CN101198619A - 蛋白糖基化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白糖基化的方法，其中蛋白被修饰以包括炔和/或叠氮基。本发明还涉及利用这些方法提供的糖基化蛋白。

Description

蛋白糖基化
发明领域
本申请涉及蛋白糖基化的方法和利用这些方法制备的糖基化蛋白。
发明背景
蛋白在翻译过程中和翻译过程后的糖基化在它们的生物学性能和稳定性方面起着重要作用(R.Dwek，Chem.Rev.，96：683-720(1996))。例如，糖基化在重要的生物过程比如细胞信号传递和调节、发育和免疫中起着重要作用。这些事件的研究因以下事实而非常困难：自然界的糖蛋白以称为糖型的混合物形式存在，它们具有相同肽骨架，但在糖基化性质和位点方面不同。此外，因为蛋白糖基化不是直接受遗传控制，治疗性糖蛋白在哺乳动物细胞培养中的表达导致非均匀糖型的混合物。因此合成均质糖蛋白糖型的能力不仅是达到准确研究目的的先决条件，而且在制备治疗性糖蛋白时其重要性越来越高，当前市场上的所述治疗糖蛋白为多糖型混合物(例如红细胞生成素和白介素)。因此控制蛋白糖基化的程度和性质可以使在生物系统中研究和控制其性能变成可能。
蛋白糖基化的大量方法是公知的，包括化学合成。糖蛋白的化学合成具有某些优点，至少具有得到纯糖蛋白糖型的可能性。一种已知的合成方法利用硫醇选择性的糖类试剂，糖基甲磺酰硫代(糖基-MTS)。这种糖基甲磺酰硫代试剂与蛋白的硫醇基反应，通过二硫键引入与蛋白连接的糖基残基。
Cu(I)催化的三唑形成已经用于大量的标记研究(Link等人，J.Am.Chem.Soc.125：11164-11165 2003；Link等人，J.Am.Chem.Soc.126：10598-10602 2004；和Speers等人，Chemistry and Biology 11：535-5462004)以及在合成中(Tornoe等人，J.Org.Chem.67(9)：3057-3064 2002)。这种反应吸引人的特征在于叠氮基与炔基反应的高选择性，以及在存在各种其他官能团的含水条件下进行反应的能力。
最近文献(Kuijpers等人，Org.Lett.6(18)：3123-3126 2004)已经证明从合适地官能团保护的糖类和保护的氨基酸/肽合成三唑连接的糖基氨基酸和小的糖肽。此外还有其他类型三唑连接的糖结合物的报道(Chittaboina等人，Tetrahedron Lett.46：2331-2336 2005)，其利用保护的糖类衍生物进行合成。
Lin和Walsh修饰了一种10个氨基酸的环肽，N-乙酰半胱胺硫酯(SNAC)将炔官能团引入肽中。该方法涉及在肽的不同位置用非天然氨基酸类似物，炔丙基甘氨酸，取代肽的氨基酸(Van Hest et al，J.Am.Chem.Soc.122：1282-1288(2000)和Kiick等人，Tetrahedron56：9487-9493(2000))。然后修饰的肽与叠氮基糖结合产生糖基化的环肽。
需要一种比在现有技术描述的更简化的方法，例如不需要使用保护的糖基化试剂，用于更复杂结构例如蛋白的糖基化，并且可以在大范围不同蛋白的多个位点进行糖基化。
发明描述
根据本发明的第一个方面，提供一种修饰蛋白的方法，所述方法包括修饰蛋白以包括至少炔基和/或叠氮基。
在此处使用时，“叠氮”基团是指(N＝N＝N)，“炔”基团是指碳碳三键。
蛋白修饰通常涉及用一个或多个包括炔基和/或叠氮基的氨基酸类似物取代蛋白中的一个或多个氨基酸。此外，或者除以上所述之外，蛋白修饰可以包括如此处讨论在蛋白中引入一个或多个天然氨基酸。在另一个选择中，蛋白修饰可以涉及氨基酸侧链的修饰以包括化学基团，例如硫醇基。蛋白的修饰以包括叠氮基、炔基或者硫醇基，通常发生在蛋白氨基酸序列内部预先确定的位置。
在本发明的优选方面，蛋白修饰涉及用一个或多个非天然(即非天然存在的)氨基酸类似物取代蛋白的一个或多个氨基酸。非天然氨基酸类似物可以是甲硫氨酸类似物。甲硫氨酸类似物可以是高炔丙基甘氨酸(Hpg)(Van Hest等人，J.Am.Chem.Soc，122，1282-1288(2000))，高烯丙基甘氨酸(Hag)(Van Hest等人，FEBS Letters，428，68-70(1998))和/或叠氮基高丙氨酸(Aha)(Kiick等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99，19-24(2002)，优选高炔丙基甘氨酸。
进行蛋白修饰以引入一个或多个非天然氨基酸，例如甲硫氨酸类似物，可以通过本领域公知方法完成，参见例如Van Hest等人，J.Am.Chem.Soc.122，1282-1288(2000)。具体来说引入一个或多个甲硫氨酸类似物的蛋白修饰涉及定位突变，在编码蛋白的核酸序列中插入编码甲硫氨酸的密码子AUG。优选的甲硫氨酸密码子的插入发生在编码蛋白的核酸序列内的预先确定的位置，例如在编码蛋白N-端(或者氨基端)的核酸序列区域内的位置。在甲硫氨酸类似物例如Aha或者Hpg存在的条件下，在营养缺陷型的甲硫氨酸-缺陷菌株中翻译包含插入的甲硫氨酸密码子的核酸序列，可以获得蛋白的表达。
本发明的方法可能涉及蛋白修饰，通过用高炔丙基甘氨酸或者高烯丙基甘氨酸取代蛋白一个或多个氨基酸的步骤以包括炔基。
可选的，或者此外，方法发明可能涉及蛋白修饰，通过用叠氮基高丙氨酸取代蛋白的一个或多个氨基酸的步骤以包括叠氮基。
优选的本发明的方法涉及蛋白修饰以包括叠氮基(如此处描述)和炔基(如此处描述)。
本文中术语“蛋白”通常表示通过肽键连接在一起的多个(至少2个氨基酸)的氨基酸残基(通常大于10)的集合。蛋白中包含的任意氨基酸优选的是α氨基酸。任意氨基酸可以是D-或者L-型。
在本发明的一个优选方面，蛋白包括硫醇(-SH)基，例如存在于一个或多个半胱氨酸残基中。半胱氨酸残基可以天然地存在于蛋白。在不包括半胱氨酸残基的蛋白中，蛋白可以被修饰以包括一个或多个半胱氨酸残基。硫醇基可以通过蛋白的化学修饰引入蛋白，例如在氨基酸侧链引入硫醇基或者引入一个或多个半胱氨酸残基。此外包含硫醇的蛋白可以通过定位突变引入半胱氨酸残基来制备。定位突变是本领域公知的技术(参见WO00/01712)。具体地，通过将密码子UGU插入编码蛋白的核酸序列可以在蛋白中引入半胱氨酸残基。优选的半胱氨酸密码子的插入发生在编码蛋白的核酸序列内的预先确定的位置，例如在编码蛋白C-端(或者羧基端)的核酸序列区域内的位置。其后修饰的蛋白可以被表达，例如在细胞表达系统中表达。
在此处使用时，术语“蛋白”通常表示通过肽键连接在一起的氨基酸残基的集合。它可以与肽和多肽互换使用，表示相同的意思。
术语“蛋白”还包括蛋白的片段、类似物和衍生物，其中片段、类似物或者衍生物保持与参比蛋白基本相同的生物活性或功能。
蛋白可以是线性结构，但是优选一种非线性结构，具有折叠的构象，例如三级或者四级。蛋白可能具有一个或多个与其结合的辅基，例如蛋白可以是糖蛋白、脂蛋白或者色素蛋白。优选的蛋白是复合蛋白。
优选蛋白包括的氨基酸在10到1000之间，例如在10到600之间的氨基酸，比如在10到200之间或者在10到100之间的氨基酸。因此蛋白可以包括的氨基酸在10到20、50、100、150、200或者500之间。
在本发明的一个优选方面，蛋白分子量大于10kDa。蛋白可能具有至少20kDa或者至少60kDa的分子量，例如在10和100kDa之间。
蛋白可以属于纤维状蛋白或者球状蛋白质类别。优选的，蛋白是球状蛋白。
优选，蛋白是具有生物学活性的蛋白。例如，蛋白可以选自糖蛋白，血清白蛋白和其他血液蛋白，激素，酶，受体，抗体，白介素和干扰素。
蛋白的实例可以包括生长因子，分化因子，细胞因子例如白介素，(例如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4.IL-5，IL-6，IL-7.IL-8，IL-9，IL-10，IL-11.IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，IL-19，IL-20或IL-21，[α]或者[β])，干扰素(例如IFN-[α]，IFN-[β]和IFN-[γ])，肿瘤坏死因子(TNF)，IFN-[γ]诱导因子(IGIF)，骨形成蛋白(BMP)；趋化因子，营养因子；细胞因子受体；自由基清除酶。
在本发明的一个优选方面，蛋白是激素。优选的激素是红细胞生成素(Epo)。
利用本发明的方法修饰的蛋白有益的保持内在的蛋白功能/活性。
在本发明的其他优选方面，蛋白是酶。优选的酶是葡萄糖苷酰基鞘氨醇酶(DD-葡糖脑苷脂酶)(CerezymeTM)或者硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)β-糖苷酶(SSbG)。
本发明还基于位点选择性引入标签，例如将炔基、叠氮基或者硫醇基引入氨基酸侧链上的蛋白氨基酸序列内预先确定的位点(如此处前述)，随后是顺次和正交的糖基化反应，分别选择性针对各自标签。这样，完成差异的多位点化学蛋白糖基化。
因此在本发明第二个方面，提供一种蛋白糖基化的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)根据本发明第一个方面的方法修饰蛋白；和
ii)在Cu(I)催化剂存在的条件下，将(i)中修饰的蛋白与
(a)修饰以包括叠氮基的糖基(carbohydrate moiety)；和/或
(b)修饰以包括炔基的糖基
反应。
在此处使用时，“糖基化”是指糖基单位通过共价键添加到另一基团的常规步骤。
通常，当蛋白在步骤(i)中修饰以包括炔基，步骤(ii)中的反应是与(a)中的糖基。此外，当蛋白在步骤(i)中修饰以包括叠氮基，步骤(ii)中的反应是与(b)中的糖基。
优选的蛋白修饰(步骤i)还包括此处定义的蛋白修饰以包括硫醇基的步骤，例如通过半胱氨酸残基的插入。
在本发明的优选方面，提供一种蛋白糖基化的方法，包括以下步骤
i)(a)修饰蛋白以包括炔基和/或叠氮基；和
(b)在(a)中蛋白修饰之前或者之后，任选修饰蛋白以包括硫醇基；
ii)在与硫醇-选择性糖类试剂(d)反应之前或者之后，在Cu(I)催化剂存在条件下(i)中修饰蛋白与糖基(c)顺序反应；
(c)修饰以包括叠氮基的糖基，和/或修饰以包括炔基的糖基；和
(d)硫醇-选择性糖类试剂。
步骤(i)(a)和(b)在此处描述。当待修饰蛋白包含半胱氨酸残基，修饰蛋白以包括硫醇基可能不是必需的。此外，除那些已经存在于蛋白中的以外，还可以包括一个或多个硫醇基。
这种硫醇-选择性的糖类试剂可以包括任意与蛋白的硫醇基反应的试剂，以通过二硫键引入与蛋白连接的糖残基。硫醇-选择性糖类试剂可以包括但不限于，糖基烷基磺酰硫代试剂，例如糖基甲磺酰硫代试剂(糖基-MTS)(参见WO00/01712，其内容在此完全引入)，糖基硫化硒基(glycoselenylsulfide)试剂(参见WO2005/000862，其内容在此完全引入)和糖基磺酰硫代试剂(参见WO2005/000862，其内容在此完全引入)。糖基甲磺酰硫代试剂具有化学式CH3-SO2-S-糖基。
糖基磺酰硫代和糖基硫化硒(SeS)试剂通常具有WO2005/000862(在此处引入作为参考)中的化学式I。具体地糖基硫化硒(SeS)试剂具有化学式R-S-X-糖基，其中X是Se，R是任选取代的C1-10烷基，苯基，吡啶基或者萘基。糖基磺酰硫代试剂具有化学式R-S-X-糖基，其中X是SO2，R是任选取代的C1-10苯基，吡啶基或者萘基。这种试剂通过二硫键将糖位点选择性的粘附到蛋白。
优选的被修饰的糖包括单糖，二糖，三糖，四糖低聚糖及其他多糖，并且包括位于任意天然存在的糖蛋白或者生物系统中的糖基。包括的是糖基或者糖苷衍生物，例如葡萄糖基，糖苷，半乳糖基或者半乳糖苷衍生物。糖基和糖苷基团包括α和β基团。合适的糖基包括葡萄糖，半乳糖，岩藻糖，GlcNAc，GalNAc，唾液酸，和甘露糖，以及包括至少一个葡萄糖，半乳糖，岩藻糖，GlcNAc，GalNAc，唾液酸，和甘露糖残基的多糖。
糖基可以包括Glc(Ac)4β-，GIc(Bn)4β-，Gal(Ac)4β-，Gal(Bn)4β-，Glc(Ac)4α(1，4)Glc(Ac)3α(1，4)Glc(Ac)4β-，β-Glc，β-Gal，α-Man，α-Man(Ac)4，Man(1，6)Manα-，                             Man(1-6)Man(1-3)Manα-，(Ac)4Man(1-6)(Ac)4Man(1-3)(AC)2 Manα-，-Et-β-Gal，-Et-β-Glc，Et-α-Glc，-Et-α-Man，-Et-Lac，-β-Glc(Ac)2，-β-Glc(Ac)3，-Et-α-Glc(Ac)2，-Et-α-Glc(Ac)3，-Et-α-Glc(Ac)4，-Et-β-Glc(Ac)2，-Et-β-Glc(Ac)3，-Et-β-Glc(Ac)4，-Et-α-Man(Ac)3，-Et-α-Man(Ac)4，-Et-β-Gal(Ac)3，-Et-β-Gal(Ac)4，-Et-Lac(Ac)5，-Et-Lac(Ac)6，-Et-Lac(Ac)7，和它们脱保护的等同物。
任何构成来自于自然界存在糖的糖基的糖单位都以天然地存在的对映体形式出现，可以是D型(例如D-葡萄糖或者D-半乳糖)，或者L-型(例如L-鼠李糖或者L-岩藻糖)。任何异头连接可以是α-或者β-连接。
在本发明的一个实施方案中，已经被修饰包括叠氮基的糖类是糖基叠氮化物。
在本发明的一个实施例中，已经被修饰包括炔基的糖类是炔基糖苷。
优选的叠氮基和/或炔修饰的糖基(例如糖基叠氮化物和/或炔基糖苷)不包括保护基团即，是不受保护的。未保护叠氮基和/或炔修饰的糖基可以通过向保护的糖添加叠氮基或者炔基制备。用于糖基上任意-OH基团的合适保护基团包括乙酸(Ac)，苯甲基(Bn)，甲硅烷基(例如特丁基二甲基硅基(TBDMSi)和叔丁基二苯基甲硅烷硅基(TMDPSi))，缩醛类，缩酮类，和甲氧基甲基(MOM)。在糖基粘附到蛋白之前或者之后除去保护基团。这样，与未保护的糖苷进行步骤(ii)中定义的反应。
在本发明优选的一个方面，Cu(I)催化剂是CuBr或者CuI。优选的催化剂是CuBr。Cu(I)在反应中催化剂可以提供为Cu(II)盐(例如Cu(II)SO4)，在反应混合物原位通过添加还原剂(例如抗坏血酸，羟胺，亚硫酸钠或者元素铜)其被还原为Cu(I)。优选的Cu(I)催化剂通过直接向反应物中添加Cu(I)Br提供。优选的提供高纯度的Cu(I)Br，例如至少99％纯度比如99.999％。仍然优选的Cu(I)催化剂(e.g.Cu(I)Br)在稳定配体例如氮碱存在的条件下以溶剂形式提供。配体在反应混合物中稳定Cu(I)；当其不存在时，快速氧化成Cu(II)。优选的配体是三三唑基胺配体(Wormald和Dwek，Structure，7，R1 55-R160(1999))。催化剂溶剂的pH可以在7.2-8.2之间。溶剂可以是水混溶性的有机溶剂(例如叔-BuOH)或者含水缓冲液比如磷酸盐缓冲液。优选的溶剂是乙腈。
步骤(ii)的反应是炔基(在蛋白和/或糖苷上)和叠氮基(在蛋白和/或糖苷上)的[3+2]环化加成反应，产生取代的1，2，3-三唑(Huigsen，Proc.Chem.Soc.357-369(1961))，提供蛋白和糖的连接。
本发明的其他方面提供利用本发明的第一个或者第二个方面的方法修饰的蛋白。
本发明的其他方面提供具有化学式(I)，(II)或者(III)的蛋白
Figure S2006800200961D00101
其中a和b是0和5之间的整数(例如0，1，2，3，4或者5)；p和q是1和5之间的整数(例如1，2，3，4或者5)；并且其中蛋白如此处所定义。
本发明的其他方面提供通过本发明的第二个方面的方法糖基化的蛋白。本发明还提供化学式(IV)所示的糖基化蛋白
Figure S2006800200961D00102
其中t是1和5之间的整数(例如1，2，3，4或者5)；间隔物，它可能是不存在的，是具有1到8个C原子的脂肪族部分。
在本发明的一个优选方面，间隔物是取代的或者未取代的C1-6烃基。优选间隔物不存在，或者是甲基或者乙基。
在本发明的另一个优选方面，间隔物是杂烷基，其中杂原子是O，N或者S并且烷基是甲基或者乙基。优选的杂烷基基团具有化学式CH2(X)y，其中X是O、N或者S并且Y是0或者1。通常杂原子直接与糖基连接。
取代基是卤素或者具有1到30个多价原子以及一价原子的基团，所述多价原子选自C、N、O、S，所述一价原子选自H和卤。在一类化合物中，取代基，如果存在，例如选自卤素和具有1、2、3、4或者5个多价原子以及选自氢和卤素的一价原子的基团。多价原子可以例如选自C、N、O、S和B，例如C、N、S和O。
在此处使用时，术语“取代的”与部分或者基团相关，是指各部分的一个或多个氢原子，尤其是1、2或者3个氢原子通过描述的取代基的对应编号彼此独立的被取代。
当然应当理解取代基只在具有化学可能性的位置，本领域技术人员无需过度的劳动很容易就能确定(实验或理论上)一种特定取代是否具有可能性。例如，如果用不饱和(例如烯)键结合碳原子，具有游离氢的氨基或者羟基可能是不稳定的。此外，还应理解此处描述的取代基自身可以被任何取代基替换，根据技术人员确认的对合适取代的上述限制。
因此取代的烷基可以是，例如最后定义的烷基，可以用一个或多个取代基取代，所述取代基相同或者不同，选自羟基，醚化羟基，卤素(例如氟)，羟烷基(例如2-羟基乙酯)，卤烷基(例如三氟甲基或者2，2，2-三氟乙基)，氨基，取代的氨基(例如N-烷氨基，N，N-二烷基氨基或者N-烷酰氨基)，烷氧羰基，苯基烷氧羰基，脒基，胍基，羟基胍基，亚胺甲基氨基，异硫酰脲基，酰脲基，巯基，酰基，酰氧基比如酯化羧基例如，羧基，磺基，氨磺酰，氨基甲酰，氰基，偶氮基，硝基和类似物的取代基进行取代。
在本发明的一个优选方面，糖基化蛋白具有化学式(V)
Figure S2006800200961D00121
其中p和q是0和5之间的整数(例如0，1，2，3，4或者5)；  t是1和5之间的整数(例如1，2，3，4或者5)；并且其中蛋白和糖基如此处所定义。
蛋白或者糖基可以连接到1，2，3-三唑的位置1或2处，如下列化学式(VI)和(VII)所示。因此本发明的糖基化蛋白可能具有化学式(VI)或者(VII)
Figure S2006800200961D00131
其中蛋白，糖基p，q和t如此处所定义。
优选的p是2。
优选的q是0。
本发明还提供化学式(VIII)所示的糖基化蛋白
Figure S2006800200961D00132
其中u是1和5之间的整数(例如1，2，3，4或者5)；间隔物和t如此处所定义，并且其中W和Z是相同或者不同的糖基。
优选的糖基化蛋白具有化学式(IX)
Figure S2006800200961D00141
其中间隔物，p，q，t和u如此处所定义；并且其中r和s是0和5之间的整数(例如0，1，2，3，4或者5)。
还优选，糖基化蛋白具有化学式(X)或者(XI)
其中蛋白，间隔物，糖基，p，q，r，s，t和u如此处所定义。
本发明的糖基化蛋白通常保持它们的内在功能，某些蛋白可以显示功能的改善，例如在此处描述的糖基化后增加的酶活性(相对于未糖基化的酶)。本发明的糖基化蛋白还显示与其他不同蛋白额外的蛋白-蛋白结合能力，例如外源凝集素结合能力。因此本发明的方法有利于调控蛋白功能例如以包括额外的，非内在的，蛋白功能比如与其他不同蛋白例如外源凝集素的蛋白-蛋白结合能力。
本发明的糖基化蛋白可以用于医疗用途，例如治疗或者预防疾病或者临床病症。因此本发明提供药物组合物，包括本发明的糖基化蛋白和药学上可接受的载体或者稀释剂。本发明的蛋白可以用于，例如，贫血症或者高雪氏(Gaucher)病的治疗。
贯穿本文本的说明书和权利要求书，词语“包括”和“包含”及其变形，表示“包括但不限于”，并且不是用于(和没有)排除其他部分、附加物、成分、整体或者步骤。
贯穿本文本的说明书和权利要求书，单数包括复数，除非上下文另外需要。特别的，当使用不定冠词，说明书被理解为构思了复数以及单数，除非上下文另外需要。
与本发明的特定方面、实施例或者实施方式结合描述的特点、整数、特征、化合物、化学部分或者基团，将被理解为适用此处描述的任何其他方面、实施例或者实施方案，除非与此不相容。
现在本发明将参考下列非限制性实施例进行描述。
实施例
多点定位诱变：
利用Stratagene[目录号2005 14]商品化提供的QuikChange多点定位诱变试剂盒构建β-半乳糖苷酶SsβG大量的突变体。用携带SsβGC344S的质粒pET28d作为模板1。设计对应的诱变引物用Ile替换Met残基，在Sigma-Genosys合成，如下所示：
表S1
  突变    引物序列(所有突变引物都是5′磷酸化的)
  M21I    TGACCCTGGTGTTCCTATTTCTGATTGAAATCCGG
  M43I    CTTACTAATCCCGCTGCTATGTTTTCTGGATCATGAACC
  M73I    CATTTAGTCTAGCTATTTTTAATCCTATTTTTTGTGCATTATCGTGAAATGTC
  M148I    TAGAGGTAATGGCCAATGATAGATGTTTAGTATAAAGTAAAGTCCTC
  M204I    CCAACAACGTTAGGTTCATTTATTGTTGAGTACTCATCCAC
  M236I    GAGCTTGAATGATGTTATATATCGCCCTACGGGAAAG
  M275I    CCATCTCTACCGCTTCTATATCTTTATCCGTTAACGG
  M280I    CATCTATTATCATTTTCAGCGATCTCTACCGCTTCTATATC
  M383I    CAATACCATTTTCAGTAACGTAGATATAGAGATGATATCTATTCCAG
  M439I    CCTTTAACAGACCAAACCTTATAGAGAATCCTGAAGCCC
这样可以引入具有所需数目(在1和10之间)Met残基的突变体。利用一系列互补的正反向诱变引物，通过单点定位诱变引入其他突变：
表S2
  突变     引物序列(所有突变引物都是5′磷酸化的)
  I439C     正向：GAATGGGCTTCAGGATTCTCTTGCAGGTTTGGTCTGTTAAAGGTC反向：GACCTTTAACAGACCAAACCTGCAAGAGAATCCTGAAGCCCATTC
对应的突变蛋白可以利用下面列出的规程进行表达。
整合Met类似物的蛋白表达：
利用培养基转换规程2，通过蛋白表达将高炔丙基甘氨酸(Hpg)或者叠氮基高丙氨酸(Aha)整合入蛋白。大肠杆菌(Escherichia coli)B834(DE3)，pET28d SsβG C344S的过夜培养物在添加卡那霉素(50μg/mL)和L-甲硫氨酸(40μg/mL)的分子尺寸培养基中培养(-16小时)。过夜培养物用于接种预温的(37℃)培养基(1.0L，如上同样的成分)，细胞生长3小时(OD600～1.2)。培养基转换按下述方法进行：离心(6,000rpm，10分钟，4℃)，在无甲硫氨酸的培养基(0.51)中重悬，转移到预温的(37℃)包含非天然氨基酸(80μg/mL DL-Hpg，40μg/mL L-Aha)的培养基(1.0L)。培养物在29℃振荡15分钟，添加1.0mM IPTG诱导。蛋白表达在29℃持续12小时。
培养物离心(9,000rpm，15分钟，4℃)，细胞沉淀物在-80℃冻存。蛋白通过镍亲和层析法纯化：细胞沉淀物转移入结合缓冲液(50ml)，细胞通过超声破碎(3×30秒，60％振幅)，离心悬浮液(20,000rpm，20分钟，4℃)。过滤(0.8μm)上清，蛋白在镍亲和层析柱上纯化，用浓度不断增加的咪唑洗脱。通过在280nm的UV吸收监控洗脱液，合并相应的级分。合并的部份在22℃磷酸钠缓冲液(50mM，pH6.5，4.01)中透析(MWCO 12-14kDa)过夜。过滤蛋白溶液(0.2μm)，4℃保存。
试剂的合成：
Figure S2006800200961D00171
通过文献3描述的Hofmann重排、重氮基转移和脱保护策略，合成L-高叠氮基丙氨酸。
Figure S2006800200961D00181
通过先前2描述的高炔丙基烷化、水解和脱羧作用，从乙酰氨基丙二酸二乙酯制备DL-高炔丙基甘氨酸。
1-叠氮基-2-乙酰亚氨基-2-脱氧β-D-吡喃葡萄糖苷
Figure S2006800200961D00182
从对应的乙酰基保护的糖基氯化物然后Zemplen脱乙酰合成N-Ac-葡糖基叠氮化物4。
壳二糖叠氮化物2
Figure S2006800200961D00183
按Macmillan等人5的描述制备壳二糖叠氮化物。
(2-甲磺酰硫代-乙基)α-D-吡喃葡萄糖苷7
Figure S2006800200961D00191
按参考文献6所述，从已知溴化物通过保护基团去除和甲磺酰硫代取代，制备α-吡喃葡萄糖基MTS试剂。
(2-叠氮基-乙基)α-D-吡喃甘露糖苷3
Figure S2006800200961D00192
根据文献步骤从甘露糖五乙酸酯通过溴乙醇糖基化然后叠氮化物取代，合成叠氮乙基α-吡喃甘露糖苷36，7。
三-三唑配体11
Figure S2006800200961D00193
按所述8从叠氮基乙酸乙酯和三炔丙基胺制备三-三唑配体11。
乙炔基C-半乳糖苷5
根据Xu，Jinwang；Egger，Anita；Bernet，Bruno；Vasella，Andrea；HeIv.Chim.Acta；79(7)，1996，2004-2022.的方法，乙炔基/3-C-半乳糖苷用与已知C-葡糖糖苷相同的方法制备。
Figure S2006800200961D00201
小分子模型糖基-CCHA反应
Figure S2006800200961D00202
高炔丙基乙酰氨基丙二酸二乙酯(55mg，0.20mmol)，HO3GlcNAc-N31(101mg，0.41mmol)，抗坏血酸钠(202mg，10mmol)和三-三唑基胺配体11(6mg，0.012mmol)溶于MOPS缓冲液(pH 7.5，0.2M；4.0mL)和叔丁醇(2.0mL)的混合物中。硫酸铜(II)溶液(0.1M，100μL，0.01mmol)被添加到搅拌的溶液中，反应混合物在室温下搅拌28小时。溶剂然后在低压下蒸发，残余物通过闪蒸塔层析法纯化(硅土，AcOEt到溶于AcOEt的15％甲醇)。产物为无色膜状物(83mg，79％)。
甲基(S)-2-[N-乙酰-氨基]-4-{1-(2-脱氧-N-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)[1，2，3，]三氮唑4-基}丁酸酯：
Figure S2006800200961D00211
溴化亚铜(10mg，0.070mmol)溶于乙腈(1mL)，添加配体(0.58mL 0.12M溶于乙腈的溶液)。将这种溶液(38μL，5％催化剂装载)添加到溶于磷酸钠缓冲液(0.5mL，0.15M，pH 8.2)的炔氨基酸(15mg，0.08mmol)和糖2(31mg，0.13mmol)溶液中。在TLC-分析显示炔起始材料消失后，反应混合物在室温下氩气中搅拌1小时。混合物是用乙酸乙酯稀释，用水(10mL)洗涤，含水层用AcOEt洗涤。含水层在低压下蒸干。残余物用柱层析法(硅土，1∶1乙基AcOEt/iPrOH对4∶4∶2 H2O/iPrOH/AcOEt)纯化，得到所需的1，2，3-三唑(26mg，74％)为无色玻璃状固体。
甲基(S)-2-[N-乙酰-氨基]-4-{4-(β-D-吡喃半乳糖基)[1，2，3]三唑-1-基}丁酸酯：
溴化亚铜(10mg，0.070mmol)溶于乙腈(1mL)，添加三三唑基胺配体(0.58mL溶于乙腈的0.12M溶液)。将这种溶液(45μL，5％催化剂装载)添加到溶于磷酸钠缓冲液(0.5mL，0.15M，pH 8.2)的氨基酸(20mg，0.10mmol)和糖5(28mg，0.13mmol)溶液中。反应混合物在室温下氩气中搅拌3小时。反应混合物在低压下蒸干，残余物用柱层析法(硅土，9∶1AcOEt/MeOH对4∶4∶2 H2O/iPrOH/AcOEt)纯化，得到所需的1，2，3-三唑(37mg，97％)为白色固体。
Figure S2006800200961D00221
图xx：从O-炔丙基-N-乙酰葡糖胺合成O-炔丙基SiaLacNAc。采用非常简单的SiaLacNAc的高收率酶催化合成(参考文献5 Baisch，等人)。除闪蒸塔层析法之外，不需要多级净化来获得任意产物。
2-乙酰氨基-2-脱氧-1-炔丙基-β-D吡喃葡萄糖苷
2-乙酰氨基-2-脱氧-1-炔丙基-β-D-吡喃葡萄糖苷先前已有描述。为达到本发明目的，根据Vauzeilles，Boris；Dausse，Bruno；Palmier，Sara；Beau，Jean-Marie；Tetrahedron Lett.，42(43)200 1，7567-7570的方法，其按下面所示制备。
Figure S2006800200961D00222
2-乙酰氨基-2-脱氧-4-O-β-d-吡喃半乳糖基-1-炔丙基-D-吡喃葡萄糖苷
Figure S2006800200961D00231
2-乙酰氨基-2-脱氧-1-炔丙基-β-D-吡喃葡萄糖苷(15.0mg，0.058mmol)和尿苷-5′-二磷酸半乳糖二钠盐(59mg，0.092mmol)溶于1.0mL二甲胂酸钠缓冲液(0.1M，25mM MnCl2，1mg/mL牛血清白蛋白，pH 7.47)。添加β-1，4-半乳糖基转移酶(ec 2.4.1.22，0.8U)和碱性磷酸酶(ec 3.1.3.1，39U)，当tlc(1∶2∶2水∶异丙醇∶乙酸乙酯)显示受体糖完全消失时(Rf 0.8)，混合物在37℃温和振荡21小时。反应混合物在硅土上冻干，闪蒸塔层析(2∶5∶6水∶异丙醇∶乙酸乙酯)纯化，得到23.7mg(97％收率)白色非晶固体。
炔丙基-(5-乙酰亚氨基-3，5-双脱氧-d-甘油基-α-D-半乳糖-2-nonulopyranosylonic酸-(2→3)-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2-乙酰亚氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷
Figure S2006800200961D00232
2-乙酰氨基-2-脱氧-4-O-β-d-吡喃半乳糖基-1-炔丙基-D-吡喃葡萄糖苷(12mg，0.028mmol)溶于1.4mL水。添加二甲胂酸钠(60mg，0.28mol，最终浓度：0.2M)，以及氯化锰四水合物(8mg，0.041mmol，最终浓度29mM)和牛血清白蛋白(2mg)。在添加胞嘧啶-5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸钠盐(19.8mg，1当量)前将pH调为7.1，添加α-2，3-(N)-唾液酸转移酶(重组ex.草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)，ec 2.4.99.6，30mU)和碱性磷酸酶(ec 3.1.3.1，30U)，混合物在37℃轻轻振荡70小时，然后反应混合物在硅土上冻干，闪蒸塔层析法(5∶11∶15水∶异醇∶乙酸乙酯)纯化，得到20.9mg非晶固体(95％产量)。
ELISA试验用于检测在P-选择蛋白结合中硫代酪氨酸的作用
进行实验以显示用本发明方法糖基化的蛋白具有改变的生物学结合性质。
ELISA试验按先前公开的试验改进。
修饰的SsβG蛋白进行包被，200ng/孔(NUNC Maxisorp，2μg/mL，50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.6)。
添加二硫苏糖醇(5μL/孔，50mg/mL溶于水)还原硫酸酪氨酸到合适状态。板在4℃孵育15小时。孔在37℃用牛血清白蛋白(25mg/mL在分析缓冲液中：2mM CaCl2，10mM Tris，150mM NaCl，pH 7.2，200μL每孔)封闭2小时。在添加P-选择蛋白(ex Calbiochem，目录号561306，CHO细胞中重组，截短序列，跨膜和细胞质结构域缺失，在100μL洗涤缓冲液中每种不同修饰的SsβG突变从400ng/孔到1.6ng/孔系列2倍稀释)前，板用洗涤缓冲液(包含0.05％v/v Tween20的试验缓冲液，3×400μL每孔)洗涤。板在37℃孵育3小时。
在用洗涤缓冲液洗涤两次后，孔与抗P-选择蛋白抗体(IgGl亚型，ex Chemicon，克隆AK-6，100ng/孔在100μL试验缓冲液中)在21℃孵育1小时(加3个对照孔)，用洗涤缓冲液(3×300μL/孔)洗涤。
每孔与抗小鼠IgG特异HRP结合物(ex Sigma，A0168)在21℃孵育1小时。孔用洗涤缓冲液洗涤(3×300μL)。通过添加TMB-底物溶液(ex Sigma-Aldrich，T0440，100μL每孔)，在22℃避光处孵育直到370nm吸光率读数进入线性范围(大约15分钟)而使得结合可视。
(S)-2-氨基-4-{4-(β-D-吡喃半乳糖基)[1，2，3]三唑-1-基}丁酸酯
Figure S2006800200961D00251
采用如上相同方法，进行最佳化研究，利用1.5eq乙炔基C-半乳糖苷5相对于Aha。
    pH     转换率，％a
    5.2     0
    6.2     16
    7.2     61
    8.2     82
    9.2     45
    无配体，8.2     7
a通过1H NMR(D2O，500MHz)判断；证实分离的收率在pH 8.2为84％
Tamm-Horsfall片段制备：
Tamm-Horsfall(THp)肽片段(295-306；H2N-Gln-Asp-Phe-Asn-Ile-Thr-Asp-Ile-Ser-Leu-Leu-Glu-C(O)NH2)12   类     似     物(                                         H2N-Gln-Asp-Phe-Aha/Hpg-Ile-Thr-Asp-Ile-Cys-Leu-Leu-Glu-C(O)NH2)在Rink酰胺MBHA-聚苯乙烯树脂[1％二乙烯基苯，Novabiochem目录号01-64-0037]上，利用微波辅助Liberty CEM肽合成仪，采用Fmoc-化学方法合成。
叠氮基蛋白包含Aha-的蛋白的糖-环加成作用的典型方法：
乙炔基-β-C-半乳糖苷(5mg，0.027mmol)5溶于磷酸钠缓冲液(0.5M，pH 8.2，200μL)。蛋白溶液(0.2mg在300μL中)被添加到上述溶液，彻底混合。新鲜制备的溶于乙腈的溴化亚铜(I)(99.999％)溶液(33μL 10mg/mL)与三-三唑基胺配体11的乙腈溶液(12.5μL，120mg/mL)预先混合。预制的Cu-复合物溶液(45μL)被添加到混合物中，反应在室温下旋转器中搅动1小时。反应混合物然后离心除去任何铜(II)盐的沉淀物，上清在PD 10柱上用软化水(3.5mL)洗脱进行脱盐。洗脱液在Vivaspin膜浓缩器(10kDa分子量截留)中浓缩，用50mM EDTA溶液洗涤，再用软化水(3×500μL)洗涤。最终，溶液浓缩到100μL，产物利用LC-MS，SDS-PAGE凝胶电泳，CD，胰蛋白酶消化和胰蛋白酶消化LC-MS/MS进行表征。
表S3实施例起始材料SSβG-Cys344Ser-Met21Aha-Met43-Aha-Met73Aha-Metl48Aha-Met204Aha-Met236Aha-Met275Aha-Met280Aha-Met383Aha-Met439Aha的胰蛋白酶消化-HPLC/MS数据
    切割片段[残基#]     保留时间[分钟]  电荷态(m/z)
  +1     +2     +3     +4
    T2 16-41     24.1     1459.1     973.1
    T3 42-70     24.7     1584.7     1056.8
    T5 79-82     4.1   442.3
    T16 147-168     32.2     930.5
    T22 200-225     25.5     1406.7     938.1
    T25 241-25l     17.7     641.8
    T29 280-292     17.1     757.3
    T45 427-446     26.8     1193.0     795.7
表S4位置选择性的三半乳糖基化SSβG-Cys344Ser-Met21Aha-Met43-T-Gal-Met73Aha-Metl48Aha-Met204Aha-Met236Aha-Met275-T-Gal-Met280-T-Gal-Met383Aha-Met439Aha胰蛋白酶消化-HPLC/MS数据
   切割片段[残基#]     保留时间[分钟]     电荷态(m/z)
    +1   +2   +3     +4
   T2 16-41     24.4   1459.6   973.4
   T3Gal 42-70     23.1   1120.1     840.3
   T5 79-82     4.3     443.2
   T22 200-225     25.6   1407.1   938.4
   T25 241-251     18.1     1282.7   641.8
   T29Gal2 280-292     6.9   945.4   630.6
   T45 427-446     26.7   1193.5   796.0
此处NB残基编号根据实际的氨基酸，并包括His-标签。贯穿本文其他部分使用的编号基于SSβG的WT序列。因此，例如，胰蛋白酶化片段T29#280-292相应于274-286(K)D[Tgal]EAVE[TGal]AENDNR(W)。
包含炔基蛋白Hpg蛋白的糖环加成作用：
采用与用于修饰包含Hpg蛋白相似的步骤。在这种情况下带有叠氮化物的糖类(HO3GlcNAcN3)1被用作反应配体，以替代炔基-β-C-糖苷。
THp片段双差异糖结合：
向溶于含水磷酸盐缓冲液(50mM，pH 8.2，0.3mL)的新鲜合成的肽(Hpg-或者Aha-整合的，0.5mg)溶液中添加溶于水的糖苷MTS-试剂7溶液(50μL，33mM，5eq.)。在利用Phenomenex Gemini 5μ C18 110A柱(流速：1.0mL/min，流动相梯度：20分钟内从溶于水的0.05％甲酸到溶于MeCN的0.05％甲酸)进行LCT-MS分析前，反应在翻滚式旋转器上进行1小时。
通过在MeCN(0.5mL)中溶解溴化亚铜(5mg，99.999％纯度)和三-三唑配体11(18mg)，制备铜催化剂复合物溶液。在添加铜(I)复合物(15μL)前，乙炔基糖5或者叠氮基糖1(6mg)溶于形成二硫键的糖结合作用的反应混合物中。利用LC-MS分析发现Aha-展示肽和乙炔基糖之间的反应在室温1小时后完成。在1小时后向Hpg-展示肽和叠氮基糖的反应中添加额外量的铜(I)复合物溶液(10μL)。再过1小时后，LC-MS分析证明起始材料完全转化为所需结合的产物的。反应位点用环标记：
Figure S2006800200961D00281
优化糖环加成作用反应条件的评论：
先前在文献13中三三唑配体11已经显示有利于在含水反应混合物中稳定Cu(I)。当其缺失时，发生快速氧化为铜(II)。因为CuBr在其他溶剂中溶解度低，选择乙腈。
发现弱碱性缓冲系统(pH 7.5-pH 8.5)最适合修饰反应。许多早先文献中的实例依赖通过在反应混合物中添加还原剂实现Cu(II)盐原位还原。所有我们在铜(II)原位还原用于催化蛋白修饰的努力都不能令人满意。对应样品光谱的质量比较低，反褶积(deconvolution)不能提供足够的信号噪音比。
酶活性：
进行动力学分析，显示突变的蛋白和糖结合物保持酶活性(数据未显示)。
外源凝集素结合研究：
进行实验，显示糖结合的糖影响生物学靶标。
糖结合SsβG突变体的外源凝集素结合性质15通过在固定化外源凝集素亲和层析柱[Galab目录号PNA，Arachis hypogaea：051061，ConA：051041，Triticum vulgaris，K-WGA-1001]上的残留分析进行表征。洗脱级分用Bradford试剂14可视化，在595nm测吸光度。
表S7
人SsβG清楚地显示结合豆类外源凝集素伴刀豆凝集素A(ConA)，而Glc-结合物(Glc SsβG)没有显示背景水平以上的显著结合。β-Gal-三唑-结合的SsβG结合亲半乳糖的外源凝集素花生凝集素(PNA)也被认为是相同情况。但是壳二糖(GlcNAc SsβG)结合物以及小的延伸GlcNAc结合物被发现，通过阻止旋转亲和层析柱释放新糖肽，结合麦胚凝集素(WGA)外源凝集素。与甘露糖结合物相反，葡萄糖结合的缺乏可能用Con A与葡萄糖16的更低亲合力来解释。已发现单糖通过Con A的相对结合是∶MeαMan∶Man∶MeαGlu∶Glu比例21∶4∶5∶1。因此甘露糖单糖通过Con A的结合比葡萄糖单糖要高4倍。芳香族三唑也可能有利于甘露糖苷与二硫键连接的糖苷17结合的增加。
在上述一些和非其他构建体中发现缺乏结合突出显示了糖蛋白精确制备的必要性
溶剂可及性：
迄今为止只有很少的化学反应中的蛋白反应性研究给出氨基酸残基可及性19-21的完整评述18。
从文献22获得SsβG的蛋白质结晶结构。通过Naccess23评定SsβG的二聚二聚体的单体A的溶剂可及性。单体B的可及性数据给出几乎相同的数值。以相对总侧链可及性给出的数值在这些研究中是有意义的。这些是给定氨基酸X侧链的可及性相对于三肽Ala-X-Ala中相同侧链可及性的测量。因此，预期研究的SsβG-突变体的N端残基Metl的可及性甚至比计算的WT蛋白的更高，因为表达的突变体具有通过His7标签(未编号)与序列其余部分隔开的Met1-Gly2。
溶剂可及性还基于天然氨基酸序列，而非例如整合的高叠氮丙氨酸和高炔丙基甘氨酸突变体。
利用不同的探针尺寸(1.0，1.4和2.8)进行计算，随着探针尺寸增加，可接近的的氨基酸侧链更少。
基于这些数据(参见下表)，预期位置1、43、275、280上的甲硫氨酸残基是相对可接近的。相同的情况也预期发生在它们的甲硫氨酸类似物突变体。
表S8
下图以颜色显示，WT-SsβG的相对可及性。
关于TIM桶：
在蛋白质结晶结构中观察到的最常见三级折叠是TIM桶。据信它存在于大约10％的所有蛋白中24。
关于Tamm-Horsfall(THp)糖蛋白：
THp是哺乳动物中最丰富的糖蛋白12，25。N-以及O-糖基化模式已知在Thp的生物功能中起着重要作用26。在8个可能的N-糖基化位点中，7个已知是糖基化的。这些中一些是Asn-298残基27。
红细胞生成素和葡萄糖苷酰基鞘氨醇酶的糖基化
红细胞生成素用于N-连接的糖类的各糖基化位点是Asn24，Asn38和Asn83。蛋白在Ser126包含一个O-连接糖基化位点。在新引入的Met位点(Epo的天然序列只包含一个甲硫氨酸(M54)利用多点定位诱变和蛋氨酸类似物整合，蛋白可以被修饰。
葡萄糖苷酰基鞘氨醇酶(D-葡萄糖脑苷脂酶)，一个在高雪氏病进展中起着重要作用的60kD糖蛋白，代表也用这种方法糖基化。
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Claims (42)

1.一种蛋白糖基化的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i)修饰蛋白以包括炔基和/或叠氮基；和
ii)在Cu(I)催化剂存在条件下，将(i)中修饰的蛋白与
(a)修饰的包括叠氮基的糖基；和/或
(b)修饰的包括炔基的糖基
反应。
2.权利要求1所述的方法，其中蛋白修饰涉及用一个或多个非天然氨基酸类似物取代蛋白的一个或多个氨基酸。
3.权利要求2所述的方法，其中非天然氨基酸类似物是甲硫氨酸类似物。
4.权利要求3所述的方法，其中甲硫氨酸类似物是高炔丙基甘氨酸或者叠氮基高丙氨酸。
5.权利要求1所述的方法，其中蛋白包括多于10个氨基酸。
6.权利要求5所述的方法，其中蛋白包括10到1000个氨基酸。
7.权利要求1所述的方法，其中蛋白分子量大于10kDa。
8.权利要求7所述的方法，其中蛋白分子量在10到100kDa之间。
9.权利要求1到4中任意一项所述的方法，其中蛋白选自糖蛋白，血液蛋白，激素，酶，受体，抗体，白介素和干扰素。
10.权利要求9所述的方法，其中蛋白是激素。
11.权利要求10所述的方法，其中激素是红细胞生成素。
12.前述权利要求中任意一项所述的方法，其中蛋白修饰(步骤i)还包括修饰蛋白以包括硫醇基的步骤。
13.权利要求12所述的方法，其中通过在蛋白的氨基酸序列中插入半胱氨酸残基而引入硫醇基。
14.一种蛋白糖基化的方法，所述方法包括以下步骤：
i)(a)修饰蛋白以包括炔基和/或叠氮基；和
(b)在(a)中的蛋白修饰之前或者之后，任选修饰蛋白以包括硫醇基；和
ii)在与硫醇-选择性的糖类试剂(d)反应之前或者之后，在Cu(I)催化剂存在条件下，将(i)中修饰的蛋白与糖基(c)顺序反应
(c)修饰以包括叠氮基的糖基，和/或修饰以包括炔基的糖基；和
(d)硫醇-选择性的糖类试剂。
15.权利要求14所述的方法，其中硫醇-选择性糖类试剂是与蛋白中的硫醇基反应以通过二硫键引入与蛋白连接的糖基残基的试剂。
16.权利要求15所述的方法，其中硫醇选择性糖类试剂是糖基磺酰硫代试剂。
17.权利要求16所述的方法，其中糖基磺酰硫代试剂是糖基甲磺酰硫代试剂。
18.权利要求15所述的方法，其中硫醇-选择性糖类试剂是糖基硫化硒基试剂。
19.前述权利要求中任意一项所述的方法，其中Cu(I)催化剂选自CuBr和CuI。
20.权利要求19所述的方法，其中Cu(I)催化剂是Cu(I)Br。
21.权利要求19或者20所述的方法，其中Cu(I)催化剂在起稳定作用的胺配体存在的条件下提供。
22.权利要求21所述的方法，其中配体是三三唑基胺配体。
23.化学式(III)所示的蛋白
Figure S2006800200961C00031
其中a和b是0到5之间的整数；p和q是1到5之间的整数。
24.按照权利要求1到22中任意一项的方法糖基化的蛋白。
25.化学式(IV)所示的糖基化蛋白
Figure S2006800200961C00041
其中t是1到5之间的整数；而隔离物，它可以是不存在的，是具有1到8个C原子的脂肪族部分。
26.权利要求25所述的糖基化蛋白，其中间隔物选自C1-6烷基和C1-6杂烷基。
27.权利要求26所述的糖基化蛋白，其中间隔物选自甲基、乙基和CH2(X)y，其中X是O、N或者S，y是0或者1。
28.权利要求25到27中任意一项所述的糖基化蛋白，其中蛋白具有化学式(V)
Figure S2006800200961C00042
其中p和q是0到5之间的整数；t是1到5之间的整数。
29.权利要求28所述的糖基化蛋白，其中蛋白具有化学式(VI)
Figure S2006800200961C00051
30.权利要求28所述的糖基化蛋白，其中蛋白具有化学式(VII)
Figure S2006800200961C00052
31.化学式(VIII)所示的糖基化蛋白
Figure S2006800200961C00053
其中u和t是1到5之间的整数；间隔物，它可以是不存在的，是具有1到8个C原子的脂肪族部分；W和Z是可以相同或者不同的糖基。
32.权利要求31所述的糖基化蛋白，其中蛋白具有化学式(IX)
Figure S2006800200961C00054
其中p、q、r和s是0到5之间的整数。
33.权利要求32所述的糖基化蛋白，其中蛋白具有化学式(X)
Figure S2006800200961C00061
34.权利要求32所述的糖基化蛋白，其中蛋白具有化学式(XI)
Figure S2006800200961C00062
35.权利要求23到34中任意一项所述的蛋白，其中蛋白包括多于10个氨基酸。
36.权利要求3 5所述的蛋白，其中蛋白包括10到1000个氨基酸。
37.权利要求23到34中任意一项所述的蛋白，其中蛋白分子量大于10kDa。
38.权利要求37所述的蛋白，其中蛋白分子量在10到100kDa之间。
39.权利要求23到34中任意一项所述的蛋白，其中蛋白选自糖蛋白，血液蛋白，激素，酶，受体，抗体，白介素和干扰素。
40.权利要求39所述的蛋白，其中蛋白是激素。
41.权利要求40所述的蛋白，其中激素是红细胞生成素。
42.权利要求23到41中任意一项所述的蛋白作为药物的用途。
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