EA011299B1 - Способы образования дисульфидных связей и гликозилирования белков и реагенты, применяемые в этих способах - Google Patents

Abstract

Раскрыты способы для образования дисульфидных связей, особенно в белках, пептидах и аминокислотах и реагенты, применяемые в этих способах. Способы и реагенты являются особенно полезными для контролируемого гликозилирования белков, пептидов и аминокислот. В этих способах в качестве реагентов или промежуточных соединений используют тиосульфонатные или селененилсульфидные соединения. Некоторые белки и пептиды, содержащие селененилсульфидные группы, также составляют часть данного изобретения.

Description

Настоящая заявка относится к способам образования дисульфидных связей и/или химической модификации белков и к реагентам, применяемым в этих способах, в частности, к способам гликозилирования белков и к реагентам, применяемым в этих способах.

Предшествующий уровень техники

Ко- и посттрансляционное гликозилирование белков играет значительную роль в их биологическом поведении и стабильности (К. Этеск. С11сш. Кеу., 96:683-720 (1996)). Например, гликозилирование играет главную роль в важнейших биологических процессах, таких как клеточная сигнализация и регуляция, развитие и иммунитет. Исследование этих событий осложняется тем, что гликопротеины встречаются в природе в виде смеси так называемых гликоформ, которые обладает одинаковым пептидным скелетом, но различаются как типом, так и сайтом гликозилирования. Более того, поскольку гликозилирование белков не находится под прямым генетическим контролем, экспрессия терапевтических гликопротеинов в культурах клеток млекопитающих дает в результате гетерогенную смесь гликоформ. Поэтому умение синтезировать гомогенные гликоформы гликопротеинов является не только предпосылкой для точных исследовательских целей, но и имеет всё возрастающее значение при получении терапевтических гликопротеинов, которые в настоящее время продаются в виде смеси мультигликоформ (например, эритропоэтин и интерлейкины). Другие посттрансляционные модификации белков, такие как фосфорилирование и метилирование, также имеют значение. Поэтому контролирование степени и природы такой модификации белка позволяет исследовать и контролировать его поведение в биологических системах (В. С. Иаущ, 8с1епсе, νοί. 303, р 480-482, 2004).

Известен ряд способов гликозилирования белков, включая химический синтез. Химический синтез гликопротеинов дает определенные преимущества и не в последнюю очередь - возможность получать чистые гликоформы гликопротеинов. В одном известном способе синтеза используют тиол-селективные углеводные реагенты - гликозилметантиосульфонатные реагенты (глико-МТ8). Такие гликозилметантиосульфонатные реагенты реагируют с тиоловыми группами белка с введением гликозильного остатка, связанного с белком через дисульфидную связь (см., например, \УО00/01712).

Однако глико-МТ8 реагенты имеют ряд недостатков, включая небольшие реакционные выходы, трудности в их получении и проблемы со стабильностью в щелочных условиях, в которых их часто используют. Поэтому существует потребность в дополнительных реагентах, применяемых при гликозилировании белков, которые могут быть легко получены, являются стабильными и дают высокие выходы гликозилированного белкового продукта.

Существует также потребность в альтернативных способах гликозилирования белков, которые дают высокие выходы гликозилированного белкового продукта, являются сайт-селективными и которые обеспечивают гликозилирование как по одному, так по многим сайтам у широкого спектра различных белков.

Сущность изобретения

Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что некоторые серо- и селеносодержащие реагенты гликозилирования являются относительно простыми для получения, обычно более стабильны, чем соответствующие глико-МТ8 реагенты, и могут быть использованы в гликозилировании широкого спектра тиол-содержащих соединений, включая белки, с высоким выходом.

Поэтому в первом аспекте изобретения предусмотрен способ образования дисульфидных связей (8-8-), включающий взаимодействие органического соединения, содержащего по меньшей мере одну тиоловую группу (-8Н), с соединением формулы I:

К-8—Х-К¹ , где

X означает 8О₂ или 8е, предпочтительно 8е;

К означает органическую группировку, например алкильную группу, алкенильную группу, алкинильную группу или углеводную группировку; и

К¹ означает факультативно замещенную алкильную группу, факультативно замещенную фенильную группу, факультативно замещенную пиридильную группу или факультативно замещенную нафтильную группу;

при условии, что если X означает 8О₂, то К¹ не является факультативно замещенным алкилом.

Предпочтительно, органическое соединение, содержащее по меньшей мере одну тиоловую группу, представляет собой аминокислоту, пептид или белок.

Во втором аспекте изобретения, кроме того, предусмотрен способ химической модификации белка, пептида или аминокислоты, содержащих по меньшей мере одну тиоловую группу (-8Н), включающий взаимодействие указанного белка, пептида или аминокислоты с соединением формулы I, как определено выше.

В еще одном аспекте изобретения предусмотрены соединения формулы I, где К означает углеводную группировку.

Когда К означает алкенильную или алкинильную группу, существует вероятность, что дисульфид

- 1 011299 ное соединение, образованное путем взаимодействия с соединением формулы I, может быть дополнительно модифицировано путем взаимодействия по С=С или С=С связи в группе В.

Авторы изобретения также неожиданно обнаружили, что тиол-содержащий белок может быть превращен в соответствующий селененилсульфид и что электрофильные свойства серы в 8-8е связи, образованной таким образом, делают ее чувствительной к нуклеофильному замещению тиол-содержащими соединениями, включая углеводы.

Поэтому в третьем аспекте изобретения предусмотрен способ химической модификации белка, пептида или аминокислоты, содержащих по меньшей мере одну тиоловую группу (-8-Н), включающий превращение указанной тиоловой группы в селененилсульфидную группу (-8-8е-В²). Таким образом, этот способ позволяет получать белок, пептид или аминокислоту, содержащие по меньшей мере одну селененилсульфидную группу. Такие белки, пептиды и аминокислоты, содержащие по меньшей мере одну селененилсульфидную группу, формируют еще один признак изобретения. Особенно предпочтительными являются белки или пептиды, содержащие по меньшей мере одну селененилсульфидную группу.

Селененилсульфидная группа в белке, пептиде или аминокислоте может быть дополнительно подвергнута взаимодействию с органическим соединением, содержащим тиоловую группу, с получением дополнительных химически модифицированных белков, пептидов или аминокислот, в которых органическая группа присоединена к белку, пептиду или аминокислоте через дисульфидную связь. Предпочтительно органическое соединение, содержащее тиоловую группу, представляет собой углеводное соединение, обеспечивая таким образом способ гликозилирования аминокислоты, пептида или белка. Как использовано в данном контексте, гликозилирование относится к общему способу добавления гликозильной единицы к другой группировке через ковалентную связь.

Поэтому в четвертом аспекте изобретения предусмотрен способ химической модификации белка, пептида или аминокислоты, содержащих по меньшей мере одну тиоловую группу (-8-Н), включающий:

(a) превращение указанной тиоловой группы в селененилсульфидную группу (-8-8е-В²); и (b) взаимодействие указанной селененилсульфидной группы с органическим соединением, содержащим тиоловую группу.

Способ(ы) согласно первому, второму, третьему и четвертому аспектам изобретения в дальнейшем в этом документе будут называться, соответственно, первым способом, вторым способом, третьим способом и четвертым способом. Если не указано иначе, все предпочтительные признаки и определения в этом документе относятся ко всем этим способам. Более того, настоящее изобретение включает любые и все возможные комбинации любых предпочтительных признаков, о которых идет речь в данном документе, независимо от того, описаны такие комбинации конкретно или нет.

Обобщенная реакционная схема образования дисульфидной связи согласно первому и второму способам показана на схеме 1:

Схема 1

Предпочтительно органическая группировка, представленная на схеме 1, представляет собой белок, пептид или аминокислоту.

Обобщенная реакционная схема введения селененилсульфидной группы в белок, пептид или аминокислоту согласно третьему и четвертому способам показана на схеме 2:

Схема 2

Способ согласно Схеме 2 дает в результате ковалентную связь группы В² с белком, пептидом или аминокислотой через селененилсульфидную (-8-8е-) связь. Такие белки, пептиды или аминокислоты формируют еще один признак изобретения.

Белки и пептиды, содержащие одну селененилсульфидную группу, могут быть полезны в определении белковой структуры методами рентгеновской дифракции. В настоящее время методы МАО (аномальной дисперсии на различных длинах волн от англ. тиШр1е \\'ауе1еп§111 аиота1ои§ бщрегаюи) включают превращение любых метиониновых остатков в белке в селенометионин. Сравнение картин рентгеновской дифракции модифицированных и немодифицированных белков делает возможным последую

- 2 011299 щее определение структуры ^модифицированного белка, с которым будут работать. Способ по изобретению обеспечивает удобный и быстрый доступ к альтернативным селеносодержащим белкам или пептидам, которые могут быть использованы в таких методах. В способах согласно изобретению предусмотрен удобный способ введения тяжелого металла в белковую структуру, который облегчает, таким образом, интерпретацию данных рентгеновской дифракции.

Селененилсульфид-содержащие белки, пептиды или аминокислоты могут быть дополнительно подвергнуты взаимодействию с тиол-содержащими органическими соединениями согласно четвертому способу, как показано в обобщенной реакционной схеме 3:

Схема 3

Способ согласно схеме 3 дает в результате ковалентную связь органической группировки с белком, пептидом или аминокислотой через дисульфидную связь (-8-8-). В атом способе белок, пептид или аминокислота действуют в качестве электрофила, тогда как тиол-содержащее органическое соединение действует в качестве нуклеофила. В противоположность этому, известные реакции, в которых используются глико-МТ8 реагенты, включают в себя реакцию нуклеофильной тиоловой группы в белке, пептиде или аминокислоте с электрофильным глико-МТ8 реагентом. Поэтому в способе по изобретению предусмотрена дополнительная стратегия к уже известным стратегиям модификации белков с использованием глико-МТ8 реагентов.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

При использовании в данном описании, термин «алкил» предпочтительно означает прямую или разветвленную алкильную группу, содержащую 1-10 атомов углерода, предпочтительно 1-6 атомов углерода. Предпочтительные алкильные группы включают в себя метил и этил. При использовании в данном описании, термин «алкенил» предпочтительно означает прямую или разветвленную углеводородную группу, включающую по меньшей мере одну двойную углерод-углеродную связь и содержащую 2-20 атомов углерода, предпочтительно 2-10 атомов углерода и более предпочтительно 2-6 атомов углерода. Предпочтительные алкенильные группы включают в себя -(СН₂)СН=СН₂, -СН₂СН₂СН=СН₂, пренил((СН₃)₂С=СНСН₂-) и фарнезил((СН₃)₂С=СН[СН₂СН₂С(СН₃)=СН]₂СН₂-). При использовании в данном описании, термин «алкинил» предпочтительно означает прямую или разветвленную углеводородную группу, включающую по меньшей мере одну тройную углерод-углеродную связь и содержащую 2-10 атомов углерода, предпочтительно 2-6 атомов углерода. Предпочтительные алкинильные группы включают в себя -СН₂С=СН и -СН₂СН₂С=СН.

Когда В¹ означает факультативно замещенную группировку, тогда подходящие заместители включают в себя любые заместители, которые не препятствуют образованию соединения формулы I или реакции образования дисульфидной связи согласно первому или второму способам, например, -N02, -8О₃Н, С0₂Н, -(СН₂СН₂0)_пН и -(СН₂СН₂О)_пМе, где η равно 1-100, предпочтительно 1-50, более предпочтительно 1-20 и еще более предпочтительно 1-10. Группа В¹ может быть независимо замещена 1-5 и предпочтительно 1 или 2 заместителями. Группа В¹ может также по выбору присоединяться к твердой подложке или образовывать часть твердой подложки, например, смолы, такой как полистирольная смола.

Предпочтительной группой В¹ является фенил. Когда группа В¹ в соединениях формулы I представляет собой фенил или другую ароматическую группу, тогда существует дополнительное преимущество в том, что протекание реакции с тиол-содержащим соединением согласно первому и второму способам можно контролировать с использованием УФ спектроскопии. Так, например, Рй8О₂-хромофор демонстрирует максимум в УФ спектре при приблизительно 265 нм. Рй8О₂-группировка присутствует и в соединении формулы I, и в Рй8О₂ ^-, которая является побочным продуктом реакции образования дисульфидной связи, но связанные коэффициенты экстинкции существенно различаются в ходе реакции, которую будут контролировать с использованием УФ. Аналогично, третий и четвертый способы изобретению можно контролировать с помощью УФ спектроскопии, когда группа В² представляет собой фенил или другую ароматическую группу.

В соединениях формулы I группа В может представлять собой любую органическую группировку, в частности, любую органическую группировку, которая подходит для связывания с белком, пептидом или аминокислотой. Не существует никакого специального ограничения относительно природы В. Например,

- 3 011299 группа В может быть первичной, вторичной или третичной. В может быть ароматической или алифатической. Группа В может быть факультативно замещена, например, фосфорильными или сульфонильными заместителями. Когда X представляет собой 8е, тогда В может представлять собой также белок, пептид или аминокислоту, которые дают возможность одному белку, пептиду или аминокислоте связываться с другим белком, пептидом или аминокислотой через дисульфидную связь.

Одна предпочтительная группа В представляет собой фарнезил. Фарнезилирование является природной посттрансляционной модификацией, ассоциированной со многими белками, включая онкогенный белок Вак. Поэтому способы по изобретению дают возможность получать фарнезилированные белки, пептиды и аминокислоты.

Также предпочтительно, В представляет собой углеводную группировку, факультативно присоединенную через линкер к группе -8-Х-. Линкер может содержать 1-10 атомов между углеводной группировкой и группой -8-Х-. Например, линкер может представлять собой алкиленовую группу (например, группу -(СН₂)₂, где 1 равно 1-10), или алкениленовую группу (например, группу -(СН₂)СН=СН- или СН₂СН₂СН=СН-). Предпочтительными являются соединения, в которых группа -8-Х- находится в аномерном положении сахаридного остатка или присоединена к аномерному углероду через линкер.

Подходящие углеводные группировки включают в себя моносахариды, олигосахариды и полисахариды, и включают в себя любую углеводную группировку, которая присутствует в природных гликопротеинах или в биологических системах. Предпочтительными являются гликозильные или гликозидные производные, которые могут быть защищены, например, глюкозильные, глюкозидные, галактозильные или галактозидные производные, которые могут быть защищены. Гликозильные и гликозидные группы включают в себя как α-, так и β-группы. Подходящие углеводные группировки включают в себя глюкозу, галактозу, фукозу, ΟΙοΝΆο, ΟαΙΝΛο. сиаловую кислоту и маннозу, и олигосахариды или полисахариды, содержащие по меньшей мере один остаток глюкозы, галактозы, фукозы, ΟΙοΝΑο, ΟαΙΝΑο, сиаловой кислоты и/или маннозы.

Любые функциональные группы в углеводной группировке могут быть защищены с использованием защитных групп, известных в данной области (см., например, Огееие е1 а1., Рго1ес1Ве дгоирк ίη огдашс 5уи1йе515, 2ηά Εάίίίοη, ^йеу, Νονν Уогк, 1991, раскрытие которой таким образом включено путем ссылки). Подходящие защитные группы для любой группы -ОН в углеводной группировке включают в себя ацетил (Ас), бензил (Ви), пиволил (ρίν), силил (например, трет-бутилдиметилсилил (ΤΒΌΜ81) и третбутилдифенилсилил (ΤΜΟΡ81)), ацетали, кетали и метоксиметил (Μ0Μ). Любые защитные группы могут быть удалены до или после присоединения углеводной группировки к аминокислоте, пептиду или белку.

Особенно предпочтительные углеводные группировки включают в себя 01ο(Αο)₄β-, 01ο(Βη)₄β-, Оа1(Ас)₄в-, Οα1(Βη)₄β-, 61с(Ас)₄а(1,4)О1с(Ас)за(1,4)О1с(Ас)₄в-, β-01ο, β-СаЬ α-Μαη, α-Μαη(Αο)₄, Μαη(1,6)Μαηα-, Μ;ιιι( 1-6 )Μ;ι и( 1-3 )Μ;ι ιια-, (Αс)₄Μаи(1-6)(Αс)₄Μаη(1-3)(Αс)₂Μаηα-, -Ε1-β-Οα1, -Εί-β-ΟΚ, Е1-а-О1с, -Εί-α-Μαη, -Εί-Еас, -β-61с(Αс)₂, -β-61с(Αс)₃, -Е1-а-О1с(Ас)₂, -Е1-а-О1с(Ас)₃, -Е1-а-О1с(Ас)₄, -Ε1β-61с(Αс)₂, -Εί-β-Ο1ο(Αο)₃, -Εί-β-61с(Αс)₄, -Εί-α-Μаи(Αс)₃, -Εί-α-Μаη(Αс)₄, -Εί-β-ΟηΚΑ^, -Εί-β-ΟηΚΑ^, -ВНЕа^Ас^, -ВВЕа^Ас^, -Ει-^ас(Αс)- и их эквиваленты после удаления защиты.

Предпочтительно, любые сахаридные фрагменты, входящие в состав углеводной группировки, которые происходят из природных сахаров, будут находиться в природной энантиомерной форме, которая может представлять собой либо Ό-форму (например, Ό-глюкоза или Ό-галактоза), либо Ь-форму (например, Ь-рамноза или Ь-фукоза). Любые аномерные связи могут представлять собой α- или β-связи.

Соединение, содержащее тиоловую группу, используемое в первом или втором способах, может представлять собой любое органическое соединение, содержащее по меньшей мере одну тиоловую группу. Тиоловая группа может быть первичной, вторичной или третичной. Соединение может быть ароматическим или алифатическим. Если в соединении присутствует более чем одна тиоловая группа, то в каждой такой тиоловой группе будет потенциально образовываться дисульфидная связь.

Предпочтительно соединение представляет собой аминокислоту, пептид или белок. Как использовано в данном описании, пептид содержит минимум два аминокислотных остатка, связанных амидной связью. Любая аминокислота, содержащаяся в белке, пептиде или аминокислоте, представляет собой предпочтительно α-аминокислоту. Любая аминокислота может находиться в Ό- или Ь-форме, предпочтительно в Ь-форме. Аминокислота, пептид или белок могут представлять собой любую природную аминокислоту, пептид или белок, содержащие тиоловую группу, например, благодаря присутствию одного или более остатков цистеина. Альтернативно, аминокислота, пептид или белок могут быть получены путем химической модификации предшественника аминокислоты, пептида или белка, не содержащих тиол. Альтернативно, тиол-содержащий пептид или белок может быть получен посредством сайтнаправленного мутагенеза с введением остатка цистеина. Сайт-направленный мутагенез является известным методом в данной области (см., например, \УО00/01712 и 1. 8атЬгоок е1 а1., Μο1еси1а^ С1ошпд: А ЬаЬога1огу Μаииа1, 3гб ΕύΗ^η, Со1б 8ргшдк НагЬоиг ЬаЬога1огу Ргекк, 2001, содержание которых включено в настоящую заявку путем ссылки).

Предпочтительные белки включают в себя ферменты, селективность которых может быть модифи

- 4 011299 цирована путем контролируемого гликозилирования с использованием способов и реагентов в соответствии с изобретением, и терапевтические белки. Другие предпочтительные белки включают в себя сывороточные альбумины и другие белки крови, гормоны, интерфероны, рецепторы, антитела, интерлейкины и эритропоэтин.

Было обнаружено, что соединения формулы I обычно тиол-селективны и поэтому присутствие других функциональных групп в тиол-содержащем органическом соединении обычно не препятствует реакции. Однако любые другие функциональные группы могут быть защищены с использованием любых защитных групп, известных в данной области, которые стабильны в условиях реакции.

Реакцию образования дисульфидной связи согласно первому или второму способу обычно осуществляют в присутствии буфера при нейтральном или щелочном рН (рН от примерно 7 до примерно 9,5), причем предпочтительными являются слегка щелочные значения рН (рН от примерно 8 до примерно 9). Подходящие буферы включают в себя НЕРЕ8, СНЕ8, МЕ8 и Трис. Если тиол-содержащее соединение представляет собой белок, пептид или аминокислоту, то величина рН должна быть такой, чтобы во время реакции не наблюдалось нежелательной денатурации, или она была бы незначительной. Аналогично, температура реакции должна быть выбрана такой, чтобы исключить любое значительное повреждение любых соединений, чувствительных к температуре. Например, реакцию с белком или пептидом предпочтительно осуществляют при температуре окружающей среды или ниже, чтобы избежать какой-либо денатурации. Могут быть использованы системы водных или органических растворителей, причем системы водных растворителей являются предпочтительными для реакции белков, аминокислот или пептидов для обеспечения их растворения. Реакция обычно протекает довольно быстро, например, часто в течение менее 1 ч.

Обычно при проведении реакции используется избыток соединения формулы I, например, 10-20 эквивалентов по отношению к тиол-содержащему соединению. В противоположность этому, реакции с глико-МТ8 реагентами часто требуют применения приблизительно 30 эквивалентов, что увеличивает стоимость реагентов.

Было обнаружено, что соединения формулы I, где Я означает углеводную группировку, X означает 8О₂, и Я¹ означает фенил, обычно более стабильны в щелочных условиях, чем соответствующие гликоМТ8 соединения. Поэтому любое непрореагировавшее соединение формулы I или его избыток часто могут быть выделены из реакционной смеси для повторного использования, что особенно выгодно, когда Я означает углеводную группировку, поскольку такие соединения могут быть относительно дорогостоящими и/или трудоемкими для получения. Более того, фенилтиосульфонатные соединения формулы I обычно дешевле и легче для получения, чем соответствующие МТ8 соединения.

Соединения формулы I могут быть получены различными способами. Соединения, где X означает 8О₂, могут быть получены путем взаимодействия соединения формулы II:

М(58О₂В’)_к II где

М означает металл, например, Ь1, Ыа, К, СТ. Са, Мд, Ζη или А1, предпочтительно Να или К; и к равно 1, 2 или 3;

с соединением формулы III:

К-Б _ш где

Я такой, как определено для соединения формулы I, и Ь означает уходящую группу.

Любая уходящая группа Ь может быть использована до тех пор, пока полученный анион Ь^- не будет каким-либо образом чрезмерно препятствовать реакции, например, путем взаимодействия с продуктом. Предпочтительные уходящие группы Ь включают в себя галогено и сульфонаты, такие как толуолсульфонат (тозилат), метансульфонат (мезилат) и трифторметансульфонат (трифлат), в частности хлоро и бромо.

Соединения формулы III имеются в продаже или могут быть получены с использованием способов, известных в данной области, например, способов образования галогеносахаров вообще и 1галогеносахаров в частности. Предпочтительно, соединение формулы III представляет собой гликозилгалогенид. Примеры подходящих соединений формулы III на основе глюкозы и галактозы показаны в общем случае ниже:

- 5 011299

Я3	^оя5	я3	...-.ок5
		Я4^ \~---	-к---0
я5о\.
	о я5		оя5]
			0-	-(СН2)(—Вг
я3		к3	_-ОК5
Я5оД_	ояч	К5О-Х	ОК5	-О--(СН2)1 — -Вг
	Вг

где каждый К⁵ независимо представляет собой Н, сахаридную группировку или подходящую защитную группу, например, Ас или Вп, предпочтительно каждый К⁵ представляет собой Н;

один из К³ и К⁴ представляет собой Н, а другой представляет собой ОН, О-защитную группу или Осахаридную группировку, предпочтительно Н или О-сахаридную группировку; и ΐ равно 1-10, предпочтительно 1-6, более предпочтительно 2 или 3.

Реакция может быть осуществлена в любой системе растворителей, в которых растворимо соединение формулы III. Предпочтительно, соединение формулы II также по меньшей мере частично растворимо в системе растворителей. Подходящие растворители включают в себя алканолы, такие как этанол и метанол, Ν,Ν-диметилформамид (ДМФА) и ацетонитрил, причем ацетонитрил является особенно предпочтительным.

Соединения формулы II могут быть получены путем взаимодействия соответствующей сульфинитной соли (формула VII) с серой, как показано на схеме 4:

М(ЗО₂К¹)_к + 8^ Μ(33Ο₂Κ')κ

VII II

Схема 4

Соединения формулы II, являющиеся кристаллическими, предпочтительны для простоты очистки, особенно в промышленном масштабе.

Сульфинитные соли формулы VII имеются в продаже (например, бензолсульфинит натрия) или могут быть получены способами, известными в данной области (см., например, 1Р 61205249, и М. ИсЫпо е! а1., С11ст1еа1 & Рйагтасеийса1 Ви11е1ш, 1978, 26(6), 1837-45, содержание которых включено в настоящую заявку путем ссылки). Например, соответствующая тиолатная соль К¹?- может быть получена путем депротонирования соответствующего тиолового соединения К¹8Н с использованием подходящего основания, например, метиллития. Тиолатная соль затем может быть окислена до соответствующей сульфинитной соли с использованием подходящего окисляющего агента, например, 2-(фенилсульфонил)-3фенилоксазиридина (реагента Дэвиса, ЗапбппеШ е! а1., Огдашс Ьейегк (1999), 1(8), 1177-1180, содержание которого включено в настоящую заявку путем ссылки).

Альтернативно, соединения формулы I, в которых X означает ?О₂, могут быть получены путем взаимодействия дисульфида формулы VIII с сульфинит-анионом К^!8О₂ ^- в присутствии ионов серебра, как показано на схеме 5:

Я—8—8—Я + к’зОг' ----► Я—8—8О₂—Я¹

I

VIII

Схема 5

Дисульфидные соединения формулы VIII имеются в продаже или могут быть получены с использованием способов, известных в данной области.

Соединения формулы I, где X означает 8е, могут быть образованы путем взаимодействия соединения формулы V:

Я—8Н _ν где К такой, как определено для соединения формулы I, с соединением формулы VIа или ЩЬ:

Р¹ЗеЬ^г К¹Зе(ОН)₂

VI а У1Ь где К¹ такой, как определено для соединения формулы I, и Ь² означает уходящую группу, например, ОН, Вг, С!, СN или I, предпочтительно Вг. Реакцию можно проводить в безводном дихлорметане и затем гасить добавлением триэтиламина. Предпочтительное соединение формулы Ша представляет собой Р118еВг. а предпочтительное соединение формулы УТЬ представляет собой Рй8е(ОН)₂.

- 6 011299

Соединения формулы VI имеются в продаже (например, Рй8еВт, Рй8еС1, РкЗеСЫ, 2нитрофенилселеноцианат) или могут быть получены способами, известными в данной области. Например, Ме8еВт может быть получен согласно способу, опубликованному Норе Ετίο С., Кетшй! Т1т и Ьеуакои ^1Шат, в 1оигиа1 о! 1йе Сйеш1са1 8ос1е1у. Регкт Тгаикасйоик 2: Рйу81са1 Отдашс СйетШту (19721999) (1987), (4), 487-90, содержание которого включено в настоящую заявку путем ссылки.

Органические соединения, содержащие по меньшей мере одну тиоловую группу, включая соединения формулы V, имеются в продаже или могут быть получены с использованием способов, известных в данной области, например, способов получения тиоловых соединений вообще и тиосахаров в частности.

Например, тиосахара могут быть получены из соответствующих галогеносахаров путем обработки галогеносахара тиомочевиной с получением соответствующей изотиоурониевой соли (XV. А. Вопиет, I. Ε. Кайи, I. Ат. Сйет. 8ос. 1951, 73), с последующим мягким гидролизом метабисульфитом натрия с получением соответствующего тиола. При необходимости, в процессе синтеза любых тиосахаров могут быть использованы подходящие защитные группы. Когда В в соединении формулы V означает углеводную группировку, тогда тиоловая группа может находиться в любом положении в этой группировке. Предпочтительно, она находится в аномерном положении сахарида или присоединяется к аномерному углероду через линкер.

Примеры подходящих соединений формулы V на основе глюкозы и галактозы в общем виде показаны ниже:

где каждый В⁵ независимо представляет собой Н, сахаридную группировку или подходящую защитную группу, например, Ас или Ви, предпочтительно каждый В⁵ представляет собой Н;

один из В³ и В⁴ представляет собой Н, а другой представляет собой ОН, О-защитную группу или Осахаридную группировку, предпочтительно Н или О-сахаридную группировку; и г равно 2-10, предпочтительно 2-6, более предпочтительно 2 или 3.

Соединения формулы V также подходят для применения в качестве тиол-содержащего соединения в четвертом способе настоящего изобретения.

При взаимодействии соединений формулы V с соединениями формулы VI любые другие функциональные группы в соединении формулы V могут быть незащищенными или могут быть защищены защитными группами, известными в данной области.

Превращение по меньшей мере одной тиоловой группы в белке, пептиде или аминокислоте в одну селененилсульфидную группу согласно третьему или четвертому способу является высоко селективным. Кроме того, реакция тиол-содержащего органического соединения с селененилсульфидной группой является высоко сайт-селективной. Поэтому обычно нет необходимости в защите каких-либо других функциональных групп в белке, пептиде или аминокислоте или в тиол-содержащем органическом соединении, пока осуществляют способы согласно изобретению. Это может быть чрезвычайно полезно, поскольку исключает необходимость последующих стадий удаления защиты, которые проводятся с продуктом.

Если белок, пептид или аминокислота содержат более чем одну тиоловую группу, то потенциально каждая такая тиоловая группа будет превращаться в соответствующую селененилсульфидную группу. Потенциально каждая такая селененилсульфидная группа может быть затем подвергнута взаимодействию с тиол-содержащим органическим соединением, что приводит к присоединению органического соединения через дисульфидную связь к белку, пептиду или аминокислоте по многим сайтам. Таким образом, в способах согласно настоящему изобретению предусмотрен удобный способ химической модификации белка, пептида или аминокислоты по многим сайтам. В частности, способы согласно настоящему изобретению делают возможным гликозилирование белка, пептида или аминокислоты по многим сайтам.

Превращение тиоловой группы в белке, пептиде или аминокислоте в селененилсульфидную группу согласно третьему или четвертому способу удобно осуществлять путем взаимодействия указанного белка, пептида или аминокислоты с соединением формулы Ха или ХЬ:

- 7 011299

К2-Зе-1?	или К2-Зе(ОН)г
Ха	ХЬ

где

Ь означает уходящую группу, например, ОН, Вг, ΟΝ, С1 или I, предпочтительно Вг; и

Я² означает факультативно замещенную алкильную группу, факультативно замещенную фенильную группу, факультативно замещенную бензильную группу, факультативно замещенную пиридильную группу или факультативно замещенную нафтильную группу. Предпочтительная группа Я² представляет собой фенил, предпочтительное соединение формулы Ха представляет собой РЬ8еВг, а предпочтительное соединение формулы ХЬ представляет собой РЬ8е(ОН)₂.

Когда Я² означает факультативно замещенную группировку, тогда подходящие заместители включают в себя любые заместители, которые не препятствуют реакции с тиол-содержащим белком, пептидом или аминокислотой, и предпочтительно также не препятствуют любой последующей реакции белка, пептида или аминокислоты, например, реакции с тиол-содержащим органическим соединением. Подходящие заместители включают в себя -ΝΟ₂, -8О₃Н, -СО₂Н, -(СН₂СН₂О)_ПН и -(СН₂СН₂О)_пМе, где η равно 1100, предпочтительно 1-50, более предпочтительно 1-20 и еще более предпочтительно 1-10. Группа Я² может быть независимо замещена 1-5 и предпочтительно 1 или 2 заместителями.

Группа Я² может также по выбору присоединяться к твердой подложке или образовывать часть этой твердой подложки. Например, соединение формулы Ха или ХЬ может быть получено из смолы, такой как полистирольная смола, как показано ниже:

Соединения формулы Ха и ХЬ имеются в продаже или могут быть получены способами, известными в данной области, как обсуждалось выше для соединений формулы У1а и У1Ь.

По меньшей мере один молярный эквивалент соединения формулы Ха или ХЬ на одну тиоловую группу белка, пептида или аминокислоты следует использовать для обеспечения превращения каждой такой тиоловой группы в соответствующую селененилсульфидную группу. Реакцию предпочтительно осуществляют в водном растворителе (таком как смесь воды и ацетонитрила) в присутствии буфера (например, МЕ8, рН 9,5). рН и температуру реакции следует выбирать таким образом, чтобы избежать нежелательной денатурации белка или пептида. Предпочтительно, реакцию осуществляют при комнатной температуре или ниже, при слегка щелочном значении рН (например, при рН от примерно 8 до примерно 9,5).

Органическое соединение, содержащее тиоловую группу, может представлять собой любое органическое соединение, которое подходит для связывания с белком, пептидом или аминокислотой, и в котором атом серы тиоловой группы может действовать в качестве нуклеофила при взаимодействии с селененилсульфидной группой. Не существует никакого специального ограничения относительно природы органического соединения. Например, тиоловая группа может быть первичной, вторичной или третичной. Соединение может быть ароматическим или алифатическим. Например, соединение может представлять собой алкил, алкенил (например, фарнезил) или алкинилтиол. Предпочтительно соединение содержит только одну тиоловую группу.

Подходящие органические группировки для присоединения к белку, пептиду или аминокислоте включают в себя любую группу, которая может быть полезна при модификации физических или химических свойств белка, пептида или аминокислоты. Подходящие группировки включают в себя метки (например, флуоресцентные метки) или группы для обеспечения стабильности, процессинга или растворимости белка, пептида или аминокислоты. Органическое соединение может представлять собой также второй белок, пептид или аминокислоту, которые обеспечивают возможность связывания одного белка, пептида или аминокислоты с другим белком, пептидом или аминокислотой через дисульфидную связь с использованием способов согласно настоящему изобретению.

Предпочтительно, органическое соединение, содержащее по меньшей мере одну тиоловую группу, представляет собой фарнезильное производное, или представляет собой углеводную группировку, как определено выше, и может быть присоединено через линкер к тиоловой (-8-Н) группе. Линкер может содержать 1-10 атомов между углеводной группировкой и группой -8Н. Например, линкер может представлять собой алкиленовую группу (например, группу -(СН₂)₂, где ΐ равно 1-10), или алкениленовую группу (например, группу -(СН₂)СН=СН- или -СН₂СН₂СН=СН-). Предпочтительными являются соединения, в которых тиоловая группа находится в аномерном положении сахаридного остатка или присоединена к аномерному углероду через линкер.

- 8 011299

Любые функциональные группы в углеводной группировке могут быть защищены с использованием защитных групп, известных в данной области, как обсуждалось выше. Любые защитные группы могут быть удалены до или после присоединения углеводной группировки к аминокислоте, пептиду или белку. Предпочтительно, их удаляют до реакции с селененилсульфидным соединением, чтобы исключить необходимость осуществления каких-либо стадий удаления защиты после стадии присоединения. Еще одно преимущество способа гликозилирования согласно изобретению состоит в том, что он обеспечивает возможность связывания незащищенных углеводных группировок с аминокислотой, пептидом или белком.

Реакцию селененилсульфидной группы с органическим соединением, содержащим тиоловую группу, согласно четвертому способу (т.е. реакцию образования дисульфидной связи) обычно осуществляют в присутствии буфера при нейтральном или щелочном рН (например, при рН от примерно 7 до примерно 9,5), причем предпочтительными являются слегка щелочные значения рН (например, рН от примерно 8 до примерно 9). Подходящие буферы включают в себя НЕРЕ8, СНЕ8, МЕ8 и Трис. Величина рН должна быть такой, чтобы во время реакции не наблюдалось нежелательной денатурации, или она была бы незначительной. Аналогично, температуру реакции следует выбирать таким образом, чтобы избежать каких-либо существенных повреждений соединений чувствительных к температуре. Например, реакцию с белком или пептидом предпочтительно осуществляют при температуре окружающей среды или ниже, чтобы избежать какой-либо денатурации. Могут быть использованы системы с водными или органическими растворителями, при этом системы с водными растворителями являются предпочтительными для обеспечения растворения белка, аминокислоты или пептида. Системы с водными растворителями также являются предпочтительными, поскольку они обеспечивают возможность использования незащищенных углеводных соединений в качестве органического соединения. Реакция обычно протекает довольно быстро, например, часто в течение менее 1 ч.

В общем, при проведении реакции используется избыток органического соединения, содержащего по меньшей мере одну тиоловую группу, например, 10-20 эквивалентов по отношению к белку, аминокислоте или пептиду. Однако в некоторых случаях можно использовать только 1 молярный эквивалент. Углеводные соединения могут быть дорогостоящими и трудоемкими, что касается их получения в больших количествах. Поэтому, когда органическое соединение, содержащее по меньшей мере одну тиоловую группу, представляет собой углеводное соединение, из соображений экономии желательно использовать минимально возможное количество эквивалентов. Способы гликозилирования белков, известные из предшествующего уровня техники, часто требуют применения очень большого избытка углеводного соединения, например, часто порядка 1000 эквивалентов (В.О. Ωανίδ. Сип. Орш. Вю1ес11по1. 2003, 14, 379). Таким образом, способ согласно изобретению преимущественно обеспечивает возможность применения меньшего количества эквивалентов гликозильного соединения, чем способы известные из предшествующего уровня техники.

Изобретение будет проиллюстрировано следующими не ограничивающими примерами.

Описание примеров осуществления изобретения

Точки плавления регистрировали на нагревающем блоке Кофлера (КоПег) и представляют собой значения без учета погрешности. Спектры протонного ядерного магнитного резонанса (5_Н) 400 мГц определяли, используя СО8У. Спектры углеродного ядерного магнитного резонанса (5_С) определяли, используя НМОС. Мультиплетности определяли, используя последовательность ЭЕРТ. Все химические сдвиги приведены на шкале δ в млн^-1 с использованием остаточного растворителя в качестве внутреннего стандарта.

Максимумы адсорбции в инфракрасных спектрах регистрировали в волновых числах (см^-1) и классифицировали как 5 (интенсивный) и Ьг (широкий). Масс-спектры низкого разрешения регистрировали, используя ионизацию электрораспылением (ИЭР) или используя методы химической ионизации (ХН₃, ХИ), как указано. Масс-спектры высокого разрешения (МСВР) регистрировали, используя методы химической ионизации (ХН₃, ХИ) или используя методы ионизации электрораспылением (ХН₃, ХИ), или используя ионизацию электрическим полем (ИЭП+), как указано. Значения т/ζ представлены в дальтонах и сопровождаются значением их процентного избытка в круглых скобках.

Оптические вращения измеряли на поляриметре с длиной пробега 1 дм. Концентрации даны в г/100 мл.

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) осуществляли на предварительно покрытых К1еке1де1 60Е₂₅₄ стеклянных пластинах от фирмы Мегск. Визуализацию пластин осуществляли, используя УФ лампу (/._т,_к = 254 или 365 нм), и/или молибдат аммония (5% в 2М Н₂8О₄) или серную кислоту (5% в ЕЮН). Колоночную флэшхроматографию осуществляли, используя силикагель 8о1Ь511 С60 40/60. Дихлорметан (ДХМ) перегоняли после обезвоживания с использованием гидрида кальция. Ацетон перегоняли после обезвоживания с использованием безводного сульфата кальция. Остальные безводные растворители были получены от фирмы Е1ика. 'Бензин' означает фракцию петролейного эфира, кипящую в диапазоне 40-60°С.

Масс-спектрометрия белков: Жидкостную хроматографию/масс-спектрометрию осуществляли на Мюгота55 ЬСТ (Е81-ТОЕ-М8), соединенном с \Уа1ег5 АШаисе 2790 НРЬ.С, используя колонку РНепоте- 9 011299 пех 1ирйег С5 (150 х 2,1 мм х 5 мкм). В качестве подвижной фазы использовали воду (растворитель А) и ацетонитрил (растворитель В), причем каждый содержал 0,5% муравьиной кислоты, при скорости потока 0,2 мл мин^-1. Градиент программировали следующим образом: 95% растворителя А (3 мин изократический) до 100% растворителя В через 16 мин, затем изократический в течение 2 мин. Источник электрораспыления ЬСТ работал с напряжением в капилляре 3 кВ и напряжением на острие 30 В. Азот использовали в качестве распылителя и десольватирующего газа при общей скорости 400 л ч^-1. Миоглобин (сердце лошади) использовали в качестве калибровочного стандарта и для тестирования чувствительности системы.

Пример 1. (2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-в-О-глюкопиранозил)-1-изотиоурония бромид

2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-а-Э-глюкопиранозилбромид (11,0 г, 26,4 ммоль) и тиомочевину (3,10 г, 41,9 ммоль) растворяли в безводном ацетоне (30 мл) в атмосфере аргона и нагревали до 60°С. Через 20 мин осаждалось белое твердое вещество. Осадок отделяли фильтрацией, фильтрат снова нагревали до температуры дефлегмации, и этот процесс повторяли до тех пор, пока твердое вещество не прекращало осаждаться. Желтоватые кристаллы объединяли и перекристаллизовывали из смеси ацетон/бензин с получением целевого соединения (11,4 г, 76%) в виде белого твердого кристаллического вещества, т.пл. 194196°С [Лит. 191°С (Н. Веуег, и. Зсйшй, Сйет. Вег. 1954, 87, 78)]; [а]_с ²⁵ -5,6 (с, 1,0 в Н2О) [Лит. [а]с²⁵ -7,6 (с, 1,4 в Н2О) (V. А. Воппег, 1. Е. Кайп, 1 Ат Сйет 8ос, 1951, 73, 2241)]; δ_Η (400 МГц, ДМСО-б₆) 1,97, 2,00, 2,02, 2,06 (12Н, 4 х 8, 4 х СН₃), 4,06-4,25 (3Н, т, Н-5, Н-6, Н-6'), 5,07-5,12 (2Н, т, Н-2, Н-4), 5,31 (1Н, а!, 1 9,5 Гц, Н-3), 5,77 (1Н, б, ί_1>2 9,9 Гц, Н-1), 9,13 (2Н, Ьг8, ИН₂), 9,29 (2Н, Ьг8, ЦН₂).

Пример 2. 1-Тио-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-в-Э-глюкопираноза

(2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-в-О-глюкопиранозил)-1-изотиоурония бромид (9,0 г, 18,8 ммоль) и Ыа₂8₂О₅ (4,93 г, 26,0 ммоль) добавляли при перемешивании к смеси ДХМ (150 мл) и воды (70 мл). Смесь нагревали до температуры дефлегмации в атмосфере аргона. Через 1,5 ч реакцию охлаждали до комнатной температуры (КТ) и разделяли фазы. Водный слой повторно экстрагировали ДХМ (3 х 50 мл). Объединенные органические слои промывали водой (50 мл), сушили над Мд8О₄, фильтровали, и растворитель удаляли в вакууме с получением целевого соединения (6,14 г, 90%) в виде белого твердого вещества, т.пл. 112-114°С [Лит. 113-114°С (К. 1. Еетег, К. Н. Еитеаих, СагЬойубг. Ке8. 1977, 57, 73)]; [а]_с ²⁴ +6,3 (с, 1,2 в СНС13) [Лит. |а| ² +5,0 (с, 1,1 в СНС13) (К. 1. Еетег, К. Н. Еитеаих, СагЬойубг. Ке8. 1977, 57, 73)]; б_Н (400 мГц, СНС1₃) 1,99, 2,00, 2,05, 2,06 (12Н, 4 х 8, 4 х СН₃), 2,30 (1Н, б, 1_1>8Н 10.2 Гц, 8Н), 3,71 (1Н, δ, .V, 10,0 Гц, .1,.. 2,4 Гц, 1₅,₆. 4,7 Гц, Н-5), 4,10 (1Н, бб, 1₆,₆. 12,3 Гц, Н-6), 4,22 (1Н, бб, Н-6'), 4,53 (1Н, а!, 1 9,9 Гц, Н-1), 4,95 (1Н, а!, ί 9,5 Гц, Н-2), 5,08 (1Н, а!, 1 9,8 Гц, Н-4), 5,17 (1Н, а!, 1 9,4 Гц, Н-3).

Пример 3. (2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-в-О-галактопиранозил)-1-изотиоурония бромид

2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-О-в-галактопиранозилбромид (5,4 г, 13,0 ммоль) и тиомочевину (1,25 г, 16,8 ммоль) растворяли в безводном ацетоне (40 мл) в атмосфере аргона и нагревали до 60°С. Через 1 ч реакцию оставляли охлаждаться до комнатной температуры, и полученный остаток фильтровали и перекристаллизовывали из смеси ацетон/бензин с получением целевого соединения (4,6 г, 70%, 2 стадии) в виде белого твердого кристаллического вещества, т.пл. 134-137°С [Лит. 170°С из изопропанола (XV. А. Воппег, 1. Е. Кайп, 1 Ат Сйет 8ос 1951, 73, 2241)]; [а]_с ²⁵ +40,4 (с, 1,0 в Н2О) [Лит. [а]с²⁵ +16,0 (с, 1,6 в Е!ОН, (V. А. Воппег, 1. Е. Кайп, 1 Ат Сйет 8ос 1951, 73, 2241)); δΗ (500 мГц, ДМСО-б₆) 1,96, 2,02, 2,09, 2,15 (12Н, 4 х 8, 4 х СН₃) 4,06-4,13 (2Н, т, Н-6, Н-6'), 4,45 (1Н, !, 1 6,2 Гц, Н-5), 5,12 (1Н, а!, 1 9,9 Гц, Н-2), 5,24 (1Н, бб, ,1_;; 10,0 Гц, 1₃,₄ 3,6 Гц, Н-3), 5,39 (1Н, б, 1₃,₄ 3,1 Гц, Н-4), 5,71 (1Н, б, ί_1>2 10,2 Гц, Н-1), 9,12, 9,36 (2 х 2Н, 2 х Ьг8, 2 х ИН₂).

- 10 011299

Пример 4. 1-Тио-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-в-Э-галактопираноза

(2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-в-О-галактопиранозил)-1-изотиоурония бромид (4,4 г, 8,8 ммоль) и Ыа₂8₂О₅ (2,02 г, 10,6 ммоль) добавляли при перемешивании к смеси ДХМ (60 мл) и воды (30 мл). Смесь нагревали до температуры дефлегмации в атмосфере аргона. Через 2,5 ч реакцию охлаждали до КТ и разделяли фазы. Водный слой повторно экстрагировали ДХМ (3 х 50 мл). Объединенные органические слои промывали водой (100 мл), рассолом (100 мл), сушили над Мд8О₄, фильтровали, и растворитель удаляли в вакууме с получением целевого соединения (2,65 г, 81%) в виде белого твердого вещества, т.пл. 83-84°С [Лит. 86,5-88°С (I. Етда1а, М. Сету, I. 8!апек, Со11ес!. С/еск. Скет. Соттип. 1975, 40, 1411)]; [а]_с ²⁴ +30,1 (с, 1,0 в СНС13) [Лит. [а]с¹⁹ +32,0 (с, 3,5 в СНС13) (I. Етда1а, М. Сету, к 81апек. Со11ес1. С/еск. Скет. Соттип. 1975, 40, 1411)]; δ_Η (400 мГц, СНС1₃) 1,99, 2,06, 2,10, 2,17 (12Н, 4 х 8, 4 х СН₃), 2,38 (1Н, б, 6_1>8Н

10,3 Гц, 8Н). 3,95 (1Н, б!, 1₄,₅ 1,2 Гц, 1₅,₆ 6,6 Гц, 1₅,₆, 6,6 Гц, Н-5), 4,09-4,14 (2Н, т, Н-6, Н-6'), 4,53 (1Н, а!, I

9,9 Гц, Н-1), 5,02 (1Н, бб, 1₂,₃ 10,1, 1₃,₄ 3,4 Гц, Н-3), 5,19 (1Н, а!, I 10,0 Гц, Н-2), 5,44 (1Н, а!, бб, 1₃,₄ 3,7 Гц, 14,5 1,2 Гц, Н-4).

Пример 5. (3,4,6-Три-О-ацетил-2-ацетамидо-2-дезокси-в-О-глюкопиранозил)-1-изотиоурония хлорид

3,4,6-Три-О-ацетил-2-ацетамидо-2-дезокси-а-О-глюкопиранозоилхлорид (3,0 г, 8,2 ммоль) и тиомочевину (1,21 г, 14,6 ммоль) растворяли в безводном ацетоне (25 мл) в атмосфере аргона и нагревали до 60°С. Через 2 ч осаждалось белое твердое вещество. Осадок отделяли фильтрацией, фильтрат снова нагревали до температуры дефлегмации, и этот процесс повторяли до тех пор, пока твердое вещество не прекращало осаждаться. Желтоватые кристаллы объединяли и перекристаллизовывали из смеси ацетон/бензин с получением целевого соединения (2,19 г, 61%) в виде белого твердого кристаллического вещества, т.пл. 134-137°С [Лит. 179-181°С из Е!ОН (Ό. Нойоп, М. Ь. ^о1£тот, I. Отд. Скет. 1962, 27, 1794)]; [а]_с ²⁵ -25,2 (с, 1,0 в Н2О) [Лит. [а]с²⁵ -29,3 (с, 1,1 в МеОН) (Ό. Нойоп, М. Ь. №о1£гот, I. Огд. Скет. 1962, 27, 1794)]; бН (400 мГц, ДМСО-б₆) 1,80 (3Н, 8, ЦНСОСН₃), 1,94, 1.98, 2.08 (9Н, 3 х 8, 3 х СН₃), 4,05 (1Н, бб, .1,·. 2,4 Гц, 16,6. 12,4 Гц, Н-6), 4,17 (1Н, бб, 1₃,6. 5,0 Гц, 16,6, 12,3 Гц, Н-6'), 4,26 (1Н, δ, Цз

10,2 Гц, 1₅,₆ 2,3 Гц, 1₅,₆. 4,7 Гц, Н-5), 4,93 (1Н, а!, I 9,9 Гц, Н-4), 5,12 (1Н, а!, I 9,9 Гц, Н-3), 5,73 (1Н, б, Ιι,₂

10,4 Гц, Н-1), 8,48 (1Н, б, I 4,7 Гц, ЦНАс), 9,13 (2Н, Ьг8, ЦН₂), 9,29 (2Н, Ьт8, ЦН₂).

Пример 6. 1-Тио-3,4,6-три-О-ацетил-2-ацетамидо-2-дезокси-в-О-глюкопираноза

(3,4,6-Три-О-ацетил-2-ацетамидо-2-дезокси-в-О-глюкопиранозил)-1-изотиоурония хлорид (1,75 г, 39,8 ммоль) и Ыа₂8₂О₅ (0,91 г, 4,8 ммоль) добавляли к перемешиваемой смеси ДХМ (30 мл) и воды (15 мл). Смесь нагревали до температуры дефлегмации в атмосфере аргона. Через 2 ч реакцию охлаждали до КТ и разделяли фазы. Водный слой повторно экстрагировали ДХМ (2 х 50 мл). Объединенные органические слои промывали водой (50 мл), рассолом (50 мл), сушили над Мд8О4, фильтровали, и растворитель удаляли в вакууме. После перекристаллизации из смеси Е!ОАс/бензин было получено целевое соединение (1,00 г, 68%) в виде белого твердого вещества, т.пл. 165-167°С [Лит. 167-168°С (V. М. ζυ Вескепбогк, V. А. Воппег, I. Огд. Скет. 1961, 26, 4596)]; [а]_с ²⁵ -24,8 (с, 1,0 в СНС13) [Лит. [а]с²⁵ -14,5 (с, 0,9 в СНС13) (V. М. ζυ Вескепбогк, V. А. Воппег, I. Огд. Скет.1961, 26, 4596)]; δ_Η (400 мГц, СНС1₃) 1,99, 2,03, 2,05,

2,10 (12Н, 4 х 8, 4 х СН₃), 2,57 (1Н, б, 6_1>8Н 9,2 Гц, 8Н), 3,67 (1Н, δ, 1₄,₅ 9,7 Гц, 1₅,₆ 4,8 Гц, 1₅,₆, 2,3 Гц, Н-5), 4,09-4,17 (2Н, т, Н-2, Н-3), 4,24 (1Н, бб,’ 1₅,₆ 4,8 Гц, 1₆,₆, 12,4 Гц, Н-6),’ 4,59 (1Н, а!, I 9,8 Гц, Н-1), 5,06-5,15 (2Н, т, Н-4, Н-6'), 5,72 (1Н, б, I 9,2 Гц, ЦН).

Пример 7. 1-Тио-в-Э-галактопираноза

- 11 011299

1-Тио-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-в-Э-галактопиранозу (3,00 г, 7,3 ммоль) и ЫаОМе (40 мг, 0,73 ммоль) добавляли при перемешивании к раствору МеОН (40 мл). Через 2 ч ТСХ (Е!ОАс/бензин, 1:1) показала образование продукта (ВТ 0,0) с полным расходованием исходного вещества (В_Т 0,5). Реакционную смесь нейтрализовали добавлением ионообменной смолы Оо\\'ех®-50. после чего реакционную смесь фильтровали и концентрировали в вакууме. После перекристаллизации из смеси МеОН/Е!ОАс было получено целевое соединение (1,41 г, 98%) в виде белого твердого кристаллического вещества, т.пл. 100-102°С; [а]_с ²² +47,6 (с, 1,0 в МеОН; δΗ (400 мГц, ΟΌ3ΟΌ), 2,62 (1Н, б, 1! ЗН 8,3 Гц, 8Н), 3,47-3,49 (2Н, т, Н-2, Н3), 3,57 (1Н, а!, 1 5,9 Гц, Н-5), 3,68 (1Н, бб, 15,6 5,0 Гц, 16,6. 11,4 Гц, Н-6), 3,75 (1Н, бб, 15,6 6,9 Гц, 16,6. 11,5 Гц, Н-6'), 3,91 (1Н, Ь8, Н-4), 4,37 (1Н, Ьб, 1 7,7 Гц, Н-1); 8С (100 мГц, ΟΌ3ΟΌ), 61,6 (!, С-6), 69,6 (б, С-4), 74,4, 74,8 (2 х б, С-2, С-3), 80,1 (б, С-5), 81,4 (б, С-1); т/ζ (ЭР-) 196 (100%, М-Н⁺); т/ζ МСВР (ЭР-) Вычислено для С6Н₁₂О₅8 (М-Н⁺) 195,0327. Найдено 195,0323.

Пример 8. 1-Тио-2-ацетамидо-2-дезокси-в-О-глюкопираноза но—

АсИН

3,4,6-Три-О-ацетил-2-ацетиламино-2-дезокси-в-О-глюкопиранозилтиол (400 мг, 0,98 ммоль) и метоксид натрия (18 мг, 0,03 ммоль) добавляли при перемешивании к раствору метанола (10 мл). Через 30 минут ТСХ (этилацетат) показала образование продукта (В_Т 0,0) с полным расходованием исходного вещества (В_Т 0,2). Реакционную смесь нейтрализовали добавлением ионообменной смолы Оо^ех®-50, после чего реакционную смесь фильтровали и концентрировали в вакууме. После перекристаллизации из смеси метанол/этилацетат было получено целевой продукт (230 мг, 98%) в виде белого твердого кристаллического вещества; т.пл. 85-88°С [Лит. 86-88°С]¹⁸; [α]Β²² -10,4 (с, 1,0 в МеОН) [Лит. [α]Β²⁵ +177,1 (с, 1,45 в СНС13)]¹⁸; δΗ (400 мГц, МеОН), 2,00 (3Н, 8, СН₃), 3,27-3,37 (2Н, т, Н-4, Н-5), 3,42 (1Н, а!, 1 9,1 Гц, Н-3), 3,64-3,73 (2Н, т, Н2, Н-6), 3,87 (1Н, бб, 1₅,₆ 2,1 Гц, 1₆,₆, 12,0 Гц, Н-6'), 4,56 (1Н, б, 1_1>2 10,0 Гц, Н-1),

8,11 (1Н, Ьб, .Г.< 9,1 Гц, ИН).

Пример 9. 1,2,3,6-Тетра-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-Оглюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-О-глюкопираноза

Ацетат натрия (700 мг, 8,3 ммоль) добавляли к уксусному ангидриду (50 мл) и нагревали до температуры дефлегмации, при которой добавляли мальтотриозу (3,00 г, 6,0 ммоль) и энергично перемешивали. Через 90 мин ТСХ (бензин: этилацетат, 1:2) показала образование продукта (ВТ 0,3) с полным расходованием исходного вещества (В) 0,0). Реакционную смесь оставляли охлаждаться до КТ и разбавляли ДХМ (50 мл) и распределяли с водой (100 мл). Фазы разделяли и водный слой повторно экстрагировали ДХМ (2 х 50 мл). Объединенные органические слои промывали гидрокарбонатом натрия (400 мл насыщенного водного раствора) до тех пор, пока не получали рН 8, рассолом (200 мл), сушили (Мд8О₄), фильтровали и концентрировали в вакууме с получением целевого продукта, представляющего собой смесь аномеров (α/β, 2/11) в виде белого аморфного твердого вещества; для β-соединения: δ_н (500 мГц, СНС1₃) 2,05, 2,07, 2,10, 2,14, 2,15, 2,19, 2,21, 2,27 (30Н, 8 х 8, 10 х ОАс), 3,92 (1Н, δ, 1 4,5 9,5 Гц, 1₅,₆ 2,9 Гц, 1₆₆ 4,1 Гц, Н-5а), 3,95-4,01 (3Н, т, Н-4Ь, Н-5Ь, Н-5с), 4,05 (1Н, а!, 1 9,1 Гц, Н-4а), 4,09 (1Н, бб, 1₅’₆ 2,5 Гц, 16,6, 12,7 Гц, Н-6с), 4,21 (1Н, бб, 1₃,6, 3,4 Гц, 16,6 12,6 Гц, Н-6Ь), 4,29 (1Н, бб, .1,·. 3,4 Гц, 16,6, 12,4 Гц, Н6'с), 4,35 (1Н, бб, 1₅,₆ 4,3 Гц, 1₆,₆. 12,3 Гц, Н-6а), 4,48-4,52 (2Н, т, Н-6'а, Н-6'Ь), 4,78 (1Н, бб, ί_1>2 4,1 Гц, 1₂,₃

10,3 Гц, Н-2Ь), 4,90 (1Н, бб, 11,₂ 4,1 Гц, 1₂,₃ 10,6 Гц, Н-2с), 5,01 (1Н, бб, 1_Ъ2 8,0 Гц, 1₂,₃ 9,0 Гц, Н-2а), 5,11 (1Н, а!, 1 10,1 Гц, Н-4с), 5,31 (1Н, б, 1_1>2 3,9 Гц, Н-1Ь), 5,32-5,44 (3Н, т, Н-3а, Н-3Ь, Н-3с), 5,45 (1Н, б, 1_Ъ2 4,1 Гц, Н-1с), 5,79 (1Н, б, 1_£,₂ 8,2 Гц, Н-1а); для α-соединения выбрали только данные: δ_н (500 мГц, СНС1₃) 2,08, 2,09, 2,12, 2,18, 2,21, 2,23, 2,26 (30Н, 8 х 8, 10 х ОАс), 5,07 (1Н, а!, 1 9,9 Гц), 6,28 (1Н, б, 1_1>2 3,8 Гц, Н-1а). Оставшиеся сигналы лежат в следующих мультиплетных областях: 3,85-3,89, 3,90-3,98, 3,99-4,07, 4,15-4,18, 4,23-4,27, 4,29-4,32, 4,43-4,49, 4,74-4,76, 4,84-4,87, 4,98-4,94, 5,25-5,54; т/ζ (ЭР+) 984 (МИН₄ ⁺, 30%), 989 (МИа⁺, 100%); т/ζ МСВР (ЭР⁺) Вычислено для С₄₍НАС N (МИН₄ ⁺) 984,3196. Найдено 984,3199.

- 12 011299

Пример 10. 2,3,6-Три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-Оглюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозилбромид

1,2,3,6-Тетра-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозил)а-О-глюкопиранозил)-О-глюкопиранозу (200 мг, 0,21 ммоль) растворяли в безводном ДХМ (5 мл). К этой смеси добавляли раствор бромоводорода (33% в уксусной кислоте, 2 мл). Смесь оставляли в атмосфере аргона при КТ. Через 30 мин ТСХ (бензин:этилацетат, 1:2) показала образование продукта (К_Г 0,6) с полным расходованием исходного вещества (К 0,3). Реакционную смесь распределяли между ДХМ (10 мл) и водой (10 мл), и водный слой повторно экстрагировали ДХМ (3x10 мл). Объединенные органические слои промывали гидрокарбонатом натрия (20 мл насыщенного водного раствора) до тех пор, пока не получали рН 8, рассолом (20 мл), сушили (Мд8О₄), фильтровали и концентрировали в вакууме с получением целевого продукта (203 мг, 98%) в виде белой пены; [а]_с ²² +152,2 (с, 1,0 в СНС1₃); δ_Η (400 мГц, СНС1₃) 2,03, 2,05, 2,06, 2,08, 2,10, 2,13, 2,18, 2,21 (30Н, 10 х СОСН₃), 3,93-3,99 (3Н, т, Н-4Ь, Н-5а, Н-5Ь), 4,05-4,10 (2Н, т, Н-4с, Н-6а), 4,20 (1Н, бб, 1₅₆ 1-8 Гц, 1₆₆ 12,2 Гц, Н-6Ь), 4,26-4,34 (2Н, т, Н-5с, Н-6а'), 4,35 (1Н, бб, 1₅₆ 3,5 Гц, 1₆₆. 12,7 Гц, Н-6с), 4,52 (1Н, бб, 1₅’₆ 0,6 Гц, 1₆₆. 12,2 Гц, Н-6Ь'), 4,57 (1Н, бб, 1₅₆ 2,1 Гц, 1₆,₆ 12,4 Гц, Н-6с), 4,74 (1Н, бб, ί_1>2 4,1 Гц, 1₂,₃ 9,9 Гц, Н-2с), 4,78 (1Н, бб, ί_1>2 4,2 Гц, 1₂,₃ 10,2 Гц, Н-2Ь), 4,88 (1Н, бб, 1ι,₂ 4,0 Гц, 1₂,₃ 10,5 Гц, Н-2а), 5,10 (1Н, а!, 1 9,7 Гц, Н-4а), 5,32 (1Н, б, ί_1>2 4,0 Гц, Н-1Ь), 5,39 (1Н, а!, 1 9,9 Гц, Н-3ц), 5,43-5,46 (1Н, т, Н-3Ь), 5,45 (1Н, б, ί_1>2 3,8 Гц, Н-1а), 5,64 (1Н, а!, 1 9,5 Гц, Н-3с), 6,53 (1Н, б, 1ι,₂ 3,9 Гц, Н-1с).

Пример 11. 1-Тио-2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-Оглюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-в-О-глюкопираноза

2,3,6-Три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозил)-аП-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозилбромид (2,10 г, 2,10 ммоль) растворяли в безводном ацетоне (60 мл). К этой смеси добавляли безводную тиомочевину (315 мг, 4,2 ммоль) и затем нагревали до температуры дефлегмации в атмосфере аргона. Через 6,5 ч ТСХ (бензин:этилацетат, 1:2) показала образование продукта (К_Г 0,0) с полным расходованием исходного вещества (КГ 0,3). Реакционную смесь концентрировали в вакууме и титровали ДХМ для удаления органических веществ из избытка тиомочевины. Фильтрат концентрировали в вакууме, и остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (этилацетат/метанол, 9:1) с получением промежуточного соединения 2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-в-О-глюкопиранозил-1изотиоурония бромида (1,14 г, 50%), которое использовали далее без идентификации. Это промежуточное соединение (100 мг, 0,09 ммоль) и Ыа₂8₂О₅ (22 мг, 0,11 ммоль) добавляли при перемешивании к смеси ДХМ (30 мл) и воды (15 мл). Эту смесь нагревали до температуры дефлегмации в атмосфере аргона. Через 2,5 ч ТСХ (бензин:этилацетат, 1:2) показала образование продукта (К_Г 0,4) с полным расходованием исходного вещества (К_Г 0,0), после чего реакционную смесь охлаждали до КТ и разделяли фазы. Водный слой повторно экстрагировали ДХМ (2 х 20 мл). Объединенные органические слои промывали рассолом (20 мл), сушили (Мд8О₄), фильтровали, и растворитель удаляли в вакууме с получением целевого продукта (74 мг, 84%) в виде белого аморфного твердого вещества; [а]_с ²² +99,5 (с, 1,0 в СНС1₃); б_Н (400 МГц, СНС1₃) 1,99, 2,00, 2,01, 2,02, 2,03, 2,05, 2,10, 2,15, 2,18 (30Н, 9 х 8,10 х СОСН₃), 3,72-3,76 (1Н, т, Н5а), 3,90-4,00 (4Н, т, Н-4а, Н-4Ь, Н-5Ь, Н-5с), 4,05 (1Н, бб, 1₅,₆ 2,2 Гц, 1₆,₆ 12,3 Гц, Н-6с), 4,17 (1Н, бб, 1₅,₆

- 13 011299

3,3 Гц, 1₆₆. 12,3 Гц, Н-6Ь), 4,25 (1Н, 66, 1₅₆ 3,6 Гц, 1₆₆.12,5 Гц, Н-6с'), 4,30 (1Н, 1₅₆ 4,3 Гц, 1₆₆.12,2 Гц, Н6с), 4,44 (1Н, 66, 1₅,₆ 2,2 Гц, 1₆,₆. 12,1 Гц, Н-6а'), 4,46 (1Н, 66, 1₅,₆ 2,2 Гц, 1₆,₆.12,2 Гц, Н-6Ь'), 4,59 (1Н, 6, ί_1>2 9,7 Гц, Н-1а), 4,74 (1Н, 66, 1_£,₂ 4,1 Гц, 1₂,₃ 10,6 Гц, Н-2Ь), 4,80 (1Н, а!, I 9.0 Гц, Н-2а), 4,85 (1Н, 66, ί_1>2 4,1 Гц, 1₂,₃ 10,6 Гц, Н-2с), 5,07 (1Н, а!, 1 9,9 ’Гц, Н-4с), 5,25 (1Н, а!, 1 9,0 Гц, Н-3а), 5,26 (1Н, 6, ί_1>2 4,1 Гц, Н1Ь), 5,35 (1Н, а!, 1 10,0 Гц, Н-3Ь), 5,37-5,41 (2Н, т, Н-1с, Н-3с).

Пример 12. 1-Тиоацетил-2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-аО-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-в-О-глюкопираноза

2,3,6-Три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозил)-аО-глюкопиранозил)-в-0-глюкопиранозилбромид (11,2 г, 11,6 ммоль) и тиоацетат калия (3,96 г, 34,8 ммоль) суспендировали в безводном ТГФ (40 мл) и нагревали до температуры дефлегмации в атмосфере инертного аргона. Через 14 ч ТСХ (бензин/Е!ОАс, 1:2) показала образование основного продукта (Я_£ 0,4) наряду с полным расходованием исходного вещества (Я_£ 0,45). Реакционную смесь разбавляли водой (80 мл) и оставляли охлаждаться до КТ. Фазы разделяли, и водную фазу повторно экстрагировали ДХМ (3 х 40 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором ЫаНСО₃ (50 мл) до тех пор, пока не получали рН 8, рассолом (50 мл), сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин/Е!ОАс, 1:4) с получением целевого соединения (8,08 г, 71%) в виде белой пены; [α]_Β ²⁵ +86,4 (с, 1,0 в СНС1₃); 5_Н (400 МГц, СНС1₃) 2,01, 2,02, 2,05, 2,08, 2,11, 2,17 (27Н, 6 х 8, 9 х ОАс), 2,40 (3Н, 8, 8Ас), 3,88 (1Н, δ, 1₄,₅ 9,8 Гц, 1₅,₆ 4,0 Гц, 1₅,₆ 2,7 Гц, Н-5а), 3,92-4,01 (4Н, т, Н-4а, Н-4Ь, Н-5Ь, Н-5с), 4,07 (1Н, 66, 1₅₆ 2,4 Гц, 1₆₆. 12,3 Гц, Н-6с), 4,19 ’ (1Н, 66, 1₅₆ 3,5 Гц, 1₆₆ 12,2 Гц, Н-6Ь), 4,27 (1Н, 66, 1₅₆. 3,8 Гц, 1₆₆ 12,3 Гц, Н-6'с), 4,30 (1Н, 66, 1₅₆ 4,2 Гц, 1₆₆.

12,4 Гц, Н-6а), 4,46 (1Н, 66, 1₃,6.2,6 Гц, 16,6 12,3 Гц, Н-6'Ь), 4,47 (1Н, 66, .1,·. 2,2 Гц, 16,6. 12,2 Гц, Н-6'а), 4,76 (1Н, 66, 1ι,₂ 3,9 Гц, 1₂,₃ 10,0 Гц, Н-2Ь), 4,87 (1Н, 66, 1_£,₂ 3,8 Гц, 1₂,₃ 10,6 Гц, Н-2с), 5,99 (1Н, 66, 1_£,₂ 10,3 Гц,

1₂,₃ 9,1 Гц,’ Н-2а), 5,08 (1Н, а!, 1 9,9 Гц, Н-4с), 5,27 (1Н, 6, 1_£,₂ 4,0 Гц, Н-1Ь), 5,31 (1Н, 6, 1_£,₂ 10,0 Гц, Н-1а), 5,33-5,43 (4Н, т, Н-1с, Н-3а, Н-3Ь, Н-3с); δ_С (125 МГц, СПС1₃) 20,7, 20,8, 20,9, 21,0, 21,1 (5 х ц, 10 х СОСН₃, 8СОСН₃), 31,0 (ц, 8СОСН₃) 61,9 (!, С-6с), 62,7 (!, С-6Ь), 63,3 (!, С-6а), 68,4 (6, С-4с), 69,0 (6, С5Ь), 69,5 (6, С-5с), 69,8 (6, С-3с), 70,3 (6, С-2а), 70,5 (6, С-2с), 70,9 (6, С-2а), 72,1 (6, С-3Ь), 73,0 (6, С-4Ь), 74,1 (6, С-4а), 76,6 (6, С-3а), 76,9 (6, С-5а), 80,2 (6, С-1а), 96,1 (6, С-1с), 96,4 (6, С-1Ь), 169,4, 169,6, 169,8, 169,9, 170,3, 170,5, 170,6 (7 х 8, 10 х СОСН₃), 196,0 (8, 8СОСН₃); т/ζ (ЭР+) 1000 (МЫН₄ ⁺, 60%), 1003 (МЫа⁺, 100%).

Пример 13. 1-Тио-в-Э-мальтотриоза

1-Тиоацетил-2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-Оглюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-1-тио-в-О-глюкопиранозу (600 мг, 0,6 ммоль) и ЫаОАс (18 мг, 0,18 ммоль) добавляли при перемешивании к раствору МеОН (10 мл). Через 10 мин ТСХ (Е!ОАс/МеОН, 9:1) показала образование продукта (Я_£ 0,0) с полным расходованием исходного вещества (Я_£ 0,9). Реакционную смесь нейтрализовали добавлением ионообменной смолы Оо^ех®-50, после чего реакционную смесь фильтровали и концентрировали в вакууме с получением целевого соединения (305 мг, 98%) в виде аморфного твердого вещества; [α]_Β ²⁵ +123 (с, 1,0 в МеОН); δН (400 мГц, Э2О), 3,15 (1Н, а!, 1 9,2 Гц, Н2а), 3,26 (1Н, а!, 1 9,3 Гц), 3,41-3,82 (16Н, т, Н-2Ь, Н-2с, Н-3а, Н-3Ь, Н-3с, Н-4а, Н-4Ь, Н-4с, Н-5а, Н-5Ь, Н5с, Н-6а, Н-6Ь, Н-6с, Н-6'а, Н-6'Ь, Н-6'с), 4,42 (1Н, 6, 1£,2 9,6 Гц, Н-1а), 5,23 (1Н, 6, 1£,2 1,7 Гц, Н-1), 5,24 (1Н, 6, 1ι,2 1,8 Гц, Н-1); δС (100 мГц, П2О), 60,8, 70,0 (2 х !, С-6а, С-6Ь, С-6с), 69,6, 71,5, 71,8, 72,1, 73,0, 73,2, 73,6, 76,0, 77,1, 77,6, 79,0 (11 х 6, С-2а, С-2Ь, С-2с, С-3а, С-3Ь, С-3с, С-4а, С-4Ь, С-4с, С-5а, С-5Ь, С5с), 80,2 (6, С-1а), 99,8, 100,1 (2 х 6, С-1Ь, С-1с); т/ζ (ЭР-) 519 (100%, М-Н⁺); т/ζ МСВР (ЭР-) вычислено для С18Н₃₁О1₅8 (М-Н⁺) 519,1384. Найдено 519,1389.

- 14 011299

Пример 14. 1,2,3,6-Тетра-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-триО-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозил)-а-П-глюкопиранозил)-а-П-глюкопиранозил)-а-П-глюкопиранозил)-а-П-глюкопиранозил)-а-Оглюкопиранозил)-О-глюкопираноза

Ацетат натрия (420 мг, 5,2 ммоль) добавляли к уксусному ангидриду (30 мл) и нагревали до температуры дефлегмации, при которой добавляли мальтогептозу (1,00 г, 0,86 ммоль), и реакционную смесь энергично перемешивали. Через 90 мин ТСХ (бензин:этилацетат, 1:3) показала образование продукта (К_£ 0,3) с полным расходованием исходного вещества (К_£ 0,0). Реакционную смесь оставляли охлаждаться до КТ, разбавляли ДХМ (50 мл) и распределяли с водой (100 мл). Фазы разделяли, и водный слой повторно экстрагировали ДХМ (2 х 40 мл). Объединенные органические слои промывали гидрокарбонатом натрия (200 мл насыщенного водного раствора) до тех пор, пока не получали рН 8, рассолом (100 мл), сушили (Мд§О₄), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэшхроматографией (бензин:этилацетат, 1:3) с получением целевого продукта, представляющего собой смесь аномеров, в виде белого аморфного твердого вещества (α/β, 15/85); δ_Η (500 мГц, СЭСГ) 2,02, 2,03, 2,04, 2,05, 2,06, 2,07, 2,08, 2,10, 2,13, 2,19, 2,22, 2,24 (66Н, 12 х 8, 22 х ОАс), 3,89-4,14 (13Н, т, Н-4а, Н-4Ь, Н-4с, Н-4б, Н-4е, Η-4£, Н-5а, Н-5Ь, Н-5с, Н-5б, Н-5е, Η-5ί, Η-5§), 4,25-4,34, 4,39 (1Н, бб, 1 4,0 Гц, 1 12,3 Гц), 4,52-4,56 (13Н, т, Н-6а, Н-6а', Н-6Ь, Н-6Ь', Н-6с, Н-6с', Η-66, Η-66', Н-6е, Н-6е', Η-6ί, Η-6ί, Η-66, Η6д'), 4,75-4,79 (δΗ, т, Н-2Ь, Н-2с, Η-26, Н-2е, Н-2е, Η-2£), 4,90 (1Н, бб, 1_£,₂ 3,7 Гц, б₂,₃10,5 Гц, Н-2д), 5,00 (1Н, а!, 1 9,4 Гц, Н-4д), 5,31-5,45 (13Н, т, Н-3а, Н-3Ь, Н-3с, Н-3б, Н-3е, Η-3£ Н-3д, Н-1Ь, Н-1с, Η-16, Н-1е, Η-1ί, Н-1д), 5,79 (0,85Η, б, 1_£,₂ 8,1 Гц, Н-1а_в), 6,28 (0,15Η, б, 1_£,₂ 4,0 Гц, Н-1а_а).

Пример 15. 2,3,6-Три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-Оацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозил)-а-П-глюкопиранозил)-а-П-глюкопиранозил)-а-П-глюкопиранозил)-а-П-глюкопиранозил)-а-Оглюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозилбромид

1,2,3,6-Тетра-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозил)-а-Оглюкопиранозил)-а-П-глюкопиранозил)-а-П-глюкопиранозил)-а-П-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-О-глюкопиранозу (100 мг, 0,05 ммоль) растворяли в безводном ДХМ (5 мл). К этой смеси добавляли раствор бромоводорода (33% в уксусной кислоте, 0,5 мл). Смесь оставляли перемешиваться в атмосфере аргона при КТ. Через 40 мин ТСХ (бензин:этилацетат, 1:3) показала образование продукта (К_£ 0,7) с полным расходованием исходного вещества (К_£ 0,3). Реакционную смесь распределяли между ДХМ (10 мл) и водой (10 мл), и водный слой повторно экстрагировали ДХМ (3 х 10 мл). Объединенные органические слои промывали раствором гидрокарбонатом натрия (150 мл насыщенного водного раствора) до тех

- 15 011299 пор, пока не получали рН 7, рассолом (20 мл), сушили (Мд8О₄), фильтровали и концентрировали в вакууме с получением целевого продукта (98 мг, 96%) в виде белой пены; [α]_Β ²² +162,0 (с, 1,0 в СНС1₃); δ_Η (400 мГц, СЭС1_;) 2,02, 2,03, 2,04, 2,06, 2,08, 2,10, 2,11, 2,14, 2,19, 2,23, 2,24, 2,25 (66Н, 12 х 8, 22 х ОАс), 3,94-4,04 (12Н, т, Н-4Ь, Н-4с, Н-4б, Н-4е, Н-4£, Н-5Ь, Н-5с, Н-5б, Н-5е, Н-5£, Н-5д), 4,08 (1Н, бб, 1₅,₆ 2,2 Гц, 1₆,₆. 12,6 Гц, Н-6), 4,19-4,33, 4,53-4,60 (12Н, т, Н-5а, Н-6Ь, Н-6Ь', Н-6с, Н-6с', Н-6б, Н-6б', Н-6е, Н-6е', Н-6£, Н-6£, Н-6д, Н-6д’), 4,12 (1Н, а!, 1 9,5 Гц, Н-4а), 4,40 (1Н, бб, 1₅,₆ 3,1 Гц, 1₆,₆. 12,7 Гц, Н-6а), 4,64 (1Н, бб, 1₅,₆ 2,3 Гц, 1₆,₆. 12,5 Гц, Н-6а'), 4,74 (1Н, бб, 1_1>2 3,9 Гц, 1₂,₃ 9,7 Гц, Н-2а), 4,75-4,97 (5Н, т, Н-2Ь, Н-2с, Н-2б,’ Н-2е, Н-2£), 4,89 (1Н, б, ф,₂ 4,0 Гц, 1₂,₃ 10,6 Гц, Н-2д), 5,11 (1Н, а!, 1 9,9 Гц, Н-4§), 5,32-5,47 (12Н, т, Н-1Ь, Н-1с, Н-1б, Н-1е, Н-1£, Н-1д, Н-3Ь, Н-3с, Н-3б, Н-3е, Н-3£, Н-3д), 5,65 (1Н, а!, 1 9,4 Гц, Н-3а), 6,54 (1Н, б, 11,2 4,3 Гц, Н-1а).

Пример 16. 1-Тио-2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-Оглюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-а-Оглюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-в-О-глюкопираноза

2,3,6-Три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозил)-а-Оглюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозилбромид (1,08 г, 0,5 ммоль) и иодид тетрабутиламмония (19 мг, 0,05 ммоль) растворяли в безводном ацетоне (50 мл). К этой смеси добавляли сухую тиомочевину (52 мг, 0,7 ммоль), и реакционную смесь затем нагревали до температуры дефлегмации в атмосфере аргона. Через 8 ч ТСХ (бензин:этилацетат, 1:4) показала образование минорного продукта (промежуточного соединения) (Κι 0,0) с полным расходованием исходного вещества (Κ_£ 0,6). Реакцию концентрировали в вакууме и титровали ДХМ для удаления органических веществ из избытка тиомочевины. Фильтрат концентрировали в вакууме, и остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (этилацетат/метанол, 9:1) с получением промежуточного соединения 2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-Оглюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-в-О-глюкопиранозил-1-изотиоурония бромида (212 мг, 19%), который использовали далее без идентификации. Это промежуточное соединение (210 мг, 0,09 ммоль) и №ь8₂О₅ (22 мг, 0,11 ммоль) добавляли при перемешивании к смеси ДХМ (10 мл) и воды (5 мл). Эту смесь нагревали до температуры дефлегмации в атмосфере аргона. Через 4,5 ч ТСХ (бензин:этилацетат, 1:2) показала образование продукта (Κ_£ 0,2) с полным расходованием исходного вещества (Κ_£ 0,0), после чего реакционную смесь охлаждали до КТ и разделяли фазы. Водный слой повторно экстрагировали ДХМ (2 х 10 мл). Объединенные органические слои промывали рассолом (20 мл), сушили (Мд8О₄), фильтровали, и растворитель удаляли в вакууме с получением целевого продукта (185 мг, 90%) в виде белого аморфного твердого вещества; [а]_с ²⁴ +128,1 (с, 1,0 в СНС1₃); + . (500 МГц, СНС1₃), 2,00, 2,01, 2,02, 2,03, 2,04, 2,05, 2,07, 2,08, 2,12, 2,17, 2,19, 2,21, 2,22, 2,23 (66Н, 14 х 8, 22 х СОСН₃), 2,27 (1Н, б, 1_1>8Н 9,8 Гц, 8Н), 3,76 (1Н, ба!, 1₄,₅ 9,7 Гц, 1 3,5 Гц, Н-5а), 3,92-4,08 (12Н, т, Н-4а, Н-4Ь, Н-4с, Н-4б, Н-4е, Н-4£, Н-5Ь, Н-5с, Н-5б, Н5е, Н-5£, Н-5д), 4,17-4,36, 4,49-4,56 (12Н, т, Н-6Ь, Н-6Ь', Н-6с, Н-6с', Н-6б, Н-6б', Н-6е, Н-6е', Н-6£, Н-6£, Н-6д, Н-6д’), 4,39 (1Н, бб, .1,·. 3,6 Гц, 16,6. 12,2 Гц, Н-6а), 4,48 (1Н, бб, .1,·. 3,2 Гц, 16,6.12,3 Гц, Н-6а), 4,62 (1Н, а!, 1 9,5 Гц, Н-1а), 4,73-4,78 (5Н, т, Н-2Ь, Н-2с, Н-2б, Н-2е, Н-2£), 4,82 (1Н, а!, 1 9,5 Гц, Н-2а), 4,88 (1Н, бб, 1_1>2 4,0 Гц, 1₂,₃ 10,4 Гц, Н-2§), 5,09 (1Н, а!, 1 9,9 Гц, Н-4§), 5,27 (1Н, а!, 1 9,1 Гц, Н-3а), 5,30-5,44 (12Н, т, -1Ь, Н-1с, Н-1б, Н-1е, Н-1£, Н-1д, Н-3Ь, Н-3с, Н-3б, Н-3е, Н-3£, Н-3д).

Пример 17. Получение 8ВЕСуз156-8-8еРй

Модификацию по одному сайту исследовали, используя модель - цистеин-содержащий белок, представляющий собой сериновую протеазу субтилизин (8ВЬ.Суз156) из мутантного штамма ВасШиз 1еп!из 8156С. 8ВЬСуз156 (10 мг) растворяли в дегазированном водном буферном растворе (1 мл, 70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5). Р118еВг (5 мг, 0,02 ммоль) растворяли в ацетонитриле (200 мкл), 150 мкл

- 16 011299 которого (40 экв.) добавляли к раствору белка и помещали на ротатор для вертикального перемешивания (еиб-оуег-еиб го!а!ог). Через 30 мин с помощью анализа Элмана было показано отсутствие свободного тиола (6. Ь. Е11тап, К. Ό. СоиПпеу. V. Лпбгез. К. М. ЕеаШегйопе, Вюсйет. Р11агтасо1. 1961, 7, 88). Реакционную смесь помещали на ротатор для вертикального перемешивания еще на 30 мин, после чего реакционную смесь наносили на колонку ΡΌ10 Зерйабех® 625 и элюировали 70 мМ ЧЕРЕЗ, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали и диализовали (МАСО предел отсечения мембраны по молекулярному весу от англ. то1еси1аг \сещ111 си! оГГ 12-14 кДа) против воды (1 х 4 л в течение 1 ч, 2 х 2 л в течение 30 мин) с получением ЗВЬЗ156С-З-ЗеРй; т/ζ (ЭР⁺) найдено 26864, вычислено 26870.

Пример 18. Получение ЗЗв6Су8344Су8432-(З-ЗеРй)₂

Модификации по многим сайтам исследовали, используя мутант термофильной β-гликозидазы из штамма Зи1Го1оЬи8 8о1Га!апси8, содержащий два цистеиновых остатка (ЗЗв6-Суз344Су8432). ЗЗв6Суз344Суз432 (1 мг) растворяли в водном буферном растворе (1 мл, 70 мМ СНЕЗ, 5 мМ МЕЗ, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5). РНЗеВг (2 мг, 0,02 ммоль) растворяли в ацетонитриле (200 мкл), 20 мкл которого (74 экв.) добавляли к раствору белка и помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 1 ч реакционную смесь наносили на колонку ΡΌ10 Зерйабех® 625 и элюировали (70 мМ НЕРЕЗ, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0) с получением ЗЗв6Су8344Су8432-(З-ЗеРй)₂; т/ζ (ЭР⁺) найдено 57700, вычислено 57697.

Пример 19. Типичное гликозилирование белков сахарными тиолами и реакция с другими тиолами ЗВВСу5156-З-ЗеР11 (1 мг) растворяли в водном буферном растворе (1 мл, 70 мМ СНЕЗ, 5 мМ МЕЗ, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5). Сахарный тиол или другой тиол растворяли в воде и добавляли к раствору белка в указанных количествах (см. данные эквивалентов тиола, приведенные в таблице ниже), и эту смесь помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 1 ч реакцию анализировали с помощью масс-спектрометрии.

Таблица

Белок1	Тиол	Эквивалент тиола	Конв. %	ИЭР-МС
Найдено (теория)
8ВЬСу8156	С1сЗН	5	>95	26908 (26909)
ЗВ1_Су<,156	6а13Н	5	>95	26908 (26909)
ЗВЬСуз156	ΟΙοΝΑοΒΗ	1	>95	26944 (26950)
ЗВ1_Суз156	С1сС!сС1сЗН	5	>95	27228 (27233)
ЗВЬСуз156	61сО1с61с01с01с<31сО1с5Н	10	>95	27878 (27881)
33β6- Суй344Сув432	С(сЗН	60	>95	57760 (57775)
8В1_Суб156	ВосСузТНгОМе	20		27030 (27047)
ЗВ1_Су8156	Глутатион (61и-Суз-С1у)	20		27022 (27020)
8В1_Суз156	МапЗН	20	>95	27058 (27062)
5В4Суз156	(АсО).-МапЗН	10	>95	27080 (27060)
ЗВ1_Су8156	Мап(1,6)МапЗН	10	>95	27075 (27071)
5В1_СуЕ156	(АсО^Мап,. (АсО)2Мап8Н (АсО)4Мап*1,3)	20	>95	27054 (27053)
ЗВ1.Суз1562	Мап\ (1,6) МапЗН Мап-/(63)	20	>95	27084 (27086)

Конв. = превращение, определяемое с помощью ИЭР-МС ¹ Активированный реакцией с фенилселенбромидом с получением соответствующего соединения белок-З-Зе-РН или белок-(З-Зе-РН)₂ перед добавлением тиола.

² Прореагировавший с РМЗЕ (фенилметилсульфонилфторидом) перед гликозилированием для предотвращения распада белка вследствие протеолитической активности.

Результаты, приведенные в вышеуказанной таблице, демонстрируют, что способ согласно настоящему изобретению обеспечивает высокопроцентную конверсию с получением желаемых продуктов с

- 17 011299 использованием только одного эквивалента тиолового соединения. Более того, эти результаты демонстрируют, что способ согласно изобретению может быть использован для гликозилирования белков по одному и по многим сайтам. Три сайта гликозилирования в 8ВЬ-Су815б и 88в6Су8344Су§432 обнаружены в сильно отличающихся белковых структурах и в условиях с различными уровнями воздействия, что иллюстрирует широкую применимость способа согласно изобретению.

Пример 20. Типичное гликозилирование белка 8ВЬСу815б с использованием 61с61с61с61с61с61с61с-8Н

1-Тио-2,3,б-три-О-ацетил-4-О-(2,3,б-три-О-ацетил-4-О-(2,3,б-три-О-ацетил-4-О-(2,3,б-три-О-ацетил-4-О-(2,3,б-три-О-ацетил-4-О-(2,3,б-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,б-тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозил)а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-в-О-глюкопиранозу (15 мг, 0,007 ммоль) и метоксид натрия (2 мг, 0,007 ммоль) добавляли при перемешивании к раствору МеОН (2 мл). Через 2 ч ТСХ (бензин :Е1ОАс, 1:2) показала образование продукта (Вг 0,0) с полным расходованием исходного вещества (Вг 0,2). Реакционную смесь нейтрализовали добавлением ионообменной смолы Όο\\όχ®-50. после чего реакционную смесь фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенную 1-тио-в-Э-мальтогептаозу выливали в воду (5 мл), 300 мкл которой (11 экв.) добавляли к раствору 8ВБСу515б-8-8сР11 (1 мг) в 500 мкл водного буфера (70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5). Полученный раствор помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 1 ч реакционную смесь наносили на колонку ΡΌ10 8ерйабех® 625 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали с получением 61с61с6Ьс61с61с61с61с8ВЬСу815б; т/ζ (ЭР⁺) найдено 27878, вычислено 27881.

Пример 21. Ферментативные удлинения 8ВБСу515б-8-61сХЛс

A. 61сХЛс-8ВБСу515б (3 мг) растворяли в 1 мл водного буфера. Добавляли фенилметилсульфонилфторид (РМ8Е) (50 мкл из 100 мг/мл раствора в ацетонитриле; 500-кратный избыток). Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин и очищали на обессоливающей колонке 8ср11абсх® 6-25 (ΡΌ-10).

Чистоту дезактивированного белка определяли с помощью ИЭР-масс-спектрометрии (найдено: 27100, вычислено: 27104). Белковую фракцию лиофилизировали и повторно растворяли в 1,0 мл 0,1 М натрий-какодилатного буфера (рН 7,52). Добавляли МпС1₂-4Н₂О (3,2 мг, 1б мкмоль) и уридиндифосфатгалактозу (υΌΡ-галактоза, 2,3 мг, 3,4 мкмоль, Куо^а Накко; 30-кратный избыток). Добавляли рекомбинантную бычью (в-1,4-галактозилтрансферазу из 8робор1сга Гтидретба (ЕС 2.4.1.22, 100 мЕд, Са1Ьюсйет), и реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 40 мин с получением 6а1в1,461сХАс-8ВЕ-Су815б (ИЭР-МС, найдено 272б5, вычислено 272бб).

B. Добавляли бЭР-фукозу (3 мг, Куо^а Накки) и человеческую а-1,3-фукозилтрансферазу из 8робор1ета Гтифретба (ЕС 2.4.1.б5, 100 мЕд, Са1Ьюсйет), и реакционную смесь инкубировали в течение ночи при комнатной температуре с получением Льюис^х-8-8ВЬ-Су515б (ИЭР-МС, найдено 27410, вычислено 27412).

Этот пример демонстрирует, что гликозилированные белки, полученные согласно способу изобретения, могут быть дополнительно модифицированы реакцией с подходящими углеводмодифицирующими ферментами, например гликозилтрансферазами, такими как β-1,4галактозилтрансфераза, которая селективно образует связь 6η1β 1.461сЧЛс.

Пример 22. Фенилтиосульфонат натрия (ЫаРТ8)

о

Бензолсульфинат натрия (10 г, б1 ммоль) и серу (1,95 г, б1 ммоль) растворяли в безводном пиридине (б0 мл) с получением желтого раствора. Реакционную смесь перемешивали в атмосфере аргона и через 1 ч получали белую суспензию. Реакционную смесь фильтровали и осадок промывали безводным диэтиловым эфиром. После перекристаллизации из безводного этанола был получен целевой продукт (10,5 г, 88%) в виде белого твердого кристаллического вещества; т.пл. 305-30б°С [Лит. 287°С, 8а1о, В.; 6о1о, Т.; Так1ка^а, Υ.; Такыама. 8. ЗутЬеяз 1980, б15]; 5_Н (200 МГц, ДМСО-б_б) 7,28-7,7б (5Н, т, Аг-Н).

Пример 23. 2,3,4,б-Тетра-О-ацетил-в-О-глюкопиранозил-фенилтиосульфонат

2,3,4,б-Тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозилбромид (207 мг, 0,5 ммоль) растворяли в безводном ацетонитриле (5 мл). К этой смеси добавляли фенилтиосульфонат натрия (201 мг, 1 ммоль) и бромид тетрабутиламмония (1б мг, 0,05 ммоль). Полученную смесь перемешивали в атмосфере аргона при 70°С.

- 18 011299

Через 4,5 ч тонкослойная хроматография (ТСХ) (бензин:этилацетат, 1:1) показала образование продукта (Я_£ 0,5) с полным расходованием исходного вещества (Я_£ 0,3). Раствор концентрировали в вакууме. Неочищенное твердое вещество распределяли между дихлорметаном (ДХМ, 20 мл) и водой (20 мл), и водный слой повторно экстрагировали ДХМ (2 х 20 мл). Объединенные органические экстракты промывали рассолом (20 мл), сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин:этилацетат, 1:1) с получением целевого продукта (225 мг, 88%) в виде белого твердого кристаллического вещества; т.пл. 129-130°С; [а]_с ²⁵ +51,2 (с, 1,0 в СНС13); утах (КВг) 1754 (8, С=О), 1376 (8, С=С) см^-1. 5Н (400 МГц, С₆О₆) 1,68, 1,72, 1,73, 1,75 (4 х 3Н, 4 х 8, 4 х ОАс), 3,09 (1Н, ббб, 14,5 10,2 Гц, А 2,4 Гц, 15,6' 4,2 Гц, Н-5), 3,83 (1Н, бб, А 2,4 Гц, 12,7 Гц, Н-6), 4,08 (1Н, бб, б_5>6. 4,2 Гц, 1₆,₆. 12,6 Гц, Н-6'), 5,17-5,23 (2Н, т, Н-2, Н-4), 5,40 (1Н, б, I 1,2 10,2 Гц, Н-1), 5,44 (1Н, а!, I

9,4 Гц, Н-3), 6,98-7,03 (3Н, т, Аг-Н), 7,90-7,92 (2Н, т, Аг-Н). Структуру продукта дополнительно подтверждали дифракцией рентгеновских лучей на монокристаллах.

Пример 24. 2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-в-О-галактопиранозил-фенилтиосульфонат

2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-а-Э-галактопиранозилбромид (2,0 г, 5 ммоль) растворяли в безводном ацетонитриле (80 мл). К этой смеси добавляли фенилтиосульфонат натрия (2,02 г, 10,3 ммоль) и бромид тетрабутиламмония (160 мг, 0,5 ммоль). Полученную смесь перемешивали в атмосфере аргона при 70°С. Через 5 ч ТСХ (бензин:этилацетат, 1:1) показала образование продукта (Я_£ 0,4) с полным расходованием исходного вещества (Я_£ 0,6). Раствор концентрировали в вакууме. Неочищенное масло распределяли между ДХМ (50 мл) и водой (50 мл), и водный слой повторно экстрагировали ДХМ (2 х 50 мл). Объединенные органические экстракты промывали рассолом (100 мл), сушили (Мд8О₄), фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин:этилацетат, 2:1) с получением целевого продукта (1,7 г, 65%, 2 стадии) в виде белого твердого кристаллического вещества; т.пл. 53-54°С; [а]_с ²⁷ +24,2 (с, 1,0 в СНС1₃); 5_Н (400 мГц, СНС1₃) 1,98, 2,03, 2,06, 2,11 (4 х 3Н, 4 х 8, 4 х ОАс), 3,85 (1Н, бб, А 8,8 Гц, 1₆,₆. 14,0 Гц, Н-6), 3,95-4,00 (2Н, т, Н-5, Н-6), 5,11 (1Н, бб, 1₂,₃ 9,7 Гц, 1₃,₄ 3,3 Гц, Н-3), 5,23 (1Н, а!,’ I 10,3 Гц, Н-2), 5,25 (1Н, б, б_1>2 10,2 Гц, Н-1), 5,43 (1Н, бб, б_3>4 3,6 Гц, 1₄,₅ 1,0 Гц, Н-4), 7,54-7,68 (3Н, т, Аг-Н), 7,93-7,97 (2Н, т, Аг-Н).

Пример 25. Этил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-1-дитио-3-О-глюкопиранозил-дисульфид

Способ 1:

2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-в-О-глюкопиранозил-фенилтиосульфонат (100 мг, 0,2 ммоль) и триэтиламин (0,03 мл, 0,2 ммоль) растворяли в безводном ДХМ (10 мл) и перемешивали при комнатной температуре (КТ) в атмосфере аргона. Медленно по каплям добавляли раствор этантиола (0,016 мл, 0,2 ммоль) в безводном ДХМ (10 мл) через шприцевой насос в течение 30 мин. Через 40 мин ТСХ (бензин: этилацетат, 1:1) показала образование основного продукта (Я_£ 0,5) наряду с полным расходованием исходного вещества (Я_£ 0,3). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин:этилацетат, 1:1) с получением целевого продукта (70 мг, 82%) в виде белого твердого кристаллического вещества; т.пл. 95-96°С [Лит. 100-102°С, (Оау18, В. С.; \Уагб. 8. I.; Яепб1е, Р. М. Сйет. Соттип. 2001, 189)]; [а]_с ²² -164,9 (с, 0,2 в СНС13) [Лит. [а]с²⁴ -178,0 (с, 1,0 в МеОН) (Пау18, В. С.; №агб, 8. I.; Яепб1е, Р. М. Сйет. Соттип. 2001, 189)]; 5Н (400 мГц, СНС1₃) 1,30 (1Н, ΐ, I 7,4 Гц, СН₃), 2,00, 2,02, 2,03, 2,06 (4 х 3Н, 4 х 8, 4 х СН₃), 2,79 (2Н, бф 1_СН3-Н 7,5 Гц, 1_НН 2,7 Гц), 3,73 (1Н, δ, б₄,₅10,2 Гц, 1₅,₆ 2,5 Гц, 1₅,₆4,8 Гц, Н-5), 4,14 (1Н, бб, б_5>62,4 Гц, 1₆,₆. 12,4 Гц, Н-6), 4,22 (1Н, бб, б_5>6. 4,7 Гц, 1₆,₆. 12,4 Гц, Н-6'), 4,52 (1Н, б, б_1>2 9,8 Гц, Н-1), 5,10 (1Н,’ а!, I 9,8 Гц, Н-4), 5,21-5,26 (2Н, т, Н-2, Н-3).

Способ 2:

Фенил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-1-селененилсульфид-О-в-глюкопиранозид (75 мг, 0,15 ммоль) и триэтиламин (30 мкл, 0,15 ммоль) растворяли в свежеперегнанном ДХМ (10 мл). Этот раствор перемешивали при КТ в атмосфере аргона. Раствор этантиола (11 мкл, 0,15 ммоль) в безводном ДХМ (10 мл) добавляли по каплям в течение 2,5 ч. Через 3 ч ТСХ (бензин:Е!ОАс, 1:1) показала образование основного продукта (Я£ 0,5) наряду с полным расходованием исходного вещества (Я£ 0,5). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин :Е!ОАс, 5:3) с получением целевого продукта (50 мг, 82%) в виде белого твердого кристаллического вещества.

- 19 011299

Пример 26. Этил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-1-дитио-в-О-галактопиранозил-дисульфид

Способ 1:

2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-в-Э-галактопиранозил-фенилтиосульфонат (100 мг, 0,2 ммоль) и триэтиламин (0,03 мл, 0,2 ммоль) растворяли в безводном ДХМ (10 мл) и перемешивали при КТ в атмосфере аргона. В течение 30 мин медленно по каплям добавляли раствор этантиола (0,016 мл, 0,2 ммоль) в безводном ДХМ (10 мл) через шприцевой насос. Через 40 мин ТСХ (бензин:этилацетат, 1:1) показала образование основного продукта (Вг 0,4) наряду с полным расходованием исходного вещества (Вг 0,3). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин:этилацетат, 1:1) с получением целевого продукта (78 мг, 91%) в виде белого твердого кристаллического вещества; т.пл. 65-66°С; [а]_с ²⁵ -52,1 (с, 1,4 в СНС13); утах (КВг) 1746 (к, С=О) см^-1; δΗ (400 мГц, СНС1₃) 1,30 (1Н, ΐ, I

7.4 Гц, СН₃), 1,95, 2,01, 2,02, 2,13 (4 х 3Н, 4 х к, 4 х СН₃), 2,79 (2Н, бф 1_СН3-Н 7,2 Гц, 1_НН 1,7 Гц), 3,94 (1Н, !б, 14,5 0,9 Гц, 15,6 6,3 Гц, 15,6' 7,0 Гц, Н-5), 4,06 (1Н, бб, 15,6 6,3 Гц, 16,6 11,3 Гц, Н-6), 4,12 (1Н, бб, 15,6. 7,0 Гц, 1₆,₆' 11,2 Гц, Н-6'), 4,51 (1Н, б, б_1>2 9,9 Гц, Н-1), 5,05 (1Н, бб, 1₂,₃ 9,9 Гц, 1₃,₄ 3,6 Гц, Н-3), 5,35-5,40 (2Н, т, Н2, Н-4).

Способ 2. Фенил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-1-селененилсульфид-О-в-галактопиранозид (75 мг, 0,15 ммоль) и триэтиламин (30 мкл, 0,15 ммоль) растворяли в свежеперегнанном ДХМ (10 мл). Этот раствор перемешивали при КТ в атмосфере аргона. Раствор этантиола (11 мкл, 0,15 ммоль) в безводном ДХМ (10 мл) добавляли по каплям в течение 2,5 ч. Через 3 ч ТСХ (бензин :ЕЮАс, 1:1) показала образование основного продукта (В_г 0,5) наряду с полным расходованием исходного вещества (В_г 0,5). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин:ЕЮАс, 5:3) с получением целевого соединения (50 мг, 82%) в виде белого твердого кристаллического вещества.

Пример 27. Этил-3,4,6-три-О-ацетил-2-ацетамидо-2-дезокси-в-О-глюкопиранозилдисульфид

Фенил-3,4,6-три-О-ацетил-2-ацетамидо-2-дезокси-1-селененилсульфид-Э-в-глюкопиранозид (100 мг, 0,19 ммоль) и триэтиламин (0,03 мл, 0,19 ммоль) растворяли в свежеперегнанном ДХМ (20 мл). Раствор перемешивали при КТ в атмосфере аргона. В течение 1 ч по каплям добавляли раствор этантиола (0,014 мл, 0,19 ммоль) в безводном ДХМ (10 мл). Через 3 ч ТСХ (ЕЮАс) показала образование основного продукта (В_г 0,4) наряду с полным расходованием исходного вещества (В_г 0,5). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (ЕЮАс) с получением целевого продукта (75 мг, 93%) в виде белого аморфного твердого вещества. [а]_с ²⁵ -70,1 (с, 2,5 в СНС1₃); δ_Η (400 мГц, СНС1₃), 1,32 (3Н, б, 1_СН,_СН3 6,6 Гц, СНСН₃), 1,96, 2,04, 2,05, 2,08 (12Н, 4 х к, 4 х СОСН₃), 2,82 (2Н, ф I 7,4 Гц, СН₂), 3,75 (1Н, ббб,’ 1₄,₅ 10,1 Гц, 1₅,₆ 2,5 Гц, б_5>(? 4,7 Гц, Н-5), 4,12-4,25 (3Н, т, Н-2, Н-6, Н-6'), 4,73 (1Н, а!, б_1>2 10,4 Гц, Н-1), 5,10 (1Н, а!, I 9,8 Гц, Н-4), 5,30 (1Н, а!, I 9,9 Гц, Н-3), 5,70 (1Н, б, Ι_ΝΗ,₂ 9,1 Гц, ЫН).

Пример 28. Метиловый эфир бис-Ы-ацетил-Ь-цистеинил-Ь-серина

Метиловый эфир бис-Ь-цистеинил-Ь-серина (100 мг, 0,23 ммоль) растворяли в метаноле (5 мл). К этой смеси добавляли раствор уксусного ангидрида (0,09 мл, 0,92 ммоль) и пиридина (0,075 мл, 0,92 ммоль). Через 15 мин ТСХ (этилацетат:метанол, 5:1) показала образование основного продукта (В_г 0,5) наряду с полным расходованием исходного вещества (В_г 0,1). Реакционную смесь концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (этилацетат:метанол, 5:1) с получением целевого продукта (60 мг, 50%) в виде белого твердого кристаллического вещества; т.пл. 145-147°С; [α]ο²⁵ -33,4 (с, 1,0 в СНС1₃); δ.. (400 мГц, СНС1₃) 2,04 (3Н, к, СОСН₃), 2,96 (1Н, бб, .1·.·.. 13,9 Гц, .1·...... 4,7 Гц, СукСНН), 3,23 (1Н, бб, .1·.·.. 13,9 Гц, .1·...... 4,7 Гц, СукСНН), 3,76 (3Н, к, ОМе), 3,83 (1Н, бб, Γη,η 11,4

- 20 011299

ГЦ, ΙοΗ,αΗ 4,1 Гц, 8егСНН), 3,93 (1Н, бб, .1. 11,3 Гц, ,1.... 4,9 Гц, 8егСНН), 4,55 (1Н, ΐ, 1 4,3 Гц, аН8ег), 4,87 (1Н, ΐ, 1 4,8, аНСук).

Пример 29. Метиловый эфир Ν-ацетил-Ь-цистеинил-Ь-серина

Метиловый эфир бис-И-ацетил-Ь-цистеинил-Ь-серина (1,92 г, 3,96 ммоль) растворяли в необезвоженном хлороформе (100 мл) и метаноле (10 мл) и перемешивали. К этой смеси при перемешивании добавляли раствор трибутилфосфина (1,1 мл, 4,36 ммоль). Через 2 ч ТСХ (этилацетат:метанол, 10:1) показала образование продукта (К._£ 0,6) наряду с полным расходованием исходного вещества (К._г 0,3). Реакционную смесь концентрировали в вакууме. После перекристаллизации из смеси этилацетат/метанол был получен целевой продукт (1,77 г, 93%) в виде белого твердого кристаллического вещества; т.пл. 127128°С; [а]_с ²⁵ -32,0 (с, 1,0 в МеОН); δ_Η (400 мГц, СНС1₃) 1,89 (1Н, а1, 1 8,9 Гц, 8Н), 2,06 (3Н, к, СОСН₃), 2,84-2,93 (1Н, т, СукСНН), 2,97-3,04 (1Н, т, СукСНН), 3,79 (3Н, к, ОМе), 3,91 (1Н, бб, 1_СН,_Н 11,4 Гц, 1_СН,_аН

3,1 Гц, 8егСНН), 4,03 (1Н, бб, 1_СН,_Н 11,7 Гц, 1_СН,_аН 4,2 Гц, 8егСНН), 4,61-4,65 (1Н, т, аН8ег), 4,71-4,76 (1Н, т, аНСук), 6,93 (1Н, б, 1_αΗ,_ΝΗ 7,8 Гц, NΗСук), 7,73 (1Н, б, 1_αΗ,_ΝΗ 7,4 Гц, ХН8ег).

2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-в-О-глюкопиранозил-фенилтиосульфонат (61 мг, 0,12 ммоль) растворяли в безводном ДХМ (5 мл) и перемешивали при КТ в атмосфере аргона. К этой смеси медленно по каплям в течение 4 ч добавляли метиловый эфир Ν-ацетил-Ь-цистеин-Ь-серина (32 мг, 0,12 ммоль) и триэтиламин (0,015 мл, 0,11 ммоль) в безводном ДХМ (10 мл) и безводном метаноле (0,5 мл) через шприцевой насос. Через 5 ч ТСХ (этилацетат:метанол, 10:1) показала образование основного продукта (К._г 0,5) наряду с полным расходованием исходного вещества (Щ 0,3, (система элюентов для ТСХ - бензин:этилацетат, 1:1)). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (этилацетат:метанол, 10:1) с получением целевого продукта (75 мг, 99%) в виде белого твердого кристаллического вещества; т.пл. 126-128°С [Лит. 125-128°С (Όανίκ, В. О; \Уагб. 8. 1.; Яеиб1е, Р. М. Сйет. Соттип. 2001, 189)]; [а]_с ²⁵ -47,9 (с, 0,7 в СНС13) [Лит. [а]с²⁴ -178,0 (с, 1,0 в МеОН) (Όανίκ, В. О.; №агб, 8. 1.; Кепб1е, Р. М. Сйет. Соттип. 2001, 189)]; δΗ (400 мГц, СНС1₃) 2,03, 2,06, 2,07, 2,11 (5 х 3Н, 4 х к, 5 х СН₃), 3,05 (1Н, бб, 1сн,н 13,9 Гц, ,1.... 8,8 Гц, СукСНН), 3,28 (1Н, бб, Щ,. 13,9 Гц, ,1.,.. 4,8 Гц, СукСНН), 3,80 (3Н, к, ОМе), 3,89 (1Н, ббб, 14,5 10,0 Гц, Щ 2,2 Гц, Щ. 4,1 Гц, Н-5), 3,94 (1Н, бб, 1сн,н 11,7 Гц, 1сн,«н 3,0 Гц, 8егСНН), 4,00 (1Н, бб, 1с.,н 13,8 Гц, 1.,.. 3,7 Гц, 8егСНН), 4,23 (1Н, бб, Щ 4,2 Гц, 1^ 12,4 Гц, Н6), 4,38 (1Н, бб, 1_5>6. 2,0 Гц, 1₆,₆. 12,5 Гц, Н-6'), 4,62-4,65 (1Н, т, аН8ег), 4,64 (1Н, б, 1_1>2 9,5 Гц, Н-1), 4,904,94 (1Н, т, аНСук), 5,18 (1Н, а1, 1 10,1 Гц, Н-4), 5,24-5,29 (2Н, т, Н-2, Н-3), 6,94 (1Н, б, 1_ΝΗ,_Η 7,9 Гц, ХНАс), 7,52 (1Н, б, Ινη,η 7,6 Гц, №8ег).

Пример 31. Метиловый эфир N-ацетил-^-цистеин-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-1-дитио-β-^галактопиранозил-дисульфид)-Ь-серина

2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-в-О-галактопиранозил-фенилтиосульфонат (50 мг, 0,1 ммоль) растворяли в безводном ДХМ (5 мл) и перемешивали при КТ в атмосфере аргона. В течение 2 ч медленно по каплям добавляли раствор метилового эфира Ν-ацетил-Ь-цистеин-Ь-серина (31 мг, 0,12 ммоль) и триэтиламина

- 21 011299 (0,015 мл, 0,11 ммоль) в безводном ДХМ (10 мл) и безводном метаноле (0,5 мл) через шприцевой насос. Через 2 ч ТСХ (этилацетат:метанол, 10:1) показала образование основного продукта (В_£ 0,5) наряду с полным расходованием исходного вещества (В_£ 0,5, система элюентов для ТСХ - бензин:этилацетат, 1:1). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (этилацетат:метанол, 10:1) с получением целевого продукта (59 мг, 95%) в виде белого аморфного твердого вещества; [а]_с ²⁵ -48,8 (с, 0,25 в СНС1₃); δΗ (400 мГц, СНС1₃) 1,99, 2,04, 2,05, 2,08, 2,18 (5 х 3Н, 4 х 5, 5 х СН₃), 2,80 (1Н, Ь5, ОН), 2,99 (1Н, бб, б_СН,_Н 14,1 Гц, .1.·· 9,2 Гц, Су5СНН), 3,32, 3,77 (3Н, 5, ОМе), 3,92 (1Н, бб, б_СН,_Н 11,7 Гц, .1·...... 3,0 Гц, ЗегСНН), 4,01 (1Н, бб, б_СН,_Н 11,7 Гц, .1._Н 3,7 Гц, ЗегСНН), 4,06-4,14 (2Н, т, Н5, Н-6), 4,20-4,26 (1Н, т, Н-6'), 4,61-4,63 (1Н, т, аН8ег), 4,65 (1Н, б, б_1>2 9,8 Гц, Н-1), 4,88-4,93 (1Н, т, аНСу5), 5,11 (1Н, бб, б₂,₃ 9,8 Гц, б₃,₄ 3,3 Гц, Н-3), 5,42-5,47 (2Н, т, Н-2, Н-4), 6,68 (1Н, б, Ь_НН 7,8 Гц, ЫНАс), 7,28 (1Н, б, 8,1 Гц, ЫН8ег). ’

Пример 32. 2,3,4,6-Тетра-О-бензил-а-О-глюкопиранозилбромид

2,3,4,6-Тетра-О-бензил-О-глюкопиранозу (1,0 г, 1,9 ммоль) растворяли в безводном ДХМ (6 мл) и безводном ДМФА (0,4 мл) в атмосфере аргона. Полученный раствор перемешивали при 0°С. В течение 5 мин по каплям добавляли оксалилбромид (4 мл, 2М в ДХМ, 24 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при КТ. Через 40 мин ТСХ (бензин: этилацетат, 2:1) показала образование основного продукта (В_£ 0,7). Реакционную смесь охлаждали до 0°С и гасили ледяной водой (30 мл), добавляемой в течение 5 мин. Реакцию распределяли между ДХМ (20 мл) и водой. Водный слой повторно экстрагировали ДХМ (3 х 20 мл), объединенные органические слои промывали рассолом (40 мл), сушили (Мд§О₄), фильтровали и концентрировали в вакууме с получением целевого продукта (1,10 г, 95%) в виде неочищенного желтого масла; δн (400 мГц, СНС1₃), 3,57 (1Н, бб, б1_>2 3,5 Гц, б₂₃ 9,1 Гц, Н-2), 3,68 (1Н, бб, б₃,6 2,1 Гц, б^ 11,0 Гц, Н-6), 3,79-3,84 (2Н, т, Н-4, Н-6'), 4,07 (1Н, а1, б 9,1 Гц, Н-3), 4,07-4,11 (1Н, т, Н-5), 4,47-4,62 (3Н, т, РЕСН₂), 4,74 (5, 2Н, РЕСН₂), 4,84-4,89 (2Н, т, РЕСН₂), 5,10 (1Н, б, б 11,1 Гц, РЕСН₂), 6,46(1Н, б, Н-1), 7,15-7,41 (20Н, т, Аг-Н).

Пример 33. 2,3,4,6-Тетра-О-бензил-в-О-глюкопиранозил-фенилтиосульфонате

2,3,4,6-Тетра-О-бензил-О-а-глюкопиранозоилбромид (3,55 г, 5,88 ммоль) и фенилтиосульфонат натрия (4,76 г, 24,3 ммоль) растворяли в безводном 1,4-диоксане (90 мл). Реакционную смесь нагревали до 70°С в атмосфере аргона. Через 20 ч ТСХ (бензин:этилацетат, 2:1) показала образование основного продукта (В_£ 0,6) с полным расходованием исходного вещества (В_£ 0,7). Реакционную смесь охлаждали до КТ и фильтровали, осадок промывали смесью бензин/этилацетат, и фильтрат концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин:этилацетат, 4:1) с получением 2,3,4,6тетра-О-бензил-О-глюкопиранозил-фенилтиосульфоната (3,18 г, 78%) в виде белой вязкой смолы, представляющей собой смесь α,β-соединений в соотношении β:α 3:1. После избирательной перекристаллизации из смеси этилацетат/бензин был получен чистый 2,3,4,6-тетра-О-бензил-в-О-глюкопиранозилфенилтиосульфонат в виде белого твердого кристаллического вещества; т.пл. 106-108°С; [а]_с ²² +21,4 (с, 0,35 в СНС1₃); δ_Η (500 мГц, С₆О₆) 3,21 (1Н, ббб, б₄₅ 9,7 Гц, б₅₆ 1,4 Гц, б₅₆ 3,8 Гц, Н-5), 3,29 (1Н, бб, б₅₆ 1-4 Гц, 66,6' 11,1 Гц, Н-6), 3,34 (1Н, бб, б_£,2 9,9 Гц, 62,3 8,7 Гц, Н-2), 3,49 (1Н, бб, б₃,6 3,8 Гц, б^. 11,1 Гц, Н-6'), 3,51 (1Н, а1, б 9,4 Гц, Н-3), 3,60 (1Н, а1, б 9,4 Гц, Н-4), 4,15, 4,25 (2Н, АБд, б 12,1 Гц, РЕСН₂), 4,52, 4,58 (2Н, АБд, б 11,0 Гц, РЕСН₂), 4,72, 4,76 (2Н, АБд, б 11,3 Гц, РЕСН₂), 4,78, 4,52 (2Н, АБд, б 11,3 Гц, РЕСН₂), 5,25 (1Н, б, 6ι,₂ 10,2 Гц, Н-1), 6,82-6,88 (3Н, т, Аг-Н), 7,05-7,26 (20Н, т, Аг-Н), 7,96-7,98 (2Н, т, Аг-Н).

Пример 34. Этил-2,3,4,6-тетра-О-бензил-1-дитио-в-О-глюкопиранозил-дисульфид

2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-в-О-глюкопиранозил-фенилтиосульфонат (100 мг, 0,14 ммоль) и триэтиламин (0,02 мл, 0,14 ммоль) растворяли в безводном ДХМ (10 мл) и перемешивали при КТ в атмосфере аргона. К этой смеси в течение 90 мин медленно по каплям добавляли этантиол (11 мкл, 0,14 ммоль) в безводном ДХМ (10 мл) через шприцевой насос. Через 90 мин ТСХ (бензин:этилацетат, 6:1) показала

- 22 011299 образование основного продукта (В_£ 0,4) наряду с полным расходованием исходного вещества (В_£ 0,2). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин:этилацетат, 7:1) с получением целевого продукта (83 мг, 95%) в виде прозрачного масла; [α]_Β ²² -164,9 (с, 0,2 в СНС13) [Лит. [α]Β²⁵ -80,0 (с, 3,0 в МеОН) (^аν^к, В. О; ^агб, 8. 1.; Веηά1е, Р. Μ. СНет. Соттип. 2001, 189)]; δΗ (400 мГц, СНС1₃) 1,22 (1Н, 1, 1 7,3 Гц, СН₃), 2,68-2,86 (2Н, т, СН₂), 3,24 (1Н, άάά, ,Р, 9,7 Гц, .1,.. 3,3 Гц, ί_5>6. 2,1 Гц, Н-5), 3,56-3,60 (2Н, т, Н-6, Н-6'), 3,61 (1Н, а1, 1 9,1 Гц, Н-3), 3,72 (1Н, а1, ί 9,4 Гц, Н-4), 3,89 (1Н, а1, 1 9,1 Гц, Н-2), 4,34 (1Н, ά, ί_1>2 9,7 Гц, Н-1), 4,37, 4,31 (2Н, АЬд, 1 12,2 Гц, РНСН₂), 4,56, 4,83 (2Н, АЬд, 1 11,3 Гц, Р11СН + 4,77-4,83 (2Н, т, Р11СН + 4,90 (1Н, ά, 1 11,1 Гц, РНСНН), 4,97 (1Н, ά, 1 10,7 Гц, РНСНН), 7,07-7,21 (14Н, т, Аг-Н), 7,25-7,27 (2Н, т, Аг-Н), 7,29-7,31 (2Н, т, Аг-Н), 7,36-7,38 (2Н, т, Аг-Н).

Пример 35. Метиловый эфир N-ацетил-^-цистеин-(2,3,4,6-тетра-О-бензил-1-дитио-β-^глюкопиранозилдисульфид)-Ь-серина

2,3,4,6-Тетра-О-бензил-β-^-глюкопиранозил-фенилтиосульфонат (50 мг, 0,07 ммоль) растворяли в безводном ДХМ (5 мл) и перемешивали при КТ в атмосфере аргона. К этой смеси в течение 5 ч медленно по каплям добавляли метиловый эфир Ν-ацетил-Ь-цистеин-Ь-серина (19 мг, 0,07 ммоль) и триэтиламин (11 мкл, 0,08 ммоль) в безводном ДХМ (5 мл) и безводном метаноле (0,5 мл) через шприцевой насос. Через 5 ч ТСХ (этилацетат) показала образование основного продукта (В_£ 0,6) наряду с полным расходованием исходного вещества (В_£ 0,9). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (этилацетат) с получением целевого продукта (48 мг, 82%) в виде белого твердого кристаллического вещества; т.пл. 96-97°С; [α]_Β ²² +56,2 (с, 1 в СНС1₃); δ_Η (400 мГц, СНС1₃) 2,03 (3Н, к, СОСН3), 3,19 (1Н, άά, .1- 14,0 Гц, .1-..,.. 8,3 Гц, СукСНН), 3,37 (1Н, άά, .1-..· 14,3 Гц, .1-.,.. 6,0 Гц,

СукСНН), 3,64 (1Н, άάά, 1₄,₅ 9,6 Гц, ,Р.. 1,8 Гц, ί_5>6. 3,9 Гц, Н-5), 3,72 (1Н, а1, 1 9,2 Гц, Н-4), 3,77 (1Н, а1, 1 8,8 Гц, Н-3), 3,82 (3Н, к, ОМе), 3,84-3,90’ (4Н, т, 8егСНН, Н-2, Н-6, Н-6'), 3,96 (1Н, άά, .1-..· 11,7 Гц, .1-.,.. 3,3 Гц, 8егСНН), 4,50 (1Н, ά, 1_£,₂ 9,6 Гц, Н-1), 4,51, 4,70 (2Н, АВд, 1 1,6 Гц, РНСН₂), 4,55, 4,85 (2Н, АВд, 1 10,4 Гц, РНСН₂), 4,59-4,62 (1Н, т, аН8ег), 4,81, 4,87 (2Н, АВд, 1 10,6 Гц, РНСН₂), 4,91, 4,97 (2Н, АВд, 1 11,0 Гц, РНСН₂), 4,93-4,98 (1Н, т, .НСук), 6,88 (1Н, Ь6, 1_ΝΗ,_Η 7,9 Гц, Б1НАс), 7,13-7,39 (20Н, т, 20 х Аг-С), 7,48 (1Н, ά, ,1-... 7,6 Гц, МН8ег).

Пример 36. 2,3,6-Три-О-ацеτил-4-О-(2,3,6-τри-О-ацеτил-4-О-(2,3,4,6-τеτра-О-ацеτил-α-Оглюкопиранозил)-α-^-глюкопиранозил)-β-^-глюкопиранозилфенилтиосульфонат

2,3,6-Три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-α-О-глюкопиранозил)-α^-глюкопиранозил)-α-^-глюкопиранозилбромид (200 мг, 0,21 ммоль) растворяли в безводном ацетонитриле (10 мл). К этой смеси добавляли бензолтиосульфонат натрия (80 мг, 0,41 ммоль) и иодид тетрабутиламмония (10 мг, 0,02 ммоль). Полученную смесь перемешивали в атмосфере аргона при 70°С. Через 2 ч ТСХ (бензин:этилацетат, 1:2) показала образование УФ-активного продукта (В_£ 0,5) с полным расходованием исходного вещества (В£ 0,5), после чего раствор оставляли охлаждаться до КТ и фильтровали, фильтрат концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин: этилацетат, 1:2) с получением целевого продукта (140 мг, 62%) в виде белого аморфного твердого вещества; [αβ²² +69,9 (с, 0,75 в СНС1₃); δ_Η (500 мГц, СНС1₃) 2,03, 2,04, 2,06, 2,08, 2,11, 2,15, 2,19, (30Н, 10 х СОСН₃), 3,77-3,79 (1Н, т, Н-5а), 3,94-4,00 (4Н, т, Н-4а, Н-4с, Н-5Ь, Н-5с), 4,10 (1Н, άά, ,Ρ·. 2,1 Гц, 1₆,₆.

12,4 Гц, Н-6Ь), 4,17-4,22 (3Н, т, Н-6а, Н-6с, Н-6а'), 4,29 (1Н, άά, ,Ρ·. 3,3 Гц, 1₆,₆. 12,6 Гц, Н-6Ь'), 4,46 (1Н, άά, ,Ρ·. 1,9 Гц, 1 6,6' 12,4 Гц, Н-6с'), 4,76 (1Н, άά, 1_£,₂ 3,9 Гц, ,Р_; 10,4 Гц, Н-2а), 4,89-4,94 (2Н, т, Н-2Ь, Н

- 23 011299

2с), 5,12 (1Н, а!, 1 9,9 Гц, Н-4Ь), 5,28 (1Н, б, 1ι,₂ 3,8 Гц, Н-1а), 5,34 (1Н, б, 1_1>2 9,7 Гц, Н-1с), 5,37 (1Н, а!, 1

9.1 Гц, Н-3с), 5,41 (1Н, а!, 1 10,1 Гц, Н-3Ь), 5,41-5,45 (2Н, т, Н-1Ь, Н-3а), 7,62-7,65 (2Н, т, Аг-Н), 7,71 (1Н, т, Аг-Н), 8,00-8,02 (2Н, т, Аг-Н).

Пример 37. Этил-2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-Оглюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-1-дитио-в-О-глюкопиранозилдисульфид

2,3,6-Три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозил)-аО-глюкопиранозил)-в-О-глюкопиранозил-фенилтиосульфонат (50 мг, 0,05 ммоль) растворяли в безводном ДХМ (10 мл) и перемешивали при КТ в атмосфере аргона. В течение 1 ч медленно по каплям добавляли раствор триэтиламина (7 мкл, 0,05 ммоль) и этантиола (3 мкл, 0,05 ммоль) и безводный ДХМ (10 мл) через шприцевой насос. Через 1 ч ТСХ (бензин:этилацетат, 1:2) показала образование основного продукта (К_£ 0,6) наряду с полным расходованием исходного вещества (К_£ 0,4). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин: этилацетат, 1:2) с получением целевого этилового продукта (43 мг, 93%) в виде прозрачного масла; [α]_Β ²⁴ +26,4 (с, 1,5 в СНС1₃); δ_Η (500 МГц, СНС1₃) 1,30 (1Н, !, 1 7,2 Гц, СН₃), 2,04, 2,05, 2,06, 2,07, 2,10, 2,14, 2,19, 2,20 (30Н, 8 х 8, 10 х СОСН₃), 2,75-2,87 (2Н, т, СН₂СН₃), 3,77-3,81 (1Н, т, Н-5а), 3,96-4,00 (3Н, т, Н-4Ь, Н-5с, Н-5Ь), 4,03 (1Н, а!, 1 9,3 Гц, Н-4а), 4,10 (1Н, бб, 1₅₆ 2,3 Гц, 1₆₆. 12,6 Гц, Н-6с), 4,22 (1Н, бб, 1₅₆ 2,9 Гц, 1₆₆. 12,4 Гц, Н-6Ь), 4,29 (1Н, бб, 1₅₆ 3,7 Гц, 1₆₆. 12,4 Гц, Н-6'с), 4,33 (1Н, бб, 1₅₆ 4,4 Гц, 1₆₆. 12,4 Гц, Н-6а), 4,51 (1Н, бб, 1₅₆ 1,8 Гц, 16,6. 12,4 Гц, Н-6Ь', 4,57 (1Н, бб, Ц,6 2,3 Гц, 1_6>(? 12,4 Гц, Н-6а'), 4,58 (1Н, б, 1_£,2 9,9 Гц, Н-1а), 4,79’ (1Н, бб, 1ι,₂ 4,1 Гц, 1₂,₃ 10,6 Гц, Н-2Ь), 4,90 (1Н, бб, 1_1>2 4,3 Гц, 1₂,₃10,4 Гц, Н-2с), 5,11 (1Н, а!, 1 9,9 Гц, Н-4с), 5,16 (1Н, а!, 1 9,5 Гц,’ Н-2а), 5,33 (1Н, б, 1_1>2 4,1 Гц, Н-1Ь), 5,37 (1Н, а!, 1 8,9 Гц, Н-3а), 5,38-5,44 (2Н, т, Н-3Ь, Н3с), 5,45 (1Н, б, 11,2 4,1 Гц, Н-1с).

Пример 38. Метиловый эфир №Бутоксикарбонил-Ь-цистеин-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-Оацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-1-дитио-в-О-глюкопиранозилдисульфид)-Ь-серина

2,3,6-Три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозил)-аО-глюкопиранозил)-в-Э-глюкопиранозил-фенилтиосульфонат (89 мг, 0,08 ммоль) растворяли в безводном ДХМ (5 мл) и перемешивали при КТ в атмосфере аргона. В течение 3 ч медленно по каплям добавляли раствор триэтиламина (0,014 мл, 0,2 ммоль) и метилового эфира Ν-бутоксикарбонил-Ь-цистеинилЬ-серина (30 мг, 0,09 ммоль) в безводном ДХМ (10 мл) и безводном метаноле (1 мл) через шприцевой насос. Через 3 ч ТСХ (этилацетат) показала образование основного продукта (К_£ 0,6) наряду с полным расходованием исходного вещества (К_£ 0,7). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (этилацетат) с получением целевого продукта (66 мг, 74%) в виде белого аморфного твердого вещества; [а]_с ²⁴ +25,1 (с, 1,25 в СНС1₃); δ_Η (500 мГц, СНС1₃) 1,47 (9Н, 8, С(СН₃)₃), 2,00, 2,01, 2,02, 2,03, 2,06, 2,09, 2,15, 2,18 (30Н, 8 х 8, 10 х СОСН₃), 2,75-2,87 (1Н, т, СННСу8), 3,16-3,19 (1Н, т, СННСу8), 3,27 (1Н, !, 1 6,2 Гц, ОН), 3,81 (3Н, 8, ОМе), 3,83-3,85 (1Н, т, Н-5а), 3,92-4,01 (6Н, т, Н4Ь, Н-5Ь, Н-5с, Н-6а, Н-6а', СНН8ег), 4,06 (1Н, бб, 1₅,₆ 2,2 Гц, 1₆,₆ 12,2 Гц, Н-6с), 4,09-4,16 (2Н, т, Н-4а, Н6Ь), 4,25 (1Н, бб, 1₅,₆ 3,2 Гц, 1₆,₆. 12,3 Гц, Н-6с'), 4,39-4,41 (1Н, т, СНН8ег), 4,52-4,67 (4Н, т, аН8ег, аНСу8, Н-1а, Н-6'Ь),’ 4,74 (1Н, бб, 1_1>2 4,1 Гц, 1₂,₃ 10,3 Гц, Н-2Ь), 4,85 (1Н, бб, 1_£,₂ 3,7 Гц, 1₂,₃ 10,5 Гц, Н-2с), 5,07 (1Н, а!, 1 9,9 ГЦ, Н-4с), 5,11-5,13 (1Н, т, Н-2а), 5,28 (1Н, б, 1_1>2 4,1 Гц, Н-1Ь), 5,32-5,41 (4Н, т, Н-3а, Н-3Ь, Н-3с, 1\1НСу8), 5,42 (1Н, б, Ц₂ 3,9 Гц, Н-1с), 7,25 (1Н, Ьб, 1_ж,_аН 6,7 Гц, NΗ8е^).

Пример 39. Фенил-2,3,6-три-О-ацетил-1-селененилсульфид-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-в-О-глюкопиранозид

- 24 011299

2,3,6-Три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-О-ацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозил)-аО-глюкопиранозил)-в-0-глюкопиранозилтиол (500 мг, 0,53 ммоль) и фенилселенбромид (200 мг, 0,9 ммоль) растворяли в безводном ДХМ (20 мл). Через 5 мин ТСХ (бензин:этилацетат 1:2) показала образование основного продукта (К_£ 0,4) наряду с полным расходованием исходного вещества (К_£ 0,3). Реакцию гасили добавлением триэтиламина (5 мл) и затем концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин:этилацетат 1:2) с получением целевого продукта (527 мг, 91%) в виде желтоватого аморфного твердого вещества; [а]_с ²⁵ -2,6 (с, 1,0 в СНС1₃); δ_Η (400 мГц, СНС1₃), 1,99, 2,01, 2,02, 2,04, 2.06, 2,10, 2,14 (30Н, 9 х 8, 10 х ОАс), 3,79 (1Н, ба!, 1₄,₅ 9,7 Гц, 1₃.₄ Гц, Н-5а), 3,92 (3Н, т, Н-4Ь, Н-5Ь, Н-5с), 4,00 (1Н, а!, I 9,3 Гц, Н-4а), 4,05 (1Н, бб, 1₅,₆ 2,8 Гц, 1₆,₆. 12,8 Гц, Н-6с), 4,15 (1Н, бб, 1₅,₆ 2,8 Гц, 16,6' 12,6 Гц, Н-6Ь), 4,22 (1Н, бб, Ц,6 3,7 Гц, Це 12,0 Гц, Н-6а), 4,25 (1Н, бб, Ц,6 3,3 Гц, 16,6' 12,0 Гц, Н-6с'), 4,42-4,46 (2Н, т, Н-6а', Н-6Ь'), 4,66 (1Н, б, 1_£,₂ 9,9 Гц, Н-1а), 4,74 (1Н, бб, 1_£,₂ 4,1 Гц, 1₂,₃ 10,4 Гц, Н2Ь), 4,86 (1Н, бб, Ιι,₂ 4,1 Гц, 1₂,₃ 10,5 Гц, Н-2с), 5,06 (1Н, а!, I 9,6 Гц, Н-4с), 5,07 (1Н, а!, I 9,8 Гц, Н-2а), 5,27 (1Н, б, Ιι,₂ 4,4 Гц, Н-1Ь), 5,32-5,39 (3Н, т, Н-3а, Н-3Ь, Н-3с), 5,41 (1Н, б, 1_£,₂ 4,2 Гц, Н-1с), 7,27-7,29 (3Н, т, Аг-Н),’ 7,64-7,67 (2Н, т, Аг-Н).

Пример 40. Метиловый эфир бис-Ы-бутоксикарбонил-Ь-цистеинил-Ь-треонина

бис-1М-Бутоксикарбонил-Ь-цистеин (4,0 г, 9,1 ммоль), метиловый эфир Ь-треонина (2,42 г, 18,2 ммоль), ОСС (3,75 г, 18,2 ммоль), НОВ! (2,46 г, 18,2 ммоль) и ΌΙΡΕΑ (2,5 мл, 18,2 ммоль) растворяли в свежеперегнанном ДХМ (150 мл). Через 18 ч ТСХ (этилацетат:метанол, 9:1) показала образование основного продукта (К_£ 0,5) наряду с полным расходованием исходного вещества (К_£ 0,0). Реакционную смесь разбавляли водой (2 х 100 мл), и фазы разделяли. Органическую фазу промывали рассолом (100 мл), сушили (Мд§О₄), фильтровали, и растворитель удаляли в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (этилацетат:метанол, 9:1), и после перекристаллизации из смеси метанол/диэтиловый эфир получали целевой продукт (3,26 г, 60%) в виде белого твердого кристаллического вещества; т.пл. 145-147°С; [а]_с ²⁵ +20,8 (с, 1,0 в СНС1₃); δ_Η (400 мГц, СНС1₃), 1,23 (3Н, б, 1_СНСНЗ 6,6 Гц, СНСН₃), 1,44 (9Н, 8, С(СН₃)₃), 3,11-3,12 (2Н, т, СН₂Су8), 3,26 (1Н, Ь8, ОН), 3,75 (3Н, 8, ОМе), 4,32-4,36 (1Н, т, СНСН₃), 4,61 (бб, .£·,·· 8,7 Гц, .1 2,15 Гц, СНСН₃), 4,63-4,68 (1Н, т, аСу8), 5,75 (1Н, б,

1\'Н.аНСу8 7,4 Гц, ЫНСу8), 7,56 (1Н, б, .£·,·· 8,6 Гц, ЫНТЬг).

- 25 011299

Пример 41. Метиловый эфир Ν-бутоксикарбонил-Ь-цистеинил-Ь-треонина

Метиловый эфир бис-№бутоксикарбонил-Ь-цистеинил-Ь-треонина (2,0 г, 3,3 ммоль) растворяли в необезвоженном хлороформе (100 мл) и метаноле (10 мл) и перемешивали. К этой смеси при перемешивании добавляли раствор трибутилфосфина (1,0 мл, 4,0 ммоль). Через 2 ч ТСХ (этилацетат:метанол, 9:1) показала образование продукта (К_£ 0,8) наряду с полным расходованием исходного вещества (К_£ 0,7). Реакционную массу концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (этилацетат) с получением целевого продукта (2,0 г, 99%) в виде белой пены; [α]_Β ²⁵ -11,4 (с, 1,0 в С.'НС.'1₃);

δΗ (400 мГц, СНС1₃) 1,09 (3Η, б, 1снсн3 6,4 Гц, СН3), 1,34 (9Н, 8, С(СН₃)₃). 1,65 (1Н, а!, I 8,7 Гц, 8Н), 2,722,89 (2Н, т, СН₂), 3,66 (3Η, 8, ОМе), 3,96 (1Н, т, ОН), 4,24-4,28 (1Н, т, СНСН₃), 4,34-4,36 (1Н, т, аНСу8), 4,49 (1Н, бб, Ρητίνη 8,5 Гц, 1антьг,снсн3 2,7 Гц, аНТЬг), 5,82 (1Н, б, Ρη^νη 8,2 Гц, NΗСу8), 7,38 (1Н, б, ΙαΗΊΐι-,ΝΗ 8,5 Гц, ΝΙΙΤΙΐΓ).

Пример 42. Метиловый эфир №бутоксикарбонил-Ь-цистеин-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-1-дитио-в-Оглюкопиранозилдисульфид)-Ь-треонина

Фенил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-1-селененилсульфид-О-в-глюкопиранозид (130 мг, 0,25 ммоль) и триэтиламин (0,02 мл, 0,18 ммоль) растворяли в свежеперегнанном ДХМ (10 мл). Полученный раствор перемешивали при КТ. К вышеуказанному раствору медленно добавляли раствор метилового эфира Νбутоксикарбонил-Ь-цистеин-Ь-треонина (30 мг, 0,089 ммоль) в безводном метаноле (4 мл). Через 10 мин ТСХ (бензин:этилацетат, 1:2) показала образование продукта (К_£ 0,2) наряду с полным расходованием исходного вещества (К_£ 0,5). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэшхроматографией (бензин:этилацетат, 1:2) с получением целевого продукта (32 мг, 51%) в виде белого аморфного твердого вещества; [а]_с ²⁵ -81,2 (с, 0,25 в СНС1₃); δ_Η (400 мГц, СНС1₃) 1,28 (3Η, б, 1_СНСН3 6,7 Гц, СНСН₃), 1,51 (9Н, 8, С(СН₃)₃), 2,06, 2,08, 2,10, 2,14 (12Н, 4 х 8, 4 х ОАс), 2,86 (1Н, Ь8, ОН), 3,06 (1Н, бб, 1снон 8,8 Гц, 1снсн 13,4 Гц, СННСу8), 3,31 (1Н, бб, ^„н 4,2 Гц, 1снсн 13,1 Гц, СННСу8), 3,82 (3Н, 8, ОСН₃), 3,87-3,89 (1Н, т, Н-5), 4,32-4,38 (2Н, т, Н-6, Н-6'), 4,39 (1Н, бб, 1_СНСН3 6,4 Гц, 1_СНаН 2,5 Гц, СНОН), 4,60-4,65 (3Н, т, Н-1, „НТЬг, „НСу8), 5,20-5,32 (3Н, т, Н-2, Н-3, Н-4), 5,42 (1Н, б, 1_ΝΗΗ 8,0 Гц, ΝΗφδ), 7,12 (1Н, б, 8,9 Гц, Ν ΙΤ11Γ).

Пример 43. Метиловый эфир Ν-бутоксикарбонил-Ь-цистеин (2,3,4,6-тетра-О-ацетил-1-дитио-в-Огалактопиранозил-дисульфид)-Ь-треонина

Фенил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-1-селененилсульфид-О-в-галактопиранозид (140 мг, 0,27 ммоль) и триэтиламин (0,01 мл, 0,089 ммоль) растворяли в свежеперегнанном ДХМ (5 мл). Полученный раствор перемешивали при КТ. К вышеуказанному раствору медленно добавляли раствор метилового эфира Νбутоксикарбонил-Ь-цистеин-Ь-треонина (26 мг, 0,077 ммоль) в безводном ДХМ (5 мл) и безводном метаноле (4 мл). Через 10 мин ТСХ (бензин:этилацетат, 1:2) показала образование продукта (К_£ 0,2) наряду с полным расходованием исходного вещества (К_£ 0,6). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин:этилацетат, 1:2) с получением целевого продукта (49 мг, 93%) в виде белого аморфного твердого вещества; [α]_Β ²⁵ -81,2 (с, 0,25 в СНС1₃); δ_Η (400 мГц, СНС1₃) 1,24 (3Н, б, 1_СН,_СН3 6,4 Гц, СН₃), 1,46 (9Н, 8, С(СН₃)₃), 2,01, 2,06, 2,08, 2,20 (12Н, 4 х 8, 4 х ОАс), 2,79 (1Н, Ьб, 1сн,он 4,1 Гц, ОН), 2,99 (1Н, бб, .1... ..- 8,8 Гц, 1сн,н 13,9 Гц, СННСу8), 3,32-3,35 (1Н, т, СННСу8), 3,76 (3Н, 8, ОСН₃), 4,04 (1Н, а!, 1 6,2 Гц, Н-5), 4,10-4,16 (1Н, т, Н-6), 4,19 (1Н, бб, 1_5>6. 6,1 Гц, 16,6· 10,8 Гц, Н-6'), 4,36-4,46 (1Н, т, СНОН), 4,56 (1Н, бб, 1антьг,сн 2,4 Гц, 1„η,νη 8,9 Гц, 4,57-4,64 (1Н, т, „НСу8), 4,65 (1Н, б, 1_£,2 9,0 Гц, Н-1), 5,13 (1Н, бб, 9,8 Гц, 12,₃ 9,8 Гц, Н-3), 5,31 (1Н, б, 1„нсу8,ж 8,3 Гц, ΝΗφδ), 5,47 (1Н, б, 1_зл 3,2 Гц, Н-4), 5,52 (1Н, а!, 1 9,6 Гц, Н-2), 6,91 (1Н, б, 9,0 Гц, ΝΗΤ6Γ).

- 26 011299

Пример 44. Метиловый эфир бутоксикарбонил-Ь-цистеинил-(8-3,4,6-три-О-ацетил-2-ацетамидо-2дезокси-в-Э-глюкопиранозилдисульфид)-Ь-треонина

Целевой продукт получали (55 мг, 88%) в виде белого аморфного твердого вещества по способу, аналогичному способу, описанному в примере 43, используя в качестве исходного вещества фенил-3,4,6три-О-ацетил-2-ацетамидо-2-дезокси-1-селененилсульфид-О-в-глюкопиранозид. [α]_Β ²⁵ -47,1 (с, 0,1 в СНС1₃); δ_Η (400 мГц, СНС1₃) 1,17 (3Н, й, 1_СН,_СН3 6,4 Гц, СН₃), 1,49 (9Н, 5, С(СН₃)₃), 1,91, 2,00, 2,02, 2,07 (12Н, 4 х 5, 4 х, СОСН₃), 2,99 (1Н, йй, 1_СНН,_СНН 13,5 Гц, .1.. .. Н 10,0 Гц, СНН), 3,38 (1Н, йй, .1.. .. 4,8 Гц, 1_СНН,_СНН 13,5 Гц, СНН), 3,88-3,91 (1Н, т, Н-5), 4,16-4,32 (4Н, т, Н-2, Н-6, Н-6', СНСН₃), 4,45 (1Н, й, .1.. .. 2,7 Гц, аНТйг), 4,54 (1Н, йй, 1_аН,_СНН 9,7 Гц, 1_аН,_СНН 4,7 Гц, аНСу5), 4,79 (1Н, й, 1ι,₂ 10,1 Гц, Н-1), 5,06 (1Н, а!, 1 9,7 Гц, Н-4), 5,28 (1Н, а!, 1 9,7 Гц, Н-3).

Пример 45. Метиловый эфир №бутоксикарбонил-Ь-цистеинил-(8-1-в-О-глюкопиранозилдисульфид)-Ь-треонина

Фенил-1-селененилсульфид-Э-в-глюкопиранозид (70 мг, 0,2 ммоль) и триэтиламин (0,01 мл, 0,1 ммоль) растворяли в МеОН (8 мл). Полученный раствор перемешивали при КТ. К вышеуказанному раствору медленно добавляли раствор метилового эфира Ν-бутоксикарбонил-Ь-цистеин-Ь-треонина (22 мг, 0,07 ммоль) в МеОН (5 мл). Через 10 мин ТСХ (ЕЮЛс:МеОН, 9:1) показала образование основного продукта (Кг 0,4). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (ЕЮЛс:МеОН, 9:1) с получением целевого соединения (32 мг, 91%) в виде белого аморфного твердого вещества; [а]_с ²⁵ -139,5 (с, 0,6 в МеОН); δ_Η (500 мГц, С1)_;О1)) 1,19 (3Н, й, 1_СН,_СН3 6,2 Гц, СНСН₃), 1,49 (9Н, 5, С(СНэ)э), 2,93 (1Н, йй, 1снн,снн 13,5 Гц, .1,.... 9,5 Гц, СЩСук), 3,32-3,46 (4Н, т, Н-3, Н-4, Н-5, СНН), 3,60-3,63 (1Н, т, Н-2), 3,73-3,77 (1Н, т, Н-6), 3,78 (3Н, 5, ОМе), 3,92-3,94 (1Н, т, Н-6'), 4,31-4,36 (1Н, т, СНСН₃), 4,39 (1Н, й, 11,2 9,3 Гц, Н-1), 4,48 (1Н, й, .1.. .. 2,9 Гц, аНТЙг), 4,69 (1Н, йй, .1.. .... 9,0 Гц, !_аН,СНН

5.2 Гц, аНСу5).

Пример 46. Метиловый эфир №бутоксикарбонил-Ь-цистеинил-(8-2-ацетамино-2-дезокси-1-в-Оглюкопиранозилдисульфид)-Ь-треонина

Целевой продукт получали (32 мг, 91%) в виде белого аморфного твердого вещества по способу, аналогичному способу, описанному в Примере 45, используя в качестве исходного вещества фенил-2ацетамидо-2-дезокси-1-селененилсульфид-в-Э-глюкопиранозид. [α]_Β ²⁵ +6,21 (с, 0,45 в МеОН); δ_Η (500 мГц, СТНЮ) 1,19 (3Н, й, 1снснэ 6,7 Гц, СНСН₃), 1,49 (9Н, 5, С(СН₃)₃), 1,99 (3Н, 5, СОСН₃), 2,97 (1Н, йй, 1_СН,_Н 13,8 Гц, .1·..... 9,6 Гц, СННСу5), 3,31-3,33 (1Н, т, СНН), 3,38-3,41 (1Н, т, Н-5), 3,45 (1Н, а!, 1 9,3 Гц, Н-4), 3,54 (1Н, йй, 1₂,₃ 8,6 Гц, 1₃,₄ 9,8 Гц, Н-3), 3,76-3,77 (1Н, т, Н-6), 3,78 (3Н, 5, ОМе), 3,79-4,01 (2Н, т, Н-2, Н-6'), 4,33 (1Н, йс.], 1снснэ 6,3 Гц, 1:11,,,.11, 3,0 Гц, СНСН₃), 4,48 (1Н, й, .1.. .. Н 3,0 Гц, аНТйг), 4,59 (1Н, й, 1ι,₂ 10,3 Гц, Н-1), 4,63-4,67 (1Н, т, аНсу5).

Пример 47. Фенил-1-селененилсульфид-в-О-глюкопиранозид

1-Тио-в-О-глюкопиранозид (200 мг, 0,9 ммоль) и фенилселененилбромид (230 мг, 1,0 ммоль) добавляли к безводному 1,4-диоксану (5 мл), перемешивали в атмосфере аргона. Через 1 мин ТСХ (этилацетат) показала образование основного продукта (К_г 0,2). Реакцию гасили добавлением триэтиламина (2 мл). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (этилаце

- 27 011299 тат:метанол, 9:1) с получением целевого продукта (165 мг, 57%) в виде желтоватого аморфного твердого вещества; [α]_Β ²² +56,2 (с, 1 в СНС1₃); δ_Η (400 мГц, МеОЭ) 3,31-3,33 (2Н, т, Н-3, Н-5), 3,39-3,45 (2Н, т, Н2, Н-4), 3,62 (1Н, бб, 1₅,₆ 5,3 Гц, 1₆,₆ 12,1 Гц, Н-6), 3,83 (1Н, бб, ί_5>6 1,9 Гц, 1₆,₆ 12,2 Гц, Н-6), 4,47 (1Н, б, ί_1>2 9,4 Гц, Н-1), 7,27-7,34 (3Н, т, Аг-Н), 7,75-7,78 (2Н, т, Аг-Н).

Пример 48. Фенил-1-селененилсульфид-в-О-галактопиранозид

Целевое соединение получали (193 мг, 20%) в виде желтоватого аморфного твердого вещества по способу, аналогичному способу, описанному в примере 47, используя в качестве исходного вещества 1тио-З-Э-галактопиранозид. [а]_с ²⁵ -111,4 (с, 1 в МеОН); δ_Η (400 мГц, СО₃,ОЭ) 3,52 (1Н, бб, 1₂,₃ 9,4 Гц, 1₃,₄

3,3 Гц, Н-3), 3,56 (1Н, а!, 1₄,₅ 0,9 Гц, I 6,5 Гц, Н-5), 3,67-3,69 (2Н, б, I 6,0 Гц, Н-6, Н-6'), 3,74 (1Н, а!, I 9,3 Гц, Н-2), 3,91 (1Н, бб, 1₃,₄ 3,2 Гц, 1₄,₅ 0,7 Гц, Н-4), 4,45 (1Н, б, ί_1>2 9,7 Гц, Н-1), 7,27-7,30 (3Н, т, Аг-Н), 7,76-7,79 (2Н, т, Аг-Н).

Пример 49. Фенил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-1-селененилсульфид-в-О-глюкопиранозид

1-Тио-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-в-Э-глюкопиранозу (200 мг, 0,6 ммоль) и Рк8еВг (150 мг, 0,6 ммоль) добавляли к свежеперегнанному ДХМ (5 мл) и перемешивали в атмосфере аргона при КТ. Через 5 мин ТСХ (бензин:Е!ОАс, 1:1) показала образование основного продукта (Вк 0,5) наряду с полным расходованием исходного вещества (В_к 0,4). Реакционную смесь гасили добавлением триэтиламина (2 мл) и перемешивали в течение 5 мин. Остаток распределяли между ДХМ (5 мл) и водой (10 мл), и водную фазу повторно экстрагировали ДХМ (3х5 мл). Объединенные органические экстракты промывали рассолом (10 мл), сушили над Мд8О4, фильтровали, и растворитель удаляли в вакууме. Полученный остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин:Е!ОАс, 2:1) с получением целевого продукта (260 мг, 93%) в виде желтого твердого кристаллического вещества, т.пл. 111-112°С; [а]_с ²⁵ -250,1 (с, 1,0 в СНС1₃); δ_Η (400 мГц, СНС1₃) 2,02, 2,01, 2,00 (12Н, 4 х 8, 4 х СН₃), 3,75 (1Н, ббб, 1₄,₅ 9,9 Гц, 1₅,₆ 2,4 Гц, ί_5>(? 4,6 Гц, Н5), 4,08 (1Н, бб, .1,·. 2,6 Гц, Це 12,4 Гц, Н-6), 4,16 (1Н, бб, Це 4,5 Гц, ί_6>(? 12,4 Гц, Н-6'), 4,62 (1Н, б, 11,2 9,8 Гц, Н-1), 5,12 (1Н, а!, I 9,7 Гц, Н-4), 5,20-5,30 (2Н, т, Н-2, Н-3), 7,25-7,28 (3Н, т, Аг-Н), 7,67-7,70 (2Н, т, Аг-Н).

Пример 50. Фенил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-1-селененилсульфид-в-О-галактопиранозид

Целевое соединение получали (402 мг, 95%) в виде желтого твердого кристаллического вещества, используя способ, аналогичный способу, описанному в примере 49, с использованием в качестве исходного вещества 1-тио-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-в-Э-галактопиранозы. Т.пл. 123-125°С; [а]_с ²⁵ -172,4 (с, 1,0 в СНС1₃); δ_Η (400 мГц, СНС1₃) 1,99, 2,02, 2,16 (12Н, 4 х 8, 4 х СН₃), 3,94-4,03 (3Н, т, Н-5, Н-6, Н-6'), 4,64 (1Н, б, Ιι,₂ 10,1 Гц, Н-1), 5,04 (1Н, бб, 1₂,₃ 10,2 Гц, 1₃,₄ 3,3 Гц, Н-3), 5,40-5,45 (2Н, т, Н-2, Н-4), 7,27-7,30 (3Н, т, Аг-Н), 7,69-7,71 (2Н, т, Аг-Н).

Пример 51. Фенил-3,4,6-три-О-ацетил-2-ацетамидо-2-дезокси-1-селененилсульфид-в-Оглюкопиранозид

Целевое соединение получали (300 мг, 66%) в виде белого твердого кристаллического вещества, используя способ, аналогичный способу, описанному в примере 49, с использованием в качестве исходного вещества 1-тио-3,4,6-три-О-ацетил-2-ацетамидо-2-дезокси-в-О-глюкопиранозы. Т.пл. 177-179°С;

- 28 011299 [α]π²⁵-134,0 (с, 1,0 в СНС1₃); δ_Η (400 мГц, СНС1₃), 1,90 (3Н, к, ЫНСОСН₃), 1,99, 2,00, 2,03 (9Н, 3 х к, 3 х СН₃), 3,76 (1Н, ббб, 14,5 10,1 Гц, .1,.. 2,3 Гц, 4,7 Гц, Н-5), 4,07 (1Н, бб, Ь_>6 2,3 Гц, Це 12,3 Гц, Н-6), 4,15 (1Н, бб, ί_5>6. 4,6 Гц, 1₆,_е 12,2 Гц, Н-6'), 4,19-4,24 (1Н, т, Н-2), 4,78 (1Н, б, ί_1>2 10,1 Гц, Н-1), 5,09 (1Н, а!, I 9.7 Гц, Н-4), 5,28 (1Н, а!, I 9,5 Гц, Н-3), 5,79 (1Н, б, I 9,1 Гц, ЫНАс), 7,24-7,28 (3Н, т, Аг-Н), 7,68-7,70 (2Н, т, Аг-Н).

Пример 52. Фенил-2-ацетиламино-2-дезокси-1-селененилсульфид-3-Э-глюкопиранозид

1-Тио-2-ацетиламино-2-дезокси-в-Э-глюкопиранозид (230 мг, 0,98 ммоль) и фенилселененилбромид (250 мг, 1,08 ммоль) добавляли к безводному 1,4-диоксану (5 мл) и безводному метанолу (3 мл), перемешивали в атмосфере аргона. Через 1 мин ТСХ (этилацетат:метанол, 9:1) показала образование основного продукта (В_г 0,4). Реакционную смесь гасили добавлением триэтиламина (5 мл). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (этилацетат: метанол, 9:1) с получением целевого продукта (270 мг, 70%) в виде белого аморфного твердого вещества; [а]_с ²² -174,0 (с, 1 в МеОН); δ_Η (400 мГц, МеОЭ), 1,96 (3Н, к, СН₃), 3,31-3,39 (2Н, т, Н-4, Н-5), 3,51 (1Н, а!, I 8,1 Гц, Н3), 3,65 (1Н, бб, 1₅,₆ 5,0 Гц, Ι₆,_β 11,7 Гц, Н-6), 3,82-3,90 (2Н, т, Н-2, Н-6'), 4,65 (1Н, б, ί_1>2 10,2 Гц, Н-1), 7,27-7,34 (3Н, т, АгН), 7,72-7,74 (2Н, т, АгН).

Пример 53. Этил-1-тио-в-Э-глюкопиранозилдисульфид

но

Фенил-1-селененилсульфид-в-Э-глюкопиранозид (140 мг, 0,4 ммоль) растворяли в МеОН (10 мл) и перемешивали при КТ. К этой смеси в течение 1 ч по каплям добавляли раствор этантиола (10 мкл, 0,1 ммоль) и триэтиламина (60 мкл, 0,4 ммоль) в МеОН (5 мл). Через 1 ч ТСХ (Е!ОАс:МеОН, 9:1) показала образование основного продукта (В_г 0,4) наряду с полным расходованием исходного вещества (В_г 0,5). Раствор концентрировали в вакууме. Остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (Е!ОАс:МеОН, 5:1) с получением целевого продукта (30 мг, 90%) в виде белого аморфного твердого вещества; [а]_с ²² -65,3 (с, 0,4 в СНС1₃); δ_Η (500 мГц, СЭ₃ОЭ), 1,33 (3Н, !, I 7,4 Гц, СН₃), 2,86 (2Н, φ I 7,4 Гц, СН₂), 3,30-3,34 (2Н, т, Н-4, Н-5), 3,41 (1Н, а!, I 9,0 Гц, Н-3), 3,49 (1Н, а!, I Гц, Н-2), 3,67 (1Н, бб, 1₅,₆ 5,3 Гц, 1₆,_е 12,0 Гц, Н-6), 3,88 (1Н, бб, ί_5>6. 2,1 Гц, 1₆,_е 12,0 Гц, Н-6'), 4,35 (1Н, б, ί_1>2 9,1 Гц, Н-1).

Пример 54. Этил-2-ацетиламидо-2-дезокси-1-дисульфид-в-Э-глюкопиранозид

Фенил-2-ацетамидо-2-дезокси-1-селененилсульфид-в-Э-глюкопиранозид (140 мг, 0,4 ммоль) растворяли в МеОН (10 мл) и перемешивали при КТ. К этой смеси в течение 1 ч по каплям добавляли раствор этантиола (10 мкл, 0,13 ммоль) и триэтиламина (55 мкл, 0,4 ммоль) в МеОН (5 мл). Через 1 ч ТСХ (Е!ОАс:МеОН, 9:1) показала образование основного продукта (В_г 0,2). Раствор концентрировали в вакууме. Полученный остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (Е!ОАс:МеОН, 9:1) с получением целевого продукта (38 мг, 99%) в виде белого аморфного твердого вещества; [а]_с ²⁵ -7,9 (с, 1,0 в СНС1₃); δ_Η (400 мГц, СЭ₃ОЭ) 1,30 (3Н, !, I 7,3 Гц, СН₃), 2,01 (3Н, к, ОАс), 2,83-2,86 (2Н, т, СН₂), 3,313,39 (2Н, т, Н-4, Н-5), 3,51-3,56 (1Н, т, Н-3), 3,68-3,72 (1Н, т, Н-6), 3,84-3,91 (2Н, т, Н-2, Н-6'), 4,57 (1Н, б, 11,2 10,3 Гц, Н-1).

Пример 55. Способы гликозилирования белков с использованием тиосульфонатных реагентов

А. Мутантный белок 8ВБ8156С (24 мг, 0,89 мкмоль) растворяли в водном буферном растворе (2,4 мл, 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 6,9). 2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-в-Э-глюкопиранозил-фенилтиосульфонат (50 мг, 0,1 ммоль) растворяли в смеси вода/ацетонитрил (1,6 мл, 9/7, об./об.). Часть раствора сахара (50 мкл) добавляли к раствору белка и помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 25 мин с помощью анализа Элмана было показано отсутствие свободного тиола (Е11таи, С. Ь. Агсй. Вюсйет. Вюрйук. 1959, 82, 70), после чего добавляли другую часть раствора сахара (50 мкл). Реакционную смесь помещали на ротатор для вертикального перемешивания еще на 5 мин, после чего реакционную смесь наносили на колонку РЭ10 8ерйабех® С25 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали и диализовали (М\\'С'О 12-14 кДа) против 10 мМ МЕ8, 1 мМ СаС1₂, рН 5,8 (1 х 4 л в течение 1 ч, 2 х 2 л в течение 30 мин), с получением гликозилированного продукта; ш/ζ (ЭР) найде

- 29 011299 но 27072, вычислено 27078.

B. Мутантный белок 8ВБ8156С (24 мг, 0,89 мкмоль) растворяли в водном буферном растворе (2,4 мл, 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 6,9). 2,3,4,6-тетра-О-ацетил-в-П-галактопиранозилфенилтиосульфонат (50 мг, 0,1 ммоль) растворяли в смеси вода/ацетонитрил (1,0 мл, соотношение 1/1). К раствору белка добавляли раствор сахара (50 мкл) и помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 25 мин с помощью анализа Элмана было показано отсутствие свободного тиола, после чего добавляли другую часть раствора сахара (50 мкл). Реакционную смесь помещали на ротатор для вертикального перемешивания еще на 5 мин, после чего реакционную смесь наносили на колонку ΡΌ10 8ерйа6ех® 625 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали и диализовали (МАСО 12-14 кДа) против 10 мМ МЕ8, 1 мМ СаС1₂, рН 5,8 (1 х 4 л в течение 1 ч, 2 х 2 л в течение 30 мин), с получением гликозилированного продукта; т/ζ (ЭР) найдено 27072, вычислено 27078.

C. Мутантный белок 8ВЬ8156С (10 мг, 0,37 мкмоль) растворяли в дегазированном водном буферном растворе (1 мл, 70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5). 2,3,6-Три-О-ацетил-4-О-(2,3,6-три-Оацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-в-О-глюкопиранозилфенилтиосульфонат (30 мг, 0,03 ммоль) растворяли в ацетонитриле (150 мкл). К раствору белка добавляли раствор сахара (75 мкл) и помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 30 мин с помощью анализа Элмана было показано отсутствие свободного тиола, после чего реакционную смесь наносили на колонку ΡΌ10 8ерНа6ех® 625 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали и диализовали (МАСО 12-14 кДа) против 10 мМ МЕ8, 1 мМ СаС1₂, рН 5,8 (1 х 4 л в течение 1 ч, 2 х 2 л в течение 30 мин), с получением гликозилированного продукта; т/ζ (ЭР) найдено 27654, вычислено 27653.

Ό. БСА (10 мг, 0,14 мкмоль) растворяли в водном буферном растворе (1 мл, 50 мМ Трис, рН 7,7).

2.3.4.6- Тетра-О-ацетил-в-О-глюкопиранозил-фенилтиосульфонат (10 мг, 0,02 ммоль) растворяли в смеси вода/ацетонитрил (1,0 мл, соотношение 8/2). К раствору белка добавляли раствор сахара (150 мкл) и помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 30 мин с помощью анализа Элмана было показано отсутствие свободного тиола, после чего реакционную смесь наносили на колонку РЭ10 8ер11а6ех® 625 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали и диализовали (МАСО 12-14 кДа) против чистой воды (1 х 4 л в течение 1 ч, 2 х 2 л в течение 30 мин), с получением гликозилированного продукта; т/ζ (ЭР) найдено 66798, вычислено 66794.

Е. БСА (10 мг, 0,14 мкмоль) растворяли в водном буферном растворе (1 мл, 50 мМ Трис, рН 7,7).

2.3.4.6- Тетра-О-ацетил-в-О-галактопиранозил-фенилтиосульфонат (25 мг, 0,05 ммоль) растворяли в ацетонитриле (0,5 мл). К раствору белка добавляли раствор сахара (75 мкл) и помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 30 мин с помощью анализа Элмана было показано отсутствие свободного тиола, после чего реакционную смесь наносили на колонку РЭ10 8ерйа6ех® 625 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали и диализовали (МАСО 12-14 кДа) против чистой воды (1 х 4 л в течение 1 ч, 2 х 2 л в течение 30 мин), с получением гликозилированного продукта; т/ζ (ЭР) найдено 66792, вычислено 66794.

Пример 56. Способы гликозилирования белков с использованием селененилсульфидных реагентов

A. Мутантный белок 8ВЬ8156С (5 мг) растворяли в дегазированном водном буферном растворе (1 мл, 70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5). Фенил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-в-Э-селененилсульфидглюкопиранозид (10 мг, 0,02 ммоль) растворяли в ацетонитриле (500 мкл). К раствору белка добавляли раствор сахара (500 мкл) и помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 1 ч с помощью анализа Элмана было показано отсутствие свободного тиола, после чего реакционную смесь наносили на колонку РЭ10 8ерйа6ех® 625 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали и диализовали (МАСО 12-14 кДа) против воды (1 х 4 л в течение 1 ч, 2 х 2 л в течение 30 мин), с получением гликозилированного продукта; т/ζ (ЭР) найдено 27074, вычислено 27077.

B. БСА (5 мг) растворяли в дегазированном водном буферном растворе (1 мл, 70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5). Фенил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-в-П-селененилсульфид-глюкопиранозид (10 мг, 0,02 ммоль) растворяли в ацетонитриле (800 мкл). К раствору белка добавляли раствор сахара (800 мкл) и помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 1 ч с помощью анализа Элмана было показано отсутствие свободного тиола, после чего реакционную смесь наносили на колонку РЭ10 8ер11а6ех® 625 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали и диализовали (МАСО 12-14 кДа) против воды (1 х 4 л в течение 1 ч, 2 х 2 л в течение 30 мин), с получением гликозилированного продукта; т/ζ (ЭР) найдено 66792, вычислено 66794.

C. Мутантный белок 8ВЬ8156С (5 мг) растворяли в дегазированном водном буферном растворе (1 мл, 70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5). Фенил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-в-Э-селененилсульфидгалактопиранозид (10 мг, 0,02 ммоль) растворяли в ацетонитриле (500 мкл). К раствору белка добавляли раствор сахара (500 мкл) и помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 1 ч с помощью анализа Элмана было показано отсутствие свободного тиола, после чего реакционную смесь наносили на колонку РЭ10 8ер11а6ех® 625 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фрак

- 30 011299 цию собирали и диализовали (М^СО 12-14 кДа) против воды (1 х 4 л в течение 1 ч, 2 х 2 л в течение 30 мин), с получением 61с(Ас)₄8ВЬ8156С; т/ζ (ЭР) найдено 27074, вычислено 27077.

Ό. Мутантный белок 8ВБ8156С (10 мг) растворяли в дегазированном водном буферном растворе (1 мл, 70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5). Фенил-1-селененилсульфид-в-О-глюкопиранозид (15 мг, 0,02 ммоль) растворяли в смеси вода/ацетонитрил (0,8 мл, 1/1 соотношение). К раствору белка добавляли раствор сахара (500 мкл) и помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 30 мин с помощью анализа Элмана было показано отсутствие свободного тиола. Реакционную смесь помещали на ротатор для вертикального перемешивания еще на 30 мин, после чего реакционную смесь наносили на колонку ΡΌ10 8ерНабех® 625 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали и диализовали (М\УСО 12-14 кДа) против воды (1 х 4 л в течение 1 ч, 2 х 2 л в течение 30 мин), с получением Лс61с8ВЬ8156С; т/ζ (ЭР) найдено 27072, вычислено 26911.

Е. Мутантный белок 8ВБ8156С (5 мг) растворяли в дегазированном водном буферном растворе (2,4 мл, 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 6,9). Фенил-2-ацетиламино-2-дезокси-1-селененилсульфид-в-Оглюкопиранозид (5 мг, 0,01 ммоль) растворяли в ацетонитриле (200 мкл, соотношение 1/1). К раствору белка добавляли раствор сахара (100 мкл) и помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 30 мин с помощью анализа Элмана было показано отсутствие свободного тиола, после чего добавляли другую часть раствора сахара (100 мкл). Реакционную смесь помещали на ротатор для вертикального перемешивания еще на 30 мин, после чего реакционную смесь наносили на колонку ΡΌ10 8ерНабех® 625 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали и диализовали (М^СО 12-14 кДа) против 10 мМ МЕ8, 1 мМ СаС1₂, рН 5,8 (1 х 4 л в течение 1 ч, 2 х 2 л в течение 30 мин), с получением НО61сЫАс8ВЬ8156С; т/ζ (ЭР) найдено 26950, вычислено 26950.

Е. Мутантный белок 8ВБ8156С (5 мг) растворяли в дегазированном водном буферном растворе (1 мл, 70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5). Фенил-3,4,6-три-О-ацетил-2-ацетиламино-2-дезокси-1селененилсульфид-в-Э-глюкопиранозид (10 мг, 0,02 ммоль) растворяли в ацетонитриле (500 мкл). К раствору белка добавляли раствор сахара (500 мкл) и помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 1 ч с помощью анализа Элмана было показано отсутствие свободного тиола, после чего реакционную смесь наносили на колонку РЭ10 8ерНабех® 625 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали и диализовали (М\УСО 12-14 кДа) против воды (1 х 4 л в течение 1 ч, 2 х 2 л в течение 30 мин), с получением Лс61сНЛс8ВВ8156С; т/ζ (ЭР) найдено 27074, вычислено 27078.

6. 8ВЬСу8156 (5 мг) растворяли в дегазированном водном буферном растворе (500 мкл, 70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5). Фенил-2,3,6-три-О-ацетил-1-селененилсульфид-4-О-(2,3,6-три-Оацетил-4-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозил)-а-О-глюкопиранозид (15 мг, 0,015 ммоль) растворяли в ацетонитриле (300 мкл, 75 экв.), и этот раствор добавляли к раствору белка и помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 30 мин с помощью анализа Элмана было показано отсутствие свободного тиола. Реакционную смесь помещали на ротатор для вертикального перемешивания еще на 30 мин, после чего реакционную смесь наносили на колонку РЭ10 8ерНабех® 625 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали и диализовали (М\УСО 12-14 кДа) против воды (1 х 4 л в течение 1 ч, 2 х 2 л в течение 30 мин) с получением 61с(Лс)₄61с(Лс)з61с(Лс)з8ВЕСу8156; т/ζ (ЭР⁺) найдено 27644, вычислено 27653.

H. 8ВЬСу8156 (5 мг) растворяли в дегазированном водном буферном растворе (500 мкл, 70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5). Фенил-1-селененилсульфид-в-Э-галактопиранозид (15 мг, 0,04 ммоль) растворяли в смеси вода/ацетонитрил (600 мкл, соотношение 1/3). К раствору белка добавляли раствор сахара (600 мкл, 230 экв.) и помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 30 мин с помощью анализа Элмана было показано отсутствие свободного тиола, реакционную смесь помещали на ротатор для вертикального перемешивания еще на 30 мин, после чего реакционную смесь наносили на колонку РЭ10 8ерНабех® 625 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали и диализовали (М\УСО 12-14 кДа) против воды (1 х 4 л в течение 1 ч, 2 х 2 л в течение 30 мин) с получением 6а1-8ВЬСу8156; т/ζ (ЭР⁺) найдено 26908, вычислено 26909.

I. 1-Тио-в-О-мальтотриозу (104 мг, 0,2 ммоль) растворяли в МеОН (5 мл), к полученному раствору добавляли раствор Р118еВг (70 мг, 0,3 ммоль) в Е!ОАс (2 мл). Через 2 мин добавляли триэтиламин (2 мл), и реакционную смесь разбавляли водой (10 мл) и бензином (5 мл). Фазы разделяли, водную фазу промывали бензином (3х10 мл) и лиофилизировали. Неочищенную фенил-1-селененилсульфид-мальтотриозу (т/ζ 755, 757 (М+Вг^-, 100%)) выливали в воду (10 мл), и 50 мкл полученного раствора (25 экв.) добавляли к раствору 8ВЬСу8156 (1 мг) в 500 мкл буфера (70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5). Полученный раствор помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 2,5 ч реакционную смесь наносили на колонку РЭ10 8ерНабех® 625 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали с получением 61с61с61с-8ВЬСу8156; т/ζ (ЭР⁺) найдено 27226, вычислено 27233.

1. БСА (5 мг) растворяли в дегазированном водном буферном растворе (1 мл, 70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5). Фенил-1-селененилсульфид-в-О-глюкопиранозид (6 мг, 0,02 ммоль) растворяли в смеси вода/ацетонитрил (0,7 мл, соотношение 2/5). К раствору белка добавляли раствор сахара (700

- 31 011299 мкл, 225 экв.) и помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 1 ч с помощью анализа Элмана было показано отсутствие свободного тиола, после чего реакционную смесь наносили на колонку РЭ10 8ерйабех® С25 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали и диализовали (М^СО 12-14 кДа) против воды (1 х 4 л в течение 1 ч, 2 х 2 л в течение 30 мин) с получением С1с-БСА; т/ζ (ЭР⁺) найдено 66620, вычислено 66625.

Перечень реакций гликозилирования с использованием селененилсульфидных реагентов

Реагент	Е13Н	ВосСузТЬгОМе	ЗВБ3156С	БСА
61с(Ас)488еРй	82%	75%	>95%	>95%
Са!(Ас)483еРй	82%	93%	>95%
61с(Ас)3ЫАс88еРП	93%	88%	>95%
О1с38еРп	90%	91%	>95%	>95%
6а158еРИ			>95%
ΟΙοΝΑο83θΡή	77%	77%	>95%
С1с(Ас)4О1с(Ас)3С1с(Ас)3ЗЗеР1г			90%	>95%
61сС1с61сЗЗеРН			>95%

Пример 57. Сравнение соединений формулы I с глико-МТ8 реагентами В табл. 1 и 2 МТ8 обозначает СН₃-8О₂-8-, и РТ8 обозначает Рй-8О₂-8-.

Таблица 1. Получение

Гликозилирующий реагент	Получение1
	Общий выход (%)	Стадии
С(с(Ас)4р-МТ8	46г	3
С1с(Ас)4р-РТЗ	64	3
61с(Вп)4р-МТЗ	433	5
ΘΙο(Βη)4β-ΡΤ3	67	5
Са1(Ас)4р-МТЗ	47	3
Оа!(Ас)4р-РТ8	65	3
О!с( Ас)4а( 1,4)<31с(Ас)за( 1,4)61с(Ас)3р-РТ8	60	3

Примечания:

¹ Из соответствующего исходного углевода Ό-глюкозы (С1с), Ό-галакгозы (Са1) или С1са(1,4)С1са(1,4)С1с.

² Значение взято из В.С. Иау18, Я.С. Ь1оуб апб ТВ. 1опе8, I. Огд. Сйет., 1998, 63, 9614, и В.С. Иау18, М.А.Т. Маидйап, М.Р. Сгееп, А. И11тап апб ТВ. 1опе8, ТеЕгайебгоп А8уште1гу, 2000, 11, 245.

³ Значение взято из В. С. Иау18, 8. I. \Уагб апб Р. М. Яапб1е, Сйет. Соттип., 2001, 189.

Как показано в табл. 1, глико-РТ8 реагенты согласно изобретению были синтезированы с лучшими выходами относительно соответствующих глико-МТ8 реагентов. Более того, стоимость исходных веществ для синтеза глико-РТ8 реагентов была примерно в десять раз ниже, чем для соответствующих глико-МТ8 реагентов (затраны на 2003 г.).

В табл. 2 8ВЬ-Су8156 представляет собой субтилизин из мутантного штамма ВасШи8 1еп1и8 8156С, и БСА-Су858 представляет собой бычий сывороточный альбумин.

- 32 011299

Таблица 2. Сравнение реакций гликозилирования с глико-МТ8 и глико-РТ8 реагентами

Гликозилирующий реагент	Е13Н1	Пептид2	Белок3 8В1-Суз156	Белок3 БСА-Суз58
	Выход (%)	Время (ч)	Выход (%)	Время (ч)	Выход (%)	Время (мин)	Выход (%)	Время (мин)
61с(Ас)4р-МТЗ	965	3	625	5	1004	504	-	-
СНс(Ас)4р-РТЗ	82	1	99	5	100	30	100	30
С1с(Вп)4р-МТЗ	785	15	65	4	-	-		-
С1с(Вп)4р-РТЗ	95	1,5	82	5	-	-	-	-
Оа!(Ас)4р-МТ8	83	1	-	-	-	-	-	-
(За1(Ас)4р-РТЗ	91	1	95	2	100	30	100	30
С1с(Ас)4а(1,4) С1с(Ас)3а(1,4) С!с(Ас)зр-РТЗ	93	1	74	3	100	30	-	-

Примечания:

¹ Εΐ₃Ν, ДХМ, КТ, 1 эквивалент (экв.) тиосульфоната.

² Εΐ₃Ν, ДХМ/МеОН (20:1), КТ, 1 экв. тиосульфоната;

Пептид [Р]-Сук-8ег-ОМе, [Р] = Ас, за исключением реакции с О1с(Ас)₄а(1,4)О1с(Ас)₃а(1,4)О1с(Ас)₃р-РТ8, где [Р] = Вос.

³ 70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5 или 50 мМ Трис-НС1, рН 7,7, КТ, примерно 30 экв. для глико-МТ8, примерно 10 экв. для О1с(Ас)₄р-РТ8 и Оа1(Ас)₄р-РТ8 с 8ВЬ-Сук156, примерно 20 экв. для О1с(Ас)₄в-РТ8 и Оа1(Ас)₄р-РТ8 с БСА-Сук58, примерно 40 экв. для 61с(Ас)4а(1,4)61с(Ас)₃а(1,4)61с(Ас)₃в-РТ8 с 8ВЬ-Сук156.

⁴ Значение взято из В.О. Этк, КС. Ь1оуб апб ЕВ. 1опек, 1. Отд. СБет., 1998, 63, 9614, и В.О. Отчк, М.А.Т. МаидБап, М.Р. Огееп, А. И11тап апб ЕВ. 1опек, ТетраБебгоп Акуттебу, 2000, 11, 245.

⁵ Значение взято из В. О. Этк, 8. 1. \Уагб апб Р. М. Яапб1е, СБет. Соттип., 2001, 189.

Как можно видеть из данных, приведенных в табл. 2, глико-РТ8 реагенты согласно изобретению обычно обеспечивали более высокий выход в реакции гликозилирования, чем соответствующее гликоМТ8 соединение.

Пример 58. Гликозилирование 8ВЬСук156 с помощью О1сО1сО1с-8-8еРБ при различных значениях

рн	Непрореагировавший белок В1 Суз156	Время (ч)	ЗВЬСуе-З-З-ЗеРИ	61сС1с61с- ЗВ1_Суз156
7,5 |а]	10%	1	80%	10%
8,5 м	10%	1	80%	10%
9,5 м	<5%	1	25%	75%
9,5 м	<5%	3	<5%	>95%

Условия реакции: 8ВЬСук156 инкубировали в течение 1 ч с О1сО1сО1с-8-8еРБ (20 экв.) в [а] 10 мМ Трис, рН 7,5; [Б] 70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 8,5; [с] 70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5.

Пример 59. Типичное фарнезилирование белков

8ВЬСук156 (10 мг) растворяли в водном буферном растворе (1 мл, 70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5). Добавляли РМ8Е (140 мкл раствора в ацетонитриле с концентрацией 100 мг/мл). Через 10 мин реакционную смесь концентрировали на центрифужном фильтре УКакрт (10 кДа М^СО, 8абопик); эту стадию повторяли 3 раза с добавлением 300 мкл воды М11Б О. Часть полученного дезактивированного 8ВЬСук156 (1 мг) затем растворяли в 200 мкл буфера (1 мл, 70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5). Добавляли фарнезил-фенилтиосульфонаты (56 мкл раствора в ТГФ с концентрацией 5 мг/мл, 20 эквивалентов). Смесь помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 1 ч реакционную смесь обессоливали, используя центрифужный фильтр УХакрт (4 фильтрации с добавлением воды М11Б О), и анализировали с помощью масс-спектрометрии.

Этот пример показывает, что способы согласно изобретению могут быть также использованы для присоединения фарнезильных групп к белкам. Фарнезилирование представляет собой естественную посттрансляционную модификацию, ассоциированную со многими белками.

- 33 011299

Пример б0. Пентаацетат Ό-маннозы

Маннозу (50 г, 280 ммоль) суспендировали при перемешивании в растворе уксусного ангидрида (200 мл) и пиридина (200 мл). Через 24 ч ТСХ (бензин: этилацетат, 1:1) показала образование продукта (В_г 0,3) с полным расходованием исходного вещества (В_г 0,0). Реакционную смесь разбавляли водой (400 мл) и распределяли с этилацетатом (300 мл). Фазы разделяли, и водный слой повторно экстрагировали этилацетатом (2 х 200 мл). Объединенные органические слои промывали разбавленной соляной кислотой (2 л, 1 М), гидрокарбонатом натрия (500 мл насыщенного водного раствора), рассолом (300 мл), сушили над Мд§О₄, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением целевого соединения (107,3 г, 98%) в виде масла, являющегося смесью аномеров (α/β, 2:1); 5_Н (400 мГц, СНС1₃) 1,95, 1,99, 2,05, 2,1б (15Н, 4 х 8, СОСН₃в), 1,9б, 2,00, 2,04, 2,12, 2,13 (15Н, 5 х 8, СОСН₃а), 3,78 (1Н, δ, 1₄,₅ 9,9 Гц, 1₅,_б 2,3 Гц, 1₅,_е 5,4 Гц, Н-5в), 3,99-4,03 (т, Н-5а), 4,05-4,10 (2Н, т, Н-ба, Н-όβ), 4,23 (1Н, йй, 1₅,_б 5,0 Гц, 1_б,_б 12,1 Гц, Н-ба), 4,2б (1Н, аа, 1₅,_б 5,3 Гц, 1_б,_б' 12,4 Гц, Н-б'Ь), 5,10 (1Н, йй, 1₂,₃ 3,3 Гц, 1₃,₄ 10,3 Гц, Н-ββ), 5,20-5,21 (1Н, йй, ί_1>2 2,1 Гц, 1₂,₃ 2,5 Гц, Н-2а),’ 5,24-5,30 (3Н, т, Н-3а, Н-4а, Н^), 5,43 (1Н, йй, ί_1>2 1,2 Гц, 1₂,₃ 3,2 Гц, ^2β), ’ 5,83 (1Н, й, 1ι,₂ 0,9 Гц, Н-Щ), б,03 (1Н, й, ί_1>2 2,1 Гц, Н-1а).

Пример б1. 2,3,4,б-Тетра-О-ацетил-а-О-маннопиранозоилбромид

Пентаацетат Ό-маннозы (103 г, 2б4 ммоль) растворяли в безводном ДХМ (200 мл). К этой смеси добавляли раствор бромоводорода (33% в уксусной кислоте, 200 мл). Смесь оставляли в атмосфере аргона при КТ. Через 2 ч ТСХ (бензин:этилацетат, 2:1) показала образование продукта (В_г 0,3) с полным расходованием исходного вещества (Вг 0,2). Реакционную смесь распределяли между ДХМ (100 мл) и ледяной водой (200 мл), и водный слой повторно экстрагировали ДХМ (3 х 200 мл). Объединенные органические слои промывали раствором гидрокарбоната натрия до тех пор, пока не получали рН 8, затем рассолом (300 мл), сушили над Мд§О₄, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением целевого соединения в виде прозрачного масла (10б,б г), которое использовали без дальнейшей очистки; δ_Н (400 МГц, СНС1₃) 1,9б, 2,03, 2,0б, 2,13 (12Н, 4 х 8, 4 х ОАс), 4,09 (1Н, йй, 1₅,_б 2,2 Гц, 1_б,_е 12,5 Гц, Н-б), 4,18 (1Н, йй,

1₄,₅ 10,1 Гц, 1₅,_б 2,2 Гц, 1₅,_е 4,8 Гц, Н-5), 4,28 (1Н, йй, 1₅,_б 4,9 Гц, 1_б,_б’ 12,5 Гц, Н-б'), 5,32 (1Н, а!, 1 10,1 Гц, Н-

4), 5,39 (1Н, йй, 1ι,₂ 1.б Гц, 1₂,₃ 3,5 Гц, Н-2), 5,бб (1Н, йй, 1₂,₃3,5 Гц, 1₃,₄ 10,1 Гц, Н-3), б,2б (1Н, Ь8, Н-1).

Пример б2. (2,3,4,б-Тетра-О-ацетил-а-О-маннопиранозил)-1-изотиоурония бромид

Целевое соединение (80,б г, б0%, 2 стадии) получали в виде белого твердого кристаллического вещества, используя способ, аналогичный способу, описанному в примере 3, с использованием в качестве исходного вещества 2,3,4,б-тетра-О-бензил-О-а-маннопиранозоилбромида. Т.пл. 123-12б°С [Лит. 125128°С (Н₂О)]; [а]_с ^2<3 +119,0 (с, 1,0 в МеОН) [Лит. [а]с²⁷ +103 (с, 1,0 в ацетоне); δН (400 мГц, ДМСО-й_б) 1,95, 2,02, 2,03, 2,14 (12Н, 4 х 8, 4 х ОАс), 4,08 (1Н, йй, 1₅,_б 2,4 Гц, 1_б,_б' 12,3 Гц, Н-б), 4,22 (1Н, йй, 1₅,_б' 2,4 Гц, 1б,_б 12,5 Гц, Н-б'), 4,32 (1Н, ййй, Ш 10,0 Гц, 1_б,б 2,2 Гц, 5,2 Гц, Н-5), 5,05 (1Н, йй, Ъ,₃ 3,4 Гц, 1_зл

10,0 Гц, Н-3), 5,17 (1Н, а!, 1 10,0 Гц, Н-4), 5,3б (1Н, йй, ί_1>2 1,5 Гц, 1₂,₃ 3,4 Гц, Н-2), б,3б (1Н, й, 1ι,₂ 1,2 Гц, Н-1), 9,40 (4Н, Ь8, 2 х ΝΉ₂).

- 34 011299

Пример 63. 2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-а-О-маннопиранозилтиол

Целевое соединение (14,5 г, 98%) получали в виде бесцветного масла, используя способ, аналогичный способу, описанному в примере 2, с использованием в качестве исходного вещества (2,3,4,6-тетра-Оацетил-а-Э-маннопиранозил)-1-изотиоурония бромида. [а]_с ²⁴ +68,7 (с, 1,5 в СНС13) [Лит. [а]с²⁰ +78,6 (с, 0,8 в СНС13)]; δυ (400 МГц, СНС1₃), 1,98, 2,04, 2,08, 2,14 (12Н, 4 х 5, 4 х ОАс), 2,28 (1Н, б, 6_1>8Н 6,7 Гц, 8Н), 4,10 (1Н, бб, б₅,₆ 2,4 Гц, б_6>6, 12,5 Гц, Н-6), 4,28 (1Н, бб, б₅,₆. 5,1 Гц, б₆,₆ 12,0 Гц, Н-6'), 4,32-4,36 (1Н, т, Н-

5), 5,26-5,34 (3Н, т, Н-2, Н-3, Н-4), 5,54 (1Н, б, 6_1>8Н 6,9 Гц, Н-1).

Пример 64. Фенил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-1-селененилсульфид-а-О-маннопиранозид

Целевое соединение (590 мг, 83%) получали в виде желтого масла, используя способ, аналогичный способу, описанному в Примере 49, с использованием в качестве исходного вещества 2,3,4,6-тетра-Оацетил-а-О-маннопиранозилтиола. [а]_с ²⁵ +13,4 (с, 1,0 в СНС1₃); δ_Η (400 МГц, СНС1₃) 1,94, 1,94, 2,02, 2,10 (12Н, 4 х 5, 4 х ОАс), 3,52 (1Н, бб, Ц,6 2,4 Гц, б_6>(? 12,4 Гц, Н-6), 3,94 (1Н, ббб, 64,5 9,6 Гц, Ц,6 2,5 Гц, 65,6' 3,9 Гц, Н-5), 4,07 (1Н, бб, б₅,₆ 3,9 Гц, б₆,₆ 12,4 Гц, Н-6'), 5,23 (1Н, бб, б₂,₃ 3,2 Гц, б₃,₄ 9,9 Гц, Н-3), 5,28 (1Н, а1, б

9,7 Гц, Н-4), 5,38 (1Н, б,’ б_1>2 1,6 Гц,’ Н-1), 5,40 (1Н, бб, б_1>2 1,5 Гц, б₂,₃ 3,1 Гц, Н-2), 7,26-7,28 (3Н, т, АгН), 7,62-7,65 (2Н, т, АгН).

Пример 65. 2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-а-Э-маннопиранозид

Пентаацетат Ό-маннозы (26,4 г, 67,7 ммоль) растворяли в свежеперегнанном ТГФ (150 мл), и к раствору при перемешивании добавляли бензиламин (11,1 мл, 101,5 ммоль). Через 24 ч ТСХ (бензин:этилацетат, 1:1) показала образование продукта (В£ 0,3) с полным расходованием исходного вещества (В_£ 0,5). Реакционную смесь гасили путем добавления разбавленной соляной кислоты (100 мл, 1 М) и перемешивали в течение 10 мин. Реакционную смесь распределяли с ДХМ (100 мл) и разделяли фазы. Водную фазу повторно экстрагировали ДХМ (3 х 100 мл). Объединенные органические слои промывали разбавленной соляной кислотой (100 мл, 1 М), рассолом (100 мл) и сушили (Мд§О₄) и концентрировали в вакууме. Полученное оранжевое масло очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин:этилацетат, 1:1). Желтоватые кристаллы объединяли и перекристаллизовывали из смеси бензин/этилацетат с получением целевого соединения (12,4 г, 53%) в виде белого твердого кристаллического вещества, т.пл. 92-94°С [Лит. 92°С]; [а]_с ²⁵ +17,8 (с, 1,0 в СНС13); [Лит. [а]с²⁵ +21,0 (с, 1,0 в СНС13)]; δυ (400 МГц, СНС1₃) 1,98, 2,04, 2,08, 2,14 (12Н, 4 х 5, 4 х ОАс), 4,09-4,14 (1Н, т, Н-6), 4,20-4,26 (2Н, т, Н-5, Н-6'), 4,59-5,00 (1Н, т, ОН), 5,20-5,23 (2Н, т, Н-1, Н-2), 5,27 (1Н, а1, б 9,9 Гц, Н-4), 5,39 (1Н, бб, б₂,₃ 2,7 Гц, б₃,₄ 9,6 Гц, Н-3).

Пример 66. 1',1',1'-Трихлорацетимидат-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-маннопиранозид

2,3,4,6-Тетра-О-ацетил-а-О-маннопиранозид (1,01 г, 2,87 ммоль), 1,1,1-трихлорацетонитрил (2,9 мл,

- 35 011299

28,7 ммоль) и активированные 4А молекулярные сита (примерно 500 мг) суспендировали в безводном ДХМ (20 мл) и оставляли перемешиваться при 0°С в течение 1 ч, после чего добавляли ΌΒυ (0,085 мл, 0,57 ммоль). Через 1,5 ч ТСХ (бензин:этилацетат, 1:1) показала образование продукта (К£ 0,5) с полным расходованием исходного вещества (К_£ 0,2). Реакционную смесь фильтровали через целит (Се11!е®) и концентрировали в вакууме. Полученный остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин: этилацетат, 1:1) с получением целевого соединения (1,42 г, 99%) в виде прозрачного масла; [а]_с ²⁵ +42,7 (с, 1,0 в СНС13) [Лит. [а]с²¹ +50,0 (с, 1,0 в СНС13)]; δ_Η (400 мГц, СНС1₃) 2,20, 2,07, 2,09, 2,29 (12Н, 4 х 8, 4 х ОАс), 4,15-4,22 (2Н, т, Н-5, Н-6), 4,28 (1Н, бб, 1₅,₆' 4,3 Гц, 1₆,₆ 11,8 Гц, Н-6'), 5,40-5,42 (2Н, т, Н-3, Н-4), 5,48 (1Н, а!, I 2,1 Гц, Н-2), 6,29 (1Н, б, ί_1>2 1,9 Гц, Н-1), 8,80 (1Н, 8, ЫН).

Пример 67. Бензил-а-О-маннопиранозид

Ό-Маннозу (30 г, 167 ммоль) и ацетилхлорид (13 мл, 167 ммоль) растворяли в бензиловом спирте (250 мл) и нагревали до 50°С в течение 1 ч. Полученный раствор концентрировали путем дистилляции под низким давлением. Полученный остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (этилацетат/метанол, 9:1) и перекристаллизовывали из смеси изопропанол/бензин с получением целевого соединения (29,34 г, 70%) в виде белого твердого кристаллического вещества, т.пл. 126-127°С [Лит. 128129°С; [а]_с ²⁶ +102,0 (с, 1,1 в МеОН); [Лит. [а]_о +73,1 (с, 1,4 в Н₂О)]; δ_Η (400 МГц, С1)_;О1)) 3,62 (1Н, ббб,

1₄.₅ 9,5 Гц, 1₅,₆ 2,3 Гц, 1₅,₆' 5,5 Гц, Н-5), 3,68 (1Н, а!, I 9,3 Гц, Н-4), 3,73-3,78 (2Н, т, Н-3, Н-6), 3,85-3,88 (2Н, т, Н-2, Н-6'), 4,75, 4,52 (2Н, АВ(]. I 11,6 Гц, СН₂), 4,86 (1Н, б, ί_1>2 1,8 Гц, Н-1), 7,28-7,38 (5Н, т, АгН).

Пример 68. Бензил-4,6-ди-О-пиволил-а-О-маннопиранозид

Бензил-а-О-маннопиранозид (30,0 г, 111,0 ммоль) суспендировали в безводном пиридине (200 мл) в атмосфере инертного аргона. Полученную суспензию охлаждали до 0°С и по каплям добавляли хлортрифенилметан (35 мл, 280 ммоль). После добавления хлортрифенилметана ТСХ (этилацетат) показала образование основного продукта (К_£ 0,7) с полным расходованием исходного вещества (К_£ 0,0). Реакционную смесь распределяли между водой (50 мл) и этилацетатом (100 мл). Фазы разделяли, и водную фазу повторно экстрагировали этилацетатом (3 х 50 мл). Объединенные органические слои промывали разбавленной соляной кислотой (1 л, 1 М), гидрокарбонатом натрия (800 мл насыщенного водного раствора) до тех пор, пока не получали рН 7, рассолом (200 мл), сушили (Мд§О₄) и концентрировали в вакууме. Полученный остаток перекристаллизовывали из смеси этилацетат/бензин с получением целевого соединения (27,07 г, 56%) в виде белого твердого кристаллического вещества, т.пл. 133-135°С; [а]_с ²⁵ +64,7 (с, 1,0 в СНС1₃); δ_Η (400 мГц, СНС1₃) 1,251, 1,254 (18Н, 2 х 8, 2 х С(СН₃)₃), 3,85 (1Н, а!, I 9,8 Гц, Н-4), 3,92 (1Н, ббб, 14,5 9,7 Гц, .1,.. 5,6 Гц, 2,5 Гц, Н-5), 4,05 (1Н, бб, К₂ 1,9 Гц, Ь,₃ 2,1 Гц, Н-2), 4,37 (1Н, бб, .1,·.

5,6 Гц, 1₆,₆' 11,8 Гц, Н-6), 4,42 (1Н, бб, Ι₅,_β 2,7 Гц, 1₆,₆ 12,0 Гц, Н-6'), 4,53, 4,76 (2Н, АЬц, I 11,9 Гц, СН₂), 4,90 (1Н, б, ί_1>2 1,8 Гц, Н-1), 5,14 (1Н, бб, 1₂,₃ 3,2 Гц, 1₃,₄ 9,7 Гц, Н-3), 7,33-7,36 (5Н, т, АгН).

Пример 69. Бензил-2,4-ди-О-бензил-3,6-ди-О-пиволил-а-О-маннопиранозид

Бензил-4,6-ди-О-пиволил-а-О-маннопиранозид (15,0 г, 34,2 ммоль) и бензолтрихлорацетимидат (17 мл, 91,4 ммоль) растворяли в безводном ДХМ (100 мл) и безводном циклогексане (100 мл) и оставляли перемешиваться в течение 1 ч над 4А молекулярными ситами (примерно 5 г) в атмосфере инертного аргона. Через 1 ч добавляли триметилсилилтрифлат (0,31 мл, 1,71 ммоль). Через 18 ч ТСХ (бензин: этилацетат, 5:1) показала образование основного продукта (К_£ 0,4) с полным расходованием исходного вещества (К_£ 0,0). Реакционную смесь гасили триэтиламином (примерно 30 мл), и раствор фильтровали через целит и концентрировали в вакууме. Полученный остаток очищали колоночной флэшхроматографией (бензин:этилацетат, 5:1) с получением целевого соединения (14,4 г, 70%) в виде бес

- 36 011299 цветного масла; [αβ²⁵ +29,0 (с, 2,0 в СНС1₃); δ_Η (400 мГц, СНС1₃) 1,24, 1,25 (18Н, 2 х к, 2 х С(СН₃)₃), 3,974,04 (3Н, т, Н-2, Н-4, Н-5), 4,25 (1Н, άά, 1₅,₆ 4,8 Гц, 1₅,₆ 11,6 Гц, Н-6), 4,44 (1Н, άά, 1₅,_β 1-6 Гц, 1₆,₆' 11,7 Гц, Н-6'), 4,51, 4,74 (2Н, АВд, 1 12,0 Гц, ВиСН₂), 4,55, 4,61 (2Н, АВд, 1 11,7 Гц, ВиСН₂), ’4,57,4,80 (2Н, АВд, 1

10,7 Гц, ВиСН₂), 4,92 (1Н, ά, 1_{£ 2} 1,8 Гц, Н-1), 5,37 (1Н, άά, 1₂₃ 3,1 Гц, 1₃₄ 8,8 Гц, Н-3), 7,28-7,35 (15Н, т,

Бензил-2,4-ди-О-бензил-3,6-ди-О-пиволил-α-^-маннопиранозид (8,0 г, 12,9 ммоль) и метоксид натрия (1,75 г, 32,4 ммоль) растворяли в метаноле (100 мл) и нагревали до температуры дефлегмации. Через 20 ч ТСХ (бензин/этилацетат, 2:1) показала образование основного продукта (В_£ 0,2) с полным расходованием исходного вещества (В_£ 0,8). Реакционную смесь нейтрализовали добавлением ионообменной смолы Оо^ех®-50, после чего реакционную смесь фильтровали и концентрировали в вакууме. Полученный остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин/этилацетат, 2:1) с получением целевого соединения (4,50 г, 78%) в виде прозрачного масла; [α]_Β ²⁵ +45,2 (с, 1,0 в СНС1₃); δ_Η (500 мГц, СНС1₃) 2,83 (2Н, Ьк, 2 х ОН), 3,83-3,86 (1Н, т, Н-5), 3,90-4,00 (4Н, т, Н-2), Н-4), Н-6, Н-6'), 4,21-4,28 (1Н, т, Н-3), 4,58 (1Н, ά, 1 12.1 Гц, СНН), 4,72-4,83 (4Н, т, 4 х СН₂Аг), 5,04 (1Н, ά, 1 11,1 Гц, СНН), 5,09 (1Н, Ьк, Н-1), 7,43-7,51 (15Н, т, 15 х АгН).

Пример 71. Бензил-2,4-ди-О-бензил-3,6-бис-О-(2,3,4,6-τеτра-О-ацеτил-α-^-маннопиранозид)-α-^маннопиранозид

Растворы бензил-2,4-ди-О-бензил-α-^-маннопиранозида (255 мг, 0,57 ммоль) в ДХМ (10 мл) и 1',1',1'-трихлорацетимидат-2,3,4,6-тетра-О-ацетил-α-^-маннопиранозида (1,12 г, 2,27 ммоль) в ДХМ (10 мл) через канюлю добавляли в сухой флакон, содержащий активированные 4А молекулярные сита (примерно 500 мг). Полученный раствор перемешивали в течение 1 ч, после чего добавляли бортрифторэфират (90 мкл, 0,85 ммоль). Через 16 ч ТСХ (бензин:этилацетат, 2:1) показала образование основного продукта (В_£ 0,3) с полным расходованием исходного вещества (В_£ 0,1). Реакционную смесь гасили триэтиламином (примерно 5 мл), и раствор фильтровали через целит и концентрировали в вакууме. Полученный остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин:этилацетат, 4:3) с получением целевого соединения (472 мг, 75%) в виде белого аморфного твердого вещества; [α]_Β ²⁵ +81,5 (с, 1,0 в СНС1₃); δ_Η (500 МГц, СНС1₃) 1,98, 2,02, 2,05, 2,07, 2,09, 2,10, 2,11, 2,19 (24Н, 8 х к, 8 х ОАс), 3,74-3,76 (1Н, т, Н-6а), 3,81-3,87 (3Н, т, Н-2а, Н-5а, Н-6'а), 3,92-3,97 (3Н, т, Н-4а, Н-5Ь, Н-6Ь), 4,03-4,22 (4Н, т, Н-3а, Н-5с, Н6'Ь, Н-6с), 4,27 (1Н, άά, ί_5>6 5,5 Гц, 1₆,_е 12,3 Гц, Н-6'с), 4,54, 4,75 (2Н, АЬд, 1 11,9 Гц, СН₂), 4,64, 4,81 (2Н, АЬд, 1 12,2 Гц, СН₂), 4,65, 4,91 (2Н, АЬд, 1 11,4 Гц, СН₂), 4,97 (1Н, ά, 1_£,₂ 1,7 Гц, Н-1с), 5,00 (1Н, ά, 1_£,₂ 1,6 Гц, Н-1а), 5,19 (1Η,ά, 1_£,₂ 1,7 Гц, Н-1Ь), 5,25 (1Н, а1, 1 10,0 Гц, Н-4Ь), 5,33 (1Н, а1, 1 10,1 Гц, Н-4с), 5,36 ’ (1Н, άά, 1ι,₂ 1,8 Гц, 1₂,₃ 3,3 Гц, Н-2с), 5,42 (1Н, άά, 1_£,₂ 1,5 Гц, 1₂,₃ 3,5 Гц, Н-2Ь), 5,44-5,47 (2Н, т, Н-3Ь, Н-3с), 7,32-7,42 (15Н, т, АгН).

- 37 011299

Пример 72. Ацетил-2,4-ди-О-ацетил-3,6-бис-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-маннопиранозид)-а/вΌ-маннопиранозид

Бензил-2,4-ди-О-бензил-3,6-бис-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-маннопиранозид)-а-Оманнопиранозид (100 мг, 0,09 ммоль) и катализатор Пирлмана (Реаг1тап) (Рб(ОН)₂, влажный, 35 мг) растворяли в абсолютном этаноле (5 мл). Полученный раствор дегазировали и продували газообразным водородом, затем оставляли перемешиваться в атмосфере водорода. Через 4 дня ТСХ (этилацетат) показала образование основного продукта (К_Г 0,4) с полным расходованием исходного вещества (К_Г 0,9). Раствор фильтровали через целит и концентрировали в вакууме. Полученный остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (этилацетат) с получением промежуточного соединения 3,6-бис-(2,3,4,6-тетра-Оацетил-а-О-маннопиранозид)-а/в-О-маннопиранозида (74 мг, 98%) в виде белого аморфного твердого вещества; т/ζ МСВР (ЭР⁺) Вычислено для С34Н48О34Иа (МЫа⁺) 863,2433. Найдено 863,2440. Это промежуточное соединение (74 мг, 0,088 ммоль) снова суспендировали в уксусном ангидриде (5 мл) и пиридине (5 мл). Через 24 ч ТСХ (бензин:этилацетат, 2:3) показала образование продукта (КГ 0,4) с полным расходованием исходного вещества (К_Г 0,0). Реакционную смесь разбавляли водой (20 мл) и распределяли с этилацетатом (20 мл), и фазы разделяли. Водный слой повторно экстрагировали этилацетатом (2 х 20 мл). Объединенные органические слои промывали разбавленной соляной кислотой (500 мл, 1 М), гидрокарбонатом натрия (50 мл насыщенного водного раствора), рассолом (30 мл), сушили над МдЗО₄, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением целевого соединения (83 мг, 98%) в виде аморфной пены, являющейся смесью аномеров (α/β, 5:1); 5_Н (500 мГц, СНС1₃) для α-соединения, 2,00, 2,02, 2,08, 2,12, 2,17, 2,18, 2,19, 2,26 (33Н, 8 х 8, 11 х ОАс), 3,59 (1Н, бб, 1₅,₆ 3,0 Гц, б_6>6. 11,1 Гц, Н-6а), 3,76 (1Н, бб,

1₅,₆ 5,2 Гц, б_6>6 11,2 Гц, Н-6'а), 3,92 (1Н, ббб, 1₄,₅ 10,2 Гц, 1₅,₆ 3,0 Гц, 1₅,₆ 5,2 Гц, Н-5а), 4,04-4,16 (4Н, т, Н5Ь, Н-5с, Н-6Ь, Н-6с), 4,21 (1Н, бб, 1₂,₃ 3,4 Гц,’ 1₃,₄ 9,9 Гц, Н-3а), 4,28 (1Н, бб, б_5>6 5,5 Гц, 1₆,₆ 12,2 Гц, Н6'Ь/с), 4,31 (1Н, бб, б_5>6. 4,7 Гц, 1₆,₆ 12,3 Гц, Н-6'Ь/с), 4,81 (1Н, б, б_1>2 1,5 Гц, Н-1с), 5,06-5,07 (2Н, т, Н-1Ь, Н-?), 5,20-5,35 (8Н, т, Н-2а, Н-2Ь, Н-2с, Н-3Ь, Н-3с, Н-4а, Н-4Ь, Н-4с), 6,07 (1Н, б, б_1>2 1,8 Гц, Н-1а). Для β-соединения выбрали только данные: 3,64 (1Н, бб, 1₅₆ 3,7 Гц, б₆₆. 10,8 Гц, Н-6а), 3,69-3,73 (1Н, т, Н-5а), 3,76 (1Н, бб, б_5(? 5,2 Гц, 1_6(? 11,2 Гц, Н-6'а), 4,01 (1Н, бб, 1₂₃ 3,2 Гц, 1₃₄ 9,7 Гц, Н-3а), 5,50 (1Н, бб, б₁₂ 0,9 Гц, 12,3 3,2 Гц, Н-2а), 5,83 (1Н, б, 11,2 0,9 Гц, Н-1а).

Пример 73. 2,4-Ди-О-ацетил-бис-О-(2,3,6-три-О-ацетил-а-О-маннопиранозил)-а-Оманнопиранозилбромид

Ацетил-2,4-ди-О-ацетил-3,6-бис-О-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-маннопиранозид)-а/в-О-маннопиранозид (87 мг, 0,09 ммоль) растворяли в безводном ДХМ (5 мл). К этой смеси добавляли раствор бромоводорода (33% в уксусной кислоте, 1 мл). Смесь перемешивали в атмосфере аргона при КТ. Через 2 ч ТСХ (бензин: этилацетат, 1:4) показала образование продукта (К_Г 0,6) с полным расходованием исходного вещества (К_Г 0,4). Реакционную смесь распределяли между ДХМ (10 мл) и водой (10 мл), и водный слой повторно экстрагировали ДХМ (3 х 10 мл). Объединенные органические слои промывали гидрокарбона

- 38 011299 том натрия (20 мл насыщенного водного раствора) до тех пор, пока не получали рН 8, рассолом (20 мл), сушили над Мд8О₄, фильтровали и концентрировали в вакууме с получением целевого соединения (80 мг, 90%) в виде белой пены, которую использовали без дальнейшей очистки; 5_Н (400 мГц, СНС1₃) 1,97, 1,99, 2,05, 2,06, 2,10, 2,12, 2,17, 2,24 (30Н, 9 х 8, 10 х ОАс), 3,60 (1Н, бб, 1₅,₆ 3,0 Гц, 1₆,₆ 11,4 Гц, Н-6а), 3,77 (1Н, бб, 1_5(? 4,5 Гц, 1₆₆ 11,4 Гц, Н-6'а), 4,02-4,09 (5Н, т, Н-5а, Н-5Ь, Н-5с, Н-6Ь, Н-6с), 4,24 (1Н, бб, 1_5(? 6,8 Гц, 1₆,₆ 12,2 Гц, Н-6'), 4,29 (1Н, бб, 1_5>6 5,0 Гц, 1₆,_е 12,6 Гц, Н-6'), 4,62 (1Н, бб, 1₂,₃ 3,4 Гц, 1₃,₄ 10,0 Гц, Н-3а), 4,79 (1Н, Ь8, Н-1с), 5,02-5,04 (2Н, т, Н-1Ь, Н-3Ь), 5,17-5,30 (5Н, т, Н-2Ь, Н-2с, Н-3с, Н-4Ь,’ Н-4с), 5,39 (1Н, а!, 1 10,1 Гц, Н-4а), 5,43 (1Н, бб, 1_£,2 1,5 Гц, Ь,₃ 3,2 Гц, Н-2а), 6,34 (1Н, Ь8, Н-1а).

Пример 74. 1-Тио-2,4-тетра-О-ацетил-3,6-О-бис-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-маннопиранозил)-а-Оманнопираноза

2,4-Тетра-О-ацетил-3,6-О-бис-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-маннопиранозил)-а-О-маннопиранозилбромид (850 мг, 0,85 ммоль) растворяли в безводном ацетоне (20 мл). Добавляли безводную тиомочевину (115 мг, 1,56 ммоль), и смесь нагревали до температуры дефлегмации в атмосфере аргона. Через 18 ч ТСХ (бензин: этил ацетат, 1:3) показала образование продукта (Κ_£ 0,0) с полным расходованием исходного вещества (Κ_£ 0,4). Реакционную смесь концентрировали в вакууме, и полученный остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (этилацетат/метанол, 9:1) с получением промежуточного соединения 2,4-тетра-О-ацетил-3,6-О-бис-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-маннопиранозил)-а-О-маннопиранозил-1изотиоурония бромида (550 мг, 60%), которое использовали далее. Это промежуточное соединение (550 мг, 0,51 ммоль) и №1₂8₂О₅ (122 мг, 0,62 ммоль) при перемешивании добавляли к смеси ДХМ (20 мл) и воды (10 мл). Смесь нагревали до температуры дефлегмации в атмосфере аргона. Через 2,5 ч ТСХ (бензин: этилацетат, 1:3) показала образование продукта (Κ_£ 0,3) с полным расходованием исходного вещества (Κ_£ 0,0), после чего реакционную смесь охлаждали до КТ и разделяли фазы. Водный слой повторно экстрагировали ДХМ (2 х 20 мл). Объединенные органические слои промывали гидрокарбонатом натрия (20 мл насыщенного водного раствора), рассолом (20 мл), сушили (Мд8О₄), фильтровали, и растворитель удаляли в вакууме. Полученный остаток очищали колоночной флэш-хроматографией (бензин:этилацетат, 1:3) с получением целевого соединения (350 мг, 73%) в виде белого аморфного твердого вещества; [а]_с ²³ +58,1 (с, 1,2 в СНС1₃); 5_Н (500 мГц, С₆О₆) 1,74, 1,75, 1,78, 1,82, 1,91, 2,03, 2,06, 2,26 (24Н, 8 х 8, 10 х Оас), 2,07 (1Н, Ь8, 8Н), 3,65 (1Н, бб, .1,·. 3,2 Гц, 1_6>(? 11,0 Гц, Н-6а), 3,93 (1Н, бб, 1₃,_е 5,3 Гц, 16,6' 11,1 Гц, Н-6'а), 4,31-4,38 (4Н, т, Н-3а, Н-5а, Н-5Ь/с, Н-6), 4,43-4,45 (1Н, т, Н-6), 4,51 (1Н, бб, 1₅,_е 5,6 Гц, 1₆,_в 12,6 Гц, Н-6'), 4,56-4,60 (2Н, т, Н-5Ь/с, Н-6'), 4,91 (1Н, б, 1_1>2 1,5 Гц, Н-1с), 5,20 (1Н, б, 1_1>2 1,8 Гц, Н1Ь), 5,43 (1Н, бб, 1ι,₂ 1,8 Гц, 1₂,₃ 3,1 Гц, Н-2Ь), 5,45 (1Н, Ь8, Н-1),’ 5,65 (1Н, бб, 1_1>2 1,5 Гц, 1₂,₃ 3,1 Гц, Н-2а), 5,70-5,82 (5Н, т, Н-2с, Н-3Ь, Н-4а, Н-4Ь, Н-4с), 5,85 (1Н, бб, 1₂,₃ 3,2 Гц, 1₃,₄ 10,2 Гц, Н-3с).

Пример 75. Типичные способы гликозилирования белка 8ВЬСу8156 с использованием Мап(1-

6)Мап(1-3)Мап8Н

1-Тио-2,4-тетра-О-ацетил-3,6-О-бис-(2,3,4,6-тетра-О-ацетил-а-О-маннопиранозил)-а-О-маннопиранозу (20 мг, 0,02 ммоль) и метоксид натрия (2 мг, 0,02 ммоль) при перемешивании добавляли к раствору метанола (5 мл). Через 12 ч ТСХ (бензин:этилацетат, 1:2) показала образование продукта (Κ_£ 0,0) с полным расходованием исходного вещества (Κ_£ 0,2). Реакционнуюю смесь нейтрализовали добавлением ионообменной смолы Оо\уех®-50. после чего реакционную смесь фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный сахарный тиол выливали в воду (5 мл), 38 мкл полученного раствора добавляли к водному буферному раствору (500 мкл, 70 мМ СНЕ8, 5 мМ МЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 9,5), содержащему 8ВЬ156Су88еР11 (1 мг). Полученный раствор помещали на ротатор для вертикального перемешивания. Через 1 ч реакционную смесь наносили на колонку ΡΌ10 8ер11абех® 625 и элюировали 70 мМ НЕРЕ8, 2 мМ СаС1₂, рН 7,0. Белковую фракцию собирали с получением Мап(Мап)Мап-8-8ВЬСу8156; т/ζ (ЭР⁺) найдено 27878, вычислено 27881.

- 39 011299

Claims (27)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения соединения, содержащего дисульфидную связь, включающий взаимодействие аминокислоты, пептида или белка, содержащего по меньшей мере одну тиоловую группу, с соединением формулы I

   К—8—Х-К¹ | где

   X означает 8О₂ или 8е;

   В означает углеводную группу или фарнезил и

   В¹ означает факультативно замещенную С₁-С₁₀ алкильную группу, факультативно замещенную фенильную группу, или факультативно замещенную пиридильную группу, где факультативные заместители выбраны из -ИО₂, -8О₃Н, -СО₂Н, -(СН₂СН₂О)_пН и -(СН₂СН₂О)_пМе, где п имеет значение от 1 до 100;

   при условии, что когда X означает 8О₂, тогда В¹ не является факультативно замещенным С₁-С₁₀ алкилом.
2. 2. Способ химической модификации белка, пептида или аминокислоты, содержащих по меньшей мере одну тиоловую группу, включающий взаимодействие указанного белка, пептида или аминокислоты с соединением формулы I

   К—8—X—К¹ ΐ где

   X означает 8О₂ или 8е;

   В означает углеводную группу или фарнезил и

   В¹ означает факультативно замещенную С₁-С₁₀ алкильную группу, факультативно замещенную фенильную группу или факультативно замещенную пиридильную группу, где факультативные заместители выбраны из -иО₂, -8О₃Н, -СО₂Н, -(СН₂СН₂О)_пН и -(СН₂СН₂О)_пМе, где п имеет значение от 1 до 100;

   при условии, что когда X означает 8О₂, тогда В¹ не является факультативно замещенным С₁-С₁₀ алкилом.
3. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что В представляет собой олигосахарид.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что В¹ представляет собой фенил.
5. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что X представляет собой 8е.
6. 6. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что X представляет собой 8О₂.
7. 7. Соединение формулы I где

   X означает 8О₂ или 8е;

   В означает углеводную группировку или фарнезил и

   В¹ означает факультативно замещенную С₁-С₁₀ алкильную группу, факультативно замещенную фенильную группу или факультативно замещенную пиридильную группу, где факультативные заместители выбраны из -иО₂, -8О₃Н, -СО₂Н, -(СН₂СН₂О)_пН и -(СН₂СН₂О)_пМе, где п имеет значение от 1 до 100;

   при условиях, что когда X означает 8О₂, тогда В¹ не является факультативно замещенным С₁-С₁₀ алкилом, и соединение не является фенилселененил 2-О-ацетил-3,4,6-три-О-бензил-1-тио-а-Оманнопиранозидом.
8. 8. Соединение по п.7, отличающееся тем, что В¹ представляет собой фенил.
9. 9. Соединение по п.7 или 8, отличающееся тем, что В представляет собой олигосахарид.
10. 10. Соединение по любому из пп.7-9, отличающееся тем, что X представляет собой 8е.
11. 11. Соединение по любому из пп.7-9, отличающееся тем, что X представляет собой 8О₂.
12. 12. Способ получения соединения формулы I, как оно определено в п.11, включающий взаимодействие соединения формулы II

    М(38О_гР¹)_к II где М означает металл, например Ы, Иа, К, Са, С8, 2п, Мд или А1; и к равно 1, 2 или 3; с соединением формулы III

    К-Ь ш где Ь означает уходящую группу.
13. 13. Способ получения соединения формулы I, как оно определено в п.11, включающий взаимодействие дисульфидного соединения формулы VIII

    К— 8—8— К

    VIII с сульфинит-анионом формулы В¹8О2^- в присутствии ионов серебра.
14. 14. Способ получения соединения формулы I, как оно определено в п.10, включающий взаимодей

    - 40 011299 ствие соединения формулы V

    Я—8Н _ν с соединением формулы VI;·! или ν!ό

    Р¹ЗеБ² К¹8е(ОН)_г

    У1а У1Ь где Ь² означает Вг, С1, СЫ или I.
15. 15. Применение соединения формулы I, как оно определено в любом из пп.1-6, для образования дисульфидной связи.
16. 16. Применение соединения формулы I, как оно определено в любом из пп.1-6, для модификации белка, пептида или аминокислоты, содержащих по меньшей мере одну тиоловую группу.
17. 17. Применение соединения формулы I, как оно определено в любом из пп.7-11, для гликозилирования белка, пептида или аминокислоты, содержащих по меньшей мере одну тиоловую группу.
18. 18. Способ химической модификации белка, пептида или аминокислоты, содержащих по меньшей мере одну тиоловую группу, включающий превращение указанной тиоловой группы в селененилсульфидную группу.
19. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что превращение осуществляют путем взаимодействия белка, пептида или аминокислоты, содержащих по меньшей мере одну тиоловую группу, с соединением формулы Ха или ХЬ:

    Р²3е1_² Р²Зе(ОН)₂

    Ха ХЬ где

    Ь² означает уходящую группу; и

    Я² означает факультативно замещенную С1-С10 алкильную группу, факультативно замещенную фенильную группу, факультативно замещенную пиридильную группу, или Я² образует часть твердой подложки или присоединена к ней, где факультативные заместители выбраны из -ЫО2, -8О₃Н, -СО₂Н, -(СН₂СН₂О)_ПН и -(СН₂СН₂О)_пМе, где η имеет значение от 1 до 100.
20. 20. Способ по п.19, отличающийся тем, что Я² представляет собой фенил.
21. 21. Способ по п.19, отличающийся тем, что соединение формулы Ха представляет собой Р118еВг.
22. 22. Способ по любому из пп.18-21, отличающийся тем, что он дополнительно включает взаимодействие селененилсульфидной группы белка, пептида или аминокислоты с органическим соединением, содержащим тиоловую группу, отличающийся тем, что органическое соединение представляет собой углеводное соединение, белок, пептид или аминокислоту.
23. 23. Способ химической модификации белка, пептида или аминокислоты, содержащих по меньшей мере одну селененилсульфидную группу, включающий взаимодействие белка, пептида или аминокислоты с органическим соединением, содержащим тиоловую группу, отличающийся тем, что органическое соединение представляет собой углеводное соединение, белок, пептид или аминокислоту.
24. 24. Белок, пептид или аминокислота, содержащие по меньшей мере одну селененилсульфидную группу, где селененилсульфидная группа представляет собой группу формулы

    -З-Зе-Я², где Я² означает факультативно замещенную С₁-С₁₀ алкильную группу, факультативно замещенную фенильную группу или факультативно замещенную пиридильную группу, где факультативные заместители выбраны из -ыО₂, -8О₃Н, -СО₂Н, -(СН₂СН₂О)_пН и -(СН₂СН₂О)_пМе, где η имеет значение от 1 до 100.
25. 25. Белок, пептид или аминокислота, содержащие по меньшей мере одну селененилсульфидную группу, полученную способом, как он определен в любом из пп.18-21.
26. 26. Белок, пептид или аминокислота, содержащие по меньшей мере одну дисульфидную связь, полученную способом, как он определен в п.22 или 23.
27. 27. Применение белка или пептида, как они определены в п.25 или 26, в определении белковой структуры методами рентгеновской дифракции.