EA013265B1

EA013265B1 - Гликозилирование белков

Info

Publication number: EA013265B1
Application number: EA200702193A
Authority: EA
Inventors: Бенджамин Гай Дэвис
Original assignee: Исис Инновейшн Лимитед
Priority date: 2005-04-08
Filing date: 2006-04-06
Publication date: 2010-04-30
Also published as: EP1871784A2; IL186500A0; US20110059501A1; ZA200709105B; MX2007012544A; CN101198619A; AU2006232642A1; BRPI0609088A2; GB0507123D0; WO2006106348A2; CA2603936A1; KR20080007575A; EA200702193A1; WO2006106348A3; JP2008534665A; NZ562996A

Abstract

Настоящее изобретение относится к способам гликозилирования белка, в соответствии с которыми белок модифицируют для включения в него алкиновой и/или азидной групп. Настоящее изобретение также относится к белку, гликозилированному в соответствии с указанными способами.

Description

Настоящее изобретение также основано на сайт-специфичном введении метки, такой как алкиновая, азидная или тиоловая группа, в боковую цепь аминокислоты, в заданном положении аминокислотной последовательности белка (как было описано выше), после чего осуществляют реакции последовательного и ортогонального гликозилирования, которые являются специфичными для каждой соответствующей метки. Таким путем может быть достигнуто дифференциальное многосайтовое химическое гликозилирование белка.

Таким образом, второй аспект настоящего изобретения относится к способу гликозилирования белка, где указанный способ включает стадии:

ί) модификации белка согласно способу первого аспекта настоящего изобретения; и ίί) взаимодействия модифицированного белка по пункту (ί) с

a) углеводным фрагментом, модифицированным для введения в него азидной группы; и/или

b) углеводным фрагментом, модифицированным для введения в него алкиновой группы в присутствии Οι.ι(Ι) катализатора.

Термин гликозилирование в контексте настоящего описания относится к общему способу присоединения гликозильной единицы к другому фрагменту посредством ковалентной связи.

В типичном случае, если белок модифицируют на стадии (ί) путем введения в него алкиновой группы, то реакцию на стадии (ίί) проводят с углеводным фрагментом согласно пункту (а) . Тогда как, если белок модифицируют на стадии (ί) путем введения в него азидной группы, реакцию на стадии (ίί) проводят с углеводным фрагментом согласно пункту (Ь).

Предпочтительно, согласно настоящему изобретению, модификация белка (стадия ί) дополнительно включает стадию модификации белка, как определено здесь, для введения в него тиоловой группы, например, с помощью инсерции цистеинового остатка.

В предпочтительном аспекте настоящее изобретение относится к способу гликозилирования белка, где указанный способ включает стадии:

ί) (а) модификации белка для включения в него алкиновой и/или азидной группы; и (Ь) до или после модификации согласно пункту (а), необязательной модификации белка для включения в него тиоловой группы; и ίί) последующей реакции белка, модифицированного согласно (ί), углеводным фрагментом (с) в присутствии СиД) катализатора, до или после реакции с тиол-селективным углеводным реагентом (ά),

c) с углеводным фрагментом, модифицированным путем введения в него азидной группы; и/или алкиновой группы; и

ά) с тиол-селективным углеводным реагентом.

Стадии (ί) (а) и (Ь) являются такими, как описаны в настоящем тексте. В том случае, когда белок подвергают модификации, с тем чтобы модифицированный белок содержал цистеиновый остаток, модификация белка, направленная на введение тиоловой группы, не является обязательной.

Альтернативно, может быть желательно включить одну или несколько тиоловых групп, в дополнение к уже имеющимся в белке.

Тиол-селективный углеводный реагент может включать любой реагент, который взаимодействует с

- 3 013265 тиоловой группой в белке, что позволяет ввести гликозильный остаток, присоединенный к белку через дисульфидную связь. Тиол-селективный углеводный реагент может включать, без ограничения, гликоалкантиосульфонатный реагент, например, гликометантиосульфонатный реагент (глико-МТС) (см. документ XVО 00/01712, содержание которого включено в настоящее описание полностью), гликоселенилсульфидные реагенты (см. документ νθ 2005/000862, содержание которого включено в настоящее описание полностью) и гликотиосульфонатные реагенты (см. документ νθ 2005/0008 62, содержание которого включено в настоящее описание полностью). Гликометантиосульфонатные реагенты представляют собой фрагмент формулы СН₃-8О₂-8-углевод.

Гликотиосульфонатные и гликоселенилсульфидные (8е8) реагенты описываются в основном формулой I, в соответствии с ν02005/000862 (где указанный документ включен в настоящее описание посредством ссылки). Конкретно, гликоселенилсульфидные (8е8) реагенты описываются формулой К-8-Хуглеводный фрагмент, где X обозначает 8е, и К обозначает необязательно замещенную С1-10 алкильную, фенильную, пиридильную или нафтильную группу. Гликотиосульфонатные реагенты описываются формулой К-8-Х-углеводный фрагмент, где X обозначает 8О₂, и К обозначает необязательно замещенную фенильную, пиридильную или нафтильную группу. Такие реагенты обеспечивают сайт-селективное присоединение углевода к белку через дисульфидную связь.

Предпочтительно, подлежащие модификации углеводы включают моносахариды, дисахариды, трисахариды, тетрасахариды, олигосахариды и другие полисахариды, а также включают любой углеводный фрагмент, который присутствует в природных гликопротеинах или в биологических системах. В их число включаются гликозильные или гликозидные производные, например глюкозильные, глюкозидные, галактозильные или галактозидные производные. Гликозильные и гликозидные группы включают как α, так и β группы. Подходящие углеводные фрагменты включают глюкозу, галактозу, фукозу, ΟΙοΝΛο. Са1ΝΆε, сиаловую кислоту и маннозу, и полисахариды, включающие по меньшей мере один из остатков глюкозы, галактозы, фукозы, ΟΙεΝΑε, ΟαΙΝΑο, сиаловой кислоты и/или маннозы.

Углеводные фрагменты включают 01ο(Αο)₄β-, Ο1ε(Βη)₄β-, Са1(Ас)₄в-, Ο1ε(Βη)₄β-, С1с(Ас)₄а(1,4)С1с (Αε)₃α(1,4)61ε(Αε)₄β-, β-СК, β-Са! α-Мап, а-Мап(Ас)₄, Мап(1,6)Мапа-, Мап(1-6)Мап(1-3)Мапа-, (Ас)₄Мап(1-6)(Ас)₄Мап(1-3)(Ас)₂Мапа-, -Εί-β-Са1, -Εΐ-β^Κ, Е1-а-С1с, -Εΐ-α-Мап, -Εΐ-Ьас, -β^1ε(Αο)₂, -βС1с(Ас)з, -Е1-а-С1с(Ас)2, -Е1-а-С1с(Ас)з, -Е1-а-С1с(Ас)4, -Εί-β-С1с(Αс)2, -Εί-β-С1с(Αс)з, -Εί-β-С1с(Αс)4, -Е1а-Мап(Ас)₃, -Е1-а-Мап(Ас)₄, -Εί-β-Са1(Αс)₃, -Εί-β-Са1(Αс)₄, -Е1-Ьас(Ас)₅, -Е1-Ьас(Ас)₆, -Е1-Ьас(Ас)₇ и их эквиваленты без защитных групп.

Любые сахаридные единицы в составе углеводного фрагмента, получаемые из природных сахаров, могут иметь природную энантиомерную форму, которая может представлять собой либо Ό-форму (например, Ό-глюкозу или Ό-галактозу), либо Ь-форму (например, Ь-рамнозу или Ь-фукозу). Любые аномерные связи могут быть представлены α- или β-связями.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения углеводы, модифицируемые с целью включения в них азидной группы, представляют собой гликозилазиды.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения углеводы, модифицируемые с целью включения в них алкиновой группы, представляют собой алкинилгликозиды.

Предпочтительно, углеводные фрагменты, модифицированные азидной и/или алкиновой группой/ами (например, гликозилазид и/или алкинигликозид) не включают защитную группу, то есть они не защищены. Незащищенные азид- или алкинмодифицированные углеводные фрагменты могут быть получены путем присоединения азидной или алкиновой группы к защищенному сахару. Защитные группы, подходящие для экранирования -ОН групп в углеводном фрагменте, включают ацетат (Ас), бензил (Вп), силил (например, трет-бутилдиметилсилил (ТВЭМ81) и трет-бутилдифенилсилил (ТМЭР81)), ацетали, кетали и метоксиметил (МОМ). Позже защитную группу удаляют, до или после присоединения углеводного фрагмента к белку. В рамках такого способа проводят реакцию, определенную как реакция на стадии (й), с незащищенным гликозидом.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения Си(1) катализатор представляет собой СиВг или Си1. Предпочтительно, катализатором является СиВг. Си(1) катализатор может быть получен при использовании Си(11) соли (например, Си(П)8О₄) в реакции, которая приводит к восстановлению до Си(1) при добавлении восстановителя (например, аскорбата, гидроксиламина, сульфита натрия или элементарной меди) ш §йи в реакционную смесь. Предпочтительно Си(1) катализатор получают путем непосредственного добавления Си(1)Вг к реакционной смеси. Предпочтительно получают Си(1)Вг с высокой степенью чистоты, например, с чистотой, равной по меньшей мере 99%, такой как 99,999%. Предпочтительно Си(1) (например, Си(1)Вг) получают в растворителе, в присутствии стабилизирующего лиганда, например, азотистого основания. Указанный лиганд стабилизирует Си(1) в реакционной смеси; в его отсутствие происходит быстрое окисление до Си(11), Предпочтительно, указанный лиганд представляет собой тристриазолиламинный лиганд (\νοπηη1ά апй Э^ек, 8йис1иге, 7, К155-К160 (1999)). Растворитель для данного катализатора имеет рН в диапазоне 7,2-8,2. Растворитель может представлять собой смешиваемый с водой растворитель (например, трет-ВиОН) или водный буфер, такой как фосфатный буфер. Предпочтительно растворителем является ацетонитрил.

- 4 013265

Реакция на стадии (ίί) представляет собой реакцию циклоприсоединения по типу [3+2] между алкиновой группой (на белке и/или на гликозиде) и азидной группой (на белке и/или на гликозиде) с образованием замещенных 1,2,3-триазолов (Ншдкеп, Ргос. Сйсш. 8ос. 356-369 (1961)), которые содержат связь между белком и одним или несколькими сахарами.

Другой аспект настоящего изобретения относится к белку, модифицированному по способу первого или второго аспекта настоящего изобретения.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к белку формулы (I), (II) или (III)

где а и Ь обозначают целые числа от 0 до 5 (например, 0, 1, 2, 3, 4 или 5): р и μ обозначают целые числа от 1 до 5 (например, 1, 2, 3, 4 или 5); и где указанный белок соответствует приведенному в настоящем описании определению.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к гликозилированному белку, модифицированному по способу согласно второму аспекту настоящего изобретения.

Настоящее изобретение также относится к гликозилированному белку формулы (IV)

где ΐ обозначает целое число от 1 до 5 (например, 1, 2, 3, 4 или 5); и спейсер, который может отсутствовать, представляет собой алифатический фрагмент, содержащий от 1 до 8 атомов С.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения спейсер представляет собой замещенную или незамеченную С1_-6алкильную группу. Предпочтительно спейсер отсутствует или представляет собой метил или этил.

В другом предпочтительном аспекте настоящего изобретения спейсер представляет собой гетероалкил, в котором гетероатом представлен О, N или 8, и алкил представлен метилом или этилом. Предпочтительно гетероалкильная группа имеет формулу СН₂(Х)_У, где X обозначает О, N или 8, и Υ обозначает 0 или 1. В типичном случае гетероатом непосредственно связан с углеводным фрагментом.

Заместитель представляет собой галоген или фрагмент, содержащий от 1 до 30 поливалентных атомов, выбранных из С, Ν, О, 8 и 81, а также моновалентных атомов, выбранных из Н и галогена. В одном классе рассматриваемых соединений заместитель, если он присутствует, например, выбран из галогена и фрагментов, содержащих 1, 2, 3, 4 или 5 поливалентных атомов, а также моновалентные атомы, выбранные из водорода и галогена. Поливалентные атомы могут быть, например, выбраны из С, Ν, О, 8, и В и могут, например, представлять собой С, Ν, 8 и О.

Термин замещенный, используемый в тексте настоящего описания применительно к фрагменту или группе, обозначает, что один или несколько атомов водорода в соответствующем фрагменте, в частности 1, 2 или 3 атома водорода, замещены, независимо друг от друга, соответствующим числом описанных заместителей.

Следует также понимать, что заместители находятся только в тех положениях, которые являются химически возможными, и специалист в данной области способен определить (экспериментально или теоретически), без дополнительных усилий, какое из конкретных замещений является возможным. На

- 5 013265 пример, аминогруппы или гидроксильные группы со свободным водородом могут быть нестабильными, если они связываются с атомами углерода ненасыщенными (например, олефиновыми) связями. Кроме того, следует также понимать, что приведенные в описании заместители сами могут быть замещены любым заместителем, и такое замещение также ограничивается определенными рамками возможности их осуществления, как это известно специалистам в данной области.

Замещенный алкил может представлять собой, например, алкил, определенный выше, который, в свою очередь, также замещен одним или несколькими заместителями, где указанные заместители, которые могут быть одинаковыми или разными, выбирают из гидроксигруппы, этерифицированного гидроксила, галогена (например фтора), гидроксиалкила (например, 2-гидроксиэтила), галогеналкила (например, трифторметила или 2,2,2-трифторэтила), аминогруппы, замещенной аминогруппы (например, Νалкиламино, Ν,Ν-диалкиламино или Ν-алканоиламино), алкоксикарбонила, фенилалкоксикарбонила, амидино, гуанидино, гидроксигуанидино, формамидино, изотиоуреидо, уреидогруппы, меркаптогруппы, ацила, ацилокси, такого как, например, этерифицированная карбоксигруппа, карбоксигруппы, сульфогруппы, сульфамоила, карбамоила, цианогруппы, азогруппы, нитрогруппы и т. п.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения гликозилированный белок имеет формулу (V)

где р и с.| обозначают целые числа от 0 до 5 (например, 0, 1, 2, 3, 4 или 5); и ΐ обозначает целое число от 1 до 5 (например, 1, 2, 3, 4 или 5); и где белок и углеводный фрагмент соответствуют приведенному в настоящем описании определению.

Белок или углеводный фрагмент могут быть присоединены к 1,2,3-триазолу в положении 1 или 2, как показано ниже в формулах (VI) и (VII). Таким образом, гикозилированный белок согласно настоящему изобретению может иметь формулу (VI) или (VII)

где белок, углеводный фрагмент, р, с.| и ΐ соответствуют приведенному в настоящем описании определению.

Предпочтительно р равно 2.

Предпочтительно с.| равно 0.

Настоящее изобретение также относится к гликозилированному белку формулы (VIII)

где и обозначает целое число от 1 до 5 (например, 1, 2, 3, 4 или 5); спейсер и ΐ соответствуют приведенному в настоящем описании определению, и и Ζ представляют собой углеводные фрагменты, которые могут быть одинаковыми или разными.

Предпочтительно, гликозилированный белок имеет формулу (IX)

		^^БелоГ^,	η
Углеводный фрагмент Ζ	1,2,3-триазол	, , I Углеводный I фрагментΙΛΙ I
		и

¹ (IX) где спейсер, р, с.|. ΐ и и соответствуют приведенному в настоящем описании определению; и где г и 5 обозначает целые числа от 0 до 5 (например, 0, 1, 2, 3, 4 или 5).

Предпочтительно, гликозилированный белок имеет формулу (X) или (XI)

- 6 013265

где белок, углеводный фрагмент, спейсер, р, μ, г, к, ΐ и и соответствуют приведенному в настоящем описании определению.

Гликозилированные белки согласно настоящему изобретению в типичном случае сохраняют присущую им функцию, а некоторые белки могут демонстрировать даже усиление данной функции, например повышенную ферментативную активность (относительно негликозилированного фермента) после гликозилирования в соответствии с настоящим изобретением. Гликозилированные белки согласно настоящему изобретению могут также демонстрировать дополнительные связывающие способности по типу белок-белок с другими белками, например способность связываться с лектином. Таким образом, способ согласно настоящему изобретению полезен с точки зрения возможности манипулировать белковыми функциями, например, с целью включения в белок дополнительной, не свойственной ему функциональной способности, такой как способность к связыванию по типу белок-белок с другими белками, например с лектинами.

Гликозилированные белки согласно настоящему изобретению могут использоваться в медицине, например, при лечении или с целью профилактики заболевания или патологического состояния. Таким образом, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей рассматриваемый в нем гликозилированный белок в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Белки согласно настоящему изобретению могут быть полезны, например, при лечении анемии или болезни Гоше.

В тексте всего описания и в формуле изобретения слова включает и содержит, а также различные вариации данных слов, например, включающий, следует трактовать как включающие, но не ограничивающиеся и их не следует понимать как исключающие какие-либо другие фрагменты, добавки, компоненты, целые числа или стадии.

В тексте всего описания изобретения и в формуле изобретения единственное число относится равным образом к множественному числу, если из контекста явно не следует иное. В частности, в случае использования неопределенного артикля следует понимать, что данная фраза относится также к множественному числу, если из контекста явно не следует иное.

Признаки, целые числа, характеристики, соединения, химические фрагменты или группы, описанные в сочетании с конкретным аспектом, вариантом или примером согласно настоящему изобретению, следует понимать как применимые к любому другому аспекту, варианту или примеру, описанному здесь, если указанные характеристики не являются несовместимыми с ними.

Ниже настоящее изобретение описывается со ссылкой на следующие не ограничивающие его примеры.

Примеры

Множественный сайт-направленный мутагенез

Получают ряд мутантов β-галактозидазы δκβΟ с использованием набора для множественного сайтнаправленного мутагенеза (Ошк-Сйапде МиШ 8йе-П1тес1еб Ми1адепекщ Кй), доступного от компании 8!та!адепе [каталожный номер 200514]. Плазмиду рЕТ28б, содержащую δκβΟ С344в, используют в качестве матрицы¹. Соответствующие мутагенные праймеры получают при замене остатков Ме1 остатками 11е и проводят обычный синтез с использованием синтезатора 81дта-Сепокук в следующем формате:

- 7 013265

Таблица 81

Мутация	Последовательность праймеров (все мутагенные праймеры являются З-фосфорилированными))
№!1	ТОАСССТбОТОТТССТАТТТСТОАТТОАААТСССЮ
Μ43Ι	СТТАСТААТСССОСТ<ЗСТАТеТТТТСТСОАТСА.ТОААСС
Μ73Ι	САТТТАОТСТАССТАТТГТТААТССТАТТГГТТСТОСАТТАТСОТСАААТОТС
Μ148Ι	ТАОАбОТААТООССААТСАТАОАтеТТТАОТАТАААОТАААОТССТС
Μ204Ι	ССААСААССТТАбОТТСАТГТАТТСТТОАСТАСТСАТССАС
М236Т	САОСТТОААТСАТСТТАТАТАТСССССТАССОСЗАААб
Μ275Ι	ССАТСТСТАССОСТТСТАТАТСТТТАТССОТТААСОО
Μ280Ι	САТСТАТТАТСАТПТСАССОАТСТСТАССОСГГСТАТАТС
Μ383Ι	СААТАССАТПТСАОТААССТАСАТАТАОАСАТОАТАТСТАТТССАО
Μ439Ι	ССТТГААСАОАССАААССТТАТАСАСААТССТОААОССС

Таким способом могут быть введены мутанты с желательным количеством Ме! остатков (от 1 до

10). Другие мутации осуществляют по методике однократного сайт-направленного мутагенеза с использованием набора комплементарных прямых и обратных мутагенных праймеров:

Таблица 82

Мутация	Последовательность праймеров (все мутагенные праймеры являются 5'-фосфорилированными)
1439С	Прямой праймер: ОААТСЮОСТГСАОСАТТСТСТТССАСОТТТСОТСТОТГАААСОТС Обратный праймер ОАССТТТААСАОАССАААССТССААСАСААТССТОААССССАТТС

Соответствующие мутантные белки могут быть экспрессированы с использованием описанного ниже протокола экспрессии.

Экспрессия белка с включенным аналогом Ме!

Экспрессию белков с включенным в их состав гомопропаргилглицином (Нрд) или азидогомоаланином (Айа) проводят по протоколу среднего смещения². Ночную культуру ЕксйепсЫа сой В834 (ΌΕ3), ρΕΤ28ά 8§βΟ С3448 растят в среде с определенными молекулярными характеристиками (~16 ч), содержащей добавки канамицина (50 мкг/мл) и Ь-метионина (40 мкг/мл). Используют ночную культуру для инокуляции предварительно нагретой (до 37°С) культуральной среды (1,0 л, указанного выше состава) и клетки растят в течение 3 ч (до ОЭ₆₀₀ ~1,2). Смещение среды осуществляют путем центрифугирования (6000 об/мин, 10 мин, 4°С), ресуспендирования в среде, не содержащей метионина (0,5 л), и переноса в предварительно нагретую (37°С) культуральную среду (1,0 л), содержащую неприродную аминокислоту (Ой-Нрд. в концентрации 80 мкг/мл, Ь-Айа, в концентрации 40 мкг/мл). Культуру встряхивают в течение 15 мин при 29°С и затем подвергают индукции путем добавления ΙΡΤΟ до концентрации 1,0 мМ. Экспрессию белка проводят при той же температуре, 29°С в течение 12 ч.

Полученную культуру центрифугируют (9000 об/мин, 15 мин, 4°С) и осадок клеток замораживают при -80°С. Белок очищают аффинной хроматографией с использованием никеля: клеточный осадок переносят в буфер для связывания (50 мл) и клетки разрушают озвучиванием (3x30 с, с амплитудой до 60%), после чего суспензию центрифугируют (20000 об/мин, 20 мин, 4°С). Супернатант фильтруют (0,8 мкм) и белок очищают на колонке для аффинной хроматографии с никелем, проводя элюцию возрастающими концентрациями имидазола. Элюцию сопровождают определением УФ поглощения при 280 нМ и соответствующие фракции объединяют. Объединенные фракции подвергают диализу (М^СО 1214 кДа) при 22°С в течение ночи против натрий-фосфатного буфера (50 мМ, рН 6,5, 4,01). Белковый раствор фильтруют (0,2 мкм) и хранят при температуре 4°С.

- 8 013265

Синтез реагентов

Ь-гомоазидоаланин синтезируют по реакции перегруппировки Хофманна, проводят диазоперенос и удаление защитной группы по стратегии, описанной в литературе.³

БЬ-гомопропаргилглицин получают из дизтилацетамидомалоната путем алкилирования гомопропаргилом, с последующими гидролизом и декарбоксилированием, как было описано ранее.²1-Азидо-2-ацетимидо-2-дезокси-в-Б-гликопиранозид 1

защищенного ацетилом гликозилΝ-Ас-глюкозилазид синтезируют из соответствующим образом хлорида с проведением впоследствии реакции деацетилирования Земплена (Ζαηρίοη)¹.

Хитобиозилазид 2

Хитобиозилазид получают по методике, описанной Макмилланом с соавт. (МастШап с1 а1)⁵. (2-Метантиосульфонатэтил)-а-Б-глюкопиранозид 7

Реагент а-глюкопиранозил-МТ8 получают из известного бромида путем удаления защитной группы и замещения метантиосульфонатом, по описанной в литературе методике⁶.

(2-Азидоэтил)-а-Б-маннопиранозид 3

Азидоэтил-а-маннопиранозид 3 синтезируют в соответствии с описанными в литературе процедурами из пентаацетата маннозы путем гликозилирования бромэтанолом с последующим замещением азидом^6,7.

трис-Триазольный лиганд 11

Трис-триазольный лиганд 11 получают из азидоэтилацетата и трипропаргиламина, по описанной ранее методике⁸.

Этинил-С-галактозид 5

Этинил-в-С-галактозид получают по процедуре, используемой для получения известного Сглюкозида, описанной в работе Хи, Лнетапд; Еддег, Апйа; Всгпс1. Вгипо; УакеИа, Апбгеа; Не1у. СЫт. Ас!а; 79 (7), 1996, 2004-2022.

- 9 013265

Модель глико-ССНА реакций малых молекул

Диэтилгомопропаргилацетамидомалонат (55 мг, 0,20 ммоль), ΗΟ₃,01οΝΑο-Ν₃, 1 (101 мг, 0,41 ммоль), аскорбат натрия (202 мг, 10 ммоль) и лиганд трис-триазолеиламина 11 (6 мг, 0,012 ммоль) растворяют в смеси ΜΟΡ8 буфера (рН 7,5, 0,2 М; 4,0 мл) и трет-бутилового спирта (2,0 мл). К перемешиваемому раствору добавляют раствор сульфата меди(11) (0,1 М, 100 мкл, 0,01 ммоль) и реакционную смесь перемешивают в течение 28 ч при комнатной температуре. Затем выпаривают растворитель при пониженном давлении и полученный остаток очищают флэш-хроматографией на колонке (силикагель, ΑεΟΕΐ до 15% МеОН в ΑεΟΕΐ). Полученный продукт имеет вид бесцветной пленки (83 мг, 79%) .

Метил-(8)-2-|И-ацетиламино]-4-{1-(2-дезокси-№ацетиламино-в-О-глюкопиранозил)[1,2,3]триазол-4ил}бутаноат

Бромид меди (10 мг, 0,070 ммоль) растворяют в ацетонитриле (1 мл) и добавляют лиганд (0,58 мл 0,12 М раствора в ацетонитриле). Указанный раствор (38 мкл, с 5% содержанием катализатора) добавляют к раствору алкинаминокислоты (15 мг, 0,08 ммоль) и сахара 2 (31 мг, 0,13 ммоль) в натрийфосфатном буфере (0,5 мл, 0,15 М, рН 8,2). Реакционную смесь перемешивают в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего проводят анализ методом ТСХ, результаты которого указывают на исчезновение исходного алкинового материала. Далее смесь разбавляют этилацетатом и промывают водой (10 мл), после чего водный слой промывают ΑεΟΕΐ. Водный слой выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток очищают колоночной хроматографией (силикагель 1:1, этилΑεΟΕΐ/ίΡτΟΗ до 4:4:2 Η₂Ο/ίΡτΟΗ/ΑεΟΕΐ) с получением требуемого 1,2,3-триазола (26 мг, 74%) в виде бесцветного стеклоподобного твердого вещества.

Метил-(8)-2-[№ацетиламино]-4-{4-(в-О-галактопиранозил)[1,2,3]-триазол-1-ил}бутаноат

ЫНАс

СиВг, лиганд Водный буфер, рН8,2

Бромид меди (10 мг, 0,07 0 ммоль) растворяют в ацетонитриле (1 мл) и добавляют лиганд тристриа золиламин (0,58 мл, 0,12 М в ацетонитриле). Раствор (45 мкл, с 5% содержанием катализатора) добавляют к раствору аминокислоты (20 мг, 0,10 ммоль) и сахара 5 (28 мг, 0,13 ммоль) в натрий-фосфатном буфере (0,5 мл, 0,15 М, рН 8,2). Реакционную смесь перемешивают в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 3 ч. Далее реакционную смесь выпаривают досуха при пониженном давлении и остаток очищают колоночной хроматографией (силикагель 9:1, ΑεΟΕΐ/ΜεΟΗ до 4:4:2 Η₂Ο/ίΡτΟΗ/ΑεΟΕΐ) с получением требуемого 1,2,3-триазола (37 мг, 97%) в виде белого твердого вещества.

Фиг. XX. Синтез О-пропаргил-8^а^асNΑс из О-пропаргил-№ацетилглюкозамина. Применяют очень

- 10 013265 простой ферментативный синтез 81аЬасМЛе с высоким выходом (по процедуре, описанной в литературе: Ва18сй, с1 а1.). Ни на одной стадии очистки, за исключением стадии флэш-хроматографии на колонке, не требуется получать какой-либо из продуктов.

2-Ацетамидо-2-дезокси-1 -пропаргил-в-Э-глюкопиранозид

2-Ацетамидо-2-дезокси-1-пропаргил-в-О-глюкопиранозид был описан ранее. Для целей настоящего изобретения его получают по описанной ниже схеме, в соответствии с методикой УаихсП1с5. Вогй: Оаи55С. Вгипо; Ра1ш1ст, 8ага: Веаи, 1сап-Маг1пс: Тсйайс'гоп Ьсй., 42(43) 2001, 7567-7570.

Л л

15%УЬ(ОВ)з , „ МаОМе

---АсО О^>^-МеОН ЫНАс

ЫНАс

АсО

ОАС -------*

ΝΗΑο

ДХМ. температура кипения

2-Ацетамидо-2-дезокси-4-О-в-'-галактопиранозил-1-пропаргил-О-глюкопиранозид

2-Ацетамидо-2-дезокси-1-пропаргил-З-Э-глюкопиранозид (15,0 мг, 0,058 ммоль) и динатриевую соль уридин-5'-дифосфогалактозы (59 мг, 0,092 ммоль) растворяют в 1,0 мл натрий-какодилатного буфера (0,1 М, 25 мМ МпС1₂, 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, рН 7,41). Добавляют β-1,4галактозилтрансферазу (сс 2.4.1.22, 0,8 Ед) и щелочную фосфатазу (сс 3.1.3.1, 39 Ед) и смесь осторожно встряхивают при температуре 37°С в течение 21 ч, после чего проводят ТСХ (вода: изопропиловый спирт: этилацетат, 1:2:2), результаты которого указывают на полной потребление акцептирующего сахара (Вг 0,8). Реакционную смесь лиофилизируют на силикагеле и очищают флэш-хроматографией на колонке (вода: изопропиловый спирт: этилацетат, 2:5:6) с получением 23,7 мг (97% выход) белого аморф ного твердого вещества.

Пропаргил-(5-ацетимидо-3,5-дидезокси-'-глицеро-а-О-галакто-2-нонулопиранозилоновая кислота(2^3)-в-О-галактопиранозил-(1^4)-2-ацетимидо-2-дезокси-в-О-глюкопиранозид

2-Ацетамидо-2-дезокси-4-О-в-'-галактопиранозил-1-пропаргил-Э-глюкопиранозид (12 мг, 0,028 ммоль) и растворяют в 1,4 мл воды. Добавляют какодилат натрия (60 мг, 0,28 моль, до конечной концентрации: 0,2 М), тетрагидра.т хлорида марганца (8 мг, 0,041 ммоль, до конечной концентрации 29 мМ) и бычий сывороточный альбумин (2 мг). рН доводят до значения 7,1 перед добавлением натриевой соли цитидин-5'-монофосфо-Ы-ацетилнейраминовой кислоты (19,8 мг, 1 эквивалент), а-2,3-(Ы)-сиалилтрансферазы, рекомбинантный вариант из 8ро'ор1ста 1гид1рсг'а, сс 2.4.99.6, 30 мЕд) и щелочную фосфатазу (сс 3.1.3.1, 30 Ед), после чего смесь осторожно встряхивают при температуре 37°С в течение 70 ч, и затем реакционную смесь лиофилизируют на силикагеле и очищают флэш-хроматографией на колонке (вода: изопропиловый спирт:этилацетат, 5:11:15) с получением 20,9 мг аморфного твердого вещества (выход 95%).

Тест ЕЬ18Л для оценки роли сульфотирозина в связывании Р-селектина

Проводят эксперименты с целью демонстрации того, что белки, гликозилированные согласно настоящему изобретению, обладают измененными биологическими свойствами по связыванию.

Тест ЕЬ18Л был модифицирован относительно описанной ранее в литературе процедуры тестирования. Модифицированные белки 8фС вносят в ячейки микротитрационного планшета в количестве 200 нг/ячейку (ЫиНС МахЦотр, 2 мкг/мл, 50 мМ карбонатный буфер, рН 9,6).

Добавляют дитиотреитол (5 мкл/ячейку, 50 мг/мл, в воде) для снижения имитирующего эффекта сульфатированного тирозина применительно к соответствующим линиям. Планшет инкубируют при температуре 4°С в течение 15 ч. Содержимое ячеек блокируют добавлением бычьего сывороточного альбумина (25 мг/мл, в буфере для анализа: 2 мМ СаС1₂, 10 мМ Трис, 150 мМ ЫаС1, рН 7,2, 200 мкл/ячейку) на 2 ч при температуре 37°С. Планшеты промывают промывочным буфером (буфер для анализа, содержащий 0,05% об./об. Твин 20, 3x400 мкл на ячейку) перед добавлением Р-селектина (от Са1Ьюсйсш, каталожный номер 561306, рекомбинантный вариант в СНО-клетках с усеченной последовательностью, без трансмембранного и цитоплазматического доменов, в двойном серийном разведении из 400 нг/ячейку до 1,6 нг/ячейку, для каждого различным образом модифицированного мутанта 8фС в 100 мкл промывочного буфера). Планшеты инкубируют при 37°С в течение 3 ч.

После промывания дважды промывочным буфером ячейки инкубируют с анти-Р-селектиновым антителом (1дС1 подтип, Сйсшкоп, клон АК-6, 100 нг/ячейку, в 100 мкл буфера для анализа) в течение 1 ч при температуре 21°С (плюс 3 контрольных ячейки) и промывают промывочным буфером (3x300

- 11 013265 мкл/ячейку).

Каждую из ячеек инкубируют с анти-мышиным 1дС-специфичным конъюгатом с пероксидазой хрена (от 8фта. А 0168) в течение 1 ч при температуре 21°С. Ячейки промывают промывочным буфером (3x300 мкл). Наличие связывания визуализируют путем добавления раствора субстрата ТМВ (от 81дтаΑΐάποίι. Т0440. 100 мкл на ячейку) и инкубируют в темноте при температуре 22°С до тех пор. когда величина поглощения при 370 нм не установится в линейном диапазоне (примерно через 15 мин).

(8)-2-Амино-4-{4-(в-П-галактопиранозил)[1.2.3]триазол-1-ил}бутаноат

В рамках указанной выше методики проводят исследование по оптимизации процесса с использованием 1.5 экв. этинил-С-галактозида 5. относительно Айа.

^а - по данным 'Н ЯМР (Ό₂Θ. 500 МГц); величина подтвержденного выхода в результате очистки. при рН 8.2 составляет 84%.

Получение фрагмента Тамма-Хорсфолла (Татт-Нот81а11)

Аналоги (Н₂Х-61п-А8р-Рйе-Айа/Нрд-11е-Тйг-А8р-11е-Су8-Ееи-Ееи-61и-С(О)ХН₂) пептидного фрагмента Тамма-Хорсфолла (ТНр) (295-306; Н₂П-61п-А8р-Рйе-А8п-11е-Тйг-А8р-8ег-Ееи-Ееи-61и-С(О)ХН₂)¹²были синтезированы в соответствии с методами Гтос-химии на амиде МВНА-полистироловой смолы К1пк [1% дивинилбензол. ХоуаЫосйет каталожный номер 01-64-0037] с использованием пептидного синтезатора. включающего устройство для микроволновой обработки. ЫЬейу-СЕМ.

Репрезентативная процедура проведения глико-циклоприсоединения Айа-содержащего белка азидопротеина

Этинил-в-С-галактозид (5 мг. 0.027 ммоль) 5 растворяют в натрий-фосфатном буфере (0.5 М. рН 8.2. 200 мкл). К указанному выше раствору добавляют раствор белка (0.2 мг в 300 мкл) и все хорошо перемешивают. Проводят предварительное смешивание свежеприготовленного раствора бромида меди(1) (99.999%) в ацетонитриле (33 мкл в концентрации 10 мг/мл) с ацетонитрильным раствором лиганда тристриазолиламина 11 (12.5 мкл в концентрации 120 мг/мл). К смеси добавляют раствор ранее образованного Си-комплекса (45 мкл) и реакционную смесь перемешивают на качалке в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь центрифугируют для удаления какого-либо осадка солей Си(11). супернатант обессоливают на колонке ΡΌ 10 и затем проводят элюцию деминерализованной водой (3.5 мл). Элюент концентрируют на мембранном концентраторе ущазрш (при отсечении величины пороговой молекулярной массы 10 кДа) и промывают 50 мМ раствором ЭДТА и затем деминерализованной водой (3x50 мкл). В итоге раствор концентрируют до 100 мкл и определяют характеристики продукта методами ЬС-М8. гель-электрофореза в 8Э8-РЛСЕ. СО. путем расщепления трипсином и при проведении анализа продуктов расщепления трипсином методами ЬС-М8/М8.

- 12 013265

Данные анализа методом ВЭЖХ/МС после расщепления трипсином для репрезентативного исходного материала 88вС-Су83448ег-Ме121Айа-Ме143-Айа-Ме173Айа-Ме1148Айа-Ме1204Айа-Ме1236АйаМе1275Ака-Ме1280Айа-Ме13 83Айа-Ме1439Айа

Таблица 83

Расщепляемый фрагмент [остаток Ν’]	Время удерживания [мин]	Состояние зараженности (т/ζ)
+ 1	+2	+ 3	+4
Т2 16-41	24,1		1459,1	973,1
ТЗ 42-70	24,7		1584,7	1056,8
Т5-79-82	4,1	442,3
Т16 147-158	32,2			930,5
Т22 200-225	25,5		1406,7	938,1
Т25 241-251	17,7		641, 8
Т29 280-292	17,1		757,3
Т45 427-445	26,8		1193,0	795,7

Данные анализа методом ВЭЖХ/МС после трипсинового расщепления региоселективно тригалактозилированного 88вС-Су83448ег-Ме121Айа-Ме143-Т-Са1-Ме173Айа-Ме1148Айа-Ме1204Айа-Ме1236АйаМе1275Айа-Т-Са1-Ме1280Айа-Т-Са1-Ме1383Айа-Ме1439Айа

Таблица 84

Расщепляемый фрагмент [остаток №]	Время удерживания [мин]	Состояние заряженности (т/ζ)
+ 1	+ 2	+3	+4
Т2 16-41	24,4		1459,6	973,4
ТЗ Са1 42-70	23,1			1120,1	840,3
Т5 79-82	4,3	443,2
Т22 200-225	25,6		1407,1	938,4
Т25 241-251	18,1	1282, 7	641,8
Т29Са1₂ 280-292	6,9		945,4	630,6
Т45 427-446	26,7		1193,5	796,0

Примечание: Нумерация остатков основана на фактически имеющихся аминокислотах и включает Ηίδ-метку. Нумерация, использованная в остальной части текста, основана на последовательности 8§βΟ дикого типа. Таким образом, например, трипсиновый фрагмент Т29 #280-292 соответствует участку 274286 (Κ)^[Т6а1]ΕАVΕ[Т6а1]ЛΕN^NΚ(Μ

Гликоциклоприсоединение Нрд-содержащего белка алкинилпротеина

Аналогичную процедуру используют для модификации Нрд-содержащих белков. В данном случае углевод, содержащий азид (НОзС1сNАсNз) 1, используют в данной реакции вместо алкинил-в-Сгликозида.

Двойная дифференциальная гликоконъюгация ТНр фрагмента

К раствору только что синтезированного пептида (пептида с включением Нрд или Айа, 0,5 мг) в водном фосфатном буфере (50 мМ, рН 8,2, 0,3 мл) добавляют раствор глюкозида МТ8-реагента 7 в воде (50 мкл, 33 мМ, 5 экв.). Реакционную смесь помещают на качалку на 1 ч и затем отбирают аликвоты для анализа по методу ЬСТ-М8 с использованием колонки Рйепотепех Сепши 5 мк С18 110А (скорость потока 1,0 мл/мин, градиент мобильной фазы: 0,05% муравьиной кислоты в Н₂О до 0,05% муравьиной кислоты в МеСN в течение 20 мин).

Раствор комплексного медного катализатора получают при растворении бромида меди (5 мг, 99,999% чистоты) и трис-триазольного лиганда 11 (18 мг) в МеСN (0,5 мл). Этинилсахар 5 или азидосахар 1 (6 мг) растворяют в реакционной смеси, используемой для гликоконъюгации через дисульфидную связь до добавления комплексного соединения медиЦ) (15 мкл).

Завершение реакции между Айа-пептидом и этинилсахаром, определяемое по результатам анализа

- 13 013265

БС-М8, достигается через 1 ч при комнатной температуре. Через 1 ч к реакционной смеси, содержащей Нрд-пептид и азидосахар, добавляют в избыточном количестве раствор комплекса меди(1) (10 мкл). Еще через 1 ч проводят анализ БС-М8, который показывает полное превращение исходного материала в желательный конъюгированный продукт. Реакционные сайты маркированы на схеме кружками:

Точная масса 1433.7

Химическая формула СтоПизЬЬтОгвЗ?

Хим*неская формула^мНчооЫнОмЗ

Химическая формула:

Точная касса: 1859.6

Химическая формула:

Точная масса: 1654.7

- 14 013265

Комментарии по оптимизации условий гликоциклоприсоединения

Тристриазоловый лиганд 11 был описан ранее в литературе¹³ в качестве агента, используемого при стабилизации Си(1) в водной реакционной смеси. В его отсутствии происходит быстрое окисление до Си(11). В связи с низкой растворимостью СиВг в других растворителях, был выбран ацетонитрил.

Было показано, что слабо щелочная буферная система (рН 7,5 - рН 8,5) лучше всего подходит для реакции модификации. Многие ранее описанные в литературе примеры основаны на восстановлении ш δίΐιι соли Си(11) при добавлении к реакционной смеси восстановителя. Все попытки авторов использовать восстановление ш δίΐιι Си(11) в направлении каталитической модификации белка были безрезультатными. Качество спектральных характеристик соответствующих образцов было низким, и удаление свертки дает недостаточный сигнал для определения шумового коэффициента.

Ферментативная активность

Проводят кинетический анализ, который показывает, что мутантные белки и гликоконъюгаты сохраняют ферментативную активность (данные не приведены).

Исследования по связыванию с лектином

Были проведены эксперименты, которые показали, что гликоконъюгированные сахара влияют на биологическую доставку.

Лектин-связывающие свойства¹⁵ гликоконъюгированных 8§βΟ мутантов были охарактеризованы в рамках анализа их удерживающей способности на аффинных колонках с иммобилизованным лектином [6а1аЬ, каталожный номер ΡΝΑ, АтасЫк Нуродаеа: 051061, Соп А: 051041, ТпЦсит уц1дап8, К-\УСА1001]. Элюированные фракции визуализируют с использованием реагента Брэдфорда¹⁴ и определяют поглощение при длине волны 595 нм.

Таблица 87

- 15 013265

Мап δδβΟ демонстрирует явное связывание с лектином бобовых конканавалином А (Соп А), тогда как С1с-конъюгат (С1с δδβΟ) не демонстрирует выраженного связывания выше фонового значения. То же самое было показано для случая связывания в-СаГтриазол-конъюгированного δδβΟ с галактофильным лектином из арахиса, агглютинином (ΡΝΑ). Хитобиозный конъюгат (С1сХАс δδβΟ) и, в меньшей степени, С1сХАс конъюгаты, как было показано по результатам хроматографического анализа на спинаффинных колонках, также связываются с лектиновым агглютинином из зародышей пшеницы (\УСА). задерживая высвобождение неогликопептидов.

Отсутствие связывания глюкозных конъюгатов, в отличие от маннозных конъюгатов, можно объяснить меньшей аффинностью Соп А для глюкозы¹⁶. Относительное связывание моносахаридов с Соп А, как было показано, происходит в следующем порядке: МеаМап:Мап:МеаО1и:О1и, в соотношении 21:4:5:1. Из этого следует, что маннозные моносахариды связываются в 4 раза прочнее с Соп А, чем моносахариды глюкозы. Ароматический триазол также может вносить вклад в повышенное связывание маннозида, в сравнении с глюкозидом, осуществляемое через дисульфидную связь¹⁷.

Отсутствие связывания, выявляемое в некоторых конструкциях и не выявляемое в ряде других указанных выше конструкций, демонстрирует потребность в надежной процедуре получения гликопротеинов.

Доступность растворителей

В настоящий момент имеется лишь несколько исследований, относящихся к реакционной способности белков в химических реакциях, из числа тех, которые дают возможность провести интегрирован18 19-21 ную оценку доступности аминокислотных остатков .

Кристаллическую структуру δδβΟ получали в соответствии с методикой, описанной в работе 22. Доступность растворителя для мономера А в димерной форме δδβΟ определяют по методике №1ссе55²³. Результаты оценки доступности мономера В дают практически идентичные значения. Значения, приведенные в виде относительной полной доступности боковой цепи, представляют особый интерес для данного исследования. Она является мерой доступности боковой цепи данной аминокислоты X относительно доступности той же самой боковой цепи в трипептиде А1а-Х-А1а. В этой связи можно ожидать, что доступность Ν-концевого остатка Ме11 при исследовании δδβΟ мутантов даст более высокие значения, чем расчетные значения для белка дикого типа (^Τ), поскольку экспрессированные мутанты содержат Ме41-О1у2, отделенный Н18₇-меткой от остальной части последовательности (остатки не пронумерованы).

Доступность растворителей проводят далее с использованием природной аминокислотной последовательности, а не на мутантах, например, содержащих включенный гомоазидоаланин и гомопропаргилглицин.

Расчеты проводят с использованием зондов разных размеров (1,0, 1,4 и 2,9 А), и было показано, что по мере повышения размера зонда становится доступным все меньшее число боковых цепей аминокислот.

На основании приведенных данных (см., приведенную ниже таблицу), следует ожидать, что метиониновые остатки в положениях 1, 43, 275 и 280 являются относительно доступными. То же самое можно ожидать в случае мутантов, которые являются их аналогами по метионину.

Таблица δ8

Аминокислотный остаток	1,0 А	1,4 А	2,8 А
МеС1	54,2	53,2	59,9
Ме!21	9,8	1,9	0,0
Ме!43	48,0	46,6	48,3
МеЕ73	0,6	0,0	0,0
Ме!148	3,6	0,0	0,0
Ме!204	4,2	0,0	0,0
Ме!236	17,3	11,2	2,1
МеЬ275	62,8	64,0	69, 5
Ме!280	37,5	35,1	26, 6
Суз344	6,6	2,0	0,0
МеЪ383	2,5	0,0	0, 0
Ме!439	12,3	7,5	3,4

- 16 013265

Цилиндрическая форма Т1М

Наиболее распространенной третичной складчатой структурой, наблюдаемой при исследовании кристаллических структур белков, является Т1М цилиндр». Считается, что он присутствует в 10% всех белков²⁴.

Гликопротеин Тамма-Хорсфолла (Татт-НогкГа11)(ТНр)

ТНр представляет собой наиболее широко представленную форму гликопротеина у млекопитающих^12,25. Как известно и Ν-, и О-гликозилирование играют ключевую роль в биологической функции ТНр²⁶. Известно, что семь из восьми возможных сайтов гликозилирования являются Νгликозилированными. В их число входит Акп-298 остаток²⁷.

Гликозилирование эритропоэтина и гликозилцерамидазы

В случае эритропоэтина, соответствующими сайтами гликозилирования являются Акп24. Акп38 и Акп 83 для Ν-связанных углеводов. Данный белок содержит единственный сайт О-связанного гликозилированного в положении 8ег126. С использованием методики множественного сайт-направленного мутаганеза и включения метиониновых аналогов в сайты вновь введенных Ме! (природная последовательность Еро содержит только один метионин (М54)) данный белок может быть модифицирован.

Глюкозилцерамидаза (И-глюкоцереброзидаза), представляющая собой гликопротеин размером 60 кДа, который играет важную роль в развитии болезни Гоше, также может быть гликозилирована по данной методике.

Список цитированной литературы

1. Напсоск, 8. М., СогЬе!!, К., Рогбйат-8ке1!оп, А. Р., 6а!ейоике, ί. А. & Иау1к, В. 6. Иеуе1ортд рготксиоик д1усок1бакек Гог д1усок1бе куп!йек1к: Веыбиек \У433 апб Е432 ш 8и1Го1оЬик ко1Га!апсик Ье!ад1усок1баке аге 1трог!ап! д1исок1бе- апб да1ас!ок1бе-крес1йсйу бе!егттап!к. СйетВюСйет 6, 866-875 (2005).

2. уап Нек!, ί. С. М., Киск, К. Б. & Т1гге11, И. А. ЕГйаеп! тсогрогайоп оГ ипка!ига!еб те!йюшпе апа1одиек т!о рго!етк ш у1уо. I. Ат. Сйет. 8ос. 122, 1282-1288 (2000).

3. Апбги^к1ете^, В. & Во7к1е^1с7, И. Ап 1тргоуеб Ргерагайоп оГ №-!ег!-Ви!охусагЬопу1- апб N2Веп7у1оху-сагЬопу1-(8)-2,4-б1агшпоЬи!апо1с Ас1бк. 8уп!й: Соттип. 34,1049-1056 (2004).

4. 8хИаду ί, Ь. & буогдубеак, Ζ. 1пуекйда!юп оГ д1усоку1 а/|бек апб о!йег а/|бо кидагк: 8!егеосйетюа1 шПиепсек оп !йе опе-Ьопб 13С-1Н соирйпд сопк!ап!к. СагЬойубг. Век. 143,21-41 (1985).

5. МастШап, И., Иатек, А. М., ВаугйиЬег, М. & Рй!ксй, 8. Ь. 8ойб-Рйаке 8уп!йек1к оГ Тйюе!йегЫпкеб 61усорер!1бе М1тюк Гог Аррйсайоп !о 61усорго!ет 8ет1куп!йек1к. Огд. Бе!!. 4,1467-1470 (2002).

6. Иау1к, В. 6., Б1оуб, В. С & 1опек, ί. В. Соп!го11еб 8йе-8е1есйуе 61усоку1а!юп оГ Рго!етк Ьу а СотЬтеб 8йе-И1гес!еб Ми!адепек1к апб Сйетюа1 МобШсайоп Арргоасй. ί. Огд. Сйет. 63, 9614-9615 (1998).

7. Сйегпуак, А. Υ. е. а. 2-А/|бое1йу1 д1усок1бек: д1усок1бек ро!епйа11у икеГи1 Гог !йе ргерагайоп оГ пеод1усосоп)ида!ек. СагЬойубг. Век. 223, 303-309 (1992).

8. Райт1, С. ί. & Ζ^υ Ζ. А. Ииогодешс РгоЬе Гог !йе Соррег(1)-Са1а1ухеб А/|бе-А1купе Ыдайоп Веасйоп: Моби1а!юп оГ !йе Ниогексепсе Етккюп У1а 3(п,р*)-1(р,р*) 1пуегкюп. ί. Ат. Сйет. 8ос. 126 (2003).

9. Бочагу, Т., Ме1ба1, М., Не1тЬо1б!, А., Уаке11а, А. & Воск, К. №уе1 Туре оГ В1д1б С-Б1пкеб 61усоку1асе!у1епе - Рйепу1а1апте Вийбтд В1оскк Гог СотЬта!опа1 8уп!йек1к оГ С-йпкеб 61усорерйбек. ί. Огд. Сйет. 63, 9657-9668 (1998).

12. Рептса, И. е. а. 1бепййса!юп оГ Нитап Иготобийп ак !йе Татт-НогкГа11 Иппагу 61усорго!ет. 8с1епсе 236, 83-88 (1987).

13. Сйап, Т. В., НбдгаГ, В., 8йагр1екк, К. В. & Рокт, V. V. Ро1у1г1ахо1ек ак Соррег(1)-81аЫ1|/тд Б1дапбк т Са!а1ук1к. Огд. Бе!!. 6,2853-2855 (2004).

14. ВгабГогб, М. М. А гар1б апб кепкШуе те!йоб Гог !йе с.|иапШа1юп оГ тюгодгат с.|иап1Шек оГ рго!ет ιιΐΠίζίπβ !йе рппар1е оГ рго!ет-буе Ьтбтд. Апа1. Вюсйет. 72, 248-254 (1976).

15. Реагсе, О. М. Т. е! а1. 61усоу1гикек: сйетюа1 д1усоку1а!юп ге!агде!к абепоу1га1 депе !гапкГег. Апдете. Сйет. 1п!1 Еб. 44,1057-1061 (2005).

16. 8сйетата, Р. Р., Рип, К. И., Вйа!, В. 6. & 8игойа, А. Тйегтобупатюк оГ Мопокассйапбе Втбтд !о Сопсапауайп А, Реа (Р1кит кайуит) Бепй1, апб Бепй1 (Бепк сийпапк) Бесйп. ί. Вю1. Сйет. 268,7668-7677 (1993).

17. Рогек, В. И. & 6о1бк!ет, I. ί. Рго!ет-СагЬойубга!е 1п!егасйоп. Вюсйет. Рйагтасо1. 20, 2727-2739 (1971).

18. Бее, В. & Вюйагбк, Р. М. Тйе 1п!егрге!а!юп оГ Рго!ет 8!гис!игек: Екйтайоп оГ 8!айс АссеккМйу. ί. Мо1. Вю1. 55, 379-400 (1971).

19. 61оскег, М. О., Вогсйегк, С, Р1еб1ег, ^., 8искаи, И. & Р1ууЬу1ккГ М. Мо1еси1аг Сйагас!е^айоп оГ 8игГасе Торо1оду т Тегйагу 8!гис!игек Ьу Атто-Асу1а!юп апб Макк 8рес!готе!пс Рерйбе Марртд. Вюсоп). Сйет. 5, 583-590 (1994).

21. 8ап!гисек, Б, 8!гойа1т, М., Каб1с1к, V., Нупек, В. & Кобюек, М. Тугокте гекбиек тобШсайоп к!иб1еб Ьу МАБИ1-ТОР такк крес!готе!гу. Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттип. 323, 1151 -1156 (2004).

22. Адийаг, С. Р. е! а1. Сгук!а1 к!гис!иге оГ !йе Ье!а-д1усок1баке Ггот !йе йуреййегторЫйс агсйеоп 8и1Го1оЬик ко1Га!апсик гекШепсе ак а кеу Гас!ог ш !йегток!аЬ11йу. ί. Мо1. Вю1 271, 789-802 (1997).

- 17 013265

24. РагЬег, 6. К. Ап а1рНа/Ье!а-Ьагге1 £и11 о£ еуойШопагу !гоиЫе. Сигг. Орш. 8!гис!. Вю1. 3, 409-412 (1993).

25. Татт, I. & Ногк£а11, Р. Ь. А тисорго!еш бепуеб £гот Нитап игше \\'1ис11 геас!к \νί11ι тПиеи/а, титрк, апб №\\'сак11е бекеаке упикек. I. Ехр. Меб. 95, 71-79 (1952).

26. Еак!оп, К. Ь., Ра!апкаг, М. 8., С1агк, 6. Р., Мотк, Н. К. & Бе11, А. Ргедпапсу-аккос1а!еб СНапдек ш (Не 61усоку1а!юп о£ Татт-Ногк£а11 61усорго!еш. I. Вю1. СНет. 275, 21928-21938 (2000).

27. уап Кооуеп, I. I. М., Уоккатр, А. Р., Катебшд, I. Р. & УБедепИаг!, Р. 6. 61усоку1а!юп кбек апб кйе-кресШс д1усоку1а!юп ш Нитап Татт-Ногк£а11 д1усорго!еш. 61усоЬю1оду 9, 21-30 (1999).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ гликозилирования белка, включающий стадии:

ί) модификации белка для включения алкиновой и/или азидной группы и ίί) взаимодействия модифицированного белка пункта (ί) с (a) углеводным фрагментом, модифицированным для включения азидной группы, и/или (b) углеводным фрагментом, модифицированным для включения алкиновой группы в присутствии Си(1) катализатора, где указанный Си(1) катализатор получают в растворителе в присутствии стабилизирующего лиганда.
2. Способ по п.1, где стабилизирующий лиганд представляет собой стабилизирующий аминный лиганд.
3. Способ по п.2, где указанный лиганд представляет собой тристриазолиламинный лиганд.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный Си(1) катализатор выбирают из группы, состоящей из СиВг и Си1.
5. Способ по п.4, где указанный Си(1) катализатор представляет собой Си(1)Вг.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная модификация белка включает замещение одной или нескольких аминокислот в белке одним или несколькими неприродными аналогами аминокислот.
7. Способ по п.6, где указанный неприродный аналог аминокислоты представляет собой аналог метионина.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный аналог метионина представляет собой гомопропаргилглицин или азидогомоаланин.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный белок включает более 10 аминокислот.
10. Способ по п.9, где указанный белок включает от 10 до 1000 аминокислот.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный белок имеет молекулярную массу свыше 10 кДа.
12. Способ по п.10, где указанный белок имеет молекулярную массу от 10 до 100 кДа.
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанный белок выбирают из группы, состоящей из гликопротеинов, белков крови, гормонов, ферментов, рецепторов, антител, интерлейкинов и интерферонов.
14. Способ по п.13, где указанный белок является гормоном.
15. Способ по п.14, где указанный гормон представляет собой эритропоэтин.
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная модификация белка (стадия ί) дополнительно включает стадию модификации белка для включения тиоловой группы.
17. Способ по п.16, где указанную тиоловую группу вводят путем инсерции цистеинового остатка в аминокислотную последовательность белка.
18. Способ по п.16 или 17, где способ включает взаимодействие модифицированного белка, модифицированного на стадии (ί) с тиолселективным углеводным реагентом.
19. Способ по п.18, где указанный тиолселективный углеводный реагент представляет собой реагент, который взаимодействует с тиоловой группой в белке для введения гликозильного остатка, связанного с белком через дисульфидную связь.
20. Способ по п.19, где указанный тиолселективный углеводный реагент представляет собой гликотиосульфонатный реагент.
21. Способ по п.20, где указанный гликотиосульфонатный реагент представляет собой гликометантиосульфонатный реагент.
22. Способ по любому из пп.16-19, где указанный тиолселективный реагент представляет собой гликоселенилсульфидный реагент.
23. Белок формулы (III)

- 18 013265 где а и Ь представляют целые числа от 0 до 5; и р и с.| представляют целые числа от 1 до 5, и указанный белок включает по крайней мере 10 аминокислот.

где ΐ обозначает целое число от 1 до 5; и спейсер, который может отсутствовать, представляет собой алифатический фрагмент, содержащий от 1 до 8 атомов С; и указанный белок включает по крайней мере 10 аминокислот.
25. Гликозилированный белок по п.24, где указанный спейсер выбирают из группы, состоящей из С1-6 алкильной группы и С1-6 гетероалкила.
26. Гликозилированный белок по п.25, где указанный спейсер выбирают из группы, состоящей из метила, этила и СН₂(Х)_У, где X обозначает О, N или 8 и у равен 0 или 1.
27. Гликозилированный белок по любому из пп.24-26, где указанный белок имеет формулу (V) где р и с.| обозначают целое число от 0 до 5 и ΐ обозначает целое число от 1 до 5.
28. Гликозилированный белок по п.27, где указанный белок имеет формулу (VI) (VI).
29. Гликозилированный белок по п.27, где указанный белок имеет формулу (VII) (νιΐ) где и и ΐ обозначают целые числа от 1 до 5; спейсер, который может отсутствовать, представляет собой алифатический фрагмент, содержащий от 1 до 8 атомов С; и и Ζ представляют собой углеводные фрагменты, которые могут быть одинаковыми или различными.

где р, д, г и 5 обозначают целые числа от 0 до 5.

- 19 013265
34. Белок по любому из пп.23-33, где указанный белок включает от 10 до 1000 аминокислот.
35. Белок по любому из пп.23-33, где указанный белок имеет молекулярную массу свыше 10 кДа.
36. Белок по п.35, где указанный белок имеет молекулярную массу от 10 до 100 кДа.
37. Белок по любому из пп.23-36, где указанный белок выбирают из группы, состоящей из гликопротеинов, белков крови, гормонов, ферментов, рецепторов, антител, интерлейкинов и интерферонов.
38. Белок по п.37, где указанный белок является гормоном.
39. Белок по п.38, где указанный гормон представляет собой эритропоэтин.
40. Применение белка по любому из пп.23-39 в качестве лекарственного средства.