CN105814213B - 经修饰的糖蛋白、蛋白质-缀合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包含任选地岩藻糖基化的式(105)或(106)的聚糖的糖蛋白，其中Su(A)x是包含一个或更多个官能团A的经修饰的糖部分。官能团A独立地选自巯基、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基。本发明还涉及一种糖蛋白‑缀合物，其中本发明的糖蛋白被缀合于目的分子。所述目标分子可以为例如活性物质。本发明还涉及一种制备经修饰的糖蛋白的方法，以及涉及一种制备糖蛋白‑缀合物的方法。本发明特别涉及经修饰的抗体、抗体‑缀合物、抗体‑药物缀合物及其制备方法。

Description

经修饰的糖蛋白、蛋白质-缀合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及经修饰的糖蛋白，特别是包含一种经修饰的糖部分的糖蛋白。本发明也涉及一种糖蛋白-缀合物，其中本发明的糖蛋白被缀合到目的分子上。所述目的分子可例如为活性物质。本发明还涉及一种用于制备经修饰的糖蛋白的方法，以及一种用于制备糖蛋白-缀合物的方法。本发明特别涉及经修饰的抗体、抗体-缀合物、抗体-药物缀合物及其制备方法。
背景技术
蛋白质缀合物，即通过接头缀合到目的分子上的蛋白质，是本领域已知的。例如，荧光标记对于体外和体内显示而言是一种有力的技术，蛋白质的共价固定对于工业应用是一种有用的策略，并且蛋白质聚乙二醇化导致显著延长的循环时间。此外，人们对其中目的分子是药物(例如细胞毒性化学药物))的抗体-缀合物具有极大的兴趣。抗体-药物-缀合物是本领域已知的，由通过合成接头与细胞毒性化学药物共价结合的重组抗体组成。现有技术中已知的蛋白质缀合物通常分别通过酰化作用或烷基化作用将官能团缀合到氨基酸赖氨酸或半胱氨酸的侧链上来制备。
对于赖氨酸，缀合优选发生在具有最高的空间可接近性(stericaccessibility)、最低的pKa或其组合的赖氨酸侧链上。该方法的缺点是对缀合的位点控制(site-control)低。
基于典型蛋白质中通常没有或极少存在游离的半胱氨酸的事实，通过半胱氨酸的烷基化获得对位点特异性更好的控制，从而提供了这样的选择：仅对那些已经以还原形式存在的或被选择性地改造进入蛋白质中的半胱氨酸进行烷基化。或者，半胱氨酸可以通过(部分)还原步骤选择性地被释放出来。例如，通过还原进行的选择性的半胱氨酸释放通常是利用还原剂(例如TCEP或DTT)处理蛋白质来进行，导致二硫键转化成两个游离的巯基。然后，通常基于马来酰亚胺化学物，将所释放的巯基与亲电试剂进行烷基化，该过程通常进行得很快并且具有高选择性；或者将所释放的巯基与卤代酰胺进行烷基化，该过程对半胱氨酸也表现出强的选择性但是会与赖氨酸侧链发生副反应。
最近的报道(N.M.Okeley等人，Bioconj.Chem.2013,24,1650，以引证方式纳入本说明书中)描述了6-巯基岩藻糖通过新陈代谢纳入单克隆抗体的聚糖中，然后进行还原-氧化-马来酰亚胺缀合。有趣的是，研究发现上述6-巯基岩藻糖马来酰亚胺缀合物相对于半胱氨酸马来酰亚胺缀合物显示增强的稳定性。但是，6-巯基岩藻糖纳入的效率仅为70％。
应用于抗体-药物缀合物的生产中的马来酰亚胺缀合物的一种替代变型，涉及一种其中不是亲核巯基被引入单克隆抗体中而是马来酰亚胺被引入单克隆抗体中的策略。例如，T-DM1通过下述过程制备：使赖氨酸与4-(N-马来酰亚氨基甲基)环已烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)进行第一(无规)缀合，由此使马来酰亚胺有效地负载到抗体上。在该方法的下一阶段中，将马来酰亚胺官能化的抗体用巯基官能化的美登木素生物碱(maytansinoid)处理，形成缀合物。因此，这是一个独特的实例，其中通过用SMCC处理，抗体被有效地转化成亲电子反应配体(而不是通常的使用亲核性氨基酸侧链用于缀合)。但是，同样在这种情况下，利用该方法的特性，仅能实现抗体的无规缀合。
尽管上述技术具有多变性，通过采用马来酰亚胺进行烷基化得到的蛋白质缀合物的一个总的缺陷是通常所得到的缀合物可能不稳定，这是由于烷基化的逆反应，即逆向-迈克尔反应(retro-Michael reaction)造成的。
一种制备糖蛋白缀合物——所有蛋白质的子类——的替代策略包括通过化学方式(高碘酸钠)或酶催化方式(半乳糖氧化酶)在蛋白质的聚糖结构上产生一个或多个醛官能团。通过酶催化产生的醛官能团随后可通过下述过程应用于选择性的缀合过程：例如与官能化的羟胺或肼分子缩合，从而分别产生肟连接或腙连接的蛋白质缀合物。然而，众所周知的是，随着时间的推移，肟和腙、特别是源自脂族醛的肟和腙在水中或在较低pH下也表现出有限的稳定性。例如，吉妥珠单抗(gemtuzumab ozogamicin)是一种肟连接的抗体-药物缀合物并且已知其在体内过早进行了解缀合作用(deconjugation)。
Qasba等人在J.Biol.Chem.2002,277,20833(以引证方式纳入本说明书中)中公开了突变型半乳糖基转移酶GalT(Y289L)、GalT(Y289I)和GalT(Y289N)可以以酶催化方式将GalNAc连接在非还原性GalNAc糖(β-苄基-GalNAc)上。
WO 2007/095506和WO 2008/029281(Invitrogen Corporation)(两篇文献以引证方式纳入本说明书中)公开了GalT(Y289L)突变体与C2取代的叠氮乙酰氨基部分2-GalNAz-UDP的结合导致在聚糖的末端非还原性GlcNAc上引入GalNAz。随后通过施陶丁格连接(Staudinger ligation)进行缀合或采用铜催化点击化学进行缀合，然后提供了各自的抗体缀合物，其中荧光炔探针缀合于抗体上。WO 2007/095506和WO 2008/029281还公开了可采用endo H对聚糖进行修饰，从而使GlcNAc-GlcNAc糖苷键水解并释放出GlcNAc用于酶催化地引入GalNAz。
Qasba等人在Bioconjugate Chem.2009,20,1228(以引证方式纳入本说明书中)中，公开了经β-半乳糖苷酶处理的具有G0糖形的单克隆抗体(例如美罗华(Rituxan)、英利普单抗(Remicade)、赫赛汀(Herceptin))在包含(GalNAz)的半乳糖部分转移到聚糖的末端GlcNAc残基上之后被完全半乳糖基化为G2糖形，产生了四叠氮基-取代的抗体，即每条重链中有两个GalNAz部分。没有公开所述四叠氮基-取代的抗体与目的分子的缀合，例如通过与炔烃发生施陶丁格连接或环加成反应。还公开了包含C2取代的酮基的半乳糖部分(C2-酮基-Gal)向G0糖形聚糖的末端GlcNAc残基的转移，以及C2-酮基-Gal与氨氧基生物素(aminooxy biotin)的连接。然而，如上所述，所产生的肟缀合物由于其在水中的水解作用而可表现出有限的稳定性。
WO 2007/095506、WO 2004/063344和Bioconjugate Chem.2009,20,1228中所公开的方法的缺点为在所有情况下通过叠氮化物-炔烃点击化学获得的缀合物具有三唑连接基，这对ADC的免疫原性是不利的。而且，如果采用铜催化的点击化学，则可能发生由不期望的氧化过程引起的蛋白质损伤，如在例如Hong等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2009,48,9879(以引证方式纳入)中所公开的。
基于以上所述，显然半乳糖可以通过用野生型Gal-T1/UDP-Gal处理而被引入具有末端GlcNAc-部分的蛋白质中(形成Gal-GlcNAc-蛋白质)，而N-乙酰氨基半乳糖可以通过用GalT1突变体Y289L处理而引入(产生GalNAc-GlcNAc-蛋白质)。Elling等人(Chem Bio Chem2001,2,884,以引证方式纳入本说明书中)也示出了多种人半乳糖基转移酶(β4-Gal-T1、β4-Gal-T4和β3-Gal-T5)，而不是牛β4-Gal-T1，其可以在缺乏Mn2+的情况下，调节UDP-Gal中半乳糖的6-生物素化的修饰，这导致有效地转移至模型蛋白质BSA-(GlcNAc)17和卵白蛋白上。类似地，Pannecoucke等人(Tetrahedron Lett.2008,49,2294，以引证方式纳入本说明书中)证明了在标准条件下，市售的牛β4-Gal-T1也能够将UDP-6-叠氮基半乳糖转移至模型GlcNAc-底物上，但是没有证明转移至GlcNAc-蛋白质上。
基于以上所述，可以推断，对糖蛋白上的聚糖进行化学选择性或酶催化修饰的策略是一种用于蛋白质缀合物的位点特异性(site-specific)制备的通用策略。然而，现有技术产生了具有不可预见的稳定性(马来酰亚胺、肟类、腙)或非天然构造(三唑)的接头。此外，制备模式缓慢并需要大量过量的反应物(肟或腙连接)或可导致蛋白质损伤(铜催点的击化学)。最后，最近公开的用于引入代谢的巯基岩藻糖的策略是有希望的，但是由于与天然岩藻糖的竞争关系，巯基岩藻糖引入的效率较低(±70％)。
基于巯基化合物的生物分子的缀合是本领域所熟知的。特别是，巯基化合物与马来酰亚胺的反应是快速且具有选择性的过程，这通常能迅速地产生期望的缀合物。不太普遍但也经常应用的是卤代乙酰胺，它们还可与游离的巯基以高选择性的方式反应，尽管其化学选择性不如马来酰亚胺缀合。与卤代乙酰胺缀合的一个特殊的优点是不可逆的形成硫醚，其稳定性与马来酰亚胺缀合物相比更好。马来酰亚胺缀合物的稳定性也适用于通过巯基化合物与联烯酰胺(allenamide)反应形成的缀合物，如由Abbas等人最近在Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,7491-7494(以引证方式纳入本说明书中)中报道的。用于与巯基化合物缀合的其他替代方案也是已知的，例如乙烯基砜缀合，但不经常应用。最后，光-诱导的巯基-烯反应也已经被证明适合于蛋白质缀合，参见例如Kunz等人Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,5226-5230，在这种情况下也产生高度稳定的硫醚。
发明内容
本发明涉及一种经修饰的糖蛋白的制备方法，该方法包括使包含含有末端GlcNAc部分的聚糖的糖蛋白与Su(A)x-P在催化剂的存在下接触，所述催化剂选自β(1,4)-半乳糖基转移酶、β(1,3)-N-半乳糖基转移酶、包含突变型催化结构域的β(1,4)-半乳糖基转移酶和包含突变型催化结构域的β(1,3)-N-半乳糖基转移酶；其中Su(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物Su，其中x为1、2、3或4，且其中A独立地选自巯基或其前体、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基；其中P为核苷酸；且其中所述含有末端GlcNAc部分的聚糖为式(101)或(102)的聚糖：
Figure BDA0001016023320000051
其中：
b为0或1；
d为0或1；
e为0或1；且
G为单糖或包含2至20个糖部分的直链或支链的低聚糖。
本发明还涉及包含式(105)或(106)的聚糖的糖蛋白：
Figure BDA0001016023320000052
其中：
b为0或1；
d为0或1；
e为0或1；
G为单糖或包含2至20个糖部分的直链或支链的低聚糖；且
Su(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物Su，其中x为1、2、3或4，且A独立地选自巯基、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基。
本发明还涉及本发明的糖蛋白在制备糖蛋白-缀合物中的用途，其中糖蛋白-缀合物被定义为通过接头L缀合到目的分子D上的糖蛋白；以及涉及一种制备糖蛋白-缀合物的方法，所述方法包括使本发明的经修饰的糖蛋白与接头-缀合物反应，其中所述接头-缀合物包含官能团B和一个或多个目的分子，其中所述官能团B为能与经修饰的糖蛋白的聚糖上的官能团A反应的官能团，且其中官能团A如上所定义。
特别地，本发明涉及经修饰的抗体、抗体-缀合物和抗体-药物缀合物。
附图说明
图1示出了可通过下述过程获得的蛋白质的不同糖形的实例：(A)通过正常表达后用内切糖苷酶修整；或(B)通过mAb在哺乳动物体系内在苦马豆素存在下的表达或者通过在工程化的宿主生物体(如Lec1CHO或毕赤酵母(Pichia))内表达；或(C)通过在唾液酸酶和半乳糖苷酶的共同作用下修整糖形(G0、G1、G2、G0F、G1F和G2F)的规则混合物。
图2示出了在半乳糖基转移酶突变体β(1,4)-Gal-T1(Y298L)的作用下，GlcNAc封端的蛋白质与非天然UDP-半乳糖衍生物1(2-酮基半乳糖)或2(GalNAz)进行酶催化转化的示意图。
图3示出了在半乳糖基转移酶(或其突变体)的作用下，用于转移至GlcNAc封端的糖上的经修饰半乳糖衍生物(3-17)的结构。
图4示出了在半乳糖基转移酶(或其突变体)的作用下，可转移至GlcNAc封端的糖上的UDP-半乳糖的一系列巯基衍生物或卤素衍生物(18-23)。
图5示出了在2-NHAc部分上有取代的UDP-GalNAc的乙酰基保护的巯基变体(28a)或脱乙酰基化的巯基变体(28b)或卤素变体(29+30)的合成制备的方案。
图6示出了生物素取代的苯硫酚(32)、叠氮基取代的苯硫酚(41)以及由丙酰胺前体42构成的叠氮基-联烯酰胺43的合成制备的方案。
图7示出了生物素(33)、MMAF(34)、芘(44)和BCN(45)的马来酰亚胺衍生物的结构。
图8示出了经修整的单克隆抗体35(仅包含核心GlcNAc)的转化策略。在Gal-T1(Y289L)作用于35时，UDP-GalNAc衍生物28-30可被选择性地引入GlcNAc上以产生36(R＝脱乙酰基后的SH，或卤素)。含有巯基的36可以与马来酰亚胺衍生物33或34反应，分别形成缀合物38或39。或者，卤代衍生物36可以通过卤素与亲核试剂如DTT、MeOPhSH或NO2PhSH或与化合物32发生亲核取代反应而缀合，形成40。
图9示出了缀合物40的MS图谱，所述缀合物40为37(X＝Cl)经32处理后的粗产物。
图10示出了其中R＝Cl的氯化抗体36(包含被GalNAcCl取代的核心GlcNAc)的转化策略。在氯化衍生物36通过携带叠氮基的41的取代而进行缀合时，形成抗体的叠氮基衍生物(46)。后者叠氮化物还可与BCN-毒素结构如47缀合，形成抗体-药物缀合物48。
图11示出了巯基化单克隆抗体36(包含被巯基化半乳糖衍生物取代的核心GlcNAc)的转化策略。含有巯基的36可以与马来酰亚胺衍生物43、44或45反应，分别形成缀合物49、50或51。携带BCN-部分的后者缀合物51还可与叠氮基-生物素结构如52缀合，形成抗体-生物素缀合物53。
图12示出了用于制备乙酰基保护的GalNAc衍生物UDP-GalNProSAc(57)和UDP-GalNBuSAc(58)和含有巯基的GalNAc衍生物UDP-GalNProSH(59)和UDP-GalNBuSH(60)的合成路径。还示出了用于制备化合物64-66(即用于分别缀合GalNAcSH、GalNProSH和GalNBuSH的模型化合物)的马来酰亚胺缀合物的合成路径。
图13示出了单克隆抗体如IgG的不同糖形，其可以通过移除mAb的天然糖基化位点并在另一位置改造糖基化位点(基于序列N-X-S/T，其中X为除了脯氨酸以外的任意氨基酸)获得。
具体实施方式
定义
在本说明书和权利要求书中所使用的动词“包含”及其变形以其非限制性的意义使用，意指包括该词之后的项目，但并不排除没有具体提到的项目。
此外，通过不定冠词“一”或“一个”提及元素时，不排除存在超过一个所述元素的可能性，除非上下文明确要求有且只有一个元素。因此不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。
本说明书和权利要求书中所公开的化合物可包含一个或多个不对称中心，并且可存在所述化合物的不同的非对映异构体和/或对映异构体。除非另有说明，对本说明书和权利要求书中任何化合物的描述意指包括所有非对映异构体及其混合物。此外，除非另有说明，对本说明书和权利要求书中任何化合物的描述意指包括单独的对映异构体以及对映异构体的任何混合物、外消旋体或其他形式。当化合物的结构被描述为具体的对映异构体时，应理解，本申请的发明不限于该具体的对映异构体。
所述化合物可以不同的互变异构的形式存在。除非另有说明，本发明的化合物意指包括所有的互变异构形式。当化合物的结构被描述为具体的互变异构体时，应理解，本申请的发明不限于该具体的互变异构体。
未取代的烷基具有通式CnH2n+1并且可以是直链的或支链的。未取代的烷基也可以包含环状部分，并因此具有相应的通式CnH2n-1。任选地，所述烷基被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、2-丙基、叔丁基、1-己基、1-十二烷基等。
芳基包含六至十二个碳原子并可包含单环和双环结构。任选地，所述芳基可以被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代。芳基的实例为苯基和萘基。
芳基烷基和烷基芳基包含至少七个碳原子并且可包含单环和双环结构。任选地，所述芳基烷基和烷基芳基可被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代。芳基烷基为例如苄基。烷基芳基为例如4-叔丁基苯基。
杂芳基包含至少两个碳原子(即至少C2)和一个或多个杂原子N、O、P或S。杂芳基可具有单环结构或双环结构。任选地，杂芳基可被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代。合适的杂芳基的实例包括吡啶基、喹啉基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、咪唑基、噻唑基、吡咯基、呋喃基、三唑基、苯并呋喃基、吲哚基、嘌呤基、苯并噁唑基、噻吩基、磷酰基(phospholyl)和噁唑基。
杂芳基烷基和烷基杂芳基包含至少三个碳原子(即至少C3)并且可包含单环和双环结构。任选地，杂芳基可被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代。
当芳基表示为(杂)芳基时，该表示法意指包括芳基和杂芳基。类似地，烷基(杂)芳基意指包括烷基芳基和烷基杂芳基，(杂)芳基烷基意指包括芳基烷基和杂芳基烷基。因此C2-C24(杂)芳基应理解为包括C2-C24杂芳基和C6-C24芳基。类似地，C3-C24烷基(杂)芳基意指包括C7-C24烷基芳基和C3-C24烷基杂芳基，并且C3-C24(杂)芳基烷基意指包括C7-C24芳基烷基和C3-C24杂芳基烷基。
除非另有说明，烷基、烯基、烯烃、炔烃、(杂)芳基、(杂)芳基烷基和烷基(杂)芳基可被一个或多个选自下述的取代基取代：C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C5-C12环烯基、C8-C12环炔基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基、C3-C12环烷氧基、卤素、氨基、氧代和甲硅烷基，其中甲硅烷基可用式(R10)3Si-表示，其中R10独自地选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基和C3-C12环烷氧基，其中烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷氧基任选地被取代，烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子中断。
炔基包含碳-碳三键。含有一个三键的未取代的炔基具有通式CnH2n-3。末端炔基是其中三键位于碳链末端位置的炔基。任选地，炔基被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代，和/或被选自氧、氮和硫的杂原子中断。炔基的实例包括乙炔基、丙炔基、丁炔基、辛炔基等。
环炔基为一种环状的炔基。含有一个三键的未取代的环炔基具有通式CnH2n-5。任选地，环炔基被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代。环炔基的实例为环辛炔基。
杂环炔基是被选自氧、氮和硫的杂原子中断的环炔基。任选地，杂环炔基被一个或多个在本文中进一步指定的取代基取代。杂环炔基的实例为氮杂环辛炔基(azacyclooctynyl))。
(杂)芳基包括芳基和杂芳基。烷基(杂)芳基包括烷基芳基和烷基杂芳基。(杂)芳基烷基包括芳基烷基和杂芳基烷基。(杂)炔基包括炔基和杂炔基。(杂)环炔基包括环炔基和杂环炔基。
在本文中，(杂)环炔烃化合物被定义为含有(杂)环炔基的化合物。
在本说明书和权利要求书中所公开的数种化合物可被描述为稠合(杂)环炔烃化合物，即其中第二环结构被稠合(即增环)至(杂)环炔基上的(杂)环炔烃化合物。例如在稠合(杂)环辛炔化合物中，环烷基(例如环丙基)或芳烃(例如苯)可以被增环至(杂)环辛炔基上。在稠合(杂)环辛炔化合物中，(杂)环辛炔基的三键可位于三个可能位置中的任一个，即位于环辛炔基部分的第2、3或4位(根据“IUPAC有机化学命名法”，A31.2条进行编号)。对本说明书和权利要求书中任何稠合(杂)环辛炔化合物的描述意指包括所述环辛炔基部分的所有三个单独的位置异构体(regioisomer)。
当烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基、(杂)芳基烷基、(杂)环炔基被任选地取代时，所述基团独立地任选地被一个或多个独立地选自下述的取代基取代：C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基、C3-C12环烷氧基、卤素、氨基、氧代基和甲硅烷基，其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷氧基被任选地取代，所述烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子中断，其中所述甲硅烷基由式(R6)3Si-表示，其中R6独自地选自C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C12环烷基、C1-C12烷氧基、C2-C12烯氧基、C2-C12炔氧基和C3-C12环烷氧基，其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、烯氧基、炔氧基和环烷氧基被任选地取代，所述烷基、烷氧基、环烷基和环烷氧基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子中断。
一般术语“糖”在本文中用于表示单糖，例如葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)和岩藻糖(Fuc)。术语“糖衍生物”在本文中用于表示单糖的衍生物，即包含取代基和/或官能团的单糖。糖衍生物的实例包括氨基糖和糖酸，例如葡糖胺(GlcNH2)、半乳糖胺(GalNH2)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、唾液酸(Sia)(也被称为N-乙酰神经氨酸(NeuNAc))、和N-乙酰胞壁酸(MurNAc)、葡糖醛酸(GlcA)和艾杜糖醛酸(IdoA)。糖衍生物的实例也包括本文中表示为Su(A)x的化合物，其中Su为糖或糖衍生物，且其中Su包含x个官能团A。
术语“核苷酸”在本文中以其常见的科学含义使用。术语“核苷酸”指的是由核碱基、五碳糖(核糖或2-脱氧核糖)和一个、两个或三个磷酸基组成的分子。不含磷酸基时，核碱基和糖构成了核苷。因此，核苷酸也被称为核苷单磷酸、核苷二磷酸或核苷三磷酸。核碱基可以为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。核苷酸的实例包括尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)、胸苷二磷酸(TDP)、胞苷二磷酸(CDP)和胞苷单磷酸(CMP)。
术语“蛋白质”在本文中以其常见的科学含义使用。在本文中，包含约10个或更多个氨基酸的多肽被认为是蛋白质。蛋白质可包括天然的氨基酸，但也可包括非天然的氨基酸。
术语“糖蛋白”在本文中以其常见的科学含义使用，并且指的是含有一个或多个共价键合至蛋白质上的单糖或低聚糖链(“聚糖”)的蛋白质。聚糖可以连接到蛋白质的羟基上(O-连接-聚糖)，例如连接到丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟赖氨酸或羟脯氨酸的羟基上；或者连接到蛋白质的酰氨基上(N-糖蛋白)，例如天冬酰胺或精氨酸；或者连接到蛋白质的碳上(C-糖蛋白)，例如色氨酸。糖蛋白可以包含多于一个聚糖，可以包含一个或多个单糖和一个或多个低聚糖聚糖的组合，并且可以包含N-连接、O-连接和C-连接的聚糖的组合。据估计，超过50％的所有蛋白质具有一些糖基化的形式，因此可被描述为糖蛋白。糖蛋白的实例包括PSMA(前列腺特异性膜抗原)、CAL(南极假丝酵母脂肪酶(candida antartica lipase))、gp41、gp120、EPO(促红细胞生成素)、抗冻蛋白和抗体。
术语“聚糖”在本文中以其常见的科学含义使用，并且指的是连接至蛋白质的单糖或低聚糖链。因此，术语聚糖指的是糖蛋白的糖类部分。聚糖通过一个糖的C-1碳连接在蛋白质上，所述聚糖可以不含其他取代基(单糖)或者可以在其一个或多个羟基上被进一步取代(低聚糖)。天然存在的聚糖通常包含1至约10个糖部分。然而，当更长的糖链连接在蛋白质上时，所述糖链在本文中被认为是聚糖。
糖蛋白的聚糖可以是单糖。通常，糖蛋白的单糖聚糖由共价键合至蛋白质的单个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)或岩藻糖(Fuc)组成。
聚糖也可以为低聚糖。糖蛋白的低聚糖链可以是直链的或支链的。在低聚糖中，直接连接在蛋白质上的糖称为核心糖。在低聚糖中，未直接连接在蛋白质上且连接在至少两个其他糖上的糖被称为内糖。在低聚糖中，未直接连接在蛋白质上但连接在单个其他糖上——即在其一个或多个其他羟基上没有携带其他糖取代基——的糖被称为末端糖。为了避免疑义，在糖蛋白的低聚糖中可以存在多个末端糖，但是仅存在一个核心糖。
聚糖可以为O-连接的聚糖、N-连接的聚糖或C-连接的聚糖。在O-连接的聚糖中，单糖或低聚糖聚糖键合在所述蛋白质的氨基酸中的O原子上，通常经由丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的羟基。在N-连接的聚糖中，单糖或低聚糖聚糖经由所述蛋白质的氨基酸中的N原子键合在蛋白质上，通常经由天冬酰胺(Asn)或精氨酸(Arg)侧链上的酰胺氮。在C-连接的聚糖中，单糖或低聚糖聚糖键合在所述蛋白质的氨基酸中的C原子上，通常键合在色氨酸(Trp)的C原子上。
直接连接在蛋白质上的低聚糖的末端被称作聚糖的还原端。所述低聚糖的另一端被称作聚糖的非还原端。
对于O-连接的聚糖，存在大量不同的链。天然存在的O-连接的聚糖通常具有丝氨酸或苏氨酸-连接的α-O-GalNAc部分，其还被半乳糖、唾液酸和/或岩藻糖取代。携带聚糖取代基的羟基化氨基酸可以是蛋白质中任何氨基酸序列的一部分。
对于N-连接的聚糖，存在大量不同的链。天然存在的N-连接的聚糖通常具有天冬酰胺-连接的β-N-GlcNAc部分，转而在其4-OH上进一步被β-GlcNAc取代，转而在其4-OH上进一步被β-Man取代，转而在其3-OH和6-OH上进一步被α-Man取代，形成聚糖五糖Man3GlcNAc2。核心GlcNAc部分还可以在其6-OH上被α-Fuc取代。五糖Man3GlcNAc2是几乎所有N-连接的糖蛋白的常见的低聚糖框架并可以携带多种其他取代基，包括但不限于Man、GlcNAc、Gal和唾液酸。在侧链上被聚糖取代的天冬酰胺通常是序列Asn-X-Ser/Thr的一部分，其中X为除了脯氨酸以外的任何氨基酸且Ser/Thr为丝氨酸或苏氨酸。
术语“抗体”在本文中以其常见的科学含义使用。抗体是通过免疫系统产生的能够识别并与特定抗原结合的蛋白质。抗体是糖蛋白的一个实例。术语抗体在本文中以其最广泛的意义使用并具体包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段以及双链和单链抗体。术语“抗体”在本文中也意指包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和特异性结合癌抗原的抗体。术语“抗体”意指包括完整抗体，但也包括抗体片段，例如来自经裂解的抗体的抗体Fab片段、(Fab’)2、Fv片段或Fc片段，scFv-Fc片段，小抗体(minibody)，双特异性抗体(diabody)或scFv。此外，该术语包括基因改造的抗体和抗体的衍生物。抗体、抗体片段和基因改造的抗体均可以通过本领域已知的方法获得。合适的市售抗体包括阿昔单抗、利妥昔单抗、巴利昔单抗、帕利珠单抗、英夫利昔单抗、曲妥珠单抗、阿仑珠单抗、阿达木单抗、托西莫单抗-I131、西妥昔单抗、替伊莫单抗(ibrituximabtiuxetan)、奥马佐单抗、贝伐单抗、那他珠单抗、雷珠单抗、帕木单抗、依库珠单抗、培化舍珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗、卡那奴单抗(canakinumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、托珠单抗、奥法木单抗(ofatumumab)、地舒单抗(denosumab)、贝利木单抗(belimumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)和布妥昔单抗(brentuximab)。
术语“治疗”是指获得期望的药理和/或生理效果。该效果在完全地或部分地预防疾病或其症状方面可能是预防性的，和/或在疾病和/或由该疾病引起的副作用的部分或完全治愈方面可能是治疗性的。在本文中所使用的“治疗”涵盖对哺乳动物(特别是人)的疾病的任何治疗，并包括预防疾病在受试者中发生，所述受试者可能易感染疾病但是还未被诊断出患有该疾病；抑制疾病，即阻止其发展；缓解疾病，即引起疾病的消退。
制备经修饰的糖蛋白的方法
本发明涉及一种制备经修饰的糖蛋白的方法，该方法包括在合适的催化剂存在下使包含含有末端GlcNAc部分的聚糖的糖蛋白与Su(A)x-P接触；其中Su(A)x为包含x个官能团A的糖衍生物Su，其中x为1、2、3或4，且其中A独立地选自巯基或其前体、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基；其中P为核苷酸；其中合适的催化剂被定义为半乳糖基转移酶或含有突变型催化结构域的半乳糖基转移酶，因为Su(A)x-P为底物；且其中含有末端GlcNAc部分的聚糖为式(101)或(102)的聚糖：
Figure BDA0001016023320000141
其中：
b为0或1；
d为0或1；
e为0或1；且
G为单糖或包含2至20个糖部分的直链或支链的低聚糖。
优选地，所述催化剂选自β(1,4)-半乳糖基转移酶、β(1,3)-N-半乳糖基转移酶、含有突变型催化结构域的β(1,4)-半乳糖基转移酶和含有突变型催化结构域的β(1,3)-N-半乳糖基转移酶。在下文中更详细地描述了所述催化剂。
在本发明方法中待修饰的糖蛋白包含聚糖，所述聚糖含有末端GlcNAc部分，即位于聚糖非还原端的GlcNAc部分。所述聚糖包含一个或多个糖部分并且可以是直链的或支链的。在本文中，其中b为1的式(101)的聚糖(即由岩藻糖基化的GlcNAc组成的聚糖)的GlcNAc部分也被认为是末端GlcNAc部分。
在聚糖(102)中，优选的是，当d为0时e为1，且当e为0时d为1。
G代表单糖或直链或支链的低聚糖，其中所述低聚糖包含2至20个、优选2至12个、更优选2至10个、甚至更优选2至8个且最优选2至6个糖部分。可存在于聚糖中的糖部分是本领域技术人员已知的，并且包括例如葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)或唾液酸、木糖(Xyl)。
在一个实施方案中，含有末端GlcNAc部分的聚糖由一个GlcNAc部分组成，且该聚糖是式(101)的聚糖，其中b为0。在另一实施方案中，所述聚糖由岩藻糖基化的GlcNAc部分组成，且该聚糖是式(101)的聚糖，其中b为1。在又一实施方案中，所述聚糖为式(102)的聚糖，其中若存在核心-GlcNAc，则其任选地被岩藻糖基化(b为0或1)。
当核心-GlcNAc-部分被岩藻糖基化时，最常见地，岩藻糖以α-1,6的方式连接于核心-GlcNAc取代基的C6位。如上所述，其中b为1的式(101)的聚糖的GlcNAc-部分在本文中也被认为是末端GlcNAc-部分。
如上所述，含有末端GlcNAc部分的优选的聚糖是式(101)或(102)的聚糖。在另一优选的实施方案中，在本发明方法中待修饰的糖蛋白为式(103)或(104)的糖蛋白：
Figure BDA0001016023320000151
其中：
Pr代表蛋白质；
y为1至20；且
b、d、e和G为如上所定义。
优选地，当d为0时e为1，且当e为0时d为1。当G是直链或支链的低聚糖时，优选的是，G包含2至12个、更优选2至10个、甚至更优选2至8个且最优选2至6个糖部分。在另一个优选的实施方案中，y为1至12，更优选y为1、2、3、4、5、6、7或8，且甚至更优选y为1、2、3或4。最优选y为1或2。在又一优选的实施方案中，y是2、4、6或8，优选2或4，最优选2。当待修饰的糖蛋白为抗体，即Pr为Ab时，该实施方案是特别优选的。
在本发明的方法中，当待修饰的糖蛋白为式(103)或(104)的糖蛋白时，可以使用糖蛋白混合物作为起始糖蛋白，所述混合物包含含有一个或多个岩藻糖基化(b为1)的聚糖(101)和/或(102)和/或一个或多个非岩藻糖基化(b为0)的聚糖(101)和/或(101)的糖蛋白。
包含含有末端GlcNAc-部分的聚糖的糖蛋白在本文中也被称为“末端非还原性GlcNAc-蛋白质”，且含有末端GlcNAc-部分的聚糖在本文中也被称为“末端非还原性GlcNAc-聚糖”。应注意的是，术语“末端非还原性GlcNAc-蛋白质”包括其中b为1的式(103)的蛋白质，以及术语“末端非还原性GlcNAc-聚糖”包括其中b为1的式(101)的聚糖。
末端非还原性GlcNAc-蛋白质可以含有直链或支链的末端非还原性GlcNAc-聚糖。所述聚糖通过核心-糖-部分的C1键合到蛋白质上，且所述核心-糖-部分优选核心-GlcNAc-部分。因此，当键合到蛋白质上的末端非还原性GlcNAc-聚糖为式(102)的聚糖时，优选d为1。
在一个优选的实施方案中，末端非还原性GlcNAc-聚糖的核心-糖部分的C1通过与所述蛋白质中氨基酸残基中的氮原子形成的N-糖苷键键合到蛋白质上，更优选键合到天冬酰胺(Asn)或精氨酸(Arg)氨基酸的侧链的酰胺氮原子上。然而，非还原性GlcNAc-聚糖的核心-糖-部分的C1也可以通过与所述蛋白质中氨基酸残基中的氧原子形成的O-糖苷键键合到蛋白质上，更优选键合到丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)氨基酸的侧链上的氧原子上。在该实施方案中，优选的是，所述聚糖的核心-糖-部分为O-GlcNAc-部分或O-GalNAc部分，优选O-GlcNAc部分。非还原性GlcNAc-聚糖的核心-糖-部分的C1也可以通过与所述蛋白质中的碳原子形成的C-糖苷键键合到蛋白质上，例如键合在色氨酸(Trp)上。如上所述，糖蛋白可以包含多于一个聚糖，并且可包含N-连接、O-连接和C-连接的糖蛋白的组合。
末端非还原性GlcNAc-聚糖可以位于蛋白质的天然糖基化位点上，也可以被引入到蛋白质的不同位点上。
在一个优选的实施方案中，末端非还原性GlcNAc-蛋白质为抗体(Ab)，该抗体包含含有末端GlcNAc-部分的聚糖。在本文中，这种抗体也被称为“末端非还原性GlcNAc-抗体”。优选的末端非还原性GlcNAc-抗体为如上所定义的式(103)或(104)的抗体，其中Pr为Ab。在该实施方案中，进一步优选y为1、2、3、4、5、6、7或8，且甚至更优选y为2、4、6或8。
如上所定义，所述抗体可以为完整抗体，也可以为抗体片段。当抗体为完整抗体时，所述抗体优选在每条重链上包含一个或更多个、更优选一个末端非还原性GlcNAc-聚糖。因此，所述完整抗体优选包含两个或更多个所述聚糖，优选两个、四个、六个或八个所述聚糖，更优选两个或四个且最优选两个聚糖。换言之，当所述抗体为完整抗体时，y优选为2、4、6或8，更优选y为2或4，且最优选y为2。当抗体为抗体片段时，优选y为1、2、3或4，且更优选y为1或2。
在一个特别优选的实施方案中，当所述糖蛋白为抗体时，y为1、2或4。
在一个优选的实施方案中，所述抗体为单克隆抗体(mAb)。优选地，所述抗体选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体。更优选地，所述抗体为IgG抗体，且最优选所述抗体为IgG1抗体。
在一个优选的实施方案中，抗体中的糖蛋白连接在位于区域290-305、通常为N297中天冬酰胺的Fc-片段中的保守的N-糖基化位点上。在另一优选的实施方案中，抗体中的糖蛋白连接在抗体中的非天然糖基化位点上。进一步优选的是，所述非天然糖基化位点为非天然N-糖基化位点。非天然糖基化位点可以通过糖工程技术被引入到抗体中。抗体中糖基化位点的位置的若干实例示于图13中。
在本发明方法中可以被修饰的末端非还原性GlcNAc-蛋白质的若干实例示于图1中。图1(a)示出了含有单个的、任选地岩藻糖基化的GlcNAc-部分的糖蛋白；该GlcNAc-聚糖可以例如通过N-糖苷键或O-糖苷键连接到蛋白质上。图1(b)示出了包含支链的低聚糖聚糖的糖蛋白，该聚糖中的一个支链含有末端GlcNAc-部分(该聚糖也被称作GnM5)。核心-GlcNAc可以任选地被岩藻糖基化。图1(c)示出了包含支链的七糖聚糖的抗体，其中核心-GlcNAc部分任选地被岩藻糖基化且其中所有支链含有末端GlcNAc-部分。
在半乳糖基转移酶的作用下，将非天然半乳糖衍生物连接至末端非还原性GlcNAc-蛋白质上的方法示于图2中。
通过本发明中用于修饰糖蛋白的方法获得的经修饰的糖蛋白被定义为含有经修饰的聚糖的糖蛋白，所述聚糖在非还原端含有GlcNAc-Su(A)x二糖-部分，其中Su(A)x如上所定义。
优选地，经修饰的聚糖为式(105)或(106)的聚糖，其中b、d和e，以及其优选的实施方案，如上所定义，且其中Su(A)x为含有x个官能团A的糖衍生物Su，其中x为1、2、3或4，且其中A独立地选自巯基或其前体、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基。
Figure BDA0001016023320000181
因此，本发明还涉及一种制备经修饰的糖蛋白的方法，所述方法包括在合适的催化剂存在下，使包含含有末端GlcNAc-部分的聚糖的糖蛋白与Su(A)x-P接触；其中Su(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物Su，其中x为1、2、3或4，且其中A独立地选自巯基或其前体、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基；其中P为核苷酸；其中合适的催化剂被定义为半乳糖基转移酶或包含突变型催化结构域的半乳糖基转移酶，因为Su(A)x-P为底物；其中含有末端GlcNAc-部分的聚糖为式(101)或(102)的聚糖，如上所定义；其中经修饰的糖蛋白被定义为含有式(105)或(106)的经修饰的聚糖的糖蛋白，其中(105)或(106)如上所定义。
更优选地，可通过本文中描述的方法获得的经修饰的糖蛋白为式(107)或(108)的糖蛋白，其中Pr、b、d、e、y和Su(A)x以及其优选的实施方案为如上所定义。
Figure BDA0001016023320000182
在下文中更详细地描述了Su(A)x及其优选的实施方案。
用于制备本发明的经修饰的糖蛋白的方法在合适的催化剂的存在下进行。合适的催化剂被定义为半乳糖基转移酶或包含突变型催化结构域的半乳糖基转移酶，因为Su(A)x-P为底物。当催化剂为半乳糖基转移酶时，所述半乳糖基转移酶优选为野生型半乳糖基转移酶。当催化剂为包含突变型催化结构域的半乳糖基转移酶时，所述突变型GalT结构域可存在于全长GalT酶中，而且其也可存在于含有催化结构域的重组分子中。
优选地，催化剂选自β(1,4)-半乳糖基转移酶、β(1,3)-N-半乳糖基转移酶、含有突变型催化结构域的β(1,4)-半乳糖基转移酶和含有突变型催化结构域的β(1,3)-N-半乳糖基转移酶。
在一个实施方案中，催化剂为野生型半乳糖基转移酶，更优选野生型β(1,4)-半乳糖基转移酶或野生型β(1,3)-N-半乳糖基转移酶，且甚至更优选野生型β(1,4)-半乳糖基转移酶I。在本文中，β(1,4)-半乳糖基转移酶I也被称为GalT。甚至更优选地，β(1,4)-半乳糖基转移酶I选自牛β(1,4)-Gal-T1、人β(1,4)-Gal-T1、人β(1,4)-Gal-T2、人β(1,4)-Gal-T3、人β(1,4)-Gal-T4和人β(1,3)-Gal-T5。
当糖衍生物Su(A)x中的官能团A位于所述糖衍生物的C2或C6、优选C6上时，其中催化剂为野生型半乳糖基转移酶的该实施方案是特别优选的。在该实施方案中，进一步优选的是，Su(A)x包含不超过一个官能团A，即优选x为1。在下文中更详细地描述了Su(A)x和Su(A)x-P。
因此，本发明还涉及一种制备经修饰的糖蛋白的方法，所述方法包括在合适的催化剂的存在下将经修饰的糖连接在糖蛋白的末端GlcNAc-部分的步骤；其中经修饰的糖被定义为含有官能团A的糖，其中A独立地选自巯基或其前体、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基；且其中合适的催化剂被定义为野生型半乳糖基转移酶或含有突变型催化结构域的半乳糖基转移酶，因为Su(A)x-P为底物；条件是当催化剂为野生型半乳糖基转移酶时，所述经修饰的糖含有不超过一个官能团A且所述官能团A位于所述经修饰的糖的C6上。
在另一实施方案中，本发明涉及一种制备经修饰的糖蛋白的方法，该方法包括在合适的催化剂存在下，使包含如上定义的式(101)或(102)的聚糖的糖蛋白与Su(A)x-P接触；其中Su(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物Su，其中x为1、2、3或4，且其中A独立地选自巯基或其前体、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基；其中P为核苷酸；且其中合适的催化剂被定义为野生型半乳糖基转移酶或包含突变型催化结构域的半乳糖基转移酶，因为Su(A)x-P为底物；条件是当催化剂为野生型半乳糖基转移酶时，Su(A)x-P含有一个官能团A(x为1)，且所述官能团A位于Su(A)x的C2或C6、优选C6上。
优选地，野生型半乳糖基转移酶为β(1,4)-半乳糖基转移酶或β(1,3)-N-半乳糖基转移酶，更优选β(1,4)-半乳糖基转移酶。
在另一实施方案中，催化剂为含有突变型催化结构域的半乳糖基转移酶，优选含有突变型催化结构域的β(1,4)-半乳糖基转移酶或含有突变型催化结构域的β(1,3)-N-半乳糖基转移酶，更优选含有突变型催化结构域的β(1,4)-半乳糖基转移酶。在本文中，β(1,4)-半乳糖基转移酶还被称为GalT。
在另一实施方案中，催化剂选自β(1,4)-半乳糖基转移酶或β(1,3)-N-半乳糖基转移酶，更优选选自均包含突变型催化结构域的β(1,4)-半乳糖基转移酶或β(1,3)-N-半乳糖基转移酶。
在一个优选的实施方案中，催化剂为包含突变型催化结构域的β(1,3)-N-半乳糖基转移酶，且优选所述β(1,3)-N-半乳糖基转移酶为人β(1,3)-Gal-T5。
更优选地，催化剂为包含突变型催化结构域的β(1,4)-N-半乳糖基转移酶，更优选为包含突变型催化结构域的β(1,4)-半乳糖基转移酶，且甚至更优选所述催化剂选自牛β(1,4)-Gal-T1、人β4-Gal-T1、人β(1,4)-Gal-T2、人β(1,4)-Gal-T3和人β(1,4)-Gal-T4，上述所有催化剂均含有突变型催化结构域。
最优选地，催化剂为含有突变型催化结构域的牛β(1,4)-Gal-T1。
对于本发明的方法，若干种合适的催化剂是本领域已知的。合适的催化剂为例如包含源自β(1,4)-半乳糖基转移酶I的突变型催化结构域的催化剂。在本文中，催化结构域指的是折叠成结构域的氨基酸片段，其能够在本发明的具体方法中催化特定的糖衍生物核苷酸Su(A)x-P与末端非还原性GlcNAc-聚糖的连接。在本文中，β(1,4)-半乳糖基转移酶I还被称为GalT。这种突变型GalT催化结构域公开在例如J.Biol.Chem.2002,277,20833和WO2004/063344(美国国立卫生研究院(National Institutes of Health))(两篇文献以引证方式纳入本说明书中)中。J.Biol.Chem.2002,277,20833和WO 2004/063344公开了牛β(1,4)-Gal-T1的Tyr-289突变体，其被称作Y289L、Y289N和Y289I。制备所述突变型催化结构域Y289L、Y289N和Y289I的方法详细地公开在WO 2004/063344第34页l.6至第36页l.2中，其以引证方式明确地纳入本说明书中。
催化形成葡萄糖-β(1,4)-N-乙酰葡糖胺键的突变型GalT结构域公开在WO 2004/063344的第10页1.25至第12页1.4(以引证方式明确地纳入本说明书中)中。催化形成N-乙酰半乳糖胺-β(1,4)-N-乙酰葡糖胺键的突变型GalT结构域公开在WO 2004/063344的第12页1.6至第13页1.2(以引证方式明确地纳入本说明书中)中。催化形成N-乙酰葡糖胺-β(1,4)-N-乙酰葡糖胺键和甘露糖-β(1,4)-N-乙酰葡糖胺键的突变型GalT结构域公开在WO2004/063344的第12页1.19至第14页1.6(以引证方式明确地纳入本说明书中)。
所公开的突变型GalT结构域可以包括在全长GalT酶中，或者包括在含有催化结构域的重组分子中，如在WO 2004/063344的第14页1.31至第16页1.28(以引证方式明确纳入本说明书中)中所公开的。
另一突变型GalT结构域为例如Y284L，由Bojarová等人，Glycobiology 2009,19,509(以引证方式明确纳入本说明书中)公开，其中Tyr284被亮氨酸代替。
另一突变型GalT结构域为例如R228K，由Qasba等人，Glycobiology2002,12,691(以引证方式明确纳入本说明书中)公开，其中Arg228被赖氨酸代替。
所述催化剂还可包含源自牛β(1,4)-半乳糖基转移酶的突变型催化结构域，其选自GalT Y289N、GalT Y289F、GalT Y289M、GalT Y289V、GalT Y289G、GalT Y289I和GalTY289A，优选地选自GalT Y289F和GalT Y289M。GalT Y289N、GalT Y289F、GalT Y289M、GalTY289V、GalT Y289G、GalT Y289I和GalT Y289A可以通过定点诱变方法提供，以类似于WO2004/063344、Qasba等人，Prot.Expr.Pur.2003,30,219和Qasba等人，J.Biol.Chem.2002,277,20833(全部以引证方式纳入)中公开的关于Y289L、Y289N和Y289I的方法进行。在GalTY289N中，在289位的酪氨酸氨基酸(Y)被天冬酰胺(N)氨基酸代替；在GalT Y289F中，在289位的酪氨酸氨基酸(Y)被苯丙氨酸(F)氨基酸代替；在GalT Y289M中，所述酪氨酸被甲硫氨酸(M)氨基酸代替，在GalT Y289V中被缬氨酸(V)氨基酸代替，在GalT Y289G中被甘氨酸(G)氨基酸代替，在GalT Y289I中被异亮氨酸(I)氨基酸代替，以及在Y289A中被丙氨酸(A)氨基酸代替。
在一个制备本发明的经修饰的糖蛋白的方法的优选实施方案中，所述催化剂为包含源自β(1,4)-半乳糖基转移酶、优选源自牛β(1,4)-Gal-T1的突变型催化结构域的催化剂。
优选地，催化剂为包含源自β(1,4)-半乳糖基转移酶的突变型催化结构域的催化剂，其优选选自牛β(1,4)-Gal-T1GalT Y289L、GalT Y289N、GalT Y289I、GalT Y289F、GalTY289M、GalT Y289V、GalT Y289G和GalT Y289A，更优选选自牛β(1,4)-Gal-T1GalT Y289L、GalT Y289N和GalT Y289I。
在一个进一步优选的实施方案中，所述催化剂为包含选自下述的GalT突变型催化结构域的催化剂：Y289L、Y289N、Y289I、Y284L、R228K、Y289F、Y289M、Y289V、Y289G和Y289A，优选选自Y289L、Y289N、Y289I、Y284L和R228K。在另一优选实施方案中，所述催化剂为包含选自下述的牛β(1,4)-Gal-T1突变型催化结构域的催化剂：Y289F、Y289M、Y289V、Y289G和Y289A。更优选地，所述催化剂为包含选自下述的GalT突变型催化结构域的催化剂：Y289L、Y289N和Y289I，且最优选地，所述催化剂为包含选自Y289L的GalT突变型催化结构域的催化剂。
另一类合适的催化剂为基于α(1,3)-N-半乳糖基转移酶(还被称为α3Gal-T)、优选α(1,3)-N-乙酰氨基半乳糖基转移酶(还被称为α3GalNAc-T)的催化剂，如在WO 2009/025646(以引证方式纳入本说明书中)中所公开的。α3Gal-T的突变能拓宽酶的供体特异性，且使其成为α3GalNAc-T。α3GalNAc-T的突变能拓宽所述酶的供体特异性。α(1,3)-N-乙酰氨基半乳糖基转移酶的多肽片段和催化结构域公开在WO2009/025646第26页1.18至第47页1.15和第77页1.21至第82页1.4(两者均以引证方式明确地纳入本说明书中)。
制备本发明的经修饰的糖蛋白的方法优选在合适的缓冲溶液中进行，所述缓冲溶液例如为磷酸盐、缓冲盐溶液(例如磷酸盐-缓冲盐水、tris-缓冲盐水)、柠檬酸盐、HEPES、tris和甘氨酸。合适的缓冲液是本领域已知的。优选地，所述缓冲溶液为磷酸盐-缓冲盐水(PBS)或tris缓冲液。
所述方法优选在约4至约50℃、更优选约10至约45℃、甚至更优选约20至约40℃且最优选约30至约37℃范围内的温度下进行。
所述方法优选在pH为约5至约9、优选约5.5至约8.5、更优选约6至约8范围内进行。最优选地，所述方法在pH为约7至约8范围内进行。
Su(A)x被定义为包含x个官能团A的糖衍生物Su，其中A独立地选自巯基或其前体、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基，其中x为1、2、3或4。
Su(A)x-部分也可被称为“经修饰的糖”。在本文中，经修饰的糖被定义为糖或糖衍生物，所述糖和糖衍生物包含1、2、3或4个官能团A，其中A选自巯基或其前体、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基。当经修饰的糖或糖衍生物包含例如巯基时，所述糖或糖衍生物可被称为经巯基-修饰的糖或糖衍生物。当经修饰的糖或糖衍生物包含例如巯基-前体时，所述糖或糖衍生物可被称为经巯基-前体-修饰的糖或糖衍生物。当经修饰的糖或糖衍生物包含例如卤素时，所述糖或糖衍生物可被称为经卤素-修饰的糖或糖衍生物。当经修饰的糖或糖衍生物包含例如磺酰氧基时，所述糖或糖衍生物可被称为经磺酰氧基-修饰的糖或糖衍生物。
巯基在本文中被定义为-[C(R7)2]oSH基团，其中R7独立地选自氢、卤素和(任选取代的)C1-C24烷基，并且o为0-24。优选R7为氢或C1、C2、C3或C4烷基，更优选R7为氢或-CH3。优选o为0-10，更优选0、1、2、3、4、5或6。更优选地，R7为氢、-CH3或C2烷基和/或o为0、1、2、3或4。甚至更优选R7为且o为0、1、2或3，更优选o为1或2，最优选o为0或1。最优选o为0。最优选地，所述巯基为-CH2CH2CH2SH、-CH2CH2SH、-CH2SH或-SH,优选-SH。
巯基的前体在本文中被定义为-[C(R7)2]oSC(O)CH3基团，其中R7和o，以及它们的优选实施方案，为如上对于巯基的定义。最优选地，所述巯基-前体为-CH2CH2CH2SC(O)CH3、-CH2CH2SC(O)CH3、-CH2SC(O)CH3或-SC(O)CH3，优选-SC(O)CH3。在制备本发明的经修饰的糖蛋白的方法中，可以使用其中A为巯基前体的糖衍生物Su(A)x。在所述方法中，巯基-前体被转化为巯基。
卤素在本文中被定义为F、Cl、Br或I。优选地，所述卤素为Cl或Br，更优选Cl。
磺酰氧基在本文中被定义为-[C(R7)2]oOS(O)2R8基团，其中R7和o为如上对于巯基的定义，并且R8选自C1-C24烷基、C6-C24芳基、C7-C24烷基芳基和C7-C24芳基烷基。R8优选为C1-C4烷基、C6-C12芳基、C7-C12烷基芳基或C7-C12芳基烷基，更优选C1-C4烷基、C7-C12烷基芳基或C7-C12芳基烷基，甚至更优选-CH3、-C2H5、C3直链或支链烷基、苯基或C7烷基芳基。R8最优选为甲基、乙基、苯基或对甲苯基。优选R7为氢或C1、C2、C3或C4烷基，更优选R7为氢或-CH3。优选o为0-10，更优选0、1、2、3、4、5或6。更优选地，R7为氢、-CH3或-C2烷基和/或o为0、1、2、3或4。甚至更优选地，R7为氢且o为1或2，最优选o为0。R8优选为C1-C4烷基、C7-C12烷基芳基或C7-C12芳基烷基，更优选-CH3、-C2H5、C3直链或支链烷基或C7烷基芳基。最优选地，磺酰氧基为甲磺酸酯基、-OS(O)2CH3、苯磺酸酯基(-OS(O)2(C6H5)或甲苯磺酸酯基(-OS(O)2(C6H4CH3)。
卤代乙酰氨基在本文中被定义为-NHC(O)[C(R7)2]oX基团，其中R7独立地选自氢、卤素和(任选取代的)C1-C24烷基，X为F、Cl、Br或I，且o为0-24。优选R7为氢或C1、C2、C3或C4烷基，更优选R7为氢或-CH3，最优选为氢。优选o为0至10，更优选为1、2、3、4、5或6，甚至更优选为1、2、3或4，且最优选o为1。更优选地，R7为氢或-CH3或C2烷基和/或o为1、2、3或4，最优选地，R7为氢且o为1。优选地，X为Cl或Br，更优选X为Cl。最优选地，R7为氢，X为Cl且o为1。
巯基乙酰氨基在本文中被定义为-NHC(O)[C(R7)2]oSH基团，其中R7独立地选自氢、卤素和(任选取代的)C1-C24烷基且o为0-24。优选R7为氢或C1、C2、C3或C4烷基，更优选R7为氢或-CH3，最优选为氢。优选o为0至10，更优选为1、2、3、4、5或6，甚至更优选为1、2、3或4，且最优选o为2、3或4。更优选地，R7为氢或-CH3或C2烷基和/或o为1、2、3或4。更优选地，R7为氢且o为1、2、3或4。最优选地，R7为氢且o为1、2或3，优选为1。优选的实例包括巯基乙酰氨基、巯基丙酰氨基、巯基丁酰氨基和巯基苯酰氨基，优选巯基丙酰氨基。
磺化的羟基乙酰氨基在本文中被定义为-NHC(O)[C(R7)2]oOS(O)2R8基团，其中R7独立地选自氢、卤素和(任选取代的)C1-C24烷基，R8选自C1-C24烷基、C6-C24芳基、C7-C24烷基芳基和C7-C24芳基烷基，且o为0-24。R8优选为C1-C4烷基、C6-C12芳基、C7-C12烷基芳基或C7-C12芳基烷基，更优选-CH3、-C2H5、C3直链或支链烷基、C6-C9芳基或C7烷基芳基。最优选磺酰氧基为甲磺酸酯基-OS(O)2CH3、苯磺酸酯基-OS(O)2(C6H5)或甲苯磺酸酯基-OS(O)2(C6H4CH3)。优选R7为氢或C1、C2、C3或C4烷基，更优选R7为氢或-CH3，最优选为氢。优选o为0-10，更优选为1、2、3、4、5或6，甚至更优选为1、2、3或4且最优选o为1。更优选地，R7为氢、-CH3或C2烷基和/或o为1、2、3或4。甚至更优选地，R7为氢且o为1、2或3。还甚至更优选地，R7为氢，o为1且R8为甲磺酸酯基、苯磺酸酯基或甲苯磺酸酯基。最优选地，R7为氢，R8为-CH3且o为1。
糖衍生物Su(A)x可包含一个或多个官能团A。当Su(A)x包含两个或更多个官能团A时，每个官能团A独立地选择，即一个Su(A)x可以含有不同的官能团A，例如巯基和卤素等。在一个优选的实施方案中，x为1或2，更优选x为1。在另一优选的实施方案中，官能团A为巯基或卤素，更优选为卤素。
糖衍生物Su(A)x源自糖或糖衍生物Su，例如氨基糖或其他衍生糖。糖和糖衍生物的实例包括半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰神经氨酸或唾液酸(Sial)和岩藻糖(Fuc)。
氨基糖是其中羟基(OH)被氨基取代的糖并且其实例包括葡萄糖胺(GlcNH2)和半乳糖胺(GalNH2)。其他衍生糖的实例包括N-乙酰神经氨酸(唾液酸、Sia或NeuNAc)或岩藻糖(Fuc)。
糖衍生物Su(A)x优选源自半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、岩藻糖(Fuc)和N-乙酰神经氨酸(唾液酸、Sial或NeuNAc)，优选选自GlcNAc、Glc、Gal和GalNAc。更优选Su(A)x源自Gal或GalNAc，且最优选Su(A)x源自GalNAc。
Su(A)x中的一个或更多个官能团A可以以若干种方式连接在糖或糖衍生物Su上。一个或更多个官能团A可以键合在糖或糖衍生物的C2、C3、C4和/或C6上，而不是羟基(OH)上。应注意的是，由于岩藻糖在C6上不含OH，如果A被键合到Fuc的C6上，则A取代该位置的H原子。优选地，Su(A)x中的一个或更多个官能团A可以存在于所述糖或糖衍生物Su的C2和/或C6上。当官能团A取代OH位于糖或糖衍生物的C2上时，A优选选自卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基。然而，当A位于2-氨基糖衍生物例如GalNAc或GlcNAc的C2上时，A优选选自卤素、巯基和磺酰氧基。
当A为巯基时，优选所述巯基位于糖衍生物或2-氨基糖衍生物的6-位上。其中A为巯基的Su(A)x的实例为2-(巯基乙酰氨基)-2-脱氧-半乳糖(2-GalNAcSH)。其中A为巯基的Su(A)x的另一个实例为6-巯基-6-脱氧-半乳糖。
当A为卤素时，优选所述卤素位于糖衍生物或2-氨基糖衍生物的6-位上。其中A为卤素的Su(A)x的一个实例为2-(氯乙酰氨基)-2-脱氧-半乳糖(2-GalNAcCl)。其中A为卤素的Su(A)x的另一实例为6-(氯乙酰氨基)-6-脱氧-半乳糖。
当A为磺酰氧基时，优选所述磺酰氧基位于糖衍生物或2-氨基糖衍生物的6-位上。其中A为磺酰氧基的Su(A)x的一个实例为2-(甲基磺酰氧基乙酰氨基)-2-脱氧-半乳糖(2-GalNAcOMs)。其中A为磺酰氧基的Su(A)x的另一个实例为2-(苯基磺酰氧基乙酰氨基)-2-脱氧-半乳糖(2-GalNAcOMs)。其中A为磺酰氧基的Su(A)x的另一个实例为6-(甲磺酰基)-半乳糖。
当A为卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基或磺化的羟基乙酰氨基时，优选所述基团位于糖衍生物的6-位上。
Su(A)x-P的其他实例包括：6-A-6-脱氧半乳糖-UDP(6-A-Gal-UDP)，例如6-氯-6-脱氧半乳糖-UDP(6-ClGal-UDP)、6-硫代-6-脱氧半乳糖-UDP(6-HSGal-UDP)；或2-A-2-脱氧半乳糖-UDP(2-A-Gal-UDP)，例如2-氯-2-脱氧半乳糖-UDP(2-ClGal-UDP)、2-硫代-2-脱氧半乳糖-UDP(2-HSGal-UDP)。或者，A可以作为转而取代羟基的乙酰氨基的一部分而间接地取代至糖衍生物上。实例包括：6-A-乙酰氨基-6-脱氧半乳糖-UDP(6-GalNAcA-UDP)，例如6-氯乙酰氨基-6-脱氧半乳糖-UDP(6-GalNAcCl-UDP,(23)其中X＝Cl)、6-硫代乙酰氨基-6-脱氧半乳糖-UDP(6-GalNAcSH-UDP,(20)其具有1个CH2且R＝H)；或2-A-乙酰氨基-2-脱氧半乳糖-UDP(2-GalNAcA-UDP)，例如2-氯乙酰氨基-2-脱氧半乳糖-UDP(2-GalNAcCl-UDP,(21)其中X＝Cl)、2-硫代乙酰氨基-2-脱氧半乳糖-UDP(2-GalNAcSH-UDP,(18)其具有1个CH2且R＝H)。或者，A可以作为转而取代羟基或连接在羟基上的另一官能团的一部分而间接地取代至糖衍生物上。所述另一官能团的实例包括(杂)烷基链或(杂)芳基链。
P在本文中被定义为核苷酸。P优选地选自核苷单磷酸和核苷二磷酸，更优选选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)、胸苷二磷酸(TDP)、胞苷二磷酸(CDP)和胞苷单磷酸(CMP)，更优选选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)。最优选地，P为UDP。
其中核苷单磷酸或核苷二磷酸P连接在糖衍生物Su(A)x上的式Su(A)x-P的几种化合物是本领域中已知的。例如，全部以引证方式纳入本说明书的下列文献公开了许多化合物Su(A)x-P及其合成方法：Wang等人，Chem.Eur.J.2010,16,13343-13345；Piller等人，ACSChem.Biol.2012,7,753；Piller等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.2005,15,5459-5462和WO2009/102820(Qasba等)。
连接在巯基-、卤代-和三甲苯氧基-取代的糖和糖衍生物的尿苷二磷酸Su(A)x-UDP的数个实例(18-23)示于下文中。也示出了其中A为巯基前体的Su(A)x-P的实例(18-20,其中R＝Ac)。如上所述，在18-20中，优选o为1、2、3、4、5或6，优选为1、2、3或4，更优选为1、2或3。此外，R为H或Ac。
Figure BDA0001016023320000281
酮基、炔基、卤素、巯基、巯基化乙酰氨基和卤代乙酰氨基-取代的糖和糖衍生物的其他实例(3-17)示于图3中，所有的上述化合物可以转化为其对应的UDP糖Su(A)x-UDP，一些上述化合物描述在图4中。一些巯基衍生物或卤代乙酰氨基衍生物——其全部可由常见前体27容易地制备——的合成方法描述在图5中。
如上所述，可用于制备本发明的经修饰的糖蛋白的方法中的数种糖衍生物核苷酸Su(A)x-P是野生型半乳糖基转移酶的底物。对于这些糖衍生物核苷酸Su(A)x-P而言，本发明的方法可以在作为催化剂的野生型半乳糖基转移酶、优选野生型β(1,4)-半乳糖基转移酶、更优选β(1,4)-半乳糖基转移酶I存在下进行。
当使用野生型半乳糖基转移酶作为催化剂时，优选的是，Su(A)x-P选自x为1且A位于所述糖或糖衍生物的C6上的Su(A)x-P，其中A为如上所定义。A可以直接取代在糖衍生物而不是羟基上。实例包括6-A-6-脱氧半乳糖-UDP(6-A-Gal-UDP)、6-氯-6-脱氧半乳糖-UDP(6-ClGal-UDP,(22)其具有1个CH2且X＝Cl)、6-硫代-6-脱氧半乳糖-UDP(6-HSGal-UDP,(19)其具有1个CH2且R＝H)。
或者，A可以作为转而取代羟基的乙酰氨基的一部分而间接地取代在糖衍生物上。实例包括6-A-乙酰氨基-6-脱氧半乳糖-UDP(6-GalNAcA-UDP)，例如6-氯乙酰氨基-6-脱氧半乳糖-UDP(6-GalNAcCl-UDP,(23)其中X＝Cl)、6-硫代乙酰氨基-6-脱氧半乳糖-UDP(6-GalNAcSH-UDP,(20)其具有1个CH2且R＝H)。或者，A可以作为转而取代羟基或连接在羟基上的另一官能团的一部分而间接地取代在糖衍生物上。所述另一官能团的实例包括(杂)烷基链或(杂)芳基链。
在一个制备经修饰的糖蛋白的方法的优选实施方案中，Su(A)x包含1或2个官能团A，即优选x为1或2。更优选x为1。在一个优选的实施方案中，Su为半乳糖(Gal)。在另一优选的实施方案中，x为1或2且Su为Gal,且最优选地，x为1且Su为Gal。
在一个优选的实施方案中，Su(A)x选自6-GalNAcCl、6-GalNAcSH、2-GalNAcCl、2-GalNAcSH、6-ClGal、2-ClGal、2-HSGal和6-HSGal，更优选选自6-GalNAcCl、6-GalNAcSH、2-GalNAcCl、2-GalNAcSH、6-ClGal和2-ClGal。
在另一优选的实施方案中，x为1，且Su(A)x选自6-GalNAcCl、6-GalNAcSH、2-GalNAcCl、2-GalNAcSH、6-ClGal、2-ClGal、2-HSGal和6-HSGal，更优选选自6-GalNAcCl、6-GalNAcSH、2-GalNAcCl、2-GalNAcSH、6-ClGal和2-ClGal。
在一个优选的实施方案中，A为巯基或卤素。
在制备本发明的经修饰的糖蛋白的方法的一个特别优选的实施方案中，Su(A)x选自2-GalNAcSH、2-GalNAcX、2-GalNAcOS(O)2R8、6-GalNAcSH、6-GalNAcX和6-GalNAcOS(O)2R8。在一个甚至更优选的实施方案中，x为1或2且Su(A)x选自2-GalNAcSH、2-GalNAcX、2-GalNAcOS(O)2R8、6-GalNAcSH、6-GalNAcX和6-GalNAcOS(O)2R8。在一个最优选的实施方案中，x为1且Su(A)x选自2-GalNAcSH、2-GalNAcX、2-GalNAcOS(O)2R8、6-GalNAcSH、6-GalNAcX和6-GalNAcOS(O)2R8，其中X为Cl或Br，优选Cl。
在制备本发明的经修饰的糖蛋白的方法的一个特别优选的实施方案中，Su(A)x-P选自2-GalNAcSH-UDP((18)其具有1个CH2且R＝H)、2-GalNAcX-UDP(21)、2-GalNAcOS(O)2R8-UDP、6-GalNAcSH-UDP((20)其具有1个CH2且R＝H)、6-GalNAcX-UDP(23)和6-GalNAcOS(O)2R8-UDP，以及催化剂为包含突变型催化结构域GalT(Y289L)的牛β(1,4)-Gal-T1；其中X为Cl、Br或I；并且其中R8为甲基、乙基、苯基或对甲苯基。
在一个更优选的实施方案中，2-GalNAcX-UDP为2-GalNAcCl-UDP或2-GalNAcBr-UDP，更优选为2-GalNAcCl-UDP；以及6-GalNAcX-UDP为6-GalNAcCl-UDP和6-GalNAcBr-UDP，更优选6-GalNAcCl-UDP。在另一优选的实施方案中，2-GalNAcOS(O)2R8-UDP中的R8为甲基、苯基或对甲苯基，最优选甲基；以及6-GalNAcOS(O)2R8-UDP中的R8为甲基、苯基或对甲苯基，最优选R8为甲基。
在制备本发明的经修饰的糖蛋白的方法的另一特别优选的实施方案中，Su(A)x-P选自6-HSGal-UDP、6-XGal-UDP、6-R8S(O)2OGal-UDP，并且催化剂为野生型人GalT；其中X为Cl、Br或I；并且其中R8为甲基、乙基、苯基或对甲苯基。X更优选为Cl或Br，最优选Cl。R8更优选为甲基、乙基、苯基或对甲苯基，最优选为甲基。人GalT优选为人β4-Gal-T1、人β(1,4)-Gal-T2、人β(1,4)-Gal-T3和人β(1,4)-Gal-T4。
制备本发明的经修饰的糖蛋白的方法还可包括提供包含在非还原端含有末端GlcNAc-部分的聚糖的糖蛋白的步骤。因此，本发明还涉及一种制备经修饰的糖蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供包含在非还原端含有末端GlcNAc-部分的聚糖的糖蛋白；以及
(ii)在合适的催化剂存在下，使包含含有末端GlcNAc-部分的聚糖的糖蛋白与Su(A)x-P接触；其中Su(A)x为包含x个官能团A的糖衍生物Su，其中x为1、2、3或4且其中A独立地选自巯基或其前体、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基；其中P为核苷酸；其中合适的催化剂被定义为半乳糖基转移酶或包含突变型催化结构域的半乳糖基转移酶，因为Su(A)x-P为底物；并且其中含有末端GlcNAc-部分的聚糖为式(101)或(102)的聚糖：
Figure BDA0001016023320000311
其中b、d、e和G如上所定义。
优选地，步骤(ii)中的催化剂选自β(1,4)-半乳糖基转移酶、β(1,3)-N-半乳糖基转移酶、包含突变型催化结构域的β(1,4)-半乳糖基转移酶、包含突变型催化结构域的β(1,3)-N-半乳糖基转移酶。所述催化剂在上文中已详细描述。
包含在非还原端含有末端GlcNAc-部分的聚糖的糖蛋白，即末端非还原GlcNAc蛋白质，可以以多种方式提供，例如通过(a)用内切糖苷酶来修整N-糖蛋白，如EMBO J.2001,12,3046(以引证方式纳入)中所述，或(b)在苦马豆碱的存在下表达杂化N-糖蛋白，如例如Satoh等人在Glycobiology 2006,17,104-118(以引证方式纳入)中所述(之后进行唾液酸酶/半乳糖苷酶处理)。
在一个特定的实施方案中，本发明还涉及一种制备经修饰的糖蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)通过内糖苷酶的作用，通过修整含有低聚糖聚糖的糖蛋白而提供包含在非还原端含有末端GlcNAc-部分的聚糖的糖蛋白；以及
(ii)在合适的催化剂存在下，使包含含有末端GlcNAc-部分的聚糖的糖蛋白与Su(A)x-P接触；其中Su(A)x为包含x个官能团A的糖衍生物Su，其中x为1、2、3或4且其中A独立地选自巯基或其前体、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基；其中P为核苷酸；其中合适的催化剂被定义为半乳糖基转移酶或包含突变型催化结构域的半乳糖基转移酶，因为Su(A)x-P为底物；并且其中含有末端GlcNAc-部分的聚糖为式(101)或(102)的聚糖：
Figure BDA0001016023320000312
其中b、d、e和G如上所定义。
优选地，所述催化剂选自β(1,4)-半乳糖基转移酶、β(1,3)-N-半乳糖基转移酶、包含突变型催化结构域的β(1,4)-半乳糖基转移酶、包含突变型催化结构域的β(1,3)-N-半乳糖基转移酶。所述催化剂在上文中已详细描述。
聚糖可以通过GlcNAc-残基的C1连接至糖蛋白上，即键合在天冬酰胺氨基酸的酰胺侧链上，所述天冬酰胺氨基酸的酰胺侧链为糖蛋白的一部分。在大多数情况下，低聚糖可以通过N-糖苷键连接到天冬酰胺(Asn)或精氨酸(Arg)氨基酸侧链上。
存在许多不同类型的聚糖。例如Ig抗体的Fc区域携带高度保守的N-糖基化位点。连接在该位点上的N-聚糖为复合型的显著的核心岩藻糖基化双触角(diantennary)结构。聚糖的另一种类型为高甘露糖聚糖类型。高-甘露糖通常包含两个N-乙酰葡萄糖胺和不同量的甘露糖残基。
如上所述，聚糖可经由GlcNAc-残基键合到糖蛋白上，且该GlcNAc-残基可以被岩藻糖基化。在图1中，这用b表示：当b为0时，所述GlcNAc-残基为非岩藻糖基化的，当b为1时，所述GlcNAc为岩藻糖基化的。
在大量聚糖中，第二GlcNAc-残基键合到直接键合于糖蛋白的GlcNAc-残基上，也可以参见图1中的(b)和(c)。可修整其中第二GlcNAc-残基键合到直接键合于糖蛋白的GlcNAc-残基上的聚糖(例如图1(b)和(c))，以便获得包含在非还原端含有末端GlcNAc-部分的式(101)的聚糖的糖蛋白。修整发生在所述两个GlcNAc-残基之间。聚糖的修整提供了式(101)的聚糖，如图1(a)所示。这种共价键合——优选通过所述GlcNAc的C1和存在于抗体的氨基酸侧链上的酰胺之间的N-糖苷键共价键合——于N-糖基化位点上的GlcNAc-残基在本文中被称为“末端GlcNAc-部分”以及“核心-GlcNAc-部分”。所述末端GlcNAc-部分或核心-GlcNAc-部分可以任选地被岩藻糖基化。
聚糖的修整通过合适酶的作用来进行，并且修整低聚糖(也称为聚糖)之后，获得末端GlcNAc-部分。通过修整，获得了含有末端GlcNAc-部分的式(101)的聚糖。该末端GlcNAc-部分可以为岩藻糖基化的(图1(a)中的b为1)或非岩藻糖基化的(b为0)。
“合适的酶”被定义为以待修整的低聚糖为底物的酶。用于本发明方法的该特定实施方案的步骤(i)的优选的酶类型取决于待被修整的特定聚糖或多种聚糖。在本发明方法的该特定实施方案的优选实施方案中，在所述方法的该特定实施方案的步骤(i)中的酶选自内切糖苷酶。
内切糖苷酶能够裂解聚糖结构中的内部糖苷键，这提供了对重塑和合成操作有利的方面。例如，当内切糖苷酶在保守聚糖区域内的可预测位点进行裂解时，其可用于异质聚糖种类的温和均质化。在此方面，最重要的类型之一的内切糖苷酶包括内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(EC3.2.1.96，通常称为Endos和ENGases)，其为一种通过水解N,N’-二乙酰壳二糖核心中的β-1,4-糖苷键而从糖蛋白中移除N-聚糖的水解酶(综述于Wong等人，Chem.Rev.2011,111,4259中，其以引证方式纳入本说明书中)，从而留下单核心N-连接的GlcNAc残基。发现内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶以常用的包含Endo D的化学酶变体广泛地分布在自然界中，其对寡甘露糖(pauci mannose)具有特异性；Endo A和Endo H，其对高甘露糖具有特异性；Endo F子类，其范围为从高甘露糖到双触角复合物；以及Endo M，其能裂解除岩藻糖基化聚糖以外的大多数N-聚糖结构(高甘露糖/复合物类型/杂化类型)，对高甘露糖类型的低聚糖的水解活性显著高于对复合物类型和杂化类型的低聚糖的水解活性。这些ENGases对末端N-聚糖结构表现出特异性，而对蛋白质则不显示特异性，这使得它们对于在天然条件下从糖蛋白上裂解大多数N-连接的聚糖是有用的。
内切糖苷酶F1、F2和F3最适合用于天然蛋白质的脱糖基化。Endo F1、F2和F3的连接特异性暗示了一种用于使蛋白质脱糖基化的一般策略，其可以移除所有类型的N-连接的低聚糖而不会使蛋白质变性。双触角和三触角结构可分别通过内切糖苷酶F2和F3而立即移除。低聚-甘露糖和杂化结构可通过Endo F1而移除。
Endo F3是独特的，这在于其裂解性对于低聚糖的肽键的状态是敏感的，以及其对核心-岩藻糖基化的状态也是敏感的。内切糖苷酶F3使天冬酰胺-连接的双触角和三触角复合物低聚糖裂解。其将以较慢的速率裂解非糖基化的双触角和三触角结构，但是只限于肽连接的结构。核心岩藻糖基化双触角结构对于Endo F3而言是有效的底物，其活性最高达400倍。对低聚甘露糖和杂化分子没有活性。参见例如Tarentino等人，Glycobiology 1995,5,599，以引证方式纳入本说明书中。
Endo S是一种来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的分泌的内切糖苷酶，并且也属于糖苷水解酶18家族，如由Collin等人(EMBO J.2001,20,3046，以引证方式纳入本说明书中)公开的。与上述的ENGases相比，Endo S具有更确定的特异性，并且仅对人IgGs(迄今为止尚未鉴定出其他底物)的Fc结构域中的保守N-聚糖的裂解具有特异性，这暗示了酶与IgG之间的蛋白质-蛋白质相互作用提供这种特异性。
Endo S49记载于WO 2013/037824(Genovis AB)中，其以引证的方式纳入本说明书中。Endo S49分离自酿脓链球菌NZ131并且是Endo S的同系物。Endo S49对天然IgG具有特异性内切糖苷酶活性并且比Endo S裂解更多种类的Fc聚糖。
在一个优选的实施方案中，该实施方案的步骤(i)中的酶为内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶。在一个进一步优选的实施方案中，所述内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶选自Endo S、Endo S49、Endo F1、Endo F2、Endo F3、Endo H、Endo M、Endo A及其组合。
当待修整的聚糖为复合物类型的双触角结构时，所述内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶优选选自Endo S、Endo S49、Endo F1、Endo F2、Endo F3及其组合。
当待修整的低聚糖为复合物类型的双触角结构(即根据图1(c))，并且其存在于N297的IgG保守N-糖基化位点上时，所述内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶优选选自Endo S、Endo S49、Endo F1、Endo F2、Endo F3及其组合，更优选选自Endo S、Endo S49及其组合。
当待修整的聚糖为复合物类型的双触角结构，并且其不存在于N297的IgG保守N-糖基化位点上时，所述内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶优选选自Endo F1、Endo F2、Endo F3及其组合。
当待修整的聚糖为高甘露糖时，所述内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶优选选自EndoH、Endo M、Endo A和Endo F1。
因此，本发明还涉及一种制备经修饰的糖蛋白的方法，该方法包括以下步骤：
(i)通过内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶的作用来修整包含低聚糖聚糖的糖蛋白的聚糖，以提供包含含有末端GlcNAc-部分的式(101)的聚糖的糖蛋白；以及
(ii)在合适的催化剂存在下，使包含式(101)的聚糖的糖蛋白与Su(A)x-P接触；其中Su(A)x为包含x个官能团A的糖衍生物Su，其中x为1、2、3或4且其中A独立地选自巯基或其前体、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基；其中P为核苷酸；其中合适的催化剂被定义为半乳糖基转移酶或包含突变型催化结构域的半乳糖基转移酶，因为Su(A)x-P为底物；并且其中含有末端GlcNAc-部分的聚糖为式(101)或(102)的聚糖：
Figure BDA0001016023320000351
其中b、d、e和G如上所定义。
优选地，步骤(ii)中的催化剂选自β(1,4)-半乳糖基转移酶、β(1,3)-N-半乳糖基转移酶、包含突变型催化结构域的β(1,4)-半乳糖基转移酶、包含突变型催化结构域的β(1,3)-N-半乳糖基转移酶。所述半乳糖基转移酶在上文中已详细描述。
在一个更优选的实施方案中，所述内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶选自Endo S、EndoS49、Endo F1、Endo F2、Endo F3、Endo H、Endo M、Endo A及其组合。更优选地，所述内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶选自Endo S、Endo S49、Endo F1、Endo F2、Endo F3及其组合。最优选地，所述内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶选自Endo S或Endo S49。
本发明方法的修整步骤(2)优选在合适的缓冲溶液中进行，所述缓冲溶液例如为磷酸盐、缓冲盐水(例如磷酸盐-缓冲盐水、tris-缓冲盐水)、柠檬酸盐、HEPES、tris和甘氨酸。合适的缓冲液是本领域中已知的。优选地，缓冲溶液为磷酸盐-缓冲盐水(PBS)或tris缓冲液。
所述方法优选在温度为约4至约50℃、更优选约10至约45℃、甚至更优选约20至约40℃、且最优选约30至约37℃范围内进行。
所述方法优选在pH为约5至约9、优选约5.5至约8.5、更优选约6至约8范围内进行。最优选地，所述方法在pH为约7至约8范围内进行。
经修饰的糖蛋白
本发明还涉及一种糖蛋白，其可通过本发明的制备经修饰的糖蛋白的方法获得。
经修饰的糖蛋白被定义为包含经修饰的聚糖的糖蛋白，所述聚糖在非还原端含有GlcNAc-Su(A)x二糖-部分，其中Su(A)x为如上所定义。在一个优选的实施方案中，所述糖蛋白为抗体。
在一个优选的实施方案中，所述糖蛋白包含式(105)或(106)的聚糖：
Figure BDA0001016023320000361
其中：
b为0或1；
d为0或1；
e为0或1；
G为单糖，或包含2至20个糖部分的直链或支链的低聚糖；并且
Su(A)x为包含x个官能团A的糖衍生物Su，其中x为1、2、3或4且其中A独立地选自巯基或其前体、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基。
如上所述，在制备本发明的经修饰的糖蛋白的方法中，当官能团A为巯基前体时，所述前体在所述方法中可以转化为巯基。因此，当该方法采用包含巯基前体作为官能团A的糖衍生物Su(A)x进行时，获得包含巯基作为官能团A的经修饰的糖蛋白。
优选地，当d为0时则e为1，且当e为0时则d为1。
G代表单糖，或包含2至20、优选2至12、更优选2至10、甚至更优选2至8且最优选2至6个糖部分的直链或支链的低聚糖。可存在于聚糖中的糖部分是本领域技术人员已知的，且包括例如葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)或唾液酸或木糖(Xyl)。
更优选地，可通过上述方法获得的经修饰的糖蛋白为式(107)或(108)的糖蛋白：
Figure BDA0001016023320000371
其中：
Pr代表蛋白质；
y为1至20；且
Su(A)x、b、d、e和G如上所定义。
在一个优选实施方案中，y为1至12，更优选y为1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选y为1、2、3或4。最优选y为1或2。在另一优选实施方案中，y为2、4、6或8。当待修饰的糖蛋白是抗体，即Pr为Ab时，该实施方案是特别优选的。
在一个优选的实施方案中，经修饰的聚糖(所述聚糖在非还原端含有GlcNAc-Su(A)x二糖-部分)的核心糖部分的C1通过与所述蛋白质中氨基酸残基中的氮原子形成的N-糖苷键键合在所述蛋白质上，更优选键合至天冬酰胺(Asn)或精氨酸(Arg)氨基酸的侧链中的酰胺氮原子上。然而，所述经修饰的聚糖的核心-糖-部分的C1还可以通过与所述蛋白质中氨基酸残基中的氧原子形成的O-糖苷键键合到蛋白质上，更优选键合至丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)氨基酸的侧链中的氧原子上。在该实施方案中，优选所述聚糖的核心-糖-部分为O-GlcNAc-部分或O-GalNAc部分，优选为O-GlcNAc-部分。所述经修饰的聚糖的核心-糖-部分的C1也可以通过与所述蛋白质中的碳原子形成的C-糖苷键键合到蛋白质上，例如键合至色氨酸(Trp)上。如上所述，糖蛋白可以含有多于一个低聚糖链，且可以由N-连接的、O-连接的和C-连接的糖蛋白的组合构成。
所述经修饰的聚糖可以位于蛋白质的天然糖基化位点上，也可以被引入到蛋白质的不同位点上。
在一个优选的实施方案中，所述经修饰的糖蛋白为经修饰的抗体。所述抗体(Ab)包含在非还原端含有GlcNAc-Su(A)x二糖-部分的聚糖。这种抗体在本文中也被称为经修饰的抗体。优选的经修饰的抗体为如上述定义的式(107)或(108)的抗体，其中Pr为Ab。在该实施方案中，进一步优选y为1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选y为1、2、3或4。
如上所述，所述抗体可以为完整抗体，也可以为抗体片段。当抗体为完整抗体时，所述抗体在每条重链上优选包含一个或更多个、更优选一个经修饰的聚糖。因此，所述完整抗体优选包含两个或更多个所述聚糖，优选两个、四个、六个或八个所述聚糖，更优选两个或四个且最优选两个聚糖。换言之，当所述抗体为完整抗体时，y优选为2、4、6或8，更优选y为2或4，且最优选y为2。当抗体为抗体片段时，优选y为1、2、3或4，且更优选y为1或2。
在一个优选的实施方案中，所述抗体为单克隆抗体(mAb)。优选地，所述抗体选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体。更优选地，所述抗体为IgG抗体，且最优选所述抗体为IgG1抗体。
在一个优选的实施方案中，所述经修饰的抗体中的糖蛋白被连接在区域290-305、通常为N297中的天冬酰胺上的Fc-片段中的保守N-糖基化位点上。如上所述，所述经修饰的抗体可以位于蛋白质的天然糖基化位点上，在这种情况下，抗体还可以位于不同的位点。图13示出了单克隆抗体的不同糖形，例如IgG。经修饰的聚糖可以位于重链或轻链的任何位置。
糖衍生物Su(A)x及其优选实施方案在上文中已详细描述。基团A的定义及其优选实施方案，以及制备经修饰的糖蛋白的方法的优选实施方案还适用于可通过所述方法获得的经修饰的糖蛋白。因此，在一个优选的实施方案中，x为1或2，更优选x为1。在另一优选的实施方案中，官能团A为巯基、卤素、卤代乙酰氨基，更优选为卤素。
存在于本发明的经修饰的糖蛋白和经修饰的抗体中的Su(A)x的其他实例包括6-A-6-脱氧半乳糖(6-A-Gal)，例如6-氯-6-脱氧半乳糖(6-ClGal)、6-硫代-6-脱氧半乳糖(6-HSGal)；或2-A-2-脱氧半乳糖(2-A-Gal)，例如2-氯-2-脱氧半乳糖(2-ClGal)、2-硫代-2-脱氧半乳糖(2-HSGal)。或者，A可以作为转而取代羟基的乙酰氨基的一部分而间接地取代在糖衍生物上。实例包括：6-A-乙酰氨基-6-脱氧半乳糖(6-GalNAcA)，例如6-氯乙酰氨基-6-脱氧半乳糖(6-GalNAcCl)、6-硫代乙酰氨基-6-脱氧半乳糖(6-GalNAcSH)；或2-A-乙酰氨基-2-脱氧半乳糖(2-GalNAcA)，例如2-氯乙酰氨基-2-脱氧半乳糖(2-GalNAcCl)、2-硫代乙酰氨基-2-脱氧半乳糖(2-GalNAcSH)。或者，A可以作为转而取代羟基或连接在羟基上的另一官能团的一部分而间接地取代在糖衍生物上。所述另一官能团的实例包括(杂)烷基链或(杂)芳基链。
在一个优选的实施方案中，Su(A)x选自6-GalNAcCl、6-GalNAcSH、2-GalNAcCl和2-GalNAcSH。
在一个优选的实施方案中，Su(A)x包含1或2个官能团A，即优选x为1或2。更优选x为1。在另一优选的实施方案中，Su为半乳糖(Gal)。在一个更优选的实施方案中，x为1或2且Su为Gal,且最优选地，x为1且Su为Gal。
在一个优选的实施方案中，Su(A)x选自6-GalNAcCl、6-GalNAcSH、2-GalNAcCl、2-GalNAcSH、6-ClGal、2-ClGal、2-HSGal和6-HSGal，更优选选自6-GalNAcCl、6-GalNAcSH、2-GalNAcCl、2-GalNAcSH、6-ClGal和2-ClGal。
在一个更优选的实施方案中，x为1且Su(A)x选自6-GalNAcCl、6-GalNAcSH、2-GalNAcCl、2-GalNAcSH、6-ClGal、2-ClGal、2-HSGal和6-HSGal，更优选选自6-GalNAcCl、6-GalNAcSH、2-GalNAcCl、2-GalNAcSH、6-ClGal和2-ClGal。
在本发明的经修饰的糖蛋白的一个优选实施方案中，A为巯基或卤素。所述经修饰的糖蛋白优选为经巯基修饰的糖蛋白或经卤素修饰的糖蛋白。当所述糖蛋白为经卤素修饰的糖蛋白时，优选经氯修饰的糖蛋白、经溴修饰的糖蛋白或经碘修饰的糖蛋白，更优选经氯修饰的糖蛋白或经溴修饰的糖蛋白，且最优选经氯修饰的糖蛋白。更优选地，x为1并且所述经修饰的糖蛋白优选为经巯基修饰的糖蛋白或经卤素修饰的糖蛋白(优选经氯或溴修饰的糖蛋白，最优选经氯修饰的糖蛋白)。
在本发明的经修饰的糖蛋白的一个特别优选的实施方案中，Su(A)x选自2-GalNAcSH、2-GalNAcX、2-GalNAcOS(O)2R8、6-GalNAcSH、6-GalNAcX和6-GalNAcOS(O)2R8。在一个甚至更优选的实施方案中，x为1或2且Su(A)x选自2-GalNAcSH、2-GalNAcX、2-GalNAcOS(O)2R8、6-GalNAcSH、6-GalNAcX和6-GalNAcOS(O)2R8。在一个最优选的实施方案中，x为1且Su(A)x选自2-GalNAcSH、2-GalNAcX、2-GalNAcOS(O)2R8、6-GalNAcSH、6-GalNAcX和6-GalNAcOS(O)2R8。R8及R8的优选实施方案为如上所定义。
当本发明的经修饰的糖蛋白包含巯基时，所述经修饰的糖蛋白可被称为经巯基修饰的糖蛋白。当经修饰的糖蛋白包含卤素时，所述经修饰的糖蛋白可被称为经卤素修饰的糖蛋白。当经修饰的糖蛋白包含磺酰氧基时，所述经修饰的糖蛋白可被称为经磺酰氧基修饰的糖蛋白。当经修饰的糖蛋白包含巯基乙酰氨基时，所述经修饰的糖蛋白可被称为经巯基乙酰氨基修饰的糖蛋白。当经修饰的糖蛋白包含卤代乙酰氨基时，所述经修饰的糖蛋白可被称为经卤代乙酰氨基修饰的糖蛋白。当经修饰的糖蛋白包含磺化的羟基乙酰氨基时，所述经修饰的糖蛋白可被称为经磺化的羟基乙酰氨基修饰的糖蛋白。
本发明还涉及本发明的经修饰的糖蛋白在制备糖蛋白-缀合物中的用途，其中糖蛋白-缀合物被定义为通过接头L缀合至目的分子D上的糖蛋白。
制备糖蛋白-缀合物的方法
本发明还涉及本发明的经修饰的糖蛋白在制备蛋白质-缀合物中的用途。在本文中，蛋白质-缀合物被定义为通过接头(L)缀合至目的分子(D)上的蛋白质。本发明的蛋白质-缀合物可以通过接头(L)缀合到一个或更多个目的分子(D)上。
本发明还涉及本发明的经修饰的糖蛋白在制备抗体-缀合物中的用途，其中抗体-缀合物被定义为通过接头(L)缀合至目的分子(D)上的抗体。
目的分子可以为例如报道分子、诊断分子、活性物质、酶、氨基酸(包括非天然氨基酸)、(非催化作用的)蛋白质、肽、多肽、低聚核苷酸、聚糖、(聚)乙二醇二胺(例如，1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷或包含更长的乙二醇链的等价物)、聚乙二醇链、聚环氧乙烷链、聚丙二醇链、聚环氧丙烷链、1,x-二氨基烷烃(其中x为烷烃中的碳原子数)、叠氮化物或(杂)环炔基部分，优选二价的或双功能的(杂)环炔基部分。在一个优选的实施方案中，目的分子选自氨基酸(特别是赖氨酸)、活性物质、报道分子、叠氮化物和(杂)环炔基部分。
活性物质为药理学的和/或生物学的物质，即具有生物学和/或药理学活性的物质，例如药物或前体药物、诊断剂、氨基酸、蛋白质、肽、多肽、聚糖、脂质、维生素、甾族化合物、核苷酸、核苷、多核苷酸、RNA或DNA。合适的肽标签的实例包括穿透细胞的肽如人乳铁蛋白或聚精氨酸。合适的聚糖的实例是低聚甘露糖。
在一个优选的实施方案中，所述活性物质选自药物和前体药物。更优选地，所述活性物质选自药理学活性物质，特别是低至中间分子量的化合物(例如，约200至约1500Da，优选约300至约1000Da)，例如细胞毒素、抗病毒剂、抗细菌剂、肽和低聚核苷酸。细胞毒素的实例包括喜树碱(camptothecins)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、紫杉烷(taxanes)、刺孢霉素(calicheamycins)、多卡米星(duocarmycins)、美登素(maytansines)、阿里他汀(auristatins)和吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0001016023320000411
(pyrrolobenzodiazepines(PBDs))。优选地，细胞毒素选自秋水仙碱(colchicine)、长春花生物碱(vinca alkaloids)、喜树碱(camptothecins)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、紫杉烷(taxanes)、刺孢霉素(calicheamycins)、微管溶素(tubulysins)、伊立替康(irinotecans)、抑制肽(inhibitory peptide)、鹅膏菌素(amanitin)、de-Bouganin、多卡米星(duocarmycins)、美登素(maytansines)、阿里他汀(auristatins)和吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0001016023320000412
(pyrrolobenzodiazepines(PBDs))。在一个优选的实施方案中，细胞毒素选自喜树碱、多柔比星、柔红霉素、紫杉烷、刺孢霉素、多卡米星、美登素、阿里他汀和吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0001016023320000413
(PBDs)。在另一优选的实施方案中，细胞毒素选自秋水仙碱、长春花生物碱、微管溶素、伊立替康、抑制肽、鹅膏菌素和de-Bouganin。
报道分子是一种容易检测其存在的分子，例如诊断剂、染料、荧光团、放射性同位素标记、造影剂、磁共振成像剂或质量标记。荧光团的实例包括Alexa Fluor(例如AlexaFluor 555)、花青染料(例如Cy3或Cy5)、香豆素衍生物、荧光素、罗丹明、别藻蓝素和色霉素的所有种类。
放射性同位素标记的实例包括99mTc、111In、18F、14C、64Cu、131I或123I，其可通过或可不通过螯合部分如DTPA、DOTA、NOTA或HYNIC连接。
在本发明的蛋白质-缀合物中，目的分子(D)通过接头(L)与抗体缀合。接头或连接单元是本领域中公知的，并在下文中更详细地描述。接头-缀合物在本文中被定义为缀合到目的分子(D)上的接头(L)。本发明的接头-缀合物可以包含一个或多于一个目的分子(D)。所述接头-缀合物优选具有式B-L(D)r，其中D为如上文所定义的，B和L为如下文所定义的，且r为1至20。优选r为1至10，更优选r为1至8，甚至更优选r为1、2、3、4、5或6，甚至更优选r为1、2、3或4，甚至更优选r为1或2，且最优选r为1。
本发明还涉及一种制备糖蛋白-缀合物的方法，所述方法包括使本发明的经修饰的糖蛋白与接头-缀合物反应，其中所述接头-缀合物包含官能团B和一个或更多个目的分子，其中所述官能团B为能够与经修饰的糖蛋白的聚糖上的官能团A反应的官能团，且其中官能团A为如上所定义。
本发明涉及一种制备糖蛋白-缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在合适的催化剂存在下，使包含含有末端GlcNAc-部分的聚糖的糖蛋白与Su(A)x-P接触以获得经修饰的糖蛋白；其中Su(A)x为包含x个官能团A的糖衍生物Su，其中x为1、2、3或4且其中A独立地选自巯基或其前体、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基；其中P为核苷酸；其中合适的催化剂被定义为半乳糖基转移酶或包含突变型催化结构域的半乳糖基转移酶，因为Su(A)x-P为底物；并且其中含有末端GlcNAc-部分的聚糖为式(101)或(102)的聚糖：
Figure BDA0001016023320000421
其中：
b为0或1；
d为0或1；
e为0或1；且
G为单糖或含有2至20个糖部分的直链或支链的低聚糖；
以及
(b)使经修饰的糖蛋白与接头-缀合物反应，其中所述接头-缀合物包含官能团B和一个或更多个目的分子(D)，其中所述官能团B为能够与经修饰的糖蛋白的聚糖上的官能团A反应的官能团，且其中官能团A独立地选自巯基、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基。
在制备糖蛋白-缀合物的方法的一个优选实施方案中，Su(A)x包含1或2个官能团A，即优选x为1或2，更优选x为1。在另一优选的实施方案中，Su为半乳糖(Gal)。在一个更优选的实施方案中，x为1或2且Su为Gal，并且最优选地，x为1且Su为Gal。在这些优选的实施方案中，进一步优选接头-缀合物包含1或2且最优选1个目的分子。
在一个优选的实施方案中，Su(A)x选自6-GalNAcCl、6-GalNAcSH、2-GalNAcCl、2-GalNAcSH、6-ClGal、2-ClGal、2-HSGal和6-HSGal，更优选选自6-GalNAcCl、6-GalNAcSH、2-GalNAcCl、2-GalNAcSH、6-ClGal和2-ClGal。在这些优选的实施方案中，进一步优选接头-缀合物包含1或2且最优选1个目的分子。
在一个更优选的实施方案中，x为1且Su(A)x选自6-GalNAcCl、6-GalNAcSH、2-GalNAcCl、2-GalNAcSH、6-ClGal、2-ClGal、2-HSGal和6-HSGal，更优选选自6-GalNAcCl、6-GalNAcSH、2-GalNAcCl、2-GalNAcSH、6-ClGal和2-ClGal。在这些优选的实施方案中，进一步优选接头-缀合物包含1或2且最优选1个目的分子。
在本发明的经修饰的抗体的一个特别优选的实施方案中，Su(A)x选自2-GalNAcSH、2-GalNAcX、2-GalNAcOS(O)2R8、6-GalNAcSH、6-GalNAcX和6-GalNAcOS(O)2R8。在一个甚至更优选的实施方案中，x为1或2且Su(A)x选自2-GalNAcSH、2-GalNAcX、2-GalNAcOS(O)2R8、6-GalNAcSH、6-GalNAcX和6-GalNAcOS(O)2R8。在一个最优选的实施方案中，x为1且Su(A)x选自2-GalNAcSH、2-GalNAcX、2-GalNAcOS(O)2R8、6-GalNAcSH、6-GalNAcX和6-GalNAcOS(O)2R8。在这些优选的实施方案中，进一步优选接头-缀合物包含1或2且最优选1个目的分子。X和R8及其优选实施方案为如上所定义。优选X为Cl。
本发明还涉及一种制备糖蛋白-缀合物的方法，所述方法包括使本发明的经修饰的糖蛋白与接头-缀合物反应，其中所述接头-缀合物包含官能团B和一个或更多个目的分子，其中所述官能团B为能够与经修饰的糖蛋白的聚糖上的官能团A反应的官能团，且其中官能团A独立地选自巯基、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基。
用于制备本发明的蛋白质-缀合物的合适的接头-缀合物为包含官能团B和目的分子的接头-缀合物。接头(L)，也被称为连接单元，在本领域内是公知的。在如本文所述的接头-缀合物中，如上所述，L被连接在目的分子(D)以及官能团(B)上。用于将所述官能团(B)和所述目标分子(D)连接至L的许多方法是本领域中已知的。如本领域技术人员清楚的是，用于将官能团(B)连接至接头的一端以及将目的分子(D)连接在接头的另一端的合适方法的选择取决于官能团(B)、接头(L)和目的分子(D)的确切性质。
接头可以具有一般结构F1-L(F2)r，其中F1代表官能团B或能与如上所述的官能团B上的官能团F反应的官能团，例如(杂)环炔基、端炔基、伯胺、氨基氧基、偕腙肼基(hydrazylgroup)、叠氮基、N-马来酰亚氨基、乙酰氨基或巯基。F2代表能与目的分子上的官能团F反应的官能团。
由于多于一个目的分子可被键合到接头上，因此多于一个官能团F2可存在于L上。如上所述，r为1至20，优选1至10，更优选1至8，甚至更优选1、2、3、4、5或6，甚至更优选1、2、3或4，且最优选为1或2。
L可以例如选自直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200亚环烷基、C5-C200亚环烯基、C8-C200亚环炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基、C9-C200芳基亚炔基。任选地，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基可以被取代，并且任选地所述基团可被一个或更多个杂原子中断，优选1至100个杂原子，所述杂原子优选选自O、S和NR5，其中R5独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基。最优选地，所述杂原子为O。
F、F1和F2例如可以独立地选自氢、卤素、R5、C4-C10(杂)环炔基、-CH＝C(R5)2、-C≡CR5、-[C(R5)2C(R5)2O]q-R5(其中q为1至200)、-CN、-N3、-NCX、-XCN、-XR5、-N(R5)2、-+N(R5)3、-C(X)N(R5)2、-C(R5)2XR5、-C(X)R5、-C(X)XR5、-S(O)R5、-S(O)2R5、-S(O)OR5、-S(O)2OR5、-S(O)N(R5)2、-S(O)2N(R5)2、-OS(O)R5、-OS(O)2R5、-OS(O)OR5、-OS(O)2OR5、-P(O)(R5)(OR5)、-P(O)(OR5)2、-OP(O)(OR5)2、-Si(R5)3、-XC(X)R5、-XC(X)XR5、-XC(X)N(R5)2、-N(R5)C(X)R5、-N(R5)C(X)XR5和-N(R5)C(X)N(R5)2，其中X为氧或硫且其中R5为如上所定义。
合适的连接单元的实例包括(聚)乙二醇二胺(例如，1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷或包含更长的乙二醇链的等价物)、聚乙二醇或聚环氧乙烷链、聚丙二醇或聚环氧丙烷链和1,x-二氨基烷烃(其中x为烷烃中的碳原子数)。
另一类合适的接头包括可裂解的接头。可裂解的接头是本领域中已知的。例如Shabat等人，Soft Matter 2012,6,1073(以引证方式纳入本说明书)，公开了包括了在生物触发(例如酶裂解或氧化作用)时释放的自我分解(self-immolative)部分的可裂解的接头。合适的可裂解的接头的一些实例为被蛋白酶(例如组织蛋白酶、血纤维蛋白溶酶或金属蛋白酶)特异性识别时裂解的肽-接头，或在被糖苷酶(例如葡糖苷酸酶)特异性识别时裂解的基于糖苷的接头，或在贫氧的、缺氧区域内被还原的硝基芳族化合物。
当A为巯基时，经巯基修饰的糖蛋白与接头-缀合物的连接优选通过迈克尔(Michael)加成反应或亲核取代反应或巯基-烯反应进行。然后，对于迈克尔加成而言，官能团B优选为N-马来酰亚氨基，对于亲核取代反应而言，官能团B优选为卤代乙酰氨基，或对于巯基-烯反应而言，官能团B优选为端烯基。因此，接头-缀合物优选为X-CH2C(O)NHL(D)r或X-CH2C(O)N[L(D)r]2，其中X为F、Cl、Br或I，或如下文所示的马来酰亚胺-接头-缀合物(120)。
Figure BDA0001016023320000451
当A为经卤素修饰的糖蛋白、经卤代乙酰氨基修饰的糖蛋白、经磺酰氧基修饰的糖蛋白或经磺化的羟基乙酰氨基修饰的糖蛋白时，所述经修饰的糖蛋白与接头-缀合物的连接优选通过与巯基反应形成硫醚来进行。当A为卤素、卤代乙酰氨基、磺酰氧基或磺化的羟基乙酰氨基时，所述经修饰的糖蛋白与接头-缀合物的连接优选通过与巯基反应形成硫醚来进行。换言之，当经修饰的糖蛋白为经卤素修饰的糖蛋白、经卤代乙酰氨基修饰的糖蛋白、经磺酰氧基修饰的糖蛋白或经磺化的羟基乙酰氨基修饰的糖蛋白时，所述经修饰的糖蛋白与接头-缀合物的连接优选通过与巯基反应形成硫醚来进行。
然后，官能团B优选包含巯基，且优选的接头-缀合物为HS-L(D)r。然而，官能团B还可以包含醇基或氨基。
特别地，本发明涉及一种制备糖蛋白-缀合物的方法，其中：
(a)当所述经修饰的糖蛋白为经卤素修饰的糖蛋白或经卤代乙酰氨基修饰的糖蛋白时，官能团B包含巯基、醇基或氨基；或
(b)当所述经修饰的糖蛋白为经巯基修饰的糖蛋白或经巯基乙酰氨基修饰的糖蛋白时，官能团B包含N-马来酰亚氨基或卤代乙酰氨基或烯基；或
(c)当所述经修饰的糖蛋白为经磺酰氧基修饰的糖蛋白或经磺化的羟基乙酰氨基修饰的糖蛋白时，官能团B包含巯基、醇基或氨基。
当所述经修饰的糖蛋白为经卤素修饰的糖蛋白且官能团B包含巯基时，所述巯基可以为脂肪族或芳香族巯基。在一个优选的实施方案中，所述巯基为芳香族巯基。
在一个优选的实施方案中，所述经修饰的糖蛋白为经巯基修饰的糖蛋白且官能团B包含N-马来酰亚氨基或卤代乙酰氨基。
在另一优选的实施方案中，所述经修饰的糖蛋白为经巯基修饰的糖蛋白且官能团B包含联烯酰氨基。因此，本发明还涉及一种制备糖蛋白-缀合物的方法，其中所述经修饰的糖蛋白为经巯基修饰的糖蛋白且官能团B包含联烯酰氨基。
本发明还涉及本发明的糖蛋白在制备糖蛋白-缀合物中的用途，其中糖蛋白-缀合物被定义为通过接头L缀合到目的分子D上的糖蛋白。
糖蛋白-缀合物
本发明还涉及一种可通过本发明的制备糖蛋白-缀合物的方法获得的糖蛋白-缀合物。
在一个优选的实施方案中，本发明的糖蛋白-缀合物为抗体-缀合物。
在另一优选的实施方案中，目的分子D选自报道分子、活性物质、酶、氨基酸、蛋白质、肽、多肽、低聚核苷酸、聚糖、(聚)乙二醇二胺、聚乙二醇链、聚环氧乙烷链、聚丙二醇链、聚环氧丙烷链和1,x-二氨基烷烃(其中x为烷烃中的碳原子数且x为1-200)、叠氮化物或(杂)环炔基部分，优选二价的或双功能的(杂)环炔基部分。
特别地，本发明涉及一种可通过包括下列步骤的方法获得的糖蛋白-缀合物：
(a)在合适的催化剂存在下，使包含含有末端GlcNAc-部分的聚糖的糖蛋白与Su(A)x-P接触以获得经修饰的糖蛋白；其中Su(A)x为包含x个官能团A的糖衍生物Su，其中x为1、2、3或4且其中A独立地选自巯基或其前体、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基；其中P为核苷酸；其中合适的催化剂被定义为半乳糖基转移酶或包含突变型催化结构域的半乳糖基转移酶，因为Su(A)x-P为底物；并且其中含有末端GlcNAc-部分的聚糖为式(101)或(102)的聚糖：
Figure BDA0001016023320000471
其中：
b为0或1；
d为0或1；
e为0或1；且
G为单糖或含有2至20个糖部分的直链或支链的低聚糖；
以及
(b)使经修饰的糖蛋白与接头-缀合物反应，其中所述接头-缀合物包含官能团B和一个或更多个目的分子(D)，其中所述官能团B为能够与经修饰的糖蛋白的聚糖上的官能团A反应的官能团，且其中官能团A独立地选自巯基、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基。
步骤(a)或(b)的方法以及它们的优选实施方案在上文中进行了详细描述。
当经巯基修饰的糖蛋白与包含官能团B的接头-缀合物反应，其中官能团B含有N-马来酰亚胺时，优选本发明的糖蛋白-缀合物具有式(121)或(122)：
Figure BDA0001016023320000481
其中：
Pr代表蛋白质；
L为接头；
D为目的分子；
r为1至20；
x为1、2、3或4；
y为1至20；
b为0或1；
d为0或1；
e为0或1；
p为0或1；
Q为-N(H)C(O)CH2-或CH2；
Su为糖或糖衍生物；并且
G为单糖或含有2至20个糖部分的直链或支链的低聚糖。
p的值和Q的性质取决于经修饰的糖或糖衍生物Su(A)x的性质，所述经修饰的糖或糖衍生物Su(A)x用于依据本发明的方法制备糖蛋白-缀合物。如果在Su(A)x中，巯基存在于所述糖或糖衍生物的C2、C3或C4位上(而不是糖的OH基团上)，则p为0。如果Su(A)x为2-(巯基乙酰氨基)-2-脱氧糖衍生物(即巯基乙酰氨基位于所述糖或糖衍生物的C2上)，Su(A)x为例如GalNAcSH或GlcNAcSH，则p为1且Q为-N(H)C(O)CH2-。如果Su(A)x中，巯基存在于所述糖或糖衍生物的C6位上，则p为1且Q为-CH2-。
当经巯基修饰的糖蛋白与包含官能团B的接头-缀合物反应，其中官能团B含有卤代乙酰氨基时，优选本发明的糖蛋白-缀合物具有式(123)或(124)：
Figure BDA0001016023320000491
其中Pr、L、D、r、x、y、b、d、e、p、Q、Su和G为如上对于式(121)和(122)中的定义，且R9选自L(D)r、氢、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C7-C24烷基芳基和C7-C24芳基烷基，所述C1-C24烷基、C6-C24芳基、C7-C24烷基芳基和C7-C24芳基烷基任选地被取代。优选地，R9选自L(D)r、氢、C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C12烷基芳基和C7-C12芳基烷基，所述C1-C12烷基、C6-C12芳基、C7-C12烷基芳基和C7-C12芳基烷基任选地被取代。更优选地，R9选自L(D)r、氢、C1-C6烷基、C6-C12芳基、C7-C12烷基芳基和C7-C12芳基烷基，所述C1-C6烷基、C6-C12芳基、C7-C12烷基芳基和C7-C12芳基烷基任选地被取代。甚至更优选地，R9为H、C1、C2、C4或C4烷基或C6-C12芳基。最优选地，R9为H或甲基。
同样在该实施方案中，p的值和Q的性质取决于经修饰的糖或糖衍生物Su(A)x的性质，所述经修饰的糖或糖衍生物Su(A)x用于依据本发明的方法制备糖蛋白-缀合物中。如果在Su(A)x中，卤素存在于所述糖或糖衍生物的C2、C3或C4位上(而不是糖的OH基团上)，则p为0。如果Su(A)x为2-(氯乙酰氨基)-2-脱氧糖衍生物(即卤代乙酰氨基位于所述糖或糖衍生物的C2上)，Su(A)x为例如GalNAcCl或GlcNAcCl，则p为1且Q为-N(H)C(O)CH2-。如果在Su(A)x中，卤素存在于所述糖或糖衍生物的C6位上，则p为1且Q为-CH2-。
当经巯基修饰的糖蛋白与包含官能团B的接头-缀合物反应，其中官能团B含有联烯酰氨基时，优选本发明的糖蛋白-缀合物具有式(125)或(126)：
Figure BDA0001016023320000501
其中Pr、L、D、r、x、y、b、d、e、p、Q、Su、G和R9为如上所定义。
同样在(125)和(126)中，p的值和Q的性质取决于经修饰的糖或糖衍生物Su(A)x的性质，所述经修饰的糖或糖衍生物Su(A)x用于依据本发明的方法制备糖蛋白-缀合物中。如果在Su(A)x中，巯基存在于所述糖或糖衍生物的C2、C3或C4位上(而不是糖的OH基团上)，则p为0。如果Su(A)x为2-(巯基乙酰氨基)-2-脱氧糖衍生物(即巯基乙酰氨基位于所述糖或糖衍生物的C2上)，Su(A)x为例如GalNAcSH或GlcNAcSH，则p为1且Q为-N(H)C(O)CH2-。如果在Su(A)x中，巯基存在于所述糖或糖衍生物的C6位上，则p为1且Q为-CH2-。
当G为直链或支链的低聚糖时，优选G包含2至12个、更优选2至10、甚至更优选2至8个且最优选2至6个糖部分。在另一优选的实施方案中，y为1至12，更优选y为1、2、3、4、5、6、7或8，且甚至更优选y为1、2、3或4。最优选y为1或2。在又一优选的实施方案中，y为2、4、6或8。当待修饰的糖蛋白为抗体，即Pr为Ab时，该实施方案是特别优选的。
优选地，r为1至10，更优选为1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选为1、2、3或4，甚至更优选为1或2，且最优选r为1。
在一个优选的实施方案中，y为1至12，更优选y为1、2、3、4、5、6、7或8，且甚至更优选y为1、2、3或4。最优选y为1或2。在又一优选的实施方案中，y为2、4、6或8。当待修饰的糖蛋白为抗体，即Pr为Ab时，该实施方案是特别优选的。
在一个优选的实施方案中，糖蛋白-聚糖的核心-糖部分的C1通过与所述蛋白质中氨基酸残基中的氮原子形成的N-糖苷键键合至蛋白质上，更优选键合至天冬酰胺(Asn)或精氨酸(Arg)氨基酸的侧链中的酰胺氮原子上。然而，所述聚糖的核心-糖-部分的C1还可以通过与所述蛋白质中氨基酸残基中的氧原子形成的O-糖苷键键合至蛋白质上，更优选键合至丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)氨基酸的侧链上的氧原子上。在该实施方案中，优选所述聚糖的核心-糖-部分为O-GlcNAc-部分或O-GalNAc部分，优选为O-GlcNAc-部分。所述聚糖的核心-糖-部分的C1还可以通过与所述蛋白质中的碳原子形成的C-糖苷键键合至蛋白质上，例如键合至色氨酸(Trp)上。如上所述，糖蛋白可以含有多于一个低聚糖链，且可以由N-连接的、O-连接的和C-连接的糖蛋白的组合构成。
所述经修饰的聚糖可以位于蛋白质的天然糖基化位点上，也可以被引入到蛋白质的不同位点上。
在一个优选的实施方案中，所述糖蛋白-缀合物为抗体-缀合物，所述抗体包含在非还原端含有GlcNAc-Su(A)x二糖-部分的聚糖。这种抗体在本文中被称为经修饰的抗体。优选的经修饰的抗体为如上所定义的式(107)或(108)的抗体，其中Pr为Ab。在该实施方案中，进一步优选y为1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选y为1、2、3或4。
如上所述，所述抗体可以为完整抗体，也可以为抗体片段。当抗体为完整抗体时，所述抗体在每条重链上优选包含一个或更多个、更优选一个经修饰的聚糖。因此，所述完整抗体优选包含两个或更多个所述聚糖，优选两个、四个、六个或八个所述聚糖，更优选两个或四个且最优选两个聚糖。换言之，当所述抗体为完整抗体时，y优选为2、4、6或8，更优选y为2或4，且最优选y为2。当抗体为抗体片段时，优选y为1、2、3或4，且更优选y为1或2。
在一个优选的实施方案中，所述抗体为单克隆抗体(mAb)。优选地，所述抗体选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体。更优选地，所述抗体为IgG抗体，且最优选所述抗体为IgG1抗体。
在一个优选的实施方案中，经修饰的抗体中的糖蛋白被连接在区域290-305、通常是N297中的天冬酰胺的Fc-片段中的保守N-糖基化位点上。
糖衍生物Su(A)x及其优选实施方案在上文中已详细描述。制备经修饰的糖蛋白的方法的优选实施方案还适用于通过所述方法获得的经修饰的糖蛋白。因此，在一个优选的实施方案中，x为1或2，更优选x为1。在另一优选的实施方案中，官能团A为巯基、卤素、卤代乙酰氨基，更优选卤素。
存在于本发明经修饰的抗体中的Su(A)x的其他实例包括6-A-6-脱氧半乳糖(6-A-Gal)，例如6-氯-6-脱氧半乳糖(6-ClGal)、6-硫代-6-脱氧半乳糖(6-HSGal)；或2-A-2-脱氧半乳糖(2-A-Gal)，例如2-氯-2-脱氧半乳糖(2-ClGal)、2-硫代-2-脱氧半乳糖(2-HSGal)。或者，A可以作为转而取代羟基的乙酰氨基的一部分而间接地取代在糖衍生物上。实例包括6-A-乙酰氨基-6-脱氧半乳糖(6-GalNAcA)，例如6-氯乙酰氨基-6-脱氧半乳糖(6-GalNAcCl)、6-硫代乙酰氨基-6-脱氧半乳糖(6-GalNAcSH)；或2-A-乙酰氨基-2-脱氧半乳糖(2-GalNAcA)，例如2-氯乙酰氨基-2-脱氧半乳糖(2-GalNAcCl)、2-硫代乙酰氨基-2-脱氧半乳糖(2-GalNAcSH)。或者，A可以作为转而取代羟基或连接在羟基上的另一官能团的一部分而间接地取代在糖衍生物上。所述另一官能团的实例包括(杂)烷基链或(杂)芳基链。
在本发明糖蛋白-缀合物的一个优选的实施方案中，y为1、2、3或4(优选2或4)和/或x为1或2(优选1)。
在一个优选的实施方案中y为1至12，更优选y为1、2、3、4、5、6、7或8，且甚至更优选y为1、2、3或4。最优选y为1或2。在另一优选的实施方案中，y为2、4、6或8。当待修饰的糖蛋白为抗体，即Pr为Ab时，该实施方案是特别优选的。
在一个更优选的实施方案中y为1、2、3或4(优选2或4)和/或x为1或2(优选1)，更优选y为1或2且x为1或2(优选1)，甚至更优选y为1或2且x为1。
在一个优选的实施方案中，经修饰的聚糖(所述聚糖在非还原端含有GlcNAc-Su(A)x二糖-部分)的核心-糖部分的C1通过与所述蛋白质中氨基酸残基中的氮原子形成的N-糖苷键键合至蛋白质上，更优选键合到天冬酰胺(Asn)或精氨酸(Arg)氨基酸的侧链中的酰胺氮原子上。然而，所述经修饰的聚糖的核心-糖-部分的C1还可以通过与所述蛋白质中氨基酸残基中的氧原子形成的O-糖苷键键合至蛋白质上，更优选键合至丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)氨基酸的侧链的氧原子上。在该实施方案中，优选所述聚糖的核心-糖-部分为O-GlcNAc部分或O-GalNAc部分，优选O-GlcNAc部分。所述经修饰的聚糖的核心-糖-部分的C1还可以通过与所述蛋白质中碳原子形成的C-糖苷键键合至蛋白质上，例如键合至色氨酸(Trp)上。如上所述，糖蛋白可以含有多于一个低聚糖链，且可以由N-连接的、O-连接的和C-连接的糖蛋白的组合构成。
所述经修饰的聚糖可以位于蛋白质的天然糖基化位点上，也可以被引入到蛋白质的不同位点上。
在一个优选的实施方案中，所述经修饰的糖蛋白为经修饰的抗体(Ab)，所述抗体包含在非还原端含有GlcNAc-Su(A)x二糖-部分的聚糖。这种抗体在本文中还被称为经修饰的抗体。优选的经修饰的抗体为如上所定义的式(107)或(108)的抗体，其中Pr为Ab。在该实施方案中，进一步优选y为1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选y为1、2、3或4。
如上所述，所述抗体可以为完整抗体，也可以为抗体片段。当抗体为完整抗体时，所述抗体在每条重链上优选包含一个或更多个、更优选一个经修饰的聚糖。因此，所述完整抗体优选包含两个或更多个所述聚糖，优选两个、四个、六个或八个所述聚糖，更优选两个或四个且最优选两个聚糖。换言之，当所述抗体为完整抗体时，y优选为2、4、6或8，更优选y为2或4，且最优选y为2。当抗体为抗体片段时，优选y为1、2、3或4，且更优选y为1或2。
进一步优选y为1、2、3或4且x为1或2，并且进一步优选y为2或4且x为1。
在一个优选的实施方案中，所述抗体为单克隆抗体(mAb)。优选地，所述抗体选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体。更优选地，所述抗体为IgG抗体，且最优选所述抗体为IgG1抗体。
在一个优选的实施方案中，经修饰的抗体中的糖蛋白被连接在区域290-305、通常是N297中的天冬酰胺的Fc-片段中的保守N-糖基化位点上。
糖衍生物Su(A)x及其优选实施方案在上文中已详细描述。制备经修饰的糖蛋白的方法的优选实施方案还适用于通过所述方法获得的经修饰的糖蛋白。因此，在一个优选的实施方案中，x为1或2，更优选x为1。在另一优选的实施方案中，官能团A为巯基、卤素、卤代乙酰氨基，更优选卤素。
抗体-药物缀合物
本发明特别涉及一种可通过制备糖蛋白的方法获得的糖蛋白-缀合物，其中所述糖蛋白-缀合物为抗体-缀合物。抗体-缀合物在本文中被定义为通过接头(L)被缀合到目的分子(D)上的抗体。本发明的抗体-缀合物可以通过接头(L)缀合到一个或更多个目的分子(D)上。以上所公开的对于糖蛋白-缀合物的优选实施方案同样适用于抗体-缀合物。
在一个更优选的实施方案中，本发明的抗体-缀合物为抗体-药物缀合物(ADC)。抗体-药物缀合物在本文中被定义为通过接头(L)被缀合到目的分子(D)上的抗体，其中D选自药理学活性物质，且更优选D选自药物或前体药物。
更优选地，所述活性物质选自药理学活性物质，特别是低至中间分子量(例如，约200至约1500Da，优选约300至约1000Da)的化合物，例如细胞毒素、抗病毒剂、抗细菌剂、肽和低聚核苷酸。细胞毒素的实例包括秋水仙碱、长春花生物碱、喜树碱、多柔比星、柔红霉素、紫杉烷、刺孢霉素、微管溶素、伊立替康、抑制肽、鹅膏菌素、de-Bouganin、多卡米星、美登素、阿里他汀和吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0001016023320000551
(PBDs)。在一个优选的实施方案中，细胞毒素选自喜树碱、多柔比星、柔红霉素、紫杉烷、刺孢霉素、多卡米星、美登素、阿里他汀和吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0001016023320000552
(PBDs)。在另一优选的实施方案中，细胞毒素选自秋水仙碱、长春花生物碱、微管溶素、伊立替康、抑制肽、鹅膏菌素和de-Bouganin。
因此，本发明还涉及可通过本发明的制备抗体-缀合物的方法获得的抗体-缀合物。
本发明还涉及本发明的抗体-缀合物，其用作药物，其中所述目的分子D为活性物质。
本发明还涉及本发明的抗体-缀合物用于治疗癌症的用途，其中所述目的分子D为活性物质。
本发明还涉及本发明的抗体-缀合物，其用于治疗乳腺癌、更优选用于治疗HER2-阳性乳腺癌，其中所述目的分子D为活性物质。
本发明还涉及一种治疗癌症的方法，包括将治疗有效量的本发明的抗体-缀合物给予需要其的受试者。
本发明还涉及一种治疗乳腺癌的方法，包括将治疗有效量的本发明的抗体-缀合物给予需要其的受试者。
本发明还涉及一种治疗HER2-阳性乳腺癌的方法，包括将治疗有效量的本发明的抗体-缀合物给予需要其的受试者。
本发明的经修饰的抗体、抗体-缀合物及其制备方法具有若干比本领域已知的方法、经修饰的抗体和抗体-缀合物更好的优点。
如上所述，本领域中已知的用于接头-毒素与抗体缀合的方法仍然需要在位点-特异性和化学计量的控制方面进行改进。尽管ADC具有导向(home in)其靶标的能力，但估计进入癌细胞的药物的量通常小于给药剂量的2％。该问题被本领域已知的ADC的不可预测的缀合结果放大。重要的是，避免过少缀合(underconjugated)的抗体，其降低了效力；以及过度缀合的种类，其可能具有显著降低的循环半衰期、减弱的与靶蛋白的结合以及增加的毒性。
对于抗体-药物缀合物，目的分子(例如药物、活性物质)向抗体上的负载的量度为所谓的药物与抗体比例(DAR)，其给出了根据统计学分布计算的每个抗体上活性物质分子的平均数量。特定类型的ADC的DAR理论最大值等于锚定位点的数目。如上所述，现有技术中已知的制备ADC的方法通常产生包含每个抗体-缀合物上存在不同数量的目的分子的抗体-缀合物的混合物的产物，以及具有高标准偏差的DAR。
本发明的经修饰的抗体和抗体-缀合物的优点之一是，这些抗体和抗体-缀合物在位点-特异性和化学计量两个方面是同质的。所获得的所述经修饰的抗体和抗体-缀合物具有非常接近理论值的DAR以及非常低的标准差。这还意味着本发明的抗体-缀合物产生了更一致的产物用于临床前测试。通过本文中所述的方法制备的抗体-缀合物的同质性例如在图9中给出的MS图谱中变得清晰。
本发明的方法和抗体的另一优点涉及减少生产中的浪费，从而优化了公司的商品成本。
当本发明的经巯基修饰的抗体耦合到包含马来酰亚氨基的接头-缀合物上时，该方法在本领域是公知的，高度稳健和有效。马来酰亚氨基缀合物的一些实例在图8和图11中提供。已经描述了许多马来酰亚胺-功能化的毒素，因为目前用于抗体-药物缀合的优选方法涉及mAb的半胱氨酸突变体(THIOmAb)与毒素的马来酰亚胺衍生物的结合。众所周知，这种巯基-马来酰亚胺缀合物可用高度有利的化学计量下的反应物(稍微过量的马来酰亚胺组分)制备。同样众所周知的是，所获得的巯基-马来酰亚胺缀合物可以具有有限的稳定性，但如果巯基位于岩藻糖上，则稳定性会显著增强。当本发明的经巯基修饰的抗体耦合到包含毒素的卤代乙酰胺衍生物的接头-缀合物上时，该方法在马来酰亚胺缀合方面的效率可能会稍微降低并且可发生更多不期望的替代缀合(例如在赖氨酸侧链上)，但是所期望的产物是不可逆地形成的(高稳定性的)硫醚缀合物。当本发明的经巯基修饰的抗体耦合到包含毒素的联烯酰胺衍生物的接头-缀合物上时，该方法在马来酰亚胺缀合方面的效率可能会稍微降低并且可能不会发生不期望的替代缀合(例如在赖氨酸侧链上)，而所期望的产物是不可逆地形成的(高稳定性的)硫醚缀合物。联烯酰胺结构的实例在图6中提供。当本发明的经卤素修饰的抗体耦合到包含含有亲核基团(巯基、醇基、氨基)的毒素衍生物的接头-缀合物，例如在图6中表示的含巯基的结构上时，所得的缀合物为硫醚(例如在图8和10中表示的结构)、常规醚或氨基醚，所有上述结构均是不可逆地形成的。与用于缀合到含游离巯基的蛋白质(如在THIOmAbs或在含巯基岩藻糖基的mAb)上的卤代乙酰胺的使用相比，卤代糖底物中的酶催化引入并没有通过与其他氨基酸(例如赖氨酸)的亲核侧链的竞争性的非特异性反应而减少。非特异性反应的缺乏还与随后的缀合步骤相关，在这种情况下，将过量的官能团的亲核衍生物应用于卤代mAb。
使用卤代抗体的一个特定的优点是，其提供了进行毒性有效负载(payload)的两阶段缀合的机会。例如如在图10中说明的，卤代抗体与携带悬垂的叠氮化物的苯硫酚衍生物的反应提供了一种中间体，该中间体可用作借助无铜点击化学引入毒性有效负载的起点。通过应用上述两阶段方法，(便宜且无毒的)苯硫酚衍生物的化学计算量可较高，而(昂贵且高毒性的)有效负载的化学计算量可保持较低。
使用含巯基的抗体的另一特别的优点是，其提供了进行毒性有效负载的两阶段缀合的机会。例如如在图11中说明的，含巯基的抗体与携带悬垂的叠氮化物的联烯酰胺衍生物的反应提供了一种稳定的中间体，该中间体可用作借助无铜点击化学引入毒性有效负载的起点(在该实例中，生物素被用作毒性有效负载的代表)。通过应用上述两阶段方法，(便宜且无毒的)联烯酰胺的化学计算量可以较高，而(昂贵且高毒性的)有效负载的化学计算量可以保持较低。
因此，另一优点是本发明的抗体-缀合物的稳定性以及用于将巯基、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基引入到抗体上的直接且普遍适用的方法。
通过本文中描述的方法制备含巯基的抗体的一个额外的优点是起始的UDP-糖很容易合成，如图12所示例的。
最后，经由聚糖链连接而制备抗体缀合物的一个优点是提供了借助天然抗体的糖诱变工程而制备大量异构体的机会。天然抗体的不同糖形(其中R＝聚糖)的实例描述在图13中。
实施例
合成
实施例1-5：UDP-GalNAc衍生物28-31的合成
图Y示出了如在实施例1-4中进行的从24开始合成UDP-GalNAc衍生物28-31的反应方案。
实施例1.UDP-GalNH2的合成
化合物24是根据在Linhardt等人，J.Org.Chem.2012,77,1449-1456中描述的用于D-葡糖胺的步骤由D-半乳糖胺制备的。
1H-NMR(300MHz,CD3OD):δ5.69(dd,J＝6.84、6.84Hz，1H)、5.43-5.41(m,1H)、5.35(dd,J＝10.9、3.4Hz，1H)、4.54(t,J＝6.48Hz，1H)、4.23-4.12(m,1H)、4.04(dd,J＝10.9、6.1Hz，1H)、3.82(dt,J＝11.1、2.7Hz，1H)、2.12(s,3H)、2.00(s,3H)、1.99(s,3H)。对于C12H18N3O11(M-H+)的LRMS(ESI-)计算值为410.06,实测值为410.1。
然后，根据Baisch等人，Bioorg.Med.Chem.,1997,5,383-391将化合物24耦合到UMP上。
因此，将D-尿苷-5'-单磷酸二钠盐(1.49g，4.05mmol)于H2O(15mL)中的溶液用DOWEX 50Wx8(H+型)处理30min，然后过滤。在室温下剧烈搅拌滤液，同时滴加三丁基胺(0.966mL，4.05mmol)。继续搅拌30min后，将反应混合物冻干，并在真空下使用P2O5继续干燥5小时。
在氩气气氛下，将所得三丁基铵尿苷-5'-单磷酸溶于无水DMF(25mL)中。加入羰二咪唑(1.38g，8.51mmol)并将反应混合物在室温下搅拌30min。接着，加入无水MeOH(180μL)，并搅拌15min以除去过量的CDI。在高真空下除去剩余的MeOH，持续15min。随后，将化合物24(2.0g，4.86mmol)溶于无水DMF(25mL)中并滴加到该反应混合物中。在真空浓缩之前将反应物在室温下搅拌2天。咪唑-UMP中间体的消耗量通过MS监测。利用快速色谱法(7:2:1-5:2:1EtOAc:MeOH:H2O)得到产物25(1.08g，1.51mmol，37％)。
1H-NMR(300MHz,D2O):δ7.96(d,J＝8.0Hz,1H)、5.98-5.94(m,2H)、5.81-5.79(m,1H)、5.70(dd,J＝7.1、3.3Hz,1H)、5.49(dd,J＝15.2、2.6Hz,1H)、5.30(ddd,J＝18.5、11.0、3.2Hz,2H)、4.57(q,J＝6.0Hz,2H)、4.35-4.16(m,9H)、4.07-3.95(m,2H)、2.17(s,3H)、2.08(s,3H)、2.07(s,3H)。
对于C21H29N5O19P2(M-H+)的LRMS(ESI-)计算值为716.09，实测值为716.3。
根据Kiso等人，Glycoconj.J.,2006,23,565-573对化合物25进行脱乙酰化。
因此，将化合物25(222mg，0.309mmol)溶于H2O(2.5mL)中并加入三乙胺(2.5mL)和MeOH(6mL)。将反应混合物搅拌3h，然后在真空中浓缩，得到粗UDP-2-叠氮基-2-脱氧-D-半乳糖(26)。1H-NMR(300MHz,D2O):δ7.99(d,J＝8.2Hz,1H)、6.02-5.98(m,2H)、5.73(dd,J＝7.4、3.4Hz,1H)、4.42-4.37(m,2H)、4.30-4.18(m,4H)、4.14-4.04(m,2H)、3.80-3.70(m,2H)、3.65-3.58(m,1H)。
对于C15H23N5O16P2(M-H+)的LRMS(ESI-)计算值为590.05，实测值为590.2。
最后，向化合物26于H2O:MeOH 1:1(4mL)的溶液中加入Lindlar催化剂(mg)。将反应物在氢气氛下搅拌5h，并经硅藻土过滤。过滤器用H2O(10mL)冲洗，并在真空中浓缩滤液，得到UDP-D-半乳糖胺(UDP-GalNH2，27)(169mg，0.286mmol，收率92％)。1H-NMR(300MHz,D2O):δ7.93(d,J＝8.1Hz,1H)、5.99-5.90(m,2H)、5.76-5.69(m,1H)、4.39-4.34(m,2H)、4.31-4.17(m,5H)、4.05-4.01(m,1H)、3.94-3.86(m,1H)、3.82-3.70(m,3H)、3.30-3.16(m,1H)。对于C15H25N3O16P2(M-H+)的LRMS(ESI-)计算值为564.06，实测值为564.1。
实施例2.UDP-GalNAcSAc(28a)的合成
将UDP-D-半乳糖胺(27)(45mg，0.0796mmol)溶于pH7的缓冲液(0.5M K2HPO4)(2mL)中。加入N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰基硫代乙酸酯(37mg，0.159mmol)和DMF(2mL)，并将该反应物在室温下搅拌过夜。再加入36mg的N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰基硫代乙酸酯，并在3h后，将该反应物在真空下浓缩。利用快速色谱法(7:2:1-5:2:1EtOAc:MeOH:H2O)得到UDP-GalNAcSAc(28a)(28mg,0.041mmol,52％)。
1H-NMR(300MHz,D2O):δ7.84(d,J＝8.1Hz,1H)、5.90-5.82(m,2H)、5.48-5.41(m,1H)、4.29-4.22(m,2H)、4.20-4.00(m,5H)、3.98-3.82(m,2H)、3.79-3.59(m,4H)、2.30(s,3H)。对C19H29N3O18P2S(M-H+)的LRMS(ESI-)计算值为680.06，实测值为680.1。
实施例3.UDP-GalNAcCl(29)的合成
将UDP-D-半乳糖胺(27)(42mg，0.074mmol)溶解在0.1M的NaHCO3(1mL)中，并加入N-(氯乙酰氧基)琥珀酰亚胺(29mg，0.149mmol)(根据Hosztafi等人，Helv.Chim.Acta,1996,79,133-136制备)和DMF(1mL)。将该反应物在室温下搅拌过夜，再加入10mg的N-(氯乙酰氧基)琥珀酰亚胺并继续搅拌过夜。将反应物在真空中浓缩并通过快速色谱法(7:2:1-5:2:1EtOAc:MeOH:H2O)纯化，得到UDP-GalNAcCl(29)(25mg,0.039mmol,53％)。
1H-NMR(300MHz,D2O):δ7.84(d,J＝8.1Hz,1H)、5.89-5.84(m,2H)、5.53-5.46(m,1H)、4.33-4.00(m,9H)、3.99-3.88(m,2H)、3.77-3.59(m,2H)、1.83(s,1H)。
对于C17H26ClN3O17P2(M-H+)的LRMS(ESI-)计算值为640.03(100％)、642.03(32％)，实测值为640.1(100％)、642.2(35％)。
实施例4.UDP-GalNAcBr(30)的合成
将UDP-D-半乳糖胺(27)(42mg，0.088mmol)溶解在0.1M的NaHCO3(3mL)中，并加入N-(溴乙酰氧基)琥珀酰亚胺(63mg，0.265mmol)(根据Hosztafi等人，Helv.Chim.Acta,1996,79,133-136制备)和DMF(2mL)。将该反应物在室温下搅拌过夜，并在真空中浓缩。通过快速色谱法(7:2:1-5:2:1EtOAc:MeOH:H2O)纯化化合物，得到UDP-GalNAcBr(30)(28mg,0.048mmol,65％)。
1H-NMR(300MHz,D2O):δ7.86(d,J＝3.2Hz,1H)、5.97-5.84(m,2H)、5.54-5.46(m,1H)、4.33-4.04(m,6H)、3.99-3.85(m,2H)、3.79-3.60(m,2H)、2.75-2.68(m,3H)。
对于C17H26BrN3O17P2(M-H+)的LRMS(ESI-)计算值为683.98(100％)、685.98(98％)，实测值为687.1(100％)、688.0(92％)、686.0(85％)、689.0(72％)。
实施例6. 4,4'-二硫烷二基二苯甲酸(31)的合成
向4-巯基苯甲酸(0.20g，1.30mmol)于EtOH(10mL)的溶液中加入I2(0.20g，0.65mmol)和Et3N(0.54mL，395mg，3.90mmol)。将所得混合物搅拌16h。加入10％的Na2S2O3水溶液和0.01M HCl水溶液(25mL)后，将混合物进行部分浓缩，并加入1M HCl水溶液(1mL)。加入EtOAc(20mL)、DCM(50mL)和水(10mL)，然后滤出产物并在真空中干燥。得到了白色固体状的所需产物(4,4'-二硫烷二基二苯甲酸)(180mg，0.59mmol，90％)，无需进一步纯化即可使用(见下文)。1H NMR(300MHz,DMSO)：δ(ppm)7.96-7.88(m,4H)、7.68-7.59(m,4H)。
实施例7.巯基-D-生物素缀合物(32)的合成
将(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯(451mg，1.82mmol)于无水DMF(5mL)中的溶液置于氩气气氛中。加入D-生物素(445mg，1.82mmol)、EDCI(418mg,2.18mmol)、HOBt(343mg,2.54mmol)、二异丙基乙胺(317μL,235mg,1.82mmol)和无水DMF(2ml)。将所得混合物搅拌24h并浓缩。将残余物经由柱色谱法(于DCM中2％→10％的MeOH)纯化。在含流分的产物浓缩后，将残余物溶于EtOAc/DCM/MeOH(100mL/20mL/20mL)的混合物中，并用饱和的NH4Cl水溶液(2×100ml)洗涤。将有机混合物干燥(Na2SO4)并浓缩至20ml。所需产物(生物素-PEG2-NHBoc)作为无色玻璃状物(228mg,0.48mmol,26％)沉淀析出，并用于下一步骤中。1H NMR(300MHz,CD3OD)：δ(ppm)4.49(dd,J＝7.4、4.5Hz,1H)、4.30(dd,J＝7.9、4.4Hz,1H)、3.62(s,4H)、3.55(t,J＝5.5Hz,2H)、3.52(t,J＝5.6Hz,2H)、3.40-3.15(m,5H)、2.93(dd,J＝12.7、5.0Hz,1H)、2.71(d,J＝12.8Hz,1H)、2.22(t,J＝7.4Hz,2H)、1.81-1.40(m,6H)、1.44(s,9H)。
将生物素-PEG2-NHBoc(208mg,0.44mmol)的溶液溶于MeOH(5mL)中。加入乙酰氯(250μL,275mg,3.5mmol)之后，将该混合物搅拌17h并浓缩。将残余物与EtOAc(5mL)共同蒸发，这样定量地得到黄色固体状的产物。产物(生物素-PEG2-NH2)用于下一步骤中，而无需进一步纯化。
向4,4'-二硫烷二基二苯甲酸(31，20mg，0.065mmol)于DMF(1mL)的溶液中加入HATU(55mg，0.144mmol)和二异丙胺(70μL，50mg，0.39mmol)。加入生物素-PEG2-NH2(53mg，0.130mmol)于DMF中的溶液。将所得混合物搅拌19h，并倒入在DCM(20mL)和饱和NH4Cl水溶液(20ml)的混合物中。分离后，将有机相干燥(Na2SO4)。将残余物经由柱色谱法(于DCM中5％→20％的MeOH)纯化。获得了白色固体状的所需产物(生物素-PEG2-SS-PEG2-生物素)(21mg,0.021mmol,32％)。对于C46H66N8O10S4(M+H+)的LRMS(ESI+)计算值为1019.39，实测值为1020.1。
向生物素-PEG2-SS-PEG2-生物素(3.5mg，3.4μmol)于THF(0.5mL)和EtOH(0.5mL)的混合物中的冷却(0℃)溶液中加入NaBH4(0.5mg，12μmol)。在升温至室温时，将混合物搅拌2小时并浓缩。将残余物用水(1mL)吸收并加入10μL的1M HCl水溶液。所需产物用DCM(2×2mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并浓缩得到标题化合物(32)(2.7mg,78％)。对于C23H35N4O5S2(M+H+)的LRMS(ESI+)计算值为511.20，实测值为511.2。
实施例8.马来酰亚胺-生物素缀合物33的合成
向6-马来酰亚胺己酸N-琥珀酰亚氨基酯(10mg,0.032mmol)在1mL DMF中的溶液中加入生物素-PEG2-NH2(13mg,0.032mmol)和Et3N(9μL,6.5mg,0.064mmol)于DMF(1mL)中的溶液。将该混合物搅拌1h，并倒入DCM(10mL)和饱和NaHCO3水溶液(10mL)的混合物中。分离后，将有机层进行干燥(Na2SO4)并浓缩，根据LRMS分析法，柱色谱法(于DCM中2％→20％的MeOH)得到所需产物33。对于C26H42N5O7S(M+H+)的LRMS(ESI+)计算值为568.28，实测值为568.2。
缀合
抗体糖基化突变体
曲妥珠单抗的特定突变体来源于文献(Qu等人，J.Immunol.Methods1998,213,131，特别是L196N和G164S)或重新设计，特别是V363T。在所有三种情况下，天冬酰胺297突变成谷氨酰胺(N297Q)以除去天然糖基化位点。
天然的曲妥珠单抗和突变体抗体通过Evitria(Zurich,Switzerland)瞬时表达。
用于IgG的质谱分析的一般程序
将总体积约70μL的50μg(经修饰的)IgG、1M Tris-HCl pH为8.0、1mM EDTA和30mMDTT的溶液在37℃温育20min以还原二硫键，这使得可以分析轻链和重链。如果存在叠氮官能团，则它们在这些条件下被还原为胺。使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)将还原的样品用milliQ洗涤三次，并浓缩至10μM的(经修饰的)IgG。还原的IgG在JEOL AccuTOF上通过电喷射离子化飞行时间(ESI-TOF)进行分析。使用Magtran软件获得去卷积谱(deconvoluted spectra)。
实施例9-12.用于修整IgG聚糖的一般程序
IgG聚糖的修整是利用源自酿脓链球菌(购自Genovis,Sweden)的Endo S进行的。将IgG(10mg/mL)用Endo S(最终浓度为40U/mL)在25mM Tris pH 8.0中在37℃下温育16h。
实施例9.天然曲妥珠单抗的修整
使MS基峰为50591Da的曲妥珠单抗进行上述修整程序。对峰去卷积后，质谱显示轻链的一个峰和重链的两个峰。重链的两个峰属于从核心GlcNAc(Fuc)-取代的曲妥珠单抗中产生的一个主产物(49495Da，总重链的90％)，以及从核心GlcNAc-取代的曲妥珠单抗中产生的一个副产物(49351Da，总重链的±10％)。
实施例12.曲妥珠单抗-突变体N297Q,V363T的修整
使主要MS基峰为50934、51227和51517Da(对应于G2F、G2FS1和G2FS2糖基化同种型)的曲妥珠单抗-(N297Q,V363T)突变体(10mg/mL)与源自脑膜脓毒性菌(Elizabethkingia meningosepticum)(购自QA-Bio)的内切糖苷酶F3(EndoF3，25mU/mgIgG)在100mM pH4.5的柠檬酸钠中温育16h，这导致完全脱糖基化(由连接有核心GlNAc(Fuc)的N297Q、V363T重链产生的49515Da主重链产物)。
经修饰的糖向IgG进行糖基转移的一般程序
在IgG上酶催化地引入经修饰的糖受牛β1,4半乳糖基转移酶(β1,4-Gal-T1-Y289L)的突变体的影响。在30℃下，将脱糖基化的IgG(如上所述制备，10mg/mL)与经修饰的UDP-糖衍生物(0.4mM)和β(1,4)-Gal-T1-Y289L(1mg/mL)在10mM MnCl2和25mM pH8.0的Tris-HCl中温育15h。
在4℃下，将经修饰的IgG与蛋白质A琼脂糖(40μL每mg IgG)温育2h。蛋白质A琼脂糖用PBS洗涤三次，并用100mM pH 2.7的甘氨酸-HCl洗脱IgG。洗脱的IgG用1M pH 8.0的Tris-HCl中和，浓缩，并使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)用PBS洗涤至10mg/mL的浓度。
实施例13.UDP-糖28a(UDP-GalNAcSAc)向脱糖基化的曲妥珠单抗进行的糖基转移
在30℃下，将经修整的曲妥珠单抗(250μL,10mg/mL,16.5nmol)与UDP-GalNAcSAc(28a)(18.5μL,10mM)和β(1,4)-Gal-T1(Y289L)(12.5μL,2mg/mL)在10mM MnCl2和25mM pH6.0的Tris-HCl中温育16h。用ProtA纯化粗混合物，并且为了保持低pH，用25mM pH 6.0的Tris-HCl洗涤该柱，在用甘氨酸HCl缓冲液(pH2.7，0.1M)洗脱后，用Tris-HCl(pH7.2，1M)中和该洗脱缓冲液。
通过此程序得到1.1mg的IgG，其AccuTOF分析表明95％的trast-(GalNAcSH)2转化成单一的所需产物(脱去乙酸基的GalNAcSAc，这可能是由DTT的原位脱保护造成的)(质量49729，预期质量49730))。其他5％为剩余的起始原料(质量49494)。
实施例14.UDP-糖28a(GalNAcSAc)向脱糖基化的曲妥珠单抗(N297Q、V363T)进行的糖基转移
在30℃下，将经修整的曲妥珠单抗(N297Q、V363T)(100μL,10mg/mL,6.6nmol)与UDP-GalNAcSAc(28a)(14μL,10mM)和β(1,4)-Gal-T1(Y289L)(10μL,2mg/mL)在10mM MnCl2和25mM pH 6.0的Tris-HCl中温育16h。用ProtA纯化粗混合物，并且为了保持低pH，用25mMpH 6.0的Tris-HCl洗涤该柱，并且在用甘氨酸HCl缓冲液(pH2.7，0.1M)洗脱后，用Tris-HCl(pH 7.2，1M)中和该洗脱缓冲液。通过此程序得到0.25mg的IgG，其AccuTOF分析表明trast-(N297Q、V363T)-(GalNAcSH)2作为单独的所需产物(脱去乙酸基的GalNAcSAc，这可能是由DTT的原位脱保护造成的)存在(质量49729，预期质量49730)。
实施例15.UDP-糖29(GalNAcCl)向脱糖基化的曲妥珠单抗进行的糖基转移
在30℃下，将经修整的曲妥珠单抗(100μL,10mg/mL,6.6nmol)与UDP-GalNAcCl(29)(5μL,10mM)和β(1,4)-Gal-T1(Y289L)(5μL,2mg/mL)在10mM MnCl2和25mM pH 6.0的Tris-HCl中温育16h。根据用于GalNAcSAc的程序，用ProtA纯化粗混合物以获得trast-(GalNAcCl)2(0.36mg)。AccuTOF分析表明完全转化为所需产物(质量49731，预期质量49732)。
实施例16.UDP-糖29(GalNAcCl)向脱糖基化的曲妥珠单抗(N297Q、V363T)进行的糖基转移
在30℃下，将经修整的曲妥珠单抗N297Q、V363T突变体(100μL,10mg/mL,6.6nmol)与UDP-GalNAcCl(29)(5μL,10mM)和β(1,4)-Gal-T1(Y289L)(5μL,2mg/mL)在10mM MnCl2和25mM pH 6.0的Tris-HCl中温育16h。根据用于GalNAcSAc的程序，用ProtA纯化粗混合物以获得trast-(GalNAcCl)2(0.36mg)。AccuTOF分析表明完全转化为所需产物(质量49750，预期质量49750)。
实施例17.UDP-糖30(GalNAcBr)向脱糖基化的曲妥珠单抗进行的糖基转移
在30℃下，将经修整的曲妥珠单抗(100μL,10mg/mL,6.6nmol)与UDP-GalNAcBr(RHX)(15μL,10mM)和β(1,4)-Gal-T1-Y289L(5μL,2mg/mL)在10mM MnCl2和25mM pH 6.0的Tris-HCl中温育16h。根据用于GalNAcSAc的程序，用ProtA纯化粗混合物以获得trast-(GalNAcBr)2(0.34mg)。AccuTOF分析表明50％转化为所需产物(质量49777，预期质量49776以及质量+DTT(在分析样品期间反应)49849.5)。溴化物的分子内取代物为30％(质量49696，预期质量49698)以及20％为剩余的起始原料。
实施例18.trast-GalNAcCl与DTT的缀合
将粗trast-(GalNAcCl)2(2μL,10mg/ml于25mM pH 8.0的Tris-HCl中)与DTT(2μL,0.2M)在37℃下温育10min。随后的AccuTOF分析表明70％与DTT结合(质量49849，预期质量49850)和30％的氯化物的分子内取代物(质量49697，预期质量的49698)。
实施例19.Trast-(GalNAcCl)2与p-NO2PhSH的缀合
在氩气气氛下，向trast-(GalNAcCl)2(7.5μL,26.6mg/ml,1.3nmol)于25mM Tris-HCl pH 6.0的溶液中加入脱气的Tris-HCl(7.5μL,100mM pH 7.2)和脱气的p-NO2PhSH溶液(7.5μL,0.10mM,750nmol于MiliQ+10mM EDTA中)。4h后，通过AccuTOF的分析表明95％转化为所需产物(质量49849,预期质量49851)。
实施例20.trast(GalNAcCl)2与p-MeOPhSH的缀合
在氩气气氛下，向trast-(GalNAcCl)2(7.5μL,26.6mg/ml,1.3nmol)于25mM Tris-HCl pH 6.0的溶液中加入脱气的Tris-HCl(7.5μL,100mM pH 7.2)和脱气的p-MeOPhSH溶液(1μL,0.10mM,100nmol于MiliQ+10mM EDTA中)。4h后，通过AccuTOF的分析表明95％转化为所需产物(质量49835,预期质量49836)。SDS-PAGE分析表示未发生抗体的二硫键还原。
实施例21.trast(GalNAcCl)2与32的缀合
在氩气气氛下，向trast-(GalNAcCl)2(7.5μL,26.6mg/ml,1.3nmol)于25mM Tris-HCl pH 6.0的溶液中加入脱气的Tris-HCl(7.5μL,100mM pH 7.2)和脱气的32溶液(1μL,0.10mM,在于MiliQ/DMF＝1:1中的10mM EDTA中为100nmol)。温育过夜之后，通过旋转过滤纯化来除去过量的反应物，之后，AccuTOF的分析表明完全转化为所需产物40(质量50208，预期质量50206)。
实施例22.trast(GalNAcSH)2与mc-vc-PABA-MMAE(34)的缀合
将如上所描述的利用UDP-糖29获得的蛋白质A纯化的trast-(GalNAcSH)2(5μL，20mg/mL于25mM的Tris-HCl pH 8.0中)，用mc-vc-PABA-MMAE(5μL,1mM,购自Concortis)在PBS中在室温下温育16h。通过旋转过滤纯化来除去过量的反应物。随后的采用AccuTOF的分析表明存在所需产物(质量51051，预期质量+Na+51050)。
实施例23.GalT突变体Y289N、Y289F、Y289M、Y289V、Y289A、Y289G和Y289I的克隆和表达
通过重叠延伸PCR方法，从含有编码由130-402氨基酸残基构成的GalT的催化结构域的序列的构建体来扩增GalT突变基因。野生型酶由SEQ ID NO:17代表。对于Y289N突变体(由SEQ ID NO:18代表)，第一DNA片段用一对引物扩增：Oligo38_GalT_External_Fw(CAGCGA CAT ATG TCG CTG ACC GCA TGC CCT GAG GAG TCC，由SEQ ID NO:1代表)和Oligo19_GalT_Y289N_Rw(GAC ACC TCC AAA
Figure BDA0001016023320000661
CTG CAC GTA AGG TAG GCT AAA，由SEQ ID NO:2代表)。NdeI限制位点加了下划线，而突变位点用粗体突出显示。第二片段用一对引物扩增：Oligo29_GalT_External_Rw(CTG ATG GAT GGA TCC CTA GCT CGG CGT CCC GAT GTC CAC由SEQ ID NO:3表示)和Oligo18_GalT_Y289N_Fw(CCT TAC GTG CAG
Figure BDA0001016023320000671
TTT GGA GGTGTC TCT GCT CTA由SEQ ID NO:4表示)。BamHI限制性位点加了下划线，而突变位点用粗体突出显示。使用Oligo38_GalT_External_Fw和Oligo29_GalT_External_Rw引物将第一轮PCR产生的两个片段融合到第二轮中。在用NdeI和BamHI消化后，此片段被连接至用相同的限制性酶裂解的pET16b载体上。新构建的表达载体包含编码Y289N突变体的基因和编码来自pET16b载体的His-tag的序列，其经DNA测序结果确认。对于Y289F(由SEQ ID NO:19代表)、Y289M(由SEQ ID NO:20代表)、Y289I(由SEQ ID NO:21代表)、Y289V(由SEQ ID NO:22代表)、Y289A(由SEQ ID NO:23代表)和Y289G(由SEQ ID NO:24代表)突变体的构建，使用相同的程序，其中突变位点分别变更为编码苯丙氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸的
Figure BDA0001016023320000672
Figure BDA0001016023320000673
和
Figure BDA0001016023320000674
三联体。更具体而言，对于Y289F的构建，采用在本文中被定义为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5的一对引物来扩增第一DNA片段，采用在本文中被定义为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6(指的是表1的相关序列)的一对引物来扩增第二片段。此外，对于Y289M的构建，采用在本文中被定义为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:7的一对引物来扩增第一DNA片段，采用本文中被定义为SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:8的一对引物来扩增第二片段。对于Y289I的构建，采用在本文中被定义为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:9的一对引物来扩增第一DNA片段，采用在本文中被定义为SEQ ID NO:3和SEQID NO:10的一对引物来扩增第二片段。对于Y289V的构建，采用在本文中被定义为SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:11的一对引物来扩增第一DNA片段，采用在本文中被定义为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:12的一对引物来扩增第二片段。对于Y289A的构建，采用在本文中被定义为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:13的一对引物来扩增第一DNA片段，采用在本文中被定义为SEQID NO:3和SEQ ID NO:14的一对引物来扩增第二片段。对于Y289G的构建，采用在本文中被定义为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:15的一对引物来扩增第一DNA片段，采用在本文中被定义为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:16(指的是表1的相关序列)的一对引物来扩增第二片段。
根据Qasba等(Prot.Expr.Pur.2003,30,219-229)报道的方法从内涵体中表达、分离和重折叠GalT突变体。重折叠之后，除去沉淀物并使用Ni-NTA柱(HisTrap excel 1mL柱,GE Healthcare)分离可溶的且折叠的蛋白质。在用25mM Tris-HCl(pH 8.0)、300mM NaCl和200mM咪唑洗脱后，在25mM Tris-HCl(pH 8.0)中透析所述蛋白质并使用旋转过滤器(配有Ultracel-10膜的Amicon Ultra-15离心过滤器单元)浓缩至2mg/mL。
表1所用引物的序列识别
Figure BDA0001016023320000681
实施例24. 4,4'-二硫烷二基二苯甲酸双羟基琥珀酰亚胺酯的合成
向4,4'-二硫烷二基二苯甲酸31(550mg,1.79mmol)于DCM(20mL)的悬浮液中加入EDC·HCl(770mg,3.95mmol)和NHS(447mg,3.95mmol)。将所得混合物搅拌4h，随后用水(2×20mL)、饱和NaHCO3水溶液(2×20mL)洗涤，经由Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。将粗品4,4'-二硫烷二基二苯甲酸双羟基琥珀酰亚胺酯用于下一步反应中。
实施例25. 4,4'-二硫烷二基双(N-(2"-(2'-(2-叠氮基乙氧基)-乙氧基)乙基)苯甲酰胺)的合成
向2"-(2'-(2-叠氮基乙氧基)-乙氧基)乙-1-胺(210mg,1mmol)于DCM(10mL)的溶液中加入Et3N(240μL,1.7mmol)，并将该混合物搅拌5min，接着加入4,4'-二硫代二苯甲酸双羟基琥珀酰亚胺酯(240mg,0.5mmol)。搅拌过夜后，将反应混合物减压浓缩，并将所得产物经快速柱色谱法(DCM→DCM:MeOH,96:4)纯化。含有产物的流分用水(3×20mL)洗涤，随后用Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩，以54％的收率获得4,4'-二硫烷二基双(N-(2"-(2'-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺(168mg,0.27mmol)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.74-7.72(m,4H)、7.54-7.52(m,4H)、3.68-3.58(m,20H)、3.35(t,4H,J＝4.8Hz)。
实施例26.巯基苯甲酸衍生物41的合成
在0℃下，向4,4'-二硫烷二基-双(N-(2"-(2'-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)苯甲酰胺(22mg,0.036mmol)于THF的溶液中加入NaBH4(2.7mg,0.07mmol)。搅拌所得浆体，并且在3和6h之后加入额外的NaBH4(2次2.7mg,0.07mmol)。将反应物再搅拌1h，接着加入0.1MHCl(1mL)和DCM(2mL)。将该混合物用DCM(2×5mL)萃取，合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩，以69％的收率获得41(16mg,0.05mmol)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.65-7.63(m,2H)、7.29-7.26(m,2H)、3.68-3.56(m,10H)、3.35(t,2H,J＝6.4Hz)。
实施例27.N-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)丁-3-炔酰胺(42)的合成
向丁-3-炔酸(15mg，0.18mmol)于CH2Cl2(2mL)的溶液中加入Mukayama试剂(66mg，0.27mmol)，搅拌该悬浮液1h，随后滴加2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(17mg，0.20mmol)和Et3N(60μL，0.45mmol)于CH2Cl2(2mL)中的预混合溶液。30min后，将混合物减压浓缩，随后加入水(5mL)和EtOAc(5mL)。有机层用水(2×5mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中并浓缩。快速柱色谱法(EtOAc：戊烷1:1→6:1)得到产物42(9mg,0.04mmol,21％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ3.64-3.58(m,6H)、3.55-3.52(m,2H)、3.45-3.42(m,2H)、3.33(t,J＝4.8Hz,2H)、3.15(d,J＝2.4Hz,2H)、2.29(t,J＝2.8Hz,1H)。
实施例28.N-(2-(2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)丁-2-联烯酰胺(43)的合成
将丁炔酰胺42(9mg,0.04mmol)溶于二氧杂环己烷(0.5mL)中，接着加入K2CO3(18％于水中,0.5mL)。将反应混合物加热到40℃，保持2h，然后加入柠檬酸(2mL，10％于水中)和CH2Cl2(2mL)。水层用CH2Cl2(2×3mL)萃取，并将有机层合并，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩，得到产物43(8mg,0.04mmol,89％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ5.63(t,J＝6.4Hz,1H)、5.21(d,J＝6.7Hz,2H)、3.70-3.60(m,6H)、3.60-3.58(m,2H)、3.53-3.50(m,2H)、3.39(t,J＝4.8Hz,2H)。
实施例29. 1-芘羧酸OSu酯的合成
向1-芘羧酸(65mg,0.24mmol)于DCM/DMF(每种2mL)的溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺(34mg,0.29mmol)和EDC·HCl(70mg,0.36mmol)。将反应物搅拌2h，随后用DCM(10mL)稀释，用柠檬酸水溶液(10％,5mL)和饱和NaHCO3(3×5mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩，得到粗的1-芘羧酸羟基琥珀酰亚胺酯。
实施例30. 44的合成
将1-芘羧酸羟基琥珀酰亚胺酯(480mg，1.38mmol)溶于DCM(15mL)中，并加入(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(348mg，1.4mmol)和Et3N(286μL，2.1mmol)。将反应混合物搅拌过夜，并用水(15mL)淬灭，将有机层用水(1×15mL)和饱和NaHCO3水溶液(2×15mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在真空中浓缩。通过快速柱色谱法(DCM→DCM:MeOH 95：5)纯化，得到的Boc-保护的芘衍生物(460mg，0.97mmol，70％)。
然后，将该Boc-保护的芘衍生物(460mg，0.97mmol)溶于甲醇(10mL)中。加入乙酰氯(140μL,1.9mmol)，并在1h和3h后加入额外的乙酰氯(2×140μL,1.9mmol)。搅拌4h后，在减压下浓缩该混合物。然后，将该粗产品(100mg,0.24mmol)溶于DCM(3mL)中，并加入4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(50mg,0.17mmol)和Et3N(73μL,0.52mmol)。搅拌过夜后，该溶液用水(3mL)淬灭，用水(2×3)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过梯度快速柱色谱法(DCM→DCM:MeOH 95:5)纯化，得到44(69mg，0.13mmol，75％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.48(d,1H,J＝9.2Hz)、8.12(d,2H,J＝7.6Hz)、8.04-7.93(m,6H)、6.59(bs,1H)、6.38(s,2H)、5.99(bs,1H)、3.76-3.71(m,4H)、3.62-3.60(m,2H)、3.54-3.52(m,2H)、3.37(t,2H,J＝5.2Hz)、3.23-3.17(m,4H)、1.82(t,2H,J＝6.8Hz)、1.63(q,2H,J＝7.2Hz)。
实施例31.马来酰亚胺BCN缀合物45的形成
向BCN-(POE)3NH2(13mg,0.04mmol)于DMA(1mL)的溶液中加入4-马来酰亚氨基丁酸羟基琥珀酰亚胺酯(7mg,0.03mmol)，然后温育1h。将该溶液本身直接用于缀合实验。
实施例32.trast(GalNProSH)2与34缀合以产生39
将曲妥珠单抗-(GalNProSH)2(1.0mg,10mg/mL)与TCEP(6.6μL,10mM于MiliQ中)在PBS和20mM EDTA中在室温下温育2h。随后，使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)将反应介质交换为PBS。加入脱氢抗坏血酸(5.4μL,10mM于DMSO中)，然后温育3h。加入马来酰亚胺-vc-PABA-MMAE 34(1μL,10mM于DMA中)，并将混合物温育35分钟。随后，取样品(2μL)用FabricatorTM(50U于10μL PBS中)消化，并使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)采用MiliQ洗涤，质量分析表明39的形成(25706，预期质量25701)。
实施例33.曲妥珠单抗-缀合物46的形成
向36(R＝Cl)(3μL,63mg/ml,1.3nmol)于25mM Tris-HCl(pH 6.0)的溶液中加入Tris-HCl(10μL,100mM pH 7.2)和41的溶液(10μL,10mM，100nmol于MiliQ+10mM EDTA+10％DMF中)。温育过夜后，AccuTOF分析表明>95％转化为所需产物46(质量50010，预期质量50006)。
实施例34. 46与47的SPAAC以产生抗体-药物缀合物48
实施例33中的剩余试剂经由旋转过滤器(3×0.5mL)除去，向其中加入Tris-HCl(25mM pH 7.5)和BCN-vc-PABA-MMAF 47(10μL,2mM，20nmol于MiliQ+5％DMF中)。温育过夜后，AccuTOF分析表明>95％转化为所需产物48(质量51566，预期质量51564)。
实施例35.trast(GalNProSH)2与联烯酰胺43缀合，产生缀合物49
将在50mM Tris-HCl pH 6.0中的曲妥珠单抗-(GalNProSH)2(0.2mg,20mg/mL)与N-(2"-(2'-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙基)丁-2-联烯酰胺(43)(1μL,40mM于DMA中)和50mM Tris-HCl pH 8.8(10μL)在室温下温育过夜。随后，取样品(2μL)用FabricatorTM(50U于10μL PBS中)消化，并使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)采用MiliQ洗涤，质量分析表明形成了作为主要产物(约70％)的所需产物49(24627，预期质量24627)。
实施例36.trast(GalNProSH)2与44缀合，产生缀合物50
将曲妥珠单抗-(GalNProSH)2(0.5mg,10mg/mL)与TCEP(3.3μL,10mM于MiliQ中)在PBS和20mM EDTA中在室温下温育2h。随后，使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)将反应介质交换为PBS。加入脱氢抗坏血酸(2.8μL,10mM于DMSO中)，然后温育3h。加入芘马来酰亚胺44(1μL,10mM于DMA中)，并将该混合物温育35min。随后，取样品(2μL)用FabricatorTM(50U于10μL PBS中)消化，并使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)采用MiliQ洗涤，质量分析表明形成作为主要产物(约85％)的所需产物50(24929，预期质量24929)。
实施例37.trast(GalNProSH)2与45缀合，然后加入生物素-N3(52)
将曲妥珠单抗-(GalNProSH)2(1mg,10mg/mL)与TCEP(8.3μL,10mM于MiliQ中)在PBS和20mM EDTA中在室温下温育2h。随后，使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)将反应介质交换为PBS。加入脱氢抗坏血酸(6.5μL,10mM于DMSO中)，然后温育3h。加入化合物45(3μL预混合料,40mM于DMA中)，并将该混合物温育35min。随后，取样品(2μL)用FabricatorTM(50U于10μL PBS中)消化，并使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)采用MiliQ洗涤，质量分析表明形成作为主要产物(约85％)的所需产物51(24891，预期质量24891)。将反应混合物旋转过滤至25mM Tris-HCl(pH 7.5)中，重复两次，随后加入52(3μL，40mM于DMF中)。温育后，使样品进行如上所述的DTT，质量分析表明形成作为主要产物(约85％)的所需产物53(50658，预期质量50650)，剩余的种类之一为经修整的曲妥珠单抗(49503，预期质量49495)。
实施例38. 52的合成
将2"-(2'-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基)乙-1-胺(50mg,0.17mmol)溶于CH2Cl2(2mL)中，并加入生物素羟基琥珀酰亚胺衍生物(60mg,0.18mmol)和Et3N(52μL,0.37mmol)。将反应混合物搅拌过夜并用水(5mL)和CH2Cl2(5mL)进行淬灭。有机层用水(2×5mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。使用快速色谱法(DCM→DCM:MeOH 9:1)，获得产品52(13mg,0.03mmol,20％)。对于C16H29N6O4S(M+H+)的LRMS(ESI+)计算值为401.19，实测值为401.34。
实施例39.UDP-GalNProSH(59)和UDP-GalNBuSH(60)衍生物的合成
从24开始合成UDP-GalNProSH和UDP-GalNBuSH衍生物59+60的反应方案，如实施例xxx实施的，在图12中示出。
实施例40. 3,4,6-三-O-乙酰基-D-半乳糖胺-1-磷酸酯(54)
向叠氮化物24(105mg,0.255mmol)于MeOH(3mL)的溶液中加入Pd/C(20mg)。将该反应物在H2气氛中搅拌2h并用硅藻土过滤。过滤器用MeOH(10mL)冲洗，并在真空中浓缩滤液得到54(94mg,0.244mmol,96％)。
1H-NMR(300MHz,D2O):δ5.87-5.76(m,1H)、5.44(br s,1H)、5.30-5.20(m,1H)、4.55(t,J＝6.3Hz,1H)、4.28-4.00(m,3H)、2.11(s,3H)、2.03(s,3H),2.00(s,3H)。
对于C12H19NO11P(M-)的LRMS(ESI-)计算值为384.07，实测值为384.1。
实施例41. 55的合成
向54(162mg,0.42mmol)于DCM/DMF(每种2mL)的溶液中加入乙酰巯基-3-丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(175mg,0.69mmol)和Et3N(88μL,0.63mmol)。搅拌过夜后，在减压下浓缩该反应混合物。通过快速柱色谱法(EtOAc→EtOAc:MeOH 30:70)纯化，获得55(85mg,0.17mmol,39％)。对于C17H25NO13PS(M-)的LRMS(ESI-)计算值为514.09，实测值为514.06。
实施例42. 57的合成
接着，根据Baisch等人，Bioorg.Med.Chem.,1997,5,383-391将化合物55耦合在UMP上。
因此，将D-尿苷-5'-单磷酸二钠盐(1.49g,4.05mmol)于H2O(15mL)中的溶液用DOWEX 50Wx8(H+型)处理30min，并过滤。将滤液在室温下剧烈搅拌，同时滴加三丁基胺(0.966mL,4.05mmol)。继续搅拌30min后，将反应混合物冻干。
在氩气气氛中，将所得的三丁基铵尿苷-5'-单磷酸盐(103mg,0.20mmol)溶于无水DMF(2ml)中。加入羰二咪唑(57mg,0.36mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌30min。然后，加入无水MeOH(7μL)，并搅拌15min以除去过量的CDI。在高真空下15min除去剩余的MeOH。接着，将化合物x(87mg,0.17mmol)和N-甲基咪唑HCl(118mg,0.85mmol)溶于无水DMF(2mL)中，并将其滴加到反应混合物中。将该反应物搅拌过夜，然后在真空中浓缩。经快速色谱法(9:2:1-5:2:1EtOAc:MeOH:H2O)，得到57(91mg,0.11mmol,65％)。对于C26H36N3O21P2S(M-)的LRMS(ESI-)计算值为820.11，实测值为820.24。
实施例43.UDP-GalNProSH(59)的合成
将UDP-半乳糖胺衍生物57(178mg，0.21mmol)溶于水:MeOH:Et3N(3:7:3，5mL)的混合物中，并搅拌直至根据LCMS达到完全脱保护。将反应物减压浓缩，并分成两部分。一部分存储，而另一半在阴离子交换柱(Q HITRAP，2×5mL的柱子)上纯化。首先，经由加载缓冲液A(10mM NaHCO3)实现与柱的结合，并用100mL缓冲液A冲洗柱子。接着进行至25％B(250mMNaHCO3)的梯度，以洗脱杂质如diUMP。增加梯度至100％B，洗脱出作为二聚体的产物。将流分冷冻干燥，并随后溶于水(5mL)中，然后加入DTT(15mg，0.1mmol)和Et3N(几滴)。1h后，完成还原并减压除去溶剂。经快速色谱法(6:2:1-3:2:1EtOAc:MeOH:H2O)，得到产物59(17mg,0.03mmol,26％)。对于C18H28N3O17P2S(M-)的LRMS(ESI-)计算值为652.07，实测值为652.03。
1H-NMR(400MHz,D2O):δ7.86(d,J＝8.0Hz,1H)、5.88-5.86(m,2H)、5.48-5.45(m,1H)、4.28-4.05(m,8H)、3.95-3.85(m,1H)、3.68-3.65(m,2H)、2.69-2.67(m,2H)、2.60-2.55(m,2H)。
实施例44.乙酰巯基-4-丁酸的合成
将4-溴代丁酸(1g,6mmol)溶于DMF(7mL)中，然后加入硫代乙酸钾(1g,9mmol)。将该反应物搅拌1h并用1M HCl(20mL)和Et2O(20mL)淬灭。有机层用1M HCl(3×20mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。经快速色谱法(1:0-7:1庚烷:EtOAc+1％Ac2O)，得到乙酰巯基-4-丁酸(450mg,2.7mmol,46％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ2.94(t,J＝7.2Hz,2H)、2.45(t,J＝7.2Hz,2H)、2.34(s,3H)、1.92(q,J＝6.8Hz,2H)。
实施例45.乙酰巯基-4-丁酸羟基琥珀酰亚胺酯的合成
将乙酰巯基-4-丁酸(450mg,2.7mmol)溶于CH2Cl2(30mL)中，然后加入EDC·HCl(813mg,4.1mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(500mg,4.1mmol)。将反应物搅拌过夜，并用饱和NaHCO3水溶液(20mL)淬灭。有机层用饱和NaHCO3水溶液(2×20mL)和柠檬酸(1×10mL)洗涤。有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，以产生作为粗产物的标题化合物(630mg,2.4mmol,90％)。
实施例46. 56的合成
向半乳糖胺衍生物54(167mg,0.43mmol)于DCM/DMF(每种2mL)的溶液中加入乙酰巯基-4-丁酸羟基琥珀酰亚胺(200mg,0.77mmol)和Et3N(88μL,0.63mmol)。搅拌过夜后，将反应混合物减压浓缩。通过快速柱色谱法(EtOAc→EtOAc:MeOH 30:70)纯化，获得56(68mg,0.13mmol,30％)。对于C18H27NO13PS(M-)的LRMS(ESI-)计算值为528.10，实测值为528.25。
实施例47. 58的合成
接着，根据Baisch等人，Bioorg.Med.Chem.,1997,5,383-391将半乳糖胺衍生物56耦合在UMP上。
因此，将D-尿苷-5'-单磷酸二钠盐(1.49g,4.05mmol)于H2O(15mL)中的溶液用DOWEX 50Wx8(H+型)处理30min，并过滤。将滤液在室温下剧烈搅拌，同时滴加三丁基胺(0.966mL,4.05mmol)。继续搅拌30min后，将反应混合物冻干。
在氩气气氛中，将所得的三丁基铵尿苷-5'-单磷酸盐(78mg,0.15mmol)溶于无水DMF(2mL)中。加入羰二咪唑(43mg,0.27mmol)，并将反应混合物在室温下搅拌30min。然后，加入无水MeOH(6μL)，并搅拌15min以除去过量的CDI。在高真空下15min除去剩余的MeOH。随后，将化合物56(68mg,0.13mmol)和N-甲基咪唑HCl(118mg,0.72mmol)溶于无水DMF(2mL)中，并将其滴加到反应混合物中。将该反应物搅拌过夜，然后在真空中浓缩。经快速色谱法(9:2:1-5:2:1EtOAc:MeOH:H2O)，得到产物58(53mg,0.06mmol,49％)。对于C27H38N3O21P2S(M-)的LRMS(ESI-)计算值为834.13，实测值为834.26。
实施例48. 60的合成
将糖58(53mg,0.06mmol)溶于脱气的水:MeOH:Et3N(3:7:3,3mL)混合物中，并搅拌直至根据LCMS达到完全脱保护。将反应物减压浓缩，并用快速色谱法(7:2:1-3:2:1EtOAc:MeOH:H2O)纯化。一部分存储，而另一半在阴离子交换柱(Q HITRAP，1×5mL的柱子)上纯化。首先，经由加载缓冲液A(10mM NaHCO3)实现与柱的结合，并用50mL缓冲液A冲洗柱子。接着进行至25％B(250mM NaHCO3)的梯度，以洗脱产物60(1mg,0.002mmol,5％)。对于C19H31N3O17P2S(M-)的LRMS(ESI-)计算值为666.08，实测值为666.0。
1H-NMR(400MHz,D2O):δ7.86(d,J＝8.0Hz,1H)、5.88-5.86(m,2H)、5.48-5.45(m,1H)、4.27-4.10(m,7H)、3.94-3.86(m,2H)、3.68-3.61(m,3H)、3.12-3.08(m,2H)、2.46-2.35(m,2H)、1.20-1.17(m,2H)。
实施例49. 64的合成
将乙酰巯基乙酸五氟苯酚酯(100mg，0.33mmol)溶于CH2Cl2(3mL)中，并加入苄胺(69μL，0.5mmol)和Et3N(44μL，0.40mmol)。将混合物搅拌过夜，并加入水(3mL)淬灭，然后用水(3×3mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。经快速色谱法(EtOAc:庚烷1:4→1:1)，得到61，将其溶于脱气的甲醇(7mL)中。随后，加入脱气的NaOH水溶液(1M,3mL)，并将该反应物在氮气气氛中搅拌。2h后，将该反应物用1M HCl(10mL)和CH2Cl2(20mL)淬灭。水层用CH2Cl2(2×30mL)萃取，经Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。产物64以粗品形式用于下一反应。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ7.28-7.70(m,5H)、6.94(bs,1H)、4.40(d,J＝5.6Hz,2H)、3.21(d,J＝9.2Hz,2H)、1.81(t,J＝9.2Hz,1H)。对于C9H12NOS(M+H+)的LRMS(ESI+)计算值为182.06，实测值为182.60。
实施例50. 65的合成
将乙酰巯基-3-丙酸羟基琥珀酰亚胺酯(100mg，0.41mmol)溶于CH2Cl2(3mL)，并加入苄胺(69μL，0.5mmol)和Et3N(44μL，0.40mmol)。将混合物搅拌过夜，并加入水(3mL)淬灭，然后用水(3×3mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。经快速色谱法(EtOAc:庚烷1:4→1:1)，得到产物62，将其溶于脱气的甲醇(7mL)中。随后，加入脱气的NaOH水溶液(1M,3mL)，并将该反应物在氮气气氛中搅拌。2h后，将该反应物用1M HCl(10mL)和CH2Cl2(20mL)淬灭。水层用CH2Cl2(2×30mL)萃取，经Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。产物65以粗品形式用于下一反应。对于C10H14NOS(M+H+)的LRMS(ESI+)计算值为196.07，实测值为196.60。
实施例51. 66的合成
将乙酰巯基-4-丁酸羟基琥珀酰亚胺酯(100mg，0.38mmol)溶于CH2Cl2(3mL)，并加入苄胺(69μL，0.5mmol)和Et3N(44μL，0.40mmol)。将混合物搅拌过夜，并加入水(3mL)淬灭，随后用水(3×3mL)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。经快速色谱法(EtOAc:庚烷1:4→1:1)得到产物63，将其溶于脱气的甲醇(7mL)中。随后，加入脱气的NaOH水溶液(1M,3mL)，并将该反应物在氮气气氛中搅拌。2h后，将该反应物用1M HCl(10mL)和CH2Cl2(20mL)淬灭。水层用CH2Cl2(2×30mL)萃取，经Na2SO4干燥，过滤并在真空下浓缩。产物66以粗品形式用于下一反应。对于C11H16NOS(M+H+)的LRMS(ESI+)计算值为210.09，实测值为210.60。
实施例52.琥珀酰亚胺加合物67的合成
向芘马来酰亚胺衍生物44(10mg，0.02mmol)于CH2Cl2的溶液中加入64(8mg，0.044mmol)和Et3N(10μL，0.09mmol)。搅拌1h后，将反应物浓缩，并经快速色谱法(DCM→DCM:MeOH 9:1)得到67(4mg，0.01mmol，28％)。对于C40H43N4O7S(M+H+)的LRMS(ESI-)计算值为723.28，实测值为723.31。
实施例53.琥珀酰亚胺加合物68的合成
向芘马来酰亚胺衍生物44(10mg，0.02mmol)于CH2Cl2的溶液中加入65(8mg，0.041mmol)和Et3N(10μL，0.09mmol)。搅拌1h后，将反应物浓缩，并经快速色谱法(DCM→DCM:MeOH 9:1)得到68(8mg，0.01mmol，54％)。对于C41H45N4O7S(M+H+)的LRMS(ESI-)计算值为737.29，实测值为736.29。
实施例54.琥珀酰亚胺加合物69的合成
向芘马来酰亚胺衍生物44(10mg，0.02mmol)于CH2Cl2的溶液中加入66(8mg，0.04mmol)和Et3N(10μL，0.09mmol)。搅拌1h后，将反应物浓缩，并经快速色谱法(DCM→DCM:MeOH 9:1)得到69(6mg，0.01mmol，40％)。对于C42H47N4O7S(M+H+)的LRMS(ESI-)计算值为751.31，实测值为751.38。
实施例55.琥珀酰亚胺67-69的稳定性研究
将琥珀酰亚胺缀合物67-69中的一种(1mg)溶于DMF(400μL)，接着加入缓冲液1、2或3(800μL)。缓冲溶液1为PBS，缓冲溶液2为PBS+1mM谷胱甘肽(GSH，还原的)，且缓冲液3为PBS+1mM谷胱甘肽(氧化的)。谷胱甘肽的终浓度(通过用DMF稀释)为0.71mM。将样品在37℃下温育并及时测量。产物比率通过LC-MS测定。
表2.起始琥珀酰亚胺(67-69)与水解的琥珀酰亚胺与通过逆向迈克尔然后GSH加成反应产生的谷胱甘肽加合物的相对比率。化合物67-69的结构示于图12中。
Figure BDA0001016023320000781
Figure BDA0001016023320000791
实施例56.UDP-糖59(GalNProSH)向脱糖基化的曲妥珠单抗上进行的糖基转移
将脱糖基化的曲妥珠单抗(10mg/mL)与59(1.3mM)和β(1,4)-Gal-T1(Y289L、C342T)(0.2mg/mL)在10mM MnCl2和50mM Tris-HCl pH 6.0中在30℃下温育16h。
然后，将功能化的曲妥珠单抗与蛋白质A琼脂糖(40μL每mg IgG)在室温下温育1h。蛋白质A琼脂糖用TBS(pH 6.0)洗涤三次，并用100mM pH 2.5的甘氨酸-HCl洗脱IgG。洗脱出的IgG用1M pH 7.0的Tris-HCl中和，并使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)采用50mM pH 6.0的Tris-HCl浓缩并洗涤至浓度为15-20mg/mL。在用FabricatorTM(50U于10μL pH 6.6的PBS中)消化，随后使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)采用MiliQ洗涤后，光谱分析表明形成两种产物，主要产物(24387Da,预期质量24388)脱糖基化的曲妥珠单抗+GalNProSH(曲妥珠单抗-(GalNProSH)2)和次要产物(25037Da,预期质量25038)脱糖基化的曲妥珠单抗+GalNProS-UDPGalNProS二硫化物。产物之间的比例为约60:40。
实施例57.UDP-糖60(GalNBuSH)向脱糖基化的曲妥珠单抗上进行的糖基转移
将脱糖基化的曲妥珠单抗(10mg/mL)与60(1.3mM)和β(1,4)-Gal-T1(Y289M)(2mg/mL)在10mM MnCl2和50mM pH 6.0的Tris-HCl中在30℃下温育16h。
在采用FabricatorTM(50U于10μL pH 6.6的PBS中)消化，接着使用Amicon Ultra-0.5、Ultracel-10膜(Millipore)采用MiliQ洗涤后，光谱分析表明60％的起始物料转化为两种产物，次要产物(24401Da,预期质量24402)脱糖基化的曲妥珠单抗+GalNBuSH(曲妥珠单抗-(GalNBuSH)2)和主要产物(25066Da,预期质量25068)脱糖基化的曲妥珠单抗+GalNBuS-UDPGalNBuS二硫化物。产物之间的比例为约20:80。
Figure IDA0001016023370000011
Figure IDA0001016023370000021
Figure IDA0001016023370000031
Figure IDA0001016023370000041
Figure IDA0001016023370000051
Figure IDA0001016023370000061
Figure IDA0001016023370000071
Figure IDA0001016023370000081
Figure IDA0001016023370000091
Figure IDA0001016023370000101
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Figure IDA0001016023370000121
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Figure IDA0001016023370000141
Figure IDA0001016023370000151

Claims (17)

1.一种制备糖蛋白-缀合物的方法，该方法包括在催化剂存在下，使包含含有末端GlcNAc-部分的聚糖的糖蛋白与Su(A)x-P接触以获得经修饰的糖蛋白，其中所述催化剂选自β(1,4)-半乳糖基转移酶、β(1,3)-N-半乳糖基转移酶、包含突变型催化结构域的β(1,4)-半乳糖基转移酶和包含突变型催化结构域的β(1,3)-N-半乳糖基转移酶；其中Su(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物Su，其中x为1，其中A位于Su的C2或C6上且其中A独立地选自巯基或其前体、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基；其中Su选自半乳糖(Gal)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和岩藻糖(Fuc)；其中P为核苷酸，选自尿苷二磷酸(UDP)、鸟苷二磷酸(GDP)和胞苷二磷酸(CDP)；且其中含有末端GlcNAc-部分的聚糖为式(101)或(102)的聚糖：
Figure FDA0002865962920000011
其中：
b为0或1；
d为0或1；
e为0或1；且
G为单糖或包含2至20个糖部分的直链或支链的低聚糖；
并且使经修饰的糖蛋白与接头-缀合物反应以获得糖蛋白-缀合物；其中所述接头-缀合物包含官能团B和一个或更多个目的分子，其中所述官能团B为能与经修饰的糖蛋白的聚糖中的官能团A反应的官能团。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述催化剂选自包含突变型催化结构域的β(1,4)-半乳糖基转移酶和包含突变型催化结构域的β(1,3)-N-半乳糖基转移酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述催化剂为包含源自β(1,4)-半乳糖基转移酶的突变型催化结构域的催化剂，选自牛β(1,4)-Gal-T1 GalT Y289L、GalT Y289N、GalTY289I、GalT Y289F、GalT Y289M、GalT Y289V、GalT Y289G和GalT Y289A。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖蛋白是抗体。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括提供包含在非还原端含有末端GlcNAc-部分的聚糖的糖蛋白的步骤。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述经修饰的糖蛋白包含式(105)或(106)的聚糖：
Figure FDA0002865962920000021
其中：
b为0或1；
d为0或1；
e为0或1；
G为单糖或包含2至20个糖部分的直链或支链的低聚糖；且
Su(A)x是包含x个官能团A的糖衍生物Su，其中x为1，其中A位于Su的C2或C6上且A独立地选自巯基、卤素、磺酰氧基、卤代乙酰氨基、巯基乙酰氨基和磺化的羟基乙酰氨基，其中Su选自半乳糖(Gal)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和岩藻糖(Fuc)。
7.根据权利要求1所述的方法，其中：
(a)当所述经修饰的糖蛋白为经卤素修饰的糖蛋白或经卤代乙酰氨基修饰的糖蛋白时，官能团B包含巯基、醇基或氨基；或
(b)当所述经修饰的糖蛋白为经巯基修饰的糖蛋白或经巯基乙酰氨基修饰的糖蛋白时，官能团B包含N-马来酰亚氨基或卤代乙酰氨基或烯基；或
(c)当所述经修饰的糖蛋白为经磺酰氧基修饰的糖蛋白或经磺化的羟基乙酰氨基修饰的糖蛋白时，官能团B包含巯基、醇基或氨基。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述经修饰的糖蛋白为经巯基修饰的糖蛋白或经巯基乙酰氨基修饰的糖蛋白，且官能团B包含联烯酰氨基。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法可获得的糖蛋白-缀合物。
10.式(121)、(122)、(123)、(124)、(125)或(126)的糖蛋白-缀合物：
Figure FDA0002865962920000031
Figure FDA0002865962920000041
其中：
Pr代表蛋白质；
L为接头；
D为目的分子；
r为1至20；
x为1；
y为1至20；
b为0或1；
d为0或1；
e为0或1；
p为0或1；
Q为-N(H)C(O)CH2-或CH2；
Su为选自半乳糖(Gal)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和岩藻糖(Fuc)的糖或糖衍生物；
G为单糖或包含2至20个糖部分的直链或支链的低聚糖；且
R9选自L(D)r、氢、C1-C24烷基、C6-C24芳基、C7-C24烷基芳基和C7-C24芳基烷基，所述C1-C24烷基、C6-C24芳基、C7-C24烷基芳基和C7-C24芳基烷基任选地被取代。
11.根据权利要求9所述的糖蛋白-缀合物，其中所述糖蛋白-缀合物是抗体-缀合物。
12.根据权利要求10所述的糖蛋白-缀合物，其中所述糖蛋白-缀合物是抗体-缀合物。
13.根据权利要求11或12所述的糖蛋白-缀合物，其中抗体通过接头L缀合于目的分子D，其中D选自药学活性物质。
14.根据权利要求9所述的糖蛋白-缀合物在制备药物中的用途。
15.根据权利要求10所述的糖蛋白-缀合物在制备药物中的用途。
16.根据权利要求11或12所述的糖蛋白-缀合物在制备药物中的用途。
17.根据权利要求13所述的糖蛋白-缀合物在制备药物中的用途。
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