KR20060019611A - 이황화결합의 형성을 위한 시약과 방법 및 단백질의 당화 - Google Patents

이황화결합의 형성을 위한 시약과 방법 및 단백질의 당화 Download PDF

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KR20060019611A
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벤자민 가이 데이비스
데이비드 필립 갬블린
안소니 존 페어뱅크스
필립프 가르니에
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아이시스 이노베이션 리미티드
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Abstract

본 발명은 특히, 단백질, 펩티드 및 아미노산에서 이황화결합의 형성을 위한 방법과 시약에 관한 것이다. 본 발명의 방법과 시약은 단백질, 펩티드 및 아미노산의 당화를 조절하기 위하여 특히 유용하다. 본 발명의 방법은 시약 또는 중간체로서 티오설포네이트 또는 셀레닐설파이드 화합물을 이용한다. 셀레닐설파이드 그룹을 포함하는 몇몇 단백질과 펩티드도 본 발명의 일부분을 이룬다.
이황화결합, 당화, 셀레닐설파이드, 티오설포네이트

Description

이황화결합의 형성을 위한 시약과 방법 및 단백질의 당화{Reagents and methods for the formation of disulfide bonds and the glycosylation of proteins}
본 출원은 단백질의 이황화결합(disulfide bond)의 형성 및/또는 화학적 변형(chemical modification)을 위한 방법과 시약 특히, 단백질의 당화(glycosylation)에서 사용하기 위한 시약과 방법에 관한 것이다.
번역과정에서 함께(co-translational) 및 번역 후(post-translational)에 일어나는 단백질의 당화(glycosylation)는 단백질의 생물학적 행동과 안정성에 중요한 역할을 한다(R Dwek, Chem. Rev., 96:683-720 (1996)). 예를 들어, 세포 신호 전달 및 조절, 발생 및 면역과 같은 필수적인 생물학적 과정에서 주된 역할을 한다. 당단백질이, 같은 펩티드 골격을 가지지만 그 성질과 당화 부위에 차이가 있는 소위, 당화 형태(glycoforms)의 혼합물로 자연적으로 존재한다는 사실에 의하여 상기 생물학적 과정에 대한 연구가 어려워진다. 게다가, 단백질 당화가 직접적인 유전적 조절하에 있지 않기 때문에, 포유류 세포 배양에서 의약 당단백질을 발현시키는 것은 당화 형태의 이종(heterogeneous) 혼합물을 만들어낸다. 동종(homogeneous) 당단백질의 당화 형태를 합성하는 능력은 따라서, 정확한 조사 목적 을 위하여 선행요건이 될 뿐만 아니라, 여러 당화 형태 혼합물(예, 에리트로포이에틴 및 인터루킨)로 현재 시판되고 있는 의약 당단백질의 제조시 그 중요성이 증가하고 있다. 인산화 및 메틸화와 같은, 단백질 번역 후의 다른 변형이 또한 중요하다. 단백질의 상기 변형의 정도와 특성을 조절하는 것은 따라서, 생물학적 시스템에서 단백질의 행동을 조사하고 조절할 수 있는 가능성을 허여한다(B.G. Davis, Science, Vol 303, p 480-482, 2004).
화학 합성을 포함하여 단백질의 당화를 위한 많은 방법이 알려져 있다. 당단백질의 화학 합성은 순수한 당단백질 당화 형태로의 접근 가능성 이상의 어떤 이점을 제공한다. 알려진 한가지 합성 방법은 티올-선택적 탄수화물 시약(thiol-selective carbohydrate reagents)인 글리코실메탄티오설포네이트 시약(glycosylmethane thiosulfonate reagents)(glyco-MTS)을 사용하는 것이다. 상기 글리코실메탄티오설포네이트 시약은 단백질 내의 티올 그룹과 반응하여 이황화결합(disulfide bond)을 통하여 상기 단백질과 연결된 글리코실 잔기를 도입한다(예로써 WO00/01712 참조).
그러나, glyco-MTS 시약은 때때로 보통의 반응 수율을 포함하여, 자주 사용되는 기초적인 조건 하에서 제조상의 어려움 및 안정성과 관련된 문제들을 포함하여 많은 단점들로 인한 어려움이 있었다. 그러므로, 단백질 당화에서 사용하기 위하여, 쉽게 제조되고 안정하며, 당화된 단백질 생성물을 높은 수율로 얻을 수 있는 다른 시약에 대한 요구가 있다.
또한, 높은 수율로 당단백질 생성물의 제조를 가능하게 하고, 위치-선택적 (site-selective)으로 단백질을 당화하는 또 다른 방법-이것은 다양한 범주의 여러 단백질의 단일 및 여러 위치에 당화를 허용한다-에 대한 요구가 있다.
본 발명자 등은 놀랍게도 특정한 황(sulfur) 및 셀레늄을 포함하는 당화 시약이 상대적으로 제조가 간단하고, 상응하는 glyco-MTS 시약보다 일반적으로 더 안정하여 단백질을 포함하는 다양한 범주의 티올 포함 화합물을 높은 수율로 당화하는데 사용될 수 있음을 발견하였다.
따라서, 첫 번째 측면에서, 본 발명은 적어도 하나의 티올 그룹(-SH)을 포함하는 유기화합물과, 화학식 Ⅰ의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하여, 이황화결합(disulfide bond)을 형성하는 방법을 제공한다.
[화학식 1]
R-S-X-R1
상기 식에서, X는 SO2 또는 Se, 바람직하게는 Se을 나타내고;
R은 유기 부분(organic moiety), 예를 들어 알킬 그룹, 알케닐 그룹, 알키닐 그룹 또는 탄수화물 부분을 나타내고; 및
R1은 선택적으로 치환된 알킬 그룹, 선택적으로 치환된 페닐 그룹, 선택적으로 치환된 피리딜 그룹 또는 선택적으로 치환된 나프틸 그룹을 나타낸다. 단, X가 SO2를 나타낼 때 R1은 선택적으로 치환된 알킬을 나타내지 않을 것.
바람직하게는, 적어도 하나의 티올 그룹을 포함하는 유기화합물은 아미노산, 펩티드 또는 단백질이다.
본 발명의 두 번째 측면은, 상기 단백질, 펩티드 또는 아미노산과, 이미 정의된 화학식 Ⅰ의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 티올 그룹을 포함하는 단백질, 펩티드 또는 아미노산을 화학적으로 변형(modification)하는 방법을 더 제공한다.
본 발명의 또다른 측면에서는, R이 탄수화물 부분인 화학식 Ⅰ의 화합물을 제공한다. R이 알케닐 또는 알케닐 그룹을 나타낼 때 화학식 Ⅰ의 화합물과의 반응에 의하여 형성되는 이황화 화합물이 그룹 R 내의 C=C 또는 C≡C 결합에서의 반응에 의하여 좀더 정교해질 가능성이 있다.
본 발명자 등은 또한 놀랍게도 티올 포함 단백질이, 상응하는 셀레닐 설파이드로 전환될 수 있고, 그 결과 형성된 S-Se 결합 내의 황의 전자친화적 특성이 탄수화물을 포함하여 티올-포함 화합물에 의한 핵친화성 치환(nucleophilic substitution)을 가능하게 한다는 것을 발견하였다.
본 발명의 세번째 측면은, 상기 티올 그룹을 셀레닐설파이드 그룹(-S-Se-R2)으로 전환하는 단계를 포함하는, 적어도 하나의 티올 그룹을 포함하는 단백질, 펩티드 또는 아미노산을 화학적으로 변형하는 방법을 제공한다. 따라서, 상기 방법은 적어도 하나의 셀레닐설파이드 그룹을 포함하는 단백질, 펩티드 또는 아미노산의 제조를 허용한다. 적어도 하나의 셀레닐설파이드 그룹을 포함하는 상기 단백질, 펩티드 및 아미노산은 본 발명의 추가적인 특징을 형성한다. 적어도 하나의 셀레닐설파이드 그룹을 포함하는 단백질 또는 펩티드가 특히 바람직하다.
단백질, 펩티드 또는 아미노산의 셀레닐설파이드 그룹은 티올 그룹을 포함하는 유기화합물과 더 반응하여 좀더 화학적으로 변형된 단백질, 펩티드 또는 아미노산-유기그룹은 이황화결합을 통하여 단백질, 펩티드 또는 아미노산에 붙는다-을 생성한다. 바람직하게는, 티올 그룹을 포함하는 유기화합물은 탄수화물 화합물로 따라서, 아미노산, 펩티드 또는 단백질을 당화하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용된 "당화(glycosylation)"는 글리코실 단위를 공유결합을 통하여 다른 부분에 부가하는 일반적인 과정을 말한다.
본 발명의 네 번째 측면은 따라서,
(a) 상기 티올 그룹을 셀레닐설파이드(-S-Se-R2) 그룹으로 전환하는 단계; 및,
(b) 상기 셀레닐설파이드 그룹을, 티올 그룹을 포함하는 유기화합물과 반응시키는 단계를 포함하는,
적어도 하나의 티올(-S-H) 그룹을 포함하는 단백질, 펩티드 또는 아미노산을 화학적으로 변형하는 방법을 제공한다.
첫 번째, 두 번째, 세 번째 및 네 번째 측면에 따른 본 발명의 방법은 이후, 첫 번째 방법, 두 번째 방법, 세 번째 방법 및 네 번째 방법으로 각각 언급될 것이다. 다르게 언급되지 않았다면, 본 명세서의 모든 바람직한 특징 및 정의는 이러한 모든 방법에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 본 명세서에 언급된, 어떠한 바람직한 특징의 어떠한 및 모든 가능한 조합을 포함한다. 그러한 조합이 상세하게 개시되어 있든 아니든. 첫 번째 및 두 번째 방법에 따른 이황화결합의 형성을 일반화한 반응식이 반응식 1에 나타나 있다.
[반응식 1]
Figure 112005515216504-PCT00001
바람직하게는, 반응식 1에 나타난 유기 부분은 단백질, 펩티드 또는 아미노산이다. 세 번째 및 네 번째 방법에 따라 셀레닐설파이드 그룹을 단백질, 펩티드 또는 아미노산에 도입하는 일반적인 반응식은 반응식 2에 나타나 있다.
[반응식 2]
Figure 112005515216504-PCT00002
반응식 2의 방법은 셀레닐설파이드(-S-Se-) 결합을 통하여 R2 그룹과 단백질, 펩티드 또는 아미노산 간의 공유 결합을 낳는다. 그러한 단백질, 펩티드 또는 아미노산은 본 발명의 추가적인 특징을 형성한다.
셀레닐설파이드 그룹을 포함하는 단백질 및 펩티드는 X 레이 회절 기술을 통하여 단백질 구조를 결정하는데 유용할 수 있다. 현재, MAD (multiple wavelength anomalous dispersion) 기술이 단백질 내 어떠한 메티오닌 잔기라도 셀레노메티오닌으로 전환하는데 관여하고 있다.
그 후 변형 및 비변형된 단백질의 X 레이 회절 패턴을 비교하여 수행된 비변형 단백질의 구조를 결정하게 된다. 본 발명의 방법으로, 상기 기술에 사용될 수 있는 대안적인(또다른) 셀레늄 포함 단백질 또는 펩티드에 대하여 편리하고 쉽게 접근할 수 있다.
본 발명의 방법은 중금속을 단백질 구조에 도입하는 쉬운 방법을 제공함으로써, X 레이 회절 데이터가 쉽게 해석될 수 있도록 한다.
셀레닐설파이드를 포함하는 단백질, 펩티드 또는 아미노산은, 반응식 3의 일반화된 반응식에서 보여지는 네 번째 방법에 따라 티올을 포함하는 유기화합물과 더 반응할 수 있다.
[반응식 3]
Figure 112005515216504-PCT00003
반응식 3의 방법은 이황화결합(-S-S-)을 통하여 유기 부분과 단백질, 펩티드 또는 아미노산 간의 공유 결합을 낳는다. 이 방법에서 티올을 포함하는 유기화합물은 친핵체(nucleophile)로 작용하는 반면에 단백질, 펩티드 또는 아미노산은 친전자체(electrophile)로 작용한다. 반대로, glyco-MTS 시약을 이용하는 기존의 반응은 단백질, 펩티드 또는 아미노산 내의 친핵성 티올 그룹과 친전자성 glyco-MTS 시약과의 반응과 관련된다. 본 발명의 방법은 따라서, glyco-MTS 시약을 이용하는 기존의 단백질 변형 전략에 상보적인 전략을 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 알킬은 바람직하게는, 1-10 탄소 원자, 더 바람직하게는 1-6 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지된(branched) 알킬 그룹을 나타낸다. 바람직한 알킬 그룹은 메틸 및 에틸을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 알케닐은 바람직하게는, 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는, 2-20 탄소 원자, 바람직하게는 2-10 탄소 원자, 보다 바람직하게는 2-6 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지된 탄화수소 그룹을 나타낸다. 바람직한 알케닐 그룹은 -(CH2)CH=CH2, -CH2CH2CH=CH2, 프레닐 ((CH3)2C=CHCH2-) 및 파네실((CH3)2C=CH[CH2CH2C(CH3)=CH]2CH2-)을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 알키닐은 바람직하게는, 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는, 2-10 탄소 원자, 바람직하게는 2-6 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지된 탄화수소 그룹을 나타낸다. 바람직한 알키닐 그룹은 -CH2C=CH 및 -CH2CH2C=CH을 포함한다.
R1이 선택적으로 치환된 부분을 나타내는 경우, 적절한 치환기는 화학식 1의 화합물의 형성 또는 첫 번째 또는 두 번째 방법에 따르는 이황화결합의 형성을 방해하지 않는 어떠한 치환기-예를 들어, -NO2, -SO3H, -CO2H, -(CH2CH2O)nH 및 -(CH2CH2O)nMe, 여기서, n은 1-100, 바람직하게는 1-50, 보다 바람직하게는, 1-20, 보다더 바람직하게는, 1-10을 나타낸다-를 포함한다. R1 그룹은 1-5, 바람직하게는 1 또는 2 치환기에 의하여 독립적으로 치환될 수 있다. R1 그룹은 또한, 고상 지지체(solid support)-예를 들어 폴리스티렌 수지와 같은 수지-에 선택적으로 부착되거나 그의 일부분을 이루기도 한다.
바람직한 R1 그룹은 페닐이다. 화학식 1의 화합물 내의 R1 그룹이 페닐 또는 또다른 방향족 그룹인 경우, 첫 번째 및 두 번째 방법에 따라 티올을 포함하는 화합물과의 반응 진행을, UV 광도계(UV spectroscopy)를 이용하여 모니터할 수 있다는 부가적인 이점이 있다. 그러므로, 예를 들어, PhSO2- chromophore는 약 265nm에서 최대 UV 스펙트럼을 나타낸다. PhSO2-부분은 화학식 1의 화합물 및 이황화결합 형성 반응의 부산물인 PhSO2 모두에 존재하지만, 연관된 소멸 상수(associated extinction coefficients)는 반응 진행이 UV를 이용하여 모니터될 수 있을 정도로 충분히 차이가 있다. 비슷하게, 본 발명의 세 번째 및 네 번째 방법은 R2가 페닐 또는 또다른 방향족 그룹일 경우, UV 광도계로 모니터될 수 있다.
화학식 1의 화합물에서, R 그룹은 유기 부분, 특히 단백질, 펩티드 또는 아미노산과 결합을 위하여 적합한 어떠한 유기 부분일 수 있다. R의 성질에 대한 특별한 제한은 없다. 예를 들어, -S-X- 그룹은 1차, 2차 또는 3차 일 수 있다. R은 방향족 또는 지방족일 수 있다. R 그룹은 예를 들어, 인산기(phosphoryl) 또는 황산기(sulfonyl) 치환기에 의하여 선택적으로 치환될 수 있다. X가 Se 인 경우, R은 단백질, 펩티드 또는 아미노산일 수 있으며, 이는 하나의 단백질, 펩티드 또는 아미노산을 다른 단백질, 펩티드 또는 아미노산과 이황화결합을 통하여 연결할 가능성을 부여한다.
바람직한 하나의 R 그룹은 파네실이다. 파네실화(Farnesylation)는 암유전자적(oncogenic) 단백질 Ras를 포함하는 많은 단백질과 연관되어 있는 자연적 번역 후 변형이다. 본 발명의 방법은 그러므로, 파네실화된 단백질, 펩티드 및 아미노산의 제조를 허여한다.
또한, 바람직하게, R은 링커를 통하여 -S-X- 그룹에 선택적으로 부착되는 탄수화물 부분이다. 링커는 탄수화물 부분과 -S-X- 그룹 사이의 1 내지 10 원자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 알킬렌 그룹(예로써, -(CH2)t- 그룹, 여기서 t 는 1 내지 10을 나타낸다), 또는 알케닐렌 그룹(예로써, -(CH2)CH=CH- 또는 -CH2CH2CH=CH- 그룹)일 수 있다. -S-X- 그룹이 당류 잔기의 아노머 위치에 있거나, 링커를 통하여 아노머 탄소에 부착되어 있는 화합물이 바람직하다.
적절한 탄수화물 부분(carbohydrate moiety)은 단당류, 올리고당류 및 다당류를 포함하며, 자연적으로 존재하는 당단백질 또는 생물학적 시스템에서 존재하는 어떠한 탄수화물 부분도 포함한다. 선택적으로 보호된 글리코실 또는 글리코시드 유도체, 예를 들어, 선택적으로 보호된 글루코실, 글루코시드, 갈락토실 또는 갈락토시드 유도체가 바람직하다. 글리코실 및 글리코시드 그룹은 α 및 β 그룹 모두를 포함한다. 적절한 탄수화물 부분은 글루코오스, 갈락토오스, 퓨코오스(fucose), GlcNAc, GalNAc, 시알릭산(silalic acid), 및 만노오스 및, 올리고당류 또는 적어도 하나의 글루코오스, 갈락토오스, 퓨코오스, GlcNAc, GalNAc, 시알릭산, 및/또는 만노오스 잔기를 포함하는 다당류를 포함한다.
탄수화물 부분에 있는 어떠한 작용 그룹도 당업계에 공지(예로써, Greene et al, "Protecting groups in organic synthesis", 2nd Edition, Wiley, New York, 1991 을 참조할 것. 여기에 개시된 내용은 이에 의하여 참조로 본 명세서 내에 삽입되어 있다)된 보호 그룹을 이용하여 선택적으로 보호될 수 있다. 탄수화물 부분에서 -OH 그룹을 위한 적절한 보호 그룹은 아세테이트 (Ac), 벤질 (Bn), 피볼릴(pivolyl, piv), 실릴 (예로써, tert-부틸디메틸실릴 (TBDMSi) 및 tert-부틸디페닐실릴 (TMDPSi)), 아세탈, 케탈, 및 메톡시메틸 (MOM)을 포함한다. 어떠한 보호 그룹도 아미노산, 펩티드 또는 단백질에 탄수화물 부분을 부착하기 전 또는 부착한 후에 제거될 수 있다.
특히 바람직한 탄수화물 부분은, Glc(Ac)4β-, Glc(Bn)4β-, Gal(Ac)4β-, Gal(Bn)4β-, Glc(Ac)4α(1,4)Glc(Ac)3α(1,4)Glc(Ac)4β-, β-Glc, β-Gal, α-Man, a-Man(Ac)4, Man(1,6)Manα-, Man(1-6)Man(1-3)Manα-, (Ac)4Man(1-6)(Ac)4Man(1-3)(AC)2Manα-, -Et-β-Gal,-Et-β-Glc, Et-α-Glc, -Et-α-Man, -Et-Lac, -β-Glc(Ac)2, -β-Glc(Ac)3, -Et-α-Glc(Ac)2, -Et-α-Glc(Ac)3, -Et-α-Glc(Ac)4, -Et-β-Glc(Ac)2, -Et-β-Glc(Ac)3, -Et-β-Glc(Ac)4, -Et-α-Man(Ac)3, -Et-α-Man(Ac)4, -Et-β-Gal(Ac)3, -Et-β-Gal(Ac)4 , -Et-Lac(Ac)5, -Et-Lac(Ac)6, -Et-Lac(Ac)7, 및 이들의 탈보호된 등가물을 포함한다.
바람직하게는, 자연적으로 존재하는 당으로부터 유래하는 탄수화물 부분을 구성하는 어떠한 당류 단위도 자연적으로 발생하는 각각의 거울상 이성질체 형태일 수 있으며, 이것은 D-형태 (예, D-glucose 또는 D-galactose) 또는 L-형태 (예, L-rhamnose 또는 L-fucose)일 수 있다. 아노머 위치의 결합은 α- 또는 2- 결합일 수 있다.
첫 번째 또는 두 번째 방법에 사용되는 티올 그룹을 포함하는 화합물은, 적어도 하나의 티올 그룹을 포함하는 어떠한 유기화합물일 수 있다. 상기 티올 그룹은 1차, 2차 또는 3차일 수 있다. 상기 화합물은 방향족 또는 지방족일 수 있다. 하나 이상의 티올 그룹이 화합물 내에 존재한다면, 이황화결합이 상기 각 티올 그룹에 잠재적으로 형성될 것이다.
바람직하게는, 상기 화합물은 아미노산, 펩티드 또는 단백질이다. 본 명세서 내에 사용된 바와 같이, 펩티드는 아미드 결합을 통하여 연결된 최소한 두 개의 아미노산 잔기를 가지고 있다. 상기 단백질, 펩티드 또는 아미노산에 포함된 어떠한 아미노산도 바람직하게는 α-아미노산이다. 어떠한 아미노산도 D- 또는 L-형태일 수 있으며, 바람직하게는, L-형태이다. 상기 아미노산, 펩티드 또는 단백질은 티올 그룹-예를 들어, 하나 이상의 시스테인 잔기의 존재에 기인하는-을 포함하는, 자연적으로 발생하는 어떠한 아미노산, 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 또는, 상기 아미노산, 펩티드 또는 단백질은 티올을 포함하지 않는 아미노산, 펩티드 또는 단백질 전구체의 화학적 변형에 의하여 제조될 수 있다. 또는, 티올을 포함하는 펩티드 또는 단백질은 위치 지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 통하여 시스테인 잔기가 도입되도록 제조될 수 있다. 위치 지정 돌연변이는 당업계에 알려진 공지의 기술이다(예로써, WO00/01712 및 J. Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Springs Harbour Laboratory Press, 2001을 참조할 것. 여기에 개시된 내용은 이에 의하여 참조로 본 명세서 내에 삽입되어 있다).
단백질은 바람직하게는, 효소-이것의 선별도(selectivity)는 본 발명에 따르는 방법과 시약을 이용하여 당화를 조절함으로써 변형될 수 있다- 및 의약 단백질을 포함한다. 바람직한 다른 단백질은 혈청 알부민 및 다른 혈액 단백질, 호르몬, 인터페론, 수용체, 항체, 인터루킨 및 에리트로포이에틴을 포함한다.
화학식 1의 화합물은 보통 티올 선택적(thiol-selective)이고, 그러므로 티올을 포함하는 유기화합물에서 다른 작용기 그룹의 존재가 보통 상기 반응을 방해하지 않는다는 사실을 발견하였다. 그러나, 어떤 다른 작용기 그룹도 당업계에 공지된 보호 그룹-이것은 반응 조건하에서 안정하다-을 이용하여 선택적으로 보호될 수 있다.
첫 번째 또는 두 번째 방법에서 이황화결합 형성 반응은 일반적으로 중성 또는 염기성 pH(약 pH 7 내지 약 9.5)-바람직하게는 약 염기성 pH(약 pH 8 내지 약 9)-에서 완충용액의 존재하에서 수행된다. 적절한 완충용액은 HEPES, CHES, MES 및 Tris를 포함한다. 상기 티올을 포함하는 화합물이 단백질, 펩티드 또는 아미노산이면, pH는 기술한 바대로 유지되어야 원치 않는 변성이 반응 과정 동안 (거의) 일어나지 않는다. 비슷하게, 상기 반응 온도는 어떠한 온도 민감성 화합물에도 어떠한 심각한 해를 끼치지 않도록 선택되어야 한다. 예를 들어, 단백질 또는 펩티드와의 반응이 바람직하게 주위 온도 또는 그 이하에서 어떠한 변성도 피하기 위하여 수행된다. 수용액 또는 유기 용매계가 사용될 수 있으나, 단백질, 아미노산 또는 펩티드의 용해를 확실히 하기 위하여 수용액 용매 계가 단백질, 아미노산 또는 펩티드의 반응에 바람직하다. 상기 반응은 일반적으로 꽤 신속하다. 예를 들어, 자주 1 시간 이하로 소요된다.
일반적으로, 화학식 1의 화합물이 과량-예를 들어, 티올을 포함하는 화합물에 기초하여 10-20 당량(equivalents)- 사용될 수 있다. 반대로, glyco-MTS 시약과 반응하려면, 약 30 당량을 사용하여야 하며, 이는 상기 시약의 비용을 부가한다.
화학식 1의 화합물-여기서 R은 탄수화물 부분을 나타내고, X는 SO2를 나타내고, R1은 페닐을 나타낸다-은 일반적으로, 이에 상응하는 glyco-MTS 화합물보다 염기성 조건에 좀더 안정하다는 사실을 발견하였다. 화학식 1의 어떠한 미반응 또는 과량의 화합물도 따라서, 재사용을 위하여 반응계로부터 자주 회수될 수 있으며, 이것은 R이 탄수화물 부분을 나타내는 경우에 특히 이점이 있다. 왜냐하면, 상기 화합물은 상대적으로 비싸고/ 또는 제조에 많은 시간이 소요되기 때문이다. 나아가, 화학식 1의 페닐티오설포네이트 화합물은 일반적으로 좀더 저렴하고 상응하는 MTS 화합물보다 제조가 용이하다.
화학식 1의 화합물은 많은 다른 방법에 의하여 제조될 수 있다.
X가 SO2를 나타내는 화합물은 화학식 2의 화합물과 화학식 3의 화합물을 반응시켜 제조할 수 있다.
[화학식 2]
M(SSO2R1)k
상기 식에서 M은 예를 들어, Li, Na, K, Ca, Cs, Zn, Mg 또는 Al, 바람직하게는 Na 또는 K 인 금속을 나타내고; 및
k는 1, 2 또는 3을 나타내고,
[화학식 3]
R-L
상기 식에서 R은 화학식 1의 화합물, L은 이탈그룹으로 정의된다.
어떠한 이탈그룹 L도 그 결과 생기는 음이온 L-가 상기 반응을 어떤 식으로든-예를 들어 생성물과 반응함으로써-과도하게 방해하지 않는다면 사용될 수 있다. 바람직한 이탈그룹 L은 할로 및 톨루엔설포네이트(tosylate), 메탄설포네이트(mesylate) 및 트리플루오로메탄설포네이트(triflate)와 같은 설포네이트, 특히 클로로 및 브로모를 포함한다.
화학식 3의 화합물은 상업적으로 시판되고 있거나 당업계에 공지된 방법-예를 들어, 일반적으로 할로-당(halo-sugars)의 형성방법 및 특히, 1-할로-당의 형성방법-을 이용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는, 화학식 3의 화합물은 글리코실 할라이드이다. 글루코오스와 갈락토오스에 기초하는 적합한 화학식 3의 화합물의 예는 일반적으로 아래에 나타나 있다.
Figure 112005515216504-PCT00004
여기서, 각 R5는 독립적으로 H, 당류 부분, 또는 Ac 또는 Bn과 같은 적절한 보호 그룹, 바람직하게는, 각 R5는 H를 나타내고;
R3 및 R4 중의 하나는 H, 다른 하나는 OH, O-보호 그룹 또는 O-당류 부분, 바람직하게는 H 또는 O-당류 부분; 및
t는 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 6, 보다 바람직하게는, 2 또는 3을 나타낸다.
상기 반응은 화학식 3의 화합물이 용해될 수 있는 어떠한 용매계에서도 수행될 수 있다. 바람직하게는, 화학식 2의 화합물은 또한 용매계에서 적어도 부분적으로 용해될 수 있다. 적절한 용매는 에탄올 및 메탄올과 같은 알칸올, N,N -디메틸포름아마이드 (DMF) 및 아세토니트릴을 포함하며, 아세토니트릴이 특히 바람직하다.
화학식 2의 화합물은 반응식 4에 나타난 바와 같이, 상응하는 설피니트 염(화학식 7)과 황(sulfur)을 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
[반응식 4]
M(SO2R1)k + S → M(SSO2R1)
7 2
결정체인 화학식 2의 화합물은 정제가 용이하여 특히 대규모 정제에 바람직하다.
화학식 7의 설피니트 염은 상업적으로 시판되는 것을 이용하거나(예로써, 소듐 벤젠설피니트), 당업계의 공지된 방법(예로써, JP 61205249, 및 M. Uchino et al, Chemical ＆ Pharmaceutical Bulletin, 1978, 26(6), 1837-45를 참조할 것. 여기에 개시된 내용은 이에 의하여 참조로 본 명세서 내에 삽입되어 있다)으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 상기 상응하는 티올레이트 염(thiolate salt) R1S-는 적절한 염기-예를 들어, 메틸리튬-를 이용하여 상기 상응하는 티올 화합물 R1SH의 deprotonation함으로써 제조될 수 있다. 티올레이트 염은 그 후 적절한 산화제-예를 들어, 2-(페닐설포닐)-3-페닐옥사지리딘-를 이용하여 상기 상응하는 설피니트 염으로 산화될 수 있다("Davis reagent", Sandrinelli et al, Organic Letters(1999), 1(8), 1177-1180, 여기에 개시된 내용은 이에 의하여 참조로 본 명세서 내에 삽입되어 있다).
또는, X가 SO2를 나타내는 화학식 1의 화합물은 반응식 5에 나타난 바와 같이, 화학식 8의 이황화결합을, 은 이온 존재하에서 설피니트 음이온인 R1SO2 -와 반응시켜 제조될 수 있다.
[반응식 5]
Figure 112005515216504-PCT00005
화학식 8의 이황화 화합물은 상업적으로 시판되는 것을 이용하거나, 당업계의 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
X가 Se인 화학식 1의 화합물은 화학식 5의 화합물과 화학식 6a 또는 6b의 화합물을 반응시켜 제조할 수 있다.
[화학식 5]
R-SH
상기 식에서, R은 화학식 1의 화합물로 정의된다.
[화학식 6a]
R1SeL2
[화학식 6b]
R1Se(OH)2
상기 식에서 R1은 화학식 1의 화합물로 정의된 바와 같다. L2는 이탈 그룹, 예를 들어 OH, Br, Cl, CN, 또는 Ⅰ, 바람직하게는 Br을 나타낸다. 상기 반응은 무수 디클로로메탄에서 수행될 수 있고 그 후 트리에틸아민의 첨가에 의하여 억제된다. 화학식 6a의 바람직한 화합물은 PhSeBr이고, 화학식 6b의 바람직한 화합물은 PhSe(OH)2 이다.
화학식 6의 화합물은 상업적으로 시판되는 것을 이용하거나(예로써, PhSeBr, PhSeCl, PhSeCN, 2-니트로페닐 셀레노시아네이트) 당업계에 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, MeSeBr는 참조(Hope, Eric G.; Kemmitt, Tim; and Levason, William, in Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2: Physical Organic Chemistry (1972-1999) (1987), (4), 487-90, 여기에 개시된 내용은 이에 의하여 참조로 본 명세서 내에 삽입되어 있다)의 방법에 따라 제조될 수 있다.
화학식 5의 화합물을 포함하여 적어도 하나의 티올 그룹을 포함하는 유기화합물은 상업적으로 시판되는 것을 이용하거나 당업계에 공지된 방법-예를 들어, 일반적으로 티올 화합물을 제조하는 방법, 및 특히 티오-당(thio-sugars)을 제조하는 방법-을 이용하여 제조될 수 있다.
예를 들어, 티오 당은 할로 당을 티오우레아(티오우레아)로 처리하여, 상응하는 이소티오우로늄 염(isothiouronium salt)을 만들고(W. A. Bonner, J. E. Kahn, J. Am. Chem. Soc. 1951, 73), 소듐 메타바이설피트로 온화하게 가수분해하여 상응하는 티올을 제공함으로써, 상응하는 할로 당으로부터 제조될 수 있다. 필요하다면, 적절한 보호그룹이 티오-당의 합성 동안 사용될 수 있다. 화학식 5의 화합물에서 R이 탄수화물 부분을 나타낼 경우, 티올 그룹은 상기 탄수화물 부분의 어느 위치에도 존재할 수 있다. 바람직하게는, 당류의 아노머 위치에 존재하거나 링커를 통하여 아노머 위치의 탄소에 붙어 있다. 글루코오스와 갈락토오스에 기초한 화학식 5의 적절한 화합물의 예는 일반적으로 아래에 나타나 있다.
Figure 112005515216504-PCT00006
여기서, 각 R5는 독립적으로 H, 당류 부분, 또는 Ac 또는 Bn과 같은 적절한 보호 그룹, 바람직하게는 각 R5는 H를 나타내고;
R3 및 R4 중의 하나는 H, 다른 하나는 OH, O-보호 그룹 또는 O-당류 부분, 바람직하게는 H 또는 O-당류 부분; 및
t는 2 내지 10, 바람직하게는 2 내지 6, 보다 바람직하게는, 2 또는 3을 나타낸다.
화학식 5의 화합물은 또한 본 발명의 네 번째 방법에서 티올을 포함하는 화합물로 적절하게 사용될 수 있다.
화학식 5의 화합물과 화학식 6의 화합물과의 반응에서, 화학식 5의 화합물에 있는 어떠한 다른 작용기 그룹도 보호되지 않을 수 있거나 당업계에 공지된 보호 그룹에 의하여 보호될 수 있다.
세 번째 또는 네 번째 방법에 따라 단백질, 펩티드 또는 아미노산 내 적어도 하나의 티올 그룹을 셀레닐설파이드 그룹으로 전환하는 것은 매우 선택적이다. 또한, 티올 포함하는 유기화합물과 셀레닐설파이드 그룹과의 반응은 매우 위치 선택적이다. 그러므로, 본 발명의 방법을 실행하면서 단백질, 펩티드 또는 아미노산 내부의 또는 티올 포함하는 유기화합물의 어떠한 다른 작용기 그룹을 보호하는 것이 일반적으로 필요한 것은 아니다. 이것은 생성물에 대해 수행되어야 하는, 후속하는 탈보호 과정에 대한 필요를 회피할 수 있기 때문에 매우 유익하다.
단백질, 펩티드 또는 아미노산이 하나 이상의 티올 그룹을 포함한다면, 그러한 각 티올 그룹은 상응하는 셀레닐설파이드 그룹으로 잠재적으로 전환될 것이다. 상기 각 셀레닐설파이드 그룹은 티올 포함하는 유기화합물과 잠재적으로 반응하여 이황화결합을 통하여 유기화합물을 여러 위치에서 단백질, 펩티드 또는 아미노산에 부착되게 할 것이다. 본 발명의 방법은 따라서, 여러 위치에서 단백질, 펩티드 또는 아미노산의 화학적 변형을 위한 편리한 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 방법은 여러 위치에서 단백질, 펩티드 또는 아미노산의 당화를 허용한다.
세 번째 또는 네 번째 방법에서 단백질, 펩티드 또는 아미노산의 티올 그룹을 셀레닐설파이드 그룹으로 전환하는 것은 상기 단백질, 펩티드 또는 아미노산을 화학식 10a 또는 10b의 화합물과 반응시킴으로써 편리하게 수행될 수 있다.
[화학식 10a]
R2SeL2
[화학식 10b]
R2Se(OH)2
여기서, L2는 OH, Br, CN, Cl 또는 Ⅰ와 같은 이탈그룹, 바람직하게는 Br을 나타내고; 및
R2는 선택적으로 치환된 알킬 그룹, 선택적으로 치환된 페닐 그룹, 선택적으로 치환된 벤질 그룹, 선택적으로 치환된 피리딜 그룹, 선택적으로 치환된 나프틸 그룹을 나타낸다. 바람직한 R2 그룹은 페닐이고, 바람직한 화학식 10a의 화합물은 PhSeBr 이며 바람직한 화학식 10b의 화합물은 PhSe(OH)2 이다.
R2 가 선택적으로 치환된 부분을 나타내는 경우, 적합한 치환기는 티올을 포함하는 단백질, 펩티드 또는 아미노산과의 반응을 방해하지 않는, 바람직하게는, 또한 단백질, 펩티드 또는 아미노산의 후속 반응-예를 들어, 티올 포함하는 유기화합물과의 반응-을 방해하지 않는 모든 치환기를 포함한다. 적합한 치환기로 -NO2, -SO3H, -CO2H, -(CH2CH2O)nH, 및 -(CH2CH2O)nMe 을 포함하며, 여기서 n은 1-100, 바람직하게는 1-50, 보다 바람직하게는 1-20, 보다 더 바람직하게는 1-10을 나타낸다. R2 그룹은 독립적으로 1-5, 바람직하게는 1 또는 2 치환기로 치환될 수 있다.
R2 그룹은 또한, 선택적으로 고상 지지체에 부착되거나 그 일부분을 형성할 수 있다. 예를 들어, 화학식 10a 또는 10b의 화합물은 아래에 나타난 바와 같이 폴리스티렌 수지와 같은 수지로부터 유도될 수 있다.
Figure 112005515216504-PCT00007
화학식 10a 및 10b의 화합물은 상업적으로 시판되는 것을 이용하거나 화학식6a 및 6b의 화합물에서 이전에 논의한 것과 같이 당업계에 공지된 방법으로 제조될 수 있다.
상기 각 티올 그룹을 상응하는 셀레닐설파이드 그룹으로 확실히 전환하기 위하여, 단백질, 펩티드 또는 아미노산에서 화학식 10a 또는 10b의 화합물의 티올 그룹 당 최소한 1몰 당량 이상이 사용되어야 한다. 상기 반응은 바람직하게는 수용성 용매(물과 아세토니트릴의 혼합물과 같은)에서 완충용액(예로써, MES, pH 9.5)의 존재하에서 수행된다. 상기 반응의 pH 및 온도는 단백질 또는 펩티드의 바람직하지 않은 변성을 피할 수 있도록 선택되어야 한다. 바람직하게는, 상기 반응은 약 염기성 pH(예로써, 약 pH 8 내지 약 pH 9.5)에서 상온 또는 그 이하에서 수행된다.
티올 그룹을 포함하는 유기화합물은 단백질, 펩티드 또는 아미노산과의 연결에 적합한 것이면 어떠한 유기화합물- 상기 유기화합물 내에서 티올 그룹의 황 원자가 친핵체로 작용하여 셀레닐설파이드 그룹과 반응할 수 있다-이어도 된다. 상기 유기화합물의 성질에 대한 특별한 제한은 없다. 예를 들어, 상기 티올 그룹은 1차, 2차 또는 3차일 수 있다. 상기 화합물은 방향족 또는 지방족일 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물은 알킬, 알케닐(예, 파네실) 또는 알키닐 티올일 수 있다. 바람직하게는, 상기 화합물은 하나의 티올 그룹만을 포함한다.
단백질, 펩티드 또는 아미노산과의 부착을 위한 적합한 유기 부분은, 단백질, 펩티드 또는 아미노산의 물리적 또는 화학적 성질을 변형하는데 유용한 모든 그룹을 포함한다. 적합한 부분은 표지(예로써, 형광 표지) 또는 단백질, 펩티드 또는 아미노산의 안정성, 프로세싱 또는 용해도에 도움이 되는 그룹을 포함한다. 상기 유기화합물은 또한 두 번째의 단백질, 펩티드 또는 아미노산으로서, 첫 번째 단백질, 펩티드 또는 아미노산을 본 발명의 방법을 이용함으로써 이황화결합을 통하여 다른 단백질, 펩티드 또는 아미노산에 연결할 가능성을 부여한다.
바람직하게는, 적어도 하나의 티올 그룹을 포함하는 상기 유기화합물은 파네실 부분이거나 이전에 정의된 탄수화물 부분으로서, 상기 티올(-S-H) 그룹에 링커를 통하여 연결되어 있다. 상기 링커는 탄수화물 부분과 -SH 그룹 사이에 1 내지 10 원자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 알킬렌 그룹(예로써, -(CH2)t-그룹, 여기서 t 는 1 내지 10을 나타낸다), 또는 알케닐렌 그룹(예로써, -(CH2)CH=CH- 또는 -CH2CH2CH=CH- 그룹)일 수 있다. 상기 티올 그룹이 당류 잔기의 아노머 위치에 있거나, 링커를 통하여 아노머 위치의 탄소(anomeric carbon)에 부착되어 있는 화합물이 바람직하다.
탄수화물 부분에 있는 작용기 그룹은 이전에 논의된 바와 같이 당업계에 공지된 보호 그룹을 이용하여 선택적으로 보호될 수 있다. 어떠한 보호 그룹도 아미노산, 펩티드 또는 단백질에 탄수화물 부분이 부착되기 전 또는 부착된 후에 제거될 수 있다. 바람직하게는, 연결 후의 탈 보호 과정(post-linkage deprotection step)에 대한 필요를 없애기 위하여 셀레닐설파이드 화합물과 반응하기 전에 제거될 수 있다. 본 발명의 당화 방법에 대한 추가적인 이점은, 보호되지 않은 탄수화물 부분을 아미노산, 펩티드 또는 단백질에 연결하도록 허용한다는 것이다.
네 번째 방법(예로써, 이황화결합 형성 반응)에 따라 티올 그룹을 포함하는 유기화합물과 셀레닐설파이드 그룹을 반응시키는 것은 일반적으로 중성 또는 염기성 pH(예로써, 약 pH 7 내지 약 pH 9.5)-바람직하게는 약 염기성 pH(예로써, 약 pH 8 내지 약 pH 9)-에서 완충용액의 존재하에 수행된다. 적절한 완충용액은 HEPES, CHES, MES 및 Tris를 포함한다. pH는 단백질 또는 펩티드의 원치 않는 변성이 반응 과정 동안 (거의) 일어나지 않도록 유지되어야 한다.
비슷하게, 상기 반응 온도는 어떠한 온도 민감성 화합물에도 어떠한 심각한 해를 끼치지 않도록 선택되어야 한다. 예를 들어, 단백질 또는 펩티드와의 반응이 바람직하게 주위 온도에서 또는 그 이하에서 어떠한 변성도 피하기 위하여 수행된다. 수용성 또는 유기 용매계가 사용될 수 있으나, 단백질, 아미노산 또는 펩티드의 용해를 확실히 하기 위하여 수용성 용매 계가 단백질, 아미노산 또는 펩티드의 반응에 바람직하다. 수용성 용매계가, 보호되지 않은 탄수화물 화합물을 유기화합물로 이용하도록 허용하기 때문에 또한 바람직하다. 상기 반응은 일반적으로 꽤 신속하다. 예를 들어, 자주 1 시간 이하로 소요된다.
일반적으로, 적어도 하나의 티올 그룹을 포함하는 유기화합물이 과량-예를 들어, 단백질, 펩티드 또는 아미노산에 기초하여 10-20 당량- 으로 사용될 수 있다. 그러나, 어떤 경우에는 1 몰 당량(mol equivalent) 정도로 사용될 수 있다. 탄수화물 화합물은 비싸고 대량으로 수득하기에 많은 시간이 소요될 수 있다. 그러므로, 적어도 하나의 티올 그룹을 포함하는 유기화합물이 탄수화물 화합물인 경우, 경제적인 이유로 최소한도로 가능한 당량수를 사용하는 것이 바람직하다. 단백질 당화 방법의 선행기술에서는 자주, 매우 과량-예를 들어, 대개 1000 당량 정도의-의 탄수화물 화합물을 사용할 필요가 있다(B. G. Davis, Curr. Opin. Biotechnol. 2003, 14, 379). 본 발명의 방법은 따라서, 선행기술의 방법보다 글리코실 화합물을 적은 당량으로 사용하도록 허용하는 이점이 있다.
본 발명을 후술하는 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바 이에 의하여 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.
일반적인 실험
녹는점은 코플러 핫블록(Kofler hot block )상에서 측정되었고, 보정되지 않았다. 양성자핵자기공명(δH) 스펙트럼 400 MHz 스펙트럼이 COSY를 이용하여 측정되었다. 탄소 핵자기공명(δC) 스펙트럼이 HMQC를 이용하여 측정되었다. 중복도(multiplicity)는 DEPT 서열(DEPT sequence)을 이용하여 측정되었다. 모든 화학적 이동(chemical shift)은 내부 표준으로 남은 용매를 이용하여 δ스케일 상에서 ppm으로 인용되었다.
적외선 스펙트럼 흡착의 최대치는 파장수(wavenumber, cm-1 )로 기록되었고, s(strong) 및 br(broad)로 분류되었다. 저해상도 질량 스펙트럼(low resolution mass spectra)이 언급된 바와 같이, 전자스프레이 이온화(electrospray ionisation, ESI)를 이용하거나, 화학적 이온화(NH3, CI) 기술을 이용하여 기록되었다. 고해상도 질량 스펙트럼은 언급된 바와 같이, 화학적 이온화(NH3, CI) 기술을 이용하거나, 전자스프레이 이온화(NH3, CI) 기술을 이용하거나, 필드 이온화(FI+)를 이용하여 기록되었다. M/z 값이 달톤으로 기록되고, 이것의 퍼센트 충만도 (percentage abundance)를 괄호 안에 넣어 기록하였다.
패스(path) 길이를 1dm 으로 하여 극성계(polarimeter)상에서 광학적 로테이션을 측정하였다. 농도는 g/100 mL로 주어진다.
얇은 막 크로마토그래피(t.l.c)는 머크사(Merck)의 Kieselgel 60F254 미리 코팅된 글래스백 플레이트(glassbacked plate) 상에서 수행되었다. 플레이트는 a UV 램프 (λmax = 254 또는 365 nm), 및/또는 암모늄 몰리브데이트 (5％ in 2M H2SO4) 또는 황산 (5％ in EtOH)를 이용하여 가시화되었다. 플래시 컬럼크로마토그래피는 Sorbsil C60 40/60 실리카를 이용하여 수행하였다. 디클로로메탄(DCM)은 칼슘 수산화물로부터 증류되었다. 아세톤은 무수 칼슘설페이트로부터 증류되었다. 남은 무수 용매는 플루카사(Fluka)로부터 구입하였다. '페트롤(Petrol)'은 40-60℃ 범위에서의 페트롤리움 에테르 끓음 분획은 말한다.
단백질 질량 분광 측정(Protein Mass spectrometry): 액체 크로마토그래피/질량 분광 측정은 Phenomenex Jupiter C5 컬럼 (150 x 2.1 mm x 5 μm)을 이용하여 Waters Alliance 2790 HPLC 에 연결된 Micromass LCT (ESI-TOF-MS) 상에서 수행하였다. 각각 0.5％ 포름산을 함유하고 있는 물(용매 A) 및 아세토니트릴(용매 B)을 0.2 ml min-1 유속으로 이동상으로 사용하였다. 농도 구배는 다음과 같이 계획되었다: 3분간 95％ A의 농도로 유지하고 전체 16분간 95％ A에서 100 ％ B로 농도구배를 하고 끝으로 2분간 100 ％ B로 유지한다(95％ A (3 min isocratic) to 100 ％ B after 16 min then isocratic for 2 min.).
상기 LCT의 전자스프레이 소스는 3 kV의 모세관(capillary) 전압 및 30 V의 콘(cone) 전압으로 작동되었다. 질소는 총 유속 400 l hr-1에서 분무(nebuliser) 및 데솔베이션 가스(desolvation gas)로 사용되었다. 미오글로빈(말의 심장에서 유래)은 상기 시스템의 민감도를 시험하기 위하여 조정 표준(calibration standard)으로 사용되었다.
실시예 1:(2,3,4,6-테트라- O -아세틸-β-D-글루코피라노실)-1-이소티오우로늄 브로마이드((2,3,4,6-Tetra- O -acetyl-β-D-glucopyranosyl)-1-isothiouronium bromide)
Figure 112005515216504-PCT00008
2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-글루코피라노실 브로마이드 (11.0 g, 26.4 mmol) 및 티오우레아(티오우레아) (3.10 g, 41.9 mmol)을 아르곤 하에서 무수 아세톤 (30 mL)에 녹이고, 60℃까지 가열하였다. 20 분 후에 하얀색 고체가 침전되었다. 침전물을 여과하여 제거하고, 여과물(filtrate)을 다시 환류하였다. 이 과정을 고체가 침전되지 않을 때까지 반복하였다. 상기 회색을 띤 흰색 결정(crystals)을 혼합하고 아세톤/페트롤로부터 재결정화 하여 표제 화합물(11.4 g, 76％)을 흰색 결정성 고체로 얻었다. mp 194-196℃ [Lit. 191℃ (H. Beyer, U. Schultz, Chem. Ber. 1954, 87, 78)]; [α]D 25-5.6 (c, 1.0 in H2O) [Lit. [α]D 25-7.6 (c, 1.4 in H2O) (W. A. Bonner, J. E. Kahn, J Am Chem Soc, 1951, 73, 2241)]; δH (400 MHz, DMSO-d6) 1.97, 2.00, 2.02, 2.06 (12H, 4 x s, 4 x CH3), 4.06-4.25 (3H, m, H-5, H-6, H-6'), 5.07-5.12 (2H, m, H-2, H-4), 5.31 (1H, at, J 9.5 Hz, H-3), 5.77 (1H, d, J 1,2 9.9 Hz, H-1), 9.13 (2H, brs, NH2), 9.29 (2H, brs, NH2)
실시예 2: 1-티오-2,3,4,6-테트라- O -아세틸-β-D-글루코피라노스(1-Thio-2,3,4,6-tetra- O -acetyl-β-D-glucopyranose)
Figure 112005515216504-PCT00009
(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-글루코피라노실)-1-이소티오우로늄 브로마이드 (9.0 g, 18.8 mmol) 및 Na2S2O5 (4.93 g, 26.0 mmol)를 DCM (150 mL) 및 물(70 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 아르곤 하에서 가열하여 환류시켰다. 1.5 시간 후 상기 반응을 실온(RT)으로 냉각시키고 상 분리하였다. 수용액 층을 DCM (3 x 50 mL)으로 재추출하였다. 혼합된 유기층을 물(50 mL)로 세척하고 MgSO4로 건조 후 여과하고 진공에서(in vacuo) 용매를 제거하여 표제 화합물(6.14 g, 90％)을 흰색 고체로 얻었다. mp 112-114℃ [Lit. 113-114℃ (R. J. Ferrier, R. H. Furneaux, Carbohydr. Res. 1977, 57, 73)]; [α]D 24+6.3 (c, 1.2 in CHCl3) [Lit. [α]D 20+5.0 (c, 1.1 in CHCl3) (R. J. Ferrier, R. H, Furneaux, Carbohydr. Res. 1977, 57, 73)]; δH (400 MHz, CDCl3) 1.99, 2.00, 2.05, 2.06 (12H, 4 x s, 4 x CH3), 2.30 (1H, d, J 1,SH 10.2 Hz, SH), 3.71 (1H, ddd, J 4,5 10.0 Hz, J 5,6' 2.4 Hz, J 5,6? 4.7 Hz, H-5), 4.10 (1H, dd, J 6,6' 12.3 Hz, H-6), 4.22 (1H, dd, H-6'), 4.53 (1H, at, J 9.9 Hz, H-1), 4.95 (1H, at, J 9.5 Hz, H-2), 5.08 (1H, at, J 9.8 Hz, H-4), 5.17 (1H, at, J 9.4 Hz, H-3)
실시예 3: (2,3,4,6-테트라- O -아세틸-β-D-갈락토피라노실)-1-이소티오우로늄 브로마이드((2,3,4,6-Tetra- O -acetyl-β-D-galactopyranosyl)-1-isothiouronium bromide)
Figure 112005515216504-PCT00010
2,3,4,6-테트라-O-아세틸-D-β-갈락토피라노실 브로마이드 (5.4 g, 13.0 mmol) 및 티오우레아 (1.25 g, 16.8 mmol)을 아르곤 하에서 무수 아세톤(40 ml)에 녹이고 60℃ 까지 가열하였다. 1 시간 후 상기 반응을 실온으로 냉각하고 상기 반응 잔여물을 여과한 후 아세톤/페트롤로부터 재결정화하여 표제 화합물(4.6 g, 70％, 2 steps)을 흰색 결정성 고체로 얻었다. mp 134-137℃[Lit. 170℃ from isopropanol (W. A. Bonner, J. E. Kahn, J Am Chem Soc 1951, 73, 2241)];[α]D 25 +40.4 (c, 1.0 in H2O) [Lit. [α]D 25 +16.0 (c, 1.6 in EtOH, (W. A. Bonner, J. E. Kahn, J Am Chem Soc 1951, 73, 2241)); δH (500 MHz, DMSO-d6) 1.96, 2.02, 2.09, 2.15 (12H, 4 x s, 4 x CH3) 4.06-4.13 (2H, m, H-6, H-6'), 4.45 (1H, t, J 6.2 Hz, H-5), 5.12 (1H, at, J 9.9 Hz, H-2), 5.24 (1H, dd, J 2,3 10.0 Hz, J 3,4 3.6 Hz, H-3), 5.39 (1H, d, J 3,4 3.1 Hz, H-4), 5.71 (1H, d, J 1,2 10.2 Hz, H-1), 9.12, 9.36 (2 x 2H, 2 x brs, 2 x NH2)
실시예 4: 1-티오-2,3,4,6-테트라- O -아세틸-β-D-갈락토피라노스(1-Thio-2,3,4,6-tetra- O -acetyl-β-D-galactopyranose)
Figure 112005515216504-PCT00011
(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실)-1-이소티오우로늄 브로마이드 (4.4 g, 8.8 mmol) 및 Na2S2O5 (2.02 g, 10.6 mmol)을 DCM (60 mL) 과 물(30 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 아르곤 하에서 환류시켰다. 2.5 시간 후에 상기 반응을 실온으로 냉각하고 상 분리하였다. 수용액 층은 DCM(3 x 50 mL)로 재추출하였다. 혼합된 유기층을 물(100 mL), 소금물(100 mL)로 세척하고 MgSO4로 건조 후 여과하고 진공에서(in vacuo) 용매를 제거하여 표제 화합물(2.65 g, 81％)을 흰 색 고체로 얻었다. mp 83-84℃ [Lit. 86.5-88℃ (J. Frgala, M. Cerny, J. Stanek, Collect. Czech. Chem. Commun. 1975, 40, 1411)]; [α]D 24 +30.1 (c, 1.0 in CHCl3) [Lit. [α]D 19 +32.0 (c, 3.5 in CHCl3) (J. Frgala, M. Cerny, J. Stanek, Collect. Czech. Chem. Commun. 1975, 40, 1411)]; δH (400 MHz, CDCl3) 1.99, 2.06, 2.10, 2.17 (12H, 4 x s, 4 x CH3), 2.38 (1H, d, J 1,SH 10.3 Hz, SH), 3.95 (1H, dt, J 4,5 1.2 Hz, J 5,6 6.6 Hz, J 5,6' 6.6 Hz, H-5), 4.09-4.14 (2H, m, H-6, H-6'), 4.53 (1H, at, J 9.9 Hz, H-1), 5.02 (1H, dd, J 2,3 10.1, J 3,4 3.4 Hz, H-3), 5.19 (1H, at, J 10.0 Hz, H-2), 5.44 (1H, at, dd, J 3,4 3.7 Hz, J 4,5 1.2 Hz, H-4)
실시예 5: (3,4,6-트리- O -아세틸-2-아세트아미노-2-디옥시-β-D-글루코피라노실)-1-이소티오우로늄 클로라이드((3,4,6-Tri- O -acetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-1-isothiouronium chloride)
Figure 112005515216504-PCT00012
3,4,6-트리-O-아세틸-2-아세트아미노-2-디옥시-α-D-글루코피라노소일 클로라이드 (3.0 g, 8.2 mmol) 및 티오우레아 (1.21 g, 14.6 mmol)을 아르곤 하에서 무수 아세톤 (25 mL)에 녹이고 60℃ 까지 가열하였다. 2 시간 후에 하얀색 고체가 침 전되었다. 침전물을 여과하여 제거하고, 여과물을 다시 환류하였다. 이 과정을 고체가 침전되지 않을 때까지 반복하였다. 상기 회색을 띤 흰색 결정(crystals)을 혼합하고 아세톤/페트롤로부터 재결정하여 표제 화합물(2.19 g, 61％)을 흰색 결정성 고체로 얻었다. mp 134-137℃ [Lit. 179-181℃ from EtOH (D. Horton, M. L. Wolfrom, J. Org. Chem. 1962, 27, 1794)]; [α]D 25 -25.2 (c, 1.0 in H2O) [Lit. [α]D 25 -29.3 (c, 1.1 in MeOH) (D. Horton, M. L. Wolfrom, J. Org. Chem. 1962, 27, 1794)]; δH (400 MHz, DMSO-d6) 1.80 (3H, s, NHCOCH 3), 1.94, 1.98, 2.08 (9H, 3 x s, 3 x CH3), 4.05 (1H, dd, J 5,6 2.4 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6), 4.17 (1H, dd, J 5,6' 5.0 Hz, J 6,6' 12.3 Hz, H-6'), 4.26 (1H, ddd, J 4,5 10.2 Hz, J 5,6 2.3 Hz, J 5,6' 4.7 Hz, H-5), 4.93 (1H, at, J 9.9 Hz, H-4), 5.12 (1H, at, J 9.9 Hz, H-3), 5.73 (1H, d, J 1,2 10.4 Hz, H-1), 8.48 (1H, d, J 4.7 Hz, NHAc), 9.13 (2H, brs, NH2), 9.29 (2H, brs, NH2)
실시예 6: 1-티오-3,4,6-트리- O -아세틸-2-아세트아미도-2-디옥시-β-D-글루코피라노스(1-Thio-3,4,6-tri- O -acetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranose)
Figure 112005515216504-PCT00013
(3,4,6-트리-O-아세틸-2-아세트아미도-2-디옥시-β-D-글루코피라노실)-1-이소티오우로늄 클로라이드 (1.75 g, 39.8 mmol) 및 Na2S2O5 (0.91 g, 4.8 mmol) 을 DCM (30 mL)과 물 (15 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 아르곤 하에서 환류시켰다. 2 시간 후에 상기 반응을 실온으로 냉각하고 상 분리하였다. 수용액층은 DCM (2 x 50 mL)으로 재추출하였다. 혼합된 유기층을 물(50 mL), 소금물(50 mL)로 세척하고 MgSO4로 건조 후 여과하고 진공에서(in vacuo) 용매를 제거하였다. EtOAc/페트롤로부터 재결정하여 표제 화합물(1.00 g, 68％)을 흰색 고체로 얻었다. mp 165-167℃ [Lit. 167-168℃ (W. M. zu Reckendorf, W. A. Bonner, J. Org. Chem. 1961, 26, 4596)]; [α]D 25 -24.8 (c, 1.0 in CHCl3) [Lit. [α]D 25 -14.5 (c, 0.9 in CHCl3) (W. M. zu Reckendorf, W. A. Bonner, J. Org. Chem .1961, 26, 4596)]; δH(400 MHz, CDCl3) 1.99, 2.03, 2.05, 2.10 (12H, 4 x s, 4 x CH3), 2.57 (1H, d, J 1,SH 9.2 Hz, SH), 3.67 (1H, ddd, J 4,5 9.7 Hz, J 5,6 4.8 Hz, J 5,6' 2.3 Hz, H-5), 4.09-4.17 (2H, m, H-2, H-3), 4.24 (1H, dd, J 5,6 4.8 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6), 4.59 (1H, at, J 9.8 Hz, H-1), 5.06-5.15 (2H, m, H-4, H-6'), 5.72 (1H, d, J 9.2 Hz, NH)
실시예 7: 1-티오-β-D-갈락토피라노스(1-Thio-β-D-galactopyranose)
Figure 112005515216504-PCT00014
1-티오-2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노스 (3.00 g, 7.3 mmol) 및 NaOMe (40 mg, 0.73 mmol)을 교반된 MeOH (40 ml) 용액에 첨가하였다. 2 시간 후에, 출발물질(Rf 0.5)이 완전히 소비됨과 함께, t.l.c. (EtOAc/petrol 1:1)가, 생성물(Rf 0.0)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응은 Dowex®-50 이온 교환 수지의 첨가로 중화되었고, 이 시점에서 상기 반응물을 여과한 후 진공에서 (in vacuo) 농축하였다. MeOH/EtOAc로부터 재결정화하여 표제 화합물(1.41 g, 98％)을 흰색 결정성 고체로 얻었다. m.p. 100-102℃; [α]D 22 +47.6 (c, 1.0 in MeOH; δH (400 MHz, CD3OD), 2.62 (1H, d, J 1,SH 8.3 Hz, SH), 3.47-3.49 (2H, m, H-2, H-3), 3.57 (1H, at, J 5.9 Hz, H-5), 3.68 (1H, dd, J 5,6 5.0 Hz, J 6,6' 11.4 Hz, H-6), 3.75 (1H, dd, J 5,6' 6.9 Hz, J 6,6' 11.5 Hz, H-6'), 3.91 (1H, bs, H-4), 4.37 (1H, bd, J 7.7 Hz, H-1); δC (100 MHz, CD3OD), 61.6 (t, C-6), 69.6 (d, C-4), 74.4, 74.8 (2 x d, C-2, C-3), 80.1 (d, C-5), 81.4 (d, C-1); m/z (ES-) 196 (100％, M-H+); m/z HRMS (ES-) C6H12O5S의 경우, (M-H+) 계산값 195.0327, 실험값 195.0323.)
실시예 8: 1-티오-2-아세트아미도-2-디옥시-β-D-글루코피라노스 (1-Thio-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranose)
Figure 112005515216504-PCT00015
3,4,6-트리-O-아세틸-2-아세틸아미노-2-디옥시-β-D-글루코피라노실 티올(400 mg, 0.98 mmol) 및 sodium methoxide (18 mg, 0.03 mmol)을 교반된 MeOH(10 ml) 용액에 첨가하였다. 30 분 후에, 출발물질(Rf 0.2)이 완전히 소비됨과 함께, t.l.c. (ethyl acetate)가 생성물(Rf 0.0)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응은 Dowex®-50 이온 교환 수지의 첨가로 중화되었고, 이 시점에서 상기 반응물을 여과한 후 진공으로(in vacuo) 농축하였다. methanol/ethyl acetate 로부터 재결정화하여 표제 화합물(230m g, 98％)을 흰색 결정성 고체로 얻었다. m.p. 85-88℃ [Lit. 86-88℃]18; [α]D 22 -10.4 (c, 1.0 in MeOH) [Lit. [α]D 25 +177.1 (c, 1.45 in CHCl3)]18; δH (400 MHz, MeOH), 2.00 (3H, s, CH3), 3.27-3.37 (2H, m, H-4, H-5), 3.42 (1H, at J 9.1 Hz, H-3), 3.64-3.73 (2H, m, H-2, H-6), 3.87 (1H, dd, J 5,6 2.1 Hz, J 6,6' 12.0 Hz, H-6'), 4.56 (1H, d, J 1,2 10.0 Hz, H-1), 8.11 (1H, bd, J NH,2 9.1 Hz, NH)
실시예 9:1,2,3,6-테트라- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,4,6- 테트라- O -아세틸-α- O -글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-D-글루코퍼라노스(1,2,3,6-tetra- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,4,6-tetra- O -acetyl-α- O -glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-D-glucopyranose)
Figure 112005515216504-PCT00016
소듐 아세테이트 (700 mg, 8.3 mmol)를 아세틱 안히드리드(acetic anhydride)(50 mL)에 가하여 환류시키고, 이 시점에서 말토트리오스 (3.00 g, 6.0 mmol)를 첨가하여 세게 저어준다. 90 분 후에 t.l.c. (petrol:ethyl acetate, 1:2)가, 출발물질(Rf 0.0)이 완전히 소비됨과 함께, 생성물(Rf 0.3)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응은 실온으로 냉각 후 DCM(50 mL)으로 희석하여 물(100 mL)로 분배(partition)되었다. 상을 분리하여 수용액 층을 DCM (2 x 50 mL)으로 재추출하였다. 혼합된 유기층을 pH가 8이 될 때까지 sodium hydrogen carbonate (400 mL 의 포화 수용액) 및 소금물(200 mL)로 세척하고 건조(MgSO4)한 후 여과하여 진공으로 농축하고 표제 화합물을 아노머 혼합물(α/β, 2/11)인 무정형의 흰색 고체로 얻었다. β 화합물의 경우: δH(500 MHz, CDCl3) 2.05, 2.07, 2.10, 2.14, 2.15, 2.19, 2.21, 2.27 (30H, 8 x s, 10 x OAc), 3.92 (1H, ddd, J 4,5 9.5 Hz, J 5,6 2.9 Hz, J 6,6 4.1 Hz, H-5a), 3.95-4.01 (3H, m, H-4b, H-5b, H-5c), 4.05 (1H, at, J 9.1 Hz, H-4a), 4.09 (1H, dd, J 5,6 2.5 Hz, J 6,6' 12.7 Hz, H-6c), 4.21 (1H, dd, J 5,6 3.4 Hz, J 6,6' 12.6 Hz, H-6b), 4.29 (1H, dd, J 5,6 3.4 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6'c), 4.35 (1H, dd, J 5,6 4.3 Hz, J 6,6' 12.3 Hz, H-6a), 4.48-4.52 (2H, m, H-6'a, H-6'b), 4.78 (1H, dd, J1,2 4.1 Hz, J 2,3 10.3 Hz, H-2b), 4.90 (1H, dd, J 1,2 4.1 Hz, J 2,3 10.6 Hz, H-2c), 5.01 (1H, dd, J 1,2 8.0 Hz, J 2,3 9.0 Hz, H-2a), 5.11 (1H, at, J 10.1 Hz, H-4c), 5.31 (1H, d, J 1,2 3.9 Hz, H-1b), 5.32-5.44 (3H, m, H-3a, H-3b, H-3c), 5.45 (1H, d, J 1,2 4.1 Hz, H-1c), 5.79 (1H, d, J 1,2 8.2 Hz, H-1a); α 화합물만의 선별된 데이타: δH (500 MHz, CDCl3) 2.08, 2.09, 2.12, 2.18, 2.21, 2.23, 2.26 (30H, 8 x s, 10 x OAc), 5.07 (1H, at, J 9.9 Hz), 6.28 (1H, d, J 1,2 3.8 Hz, H-1a)) 남아 있는 시그널은 다음의 여러 영역(3.85-3.89, 3.90-3.98, 3.99-4.07, 4.15-4.18, 4.23-4.27, 4.29-4.32, 4.43-4.49, 4.74-4.76, 4.84-4.87, 4.98-4.94, 5.25-5.54) 내에 있다; m/z (ES+) 984 (MNH4 +, 30％), 989 (MNa+, 100％); m/z HRMS (ES+) C40H58O27N (MNH4 +)의 경우, 계산값 984.3196, 실험값 984.3199.
실시예 10: 2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α- O -글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-a-D-글루코피라노실 브로마이드(2,3,6-Tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,4,6-tetra- O - acetyl-α- O -glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-a-D-glucopyranosyl bromide)
Figure 112005515216504-PCT00017
1,2,3,6-테트라-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-D-글루코피라노스 (200 mg, 0.21 mmol)을 무수 DCM (5 mL)에 녹였다. 여기에 브롬화수소 (33％ in acetic acid, 2 mL)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 아르곤 하에 두었다. 30 분 후, t.l.c. (petrol:ethyl acetate, 1:2)가, 출발물질(Rf 0.3)이 완전히 소비됨과 함께 생성물(Rf 0.6)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응 혼합물은 DCM(10 mL) 및 물(10 mL) 사이에서 분배(partition)되었고, 수용액 층을 DCM (3 x 10 mL)으로 재추출하였다. 혼합된 유기층을 pH가 8이 될 때까지 탄산수소나트륨(20 mL의 포화 수용액) 및 소금물(20 mL)로 세척하고 건조(MgSO4)한 후 여과하여 진공으로 농축하고 표제 생성물(203 mg, 98％)을 흰색 거품 형태로 얻었다. [α]D 22 +152.2 (c, 1.0 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3) 2.03, 2.05, 2.06, 2.08, 2.10, 2.13, 2.18, 2,21 (30H, 10 x COCH3), 3.93-3.99 (3H, m, H-4b, H-5a, H-5b), 4.05-4.10 (2H, m, H-4c, H-6a), 4.20 (1H, dd, J 5,6 1.8 Hz, J 6,6' 12.2 Hz, H-6b), 4.26-4.34 (2H, m, H- 5c, H-6a'), 4.35 (1H, dd, J 5,6 3.5 Hz, J 6,6' 12.7 Hz, H-6c), 4.52 (1H, dd, J 5,6 0.6 Hz, J 6,6' 12.2 Hz, H-6b'), 4.57 (1H, dd, J 5,6 2.1 Hz, J 6,6, 12.4 Hz, H-6c''), 4.74 (1H, dd, J 1,2 4.1 Hz, J 2,3 9.9 Hz, H-2c), 4.78 (1H, dd, J 1,2 4.2 Hz, J 2,3 10.2 Hz, H-2b), 4.88 (1H, dd, J 1,2 4.0 Hz, J 2,3 10.5 Hz, H-2a), 5.10 (1H, at, J 9.7 Hz, H-4a), 5.32 (1H, d, J 1,2 4.0 Hz, H-1b), 5.39 (1H, at, J 9.9 Hz, H-3q), 5.43-5.46 (1H, m, H-3b), 5,45 (1H, d, J 1,2 3.8 Hz, H-1a), 5.64 (1H, at, J 9.5 Hz, H-3c), 6.53 (1H, d, J 1,2 3.9 Hz, H-1c)
실시예 11: 1-티오-2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α- O -글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-β-D-글루코피라노스(1-Thio-2,3,6-Tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,4,6-tetra- O -acetyl-α- O -glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranose)
Figure 112005515216504-PCT00018
2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실브로마이드 (2.10 g, 2.10 mmol)을 무수 아세톤 (60 mL)에 녹였다. 여기에 무수 티오우레아 (315 mg, 4.2 mmol)를 첨가한 후 환류시까지 아르곤 대기 하에서 가열하였다. 6.5 시간 후 t.l.c. (petrol:ethyl acetate, 1:2) 가, 출발물질(Rf 0.3)이 완전히 소비됨과 함께 생성물(Rf 0.0)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응물은 진공으로 농축하고 과량의 티오우레아로부터 유기물을 제거하기 위하여 DCM으로 추출하였다. 여과물을 진공으로 농축하고 잔여물을 컬럼 플래시 크로마토그래피(ethyl acetate/methanol, 9:1)로 정제하여 특성화 과정 없이 수행된 중간체 2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-β-D-글루코피라노실-1-이소티오우로늄 브로마이드(1.14g, 50％) 를 얻었다. 이 중간체(100 mg, 0.09 mmol) 및 Na2S2O5 (22 mg, 0.11 mmol)는 DCM (30 mL) 및 물 (15 mL)의 혼합물에 첨가되었다. 상기 혼합물을 아르곤 하에서 환류시켰다. 2.5 시간 후, t.l.c. (petrol:ethyl acetate, 1:2)가, 출발물질(Rf 0.0)이 완전히 소비됨과 함께 생성물(Rf 0.4)이 형성됨을 나타내었다. 이 시점에서 반응을 실온으로 냉각시키고 상 분리하였다. 상기 반응은 실온으로 냉각 후 DCM(50 mL)으로 희석하여 물(100 mL)로 분배(partition)되었다. 수용액 층을 DCM (2 x 20 mL)으로 재추출하였다. 혼합된 유기층을 소금물(20 mL)로 세척하고 건조(MgSO4)한 후 여과하고 용매를 진공으로 제거하여 표제 생성물(74 mg, 84％)을 무정형의 흰색 고체로 얻었다. [α]D 22 +99.5 (c, 1.0 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3) 1.99, 2.00, 2.01, 2.02, 2.03, 2.05, 2.10, 2.15, 2.18 (30H, 9 x s,10 x COCH3), 3.72-3.76 (1H, m, H-5a), 3.90-4.00 (4H, m, H-4a, H-4b, H-5b, H-5c), 4.05 (1H, dd, J 5,6 2.2 Hz, J 6,6' 12.3 Hz, H-6c), 4.17 (1H, dd, J 5,6 3.3 Hz, J6,6' 12.3 Hz, H-6b), 4.25 (1H, dd, J 5,6 3.6 Hz, J 6,6' 12.5 Hz, H-6c', 4.30 (1H, J 5,6 4.3 Hz, J 6,6' 12.2 Hz, H-6c), 4.44 (1H, dd, J 5,6 2.2 Hz, J 6,6' 12.1 Hz, H-6a', 4.46 (1H, dd, J 5,6 2.2 Hz, J 6,6' 12.2 Hz, H-6b'), 4.59 (1H, d, J 1,2 9.7 Hz, H-1a), 4.74 (1H, dd, J 1,2 4.1 Hz, J 2,3 10.6 Hz, H-2b), 4.80 (1H, at, J 9.0 Hz, H-2a), 4.85 (1H, dd, J 1,2 4.1 Hz, J 2,3 10.6 Hz, H-2c), 5.07 (1H, at, J 9.9 Hz, H-4c), 5.25 (1H, at, J 9.0 Hz, H-3a), 5.26 (1H, d, J 1,2 4.1 Hz, H-1b), 5.35 (1H, at, J 10.0 Hz, H-3b), 5.37-5.41 (2H, m, H-1c, H-3c)
실시예 12: 1-티오아세틸-2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α- O -글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-β-D-글루코피라노스 (1-Thioacetyl-2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,4,6-tetra- O -acetyl-α- O -glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranose)
Figure 112005515216504-PCT00019
2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-β-D-글루코피라노실브로마이드(11.2 g, 11.6 mmol) 및 포타슘 티오아세테이트 (3.96 g, 34.8 mmol)를 무수 THF(40 ml)에 현탁하고 비활성 아르곤 대기 하에서 환류시까지 가열하였다. 14 시간 후, t.l.c. (petrol/EtOAc, 1:2)가, 출발물질(Rf 0.45)을 완전히 소비함에 따라 주 생성물(Rf 0.4)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 물(80 mL)로 희석하고 실온으로 냉각하였다. 상을 분리하고 수용액 층을 DCM (3 x 40 mL)으로 재추출하였다. 혼합된 유기층을 포화 NaHCO3 (50 mL), 소금물(50 mL)로 pH가 8이 될 때까지 세척하고, MgSO4로 건조 후 여과하여 진공에서 농축하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol/EtOAc, 1:4)로 정제하여 표제 화합물(8.08 g, 71％)을 흰색 거품 형태로 얻었다. [α]D 25 +86.4 (c, 1.0 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3) 2.01, 2.02, 2.05, 2.08, 2.11, 2.17 (27H, 6 x s, 9 x OAc), 2.40 (3H, s, SAc), 3.88 (1H, ddd, J 4,5 9.8 Hz, J 5.6 4.0 Hz, J 5,6' 2.7 Hz, H-5a), 3.92-4.01 (4H, m, H-4a, H-4b, H-5b, H-5c), 4.07 (1H, dd, J 5,6 2.4 Hz, J 6,6' 12.3 Hz, H-6c), 4.19 (1H, dd, J 5,6 3.5 Hz, J 6,6' 12.2 Hz, H-6b), 4.27 (1H, dd, J 5,6' 3.8 Hz, J 6,6' 12.3 Hz, H-6'c), 4.30 (1H, dd, J 5,6 4.2 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6a), 4.46 (1H, dd, J 5,6' 2.6 Hz, J 6,6' 12.3 Hz, H-6'b), 4.47 (1H, dd, J 5,6' 2.2 Hz, J 6,6' 12.2 Hz, H-6'a), 4.76 (1H, dd, J 1,2 3.9 Hz, J 2,3 10.0 Hz, H-2b), 4.87 (1H, dd, J 1,2 3.8 Hz, J 2,3 10.6 Hz, H-2c), 5.99 (1H, dd, J 1,2 10.3 Hz, J 2,3 9.1 Hz, H-2a), 5.08 (1H, at, J 9.9 Hz, H-4c), 5.27 (1H, d, J 1,2 4.0 Hz, H-1b), 5.31 (1H, d, J 1,2 10.0 Hz, H-1a), 5.33-5.43 (4H, m, H-1c, H-3a, H-3b, H-3c); δc (125 MHz, CDCl3) 20.7, 20.8, 20.9, 21.0, 21.1 (5 x q, 10 x COCH3, SCOCH3), 31.0 (q, SCOCH3) 61.9 (t, C-6c), 62.7 (t, C-6b), 63.3 (t, C-6a), 68.4 (d, C-4c), 69.0 (d, C-5b), 69.5 (d, C-5c), 69.8 (d, C-3c), 70.3 (d, C-2a), 70.5 (d, C-2c), 70.9 (d, C-2a), 72.1 (d, C-3b), 73.0 (d, C-4b), 74.1 (d, C-4a), 76.6 (d, C-3a), 76.9 (d, C-5a), 80.2 (d, C-1a), 96.1 (d, C-1c), 96.4 (d, C-1b), 169.4, 169.6, 169.8, 169.9, 170.3, 170.5, 170.6 (7 x s, 10 x COCH3), 196.0 (s, SCOCH3); m/z (ES+) 1000 (MNH4 +, 60％), 1003(MNa+, 100％)
실시예 13: 1-티오-β-D-말토트리오스(1-Thio-β-D-maltotriose)
Figure 112005515216504-PCT00020
1-티오아세틸-2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-1-티오-β-D-글루코피라노스 (600 mg, 0.6 mmol) 및 NaOAc (18 mg, 0.18 mmol)을 교반된 MeOH (10 ml)용액에 첨가하였다. 10분 후 t.l.c. (EtOAc/MeOH, 9:1)가, 출발물질(Rf 0.9)을 완전히 소비하는 것과 함께 생성물(Rf 0.0)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응은 Dowex®-50 이온 교환 수지의 첨가로 중화되었고, 이 시점 후에 상기 반응물을 여과한 후 진공으로(in vacuo) 농축하여 표제 화합물(305 mg, 98％)을 무정형 고체로 수득하였다. [α]D 25 +123 (c, 1.0 in MeOH); δH (400 MHz, D2O), 3.15 (1H, at, J 9.2 Hz, H-2a), 3.26 (1H, at, J 9.3 Hz), 3.41-3-82 (16H, m, H-2b, H-2c, H-3a, H-3b, H-3c, H-4a, H-4b, H-4c, H-5a, H-5b, H-5c, H-6a, H-6b, H-6c, H-6'a, H-6'b, H-6'c), 4.42 (1H, d, J 1,2 9.6 Hz, H-1a), 5.23 (1H, d, J 1,2 1.7 Hz, H-1), 5.24 (1H, d, J 1,2 1.8 Hz, H-1); δC (100 MHz, D2O), 60.8, 70.0 (2 x t, C-6a, C-6b, C-6c), 69.6, 71.5, 71.8, 72.1, 73.0, 73.2, 73.6, 76.0, 77.1, 77.6, 79.0 (11 x d, C-2a, C-2b, C-2c, C-3a, C-3b, C-3c, C-4a, C-4b, C-4c, C-5a, C-5b, C-5c), 80.2 (d, C-1a), 99.8, 100.1 (2 x d, C-1b, C-1c); m/z (ES-) 519 (100％, M-H+); m/z HRMS (ES-) C18H31O15S (M-H+)의 경우, 계산값 519.1384., 실험값 519.1389.
실시예 14: 1,2,3,6-테트라- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O - 아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α- O -글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-D-글루코피라노스(1,2,3,6-Tetra- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,4,6-tetra- O -acetyl-α- O -glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-D-glucopyranose)
Figure 112005515216504-PCT00021
소듐 아세테이트 (420 mg, 5.2 mmol)를 아세틱 안히드리드 (30 mL)에 첨가하고 환류시켰다. 이 시점에서 말코헵토오스 (1.00 g, 0.86 mmol)를 첨가하고 반응액을 강하게 교반하였다.
90 분 후, 출발물질(Rf 0.0)이 완전히 소비됨과 함께 t.l.c.(petrol:ethyl acetate, 1:3)가 생성물(Rf 0.3)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응은 실온으로 냉각 후 DCM(50 mL)으로 희석하여 물(100 mL)로 분배(partition)되었다. 상을 분리하고 수용액 층을 DCM (2 x 40 mL)으로 재추출하였다. 혼합된 유기층을 pH가 8이 될 때까지 탄산수소나트륨(200 mL의 포화 수용액) 및 소금물(100 mL)로 세척하고 건조(MgSO4)한 후 여과하여 진공에서 농축하였다. 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol:ethyl acetate, 1:3)로 정제하여 표제 생성물을 아노머 혼합물인 무정형의 흰색 고체로 얻었다. (α/β, 15/85); δH (500 MHz, CDCl3)2.O2, 2.03, 2.04, 2.05, 2.06, 2.07, 2.08, 2.10, 2.13, 2.19, 2.22, 2.24 (66H, 12 x s, 22 x OAc), 3.89-4.14 (13H, m, H-4a, H-4b, H-4c, H-4d, H-4e, H-4f, H-5a, H-5b, H-5c, H-5d, H-5e, H-5f, H-5g), 4.25-4.34, 4.39 (1H, dd, J 4.0 Hz, J 12.3 Hz), 4.52-4,56 (13H, m, H-6a, H-6a', H-6b, H-6b', H-6c, H-6c', H-6d, H-6d', H-6e, H-6e', H-6f, H-6f', H-6d, H-6g'), 4 75-4.79 (5H, m, H-2b, H-2c, H-2d, H-2e, H-2e, H-2f), 4.90 (1H, dd, J 1,2 3.7 Hz, J 2,3 10.5 Hz, H-2g), 5.00 (1H, at, J 9.4 Hz, H-4g), 5.31-5.45 (13H, m, H-3a, H-3b, H-3c, H-3d, H-3e, H-3f, H-3g, H-1b, H-1c, H-1d, H-1e, H-1f, H-1g), 5.79 (0.85H, d, J 1,2 8.1 Hz, H-1aβ), 6.28 (0.15H, d, J 1,2 4.0 Hz, H-1aα)
실시예 15: 2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α- O -글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실 브로마이드 (2,3,6-Tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,4,6-tetra- O -acetyl-α- O -glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl bromide)
Figure 112005515216504-PCT00022
1,2,3,6-테트라-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-D-글루코피라노스 (100 mg, 0.05 mmol)를 무수 DCM (5 mL)에 녹였다. 여기에 hydrogen bromide (33％ in acetic acid, 0.5 mL)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 아르곤 대기하에서 교반하면서 방치하였다. 40분 후에 출발물질(Rf 0.3)이 완전히 소비되는 것과 함께, t.l.c.(페트롤:에틸 아세테이트, 1:3)가 생성물(Rf 0.7)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응 혼합물은 DCM(10 mL) 및 물(10 mL) 사이에서 분배(partition)되었고, 수용액 층을 DCM (3 x 10 mL)으로 재추출하였다. 혼합된 유기층을 pH가 7이 될 때까지 탄산수소나트륨(150 mL의 포화 수용액) 및 소금물(20 mL)로 세척하고 건조(MgSO4)한 후 여과하여 진공으로 농축하고 표제 생성물 (98 mg, 96％)을 흰색 거품으로 얻었다. [α]D 22 +162.0 (c, 1.0 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3) 2.02, 2.03, 2.04, 2.06, 2.08, 2.10, 2.11, 2.14, 2.19, 2.23, 2.24, 2.25 (66H, 12 x s, 22 x OAc), 3.94-4.04 (12H, m, H-4b, H-4c, H-4d, H-4e, H-4f, H-5b, H-5c, H-5d, H-5e, H-5f, H-5g), 4.08 (1H, dd, J 5,6 2.2 Hz, J 6,6' 12.6 Hz, H-6), 4.19-4.33, 4.53-4.60 (12H, m, H-5a, H-6b, H-6b', H-6c, H-6c', H-6d, H-6d', H-6e, H-6e', H-6f, H-6f', H-6g, H-6g'), 4.12 (1H, at, J 9.5 Hz, H-4a), 4.40 (1H, dd, J 5,6 3.1 Hz, J 6,6' 12.7 Hz, H-6a), 4.64 (1H, dd, J 5,6 2.3 Hz, J 6,6 12.5 Hz, H-6a'), 4.74 (1H, dd, J 1,2 3.9 Hz, J 2,3 9.7 Hz, H-2a), 4.75-4.97 (5H, m, H-2b, H-2c, H-2d, H-2e, H-2f), 4.89 (1H, d, J 1,2 4.0 Hz, J 2,3 10.6 Hz, H-2g), 5.11 (1H, at, J 9.9 Hz, H-4g), 5.32-5.47 (12H, m, H-1b, H-1c, H-1d, H-1e, H-1f, H-1g, H-3b, H-3c, H-3d, H-3e, H-3f, H-3g), 5.65 (1H, at, J 9.4 Hz, H-3a), 6.54 (1H, d, J 1,2 4.3 Hz, H-1a)
실시예 16: 1-티오-2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α- O -글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-β-D-글루코피라노스 (1-Thio-2,3,6-tri- O -acetyl-4- O - (2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,4,6-tetra- O -acetyl-α- O -glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranose)
Figure 112005515216504-PCT00023
2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실 브로마이드 (1.08 g, 0.5 mmol) 및 테트라부틸암모늄 아이오딘 (19 mg, 0.05 mmol)를 무수 아세톤(50 mL)에 녹였다. 여기에, 건조된 티오우레아 (52 mg, 0.7 mmol)를 첨가하고 상기 반응액을 아르곤 대기 하에서 환류시까지 가열하였다. 8 시간 후 출발물질(Rf 0.6)이 완전히 소비되는 것과 함께, t.l.c.(petrol:ethyl acetate, 1:4)가 부(minor) 생성물(Rf 0.0)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응액을 진공에서 농축하고 과량의 티오우레아로부터 유기물을 제거 하기 위하여 DCM으로 추출하였다. 여과물을 진공에서 농축하고 이 잔여물을 컬럼플래시 크로마토그래피(ethyl acetate/methanol, 9:1)로 정제하여 특성화 과정 없이 더 수행된 중간체 2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-β-D-글루코피라노실-1-이소티오우로늄 브로마이드 (212 mg, 19％)를 얻었다. 이 중간체 (210 mg, 0.09 mmol) 및 Na2S2O5 (22 mg, 0.11 mmol)를 DCM(10 mL) 및 물 (5 mL)이 섞인 혼합물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 아르곤 하에서 환류시켰다. 4.5 시간 후, 출발물질(Rf 0.0)이 완전히 소비되는 것과 함께, t.l.c.가 생성물(Rf 0.2)이 형성됨을 나타내었다. 이 시점에서, 반응을 실온으로 냉각시키고 상 분리하였다. 수용액 층을 DCM (2 x 10 mL)으로 재추출하였다. 혼합된 유기층을 소금물(20 mL)로 세척하고 건조(MgSO4)한 후 여과하고 용매를 진공으로 제거하여 표제 생성물(185 mg, 90％)을 무정형의 흰색 고체로 수득하였다. [α]D 24 +128.1 (c, 1.0 in CHCl3); δH (500 MHz, CDCl3), 2.00, 2.01, 2.02, 2.03, 2.04, 2.05, 2.07, 2.08, 2.12, 2.17, 2.19, 2.21, 2.22, 2.23 (66H, 14 x s, 22 x COCH3), 2.27 (1H, d, J 1,SH 9.8 Hz, SH), 3.76 (1H, dat, J 4,5 9.7 Hz, J 3.5 Hz, H- 5a), 3.92-4.08 (12H, m, H-4a, H-4b, H-4c, H-4d, H-4e, H-4f, H-5b, H-5c, H-5d, H-5e, H-5f, H-5g), 4.17-4.36, 4.49-4.56 (12H, m, H-6b, H-6b', H-6c, H-6c', H-6d, H-6d', H-6e, H-6e', H-6f, H-6f', H-6g, H-6g'), 4.39 (1H, dd, J 5,6 3.6 Hz, J6,6' 12.2 HZ, H-6a), 4.48 (1H, dd, J 5,6 3.2 Hz, J 6,6' 12.3 Hz, H-6a), 4.62 (1H, at, J 9.5 Hz, H-1a), 4.73-4.78 (5H, m, H-2b, H-2c, H-2d, H-2e, H-2f), 4.82 (1H, at, J 9.5 Hz, H-2a), 4.88 (1H, dd, J 1,2 4.0 Hz, J 2,3 10.4 Hz, H-2g), 5.09 (1H, at, J 9.9 Hz, H-4g), 5.27 (1H, at, J 9.1 Hz, H-3a), 5.30-5.44 (12H, m, -1b, H-1c, H-1d, H-1e, H-1f, H-1g, H-3b, H-3c, H-3d, H-3e, H-3f, H-3g)
실시예 17: SBLCys156-S-SePh의 제조
시스테인-포함 단백질인 세린 프로테아제 서브틸리신, Bacillus lentus 유래변이체 S156C (SBLCys156)을 모델로 이용하여 단일 부위 변형(single site modification)을 조사하였다. SBLCys156 (10 mg)을 가스가 제거된 수용성 완충용액(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, PH 9.5)에 녹였다. PhSeBr (5 mg, 0.02 mmol)을 아세토니트릴 (200 μL)에 녹이고 그 중 150 μL (40 eq)을 상기 단백질 용액에 첨가하여 end-over-end rotator 상에 놓아두었다. 30 분 후, 유리(free) 티올의 존재가 엘만 분석 (Ellman's analysis) (G. L. Ellman, K. D. Courtney, V. Andres, R. M. Featherstone, Biochem. Pharmacol. 1961, 7, 88)에 의하여 확인되었다. 상기 반응액을 end-over-end rotator 상에 30분을 더 놓아두었다. 이 시점에서 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex®G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 상기 단백질 분획을 모아 물에서 (1 x 4L for 1 h, 2 x 2L for 30 min) 투석(MWCO 12-14 KDa)하고 SBLS156C-S-SePh(m/z (ES+) 실험값 26864, 계산값 26870)을 수득하였다.
실시예 18: SSβGCys344Cys432-(S-SePh) 2 의 제조
여러 부위 변형(multiple site modification)은 archeon Sulfolobus solfataricus에서 유래하는 호열성 β-글리코시다아제의 변이체(SSβG-Cys344Cys432)-두 개의 시스테인 잔기를 가짐-를 이용하여 조사하였다. SSβG-Cys344Cys432 (1 mg)을 수용성 완충용액(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)에 녹였다. PhSeBr (2 mg, 0.02 mmol) 을 아세토니트릴 (200 μL)에 녹이고 그 중 20 μL (74 eq)을 상기 단백질 용액에 첨가하여 end-over-end rotator 상에 놓아두었다. 1 시간 후, 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex®G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하여 SSβGCys344Cys432-S-SePh)2;(m/z (ES+) 실험값 57700, 계산값 57697)을 수득하였다.
실시예 19: 당 티올을 이용한 대표적인 단백질 당화 및 다른 티올과의 반응
SBLCys156-S-SePh (1 mg)을 수용성 완충용액(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)에 녹였다. 당 티올(sugar thiol) 또는 다른 티올을 물에 녹이고 상기 단백질 용액에 언급된 양(당량은 아래 표 참조)을 첨가하고, 상기 혼합물을 end-over-end rotator에 놓아두었다. 1 시간 후 상기 반응액을 질량분광기로 분석하였다.
결과
[표 1]
Figure 112005515216504-PCT00024
* 전환= ESI-MS에 의해 결정된 전환.
1상응하는 단백질-S-Se-Ph 또는 단백질-(S-Se-Ph)2화합물을 생성하기 위하여 티올 첨가 전, 페닐 셀레늄 브로마이드와의 반응에 의해 활성화된다.
2단백질 분해활성에 기인한 단백질 분해를 예방하기 위하여 당화 전, PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)와 반응된다.
상기 표의 결과는 본 발명의 방법이, 티올 화합물 1 당량을 이용하여 높은 수율로 원하는 생성물로 전환시킨다는 것을 나타낸다. 나아가, 상기 결과는 본 발명의 방법이 단일 및 여러 부위의 단백질 당화에 사용될 수 있음을 나타낸다. SBL-Cys156 및 SSβGCys344Cys432 내의 상기 세 가지 당화 부위는 매우 다양한 단백질 구조 및 여러 노출 수준을 가지는 환경에서 발견되는데, 이는 본 발명의 방법이 광범위한 적용가능성을 가지고 있음을 보여준다.
실시예 20: GlcGlcGlcGlcGlcGlcGlc-SH를 이용한 SBLCys156의 대표적인 단백질 당화
1-티오-2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-β-D-글루코피라노스 (15 mg, 0.007 mmol) 및 소듐 메톡시드 (2 mg, 0.007 mmol)를 교반된 MeOH 용액(2 ml)에 첨가하였다. 2 시간 후 출발물질(Rf 0.2)이 완 전히 소비됨과 함께, t.l.c.(petrol:EtOAc, 1:2)가 생성물(Rf 0.0)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응은 Dowex®-50 이온 교환 수지의 첨가로 중화되었고, 이 시점 후에 상기 반응물을 여과한 후 진공으로(in vacuo) 농축하였다. 조제(粗製, crude)의 1-티오-β-D-말토헵토오스를 물(5 mL)에 녹이고 그 중 300 μL (11 eq)를, SBLCys156-S-SePh (1 mg)를 함유하고 있는, 500 μL의 수용성 완충용액 (70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)에 첨가하였다. 상기 반응 용액을 end-over-end rotator 상에 놓아두었다. 1 시간 후, 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex®G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 상기 단백질 분획을 모아 GlcGlcGLcGlcGlcGlcGlc-SBLCys156 (m/z (ES+) 실험값 27878, 계산값 27881)을 수득하였다.
실시예 21: SBLCys156-S-GlcNAc의 효소적 연장
A. GlcNAc-SBLCys156 (3 mg)을 1 mL의 수용성 완충용액인 물에 녹였다. PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride)를 첨가하였다(50 μL of a 100 mg/mL solution in 아세토니트릴; 500-fold excess). 상기 반응 혼합물을 실온에서 30분간 놓아둔 후 Sephadex®G25 (PD-10) 탈염 컬럼으로 정제하였다. 비활성화된 단백질의 순도를 ESI-질량 분석기 (실험값 27100, 계산값 27104)로 평가하였다. 상기 단백질 분획은 동결건조(lyophilized)하여 1.0 mL의 0.1M 소듐 카코딜레이트(sodium cacodylate) 완충용액 (pH 7.52)에 다시 녹인 후 MnCl2.4H2O (3.2 mg; 16 μmol) 및 우리딘 디포 스페이트-갈락토오스 (UDP-galactose, 2.3 mg; 3.4 μmol, Kyowa Hakko; 30-fold excess)를 첨가하였다. Spodoptera Frugiperda (EC 2.4.1.22, 100 mU, Calbiochem) 유래 재조합 소(bovine) β-1,4-갈락토실트랜스퍼라아제를 첨가하고 상기 반응 혼합물을 실온에 40 분 동안 두어 Galβ1,4GlcNAc-SBL-Cys156 (ESI-MS, 실험값 27265, 계산값 27266)를 수득하였다.
B. GDP-푸코오스 (3mg, Kyowa Hakku) 및 Spodoptera Frugiperda (EC 2.4.1.65, 100 mU, Calbiochem) 유래 인간 α-1,3-푸코오실트랜스퍼라아제를 첨가하고 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 배양하여 LewisX-S-SBL-Cys156 (ESI-MS, 실험값 27410, 계산값 27412)를 수득하였다.
상기 실시예는 본 발명의 방법에 따라 제조된 당화 단백질이 적절한 탄수화물 변형 효소-예를 들어, 선택적으로 Galβ1,4GlcNAc 결합을 형성하는 β1,4-갈락토실트랜스퍼라아제와 같은 글리코실트랜스퍼라아제-와 반응하여 좀더 변형될 수 있음을 나타낸다.
실시예 22: 소듐 페닐티오술포네이트 (NaPTS)
Figure 112005515216504-PCT00025
소듐 벤젠설피네이트 (Sodium benzenesulfinate) (10 g, 61 mmol) 및 황(sulfur) (1.95 g, 61 mmol)을 무수 피리딘 (60 mL)에 녹여 노란색 용액을 만들었다. 상기 반응을 아르곤 하에서 교반시켜 1 시간 후 하얀색 현탁액을 제조하였다. 이것을 여과하고, 무수 디에틸에테르로 세척하였다. 무수 에탄올로부터 재결정하여 표제 생성물(10.5 g, 88％)을 흰색 결정성 고체로 얻었다. m.p. 305-306℃ [Lit. 287℃, Sato, R.; Goto, T.; Takikawa, Y.; Takizawa, S. Synthesis 1980, 615]; δH (200 MHz, DMSO-d6) 7.28-7.76 (5H, m, Ar-H)
실시예 23: 2,3,4,6-테트라- O -아세틸-β-D-글루코피라노실 페닐티오술포네이트(2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl phenylthiosulfonate)
Figure 112005515216504-PCT00026
2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-글루코피라노실 브로마이드 (207 mg, 0.5 mmol) 를 무수 아세토니트릴 (5 mL)에 녹였다. 여기에, 소듐 페닐티오술포네이트 (201 mg, 1 mmol) 및 테트라부틸암모늄 브로마이드 (16 mg, 0.05 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 70℃ 에서 아르곤 하에서 교반하였다. 4.5 시간 후, 출발물질(Rf 0.3)이 완전히 소비됨과 함께 t.l.c.(petrol: ethyl acetate, 1:1)가 생성물(Rf 0.5)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액은 진공에서 농축되었다. 상기 조제(crude)의 고체는 DCM(20 mL) 및 물(20 mL) 사이에서 분배(partition)되었고, 수용액 층을 DCM (2 x 20 mL)으로 재추출하였다. 혼합된 유기층을 소금물(20 mL)로 세척하고 건조(MgSO4)한 후 여과하여 진공에서 농축하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol:ethyl acetate, 1:1)로 정제하여 표제 생성물(225 mg, 88％)을 흰색 결정성 고체로 수득하였다. 상기 생성물의 구조를 단일 크리스탈 X 레이 회절에 의하여 좀더 확실히 분석하였다. mp 129-130℃; [α]D 25 +51.2 (c, 1.0 in CHCl3); υmax (KBr) 1754 (s, C=0), 1376 (s, C=C) cm-1 ;δH (400 MHz, C6D6) 1.68, 1.72, 1.73, 1.75 (4 x 3H, 4 x s, 4 x OAc), 3.09 (1H, ddd, J 4,5 10.2 Hz, J 5,6 2.4 Hz, J 5,6', 4.2 Hz, H-5), 3.83 (1H, dd, J 5,6 2.4 Hz, J 6,6' 12.7 Hz, H-6), 4.08 (1H, dd, J 5,6' 4.2 Hz, J 6,6' 12.6 Hz, H-6'), 5.17-5.23 (2H, m, H-2, H-4), 5.40 (1H, d, J 1,2 10.2 Hz, H-1), 5.44 (1H, at, J 9.4 Hz, H-3), 6.98-7.03 (3H, m, Ar-H), 7.90-7.92 (2H, m, Ar-H)
실시예 24: 2,3,4,6-테트라- O -아세틸-β-D-갈락토피라노실 페닐티오술포네이트 (2,3,4,6-Tetra- O -acetyl-β-D-galactopyranosyl phenylthiosulfonate)
Figure 112005515216504-PCT00027
2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-갈락토피라노실 브로마이드 (2.0 g, 5 mmol)를 무수 아세토니트릴 (80 mL)에 녹였다. 여기에, 소듐 페닐티오술포네이트(2.02 g, 10.3 mmol) 및 테트라부틸암모늄 브로마이드 (160 mg, 0.5 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 70℃ 에서 아르곤 하에서 교반하였다. 5 시간 후 출발물질(Rf 0.6)이 완전히 소비됨과 함께, t.l.c.(petrol: ethyl acetate, 1:1)가 생성물(Rf 0.4)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액은 진공에서 농축되었다. 상기 조제의 오일은 DCM(50 mL) 및 물(50 mL) 사이에서 분배(partition)되었고, 수용액 층을 DCM (2 x 50 mL)으로 재추출하였다. 혼합된 유기층을 소금물(100 mL)로 세척하고 건조(MgSO4)한 후 여과하여 진공에서 농축하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol:ethyl acetate, 2:1)로 정제하여 표제 생성물(1.7 g, 65％, 2steps)을 흰색 결정성 고체로 수득하였다. mp 53-54℃; [α]D 27 +24.2 (c, 1.0 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3) 1.98, 2.03, 2.06, 2.11 (4 x 3H, 4 x s, 4 x OAc), 3.85 (1H, dd, J 5,6 8.8 Hz, J 6,6' 14.0 Hz, H-6), 3.95-4.00 (2H, m, H-5, H-6), 5.11 (1H, dd, J 2,3 9.7 Hz, J 3,4 3.3 Hz, H-3), 5.23 (1H, at, J 10.3 Hz, H-2), 5.25 (1H, d, J 1,2 10.2 Hz, H-1), 5.43 (1H, dd, J 3,4 3.6 Hz, J 4,5 1.0 Hz, H-4), 7.54-7.68 (3H, m, Ar-H), 7.93-7.97 (2H, m, Ar-H)
실시예 25: 에틸 2,3,4,6-테트라- O -아세틸-1-디티오-β-D-글루코피라노실 디술피드(Ethyl 2,3,4,6-tetra- O -acetyl-1-dithio-β-D-glucopyranosyl disulfide)
Figure 112005515216504-PCT00028
방법 1: 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-글루코피라노실 페닐티오술포네이트 (100 mg, 0.2 mmol) 및 트리에틸아민 (0.03 mL, 0.2 mmol)을 무수 DCM (10 mL)에 녹이고 아르곤 대기 하에서 실온에서 교반하였다. 에탄 티올 (0.016 mL, 0.2 mmol)을 함유하는 무수 DCM (10 mL) 용액을 시린지 펌프를 통하여 30 분에 걸쳐 천천히 방울 단위로(dropwise) 첨가하였다. 40 분 후에, 출발물질(Rf 0.3)이 완전히 소비됨에 따라, t.l.c.(petrol: ethyl acetate, 1:1)가 주 생성물(Rf 0.5)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액은 진공에서 농축되었다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol:ethyl acetate, 1:1)로 정제하여 표제 생성물(70 mg, 82％)을 흰색 결정성 고체로 얻었다. mp 95-96℃ [Lit. 100-102℃, (Davis, B. G.; Ward, S. J.; Rendle, P. M. Chem. Commun. 2001, 189)]; [α]D 22 -164.9 (c, 0.2 in CHCl3) [Lit. [α]D 24 -178.0 (c, 1.0 in MeOH) (Davis, B. G.; Ward, S. J.; Rendle, P. M. Chem. Commun. 2001, 189)]; δH (400 MHz, CDCl3) 1.30 (1H, t, J 7.4 Hz, CH3), 2.00, 2.02, 2.03, 2.06 (4 x 3H, 4 x s, 4 x CH3), 2.79 (2H, dq, J CH3-H 7.5 Hz, J HH 2.7 Hz), 3.73 (1H, ddd, J 4,5 10.2 Hz, J 5,6 2.5 Hz, J 5,6' 4.8 Hz, H-5), 4.14 (1H, dd, J 5,6 2.4 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6), 4.22 (1H, dd, J 5,6' 4.7 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6'), 4.52 (1H, d, J 1,2 9.8 Hz, H-1), 5.10 (1H, at, J 9.8 Hz, H-4), 5.21-5.26 (2H, m, H-2, H-3)
방법 2: 페닐 2,3,4,6-테트라- O -아세틸-1-셀레닐술피드-D-β-글루코피라노시 드 (75 mg, 0.15 mmol) 및 트리에틸아민 (30 μL, 0.15 mmol)을 신선하게 증류된 DCM (10 mL)에 녹였다. 상기 용액을 실온에서 아르곤 대기 하에서 교반하였다. 에탄 티올 (11 μL, 0.15 mmol)을 함유하는 무수 DCM (10 mL) 용액을 2.5 시간에 걸쳐 방울 단위로 첨가하였다. 3 시간 후, 출발물질(Rf 0.5)이 완전히 소비됨에 따라, t.l.c.(petrol: EtOAc, 1:1)가 주 생성물(Rf 0.5)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액은 진공에서 농축되었다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol:EtOAc, 5:3)로 정제하여 표제 생성물(50 mg, 82％)을 흰색 결정성 고체로 얻었다.
실시예 26: 에틸 2,3,4,6-테트라- O -아세틸-1-디티오-β-D-갈락토피라노실 디술피드(Ethyl 2,3,4,6-tetra- O -acetyl-1-dithio-β-D-galactopyranosyl disulfide)
Figure 112005515216504-PCT00029
방법 1: 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-글랙토피라노실 페닐티오 술포네이트(100 mg, 0.2 mmol) 및 트리에틸아민 (0.03 mL, 0.2 mmol)을 무수 DCM (10 mL) 에 녹이고 실온에서 아르곤 대기 하에 교반하였다. 에탄 티올 (0.016 mL, 0.2 mmol)을 함유하는 무수 DCM (10 mL) 용액을 시린지 펌프를 통하여 30 분에 걸쳐 천천히 방울 단위로(dropwise) 첨가하였다. 40 분 후에, 출발물질(Rf 0.3)이 완전히 소비됨에 따라, t.l.c.(petrol: ethyl acetate, 1:1)가 주 생성물(Rf 0.4)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액은 진공에서 농축되었다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (petrol:ethyl acetate, 1:1)로 정제하여 표제 생성물(78 mg, 91％)을 흰색 결정성 고체로 얻었다. mp 65-66℃; [α]D 25 -52.1 (c, 1.4 in CHCl3); υmax (KBr) 1746 (s, C=0) cm-1; δH (400 MHz, CDCl3) 1.30 (1H, t, J 7.4 Hz, CH3), 1.95, 2.01, 2.02, 2.13 (4 x 3H, 4 x s, 4 x CH3), 2.79 (2H, dq, J CH3-H 7.2 Hz, J HH 1.7 Hz), 3.94 (1H, td, J 4,5 0.9 Hz, J 5,6 6.3 Hz, J 5,6' 7.0 Hz, H-5), 4.06 (1H, dd, J 5,6 6.3 Hz, J 6,6' 11.3 Hz, H-6), 4.12 (1H, dd, J 5,6' 7.0 Hz, J 6,6' 11.2 Hz, H-6'), 4.51 (1H, d, J 1,2 9.9 Hz, H-1), 5.05 (1H, dd, J 2,3 9.9 Hz, J 3,4 3.6 Hz, H-3), 5.35-5.40 (2H, m, H-2, H-4)
방법 2: 페닐 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-1-셀레닐술피드-D-β-갈락토피라노시드 (75 mg, 0.15 mmol) 및 트리에틸아민 (30 μL, 0.15 mmol) 을 신선하게 증류된 DCM (10 mL)에 녹였다. 상기 용액을 실온에서 아르곤 대기 하에서 교반하였다. 에탄 티올 (11 μL, 0.15 mmol)을 함유하는 무수 DCM (10 mL) 용액을 2.5 시간에 걸쳐 방울 단위로 첨가하였다. 3 시간 후, 출발물질(Rf 0.5)이 완전히 소비됨에 따라, t.l.c.(petrol: EtOAc, 1:1)가 주 생성물(Rf 0.5)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액은 진공에서 농축되었다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (petrol:EtOAc, 5:3)로 정제하여 표제 생성물(50 mg, 82％)을 흰색 결정성 고체로 얻었다.
실시예 27: 에틸 3,4,6-트리- O -아세틸-2-아세트아미도-2-디옥시-β-D-글루코 피라노실 디술피드 (Ethyl 3,4,6-tri- O -acetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl disulfide)
Figure 112005515216504-PCT00030
페닐 3,4,6-트리-O-아세틸-2-아세트아미도-2-디옥시-1-셀레닐술피드-D-β-글루코피라노시드 (100 mg, 0.19 mmol) 및 트리에틸아민 (0.03 mL, 0.19 mmol) 을 신선하게 증류된 DCM (20 mL)에 녹였다. 상기 용액을 실온에서 아르곤 대기 하에서 교반하였다. 에탄 티올 (0.014 mL, 0.19 mmol)을 함유하는 무수 DCM (10 mL) 용액을 1 시간에 걸쳐 방울 단위로 첨가하였다. 3 시간 후, 출발물질(Rf 0.5)이 완전히 소비됨에 따라, t.l.c.(EtOAc)가 주 생성물(Rf 0.4)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액은 진공에서 농축되었다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc)로 정제하여 표제 생성물 (75 mg, 93％)을 흰색의 무정형 고체로 수득하였다. [α]D 25 -70.1(c, 2.5 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3), 1.32 (3H, d, J CH,CH3 6.6 Hz, CHCH3), 1.96, 2.04, 2.05, 2.08 (12H, 4 x s, 4 x COCH3), 2.82 (2H, q, J 7.4 Hz, CH2), 3.75 (1H, ddd, J 4,5 10.1 Hz, J 5,6 2.5 Hz, J 5,6' 4.7 Hz, H-5), 4.12-4.25 (3H, m, H-2, H-6, H-6'), 4.73 (1H, at, J 1,2 10.4 Hz, H-1), 5.10 (1H, at, J 9.8 Hz, H-4), 5.30 (1H, at, J 9.9 Hz, H-3), 5.70 (1H, d, J NH,2 9.1 Hz, NH)
실시예 28: 비스-N-아세틸-L-시스테닐-L-세린 메틸에스테르 ( bis-N- Acetyl-L-cysteinyl-L-serine methylester)
Figure 112005515216504-PCT00031
비스-L-시스테닐-L-세린 메틸에스테르 (100 mg, 0.23 mmol)를 메탄올(5 mL)에 녹였다. 이 용액에, 아세틱 안히드리드 (0.09 mL, 0.92 mmol) 및 피리딘(0.075 mL, 0.92 mmol)을 첨가하였다. 15분 후에 출발물질(Rf 0.1)이 완전히 소비됨에 따라, t.l.c.(ethyl acetate:methanol 5:1)가 주 생성물(Rf 0.5)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액은 진공에서 농축되었다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (ethyl acetate:methanol 5:1)로 정제하여 표제 생성물(60 mg, 50％)을 흰색의 결정성 고체로 얻었다. mp 145-147℃; [α]D 25 -33.4 (c, 1.0 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3) 2.04 (3H, s, COCH3), 2.96 (1H, dd, J CH,H 13.9 Hz, J CH,αH 4.7 Hz, CysCHH), 3.23 (lH, dd, J CH,H 13.9 Hz, J CH,αH 4.7 Hz, CysCHH), 3.76 (3H, s, OMe), 3.83 (1H, dd, J CH,H 11.4 Hz, J CH,αH 4.1 Hz, SerCHH), 3.93 (1H, dd, J CH,H 11.3 Hz, J CH,αH 4.9 Hz, SerCHH), 4.55 (1H, t, J 4.3 Hz, αHSer), 4.87 (1H, t, J 4.8, αHCys)
실시예 29: N -아세틸-L-시스테닐-L-세린 메틸에스테르 ( N -Acetyl-L- cysteinyl-L-serine methylester)
Figure 112005515216504-PCT00032
비스-N-아세틸-L-시스테닐-L-세린 메틸에스테르 (1.92 g, 3.96 mmol)를 ㅈ젖은 클로로포름 (100 mL) 및 메탄올 (10 mL)에 녹이고, 교반하였다. 상기 교반된 용액에 트리부틸포스핀(tributylphosphine) (1.1 mL, 4.36 mmol)을 첨가하였다. 2 시간 후에, 출발물질(Rf 0.3)이 완전히 소비됨에 따라, t.l.c.(ethyl acetate:methanol 10:1)가 주 생성물(Rf 0.6)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액은 진공에서 농축되었다. 에틸 아세테이트/메탄올로부터 재결정하여 표제 생성물(1.77 g, 93％)을 흰색의 결정성 고체로 수득하였다. mp 127-128℃; [α]D 25 -32.0 (c, 1.0 in MeOH); δH (400 MHz, CDCl3) 1.89 (1H, at, J 8.9 Hz, SH), 2.06 (3H, s, COCH3), 2.84-2.93 (1H, m, CysCHH), 2.97-3.04 (1H, m, CysCHH), 3.79 (3H, s, OMe), 3.91 (1H, dd, J CH,H 11.4 Hz, J CH,αH 3.1 Hz, SerCHH), 4.03 (1H, dd, J CH,H 11.7 Hz, J CH,αH 4.2 Hz, SerCHH), 4.61-4.65 (1H, m, αHSer), 4.71-4.76 (1H, m, αHCys), 6.93 (1H, d, J αH,NH 7.8 Hz, NHCys), 7.73 (1H, d, J αH,NH 7.4 Hz, NHSer)
실시예 30: N -아세틸-L-시스테인 (2,3,4,6-테트라- O -아세틸-1-디티오-β-D- 글루코피라노실 디술피드)-L-세린 메틸에스테르 ( N -Acetyl-L-cysteine (2,3,4,6-tetra- O -acetyl-1-dithio-β-D-glucopyranosyl disulfide)-L-serine methylester)
Figure 112005515216504-PCT00033
2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-글루코피라노실 페닐티오술포네이트 (61 mg, 0.12 mmol) 을 무수 DCM (5 mL)에 녹이고, 실온에서 아르곤 대기 하에서 교반하였다. 여기에, N-아세틸-L-시스테인-L-세린 메틸에스테르 (32 mg, 0.12 mmol) 및 트리에틸아민 (0.015 mL, 0.11 mmol)을 함유하는 무수 DCM (10 mL) 및 무수 메탄올(0.5 mL)을 시린지 펌프를 통하여 4 시간에 걸쳐 방울 단위로 천천히 첨가하였다. 5 시간 후, 출발물질(Rf 0.3, (t.l.c system (petrol:ethyl acetate, 1:1))이 완전히 소비됨에 따라, t.l.c.(ethyl acetate: methanol 10:1)가 주 생성물(Rf 0.5)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액은 진공에서 농축되었다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(ethyl acetate:methanol, 10:1)로 정제하여 표제 생성물(75 mg, 99％)을 흰색 결정성 고체로 얻었다. mp 126-128℃ [Lit. 125-128℃ (Davis, B. G.; Ward, S. J.; Rendle, P. M. Chem. Commun. 2001, 189)], [α]D 25 -47.9 (c, 0.7 in CHCl3) [Lit. [α]D 24 -178.0 (c, 1.0 in MeOH) (Davis, B. G.; Ward, S. J.; Rendle, P. M. Chem. Commun. 2001, 189)]; δH (400 MHz, CDCl3) 2.03, 2.06, 2.07, 2.11 (5 x 3H, 4 x s, 5 x CH3), 3.05 (1H, dd, J CH,H 13.9 Hz, J CH,αH 8.8 Hz, CysCHH), 3.28 (1H, dd, J CH,H 13.9 Hz, J CH,αH 4.8 Hz, CysCHH), 3.80 (3H, s, OMe), 3.89 (1H, ddd, J 4,5 10.0 Hz, J 5,6 2.2 Hz, J 5,6' 4.1 Hz, H-5), 3.94 (1H, dd, J CH,H 11.7 Hz, J CH,αH 3.0 Hz, SerCHH), 4.00 (1H, dd, J CH,H 13.8 Hz, J CH,αH 3.7 Hz, SerCHH), 4.23 (1H, dd, J 5,6 4.2 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6), 4.38 (1H, dd, J 5,6' 2.0 Hz, J 5,6' 12.5 Hz, H-6'), 4.62-4.65 (1H, m, αHSer), 4,64 (1H, d, J 1,2 9.5 Hz, H-1), 4.90-4.94 (1H, m, αHCys), 5.18 (1H, at, J 10.1 Hz, H-4), 5.24-5.29 (2H, m, H-2, H-3), 6.94 (1H, d, J NH,H 7.9 Hz, NHAc), 7.52 (1H, d, J NH,H 7.6 Hz, NHSer)
실시예 31: N -아세틸-L-시스테인 (2,3,4,6-테트라- O -아세틸-1-디티오-β-D-갈락토피라노실디술피드)-L-세린 메틸에스테르 ( N -Acetyl-L-cysteine (2,3,4,6-tetra- O -acetyl-1-dithio-β-D-galactopyranosyldisulfide)-L-serine methylester)
Figure 112005515216504-PCT00034
2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실 페닐티오술포네이트 (50 mg, 0.1 mmol)를 무수 DCM (5 mL)에 녹이고 실온에서 아르곤 대기 하에서 교반하였다. N-아세틸-L-시스테인-L-세린 메틸에스테르(31 mg, 0.12 mmol) 및 트리에틸아민(0.015 mL, 0.11mmol)을 함유하는 무수 DCM (10 mL) 용액 및 무수 메탄올(0.5 mL)을 시린지 펌프를 통하여 2 시간에 걸쳐 방울단위로 천천히 첨가하였다. 2 시간 후, 출발물질(Rf 0.5, (t.l.c system (petrol:ethyl acetate, 1:1))이 완전히 소비됨에 따라, t.l.c.(ethyl acetate: methanol 10:1)가 주 생성물(Rf 0.5)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액은 진공에서 농축되었다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(ethyl acetate: methanol, 10:1)로 정제하여 표제 생성물(59 mg, 95％)을 흰색 무정형 고체로 얻었다. [α]D 25 -48.8 (c, 0.25 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3) 1.99, 2.04, 2.05, 2.08, 2.18 (5 x 3H, 4 x s, 5 x CH3), 2.80 (1H, bs, OH), 2.99 (1H, dd, J CH,H 14.1 Hz, J CH,αH 9.2 Hz, CysCHH), 3.32, 3.77 (3H, s, OMe), 3.92 (1H, dd, J CH,H 11.7 Hz, J CH,αH 3.0 Hz, SerCHH), 4.01 (1H, dd, J CH,H 11.7 Hz, J CH,αH 3.7 Hz, SerCHH), 4.06-4.14 (2H, m, H-5, H-6), 4.20-4.26 (1H, m, H-6'), 4.61-4.63 (1H, m, αHSer), 4.65 (1H, d, J 1,2 9.8 Hz, H-1), 4.88-4.93 (1H, m, αHCys), 5.11 (1H, dd, J 2,3 9.8 Hz, J 3,4 3.3 Hz, H-3), 5.42-5.47 (2H, m, H-2, H-4), 6.68 (1H, d, J NH,H 7.8 Hz, NHAc), 7.28 (1H, d, J NH,H 8.1 Hz, NHSer)
실시예 32: 2,3,4,6-테트라- O -벤질-β-D-글루코피라노실 브로마이드 (2,3,4,6-Tetra- O -benzyl-β-D-glucopyranosyl bromide)
Figure 112005515216504-PCT00035
2,3,4,6-테트라-O-벤질-D-글루코피라노스 (1.0 g, 1.9 mmol)을 아르곤 하에서 무수 DCM (6 mL) 및 무수 DMF (0.4 mL)에 녹였다. 상기 용액을 0℃에서 교반하였다. 옥사일 브로마이드 (Oxalyl bromide) (4 mL, 2M in DCM, 24 mmol)을 방울단위로 5 분에 걸쳐 첨가하고 상기 반응액을 실온에서 교반하였다. 40 분 후, t.l.c.(petrol:ethyl acetate, 2:1)가 주 생성물(Rf 0.7)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 0℃ 로 냉각하고 5 분에 걸쳐 첨가된 얼음물(30 mL)로 반응을 억제하였다. 상기 반응은 DCM (20 mL) 및 물 사이에서 분배되었다. 수용액 층을 DCM (3 x 20 mL)으로 재추출하고, 혼합된 유기층을 소금물(40 mL)으로 세척한 후 건조시키고(MgSO4), 여과한 뒤 진공에서 농축하여 표제 생성물(1.10 g, 95％)을 조제의(crude) 노란색 오일로 얻었다. δH (400 MHz, CDCl3), 3.57 (1H, dd, J 1,2 3.5 Hz, J 2,3 9.1 HZ, H-2), 3.68 (1H, dd, J 5,6 2.1 Hz, J 6,6' 11.0 Hz, H-6), 3.79-3.84 (2H, m, H-4, H-6'), 4.07 (1H, at, J 9.1 Hz, H-3), 4.07-4.11 (1H, m, H-5), 4.47-4.62 (3H, m, PhCH 2), 4.74 (s, 2H, PhCH 2), 4.84-4.89 (2H, m, PhCH 2), 5.10 (1H, d, J 11.1 Hz, PhCH 2), 6.46 (1H, d, H-1), 7.15-7.41 (2OH, m, Ar-H)
실시예 33: 2,3,4,6-테트라- O -벤질-β-D-글루코피라노실 페닐티오술포네이트(2,3,4,6-Tetra- O -benzyl-β-D-glucopyranosyl phenylthiosulfonate)
Figure 112005515216504-PCT00036
2,3,4,6-테트라-O-벤질-D-α-글루코피라노실 브로마이드 (3.55 g, 5.88 mmol) 및 소듐 페닐티오술포네이트 (4.76 g, 24.3 mmol)를 무수 1,4 디옥산(90 mL)에 녹였다. 상기 반응을 아르곤 하에서 70℃ 까지 가열하였다. 20 시간 후 출발물질(Rf 0.7)이 완전히 소비됨과 함에 t.l.c.(petrol:ethyl acetate, 2:1)가 주 생성물(Rf 0.6)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액은 실온으로 냉각시키고 여과하여 침전물을 페트롤/에틸아세테이트로 세척한 후 진공에서 농축하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol: ethyl acetate, 4:1)로 정제하여 2,3,4,6-테트라-O-벤질-D-글루코피라노실 페닐티오술포네이트 (3.18 g, 78％)를 흰색 점성 검(gum)- β:α비율이 3:1인 α,β화합물의 혼합물 -으로 수득하였다. ㅇ에틸아세테이트/페트롤로부터 선택적으로 재결정하여 순수한 2,3,4,6-테트라-O-벤질-β-D-글루코피라노실 페닐티오술포네이트를 흰색 결정성 고체로 수득하였다. m.p. 106-108℃; [α]D 22 + 21.4 (c, 0.35 in CHCl3); δH (500 MHz, C6D6) 3.21 (1H, ddd, J 4,5 9.7 Hz, J 5,6 1.4 Hz, J 5,6 3.8 Hz, H-5), 3.29 (1H, dd, J 5,6 1.4 Hz, J 6,6' 11.1 Hz, H-6), 3.34 (1H, dd, J 1,2 9.9 Hz, J 2,3 8.7 Hz, H-2), 3.49 (1H, dd, J 5,6 3.8 Hz, J 6,6' 11.1 Hz, H-6', 3.51 (1H, at, J 9.4 Hz, H-3), 3.60 (1H, at, J 9.4 Hz, H-4), 4.15, 4.25 (2H, ABq, J 12β.1 Hz, PhCH2), 4.52, 4.58 (2H, ABq, J 11.0 Hz, PhCH2), 4.72, 4.76 (2H, ABq, J 11.3 Hz, PhCH2), 4.78, 4.52 (2H, ABq, J 11.3 Hz, PhCH2), 5.25 (1H, d, J 1,2 10.2 Hz, H-1), 6.82-6.88 (3H, m, Ar-H), 7.05-7.26 (2OH, m, Ar-H), 7.96-7.98 (2H, m, Ar-H)
실시예 34: 에틸 2,3,4,6-테트라- O -벤질-1-디티오-β-D-글루코피라노실 디술피드(Ethyl 2,3,4,6-tetra- O -benzyl-1-dithio-β-D-glucopyranosyl disulfide)
Figure 112005515216504-PCT00037
2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-글루코피라노실 페닐티오술포네이트 (100 mg, 0.14 mmol) 및 트리에틸아민 (0.02 mL, 0.14 mmol)을 무수 DCM (10 mL)에 녹이고, 실온에서 아르곤 대기 하에서 교반하였다. 여기에, 에탄 티올 (11 μL, 0.14 mmol)을 함유하는 무수 DCM (10 mL)을 천천히 방울 단위로 시린지 펌프를 통하여 90 분에 걸쳐 첨가하였다. 90 분 후, 출발물질(Rf 0.2)이 완전히 소비됨에 따라 t.l.c.(petrol:ethyl acetate, 6:1)가 주 생성물(Rf 0.4)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액을 진공에서 농축하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol:ethyl acetate, 7:1)로 정제하여 표제 생성물(83 mg, 95％)을 깨끗한 오일 로 얻었다. [α]D 22 -164.9 (c, 0.2 in CHCl3) [Lit. [α]D 25 -80.0 (c, 3.0 in MeOH) (Davis, B. G.; Ward, S. J.; Rendle, P. M. Chem. Commun. 2001, 189)]; δH (400 MHz, CDCl3) 1.22 (1H, t, J 7.3 Hz, CH3), 2.68-2.86 (2H, m, CH2), 3.24 (1H, ddd, J 4,5 9.7 Hz, J 5,6 3.3 Hz, J 5,6' 2.1 Hz, H-5), 3.56-3.60 (2H, m, H-6, H-6'), 3.61 (1H, at, J 9.1 Hz, H-3), 3.72 (1H, at, J 9.4 Hz, H-4), 3.89 (1H, at, J 9.1 Hz, H-2), 4.34 (1H, d, J 1,2 9.7 Hz, H-1), 4.37, 4.31 (2H, Abq, J 12.2 Hz, PhCH 2), 4.56, 4.83 (2H, Abq, J 11.3 Hz, PhCH 2), 4.77-4.83 (2H, m, PhCH 2), 4.90 (1H, d, J 11.1 Hz, PhCHH), 4.97 (1H, d, J 10.7 Hz, PhCHH), 7.07-7.21 (14H, m, Ar-H), 7.25-7.27 (2H, m, Ar-H), 7.29-7.31 (2H, m, Ar-H), 7.36-7.38 (2H, m, Ar-H)
실시예 35: N -아세틸-L-시스테인 (2,3,4,6-테트라- O -벤질-1-디티오-β-D-글루코피라노실 디술피드)-L-세린 메틸에스테르 ( N -Acetyl-L-cysteine (2,3,4,6-tetra- O -benzyl-1-dithio-β-D-glucopyranosyl disulfide)-L-serine methylester)
Figure 112005515216504-PCT00038
2,3,4,6-테트라-O-벤질-β-D-글루코피라노실 페닐티오술포네이트 (50 mg, 0.07 mmol)을 무수 DCM (5 mL)에 녹이고, 실온에서 아르곤 대기 하에서 교반하였다. 여기에, N-아세틸-L-시스테인-L-세린 메틸에스테르 (19 mg, 0.07 mmol) 및 트리에틸아민 (11 μL, 0.08 mmol)을 함유하는 무수 DCM (5 mL) 및 무수 메탄올(0.5 mL) 을 천천히 방울 단위로 시린지 펌프를 통하여 5 시간에 걸쳐 첨가하였다. 5 시간 후, 출발물질(Rf 0.9)이 완전히 소비됨에 따라 t.l.c.(ethyl acetate)가 주생성물(Rf 0.6)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액을 진공에서 농축하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(ethyl acetate)로 정제하여 표제 생성물(48 mg, 82％)을 흰색 결정성 고체로 수득하였다. mp 96-97℃; [α]D 22 +56.2 (c, 1 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3) 2.03 (3H, s, COCH3), 3.19 (1H, dd, J CH,H 14.0 Hz, J CH,αH 8.3 Hz, CysCHH), 3.37 (1H, dd, J CH,H 14.3 Hz, J CH,αH 6.0 Hz, CysCHH), 3.64 (1H, ddd, J 4,5 9.6 Hz, J 5,6 1.8 Hz, J 5,6' 3.9 Hz, H-5), 3.72 (1H, at, J 9.2 Hz, H-4), 3.77 (1H, at, J 8.8 Hz, H-3), 3.82 (3H, s, OMe), 3.84-3.90 (4H, m, SerCHH, H-2, H-6, H-6', 3.96 (1H, dd, J CH,H 11.7 Hz, J CH,αH 3.3 Hz, SerCHH), 4.50 (1H, d, J 1,2 9.6 Hz, H-1), 4.51, 4.70 (2H, ABq, J 11.6 Hz, PhCH2), 4.55, 4.85 (2H, ABq, J 10.4 Hz, PhCH2), 4.59-4.62 (1H, m, αHSer), 4.81, 4.87 (2H, ABq, J 10.6 Hz, PhCH2), 4.91, 4.97 (2H, ABq, J 11.0 Hz, PhCH2), 4.93-4.98 (1H, m, αHCys), 6.88 (1H, bd, J NH,H 7.9 Hz, NHAc), 7.13-7.39 (20H, m, 20 x Ar-C), 7.48 (1H, d, J NH,H 7.6 Hz, NHSer)
실시예 36: 2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α- O -글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-β-D-글루코피라노실 페닐티오술포네이트 (2,3,6-Tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,4,6-tetra- O -acetyl-α- O -glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl phenylthiosulfonate)
Figure 112005515216504-PCT00039
2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실브로마이드(200 mg, 0.21 mmol)를 무수 아세토니트릴 (10 mL)에 녹였다. 여기에, 소듐 벤젠티오술포네이트 (80 mg, 0.41 mmol) 및 테트라부틸암모늄 아이오딘 (10 mg, 0.02 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 70℃ 에서 아르곤 하에서 교반하였다. 2 시간 후, 출발물질(Rf 0.5)이 완전히 소비됨과 함께 t.l.c.(petrol:ethyl acetate, 1:2)가 UV 활성 생성물(Rf 0.5)이 형성됨을 나타내었다. 이 시점에서 상기 용액을 실온으로 냉각하고 여과하여 이 여과물을 진공에서 농축하였다. 이것을 플래시 컬럼 크 로마토그래피(petrol:ethyl acetate, 1:2)로 정제하여 표제 생성물(140 mg, 62％)을 흰색 무정형 고체로 얻었다. [α]D 22 +69.9 (c, 0.75 in CHCl3); δH (500 MHz, CDCl3) 2.03, 2.04, 2.06, 2.08, 2.11, 2.15, 2.19, (30H, 10 x COCH3), 3.77-3.79 (1H, m, H-5a), 3.94-4.00 (4H, m, H-4a, H-4c, H-5b, H-5c), 4.10 (1H, dd, J 5,6 2.1 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6b), 4.17-4.22 (3H, m, H-6a, H-6c, H-6a'), 4.29 (1H, dd, J 5,6 3.3 Hz, J 6,6' 12.6 Hz, H-6b'), 4.46 (1H, dd, J 5,6 1.9 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6c'), 4.76 (1H, dd, J 1,2 3.9 Hz, J 2,3 10.4 Hz, H-2a), 4.89-4.94 (2H, m, H-2b, H-2c), 5.12 (1H, at, J 9.9 Hz, H-4b), 5.28 (1H, d, J 1,2 3.8 Hz, H-1a), 5.34 (1H, d, J 1,2 9.7 Hz, H-1c), 5.37 (1H, at, J 9.1 Hz, H-3c), 5.41 (1H, at, J 10.1 Hz, H-3b), 5.41-5.45 (2H, m, H-1b, H-3a), 7.62-7.65 (2H, m, Ar-H), 7.71 (1H, m, Ar-H), 8.00-8.02 (2H, m, Ar-H)
실시예 37: 에틸 2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α- O -글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-1-디티오-β-D-글루코피라노실 디술피드 (Ethyl 2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,4,6-tetra- O- acetyl-α- O -glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-1-dithio-β-D-glucopyranosyl disulfide)
Figure 112005515216504-PCT00040
2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-β-D-글루코피라노실페닐티오술포네이트 (50 mg, 0.05 mmol)을 무수 DCM (10 mL)에 녹이고 실온에서 아르곤 하에서 교반하였다. 트리에틸아민 (7 μL, 0.05 mmol) 및 에탄 티올 (3 μL, 0.05 mmol) 및 무수 DCM (10 mL) 용액을 천천히 방울 단위로 시린지 펌프를 통하여 1 시간에 걸쳐 첨가하였다. 1 시간 후, 출발물질(Rf 0.4)이 완전히 소비됨에 따라, t.l c.(petrol:ethyl acetate, 1:2)가 주 생성물(Rf 0.6)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액을 진공에서 농축하고 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol:ethyl acetate, 1:2)로 정제하여 표제 생성물(43 mg, 93 ％)을 깨끗한 오일로 얻었다. [α]D 24 +26.4 (c, 1.5 in CHCl3); δH (500 MHz, CDCl3) 1.30 (1H, t, J 7.2 Hz, CH3), 2.04, 2.05, 2.06, 2.07, 2.10, 2.14, 2.19, 2.20 (30H, 8 x s, 10 x COCH3), 2.75-2.87 (2H, m, CH 2CH3), 3.77-3.81 (1H, m, H-5a), 3.96-4.00 (3H, m, H-4b, H-5c, H-5b), 4.03 (1H, at, J 9.3 Hz, H-4a), 4.10 (1H, dd, J 5,6 2.3 Hz, J 6,6' 12.6 Hz, H-6c), 4.22 (1H, dd, J 5,6 2.9 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6b), 4.29 (1H, dd, J 5,6 3.7 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6'c), 4.33 (1H, dd, J 5,6 4.4 Hz, J6,6' 12.4 Hz, H-6a), 4.51 (1H, dd, J 5,6' 1.8 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6b', 4.57 (1H, dd, J 5,6 2.3 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6a'), 4.58 (1H, d, J 1,2 9.9 Hz, H-1a), 4.79 (1H, dd, J 1,2 4.1 Hz, J 2,3 10.6 Hz, H-2b), 4.90 (1H, dd, J 1,2 4.3 Hz, J 2,3 10.4 Hz, H-2c), 5.11 (1H, at, J 9.9 Hz, H-4c), 5.16 (1H, at, J 9.5 Hz, H-2a), 5.33 (1H, d, J 1,2 4.1 Hz, H-1b), 5.37 (1H, at, J 8.9 Hz, H-3a), 5.38-5.44 (2H, m, H-3b, H-3c), 5.45 (1H, d, J 1,2 4.1 HZ, H-1c)
실시예 38: N-부톡시카보닐-L-시스테인 (2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α- O -글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-1-디티오-β-D-글루코피라노실 디술피드)-L-세린 메틸에스테르 ( N -Butoxycarbonyl-L-cysteine (2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,4,6-tetra- O -acetyl-α- O -glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-1-dithio-β-D-glucopyranosyl disulfide)-L-serine methylester)
Figure 112005515216504-PCT00041
2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세 틸-α-O-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-β-D-글루코피라노실 페닐티오술포네이트 (89 mg, 0.08 mmol)를 무수 DCM (5 mL) 에 녹이고 실온에서 아르곤 대기 하에서 교반하였다. 트리에틸아민 (0.014 mL, 0.2 mmol) 및 N-부톡시카보닐-L-시스테이닐-L-세린 메틸에스테르 (30 mg, 0.09 mmol)을 함유하는 무수 DCM (10 mL) 및 무수 메탄올 (1 mL) 용액을 천천히 방울 단위로 시린지 펌프를 통하여 3 시간에 걸쳐 첨가하였다. 3 시간 후, 출발물질(Rf 0.7)이 완전히 소비됨에 따라, t.l.c.(ethyl acetate)가 주 생성물(Rf 0.6)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액을 진공에서 농축하고 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(ethyl acetate)로 정제하여 표제 생성물(66 mg, 74％)을 무정형의 흰색 고체로 얻었다. [α]D 24 +25.1 (c, 1.25 in CHCl3); δH (500 MHz, CDCl3) 1.47 (9H, s, C(CH3)3), 2.00, 2.01, 2.02, 2.03, 2.06, 2.09, 2.15, 2.18 (30H, 8 x s, 10 x COCH3), 2.75-2.87 (1H, m, CHHCys), 3.16-3.19 (1H, m, CHHCys), 3.27 (1H, t, J 6.2 Hz, OH), 3.81 (3H, s, OMe), 3.83-3.85 (1H, m, H-5a), 3.92-4.01 (6H, m, H-4b, H-5b, H-5c, H-6a, H-6a', CHHSer), 4.06 (1H, dd, J 5,6 2.2 Hz, J 6,6' 12.2 Hz, H-6c), 4.09-4.16 (2H, m, H-4a, H-6b), 4.25 (1H, dd, J 5,6 3.2 Hz, J 6,6' 12.3 Hz, H-6c'), 4.39-4.41 (1H, m, CHHSer), 4.52-4.67 (4H, m, αHSer, αHCys, H-1a, H-6'b), 4.74 (1H, dd, J 1,2 4.1 Hz, J 2,3 10.3 Hz, H-2b), 4.85 (1H, dd, J 1,2 3.7 Hz, J 2,3 10.5 Hz, H-2c), 5.07 (1H, at, J 9.9 Hz, H-4c), 5.11-5.13 (1H, m, H-2a), 5.28 (1H, d, J 1,2 4.1 Hz, H-1b), 5.32-5.41 (4H, m, H-3a, H-3b, H-3c, NHCys), 5.42 (1H, d, J 1,2 3.9 Hz, H-1c), 7.25 (1H, bd, J NH,αH 6.7 Hz, NHSer)
실시예 39: 페닐 2,3,6-트리- O -아세틸-1-셀레닐술피드-4- O -(2,3,6-트리- O -아세틸-4- O -(2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α- O -글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-β-D-글루코피라노시드 (Phenyl 2,3,6-tri- O -acetyl-1-selenenylsulfide-4- O -(2,3,6-tri- O -acetyl-4- O -(2,3,4,6-tetra- O -acetyl-α- O -glucopyranosyl)-α-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00042
2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-β-D-글루코피라노실티올 (500 mg, 0.53 mmol) 및 페닐 셀레늄 브로마이드 (200 mg, 0.9 mmol)를 무수 DCM (20 ml)에 녹였다. 5 분 후, 출발물질(Rf 0.3)이 완전히 소비됨에 따라, t.l.c.(petrol:ethyl acetate 1:2)가 주 생성물(Rf 0.4)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 트리에틸아민 (5 ml)을 첨가하여 억제하고 나서, 진공에서 농축하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol:ethyl acetate 1:2)로 정제하여 표제 생성물(527 mg, 91％) 을 무정형의, 회색을 띤 흰색 고체로 얻었다. [α]D 25 -2.6 (c, 1.0 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3), 1.99, 2.01, 2.02, 2.04, 2.06, 2.10, 2.14 (30H, 9 x s, 10 x OAc), 3.79 (1H, dat, J 4,5 9.7 Hz, J 3.4 Hz, H-5a), 3.92 (3H, m, H-4b, H-5b, H-5c), 4.00 (1H, at, J 9.3 Hz, H-4a), 4.05 (1H, dd, J 5,6 2.8 Hz, J 6,6' 12.8 Hz, H-6c), 4.15 (1H, dd, J 5,6 2.8 Hz, J 6,6' 12.6 Hz, H-6b), 4.22 (1H, dd, J 5,6 3.7 Hz, J 6,6' 12.0 Hz, H-6a), 4.25 (1H, dd, J 5,6 3.3 Hz, J 6,6' 12.0 Hz, H-6c'), 4.42-4.46 (2H, m, H-6a', H-6b', 4.66 (1H, d, J 1,2 9.9 Hz, H-1a), 4.74 (1H, dd, J 1,2 4.1 Hz, J 2,3 10.4 Hz, H-2b), 4.86 (1H, dd, J 1,2 4.1 Hz, J 2,3 10.5 Hz, H-2c), 5.06 (1H, at, J 9.6 Hz, H-4c), 5.07 (1H, at, J 9.8 Hz, H-2a), 5.27 (1H, d, J 1,2 4.4 Hz, H-1b), 5.32-5.39 (3H, m, H-3a, H-3b, H-3c), 5.41 (1H, d, J 1,2 4.2 Hz, H-1c), 7.27-7.29 (3H, m, Ar-H), 7.64-7.67 (2H, m, Ar-H)
실시예 40: 비스-N-부톡시카보닐-L-시스테이닐-L-트레오닌 메틸에스테르 ( bis -N-Butoxycarbonyl-L-cysteinyl-L-threonine methylester)
Figure 112005515216504-PCT00043
비스-N-부톡시카보닐-L-시스테인 (4.0 g, 9.1 mmol), L-트레오닌 메틸에스테르 (2.42 g, 18.2 mmol), DCC (3.75 g, 18.2 mmol), HOBt (2.46 g, 18.2 mmol) 및 DIPEA (2.5 ml, 18.2 mmol)를 신선하게 증류된 DCM (150 mL)에 녹였다. 18 시간 후, 출발물질(Rf 0.0)이 완전히 소비됨에 따라, t.l.c.(ethyl acetate:methanol 9:1)가 주 생성물(Rf 0.5)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 물(2 x 100 ml) 로 희석하고 상을 분배하였다. 유기물을 소금물(100 ml)로 세척하고 건조(MgSO4) 후 여과하여 상기 용매를 진공에서 제거하였다. 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(ethyl acetate:methanol 9:1)로 정제하고, 메탄올/디에틸에테르로부터 재결정하여 표제 생성물(3.26 g, 60％)을 흰색 결정성 고체로 수득하였다. mp 145-147℃; [α]D 25 +20.8 (c, 1.0 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3), 1.23 (3H, d, J CH,CH3 6.6 Hz, CHCH3), 1.44 (9H, s, C(CH3)3), 3.11-3.12 (2H, m, CH2Cys), 3.26 (1H, bs, OH), 3.75 (3H, s, OMe), 4.32-4.36 (1H, m, CHCH3), 4.61 (dd, J NH,aThr 8.7 Hz, J αH,C H CH3 2.15 Hz, CHCH3), 4.63-4.68 (1H, m, aCys), 5.75 (1H, d, J NH,αHCys 7.4 Hz, NHCys), 7.56 (1H, d, J NH,aThr 8.6 Hz, NHThr)
실시예 41: N -부톡시카보닐-L-시스테이닐-L-트레오닌 메틸에스테르 ( N -Butoxycarbonyl-L-cysteinyl-L-threonine methylester)
Figure 112005515216504-PCT00044
비스-N-부톡시카보닐-L-시스테이닐-L-트레오닌 메틸에스테르 (2.0 g, 3.3 mmol) 를 젖은 클로로포름 (100 mL) 및 메탄올 (10 mL)에 녹이고 교반하였다. 여기에, 교반된 용액 트리부틸포스핀 (1.0 mL, 4.0 mmol) 을 첨가하였다. 2 시간 후, 출발물질(Rf 0.7)이 완전히 소비됨에 따라, t.l.c.(ethyl acetate: methanol 9:1)가 생성물(Rf 0.8)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 진공에서 농축하고 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(ethyl acetate)로 정제하여 표제 생성물(2.0 g, 99％)을 흰색 거품으로 얻었다. [α]D 25 -11.4 (c, 1.0 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3) 1.09 (3H, d, J CH,CH3 6.4 Hz, CH3), 1.34 (9H, s, C(CH3)3), 1.65 (1H, at, J 8.7 Hz, SH), 2.72-2.89 (2H, m, CH2), 3.66 (3H, s, OMe), 3.96 (1H, m, OH), 4.24-4.28 (1H, m, CHCH3), 4.34-4.36 (1H, m, αHCys), 4.49 (1H, dd, J αHThr,NH 8.5 Hz, J αHThr,CHCH3 2.7 Hz, αHThr), 5.82 (1H, d, J αHCys,NH 8.2 Hz, NHCys), 7.38 (1H, d, J αHThr,NH 8.5 Hz, NHThr)
실시예 42: N -부톡시카보닐-L-시스테인 (2,3,4,6-테트라- O -아세틸-1-디티오-β-D-글루코피라노실 디술피드)-L-트레오닌 메틸에스테르 ( N -butoxycarbonyl-L-cysteine (2,3,4,6-tetra- O -acetyl-1-dithio-β-D-glucopyranosyl disulfide)-L- threonine methylester)
Figure 112005515216504-PCT00045
페닐 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-1-셀레닐술피드-D-β-글루코피라노시드 (130 mg, 0.25 mmol) 및 트리에틸아민 (0.02 mL, 0.18 mmol) 을 신선하게 증류된 DCM (10 mL)에 녹였다. 상기 용액을 실온에서 교반하였다. N-부톡시카보닐-L-시스테인-L-트레오닌 메틸에스테르 (30 mg, 0.089 mmol)을 함유하는 무수 메탄올 (4 mL) 용액을 천천히 상기 용액에 첨가하였다. 10 분 후에 출발물질 (Rf 0.5)이 완전히 소비됨에 따라, t.l.c.(petrol:ethyl acetate, 1:2)가 생성물 (Rf 0.2)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액을 진공에서 농축하고 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol:ethyl acetate, 1:2)로 정제하여 표제 생성물(32 mg, 51％)을 흰색의 무정형 고체로 얻었다. [α]D 25 -81.2 (c, 0.25 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3) 1.28 (3H, d, J CHCH3 6.7 Hz, CHCH 3), 1.51 (9H, s, C(CH3)3), 2.06, 2.08, 2.10 2.14 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 2.86 (1H, bs, OH), 3.06 (1H, dd, J CHαH 8.8 Hz, J CHCH 13.4 Hz, CHHCys), 3.31 (1H, dd, J CHαH 4.2 Hz, J CHCH 13.1 Hz, CHHCys), 3.82 (3H, s, OCH3), 3.87-3.89 (1H, m, H-5), 4.32-4.38 (2H, m, H-6, H-6'), 4.39 (1H, dd, J CHCH3 6.4 Hz, JCHαH 2.5 Hz, CHOH), 4.60-4.65 (3H, m, H-1, αHThr, αHCys), 5.20-5.32 (3H, m, H-2, H-3, H-4), 5.42 (1H, d, J NHαH 8.0 Hz, NHCys), 7.12 (1H, d, J NHαH 8.9 Hz, NHThr)
실시예 43: N -부톡시카보닐-L-시스테인 (2,3,4,6-테트라- O -아세틸-1-디티오-β-D-갈락토퍼라노실 디술피드)-L-트레오닌 메틸에스테르 ( N -butoxycarbonyl-L-cysteine (2,3,4,6-tetra- O -acetyl-1-dithio-β-D-galactopyranosyl disulfide)-L-threonine methylester)
Figure 112005515216504-PCT00046
페닐 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-1-셀레닐술피드-D-β-갈락토피라노시드 (140 mg, 0.27 mmol) 및 트리에틸아민 (0.01 mL, 0.089 mmol)을 신선하게 증류된 DCM (5 mL)에 녹였다. 상기 용액을 실온에서 교반하였다. N-부톡시카보닐-L-시스테인-L-트레오닌 메틸에스테르 (26 mg, 0.077 mmol)를 함유하는 무수 DCM (5 mL) 및 무수 메탄올 (4 mL) 용액을 천천히 상기 용액에 첨가하였다. 10 분 후에, 출발물질 (Rf 0.6)이 완전히 소비됨에 따라, t.l.c. (petrol:ethyl acetate, 1.2)가 생성물 (Rf 0.2)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액을 진공에서 농축하고 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol:ethyl acetate, 1:2)로 정제하여 표제 생성물(49 mg, 93％) 을 흰색 무정형 고체로 얻었다. [α]D 25 -81.2 (c, 0.25 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3) 1.24 (3H, d, J CH,CH3 6.4 Hz, CH3), 1.46 (9H, s, C(CH3)3), 2.01, 2.06, 2.08, 2.20 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 2.79 (1H, bd, J CH,OH 4.1 Hz, OH), 2.99 (1H, dd, J αH,CH2 8.8 Hz, J C H ,H 13.9 Hz, CHHCys), 3.32-3.35 (1H, m, CHHCys), 3.76 (3H, s, OCH3), 4.04 (1H, at, J 6.2 Hz, H-5), 4.10-4.16 (1H, m, H-6), 4.19 (1H, dd, J 5,6 6.1 Hz, J 6,6 10.8 Hz, H-6'), 4.36-4.46 (1H, m, CHOH), 4.56 (1H, dd, J αHThr,CH 2.4 Hz, J αH,NH 8.9 Hz, αHThr), 4.57-4.64 (1H, m, αHCys), 4.65 (1H, d, J 1,2 9.0 Hz, H-1), 5.13 (1H, dd, J 2,3 9.8 Hz, J 2,3 9.8 Hz, H-3), 5.31 (1H, d, J αHCys,NH 8.3 Hz, NHCys), 5.47 (1H, d, J 3,4 3.2 Hz, H-4), 5.52 (1H, at, J 9.6 Hz, H-2), 6.91 (1H, d, J αHThr,NH 9.0 Hz, NHThr)
실시예 44: 부톡시카보닐-L-시스테이닐-( S -3,4,6-트리- O -아세틸-2-아세트아미도-2-디옥시-β-D-글루코피라노실 디술피드)-L-트레오닌 메틸에스테르 (Butoxycarbonyl-L-cysteinyl-( S -3,4,6-tri- O -acetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl disulfide)-L-threonine methylester)
Figure 112005515216504-PCT00047
상기 표제 생성물(55 mg, 88％)을 페닐 3,4,6-트리-O-아세틸-2-아세트아미도-2-디옥시-1-셀레닐술피드-D-β-글루코피라노시드를 출발물질로 이용하여 실시예 43의 방법과 유사한 방법에 의하여 흰색의 무정형 고체로 얻었다. [α]D 25 -47.1 (c, 0.1 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3) 1.17 (3H, d, J CH,CH3 6.4 Hz, CH3), 1.49 (9H, s, C(CH3)3), 1.91, 2.00, 2.02, 2.07 (12H, 4 x s, 4 x, COCH3), 2.99 (1H, dd, J C H H,CH H 13.5 Hz, J αH,CH 10.0 Hz, CHH), 3.38 (1H, dd, J αH,CH 4.8 Hz, J C H H,CH H 13.5 Hz, CHH), 3.88-3.91 (1H, m, H-5), 4.16-4.32 (4H, m, H-2, H-6, H-6', CHCH3), 4.45 (1H, d, J αH,CH 2.7 Hz, αHThr), 4.54 (1H, dd, J αH,C H H 9.7 Hz, JαH,CH H 4.7 Hz, αHCys), 4.79 (1H, d, J 1,2 10.1 Hz, H-1), 5.06 (1H, at, J 9.7 Hz, H-4), 5.28 (1H, at, J 9.7 Hz, H-3).
실시예 45: N -부톡시카보닐-L-시스테이닐-( S -1-β-D-글루코피라노실 디술피드)-L-트레오닌 메틸에스테르 ( N -Butoxycarbonyl-L-cysteinyl-( S -1-β-D-glucopyranosyl disulfide)-L-threonine methylester)
Figure 112005515216504-PCT00048
페닐 1-셀레닐술피드-D-β-글루코피라노시드 (70 mg, 0.2 mmol) 및 트리에틸아민 (0.01 mL, 0.1 mmol) 을 MeOH (8 mL)에 녹였다. 상기 용액을 실온에서 교반하였다. N-부톡시카보닐-L-시스테인-L-트레오닌 메틸에스테르 (22 mg, 0.07 mmol)을 함유하는 MeOH (5 mL) 용액을 천천히 상기 용액에 첨가하였다. 10 분 후, t.l.c.(EtOAc:MeOH, 9:1)가 생성물 (Rf 0.4)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액을 진공에서 농축하고 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:MeOH, 9:1)로 정제하여 표제 생성물(32 mg, 91％)을 흰색 무정형 고체로 얻었다. [α]D 25 -139.5 (c, 0.6 in MeOH); δH (500 MHz, CD3OD) 1.19 (3H, d, J CH,CH3 6.2 Hz, CHCH3), 1.49 (9H, s, C(CH3)3), 2.93 (1H, dd, JC H H,CH H 13.5 Hz, JC H,αH 9.5 Hz, CH2Cys), 3.32-3.46 (4H, m, H-3, H-4, H-5, CHH), 3.60-3.63 (1H, m, H-2), 3.73-3.77 (1H, m, H-6), 3.78 (3H, s, OMe), 3.92-3.94 (1H, m, H-6'), 4.31-4.36 (1H, m, CHCH3), 4.39 (1H, d, J 1,2 9.3 Hz, H-1), 4.48 (1H, d, J αH,CH 2.9 Hz, αHThr), 4.69 (1H, dd, J αH,C H H 9.0 Hz, JαH,CH H 5.2 Hz, αHCys)
실시예 46: N -부톡시카보닐-L-시스테이닐-( S -2-아세타미노-2-디옥시-1-β-D- 글루코피라노실 디술피드)-L-트레오닌 메틸에스테르 (N-Butoxycarbonyl-L-cysteinyl-( S -2-acetamino-2-deoxy-1-β-D-glucopyranosyldisulfide)-L-threonine methylester
Figure 112005515216504-PCT00049
상기 표제 생성물(32 mg, 91％)을 페닐 2-아세트아미도-2-디옥시-1-셀레닐술피드-β-D-글루코피라노시드를 출발물질로 이용하여 실시예 45의 방법과 유사한 방법에 의하여 흰색의 무정형 고체로 얻었다. [α]D 25 +6.21 (c, 0.45 in MeOH); δH (500 MHz, CD3OD) 1.19 (3H, d, J CHCH3 6.7 Hz, CHCH 3), 1.49 (9H, s, C(CH3)3), 1.99 (3H, s, COCH3), 2.97 (1H, dd, J CH, H 13.8 Hz, J C H,αH 9.6 Hz, CHHCys), 3.31-3.33 (1H, m, CHH), 3.38-3.41 (1H, m, H-5), 3.45 (1H, at, J 9.3 Hz, H-4), 3.54 (1H, dd, J 2,3 8.6 Hz, J 3,4 9.8 Hz, H-3), 3.76-3.77 (1H, m, H-6), 3.78 (3H, s, OMe), 3.79-4.01 (2H, m, H-2, H-6'), 4.33 (1H, dq, J CHCH3 6.3 Hz, J CH,αH 3.0 Hz, CHCH3), 4.48 (1H, d, J αH,CH 3.0 Hz, αHThr), 4.59 (1H, d, J 1,2 10.3 Hz, H-1), 4.63-4.67 (1H, m, αHcys)
실시예 47: 페닐-1-셀레닐술피드-β-D-글루코피라노시드 (Phenyl-1- selenenylsulfide-β-D-glucopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00050
1-티오-β-D-글루코피라노시드 (200 mg, 0.9 mmol) 및 페닐셀레닐 브로마이드 (230 mg, 1.0 mmol)를 아르곤 대기 하에서 교반된 무수 1,4-디옥산 (5 mL)에 첨가하였다. 1 분 후, t.l.c (ethyl acetate)가 주 생성물(Rf 0.2)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 트리에틸아민 (2 mL)의 첨가로 억제하고 진공에서 농축하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (ethyl acetate:methanol, 9:1)로 정제하여 표제 생성물(165 mg, 57％)을, 회색을 띤 흰색의 무정형 고체로 수득하였다. [α]D 22 +56.2 (c, 1 in CHCl3); δH (400 MHz, MeOD) 3.31-3.33 (2H, m, H-3, H-5), 3.39-3.45 (2H, m, H-2, H-4), 3.62 (1H, dd, J 5,6 5.3 Hz, J 6,6'? 12.1 Hz, H-6), 3.83 (1H, dd, J 5,6'? 1.9 Hz, J 6,6' 12.2 Hz, H-6), 4.47 (1H, d, J 1,2 9.4 Hz, H-1), 7.27-7.34 (3H, m, Ar-H), 7.75-7.78 (2H, m, Ar-H)
실시예 48: 페닐 1-셀레닐술피드-β-D-갈락토피라노시드 (Phenyl 1-selenenylsulfide-β-D-galactopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00051
상기 표제 생성물(193 mg, 20％)을 1-티오-β-D-갈락토피라노시드를 출발물질로 이용하여 실시예 47의 방법과 유사한 방법에 의하여 회색을 띤 흰색의 무정형 고체로 얻었다. [α]D 25 -111.4 (c, 1 in MeOH); δH (400 MHz, CD3OD) 3,52 (1H, dd, J 2,3 9.4 Hz, J 3,4 3.3 Hz, H-3), 3.56 (1H, at, J 4,5 0.9 Hz, J 6.5 Hz, H-5), 3.67-3.69 (2H, d, J 6.0 Hz, H-6, H-6', 3.74 (1H, at, J 9.3 Hz, H-2), 3.91 (1H, dd, J 3,4 3.2 Hz, J 4,5 0.7 Hz, H-4), 4.45 (1H, d, J 1,2 9.7 Hz, H-1), 7.27-7.30 (3H, m, Ar-H), 7.76-7.79 (2H, m, Ar-H).
실시예 49: 페닐 2,3,4,6-테트라- O -아세틸-1-셀레닐술퍼드-β-D-글루코퍼라노시드 (Phenyl 2,3,4,6-tetra- O -acetyl-1-selenenylsulfide-β-D-glucopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00052
1-티오-2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-글루코피라노스 (200 mg, 0.6 mmol) 및 PhSeBr (150 mg, 0.6 mmol)을 신선하게 증류된 DCM (5 mL)에 첨가하고 실온에서 아르곤 하에서 교반하였다. 5 분 후에, 출발물질(Rf 0.4)이 완전히 소비됨에 따라 t.l.c (petrol:EtOAc, 1:1)가 주 생성물(Rf 0.5)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 트리에틸아민 (2 mL)의 첨가로 억제하고 5분간 교반하였다. 이것을 DCM (5 mL) 및 물 (10 mL) 사이에서 분배하고 수용액 층을 DCM (3 x 5 mL)로 재추출하였다. 혼 합된 유기층을 소금물(10 mL)로 세척하고, MgSO4 로 건조한 후 여과하여 상기 용매를 진공에서 제거하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (petrol:EtOAc, 2:1)로 정제하여 표제 생성물(260 mg, 93％)을 노란색 결정성 고체로 수득하였다. mp 111-112 ℃; [α]D 25 -250.1 (c, 1.0 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3) 2.02, 2.01, 2.00 (12H, 4 x s, 4 x CH3), 3.75 (1H, ddd, J 4,5 9.9 Hz, J 5,6 2.4 Hz, J 5,6'? 4.6 Hz, H-5), 4.08 (1H, dd, J 5,6 2.6 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6), 4.16 (1H, dd, J 5,6'? 4.5 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6'), 4.62 (1H, d, J 1,2 9.8 Hz, H-1), 5.12 (1H, at, J 9.7 Hz, H-4), 5.20-5.30 (2H, m, H-2, H-3), 7.25-7.28 (3H, m, Ar-H), 7.67-7.70 (2H, m, Ar-H)
실시예 50: 페닐 2,3,4,6-테트라- O -아세틸-1-셀레닐술피드-β-D-갈락토피라노시드 (Phenyl 2,3,4,6-tetra- O -acetyl-1-selenenylsulfide-β-D-galactopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00053
표제 화합물(402 mg, 95％)을 1-티오-2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노스를 출발물질로 이용하여 실시예 49의 방법과 유사한 방법에 의하여 노란색 결정성 고체로 얻었다. Mp 123-125 ℃; [a]D 25 -172.4 (c, 1.0 in CHCl3); δH(400 MHz, CDCl3) 1.99, 2.02, 2.16 (12H, 4 x s, 4 x CH3), 3.94-4.03 (3H, m, H-5, H-6, H-6'), 4.64 (1H, d, J 1,2 10.1 Hz, H-1), 5.04 (1H, dd, J 2,3 10.2 Hz, J 3,4 3.3 Hz, H-3), 5.40-5.45 (2H, m, H-2, H-4), 7.27-7.30 (3H, m, Ar-H), 7.69-7.71 (2H, m, Ar-H).
실시예 51: 페닐 3,4,6-트리- O -아세틸-2-아세트아미도-2-디옥시-1-셀레닐술피드-β-D-글루코피라노시드 (Phenyl 3,4,6-tri- O -acetyl-2-acetamido-2-deoxy-1-selenenylsulfide-β-D-glucopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00054
표제 화합물(300 mg, 66％)을 1-티오-3,4,6-트리-O-아세틸-2-아세트아미도-2-디옥시-β-D-글루코피라노스를 출발물질로 이용하여 실시예 49의 방법과 유사한 방법에 의하여 흰색 결정성 고체로 얻었다. Mp 177-179℃; [a]D 25 -134.0 (c, 1.0 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3) 1.90 (3H, s, NHCOCH 3 ), 1.99, 2.00, 2.03 (9H, 3 x s, 3 x CH3), 3.76 (1H, ddd, J 4,5 10.1 Hz, J 5,6 2.3 Hz, J 5,6'? 4.7 Hz, H-5), 4.07(1H, dd, J 5,6 2.3 Hz, J 6,6' 12.3 Hz, H-6), 4.15 (1H, dd, J 5,6'? 4.6 Hz, J 6,6'? 12.2 Hz, H-6'), 4.19-4.24 (1H, m, H-2), 4.78 (1H, d, J 1,2 10.1 Hz, H-1), 5.09 (1H, at, J 9.7 Hz, H-4), 5.28 (1H, at, J 9.5 Hz, H-3), 5.79 (1H, d, J 9.1 Hz, NHAc), 7.24-7.28 (3H, m, Ar-H), 7.68-7.70 (2H, m, Ar-H).
실시예 52: 페닐-2-아세틸아미노-2-디옥시-1-셀레닐술피드-β-D-글루코피라노시드(Phenyl-2-acetylamino-2-deoxy-1-selenenylsulfide-β-D-glucopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00055
1-티오-2-아세틸아미노-2-디옥시-β-D-글루코피라노시드 (230 mg, 0.98 mmol) 및 페닐셀레닐 브로마이드 (250 mg, 1.08 mmol)를 아르곤 대기 하에서 교반된 무수 1,4-디옥산 (5 mL) 및 무수 메탄올 (3 ml)에 첨가하였다. 1 분 후에, t.l.c. (ethyl acetate:methanol, 9:1)가 주 생성물(Rf 0.4)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 트리에틸아민 (5 mL)의 첨가로 억제하고 진공에서 농축하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (ethyl acetate:methanol, 9:1)로 정제하여 표제 생성물(270 mg, 70％)을, 흰색의 무정형 고체로 수득하였다. [a]D 22 -174.0 (c, 1 in MeOH); δH (400 MHz, MeOD), 1.96 (3H, s, CH3), 3.31-3.39 (2H, m, H-4, H-5), 3.51 (1H, at, J 8.1 Hz, H-3), 3.65 (1H, dd, J 5,6 5.0 Hz, J 6,6'? 11.7 Hz, H-6), 3.82-3.90 (2H, m, H-2, H-6'), 4.65 (1H, d, J 1,2 10.2 Hz, H-1), 7.27-7.34 (3H, m, ArH), 7.72-7.74 (2H, m, ArH)
실시예 53: 에틸 1-티오-β-D-글루코피라노실 디술피드 (Ethyl 1-thio-β-D-glucopyranosyl disulfide)
Figure 112005515216504-PCT00056
페닐 1-셀레닐술피드-β-D-글루코피라노시드 (140 mg, 0.4 mmol)을 MeOH(10 mL)에 녹이고 실온에서 교반하였다. 이 용액에, 에탄 티올 (10 μL, 0.1 mmol) 및 트리에틸아민 (60 μL, 0.4 mmol)을 함유하는 MeOH (5 mL) 용액을 방울 단위로 1 시간에 걸쳐 첨가하였다. 1 시간 후, 출발물질(Rf 0.5)을 완전히 소비함에 따라 t.l.c. (EtOAc:MeOH, 9:1)가 주 생성물(Rf 0.4)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액을 진공에서 농축하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:MeOH, 5:1)로 정제하고 표제 생성물(30 mg, 90％)을 흰색 무정형 고체로 수득하였다. [a]D 22 -65.3 (c, 0.4 in CHCl3); δH (500 MHz, CD3OD) 1.33 (3H, t, J 7.4 Hz, CH3), 2.86 (2H, q, J 7.4 Hz, CH2), 3.30-3.34 (2H, m, H-4, H-5), 3.41 (1H, at, J 9.0 Hz, H-3), 3.49 (1H, at, J Hz, H-2), 3.67 (1H, dd, J 5,6 5.3 Hz, J 6,6' 12.0 Hz, H-6), 3.88 (1H, dd, J 5,6' 2.1 Hz, J6,6' 12.0 Hz, H-6'), 4.35 (1H, d, J 1,2 9.1 Hz, H-1)
실시예 54: 에틸 2-아세트아미도-2-디옥시-1-디술피드-β-D-글루코피라노시 드(Ethyl 2-acetamido-2-deoxy-1-disulfide-β-D-glucopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00057
페닐 2-아세트아미도-2-디옥시-1-셀레닐술피드-β-D-글루코피라노시드 (140 mg, 0.4 mmol)를 MeOH (10 mL)에 녹이고 실온에서 교반하였다. 이 용액에 에탄 티올(10 μL, 0.13 mmol) 및 트리에틸아민 (55 μL, 0.4 mmol)을 함유하는 MeOH (5 mL) 용액을 방울 단위로 1시간에 걸쳐 첨가하였다. 1 시간 후, t.l.c. (EtOAc:MeOH, 9:1)가 주 생성물(Rf 0.2)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액을 진공에서 농축하고 플래시 컬럼 크로마토그래피(EtOAc:MeOH, 9:1)로 정제하여 표제 생성물(38 mg, 99％)을 흰색의 무정형 고체로 얻었다. [a]D 25 -7.9 (c, 1.0 in CHCl3); δH (400 MHz, CD3OD) 1.30 (3H, t, J 7.3 Hz, CH3), 2.01 (3H, s, OAc), 2.83-2.86 (2H, m, CH2), 3.31-3.39 (2H, m, H-4, H-5), 3.51-3.56 (1H, m, H-3), 3.68-3.72 (1H, m, H-6), 3.84-3.91 (2H, m, H-2, H-6'), 4.57 (1H, d, J 1,2 10.3 Hz, H-1)
실시예 55: 티오설포네이트 시약을 이용한 단백질 당화 과정
A. SBLS156C 변이체 (24 mg, 0.89 mmol)를 수용성 완충용액(2.4 mL, 70 mM HEPES, 2 mM CaCl 2 , pH 6.9)에 녹였다. 2,3,4,6-테트라- O -아세틸-β-D-글루코피라노실 페닐티오술포네이트 (50 mg, 0.1 mmol)를 물/아세토니트릴 (1.6 mL, 9/7 v/v)에 녹였다. 50 μL의 당 용액 일정량을 상기 단백질 용액에 첨가하여 end-over-end rotator에 놓아두었다. 25 분 후, 유리(free) 티올의 존재가 엘만 분석(Ellman, G. L. Arch. Biochem. Biophys. 1959, 82, 70)에 의하여 확인되었고, 이 시점에서 50 μL의 당 용액의 다른 일정량을 첨가하였다. 상기 반응을 5 분간 end-over-end rotator에 더 놓아두고, 상기 시점에서 반응 혼합물을 PD10 Sephadex®G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 상기 단백질 분획을 모아 10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5.8, (1 x 4L for 1 h, 2 x 2L for 30 min)에서 투석(MWCO 12-14 KDa)하여 당화된 생성물(m/z (ES) 실험값 27072, 계산값 27078)을 얻었다.
B. SBLS156C 변이체 (24 mg, 0.89 μmol)를 수용성 완충용액(2.4 mL, 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 6.9)에 녹였다. 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실 페닐티오술포네이트 (50mg, 0.1 mmol)를 물/아세토니트릴 (1.0 mL, 1/1 ratio)에 녹였다. 50 μL의 당 용액 일정량을 상기 단백질 용액에 첨가하여 end-over-end rotator 상에 놓아두었다. 25 분 후, 유리(free) 티올의 존재가 엘만 분석(Ellman, G. L. Arch. Biochem. Biophys. 1959, 82, 70)에 의하여 확인되었고, 이 시점에서 50 μL의 당 용액의 다른 일정량을 첨가하였다. 상기 반응을 5 분간 end-over-end rotator에 더 놓아두고, 상기 시점에서 반응 혼합물을 PD10 Sephadex® G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 상기 단백질 분획을 모 아 10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5.8, (1 x 4L for 1 h, 2 x 2L for 30 min)에서 투석(MWCO 12-14 KDa)하여 당화된 생성물(m/z (ES) 실험값 27072, 계산값 27078)을 얻었다.
C. SBLS156C 변이체 (10 mg, 0.37 μmol)를 가스가 제거된 수용성 완충 용액(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)에 녹였다. 2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-글루코피라노실)-α-D-글루코피라노실)-β-D-글루코피라노실 페닐티오술포네이트 (30mg, 0.03 mmol) 를 아세토니트릴 (150 μL)에 녹였다. 당 용액(75 μL)을 상기 단백질 용액에 첨가하고 end-over-end rotator 상에 올려놓았다. 30 분 후, 유리(free) 티올의 존재가 엘만 분석에 의하여 확인되었고, 이 시점에서 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex® G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 단백질 분획을 모아 10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5.8, (1 x 4L for 1 h, 2 x 2L for 30 min)에서 투석(MWCO 12-14 KDa)하여 당화된 생성물(m/z (ES) 실험값 27654, 계산값 27653)을 얻었다.
D. BSA (10 mg, 0.14 μmol)를 수용성 완충 용액 (1 mL, 50 mM Tris, pH 7.7)에 녹였다. 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-글루코피라노실 페닐티오 술포네이트 (10 mg, 0.02 mmol)를 물/아세토니트릴 (1.0 mL, 8/2 ratio)에 녹였다. 당 용액(150 μL)을 상기 단백질 용액에 첨가하고 end-over-end rotator 상에 올려놓았다. 30 분 후, 유리(free) 티올의 존재가 엘만 분석에 의하여 확인되었고, 이 시점에서 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex® G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 단백질 분획을 모아 순수한 물(1 x 4L for 1 h, 2 x 2L for 30 min)에서 투석(MWCO 12-14 KDa)하여 당화된 생성물(m/z (ES) 실험값 66798, 계산값 66794)을 얻었다.
E. BSA (10 mg, 0.14 μmol)을 수용성 완충 용액(1 mL, 50 mM Tris, pH 7.7)에 녹였다. 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-갈락토피라노실 페닐티오술포네이트 (25 mg, 0.05 mmol)를 아세토니트릴 (0.5 mL)에 녹였다. 당 용액(75 μL)을 상기 단백질 용액에 첨가하고 end-over-end rotator 상에 올려놓았다. 30 분 후, 유리(free) 티올의 존재가 엘만 분석에 의하여 확인되었고, 이 시점에서 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex® G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 단백질 분획을 모아 순수한 물(1 x 4L for 1 h, 2 x 2L for 30 min)에서 투석(MWCO 12-14 KDa)하여 당화된 생성물(m/z (ES) 실험값 66792, 계산값 66794)을 얻었다.
실시예 56: 셀레닐술피드 시약을 이용한 단백질 당화 과정
SBLS156C 변이체 (5 mg)를 가스가 제거된 수용성 완충 용액(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5) 에 녹였다. 페닐 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-셀레닐술피드 글루코피라노시드 (10 mg, 0.02 mmol)를 아세토니트릴 (500 μl)에 녹였다. 당 용액(500 μL)을 상기 단백질 용액에 첨가하고 end-over-end rotator 상에 올려놓았다. 1 시간 후, 유리(free) 티올의 존재가 엘만 분석에 의하 여 확인되었고, 이 시점에서 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex® G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 단백질 분획을 모아 물(1 x 4L for 1 h, 2 x 2L for 30 min)에서 투석(MWCO 12-14 KDa)하여 당화된 생성물(m/z (ES) 실험값 27074, 계산값 27077)을 얻었다.
B. BSA (5 mg)를 가스가 제거된 수용성 완충 용액 (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)에 녹였다. 페닐 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-셀레닐술피드 글루코피라노시드 (10 mg, 0.02 mmol)를 아세토니트릴 (800 μl)에 녹였다. 당 용액(800 μL)을 상기 단백질 용액에 첨가하고 end-over-end rotator 상에 올려 놓았다. 1 시간 후, 유리(free) 티올의 존재가 엘만 분석에 의하여 확인되었고, 이 시점에서 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex® G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 단백질 분획을 모아 물(1 x 4L for 1 h, 2 x 2L for 30 min)에서 투석(MWCO 12-14 KDa)하여 당화된 생성물(m/z (ES) 실험값 66792, 계산값 66794)을 얻었다.
C. SBLS156C 변이체 (5 mg)를 가스가 제거된 수용성 완충 용액(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)에 녹였다. 페닐 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-β-D-셀레닐술피드 갈락토피라노시드 (10 mg, 0.02 mmol)를 아세토니트릴 (500 μl)에 녹였다. 당 용액(500 μL)을 상기 단백질 용액에 첨가하고 end-over-end rotator 상에 올려놓았다. 1 시간 후, 유리(free) 티올의 존재가 엘만 분석에 의하여 확인되었고, 이 시점에서 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex® G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 단백질 분획을 모아 물(1 x 4L for 1 h, 2 x 2L for 30 min)에서 투석(MWCO 12-14 KDa)하여 당화된 생성물 Glc(Ac)4SBLS126C(m/z (ES) 실험값 27074, 계산값 27077)을 얻었다.
D. SBLS156C 변이체 (10 mg)를 가스가 제거된 수용성 완충 용액(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)에 녹였다. 페닐-1-셀레닐술피드-β-D-글루코피라노시드 (15 mg, 0.02 mmol)를 물 /아세토니트릴 (0.8 mL, 1/1 ratio)에 녹였다. 당 용액(500 μL)을 상기 단백질 용액에 첨가하고 end-over-end rotator 상에 올려놓았다. 30 분 후, 유리(free) 티올의 존재가 엘만 분석에 의하여 확인되었고, 이 시점에서 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex® G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 단백질 분획을 모아 물(1 x 4L for 1 h, 2 x 2L for 30 min)에서 투석(MWCO 12-14 KDa)하여 AcGlcSBLS126C (m/z (ES) 실험값 27072, 계산값 26911)을 얻었다.
E. SBLS156C 변이체 (5 mg)을 가스가 제거된 수용성 완충 용액(2.4 mL, 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 6.9)에 녹였다. 페닐 -2-아세틸아미노-2-디옥시-1-셀레닐술피드-β-D-글루코피라노시드 (5 mg, 0.01 mmol)을 아세토니트릴 (200 μL, 1/1 ratio)에 녹였다. 당 용액(100 μL)을 상기 단백질 용액에 첨가하고 end-over-end rotator 상에 올려놓았다. 30 분 후, 유리(free) 티올의 존재가 엘만 분석에 의하여 확인되었고, 이 시점에서 당 용액의 다른 일정량(100 μL)을 첨가하였다. 상기 반응을 end-over-end rotator 상에 30 분 더 올려놓았다. 상기 시점에서 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex® G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 단백질 분획을 모아 10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5.8, (1 x 4L for 1 h, 2 x 2L for 30 min)에서 투석(MWCO 12-14 KDa)하여 HOGlcNAcSBLS156C(m/z (ES) 실험값 26950, 계산값 26950)을 얻었다.
F. SBLS156C 변이체 (5 mg)를 가스가 제거된 수용성 완충 용액 (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)에 녹였다. 페닐 3,4,6-트리-O-아세틸-2-아세틸아미노-2-디옥시-1-셀레닐술피드-β-D-글루코피라노시드 (10 mg, 0.02 mmol)를 아세토니트릴 (500 μl)에 녹였다. 당 용액(500 μL)을 상기 단백질 용액에 첨가하고 end-over-end rotator 상에 올려놓았다. 1 시간 후, 유리(free) 티올의 존재가 엘만 분석에 의하여 확인되었고, 이 시점에서 상기 시점에서 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex® G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 단백질 분획을 모아 물(1 x 4L for 1 h, 2 x 2L for 30 min)에서 투석(MWCO 12-14 KDa)하여 AcGlcNAcSBLS126C(m/z (ES) 실험값 27074, 계산값 27078)을 얻었다.
G. SBLCys156 (5 mg)을 가스가 제거된 수용성 완충 용액(500 μL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)에 녹였다. 페닐 2,3,6-트리-O-아세틸-1-셀레닐술피드-4-O-(2,3,6-트리-O-아세틸-4-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-글루코피 라노실)-α-D-글루코피라노실)-β-D-글루코피라노시드(15 mg, 0.015 mmol) 을 아세토니트릴 (300 μL, 75 eq)에 녹이고, 이 용액을 상기 단백질 용액에 첨가하여 end-over-end rotator 상에 올려놓았다. 30 분 후, 유리(free) 티올의 존재가 엘만 분석에 의하여 확인되었다. 상기 반응을 end-over-end rotator 상에 30 분 더 올려놓았다. 상기 시점에서 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex® G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 단백질 분획을 모아 물(1 x 4L for 1 h, 2 x 2L for 30 min)에서 투석(MWCO 12-14 KDa)하여 Glc(Ac)4Glc(Ac)3Glc(Ac)3-SBLCys156(m/z (ES+) 실험값 27644, 계산값 27653)을 얻었다.
H. SBLCys156 (5 mg) 을 가스가 제거된 수용성 완충 용액 (500 μL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)에 녹였다. 페닐 1-셀레닐술피드-β-D-갈락토피라노시드 (15 mg, 0.04 mmol) 을 물/아세토니트릴 (600 μL, 1/3 ratio)에 녹였다. 당 용액(600 μL, 230 eq)을 상기 단백질 용액에 첨가하고 end-over-end rotator 상에 올려놓았다. 30 분 후, 유리(free) 티올의 존재가 엘만 분석에 의하여 확인되었고, [8]상기 반응을 end-over-end rotator 상에 30분 더 올려놓았다. 상기 시점에서 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex® G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 단백질 분획을 모아 물(1 x 4L for 1 h, 2 x 2L for 30 min)에서 투석(MWCO 12-14 KDa)하여 Gal-SBLCys156(m/z (ES+) 실 험값 26908, 계산값 26909)을 얻었다.
Ⅰ. 1-티오-β-D-말토트리오스 (104 mg, 0.2 mmol)를 MeOH (5 mL)에 녹이고, 여기에 PhSeBr (70 mg, 0.3 mmol)을 함유하는 EtOAc (2 mL) 용액을 첨가하였다. 2 분 후, 트리에틸아민 (2 mL)을 첨가하고 상기 반응을 물(10 mL) 및 페트롤 (5 mL)로 희석하였다. 상을 분리하고 수용액 층을 페트롤 (3 x 10 mL)로 세척한 후 동결건조(lyophilised)하였다. 조제(crude)의 페닐 1-셀레닐술피드-말토트리오스 (m/z 755, 757 (M+Br-, 100％))을 물(10 mL)에 녹이고 이 중 50 μL (25 eq)을, SBLCys156 (1 mg)을 함유하는 500 μL의 완충용액 (70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)에 첨가하였다. 상기 용액을 end-over-end rotator 상에 올려놓았다. 2.5 시간 후, 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex® G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 단백질 분획을 모아 GlcGlcGlc-SBLCys156 (m/z (ES+) 실험값 27226, 계산값 27233)을 얻었다.
J. BSA (5 mg)을 가스가 제거된 수용성 완충 용액(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)에 녹였다. 페닐 1-셀레닐술피드-β-D-글루코피라노시드(6 mg, 0.02 mmol)를 물/아세토니트릴 (0.7 mL, 2/5 ratio)에 녹였다. 당 용액(700 μL, 225 eq)을 상기 단백질 용액에 첨가하고 end-over-end rotator 상에 올려놓았다. 1 시간 후, 유리(free) 티올의 존재가 엘만 분석에 의하여 확인되었고, [8]상기 시점에서 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex® G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 단백질 분획을 모아 물(1 x 4L for 1 h, 2 x 2L for 30 min)에서 투석(MWCO 12-14 KDa)하여 Glc-BSA(m/z (ES+) 실험값 66620, 계산값 66625)을 얻었다.
셀레닐술피드(selenenylsulfide) 시약을 이용한 당화 반응의 요약
[표 2]
Figure 112005515216504-PCT00058
실시예 57: 화학식 1의 화합물과 glyco-MTS 시약의 비교
표 3과 표 4에서 MTS는 CH3-SO2-S-를, PTS는 Ph-SO2-S-를 나타낸다.
제조 (Preparation)
[표 3]
Figure 112005515216504-PCT00059
1. 상응하는 모(parent) 탄수화물 D-glucose (Glc), D-galactose (Gal) 또는 Glcα(1,4)Glcα(1,4)Glc에서 유래됨.
2. B.G. Davis, R.C. Lloyd and J.B, Jones, J. Org. Chem., 1998, 63, 9614, and B.G. Davis, M.A.T. Maughan, M.P. Green, A. Ullman and J.B. Jones, Tetrahedron Asymmetry, 2000, 11, 245 참조.
3. B. G. Davis, S. J. Ward and P. M. Randle, Chem. Commun., 2001, 189 참조.
표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 glyco-PTS 시약은, 상응하는 glyco-MTS 시약보다 월등한 수율로 합성되었다. 또한, glyco-PTS 시약 합성의 출발물질의 비용이, 상응하는 glyco-MTS 시약보다 약 10 배 더 낮다(2003 년 비용).
표 4에서, SBL-Cys156은 서브틸리신 Bacillus lentus 변이체 S156C이고 BSA-Cys58은 소혈청 알부민이다.
glyco-MTS 및 glyco-PTS 시약의 당화 반응 비교
[표 4]
Figure 112005515216504-PCT00060
1. Et3N, DCM, RT, 티오설포네이트 1 당량 (eq.).
2. Et3N, DCM/MeOH (20:1), RT, 티오설포네이트 1 당량; 펩티드 [P]-Cys- Ser-OMe, Glc(Ac)4α(1,4)Glc(Ac)3α(1,4)Glc(Ac)3-PTS
Figure 112005515216504-PCT00061
반응하는 경우에 [P] = Boc, Glc(Ac)4α(1,4)Glc(Ac)3α(1,4)Glc(Ac)3β-PTS와 반응하는 경우를 제외한 경우에는 [P] = Ac.
3. 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2 pH 9.5 또는 50 mM Tris.HCl, pH 7.7, RT, glyco-MTS의 경우 ~30 eq, Glc(Ac)4β-PTS 및 Gal(Ac)4β-PTS 를 SBL-Cys156 과 반응시키는 경우는 ~10 eq., Glc(Ac)4β-PTS 및 Gal(Ac)4β-PTS 를 BSA-Cys58 와 반응시키는 경우는 ~20 eq., Glc(Ac)4α(1,4)Glc(Ac)3α(1,4)Glc(Ac)3β-PTS를 SBL-Cys156과 반응시키는 경우는 40 eq.
4. B.G. Davis, R.C. Lloyd and J.B. Jones, J. Org. Chem., 1998, 63, 9614, and B.G. Davis, M.A.T. Maughan, M.P. Green, A. Ullman and J.B. Jones, Tetrahedron Asymmetry, 2000, 11, 245. 참조.
5. B. G. Davis, S. J. Ward and P. M. Randle, Chem. Commun., 2001, 189 참조.
표 4에 나타난 것과 같이, 본 발명의 glyco-PTS 시약은, 상응하는 glyco-MTS 화합물보다 당화 반응의 높은 수율을 일반적으로 제공한다.
실시예 58: 다양한 pH에서 GlcGlcGlc-S-SePh 를 이용한 SBLCys156의 당화
[표 5]
Figure 112005515216504-PCT00062
반응 조건: SBLCys156 을 [a] 10 mM Tris pH 7.5; [b] 70 mM CHES, 5mM MES, 2 mM CaCl2, pH 8.5; [c] 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5에서 GlcGlcGlc-S-SePh (20 eq.)과 1 시간 동안 배양하였다.
실시예 59: 대표적인 단백질 파네실화
SBLCys156 (10 mg)을 수용성 완충 용액 (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)에 녹였다. PMSF (140 μL of a 100 mg/mL solution in 아세토니트릴)를 첨가하였다. 10 분 후, 상기 반응 혼합물을 비바스핀(Vivaspin) 원심분리 필터(10 kDa MWCO, Sartorius) 상에서 농축하였고, 300 μL의 Milli Q water를 첨가하여 이 과정을 3번 반복하였다. 상기 과정으로 비활성화된 SBLCys156 일정량(1 mg)을 200 μL의 완충용액(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)에 녹였다. 파네실 페닐티오술포네이트 (56 μL of a 5 mg/mL solution in THF, 20 equivalents)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 end-over-end rotator상에 올려놓았다. 1시간 후에, 상기 반응액을 비바스핀 원심분리 필터(4 filtrations with addition of Milli Q water)를 이용하여 탈염하고 질량 분광기(mass spectrometry)로 분석하 였다.
상기 실시예는 본 발명의 방법이 단백질에 파네실 그룹을 붙이는데 사용될 수도 있음을 보여준다. 파네실화(Farnesylation)는 많은 단백질들과 연관되어 자연적으로 일어나는 번역 후 변형이다.
실시예 60: D-만노오스 펜타아세테이트 (D-Mannose pentaacetate)
Figure 112005515216504-PCT00063
만노오스 (50 g, 280 mmol)를 아세틱 안히드리드 (200 mL) 및 피리딘 (200 mL)의 교반된 용액에 현탁하였다. 24 시간 후에, 출발물질(Rf 0.0)을 완전히 소비함에 따라, t.l.c. (petrol:ethyl acetate, 1:1)가 생성물(Rf 0.3)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응액을 물(400 mL)로 희석하고 에틸아세테이트 (300 mL)로 분배(partition)하여 상을 분리하였다. 수용액 층을 에틸아세테이트 (2 x 200 mL)로 재추출하였다. 혼합된 유기층을 희석된 염산 (2 L, 1M), 탄산수소나트륨 (500 mL of a saturated aqueous solution), 소금물 (300 mL)로 세척하고 건조(MgSO4) 후, 여과한 뒤 진공에서 농축하여 표제 화합물(107.3 g, 98％)을 아노머 혼합물의 오일형태로 얻었다. (α/β 2:1); δH (400 MHz, CDCl3) 1.95, 1.99, 2.05, 2.16(15 H, 4 x s, COCH3β), 1.96, 2.00, 2.04, 2.12, 2.13 (15 H, 5 x s, COCH3α), 3.78 (1H, ddd, J 4,5 9.9 Hz, J 5,6 2.3 Hz, J 5,6 5.4 Hz, H-5β), 3.99-4.03 (m, H-5α), 4.05- 4.10 (2H, m, H-6α, H-6β), 4.23 (1H, dd, J 5,6' 5.0 Hz, J 6,6' 12.1 Hz, H-6α), 4.26 (1H, dd, J 5,6' 5.3 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6'b), 5.10 (1H, dd, J 2,3 3.3 Hz, J 3,4 10.3 Hz, H-3β), 5.20-5.21 (1H, dd, J 1,2 2.1 Hz, J 2,3 2.5 Hz, H-2α), 5.24-5.30 (3H, m, H-3α, H-4α, H-4β), 5.43 (1H, dd, J 1,2 1.2Hz, J 2,3 3.2 Hz, H-2β), 5.83 (1H, d, J 1,2 0.9 Hz, H-1β ), 6.03 (1H, d, J 1,2 2.1 Hz, H-1α)
실시예 61: 2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α-D-만노피라노소일 브로마이드(2,3,4,6-Tetra- O -acetyl-α-D-mannopyranosoyl bromide)
Figure 112005515216504-PCT00064
D-만노오스 펜타아세테이트 (103 g, 264 mmol)를 무수 DCM (200 mL)에 녹였다. 여기에, 브롬화수소 (33％ in acetic acid, 200 mL)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 아르곤 하에 두었다. 2 시간 후, 출발물질(Rf 0.2)을 완전히 소비함에 따라, t.l.c. (petrol:ethyl acetate, 2:1)가 생성물(Rf 0.3)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응 혼합물을 DCM (100 mL)와 얼음물 (200 mL)사이에서 분배하고 수용액 층을 DCM (3 x 200 mL)으로 재추출하였다. 혼합된 유기층을 pH가 8이 될 때까지 탄산수소나트륨으로 세척한 후 소금물로 세척하였다. 건조시킨(MgSO4) 후, 여과한 뒤 진공에서 농축하였다. 그 결과, 표제 화합물(106.6 g)을 정제과정 없이 깨끗한 오일 형태로 얻었다. δH(400 MHz, CDCl3) 1.96, 2.03, 2.06, 2.13 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 4.09 (1H, dd, J 5,6 2.2 Hz, J 6,6 12.5 Hz, H-6), 4.18 (1H, dd, J 4,5 10.1 Hz, J 5,6 2.2 Hz, J 5,6' 4.8 Hz, H-5), 4.28 (1H, dd, J 5,6 4.9 Hz, J 6,6' 12.5 Hz, H-6'), 5.32 (1H, at, J 10.1 Hz, H-4), 5.39 (1H, dd, J 1,2 1.6 Hz, J 2,3 3.5 Hz, H-2), 5.66 (1H, dd, J 2,3 3.5 Hz, J 3,4 10.1 Hz, H-3), 6.26 (1H, bs, H-1)
실시예 62: (2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α-D-만노피라노실)-1-이소티오우로늄 브로마이드((2,3,4,6-Tetra- O -acetyl-α-D-mannopyranosyl)-1-isothiouronium bromide)
Figure 112005515216504-PCT00065
표제 화합물 (80.6 g, 60％, 2 steps)을 실시예 3의 방법과 유사한 방법으로 2,3,4,6-테트라-O-벤질-D-α-만노피라노소일 브로마이드를 출발물질로 이용하여 흰색 결정성 고체로 얻었다. Mp 123-126 ℃ [Lit. 125-128 ℃ (H2O)]; [α]D 26+119.0 (c, 1.0 in MeOH) [Lit. [α]D 27+103 (c, 1.0 in Acetone)]; δH (400 MHz, DMSO-d6) 1.95, 2.02, 2.03, 2.14 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 4.08 (1H, dd, J 5,6 2.4 Hz, J 5,6' 12.3 Hz, H-6), 4.22 (1H, dd, J 5,6' 2.4 Hz, J 6,6' 12.5 Hz, H-6'), 4.32 (1H, ddd, J 4,5 10.0 Hz, J 5,6 2.2 HZ, J 5,6' 5.2 Hz, H-5), 5.05 (1H, dd, J 2,3 3.4 HZ, J 3,4 10.0 Hz, H-3), 5.17 (1H, at, J 10.0 Hz, H-4), 5.36 (1H, dd, J 1,2 1.5 Hz, J 2,3 3.4 Hz, H-2), 6.36 (1H, d, J 1,2 1.2 Hz, H-1), 9.40 (4H, bs, 2 x NH2).
실시예 63: 2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α-D-만노피라노실티올 (2,3,4,6-Tetra- O -acetyl-α-D-mannopyranosylthiol)
Figure 112005515216504-PCT00066
표제 화합물 (14.5 g, 98％)을 실시예 2의 방법과 유사한 방법으로 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-a-D-만노피라노실)-1-이소티오우로늄 브로마이드를 출발물질로 이용하여 색깔 없는 오일 형태로 얻었다. [α]D 24 +68.7 (c, 1.5 in CHCl3) [Lit. [α]D 20 +78.6 (c, 0.8 in CHCl3)]; δH (400 MHz, CDCl3) 1.98, 2.04, 2.08, 2.14 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 2.28 (1H, d, J 1,SH 6.7 Hz, SH), 4.10 (1H, dd, J 5,6 2.4 Hz, J 6.6'12.5 Hz, H-6), 4.28 (1H, dd, J 5,6' 5.1 Hz, J 6,6', 12.0 Hz, H-6'), 4.32-4.36 (1H, m, H-5), 5.26-5.34 (3H, m, H-2, H-3, H-4), 5.54 (1H, d, J 1,SH 6.9 Hz, H-1)
실시예 64: 페닐 2,3,4,6-테트라- O -아세틸-1-셀레닐술피드-α-D-만노피라노시드(Phenyl 2,3,4,6-tetra- O -acetyl-1-selenenylsulfide-α-D-mannopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00067
표제 화합물 (590 mg, 83％)을 실시예 49의 방법과 유사한 방법으로 2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-만노피라노실 티올을 출발물질로 이용하여 노란색 오일 형태로 얻었다. [α]D 25 +13.4 (c, 1.0 in CHCl3; δH (400 MHz, CDCl3) 1.94, 1.94, 2.02, 2.10 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 3.52 (1H, dd, J 5,6 2.4 Hz, J 6.6' 12.4 Hz, H-6), 3.94 (1H, ddd, J 4,5 9.6 Hz, J 5,6 2.5 Hz, J 5,6' 3.9 Hz, H-5), 4.07 (1H, dd, J 5,6' 3.9 Hz, J 6,6' 12.4 Hz, H-6'), 5.23 (1H, dd, J 2,3 3.2 Hz, J 3,4 9.9 Hz, H-3), 5.28 (1H, at, J 9.7 Hz, H-4), 5.38 (1H, d, J 1,2 1.6 Hz, H-1), 5.40 (1H, dd, J 1,2 1.5 Hz, J 2,3 3.1 Hz, H-2), 7.26-7.28 (3H, m ArH), 7.62-7.65 (2H, m, ArH)
실시예 65: 2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α-D-만노피라노시드(2,3,4,6-Tetra- O -acetyl-α-D-mannopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00068
D-만노오스 펜타아세테이트 (26.4 g, 67.7 mmol)를 신선하게 증류시킨 THF(150 mL)에 녹이고, 벤질아민 (11.1 mL, 101.5 mmol)을 상기 교반한 용액에 첨가하였다. 24 시간 후에, 출발물질(Rf0.5)을 완전히 소비함에 따라, t.l.c.(petrol:ethyl acetate, 1:1)가 생성물(Rf 0.3)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 희석된 염산 (100 mL, 1M)을 첨가하여 억제하고 10 분간 교반하였다. 상기 반응을 DCM (100 mL)으로 분배하고 상을 분리하였다. 수용성 상을 DCM (3 x 100 mL)으로 재추출하였다. 혼합된 유기물을 희석된 염산 (100 mL, 1M), 소금물 (100 mL)로 세척하고 건조한(MgSO4) 후 진공에서 농축하였다. 그 결과 생성된 오렌지 오일을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol:ethyl acetate, 1:1)로 정제하였다. 회색을 띤 흰색 결정을 혼합하고, 페트롤/에틸아세테이트에서 재결정하여 표제 화합물(12.4 g, 53％)을 흰색 결정성 고체 형태로 얻었다. mp 92-94 ℃ [Lit. 92℃]; [α]D 25 +17.8 (c, 1.0 in CHCl3); [Lit. [α]D 25 +21.0 (c, 1.0 in CHCl3)]; δH (400 MHz, CDCl3) 1.98, 2.04, 2.08, 2.14 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 4.09-4.14 (1H, m, H-6), 4.20-4.26 (2H, m, H-5, H-6'), 4.59-5.00 (1H, m, OH), 5.20-5.23 (2H, m, H-1, H-2), 5.27 (1H, at, J 9.9 Hz, H-4), 5.39 (1H, dd, J 2,3 2.7 Hz, J 3,4 9.6 Hz, H-3)
실시예 66: 1',1',1'-트리클로로 아세트이미데이트 2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α-D-만노피라노시드 (1',1',1'-Trichloro acetimidate 2,3,4,6-tetra- O -acetyl-α-D-mannopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00069
2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-만노피라노시드 (1.01 g, 2.87 mmol), 1,1,1-트리클로로아세토니트릴 (2.9 mL, 28.7 mmol) 및 활성화된 4Å 분자 체(molecular sieves) (ca. 500 mg)를 무수 DCM (20 mL)에 현탁하고 1 시간 동안 0 ℃ 에서 교반하면서 놓아두었다. 이 시점에서, DBU (0.085 mL, 0.57 mmol)를 첨가하였다. 1.5 시간 후에 출발물질(Rf0.2)을 완전히 소비함에 따라, t.l.c (petrol:ethyl acetate, 1:1)가 생성물(Rf 0.5)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 Celite® 을 통하여 여과하고, 진공에서 농축하였다. 상기 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol:ethyl acetate, 1:1)로 정제하여 표제 화합물(1.42 g, 99％)을 깨끗한 오일 형태로 수득하였다. [α]D 25 +42.7 (c, 1.0 in CHCl3) [Lit. [α]D 21 +50.0 (c, 1.0 in CHCl3)]; δH (400 MHz, CDCl3) 2.20, 2.07, 2.09, 2.29 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 4.15-4.22 (2H, m, H-5, H-6), 4.28 (1H, dd, J 5,6' 4.3 Hz, J 6.6' 11.8 Hz, H-6'), 5.40-5.42 (2H, m, H-3, H-4), 5.48 (1H, at, J 2.1 Hz, H-2), 6.29 (1H, d, J 1,2 1.9 Hz, H-1), 8.80 (1H, s, NH)
실시예 67: 벤질-α-D-만노피라노시드 (Benzyl-α-D-mannopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00070
D-만노오스 (30 g, 167 mmol) 및 아세틸 클로라이드 (13 mL, 167 mmol)를 ㅂ벤질 알콜 (250 mL)에 녹이고, 1 시간 동안 50 ℃ 까지 가열하였다. 이것을 낮은 압력 증류 (low pressure distillation)로 농축하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (ethylacetate/ methanol, 9:1)로 정제하여 이소프로판올/페트롤로부터 재결정하여 표제 화합물 (29.34 g, 70％)을 흰색의 결정성 고체로 얻었다. m.p. 126-127 ℃ [Lit 128-129 ℃]; [α]D 26 +102.0 (c, 1.1 in MeOH); [Lit. [α]D 18 +73.1 (c, 1.4 in H2O)]; δH (400 MHz, CD3OD) 3.62 (1H, ddd, J 4,5 9.5 Hz, J 5,6 2.3 Hz, J 5,6' 5.5 Hz, H-5), 3.68 (1H, at, J 9.3 Hz, H-4), 3.73-3.78 (2H, m, H-3, H-6), 3.85-3.88 (2H, m, H-2, H-6'), 4.75, 4.52 (2H, ABq, J 11.6 Hz, CH2), 4.86 (1H, d, J 1,2 1.8 Hz, H-1), 7.28-7.38 (5H, m, ArH).
실시예 68: 벤질 4,6-디- O -피볼일-α-D-만노피라노시드 (Benzyl 4,6-di- O - pivolyl-α-D-mannopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00071
벤질-α-D-만노피라노시드 (30.0 g, 111.0 mmol)를 비활성 아르곤 대기 하에서 무수 피리딘 (200 mL)에 현탁시켰다. 이 현탁액을 0℃냉각시키고 여기에 클로로트리페닐 메탄 (35 mL, 280 mmol)을 방울 단위로 첨가하였다. 클로로트리페닐 메탄을 첨가한 후, 출발물질(Rf 0.0)을 완전히 소비함에 따라, t.l.c. (ethyl acetate)가 주 생성물(Rf 0.7)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 물 (50 mL) 및 에틸아세테이트 (100 mL) 사이에서 분배하고, 상을 분리하여 수용액 상을 에틸아세테이트 (3 x 50 mL)로 재추출하였다. 혼합된 유기물을 pH가 7이 될 때까지 희석된 염산 (1L, 1M), 탄산수소나트륨 (800 mL의 포화된 수용액)으로 세척하고 소금물로 세척한 후 건조시켜(MgSO4) 진공에서 농축하였다. 이것을 에틸아세테이트/페트롤로부터 재결정하여 표제 화합물(27.07 g, 56％)을 흰색 결정성 고체로 수득하였다. mp 133-135℃; [α]D 25 +64.7 (c, 1.0 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3) 1.251, 1.254 (18H, 2 x s, 2 x C(CH3)3), 3.85 (1H, at, J 9.8 Hz, H-4), 3.92 (1H, ddd, J 4,5 9.7 Hz, J 5,6 5.6 Hz, J 5,6' 2.5 Hz, H-5), 4.05 (1H, dd, J 1,2 1.9 Hz, J 2,3 2.1 Hz, H-2), 4.37 (1H, dd, J 5,6 5.6 Hz, J 6,6' 11.8 Hz, H-6), 4.42 (1H, dd, J 5,6' 2.7 Hz, J 6,6' 12.0 Hz, H-6'), 4.53, 4.76 (2H, Abq, J 11.9 Hz, CH2), 4.90 (1H, d, J 1,2 1.8 Hz, H-1), 5.14 (1H, dd, J 2,3 3.2 Hz, J 3.4 9.7 Hz, H-3), 7.33-7.36 (5H, m, ArH)
실시예 69: 벤질 2,4-디- O -벤질-3,6-디- O -피보일-α-D-만노피라노시드 (Benzyl 2,4-di- O -benzyl-3,6-di- O -pivolyl-α-D-mannopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00072
벤질 4,6-디-O-피보일-α-D-만노피라노시드 (15.0 g, 34.2 mmol) 및 벤젠트리클로로아세트이미데이트 (17 mL, 91.4 mmol)를 무수 DCM (100 mL) 및 무수 시클로헥산 (100 mL)에 녹이고 비활성 아르곤 대기 하에서 4Å 이상의 분자 체 (ca 5 g) 1 시간 동안 교반하며 놓아두었다. 1 시간 후에 트리메틸 실릴트리플레이트 (0.31 mL, 1.71 mmol)을 첨가하였다. 18 시간 후에 출발물질(Rf 0.0)을 완전히 소비함에 따라, t.l.c. (petrol:ethyl acetate, 5:1)가 주 생성물(Rf 0.4)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 트리에틸아민 (ca 30 mL)로 억제하고 상기 용액을 celite를 통하여 여과한 후 진공에서 농축하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol:ethyl acetate, 5:1)로 정제하여 표제 화합물(14.4 g, 70％)을 무색의 오 일 형태로 얻었다. [α]D 25 +29.0 (c, 2.0 in CHCl3); δH (400 MHz, CDCl3) 1.24, 1.25 (18H, 2 x s, 2 x C(CH3)3), 3.97-4.04 (3H, m, H-2, H-4, H-5), 4.25 (1H, dd, J 5,6 4.8 Hz, J 5.6'11.6 Hz, H-6), 4.44 (1H, dd, J 5,6' 1.6 Hz, J 6,6' 11.7 Hz, H-6'), 4.51, 4.74 (2H, ABq, J 12.0 Hz, BnCH2), 4.55, 4.61 (2H, ABq, J 11.7 Hz, BnCH2), 4.57,4.80 (2H, ABq, J 10.7 Hz, BnCH2), 4.92 (1H, d, J 1,2 1.8 Hz, H-1), 5.37 (1H, dd, J 2,3 3.1 Hz, J 3,4 8.8 Hz, H-3), 7.28-7.35 (15H, m, ArH)
실시예 70: 벤질 2,4-디- O -벤질-α-D-만노피라노시드 (Benzyl 2,4-di- O -benzyl-α-D-mannopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00073
벤질 2,4-디-O-벤질-3,6-디-O-피보일-α-D-만노피라노시드 (8.0 g, 12.9 mmol) 및 소듐 메톡시드 (1.75 g, 32.4 mmol)를 메탄올 (100 mL)에 녹이고 환류시까지 가열하였다. 20 시간 후, 출발물질(Rf 0.8)을 완전히 소비함에 따라, t.l.c. (petrol:ethyl acetate, 2:1)가 주 생성물(Rf 0.2)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 Dowex®-50 이온 교환 수지를 첨가하여 중화시키고 상기 시점에서 반응물을 여과하여 진공에서 농축하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피 (petrol/ethyl acetate, 2:1)로 정제하여 표제 화합물(4.50 g, 78％)을 깨끗한 오일로 수득하였다. [α]D 25 +45.2 (c, 1.0 in CHCl3); δH (500 MHz, CDCl3) 2.83 (2H, bs, 2 x OH), 3.83-3.86 (1H, m, H-5), 3.90-4.00 (4H, m, H-2), H-4), H-6, H-6'), 4.21-4.28 (1H, m, H-3), 4.58 (1H, d, J 12.1 Hz, CHH), 4.72-4.83 (4H, m, 4 x CH 2Ar), 5.04 (1H, d, J 11.1 Hz, CHH), 5.09 (1H, bs, H-1), 7.43-7.51 (15H, m, 15 x ArH)
실시예 71: 벤질 2,4-디- O -벤질-3,6-비스- O -(2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α-D-만노피라노시드)-α-D-만노피라노시드 (Benzyl 2,4-di- O -benzyl-3,6-bis- O -(2,3,4,6-tetra- O -acetyl-α-D-mannopyranoside)-α-D-mannopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00074
벤질 2,4-디-O-벤질-α-D-만노피라노시드 (255 mg, 0.57 mmol)을 함유하는 DCM (10 mL) 및 1',1',1'-트리클로로아세트이미데이트-2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-만노피라노시드 (1.12 g, 2.27 mmol)을 함유하는 DCM (10 mL)을 캐뉼러를 통하여 비활성화된 4Å 분자 체(ca 500 mg)를 함유하고 있는 건조된 플라스크에 첨가하 였다. 상기 용액을 1 시간 동안 교반하고 상기 시점 후, 보론 트리플루오로에테르레이트(boron trifluoroetherate) (90 μL, 0.85 mmol)을 첨가하였다 16 시간 후, 출발물질(Rf 0.1)을 완전히 소비함에 따라, t.l.c. (petrol:ethyl acetate, 2:1)가 주 생성물(Rf 0.3)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 트리에틸아민 (ca 5 mL)으로 억제하고 상기 용액을 celite를 통하여 여과한 후 진공에서 농축하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol:ethyl acetate, 4:3)로 정제하여 표제 화합물(472 mg, 75％)을 흰색의 무정형 고체 형태로 수득하였다. [α]D 25 +81.5 (c, 1.0 in CHCl3); δH (500 MHz, CDCl3) 1.98, 2.02, 2.05, 2.07, 2.09, 2.10, 2,11, 2.19 (24H, 8 x s, 8 x OAc), 3.74-3.76 (1H, m, H-6a), 3.81-3.87 (3H, m, H-2a, H-5a, H-6'a), 3.92-3.97 (3H, m, H-4a, H-5b, H-6b), 4.03-4.22 (4H, m, H-3a, H-5c, H-6'b, H-6c), 4.27 (1H, dd, J 5,6' 5.5 Hz, J 6,6' 12.3 Hz, H-6'c), 4.54, 4.75 (2H, Abq, J 11.9 Hz, CH2), 4.64, 4.81 (2H, Abq, J 12.2 Hz, CH2), 4.65, 4.91 (2H, Abq, J 11.4 Hz, CH2), 4.97 (1H, d, J 1,2 1.7 HZ, H-1c), 5.00 (1H, d, J 1,2 1.6 Hz, H-1a), 5.19 (1H,d, J 1,2 1.7 Hz, H-1b), 5.25 (1H, at, J 10.0 Hz, H-4b), 5.33 (1H, at, J 10.1 Hz, H-4c), 5.36 (1H, dd, J 1,2 1.8 Hz, J 2,3 3.3 Hz, H-2c), 5.42 (1H, dd, J 1,2 1.5 Hz, J 2,3 3.5 Hz, H-2b), 5.44-5.47 (2H, m, H-3b, H-3c), 7.32-7.42 (15H, m, ArH)
실시예 72: 아세틸 2,4-디- O -아세틸-3,6- 비스-O -(2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α-D-만노피라노시드)-α/β-D-만노피라노시드 (Acetyl 2,4-di- O -acetyl-3,6- bis-O -(2,3,4,6-tetra- O -acetyl-α-D-mannopyranoside)-α/β-D-mannopyranoside)
Figure 112005515216504-PCT00075
벤질 2,4-디-O-벤질-3,6-비스-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-만노피라노시드)-α-D-만노피라노시드 (100 mg, 0.09 mmol) 및 펄만의 촉매(pearlman's catalyst) (Pd(OH)2, moist, 35 mg)를 absolute 에탄올 (5 mL)에 녹였다. 상기 용액의 가스를 제거하고 수소 기체로 서지(surged)한 후 수소 대기 하에서 교반하며 놓아두었다. 4 일 후, 출발물질(Rf 0.9)이 완전히 소비됨에 따라, t.l.c. (ethyl acetate)가 주 생성물(Rf 0.4)이 형성됨을 나타내었다. 상기 용액을 celite를 통과하여 여과하고 진공에서 농축하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(ethyl acetate)로 정제하여 중간체 3,6-비스-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-만노피라노시드)-α/β-D-만노피라노시드 (74 mg, 98％)를 흰색의 무정형 고체로 얻었다. m/z HRMS (ES+) C34H48O34Na (MNa+)의 경우, 계산값 863.2433, 실험값 863.2440. 이 중간체(74 mg, 0.088 mmol)를 아세틱 안히드리드 (5 mL) 및 피리딘 (5 mL)에 재현탁 하였다. 24 시간 후, t.l.c. (petrol:ethyl acetate, 2:3)가, 출발물질 (Rf 0.0)이 완전히 소모됨에 따라 생성물(Rf 0.4)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 물 (20 mL)로 희석하고 에틸아세테이트 (20 mL)로 분배한 후, 상 분리하였다. 수용액 층을 에틸아세테이트 (2 x 20 mL)로 재추출하였다. 혼합된 유기층을 희석된 염산 (500 mL, 1M), 탄산수소나트륨 (50 mL의 포화된 수용액)로 세척하고 소금물 (30 mL)로 세척한 후 건조시켜 (MgSO4) 여과한 뒤 진공에서 농축하여 표제 화합물 (83 mg, 98％)을 아노머 혼합물(α/β 5:1)의 무정형 거품 형태로 수득하였다. δH (500 MHz, CDCl3) α compound, 2.00, 2.02, 2.08, 2.12, 2.17, 2.18, 2.19, 2.26 (33H, 8 x s, 11 x OAc), 3.59 (1H, dd, J 5,6 3.0 Hz, J 6,6' 11.1 Hz, H-6a), 3.76 (1H, dd, J 5,6' 5.2 Hz, J 6,6 11.2 Hz, H-6'a), 3.92 (1H, ddd, J 4,5 10.2 Hz, J 5,6 3.0 Hz, J 5,6' 5.2 Hz, H-5a), 4.04-4.16 (4H, m, H-5b, H-5c, H-6b, H-6c), 4.21 (1H, dd, J 2,3 3.4 Hz, J 3,4 9.9 Hz, H-3a), 4.28 (1H, dd, J 5,6' 5.5 Hz, J 6,6' 12.2 Hz, H-6'b/c), 4.31 (1H, dd, J 5,6' 4.7 Hz, J 6,6' 12.3 Hz, H-6'b/c), 4.81 (1H, d, J 1,2 1.5 Hz, H-1c), 5.06-5.07 (2H, m, H-1b, H-?), 5.20-5.35 (8H, m, H-2a, H-2b, H-2c, H-3b, H-3c, H-4a, H-4b, H-4c), 6.07 (1H, d, J 1,2 1.8 Hz, H-1a).
β 화합물에 대한 선택적 데이터로는, 3.64 (1H, dd, J 5,6 3.7 Hz, J 6,6' 10.8 Hz, H-6a), 3.69-3.73 (1H, m, H-5a), 3.76 (1H, dd, J 5,6' 5.2 Hz, J 6,6' 11.2 Hz, H-6'a), 4.01 (1H, dd, J 2,3 3.2 Hz, J 3,4 9.7 Hz, H-3a), 5.50 (1H, dd, J 1,2 0.9 Hz, J 2,3 3.2 Hz, H-2a), 5.83 (1H, d, J 1,2 0.9 Hz, H-1a)가 있다.
실시예 73: 2,4-디- O -아세틸- 비스-O -(2,3,6-트리- O -아세틸-α- O -만노피라노실)-α-D-만노피라노실 브로마이드 (2,4-Di- O -acetyl- bis-O- (2,3,6-tri- O -acetyl--α- O -mannopyranosyl)-α-D-mannopyranosyl bromide)
Figure 112005515216504-PCT00076
아세틸 2,4-디-O-아세틸-3,6-비스-O-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-D-만노피라노시드)-α/β-D-만노피라노시드 (87 mg, 0.09 mmol)을 무수 DCM (5 mL)에 녹였다. 여기에, 브롬화수소 (33％ in acetic acid, 1 mL)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 아르곤 하에서 교반하였다.
2 시간 후, t.l.c. (petrol:ethyl acetate, 1:4)가, 출발물질 (Rf 0.4)이 완전히 소모됨에 따라 생성물(Rf 0.6)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응 혼합물을 DCM (10 mL) 및 물 (10 mL) 사이에서 분배하고 수용액 층을 DCM (3 x 10 mL)으로 재추출하였다. 혼합된 유기층을 pH가 8이 될 때까지 탄산수소나트륨 (20 mL of a saturated aqueous solution)으로 세척하고 소금물(20 mL)로 세척한 다음 건조(MgSO4)후 여과하여 진공에서 농축하고 표제 화합물(80 mg, 90％)을 추가 정제과정 없이 흰색 거품 형태로 얻었다. δH (400 MHz, CDCl3) 1.97, 1.99, 2.05, 2.06, 2.10, 2,12, 2.17, 2.24 (30H, 9 x s, 10 x OAc), 3.60 (1H, dd, J 5,6 3.0 Hz, J 6,6' 11.4 Hz, H-6a), 3.77 (1H, dd, J 5,6' 4.5 Hz, J 6,6' 11.4 Hz, H-6'a), 4.02-4.09 (5H, m, H-5a, H-5b, H-5c, H-6b, H-6c), 4.24 (1H, dd, J 5,6' 6.8 Hz, J 6,6' 12.2 Hz, H-6'), 4.29 (1H, dd, J 5,6' 5.0 Hz, J 6,6' 12.6 Hz, H-6'), 4.62 (1H, dd, J 2,3 3.4 Hz, J 3,4 10.0 Hz, H-3a), 4.79 (1H, bs, H-1c), 5.02-5.04 (2H, m, H-1b, H-3b), 5.17-5.30 (5H, m, H-2b, H-2c, H-3c, H-4b, H-4c), 5.39 (1H, at, J 10.1 Hz, H-4a), 5.43 (1H, dd, J 1,2 1.5 Hz, J 2,3 3.2 Hz, H-2a), 6.34 (1H, bs, H-1a)
실시예 74: 1-티오-2,4-테트라- O -아세틸-3,6- O-비스 -(2,3,4,6-테트라- O -아세틸-α- O -만노피라노실)-α-D-만노피라노스 (1-Thio-2,4-tetra- O -acetyl-3,6- O-bis -(2,3,4,6-tetra- O -acetyl-α- O -mannopyranosyl)-α-D-mannopyranose)
Figure 112005515216504-PCT00077
2,4-테트라-O-아세틸-3,6-O-비스-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-만노피라노실)-α-D-만노피라노실 브로마이드 (850 mg, 0.85 mmol)를 무수 아세톤 (20 mL)에 녹였다. 무수 티오우레아 (115 mg, 1.56 mmol)를 첨가하고 상기 혼합물을 아르곤 대기 하에서 환류시까지 가열하였다. 18 시간 후, t.l.c. (petrol:ethyl acetate, 1:3)가, 출발물질(Rf 0.4)이 완전히 소모됨에 따라 생성물(Rf 0.0)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 진공에서 농축하고 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(ethyl acetate/methanol, 9:1)로 정제하여 중간체 2,4-테트라-O-아세틸-3,6-O-비스-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-만노피라노실)-α-D-만노피라노실-1-이소티오우로늄 브로마이드 (550 mg, 60％)를 얻었다. 이 중간체(550 mg, 0.51 mmol) 및 Na2S2O5 (122 mg, 0.62 mmol)는 교반된 DCM (20 mL) 및 물 (10 mL)의 혼합물에 첨가되었다. 상기 혼합물을 아르곤 하에서 환류시켰다. 2.5 시간 후, t.l.c. (petrol:ethyl acetate, 1:3)가, 출발물질(Rf 0.0)이 완전히 소모됨에 따라 생성물(Rf 0.3)이 형성됨을 나타내었다. 이 시점에서 상기 반응물을 실온으로 냉각시키고 상을 분리하였 다. 수용액 층을 DCM (2 x 20 mL)으로 재추출하였다. 유기층을 탄산수소나트륨 (20 mL of a saturated aqueous solution) 및 소금물 (20 mL)로 세척하고 건조 (MgSO4)시킨 후 여과하여 진공에서 용매를 제거하였다. 이것을 플래시 컬럼 크로마토그래피(petrol:ethyl acetate, 1:3)로 정제하여 표제 화합물(350 mg, 73％)을 희색의 무정형 고체를 얻었다. [α]D 23 +58.1 (c, 1.2 in CHCl3; δH (500 MHz, C6D6) 1.74, 1.75, 1.78, 1.82, 1.91, 2.03, 2.06, 2.26 (24H, 8 x s, 10 x Oac), 2.07 (1H, bs, SH), 3.65 (1H, dd, J 5,6 3.2 Hz, J 6,6' 11.0 Hz, H-6a), 3.93 (1H, dd, J 5,6' 5.3 Hz, J 6,6' 11.1 Hz, H-6'a), 4.31-4.38 (4H, m, H-3a, H-5a, H-5b/c, H-6), 4.43-4.45 (1H, m, H-6), 4.51 (1H, dd, J 5,6' 5.6 Hz, J 6,6' 12.6 Hz, H-6'), 4.56-4.60 (2H, m, H-5b/c, H-6'), 4.91 (1H, d, J 1,2 1.5 Hz, H-1c), 5.20 (1H, d, J 1,2 1.8 Hz, H-1b), 5.43 (1H, dd, J 1,2 1.8 Hz, J 2,3 3.1 Hz, H-2b), 5.45 (1H, bs, H-1), 5.65 (1H, dd, J 1,2 1.5 Hz, J 2,3 3.1 Hz, H-2a), 5.70-5.82 (5H, m, H-2c, H-3b, H-4a, H-4b, H-4c), 5.85 (1H, dd, J 2,3 3.2 Hz, J 3,4 10.2 Hz, H-3c).
실시예 75: Man(1-6)Man(1-3)ManSH를 사용한 SBLCys156의 대표적인 단백질 당화 과정
1-티오-2,4-테트라-O-아세틸-3,6-O-비스-(2,3,4,6-테트라-O-아세틸-α-O-만노피라노실)-α-D-만노피라노스 (20 mg, 0.02 mmol) 및 소듐 메톡시드 (2 mg, 0.02mmol)를 교반된 메탄올 (5 mL) 용액에 첨가하였다. 12 시간 후, t.l.c. (petrol:ethyl acetate, 1:2)가, 출발물질(Rf 0.2)이 완전히 소모됨에 따라 생성물(Rf 0.0)이 형성됨을 나타내었다. 상기 반응을 Dowex®-50 이온 교환 수지를 첨가하여 중화시키고 상기 시점 후 반응물을 여과하여 진공에서 농축하였다. 조제(crude)의 sugar thiol을 물(5 mL)에 녹이고 이중 38 μL을 SBL156CSSePh (1 mg)을 함유하고 있는 수용성 완충 용액(500 μL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)에 첨가하였다. 상기 용액을 end-over-end rotator 상에 올려놓았다. 1 시간 후, 상기 반응 혼합물을 PD10 Sephadex® G25 컬럼에 로딩하고 70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0으로 용출하였다. 이 단백질 분획을 모아 Man(Man)Man-S-SBLCys156; (m/z (ES+) 실험값 27878, 계산값 27881)을 수득하였다.

Claims (28)

  1. 적어도 하나의 티올(thiol) 그룹을 포함하는 유기화합물과, 하기 화학식 1의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는, 이황화결합(disulfide bond)을 형성하는 방법.
    ＜화학식 1＞
    R-S-X-R1
    상기 식에서 X는 SO2 또는 Se을 나타내고;
    R은 유기 부분을 나타내고; 및
    R1은 선택적으로 치환된 알킬 그룹, 선택적으로 치환된 페닐 그룹, 선택적으로 치환된 피리딜 그룹 또는 선택적으로 치환된 나프틸 그룹을 나타내고, 단, X가 SO2를 나타낼 때 R1은 선택적으로 치환된 알킬을 나타내지 않을 것.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 티올 그룹을 포함하는 상기 유기 화합물은 아미노산, 펩티드 또는 단백질인 방법.
  3. 적어도 하나의 티올 그룹을 포함하는 단백질, 펩티드 또는 아미노산을 화학적으로 변형(modification)하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 단백질, 펩티드 또 는 아미노산과, 하기 화학식 1의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
    ＜화학식 1＞
    R-S-X-R1
    상기 식에서 X는 SO2 또는 Se을 나타내고;
    R은 유기 부분을 나타내고; 및
    R1은 선택적으로 치환된 알킬 그룹, 선택적으로 치환된 페닐 그룹, 선택적으로 치환된 피리딜 그룹 또는 선택적으로 치환된 나프틸 그룹을 나타내고, 단, X가 SO2를 나타낼 때 R1은 선택적으로 치환된 알킬을 나타내지 않을 것.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나에 있어서, 상기 R은 탄수화물(carbohydrate) 그룹인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나에 있어서, 상기 R1은 페닐인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나에 있어서, 상기 X는 Se인 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나에 있어서, 상기 X은 SO2인 방법.
  8. 하기 화학식 1의 화합물
    ＜화학식 1＞
    R-S-X-R1
    상기 식에서 X는 SO2 또는 Se을 나타내고;
    R은 탄수화물 부분을 나타내고; 및
    R1은 선택적으로 치환된 알킬 그룹, 선택적으로 치환된 페닐 그룹, 선택적으로 치환된 피리딜 그룹 또는 선택적으로 치환된 나프틸 그룹을 나타내고, 단, X가 SO2를 나타낼 때 R1은 선택적으로 치환된 알킬을 나타내지 않을 것.
  9. 제8항에 있어서, 상기 R1은 페닐인 화합물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 X는 Se인 화합물.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 X는 SO2인 화합물.
  12. 제11항에 정의된 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하 기 화학식 2의 화합물과, 하기 화학식 3의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
    ＜화학식 2＞
    M(SSO2R1)k
    상기 식에서 M은 예를 들어, Li, Na, K, Ca, Cs, Zn, Mg 또는 Al인 금속을 나타내고; 및
    k는 1, 2 또는 3을 나타낸다.
    ＜화학식 3＞
    R-L
    상기 식에서 L은 이탈 그룹을 나타낸다.
  13. 제11항에 정의된 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 은(silver) 이온의 존재하에서 하기 화학식 8의 이황화 화합물과, 식 R1SO2 -의 설피니트(sulfinite) 음이온을 반응시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
    ＜화학식 8＞
    R-S-S-R
  14. 제10항에 정의된 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 하 기 화학식 5의 화합물과, 하기 화학식 6a 또는 6b의 화합물을 반응시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
    ＜화학식 5＞
    R-SH
    ＜화학식 6a＞
    R1SeL2
    상기 식에서 L2는 Br, Cl, CN 또는 I를 나타낸다.
    ＜화학식 6b＞
    R1Se(OH)2
  15. 이황화결합 형성에 있어서, 제1항 내지 제7항 중 어느 하나에 정의된 화학식 1의 화합물의 용도.
  16. 적어도 하나의 티올 그룹을 포함하는 단백질, 펩티드 또는 아미노산을 변형(modification)하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 하나에 정의된 화학식 1의 화합물의 용도.
  17. 적어도 하나의 티올 그룹을 포함하는 단백질, 펩티드 또는 아미노산을 당화 (glycosylation)하기 위한, 제8항 내지 제11항 중 어느 하나에 정의된 화학식 1의 화합물의 용도.
  18. 적어도 하나의 티올 그룹을 포함하는 단백질, 펩티드 또는 아미노산을 화학적으로 변형하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 티올 그룹을 셀레닐설파이드(selenenylsulfide) 그룹으로 전환하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 전환은 적어도 하나의 티올 그룹을 포함하는 단백질, 펩티드 또는 아미노산을 하기 화학식 10a 또는 10b의 화합물과 반응시킴으로써 수행되는 것인 방법.
    ＜화학식 10a＞
    R3SeL2
    ＜화학식 10b＞
    R2Se(OH)2
    상기 식에서 L2는 이탈 그룹을 나타내고; 및
    R2는 선택적으로 치환된 알킬 그룹, 선택적으로 치환된 페닐 그룹, 선택적으로 치환된 벤질 그룹, 선택적으로 치환된 피리딜 그룹, 선택적으로 치환된 나프틸 그룹을 나타내고 또는 R2는 고체상 지지체의 부분을 이루거나 이에 붙어 있다.
  20. 제19항에 있어서, 상기 R2은 페닐인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 화학식 10a 또는 10b의 화합물은 PhSeBr인 방법.
  22. 제18항 내지 제21항의 어느 하나에 있어서, 단백질, 펩티드 또는 아미노산 내의 셀레닐설파이드 그룹을 티올 그룹을 포함하는 유기 화합물과 반응시키는 단계를, 추가적으로 포함하는 방법.
  23. 적어도 하나의 셀레닐설파이드 그룹을 포함하는 단백질, 펩티드 또는 아미노산을 화학적으로 변형하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 단백질, 펩티드 또는 아미노산을, 상기 티올 그룹을 포함하는 유기 화합물과 반응시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 유기화합물은 탄수화물 화합물인 것인 방법.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 유기화합물은 단백질, 펩티드 또는 아미노산인 것인 방법.
  26. 적어도 하나의 셀레닐설파이드 그룹을 포함하는 단백질, 펩티드 또는 아미노산으로서, 상기 셀레닐설파이드 그룹은 하기 화학식의 그룹인, 단백질, 펩티드 또는 아미노산.
    ＜화학식＞
    -S-Se-R2
    상기 식에서, R2는 선택적으로 치환된 알킬 그룹, 선택적으로 치환된 페닐 그룹, 선택적으로 치환된 벤질 그룹, 선택적으로 치환된 피리딜 그룹, 선택적으로 치환된 나프틸 그룹을 나타낸다.
  27. 제18항 내지 제21항 중 어느 하나의 방법에 의하여 얻어지는, 적어도 하나의 셀레닐설파이드 그룹을 포함하는 단백질, 펩티드 또는 아미노산.
  28. 제22항 내지 제25항 중 어느 하나의 방법에 의하여 얻어지는, 적어도 하나의 이황화결합을 포함하는 단백질, 펩티드 또는 아미노산.
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