BRPI0609088A2 - método para glicosilar uma proteìna, e, proteìna - Google Patents
método para glicosilar uma proteìna, e, proteìna Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0609088A2 BRPI0609088A2 BRPI0609088-5A BRPI0609088A BRPI0609088A2 BR PI0609088 A2 BRPI0609088 A2 BR PI0609088A2 BR PI0609088 A BRPI0609088 A BR PI0609088A BR PI0609088 A2 BRPI0609088 A2 BR PI0609088A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- protein
- formula
- group
- glycosylated
- reagent
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 161
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 160
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 claims abstract description 22
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims abstract 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 150
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 35
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 33
- 125000000837 carbohydrate group Chemical class 0.000 claims description 31
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 28
- -1 antibodies Proteins 0.000 claims description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 23
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 19
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 16
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 15
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 15
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 13
- 125000001360 methionine group Chemical class N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims description 11
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 11
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 10
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 9
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229910021589 Copper(I) bromide Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- SCGJGNWMYSYORS-UHFFFAOYSA-N 2-azaniumylhex-5-ynoate Chemical compound OC(=O)C(N)CCC#C SCGJGNWMYSYORS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 claims description 6
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 claims description 6
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 claims description 6
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical group [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 claims description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 5
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 claims description 5
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 5
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 5
- NNWQLZWAZSJGLY-VKHMYHEASA-N (2s)-2-azaniumyl-4-azidobutanoate Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCN=[N+]=[N-] NNWQLZWAZSJGLY-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 4
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 4
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 claims description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 125000006716 (C1-C6) heteroalkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 17
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 13
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 12
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 12
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 9
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 9
- 125000002355 alkine group Chemical group 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 9
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 8
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 7
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 7
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 7
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 6
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 5
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 5
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- NKNDPYCGAZPOFS-UHFFFAOYSA-M copper(i) bromide Chemical compound Br[Cu] NKNDPYCGAZPOFS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 4
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 4
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 4
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 150000002367 halogens Chemical group 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N Cu+ Chemical compound [Cu+] VMQMZMRVKUZKQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 3
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 3
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QWENRTYMTSOGBR-UHFFFAOYSA-N 1H-1,2,3-Triazole Chemical compound C=1C=NNN=1 QWENRTYMTSOGBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 2
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 2
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 2
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008212 P-Selectin Human genes 0.000 description 2
- 108010035766 P-Selectin Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010029302 Sulfolobus solfataricus beta-glycosidase Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 108010046516 Wheat Germ Agglutinins Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 2
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 2
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 125000004404 heteroalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 125000004184 methoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- GWIKYPMLNBTJHR-UHFFFAOYSA-M thiosulfonate group Chemical group S(=S)(=O)[O-] GWIKYPMLNBTJHR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical class [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- BXMRLISFFDPHHT-VKHMYHEASA-N (2S)-2-aminobutanoyl azide Chemical compound N[C@@H](CC)C(=O)N=[N+]=[N-] BXMRLISFFDPHHT-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 125000000008 (C1-C10) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000006269 (delayed) early viral mRNA transcription Effects 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001399 1,2,3-triazolyl group Chemical group N1N=NC(=C1)* 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 125000004206 2,2,2-trifluoroethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C(F)(F)F 0.000 description 1
- JFTHBDBUVHRREF-UHFFFAOYSA-N 2-acetamidopropanedioic acid Chemical compound CC(=O)NC(C(O)=O)C(O)=O JFTHBDBUVHRREF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical class NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDLCZOVUSADOIV-UHFFFAOYSA-N 2-bromoethanol Chemical compound OCCBr LDLCZOVUSADOIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000954 2-hydroxyethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BXRLWGXPSRYJDZ-UHFFFAOYSA-N 3-cyanoalanine Chemical compound OC(=O)C(N)CC#N BXRLWGXPSRYJDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FZTIWOBQQYPTCJ-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(4-carboxyphenyl)phenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(C(=O)O)=CC=C1C1=CC=C(C=2C=CC(=CC=2)C(O)=O)C=C1 FZTIWOBQQYPTCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001556567 Acanthamoeba polyphaga mimivirus Species 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- TXCIAUNLDRJGJZ-BILDWYJOSA-N CMP-N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound O1[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(=O)C)[C@@H](O)C[C@]1(C(O)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(N=C(N)C=C2)=O)O1 TXCIAUNLDRJGJZ-BILDWYJOSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 101000874334 Dalbergia nigrescens Isoflavonoid 7-O-beta-apiosyl-glucoside beta-glycosidase Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100456896 Drosophila melanogaster metl gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101000757733 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) Autolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNKUSGQVOMIXLU-UHFFFAOYSA-N Formamidine Chemical compound NC=N PNKUSGQVOMIXLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 101000960954 Homo sapiens Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 238000006736 Huisgen cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 1
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 1
- 102100039898 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-PQMKYFCFSA-N L-Fucose Natural products C[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 1
- DGYHPLMPMRKMPD-UHFFFAOYSA-N L-propargyl glycine Natural products OC(=O)C(N)CC#C DGYHPLMPMRKMPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000757734 Mycolicibacterium phlei 38 kDa autolysin Proteins 0.000 description 1
- LNFVQZQJEGUHLW-VZVZTSLSSA-N N-[(3R,4R,5S,6R)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-prop-2-ynoxyoxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)OC1OCC#C LNFVQZQJEGUHLW-VZVZTSLSSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- HFDZHKBVRYIMOG-QMMMGPOBSA-N N-sulfotyrosine Chemical compound OS(=O)(=O)N[C@H](C(=O)O)CC1=CC=C(O)C=C1 HFDZHKBVRYIMOG-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 101100395023 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 1
- 108010046016 Peanut Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 241000205091 Sulfolobus solfataricus Species 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IAVPGZZRAJUOGE-UHFFFAOYSA-N [n'-(2-hydroxy-2-phenylethyl)carbamimidoyl]azanium;carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O.NC([NH3+])=NCC(O)C1=CC=CC=C1.NC([NH3+])=NCC(O)C1=CC=CC=C1 IAVPGZZRAJUOGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001241 acetals Chemical class 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 1
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N alpha-D-mannose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- QLTSDROPCWIKKY-PMCTYKHCSA-N beta-D-glucosaminyl-(1->4)-beta-D-glucosamine Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](N)[C@H](O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 QLTSDROPCWIKKY-PMCTYKHCSA-N 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004791 biological behavior Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012152 bradford reagent Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007978 cacodylate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 150000001719 carbohydrate derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000009134 cell regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940049197 cerezyme Drugs 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- ISOLMABRZPQKOV-UHFFFAOYSA-N diethyl 2-acetamidopropanedioate Chemical compound CCOC(=O)C(NC(C)=O)C(=O)OCC ISOLMABRZPQKOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004177 diethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 102000034240 fibrous proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005899 fibrous proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008195 galaktosides Chemical class 0.000 description 1
- 108700039708 galantide Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 125000003563 glycoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108010039650 imiglucerase Proteins 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L manganese(II) chloride tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Mn+2] CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000008146 mannosides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 125000001181 organosilyl group Chemical group [SiH3]* 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- PGMYKACGEOXYJE-UHFFFAOYSA-N pentyl acetate Chemical compound CCCCCOC(C)=O PGMYKACGEOXYJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 239000011546 protein dye Substances 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 description 1
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- UOENJXXSKABLJL-UHFFFAOYSA-M sodium;8-[(2-hydroxybenzoyl)amino]octanoate Chemical compound [Na+].OC1=CC=CC=C1C(=O)NCCCCCCCC([O-])=O UOENJXXSKABLJL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- ILMRJRBKQSSXGY-UHFFFAOYSA-N tert-butyl(dimethyl)silicon Chemical compound C[Si](C)C(C)(C)C ILMRJRBKQSSXGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001981 tert-butyldimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([H])(C([H])([H])[H])[*]C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000037 tert-butyldiphenylsilyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[Si]([H])([*]C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 150000004044 tetrasaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000008501 α-D-glucopyranosides Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/1072—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups
- C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
METODO PARA GLICOSILAR UMA PROTEìNA, E, PROTEìNA. A presente invenção se refere a métodos para glicosilar uma proteína nos quais a proteína é modificada para incluir um grupo alquileno e/ou azida. A invenção se refere adicionalmente a uma proteína glicosilada por estes métodos.
Description
"MÉTODO PARA GLICOSILAR UMA PROTEÍNA, E, PROTEÍNA"
Campo da Invenção
O presente pedido está interessado em métodos para aglicosilação de proteínas e as proteínas glicosiladas fornecidas por estesmétodos.
Fundamentos da Técnica da Invenção
A glicosilação co e pós-traducional de proteínas desempenhaum papel vital em seu comportamento biológico e estabilidade (R. Dwek,Chem. Rev., 96:683-720 (1996)). Por exemplo, glicosilação desempenha umgrande papel em processos biológicos essenciais tal como sinalização eregulação, desenvolvimento e imunidade de células. O estudo destes eventosse faz difícil pelo fato de que glicoproteínas ocorrem naturalmente comomisturas de assim chamadas glicoformas que possuem o mesmo esqueleto depeptídeo mas diferem tanto na natureza como no sítio de glicosilação. Alémdisso, uma vez que glicosilação de proteína não está sob controle genéticodireto, a expressão de glicoproteínas terapêuticas em cultura de célula demamífero leva a misturas heterogêneas de glicoformas. A capacidade desintetizar glicoformas homogêneas de glicoproteína é portanto não apenas umpré-requisito para propósitos de investigação precisa, mas é de crescenteimportância ao preparar glicoproteínas terapêuticas, que são atualmentecomercializadas como misturas multi-glicoformas (e.g. eritropoietina einterleucinas). Controlar o grau e natureza de glicosilação de uma proteínaportanto permite a possibilidade de investigar e controlar seu comportamentoem sistemas biológicos.
Diversos métodos para a glicosilação de proteínas sãoconhecidos, incluindo síntese química. Síntese química de glicoproteínasoferece certas vantagens, não apenas a possibilidade de acesso a glicoformaspuras de glicoproteína. Um método sintético conhecido utiliza reagentes decarboidratos seletivos para tiol, reagentes de glicosilmetano tiossulfonato(glico-MTS). Tais reagentes de glicosilmetano tiossulfonato reagem comgrupos tiol em uma proteína para introduzir um resíduo de glicosil ligado àproteína através de uma ligação de dissulfeto (veja por exemploWO00/01712).
Formação de triazol catalisada por Cu(I) foi usada paradiversos dos estudos de marcação (Link et ai., J. Am. Chem. Soe. 125:11164-11165 2003; Link et al., J. Am. Chem. Soe. 126:10598-10602 2004; e Speerset al., Chemistry and Biology 11: 535-546 2004) assim como em síntese(Tornoe et al., J. Org. Chem. 67(9): 3057-3064 2002). As característicasatrativas desta reação são a alta seletividade da reação de azidas com alcinos ea capacidade de realizar a reação em condições aquosas na presença de umavariedade de outros grupos funcionais.
Na literatura recente (Kuijpers et al., Org. Lett. 6(18):3123-3126 2004) síntese de aminoácidos de glicosil ligados a triazol eglicopeptídeos pequenos a partir de carboidratos protegidos adequadamentefuncionalizados e aminoácidos/peptídeos protegidos foi demonstrada.
Também outros tipos de glicoconjugados ligados a triazol foram relatados(Chittaboina et al., Tetrahedron Lett. 46:2331-2336 2005) que são sintetizadosutilizando derivados de carboidratos protegidos.
Lin e Walsh modificaram um peptídeo cíclico de 10aminoácidos, N-acetil cisteamina tioéster (SNAC) para introduzirfuncionalidade de alcino no peptídeo. O método envolveu substituiraminoácidos no peptídeo com o análogo de aminoácido não natural,propargilglicina, em diferentes posições no peptídeo (Van Hest et al. J. Am.Chem. Soe. 122:1282-1288 (2000) e Kiick et al., Tetrahedron 56:9487-9493(2000)). Os peptídeos modificados foram então conjugados a açúcares deazido para produzir peptídeos cíclicos glicosilados.
Existe uma necessidade de um método simplificado, porexemplo um que não requeira o uso de reagentes glicosilantes protegidos,para glicosilação de estruturas mais complexas, por exemplo proteínas, do quedescrito na técnica anterior e que permita glicosilação em múltiplos sítios emuma ampla variação de proteínas diferentes.
Relatos da invenção
De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção éfornecido um método para modificar uma proteína, o método compreendendomodificar a proteína para incluir pelo menos um grupo alcino e/ou azida.
Como usado neste lugar um grupo azida se refere a (N=N=N)e um grupo alcino se refere a uma ligação tripla CC.
A modificação para a proteína geralmente envolve asubstituição de um ou mais aminoácidos na proteína por um ou mais análogosde aminoácidos compreendendo um grupo alcino e/ou azida.
Alternativamente, ou em adição ao precedente, a modificação para a proteínapode incluir a introdução de um ou mais aminoácidos naturais na proteínacomo discutido neste lugar. Em outra alternativa, a modificação para aproteína pode envolver a modificação de uma cadeia lateral de umaminoácido para incluir um grupo químico, por exemplo um grupo tiol. Amodificação da proteína para incluir um grupo azida, alcino ou tiol ocorretipicamente em uma posição pré-determinada dentro da seqüência deaminoácidos da proteína.
Em um aspecto preferido da invenção a modificação para aproteína envolve a substituição de um ou mais aminoácidos na proteína comum ou mais análogos de aminoácidos não naturais (ie. não naturalmenteocorrentes). O análogo de aminoácido não natural pode ser um análogo demetionina. O análogo de metionina pode ser homopropargil glicina (Hpg)(Van Hest et al., J. Am. Chem. Soc., 122, 1282-1288 (2000)), homoalilglicina (Hag) (Van Hest et al., FEBS Letters, 428, 68-70 (1998)) e/ou azidohomoalanina (Aha) (Kiick et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 99, 19-24(2002)), preferivelmente homopropargil glicina.A modificação da proteína para introduzir um ou maisaminoácidos não naturais, por exemplo análogos de metionina, pode seratingida por métodos conhecidos na técnica, veja por exemplo Van Hest et al.,J. Am. Chem. Soe. 122, 1282-1288 (2000). Especificamente a modificação deuma proteína para introduzir um ou mais análogos de metionina envolve amutagênese sítio dirigida para inserir em uma seqüência de ácidos nucléicoscodificando a proteína o códon AUG codificando para metionina.
Preferivelmente a inserção do códon para metionina ocorre em uma posiçãopré-determinada dentro da seqüência de ácidos nucléicos codificando aproteína, por exemplo em uma localização dentro de uma região da seqüênciade ácidos nucléicos que codifica o término N (ou extremidade amino) daproteína. Expressão da proteína pode então ser atingida traduzindo aseqüência de ácidos nucléicos contendo o códon de metionina inserido emuma linhagem bacteriana auxotrófica deficiente em metionina na presença deanálogos de metionina, por exemplo, Aha ou Hpg.
O método da invenção pode envolver a modificação daproteína para incluir um grupo alcino pela etapa de substituir um ou maisaminoácidos na proteína com homopropargil glicina ou homoalil glicina.
Alternativamente, ou adicionalmente, o método da invenção podeenvolver a modificação da proteína para incluir um grupo azida pela etapa desubstituir um ou mais aminoácidos na proteína com azido homoalanina.
Preferivelmente o método da invenção envolve a modificaçãoda proteína para incluir um grupo azida (como descrito neste lugar) e umgrupo alcino (como descrito neste lugar).
O termo "proteína" neste texto significa, em termos gerais,uma pluralidade (mínimo de 2 aminoácidos) de resíduos de aminoácidos(geralmente mais do que 10) unidos juntos por ligações peptídicas. Qualqueraminoácido compreendido na proteína preferivelmente é um aminoácido a.
Qualquer aminoácido pode estar na forma D ou L.Em um aspecto preferido da invenção a proteína compreende umgrupo tiol (-SH) por exemplo presente em um ou mais resíduos de cisteína. 0(s)resíduo(s) de cisteína pode(m) estar naturalmente presente na proteína. Onde aproteína não inclui um resíduo de cisteína, a proteína pode ser modificada paraincluir um ou mais resíduos de cisteína. Um(uns) grupo(s) tiol(s) pode serintroduzido na proteína por modificação química da proteína, por exemplo paraintroduzir um grupo tiol na cadeia lateral de um aminoácido ou para introduzirum ou mais resíduos de cisteína. Alternativamente uma proteína contendo tiolpode ser preparada através de mutagênese sítio dirigida para introduzir umresíduo de cisteína. Mutagênese sítio dirigida é uma técnica conhecida na técnica(veja por exemplo W000/01712). Especificamente, um resíduo de cisteína podeser introduzido na proteína por inserção do códon UGU em uma seqüência deácidos nucléicos codificando a proteína. Preferivelmente a inserção do códonpara cisteína ocorre em uma posição pré-determinada dentro da seqüência deácidos nucléicos codificando a proteína, por exemplo em uma localização dentrodaquela região da seqüência de ácidos nucléicos codificando o término C (ouextremidade carboxílica) da proteína. Depois disso a proteína modificada podeser expressa, por exemplo em um sistema de expressão celular.
O termo "proteína" como usado neste lugar significa, emtermos gerais, uma pluralidade de resíduos de aminoácidos unidos juntos porligações peptídicas. Ele é usado permutavelmente e significa o mesmo quepeptídeo e polipeptídeo.
O termo "proteína" também é pretendido para incluirfragmentos, análogos e derivados de uma proteína caracterizada pelo fato deque o fragmento, análogo ou derivado retém essencialmente a mesmaatividade ou função biológica que uma proteína de referência.
A proteína pode ser uma estrutura linear mas preferivelmente éuma estrutura não linear tendo uma conformação dobrada, por exemplo terciáriaou quaternária. A proteína pode ter um ou mais grupos prostéticos conjugados aela, por exemplo a proteína pode ser uma glicoproteína, lipoproteína oucromoproteína. Preferivelmente a proteína é uma proteína complexa.
Preferivelmente a proteína compreende entre 10 e 1.000aminoácidos, por exemplo entre 10 e 600 aminoácidos, tal como entre 10 e200 ou entre 10 e 100 aminoácidos. Assim a proteína pode compreender entre10 e 20, 50, 100, 150, 200 ou 500 aminoácidos.
Em um aspecto preferido da invenção a proteína tem um pesomolecular de mais do que IOkDa. A proteína pode ter um peso molecular depelo menos 20kDa ou pelo menos 60kDa, por exemplo entre 10 e 1 OOkDa.
A proteína pode pertencer ao grupo de proteínas fibrosas ouproteínas globulares. Preferivelmente, a proteína é uma proteína globular.
Preferivelmente a proteína é uma proteína biologicamenteativa. Por albuminas de soro e outras proteínas sangüíneas, hormônios,enzimas, receptores, anticorpos, interleucinas e interferons.
Exemplos de proteínas podem incluir fatores de crescimento,fatores de diferenciação, citocinas e.g. interleucinas, (eg. IL-1, IL-2, M-3, IL-4.IL-5, M-6, M-7. M-8, 1L-9, IL-10, IL-11. M-12, IL-13, 11-14, M-15, M-16, IL-17, IL-18, IL-19, M-20 ou M-21, ou [alfa] ou [beta]), interferons (eg. IFN-[alfa],IFN-[beta] e IFN-[gama]), fator de necrose de tumor (TNF), fator indutor de IFN-[gama] (IGIF), proteína morfogenética óssea (BMP); quimiocinas, fatorestróficos; receptores de citocina; enzimas recolhendo radical livre.
Em um aspecto preferido da invenção a proteína é umhormônio. Preferivelmente o hormônio é eritropoietina (Epo).
A proteína modificada pelo método da invenção retémbeneficamente função/atividade de proteína.
Em um aspecto preferido adicional da invenção a proteína éuma enzima. Preferivelmente a enzima é Glucosilceramidase (D-glucocerebrosidase) (Cerezyme) ou beta-glicosidase de Sulfolobussolfataricus (SSbG).A presente invenção é adicionalmente baseada na introduçãosítio seletiva de uma etiqueta, tal como um grupo alcino, azida ou tiol, nacadeia lateral de um aminoácido em um sítio pré-determinado dentro daseqüência de aminoácidos de uma proteína (como discutido acima) seguidopor reações de glicosilação seqüenciais, e ortogonais, que são seletivas paracada respectiva etiqueta. Desta maneira, glicosilação química de proteínadiferencial em múltiplos sítios é atingida.
Assim em um segundo aspecto da invenção é fornecido ummétodo para glicosilar uma proteína caracterizado pelo fato de que o métodocompreende as etapas de
i) modificar uma proteína de acordo com o método doprimeiro aspecto da invenção; e
ii) reagir a proteína modificada em (i) com
(a) uma unidade de carboidrato modificada para incluirum grupo azida; e/ou
(b) uma unidade de carboidrato modificada para incluirum grupo alcino na presença de um catalisador de Cu(I).
Como usado neste lugar "glicosilação" se refere ao processogeral de adição de uma unidade de glicosil a outra unidade através de umaligação covalente.
Tipicamente, onde a proteína é modificada em etapa (i) paraincluir um grupo alcino, a reação em etapa (ii) é com a unidade de carboidratoem (a). Além disso, onde a proteína é modificada em etapa (i) para incluir umgrupo azida, a reação em etapa (ii) is com a unidade de carboidrato em (b).
Preferivelmente a modificação para a proteína (etapa i)compreende adicionalmente a etapa de modificar a proteína como definidoneste lugar para incluir um grupo tiol, por exemplo através da inserção de umresíduo de cisteína.
Em um aspecto preferido da invenção é fornecido um métodode glicosilar uma proteína, o método compreendendo as etapas de
i) (a) modificar uma proteína para incluir um grupoalcino e/ou azida; e
(b) antes ou depois da modificação para a proteína em
(a), opcionalmente modificar uma proteína para incluir um grupo tiol; e
ii) reação seqüencial da proteína modificada em (i) com umaunidade de carboidrato (c) na presença de um catalisador Cu (I) antes oudepois de reação com um reagente de carboidrato seletivo para tiol (d)
(c) uma unidade de carboidrato modificada para incluir umgrupo azida e/ou uma unidade de carboidrato modificada para incluir umgrupo alcino; e
(d) um reagente de carboidrato seletivo para tiol.
Etapas (i) (a) e (b) são como descrito neste lugar. Onde aproteína a ser modificada contém um resíduo de cisteína, modificação daproteína para incluir um grupo tiol pode não ser necessária. Alternativamente,pode ser desejável incluir um ou mais grupos tiol em adição àqueles jápresentes na proteína.
O reagente de carboidrato seletivo para tiol pode incluir qualquerreagente que reage com um grupo tiol em uma proteína para introduzir umresíduo de glicosil ligado à proteína através de uma ligação de dissulfeto. Oreagente de carboidrato seletivo para tiol pode incluir, mas não é limitado a,reagente de glicoalcanotiossulfonato, por exemplo reagente deglicometanotiossulfonato (glico-MTS) (veja W000/01712 o conteúdo da qualestá incorporado por completo neste lugar), reagentes de glicoselenilssulfeto(veja W02005/000862 o conteúdo da qual está incorporado neste lugar em suatotalidade) e os reagentes de glicotiossulfonato (veja W02005/000862 oconteúdo da qual está incorporado neste lugar em sua totalidade). Reagentes deglicometanotiossulfonato são da unidade de carboidrato de fórmula CH3-SO2-S.
Os reagentes de glicotiossulfonato e glicoselenilssulfeto (SeS)geralmente são da fórmula I em W02005/000862 (incorporada por referêncianeste lugar). Especificamente reagentes de glicoselenilssulfeto (SeS) são daunidade de carboidrato de fórmula R-S-X- caracterizada pelo fato de que X é Se eR é um grupo Cl-IO alquil, fenil, piridil ou naftil opcionalmente substituído.
Reagentes de glicotiossulfonato são da unidade de carboidrato de fórmula R-S-Xcaracterizada pelo fato de que X é SO2 e R é um grupo fenil, piridil ou naftilopcionalmente substituído. Tais reagentes sustentam acoplamento seletivo parasítio do carboidrato com a proteína através de uma ligação dissulfeto.
Preferivelmente os carboidratos a serem modificados iriclüemmonossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, tetrassacarídeos oligossacarídeose outros polissacarídeos, e incluem qualquer unidade de carboidrato que estápresente em glicoproteínas naturalmente ocorrentes ou em sistemas biológicos.São incluídos derivados de glicosil ou glicosídeo, por exemplo derivados deglicosil, glucosídeo, galactosil ou galactosídeo. Grupos de Glicosil e glicosídeoincluem tanto grupos a como (3. Unidades de carboidrato adequadas incluemglicose, galactose, fucose, GleNAc5 GalNAc5 ácido siálico, e manose, epolissacarídeos compreendendo pelo menos um resíduo de glicose, galactose,fucose, GlcNAc, GalNAc, ácido siálico, e/ou manose.
Unidades de carboidrato podem incluir Glc(Ac)43-,Glc(Bn)4B-, Gal(Ac)43-, Gal(Bn)413-,Glc(Ac)4a( 1,4)G 1 c(Ac)3a( 1,4)G 1 c(Ac)413-, [3-Glc, [3-Gal, a-Man, a-Man(Ac)4, Man(l,6)Mana-, Man(l-6)Man(l-3)Mana-, (Ac)4Man(l-6)(Ac)4Man( 1 -3)(AC)2Mana-, -Et-f3-Gal,-Et-13-Glc, Et-a-Glc, -Et-a-Man, -Et-Lac, -(3-GIc(Ac)2, -13-Glc(Ac)3, Et-a-Glc(Ac)2, -Et-a-Glc(Ac)3, -Et-a-Glc(Ac)4, -Et-13-Glc(Ac)2, -Et-f3-Glc(Ac)3, 25 -Et-13-GIc(Ac)4, -Et-a-Man(Ac)3, -Et-a-Man(Ac)4, -Et-13-Gal(Ac)3, -Et-(3-Gal(Ac)4, Et-Lac(Ac)5, -Et-Lac(Ac)6, -Et-Lac(Ac)7, e seus equivalentes desprotegidos.
Quaisquer unidades de sacarídeo constituindo a unidade decarboidrato que são derivados de açúcares naturalmente ocorrentes estarão ouna forma enantiomérica naturalmente ocorrente, que pode ser ou a forma D(e.g. D-glicose ou D-galactose), ou a forma L (e.g. L-ramnose ou L-fucose).
Quaisquer ligações anoméricas podem ser ligações a ou (3.
Em uma forma de realização da invenção, carboidratos queforam modificados para incluir um grupo azida são glicosil azidas.
Em uma forma de realização da invenção, carboidratos queforam modificados para incluir um grupo alcino são alquinil glicosídeos.
Preferivelmente as unidades de carboidrato modificadas comazido e/ou alcino (e.g glicosil azida ê/ou alquinil glicosídeo) não incluem umgrupo protetor i.e. são desprotegidas. As unidades de carboidrato modificadascom azido e/ou alcino desprotegidas podem ser preparadas pela adição dogrupo azida ou alcino a um açúcar protegido. Grupos protetores adequadospara quaisquer grupos -OH na unidade de carboidrato incluem acetato (Ac),benzil (Bn), silil (por exemplo terc-butil dimetilsilil (TBDMSi) e terc-butildifenilsilil (TMDPSi)), acetais, cetais, e metoximetil (MOM). O grupoprotetor é então removido antes ou depois de acoplamento da unidade decarboidrato com a proteína. Desta maneira, a reação definida em etapa (ii) érealizada com um glicosídeo desprotegido.
Em um aspecto preferido da invenção o catalisador de Cu(I) éCuBr ou Cul. Preferivelmente o catalisador é CuBr. O catalisador de Cu(I)pode ser fornecido pelo uso de um sal de Cu(H) (e.g. Cu(I)SO4) na reação queé reduzido para Cu(I) pela adição de um agente redutor (e.g. ascorbato,hidroxilamina, sulfito de sódio ou cobre elementar) in situ na mistura dereação. Preferivelmente o catalisador de Cu(I) é fornecido pela adição diretade Cu(I)Br à reação. Preferivelmente o Cu(I)Br é fornecido em alta pureza,por exemplo pelo menos 99% de pureza tal como 99.999%. Aindapreferivelmente o catalisador de Cu(I) (e.g.Cu(I)Br) é fornecido em umsolvente na presença de um ligante estabilizante e.g. uma base de nitrogênio.
O ligante estabiliza Cu(I) na mistura de reação; em sua ausência oxidaçãopara Cu(II) ocorre rapidamente. Preferivelmente o ligante é ligante detristriazolil amina (Wormald and Dwek, Structure, 7, R155-R160 (1999)). Osolvente para o catalisador pode ter um pH de 7,2-8,2. O solvente pode ser umsolvente orgânico miscível em água (e.g terc-BuOH) ou um tampão aquosotal como tampão fosfato. Preferivelmente o solvente é acetonitrila.
A reação em etapa (ii) é uma reação de cicloadição [3+2] entre umgrupo alcino (na proteína e/ou no glicosídeo) e um grupo azida (na proteína e/ouglicosídeo) para gerar triazóis 1,2,3-1,2,3-substituídos (Huigsen, Proc. Chem. Soe.357-369 (1961)) que fornecem uma ligação entre a proteína e o(s) açúcar(es).
Um aspecto adicional da invenção fornece uma proteínamodificada pelo método do primeiro ou segundo aspecto da invenção.
Um aspecto adicional da invenção fornece uma proteína defórmula (I), (II) ou (III)
<formula>formula see original document page 12</formula>em que a e b são números inteiros entre 0 e 5 (e.g. 0, 1, 2, 3, 4 ou 5); p e q sãonúmeros inteiros entre 1 e 5 (e.g. 1, 2, 3, 4 ou 5); e caracterizado pelo fato deque a proteína é como definida neste lugar.
Um aspecto ainda adicional da invenção fornece uma proteínaglicosilada modificada pelo método do segundo aspecto da invenção.
A invenção adicionalmente fornece uma proteína glicosiladade FORMULA (IV)
<formula>formula see original document page 13</formula>
em que t é um número inteiro entre 1 e 5 (e.g. 1, 2, 3, 4 ou 5); e oespaçador, que pode estar ausente, é uma unidade alifática tendo de 1 a 8átomos de C.
Em um aspecto preferido da invenção o espaçador é um grupoalquil C1-6 substituído ou não substituído. Preferivelmente o espaçador éausente, metil ou etil.
Em um aspecto preferido adicional da invenção o espaçadoré um heteroalquil caracterizado pelo fato de que o heteroátomo é 0, N ouSeo alquil é metil ou etil. Preferivelmente o grupo heteroalquil é defórmula CH2(X) y caracterizada pelo fato de que X é 0, N ou S e Y é 0 ou1. Tipicamente o heteroátomo é diretamente ligado à unidade decarboidrato.
Um substituinte é halogênio ou uma unidade tendo de 1 a 30átomos plurivalentes selecionados a partir de C, N, 0, S e Si assim comoátomos monovalentes selecionados a partir de H e halo. Em uma classe decompostos, o substituinte, se presente, é por exemplo selecionado a partir dehalogênio e unidades tendo 1, 2, 3, 4 ou 5 átomos plurivalentes assim comoátomos monovalentes selecionados a partir de hidrogênio e halogênio. Osátomos plurivalentes podem ser, por exemplo, selecionados a partir de C, N,
O, S e B, e.g. C, N, S e O.
O termo "substituído" como usado neste lugar em referência auma unidade ou grupo significa que um ou mais átomos de hidrogênio narespectiva unidade, especialmente 1, 2 ou 3 dos átomos de hidrogênio sãosubstituídos independentemente um do outro pelo número correspondente dossubstituintes descritos.
Será, como se sabe, entendido que substituintes estão apenasem posições onde eles são quimicamente possíveis, a pessoa versada natécnica sendo capaz de decidir (ou experimentalmente ou teoricamente) semesforço inapropriado se uma substituição particular é possível. Por exemplo,grupos amino ou hidróxi com hidrogênio livre podem ser instáveis se ligadosa átomos de carbono com ligações insaturadas (e.g. olefínicos).
Adicionalmente, será como se sabe entendido que os substituintes descritosneste lugar podem ser eles mesmos substituídos por qualquer substituinte,sujeitos às restrições mencionadas acima para substituições apropriadas comoreconhecido pelo sujeito versado.
Alquil substituídos podem ser portanto, por exemplo, alquilcomo ultimamente definido, pode ser substituído com um ou mais desubstituintes, os substituintes sendo os mesmos ou diferentes e selecionados apartir de hidróxi, hidroxil eterificado, halogênio (e.g. flúor), hidroxialquil (e.g.2-hidroxietil), haloalquil (e.g. trifluorometil ou 2,2,2-trifluoroetil), amino,amino substituído (e.g. N-alquilamino, N,N-dialquilamino ou N-alcanoilamino), alcoxicarbonil, fenilalcoxicarbonil, amidino, guanidino,hidroxiguanidino, formamidino, isotioureído, ureído, mercapto, acil, acilóxital como carbóxi esterificado por exemplo, carbóxi, sulfo, sulfamoil,carbamoil, ciano, azo, nitro e os semelhantes.
Em um aspecto preferido da invenção, a proteína glicosilada éde fórmula (V)
<formula>formula see original document page 15</formula>
em que p e q são números inteiros entre 0 e 5 (e.g. 0, 1, 2, 3, 4 ou 5); t é umnúmero inteiro entre 1 e 5 (e.g. 1, 2, 3, 4 ou 5); e caracterizado pelo fato deque a proteína e unidade de carboidrato são como definido neste lugar.
A proteína ou a unidade de carboidrato podem ser ligadas ao1,2, 3,-triazol em posição 1 ou 2 como mostrado em fórmula (VI) e (VII)abaixo. Assim a proteína glicosilada da invenção pode ser de fórmula (VI) ou (VII)
<formula>formula see original document page 15</formula>
em que a proteína, unidade de carboidrato p, q e t são como definido nestelugar.
Preferivelmente p é 2.
Preferivelmente q é 0.
A invenção adicionalmente fornece uma proteína glicosiladade fórmula (VIII)
<formula>formula see original document page 15</formula>em que u é um número inteiro entre 1 e 5 (e.g. 1, 2, 3, 4 ou 5); o espaçador e tsão como definido neste lugar e caracterizado pelo fato de que W e Z sãounidades de carboidrato que podem ser as mesmas ou diferentes
Preferivelmente a proteína glicosilada é de fórmula (IX)
<formula>formula see original document page 16</formula>
em que o espaçador, p, q, t e u são como definido neste lugar; e caracterizadopelo fato de que r e s são números inteiros entre 0 e 5 (e.g. 0, 1, 2, 3, 4 ou 5).
Ainda preferivelmente a proteína glicosilada é de fórmula (X) ou (XI)
<formula>formula see original document page 16</formula>
em que a proteína, espaçador, porções de carboidrato, p, q, r, s, t e u são comodefinidos aqui.
As proteínas glicosiladas da presente invenção tipicamenteretêm sua função inerente e certas proteínas podem demonstrar uma melhoraem função, por exemplo atividade enzimática aumentada (em relação àenzima não glicosilada) seguindo glicosilação como descrito neste lugar. Asproteínas glicosiladas da invenção também podem mostrar capacidadesadicionais de ligação de proteína-proteína com outras proteínas diferentes, porexemplo capacidade de ligação a lectina. Assim o método da presenteinvenção é útil para manipular função de proteína por exemplo para incluirfuncionalidade adicional, não inerente, de proteína tal como capacidades deligação de proteína-proteína com outras proteínas diferentes e.g. Iectinas.
As proteínas glicosiladas da invenção podem ser úteis emmedicina, por exemplo no tratamento ou prevenção de uma doença oucondição clínica. Assim a invenção fornece uma composição farmacêuticacompreendendo uma proteína glicosilada de acordo com a invenção emcombinação com um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Asproteínas da invenção podem ser úteis, por exemplo, no tratamento de anemiaou doença de Gaucher.
Ao longo da descrição e reivindicações deste relatório, aspalavras "compreendem" e "contêm" e variações das palavras, por exemplo"compreendendo" e "compreende", significam "incluindo mas não limitadoa", e não são pretendidas para (e não) excluir outras unidades, aditivos,componentes, números inteiros ou etapas.
Ao longo da descrição e reivindicações deste relatório, osingular abrange o plural a menos que o contexto requeira de outra maneira.
Em particular, onde o artigo indefinido é usado, o relatório é para serentendido como contemplando pluralidade assim como singularidade, amenos que o contexto requeira de outra maneira.
Traços, números inteiros, características, compostos, unidadesou grupos químicos descritos em conjunção com um aspecto, forma derealização ou exemplo particular da invenção são para serem entendidos comosendo aplicáveis a qualquer outro aspecto, forma de realização ou exemplodescrito neste lugar a menos que incompatível com este.
A invenção agora será descrita com referência aos seguintesExemplos não limitantes.
EXEMPLOS
Mutagênese multi-sítio dirigida:
Diversos mutantes da (3-galactosidase SsPG foram criadosusando o Kit de Mutagênese multi-sítio dirigida QuikChange comercialmentedisponível a partir de Stratagene [no. de catálogo 200514], Plasmídeo pET28dcarregando Ss(3G C344S foi usado como um modelo1. Os iniciadoresmutagênicos correspondentes foram projetados para substituição de resíduosde Met por Ile e foram sintetizados sob encomenda por Sigma-Genosys eforam como segue:
Tabela Sl
<table>table see original document page 18</column></row><table>
Desta maneira mutantes com um número desejado (entre 1 e10) de resíduos de Met podem ser introduzidos. Mutações adicionais foramintroduzidas por mutagênese sítio único dirigida usando conjuntos deiniciadores mutagênicos diretos e reversos complementares:
Tabela S2
<table>table see original document page 18</column></row><table>As proteínas mutantes correspondentes devem ser expressasusando o protocolo descrito abaixo.
Expressão proteica com Incorporação de análogo de Met:
Incorporação de homopropargil glicina (Hpg) ou azidohomoalanina (Aha) em proteínas por expressão proteica usando protocolode troca de meio2. Uma cultura noturna de Escherichia coli B834 (DE3),pET28d SspG C344S foi crescida em meio de dimensões moleculares (-16h) suplementado com canamicina (50 |ig/mL) e L-metionina (40 jig/mL).
A cultura noturna foi usada para inocular meio de cultura pré-aquecido(37°C) (1,0 L, mesma composição que acima) e as células foram crescidaspor 3 h (ODeoo ~1,2). A troca de meio foi realizada por centrifugação(6.000 rpm, 10 min, 4°C), ressuspensão em meio livre de metionina (0,51)e transferência para meio de cultura pré-aquecido (37°C) (1,0 L) contendoo aminoácido não natural (DL-Hpg a 80 |ig/mL, L-Aha a 40 |ig/mL). Acultura foi agitada por 15 min a 29°C e então induzida por adição deIPTG a 1,0 mM.
Expressão proteica foi continuada a 29°C por 12 h.
A cultura foi centrifugada (9.000 rpm, 15 min, 4°C) e aspelotas celulares congeladas a -80°C. A proteína foi purificada porcromatografia de afinidade de níquel: As pelotas celulares foram transferidaspara tampão de ligação (50 ml) e células foram separadas por sonicação (3*30s, 60% de amplitude) e a suspensão foi centrifugada (20.000 rpm, 20 min,4°C). O sobrenadante foi filtrado (0,8 (im) e a proteína foi purificada emuma coluna de afinidade de níquel eluindo com uma concentraçãocrescente de imidazol. Eluição foi monitorada por absorbância de LTV a28Onm e frações combinadas por conseguinte. As frações combinadasforam dialisadas (MWCO 12-14kDa) a 22°C durante a noite contra tampãofosfato de sódio (50mM, pH 6,5, 4,01). A solução de proteína foi filtrada(0,2 |im) e armazenada a 4°C.Síntese de reagentes.
<formula>formula see original document page 20</formula>
L-Homoazido alanina foi sintetizada através de uma estratégiarearranjo de Hofmann, diazotransferência, e desproteção como descrito emliteratura3.
<formula>formula see original document page 20</formula>
DL-Homopropargil glicina foi preparada a partir de dietilacetamidomalonato por alquilação, hidrólise, e descarboxilação dehomopropargil como descrito previamente2.
l-azido-2-acetimido-2-desoxi p-D-glucopiranosídeo 1
<formula>formula see original document page 20</formula>
N-Ac-glicosil azida foram sintetizados a partir do cloreto deglicosil protegido com acetil correspondente seguido por desacetilação deZemplen4.
Quitobiosil azida 2
<formula>formula see original document page 20</formula>
Quitobiosil azida foi preparada como descrito por Macmillan et al5.
(2-metanotiossulfonato-etil) a-D-glucopiranosídeo 7
<formula>formula see original document page 20</formula>
Reagente de a-Glucopiranosil MTS foi preparado a partir debrometo conhecido através de remoção de grupo protetor e substituição demetanotiossulfonato como descrito em ref6.
(2-azido-etiI) a-D-manopiranosídeo 3
<formula>formula see original document page 21</formula>
Azidoetil a-manopiranosídeo 3 foi sintetizado de acordo comprocedimentos de literatura a partir de pentacetato de manose por glicosilaçãocom bromoetanol seguido por substituição de azida ' .
Ligante de tris-triazol 11
<formula>formula see original document page 21</formula>
Ligante de tris-triazol 11 foi preparado a partir de azido etilacetato e tripropargil amina como descrito8.
Etinil C-galactosídeo 5
Etinil (3-C-galactosídeo foi preparado da mesma maneira que oC-glucosídeo conhecido de acordo com o método de Xu5 Jinwang; Egger,Anita; Bernet, Bruno; Vasella, Andréa; Helv. Chim. Acta; 79 (7), 1996, 2004-2022.
<formula>formula see original document page 21</formula>
Reações de Molécula Pequena Modelo glico-CCHA
<formula>formula see original document page 21</formula>
Dietil homopropargil acetamidomalonato (55 mg, 0,20 mmol),HO3GIcNAc-N3 1 (101 mg, 0,41 mmol), ascorbato de sódio (202 mg, 10mmol) e ligante de tris-triazoleil amina 11 (6 mg, 0,012 mmol) foramdissolvidos em uma mistura de tampão MOPS (pH 7,5, 0,2 M; 4,0 mL) e terc-butil álcool (2,0 mL). Solução de sulfato de cobre(II) (0,1 M, 100 uL, 0,01mmol) foi adicionada à solução agitada e a mistura de reação foi agitada por28 h em temperatura ambiente. O solvente foi então evaporado em pressãoreduzida e o resíduo remanescente foi purificado por coluna cromatográficarápida em (sílica, AcOEt para 15% de MeOH em AcOEt). O produtoapareceu como uma película sem cor (83 mg, 79%).
Metil (S)-2-[N-acetil-amino]-4-{l-(2-desoxi-N-acetilamino-P-D-glucopiranosil)[l,2,3,]triazol-4-il}butanoato:
<formula>formula see original document page 22</formula>
Brometo cuproso (10 mg, 0,070 mmol) foi dissolvido emacetonitrila (1 mL) e ligante (0,58 mL de uma solução 0,12 M em acetonitrila)adicionado. Esta solução (38 \\L, 5% de carga de catalisador) foi adicionada auma solução de aminoácido alcino (15 mg, 0,08 mmol) e açúcar 2 (31 mg,0,13 mmol) em tampão fosfato de sódio (0,5 mL, 0,15M, pH 8,2). A misturade reação foi agitada em argônio em temperatura ambiente por 1 h, depois doque análise TLC indicou desaparecimento de material inicial de alcino. Amistura foi diluída com acetato de etil e lavada com água (10 mL) e a camadaaquosa lavada com AcOEt. A camada aquosa foi evaporada até secar empressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna(sílica, 1:1 etil AcOEt/iPrOH para 4:4:2 H20/iPrOH/AcOEt) para fornecer o1,2,3-triazol desejado (26 mg, 74%) como um sólido opaco sem cor.
Metil (S)-2-[N-acetil-amino]-4-{4-(p-D-galactopiranosil)[l,2,3]triazol-l-il}butanoato:
<formula>formula see original document page 22</formula>Brometo cuproso (10 mg, 0,070 mmol) foi dissolvido emacetonitrila (1 mL) e ligante de tristriazolil amina (0,58 mL, 0,12 M emacetonitrila) foi adicionado. Esta solução (45 \iL, 5% de carga de catalisador)foi adicionada a uma solução de aminoácido (20 mg, 0,10 mmol) e açúcar 5(28 mg, 0,13 mmol) em tampão fosfato de sódio (0,5 mL, 0,15 M, pH 8,2). Amistura de reação foi agitada em argônio em temperatura ambiente por 3 h. Amistura de reação foi evaporada até secar em pressão reduzida e o resíduopurificado por cromatografia em coluna (sílica, 9:1 AcOEt/MeOH para 4:4:2H20/iPrOH/AcOEt) para fornecer o 1,2,3-triazol desejado (37 mg, 97%) comoum sólido branco.
<formula>formula see original document page 23</formula>
figura xx: síntese de 0-propargil SiaLacNAc de O-propargil-N-acetilglucosamina. Uma síntese enzimática de alto rendimento muito simplesde SiaLacNAc foi empregada (referência Baisch, et.al.). Em nenhum estágiopurificação outra do que coluna cromatográfica rápida foi requerida para obterqualquer dos produtos.
2-acetamido-2-desoxi-l-propargil-p-D-glucopiranosídeo
<formula>formula see original document page 23</formula>
2-Acetamido-2-desoxi-1 -propargil-(3-D-glucopiranosídeo foidescrito previamente . Para nossos propósitos ele foi preparado comomostrado abaixo de acordo com o método de Vauzeilles, Boris; Dausse,Bruno; Palmier, Sara; Beau, Jean-Marie; Tetrahedron Lett., 42(43) 2001,7567 — 7570
2-Acetamido-2-desoxi-4-0-p-d-galactopiranosil-l-propargil-D-glucopiranosídeo
<formula>formula see original document page 24</formula>
2-Acetamido-2-desoxi-1 -propargi 1 -(3-D-glucopiranosídeo(15,0 mg, 0,058 mmol) e sal dissódico de uridina-5'-difosfogalactose (59 mg,0,092 mmol) foram dissolvidos em 1,0 mL de tampão cacodilato de sódio (0,1M, 25 mM de MnCl2, 1 mg/mL de albumina no soro bovino, pH 7,47). (3-1,4-galactosiltransferase (ec 2.4.1.22, 0,8 U) e fosfatase alcalina (ec 3.1.3.1,39 U)foram adicionados e a mistura foi agitada suavemente a 37°C por 21 horasquando tic (1:2:2 água:álcool isopropílico:acetato de etil) indicou o completodesaparecimento do açúcar aceitador (Rf 0,8). A mistura de reação foiliofilizada em sílica e purificada por coluna cromatográfica rápida (2:5:6água:álcool isopropílico:acetato de etil) para render 23,7 mg (97% derendimento) de um sólido amorfo branco.
Propargil-(5-acetimido-3,5-didesoxi-d-glicero-a-D-galacto-2-ácidononulopiranosilônico-(2->3)-P-D-galactopiranosiI-(1^4)-2-acetimido-2-desoxi-p-D-glucopiranosídeo
<formula>formula see original document page 24</formula>
2-Acetamido-2-desoxi-4-0-p-d-galactopiranosi 1 -1 -propargil-D-glucopiranosídeo (12 mg, 0,028 mmol) foi dissolvido em 1,4 mL de água.Cacodilato de sódio foi adicionado (60 mg, 0,28 mol, concentração final: 0,2M), assim como foi cloreto de manganês tetraidratado (8 mg, 0,041 mmol,concentração final 29 mM) e albumina no soro bovino (2 mg). O pH foiajustado para 7,1 antes da adição de sal de sódio de citidina-5'-monofosfo-N-ácido acetilneuramínico (19,8 mg, 1 equivalente) e a-2,3(N)-sialiltransferase,recombinante ex. Spodoptera fi-ugiperda, ec 2.4.99.6, 30 mU) e fosfatasealcalina (ec 3.1.3.1, 30 U) foram adicionados e a mistura foi agitadasuavemente a 37°C por 70 horas, depois do que a mistura de reação foiliofilizada em sílica e purificada por coluna cromatográfica rápida (5:11:15água:álcool isopropílico:acetato de etil) para render 20,9 mg de um sólidoamorfo (95% de rendimento).
Ensaio ELISA para medir papel de sulfotirosina em ligação de P-Selectina
Experimentos foram realizados para mostrar que proteínasglicosiladas pela invenção têm propriedades biológicas de ligação alteradas.
O ensaio ELISA foi modificado a partir do ensaio publicadopreviamente.
As proteínas Ss(3G modificadas foram revestidas a 200ng/poço (NUNC Maxisorp, 2|ig/mL, 50 mM de tampão carbonato, pH 9,6).
Ditiotreitol (5 fiL/poço, 50 mg/mL em água) foi adicionadopara reduzir o mimético de tirosina sulfatada às pistas apropriadas. A placa foiincubada a 4°C por 15 horas. Os poços foram bloqueados com albumina nosoro bovino (25 mg/mL em tampão de ensaio: 2 mM de CaC 12, 10 mM deTris, 150 mM de NaCl, pH 7,2, 200 [iL por poço) por 2 horas a 37°C .
A placa foi lavada com tampão de lavagem (tampão de ensaiocontendo 0,05% v/v de Tween 20, 3 x 400 (iL por poço), antes de adição deP-selectina (ex Calbiochem, cat. no. 561306, recombinante em células CHO,seqüência trancada, faltando domínio transmembrana e citoplasmático,diluição dupla serial de 400 ng/poço para 1.6 ng/poço para cada um dosmutantes diferentemente modificados SspG em 100 |iL de tampão delavagem). A placa foi incubada a 37°C por 3 horas.
Depois de lavagem com tampão de lavagem duas vezes, ospoços foram incubados com anticorpo anti-P-selectina (subtipo IgGl, exChemicon, clone AK-6, 100 ng/poço em 100 [iL de tampão de ensaio) por 1hora a 21°C (mais 3 poços controle) e lavados com tampão de lavagem (3 x300 uL/poço).
Cada um dos poços foi incubado com conjugado de anti-camundongo e HRP específico (ex Sigma, A 0168) por 1 hora a 21°C. Ospoços foram lavados com tampão de lavagem (3 x 300 |iL). A ligação foivisualizada pela adição de solução de substrato TMB (ex Sigma-Aldrich,T0440, 100 |iL, por poço) e incubando no escuro a 22°C até que asabsorbâncias lidas a 370 nm ficassem na escala linear (aprox. 15 minutos).
(S)-2-amino-4- {4-p-D-galactopiranosil) [1,2,3] triazol-l-il} butanoato
<formula>formula see original document page 26</formula>
Usando o mesmo método que acima um estudo de otimizaçãofoi conduzido usando 1,5 eq de Etinil C-galactosídeo 5 em relação a Aha.
<table>table see original document page 26</column></row><table>
* Como julgado por 1HNMR (D2O, 500 MHz); rendimento isoladoconfirmado para valor de pH 8,2 a 84%
Preparação de Fragmento Tamm-HorsfalI:
Análogos de fragmento de peptídeo Tatum-Horsfall (IHp) (295-306; H2N-Gln-Asp-Phe-Asn-Ile-Thr-AspIle-Ser-Leu-Leu-Glu-C(O)NH2)12 (H2N-Gln-Asp-Phe-Aha/Hpg-Ile-Thr-AspIle-Cys-Leu-Leu-Glu-C(0)NH2) foramsintetizados por meio de química Fmoc em resina de amida de Rink MBHA-poliestireno [1% de divinil benzeno, Novabiochem cat. no. 01-64-0037] usandoum sintetizador de peptídeo Liberty CEM assistido por microonda.
Procedimento representativo para Glico-cicloadição de proteínacontendo Azidoproteína Aha:
Etinil-P-C-galactosídeo (5 mg, 0,027 mmol) 5 foi dissolvidoem tampão fosfato de sódio (0,5 M, pH 8,2, 200 pL). Solução de proteína (0,2mg em 300 pL) foi adicionada à solução acima e misturada exaustivamente.
Uma solução recentemente preparada de brometo de cobre(l) (99,999%) emacetonitrila (33 pi de 10 mg/mL) foi pré-misturada com uma solução deacetonitrila de ligante de tris-triazolil amina 11 (12,5 (iL de 120 mg/mL). Asolução de complexo de Cu realizada (45 (iL) foi adicionada à mistura e areação foi agitada em um agitador por 1 h em temperatura ambiente. Amistura de reação foi então centrifugada para remover qualquer precipitado desais de Cu(II) e o sobrenadante dessalinizado em uma coluna PD 10 eluindocom água desmineralizada (3,5 mL). O eluente foi concentrado em umconcentrador de membrana de vivaspina (remoção de peso molecular de 10kDa) e lavado com solução de 50 mM de EDTA e então com águadesmineralizada (3 x 500 pL). Finalmente, a solução foi concentrada para 100(iL, e o produto foi caracterizado por LC-MS, eletroforese em gel SDS-PAGE, CD, digerido tríptico e digerido tríptico-LC MS/MS.
Tabela S3 Dados de digerido tríptico-HPLC/MS por exemplo material inicialS S PG-Cy s344Ser-Met21 Aha-Met43 -Aha-Met73 Aha-Met 14 8 Aha-Met204Aha-Met236Aha-Met275Aha-Met280Aha-Met383Aha-Met439Aha
<table>table see original document page 27</column></row><table>
Tabela S4 Dados de digerido tríptico-HPLC/MS para SS(3G-Cys344Ser-Met21 Aha-Met43 -T-Gal-Met73 Aha-Met 14 8 Aha-Met204Aha-Met236Aha-Met275-T-Gal-Met280-T-Gal-Met383.Aha-Met439Aha região-seletivamentetrigalactosilado
<table>table see original document page 28</column></row><table>
Resíduos de NB numerados aqui baseados em aminoácidosatuais e incluem etiqueta de His. A numeração usada ao longo do resto desterelatório é baseada em seqüência WT de SS(3G. Assim, por exemplo,fragmento tríptico T29 #280-292 corresponde a 274-286(K)D[TGal]EAVE[TGal]AENDNR(W).
Glico-cicloadição de proteína contendo Alquinilproteína Hpg:
Um procedimento análogo foi empregado para a modificaçãode proteínas contendo Hpg. Neste caso uma azida carregando carboidrato(Ho3GIcNAcN3) 1 foi usada como a parceira de reação ao invés do alquinil-(3-C-glicosídeo.
Glicoconjugação Diferencial Dual de Fragmento THp:
À uma solução de peptídeo recentemente sintetizado (Hpg- ouAha-incorporado, 0,5 mg) em tampão fosfato aquoso (50 mM, pH 8,2, 0,3mL) foi adicionada uma solução de glucosídeo MTS-reagente 7 em água (50|xL, 33 mM, 5 eq.). A reação foi posta em um agitador "de baixo para cima"por 1 h antes de uma alíquota passar por análise LCT-MS usando uma colunaPhenomenex Gemini 5fi C18 IlOA (fluxo: 1,0 mL/min, gradiente de fasemóvel: 0,05% de ácido fórmico em H2O a 0,05% de ácido fórmico em MeCNpor 20 min).
Uma solução de complexo de catalisador de cobre foi feitadissolvendo brometo cuproso (5 mg, 99,999% puro) e ligante de tris-triazol11 (18 mg) em MeCN (0,5 mL). Açúcar de etinil 5 ou açúcar de azido 1 (6mg) foi dissolvido na mistura de reação da glicoconjugação formando ligaçãodissulfeto antes de complexo de cobre(I) (15 (iL) ser adicionado. Reação entrepeptídeo apresentando Aha e açúcar de etinil foi completa encontrada poranálise LC-MS para ser completa depois de 1 h em rt. À reação de peptídeoapresentando Hpg e açúcar de azido uma quantidade extra de solução decomplexo de cobre(l) (10 }iL) foi adicionada depois de 1 h. Depois de umperíodo adicional de 1 h. análise LC-MS demonstrou conversão total dematerial inicial para o produto conjugado desejado. Sítios de reação sãomarcados com um círculo:
<formula>formula see original document page 29</formula><formula>formula see original document page 30</formula>
Comentários em otimização de condições de reação para Glico-cicloadição:
Ligante de Tristriazol 11 foi mostrado previamente naliteratura13 como sendo útil para estabilizar Cu(I) na mistura de reaçãoaquosa. Em sua ausência, oxidação para Cu(I) ocorre rapidamente. Devido àbaixa solubilidade de CuBr em outros solventes, acetonitrila foi escolhida.
Um sistema tampão levemente alcalino (pH 7,5 - pH 8,5) foiencontrado ser o mais adequado para a reação de modificação. Muitosexemplos prévios na literatura se apoiam em redução in situ de um sal deCu(II) adicionando um agente redutor à mistura de reação. Todas as nossastentativas de empregar redução in suu ue ^u^n; para catálise paramodificação de proteína se provaram insatisfatórias. A qualidade de espectrosdas amostras correspondentes foi baixa e desconvolução forneceu sinalinsuficiente para proporção de ruído.
Atividade enzimática:
Análise cinética foi realizada e mostrou que proteínas eglicoconjugados mutantes retêm atividade enzimática (dados não mostrados).
Estudos de ligação de lectina:
Experimentos foram realizados para mostrar que os açúcaresglicoconjugados afetam direcionamento biológico.
As propriedades de ligação de lectina15 de mutantes SspGglicoconjugados foram caracterizadas por análise de retenção em colunasimobilizadas de afinidade de lectina [Galab cat no. PNA, Arachis hypogaea:051061, Con A: 051041, Triticum vulgaris, K-WGA-1001]. Frações eluídasforam visualizadas com reagente de Bradford 14 e absorção foi determinadaem 595 nm.
Tabela S7
<table>table see original document page 31</column></row><table>SsPG glicosilado correspondente SspG humano demonstrouclaramente ligação a lectina Concanavalina A (Con A) de legume enquantoGlc-conjugado (Glc SsPG) não mostrou ligação significante acima derequisitos. Este também foi encontrado ser o caso para ligação de SspGconjugado com P-Gal-triazol a lectina galactofílica aglutinina de amendoim(PNA). Conjugado de quitobiose (GlcNAc SspG), e em uma pequenaproporção conjugados de GlcNAc, entretanto, foram encontrados se ligando alectina aglutinina de germe de trigo (WGA), retardando a liberação de neo-glicopeptídeos das colunas de afinidade de rotação. A ausência de ligação deglicose- ao contrário de conjugado de manose, pode possivelmente serexplicada por menores afinidades de Con A para glicose16. Ligação relativa demonossacarídeos por Con A foi encontrada sendo:
MeaMan:Man:MeaGlu:Glu na proporção 21:4:5:1. Monossacarídeos demanose são portanto ligados 4 vezes mais apertados por Con A do quemonossacarídeo de glicose. O triazol aromático também pode contribuir paraligação aumentada de manosídeo sobre glucosídeo ligado por dissulfeto.
Ausência de ligação encontrada em alguns e não outros dosacima mencionados construtos destaca a necessidade de preparação precisa deglicoproteínas.
Acessibilidade de solvente:
Apenas uns poucos estudos de reatividade de proteínas emreações químicas até o momento fornecem uma verificação integrada deacessibilidade de resíduos de aminoácidos 19-21
Estrutura cristalina de proteína de SspG foi obtida a partir deref.22. A acessibilidade de solvente para monômero A de dímero dimérico deSspG foi verificada por Naccess23. Dados de acessibilidade para monômero Bforneceram valores praticamente idênticos. Os valores dados comoacessibilidade relativa total de cadeia lateral é de interesse neste estudo. Estesvalores são uma medida da acessibilidade da cadeia lateral de um dadoaminoácido X em relação à acessibilidade da mesma cadeia lateral notripeptídeo Ala-X-Ala. Portanto, deve ser esperado que a acessibilidade deresíduo Nterminal Metl para os mutantes de SspG estudados seja ainda maiordo que para a proteína WT calculada uma vez que os mutantes expressos têmMetl-Gly2 espaçado do resto da seqüência por uma etiqueta de His7 (nãonumerada).
Acessibilidade de solvente foi além disso baseada naseqüência de aminoácidos naturais e não e.g. mutantes incorporados comhomoazidoalanina e homopropargil glicina.
Os cálculos foram realizados usando diferentes tamanhos desonda (1,0 A, 1,4 A, e 2,8 A), menos cadeias laterais de aminoácidos setornaram acessíveis aumentando o tamanho de sonda.
Baseado nestes dados (veja tabela abaixo) deve ser antecipadoque resíduos de metionina em posições 1, 43, 275, 280 são relativamenteacessíveis. O mesmo pode ser esperado para seus mutantes de análogo demetionina.
Tabela S8
<table>table see original document page 33</column></row><table>
A figura abaixo mostra, em cores, a acessibilidade relativa deWT-SsPG.
Em barris TIM:
A dobra terciária de longe mais comum observada emestruturas cristalinas de proteína é o barril TIM. Acredita-se que ele estejapresente em cerca de 10% de todas as proteínas24.
Na glicoproteína Tamm-HorsfaIl (THp):
THp é a glicoproteína mais abundante em mamíferos 'Padrão de Glicosilação N assim como O é conhecido por desempenhar umpapel chave na função biológica de Thp.26 Dos oito sítios de N-glicosilaçãopossíveis, sete são conhecidos por serem glicosilados. Entre estes estãoresíduo Asn298.
Glicosilação de Eritropoietina e Glucosilceramidase
Para Eritropoietina os respectivos sítios de glicosilação sãoAsn24, Asn38 e Asn83 para os carboidratos ligados por Ν. A proteína contémum único sítio de glicosilação O-Iigado em Serl26. Usando mutagênese multi-sítio dirigida e incorporação de análogos de metionina nos sítios de Metrecentemente introduzidos (a seqüência natural de Epo contém apenas umaúnica metionina (M54)) a proteína pode ser modificada.
Glucosilceramidase (D-glucocerebrosidase), uma glicoproteínade 60 kD que desempenha um importante papel no desenvolvimento derepresentantes de doença de Gaucher, também é glicosilada por estametodologia.
Referências
1. Hancock, S. M., Corbett, K., Fordham-Skelton, A. P., Gatehouse, J. A. &Davis, B. G. Developing promiscuous glycosidases for glycoside synthesis:Residues W433 and E432 in Sulfolobus solfataricus beta-glycosidase areimportant glucoside- and galactoside-specificity determinants. ChemBioChem6, 866-875 (2005).
2. van Hest, J. C. M., Kiick, K. L. & Tirrell, D. A. Efficient incorporation ofunsaturated methionine analogues into proteins in vivo. J. Am. Chem. Soe.122, 1282-1288 (2000).
3. Andruszkiewicz, R. & Rozkiewicz, D. An Improved Preparation of N2-tertButoxycarbonyl- and N2-Benzyloxy-carbonyl-(S)-2,4-diaminobutanoicAcids. Synth. Commun. 34, 1049-1056 (2004).
4. Szilagyi, L. & Gyorgydeak, Z. investigation of glycosyl azides and otherazido sugars: Stereoehemical influences on the one-bond 13C-1H couplingconstants. Carbohydr. Res. 143, 21-41 (1985).
5. Macmillan, D., Dailies, A. M., Bayrhuber, M. & Flitsch, S. L. Solid-PhaseSynthesis of Thioether-Linked Glyeopeptide Mimies for Application toGlycoprotein Semisynthesis. Org. Lett. 4, 1467-1470 (2002).
6. Davis, B. G., Lloyd, R. C. & Jones, J. B. Controlled Site-SeleetiveGlycosylation of Proteins by a Combined Site-Direeted Mutagenesis andChemical Modification Approach. J. Org. Chem. 63, 9614-9615 (1998).
7. Chernyak, A. Y. e. a. 2-Azidoethyl glycosides: glycosides potentially usefulfor the preparation of neoglycoconjugates. Carbohydr. Res. 223,303-309 (1992).
8. Fahmi, C. J. & Zhou, Z. A. Fluorogenic Probe for the Copper(I)-CatalyzedAzideAlkyne Ligation Reaction: Modulation of the Fluorescence Emissionvia 3(n,p*)- l(p,p*) Inversion. J. Am. Chem. Soe. 126 (2003).
9. Lowary, T., Meldal, M., Helmboldt, A., Vasella, A. & Bock, K. NovelType of Rigid C-Linked Glycosylacetylene - Phenylalanine Building Blocksfor Combinatorial Synthesis of C-Iinked Glycopeptides. J. Org. Chein. 63,9657-9668 (1998).
12. Pennica, D. e. a. Identification of Human Uromodulin as the Tamm-Horsfall Urinary Glycoprotein. Science 236, 83-88 (1987).
13. Chan, T. R., Hilgraf, R., Sharpless, Κ. B. & Fokin, V. V. Polytriazoles asCopper(I)-Stabilizing Ligands in Catalysis. Org. Lett. 6, 2853-2855 (2004).
14. Bradford, Μ. Μ. A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding.Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).15. Pearce, 0. Μ. Τ. et al. Glycoviruses: chemical glycosylation retargetsadenoviral gene transfer. Angew. Chem. Intl Ed. 44, 1057-1061 (2005).
16. Schwarz, F. P., Puri, K. D., Bhat5 R. G. & Surolia, A. Thermodynamics ofMonosaccharide Binding to Coneanavalin A, Pea (Pisum sativum) Lentil, andLentil (Lens culinaris) Leetin./. Biol Chem. 268, 7668-7677 (1993).
17. Poretz, R. D. & Goldstein5 I. J. Protein-Carbohydrate Interaction.Biochem. Pharmacol. 20, 2727-2739 (1971).
18. Lee, B. & Richards, F. M. The Interpretation of Protein Structures:Estimation of Statie Accessibility. J. Mol Biol. 55, 379-400 (1971).
19. Gloeker5 M. 0., Borehers5 C.5 Fiedler5 W.5 Suckau, D. & Przybylski, M.Molecular Characterization of Surfaee Topology in Tertiary Structures byAmino-Acylation and Mass Spectrometrie Peptide Mapping. Biocon j. Chem.5, 583-590 (1994).
21. Santrucek5 J., Strohalm, M., Kadlcik, V., Hynek, R. & Kodicek, M.Tyrosine residues modification studied by MALDI-TOF mass spectrometry.Biochem. Biophys. Res. Commun. 323, 1151 -1156 (2004).
22. Aguilar, C. F. et al. Crystal structure of the beta-glycosidase from thehyperthermophilic archeon Sulfolobus solfataricus: resilience as a key factorin thermostability. Mol. Biol. 271, 789-802 (1997).
24. Farber, G. K. An alpha/beta-barrel full of evolutionary trouble. Curr.Opin. Struet Biol. 3, 409-412 (1993).
25. Tamm, I. & Horsfall, F. L. A mucoprotein derived from human urinewhich reacts with influenza, mumps, and Newcastle desease viruses. Exp.Med. 95,71-79(1952).
26. Easton, R. L., Patankar, M. S., Clark5 G. F., Morris, H. R. & Dell, A.Pregnancy-associated Changes in the Glycosylation of Tamm-HorsfallGlycoprotein. J. Biol Chem. 275, 21928-21938 (2000).
27. van Rooijen, J. J. M., Voskamp, A. F., Kamerling, J. P. & Vliegenthart, F.G. Glycosylation sites and site-specific glycosylation in human Tamm-Horsfall glycoprotein. Glycobiology 9, 21-30 (1999).
Claims (42)
1. Método para glicosilar uma proteína, caracterizado pelo fatode que compreende as etapas dei) modificar uma proteína para incluir um grupo alquileno e/ou azida;eii) reagir a proteína modificada em (i) com(a) uma porção de carboidrato modificada para incluir um grupoazida; e/ou(b) uma porção de carboidrato modificada para incluir um grupoalquileno na presença de um catalisador Cu(I).
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a modificação para a proteína envolve a substituição de um oumais aminoácidos na proteína por um ou mais análogos de aminoácidos nãonaturais.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o análogo de aminoácido não natural é um análogo de metionina.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que o análogo de metionina é homopropargil glicina ou azidohomoalanina.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a proteína compreende mais do que 10 aminoácidos.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que a proteína compreende entre 10 e 1.000 aminoácidos.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a proteína tem um peso molecular de mais do que IOkDa.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que a proteína tem um peso molecular entre 10 e 1 OOkDa.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, caracterizado pelo fato de que a proteína é selecionada a partir do grupoconsistindo de glicoproteínas, proteínas sangüíneas, hormônios, enzimas,receptores, anticorpos, interleucinas e interferons.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que a proteína é um hormônio.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que o hormônio é eritropoietina.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a modificação para a proteína(etapa i) compreende adicionalmente a etapa de modificar a proteína paraincluir um grupo tiol.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o grupo tiol é introduzido através da inserção de um resíduode cisteína na seqüência de aminoácidos da proteína.
14. Método para glicosilar uma proteína, caracterizado pelofato de compreender as etapas dei) (a) modificar uma proteína para incluir um grupo alquileno e/ouazida; e(b) antes ou depois da modificação para a proteína em (a),opcionalmente modificar uma proteína para incluir um grupotiol; eii) reação seqüencial da proteína modificada em (i) com uma porção decarboidrato (c) na presença de um catalisador Cu (I) antes ou depoisde reação com um reagente de carboidrato seletivo para tiol (d)(c) uma porção de carboidrato modificada para incluir um grupoazida e/ou uma porção de carboidrato modificada para incluirum grupo alquileno; e(d) um reagente de carboidrato seletivo para tiol.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que o reagente de carboidrato seletivo para tiol é um reagente quereage com um grupo tiol em uma proteína para introduzir um resíduo deglicosil ligado à proteína através de uma ligação de dissulfeto.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que o reagente de carboidrato seletivo para tiol é um reagente deglicotiosulfonato.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que o reagente de glicotiosulfonato é reagente deglicometanotiosulfonato.
18. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que o tiol seletivo é um reagente de glicoselenilsulfeto.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedente, caracterizado pelo fato de que o catalisador Cu(I) é selecionado apartir do grupo consistindo de CuBr e CuI.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que o catalisador Cu(I) é Cu(I)Br.
21. Método de acordo com a reivindicação 19 ou 20,caracterizado pelo fato de que o catalisador Cu(I) é fornecido na presença deum ligante estabilizante de amina.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que o ligante é um ligante de tristriazolil amina.
23. Proteína, caracterizada pelo fato de ser de fórmula (III): <formula>formula see original document page 39</formula> em que a e b são números inteiros entre 0 e 5; e ρ e q são números inteirosentre 1 e 5.
24. Proteína, caracterizada pelo fato de ser glicosilada pelométodo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22.
25. Proteína glicosilada, caracterizada pelo fato de ser defórmula (IV): <formula>formula see original document page 40</formula> em que t é um número inteiro entre 1 e 5; e o espaçador, quepode estar ausente, é uma porção alifática tendo de 1 a 8 átomos de C.
26. Proteína glicosilada de acordo com a reivindicação 25,caracterizada pelo fato de que o espaçador é selecionado a partir do grupoconsistindo de um grupo alquila C1-6 e um heteroalquila C1-6.
27. Proteína glicosilada de acordo com a reivindicação 26,caracterizada pelo fato de que o espaçador é selecionado a partir do grupoconsistindo de metil, etil e CH2(X)y em que X é 0, N ou S e y é 0 ou 1.
28. Proteína glicosilada de acordo com qualquer uma dasreivindicações 25 a 27, caracterizada pelo fato de que a proteína é de fórmula (V): <formula>formula see original document page 40</formula> em que peq são números inteiros entre 0 e 5; t é um númerointeiro entre 1 e 5.
29. Proteína glicosilada de acordo com a reivindicação 28,caracterizada pelo fato de que a proteína é de fórmula (VI): <formula>formula see original document page 40</formula>
30. Proteína glicosilada de acordo com a reivindicação 28,caracterizada pelo fato de que a proteína é de fórmula (VII): <formula>formula see original document page 41</formula>
31. Proteína glicosilada, caracterizada pelo fato de ser defórmula (VIII): <formula>formula see original document page 41</formula> em que u e t são números inteiros entre 1 e 5; o espaçador, quepode estar ausente, é uma porção alifática tendo de 1 a 8 átomos de C; e W eZ são porções de carboidratos que podem ser as mesmas ou diferentes.
32. Proteína glicosilada de acordo com a reivindicação 31,caracterizada pelo fato de que a proteína é de fórmula (IX) <formula>formula see original document page 41</formula> em que p, q, r e s são números inteiros entre 0 e 5.
33. Proteína glicosilada de acordo com a reivindicação 32,caracterizada pelo fato de que a proteína é de fórmula (X):
34. Proteína glicosilada de acordo com a reivindicação 32,caracterizada pelo fato de que a proteína é de fórmula (XI)
35. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações-23 a 34, caracterizada pelo fato de que a proteína compreende mais do que 10aminoácidos.
36. Proteína de acordo com a reivindicação 35 caracterizadapelo fato de que a proteína compreende entre IOe 1.000 aminoácidos.
37. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações-23 a 34, caracterizada pelo fato de que a proteína tem um peso molecular demais do que 1 OkDa.
38. Proteína de acordo com a reivindicação 37 caracterizadapelo fato de que a proteína tem um peso molecular entre IOe 1 OOkDa.
39. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações-23 a 34, caracterizada pelo fato de que a proteína é selecionada a partir dogrupo consistindo de glicoproteínas, proteínas sangüíneas, hormônios,enzimas, receptores, anticorpos, interleucinas e interferons.
40. Proteína de acordo com a reivindicação 39 caracterizadapelo fato de que a proteína é um hormônio.
41. Proteína de acordo com a reivindicação 40 caracterizadapelo fato de que o hormônio é eritropoietina.
42. Proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações-23 a 41, caracterizada pelo fato de ser para uso como um medicamento.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0507123.8 | 2005-04-08 | ||
| GBGB0507123.8A GB0507123D0 (en) | 2005-04-08 | 2005-04-08 | Method |
| PCT/GB2006/001274 WO2006106348A2 (en) | 2005-04-08 | 2006-04-06 | Protein glycosylation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0609088A2 true BRPI0609088A2 (pt) | 2010-11-16 |
Family
ID=34586902
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0609088-5A BRPI0609088A2 (pt) | 2005-04-08 | 2006-04-06 | método para glicosilar uma proteìna, e, proteìna |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20110059501A1 (pt) |
| EP (1) | EP1871784A2 (pt) |
| JP (1) | JP2008534665A (pt) |
| KR (1) | KR20080007575A (pt) |
| CN (1) | CN101198619A (pt) |
| AU (1) | AU2006232642A1 (pt) |
| BR (1) | BRPI0609088A2 (pt) |
| CA (1) | CA2603936A1 (pt) |
| EA (1) | EA013265B1 (pt) |
| GB (1) | GB0507123D0 (pt) |
| IL (1) | IL186500A0 (pt) |
| MX (1) | MX2007012544A (pt) |
| NZ (1) | NZ562996A (pt) |
| WO (1) | WO2006106348A2 (pt) |
| ZA (1) | ZA200709105B (pt) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9005577B2 (en) | 2008-04-30 | 2015-04-14 | Siemens Medical Solutions Usa, Inc. | Substrate based PET imaging agents |
| US8431551B2 (en) | 2010-01-12 | 2013-04-30 | Albert Duoibes | Nutritional composition made using isolated organic matter |
| WO2011094580A2 (en) * | 2010-01-28 | 2011-08-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Chelated copper for use in the preparation of conjugated oligonucleotides |
| US20140308699A1 (en) | 2010-07-30 | 2014-10-16 | Glycode | Yeast artificial chromosome carrying the mammalian glycosylation pathway |
| WO2012127045A1 (en) | 2011-03-23 | 2012-09-27 | Glycode | A yeast recombinant cell capable of producing gdp-fucose |
| WO2012142659A1 (en) * | 2011-04-19 | 2012-10-26 | Baker Idi Heart And Diabetes Institute Holdings Limited | Site-selective modification of proteins |
| WO2013042581A1 (ja) * | 2011-09-20 | 2013-03-28 | 国立大学法人和歌山大学 | 新規シアロ糖鎖の製造方法 |
| EP2820030A4 (en) * | 2012-02-29 | 2015-04-15 | Ambrx Inc | INTERLEUKIN-3-POLYPEPTIDE CONJUGATES AND ITS USES |
| JP6324660B2 (ja) * | 2013-03-19 | 2018-05-16 | 国立大学法人 和歌山大学 | 新規（２→３）結合型シアロ糖鎖の製造方法 |
| WO2015031147A1 (en) * | 2013-08-26 | 2015-03-05 | Duoibes Albert R | Catalyst and related methods |
| US20160130324A1 (en) | 2014-10-31 | 2016-05-12 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | C1 Inhibitor Fusion Proteins and Uses Thereof |
| US20180334493A1 (en) | 2015-11-19 | 2018-11-22 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Recombinant human c1 esterase inhibitor and uses thereof |
| EP3210626A1 (en) * | 2016-02-26 | 2017-08-30 | biolitec Unternehmensbeteiligungs II AG | Conjugates of porphyrinoid photosensitizers and glycerol-based polymers for photodynamic therapy |
| US11837327B2 (en) | 2022-01-10 | 2023-12-05 | Climax Foods Inc. | System and method for protein selection |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL77081A (en) * | 1984-12-04 | 1999-10-28 | Genetics Inst | AND sequence encoding human erythropoietin, a process for its preparation and a pharmacological preparation of human erythropoietin |
| US5470949A (en) * | 1992-12-15 | 1995-11-28 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Method for making amino acid glycosides and glycopeptides |
| US5589356A (en) * | 1993-06-21 | 1996-12-31 | Vanderbilt University | Litigation of sidechain unprotected peptides via a masked glycoaldehyde ester and O,N-acyl rearrangement |
| EP0737682B1 (en) * | 1995-04-11 | 2002-01-09 | Mitsui Chemicals, Inc. | Substituted thiophene derivative and agricultural and horticultural fungicide containing the same as active ingredient |
| JP3856561B2 (ja) * | 1998-04-15 | 2006-12-13 | 三井化学株式会社 | 植物病害防除剤組成物 |
| JP3824421B2 (ja) * | 1998-04-24 | 2006-09-20 | 三井化学株式会社 | 植物病害防除剤組成物 |
| JP3963570B2 (ja) * | 1998-04-24 | 2007-08-22 | 三井化学株式会社 | 植物病害防除剤組成物 |
| JP3824420B2 (ja) * | 1998-04-24 | 2006-09-20 | 三井化学株式会社 | 植物病害防除剤組成物 |
| JP3963569B2 (ja) * | 1998-04-24 | 2007-08-22 | 三井化学株式会社 | 植物病害防除剤組成物 |
| US6512098B2 (en) * | 1998-07-02 | 2003-01-28 | Genencor International, Inc. | Chemically modified proteins with a carbohydrate moiety |
| JP4090639B2 (ja) * | 1999-09-03 | 2008-05-28 | 三井化学株式会社 | 植物病害防除剤組成物 |
| JP4090638B2 (ja) * | 1999-09-03 | 2008-05-28 | 三井化学株式会社 | 植物病害防除剤組成物 |
| US6570040B2 (en) * | 2000-03-16 | 2003-05-27 | The Regents Of The University Of California | Chemoselective ligation |
| US7598055B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
| JP2002176998A (ja) * | 2000-12-15 | 2002-06-25 | Meiji Milk Prod Co Ltd | ムチン型糖ペプチドおよび糖タンパク質製造法 |
| US7767643B2 (en) * | 2000-12-29 | 2010-08-03 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Protection, restoration, and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs |
| HUP0600342A3 (en) * | 2001-10-25 | 2011-03-28 | Genentech Inc | Glycoprotein compositions |
| JP2003235561A (ja) * | 2002-02-21 | 2003-08-26 | Kazuhito Fujiyama | 植物型糖鎖を持つ糖タンパク質を動物型糖鎖を持つ糖タンパク質に変換する方法 |
| US7301006B2 (en) * | 2002-07-16 | 2007-11-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods and materials for the synthesis of modified peptides |
| JP5642916B2 (ja) * | 2003-04-17 | 2014-12-17 | ザ スクリプス リサーチ インスティテュート | 真核遺伝コードの拡張 |
| EP2392923B1 (en) * | 2003-06-18 | 2014-05-21 | The Scripps Research Institute | Method of producing proteins comprising unnatural amino acid |
| ATE506370T1 (de) * | 2003-06-24 | 2011-05-15 | Isis Innovation | Reagenzien und verfahren zur bildung von disulfid-bindungen und glykosylierung von proteinen |
| DE102004029972A1 (de) * | 2004-06-21 | 2006-01-05 | Bayer Cropscience Ag | Beizmittel zur Bekämpfung von phytopathogenen Pilzen |
| ATE408341T1 (de) * | 2004-09-27 | 2008-10-15 | Du Pont | Fungizide mischungen mit thiophenderivaten |
| US9185911B2 (en) * | 2005-02-04 | 2015-11-17 | Mitsui Chemicals, Inc. | Composition for preventing plant diseases and method for preventing the diseases |
-
2005
- 2005-04-08 GB GBGB0507123.8A patent/GB0507123D0/en not_active Ceased
-
2006
- 2006-04-06 NZ NZ562996A patent/NZ562996A/en not_active IP Right Cessation
- 2006-04-06 KR KR1020077025889A patent/KR20080007575A/ko not_active Application Discontinuation
- 2006-04-06 AU AU2006232642A patent/AU2006232642A1/en not_active Abandoned
- 2006-04-06 US US11/910,883 patent/US20110059501A1/en not_active Abandoned
- 2006-04-06 EA EA200702193A patent/EA013265B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2006-04-06 BR BRPI0609088-5A patent/BRPI0609088A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-04-06 CA CA002603936A patent/CA2603936A1/en not_active Abandoned
- 2006-04-06 EP EP06726677A patent/EP1871784A2/en not_active Withdrawn
- 2006-04-06 JP JP2008504845A patent/JP2008534665A/ja active Pending
- 2006-04-06 WO PCT/GB2006/001274 patent/WO2006106348A2/en active Application Filing
- 2006-04-06 MX MX2007012544A patent/MX2007012544A/es unknown
- 2006-04-06 CN CNA2006800200961A patent/CN101198619A/zh active Pending
-
2007
- 2007-10-08 IL IL186500A patent/IL186500A0/en unknown
- 2007-10-22 ZA ZA200709105A patent/ZA200709105B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101198619A (zh) | 2008-06-11 |
| EA200702193A1 (ru) | 2008-04-28 |
| GB0507123D0 (en) | 2005-05-11 |
| JP2008534665A (ja) | 2008-08-28 |
| IL186500A0 (en) | 2008-01-20 |
| AU2006232642A1 (en) | 2006-10-12 |
| WO2006106348A3 (en) | 2007-01-04 |
| NZ562996A (en) | 2009-08-28 |
| US20110059501A1 (en) | 2011-03-10 |
| KR20080007575A (ko) | 2008-01-22 |
| EP1871784A2 (en) | 2008-01-02 |
| EA013265B1 (ru) | 2010-04-30 |
| ZA200709105B (en) | 2008-08-27 |
| WO2006106348A2 (en) | 2006-10-12 |
| MX2007012544A (es) | 2008-02-25 |
| CA2603936A1 (en) | 2006-10-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BRPI0609088A2 (pt) | método para glicosilar uma proteìna, e, proteìna | |
| Cummings et al. | The distribution of repeating [Gal beta 1, 4GlcNAc beta 1, 3] sequences in asparagine-linked oligosaccharides of the mouse lymphoma cell lines BW5147 and PHAR 2.1. | |
| AU2004204463B2 (en) | Catalytic domains of beta(1,4)-galactosyltransferase I having altered donor and acceptor specificities, domains that promote in vitro protein folding, and methods for their use | |
| Wright | Crystal structure of a wheat germ agglutinin/glycophorin-sialoglycopeptide receptor complex. Structural basis for cooperative lectin-cell binding. | |
| Grabenhorst et al. | Construction of Stable BHK‐21 Cells Coexpressing Human Secretory Glycoproteins and Human Gal (β1‐4) GlcNAc‐R α2, 6‐Sialyltransferase: α2, 6‐Linked NeuAc is Preferentially Attached to the Gal (β1‐4) GlcNAc (β1‐2) Man (α1‐3)‐Branch of Diantennary Oligosaccharides from Secreted Recombinant β‐Trace Protein | |
| Gross et al. | Transfer of synthetic sialic acid analogs to N-and O-linked glycoprotein glycans using four different mammalian sialyltransferases | |
| US6939945B2 (en) | Synthetic peptides, conjugation reagents and methods | |
| JPH05336963A (ja) | 新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ | |
| US20100267090A1 (en) | Novel saccharide primer | |
| EP2684899B1 (en) | Method for producing glycopeptide having sialyl sugar chain, sialyl sugar chain-added amino acid derivative to be used in same, and glycopeptide | |
| Meldal | Glycopeptide synthesis | |
| EP1801118A1 (en) | Process for synthesis of mucin-type peptides and muc1-related glycopeptides | |
| Baisch et al. | On the preparative use of recombinant pig α (1–3) galactosyl-transferase | |
| JPH10502068A (ja) | 新規オリゴシド誘導体、その調製方法およびその利用 | |
| WO2010150558A1 (ja) | 糖ペプチドの合成法 | |
| Plíhal et al. | The Isoforms of Rat Natural Killer Cell Receptor NKR-P1 Display a Distinct Binding of Complex Saccharide Ligands-RETRACTED | |
| Borgia et al. | Difficulties encountered during glycopeptide syntheses | |
| Franzyk et al. | Glycopeptide mimics of mammalian Man9GlcNAc2. Ligand binding to mannan-binding proteins (MBPs) | |
| Fukuda et al. | Erythropoietin metabolism and the influence of carbohydrate structure | |
| KR20030082039A (ko) | Ｎ-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라제 활성을 갖는융합단백질, 이를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자가도입된 형질전환 세포주 | |
| Brandenburg | 50 Shades of Sugarcoating: Recent Advances in Convergent Peptide Glycosylation for Homogeneous Glycoprotein Synthesis | |
| van Kasteren et al. | Chemical methods for mimicking post-translational modifications | |
| WO2007114307A1 (ja) | ポリラクトサミン骨格を有するムチン型糖ペプチド | |
| Vogelmeir | Expression of Peptide-and Glycopeptide Modifying Glycosyltransferases for Applications in Liquid-and Solid Phase Carbohydrate Synthesis | |
| Pratt | Synthetic and chemical approaches for understanding glycosylation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06G | Technical and formal requirements: other requirements [chapter 6.7 patent gazette] |
Free format text: SOLICITA-SE A REGULARIZACAO DA PROCURACAO, UMA VEZ QUE BASEADO NO ARTIGO 216 1O DA LPI, O DOCUMENTO DE PROCURACAO DEVE SER APRESENTADO NO ORIGINAL, TRASLADO OU FOTOCOPIA AUTENTICADA. |
|
| B08F | Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE A 6A ANUIDADE. |
|
| B08K | Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE AO DESPACHO 8.6 PUBLICADO NA RPI 2161 DE 05/06/2012. |