq−Ｆ　＝ １８、５．　ＪＮ−１１＝　３．　ＯＨｚ）、　３．９３（ａＨ−６）、　３． ８４（ｍ、　Ｈ−４）、　３．４７（ｔ、　Ｈ−５，ＪＨ−P１＝　１０．５　 Ｈｚ）。
２、１２（ｄｄ、　Ｈ−３ｅ、　Ｊｌｌ−−１４４”　２．６　Ｈｚ、　Ｊ）Ｉ −−ＭＳ　＝１２．５　Ｈｚ）、　１．７４（ｄｄ、　Ｈ−Rａ、　Ｊｏ−ｏａ 　４２．５゜ ＪＨ＄ａ−Ｈ＄ｅ　＝１２　Ｈ２）。ピークの帰属は、２Ｄ方法を用いて行った 。
Ｄ、５−エビ−５−デアミノ−５−フルオロ−ノイラミン酸（化合物２０６）ア ルドラーゼ基質として２−デオキシ−２−フルオログルコースを用いた以外は本 明細書で記載したアルドラーゼ反応を用いて化合物２０６を調製した。
ＨＲＭＳ　：計算値　２６９．０６７３．実測値　２６９．０６５１．　”ＣＮ ＭＲ（ＤｔＯ，基準としてＣＤ、ＯＤ）δ１７４．５（ｓ、　Ｃ−１）、　９６ ．４（ｓ、　Ｃ−２）、　３４．５（ｓ、　Ｃ−３）、　６５．５（ｄ、　Ｃ− ４，Ｊメ|ａ、　ｙ−ｓ＝１８Ｈｚ）。
□　９１．２（ｄ、　Ｃ５，Ｊｃ−ｓ、　ｙ−ｓ□　１９１　Ｈｚ）、　７０． ７（ｄ、　Ｃ−６，Ｊｃ−ｓ、　ｒ−ｓ”　１８　Ｈｚ）、@７１．９（ｓ、　 Ｃ−７）、　７２．８（ｓ、Ｃ−８）、　６３．５（ｓ、Ｃ−９）。
Ｅ、３−デオキシ−し−グリセロ−し−ガラクト−２−ノヌロソン酸（ＫＤＮ） （化合物２０７） １０ｍｌのリン酸カリウムバッフｙ　（０，１Ｍ、　ｐＨ７，５）にｌ　ＯａＭ ＤＴＴ、ｏ、５Ｍピルビン酸塩、０．１ＭＤ−マンノース及び１．５■のＮｅｕ Ａｃアルドラーゼを加えた。反応混合液を３７℃で３日間振盪した。この反応混 合液をダウエックス−１（ＨＣＯ，−）樹脂を用いてクロマトグラフィー処理し 、０〜ＩＭ重炭酸アンモニウム勾配で溶離した。ＫＤＮを含む両分をプールし、 凍結乾燥し、これを３回繰り返して揮発性塩を除いて収率７８％のＫＤＮを得た 。生成物の物理的データは発表されているものと一致した。
Ｆ、３．５−ジデオキシ−し−グリセロ−し−ガラクト−２−ノヌロソン酸（５ −デオキシ−ＫＤＮ）（化合物２０８） Ｄ−マンノースの代わりに２−デオキシグルコース（０，１Ｍ）を溶液に加え、 調製手順は上記と同様とした。反応混合液を５日間振盪し、化合物２０ｇを収率 ３０％で得た。生成物の物理的データは、発表されているデータと一致した。
Ｇ、９−（ジメチルホスフィニル）−９−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸 （化合物２０９） ＭａｎＮＡｃ　（５，０ｇ、２．６ミリモル）、ＡｃｔＯ（ｌ　０ｗ１）及びピ リジン（２０ｍｌ）の溶液を室温で１０時間攪拌し、この混合液を濃縮した後、 トルエンと共蒸発した。ＣＨｓＮＯｘ　（１５０１０１）中残留物、ベンジルア ルコール（２０ｍｌ）、ＢＦｘＯＥｔｔ　（１，６ｇ、ｌ　１．３ミリモル）の 溶液を２．５時間穏やかに還流した。冷却後、この混合液を濃縮した。残留物を トルエン−Ｅ　ｔ　ＯＡ　ｃ　（１：２）を用いたシリカゲルでクロマトグラフ ィー処理した。単離ベンジル２−アセトアミド−４，５゜６−トリー〇−アセチ ルー２−デオキシ−ａ−Ｄ−マンノピラノシドと０．１５　ｇのＮａＯＭｅをＭ ｅＯＨ（１００ｍ１）に溶解し、この溶液を室温で３０分間攪拌し、ダウエック ス５ＯＷ−Ｘ８（Ｈ”　）を加えて中和した。樹脂をろ別した後、ろ液を濃縮し 、次いでピリジンと共蒸発した。ドライアイス−アセトン浴における無水ＤＭＦ 　（３０ｍ１）中ベンジル２−アセトアミドー２−デオキシ−ａ−Ｄ−マンノピ ラノシド（０，５０ｇ、１．６ミリモ／ｌｚ）　、２．６−にチジン（０，３４ ｇ、３．２ミリモノりの冷却溶液にＤＭＦ中塩化ジメチルホスフィン酸（Ｉｇ、 ８．８ミリモル）の溶液を加え、この反応液を室温まで徐々に加温した。反応を （１ＭＮＨ４０ＡＣ／２−プロパナール／Ｅ　ｔＯＡｃ、　ｌ／２．４／３．４ ）を用いたＴＬＣでモニターした。
１０時間後、反応混合液をシリカゲルクロマトグラフィーに直接加え、ＣＨＣｔ ｓ／ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ（５／２／ｌ）で溶離してベンジル２−アセトアミド −２−デオキシ−６−（ジメチル−ホスフィニル）−ａ−Ｄ−マンノピラノシド （収率５６％）を得た。
’ＨＮＭＲ（ＤｆＯ）δ１．４６（３８，ｄ、Ｊ　＝　１３．４　Ｈｚ、Ｐ−Ｃ Ｈｓ）、　１．５（３Ｈ，ｄ、Ｊ　＝　１３．４　Ｈ２，Ｐ|ＣＨＩ）。
１．８９（３Ｈ，ｓ、ＮＡｃ）、３．５３（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　８．８　Ｈ２ ，Ｉ（−４）、３．７６（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　８．４．３@Ｈ２，Ｈ−３）。
４．０（３Ｈ，ｍ、Ｈ−５，６）、　４．１８（ＩＨ，ｄ、Ｊ　＝　４．３　Ｈ ｚ、　Ｈ−２）、　４．４４（ＬＨ，ｄ、　Ｊ　＝　９．２@Ｈｚ、　Ｂｎ−Ｈ −１ａ）。
４、５５（ＩＨ，ｄ、　Ｊ　＝　９．２　Ｈ２，Ｂｎ−Ｈ−１ｂ）、　４．７６ （ＩＨ，ｓ、　Ｈ−１）、　７．２８（５Ｈ，ｓ、　Ｂｎ）B エタノール／水（ｌ　Ｏｍｌ　；　ｌ／１）中上記のように調製したベンジル２ −アセトアミド−２−デオキシ−６−（ジメチル−ホスフィニル）−α−Ｄ−マ ンノピラノシト（１００ｍｇ、０．２６ミリモル）の溶液を５０［（７）１０％ Ｐｄ／（、で１０時間水素化した。反応の進行をＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ／ＡｃＯＨ ／ＨｔＯ１８／２／ｌ）テモニターした。触媒をろ過し、ろ液を濃縮して２−ア セトアミド−２−デオキシ−６−（ジメチルホスフィニル）−α−Ｄ−マンノピ ラノシド（収率１００％）を得た。
’ＨＮＭＲ（ＤｔＯ）δ１．５１（６Ｈ，ｄ、　Ｊ　＝　１３．６　Ｈｚ）、　 １．９４（３Ｈ，Ｓ、　ＮＡｃ）、　３．４５（２Ｈ，ｍ）A　３．９（ＩＨ。
ｄｄ、Ｊ　＝　８．４．３　Ｈｚ、Ｈ−３）、４．１（３Ｈ，＋ｎ、Ｈ−５．６ ）、４．８７．４．９８（ＩＨ，ｓ、Ｈ−１）。
上記のように調製した２−アセトアミド−２−デオキシ−６−（ジメチルポスフ ィニル）−α−Ｄ−マンノピラノシドとピルビン酸とのシアル酸アルドース触媒 アルドール縮合を４日間行った。生成物をＢｉｏ　Ｇｅｌ　Ｐ−２を用いて４℃ で精製して化合物２０９を収率４２％で得た。
’ＨＮＭＲ（Ｄ、０）δ１．４８（６Ｈ，ｄ、　Ｊ　＝１４．２　Ｈｚ、　Ｐ− ＣＨｓ　）、　１．６７（ｌＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　１１．１３@Ｈｚ、Ｈ− ３ａｘ）、　１．９（３Ｈ，ｓ、　ＮＡｃ）、　２．０８（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ　 ＝　５．３．１３　Ｈｚ、Ｈ−２ｅｑ）、　３．４５（ＩＨCｄ、　Ｊ　＝　９ ．３　Ｈｚ。
Ｈ−７）、　３．８−４．０（６Ｈ，ｍ、　Ｈ−４，５，６，８，９）。
Ｈ，９−アジド−９−デオキシ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（化合物２ｏ３）ピ リジン（２０ｍｌ）中ＭａｎＮＡｃ　（５，０ｇ、２．６ミリモル）及びＡｃ、 ０（１０ｍｌ）の溶液を室温で１０時間攪拌し、この混合液を濃縮した後、トル エンと共蒸発した。Ｃ１ｂＮＯｔ　（１５０ｍ１）中残留物、アリノげルコール （２，６３ｇ、４５．２ミリモル；３．１ｍ１）　、ＢＦｓ・０Ｅｔｔ　（１， ６０ｇ、１１．３ミリモル；１．３９ｍ１）の溶液を２．５時間積やかに還流し た。冷却後、この混合液を濃縮した。残留物をトルエン−ＥｔＯＡｃ（１：２） を用いたシリカゲルでクロマトグラフィー処理してアリル２−アセトアミド−３ ，４，６−トリー〇−アセチルー２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシドを６ ．４７ｇ（７４％）で得た：’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）δ１．９９．２．０５． ２．０６．２．１２（３Ｈ，ｓ、３ｘＯＡｃ、Ｎ）ｔＡｃ）、４．００−４．０ ３（ＩＨB ａＨ−５）、４．０７（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　２．４５．１２．２４　）１ｚ、 Ｈ−６ａ）、４．２９（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　５．３４．１Q．２３　Ｈｚ。
Ｈ−６ｂ）、４．６３（ＩＨ，ｄｄｄ、Ｊ　＝　１．４３．４．６０．９．１１ 　Ｈｚ、Ｈ−２）、４．８１（ＩＨ，ｄ、Ｊ　＝　１．４３@Ｈｚ、Ｈ−１）。
５、　ＩＩ（ＩＨ，ｔ、　Ｊ　＝　１０．１８　Ｈｚ、　Ｈ−４）、　５．３６ （ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ　＝　４．５９．１０．１９　Ｈｚ、　g−３）、　５．８ ２（ＩＨ。
ｄ、Ｊ　＝　９．１１　Ｈｚ、ＮＨＡｃ）；　”ＣＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）δ２０ ．６７、２０．７４．２３．３３．５０．２９．６２．４２K ６６．０５．６８．０２．６８．６４．６９．１１．９８．０２．１１８．４２ ．１３２．８３．１６９．８９．１６９．９６．１７０．０W゜ １８０、５５゜ ＭｅＯＨ（１００ｍ１）中上記のように調製したアリル２−アセトアミド−３， ４゜６−トリー〇−アセチルー２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド（６， ４６ｇ、１６．７ミリモル）及びメタノール性ＮａＯＭｅ　（２ｍｌ；　１Ｍ溶 液）の溶液を室温で２時間攪拌し、ダウエックス５０Ｗ−Ｘ８　［Ｈ”　］を加 えて中和した。樹脂をろ別し、ろ液を濃縮した後、ピリジンと共蒸発した。ピリ ジン（２０ｍｌ）及びＣＨｔＣｌｔ（３０ｍｌ）中塩化トリルスルホニル（３， ５０ｇ、１８．３ミリモル）の溶液をピリジン（３０ｍ１）及びＣＨｔＣＩｔ　 （５０１０１）中残留物の冷却溶液＋、：、　Ｏ−Ｓ℃で３０分かけて滴下し、 この混合液を室温で１０時間攪拌した後、冷却した。この混合液に酢酸無水物（ ３０＋ｎｌ）を加え、この混合液を室温で５時間攪拌した。この混合液を濃縮し 、残留物をトルエン−ＥｔＯＡｃ（１：２）を用いたシリカゲルでクロマトグラ フィー処理してアリル２−アセトアミド−３，４−ジーＯ−アセチルー２−デオ キシ−６−０−）リルスルホニルーα−Ｄ−マンノピラノシド（３，６８ｇ。
４４％）を得た； ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１＊）δ１．９８（６Ｈ，ｓ、　２ｘＡｃ）、　２．０４（ ３Ｈ，ｓ、　Ａｃ）、　２．４６（３Ｈ，ｓ、　トシルのｃ盾浴j、’ ３．９６−４．００（ＩＨ，ＩＩｌ、Ｈ−４）、　４．１０（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　 ＝　４．５０．１１．５０　Ｈｚ、Ｈ−６ａ）、　４．３０iＩＨ，ｄｄ、Ｊ　 ＝ ２．００．１１．５０　Ｈｘ、Ｈ−６ｂ）、４．６２（ＩＨ，ｄｄｄ、Ｊ　＝　 １．５０．４．５０．９．００　Ｈｘ、Ｈ−２）、４．７８iｌＨ，ｄ。
Ｊ　＝　１．５０．４．５０．９．００　Ｈｚ、Ｈ−２）、　４．７８（ＩＨ， ｄ、Ｊ　＝　１．５０　Ｈｚ、　Ｈ−１）、　５．１６（ｔg，ｔ、Ｊ　＝ １０、ＯＨｚ、　Ｈ−４）、　５．３３（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　４．５０．１０ ．０　）１２．　Ｈ−３）、　６．０３（ＩＨ，ｄ、Ｊ　＝@９．５０　Ｈｚ。
Ｎ）ＩＡｃ）；　”ＣＦａｉｌＲ（ＣＤＣＩｓ）δ２０．５９．２０．７８．２ １．６４．２３．２６．５０．００．６５、？５．６７．９X゜ ６８．１０．６８．６９．６９．２０．９８．０４．１１８．３７．１２７．８ ９．１２９．８９．１３２．７９．１７０．２８゜ＣｔｔＨｔ書Ｎｏｔ。Ｓ（Ｍ ”　）に対するＨＲＭＳ　：計算値　５００．１５９０　、実測値　５００．１ ５９０゜上記のように調製したアリル２−アセトアミド−３，４−ジーＯ−アセ チルー２−デオキシ−６−０−トリルスルホニル−α−Ｄ−マンノピラノシド（ ３，６８ｇ。
７．３７ミリモル）及びＮａ１（２，２１ｇ、１４．７ミリモル）の溶液をＩＯ 時時間中かに還流し、冷却した。この混合液を濃縮し、残留物をトルエン−Ｅｔ ＯＡｃ（１：２）を用いたシリカゲルでクロマトグラフィー処理してアリル２− アセトアミド−３，４−ジー０−アセチル−２，６−ジデオキシ−６−ヨード− α−Ｄ−マンノピラノシド（２，９６ｇ、８８％）を得た；’ＨＮＭＲ（ＣＤＣ Ｉｓ）δ１．９９．２．０５．２．０８（３）１．　ｓ、　２ｘＡｃ、　Ｎ）ｔ Ａｃ）、　３．１９（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ@＝７．５０゜ １１．０　）１ｚ、Ｈ−６ａ）、３．３５（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　３．０．１１ ．０　Ｈｚ、Ｈ−６ｂ）、３．７１（ｌＨ，ｄｄｄ、Ｊ　＝@３．０．７．５゜ １０．０Ｈｚ、Ｈ−５）、４．６３（ＩＨ，ｄｄｄ、Ｊ　＝　１．５．４．５． ９．５　Ｈｘ、Ｈ−２）、４．８２（ＩＨ，ｄ、Ｊ　＝１．T　Ｈ２，Ｈ −１）、４．９８（ＩＨ，ｔ、Ｊ　＝　１０．０　）１ｚ、　Ｈ−４）、５．３ ６（ＩＨ，ｄ、Ｊ　＝　４．５．１０．０　Ｈｚ、　Ｈ−３j、５．７９（ＩＨ 。
ｄ、Ｊ　＝　９．５．Ｎ）ｌＡｃ）　；　”ＣＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）　δ５．４ ９．２０．７４．２３．３４．５０．１７．６８．５１゜６９．１１．７０．０ ７．９７．７６、１１８．５４．１３２．７５．１６９．９３．１６９．９９゜ Ｃ＋ｓＨｔ＊ＮＯｄ（Ｍ”　）に対するＨＲＭＳ　：計算値　４５６．０５１９ 　、実測値　４５６．０５２０゜上記のように調製したアリル２−アセトアミド −３，４−ジーＯ−アセチル−２゜６−ジデオキシ−６−ヨード−α−Ｄ−マン ノピラノシド０．９ｇをｌｏｍｌのＤＭＦに溶解し、３当量のＮａＮ５を加え、 この反応混合液を１００℃で１０時間加熱した。
生成物は、ＴＬＣ（酢酸エチル）によりヨード誘導体と同一のＲｆ値（０，７） を示した。しかしながら、ＴＬＣによるアジド誘導体のＵＶは可視できなかった が、ヨード誘導体のＵＶは可視できた。
溶媒を蒸発した後、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ 酢酸エチル、３／２）に直接加えてアリル２−アセトアミド−３，４−ジー０− アセチル−６−アジド−２，６−シデオキシーα−Ｄ−マンノピラノシド（０， ５ｇ。
６９％）を得た； ’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）δ１．９２（３Ｈ，ｓ、　ＮＨＡｃ）、　１．９８（ ３Ｈ，ｓ、　０Ａｃ）、　１．９９（３Ｈ，ｓ、　０Ａｃ）A　３．２（ＩＨ。
ｄｄｊ　＝　３．１３　Ｈｚ、）Ｉ−６ａ）、３．２７（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　 ６．５．１３　Ｈｚ、Ｈ−６ｂ）、３．８７（ＩＨ，ｄｄｄAＪ　＝３゜ ６．５．１１．７　Ｈｘ、１（−５）、３．９５（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　６．１ ８　Ｈ２，アリル−Ｈ−１ａ）、４．１１（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ@＝　６゜ １８Ｈｚ、アリル−Ｈ−１ｂ）、４．５４（ＩＨ，ｄｄｄ、Ｊ　＝　２．５．５ ．９．８　Ｈ２，Ｈ−２）、４．７４（ＩＨ，ｄ、Ｊ　＝　Q １Ｚ、Ｈ−１）、５．０２（ｌＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　９．８．９．８　）１ｚ、Ｈ −４）、５．１４（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　２．１１．３　Ｈ噤Aアリル −Ｈ−３ａ）、５．２３（１８，ｄｄｄ、Ｊ　＝　６．６．１１．３．１６　Ｈ ２，アリル−Ｈ−２）、　６．１７（ＩＨ，ｄ、　Ｊ　＝　X．８ Ｈｚ、ＮＨ）；　１３ＣＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）δ２０．８．２３．５０．６７． ６８．６８．４．６９．２．９７．５．１１７．８゜１３２．４．１６９．８． １７０．１゜上記のように調製したアリル２−アセトアミド−３，４−ジー０− アセチル−６−２，６−シデオキシーａ−Ｄ−７ンノピラノシドを０．２ＭＭｅ ＯＮａを含む１０ｍ１のメタノールに溶解した。５分後、この混合液にダウエッ クス５０カチオン交換樹脂を加えて中和した。この樹脂をろ過し、ろ液を濃縮し てアリル２−アセトアミド−６−アジド−２，６−シデオキシーα−Ｄ−マンノ ピラノシド（９９％）を得た。
’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）δ２．０３（３Ｈ，ｓ、　ＮＡｃ）、　３．４−３． ５（２Ｈ，ｍ、　Ｈ−６ａ、　６ｂ）、　３．５９（ＩＨ，рпA　Ｊ　＝９． ８゜ ９．８　Ｈｚ、Ｈ−４）、３．７５（ＩＨ，ａＨ−５）、４．０２（ＩＩ（、ｄ ｄ、Ｊ　＝　９．８．５　Ｈｚ、Ｈ−３）、　４．１８．４D３９（ＩＨ。
ｄｄ、Ｊ　＝　５．８．１　Ｈｚ、Ｈ−２）、　４．７４（ＩＨ，ｂｒ−ｓ、Ｏ Ｈ）、　４．８（ＩＨ，ｓ、Ｈ−１）、　４．８７（ＩＨ，ｂ秩|ｓ、ＯＨ）。
５゜２３（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　１．２．１０　Ｈｚ、アリル−Ｈ−３ａ）、５ ．３２（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　１７．１．２　Ｈｚ、アリル−Ｈ−３ｂ）、　５ ．９０（ＩＨ，ｄｄｄｄ、　Ｊ・６．６．１０．１７　Ｈｚ、アリル−）１−２ ）、　６．６９（ＩＨ，ｄ、　Ｊ・８．P．ＮＨ）。
アリル２−アセトアミド−６−アジド−２，６−シデオキシーα−Ｄ−マンノピ ラノシド（２００ａ＋ｇ）　、１．２当量のＰｄＣ１を及び２．４当量のＮａ０ Ａｃの懸濁液を９５％酢酸（５ｍｌ）に溶解した。この反応液を室温で一晩攪拌 し、濃縮した。
残留物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨＣＩ３／酢酸エチル／メタノール 、５／２／２　）で精製して２−アセトアミド−６−アジド−２，６−シデオキ シーα−Ｄ−マンノピラノシドを収率３１％で得た。
’ＨＮＭＲ（ＤｔＯ）δ１．６６（ＩＨ，３Ｈ，Ｓ、　ＮＡｃ）、　３．４６（ ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ　＝　９．８．９．８　Ｈｚ、　Ｈ−４）A　３．４５− ３．５５（２Ｈ，ａＨ−６ａ、６ｂ）、　３．８２（ＩＨ，ｍ、Ｈ−５）、　３ ．８７（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　４．６．９．８　Ｈ２，Ｈ−R）、４．１５ （ＩＨ，ｄ、　Ｊ　＝　４．６　Ｈ２，Ｈ−２）、　４．８８（ｄ、　Ｊ　＝　 １．２　Ｈｘ、Ｈ−１ｂ）、　４．９７（ｓ、Ｈ−１ａ）。
５０■の６−アジトー６−デオキシーＮ−アセチル−マンノサミンと１．５■の ＮｅｕＡｃアルドラーゼを１０ｍ１ｊｌＤＴＴ及び０．５Ｍピルビン酸塩を含む ｌ０ｍ１の０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｌ（７，５）に溶解した。出発 物質は１４時間で消費された。この溶液を凍結乾燥し、Ｂｉｏ　Ｇｅｌ　Ｐ−２ ゲルろ過（３Ｘ９０ｃｍ）クロマトグラフィーを用いて流速６ｍｌ／４０分で４ ℃において精製を行った。生成物を含む画分をプールし、凍結乾燥して化合物２ ０３を収率８４％で得た。
’ＨＮＭＲ（ＤｔＯ）　δ１．６６（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ　＝１．１３　Ｈ２，Ｈ −３ａｘ）、　１．８９（３Ｈ，ｓ、　ＮＡｃ）、　２．０T（ＩＨ。
ｄｄ、Ｊ　＝　４．４．１３　）１ｘ、Ｈ−ｅｑ）、　３．３１（ＩＨ，ｄｄ、 Ｊ　＝　５．８．１２　Ｈｚ、Ｈ−９ａ）、　３．３７（Ｉg，ｄｄ、Ｊ　＝ １．２．１０　Ｈｚ、Ｈ−７）、３．４５（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　３．３．１２ 　Ｈｚ、１（−９ｂ）、３．７−３．９（４Ｈ，ａ　Ｈ−４C５，６゜ ８）。Ｃ１１Ｈ１ｌＣ１１Ｈ１ｌＮ４ＤＩ（に対するＨＲＭＳ　：計算値　３３ ３．１０４６　、実測値　３３３．１０４６゜１、　９−デオキシ−９−フルオ ロ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（化合物２０４）上記のように調製したアリル２ −アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド２．０ｇと１．２当 量の塩化トリチルの溶液を７２℃で１０時間攪拌した。反応混合液を０℃まで冷 却した後、この混合液に２．５当量の塩化ベンゾイル基ル加えた。この反応混合 液を室温まで２時間徐々に加温した。反応を完結させた後、氷水を加え、反応混 合液を酢酸エチルで抽出した。有機抽出液を１ＮＨＣＩで２回洗浄し、乾燥し、 濃縮した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィ一に加え、ヘキサン／酢酸エチ ル（１（１／１）で溶離してアリル２−アセトアミド−３，４−ジー０−ベンゾ イル−２−デオキシ−６−０−トリチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（収率２３ ％）を得た。
１１　ＮＭＲ（ＣＤＣ１，）δ２．０５（３Ｈ，ｓ、ＮＡｃ）、　３．８７（Ｌ Ｈ，ｄｄ、Ｊ　＝　９．８．９．８　Ｈｚ、Ｈ−４）、４．O５ （ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　６．　１２　Ｈ２，アリル）＋４．１（３８，Ｉｎ、Ｈ −５，６，６’　）、４．２（ｌＨ，ａ　アリル）、　４．X６ （１１（、ｄ、Ｊ　＝１１．３　Ｈｚ、アリル）、５．０７（ｌ）ｌ、ｄ、Ｊ　 ＝　１１．３　Ｈｚ、アリル）、　５．１Ｔ（ＩＨ，ＩｌｌAアｔノル）。
５、９７（ＩＩ（、ｄ、　Ｊ　＝　７．４　Ｈｚ、　ＮＨＡｃ）。
８０％酢酸（１０ｍｌ）中上記のように調製した１、　５　ｇのアリル２−アセ トアミド−３，４−ジーＯ−ベンゾイルー２−デオキシ−６−０−ト１ノチル− α−Ｄ−マンノピロシトの懸濁液を室温で一晩攪拌した。反応混合液を濃縮した 後、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーに加え、ヘキサン／酢酸エチＪしく ５／１）で溶離してアリル２−アセトアミド−３，４−ジーＯ−ベンゾイルー２ −デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド（収率９０％）を得た。
’）Ｉ　ＮＭＲ（Ｄ、Ｏ）δ２．０（３）１．　Ｓ、Ｎ）ｌＡｃ）、　３．７８ ＜２）１．亀Ｈ−５，６）、４．０４（１）１．島Ｈ−６）A　４．１（ＩＨ。
■、アリル）、４．２３（ＩＨ，ｄｄｄ、Ｊ　＝　１．２６．　５．７３．　１ ２．７　ＦＩＺ、アリル）、　４．８８（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ@＝　４．５６゜ ９、２４　Ｈｚ、アリル）、４．９３（ＬＨ，ｄ、Ｊ　＝　１．０６　Ｈｚ、ｔ （−１）、５．２４（ｌ）Ｉ、ｄｄ、Ｊ　＝　１．２５．１O．５　Ｈ２゜ アリル）、５．３３（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　１．４．１７．２　Ｈｚ、アリル） 、　５．６３（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ　＝　１０．１．１０．１@Ｈｚ。
Ｈ−４）、５．９１（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　４．５５．　１０．３４　Ｈｚ、Ｈ −３）、５．９５（ＩＨ，ｍ、　ア１ノル）、６．８３（Ｌg，ｄ、Ｊ　＝ ９、１５　）１ｚ、　ＨＮＡｃ）。
乾燥ジグリム（２ｍｌ）中（ジエチルアミハサルファトリフルオＩノド（０，５ ｍ１）の攪拌溶液に乾燥ジグリム（３ｍｌ）中上記のように調製しＩこアｌＪ７ し２−アセトアミド−３，４−ジ−ベンゾイル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノ ピラノシドの溶液を室温で加え、反応混合液を室温で１時間及び４０℃で３時間 攪拌した。出発物質が消費された後、反応混合液を氷水に注ぎ、酢酸エチルで抽 出した。抽出液を乾燥し、濃縮し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィーに加 えた。不純物をヘキサンで溶離した後、生成物をエーテルで溶離してフッ化生成 物を収率８９％で得た。次いで、生成物をメタノール中５ｍｌのＩＮナトリウム メトキシドに溶解してベンゾイル基を除去した。２０分後、ダウエックスＳＯＷ 　Ｘ−８［Ｈ”　］を加えて反応混合液を中和した。樹脂をろ過し、ろ液を濃縮 してアリル２−アセトアミド−２，６−ジデオキシ−６−フルオロ−α−Ｄ−マ ンノピラノシドを収率９９％で得た。生成物（５０■）　、１．２当量の酢酸パ ラジウム（ＩＩ）及び２．５当量の酢酸ナトリウムを９５％酢酸中５０℃で１８ 時間攪拌し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィー に加え、酢酸エチル／メタノール（２／１）で溶離して２−アセトアミド−２， ６−シージオキシ−６−フルオロ−α−Ｄ−マン　゛ノピラノシドを収率７３％ で得た。
’ＨＮＭＲ（Ｄ！０）６１．９（３１（、ｓ、　ＮＡｃ）、　３．５（ＩＨ，ｄ ｄ、　Ｊ　＝　１０．３．１０．３　［（ｚ、　Ｈ−４）、@３．７２（１８゜ ｍ、Ｈ−５）、　３．９３（ＬＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　４．５．１０．３　Ｈｚ、Ｈ −３）、　４．１６（ＩＨ，ｄ、Ｊ　＝　４．５　Ｈｚ、Ｈ|２）、４゜４６ （２Ｈ，ａＨ−６）、　４．９．５．０（ＩＨ，ｓ、Ｈ−１）。
Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（１００Ｕ）の存在下、０．１Ｍリン酸 カリウムバッファー（ｐＨ７，５，１０ｍ１）中上記のように調製した２−アセ トアミド−２，６−シージオキシ−６−フルオロ−α−Ｄ−マンノピラノシド（ ２０■）及びピルビン酸ナトリウム塩（２５５■、３０当量）の溶液を３７℃で ８日間インキュベートした。反応混合液を凍結乾燥し、Ｂｉｏ　Ｇｅｌ　Ｐ−２ カラムでクロマトグラフィー処理して化合物２０４を収率２２％で得た。物理的 データは発表されている数値と一致した。５ｈａｎｏａ等、Ｃａｒｂ、Ｒｅｓ、 、１７５：２５　（１９８８）。
前記説明は、本発明を例示するものであるが、限定するものではない。本発明の 新規な概念の真の精神及び範囲を逸脱することな（種々の変更及び修正を行うで もよい。
配列表 （１）一般的情報 （ｉ）出願人二つォン（Ｗｏｎｇ）、チーーフエイ（Ｃｈｉ−Ｈｕｅｙ）、イチ カワ（Ｉｃｈｉｋａｗａ）、ヨシタカ（Ｙｏｓｈｉｔａｋａ）　、ジエン（Ｓｈ ｅｎ）、グラオー−ジエン（Ｇｗｏ−Ｊｅｎｎ） （ｉｉ）　発明の名称：オリゴ糖酵素基質および阻害剤：方法並びに組成物（ｉ ｉｉ）配列数二３ （１ｖ）通信用住所： （Ａ）受信人：ドレスラー（Ｄｒｅｓｓｌｅｒ）、ゴールドスミス（Ｇｏｌｄｓ ｌｌｌｉ　ｔｈ）＋シオアー（Ｓｈａｒｅ）、シュドカー（Ｓｕｔｋｅｒ）＆ミ ルナモウ（Ｍ　ｉ　Ｉ　ｎａｍｏｗ）（Ｂ）ストリート：スート４７００．１８ ０　Ｎ、シュテットソン（Ｓｔｅｔｓｏｎ）（Ｃ）市ニジカゴ （Ｄ）州：イリノイ州（ル） （Ｅ）国：米国（ＵＳＡ） （Ｆ）　ジップコード（ＺＩＰ）：　６０６０１（リ　コンピュータ読み取り可 能型： （＾）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣコンバーチプル（Ｃ）操作システム：　Ｐ Ｃ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア−・パテントインリリース（Ｐａ ｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ）　＃１．２４（ｖｉ）　現出願日： （Ａ）出願番号： ＣＢ）出願臼： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人情報・ （Ａ）氏名：ガムソンエドワード（Ｇａｍｓｏｎ、　Ｅｄｗａｒｄ）　Ｐ。
（Ｂ）登録番号：　２９．３８１ （Ｃ）参照／事件番号：　５ＣＲＦ２４３．１（ｉｘ）　電気通信情報： （Ａ）電話番号：　３１２６１６５４００（Ｂ）ファクシミリ番号：　３１２６ １６５４６０（２）配列同定番号：　ｌ　（ＳＥＱ夏ＤＮＯ：１）情報（ｉ）　 配列の諸特性 （Ａ）長さ二６０塩基対（ｂｐ） （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド形態ニー末鎖 （Ｄ）形態：線状 （ｉｉ）　分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）　配列の表示：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ＩＡＴＡＴｒＧＡＡＴＴ’　Ｃ ＴＡＡＡＣＴＡＧＴ　ＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧ　ＡＣＡＧＴＣＡＴＡＡ　ＴＧＡＧ ＡＡＣＡＡＡ　ＡＡＴＴＡＴ１fＧＣＧ　６０ （２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　２に関する情報（ｉ）　配列の諸特性 （Ａ）長さ：６７塩基対（ｂｐ） （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド形態ニー末鎖 （Ｄ）形態二線状 （ｉυ　分子型：ＤＮＡ（ゲノム） 配列の表示：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３に 関する情報（ｉ）　配列の諸特性 （Ａ）長さ：ｌＯアミノ酸 ＣＢ）型：ペプチド （Ｄ）形態：線状 （ｉｉ）　分子型：ペプチド 配列の表示：　ＳＥ９１０　ＮＯ：　３Ｔｙｒ　Ｐｒｅ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｖａ ｌ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　５ｅｒＦＩＧＵＲＥ　１ 開裂サイト 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　１／２１　７ ２３６−４Ｂ １５１５２　ＺＮＡ ／／ＣＣ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （３１）優先権主張番号　７３８，２１１（３２）優先日　１９９１年７月３０ 日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （３１）優先権主張番号　８５２，４０９（３２）優先日　１９９２年３月１６ 日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。
ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ 、ＪＰ Ｉ （７２）発明者　イチカワ　ヨシタカ アメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９２１２２　サン　ディエゴ　ショアラインドライヴ　７１５０ （７２）発明者　ジエン　グウォ　ジエンアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９２００９　カールスバド　フォス力　ストリート　３３４０

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．以下の式Ｉに対応するオリゴ糖： ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ 該式Ｉにおいて、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２またはＮＲ１４（ここで、Ｒ１６は 水素原子、Ｃ１−Ｃ１２アシル基、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ４アルコ キシカルボニル基を表し、または＝ＮＲ１４としてＣ１−Ｃ１２アルキルＮ−オ キシド基を表す）を表し、Ｒ１は存在しないか、もしくは水素原子、ヒドロキシ ル基、Ｃ１−Ｃ４アシル基、Ｃ１−Ｃ４アルコキシカルボニルオキシ基、炭素原 子数５までの飽和または不飽和のアルコキシドまたはアルコキシアルコキシド基 またはグリコシド結合したサッカライド残基を表し、 Ｒ１′は水素原子を表すか、またはＲ１とＲ１′とは一緒にオキソ基を形成し、 Ｒ２は存在しないか、もしくは水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、Ｃ１ −Ｃ５アルコキシ基またはＮＲ１７Ｒ１８（ここで、Ｒ１７は水素原子またはＣ １−Ｃ４アルキル基を表し、またＲ１８は水素原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基Ｃ１ −Ｃ４アシル基またはＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基を表すか、もしくはＮ Ｒ１７Ｒ１８は一緒に４〜８個の炭素原子を含む環状イミド基を形成する）を表 し、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に水素原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、ヒドロ キシル基、チオフェニル基、Ｃ１−Ｃ３アルキルチオ基、炭素原子数５までの飽 和または不飽和のアルコキシドまたはアルコキシアルコキシド基、グリコシド結 合したグルコシル基、Ｎ−アセチルグルコースアミニル基、ガラクトシル基、Ｎ −アセチルガラクトースアミニル基、フコシル基、マンノシル基、ラムノシル基 、シアリル基またはそのジサッカライド残基を表すか、もしくはＲ３とＲ４とは 一緒にオキソ基を形成し、但しＲ３およびＲ４の少なくとも一方は、（ｉ）Ｒ３ とＲ４とが一緒にオキソ基を形成する場合、（ｉｉ）Ｒ２およびＲ３が存在せず に、その結合がエチレン性不飽和結合を形成する場合または（ｉｉｉ）ＸがＮＲ １６である場合を除き、水素原子を表すことを条件とし、 Ｒ５は存在しないか、もしくは水素原子、ヒドロキシル基、メチル基、Ｃ１−Ｃ ４アシル基またはＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニルオキシ基を表し、Ｒ６は存在 しないか、もしくはヒドロキシメチル基、メチル基、トリヒドロキシプロピル基 、メチレンＣ１−Ｃ４アシルオキシ基またはベンジルオキシ基を表し、Ｒ７は水 素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ８は水素原子、ヒドロキシル基またはア セタミド基を表し、Ｒ９はヒドロキシメチル基、メチル基、トリヒドロキシプロ ピル基、メチレンＣ１−Ｃ４アシルオキシ基またはベンジルオキシ基を表すか、 およびＲ■が水素原子であり、かつＲ１１がＮ−アセチルアミノ基である場合に は、３−アセトキシ−１，２−ジヒドロキシプロピル基、３−ラクチルオキシ− １，２−ジヒドロキシプロピル基、３−アジド−１，２−ジヒドロキシプロピル 基、および３−フルオロ−１，２−ジヒドロキシプロピル基を表し、 Ｒ１０は存在しないか、もしくはヒドロキシル基またはアセタミド基を表し、Ｒ １１は存在しないか、もしくはヒドロキシル基またはアセタミド基を表し、Ｒ１ ２はヒドロキシル基またはアセタミド基を表し、Ｒ１３はヒドロキシメチル基ま たはトリヒドロキシプロピル基、およびＲ１５が水素原子であり、かつＲ１２が Ｎ−アセチルアミノ基である場合には、３−アセトキシ−１，２−ジヒドロキシ プロピル基、３−ラクチルオキシ−１，２−ジヒドロキシプロピル基、３−アジ ド−１，２−ジヒドロキシプロピル基、および３−フルオロ−１，２−ジヒドロ キシプロピル基を表し、 Ｒ１４は水素原子またはカルボキシル基を表し、Ｒ１５は水素原子、ヒドロキシ ル基またはアセタミド基を表し、およびｍは０または１であって、ｍが０である 場合には環Ｃは存在せず、かつｍが１である場合には環Ｃは存在し、 但し、（ａ）置換基Ｒ１、Ｒ２およびＲ５のうちの一つまたはＲ６のヒドロキシ ル基が環Ｂに存在せず、かつ環Ｂは該置換基の存在しない該環Ｂの炭素原子に対 するグリコシド結合を介して環Ａと結合しており、しかもここに列挙した以外の 該当する置換基またはヒドロキシル基の位置で環Ａが環Ｂに結合している場合に おいてのみ、番号付けした置換基の一つまたはヒドロキシル基は存在せず、（ｂ ）ｍが１である場合、置換基Ｒ１０およびＲ１１の一方またはＲ９のヒドロキシ ル基は環Ａには存在せず、かつ環Ｃは該置換基またはヒドロキシル基の存在しな い該環Ａの炭素に対するグリコシド結合を介して環Ａと結合しており、しかも該 当する置換基またはヒドロキシル基の位置で環Ｃが環Ａに結合している場合にお いてのみ、番号付けした置換基の一つまたはヒドロキシル基が存在せず、（ｃ） 以下の構造（ｉ）〜（ｖ）；即ち（ｉ）Ｒ１およびＲ１′が一緒にオキソ基を形 成し、（ｉｉ）Ｒ１と、Ｒ３またはＲ４の何れかはヒドロキシル基ではなく、（ ｉｉｉ）Ｒ３およびＲ４が一緒にオキソ基を形成し、（ｉｖ）Ｒ３またはＲ４の 何れかがＣ１−Ｃ３アルキルチオ基であり、あるいは（ｖ）Ｒ２およびＲ３は存 在せず、その結合がエチレン性不飽和結合を形成し、かつＲ１、Ｒ５、Ｒ８また はＲ９の何れかはヒドロキシル基ではなくまたはＲ６はヒドロキシメチル基では ない、の一つが存在する場合にのみＸはＯであり、かつ（ｄ）ＸがＯである場合 にのみＲ２およびＲ３は存在せず、該結合がエチレン性不飽和結合を形成するこ とを条件とする。 ２．ｍが０である請求の範囲第１項記載のオリゴ糖。 ３．ｍが１である請求の範囲第１項記載のオリゴ糖。 ４．以下の構造式ＩＩに対応するオリゴ糖：▲数式、化学式、表等があります▼ ＩＩ該式ＩＩにおいて、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２またはＮＲ１５（ここで、Ｒ ６は水素原子、Ｃ１−Ｃ１２アシル基、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ４ア ルコキシカルボニル基を表し、または＝ＮＲ１５としてＣ１−Ｃ１２アルキルＮ −オキシド基を表す）を表し、Ｒ１は存在しないか、もしくは水素原子、ヒドロ キシル基、Ｃ１−Ｃ４アシル基、Ｃ１−Ｃ４アルコキシカルボニルオキシ基、炭 素原子数５までの飽和または不飽和のアルコキシドまたはアルコキシアルコキシ ド基またはグリコシド結合したサッカライド残基を表し、 Ｒ１′は水素原子を表すか、またはＲ１とＲ１′とは一緒にオキソ基を形成し、 Ｒ２は存在しないか、もしくは水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、Ｃ１ −Ｃ５アルコキシ基またはＮＲ１２Ｒ１３（ここで、Ｒ１７は水素原子またはＣ １−Ｃ４アルキル基を表し、またＲ１８は水素原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、Ｃ １−Ｃ４アシル基またはＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基を表すか、もしくは ＮＲ１７Ｒ１８は一緒に４〜８個の炭素原子を含む環状イミド基を形成する）を 表し、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に水素原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、ヒド ロキシル基、チオフェニル基、Ｃ１−Ｃ３アルキルチオ基、炭素原子数５までの 飽和または不飽和のアルコキシドまたはアルコキシアルコキシド基、グリコシド 結合したグルコシル基、Ｎ−アセチルグルコースアミニル基、ガラクトシル基、 Ｎ−アセチルガラクトースアミニル基、フコシル基、マンノシル基、ラムノシル 基、シアリル基またはそのジサッカライド残基を表すか、もしくはＲ３とＲ４と は一緒にオキソ基を形成し、但しＲ３およびＲ４の少なくとも一方は、（ｉ）Ｒ ３とＲ４とが一緒にオキソ基を形成する場合、（ｉｉ）Ｒ２およびＲ３が存在せ ずに、エチレン性不飽和結合を形成する場合または（ｉｉｉ）ＸがＮＲ１６であ る場合を除き、水素原子を表すことを条件とし、Ｒ５は存在しないか、もしくは 水素原子、ヒドロキシル基、メチル基、Ｃ１−Ｃ４アシル基またはＣ１−Ｃ４ア ルコキシカルボニルオキシ基を表し、Ｒ６は存在しないか、もしくはヒドロキシ メチル基、メチル基、トリヒドロキシプロピル基、メチレンＣ１−Ｃ４アシルオ キシ基またはベンジルオキシ基を表し、Ｒ７は水素原子またはカルボキシル基を 表し、Ｒ８は存在しないか、もしくはヒドロキシル基またはアセタミド基を表し 、Ｒ９はヒドロキシメチル基、メチル基、トリヒドロキシプロピル基、メチレン Ｃ１−Ｃ４アシルオキシ基またはベンジルオキシ基を表すか、およびＲ■が水素 原子であり、かつＲ１１がＮ−アセチルアミノ基である場合には、３−アセトキ シ−１，２−ジヒドロキシプロピル基、３−ラクチルオキシ−１，２−ジヒドロ キシプロピル基、３−アジド−１，２−ジヒドロキシプロピル基、および３−フ ルオロ−１，２−ジヒドロキシプロピル基を表し、 Ｒ１１はヒドロキシル基またはアセタミド基を表し、但し、（ａ）置換基Ｒ１、 Ｒ２およびＲ５のうちの一つまたはＲ６のヒドロキシル基が環Ｂには存在せず、 かつ環Ｂは該置換基の存在しない該環Ｂの炭素原子に対するグリコシド結合を介 して環Ａと結合しており、しかもここに列挙した以外の該当する置換基またはヒ ドロキシル基の位置で環Ａが環Ｂに結合している場合においてのみ、番号付けし た置換基の一つまたはヒドロキシル基は存在せず、（ｂ）以下の構造（ｉ）〜（ ｖ）：即ち（ｉ）Ｒ１およびＲ１′が一緒にオキソ基を形成し、（ｉｉ）Ｒ１と Ｒ２またはＲ４の何れかがヒドロキシル基ではなく、（ｉｉｉ）Ｒ３およびＲ４ が一緒にオキソ基を形成し、（ｉｖ）Ｒ３またはＲ４の何れかがＣ１−Ｃ３アル キルチオ基であり、あるいは（ｖ）Ｒ２およびＲ３は存在せず、エチレン性不飽 和結合を形成し、かつＲ１、Ｒ６、Ｒ８またはＲ９の何れかはヒドロキシル基で はなく、またはＲ６はヒドロキシメチル基ではない、の一つが存在する場合にの みＸはＯであり、かつ（ｃ）ＸがＯである場合にのみＲ２およびＲ３は存在せず 、かつエチレン性不飽和結合を形成することを条件とする。 ５．Ｒ１１がヒドロキシル基であり、かつ該置換基群が以下の構造式ＩＶで示さ れる立体化学的形状をもつ請求の範囲第４項記載のオリゴ糖：▲数式、化学式、 表等があります▼ＩＶ６．ＸがＳである請求の範囲第５項記載のオリゴ糖。 ７．ＸがＮＨである請求の範囲第５項記載のオリゴ糖。 ８．ＸがＯである請求の範囲第５項記載のオリゴ糖。 ９．水性媒体と、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼを阻害す る量の該媒体中に分散された以下の構造式ＩＩに対応するオリゴ糖とを含有する 組成物： ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩ該式ＩＩにおいて、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、 ＳＯ２またはＮＲ１６（ここで、Ｒ１６は水素原子、Ｃ１−Ｃ１２アシル基、Ｃ １−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基を表し、または＝Ｎ Ｒ１６としてＣ１−Ｃ１２アルキルＮ−オキシド基を表す）を表し、Ｒ１は存在 しないか、もしくは水素原子、ヒドロキシル基、Ｃ１−Ｃ４アシル基、Ｃ１−Ｃ ４アルコキシカルボニルオキシ基、炭素原子数５までの飽和または不飽和のアル コキシドまたはアルコキシアルコキシド基またはグリコシド結合したサッカライ ド残基を表し、 Ｒ１′は水素原子を表すか、またはＲ１とＲ１′とは一緒にオキソ基を形成し、 Ｒ２は存在しないか、もしくは水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、Ｃ１ −Ｃ■アルコキシ基またはＮＲ１２Ｒ１３（ここで、Ｒ１７は水素原子またはＣ １−Ｃ４アルキル基を表し、またＲ１８は水素原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、Ｃ １−Ｃ４アシル基またはＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基を表すか、もしくは ＮＲ１７Ｒ１８は一緒に４〜８個の炭素原子を含む環状イミド基を形成する）を 表し、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に水素原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、ヒド ロキシル基、チオフェニル基、Ｃ１−Ｃ３アルキルチオ基、炭素原子数５までの 飽和または不飽和のアルコキシドまたはアルコキシアルコキシド基、グリコシド 結合したグルコシル基、Ｎ−アセチルグルコースアミニル基、ガラクトシル基、 Ｎ−アセチルガラクトースアミニル基、フコシル基、マンノシル基、ラムノシル 基、シアリル基またはそのジサッカライド残基を表すか、もしくはＲ３とＲ４と は一緒にオキソ基を形成し、但しＲ３およびＲ４の少なくとも一方は、（ｉ）Ｒ ３とＲ４とが一緒にオキソ基を形成する場合、（ｉｉ）Ｒ２およびＲ３が存在せ ずに、エチレン性不飽和結合を形成する場合または（ｉｉｉ）ＸがＮＲ１６であ る場合を除き、水素原子を表すことを条件とし、Ｒ５は存在しないか、もしくは 水素原子、ヒドロキシル基、メチル基、Ｃ１−Ｃ４アシル基またはＣ１−Ｃ４ア ルコキシカルボニルオキシ基を表し、Ｒ６は存在しないか、もしくはヒドロキシ メチル基、メチル基、トリヒドロキシプロピル基、メチレンＣ１−Ｃ４アシルオ キシ基またはベンジルオキシ基を表し、Ｒ７は水素原子またはカルボキシル基を 表し、Ｒ８は存在しないか、もしくはヒドロキシル基またはアセタミド基を表し 、Ｒ９はヒドロキシメチル基、メチル基、トリヒドロキシプロピル基、メチレン Ｃ１−Ｃ４アシルオキシ基またはベンジルオキシ基を表すか、およびＲ■が水素 原子であり、かつＲ１１がＮ−アセチルアミノ基である場合には、３−アセトキ シ−１，２−ジヒドロキシプロピル基、３−ラクチルオキシ−１，２−ジヒドロ キシプロピル基、３−アジド−１，２−ジヒドロキシプロピル基、および３−フ ルオロ−１，２−ジヒドロキシプロピル基を表し、 Ｒ１１はヒドロキシル基またはアセタミド基を表し、但し、（ａ）置換基Ｒ１、 Ｒ２よびＲ５のうちの一つまたはＲ６のヒドロキシル基が環Ｂには存在せず、か つ環Ｂは該置換基の存在しない該環Ｂの炭素原子に対するグリコシド結合を介し て環Ａと結合しており、しかもここに列挙した以外の該当する置換基またはヒド ロキシル基の位置で環Ａが環Ｂに結合している場合においてのみ、番号付けした 置換基の一つまたはヒドロキシル基は存在せず、（ｂ）以下の構造（ｉ）〜（ｖ ）：即ち（ｉ）Ｒ１およびＲ１′が一緒にオキソ基を形成し、（ｉｉ）Ｒ１とＲ ３またはＲ４の何れかはヒドロキシル基ではなく、（ｉｉｉ）Ｒ３およびＲ４が 一緒にオキソ基を形成し、（ｉｖ）Ｒ３またはＲ４の何れかはＣ１−Ｃ３アルキ ルチオ基であり、あるいは（ｖ）Ｒ２およびＲ３は存在せず、エチレン性不飽和 結合を形成し、かつＲ１、Ｒ５、Ｒ８またはＲ９の何れかはヒドロキシル基では なく、またはＲ６はヒドロキシメチル基ではない、の一つが存在する場合にのみ ＸはＯであり、かつ（ｃ）ＸがＯである場合にのみＲ２およびＲ３は存在せず、 かつエチレン性不飽和結合を形成することを条件とする。 １０．（ａ）水性媒体中で、以下の式ＩＩおよびＩＩＩに対応する活性化された 供与体単糖と、受容体サッカライドとを、該活性化された供与体単糖および該受 容体サッカライド両者に対して特異性を有する触媒量のグリコシルトランスフェ ラーゼの存在下で混合して、反応混合物を形成する工程：▲数式、化学式、表等 があります▼ＩＩ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩＩ〔ここで、ＸはＯ、 Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２またはＮＲ１６（ここで、Ｒ１６は水素原子、Ｃ１−Ｃ１２ア シル基、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基を表し、 または＝ＮＲ１６としてＣ１−Ｃ１２アルキルＮ−オキシド基を表す）を表し、 Ｒ１は存在しないか、もしくは水素原子、ヒドロキシル基、Ｃ１−Ｃ４アシル基 、Ｃ１−Ｃ４アルコキシカルボニルオキシ基、炭素原子数５までの飽和または不 飽和のアルコキシドまたはアルコキシアルコキシド基またはグリコシド結合した サッカライド残基を表し、 Ｒ１′は水素原子を表すか、またはＲ１とＲ１′とが一緒にオキソ基を形成し、 Ｒ２は存在しないか、もしくは水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、Ｃ１ −Ｃ５アルコキシ基またはＮＲ１２Ｒ１３（ここで、Ｒ１７は水素原子またはＣ １−Ｃ４アルキル基を表し、またＲ１６は水素原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、Ｃ １−Ｃ４アシル基またはＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基を表すか、もしくは ＮＲ１７Ｒ１８は一緒に４〜８個の炭素原子を含む環状イミド基を形成する）を 表し、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に水素原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、ヒド ロキシル基、チオフェニル基、Ｃ１−Ｃ２アルキルチオ基、炭素原子数５までの 飽和または不飽和のアルコキシドまたはアルコキシアルコキシド基、グリコシド 結合したグルコシル基、Ｎ−アセチルグルコースアミユル基、ガラクトシル基、 Ｎ−アセチルガラクトースアミニル基、フコシル基、マンノシル基、ラムノシル 基、シアリル基またはそのジサッカライド残基を表すか、もしくはＲ３とＲ４と は一緒にオキソ基を形成し、但しＲ３およびＲ４の少なくとも一方は、（ｉ）Ｒ ３とＲ４とが一緒にオキソ基を形成する場合、（ｉｉ）Ｒ２およびＲ３が存在せ ずに、エチレン性不飽和結合を形成する場合または（ｉｉｉ）ＸがＮＲ１６であ る場合を除き、水素原子を表すことを条件とし、Ｒ５は存在しないか、もしくは 水素原子、ヒドロキシル基、メチル基、Ｃ１−Ｃ４アシル基またはＣ１−Ｃ４ア ルコキシカルボニルオキシ基を表し、Ｒ６は存在しないか、もしくはヒドロキシ メチル基、メチル基、トリヒドロキシプロピル基、メチレンＣ１−Ｃ４アシルオ キシ基またはベンジルオキシ基を表し、Ｒ７は水素原子またはカルボキシル基を 表し、Ｒ８は存在しないか、もしくはヒドロキシル基またはアセタミド基を表し 、Ｒ９はヒドロキシメチル基、メチル基、トリヒドロキシプロピル基、メチレン Ｃ１−Ｃ４アシルオキシ基またはベンジルオキシ基を表すか、およびＲ■が水素 原子であり、かつＲ１１がＮ−アセチルアミノ基である場合には、３−アセトキ シ−１，２−ジヒドロキシプロピル基、３−ラクトイルオキシ−１，２−ジヒド ロキシプロピル基、３−アジド−１，２−ジヒドロキシプロピル基、および３− フルオロ−１，２−ジヒドロキシプロピル基を表し、 Ｒ１１はヒドロキシル基またはアセタミド基を表し、但し、（ａ）置換基Ｒ１、 Ｒ２およびＲ５のうちの一つまたはＲ６のヒドロキシル基が環Ｂには存在せず、 かつ環Ｂは該置換基の存在しない該環Ｂの炭素原子に対するグリコシド結合を介 して環Ａと結合しており、しかもここに列挙した以外の該当する置換基またはヒ ドロキシル基の位置で環Ａが環Ｂに結合している場合においてのみ、番号付けし た置換基の一つまたはヒドロキシル基は存在せず、（ｂ）以下の構造（ｉ）〜（ ｖ）：即ち（ｉ）Ｒ１およびＲ１′が一緒にオキソ基を形成し、（ｉｉ）Ｒ１と Ｒ３またはＲ４の何れかはヒドロキシル基ではなく、（ｉｉｉ）Ｒ３およびＲ４ が一緒にオキソ基を形成し、（ｉｖ）Ｒ３またはＲ４の何れかはＣ１−Ｃ２アル キルチオ基であり、あるいは（ｖ）Ｒ２およびＲ３は存在せず、エチレン性不飽 和結合を形成し、かつＲ１、Ｒ５、Ｒ８またはＲ９の何れかはヒドロキシル基で はなく、または８はヒドロキシメチル基ではない、の一つが存在する場合にのみ Ｘは０であり、かつ（ｃ）ＸがＯである場合にのみＲ２およびＲ３は存在せず、 かつエチレン性不飽和結合を形成することを条件とする〕、および （ｂ）該反応混合物を、該受容体サッカライドをグリコシル化し、かつグリコシ ル化された受容体サッカライドを形成するのに十分な条件下に十分な時間維持す る工程、 を含むことを特徴とするグリコシル化法。 １１．（ａ）水性媒体中で、それぞれの存在下で、（ｉ）受容体サッカライド、 （ｉｉ）供与体単糖、 （ｉｉｉ）活性化ヌクレオチド、 （ｉｖ）活性化供与体単糖の再生系、 （ｖ）ピロ燐酸塩スキャベンジャー、および（ｖｉ）該活性化された型の供与体 単糖および該受容体サッカライド両者に対して特異性を有する触媒量のグリコシ ルトランスフェラーゼおよび該供与体単糖および該活性化ヌクレオチド両者に対 して特異性を有する触媒量のヌクレオチドー糖−ピロホスホリラーゼを混合して 、反応混合物を形成する工程、および（ｂ）該反応混合物を、該受容体サッカラ イドをグリコシル化し、かつグリコシル化された受容体サッカライドを形成する のに十分な条件下に十分な時間維持する工程、 を含むことを特徴とするグリコシル化法。 １２．該受容体サッカライドが以下に示す構造式ＩＩまたはＩＩＩに対応するも のである、請求の範囲第１１項記載の方法： ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩ▲数式、化学式、表等があります▼ＩＩ Ｉここで、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２またはＮＲ１６（ここで、Ｒ１６は水素原 子、Ｃ１−Ｃ１２アシル基、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ４アルコキシカ ルボニル基を表し、または＝ＮＲ１８としてＣ１−Ｃ１２アルキルＮ−オキシド 基を表す）を表し、Ｒ１は存在しないか、もしくは水素原子、ヒドロキシル基、 Ｃ１−Ｃ４アシル基、Ｃ１−Ｃ４アルコキシカルボニルオキシ基、炭素原子数５ までの飽和または不飽和のアルコキシドまたはアルコキシアルコキシド基または グリコシド結合したサッカライド残基を表し、 Ｒ１′は水素原子を表すか、またはＲ１とＲ１′とが一緒にオキソ基を形成し、 Ｒ２は存在しないか、もしくは水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、Ｃ１ −Ｃ５アルコキシ基またはＮＲ１２Ｒ１８（ここで、Ｒ１７は水素原子またはＣ １−Ｃ４アルキル基を表し、またＲ１８は水素原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、Ｃ １−Ｃ４アシル基またはＣ１−Ｃ４アルコキシカルボニル基を表すか、もしくは ＮＲ１７Ｒ１８は一緒に４〜８個の炭素原子を含む環状イミド基を形成する）を 表し、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に水素原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、ヒド ロキシル基、チオフェニル基、Ｃ１−Ｃ３アルキルチオ基、炭素原子数５までの 飽和または不飽和のアルコキシドまたはアルコキシアルコキシド基、グリコシド 結合したグルコシル基、Ｎ−アセチルグルコースアミニル基、ガラクトシル基、 Ｎ−アセチルガラクトースアミニル基、フコシル基、マンノシル基、ラムノシル 基、シアリル基またはそのジサッカライド残基を表すか、もしくはＲ３とＲ４と は一緒にオキソ基を形成し、但しＲ３およびＲ４の少なくとも一方は、（ｉ）Ｒ ３Ｒ４とが一緒にオキソ基を形成する場合、（ｉｉ）Ｒ２およびＲ３が存在せず に、エチレン性不飽和結合を形成する場合または（ｉｉｉ）ＸがＮＲ１６である 場合を除き、水素原子を表すことを条件とし、Ｒ５は存在しないか、もしくは水 素原子、ヒドロキシル基、メチル基、Ｃ１−Ｃ４アシル基またはＣ１−Ｃ４アル コキシカルボニルオキシ基を表し、Ｒ６は存在しないか、もしくはヒドロキシメ チル基、メチル基、トリヒドロキシプロピル基、メチレンＣ１−Ｃ４アシルオキ シ基またはベンジルオキシ基を表し、Ｒ７は水素原子またはカルボキシル基を表 し、Ｒ８は存在しないか、もしくはヒドロキシル基またはアセタミド基を表し、 Ｒ９はヒドロキシメチル基、メチル基、トリヒドロキシプロピル基、メチレンＣ １−Ｃ４アシルオキシ基またはベンジルオキシ基を表すか、およびＲ３が水素原 子であり、かつＲ１１がＮ−アセチルアミノ基である場合には、３−アセトキシ −１，２−ジヒドロキシプロピル基、３−ラクチルオキシ−１，２−ジヒドロキ シプロピル基、３−アジド−１，２−ジヒドロキシプロピル基、および３−フル オロ−１，２−ジヒドロキシプロピル基を表し、 Ｒ１１はヒドロキシル基またはアセタミド基を表し、但し、（ａ）置換基Ｒ１、 Ｒ２およびＲ５のうちの一つまたはＲ６のヒドロキシル基が環Ｂには存在せず、 かつ環Ｂは該置換基の存在しない該環Ｂの炭素原子に対するグリコシド結合を介 して環Ａと結合しており、しかもここに列挙した以外の該当する置換基またはヒ ドロキシル基の位置で環Ａが環Ｂに結合している場合においてのみ、番号付けし た置換基の一つまたはヒドロキシル基は存在せず、（ｂ）以下の構造（ｉ）〜（ ｖ）：即ち（ｉ）Ｒ１およびＲ１′が一緒にオキソ基を形成し、（ｉｉ）Ｒ１と Ｒ３またはＲ４の何れかはヒドロキシル基ではなく、（ｉｉｉ）Ｒ３およびＲ４ が一緒にオキソ基を形成し、（ｉｖ）Ｒ３またはＲ４の何れかはＣ１−Ｃ３アル キルチオ基であり、あるいは（ｖ）Ｒ２およびＲ３は存在せず、エチレン性不飽 和結合を形成し、かつＲ１、Ｒ５、Ｒ８またはＲ９の何れかはヒドロキシル基で はなく、またはＲ６はヒドロキシメチル基ではない、の一つが存在する場合にの みＸはＯであり、かつ（ｃ）ＸがＯである場合にのみＲ２およびＲ３は存在せず 、かつエチレン性不飽和結合を形成することを条件とする。 １３．該受容体サッカライドが構造式ＩＩに対応する受容体オリゴ糖である請求 の範囲第１２項記載の方法。 １４．該受容体オリゴ糖がそれ自体該反応混合物中で調製され、該反応混合物が 更に （ａ）第二の受容体サッカライド、 （ｂ）第二の供与体単糖、 （ｃ）該第二の供与体単糖に対して特異的な第二の活性化ヌクレオチド、（ｄ） 第二の活性化された供与体単糖の再生系、および（ｅ）該活性化された型の該第 二の供与体単糖および該第二の受容体サッカライド両者に対して特異性を有する 触媒量の第二のグリコシルトランスフェラーゼおよび該第二の供与体単糖および 該第二の活性化ヌクレオチド両者に対して特異性を有する触媒量のヌクレオチド ー糖−ピロホスホリラーゼ、をも含む請求の範囲第１３項記載の方法。 １５．該第二の受容体サッカライドが受容体オリゴ糖である請求の範囲第１４項 記載の方法。 １６．該グリコシルトランスフェラーゼおよび該第二のグリコシルトランスフェ ラーゼがそれぞれ独立にグリコシド結合の形成を触媒し、該グリコシルトランス フェラーゼが Ｓｉａ　α２，６Ｇａｌ；Ｓｉａα２，３Ｇａｌ；Ｓｉａα２，６ＧａｌＮＡｃ ；Ｓｉａ　α２，６ＧｌｃＮＡｃ；Ｓｉａ　α２，８Ｓｉａ；Ｓｉａα２，４Ｇ ａｌ；Ｓｉａα２，４ＧｌｃＮＡｃ：Ｓｉａ　α２，６Ｍａｎ；Ｆｕｃα１，２ Ｇａｌβ；Ｆｕｃ　α１，　４ＧｌｃＮＡｃβ；Ｆｕｃ　α１，　３ＧｌｃＮａ ｃｐ；　Ｆｕｃ　αｌ，　３Ｇｌｃ；　Ｆｕｃαｌ．６Ｇａｌｅ；　ｐｕｃ　α ｌ，　３Ｇａｌ　Ｐ；　Ｆｕｃ　αｌ，　３Ｐｕｃ；　Ｇａｌｅｌ，　４Ｇ［ｃ ：　Ｇａｌ〜ｌ，　４ＧｌｃＮＡｃ；　Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃ；Ｇａｌ　 β１，６ＧｌｃＮＡｃ；Ｇａｌ　β１，３ＧａｌＮＡｃ；Ｇａｌ　β１，６Ｇａ ｌＮＡｃ；Ｇａｌαｌ，　３ＧａｌＮＡｃ；Ｇａｌ　α１，３Ｇａｌ；Ｇａｌα ｌ，４Ｇａｌ；Ｇａｌβ１，　４Ｇａｌ；Ｇａｌβ１，６Ｇａｌ；Ｇａｌβ１， 　４Ｘｙｌ：ＧａｌＮＡｃ　α１，３Ｇａｌ　β；ＧａｌＮＡｃβ１，４Ｇａｌ ；ＧａｌＮＡｃ　β１，３Ｇａｌ；ＧａｌＮＡｃ　α１，３ＧａｌＮＡｃ；Ｇｌ ｃＮＡｃβ１，４ＧｌｃＮＡｃ；ＧｌｃＮＡｃβ１，２Ｍａｎ；ＧｌｃＮＡｃ　 β１，４Ｍａｎ；ＧｌｃＮＡｃβ１，６Ｍａｎ；ＧｌｃＮＡｃ　β１，３Ｍａｎ ；ＧｌｃＮＡｃ　β１，３Ｇａｌ；ＧｌｃＮＡｃ　β１，４Ｇａｌ；ＧｌｃＮＡ ｃβ１，６Ｇａｌ；ＧｌｃＮＡｃ　α１，４Ｇａｌ；ＧｌｃＮＡｃ　α１，　４ ＧｌｃＮＡｃ；ＧｌｃＮＡｃβ１，６ＧａｌＮＡｃ；ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａ ｌＮＡｃ；ＧｌｃＮＡｃ　α１，４ＧｌｃＵＡ；ＧｌｃＮＡｃ　α１，４Ｇｌｃ ＵＡ；およびＧｌｃＮＡｃ　α１，４ＩｄＵＡからなる群から選ばれる請求の範 囲第１４項記載の方法。 １７．ＮｅｕＡｃα２，６Ｇａｌβ１，４ＧＩｃＮＡｃの合成法において、水性 溶液中で、かつそれぞれの存在下で、Ｎ−アセチルマンノースアミン、Ｎ−アセ チルグルコースアミン、グルコース−１−Ｐ、ＣＭＰ、ＵＤＰ、ＡＴＰ、ＰＥＰ および触媒量のＮｅｕＡｃアルドラーゼ、ピルベートキナーゼ、無機ピロホスフ ァターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．２２）、ＵＤＰ −グルコースピロホスホリラーゼ（ＥＣ２．７．７．９）、ＵＤＰ−ガラクトー ス４−エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．２）、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ 、およびα（２，６）−シアリルトランスフェラーゼを混合して、反応混合物を 形成し、ＮｅｕＡｃα２，６Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃを形成するのに十分な 条件下にて十分な時間、該反応混合物を維持することを特徴とする上記合成法。 １８．更に、該合成されたＮｅｕＡｃα２，６Ｇａｌβ１，４ＧＩｃＮＡｃを回 収する工程をも含む請求の範囲第１７項記載の方法。 １９．水性溶液中で、かつそれぞれの存在下で、Ｎ−アセチルマンノースアミン 、Ｎ−アセチルグルコースアミン、グルコース−１−Ｐ、ＣＭＰ、ＵＤＰ、ＡＴ Ｐ、ＰＥＰおよび触媒量のＮｅｕＡｃアルドラーゼ、ピルベートキナーゼ、無機 ピロホスファターゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．２２ ）、ＵＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（ＥＣ２．７．７．９）、ＵＤＰ− ガラクトース４−エピメラーゼ（ＥＣ５．１．３．２）、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシ ンセターゼ、（２，６）−シアリルトランスフェラーゼ、ＣＴＰ、フコース−１ −ホスフェート、ＧＤＰ−Ｆｕｃ−ピロホスホリラーゼおよびα１，３−フコシ ルトランスフェラーゼを混合して、反応混合物を形成し、シアリルＬｅｘを形成 するのに十分な条件下にて十分な時間、該反応混合物を維持する工程を含むこと を特徴とするシアリルＬｅｘの合成法。 ２０．更に、合成された該シアリルＬｅｘを回収する工程をも含む請求の範囲第 １９項記載の方法。 ２１．以下の構造式ＩＩＩに対応するサッカライド：▲数式、化学式、表等があ ります▼ＩＩＩここで、ＸはＯ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２またはＮＲ１６（ここで、Ｒ １６は水素原子、Ｃ１−Ｃ１２アシル基、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ４ アルコキシカルボニル基を表し、または＝ＮＲ■としてＣ１−Ｃ１２アルキルＮ −オキシド基を表す）を表し、Ｒ１は存在しないか、もしくは水素原子、ヒドロ キシル基、Ｃ１−Ｃ４アシル基、Ｃ１−Ｃ４アルコキシカルボニルオキシ基、炭 素原子数５までの飽和または不飽和のアルコキシドまたはアルコキシアルコキシ ド基またはグリコシド結合したサッカライド残基を表し、 Ｒ１′は水素原子を表すか、またはＲ１とＲ１′とが一緒にオキソ基を形成し、 Ｒ２は存在しないか、もしくは水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、Ｃ１ −Ｃ５アルコキシ基またはＮＲ１２Ｒ１８（ここで、Ｒ１７は水素原子またはＣ １−Ｃ４アルキル基を表し、またＲ１８は水素原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、Ｃ １−Ｃ４アシル基またはＣ１−Ｃ４アルコキシカルボエル基を表すか、もしくは ＮＲ１７Ｒ１８は一緒に４〜８個の炭素原子を含む環状イミド基を形成する）を 表し、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に水素原子、Ｃ１−Ｃ４アルキル基、ヒド ロキシル基、チオフェニル基、Ｃ１−Ｃ３アルキルチオ基、炭素原子数５までの 飽和または不飽和のアルコキシドまたはアルコキシアルコキシド差、グリコシド 結合したグルコシル基、Ｎ−アセチルグルコースアミニル基、ガラクトシル基、 Ｎ−アセチルガラクトースアミニル基、フコシル基、マンノシル基、ラムノシル 基、シアリル基またはそのジサッカライド残基を表すか、もしくはＲ３とＲ４と は一緒にオキソ基を形成し、但しＲ３およびＲ４の少なくとも一方は、（ｉ）Ｒ ３とＲ４とが一緒にオキソ基を形成する場合、（ｉｉ）Ｒ２およびＲ３が存在せ ずに、エチレン性不飽和結合を形成する場合または（ｉｉｉ）ＸがＮＲ１６であ る場合を除き、水素原子を表すことを条件とし、Ｒ５は存在しないか、もしくは 水素原子、ヒドロキシル基、メチル基、Ｃ１−Ｃ４アシル基またはＣ１−Ｃ４ア ルコキシカルボニルオキシ基を表し、かつＲ４は存在しないか、もしくはヒドロ キシメチル基、メチル基、トリヒドロキシプロピル基、メチレンＣ１−Ｃ４アシ ルオキシ基またはベンジルオキシ基を表す。 ２２．ファゲミドＣＭＰＳＩＬ−１で形質転換され、かつＡＴＣＣ寄託番号６８ ５３１を有することを特徴とする形質転換されたＥ．コリ。
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