JP2007527376A - タンパク質のジスルフィド結合形成およびグリコシル化の方法とそれに用いられる試薬 - Google Patents
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Abstract
Description
に用いられる試薬に関する。特にタンパク質のグリコシル化に使用される試薬または方法である。
例えば、グリコシル化反応は、細胞のシグナル伝達および制御、発生と免疫といった必須の生物的諸過程において主要な役割を果たす。これらの事象の研究は、糖タンパク質が同じペプチド骨格を有するものの、グリコシル化の性質もその部位も異なる、いわゆる糖型物混合物として自然界に生じるという事実により困難なこととなる。
メタンチオスルフォネート試薬はタンパク質のチオール基と反応し、ジスフィルド結合によりタンパク質と結合するグリコシル残基が導入される(例えば WO00/01712参照)。
その調製における困難さ、ならびにしばしば使用される塩基性条件下での安定性の問題をはらんでいる。そのため、容易に調製できて、安定性があり、および高収率でグリコシル化タンパク質を生成することができるタンパク質グリコシル化用試薬が望まれてきた。
性があり、高収率でタンパク質も含め、広範囲のチオールを含有する化合物のグリコシル化に使用できることを見出した。
る。この方法は、少なくとも1個のチオール基(−SH)を含む有機化合物と式Iの化合物とを反応させることを含む。
(式I中、XはSO2またはSeであり、好ましくはSeである。Rは有機部分であり、
例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、または炭水化物部分である。R1は置
換されていてもよいアルキル基であり、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいピリジル基、または置換されていてもよいナフチル基であり、かつ、XがSO2
のときR1はアルキル基(置換されていてもよい)ではないという条件である。)
少なくとも1つのチオール基を含む有機化合物は、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質であることが好ましい。
さらに、別の態様として、本発明はRが炭水化物部分を表す式Iの化合物を提供する。
Rがアルケニルまたはアルケニル基であるとき、式Iの化合物との反応によって生成したジスフィルド化合物がR基内のC=C結合、またはC≡C結合での反応によってさらに変更される可能性がある。
明により少なくとも1つのセレネニルスルフィド基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を調製することが可能となる。少なくとも1つのセレネニルスルフィド基を含む、そうしたタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸は、本発明のさらなる特徴を構成する。特に好ましくは、少なくとも1つのセレネニルスルフィド基を含むタンパク質またはペプチドである。
(a)該チオール基をセレネニルスルフィド基(−S−Se−R2)へ変換すること
(b)チオール基を含む有機化合物とそのセレネニルスルフィド基とを反応させること
本発明の第1、2、3、4の態様を、以下、第1、第2、第3、第4の方法として、各々を言及する。特記しない限り、本明細書にある好ましい構成および定義はこれらのすべての方法と関係している。さらに、本発明はここに述べられる、好ましいいずれかの構成のすべての可能な組み合わせを含む。そうした組み合わせが明らかに開示されているか、
いないかにかかわらずである。
第3の方法および第4の方法によるタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸のセレネニルスルフィド基導入の一般化されたスキームは、スキーム2で表される。
スルフィド(−S−Se−)結合を介して共有結合することとなる。このようなタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸は本発明のさらなる局面を形成する。
般化された反応図式に表される第4の方法により、チオール基を含む有機化合物とさらに反応することができる。
ルキル基であり、より好ましくは1〜6個の炭素原子を含む直鎖または分岐のアルキル基である。好ましいアルキル基としては、メチル基およびエチル基が挙げられる。本明細書で好ましいアルケニル基は、少なくとも1個のC−C二重結合を含む直鎖または分岐の炭化水素であり、2〜20個の炭素原子を有し、好ましくは2〜10個の炭素原子を有し、より好ましくは2〜6個の炭素原子を含む。好ましいアルケニル基として以下のものが挙げられる。
プレニル基((CH3)2C=CHCH2−)
ファルネシル基((CH3)2C=CH[CH2CH2C(CH3)=CH]2CH2−)
本明細書で好ましいアルキニル基は、少なくとも1個のC−C三重結合を含む直鎖または分岐の炭化水素であり、2〜10個の炭素原子を有し、好ましくは2〜6個の炭素原子を含む。好ましいアルキニル基には以下のものが含まれる。
R1が任意に置換された基を表す場合、適切な置換基として、式Iの化合物の生成を妨
げないか、あるいは第1の方法または第2の方法によるジスフィルド結合の形成反応を妨げない任意の置換基が挙げられる。例えば、−NO2、−SO3H、−CO2H、−(CH2CH2O)nH、−(CH2CH2O)nMeであり、nは1〜100の整数であり、好まし
くは1〜50の整数であり、より好ましくは1〜20の整数であり、特に好ましくは1〜10の整数である。R1基は1〜5個、好ましくは1〜2個の置換基で別個に置換されて
もよい。R1基は任意に、例えばポリスチレン樹脂のような樹脂である固体担体に結合し
てもよく、またはその一部を構成してもよい。
合に、UV分光法によってモニタリングされる。
は脂肪族基であってもよい。R基は必要に応じて置換することができ、例えばフォスホリル基またはスルフォニル基によって置換されてもよい。XがSeのとき、他のタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸とジスフィルド結合を介して結合ができるように、Rはタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸であってもよい。
好ましい。そのリンカーは炭水化物部分とS−X−基との間に1〜10の原子を含むこと
ができる。例えばそのリンカーは、アルキレン基(例えば、−(CH2)t−基であり、tは1〜10の整数)またはアルケニレン基(例えば、−(CH2)CH=CH−または−CH2CH2CH=CH−基)である。S−X−基が糖残基のアノマー位に存在するか、ある
いはリンカーを介してそのアノマー炭素と結合している化合物が好ましい。
分の任意の−OH基のための適切な保護基として、アセチル(Ac)、ベンジル(Bn)、ピボリル(piv)、シリル(例えば、tert-ブチルジメチルシリル(TBDMSi)お
よびtert-ブチルジフェニルシリル(TMDPSi))、アセタール、ケタールおよびメ
トキシメチル(MOM)が挙げられる。該保護基は、炭水化物部分がアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質へ付着する前後に取り除くことができる。
)4、Man(1,6)Manα−、Man(1−6)Man(1−3)Manα−、(
Ac)4Man(1−6)(Ac)4Man(1−3)(Ac)2Manα−、−Et−β
−Gal、−Et−β−Glc、Et−α−Glc、−Et−α−Man、−Et−Lac、−β−Glc(Ac)2、−β−Glc(Ac)3、−Et−α−Glc(Ac)2、
−Et−α−Glc(Ac)3、−Et−α−Glc(Ac)4、−Et−β−Glc(Ac)2、−Et−β−Glc(Ac)3、−Et−β−Glc(Ac)4、−Et−α−M
an(Ac)3、−Et−α−Man(Ac)4、−Et−β−Gal(Ac)3、−Et
−β−Gal(Ac)4、−Et−Lac(Ac)5、−Et−Lac(Ac)6、−Et
−Lac(Ac)7、またはその脱保護された等価物である。
の鏡像体(enantiomeric form)となり得て、これらはD−型(例えばD−グルコースま
たはD−ガラクトース)か、あるいはL−型(例えばL−ラムノースまたはL−フコース)のいずれでもよい。いずれのアノマー結合はα−またはβ−の結合である。
。タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸に含まれるアミノ酸は、α‐アミノ酸であることが望ましい。アミノ酸はD−型でもL−型でもよいが、好ましくはL−型である。そうし
たアミノ酸、 ペプチドまたはタンパク質は、チオール基を含む天然のアミノ酸、 ペプチドまたはタンパク質でもよく、例えば1個以上のシステイン残基の存在によるものが挙げられる。あるいはそうしたアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質が、前駆体であってチオールを含まないアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の化学修飾によって調製されてもよい。あるいはチオール基を含むペプチドまたはタンパク質は、部位特異的突然変異によってシステイン残基を導入して調製し得る。部位特異的突然変異は当該技術分野において公知の技術である。( 例えば WO00/01712 および J. Sambrookら、 分子クローニング:研究室マニュアル第3版、 Cold Springs Harbour Laboratory Press、2001年、参照。その
開示は参照によってここに取り込まれる。)
合物に他の官能基が存在しても、そのことがその反応を妨げないことが見出されている。しかしながら他の官能基は、いずれも必要に応じて反応条件下で安定である、当該技術分野で公知の保護基を用いて保護してもよい。
の溶媒系が好ましい。その反応は一般的にかなり迅速であり、例えばしばしば1時間未満
で起こる。
合物である場合、式IIの化合物と式IIIの化合物とを反応させることにより調製してもよ
い。
(式中、M は金属であり、例えばLi、Na、K、Cs、Ca、Mg、ZnまたはAlを示すが、Na、Kが好ましい。kは1〜3の整数である。)
R−L III
(式中、Rは式Iについて定義されたとおりであり、Lは脱離基である。)
脱離基Lは、生成したアニオンL−が、何ら甚だしく反応を妨げることがない、例えば
生成物と反応することにより妨げられることはない限り使用することができる。好ましい脱離基として、Lはトルエンスルフォネート(トシレート)、メタンスルフォネート(メシレート)およびトリフルオロメタンスルフォネート(トリフレート)のようなハロゲンおよびスルフォネートを含むものである。特にクロロまたはブロモである場合が好ましい。
ことができ、例えば一般にはハロゲン化糖、より好ましくは1−ハロゲン糖を生成する方法がある。式IIIの化合物はハロゲン化グリコシル(glycosyl halide)が好ましい。式IIIの化合物として適したものは、例えば一般的に下記に示されるようなグルコースまたは
ガラクトースに基づくものが挙げられる。
できる。式IIの化合物もまた少なくとも部分的に可溶である溶媒系が好ましい。適切な溶媒としてエタノール、メタノールのようなアルコールまたはN,N−ジメチルフォルムアミド(DMF)およびアセトニトリルが挙げられる。中でもアセトニトリルが好ましい。式IIの化合物は、スキーム4に示すように硫黄と対応するスルフィニート(sulfinite)
塩(式VII)との反応によって調製することができる。
VII II
スキーム4
式VIIのスルフィニート(sulfinite)塩は市販のもの(例えばナトリウムベンゼンスルフィニート)、または当該技術分野において公知の方法により調製することができるもの(例えばJP 61205249, および M. UchinoらChemical & Pharmaceutical Bulletin, 1978, 26 (6), 1837-45参照。その開示は参照によってここに取り込まれる。)である。
て、対応するチオール化合物R1SHの脱プロトン化によって生成することができる。そ
のチオレート塩は、次いで適切な酸化剤、例えば2−(フェニルスルフォニル)−3−フェニルオキサジリジン("Davis試薬", Sandrinelliら、 Organic Letters (1999), 1 (8), 1177-1180, その開示は参照によってここに取り込まれる。)を用いて対応するスル
フィニート塩に酸化することができる。
イオンの存在下でスルフィニートアニオンR1SO2 -と式VIIIのジスルフィドとを反応さ
せることによって調製することができる。
XがSeである式Iの化合物は、式Vの化合物の反応によって生成できる。
式中、Rは式Iの化合物に定義されたとおりであり、式VIaまたは式VIbの化合物である。
VIa VIb
(式中、R1は式Iによって定義されたとおりで、L2は脱離基であり、例えばOH、Br、Cl、CNまたはIが挙げられるが、Brが好ましい。)
該反応は無水ジクロロメタン中で行なわれ、次いでトリエチルアミンを加えて抑止させることができる。式VIaの好ましい化合物はPhSeBrであり、式VIbの好ましい化合物はPhSe(OH)2である。
少なくとも1つのチオール基を含む有機化合物(式Vの化合物を含む)は市販のものでもよく、または当該技術分野における公知の方法により調製してもよい。例えばそれらの方法は一般にチオール化合物、特にチオ−糖の調製方法である。
グルコースおよびガラクトースに基づく式Vの化合物の適切例は、一般には下記のように示される。
本発明の第4の方法において式Vの化合物は、チオールを含む化合物として用いるのにも最適である。
第3の方法または第4の方法により、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸中の少なくとも1個のチオール基をセレネニルスルフィド基へ変換することは高度に選択的である。さらにセレネニルスルフィド基とチオールを含む有機化合物との反応は、高度に部位選択的である。そのため、本発明の方法を実施す際、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸または他のチオールを含む有機化合物にある他の官能基を保護することは通常、必要ではない。このことは、生成物にその後の脱保護工程を実施する必要性を回避できるためにかなり好都合である。
な各チオール基は対応するセレネニルスルフィド基に変換される可能性がある。前記セレネニツスルフィド基の各々はチオール基を含む有機化合物と反応させてもよく、ジスルフィド結合を介してタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸の複数の部位で該有機化合物を結合する可能性がある。したがって本発明の方法は、複数部位でタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を化学修飾する都合のよい方法を提供する。特に本発明の方法は、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸の複数部位でのグリコシル化を可能にする。
Xa Xb
(式中、Lは脱離基であり、例えばOH、Br、CN、ClまたはIであり、Brが好ましい。R2は、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置
換されていてもよいベンジル基、置換されていてもよいピリジル基、置換されていてもよ
いナフチル基である。好ましいR2はフェニル基であり、式Xaの好ましい化合物はPh
SeBrであり、式Xbの好ましい化合物はPhSe(OH)2である。
タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸との反応を妨げないすべての置換基を含むものであり、好ましくはタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸のその後の反応、例えばチオールを含む有機化合物との反応を妨げない置換基である。適した置換基としては、−NO2、−
SO3H、 −CO2H、−(CH2CH2O)nHおよび−(CH2CH2O)nMeが挙げら
れ、nは好ましくは1〜100であり、より好ましくは1〜20であり、さらに好ましくは1〜10の整数である。R2基は独立に1−5の置換基、好ましくは1または2の置換
基で独立に置換されることができる。
、 式Xaまたは式Xbの化合物は、以下に示すようなポリスチレン樹脂のような樹脂か
ら生じる。
各チオール基を対応するセレネニルスルフィド基に確実に変換させるためには、タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸中のチオール基当り、少なくとも1モル当量の式Xaまた
は式Xbの化合物を用いなければならない。該反応は、緩衝液(例えばMES、pH9.5)の存在下、水性溶媒(水とアセトニトリルの混合物のような)中において進行させるのが好ましい。該反応のpHおよび温度は、タンパク質またはペプチドの望ましくない変性を避けるように選択しなければならない。該反応はわずかに塩基性のpH(約pH8〜
約pH9)において、室温またはそれ以下の温度で進行させるのが好ましい。
、加工処理または溶解性の助けとなる標識(例えば蛍光標識)または基が含まれる。そうした有機化合物は、本発明の方法を用いてジスフィルド結合を介して一つのタンパク質、
ペプチドまたはアミノ酸と他のタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸とを結合させる可
能性を与えることができる第二のタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸であってもよい。
H2CH2CH=CH−)が挙げられる。チオール基を含む化合物は、チオール基が糖残基のアノマー位にあるか、またはリンカーによりアノマー炭素と結合する化合物が好ましい。
くないpHでなければならない。同様に、温度に敏感な化合物の重大な損害を避けるように反応温度を選択しなければならない。 例えば、 タンパク質またはペプチドの反応は、これらの変性を避けるためには室温またはそれ以下の温度で進行させるのが好ましい。水性溶媒系または有機溶媒系を用いることができる。水性溶媒の系が好ましく、水性溶媒系はタンパク質, アミノ酸 またはペプチドの溶解を確実にすることができるからである。
水性溶媒系がまた、有機化合物として保護されていない炭水化物化合物の使用を可能とすることからも好ましい。該反応は一般に非常に早く、しばしば1時間未満である。
本発明をさらに次の実施例により説明するが、これにより限定されるものではない。
融点は、Kofler加熱ブロックで測定し、補正はしなかった。プロトン核磁気共鳴(δH)
スペクトルの400 MHzスペクトルは、COSYを利用して帰属した。炭素核磁気共鳴(δc)スペクトルは、HMQCを使用して帰属した。多重性は、DEPTシーケンスを使用して帰属した。化
学シフトはすべて、内部標準として残留溶媒を使用して、ppmでδスケール上に引用した
。
値はダルトン(Dalton)で示され、その後に括弧内にそれらのパーセント存在率(percentage abundance)を付した。旋光度は、1 dmの光路長で旋光計により測定した。濃度は、g/100 mLで与えられる。
ートプレート上で実施した。プレートの可視化は、紫外線ランプ(λmax=254または365nm)および/またはモリブデン酸アンモニウム(5%、2M硫酸中)または硫酸(5% EtOH中)を用
いて行なった。フラッシュ(Flash)カラムクロマトグラフィーは、Sorbsil C60 40/60
シリカを用いて行なった。ジクロロメタン(DCM)は、水素化カルシウムから蒸留した。ア
セトンは、無水硫酸カルシウムから蒸留した。残りの無水溶媒は、Fluka社から購入した
。「ペトロール(Petrol)」とは、40〜60℃範囲で蒸留される石油エーテルの画分をいう。
グロビン(ウマ心臓)を検量の標準として、ならびに系の感度を試験するために用いた。
−イソチオウロニウムブロミド
に溶解させ、60℃まで加熱した。20分後、白色固体が沈殿した。該沈殿物を濾過により取り除き、濾液を還流し、白色固体が沈殿しなくなるまでこの処理を繰り返した。白色がかった結晶が結合し、アセトン/ペトロールから再結晶することにより、標記の化合物(11.4 g, 76%)が白色結晶として得られた:融点194-196℃ [Lit. 191°C (H. Beyer, U. Schultz, Chem. Ber. 1954, 87, 78)] ; [α] D 25-5. 6 (c, 1. 0 in H2O) [Lit. [α] D
25-7. 6 (c, 1.4 in H2O) (W. A. Bonner, J. E. Kahn, J Am Chem Soc, 1951, 73, 2241) ]; δH (400 MHz, DMSO-d6) 1.97, 2.00, 2.02, 2.06 (12H, 4 x s, 4 x CH3), 4.06-4.25 (3H, m, H-5, H-6, H-6'), 5.07-5.12 (2H, m, H-2, H-4), 5.31 (1H, at, J9. 5 Hz, H-3), 5.77 (1H, d, J1,2 9.9 Hz, H-1), 9.13 (2H, brs, NH2), 9.29 (2H, brs, NH2)。
mL) と水 (70 mL)との攪拌された混合物に加えた。該混合物をアルゴン雰囲気下、加熱
還流した。 1.5 時間後、室温(RT)まで冷却し、相を分離させた。水溶性相はDCM (3 x 50
mL)で再抽出した。これらの混合有機相を、水(50 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、真空中で溶媒を除去することにより、標記の化合物(6.14 g, 90%)が白色固体とし
て得られた:融点112-114℃ [Lit. 113-114°C (R. J. Ferrier, R. H. Furneaux, Carbohydr. Res. 1977, 57, 73) ]; [α] D 24 +6. 3 (c, 1. 2 in CHCl3) [Lit. [α] D 20 +5.
0 (c, 1.1 in CHCl3) (R. J. Ferrer, R. H. Furneaux, Carbohydr. Res. 1977, 57, 73)]; δH (400 MHz, CDCl3) 1.99, 2.00, 2.05, 2.06 (12H, 4 xs, 4xCH3), 2.30 (1H, d,
J1,SH, 10.2 Hz, SH), 3.71 (1H, ddd, J4, 5 10.0 Hz, J5,6 2.4 Hz, J5,6 , 4. 7 Hz, H-5), 4. 10 (1H, dd, J6,6, 12.3 Hz, H-6), 4. 22 (1H, dd, H-6'), 4.53 (1H, at, J9.9 Hz, H-1), 4. 95 (1H, at, J9.5 Hz, H-2), 5. 08 (1H, at, J 9. 8 Hz, H-4), 5.17 (1H, at, J 9. 4 Hz, H-3)。
過して分離し、さらにアセトン/ペトロールから再結晶させることにより、標記の化合物(4.6 g, 70%, 2 段階)が白色結晶固体として得られた:融点134-137℃ [Lit. 170°C from isopropanol (W. A. Bonner, J. E. Kahn, J Am Chem Soc 1951, 73, 2241)] ; [α] D 25 +40. 4 (c, 1.0 in H2O) [Lit. [α] D 25 +16. 0 (c, 1.6 in EtOH, (W. A. Bonner,
J. E. Kahn, J Am Chem Soc 1951,73, 2241)) ; δH (500 MHz, DMSO-d6) 1.96, 2.02, 2.09, 2.15 (12H, 4 xs, 4xCH3) 4.06-4. 13 (2H, m, H-6, H-6'), 4.45 (1H, t, J6. 2 Hz, H-5), 5.12 (1H, at, J9.9 Hz, H-2), 5.24 (1H, dd, J2, 3 10.0 Hz, J3,4 3. 6 Hz,
H-3), 5. 39 (1H, d, J3,4 3.1 Hz, H-4), 5.71 (1H, d, J1,2 10.2 Hz, H-1), 9.12, 9.36 (2 x 2H, 2 x brs, 2 x NH2)。
再抽出した。 これらの混合有機相を、水(100 mL)で洗浄し、塩水 (100 mL)につけ、MgS04で乾燥し、濾過し、真空中で溶媒を除去することにより、標題の化合物 (2.65 g, 81%)
が白色固体として得られた:融点83−84℃[Lit. 86. 5-88°C (J. Frgala, M. Cerny, J.
Stanek, Collect. Czech. Chem. Commun. 1975, 40, 1411) ];
[α] D 24+30. 1 (c, 1. 0 in CHCl3) [Lit. [α] D 19 +32.0 (c, 3.5 in CHCl3) (J. Frgala, M. Cerny, J. Stanek, Collect. Czech. Chem. Commun. 1975, 40, 1411) ];δH (400 MHz, CDCl3) 1.99, 2.06, 2.10, 2.17 (12H, 4 xs, 4 x CH3), 2. 38 (1H, d, J1,SH 10.3 Hz, SH), 3.95 (1H, dt, J4, 5 1. 2 Hz, J5,6 6. 6 Hz, J5,6' 6.6 Hz, H-5), 4.09-4. 14 (2H, m, H-6, H-6'), 4.53 (1H, at, J9,9 Hz, H-1), 5.02 (1H, dd, J2,3 10. 1, J3, 4 3.4 Hz, H-3), 5.19 (1H, at, J 10.0 Hz, H-2), 5.44 (1H, at, dd, J3,4 3.7
Hz, J4,5 1.2 Hz, H-4)。
it. 179-181℃from EtOH (D. Horton, M. L. Wolfrom, J. Org. Chem. 1962, 27, 1794)];
[α] D 25-25. 2 (c, 1. 0 in H2O) [Lit. [α] D 25-29. 3 (c, 1. 1 in MeOH) (D. Horton, M. L. Wolfrom, J. Org. Chem. 1962, 27,1794)] ; δH (400 MHz, DMSO-d6) 1. 80 (3H, s, NHCOCH3), 1.94, 1. 98, 2. 08 (9H, 3 xs, 3 x CH3), 4.05 (1H, dd, J5,6 2.4 Hz, J6,6, 12.4 Hz, H-6), 4.17 (1H, dd, J5,6, 5.0 Hz, J6,6, 12.3 Hz, H-6'), 4. 26
(1H, ddd, J4,5 10.2 Hz, J5,6 2. 3 Hz, J5,6, 4. 7 Hz, H-5), 4. 93 (1H, at, J9.9Hz, H-4), 5.12 (1H, at, J9.9 Hz, H-3), 5.73 (1H, d, J1,2 10.4 Hz, H-1), 8.48 (1H,
d, J4.7 Hz, NHAc), 9.13 (2H, brs, NH2), 9.29 (2H, brs, NH2)。
物をアルゴン雰囲気下において加熱還流した。2時間後、RTまで冷却し、相を分離させた
。 水溶性相はDCM (2 x 50 mL)で再抽出した。これらの混合有機相を、水 (50 mL)で洗浄し、塩水(50 mL)につけ、MgS04で乾燥し、真空中で溶媒を除去した。EtOAc/ペトロール
から再結晶することにより、標記の化合物(1.00 g, 68%)が白色固体として得られた:融
点165-167℃ [Lit. 167-168°C (W. M. zu Reckendorf, W. A. Bonner, J. Org. Chem. 1961, 26, 4596) ];
[α] D 25 -24.8 (c, 1.0 in CHCl3) [Lit. [α] D 25-14. 5 (c, 0.9 in CHC13) (W. M. zu Reckendorf, W. A. Bonner, J. Org. Chem. 1961, 26, 4596) ];δH (400 MHz, CDC13)
1.99, 2.03, 2.05, 2.10 (12H, 4 xs, 4 x CH3), 2.57 (1H, d, J1,SH 9.2 Hz, SH), 3.67 (1H, ddd, J4,5 9.7 Hz, J5,6 4. 8 Hz, J5,6' 2. 3 Hz, H-5), 4.09-4. 17 (2H, m, H-2, H-3), 4.24 (1H dd, J5,6 4. 8 Hz, J6,6'12. 4 Hz, H-6), 4.59 (1H, at, J 9.8 Hz, H-1), 5.06-5.15 (2H, m, H-4, H-6'), 5.72 (1H, d, J 9. 2 Hz, NH)。
加えた。2時間後薄層クロマトグラフィー(EtOAc:ペトロール 1:1)は、出発原料(Rf0. 5)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.0) が得られたことを示した。該反応物はD
owex(R)-50イオン交換樹脂を加えることによって中和され、この後に濾過し、真空中で濃縮した。MeOH/EtOAcからの再結晶により、標記の化合物(1.41 g, 98%)が下記のような白
色結晶固体として得られた:融点100-102℃;
[α] D 22+47.6 (c, 1.0 in MeOH ;δH (400 MHz, CD3OD), 2. 62 (1H, d, J1,SH 8.3 Hz,
SH), 3.47- 3.49 (2H, m, H-2, H-3), 3.57 (1H, at, J 5.9 Hz, H-5), 3. 68 (1H, dd,
J5,6 5. 0 Hz, J6,6, 11.4 Hz, H-6), 3.75 (1H, dd, J5,6' 6. 9 Hz, J6,6, 11. 5 Hz,
H-6'), 3.91 (1H, bs, H-4), 4.37 (1H, bd, J 7.7 Hz, H-1) ; δc (100 MHz, CD3OD),
61.6 (t, C-6), 69.6 (d, C-4), 74.4, 74. 8 (2 xd, C-2, C-3), 80.1 (d, C-5), 81. 4 (d, C-1) ; m/z (ES-) 196 (100%, M-H+) ; m/z HRMS (ES-) Calcd. for C6H12O5S (M-H+) 195.0327. Found 195.0323 。
酸エチル)は、出発原料(Rf 0. 2)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0. 0) が得られたことを示した。 該反応物はDowex(R)-50イオン交換樹脂を加えることによって中和され、その後に濾過し、真空中で濃縮した。メタノール/酢酸エチルからの再結晶により、標記の化合物(230mg, 98%)が下記のような白色結晶固体として得られた:融点85-88℃ [Lit. 86-88°C]18 ;
[α] D 22-10. 4 (c, 1.0 in MeOH) [Lit. [α] D 25+177.1 (c, 1.45 in CHCl3) ]18;δH (400 MHz, MeOH), 2.00 (3H, s, CH3), 3.27-3. 37 (2H, m, H-4, H-5), 3.42 (1H, at J9.1 Hz, H-3), 3. 64-3. 73 (2H, m, H2, H-6), 3.87 (1H, dd, J5,6 2.1 Hz, J6,6, 12.0 Hz, H-6'), 4.56 (1H, d, J1,2 10.0 Hz, H-1), 8.11 (1H, bd, JNH,2 9.1 Hz, NH)。
れるとともに、生成物(Rf 0. 3) が得られたことを示した。該反応物はRTまで冷却し、DCM (50 mL)で希釈、 水 (100 mL)と分離させた。相を分離させ、水溶性相はDCM (2 x 50 mL)で再抽出した。これらの混合有機相を、pHが8になるまで炭酸水素ナトリウム(飽和
水溶液400 mL) で洗浄し、塩水(200 mL)につけ、MgS04で乾燥、濾過し、真空中において
濃縮することにより、標記の化合物(1.00 g, 68%)がアモルファスの白色固体であるアノ
マー混合物(α/s, 2/11)として得られた;
β化合物:δH (500 MHz, CDCl3) 2.05, 2.07, 2.10, 2.14, 2.15, 2.19, 2. 21, 2.27 (30H, 8 xs, 10 x OAc), 3.92 (1H, ddd, J4, 5 9.5 Hz, J5, 6 2. 9 Hz, J6,6 4.1 Hz, H-5a), 3.95-4. 01 (3H, m, H-4b, H-5b, H-5c), 4.05 (1H, at, J 9. 1 Hz, H-4a), 4.09 (1H, dd, J5, 6 2.5 Hz, J6,6, 12.7 Hz, H-6c), 4.21 (1H, dd, J5, 6 3. 4 Hz, J6,6, 12.6 Hz, H-6b), 4.29 (1H, dd, J5, 6 3.4 Hz, J6,6, 12. 4 Hz, H-6'c), 4.35 (1H, dd, J5, 6 4. 3 Hz, J6,6, 12.3 Hz, H-6a), 4. 48-4. 52 (2H, m, H-6'a, H-6'b), 4.78 (1H, dd, J1,2 4.1 Hz, J2, 3 10.3 Hz, H-2b), 4.90 (1H, dd, J1,2 4.1 Hz, J2, 3 10.6
Hz, H-2c), 5.01 (1H, dd, J1,2 8.0 Hz, J2, 3 9.0 Hz, H-2a), 5.11 (1H, at, J 10.1
Hz, H-4c), 5.31 (1H, d, J1,2 3.9 Hz, H-1b), 5.32-5. 44 (3H, m, H-3a, H-3b, H-3c), 5.45 (1H, d, J1,2 4.1 Hz, H-1c), 5.79 (1H, d, J1,2 8. 2 Hz, H-1a) ;
α化合物は選択したデータだけ:δH (500 MHz, CDCl3) 2. 08, 2. 09, 2.12, 2. 18, 2. 21, 2. 23,2. 26 (30H, 8 xs, 10 x OAc), 5.07 (1H, at, J 9.9 Hz), 6.28 (1H, d, J1,2 3. 8 Hz, H-1a)。
残りのシグナルは次の多重線に位置する。3. 85-3. 89, 3.90-3. 98,3. 99-4. 07,4. 15-4. 18,4. 23-4. 27, 4. 29-4.32, 4. 43-4. 49, 4. 74-4. 76, 4. 84-4. 87, 4. 98-4. 94, 5. 25-5. 54; m/z (ES+) 984 (MNH4 +, 30%), 989 (MNa+, 100%) ; m/z HRMS (ES+) Calcd. For C40H58O27N(MNH4 +) 984. 3196 Found 984. 3199。
ことを示した。該反応混合物はDCM (10 mL) と水 (10 mL)に分離し、水溶性相はDCM (3 x
10 mL)で再抽出した。これらの混合有機相は、pHが8になるまで炭酸水素ナトリウム (飽和水溶液20 mL) で洗浄し、塩水 (20 mL)につけ、MgSO4で乾燥、濾過し、真空中で濃
縮した。標記の化合物が下記のように白色体(203 mg, 98%)として得られた;
[α] D 22+152. 2 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 2. 03, 2. 05, 2. 06, 2.
08, 2. 10, 2. 13, 2. 18,2. 21 (30H, 10 x COCH3), 3.93-3. 99 (3H, m, H-4b, H-5a,
H-5b), 4.05-4. 10 (2H, m, H-4c, H-6a), 4.20 (1H, dd, J5,6 1,8 Hz, J6,6, 12. 2 Hz, H-6b), 4.26-4. 34 (2H, m, H-5c, H-6a'), 4. 35 (1H, dd,J5,6 3. 5 Hz, J6,6, 12.7 Hz, H-6c), 4.52 (1H, dd, J5,6 0.6 Hz, J6,6, 12.2 Hz, H-6b'), 4. 57 (1H, dd, J5,62. 1 Hz, J6,6, 12. 4 Hz , H-6c''), 4.74 (1H, dd, J1,24.1 Hz, J2,39. 9 Hz, H-2c), 4. 78 (1H, dd, J1,24. 2 Hz, J2,310. 2 Hz, H-2b), 4,88 (1H, dd, J1,24.0 Hz, J2,310. 5 Hz, H-2a), 5.10 (1H, at, J9. 7 Hz, H-4a), 5.32 (1H, d, J1,24.0 Hz, H-1b), 5. 39 (1H, at, J 9.9 Hz, H-3q), 5.43-5. 46 (1H, m, H-3b), 5,45 (1H, d, J1,23.8 Hz, H-la), 5.64 (1H, at, J9. 5 Hz, H-3c), 6.53 (1H, d, J1,23.9 Hz, H-lc)。
アセトン (60 mL)内に溶解させた。これに無水チオ尿素 (315 mg, 4.2 mmol)を加え、ア
ルゴン雰囲気中加熱還流した。6.5時間後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール:酢酸エチル, 1: 2)は、出発原料(Rf 0.3)が完全に消費されるとともに、生成物 (Rf 0. 0) が得られたことを示した。該反応物を真空中で濃縮し、DCMで滴定し、過剰チオ尿素から
有機物を除去した。濾液を真空中で濃縮し、残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール、9:1)によって精製することにより、特性のない中間物、2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−α−O−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−β−D−グルコピラノシル−1−イソチオウロニウムブロミド(1.14g, 50%)を得た。該中間物 (100 mg, 0.09 mmol) とNa2S205 (22 mg, 0.11 mmol) を DCM
(30 mL) と水 (15 mL)との攪拌された混合物に加えた。該混合物をアルゴン雰囲気下加
熱還流した。2.5時間後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール: 酢酸エチル, 1: 2)
は、出発原料(Rf0.0) が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.4) が得られたことを示
し、この時点で反応温度をRTまで冷却し、相を分離させた。水溶性相はDCM (2 x 20 mL)
で再抽出した。これらの混合有機相を塩水(20 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥、濾過し、真空中で溶媒を除去した。標記の化合物が下記のような白色アモルファス固体(74 mg, 84%)として得られた;
[α] D 22+99. 5 (c, 1.0 in CHC13) ;δH (400 MHz, CDCl3) 1.99, 2.00, 2.01, 2.02, 2.03, 2.05, 2.10, 2.15, 2. 18 (30H, 9 x s, 10 x COCH3), 3.72-3. 76 (1H, m, H-5a),
3. 90-4. 00 (4H, m, H-4a, H-4b, H-5b, H-5c), 4.05 (1H, dd, J5,62.2 Hz, J6,6, 12.3 Hz, H-6c), 4.17 (1H, dd, J5,63. 3 Hz, J6,6, 12.3 Hz, H-6b), 4.25 (1H, dd, J5,63. 6 Hz, J6,6'12.5 Hz, H-6c'), 4.30 (1H, J5,64.3 Hz, J6,6, 12. 2 Hz, H-6c), 4.44 (1H, dd, J5,62. 2 Hz, J6,6, 12. 1 Hz, H-6a'), 4.46 (1H, dd, J5,62. 2 Hz, J6,6,
12.2 Hz, H-6b'), 4.59 (1H, d, J1,29.7 Hz, H-1a), 4.74 (1H, dd, J1,24.1 Hz, J2,3 10.6 Hz, H-2b), 4. 80 (1H, at, J9.0 Hz, H-2a), 4. 85 (1H, dd, J1,24. 1 Hz, J2,310. 6 Hz, H-2c), 5.07 (1H, at, J9. 9 Hz, H-4c), 5.25 (1H, at, J 9.0 Hz, H-3a), 5.26 (1H, d, J1,24. 1 Hz, H-lb), 5.35 (1H, at, J 10.0 Hz, H-3b), 5.37-5. 41 (2H, m, H-1c, H-3c)。
カリウム(3.96 g, 34. 8 mmol)を無水THF (40 ml)中に懸濁させ、不活性アルゴン雰囲気
下加熱還流した。 12時間後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール:EtOAc, 1: 2)は、出発原料(Rf 0.45)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.4) が得られたことを示した。該反応物を水 (80 mL)で希釈し、RTまで冷却した。相を分離させ、水溶性相はDCM (3
x 40 mL)で再抽出した。これらの混合有機相はpH 8 まで飽和NaHCO3 (50 mL)で洗浄し、塩水 (50 mL)につけ、MgSO4で乾燥、濾過し、真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッ
シュクロマトグラフィー(ペトロール/EtOAc, 1: 4)によって精製することにより、標記の化合物(8. 08 g, 71%)が白色体として得られた;
[α] D 25+86. 4 (c, 1.0 in CHC13) ;δH (400 MHz, CDCl3) 2.01, 2.02, 2.05, 2.08, 2.11, 2.17 (27H, 6 x s, 9 x OAc), 2.40 (3H, s, SAc), 3. 88 (1H, ddd, J4,59. 8 Hz,
J5,64.0 Hz, J5,6, 2. 7 Hz, H-5a), 3.92-4. 01 (4H, m, H-4a, H-4b, H-5b, H-5c), 4.07 (1H, dd, J5,62.4 Hz, J6,6, 12. 3 Hz, H-6c), 4.19 (1H, dd, J5,63.5 Hz, J6,6, 12.2 Hz, H-6b), 4.27 (1H, dd, J5,6, 3.8 Hz, J6,6,12.3 Hz, H-6'c), 4.30 (1H, dd, J5,64.2 Hz, J6,6, 12. 4 Hz, H-6a), 4.46 (1H, dd, J5,6, 2.6 Hz, J6,6, 12.3 Hz, H-6'b), 4.47 (1H, dd, J5,6, 2. 2 Hz, J6,6, 12.2 Hz, H-6'a), 4.76 (1H, dd, J1,23.9 Hz, J2,310. 0 Hz, H-2b), 4.87 (1H, dd, J1,23. 8 Hz, J2,310. 6 Hz, H-2c), 5.99 (1H, dd, J1,210.3 Hz, J2,39. 1 Hz, H-2a), 5.08 (1H, at, J9.9 Hz, H-4c), 5.27 (1H, d, J1,24. 0 Hz, H-1b), 5.31 (1H, d, J1,210. 0 Hz, H-1a), 5.33-5. 43 (4H, m, H-1c, H-3a, H-3b, H-3c) ; δc (125 MHz, CDCl3) 20.7, 20. 8, 20.9, 21.0, 21.1 (5 x q,
10 x COCH3, SCOCH3), 31. 0 (q, SCOCH3) 61.9 (t, C-6c), 62.7 (t, C-6b), 63.3 (t,
C-6a), 68.4 (d, C-4c), 69.0 (d, C-5b), 69.5 (d, C-5c), 69.8 (d, C-3c), 70.3 (d,
C-2a), 70.5 (d, C-2c), 70.9 (d, C-2a), 72.1 (d, C-3b), 73.0 (d, C-4b), 74.1 (d,
C-4a), 76.6 (d, C-3a), 76.9 (d, C-5a), 80.2 (d, C-1a), 96.1 (d, C-1c), 96.4 (d,
C-1b), 169.4, 169.6, 169. 8, 169.9, 170.3, 170.5, 170.6 (7 x s, 10 x COCH3), 196.0 (s, SCOCH3) ; m/z (ES+) 1000 (MNH4 +, 60%), 1003 (MNa+, 100%)。
0. 9)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0. 0) が得られたことを示した。該反応物はDowex(R)-50イオン交換樹脂を加えることによって中和され、その後に濾過し、真空中
で濃縮することにより、標記の化合物がアモルファス固体(305 mg, 98%)として得られた
;
[α] D 25+123 (c, 1.0 in MeOH) ;δH (400 MHz, D20), 3.15 (1H, at, J9. 2 Hz, H-2a), 3.26 (1H, at, J9. 3 Hz), 3.41-3. 82 (16H, m, H-2b, H-2c, H-3a, H-3b, H-3c, H-4a, H-4b, H-4c, H-5a, H-5b, H-5c, H-6a, H-6b, H-6c, H-6'a, H-6'b, H-6'c), 4.42 (1H, d, J1,29. 6 Hz, H-1a), 5.23 (1H, d, J1,21.7 Hz, H-1), 5.24 (1H, d, J1,21. 8 Hz, H-1) ; δc (100 MHz, D2O), 60. 8, 70.0 (2 x t, C-6a, C-6b, C-6c), 69.6, 71.5,
71.8, 72.1, 73.0, 73.2, 73.6, 76.0, 77.1, 77.6, 79.0 (11 x d, C-2a, C-2b, C-2c,
C-3a, C-3b, C-3c, C-4a, C-4b, C-4c, C-5a, C-5b, C-5c), 80. 2 (d, C-1a), 99.8, 100.1 (2 x d, C-1b, C-1c) ; m/z (ES-) 519 (100%, M-H+) ; m/z HRMS (ES-) calcd. for C18H31O15S (M-H+) 519. 1384. Found 519.1389。
れるとともに生成物(Rf 0. 3) が得られたことを示した。該反応物をRTまで冷却し、DCM (50 mL)で希釈し、水(100 mL)と分離させた。 相を分離させ、水溶性相はDCM (2 x 40 mL)で再抽出した。これらの混合有機相はpH 8まで炭酸水素ナトリウム(飽和水溶液200 mL)
で洗浄し、蒸留、塩水(100 mL)につけ、MgSO4で乾燥し、真空中で濾過して濃縮した。残
留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル 1: 3)によって精
製することにより、標記の化合物がアモルファスの白色固体であるアノマー混合物(α/β, 15/85)として得られた;
δH (500 MHz, CDCl3)2.02, 2.03, 2.04, 2.05, 2.06, 2.07, 2.08, 2.10, 2.13, 2.19, 2.22, 2.24 (66H, 12 x s, 22 x OAc), 3. 89-4. 14 (13H, m, H-4a, H-4b, H-4c, H-4d,
H-4e, H-4f, H-5a, H-5b, H-5c, H-5d, H-5e, H-5f, H-5g), 4.25-4. 34,4. 39 (1H, dd, J4. 0 Hz, J 12.3 Hz), 4.52-4. 56 (13H, m, H-6a, H-6a', H-6b, H-6b', H-6c, H-6c', H-6d, H-6d', H-6e, H-6e', H-6f, H-6f', H-6d, H-6g'), 4. 75-4.79 (5H, m, H-2b,
H-2c, H-2d, H-2e, H-2e, H-2f), 4.90 (1H, dd, J1,23. 7 Hz, J2,310.5 Hz, H-2g), 5.00 (1H, at, J9. 4 Hz, H-4g), 5.31-5. 45 (13H, m, H-3a, H-3b, H-3c, H-3d, H-3e, H-3f, H-3g, H-1b, H-1c, H-1d, H-1e, H-1f, H-1g), 5.79 (0.85H, d, J1,2 8. 1 Hz, H-1a β), 6.28 (0.15H, d, J1,24. 0 Hz, H-1aα)。
セチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−α−O−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシルブロミド
−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−α−O−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−D−グルコピラノース (100 mg, 0.05 mmol)を無水DCM (5 mL)に溶解させた。これに臭化水素(33% 酢酸
中, 0.5 mL) を加えた。該混合物をアルゴン雰囲気下、RTで攪拌し続けた。40分後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル,1:3)は、出発原料(Rf0.3)が完全に消費
されるとともに生成物(Rf0.7)が得られたことを示した。該反応混合物をDCM(10mL)と水(10mL)に分離させ、水溶性相はDCM(3x10mL)で再抽出した。これらの混合有機相は、pH 7ま
で炭酸水素ナトリウム (飽和水溶液150mL)で洗浄し、蒸留、塩水(20mL)につけ、MgSO4で
乾燥し、濾過し、真空中で濃縮することにより、標記の化合物(98mg,96%)が白色固体として得られた;
[α] D 22+162.0 (c, 1.0 in CHCl3) ;δH (400 MHz, CDCl3) 2.02, 2.03, 2.04, 2.06, 2. 08, 2.10, 2.11, 2.14, 2.19, 2.23, 2.24, 2.25 (66H, 12 x s, 22 x OAc), 3.94-4. 04 (12H, m, H-4b, H-4c, H-4d, H-4e, H-4f, H-5b, H-5c, H-5d, H-5e, H-5f, H-5g), 4. 08 (1H, dd, J5,6 2.2 Hz, J6,6, 12. 6 Hz, H-6), 4.19-4. 33,4. 53-4.60 (12H, m, H-5a, H-6b, H-6b', H-6c, H-6c', H-6d, H-6d', H-6e, H-6e', H-6f, H-6f', H-6g, H-6g'), 4.12 (1H, at, J 9.5 Hz, H-4a), 4.40 (1H, dd, J5,63.1 Hz, J6,6, 12. 7 Hz, H-6a), 4.64 (1H, dd, J5,62. 3 Hz, J6,6'12. 5 Hz, H-6a'), 4.74 (1H, dd, J1,23.9 Hz,
J2,39. 7 Hz, H-2a), 4.75-4. 97 (5H, m, H-2b, H-2c, H-2d, H-2e, H-2f), 4. 89 (1H, d, J1,24. 0 Hz, J2,310.6 Hz, H-2g), 5.11 (1H, at, J 9.9 Hz, H-4g), 5.32-5. 47 (12H, m, H-1b, H-1c, H-1d, H-1e, H-1f, H-1g, H-3b, H-3c, H-3d, H-3e, H-3f, H-3g), 5.65 (1H, at, J 9.4 Hz, H-3a), 6.54 (1H, d, J1,24. 3 Hz, H-1a) 。
、該反応物をアルゴン雰囲気下加熱還流した。8時間後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール: 酢酸エチル 1: 4) は、出発原料(Rf 0. 6)が完全に消費されるとともに副生成物(Rf 0.0) が得られたことを示した。該反応物を真空中で濃縮し、過剰チオ尿素から有機
物を除去するためにDCMで滴定した。濾液を真空中で濃縮し、残留物をカラムフラッシュ
クロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール, 9: 1)によって精製することにより、特性
のない中間物、2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−α−O−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−β−D−グルコピラノシル−1−イソチオウロニウムブロミド(212 mg, 19%)を得た。該中間物(210 mg, 0.09 mmol)とNa2S2O5 (22 mg, 0.11 mmol) をDCM (10 mL) と水 (5 mL)との撹拌された混合物に加えた。該混合物をアルゴン雰囲気下加熱還流した。 4.5時間後、薄層
クロマトグラフィー (ペトロール: 酢酸エチル, 1: 2)は、出発原料(RfO. 0)が完全に消
費されるとともに生成物(Rf 0.2) が得られたことを示した。そこで該反応物をRT まで冷却し、相を分離させた。水溶性相はDCM (2 x 10 mL)で再抽出した。これらの混合有機相
を塩水 (20 mL)で洗浄し、乾燥 (MgSO4)、真空中で濾過し、溶媒を除去した。標記の化合物(185 mg, 90%)が書きのような非晶性固体として得られた;
[α] D 24+128. 1 (c, 1. 0 in CHCl3);δH (500 MHz, CDCl3), 2.00, 2.01, 2.02, 2.03,
2.04, 2.05, 2.07, 2. 08, 2. 12, 2. 17, 2. 19, 2. 21, 2. 22, 2. 23 (66H, 14 x s,
22 x COCH3), 2.27 (1H, d, J1,SH 9. 8 Hz, SH), 3. 76 (1H, dat, J4,59.7 Hz, J3. 5
Hz, H-5a), 3. 92-4. 08 (12H, m, H-4a H-4b, H-4c, H-4d, H-4e, H-4f, H-5b, H-5c, H-5d, H-5e, H-5f, H-5g), 4. 17- 4.36, 4.49-4. 56 (12H, m, H-6b, H-6b', H-6c, H-6c', H-6d, H-6d', H-6e, H-6e', H-6f, H-6f', H-6g, H-6g'), 4.39 (1H, dd, J5,6 3.6 Hz, J6,6, 12. 2 Hz, H-6a), 4. 48 (1H, dd, J5,63.2 Hz,J6,6'12.3 Hz, H-6a), 4.62 (1H at, J 9. 5 Hz, H-1a), 4.73-4. 78 (5H, m, H-2b, H-2c, H-2d, H-2e, H-2f), 4. 82
(1H, at, J 9. 5 Hz, H-2a), 4. 88 (1H, dd, J1,24.0 Hz, J2,310.4 Hz, H-2g), 5.09
(1H, at, J9. 9 Hz, H-4g), 5.27 (1H, at, J9. 1 Hz, H-3a), 5. 30- 5.44 (12H, m,-1b, H-1c, H-1d, H-1e, H-1f, H-1g, H-3b, H-3c, H-3d, H-3e, H-3f, H-3g)。
単一修飾は規範的システイン含有タンパク質、セリンプロテアーゼスブチリシン、バチルスレンタス変異株S156C (SBLCysl56) を用いて研究されている。SBLCysl56 (10 mg)を脱
気水性バッファー溶液(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)へ溶解させた。PhSeBr (5 mg, 0.02 mmol) をアセトニトリル (200 μL)に溶解し、このうちの150 μL
(40 eq)をタンパク質溶液に加え、逆回転子に置いた。30分後、エルマン分析(G. L. Ellman, K. D. Courtney, V. Andres, R. M. Featherstone, Biochem. Pharmacol. 1961,7, 88)により、遊離型のチオールは存在しないことが示された。さらに30分、該反応物
を逆回転子に置き、その段階で反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25カラムに流し、pH 7.0
で 70 mM HEPESと 2 mM CaCl2を溶出した。分留タンパク質を集め、水と接触して透析(MWCO 12-14 KDa)し(1 x 4L 1時間, 2 x 2L 30分)、SBLS156C-S-SePhを得たa;
m/z (ES+) found 26864 clcd. 26870。
多重修飾は、2つのシステイン残留物(SSβG-Cys344Cys432)を含有した古細菌Sulfolobus
solfataricus由来の好熱性β−グルコシダーゼ変異体を用いて、研究が行われた。SSβG-Cys344Cys432 (1 mg)を水溶性バッファー中に溶解させた (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9. 5)。PhSeBr (2 mg, 0. 02 mmol)はアセトニトリル (200 μL)中に
溶解し、そのうちの20 μL (74 eq) をタンパク質溶液に加え、逆回転子に置いた。1時
間後、該混合反応物をPD10 Sephadex(R) G25 カラムに流し、溶出して (70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0) SSβGCys344Cys432-(S-SePh)2を得た;
m/z (ES+) found 57700 calcd. 57697 。
SBLCys156-S-SePh (1 mg)を水溶性バッファー中(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)に溶解した。チオール糖または他のチオールを水の中に溶解し、規定量のタ
ンパク質溶液(下記表の当量参照)の中に溶解し、混合物を逆回転子に置いた。1時間後、該反応物を質量スペクトルで分析した。
1チオールの添加に先立ち、フェニルセレニウムブロミドとの反応により活性化され、対
応するタンパク質-S-Se-Phまたはタンパク質-(S-Se-Ph) 2が与えられた
2タンパク質分解活性によるタンパク質分解を防ぐために、グリコシレーションに先立ちP
MSF(フェニルメチルスルフォニルフルオライド)と反応させた
上記表の結果は、本発明の方法によるとわずか1当量のチオール化合物を用いることで、所望の生成物に高率で変換されることを実証している。さらに、該結果は本発明の方法は、単一または多重の位置でのタンパク質グリコシル化に利用できることを実証している。SBL-Cys 156とSSβGCys344Cys432 の3箇所でのグリコシル化は、大変多様なタンパク質
構造および露出程度の異なる環境において見られ、本発明の方法が幅広い応用性があることを示している。
1−チオ−2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−α−O−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−β−D−グルコピラノース (15 mg, 0.007 mmol) とナトリウムメトキシド (2 mg, 0.007 mmol)を撹拌されたメタノール (2 ml) 溶液に加えた。2時間後、薄層クロマトグラフィー(ペトロー
ル: 酢酸エチル, 1: 2) は、出発原料(Rf 0. 2)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.0) が得られたことを示した。該反応物はDowex(R)-50イオン交換樹脂を加えることによ
って中和され、その後真空中で濾過し、濃縮した。
1−チオ−β−D−マルトヘプトースの原料は、未精製の1−チオ−β−D−マルトヘプトースを水(5 mL)に投入し、そのうちの300μL (11 eq)を、500μLの水溶性バッファー液(70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)にSBLCys 156-S-SePh (1 mg)が溶解した溶液に添加した。結果として生じた溶液を逆回転子に置いた。1時間後、該混合反応物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、70 mM HEPES, 2 mM CaCl2, pH 7.0において溶出した
。分留タンパク質を収集してGlcGlcGLcGlcGlcGlcGlc-SBLCysl56を得た;
m/z (ES+) found 27878 calcd. 27881。
A. GIcNAc-SBLCysl56 (3 mg) を1 mLの水溶性バッファー液に溶解した。 フェニルメチ
ルスルフォニルフルオライド (PMSF)を加えた (100 mg/mLの アセトニトリル溶液50μL; 500-当量)。該混合反応は30分間室温で温置し、 Sephadex(R)G25 (PD-10)脱塩カラムで精製した。非活性化したタンパク質の純度をESI-質量分光分析で評価した (観測値 : 27100,計算値27104)。タンパク質分留は凍結乾燥し、0. 1Mカコジル酸ナトリウムバッファー液 (pH 7.52)の1.0 mL中に再溶解した。MnCl2. 4H2O (3.2 mg; 16 μmol) とウリジン二
リン酸-ガラクトース(UDP-galactose, 2.3 mg; 3.4 p. mol, Kyowa Hakko ; 30-当量) を加えた。Spodoptera Frugiperda 由来の組換えウシ β−1,4−ガラクトシルトランス
フェラーゼ (EC 2. 4. 1. 229 100 mU, Calbiochem)を加え、反応混合物を40分間室温
で温置し、Galβ1,4GlcNAc-S-SBL-Cys156 (ESI-MS, 観測値 27265, 計算値 27266)を得た。
フコシルトランスフェラーゼ(EC 2.4. 1. 65, 10 mU, Calbiochem)を加え、該混合反応物を一晩室温で温置し、LewisX-S- SBL-Cys 156 (ESI-MS,観測値27410,計算値 27412)を得
た。
この実施例では、本発明の方法により調製されたグリコシル化タンパク質が、適した糖修飾酵素、例えば、選択的にGalβ1, 4GlcNAc結合を形成するβ-1, 4-ガラクトシルトラン
スフェラーゼのようなグリコシルトランスフェラーゼとの反応によりさらに修飾されることを実証した。
ピリジン (60 mL) に溶解し、黄色溶液を得た。該反応物はアルゴン雰囲気下攪拌し、1
時間後白色懸濁液を得た。 該反応物を濾過し、無水ジエチルエーテルで洗浄した。無水
エタノールからの再結晶により、白色結晶固体として標記の化合物(10.5 g, 88%)を得た;
融点305-306℃[Lit. 287°C, Sato, R.; Goto, T.; Takikawa, Y.; Takizawa, S. Synthesis 1980,615] ;
δH (200 MHz, DMSO-d6) 7.28-7. 76 (5H, m, Ar-H) 。
トグラフィー (ペトロール : 酢酸エチル, 1 : 1) は、出発原料(Rf 0. 3)が完全に消費
されるとともに生成物(Rf 0.5) が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。
未精製固形物をジクロロメタン(DCM, 20 mL)と水(20 mL)に分離し、水溶性相はDCM (2 x 20 mL)で再抽出した。 これらの混合有機相は塩水(20 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥、濾過
して真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー (ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1)によって精製することにより、標記の化合物(225 mg, 88%)を白色結晶固体として得た;
融点 129-130℃;
[α] D 25 +51. 2 (c, 1. 0 in CHCl3) ; umax (KBr) 1754 (s, C=O), 1376 (s, C=C) cm-1 ; δH (400 MHz, C6D6) 1.68, 1.72, 1.73, 1.75 (4 x 3H, 4 x s, 4 x OAc), 3.09 (1H, ddd, J4,510. 2 Hz, J5,62.4 Hz, J5,6' 4. 2 Hz, H-5), 3.83 (1H, dd, J5,62. 4 Hz, J6,6' 12. 7 Hz, H-6), 4. 08 (1H, dd, J5,6'4.2 Hz, J6,6'12. 6 Hz, H-6'), 5.17-5. 23 (2H, m, H-2, H-4), 5.40 (1H, d, J1,210.2 Hz, H-1), 5.44 (1H, at, J9.4 Hz, H-3), 6. 98-7. 03 (3H, m, Ar-H), 7.90-7. 92 (2H, m, Ar-H)。
生成物の構造は、さらに単結晶X線回折によって確認された。
5 mmol)を無水アセトニトリル(80 mL)に溶解した。これにソディウムフェニルチオスル
フォネート (2.02 g, 10.3 mmol) とテトラブチルアンモニウムブロミド(160 mg, 0.5 mmol)を加えた。該混合物をアルゴン雰囲気下70° Cで攪拌した。5時間後、薄層クロマト
グラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1) は、出発原料(Rf 0. 6)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.4) が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。未精製
油分をDCM (50 mL)と水(50 mL)で分離し、水溶性相はDCM (2 x 50 mL)で再抽出した。こ
れらの混合有機相は塩水(100 mL)で洗浄し、MgSO4で乾燥、濾過し、真空中で濃縮した。
残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール : 酢酸エチル, 2 : 1)によって精製することにより、標記の化合物(1.7 g9 65%, 2 段階)を白色結晶固体として得た融点 53-54℃ ;
[α] D 27+24. 2 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400MHz, CDCl3) 1.98, 2.03, 2.06, 2.11 (4
x 3H, 4 x s, 4 x OAc), 3. 85 (1H, dd, J5,6 8.8 Hz, J6,6' 14.0 Hz, H-6), 3.95-4.
00 (2H, m, H-5, H-6), 5.11 (1H, dd, J2,39.7 Hz, J3,43. 3 Hz, H-3), 5.23 (1H, at, J 10.3 Hz, H-2), 5.25 (1H, d, J1,210. 2 Hz, H-1), 5.43 (1H, dd, J3,43.6 Hz, J4,51. 0 Hz, H-4), 7.54-7. 68 (3H, m, Ar-H), 7.93-7. 97 (2H, m, Ar-H)。
水DCM (10 mL)に溶解し、アルゴン雰囲気下室温(RT)で攪拌した。エタンチオール(0. 016
mL, 0.2 mmol)の無水DCM(10 mL)溶液を、シリンジ・ポンプを通して30分以上かけてゆっくりと液滴にて加えた。40分後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル,
1: 1) は、出発原料(Rf 0.3)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.5) が得られたことを示し、該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1)によって精製することにより、標記の化合物(70 mg, 82%)を白色結晶固体として得た;
融点 95-96℃ [Lit. 100-102°C, (Davis, B. G.; Ward, S. J.; Rendle, P. M. Chem. Commun. 2001,189)] ;
[α] D 22-164. 9 (c, 0.2 in CHCl3) [Lit. [α] D 24-178. 0 (c, 1.0 in MeOH) (Davis,
B. G.; Ward, S. J.; Rendle, P. M. Chem. Commun. 2001, 189)] ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.30 (1H, t, J 7. 4 Hz, CH3), 2.00, 2.02, 2.03, 2.06 (4 x 3H, 4 x s, 4 x CH3
), 2. 79 (2H, dq, JCH3-H 7. 5 Hz, JHH 2. 7 Hz), 3.73 (1H, ddd, J4,5 10. 2 Hz, J5,6 2. 5 Hz, J5, 6' 4.8 Hz, H-5), 4. 14 (1H, dd, J5, 6 2. 4 Hz, J6,6' 12.4 Hz, H-6), 4.22 (1H, dd, J5,6' 4. 7 Hz, J6,6' 12. 4 Hz, H-6'), 4.52 (1H, d, J1,2 9. 8 Hz, H-1), 5.10 (1H, at, J 9.8 Hz, H-4), 5.21-5. 26 (2H, m, H-2, H-3)。
方法2: フェニル2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−1−セレネニルスルフィド−D−β−グルコピラノシド(75 mg, 0.15 mmol)とトリエチルアミン(30 μL, 0.15 mmol)
を新たに蒸留したDCM (10 mL)に溶解した。該溶液をアルゴン雰囲気下RTで撹拌した。エ
タンチオール(11μL, 0.15 mmol)の無水DCM(10 mL)溶液を液滴にて2.5時間以上かけて加えた。3時間後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール:酢酸エチル 1: 1) は、出発原
料(Rf 0.5)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.5) が得られたことを示した。該
溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: EtOAc, 5: 3)によって精製することにより、標記の化合物(50 mg, 82%)を白色結晶固体と
して得た。
mmol)の無水DCM (10 mL)溶液をシリンジ・ポンプを通して30分以上かけてゆっくりと
液滴により加えた。40分後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1)
は、出発原料(Rf 0.3)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.4) が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペ
トロール: 酢酸エチル, 1: 1)によって精製することにより、標記の化合物(78 mg, 91%)
を白色結晶固体として得た;
融点65-66℃ ;
[α] D 25 -52. 1 (c, 1.4 in CHCl3) ;
umax (KBr) 1746 (s, C=O) cm-1; δH (400 MHz, CDCl3) 1.30 (1H, t, J7.4 Hz, CH3), 1.95, 2.01, 2.02, 2.13 (4 x 3H, 4 x s, 4 x CH3), 2.79 (2H, dq, JCH3-H 7.2 Hz, JHH 1.7 Hz), 3.94 (1H, td, J4,5 0.9 Hz, J5, 6 6. 3 Hz, J5, 6' 7. 0 Hz, H-5), 4. 06
(1H, dd, J5,6 6.3 Hz, J6,6'11.3 Hz, H-6), 4.12 (1H, dd, J5,6' 7.0 Hz, J6,6' 11.2 Hz, H-6'), 4.51 (1H, d, J1,2 9.9 Hz, H-1), 5.05 (1H, dd, J2,3 9.9 Hz, J3,43.6 Hz, H-3), 5. 35-5. 40 (2H, m, H-2, H-4)。
を新たに蒸留したDCM (10 mL)に溶解した。該溶液をアルゴン雰囲気下RTで撹拌した。エ
タンチオール(11μL, 0.15 mmol)の無水DCM (10 mL)溶液を2.5時間以上かけてゆっく
りと液滴により加えた。3時間後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール:酢酸エチル 1: 1) は、出発原料(Rf 0.5)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.5) が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(
ペトロール: EtOAc, 5 : 3)によって精製し、標記の化合物(50 mg, 82%)を白色結晶固体
として得た。
下RTで撹拌した。エタンチオール (0.014 mL, 0.19 mmol)の無水DCM (10 mL)溶液を1時
間以上かけて液滴により加えた。3時間後、薄層クロマトグラフィー(EtOAc) は、出発原
料(Rf 0.5)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.4) が得られたことを示した。該
溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(EtOAc)によっ
て精製することにより、標記の化合物(75 mg, 93%)をアモルファス固体として得た;
[α] D 25-70. 1 (c, 2.5 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3), 1. 32 (3H, d, JCH, CH3 6.6 Hz, CHCH3), 1.96, 2.04, 2.05, 2.08 (12H, 4 x s, 4 x COCH3), 2.82 (2H, q, J 7.4 Hz, CH2), 3.75 (1H, ddd, J4,5 10.1 Hz, J5,6 2. 5 Hz, J5, 6, 4.7 Hz, H-5), 4.12-4. 25 (3H, m, H-2, H-6, H-6'), 4.73 (1H, at, J1,2 10. 4 Hz, H-1), 5.10 (1H, at, J 9. 8 Hz, H-4), 5.30 (1H, at, J 9. 9 Hz, H-3), 5.70 (1H, d, JNH,2 9. 1 Hz, NH)。
中(5 mL)に溶解した。この溶液に無水酢酸(0.09 mL, 0.92 mmol)とピリジン(0.075 mL, 0.92 mmol)を加えた。15分後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール5: 1) は、出発原料(Rf 0.1)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.5) が得られたことを示
した。該反応物を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢
酸エチル: メタノール 5: 1)によって精製することにより、標記の化合物(60 mg, 50%)を白色結晶固体として得た;
融点 145-147℃ ;
[α] D 25-33. 4 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 2.04 (3H, s, COCH3), 2.96 (1H, dd, JCH, H 13.9 Hz, JCH,αH 4. 7 Hz, CysCHH), 3. 23 (1H, dd, JCH,H 13. 9
Hz, JCH,αH 4.7 Hz, CysCHH), 3.76 (3H, s, OMe), 3.83 (1H, dd, JCH,H 11.4 Hz, JCH,αH4.1 Hz, SerCHH), 3.93 (1H, dd, JCH,H 11.3 Hz, JCH,αH 4.9 Hz, SerCHH), 4.55 (1H, t, J 4.3 Hz,αHSer), 4.87 (1H, t, J4.8,αHCys)。
に主生成物(Rf 0.6) が得られたことを示した。該反応物を真空中で濃縮した。酢酸エチ
ル/メタノールから再結晶させることにより、標記の化合物(1.77 g, 93%)を白色結晶固
体として得た;
融点 127-128℃;
[α] D 25-32. 0 (c, 1.0 in MeOH) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1. 89 (1H, at, J 8.9 Hz, SH), 2.06 (3H, s, COCH3), 2. 84-2. 93 (1H, m, CysCHH), 2. 97-3. 04 (1H, m, CysCHH), 3. 79 (3H, s, OMe), 3. 91 (1H, dd, JCH,H 11.4 Hz, JCH,αH 3.1 Hz, SerCHH, 4.03 (1H, dd, JCH,H 11. 7 Hz, JCH,αH4. 2 Hz, SerCHH), 4. 61-4. 65 (1H, m,αHSer),
4.71-4. 76 (1H, m, αHCys), 6.93 (1H, d, JαH,NH 7.8 Hz, NHCys), 7.73 (1H, d, JαH,NH 7.4 Hz, NHSer).
した。これにN−アセチル−L−システイン−L−セリンメチルエステル(32 mg, 0.12 mmol)およびトリエチルアミン(0.015 mL, 0. 1 lmmol)を無水DCM (10 mL)および無水メタ
ノール(0.5 mL)に溶解させた溶液をシリンジ・ポンプを通して4時間以上かけてゆっくりと液滴により加えた。5時間後、薄層クロマトグラフィー (酢酸エチル: メタノール, 10: 1) は、出発原料(Rf 0. 3, (薄層クロマトグラフィー装置 (ぺトロール: 酢酸エチル, 1: 1) )が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.5) が得られたことを示した。該溶液
を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル: メタ
ノール 10: 1)によって精製することにより、標記の化合物(75 mg, 99%)を白色結晶固体
として得た;
融点126−128℃ [Lit. 125-128°C (Davis, B. G. ; Ward, S. J.; Rendle, P. M. Chem.
Commun. 2001, 189)] ;
[α] D 25-47. 9 (c, 0.7 in CHCl3) [Lit. [α] D 24-178. 0 (c, 1.0 in MeOH) (Davis, B. G.; Ward, S. J.; Rendle, P. M. Chem. Commun. 2001, 189)] ;
δH (400 MHz, CDCl3) 2.03, 2.06, 2.07, 2.11 (5 x 3H, 4 x s, 5 x CH3), 3.05 (1H, dd, JCH,H 13. 9 Hz, JCH,αH8. 8 Hz, CysCHH), 3.28 (1H, dd, JCH,H 13.9 Hz, JCH,αH 4.8 Hz, CysCHH), 3.80 (3H, s, OMe), 3. 89 (1H, ddd, J4,5 10. 0 Hz, J5, 6 2. 2 Hz, J5, 6' 4. 1 Hz, H-5), 3. 94 (1H, dd, JCH, H 11.7 Hz, JCH,αH 3.0 Hz, SerCHH), 4.00 (1H, dd, JCH, H 13. 8 Hz, JCH,αH 3. 7 Hz, SerCHH), 4.23 (1H, dd, J5,6 4.2 Hz, J6,6' 12. 4 Hz, H-6), 4. 38 (1H, dd, J5,6' 2.0 Hz, J6,6' 12.5 Hz, H-6'), 4. 62-4. 65 (1H, m, αHSer), 4. 64 (1H, d, J1,2 9.5 Hz, H-1), 4.90-4. 94 (1H, m, αHCys), 5. 18 (1H, at, J 10. 1 Hz, H-4), 5. 24-5. 29 (2H, m, H-2, H-3), 6.94 (1H, d, JNH,H 7.9 Hz, NHAc), 7.52 (1H, d, JNH,H 7.6 Hz, NHSer)。
した。N−アセチル−L−システイン−L−セリンメチルエステル(31 mg, 0. 12 mmol)
およびトリエチルアミン(0. 015 mL, 0. 1 lmmol)を無水DCM (10 mL)および無水メタノール(0.5 mL)に溶解させた溶液をシリンジ・ポンプを通して2時間以上かけて液滴により加えた。2時間後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール, 10: 1) は出発原料(Rf 0. 5, t.1.cシステム ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1 )を完全に消費するとともに主生成物(Rf 0.5)が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール 10: 1)によって精製することにより、標記の化合物(59 mg, 95%)を白色アモルファス固体として得た;
[α] D 25-48. 8 (c, 0.25 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.99, 2.04, 2.05, 2. 08, 2. 18 (5 x 3H, 4 x s, 5 x CH3), 2. 80 (1H, bs, OH), 2.99 (1H, dd, JCH,H 14.1 Hz, JCH,αH 9.2 Hz, CysCHH), 3.32, 3.77 (3H, s, OMe), 3.92 (1H, dd, JCH,H 11. 7 Hz, JCH,αH 3. 0 Hz, SerCHH), 4.01 (1H, dd, JCH,H 11.7 Hz, JCH,αH 3.7 Hz, SerCHH), 4.06-4. 14 (2H, m, H-5, H-6), 4.20-4. 26 (1H, m, H-6'), 4.61-4. 63 (1H, m,αHSer), 4.65 (1H, d, J1,2 9. 8 Hz, H-1), 4.88-4. 93 (1H, m, αHCys), 5.11 (1H, dd,
J2,3 9.8 Hz, J3,4 3.3 Hz, H-3), 5.42-5. 47 (2H, m, H-2, H-4), 6. 68 (1H, d, JNH,H 7. 8 Hz, NHAc), 7.28 (1H, d, JNH,H 8.1 Hz, NHSer)。
ルゴン雰囲気下無水DCM (6 mL)と無水DMF (0. 4 mL)に溶解した。結果物の溶液を0℃で
撹拌した。オキサリルブロミド(4 mL, 2M in DCM, 24 mmol)を5分以上かけて液滴により加えた。該反応物をRTで撹拌した。40分後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢
酸エチル, 2: 1) は主生成物(Rf 0.7)が得られたことを示した。該反応物は0℃まで冷却し、5分以上氷冷水(30 mL)を加えて急冷した。該反応物はDCM (20 mL)と水に分離した。水溶性相はDCM (3 x 20 mL)で再抽出し、これらの混合有機相を塩水(40 mL)で洗浄し、MgS04で乾燥、濾過し、真空中で濃縮することにより標記の化合物(1. 10 g, 95%)を粗製黄
色オイルとして得た;
δH (400 MHz, CDCl3), 3.57 (1H, dd, J1, 23. 5 Hz, J2, 3 9.1 Hz, H-2), 3.68 (1H, dd, J5, 6 2.1 Hz, J6,6'11. 0 Hz, H-6), 3.79-3. 84 (2H, m, H-4, H-6'), 4.07 (1H, at, J 9. 1 Hz, H-3), 4.07-4. 11 (1H, m, H-5), 4.47-4. 62 (3H, m, PhCH 2 ), 4.74 (s, 2H, PhCH 2 ), 4.84- 4.89 (2H, m, PhCH 2 ), 5.10 (1H, d, J 11.1 Hz, PhCH 2 ), 6.46 (1H, d, H-1), 7.15-7. 41 (20H, m, Ar-H)。
キサン(90 mL)に溶解した。該反応物をアルゴン雰囲気下70℃まで加熱した。20時間
後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール:酢酸エチル, 2: 1)は、出発原料(Rf 0. 7)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.6)が得られたことを示した。該反応物はRTまで冷却して濾過し、沈殿物をペトロール/酢酸エチルで洗浄し、濾液を真空中で濃縮した。残
留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 4 : 1)によって
精製することにより、2,3,4,6−テトラ−O−ベンジル−D−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート(3. 18 g, 78%)をβ:α比が3:1のα、β化合物混合物である白色粘性ゴムとして得た。酢酸エチル/ペトロールからの選択的な再結晶により、純粋な2,3,4,6−テトラ−O−ベンジル−β−D−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネートを白色結晶固体として得た;
融点 106-108℃;
[α] D 22+21. 4 (c, 0. 35 in CHCl3) ; δH (500 MHz, C6D6) 3.21 (1H, ddd, J4, 5 9.
7 Hz, J5, 6 1. 4 Hz, J5, 6' 3.8 Hz, H-5), 3.29 (1H, dd, J5, 61. 4 Hz, J6,6' 11.
1 Hz, H-6), 3.34 (1H, dd, J1, 2 9.9 Hz, J2, 3 8.7 Hz, H-2), 3.49 (1H, dd, J5, 6
3.8 Hz, J6, 6' 11.1 Hz, H-6'), 3.51 (1H, at, J9. 4 Hz, H-3), 3.60 (1H, at, J9. 4 Hz, H-4), 4.15, 4.25 (2H, ABq, J 12.1 Hz, PhCH2), 4.52, 4.58 (2H, ABq, J 11.0 Hz, PhCH2), 4.72, 4.76 (2H, ABq, J 11.3 Hz, PhCH2), 4.78, 4.52 (2H, ABq, J 11.3 Hz, PhCH2), 5.25 (1H, d, J1,2 10. 2 Hz, H-1), 6.82-6. 88 (3H, m, Ar-H), 7.05-7. 26 (20H, m, Ar-H), 7.96-7. 98 (2H, m, Ar-H)。
出発原料(Rf 0. 2)を完全に消費するとともに主生成物(Rf 0.4)が得られたことを示した
。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロー
ル: 酢酸エチル, 7: 1)によって精製することにより、標記の化合物を澄んだオイル(83 mg, 95%)として得た;
[α] D 22-164. 9 (c, 0.2 in CHCl3) [Lit. [α] D 25-80. 0 (c, 3.0 in MeOH) (Davis, B. G.; Ward, S. J.; Rendle, P. M. Chem. Commun. 2001, 189)] ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.22 (1H, t, J 7. 3 Hz, CH3), 2.68-2. 86 (2H, m, CH2), 3.24 (1H, ddd, J4, 5 9.7 Hz, J5,6 3.3 Hz, J5,6' 2. 1 Hz, H-5), 3. 56-3. 60 (2H, m, H-6, H-6'), 3. 61 (1H, at, J 9.1 Hz, H-3), 3.72 (1H, at, J9. 4 Hz, H-4), 3. 89 (1H, at, J 9. 1 Hz, H-2), 4. 34 (1H, d, J1,2 9.7 Hz, H-1), 4. 37, 4. 31 (2H, Abq, J 12.2 Hz, PhCH 2 ),
4.56, 4. 83 (2H, Abq, J 11.3 Hz, PhCH 2 ), 4. 77-4. 83 (2H, m, PhCH 2 ), 4. 90 (1H,
d, J 11.1 Hz, PhCHH), 4. 97 (1H, d, J 10.7 Hz, PhCHH), 7. 07-7. 21 (14H, m, Ar-H), 7.25-7. 27 (2H, m, Ar-H), 7. 29-7. 31 (2H, m, Ar-H), 7. 36-7.38 (2H, m, Ar-H)。
た。5時間後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル)は出発原料(Rf 0. 9)を完全に消費
するとともに主生成物(Rf 0.6)が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル)によって精製することにより、標記の化合物(48 mg, 82%)を白色結晶固体として得た;
融点 96-97℃ ;
[α] D 22+56. 2 (c, 1 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 2.03 (3H, s, COCH3), 3.19 (1H, dd, JCH,H 14.0 Hz, JCH,αH 8.3 Hz, CysCHH), 3. 37 (1H, dd, JCH,H 14.3 Hz, JCH,αH 6.0 Hz, CysCHH), 3.64 (1H, ddd, J4,5 9.6 Hz, J5,6 1.8 Hz, J5,6' 3.9 Hz, H-5), 3.72 (1H, at, J 9.2 Hz, H-4), 3.77 (1H, at, J 8. 8 Hz, H-3), 3.82 (3H, s, OMe), 3.84-3. 90 (4H, m, SerCHH, H-2, H-6, H-6'), 3.96 (1H, dd, JCH,H 11.7 Hz, JCH,αH 3.3 Hz, SerCHH), 4.50 (1H, d, J1, 2 9.6 Hz, H-1), 4.51, 4.70 (2H, ABq, J 11.6 Hz, PhCH2), 4.55, 4. 85 (2H, ABq, J 10.4 Hz, PhCH2), 4.59-4. 62 (1H, m, αHSer), 4.81, 4.87 (2H, ABq, J 10.6 Hz, PhCH2), 4.91, 4.97 (2H, ABq, J 11.0 Hz, PhCH2), 4. 93-4. 98 (1H, m,αHCys), 6.88 (1H, bd, JNH,H 7. 9 Hz, NHAc), 7.13-7. 39 (20H, m, 20 x Ar-C), 7. 48 (1H, d, JNH,H 7.6 Hz, NHSer)。
トニトリル中(10 mL)に溶解した。これにソディウムベンゼンチオスルフォネート(80 mg,
0.41 mmol)とテトラブチルアンモニウムイオダイド(10 mg, 0.02 mmol)を加えた。結果
物混合物をアルゴン雰囲気下70℃で撹拌した。2時間後、薄層クロマトグラフィー(ペ
トロール: 酢酸エチル, 1: 2)は出発原料(Rf 0. 5)を完全に消費するとともにUV活性の生成物(Rf 0.5)が得られたことを示した。ここで該溶液をRTまで冷却して濾過し、濾液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチ
ル, 1: 2)によって精製することにより、標記の化合物(140 mg, 62%)を白色アモルファス固体として得た;
[α] D 22+69. 9 (c, 0.75 in CHCl3) ; δH (500 MHz, CDCl3) 2.03, 2.04, 2.06, 2.08,
2.11, 2.15, 2.19, (30H, 10 x COCH3), 3.77-3. 79 (1H, m, H-5a), 3.94-4. 00 (4H, m, H-4a, H-4c, H-5b, H-5c), 4.10 (1H, dd, J5, 6 2.1 Hz, J6,6' 12. 4 Hz, H-6b), 4
.17-4. 22 (3H, m, H-6a, H-6c, H-6a'), 4.29 (1H, dd, J5, 6 3.3 Hz, J6, 6' 12. 6 Hz, H-6b'), 4.46 (1H, dd, J5, 6 1. 9 Hz, J6,6' 12.4 Hz, H-6c'), 4.76 (1H, dd, J1,23. 9 Hz, J2, 3 10.4 Hz, H-2a), 4.89-4. 94 (2H, m, H-2b, H-2c), 5.12 (1H, at, J 9.9 Hz, H-4b), 5.28 (1H, d, J1, 2 3. 8 Hz, H-1a), 5.34 (1H, d, J1, 29. 7 Hz, H-1c), 5.37 (1H, at, J9.1 Hz, H-3c), 5.41 (1H, at, J 10.1 Hz, H-3b), 5.41-5. 45 (2H, m, H-1b, H-3a), 7.62-7. 65 (2H, m, Ar-H), 7.71 (1H, m, Ar-H), 8.00-8. 02 (2H, m, Ar-H)。
で撹拌した。トリエチルアミン(7 μL, 0.05 mmol)とエタンチオール(3μL, 0.05 mmol)
と無水DCM (10 mL)との溶液をシリンジ・ポンプを通して1時間以上かけてゆっくりと液
滴により加えた。1時間後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 2)は出発原料(Rf 0. 4)を完全に消費するとともに主生成物(Rf 0.6)が得られたことを示した
。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロー
ル: 酢酸エチル, 1: 2)によって精製することにより、標記の化合物(43 mg, 93 %)を澄んだオイルとして得た;
[α] D 24 +26.4 (c, 1.5 in CHCl3) ; δH (500 MHz, CDCI3) 1.30 (1H, t, J7. 2 Hz, CH3), 2.04, 2.05, 2.06, 2.07, 2.10, 2. 14, 2.19, 2.20 (30H, 8 x s, 10 x COCH3), 2.75-2. 87 (2H, m, CH 2CH3), 3.77-3. 81 (1H, m, H-5a), 3.96-4. 00 (3H, m, H-4b, H-5c, H-5b), 4.03 (1H, at, J 9.3 Hz, H-4a), 4.10 (1H, dd, J5,6 2. 3 Hz, J6,6' 12. 6 Hz, H-6c), 4.22 (1H, dd, J5,6 2.9 Hz, J6, 6' 12.4 Hz, H-6b), 4.29 (1H, dd, J5,
6 3.7 Hz, J6, 6' 12. 4 Hz, H-6'c), 4.33 (1H, dd, J5, 6 4.4 Hz, J6, 6'12. 4 Hz, H-6a), 4.51 (1H, dd, J5, 6' 1.8 Hz, J6,6' 12.4 Hz, H- 6b', 4.57 (1H, dd, J5, 6 2.3 Hz, J6,6' 12.4 Hz, H-6a'), 4. 58 (1H, d, J1,2 9. 9 Hz, H-1a), 4.79 (1H, dd, J1,2 4.1 Hz, J2,3 10. 6 Hz, H-2b), 4.90 (1H, dd, J1, 2 4.3 Hz, J2, 3 10.4 Hz, H-2c), 5.11 (1H, at, J 9. 9 Hz, H-4c), 5.16 (1H, at, J 9. 5 Hz, H-2a), 5.33 (1H, d,
J1,2 4.1 Hz, H-1b), 5.37 (1H, at, J8. 9 Hz, H-3a), 5. 38-5. 44 (2H, m, H-3b, H-3c), 5.45 (1H, d, J1,2 4.1 Hz, H-1c)。
−β−D−グルコピラノシルジスルフィド)−L−セリンメチルエステル
mmol)を無水DCM (5 mL)に溶解し、アルゴン雰囲気下RTで撹拌した。トリエチルアミン(0. 014 mL, 0.2 mmol)およびN−ブトキシカルボニル−L−システイニル−L−セリンメ
チルエステル(30 mg, 0.09 mmol)を無水DCM (10 mL)および無水メタノール(1 mL)に溶解
させた溶液をシリンジ・ポンプを通して3時間以上かけてゆっくりと液滴により加えた。3時間後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル)は出発原料(Rf 0. 7)を完全に消費する
とともに主生成物(Rf 0.6)が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル)によって精製することにより、標記の化合物(66 mg, 74%)をアモルファス固体として得た;
[α] D 24 +25.1 (c, 1.25 in CHCl3) ; δH (500 MHz, CDCl3) 1.47 (9H, s, C (CH3) 3), 2.00, 2.01, 2.02, 2.03, 2.06, 2.09, 2.15, 2.18 (30H, 8 x s, 10 x COCH3), 2.75-2. 87 (1H, m, CHHCys), 3.16- 3.19 (1H, m, CHHCys), 3.27 (1H, t, J 6.2 Hz, OH), 3.81 (3H, s, OMe), 3.83-3. 85 (1H, m, H-5a), 3.92-4. 01 (6H, m, H-4b, H-5b, H-5c,
H6a, H-6a', CHHSer), 4.06 (1H, dd, J5, 6 2.2 Hz, J6, 6' 12.2 Hz, H-6c), 4.09-4.
16 (2H, m, H-4a, H-6b), 4.25 (1H, dd, J5, 6 3.2 Hz, J6, 6' 12. 3 Hz, H-6c'), 4.39-4. 41 (1H, m, CHHSer), 4. 52-4. 67 (4H, m,αHSer, αHCys, H-1a, H-6'b), 4.74 (1H, dd, J1,2 4.1 Hz, J2, 3 10.3 Hz, H-2b), 4.85 (1H, dd, J1,2 3.7 Hz, J2,3 10.5
Hz, H-2c), 5.07 (1H, at, J 9. 9 HZ, H-4c), 5.11-5. 13 (1H, m, H-2a), 5.28 (1H, d, J1, 2 4.1 Hz, H-1b), 5.32-5. 41 (4H, m, H-3a, H-3b, H-3c, NHCys), 5.42 (1H, d, J1, 2 3.9 Hz, H-1c), 7.25 (1H, bd, JNH,αH 6.7 Hz, NHSer)。
セレニウムブロミド(200 mg, 0.9 mmol)を無水DCM (20 ml)中に溶解した。5時間後、薄
層クロマトグラフィー(ペトロール:酢酸エチル 1: 2)は出発原料(Rf 0. 3)を完全に消費
するとともに主生成物(Rf 0.4)が得られたことを示した。該反応物をトリエチルアミン(5
ml)を加えて急冷し、真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール:酢酸エチル 1: 2)によって精製することにより、標記の化合物(527 mg, 91%)を白色がかったアモルファス固体として得た;
[α] D 25-2. 6 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3), 1.99, 2.01, 2.02, 2.04, 2.06, 2.10, 2.14 (30H, 9 x s, 10 x OAc), 3.79 (1H, dat, J4, 5 9.7 Hz, J3. 4 Hz, H-5a), 3.92 (3H, m, H4b, H-5b, H-5c), 4.00 (1H, at, J 9. 3 Hz, H-4a), 4.05 (1H, dd, J5,6 2.8 Hz, J6,6' 12. 8 Hz, H-6c), 4.15 (1H, dd, J5,6 2. 8 Hz, J6,6' 12.6 Hz, H-6b), 4.22 (1H, dd, J5,6 3. 7 Hz, J6, 6' 12.0 Hz, H-6a), 4.25 (1H, dd, J5, 6
3.3 Hz, J6,6' 12. 0 Hz, H-6c'), 4.42-4. 46 (2H, m, H-6a', H-6b'), 4.66 (1H, d, J1,2 9.9 Hz, H-1a), 4.74 (1H, dd, J1, 2 4.1 Hz, J2,3 10.4 Hz, H-2b), 4.86 (1H, dd, J1, 2 4.1 Hz, J2, 310. 5 Hz, H-2c), 5.06 (1H, at, J 9. 6 Hz, H-4c), 5.07 (1H,
at, J 9.8 Hz, H-2a), 5.27 (1H, d, J1, 2 4.4 Hz, H-1b), 5.32-5. 39 (3H, m, H-3a,
H-3b, H-3c), 5.41 (1H, d, J1, 2 4.2 Hz, H-1c), 7.27-7. 29 (3H, m, Ar-H), 7.64-7. 67 (2H, m, Ar-H)。
チルエステル(2.42 g, 18.2 mmol)、DCC (3.75 g, 18.2 mmol)、HOBt (2.46 g, 18.2 mmol)およびDIPEA (2.5 ml, 18.2 mmol)を新たに蒸留したDCM (150 mL)中に溶解した。18
時間後、薄層クロマトグラフィー (酢酸エチル: メタノール 9: 1)は出発原料(Rf 0. 0)
を完全に消費するとともに主生成物(Rf 0.5)が得られたことを示した。該反応物を水(2 x
100 ml)で希釈し、相を分離させた。有機相を塩(100 ml)水で洗浄し、MgSO4で乾燥、濾
過し、真空中で溶媒を除去した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エ
チル: メタノール9: 1)によって精製し、メタノール/ジエチルエステルから再結晶させ
ることにより、標記の化合物 (3.26 g, 60%)を白色結晶固体として得た;
融点145-147℃ ;
[α] D 25 +20.8 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3), 1.23 (3H, d, JCH,CH3 6.6 Hz, CHCH3), 1.44 (9H, s, C (CH3) 3), 3.11-3. 12 (2H, m, CH2Cys), 3.26 (1H, bs,
OH), 3.75 (3H, s, OMe), 4.32-4. 36 (1H, m, CHCH3), 4.61 (dd, JNH, αThr 8. 7 Hz, JαH,CHCH3 2. 15 Hz, CHCH3), 4.63-4. 68 (1H, m,αCys), 5.75 (1H, d, JNH,αHCys
7. 4 Hz, NHCys), 7.56 (1H, d, JNH,αThr 8. 6 Hz, NHThr)。
g, 3.3 mmol)を液体クロロフォルム(100 mL)とメタノール(10 mL)中で溶解し、撹拌した。この攪拌溶液にトリエチルフォスフィン (1.0 mL, 4.0 mmol)を加えた。2時間後、薄
層クロマトグラフィー (酢酸エチル: メタノール 9: 1)は出発原料(Rf 0. 7)を完全に消
費するとともに生成物(Rf 0.8)が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル)によって精製することにより、標記の化合物(2.0 g, 99%)を白色体として得た;
[α] D 25-11. 4 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.09 (3H, d, JCH, CH3 6.4 Hz, CH3), 1.34 (9H, s, C (CH3) 3), 1.65 (1H, at, J 8. 7 Hz, SH), 2.72-2. 89 (2H, m, CH2), 3.66 (3H, s, OMe), 3.96 (1H, m, OH), 4.24-4. 28 (1H, m, CHCH3), 4.34-4. 36 (1H, m, αHCys), 4.49 (1H, dd, JαHThr,NH 8.5 Hz, JαHThr,CHCH3 2.7 Hz,
αHThr), 5.82 (1H, d, JαHCys, NH 8. 2 Hz, NHCys), 7. 38 (1H, d, JαHThr,NH 8. 5
Hz, NHThr)。
ニル−L−システイン−L−トレオニンメチルエステル(30 mg, 0. 089 mmol)の無水メタノール(4 mL)溶液を上記溶液にゆっくりと加えた。10分後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール: 酢酸エチル, 1: 2)は出発原料(Rf 0. 5)を完全に消費するとともに生成物(Rf 0.2)が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 2)によって精製することにより、標記の化合物(32 mg, 51 %)を白色アモルファス固体として得た;
[α] D 25-81. 2 (c, 0.25 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.28 (3H, d, JCHCH3 6.7
Hz, CHCH 3), 1.51 (9H, s, C (CH3) 3), 2.06, 2. 08, 2.10 2.14 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 2.86 (1H, bs, OH), 3.06 (1H, dd, JCHαH 8. 8 Hz, JCHCH 13.4 Hz, CHHCys), 3.3
1 (1H, dd, JCHαH 4. 2 Hz, JCHCH 13.1 Hz, CHHCys), 3.82 (3H, s, OCH3), 3. 87- 3.89 (1H, m, H-5), 4.32-4. 38 (2H, m, H-6, H-6'), 4.39 (1H, dd, JCHCH3 6.4 Hz, JCHαH 2.5 Hz, CHOH), 4.60-4. 65 (3H, m, H-1, αHThr, αHCys), 5.20-5. 32 (3H, m, H-2, H-3, H-4), 5.42 (1H, d, JNHαH 8. 0 Hz, NHCys), 7.12 (1H, d, JNHαH 8.9 Hz, NHThr)。
0分後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 2)は出発原料(Rf 0. 6)
を完全に消費するとともに生成物(Rf 0.2)が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 2)によって精製することにより、標記の化合物(49 mg, 93%)を白色アモルファス固体として得た;
[α] D 25-81. 2 (c, 0.25 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.24 (3H, d, JCHCH3 6.4
Hz, CH3), 1.46 (9H, s, C (CH3) 3), 2.01, 2.06, 2.08, 2.20 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 2.79 (1H, bd, JCH,OH 4.1 Hz, OH), 2.99 (1H, dd, JαH,CH2 8.8 Hz, JCH,H 13.9 Hz, CHHCys), 3.32-3. 35 (1H, m, CHHCys), 3.76 (3H, s, OCH3), 4.04 (1H, at, J6.2 Hz, H-5), 4.10-4. 16 (1H, m, H-6), 4.19 (1H, dd, J5,6' 6.1 Hz, J6,6' 10. 8 Hz, H-6'), 4. 36-4. 46 (1H, m, CHOH), 4.56 (1H, dd, JαHThr,CH 2.4 Hz, JαH,NH 8. 9 Hz,
αHThr), 4.57-4. 64 (1H, m, αHCys), 4.65 (1H, d, J1,2 9.0 Hz, H-1), 5.13 (1H, dd, J2, 3 9. 8 Hz, J2,3 9. 8 Hz, H-3), 5. 3 1 (1 H, d, JαHCys,NH 8. 3 Hz, NHCys), 5.47 (1H, d, J3,4 3.2 Hz, H-4), 5.52 (1H, at, J9. 6 Hz, H-2), 6.91 (1H, d, J
αHThr,NH 9.0 Hz, NHThr)。
[α] D 25 -47. 1 (c, 0. 1 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.17 (3H, d, JCH, CH3 6.4 Hz, CH3), 1.49 (9H, s, C (CH3) 3), 1.91, 2. 00, 2.02, 2.07 (12H, 4 x s, 4 x,
COCH3), 2.99 (1H, dd, JCHH,CHH 13.5 Hz, JαH,CH 10.0 Hz, CHH), 3.38 (1H, dd, J
αH,CH 4.8 Hz, JCHH,CHH 13. 5 Hz, CHH), 3. 88-3. 91 (1H, m, H-5), 4. 16-4. 32 (4H, m, H-2, H-6, H-6', CHCH3), 4. 45 (1H, d, JαH,CH 2.7 Hz, αHThr), 4. 54 (1H, dd, JαH,CH,H9.7 Hz, JαH,CHH 4.7 Hz, αHCys), 4. 79 (1H, d, J1, 2 10.1 Hz, H-1),
5. 06 (1H, at, J 9. 7 Hz, H-4), 5. 28 (1H, at, J 9.7 Hz, H-3)。
リエチルアミン(0.01 mL, 0.1 mmol)をメタノール中(8 mL)に溶解した。該結果物溶液をRTで撹拌した。N−ブトキシカルボニル−L−システイン−L−トレオニンメチルエステ
ル (22 mg, 0.07 mmol)のメタノール(5 mL) 溶液を上記溶液にゆっくりと加えた。10分後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル:メタノール, 9: 1)は主生成物(Rf 0.4)が形成さ
れたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル:メタノール, 9: 1)によって精製することにより、標記の化合物(32 mg, 91%)を白色アモルファス固体として得た;
[α] D 25-139. 5 (c, 0.6 in MeOH) ; δH (500 MHz, CD30D) 1.19 (3H, d, JCH,CH3 6.2
Hz, CHCH3), 1.49 (9H, s, C (CH3) 3), 2.93 (1H,dd,JCHH,CHH 13.5Hz, JCH,αH9. 5 Hz, CH2Cys), 3.32-3. 46 (4H, m, H-3, H-4, H-5, CHH), 3.60-3. 63 (1H, m, H-2), 3.73-3. 77 (1H, m, H-6), 3.78 (3H, s, OMe), 3.92-3. 94 (1H, m, H-6'), 4. 31-4. 36 (1H, m, CHCH3), 4.39 (1H, d, J1, 2 9.3 Hz, H-1), 4. 48 (1H, d, JαH,CH 2. 9 Hz, αHThr), 4.69 (1H, dd, JαH,CHH9. 0 Hz, JαH,CHH 5.2 Hz, αHCys)。
−デオキシ−1−β−D−グルコピラノシルジスルフィド)−L−トレオニンメチルエステル
[α] D 25+6.21 (c, 0.45 in MeOH) ; δH (500 MHz, CD3OD) 1.19 (3H, d, JCHCH3 6.7 Hz, CHCH 3), 1.49 (9H, s, C (CH3) 3), 1.99 (3H, s, COCH3), 2.97 (1H, dd, JCH, H 13. 8 Hz, JCH,αH 9.6 Hz, CHHCys), 3.31-3. 33 (1H, m, CHH), 3.38-3. 41 (1H, m, H-5), 3.45 (1H, at, J9. 3 Hz, H-4), 3.54 (1H, dd, J2, 3 8. 6 Hz, J3,4 9.8 Hz, H-3), 3.76-3. 77 (1H, m, H-6), 3.78 (3H, s, OMe), 3.79-4. 01 (2H, m, H-2, H-6'), 4.33 (1H, dq, JCHCH3 6.3 Hz, JCH,αH3.0 Hz, CHCH3), 4.48 (1H, d, JαH,CH 3.0 Hz, αHThr), 4.59 (1H, d, J1,2 10. 3 Hz, H-1), 4.63- 4.67 (1H, m, αHcys)。
H-1), 7. 27- 7. 34 (3H, m, Ar-H), 7.75-7. 78 (2H, m, Ar-H)。
[α] D 25-111. 4 (c, 1 in MeOH) ; δH (400 MHz, CD3OD) 3.52 (1H, dd, J2, 3 9. 4 Hz, J3,4 3.3 Hz, H-3), 3.56 (1H, at, J4,5 0.9 Hz, J6. 5 Hz, H-5), 3.67-3. 69 (2H, d, J 6. 0 Hz, H-6, H-6'), 3.74 (1H, at, J 9.3 Hz, H-2), 3.91 (1H, dd, J3,4 3. 2 Hz, J4, 5 0. 7 Hz, H-4), 4.45 (1H, d, J1, 2 9.7 Hz, H-1), 7.27-7. 30 (3H, m, Ar-H), 7.76-7. 79 (2H, m, Ar-H)。
0.6 mmol)とフェニルセレネニルブロミド(150 mg, 0.6 mmol)を新たに蒸留したDCM (5 mL)に加え、アルゴン雰囲気下RTで撹拌した。5分後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1)は出発原料(Rf 0. 4)を完全に消費するとともに生成物(Rf 0.5)が得られたことを示した。該反応物はトリエチルアミン(2 mL)を加えて急冷し、5分間撹拌した。残留物はDCM (5 mL)と水(10 mL)に分離し、水溶性相はDCM (3 x 5 mL)で再抽出し
た。これらの混合有機相は塩水(10 mL)で洗浄し、MgS04で乾燥、濾過し、溶媒を真空中で除去した。結果物である残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢
酸エチル, 2: 1)によって精製することにより、標記の化合物(260 mg, 93%)を黄色結晶固体として得た;
融点111-112 ℃;
[α] D 25 -250. 1 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 2.02, 2.01, 2.00 (12H,
4 x s, 4 x CH3), 3.75 (1H, ddd, J4,5 9.9 Hz, J5,6 2.4 Hz, J5, 6' 4. 6 Hz, H-5),
4.08 (1H, dd, J5, 6 2.6 Hz, J6, 6' 12.4 Hz, H-6), 4.16 (1H, dd, J5 6' 4.5 Hz, J6, 6' 12. 4 Hz, H-6'), 4. 62 (1H, d, J1, 2 9. 8 Hz, H-1),5.12 (1H, at, J 9. 7 Hz, H-4), 5.20-5. 30 (2H, m, H-2, H-3), 7.25-7.28 (3H, m, Ar-H), 7.67-7. 70 (2H, m, Ar-H)。
mg, 95%)として得た;
融点 123-125 ℃ ;
[α] D 25 -172. 4 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.99, 2.02, 2.16 (12H,
4 x s, 4 x CH3), 3.94-4. 03 (3H, m, H-5, H-6, H-6'), 4.64 (1H, d, J1, 2 10.1 Hz, H-1), 5.04 (1H, dd, J2, 3 10.2 Hz, J3, 4 3.3 Hz, H-3), 5.40-5. 45 (2H, m, H-2,
H-4), 7.27-7. 30 (3H, m, Ar-H), 7.69-7. 71 (2H, m, Ar-H)。
融点177-179 ℃;
[α] D 25 - 134. 0 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.90 (3H, s, NHCOCH 3), 1.99, 2.00, 2.03 (9H, 3 x s, 3 x CH3), 3.76 (1H, ddd, J4, 510. 1 Hz, J5,6 2.3 Hz, J5,6' 4.7 Hz, H-5), 4.07 (1H, dd, J5, 6 2.3 Hz, J6, 6' 12.3 Hz, H-6), 4.15 (1H, dd, J5,6' 4.6 Hz, J6, 6' 12.2 Hz, H-6'), 4.19-4. 24 (1H, m, H-2), 4.78 (1H, d, J1,2 10.1 Hz, H-1), 5.09 (1H, at, J 9. 7 Hz, H-4), 5.28 (1H, at, J 9.5 Hz, H-3), 5.79 (1H, d, J 9. 1 Hz, NHAc), 7.24-7. 28 (3H, m, Ar-H), 7. 68-7. 70 (2H, m,
Ar-H)。
サン(5 mL)と無水メタノール(3 ml)に加えた。1分後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エ
チル: メタノール, 9: 1)は生成物(Rf 0.4)が得られたことを示した。該反応物はトリエ
チルアミン(5 mL)を加えて急冷した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール, 9: 1)によって精製することにより、標記の化合物 (270 mg, 70%)を白色アモルファス固体として得た;
[α] D 22-174. 0 (c, 1 in MeOH) ; δH (400 MHz, MeOD), 1.96 (3H, s, CH3), 3.31-3. 39 (2H, m, H-4, H-5), 3.51 (1H, at, J 8.1 Hz, H-3), 3.65 (1H, dd, J5,6 5.0 Hz,
J6, 6' 11.7 Hz, H-6), 3.82-3. 90 (2H, m, H-2, H-6'), 4.65 (1H, d, J1,2 10.2 Hz,
H-1), 7.27-7. 34 (3H, m, ArH), 7.72-7. 74 (2H, m, ArH)。
エタンチオール(10 μL, 0.1 mmol)およびトリエチルアミン(60 μL, 0.4 mmol)を1時間
以上液滴により加えた。1時間後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール, 9: 1)は出発原料(Rf 0. 5)を完全に消費するとともに主生成物(Rf 0.4)が得られたことを
示した。該溶液を真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢
酸エチル: メタノール, 5: 1)によって精製することにより、標記の化合物(165 mg, 57%)を白色アモルファス固体として得た;
[α] D 22-65. 3 (c, 0.4 in CHCl3) ; δH (500 MHz, CD3OD) 1.33 (3H, t, J 7. 4 Hz,
CH3), 2. 86 (2H, q, J 7. 4 Hz, CH2), 3.30-3. 34 (2H, m, H-4, H-5), 3.41 (1H, at, J 9. 0 Hz, H-3), 3. 49 (1H, at, JHz, H-2), 3.67 (1H, dd, J5, 6 5.3 Hz, J6,6' 12.0 Hz, H-6), 3.88 (1H, dd, J5,6' 2.1 Hz, J6,6' 12.0 Hz, H-6'), 4. 35 (1H, d, J1,2 9. 1 Hz, H-1)。
液にメタノール (5 mL)に溶解させたエタンチオール(10 μL, 0.13 mmol)およびトリエチルアミン(55 μL, 0. 4 mmol)を1時間以上かけて液滴により加えた。1時間後、薄層ク
ロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール, 9: 1)は主生成物(Rf 0.2)が得られたことを示した。該溶液を真空中で濃縮した。該結果物である残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール, 5: 1)によって精製することにより、標記の化合物(38 mg, 99%)を白色アモルファス固体として得た;
[α] D 25-7. 9 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CD30D) 1. 30 (3H, t, J 7. 3 Hz, CH3), 2. 01 (3H, s, OAc), 2.83-2. 86 (2H, m, CH2), 3.31-3. 39 (2H, m, H-4, H-5),
3.51-3. 56 (1H, m, H-3), 3. 68-3. 72 (1H, m, H-6), 3.84-3. 91 (2H, m, H-2, H-6'), 4.57 (1H, d, J1, 2 10. 3 Hz, H-1)。
A. SBLS 156C 変異体(24 mg, 0. 89 μmol)を水溶性バッファー液 (2.4 mL, 70 mM HEPES
, 2 mM CaCl2, pH 6.9)に溶解した。2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β−D−
グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート (50mg, 0.1 mmol)を水/アセトニトリル (1.6 mL, 9/7 v/v)に溶解した。糖溶液(50 μL)の一部をタンパク質溶液に加え、 逆回転子に置いた。25分後、エルマン分析(Ellman, G. L. Arch. Biochem. Biophys. 1959, 82, 70)により遊離型のチオールは存在しないことが示され、ここで糖溶液(50 μL) の残
りの部分を加えた。該反応物をさらに5分間逆回転子に置き、該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して(10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5. 8, (1 x 4L を
1時間, 2 x 2Lを30分間))、グリコシル化された生成物を得た(m/z (ES)観測値 27072
計算値27078)。
2 mM CaCl2, pH 6.9)に溶解した。2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β−D−ガラクトコピラノシルフェニルチオスルフォネート (50mg, 0.1 mmol) を水/アセトニトリル (1.0 mL, 1/1 比) に溶解した。糖溶液(50 μL) をタンパク質溶液に加え、 逆回転子に置いた。25分後、エルマン分析により遊離型のチオールは存在しないことが示され、ここで糖溶液(50 μL) の残りの部分を加えた。該反応物をさらに5分間逆回転子に置き
、該反応混合物をPD10 SephadexRG25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して(10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5. 8, (1 x 4L を1時間, 2 x 2L 30分間))、グリコシル化された生成物を得た( m/z (ES) 観測値27072 計算値 27078)。
5mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5) に溶解した。2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−α−O−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−β−D−グルコピラノシルフェニルチオスルフォネート (30mg, 0.03 mmol)をアセトニトリル (150 μL)に溶解した。糖溶液(75 μL) をタンパク質溶液に加え、逆回転子に置いた。30分後、 エルマン分析により遊離型のチオールは存在しないことが示され、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R) G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパ
ク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して(10 mM MES, 1 mM CaCl2, pH 5. 8, (1 x
4L を1時間, 2 x 2L 30分間))、グリコシル化された生成物を得た( m/z (ES) 観測値27654 計算値 27653)。
12-14 KDaで透析して(純水, (1 x 4L を1時間, 2 x 2Lを30分間))、グリコシル化
された生成物を得た( m/z (ES) 観測値66792 計算値66794)。
A. SBLS 156C 変異体(5 mg) を脱気水溶性バッファー液(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2
mM CaCl2, pH 9.5) に溶解した。フェニル2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β
−D−セレネニルスルフィドグルコピラノシド (10 mg, 0.02 mmol)をアセトニトリル(500 μl)に溶解した。糖溶液(500 μl)をタンパク質溶液に加え、逆回転子に置いた。1時
間後、エルマン分析により遊離型のチオールは存在しないことが示され、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して(純水, (1 x 4L を1時間, 2 x 2Lを30分間))、グリコシル化された生成物を得た( m/z (ES) 観測値27074 計算値27077)。
ルスルフィドグルコピラノシド (10 mg, 0.02 mmol)をアセトニトリル(800 μl)に溶解した。糖溶液(800 μl) をタンパク質溶液に加え、 逆回転子に置いた。 1時間後、エルマン分析により遊離型のチオールは存在しないことが示され、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して(純水, (1 x 4L を1時間, 2 x 2Lを30分間))、グリコシル化された生成物を得た( m/z (ES) 観測値66792 計算値 66794)。
2 mM CaCl2, pH 9.5) に溶解した。フェニル−1−セレネニルスルフィド−β−D−グ
ルコピラノシド (15 mg, 0.02 mmol)を水/アセトニトリル(0.8 mL, 1/1 比)に溶解した
。糖溶液(500 μl) をタンパク質溶液に加え、 逆回転子に置いた。30分後、エルマン
分析により遊離型のチオールが存在しないことが示され、該反応物をさらに30分逆回転子に置き、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して(水, (1 x 4L を1時間, 2 x 2Lを30分間))、AcGlcSBLS156Cを得た( m/z (ES) 観測値27072 計算値 26911)。
30分後、エルマン分析により遊離型のチオールは存在しないことが示され、ここで糖溶液(100 μL) の残りの部分を加えた。該反応物をさらに30分逆回転子に置き、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して(10 mM MES, 1 mM CaCl
2, pH 5. 8, (1 x 4L を1時間, 2 x 2Lを30分間))、HOGlcNAcSBLS156Cを得た( m/z (ES) 観測値26950 計算値 26950)。
2 mM CaCl2, pH 9.5) に溶解した。フェニル3,4,6−トリ−O−アセチル−2−ア
セチルアミノ−2−デオキシ−1−セレネニルスルフィド−β−D−グルコピラノシド (10 mg, 0.02 mmol) をアセトニトリル(500 μl)に溶解した。糖溶液 (500μl) をタンパ
ク質溶液に加え、逆回転子に置いた。1時間後、エルマン分析により遊離型のチオールが存在しないことが示され、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して(水, (1 x 4L を1時間, 2 x 2Lを30分間))、AcGlcNAcSBLS156Cを得た( m/z (ES) 観測値27074 計算値 27078)。
ニルスルフィド−4−O−(2,3,6−トリ−O−アセチル−4−O−(2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−α−O−グルコピラノシル)−α−D−グルコピラノシル)−β−D−グルコピラノシド (15 mg, 0.015 mmol) をアセトニトリル (300 μL, 75 eq)
に溶解し、この溶液をタンパク質溶液に加え、逆回転子に置いた。30分後、エルマン
分析により遊離型のチオールは存在しないことが示された。該反応物をさらに30分間逆回転子に置き、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM
、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析し
て(水, (1 x 4L を1時間, 2 x 2Lを30分間))、Glc (Ac)4Glc (Ac)3Glc (Ac)3- SBLCysl56を得た( m/z (ES+) 観測値27644 計算値 27653)。
マン分析により遊離型のチオールは存在しないことが示され、該反応物をさらに30分間回転子に置き、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して
(水, (1 x 4L を1時間, 2 x 2Lを30分間))、Gal-SBLCysl56を得た( m/z (ES+) 観
測値26908 計算値 26909)。
(5 mL)中に溶解し、酢酸エチル(2 mL)中のフェニルセレネニルブロミド(70 mg, 0.3 mmol)溶液に加えた。2分後、トリエチルアミン (2 mL)を加え、該反応を水(10 mL)とエタノール(5 mL)で希釈した。相は分離し、水溶性相をペトロール(3 x 10 mL)で洗浄し、凍結
乾燥した。未精製のフェニル1−セレネニルスルフィド−マルトトリオース (m/z 755,757 (M+Br, 100%))を水(10 mL)に投入し、その50 μL(25 eq) を500μlのバッファー液中(70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)のSBLCys156 (1 mg)溶液に加えた。結果物溶液を逆回転子に置いた。2.5時間後、該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、HEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、GlcGlcGlc- SBLCysを得た( m/z (ES+) 観測値27226 計算値 27233)。
μL, 225 eq) をタンパク質溶液に加え、 逆回転子に置いた。1時間後、エルマン分析に
より遊離型のチオールは存在しないことが示され、ここで該反応混合物をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流しHEPES 70 mM、CaCl2 2 mM、pH 7. 0で溶出した。タンパク質留分を収集し、MWCO 12-14 KDaで透析して(水, (1 x 4L を1時間, 2 x 2Lを30分間))、Glc-BSAを得た( m/z (ES+) 観測値66620 計算値 66625)。
表1および2において、MTSはCH3-S02-S-を表し、PTSはPh-S02-S-を表す。
Glcα(1, 4) Glcに由来する。
2. B. G. Davis, R. C. Lloyd and J. B. Jones, J. Org. Cliem., 1998, 63, 9614, and
B. G. Davis, M. A. T. Maughan, M. P. Green, A. Ullman and J. B. Jones, Tetrahedron Asymmetry, 2000, 11, 245から抜粋。
3. B. G. Davis, S. J. Ward and P. M. Randle, Chem. Commun., 2001, 189. から抜粋
。
対応するglyco-MTS試薬のおよそ10倍低い(2003年の換算)。
表2において、SBL-Cys156はスブチリシン Bacillus lentus 変異体S156Cであり、BSA-Cys58はウシ血清アルブミンである。
2. Et3N, DCM/MeOH (20: 1), RT, 1 当量(eq.) のチオスルフォネート ; ペプチド[P]-Cys-Ser-OMe, Glc (Ac) 4α(1, 4) Glc (Ac) 3α(1, 4) Glc (Ac) 3 β-PTSとの反応においては[P] = Boc であり、これを除き[P] = Ac
3.70mM CHES, 5mM MES, 2mM CaCl2 pH 9.5 または50mM Tris. HCl, pH 7.7, RT, glyco-MTSでは〜30 eq、SBL- Cys156のGlc (Ac) 4 s-PTSおよび Gal(Ac)4s-PTS では〜10 eq、BSA-Cys58の Glc (Ac) 4s-PTSおよび Gal (Ac) 4s-PTS では〜20 eq、SBL-Cys156 のGlc (Ac) 4α(1, 4) Glc (Ac) 3α(1, 4) Glc (Ac) 3s-PTS では〜40 eq。
5. B. G. Davis, S. J. Ward and P. M. Randle, Chem. Commun., 2001, 189から抜粋。
表2から見られるように、本発明のglyco-PTS試薬は対応するglyco-MTS 化合物よりも一般的に高収率のグリコシル化反応を示すことがわかる。
SBLCysl56 (10 mg) を水溶性バッファー液(1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5)に溶解した。PMSF (100 mg/mLのアセトニトリル溶液140 μL)を加えた。10分後
、反応混合物を ビバスピン遠心濾過機で濃縮した。 (10 kDa MWCO, Sartorius社製); この工程は300 μL のミリ Qウォーターを加えて3回繰り返した。次に、得られた非活性化されたSBLCysl56 の一部(1 mg) を200 μL のバッファー液に溶解した (1 mL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCl2, pH 9.5) 。ファルネシルフェニルチオスルフォネート (5 mg/mLのTHF 溶液56 μL ,20 当量) を加えた。該混合物を逆回転子に置いた。1時間後、 該反応物をビバスピン遠心濾過機(ミリ Qウォーターを加えて4 回濾過)で脱塩し、質量分析法で分析した。
反応物を水(400 mL)で希釈し、酢酸エチル(300 mL)と分離させた。相は分離し、水溶性相は酢酸エチル(2 x 200 mL)で再抽出した。これらの混合有機相は希塩酸(2 L, 1M)、ソデ
ィウムハイドロゲンカルボネート(飽和水溶液の500 mL)で洗浄し、塩水(300 mL)につけ、MgS04で乾燥、濾過し、真空中で濃縮して標記の化合物(107.3 g, 98%)をアノマーの混合
オイル(α/β 2: 1)として得た;
δH (400 MHz, CDCl3) 1.95, 1.99, 2.05, 2.16 (15 H, 4 x s, COCH3β), 1.96, 2.00,
2.04, 2.12, 2.13 (15 H, 5 x s, COCH3α), 3. 78 (1H, ddd, J4,5 9.9 Hz, J5, 6 2. 3
Hz, J5, 6' 5.4 Hz, H-5β), 3.99-4. 03 (m, H-5α), 4.05-4. 10 (2H, m, H-6α, H-6β), 4.23 (1H, dd, J5, 6' 5.0 Hz, J6,6' 12. 1 Hz, H-6α), 4.26 (1H, dd, J5, 6' 5.3 Hz, J6,6' 12. 4 Hz, H-6'b), 5.10 (1H, dd, J2, 3 3.3 Hz, J3, 4 10.3 Hz, H-3β), 5.20-5. 21 (1H, dd, J1,2 2.1 Hz, J2, 3 2.5 Hz, H-2α), 5.24-5. 30 (3H, m, H-3
α, H-4α, H-4β), 5.43 (1H, dd, J1,2 1.2 Hz, J2, 3 3.2 Hz, H-2β), 5. 83 (1H, d, J1,2 0.9 Hz, H-1β), 6.03 (1H, d, J1,2 2.1 Hz, H-1α)。
2時間後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 2: 1) は、出発原料(Rf 0.2)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.3) が得られたことを示した。該反応混合物はDCM (100 mL)と冷水(200 mL)に分離し、水溶性相をDCM (3 x 200 mL)で再抽出した。これらの混合有機相はpH 8まで得られたソディウムハイドロゲンカルボネートで洗浄し、塩水(300 mL)につけ、MgS04で乾燥、濾過し、真空中で濃縮した。結果物の標記の化合物で
ある澄んだオイル(106.6 g)は、精製することなく使用できた;
δH (400 MHz, CDCl3) 1.96, 2.03, 2.06, 2.13 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 4.09 (1H, dd,
J5,6 2. 2 Hz, J6, 6' 12.5 Hz, H-6), 4.18 (1H, dd, J4,5 10.1 Hz, J5,6 2.2 Hz, J5,6' 4. 8 Hz, H-5), 4.28 (1H, dd, J5, 6 4.9 Hz, J6, 6' 12. 5 Hz, H-6'), 5. 32 (1H, at, J 10.1 Hz, H-4), 5. 39 (1H, dd, J1, 2 1.6 Hz, J2, 3 3.5 Hz, H-2), 5.66 (1H, dd, J2, 3 3.5 Hz, J3, 4 10. 1 Hz, H-3), 6.26 (1H, bs, H-1)。
融点 123-126 ℃ [Lit. 125-128 ℃(H20) ];
[α] D 26+119. 0 (c, 1.0 in MeOH) [Lit. [α] D 27+103 (c, 1. 0 in Acetone)] ; δH (400 MHz, DMSO-d6) 1.95, 2.02, 2.03, 2.14 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 4.08 (1H dd, J5
, 6 2.4 Hz, J6,6' 12. 3 Hz, H-6), 4.22 (1H, dd, J5,6' 2. 4 Hz, J6,6' 12. 5 Hz, H-6'), 4.32 (1H, ddd, J4,5 10. 0 Hz, J5,6 2.2 Hz, J5,6' 5.2 Hz, H-5), 5.05 (1H, dd, J2,3 3.4 Hz, J3,4 10.0 Hz, H-3), 5.17 (1H, at, J 10.0 Hz, H-4), 5. 36 (1H, dd, J1,2 1.5 Hz, J2, 3 3.4 Hz, H-2), 6. 36 (1H, d, J1,2 1.2 Hz, H-1), 9.40 (4H, bs, 2 x NH2)。
オイルとして得た。
[α] D 25+13.4 (c, 1.0 in CHCl3 ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.94, 1.94, 2.02, 2.10 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 3.52 (1H, dd, J5,6 2.4 Hz, J6, 6' 12. 4 Hz, H-6), 3.94 (1H ddd, J4,5 9.6 Hz, J5, 6 2.5 Hz, J5,6' 3. 9 Hz, H-5), 4.07 (1H, dd, J5, 6'3.9 Hz, J6,6' 12. 4 Hz, H-6'), 5.23 (1H, dd, J2,3 3.2 Hz, J3,4 9. 9 Hz, H-3), 5.28 (1H, at, J9. 7 Hz, H-4), 5. 38 (1H, d, J1,2 1. 6 Hz, H-1), 5.40 (1H, dd, J1,2 1.5 Hz,
J2,3 3.1 Hz, H-2), 7.26-7. 28 (3H, m ArH), 7.62-7. 65 (2H, m, ArH)。
ラフィー (ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1) は、出発原料(Rf 0.5)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.3) が得られたことを示した。該反応物は新たに蒸留した塩酸(100 mL, 1M)を加えて急冷し、10分間撹拌した。該反応物はDCM (100 mL)を加えて分別し、相は分離した。水溶性相はDCM (3 x 100 mL)で再抽出した。これらの混合有機相は希塩酸(100 mL, 1M)で洗浄し、塩水(100 mL)につけ、MgS04で乾燥、真空中で濃縮した。結果物の
オレンジ色のオイルはカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1)で精製した。白色がかった結晶はペトロール/酢酸エチルから結合し、再結晶するこ
とにより、標記の化合物(12.4 g, 53%)を白色固体として得た。
融点92-94 ℃ [Lit. 92℃] ;
[α] D 25+17.8 (c, 1. 0 in CHCl3) ; [Lit. [α] D 25+21. 0 (c, 1.0 in CHCl3)] ; δH
(400 MHz, CDCl3) 1.98, 2.04, 2.08, 2.14 (12H, 4 x s, 4 x OAc), 4.09-4. 14 (1H, m, H-6), 4.20-4. 26 (2H, m, H-5, H-6'), 4.59-5. 00 (1H, m, OH), 5.20-5. 23 (2H, m, H-1, H-2), 5.27 (1H, at, J 9. 9 Hz, H-4), 5. 39 (1H, dd, J2,3 2.7 Hz, J3,4 9.6 Hz, H-3)。
レキュラーシーブ(ca. 500 mg)を無水DCM (20 mL)に懸濁させ、0℃で1時間撹拌した。
そこで、DBU (0. 085 mL, 0.57 mmol)を加えた。1.5時間後、薄層クロマトグラフィー
(ペトロール: 酢酸エチル, 1: 1) は、出発原料(Rf 0.2)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.5) が得られたことを示した。該反応物をセリット(R)を通して濾過し、真空中で濃縮した。結果物である残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール:
酢酸エチル, 1: 1)で精製することにより、標記の化合物(1.42 g, 99%)を澄んだオイルとして得た。;
[α] D 25+42. 7 (c, 1.0 in CHCl3) [Lit. [α] D 21 +50.0 (c, 1.0 in CHCl3)] ; δH (400 MHz, CDCl3) 2.20, 2.07, 2.09, 2.29 (12H 4 x s, 4 x OAc), 4.15-4. 22 (2H, m,
H-5, H-6), 4.28 (1H dd, J5,6'4. 3 Hz, J6,6' 11.8 Hz, H-6'), 5.40-5. 42 (2H, m, H-3, H-4), 5.48 (1H, at, J2.1 Hz, H-2), 6.29 (1H, d, J1,2 1. 9 Hz, H-1), 8. 80 (1H, s, NH)
ラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル: メタノール, 9: 1)で精製し、イソプロパノール/ペトロールから再結晶することにより、標記の化合物(29.34 g, 70%)を白色結晶固体
として得た。
融点 126-127 ℃ [Lit 128-129 ℃];
[α] D 26+102. 0 (c, 1.1 in MeOH) ; [Lit. [α] D 18 +73.1 (c, 1.4 in H2O)] ; δH (400 MHz, CD30D) 3.62 (1H, ddd, J4, 5 9.5 Hz, J5, 6 2.3 Hz, J5,6' 5. 5 Hz, H-5), 3.68 (1H, at, J 9. 3 Hz, H-4), 3.733. 78 (2H, m, H-3, H-6), 3.85-3. 88 (2H, m, H-2, H-6'), 4.75, 4.52 (2H, ABq, J 11.6 Hz, CH2), 4.86 (1H, d, J1,2 1.8 Hz, H-1),
7.28-7. 38 (5H, m, ArH)。
、無水ピジリン中(200 mL)に懸濁させた。結果物である懸濁液を0 ℃まで冷却し、クロロトリフェニルメタン(35 mL, 280 mmol)を液滴により加えた。クロロトリフェニルメタン
を加えた後、薄層クロマトグラフィー(酢酸エチル)は、出発原料(Rf 0.0)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.7)が得られたことを示した。該反応物は水(50 mL)と酢酸エ
チル(100 mL)に分離した。相は分離し、水溶性相は酢酸エチル(3 x 50 mL)で再抽出した
。これらの混合有機相は希塩酸(1L, 1M)で洗浄し、ソディウムハイドロゲンカーボネート(飽和溶液中の800 mL)でpH 7まで調整し、塩水(200 mL)につけ、MgS04で乾燥し、真空中
で濃縮した。残留物を酢酸エチル/ペトロールから再結晶し、標記の化合物(27.07 g, 56%)を白色結晶固体として得た。
融点133-135℃ ;
[α] D 25 +64. 7 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.251, 1.254 (18H, 2 x s, 2 x C (CH3) 3), 3. 85 (1H, at, J 9. 8 Hz, H-4), 3.92 (1H, ddd, J4,5 9.7 Hz, J5,6 5. 6 Hz, J5,6' 2.5 Hz, H-5), 4.05 (1H, dd, J1,2 1. 9 Hz, J2,3 2.1 Hz, H-2),
4. 37 (1H, dd, J5,6 5.6 Hz, J6,6' 11.8 Hz, H-6), 4.42 (1H, dd, J5,6' 2. 7 Hz, J6,6' 12.0 Hz, H-6'), 4.53, 4.76 (2H, Abq, J 11.9 Hz, CH2), 4.90 (1H, d, J1,2 1. 8
Hz, H-1), 5.14 (1H, dd, J2,3 3.2 Hz, J3,4 9. 7 Hz, H-3), 7. 33-7. 36 (5H, m, ArH)。
よびベンゼントリクロロアセチミデート(17 mL, 91.4 mmol)を無水DCM (100 mL)および無水シクロヘキサン(100 mL)とに溶解させ、不活性アルゴン雰囲気下、1時間以上かけて4
Åモレキュラーシーブ(ca 5 g)で撹拌した。1時間後、トリメチルシリルトリフレート(0.31 mL, 1.71 mmol)を加えた。18時間後、薄層クロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸
エチル, 5: 1)は、出発原料(Rf 0.0)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.4)が得
られたことを示した。該反応物はトリエチルアミン(ca 30 mL)で急冷し、該溶液をセリット(R)を通して濾過し、真空中で濃縮した。結果物である残留物をカラムフラッシュクロ
マトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 5: 1)で精製することにより、標記の化合物(14. 4 g, 70%)を無色のオイルとして得た;
[α] D 25+29. 0 (c, 2.0 in CHCl3) ; δH (400 MHz, CDCl3) 1.24, 1.25 (18H,2 x s, 2
x C (CH3) 3), 3.97-4. 04 (3H, m, H-2, H-4, H-5), 4.25 (1H,dd, J5,6 4.8 Hz, J5,6' 11.6 Hz, H-6), 4. 44 (1H, dd, J5,6' 1. 6 Hz, J6,6' 11.7 Hz, H-6'), 4.51, 4.74 (2H, ABq, J 12. 0 Hz, BnCH2), 4. 55, 4. 61 (2H, ABq, J 11.7 Hz, BnCH2), 4.57, 4.
80 (2H, ABq, J 10.7 Hz, BnCH2), 4. 92 (1H, d, J1,2 1.8 Hz, H-1), 5.37 (1H, dd, J2,3 3.1 Hz, J3,4 8. 8 Hz, H-3), 7. 28-7. 35 (15H, m, ArH)。
られたことを示した。該反応物はDowex(R)-50イオン交換樹脂を加えることによって中和
され、この後に濾過し、真空中において濃縮した。結果物である残留物をカラムフラッシ
ュクロマトグラフィー(ペトロール: 酢酸エチル, 2: 1)で精製することにより、標記の化合物(4.50 g, 78%)を純粋オイルとして得た;
[α] D 25+45.2 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (500 MHz, CDCl3) 2. 83 (2H, bs, 2 x OH), 3. 83-3. 86 (1H, m, H-5), 3.90-4. 00 (4H, m, H-2), H-4), H-6, H-6'), 4. 21-4. 28
(1H, m, H-3), 4. 58 (1H, d, J 12.1 Hz, CHH), 4.72-4. 83 (4H, m, 4 x CH 2Ar), 5.04 (1H, d, J 11.1 Hz, CHH), 5.09 (1H, bs, H-1), 7.43-7. 51 (15H, m, 15 x ArH)。
ド(255 mg, 0.57 mmol)およびDCM (10 mL)に溶解させた1',1’,1'−トリクロロアセチミデート−2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−α−D−マンノピラノシド(1.12 g, 2.27 mmol)を、カニューレを通して活性4Åモレキュラーシーブを入れた乾燥フラスコに加えた。該溶液を1時間撹拌し、その後ボロントリフルオロエチレート(90 μL, 0. 85
mmol)を加えた。16時間後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール:酢酸エチル, 2: 1)は、出発原料(Rf 0.1)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.3)が得られたことを示した。該反応物をトリエチルアミン(ca 5 mL)で急冷し、該溶液をセリット(R)を通して濾過し、真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール:
酢酸エチル, 4: 3)で精製することにより、標記の化合物(472 mg, 75%)を白色アモルファス固体として得た;
[α] D 25+81. 5 (c, 1.0 in CHCl3) ; δH (500 MHz, CDCl3) 1.98, 2.02, 2.05, 2.07, 2.09, 2.10, 2.11, 2.19 (24H, 8 x s, 8 x OAc), 3.74-3. 76 (1H, m, H-6a), 3.81-3. 87 (3H, m, H-2a, H-5a, H-6'a), 3.92-3. 97 (3H, m, H-4a, H-5b, H-6b), 4.03-4. 22 (4H, m, H-3a, H-5c, H-6'b, H-6c), 4.27 (1H, dd, J5,6' 5. 5 Hz, J6, 6' 12.3 Hz, H-6'c), 4.54, 4.75 (2H, Abq, J 11.9 Hz, CH2), 4.64, 4.81 (2H, Abq, J 12. 2 Hz, CH2), 4.65, 4.91 (2H, Abq, J 11. 4 Hz, CH2), 4.97 (1H, d, J1,2 1. 7 Hz, H-1c), 5.00 (1H, d, J1,2 1.6 Hz, H-1a), 5.19 (lH, d, J1,2 1.7 Hz, H-1b), 5.25 (1H, at, J 10.0 Hz, H-4b), 5.33 (1H, at, J 10.1 Hz, H-4c), 5.36 (1H, dd, J1,2 1.8 Hz, J2, 3 3.3 Hz, H-2c), 5.42 (1H, dd, J1, 2 1. 5 Hz, J2, 3 3.5 Hz, H-2b), 5.44-5. 47 (2H,
m, H-3b, H3c), 7.32-7. 42 (15H, m, ArH)。
液を脱気し、水素ガスでパージし、水素雰囲気下で撹拌した。4日後、薄層クロマトグラフィー (酢酸エチル)は、出発原料(Rf 0.9)が完全に消費されるとともに主生成物(Rf 0.4)が得られたことを示した。該溶液をセリット(R)を通して濾過し、真空中で濃縮した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル)で精製することにより、中間生成物である3,6−ビス−O−(2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−α−D−マンノピラノシド)−α/β−D−マンノピラノシド(74 mg, 98%)を白色アモルファス固体として得た;
m/z HRMS (ES+) C34H48034Na (MNa+)としての計算値 863. 2433.観測値863. 2440. この
中間生成物(74 mg, 0. 088 mmol) は無水酢酸(5 mL)とピリジン(5 mL)中に再懸濁させた
。24時間後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール:酢酸エチル, 2: 3)は、出発原料(Rf 0.0)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.4)が得られたことを示した。該反応物は水(20 mL)で希釈し、酢酸エチル(20 mL)で分別して相を分離した。水溶性相は酢酸エチル(2 x 20 mL)で再抽出した。これらの混合有機相は希塩酸(500 mL, 1M)で洗浄し、ソディ
ウムアイドロゲンカルボネート(飽和溶液中の50 mL)で調整、塩水(30 mL)につけ、MgS04
で乾燥、濾過し、真空中で濃縮することにより、標記の化合物(83 mg, 98%)をアノマー混合物(α/β 5: 1)のアモルファス体として得た;
δH (500 MHz, CDCl3) α化合物, 2.00, 2.02, 2.08, 2.12, 2.17, 2.18, 2.19, 2.26 (33H, 8 x s, 11 x OAc), 3.59 (1H, dd, J5, 6 3.0 Hz, J6,6' 11.1 Hz, H-6a), 3.76 (1H, dd, J5,6' 5. 2 Hz, J6,6' 11. 2 Hz, H-6'a), 3.92 (1H, ddd, J4,5 10.2 Hz, J5, 6
3.0 Hz, J5, 6' 5.2 Hz, H-5a), 4.04-4. 16 (4H, m, H-5b, H-5c, H-6b, H-6c), 4.21 (1H, dd, J2,3 3.4 Hz, J3, 4 9.9 Hz, H-3a), 4.28 (1H, dd, J5,6' 5.5 Hz, J6,6' 12.2 Hz, H-6'b/c), 4.31 (1H, dd, J5,6' 4.7 Hz, J6,6' 12.3 Hz, H-6'b/c), 4. 81 (1H, d, J1,2 1.5 Hz, H-1c), 5.06-5. 07 (2H, m, H-1b, H-?), 5.20-5. 35 (8H, m, H-2a, H-2b, H-2c, H-3b, H-3c, H-4a, H-4b, H-4c), 6.07 (1H, d, J1,2 1. 8 Hz, H-1a). β化合物はデータを下記のみに選択した。3.64 (1H, dd, J5,6 3.7 Hz, J6,6' 10. 8 Hz, H-6a), 3.69-3. 73 (1H, m, H-5a), 3.76 (1H, dd, J5,6' 5.2 Hz, J6, 6' 11.2 Hz, H-6'a), 4.01 (1H, dd, J2,3 3.2 Hz, J3,4 9. 7 Hz, H-3a), 5.50 (1H, dd, J1,2 0.9 Hz, J2,3 3.2 Hz, H-2a), 5.83 (1H, d, J1,2 0.9 Hz, H-1a)。
mmol)を無水DCM (5 mL)中に溶解した。これに臭化水素(酢酸中33%, 1 mL)を加えた。該
混合物をアルゴン雰囲気下RTで撹拌した。2時間後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール:酢酸エチル, 1: 4)は、出発原料(Rf 0.4)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.6)が得られたことを示した。該反応混合物をDCM (10 mL)と水(10 mL)に分離し、水溶性相をDCM (3 x 10 mL)で再抽出した。これらの混合有機相をソディウムハイドロゲンカルボネ
ート(飽和水溶液の20 mL)でpH 8まで調整し、塩水(20 mL)につけ、MgS04で乾燥、濾過し
、真空中で濃縮して、標記の化合物(80 mg, 90%)をなんら精製の必要がない白色体として得た;
δH (400 MHz, CDCl3) 1.97, 1.99, 2. 05,2. 06,2. 10,2. 12,2. 17,2. 24 (30H, 9 x s, 10 x OAc), 3.60 (1H, dd, J5, 6 3.0 Hz, J6, 6' 11.4 Hz, H-6a), 3.77 (1H, dd, J5,6' 4.5 Hz, J6,6' 11. 4 Hz, H-6'a), 4.02-4. 09 (5H, m, H-5a, H-5b, H-5c, H-6b, H-6c), 4.24 (1H, dd, J5,6' 6. 8 Hz, J6, 6' 12.2 Hz, H-6'), 4.29 (1H, dd, J5, 6' 5.0 Hz, J6,6' 12.6 Hz, H-6'), 4.62 (1H, dd, J2, 3 3.4 Hz, J3, 4 10. 0 Hz, H-3a), 4.79 (1H, bs, H-1c), 5. 02-5. 04 (2H, m, H-1b, H-3b), 5.17-5. 30 (5H, m, H-2b, H-2c, H-3c, H-4b, H-4c), 5. 39 (1H, at, J 10. 1 Hz, H-4a), 5.43 (1H, dd, J1, 2 1.5 Hz, J2, 3 3.2 Hz, H-2a), 6. 34 (1H, bs, H-1a)。
(ペトロール:酢酸エチル, 1: 3)は、出発原料(Rf 0.4)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.0)が得られたことを示した。該反応物を真空中で濃縮し、結果物である残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(酢酸エチル:メタノール, 9: 1)で精製することにより、中間生成物2,4−テトラ−O−アセチル−3,6−O−ビス−(2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−α−O−マンノピラノシル)−α−D−マンノピラノシル−1−イソチオウロニウムブロミド (550 mg, 60%)を得た。この中間生成物(550 mg, 0.51 mmol)とNa2S2O5(122 mg, 0.62 mmol)をDCM (20 mL)と水(10 mL)の混合物に加えた。該混合
物をアルゴン雰囲気下、加熱還流した。2.5時間後、薄層クロマトグラフィー (ペトロール:酢酸エチル, 1: 3)は、出発原料(Rf 0.0)が完全に消費されるとともに生成物(Rf 0.3)が得られたことを示し、ここで該反応物をRTまで冷却し、相は分離した。水溶性相はDCM (2 x 20 mL)で再抽出した。これらの混合有機相はソディウムハイドロゲンカルボネー
ト(飽和水溶液の20 mL)で洗浄し、塩水(20 mL)につけ、MgS04で乾燥、濾過して真空中で
溶媒を除去した。残留物をカラムフラッシュクロマトグラフィー(ペトロール:酢酸エチル, 1: 3)で精製することにより、標記の化合物(350 mg, 73%)を白色アモルファス固体として得た;
[α] D 23 +58.1 (c, 1.2 in CHCl3 ; δH (500 MHz, C6D6) 1. 74,1.75, 1.78, 1. 82, 1. 91, 2.03, 2.06, 2.26 (24H, 8 x s, 10 x Oac), 2. 07 (1H,bs, SH), 3. 65 (1H, dd,
J5,6 3. 2 Hz, J6,6' 11.0 Hz, H-6a), 3.93 (1H, dd, J5, 6' 5.3 Hz, J6, 6' 11.1 Hz, H-6'a), 4.31-4.38 (4H, m, H-3a, H-5a, H-5b/c, H-6), 4. 43-4. 45 (1H, m, H-6), 4. 51 (1H, dd, J5, 6' 5.6 Hz, J6,6' 12. 6 Hz, H-6'), 4. 56- 4.60 (2H, m, H-5b/c,
H-6'), 4. 91 (1H, d, J1,2 1.5 Hz, H-1c), 5. 20 (1H, d, J1,2 1.8 Hz, H-1b), 5.43
(1H, dd, J1,2 1.8 Hz, J2, 3 3.1 Hz, H-2b), 5.45 (1H, bs, H-1), 5.65 (1H, dd, J1, 21. 5 Hz, J2, 3 3.1 Hz, H-2a), 5.70-5. 82 (5H, m, H-2c, H-3b, H-4a, H-4b, H-4c), 5. 85 (1H, dd, J2, 3 3.2 Hz, J3,4 10.2 Hz, H-3c)。
1−チオ−2,4−テトラ−O−アセチル−3,6−O−ビス−(2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−α−O−マンノピラノシル)−α−D−マンノピラノース(20 mg, 0.02 mmol)とソディウムメトキシド(2 mg, 0. 02mmol)をメタノール撹拌溶液(5 mL)に加え
た。12時間後、(ペトロール:酢酸エチル, 1: 2)出発原料(Rf 0.2)が完全に消費される
とともに生成物(Rf 0.0)が得られたことが示された。該反応はDowex(R)-50イオン交換樹
脂を加えることによって中和され、この中和点で濾過し、真空中において濃縮した。粗糖チオールを水(5 mL)に投入し、そのうちの38 μLをSBL156CysSePh (1 mg)を含有した水溶性バッファー液(500 μL, 70 mM CHES, 5 mM MES, 2 mM CaCL2, pH9.5)に添加した。結果物溶液を逆回転子に置いた。1時間後、該混合反応をPD10 Sephadex(R)G25 カラムに流し、70 mM HEPES、 2 mM CaCl2、pH 7.0で溶出した。タンパク質画分を採取し、Man (Man) Man-S- SBLCysl56が得られた;
m/z (ES+) 観測値 27878, 計算値 27881。
Claims (28)
- 少なくとも1個のチオール基を含む有機化合物と式Iの化合物:
R−S−X−R1 (I)
(式中、XはSO2またはSeを表し、Rは有機部分であり、R1は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいピリジル基、または置換されていてもよいナフチル基であり、かつ、XがSO2であるときR1は置換されていてもよいアルキル基でない。)との反応を含む、ジスルフィド結合を形成する方法。 - 前記の少なくとも1つのチオール基を含む有機化合物は、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1個のチオール基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を化学修飾する方法であり、そうしたタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸と式Iの化合物:
R−S−X−R1 (I)
(式中、XはSO2 または Seを表し、 Rは 有機部分であり、R1は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいピリジル基、または置換されていてもよいナフチル基であり、かつ、XがSO2 であるとき、R1は置
換されていてもよいアルキル基でない。)との反応を含む方法。 - Rが炭水化物の基である、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- R1がフェニル基である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- XがSeである、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- XがSO2である、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 下記式I:
R−S−X−R1 (I)
(式中、XはSO2またはSeを表し、Rは炭水化物部分であり、R1は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいピリジル基、または置換されていてもよいナフチル基であり、かつ、XがSO2であるとき、R1は置換されていてもよいアルキル基でない。)で表される化合物。 - R1がフェニル基である請求項8に記載の化合物。
- XがSeである請求項8または請求項9に記載の化合物 。
- XがSO2である請求項8または請求項9に記載の化合物 。
- 式IIの化合物:
M(SSO2Rl)k (II)
(式中、Mは金属であり、例えば Li、Na、K、Ca、 Cs、 Zn、 Mgまたは Alである。kは1〜3の整数である。)
と、式IIIの化合物:
R−L (III)
(式中、Lは脱離基である。)とを反応させることを含む、請求項11に記載された式Iの化合物を調製する方法。 - 式VIIIのジスルフィド化合物:
R−S−S−R (VIII)
を銀イオンの存在下、スルフィニートアニオン:R1SO2 -
に反応させることを含む、請求項11に記載された式Iの化合物を調製する方法。 - 式Vの化合物と、式VIaの化合物または式VIbの化合物と
R−SH (V)
R1SeL2 (VIa)
R1Se(OH)2 (VIb)
(式中、L2は Br、 Cl、 CN、または Iである。)
を反応させることを含む、請求項10に記載された式Iの化合物を調製する方法。 - ジスフィルド結合の形成において請求項1〜7のいずれかに記載の式Iの化合物の使用。
- 少なくとも1個のチオール基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を修飾するための、請求項1〜7のいずれかに記載の式Iの化合物の使用。
- 少なくとも1個のチオール基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸をグリコシル化するための、請求項8〜11のいずれかに記載の式Iの化合物の使用。
- チオール基をセレニルスフィド基に変換することを含む、少なくとも1個のチオール基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を化学修飾する方法。
- 少なくとも1個のチオール基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸と式Xaまたは式Xbに表される化合物:
R2SeL2 Xa
R2Se(OH)2 Xb
(式中、L2は脱離基であり、R2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいベンジル基、置換されていてもよいピリジル基、または置換されていてもよいナフチル基である。R2は固体支持体の一部を構成するか、
または結合している。)とを反応させることを含む、請求項18に記載の方法。 - R2がフェニル基による、請求項19に記載の方法。
- 式Xaまたは式Xbで表される化合物がPhSeBrである、請求項19に記載の方法。
- タンパク質、ペプチドまたはアミノ酸中のセレネニルスルフィド基と、チオール基を含む有機化合物とをさらに反応させる、請求項18〜21のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも1つのセレネニルスルフィド基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を、チオール基を含む有機化合物とを反応させることにより、そうしたタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸を化学修飾する方法。
- 前記有機化合物が炭水化物であるの化合物である、請求項22または23に記載の方法。
- 前記有機化合物がタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸である、請求項22または23に記載の方法。
- セレネニルスルフィド基が、下記式:
−S−Se−R2
(式中、R2は置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいフェニル基、置
換されていてもよいベンジル基、置換されていてもよいピリジル基または置換されていてもよいナフチル基である。)
で表される基である、セレネニルスルフィド基を少なくとも1つ含むタンパク質、ペプチド、アミノ酸。 - 請求項18〜21のいずれかに記載された方法により得ることができる、少なくとも1つのセレネニルスルフィド基を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸。
- 請求項18〜21のいずれかに記載された方法により得ることができる、少なくとも1個のジスルフィド結合を含むタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸。
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