CN117157107A - 多功能抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有至少一种抗体Ab和两种不同的有效负载D1和D2的多功能抗体构建体，所述构建体具有结构(1)或(2)。其中，L1、L2、L3、L4和L5为接头；x1和x2各自独立地为1‑8范围内的整数，其中x1+x2＝2‑10；BM为支链部分；m和n各自独立地为0或1；x3为1‑4范围内的整数；D1和D2为两个不同的选自多肽、小分子、细胞毒素和寡核苷酸的有效负载，其中D1和D2中的至少一个是多肽。根据本发明的多功能抗体构建体适用于医药，例如用于治疗癌症、病毒感染、细菌感染、神经系统疾病、自身免疫疾病、眼病、高胆固醇血症和淀粉样变性。

Description

多功能抗体
技术领域
本发明涉及具有多种功能的抗体。更具体而言，本发明涉及将两种(或更多种)功能的分子连接到抗体上而无需在如连接前对抗体进行基因工程的构建体和组合物，其中功能分子可包括细胞毒素、多肽或其他有效负载。例如，所得到的多功能抗体构建体可用于治疗。
背景技术
单克隆抗体作为精心选择的生物受体的蛋白配体，其为选择性地在体内靶向疾病或特定病原体的部位提供了理想的递送平台。抗体(也称为配体)可以是小蛋白形式(scFv’s、Fab片段、DARPins、亲和体等)，但通常是单克隆抗体(mAb)，这些抗体是基于它们对给定抗原的高选择性和亲和力、长循环半衰期和几乎没有免疫原性而选择的。例如，已知与特定癌症相关抗原选择性结合的单克隆抗体可通过结合、内化、细胞内加工和最终释放活性分解代谢物而用于将化学缀合的细胞毒剂递送至肿瘤。细胞毒剂可以是小分子毒素、蛋白毒素或其他形式，如寡核苷酸。因此，可以选择性地清除肿瘤细胞，同时不损害未被抗体靶向的正常细胞。类似地，抗菌药物(抗生素)与抗体的化学缀合可用于治疗细菌感染，而抗炎药物的缀合物正在研究用于治疗自身免疫性疾病，例如将寡核苷酸连接至抗体上是一种潜在的有前途的治疗神经肌肉疾病的方法。因此，将活性药物靶向递送至选择的特定细胞位置的概念是治疗多种疾病的有效方法，与相同药物的全身给药相比具有许多有益方面。
使用单克隆抗体靶向递送特定蛋白试剂的替代策略是通过DNA重组技术将特定蛋白与抗体基因融合，例如轻链或重链(或两者)上的N端或C端，或两个抗体结构域之间。在这种情况下，将感兴趣的生物活性蛋白(例如蛋白毒素，如假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A(PE38)或抗CD3单链可变片段(scFv))基因编码为与抗体的融合体(可能但不一定通过肽间隔基)，因此将抗体表达为融合蛋白。肽间隔基可以包含或不包含蛋白酶敏感的切割位点。
单克隆抗体也可以在蛋白序列本身中进行基因修饰，以修饰其结构从而引入(或去除)特定特性。例如，可以在抗体Fc-片段中进行突变以消除与Fc-γ受体的结合，可以调节与FcRn受体的结合或与特定癌症靶标的结合，或者可以对抗体进行工程改造以降低pl和控制循环中的清除率。
癌症治疗中的新兴策略涉及使用能够同时与多种抗原或表位结合的抗体，即所谓的双特异性抗体(同时针对两种不同的抗原或表位)，或三特异性抗体(针对三种不同的抗原或表位)等等，如记载于Kontermann和Brinkmann,Drug Discov.Today 2015,20,838-847(通过引用纳入本文)中。例如，具有“双靶标”功能的双特异性抗体可以干扰与癌症、增殖或炎症过程等相关的多种表面受体或配体。双特异性抗体还能使靶标靠近，支持一个细胞上蛋白复合物的形成，或触发细胞间的接触。“强制连接(forced-connection)”功能的实例包括支持凝血级联过程中蛋白复合物的双特异性抗体，或肿瘤靶向免疫细胞招募剂和/或激活剂。根据不同的生产方法和结构，双特异性抗体在抗原结合位点的数量、几何形状、血清中的半衰期和效应功能方面各不相同。在这方面，双特异性抗体不能与双价抗体混淆，双价抗体是指对称的IgG能够通过两个相同的CDR中的每一个同时与两个相同的靶标结合。
双特异性抗体或三特异性抗体还可含有另外的功能，例如细胞毒剂、多肽细胞因子、寡核苷酸、抗生素或抗病毒剂。从而有效地将双特异性抗体转化为三功能分子，将三特异性抗体转化为四功能分子，以此类推。多功能抗体中的不同功能各自具有特定的生物学功能，包括但不限于结合、信号传导、免疫细胞参与、诱导效应功能、检查点抑制、细胞活化、细胞下调、细胞杀伤、基因沉默、基因活化。不同的功能可以独立作用，以诱导特定的生物反应(相加效应)，也可以相互增强其活性(协同效应)。
多年来，多功能抗体已开发出多种不同的形式，大致可分为IgG样(带有Fc-片段)和非IgG样(缺少Fc-片段)形式，如记载于Kontermann和Brinkmann,Drug Discov.Today2015,20,838-847和Yu和Wang,J.Cancer Res.Clin.Oncol.2019,145,941-956(通过引用纳入本文)中。大多数双特异性抗体均通过以下三种方法之一产生的：两个杂交瘤系的体细胞融合(细胞杂交瘤)、基因(蛋白/细胞)工程或与交联剂的化学缀合，目前共有60多种不同的技术平台。
基于全IgG分子结构的IgG样形式包括但不限于具有双变异结构域(DVD-Ig)的IgG、Duobody技术、knob-in-hole(KIH)技术、普通轻链技术和cross-mAb技术，而截短IgG版本包括ADAPTIR、XmAb和BEAT技术。非IgG样方法包括但不限于BITE、DART、TandAb和ImmTAC技术。双特异性或三特异性抗体也可以通过将不同的抗原结合分子(如scFv或Fab)与其他蛋白结构域融合而产生，这样就能包含更多的功能。例如，与白蛋白融合的两个scFv片段，即赋予了抗体片段具有血清白蛋白的长循环时间，如证明于Müller等人,J.Biol.Chem.2007,282,12650-12660(通过引用纳入本文)中。另一个实例是基于cAMP-依赖性蛋白激酶A和蛋白A激酶-锚定蛋白的异源二聚体的“对接-锁定(dock-and-lock)”方法，如报道于Rossi等人,Proc.Nat.Acad.Sci.2006,103,6841-6846(通过引用纳入本文)中。这些结构域可与Fab片段和整个抗体连接，以形成多价双特异性抗体，如显示于Rossi等人,Bioconj.Chem.2012,23,309-323中。对接-锁定策略要求在靶向抗体和肽片段之间生成融合蛋白，以便对接到蛋白A激酶-锚定蛋白上。治疗性Ab片段(scFv、双特异抗体)也可与白蛋白或与白蛋白结合的蛋白融合，这可将药物在血液中的半衰期延长五至六倍。这种分子的构建结果难以预测，因此，不同的Ab片段融合或Ab与其他蛋白结合产生的双特异性抗体在新治疗分子的研究和开发中应用有限。
尽管不常用于此含义，但任何对称的Y型IgG抗体均可被视为双特异性抗体，前提是其Fc-结构域中含有复合N-聚糖。这样的抗体能够同时(a)通过其多肽补体依赖区(CDR)与特异性抗原结合，并且(b)通过其N-聚糖与各种Fc-γ受体I、II和III(也称为CD64、CD32和CD16)结合。例如，曲妥珠单抗(trastuzumab)是一种与癌细胞上的HER2抗原结合的抗体，并通过效应器功能(至少部分)发挥其生物效应，即抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，所有这些效应均通过其复合N-聚糖与特定蛋白或受体结合而引发。同样，如果任何双特异性抗体能与(a)两种不同的特异性抗原(或表位)和(b)免疫细胞受体(其聚糖)结合，则双特异性抗体可被视为三特异性抗体。例如，卡妥索单抗(catumaxomab)是已知的抗体，它能同时与细胞表面受体EpCam和CD3结合，因此卡妥索单抗是双特异性抗体。然而，由于其复合N-聚糖与抗体的Fc部分相连，能同时与NK细胞上的CD16结合的能力，因此它通常被称为三特异性抗体。为避免疑义，如果抗体的Fc区发生突变，使N-聚糖不能与Fc-γ受体结合，或通过其他方法(如完全移除N-聚糖)使翻译的Fc-沉默，那么这种双特异性抗体绝不会被视为三特异性抗体。
众所周知，真正意义上的多功能抗体，即不是指结合Fc-聚糖，而是具有同时结合多个靶标的CDR的抗体，例如Wu等人Nature Cancer 2020,1,86-98(通过引用纳入本文)记载了一种结合CD38、CD3和CD28的三特异性三功能融合IgG抗体。类似地，CDR-Life(https://www.cdr-life.com/science/#pipeline)也在开发一种靶向BCMA、PD-L1和CD3的三特异性三功能抗体。Numab Therapeutics(www.numab.com)记载了一种与PD-L1、HER-2、CD-3和HSA结合的四价四功能抗体。
双特异性、三功能抗体在本领域也是已知的，例如，Affimed(www.affimed.com)开发了一种基于能够与两种不同抗原(如CD200和BCMA)以及CD16结合的抗体的aTriFlex技术。类似地，GT Biopharma正在开发一种基于与细胞因子(IL-15)融合的两种抗体片段(抗CD33和抗CD16)的融合的双特异性三功能蛋白，如记载于Vallera et al.Clin.CancerRes.2016,22,3440-3451(通过引用纳入本文)中。Vallera等人Cancers 2020,12,2659-2677(通过引用纳入本文)记载了一种与B7-H3和融合至IL-15的CD16结合的类似的三功能构建体。双特异性、三功能抗体-药物缀合物也是本领域已知的，例如，Li等人Cancer Cell2016,29,117-129(通过引用纳入本文)报道了MEDI4276。双特异性三功能抗体-药物缀合物的另一个实例是Zymeworks(www.zymeworks.com)开发的ZW49，它基于靶向HER-2上两个不同表位的双特异性抗体，并与澳瑞他汀(auristatin)有效负载缀合。第三个实例是Merck-Serono开发的M1231，其为一种靶向MUC-1和EGFR的双特异性抗体，并与哈米特林(hemiasterlin)细胞毒性有效负载缀合。
在本文中，任何也能与Fc-γ受体结合的单特异性IgG抗体将被称为单特异性双功能抗体，双特异性抗体将被称为双特异性三功能抗体。根据同样的推理，Fc-沉默的单特异性或双特异性IgG抗体将分别称为单特异性、单功能抗体或双特异性、双功能抗体。与细胞因子、寡核苷酸或细胞毒性有效负载缀合的单特异性抗体(任何类型)称为双功能抗体，与细胞因子、寡核苷酸或细胞毒性有效负载缀合的双特异性IgG抗体称为三功能抗体。在单特异性抗体上共价连接两种不同的小分子、两种不同的寡核苷酸或两种不同的肽片段，或这些的组合，将被称为单特异性三功能抗体。
Brennan等人Science 1985,229,81-83(通过引用纳入本文)中首次使用化学缀合方法生成非IgG型双特异性抗体：将兔IgG胃蛋白酶溶解得到的两个Fab2片段还原，然后氧化，得到双特异性Fab2。类似地，Glennie等人1987,139,2367-2375(通过引用纳入本文)也报道了与半胱氨酸残基相互作用的同双官能团和异双官能团试剂。Gall等人,Exp.Hematol.2005,33,452-459(通过引用纳入本文)中示出了利用抗CD3和CD20(rituximab(利妥昔单抗))的Ab的化学缀合作用，获得具有双特异性抗体包被表面的T细胞。用Traut’s试剂处理OKT3(抗CD3)，然后与马来酰亚胺功能化的利妥昔单抗(通过将利妥昔单抗与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(sulfo-SMCC)预处理而得到)混合，确保了双特异性CD20×CD3的产生。通过两种抗体的随机化学缀合，再经过随机异二聚化，双特异性抗体不可避免地成为一种高度异质的混合物(也含有多聚体)。迄今为止报道的唯一具有位点-特异性的化学方法为CovX-Body技术，正如Doppalapudi等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.2007,17,501-506(通过引用纳入本文)所报道的，其原理是在靶向抗体中加入醛缩酶催化抗体位点，然后用经氮杂环丁酮-基团化学修饰的肽片段进行处理，从而实现自发连接。双特异性抗体是通过在两个抑制VEGF或血管生成素2的短肽中加入支链接头，然后再加入Ab，正如Doppalapudi等人Proc.Nat.Acad.Sci.2010,107,22611-22616(通过引用纳入本文)所报道的。
目前，基于化学Ab或Ab片段缀合的双特异性抗体生成形式已不再使用，特别是由于产品收率低(纯度低)和成本高。此外，DNA重组技术的进步使得融合蛋白得以高效生成，并取得了积极的临床效果。无论如何，如果能确保对化学计量的位点特异性进行适当控制，非遗传化学修饰方法可显著加快临床试验的时间。
已经或正在进行临床开发的双特异性抗体(其均为Fc-沉默，因此也具有双功能)的实例有：贝林妥欧单抗(blinatumomab)(CD19×CD3)、GBR1302(Her2×CD3)、MEDI-565(CEA×CD3)、BAY2010112(PSMA×CD3)、RG7221(血管生成素×VEGF)、RG6013(FIX×FX)、RG7597(Her1×Her3)、MCLA128(Her2×Her3)、MM111(Her2×Her3)、MM141(IGF1R×Her3)、ABT122(TNFα×IL17)、ABT981(IL1a×Il1b)、ALX0761(IL17A×IL17F)、SAR156597(IL4×IL13)、AFM13(CD30×CD16)和LY3164530(Her1×cMET)。
在癌症治疗领域，一种流行的策略是使用双特异性抗体，其中一个CDR与上调的肿瘤相关抗原(TAA或简称靶标)结合，另一个CDR与存在于癌症破坏性免疫细胞(如T细胞或NK细胞)上的受体结合。这种双特异性抗体也分别称为T细胞或NK细胞重定向抗体。虽然免疫细胞重定向的方法已有30多年的历史，但新技术正在克服第一代免疫细胞重定向抗体的局限性，特别是延长半衰期以允许间歇给药、降低免疫原性和提高安全性。目前，已有一种药物(贝林妥欧单抗或)获得批准，另有30多种双特异性形式处于不同的临床开发阶段。
与其他治疗严重疾病的方法一样，治疗性双特异性抗体也会引起不同的副作用，其中最常见的副作用是恶心、呕吐、腹痛、疲劳、白细胞减少、中性粒细胞减少和血小板减少。许多患者在治疗期间，血液中会出现针对治疗性双特异性抗体的Ab。大多数不良反应发生在治疗初期，在大多数情况下，副作用会在持续治疗后恢复正常。有关治疗性BsAb不良反应的大部分数据都是关于贝林妥欧单抗和卡妥索单抗的，因为这两种药物已经过多次临床试验。贝林妥欧单抗和卡妥索单抗治疗的常见副作用是“细胞因子风暴”、细胞因子水平升高和一些神经系统事件。细胞因子释放相关症状是许多治疗性mAb的一般副作用，其发生是由于特定的作用机制：使用细胞毒性T细胞作为效应器。通过小剂量初始用药结合随后的大剂量用药，以及皮质类固醇(地塞米松(dexamethasone))和抗组胺药的预处理，可将细胞因子释放综合征降至最低。
减少与免疫细胞参与疗法相关的不良事件，特别是细胞因子释放综合征，以及避免使用阶梯剂量方案的一种方法报道于Bacac等人,Clin.Cancer Res.2018,24,4785-4797(通过引用纳入本文)中。研究表明，通过在全IgG抗CD20抗体的一个Fab臂中插入抗CD3片段，可以生成具有2:1分子形式的CD20×CD3 T细胞接合器(cell engager)，即与CD20的双价结合并且与CD3的单价结合，从而实现明显更高的效力和更安全的给药。由此产生的双特异性抗体具有长半衰期和高效力，这得益于其与CD20的高活性双价结合，以及B细胞和T细胞结合域以2:1的分子形式头尾定向。将携带“PG LALA”突变的异源二聚体人IgG1 Fc区域整合在一起，以取消与Fcg受体和补体成分C1q的结合，同时保持与新生儿Fc受体(FcRn)的结合，从而实现长循环半衰期。这种双特异性CD20-T细胞接合器呈现的效力远高于其他正在临床开发的CD20-TCB抗体，而且对表达低水平CD20的肿瘤细胞有效。CD20-TCB还能在效应物与靶标比率较低的原发性肿瘤样本中显示出强大的活性。
到目前为止，研究最多的用于T细胞接合器的受体涉及活化T细胞上的CD3受体。T细胞重定向双特异性抗体是癌症治疗中最常用的方法之一，30年前发表的第一份报告中，双特异性抗体一方面特异性地与T细胞上的CD3结合，另一方面特异性地与癌细胞的抗原结合，而不依赖于它们的T细胞受体(TCR)。过去10年中，T细胞重定向抗体在血液恶性肿瘤和实体瘤治疗方面取得了长足进展。卡妥索单抗是首个靶向上皮细胞粘附分子(EpCAM)和CD3的双特异性抗体，实际上它是三特异性的，因为它还能通过其聚糖与CD16结合。卡妥索单抗在欧洲(2009)获批用于治疗恶性腹水(但因商业原因于2017年撤回)。在这一发现之后，另一种靶向CD19和CD3的双特异性药物(贝林妥欧单抗)也获得了成功，2014年美国食品药品管理局(FDA)批准其上市，用于治疗复发或难治性前体B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)。目前，虽然许多患者受益于贝林妥欧单抗，但在临床研究中，还有许多具有不同形式和特征的T细胞重定向抗体显示出潜在的抗肿瘤疗效。
已知结合T细胞的抗体在本领域是已知的，记载于Martin等人,Clin.Immunol.2013,148,136-147和Rossi等人,Int.Immunol.2008,20,1247-1258(均通过引用纳入本文)中，例如OKT3、UCHT3、BMA031及其人源化版本。已知能与Vγ9Vδ2T细胞结合的抗体也是已知的，例如参见de Bruin等人,J.Immunol.2017,198,308-317(通过引用纳入本文)。
目前，将T细胞重定向至肿瘤的概念已扩展至其他受体，这些受体同时具有共刺激，如CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD27或ICOS。
与T细胞接合类似，NK细胞招募到肿瘤微环境也在广泛研究之中。NK细胞接合通常基于结合CD16、CD56、NKp46或其他NK细胞特异性受体，如Konjevic等人,2017,http://dx.doi.org/10.5772/intechopen.69729(通过引用纳入本文)所总结的。NK细胞接合器可通过将NK结合抗体(片段)融合或插入与肿瘤相关抗原结合的全IgG而产生。或者，也可以使用特异性细胞因子，鉴于NK细胞的抗肿瘤活性受多种激活和抑制性NK细胞受体的调节，NK细胞受体表达和信号的改变是细胞毒性NK细胞功能减弱的基础。基于这一点和预测性体外研究结果，包括IFNα、IL-2、IL-12、IL-15和IL-18在内的细胞因子已被用于全身或体外激活和扩增NK细胞，并通过增加NK细胞激活受体的表达和诱导细胞毒性效应分子来提高NK细胞的抗肿瘤活性。此外，这种以细胞因子为基础的疗法能增强NK细胞的增殖和调节功能，而且有研究表明，它能诱导NK细胞表现出细胞因子诱导的记忆样特性，这种特性代表了一种新定义的NK细胞亚群，能提高NK细胞的活性和寿命。对于癌症疗法以及治疗慢性炎症，人们开发了多种细胞因子有效负载，并在临床前试验中进行了测试。研究发现，IL-2、TNF和IL-12等促炎细胞因子已用于肿瘤疗法，因为已发现它们可增加和激活肿瘤部位白细胞的局部浸润。例如，IL-2单药疗法已作为阿地白介素获得批准，目前正与纳武利尤单抗(nivolumab)(NKTR-214)联合进行III期临床试验。类似地，IL-15的各种重组版本(rhIL-15或ALT-803)也在临床评估中。已报道了IL-15的特异性突变体，例如Behár等人,Prot.Engin.Des.Sel.2011,24,283-290和Silva等人,Nature 2019,565,186-191(均通过引用纳入本文)；IL-15与IL-15受体复合物(IL-15R)，如Rubinstein等人,Proc.Nat.Acad.Sci.2006,103,9166-9171(通过引用纳入本文)所报道的；以及IL-15和IL-15R的融合构建物(Sushi结构域)也进行了抗肿瘤活性评估，例如参见Bessard等人,Mol.Canc.Ther.2009,8,2736-2745(通过引用纳入本文)。此外，还开发了抗体，例如Boyman等人,Science 2006,311,1924-1927,Arenas-Ramirez et al.,Sci.Transl.Med.2016,8,DOI:10.1126/scitranslmed.aag3187,Lee et al,Oncoimmunology 2020,9,e1681869,DOI:10.1080/2162402X.2019.1681869,WO 2017070561,WO2018217058,WO2016005950(全部通过引用纳入本文)中所报道的，用于招募内源性IL-2，最有利的方式是与通常与IL-2Rα结合的IL-2结构域结合，从而导致CD8+T细胞的选择性激活，而不激活Treg。相比之下，IL-10等免疫抑制细胞因子可被视为治疗慢性炎症或其他疾病(如子宫内膜异位症)的有效负载。
促炎细胞因子的全身性给药可导致严重的脱靶相关不良反应，这可能会限制剂量并阻止升级为治疗活性的方案。某些细胞因子产品(如IL-2、TNF、IL-12)的推荐剂量为个位数毫克范围(每人)甚至更低。与静脉注射促炎细胞因子相关的不良反应可能包括低血压、发热、恶心或流感样症状，偶尔也可能导致严重的血液、内分泌、自身免疫或神经系统事件。鉴于这些考虑因素，生物医学显然需要开发“下一代”细胞因子产品，这些产品具有更好的耐受性，并能在疾病部位发挥优先作用，有助于保护正常组织，正如Murer和Neri,NewBiotechnol.2019,52,42-53(通过引用纳入本文)中所总结的。因此，向肿瘤靶向输送细胞因子的目的是诱导局部促炎环境，从而激活和招募免疫细胞。文献中记载了抗体-细胞因子融合列表，报道于Hutmacher和Neri,Adv.Drug Deliv.Rev.2018,141,67-91(通过引用纳入本文)中。Murer和Neri,New Biotechnol.2019,52,42-53(通过引用纳入本文)中提供了临床细胞因子融合列表。各种IL-15融合蛋白正在进行临床前评估，正如"T-cell&NK-CellEngaging Bispecific Antibodies 2019:A Business,Stakeholder,Technology andPipeline Analysis",2019，由La Merie出版社出版(通过引用纳入本文)中所总结的，例如由Trike技术制备的OXS-3550(CD33-IL-15-CD16融合)目前处于I期。
免疫细胞参与领域的常见策略是使抗体与Fc-γ受体的结合能力消灭或消除，这对药物有多种影响。除去与Fc-γ受体结合的第一个后果是Fc-γ受体介导的例如巨噬细胞或巨核细胞对抗体的摄取减少，这可能导致剂量限制性毒性，例如(曲妥珠单抗-DM1)和LOP628所报道的。体内抗体的选择性去糖基化为治疗抗体介导的自身免疫患者提供了机会。去除重组治疗糖蛋白中的高甘露糖糖型可能是有益的，因为已知高甘露糖糖型会被内源性甘露糖受体特异性摄取并导致快速清除，从而影响疗效，例如记载于Gorovits和Krinos-Fiorotti,Cancer Immunol.Immunother.2013,62,217-223和Goetze等人,Glycobiology 2011,21,949-959(均通过引用纳入本文)。此外，Van de Bovenkamp等人,J.Immunol.2016,196,1435-1441(通过引用纳入本文)记载了高甘露糖聚糖如何影响免疫力。Reusch和Tejada,Glycobiology 2015,25,1325-1334(通过引用纳入本文)记载了单克隆抗体中不适当的糖基化可能导致表达的Ig基因不能有效地产生抗体。
在免疫治疗领域，糖基化抗体与免疫细胞上的Fc-γ受体结合，可能会在抗体与肿瘤相关抗原结合之前诱发免疫系统的全身性激活，导致细胞因子风暴(细胞因子释放综合征，CRS)。因此，为了降低CRS的风险，临床上绝大多数免疫细胞接合器都是基于Fc沉默抗体，缺乏与Fc-γ受体结合的能力。此外，双特异性抗体领域的各家公司正在根据靶点结合与免疫细胞参与抗体域的确定比例定制分子结构。例如，罗氏(Roche)正在开发基于非对称单克隆抗体的T细胞接合器，这种抗体通过两个CDR保留了与TAA(如CD20或CEA)的二价结合能力，但只在两条重链中的一条中加入了额外的抗CD3片段(靶标结合与CD3结合的比例为2:1)。类似的策略还可用于抗CD137(4-1BB)、抗OX40、抗CD27与T细胞的接合/激活，或抗CD16、CD56、NKp46或其他NK细胞特异性受体与NK细胞的接合/激活。
与Fc-γ受体的结合失效可以通过多种方式实现，例如通过抗体(特别是Fc-片段)的特异性突变或通过去除Fc-片段(CH2结构域，N297附近)中天然存在的聚糖。可以通过对Fc-结构域进行基因修饰，如N297Q突变或T299A突变，或在重组表达抗体后使用PNGase F或内切糖苷酶等酶法去除聚糖。例如，已知内切糖苷酶H能修剪高甘露糖和杂交糖型，而内切糖苷酶S能修剪复合型聚糖，并在一定程度上修剪杂交聚糖。内切糖苷酶S2能够修剪复合糖、杂交糖和高甘露糖糖型。内切糖苷酶F2能够修剪复合型聚糖(但不能修剪杂交型)，而内切糖苷酶F3只能修剪同时具有1,6-岩藻糖基化的复合型聚糖。另一种内切糖苷酶——内切糖苷酶D只能水解Man5(M5)聚糖。Freeze等人在Curr.Prot.Mol.Biol.,2010,89:17.13A.1-17(通过引用纳入本文)中公开了不同内切糖苷酶的具体活性综述。用于治疗的蛋白去糖基化的另一个优点是促进了批次间的一致性并显著提高了均一性。
可以从ADC技术领域得到启发，来制备抗体-蛋白缀合物以生成双特异性抗体或抗体-细胞因子融合物。
生物共轭技术有许多已知的技术，如G.T.Hermanson,"BioconjugateTechniques",Elsevier,3rd Ed.2013(通过引用纳入本文)中所总结的。通过随机缀合制备ADC的技术主要有两种，一种是基于赖氨酸侧链的酰化，另一种是基于半胱氨酸侧链的烷基化。ε-氨基基团在赖氨酸侧链上的酰化通常是通过将蛋白置于基于活性酯或活性碳酸盐衍生物的试剂中来实现的，例如SMCC就被用于的制造。半胱氨酸侧链硫醇基团烷基化的主要化学方法是使用马来酰亚胺试剂，例如用于制造/>除了标准的马来酰亚胺衍生物外，一系列马来酰亚胺变体也可用于更稳定的半胱氨酸缀合物，例如已证明于James Christie等人,J.Contr.Rel.2015,220,660-670和Lyon等人,Nat.Biotechnol.2014,32,1059-1062(均通过引用纳入本文)中。与半胱氨酸侧链缀合的另一项重要技术是通过二硫键，这是一种可生物活化的连接方式，已被用于将蛋白毒素、化疗药物和探针与载体分子进行可逆连接(例如参见Pillow等人,Chem.Sci.2017,8,366-370)。半胱氨酸烷基化的其他方法包括卤代乙酰胺(通常为溴乙酰胺或碘乙酰胺)的亲核取代等，例如参见Alley等人,Bioconj.Chem.2008,19,759-765(通过引用纳入本文)，或基于不饱和键的迈克尔加成的各种方法，例如与丙烯酸酯试剂的反应，例如参见Bernardim等人,Nat.Commun.2016,7,DOI:10.1038/ncomms13128和Ariyasu等人,Bioconj.Chem.2017,28,897-902(均通过引用纳入本文)；与膦酰氨酸盐的反应，例如参见Kasper等人,Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,11625-11630(通过引用纳入本文)；与烯酰胺的反应，参见Abbas等人,Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,7491-7494(通过引用纳入本文)；与氰乙炔基试剂的反应，参见例如Kolodych等人,Bioconj.Chem.2015,26,197-200(通过引用纳入本文)；与乙烯基砜的反应，例如参见Gil de Montes等人,Chem.Sci.2019,10,4515-4522(通过引用纳入本文)；或与乙烯基吡啶反应，例如参见https://iksuda.com/science/permalink/(2020年1月7日访问)。Toda等人,Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,12592-12596(通过引用纳入本文)也报道了与甲磺酰基苯并噁二唑反应进行半胱氨酸缀合。
现已开发出许多方法，通过与抗体中的一个(或多个)预定位点进行位点特异性缀合，使得能够生成具有确定药物抗体比(DAR)的抗体-药物缀合物。位点特异性缀合物通常是通过在抗体中加入特定氨基酸(或序列)作为有效负载附着的锚点来实现的，例如参见Aggerwal和Bertozzi,Bioconj.Chem.2014,53,176-192(通过引用纳入本文)，最典型的是半胱氨酸工程。此外，过去十年中还探索了一系列其他位点特异性缀合技术，其中最突出的是非天然氨基酸的基因编码，例如适合肟连接的对乙酰苯丙氨酸，或适合点击化学缀合的对叠氮甲基苯丙氨酸。大多数基于基因重组抗体的方法都能制备出DAR约为2的ADC。另一种无需重新工程改造抗体的抗体缀合方法涉及还原链间二硫键，然后加入连接到半胱氨酸交联试剂(如双砜试剂)上的有效负载，例如参见Balan等人,Bioconj.Chem.2007,18,61-76和Bryant等人,Mol.Pharmaceutics2015,12,1872-1879(均通过引用纳入本文)；单溴或双溴马来酰亚胺，例如参见Smith等人,J.Am.Chem.Soc.2010,132,1960-1965和Schumacher等人,Org.Biomol.Chem.2014,37,7261-7269(均通过引用纳入本文)；双马来酰亚胺试剂，例如参见WO2014114207；双(苯硫基)马来酰亚胺，例如参见Schumacher等人,Org.Biomol.Chem.2014,37,7261-7269和Aubrey等人,Bioconj.Chem.2018,29,3516-3521(均通过引用纳入本文)；双溴哒嗪二酮，例如参见Robinson等人,RSC Advances2017,7,9073-9077(通过引用纳入本文)；双(卤甲基)苯，例如参见Ramos-Tomillero等人,Bioconj.Chem.2018,29,1199-1208(通过引用纳入本文)；或其他双(卤甲基)芳烃，例如参见WO2013173391。通常，通过半胱氨酸交联制备的ADC具有约4(DAR4)的药物-抗体负载。
Ruddle等人,ChemMedChem 2019,14,1185-1195最近表明，通过选择性还原CH1和CL链间二硫链，然后用含有两个马来酰亚胺单元的对称PDB二聚体处理重键片段，可以从抗体Fab片段(通过木瓜蛋白酶消化全抗体或重组表达制备)制备DAR1缀合物。结果表明，得到的DAR1型Fab片段高度均匀，在血清中稳定，并具有出色的细胞毒性。在后续出版物中，White等人,MAbs 2019,11,500-515，以及WO2019034764(通过引用纳入本文)表明，在事先对抗体进行工程改造后，还可从全IgG抗体中制备DAR1缀合物：或者使用在铰链区只有一个链内二硫键的抗体(Flexmab技术，报道于Dimasi等人,J.Mol.Biol.2009,393,672-692，通过引用纳入本文)，或使用具有额外游离半胱氨酸的抗体，该游离半胱氨酸可通过天然氨基酸突变(如HC-S239C)或插入序列中获得(如HC-i239C，报道于Dimasi等人,Mol.Pharmaceut.2017,14,1501-1516)。通过将得到的半胱氨酸工程改造的ADC与双马来酰亚胺衍生的PBD二聚体反应，证明这两种工程改造的抗体都能生成DAR1 ADC。研究表明，Flexmab衍生的DAR1 ADC对血清中有效负载的损失具有很强的抵抗力，并在HER2阳性胃癌异种移植模型中表现出强大的抗肿瘤活性。此外，与使用单个含马来酰亚胺的PBD二聚体制备的位点特异性DAR2ADC相比，这种ADC在大鼠体内的耐受剂量是后者的两倍。然而，由于DAR1 ADC与DAR2 ADC的最小有效剂量(MED)以相同的系数2增加，因此治疗窗口期并没有得到改善。
WO2014065661和van Geel等人,Bioconj.Chem.2015,26,2233-2242(通过引用纳入本文)中表明，抗体可基于N297处的天然抗体聚糖的酶重塑(由内切糖苷酶修剪并在糖基转移酶作用下引入叠氮修饰的GalNAc衍生物)进行位点特异性缀合，然后利用点击化学连接细胞毒性有效负载。Verkade等人,Antibodies 2018,7,12的研究表明，引入酰化硫酰胺可进一步提高聚糖重塑技术的治疗指数，而且通过选择特定的接头，可将所得抗体-药物缀合物的DAR调整为DAR2或DAR4。研究还证明，在缀合前对聚糖进行修剪会导致所制备的抗体药物缀合物(ADC)与Fc-γ受体的结合无效(Fc-沉默)。通过这项技术制备的ADC与一系列其他缀合技术和目前临床应用的聚糖修饰缀合技术(如ADCT-601(ADC疗法))相比，治疗指数明显提高。
用类似的酶法将抗体转化为叠氮修饰的抗体，并同时进行Fc沉默，报道于Lhospice等人,Mol.Pharmaceut.2015,12,1863-1871(通过引用纳入本文)，采用细菌酶转谷氨酰胺酶(BTG或TGase)。研究表明，用PNGase F对天然糖基化位点N297进行去糖基化，可使邻近的N295成为TGase介导导入的底物，在TGase存在的情况下，将去糖基化后的抗体与含叠氮化物的分子接触后，可将其转化为双叠氮抗体。随后，双叠氮抗体与DBCO修饰的细胞毒素反应，生成带有DAR2的ADC。Cheng等人,Mol.Cancer Therap.2018,17,2665-2675(通过引用纳入本文)报道了基于C端TGase介导的叠氮化物导入的遗传方法，然后通过无金属点击化学将其转化为ADC。
除了小分子的附着，各种点击化学也被充分证明适用于生成蛋白-蛋白缀合物。例如，Witte等人,Proc.Nat.Acad.Sci.2012,109,11993-11998(通过引用纳入本文)显示，通过将分选酶介导的两种互补点击探针(叠氮和DBCO)引入到两种不同的蛋白，然后基于无金属点击化学(菌株促进叠氮-炔环加成或SPAAC)进行无缝连接的组合，可以获得非天然的N对N和C对C蛋白二聚体。Wagner等人,Proc.Nat.Acad.Sci.2014,111,16820-16825(通过引用纳入本文)已使用该方法制备基于C端分选标签与抗流感scFv排序的双特异性抗体，并进一步扩展到Bartels等人,Methods 2019,154,93-101(通过引用纳入本文)使用的基于反电子需求Diels-Alder与四嗪的环加成的无金属单击化学方法。四嗪连接法也在早些时候应用过，例如，Devaraj等人,Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,7013-7016和Robillard等人,Angew.Chem.Ed.Engl.2010,49,3375-3378(均通过引用纳入本文)，通过将反式环辛烯(TCO)首先(随机)化学安装到抗体上对抗体进行抗体修饰。相反，将TCO(或四嗪或环丙烯等用于四嗪连接的点击分子)的位点特异性地引入抗体，可通过多种方法实现，这些方法基于对抗体的事先遗传修饰，如上所述，例如报道于Lang等人,J.Am.Chem.Soc.2012,134,10317-10320,Seitchik etal.,J.Am.Chem.Soc.2012,134,2898-2901和Oller-Salvia,Angew.Chem.Int.Ed.2018,57,2831-2834(均通过引用纳入本文)。
在事先引入分选酶识别序列后，分选酶是一种适用于对蛋白进行位点特异性修饰的酶，正如首次报道于Popp等人,Nat.Chem.Biol.2007,3,707-708中。已知还有许多其他酶-酶识别序列组合也可用于蛋白的位点特异性修饰，例如总结于Milczek,Chem.Rev.2018,118,119-141(通过引用纳入本文)中，特别适用于抗体，正如总结于Falck和Müller,Antibodies 2018,7,4(doi:10.3390/antib7010004)和van Berkel和vanDelft,Drug Discov.Today:Technol.2018,30,3-10(均通过引用纳入本文)。此外，还有多种方法可用于对天然蛋白进行非遗传修饰，正如总结于Koniev和Wagner,Chem.Soc.Rev.2015,44,5495-5551(通过引用纳入本文)；以及对N端修饰，Rosen和Francis,Nat.Chem.Biol.2017,13,697-705和Chen等人,Chem.Sci.2017,8,27172722(均通过引用纳入本文)。上述任何一种方法都可用于将适当的点击探针安装到多肽/蛋白中，例如总结于Chen等人,Acc.Chem.Res.2011,44,762-773和Jung和Kwon,Polymer Chem.2016,7,4585-4598(均通过引用纳入本文)中，并应用于免疫细胞接合器或细胞因子。将互补点击探针安装到靶向肿瘤相关抗原的抗体中后，就可以很容易地生成免疫细胞接合器，而肿瘤结合抗体与免疫细胞粘合剂的化学计量则可以通过适当的技术选择来定制。
Bruins等人,Bioconjugate Chem.2017,28,1189-1193(通过引用纳入本文)表明，抗体可以通过酪氨酸酶介导的适当位置的酪氨酸氧化，通过中间体1,2-醌与细胞毒性有效负载进行位点特异性缀合，该中间体随后可以与应变炔或烯烃进行环加成。该技术被称为应变促进氧化控制醌炔环加成(SPOCQ)。
还开发了化学方法，无需事先进行基因修饰即可对抗体进行位点特异性修饰，例如记载于Yamada和Ito,ChemBioChem.2019,20,2729-2737中。
Kishimoto等人,Bioconj.Chem.2019已开发了通过亲和肽化学缀合(CCAP)进行位点特异性修饰，通过使用能与人IgG-Fc高亲和力结合的多肽，从而实现了用生物素分子或细胞毒性有效负载对Fc-片段中的单个赖氨酸进行选择性修饰。类似地，Yamada等人,Angew.Chem.Int.Ed.2019,58,5592-5597和Matsuda等人,ACS Omega 2019,4,20564-20570(均通过引用纳入本文)均已证明，类似的方法(AJICAPTM技术)可用于在抗体重链的单个赖氨酸上位点特异性地引入硫醇基团。CCAP或AJICAPTM技术也可利用位点特异性引入叠氮基团或其他官能团。
很明显，将免疫细胞接合器或细胞因子与IgG的基因融合会产生同质产物。免疫细胞接合器与抗体的化学缀合已经得到应用，但会导致异质混合物。迄今为止，还没有报道过制备同源双特异性抗体或抗体-细胞因子融合物的方法，不需要事先重新工程改造全长IgG和/或能够定制免疫细胞接合多肽的数量以及IgG和多肽之间的间隔基长度和结构。此外，还没有报道用非遗传方法将IgG转化为Fc沉默的双特异性抗体。
此外，还没有报道用化学方法将两种不同的功能以受控的方式缀合到IgG上，从而将单功能抗体转化为三功能抗体，或将双特异性、双功能抗体转化为四功能抗体。
发明内容
本发明者开发了通过连接至少两种不同的功能(小分子、多肽、寡核苷酸、荧光团、放射性标记等)而无需对IgG进行基因修饰的多功能抗体构建体。通常，抗体对肿瘤细胞具有特异性，多肽有效负载对免疫细胞具有特异性。本发明能够将所得的多功能抗体的分子形式定制到确定的比例(即全IgG CDR中的补体依赖区与新安装的功能标签的比例)。例如，单特异性、单功能的全长IgG抗体可以通过精确安装两种不同功能分子中的两个(各一个)转换成比例为2:1:1的三功能构建体，也可以通过安装四(4)个一种功能的分子和一个另一种功能的分子转换成比例为2:4:1的三功能构建体。此外，本发明也适用于已经是双特异性的IgG(即具有两个不同的CDR，例如Duobody或通过knob-in-hole技术或受控Fab交换技术获得的双特异性IgG)，从而产生给定形式的四功能抗体，例如1:1:1:1，指的是全IgG CDR中的两个补体依赖区(1:1)加上两个新安装的不同功能分子。最后，如果IgG抗体的功能化涉及内切糖苷酶介导的完全去糖基化步骤或内切糖苷酶介导的修剪步骤，那么在不重新工程改造抗体的情况下，所得到的多功能抗体构建体将不再能够与Fc-γ受体结合(Fc-沉默)。本发明还涉及根据本发明的多功能抗体构建体的医学用途。
附图说明
图1示出了生物大分子中一组有代表性(但不全面)的官能团(F)，这些官能团可以是天然存在的，也可以是通过工程改造引入的，它们与活性基团反应后产生连接基团Z。官能团F可以是天然存在的，也可以人工地引入(工程改造)到生物大分子中所选的任意位置。哒嗪连接基团是四氮杂双环[2.2.2]辛烷连接基团重排的产物，该连接基团是四嗪与炔烃反应后失去N2而形成的。连接基团Z是本发明中优选使用的连接基团。
图2示出了将单克隆抗体非基因转化为针对缀合物(F)含有反应位点的抗体的一般过程，其中反应位点可以是点击探针或硫醇基团。反应位点可以位于抗体的不同位置，并与抗体保持一定的比例，具体取决于所采用的技术。抗体也可以转化为含有两个不同反应位点探针(下图结构)或三个不同反应位点(右下图)的抗体，每个反应位点与抗体的比例都是一定的。对于作为反应位点的氨基酸基团，无需对抗体进行修饰，因为它作为侧链天然存在于赖氨酸中。
图3(上)描述了如何形成三功能抗体的步骤：用给定数量(x)的探针(F)(其可以是天然功能性探针或安装在抗体上的点击探针)修饰的IgG抗体可通过支链结构与含有两种不同功能分子A和B的互补探针(Q)反应，反应后形成稳定的键(Q)，从而形成三功能抗体。用于缀合的探针可以从图1所示的任何合适组合中选择。生成的双特异性抗体的化学计量取决于天然存在的探针F的数量或在缀合前安装的探针F的数量，因此不一定所有出现的探针F都会发生反应。可以使用对称的二价IgG(CDR1＝CDR2)，从而得到分子形式为2:x:x的三功能抗体。也可以使用非对称抗体(CDR1≠CDR2)，从而产生分子形式为1:1:x:x的四功能抗体。如果抗体(底部)上存在或安装了两个不同的探针F1和F2，它们可以通过直链结构与两个不同的互补探针(Q1和Q2)反应，每个探针都含有功能分子(分别为A或B)，分子形式可以根据A和B的化学计量进一步变化，从而形成例如2:x:y的分子形式。这两种策略的组合也是可能的(未画出)。
图4示出了在全长抗体(分子形式定义为2:1:1)上精确安装一个A和一个B的三种替代方法。因此，全长抗体首先用两个点击探针F1修饰。在一种方法中(箭头向下)，IgG(F1)2与由两个不同的功能分子A和B组成的构建体接触，该构建体通过支链接头连接到两个互补的点击探针Q1上，这两个探针都将与抗体上的一个F1发生反应。在第二种方法中(箭头右侧)，IgG(F1)2与含有三个互补探针Q1的三价构建体接触，其中两个探针将与IgG(F1)2发生反应，剩下一个游离Q1单元随后可与含有A和B各一个的F1修饰支链构建体发生反应。在第三种方法中(对角箭头)，IgG(F1)2与含有两个互补探针Q1和一个非反应性点击探针F2(也不同于F1)的三价构建体接触。两个点击探针Q将与IgG(F1)2发生反应，剩下的F2随后将与含有A和B的Q2修饰构建体发生反应。
图5示出了适用于无金属点击化学的环辛炔类化合物，以及活性分子Q的优选实施方案。上述列表并不全面，例如，炔烃可以通过氟化、芳香环取代或在芳香环中引入杂原子等方式进一步活化。
图6示出了一系列抗体变体作为起始材料，用于随后转化为抗体缀合物。
图7示出了几种半乳糖胺UDP糖衍生物的结构，这些衍生物可以用例如3-巯基烷酰基(11a)、叠氮乙酰基(11b)、叠氮二氟乙酰基(11c)、炔基(11f)或氧代烷基(11g)在2位上修饰，或在N-乙酰半乳糖胺的6位上用叠氮(烷基)基团(11d)、巯基(烷基)基团(11e)或炔基(11h)修饰。单糖(即移去UDP)是本发明中使用的优选分子Su。
图8描述了基于全长IgG的聚糖重塑和叠氮-环辛炔点击化学反应形成2:2分子形式的双特异性抗体的具体实例。首先通过内切糖苷酶介导的所有不同糖型的修剪对IgG进行酶重塑，然后通过糖基转移酶介导的叠氮糖转移到内切糖苷酶释放的核心GlcNAc上。在下一步中，叠氮重塑的IgG将与多肽(如免疫细胞接合多肽)接触，而这种多肽是用单环辛炔进行无金属点击化学(SPAAC)修饰的，从而形成2:2分子形式的双特异性抗体。本发明也记载了环辛炔-多肽构建体在环辛炔与多肽之间具有特定的间隔基，这样就可以定制IgG-多肽的距离，或赋予由此产生的双特异性抗体其他特性。
图9示例性说明了叠氮糖重塑的抗体如何转化为分子形式为2:1的双特异性抗体，其方法是先将叠氮糖重塑的抗体于适合剪切到双叠氮抗体上的三价环辛炔构建体接触，留出一个游离环辛炔用于随后与叠氮修饰的多肽进行SPAAC，从而有效地将仅一个多肽安装到IgG上。后一种多肽还可以用其他补体点击探针进行修饰，以便与环辛炔反应，例如用四嗪分子进行反电子需求的Diels-Alder环加成反应。本文科构想F和Q(图1)的任何组合。
图10示出了用于与双叠氮糖修饰的mAb反应的三价构建体的各种选择。三价构建体可以是同三价或异三价(2+1形式)。同三价结构体(X＝Y)可由3x环辛炔或3x乙炔或3x马来酰亚胺或3x其他硫醇反应基团组成。例如，异三价构建体(X≠Y)可由两个环辛炔基团和一个马来酰亚胺基团或两个马来酰亚胺基团和一个反式环辛烯基团组成。除非X和Y相互反应(如马来酰亚胺+硫醇)，否则异三价构建体可以以X和Y的任意组合存在。
图11示出了分选酶介导的蛋白连接的一般概念(大写字母表示常用的氨基酸缩写)，用于与感兴趣的蛋白进行C端(上)或N端(下)连接。对于C端连接，将LPXTGG序列重组与感兴趣的蛋白的C端融合，其中X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸，GG可以进一步融合到其他氨基酸(序列)，通过底物GGG-R(R为感兴趣的功能)处理形成新的肽键，从而实现分选酶介导的连接。类似地，对于N端连接，将GGG序列与感兴趣的蛋白的N端融合，与LPXTGG序列连接，其中亮氨酸用感兴趣的功能性R修饰，X可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸，GG可以进一步与其他氨基酸(序列)融合。
图12示出了一系列用于分选的二价BCN试剂(105、107、118、125、129、134)、三价BCN试剂(143、145、150)和单价BCN试剂(154、157、161、163、168)。
图13示出了一系列配备N端GGG(169-171和176)或C端LPETGG(172-175)的无金属点击试剂，适用于蛋白的分选。
图14示出了一系列基于MMAE或MMAF的双BCN修饰的细胞毒性药物。
图15示出了一系列基于MMAE(303)、PBD二聚体(304)、卡利奇霉素(calicheamicin)(305)或PNU159,682(306)的其他双BCN修饰的细胞毒性药物。
图16示出了一系列基于MMAE或MMAF的二价细胞毒性药物，这些药物具有各种环辛炔(BCN、DIBO、DBCO，具有各种环辛炔间接头变化)或叠氮化物或马来酰亚胺。
图17示出了基于MMAE(312和LD14)或MMAF(313)的三种单价直链接头药物的结构。
图18示出了一系列二价或三价交联剂(XL01-XL09、XL11、XL12、XL14)。
图19示出了带有C-端LPETGG、C-端G4SY、N-端SLR(或两者)，也可能带有G4S间隔的scFv的hOKT3(200)、mOKT3(PF04)和α-4-1BB(PF31)的结构。结构201-204和PF01、PF02、PF04-PF09是200、PF04或PF31的衍生物，其配备有通过酶或化学衍生化获得的合适的点击探针(BCN、四嗪或叠氮化物)。
图20示出了200的二价双BCN修饰的衍生物。
图21示出了IL-15的各种突变体(PF18)或IL-15R-IL-15融合蛋白(207、208和PF26，IL-15R＝IL-15受体的Sushi结构域)及其衍生物的结构，其配备有合适的点击探针(BCN、四嗪或叠氮化物)或马来酰亚胺，在每种情况下均在其N端进行修饰以实现位点特异性修饰。
图22示出了PF26的二价衍生物，其配备了双BCN(PF27和PF29)或双马来酰亚胺(PF28)，以及由PF18衍生的双BCN修饰的IL-15(PF30)。
图23示出了一系列功能化蛋白片段：通过XL11与PF03反应得到PF32，再与PF19进一步反应得到PF34。三价BCN试剂105与PF18反应得到PF33，而PF35则是通过PF09与PF27反应得到的。
图24示出了SDS-PAGE分析：泳道1-利妥昔单抗；泳道2-rit-v1a；泳道3-rit-v1a-145；泳道4-rit-v1a-(201)2；泳道5-rit-v1a-145-204；泳道6-rit-v1a-145-PF01；泳道7-rit-v1a-145-PF02。凝胶用考马斯(coomassie)染色以示出总蛋白。样品在非还原条件下(左)在6％ SDS-PAGE上分析，在还原条件下(右)在12％ SDS-PAGE上分析。
图25示出了在非还原条件下对6％凝胶进行的SDS-PAGE分析：泳道1-trast-v1a；泳道2-trast-v1a-(PF07)1；泳道3-trast-v1a-(PF07)1-(PF33)1；泳道4-trast-v1a-(PF07)1-(LD11)1。凝胶用考马斯染色以示出总蛋白。
图26示出了在非还原条件下对6％凝胶进行的SDS-PAGE分析：泳道1-rit-v1a-145-(PF02)1；泳道2-rit-v10-[145-PF02]-[LD09]；泳道3-rit-v10-[145-PF02]-[XL01]；泳道4-rit-v10-[145-PF02]-[XL01-PF19]；泳道5-rit-v10-[145-PF02]-[XL01-PF13]。凝胶用考马斯染色以示出总蛋白。
具体实施方式
定义
如在本说明书和权利要求书中使用的动词“包含”及其变体以其非限制性意义使用，表示包括该词之后的项目，但不排除未具体提及的项目。此外，不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”对元素的引用不排除存在多个元素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且只有一个元素。因此，不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”通常表示“至少一个”。
本说明书和权利要求书中公开的化合物可以包含一个或多个不对称中心，并且化合物可以存在不同的非对映异构体和/或对映异构体。除非另有说明，否则本说明书和权利要求书中对任何化合物的描述旨在包括所有非对映异构体及其混合物。此外，除非另有说明，否则本说明书和权利要求书中对任何化合物的描述旨在包括单独的对映异构体以及对映异构体的任何混合物、外消旋体或其他形式。当化合物的结构被描述为特定的对映异构体时，应理解为本申请的发明不限于该特定的对映异构体。
这些化合物可以以不同的互变异构形式存在。除非另有说明，否则根据本发明的化合物旨在包括所有互变异构形式。当化合物的结构被描述为特定的互变异构体时，应理解为本申请的发明不限于该特定的互变异构体。
本说明书和权利要求书中公开的化合物还可以作为外型和内型非对映异构体存在。除非另有说明，否则说明书和权利要求书中对任何化合物的描述旨在包括化合物的单独的外型和单独的内型非对映异构体，以及它们的混合物。当化合物的结构被描述为特定的内型或外型非对映体时，应理解为本申请的发明不限于该特定的内型或外型非对映体。
此外，本说明书和权利要求书中公开的化合物可以以顺式和反式异构体存在。除非另有说明，否则说明书和权利要求书中对任何化合物的描述旨在包括化合物的单独的顺式和单独的反式异构体，以及它们的混合物。例如，当化合物的结构被描述为顺式异构体时，应理解为相应的反式异构体或顺式和反式异构体的混合物不排除在本申请的发明之外。当化合物的结构被描述为特定的顺式或反式异构体时，应理解本申请的发明不限于该特定的顺式或反式异构体。
根据本发明的化合物可以以盐的形式存在，其也包括在本发明中。盐通常是药学上可接受的盐，包含药学上可接受的阴离子。术语“其盐”是指当酸质子(通常是酸的质子)，被阳离子(如金属阳离子或有机阳离子等)替代时形成的化合物。在适用的情况下，盐是药学上可接受的盐，但是这对于非用于给予患者的盐而言不是必需的。例如，在化合物的盐中，该化合物可以被无机酸或有机酸质子化以形成阳离子，无机酸或有机酸的共轭碱作为盐的阴离子组分。
术语“药学上可接受的”盐是指对给予患者(如哺乳动物)可接受的盐(具有抗衡离子的盐对于给定的剂量方案具有可接受的哺乳动物安全性)。此类盐可以衍生自药学上可接受的无机或有机碱和药学上可接受的无机或有机酸。“药学上可接受的盐”是指化合物的药学上可接受的盐，该盐衍生自本领域已知的多种有机和无机抗衡离子，包括例如钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等，且分子含有基本功能时，有机或无机酸的盐类，如盐酸盐、氢溴酸盐、甲酸盐、酒石酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐等。
术语“蛋白质”在本文中以其标准的科学含义使用。在本文中，包含约10个或更多个氨基酸的多肽被认为是蛋白质。蛋白质可包含天然氨基酸，但也可包含非天然氨基酸。
术语“单糖”在本文中以其标准的科学含义使用，是指由含5-9个(羟基化)碳原子的链环化后形成的分子内半缩醛形成的含氧杂环，最常见的是包含5个碳原子(戊糖)，6个碳原子(己糖)或9个碳原子(唾液酸)。典型的单糖为核糖(Rib)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、葡萄糖醛酸(GlcA)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)和N-乙酰神经氨酸(NeuAc)。
术语“细胞因子”在本文中以其标准的科学含义使用，它是小分子蛋白质(5-20kDa)，通过与其同源受体结合并触发随后的细胞信号来调节免疫细胞的活性。细胞因子包括趋化因子、干扰素(IFN)、白细胞介素、单核因子、淋巴因子、集落刺激因子(CSF)和肿瘤坏死因子(TNF)。细胞因子的实例有：IL-1α(IL1a)、IL-1β(IL1b)、IL-2(IL2)、IL-4(IL4)、IL-5(IL5)、IL-6(IL6)、IL8(IL-8)、IL-10(IL10)、IL-12(IL12)、IL-15(IL15)、IFN-α(IFNA)、IFN-γ(IFN-G)和TNF-α(TNFA)。
术语“抗体”在本文中以其标准的科学含义使用。抗体是由免疫系统产生的能够识别和结合特定抗原的蛋白质。抗体是糖蛋白的一个实例。本文中的术语抗体以其最广泛的含义使用，具体包括单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段以及双链和单链抗体。术语“抗体”在本文还旨在包括人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和特异性结合癌抗原的抗体。术语“抗体”旨在包括完整的免疫球蛋白，也包括抗体的抗原结合片段。此外，该术语包括基因工程抗体和抗体衍生物。抗体、抗体片段和基因工程抗体可以通过本领域已知的方法获得。抗体的典型实例包括，阿昔单抗(abciximab)、利妥昔单抗、巴利昔单抗(basiliximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿达木单抗(adalimumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、奥马珠单抗(omalizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、雷珠单抗(ranibizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、依库珠单抗(eculizumab)、戈利木单抗(golimumab)、卡那奴单抗(canakinumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、托珠单抗(tocilizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、地诺单抗(denosumab)、贝利木单抗(belimumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)和维布妥昔单抗(brentuximab)等。
“抗体片段”在本文中定义为完整抗体的一部分，包含其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab′)2和Fv片段、双抗体、微抗体、三抗体、四抗体、直链抗体、单链抗体分子、scFv、scFv-Fc、由一个或多个抗体片段形成的多特异性抗体片段、由Fab表达文库产生的一个或多个片段，或任何上述免疫特异性结合靶抗原(例如，癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)的表位结合片段。
术语“抗体构建体”在本文中定义为两种或两种以上不同蛋白质的共价连接组合，其中一种蛋白质为抗体或抗体片段，另一种(或多种)蛋白质为多肽，如抗体、抗体片段或细胞因子。通常，其中一种蛋白质是对肿瘤相关受体或抗原具有高亲和力的抗体或抗体片段，而另一种蛋白质的一种(或多种)是对免疫细胞上的受体或抗原具有高亲和力的抗体、抗体片段或多肽。
“抗原”在本文中定义为抗体特异性结合的实体。
术语“特异性结合(specific binding)”和“特异性结合(specifically binds)”在本文中定义为一种或多种抗体与其对应的靶抗原表位结合而不是与大量其他抗原结合的高度选择性方式。通常，抗体或抗体衍生物以亲和力为至少约1×10-7M，且更优选10-8M至10-9M、10-10M、10-11M、或10-12结合，并且以这样的亲和力结合预定抗原：以至少大于其与除预定抗原或密切相关抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)结合的亲和力两倍的亲和力。
术语“双特异性”在本文中定义为对两种不同的受体或抗原(或单个抗原上的不同表位)具有亲和力的抗体构建体，这些受体或抗原可能存在于肿瘤细胞或免疫细胞上，其中双特异性可以是各种分子形式，并可能具有不同的价态。
术语“三特异性”在本文中定义为对三种不同受体或肿瘤相关抗原(或单个抗原上的不同表位)具有亲和力的抗体构建体，这些受体或抗原可能存在于肿瘤细胞或免疫细胞上，其中三特异性可以是各种分子形式，并可能具有不同的价态。
术语“多特异性”在本文中定义为对至少两种不同受体或抗原(或一种或多种单一抗原上的不同表位)具有亲和力的抗体构建体，这些受体或抗原可能存在于肿瘤细胞或免疫细胞上，其中多特异性可以是各种分子形式，并可能具有不同的价态。
术语“双位点(biparatopic)”在本文中定义为对两个明显不同的表位具有亲和力的抗体，但这两个表位存在于相同的受体或肿瘤相关抗原上。
术语“双功能”在本文中定义为具有两种明显不同性质的抗体，例如能够与两种明显不同的表位或肿瘤相关抗原结合的抗体，或能够与特定表位或肿瘤相关抗原结合并携带小分子有效负载的抗体。
术语“三功能”在本文中定义为具有三种明显不同性质的抗体，例如能够与三种明显不同的表位或肿瘤相关抗原结合的抗体，或能够与两种明显不同的表位或肿瘤相关抗原结合并同时携带小分子有效负载的抗体，或能够与特定表位或肿瘤相关抗原结合并同时携带两种不同小分子有效负载的抗体。
术语“多功能”在本文中定义为具有多种明显不同特性的抗体，例如能够与多种明显不同的表位或肿瘤相关抗原结合的抗体，或能够与特定表位或肿瘤相关抗原结合并携带多种小分子有效负载的抗体或其变体。
术语“Fc-沉默”在本文中定义为与Fc-γ受体III(CD16)结合明显降低或无效的抗体。
术语“大量的”或“大量地”在本文中定义为混合物或样品的大多数，即＞50％的群体，优选大于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的群体。
“接头”在本文中定义为连接化合物的两个或更多个元件的部分。例如，在抗体缀合物中，抗体和有效负载通过接头彼此共价连接。接头可以包含一个或多个接头和连接接头内的各种部分的间隔基部分。
“极性接头”在本文中定义为包含结构元件的接头，其具体目的是增加接头的极性，从而提高水溶性。极性接头可以例如包含一个或多个单元或其组合，其选自乙二醇、羧酸部分、磺酸酯部分、砜部分、酰化磺酰胺部分、磷酸酯部分、次膦酸酯部分、氨基或铵基。
“间隔基”或间隔基部分(Sp)在本文中定义为间隔(即提供之间的距离)并将接头的两个(或更多)部分共价连接在一起的部分。接头可以是例如下文定义的接头-构建体、接头-缀合物或生物缀合物的一部分。间隔基可以是共价键，也可以是至少1个(优选2至50个)选自C、N、O、S和P的原子的链。在本文中，原子链是指从间隔基两端开始的最短原子链。链中的原子也可称为骨架原子。正如技术人员所理解的，具有两个以上价态的原子，如C、N和P，可以适当地官能化，以完成这些原子的价态。
“生物缀合物”在本文中定义为其中生物分子通过接头共价连接至有效负载的化合物。生物缀合物包含一种或多种生物分子和/或一种或多种靶标分子。
“生物分子”在本文中定义为可从自然界分离的任何分子或由源自自然界的大分子结构组成部分的较小分子结构单元组成的任何分子，特别是核酸、蛋白质、聚糖和脂质。生物分子的实例包括酶、(非催化)蛋白质、多肽、肽、氨基酸、寡核苷酸、单糖、寡糖、多糖、聚糖、脂质和激素。
术语“有效负载”是指共价连接至靶向部分(例如抗体)的部分。因此，有效负载是指具有一个开放端的单价部分，其通过接头共价连接到靶标部分。有效负载可以为小分子或生物分子。
术语“分子形式”是指抗体上不同功能性的数量和相对化学计量，其中2:1:1分子形式表示与同一靶标结合的两个CDR结构域并连接一个出现的另一个功能性分子的三功能性抗体；其中1:1:2:2分子形式表示基于双特异性抗体的四功能抗体，所述双特异性抗体具有与两个不同的靶标(或同一表位上的两个靶标)结合的两个不同的CDR结构域并连接一个出现的另一个功能分子。一个(或两个)功能分子本身可以是能够结合特定靶标的多肽片段，该靶标与抗体支架的靶标不同。术语“2:1分子形式”是指由二价单克隆抗体与单功能有效负载缀合而成的蛋白缀合物。
术语“补体依赖区”或“CDR”是指能够结合特定受体或抗原的抗体可变片段。
本发明
本发明者已开发出多功能抗体构建体，它们一方面对肿瘤细胞具有特异性，另一方面对免疫细胞(如T细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞)具有特异性。本发明的多功能抗体构建体还可含有一种或多种不同的小分子有效负载，用于在肿瘤微环境或肿瘤溶酶体中特异性释放。本发明首次实现了在完全控制分子形式和无需基因工程的情况下制备双功能或多功能抗体构建体。本发明涉及多功能抗体构建体以及根据本发明的多功能抗体构建体的(医疗)用途。
在下文中，分子部分定义为起始材料、中间体和最终产品。技术人员应理解，只要分子的这一部分在转化期间不受影响，其中任一优选实施方案的任何定义同样适用于其他化合物。同样，根据本发明的方法所定义的任何结构也同样适用于根据本发明的化合物。
多功能抗体构建体
在第一方面，本发明涉及一种多功能抗体构建体，该构建体包含至少一种抗体(Ab)和两种不同的有效负载(D1)和(D2)。其中，至少一种有效负载是多肽，另一种有效负载可以是另一种多肽、细胞毒素、另一种小分子或寡核苷酸。在一个实施方案中，多功能抗体构建体可包含第三种不同的有效负载(D3)。
根据本发明的多功能抗体构建体可以具有结构(1)或(2)。
其中：
-Ab为抗体；
-L1、L2、L3、L4和L5为接头；
-x1和x2各自独立地为1-8范围内的整数，其中x1+x2＝2-10；
-BM为支链部分；
-m和n各自独立地为0或1；
-x3为1-4范围内的整数；
-D1和D2为两个不同的选自多肽、小分子、细胞毒素和寡核苷酸的有效负载，其中D1和D2中的至少一个是多肽。
根据结构(1)的多功能抗体构建体具有分别连接到抗体上的连接点的两种不同的有效负载。根据结构(2)的多功能抗体构建体具有与相同的支链接头连接的两个不同的有效负载，所述支链接头可以在抗体上有一个或多个连接点。如下文所述，将有效负载连接到抗体上的方法可以是本领域已知的任何缀合技术。优选地，对于根据结构(1)的多功能抗体构建体，对两种不同的有效负载采用两种不同的缀合技术，而根据结构(2)的多功能抗体构建体则可以很容易地通过单缀合技术制备，所述单缀合技术将带有两种不同有效负载的接头-有效负载构建体连接起来。
抗体
Ab为一种抗体。抗体在本领域是已知的，包括IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、Fab、VHH、scFv、双特异抗体、微抗体、亲和体、affylin、affimers、atrimers、菲诺体(fynomer)、Cys-knot、DARPin、adnectin/centryin、knotin、抗运载蛋白(anticalin)、FN3、Kunitz结构域、OBody、双环肽和三环肽。优选地，抗体为单克隆抗体，更优选选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM抗体。甚至更优选的Ab为IgG抗体。IgG抗体可以是任何IgG亚型。抗体可以是任何IgG亚型，如IgG1、IgG2、IgI3或IgG4。优选地抗体Ab为全长抗体，但Ab也可以是Fc-片段。
抗体Ab通常对肿瘤细胞上的细胞外受体具有特异性，优选地，其中肿瘤细胞上的细胞外受体选自5T4、ADAM-9、AMHRII、ASCT2、ASLG659、ASPHD1、av-整合素、Axl、B7-H3、B7-H4、BAFF-R、BCMA、BMPR1B、短小蛋白聚糖、c-KIT、c-Met、C4.4a、CA-IX、钙粘着蛋白-6、CanAg、CD123、CD13、CD133、CD138/多配体蛋白聚糖-1、CD166、CD19、CD20、CD203c、CD205、CD21、CD22、CD228、CD25、CD30、CD324、CD33、CD37、CD38、CD45、CD46、CD48a、CD56、CD70、CD71、CD72、CD74、CD79a、CD79b、CEACAM5、封闭蛋白-18.2、封闭蛋白-6、CLEC12A、CLL-1、Cripto、CRIPTO、CS1、CXCR5、DLK-1、DLL3、DPEP3、E16、EGFR、ENPP3、EpCAM、EphA2、EphB2R、ETBR、FAP、FcRH1、FcRH2、FcRH5、FGFR2、纤连蛋白、FLT3、叶酸受体α、Gal-3BP、GD3、GDNF-Ra1、GEDA、GFRA1、Globo H、gpNMB、GPR172A、GPR19、GPR54、鸟苷酸环化酶C、HER2、HER3、HLA-DOB、IGF-1R、IL13R、IL20Rα、Lewis Y、LGR5、LIV-1、LRRC15、LY64、Ly6E、Ly6G6D、LY6K、MDP、MFI2、MICA/B、MOSPD2、MPF、MSG783、MUC1、MUC16、NaPi2b、NCA、粘连蛋白-4、Notch3、P-钙粘着蛋白、P2X5、PD-L1、PMEL17、PRLR、PSCA、PSCAhlg、PSMA、PTK7、RET、RNF43、RON、ROR1、ROR2、Sema5b、SLITRK6、SSTR2、STEAP1、STEAP2、TAG72、TENB2、TF、TIM-1、TM4SF、TMEFF、TMEM118、TMEM46、转铁蛋白、TROP-2、TrpM4、TWEAKR、受体酪氨酸激酶(RTK)、腱生蛋白(tenascin)。
在根据结构(1)的多功能抗体构建体中，抗体用x1次出现的有效负载D1和x2次出现的有效负载D2功能化。其中，x1和x2各自独立地为1-8范围内的整数，其中x1+x2＝2-10。x1和x2的确切数目决定了分子形式比，并受所使用的缀合技术的制约。在一个优选的实施方案中，x1和x2相同，并且均为1-4范围内的整数，优选两者均为1或2，最优选两者均为1。在另一个优选的实施方案中，x1为1-8范围内的整数，x2为1-4范围内的整数，优选x2为1或2，最优选x2为2。或者，x1为1-4范围内的整数，x2为1-8范围内的整数，优选x1为1或2，最优选x1为2。
在根据结构(2)的多功能抗体构建体中，抗体被x3次出现的带有有效负载D1和有效负载D2的接头构建体功能化。其中，x3为1-4范围内的整数，优选x3为1、2或4，更优选x3为1或2。
有效负载
至少一种有效负载(通常为D1)是多肽。多肽有效负载对与抗体Ab的不同靶点具有亲和力。因此，根据本发明的抗体构建体是多功能的，至少针对两个不同的靶标。优选地，多肽选自免疫细胞诱导剂、检查点抑制剂和细胞表面受体粘合剂，优选地，其中所述多肽是免疫细胞接合的多肽或检查点抑制多肽。
免疫细胞接合的多肽是本领域已知的，任何已知的此类多肽均可用于本发明。免疫细胞接合的多肽优选对T细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或粒细胞上的细胞受体具有特异性，或对IL2或IL15具有特异性。在本文中，T细胞上的细胞受体优选选自CD3、CD28、CD137(4-1BB)、CD134、CD27、Vγ9Vδ2和ICOS；NK细胞上的细胞受体选自CD16、CD56、CD335、CD336、CD337、CD28、NKG2A、NKG2D、NKp46、KIR、DNAM-1和CD161；单核细胞或巨噬细胞上的细胞受体为CD64；粒细胞上的细胞受体为CD89。
检查点抑制多肽是本领域已知的并且包括任何已知的此类多肽，它们可用于本发明的上下文中。优选地，检查点抑制多肽对CTLA-4、PD-1、PD-L1、TIGIT、TIM-3、LAG-3或VISTA具有特异性。
与细胞表面受体结合的多肽是本领域已知的，任何已知的此类多肽均可用于本发明的上下文中。
在一个特别优选的实施方案中，所述多肽选自OKT3、UCHT1、BMA031、VHH 6H4、IL2、IL15、IL15/IL15R复合体、IL15/IL15R融合体、IL2特异性抗体和IL15特异性抗体。最优选地，多肽为OKT3、IL15/IL15R融合体、IL15、mAb602、Nara1或TCB2。
第二有效负载(通常为D2)也可以为多肽，或可以为细胞毒素、另一种小分子或寡核苷酸。如果第二有效负载也是多肽，则它是与第一有效负载不同的多肽。第二有效负载可以是小分子，如细胞毒素或其他小分子。小分子通常具有低至中分子量的化合物，如约100至约2500Da，优选约300至约1750Da。这些可包括活性物质(如细胞毒素)和报告分子(如荧光团、放射性标记)，如下文所定义。在一个优选的实施方案中，第二有效负载为多肽、细胞毒素或寡核苷酸，更优选多肽或细胞毒素。在一个实施方案中，第二有效负载为多肽。在另一个实施方案中，第二有效负载为细胞毒素。
细胞毒素在抗体构建体领域是众所周知的，尤其是用于治疗癌症。抗体-药物缀合物通常具有细胞毒性有效负载，本发明的上下文中可使用任何此类细胞毒性有效负载。在本文中，“细胞毒素”也可称为“抗癌剂”。细胞毒素可以是药物或前药，并且选自药用活性化合物，特别是中低分子量化合物(例如约200至约2500Da，优选约300至约1750Da)。
细胞毒素的实例包括秋水仙碱、长春花生物碱、蒽环霉素、喜树碱、阿霉素、道诺霉素、紫杉烷、卡利奇霉素、微管溶素(tubulysin)、依立替康(irinotecan)、抑制肽、鹅膏蕈碱、艾瑞布林(eribulin)、deBouganin、杜卡霉素(duocarmycin)、美登素、澳瑞他汀(auristatin)、烯二炔、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或吲哚并苯并二氮杂卓二聚体(IGN)或PNU159,682。特别优选的细胞毒素包括澳瑞他汀(如MMAE)、美登木素生物碱(maytansinoids)、卡利奇霉素和喜树碱。
有效负载D1和D2的优选组合如下：
(i)D1为CD3靶向多肽，D2为CD28靶向多肽；
(ii)D1为IL15或IL15靶向多肽，D2为CD16靶向多肽；
(iii)D1为IL2或IL2靶向多肽，D2为CD16靶向多肽；
(iv)D1为NKp46靶向多肽，D2为CD16靶向多肽；
(v)D1为细胞毒素，D2为检查点抑制剂，优选选自靶向CTLA-4、TIGIT、LAG-3、TIM-3、VISTA、PD-1或PD-L1的多肽；
(vi)D1为OX40靶向多肽，D2为CD137靶向多肽；
(vii)D1为PD-L1靶向多肽，D2为CD137靶向多肽；
(viii)D1为细胞毒素，D2为IL15或IL15靶向多肽；
(ix)D1为细胞毒素，D2为IL2或IL2靶向多肽；
(x)D1为细胞毒素，D2为CD16靶向多肽；或
(xi)D1为TLR7-激动剂或TRL8-激动剂，D2为CD16-靶向多肽。
任何检查点抑制剂均可用于实施方案(v)。优选的检查点抑制剂包括PD-1靶向多肽和PD-L1靶向多肽。在目前的癌症治疗中，抗体-药物缀合物通常与检查点抑制剂联合给药。本发明提供了一种通用型方法，将抗体-药物缀合物与检查点抑制剂结合在单一的多功能抗体构建体中，极大地方便了目前采用的联合治疗。因此，在本发明的上下文中，特别优选细胞毒素与检查点抑制剂的结合。
根据本发明的多功能抗体构建体可以含有第三种不同的有效负载，例如当其中一个接头含有(额外的)支链部分时，所述支链部分通常通过接头与第三种不同的有效负载D3连接。有效负载分子在本领域，特别是抗体缀合物领域是众所周知的，其作为与抗体共价连接的部分，在缀合物被吸收和/或接头被裂解时从抗体中释放出来。在一个优选的实施方案中，有效负载选自活性物质、报告分子、聚合物、固体表面、水凝胶、纳米颗粒、微粒和生物分子。特别优选的有效负载是活性物质和报告分子，特别是活性物质。
术语“活性物质”在本文中指药理和/或生物物质，即具有生物和/或药理活性的物质，例如药物、前药、细胞毒素、诊断剂、蛋白质、肽、多肽、肽标签、氨基酸、聚糖、脂质、维生素、类固醇、核苷酸、核苷、多核苷酸、RNA或DNA。肽标签的实例包括细胞穿透肽，如人乳铁蛋白或多聚精氨酸。聚糖的实例是低聚甘露糖。氨基酸的实例是赖氨酸。当有效负载为活性物质时，活性物质优选选自药物和前药。更优选地，活性物质选自药物活性化合物，特别是中低分子量化合物(例如，约200至约2500Da，优选约300至约1750Da)。在另一个优选的实施方案中，活性物质选自细胞毒素、抗病毒剂、抗菌剂、肽和寡核苷酸。细胞毒素的实例包括秋水仙碱、长春花生物碱、蒽环霉素、喜树碱、阿霉素、道诺霉素、紫杉烷、卡利奇霉素、微管溶素、依立替康、抑制肽、鹅膏蕈碱、艾瑞布林、deBouganin、杜卡霉素、美登素、澳瑞他汀、烯二炔、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或吲哚并苯并二氮杂卓二聚体(IGN)或PNU159,682以及它们的衍生物。优选的有效负载选自MMAE、MMAF、依喜替康(exatecan)、SN-38、DXd、美登木素生物碱、卡利奇霉素、PNU159,685和PBD二聚体。特别优选的有效负载是PBD、MMAE、依喜替康或DXd。在一个实施方案中，有效负载是美登木素生物碱。在一个实施方案中，有效负载是依喜替康或DXd。在一个实施方案中，有效负载是MMAE。在一个实施方案中，有效负载是PDB二聚体。
术语“报告分子”在本文中指其存在易于被检测的分子，例如诊断剂、染料、荧光团、放射性同位素标记、造影剂、磁共振成像剂或质量标记。本领域技术人员已知的荧光团(也称为荧光探针)种类繁多。多个荧光团详细记载于例如，G.T.Hermanson,“BioconjugateTechniques”,Elsevier,2013年第3版,第10章:“Fluorescent probes”,第395-463页，通过引入纳入本文。荧光团的实例包括各种Alexa Fluor(如Alexa Fluor555)、氰基染料(如Cy3或Cy5)和氰基染料衍生物、香豆素衍生物、荧光素和荧光素衍生物、罗丹明和罗丹明衍生物、二吡咯烷硼衍生物、芘衍生物、萘二甲酰亚胺衍生物、藻胆蛋白衍生物(如别藻蓝蛋白)、铬霉素、镧系元素螯合物和量子点纳米晶体。
放射性同位素标记的实例包括99mTc、111In、114mIn、115In、18F、14C、64Cu、131I、125I、123I、212Bi、88Y、90Y、67Cu、186Rh、188Rh、66Ga、67Ga和10B，其任选地通过螯合部分连接，例如DTPA(二亚乙基三胺五乙酸酐)、DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N′,N″,N″′-四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷N,N′,N″-三乙酸)、TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N′,N″,N″′-四乙酸)、DTTA(N1-(对异硫氰酸基苄基)-二亚乙基三胺-N1,N2,N3,N3-四乙酸)、去铁胺或DFA(N′-[5-[[4-[[5-(乙酰基羟基氨基)戊基]氨基]-1,4-二氧丁基]羟基氨基]戊基]-N-(5-氨基戊基)-N-羟基丁二酰胺)或HYNIC(肼基烟酰胺)。同位素标记技术是本领域技术人员已知的，并且在例如G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,2013年第3版,第12版:“Isotopic labelling techniques”,第507-534页中有更详细的描述，其通过引用纳入本文。
适合在根据本发明的化合物中用作有效负载D3的聚合物是本领域技术人员已知的，并且在例如G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,2013年第3版,第18版:“PEGylation and synthetic polymer modification”,第787-838页中更详细地描述了几个实例，其通过引用纳入本文。当有效负载D3是聚合物时，有效负载D3优选独立地选自聚(乙二醇)(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚丙二醇(PPG)、聚环氧丙烷(PPO)、1,q-二氨基烷烃聚合物(其中q为烷烃中的碳原子数，优选q为2至200范围内，优选2至10范围内的整数)、(聚)乙二醇二胺(例如1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷和包含更长乙二醇链的等价物)、聚糖(例如葡聚糖)、聚(氨基酸)(例如聚(L-赖氨酸))和聚(乙烯醇)。
适合用作有效负载D3的固体表面是本领域技术人员已知的。固体表面例如是功能表面(例如纳米材料、碳纳米管、富勒烯或病毒衣壳的表面)、金属表面(例如钛、金、银、铜、镍、锡、铑或锌表面)、金属合金表面(其中合金来自例如铝、铋、铬、钴、铜、镓、金、铟、铁、铅、镁、汞、镍、钾、钚、铑、钪、银、钠、钛、锡、铀、锌和/或锆)、聚合物表面(其中聚合物是例如聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚(二甲基硅氧烷)或聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺)、玻璃表面、硅酮表面、色谱支持物表面(其中色谱支持物是例如二氧化硅支持物、琼脂糖支持物、纤维素支持物或氧化铝支持物)等。当有效负载D3是固体表面时，优选D独立地选自功能表面或聚合物表面。
水凝胶是本领域技术人员已知的。水凝胶是通过聚合成分之间的交联形成的水溶胀网络。参见例如A.S.Hoffman,Adv.Drug Delivery Rev.2012,64,18，其通过引用纳入本文。当有效负载是水凝胶时，优选水凝胶由作为聚合物基础的聚(乙二醇)(PEG)组成。
适合用作有效负载D3的微粒和纳米颗粒是本领域技术人员已知的。在例如G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,2013年第3版,第14版:“Microparticles and nanoparticles”,第549-587页中记载了各种合适的微粒和纳米颗粒，其通过引用纳入本文。微粒或纳米颗粒可以是任何形状，例如球形、棒状、管状、立方体、三角形和圆锥形。优选地，微粒或纳米颗粒为球形。微粒和纳米颗粒的化学组成可以变化。当有效负载D3是微粒或纳米颗粒时，微粒或纳米颗粒是例如聚合微粒或纳米颗粒、二氧化硅微粒或纳米颗粒或金微粒或纳米颗粒。当颗粒是聚合物微粒或纳米颗粒时，聚合物优选是聚苯乙烯或苯乙烯的共聚物(例如苯乙烯和二乙烯基苯、丁二烯、丙烯酸酯和/或乙烯基甲苯的共聚物)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯基甲苯、聚(甲基丙烯酸羟乙酯(pHEMA)或聚(二甲基丙烯酸乙二醇酯/甲基丙烯酸2-羟乙酯)[聚(EDGMA/HEMA)]。任选地，将微粒或纳米颗粒的表面改性，例如用去污剂，通过第二聚合物的接枝聚合或通过另一种聚合物或间隔基部分的共价连接等。
有效负载D3也可以是生物分子。生物分子及其优选实施方案将在下文更详细地描述。当有效负载D3是生物分子时，优选生物分子选自蛋白质(包括糖蛋白，如抗体)、多肽、肽、聚糖、脂质、核酸、寡核苷酸、多糖、寡糖、酶、激素、氨基酸和单糖。在一个优选的实施方案中，有效负载D3是寡核苷酸。
在本发明的上下文中，细胞毒性有效负载是特别优选的。因此，D2和/或D3优选为细胞毒素，更优选选自秋水仙碱、长春花生物碱、蒽环霉素、喜树碱、阿霉素、道诺霉素、紫杉烷、卡利奇霉素、微管溶素、依立替康、抑制肽、鹅膏蕈碱、鹅膏毒素、艾瑞布林、deBouganin、杜卡霉素、埃博霉素(epothilone)、丝裂霉素(mytomycin)、康普立停(combretastatin)、美登素、澳瑞他汀、烯二炔、吡咯并苯并二氮杂卓(PBD)或吲哚并苯并二氮杂卓二聚体(IGN)或PNU159,682。在一个特别优选的实施方案中，有效负载是MMAE、卡利奇霉素或依喜替康。
缀合技术
本领域已知的任何缀合技术均可用于制备本发明的多功能抗体构建体。合适的缀合技术包括硫醇连接、赖氨酸连接、环加成(例如铜催化的点击反应、应变促进的叠氮-炔环加成、应变促进的醌-炔环加成)。本发明上下文中优选使用的缀合技术包括亲核反应和环加成反应，其中优选地环加成反应为[4+2]环加成反应或[3+2]环加成反应，亲核反应为迈克尔(Michael)加成反应或亲核取代反应。合适的缀合技术例如公开于G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,2013年第3版(ISBN:978-0-12-382239-0)；WO2014/065661；van Geel等人,Bioconj.Chem.2015,26,2233-2242；PCT/EP2021/050594；PCT/EP2021/050598和NL 2026947。
因此，在根据本发明的缀合方法的一个优选实施方案中，缀合通过亲核反应完成，例如亲核取代反应或迈克尔反应。优选的亲核反应为伯氨基与活化酯的酰化反应。优选的迈克尔反应为马来酰亚胺-硫醇反应，所述反应广泛用于生物缀合。
因此，在根据本发明的缀合方法的一个优选实施方案中，缀合通过环加成反应完成。优选的环加成反应为(4+2)-环加成(如Diels-Alder反应)或(3+2)-环加成(如1,3-二极环加成反应)。优选地，缀合反应为Diels-Alder反应或1,3-二极环加成反应。优选的Diels-Alder反应为反电子需求Diels-Alder环加成反应。在另一个优选的实施方案中，使用1,3-二极环加成反应，更优选炔-叠氮环加成反应，最优选其中Q为炔基或Q包含炔基，F为叠氮基团。环加成反应(如Diels-Alder反应和1,3-二极环加成反应)在本领域是众所周知的，技术人员也知道如何进行这些反应。
连接基团Z
所使用的缀合技术的确切性质决定了根据本发明的多功能抗体构建体中存在的接头的确切结构。通常，与抗体Ab连接的接头含有在缀合反应中形成的连接基团Z。术语“连接基团”是指连接化合物的一部分和同一化合物的另一部分的结构元件。例如，Z可以将抗体Ab(任选地通过L8等接头)与有效负载或支链部分BM(任选地通过L7等接头)连接。正如本领域技术人员所理解的，连接基团的性质取决于反应的类型，所述化合物各部分之间的连接通过这种反应获得。例如，当R-C(O)-OH(或其活化酯衍生物)的羧基与H2N-R’的氨基反应形成R-C(O)-N(H)-R’时，R通过连接基团Z连接到R’，Z由基团-C(O)-N(H)-表示。由于连接基团Z源于Q和F之间的反应，因此它可以采取任何形式。此外，对于本发明的实施而言，连接基团Z的性质并不重要。
接头L1、L2和L3通常含有可通过缀合反应获得的连接基团Z。在多功能抗体构建体具有结构(1)的情况下，优选接头L1中的连接基团Z的结构不同于接头L2中的连接基团Z的结构，这样可以简化多功能抗体构建体的合成。可以使用两种不同的缀合技术来连接两种不同的有效负载。然而，也可以开发合成方法，其中对两种有效负载使用相同的缀合技术，并且接头L1和L2中Z的结构相同。
通常，连接基团通过将含有反应性部分F的抗体与含有反应性部分Q的有效负载-接头-构建体反应获得。在本文中，反应性部分F和反应性部分Q是互补的，这意味着Q与F反应形成连接基团Z形式的共价键构建体。用于连接反应基团Q和反应性部分F的有机反应很多。因此，可用的连接基团Z的种类也很多。例如，Z可通过环加成反应或亲核反应获得，其中优选地环加成反应为[4+2]环加成反应或1,3-二极环加成反应，亲核反应为迈克尔加成反应或亲核取代反应。缀合反应是技术人员所熟知的，技术人员有能力选择合适的反应搭档F和Q，并了解由此产生的连接基团Z的性质。图5中提供了反应基团Q的一些示例性选择，图1中提供了Q和F以及相应连接基团Z的一些示例性组合。更多的教导记载于G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,2013年第3版(ISBN:978-0-12-382239-0)中，特别是在第3章，第229-258页，通过引用纳入本文。
例如，当F包括硫醇基或F为硫醇基时，互补基团Q包括N-马来酰亚胺基和烯基，相应的连接基团Z如图1所示。当F包括硫醇基或F为硫醇基时，互补基团Q还包括烯酰胺基团和亚磷酰胺(phosphonamidite)基团。
例如，当F包括酮基或F为酮基时，互补基团Q包括(O-烷基)羟基氨基基团和肼基，相应的连接基团Z如图1所示。
例如，当F包括炔基或F为炔基时，互补基团Q包括叠氮基团，相应的连接基团Z如图1所示。
例如，当F包括叠氮基团或F为叠氮基团时，互补基团Q包括炔基，相应的连接基团Z如图1所示。
例如，当F包括环丙烯基、反式环辛烯基或环炔基或F为环丙烯基、反式环辛烯基或环炔基时，互补基团Q包括四嗪基，相应的连接基团Z如图1所示。在特殊情况下，Z仅为中间结构并且会排出N2，从而生成二氢哒嗪(与烯反应生成)或哒嗪(与炔反应生成)。
例如，当F包括四嗪基或F为四嗪基时，互补基团Q包括环丙烯基、反式环辛烯基或环炔基；相应的连接基团Z如图1所示。在特殊情况下，Z仅为中间结构并且会排出N2，从而生成二氢哒嗪(与烯反应生成)或哒嗪(与炔反应生成)。
F和Q的其他合适组合以及由此产生的连接基团Z的性质是本领域技术人员所熟知的，如记载于G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,2013年第3版(ISBN:978-0-12-382239-0),第3章,第229-258页中，其通过引用纳入本文。G.T.Hermanson,“Bioconjugate Techniques”,Elsevier,3rd Ed.2013(ISBN:978-0-12-382239-0)的第3章的第229-258页的表3.1中公开列出了适用于生物缀合方法的互补反应基团，该表的内容通过引用明确纳入本文。
在一个优选的实施方案中，每个Z独立地选自-O-、-S-、-S-S-、-NR2-、-N＝N-、-C(O)-、-C(O)-NR2-、-O-C(O)-、-O-C(O)-O-、-O-C(O)-NR2、-NR2-C(O)-、-NR2-C(O)-O-、-NR2-C(O)-NR2-、-S-C(O)-、-S-C(O)-O-、-S-C(O)-NR2-、-S(O)-、-S(O)2-、-O-S(O)2-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-NR2-、-O-S(O)-、-O-S(O)-O-、-O-S(O)-NR2-、-O-NR2-C(O)-、-O-NR2-C(O)-O-、-O-NR2-C(O)-NR2-、-NR2-O-C(O)-、-NR2-O-C(O)-O-、-NR2-O-C(O)-NR2-、-O-NR2-C(S)-、-O-NR2-C(S)-O-、-O-NR2-C(S)-NR2-、-NR2-O-C(S)-、-NR2-O-C(S)-O-、-NR2-O-C(S)-NR2-、-O-C(S)-、-O-C(S)-O-、-O-C(S)-NR2-、-NR2-C(S)-、-NR2-C(S)-O-、-NR2-C(S)-NR2-、-S-S(O)2-、-S-S(O)2-O-、-S-S(O)2-NR2-、-NR2-O-S(O)-、-NR2-O-S(O)-O-、-NR2-O-S(O)-NR2-、-NR2-O-S(O)2-、-NR2-O-S(O)2-O-、-NR2-O-S(O)2-NR2-、-O-NR2-S(O)-、-O-NR2-S(O)-O-、-O-NR2-S(O)-NR2-、-O-NR2-S(O)2-O-、-O-NR2-S(O)2-NR2-、-O-NR2-S(O)2-、-O-P(O)(R2)2-、-S-P(O)(R2)2-、-NR2-P(O)(R2)2-以及(Z1)-(Z71)中任一项所代表的部分。此处，R2独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，烷基、烯基、炔基和环烷基可任选地被取代。
更优选地，每个Z包含选自琥珀酰亚胺、三唑、环己烯、环己二烯、异噁唑啉、异噁唑烷、吡唑啉、哌嗪、硫醚、酰胺或亚胺基团的部分。更优选地，Z包含选自三唑、环己烯、环己二烯、异噁唑啉、异噁唑烷、吡唑啉、哌嗪、硫醚、酰胺或亚胺基团的部分。在一个特别优选的实施方案中，Z包含三唑部分或琥珀酰亚胺部分。特别优选Z中含有三唑部分。
在第一个优选的实施方案中，Z由环加成反应形成。优选的环加成反应为(4+2)-环加成(例如Diels-Alder反应)或(3+2)-环加成(例如1,3-二极环加成反应)。优选地，缀合反应为Diels-Alder反应或1,3-二极环加成反应。优选的Diels-Alder反应为反电子需求Diels-Alder环加成反应。在另一个优选的实施方案中，使用1,3-二极环加成反应，更优选炔-叠氮环加成反应，最优选其中Q为炔基或Q包含炔基，F为叠氮基团。环加成反应(如Diels-Alder反应和1,3-二极环加成反应)在本领域是众所周知的，技术人员也知道如何进行这些反应。
优选地，Z含有选自以下的部分：三唑、环己烯、环己二烯、[2.2.2]-双环辛二烯、[2.2.2]-双环辛烯、异噁唑啉、异噁唑烷、吡唑啉、哌嗪、硫醚、酰胺或亚胺基团。特别优选Z中含有三唑部分。在一个实施方案中，Z包含一个(杂)环烯部分，即由包含(杂)环炔部分的Q形成。在另一个实施方案中，Z包含(杂)环烷部分，即由包含(杂)环烯分子的Q形成。
在一个优选的实施方案中，Z具有结构(Z1)：
其中，描述为的键为单键或双键。此外：
-R15独立地选自氢、卤素、-OR16、-NO2、-CN、-S(O)2R16、-S(O)3 (-)、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24
(杂)芳基烷基，其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)
芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起形成任选取代的环状的环烷基或任选取代的环(杂)芳烃取代基，且其中R16独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y2为C(R31)2、O、S、S(+)R31、S(O)R31、S(O)＝NR31或NR31，其中S(+)是被B(-)平衡的阳离子硫原子，B(-)是阴离子，每个R31独立地为R15或通过L与Q2或D连接；
-u为0、1、2、3、4或5；
-u’为0、1、2、3、4或5，其中u+u’＝0、1、2、3、4、5、6、7或8；
-v＝8-16范围内的整数；
-环Z由环加成反应形成，优选选自下文定义的(Za)-(Zn)。
如果描述为的键是双键，优选u+u’＝4、5、6、7或8。优选地，标有*的波浪键与抗体Ab连接(任选地通过接头)，标有**的波浪键与有效负载连接(任选地通过接头)。
环Z由环加成反应形成，优选为三唑、环己烯、环己二烯、[2.2.2]-双环辛二烯、[2.2.2]-双环辛烯、异噁唑啉、异噁唑烷、吡唑啉或哌嗪。最优选地，环Z为三唑环。优选地，环Z具有选自下图(Za)-(Zn)的结构，其中标有**的碳原子对应于环Z与之融合的(杂)环烷或(杂)环烯环的两个碳原子。在环Z与(杂)环烯环融合的情况下，则上文(Z1)中描述为的键为双键，环Z优选选自下文描述的(Za)-(Zj)。优选地，环Z为(Za)、(Zi)或(Zj)，最优选(Za)。
在环Z与(杂)环烷环融合的情况下，上文在(Z1)中描述为的键为单键，环Z优选选自下文描述的(Zk)-(Zn)。优选地，环Z为(Zn)。/>
特别优选地，Z包含(杂)环烯部分，即描述为的键是双键。在一个优选的实施方案中，Z选自下文描述的结构(Z2)-(Z20)：
/>
此处，与有效负载的(通常通过接头)连接用波浪键表示。B(-)为阴离子，优选药学上可接受的阴离子。环Z由环加成反应形成，优选具有选自上文描述的(Za)-(Zj)的结构，其中标有**的碳原子对应于环Z与之融合的(Z2)-(Z20)的(杂)环烯环的两个碳原子。
在另一个优选的实施方案中，Z选自下文描述的结构(Z21)-(Z38)：
/>
此处，与有效负载的连接(任选地通过接头)用波浪键表示。在结构(Z38)中，B(-)为阴离子，优选药学上可接受的阴离子。环Z选自上文定义的结构(Za)-(Zj)。环Z由环加成反应形成，优选具有选自上文描述的结构(Za)-(Zj)，其中标有**的碳原子对应于环Z与之融合的(Z21)-(Z38)的(杂)环烯环的两个碳原子。
在一个优选的实施方案中，Z包括根据结构(Z8)，更优选根据结构(Z29)的(杂)环辛烯部分，其被任选地取代。在本实施方案的上下文中，Z优选包括如下文所示根据结构(Z39)的(杂)环辛烯分子，其中V为(CH2)l，l为0至10范围内的整数，优选0至6范围内的整数。更优选地，l为0、1、2、3或4，更优选l为0、1或2，最优选l为0或1。就基团(Z39)的上下文中，l最优选为1。最优选地，Z为下文进一步定义的结构(Z42)。
在另一个优选的实施方案中，Z包括根据结构(Z26)、(Z27)或(Z28)的(杂)环辛烯部分，其被任选地取代。就本实施方案的上下文中，Z优选包括如下文所示根据结构(Z40)或(Z41)的(杂)环辛烯部分，其中Y1为O或NR11，其中R11独立地选自氢、直链或支链的C1-C12烷基或C4-C12(杂)芳基。(Z40)中的芳香环任选地在一个或多个位置进行O-磺酰化，而(Z41)的芳香环可在一个或多个位置进行卤化。最优选地，Z为下文进一步定义的结构(Z43)。
在另一个优选的实施方案中，Z包括杂环庚烯基，并如结构(Z37)所示。
在一个特别优选的实施方案中，Z包括环辛烯基，并如结构(Z42)所示：
/>
其中
-标有*的键与抗体(任选地通过接头)连接；标有**的波浪键与有效负载(任选地通过接头)连接；
-R15独立地选自氢、卤素、-OR16、NO2、CN、-S(O)2R16、-S(O)3 (-)、C1-C24烷基、C5-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24
(杂)芳基烷基，其中烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)
芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起形成任选取代的环状的环烷基或任选取代的环(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)
芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R18独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-R19选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，所述烷基任选地被一个或多个选自O、N和S的杂原子间断，其中，所述烷基、(杂)
芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基独立地任选地被取代，或R19是通过间隔基部分与另一个出现的有效负载(如D3)连接；并且
-l为0至10范围内的整数。
在根据结构(Z42)的基团的一个优选实施方案中，R15独立地选自氢、卤素、-OR16、C1-C6烷基、C5-C6(杂)芳基，其中R16为氢或C1-C6烷基，更优选R15独立地选自氢和C1-C6烷基，最优选所有R15均为H。在根据结构(Z42)的基团的一个优选实施方案中，R18独立地选自氢、C1-C6烷基，最优选两个R18均为H。在根据结构(Z42)的基团的一个优选实施方案中，R19为H。在根据结构(Z42)的基团的一个优选实施方案中，I为0或1，更优选I为1。
在一个特别优选的实施方案中，Z包括(杂)环辛烯基，并如结构(Z43)所示：
其中
-标有*的键与抗体(任选地通过接头)连接；标有**的波浪键与有效负载(任选地通过接头)连接；
-R15独立地选自氢、卤素、-OR16、-NO2、-CN、-S(O)2R16、-S(O)3 (-)、C1-C24烷基、C5-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基，其中所述烷基、(杂)芳基、烷基(杂)芳基和(杂)芳基烷基任选地被取代，其中两个取代基R15可连接在一起形成任选取代的环状的环烷基或任选取代的环(杂)芳烃取代基，并且其中R16独立选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基；
-Y为N或CR15。
在根据结构(Z43)的基团的一个优选实施方案中，R15独立地选自氢、卤素、-OR16、-S(O)3 (-)、C1-C6烷基、C5-C6(杂)芳基，其中R16为氢或C1-C6烷基，更优选R15独立地选自氢和-S(O)3 (-)。在根据结构(Z43)的基团的一个优选实施方案中，Y为N或CH，更优选Y＝N。
在另一个优选的实施方案中，Z包括(杂)环烷部分，即描述为的键为单键。(杂)环烷基团也可称为杂环烷基或环烷基，优选环烷基，其中(杂)环烷基是任选取代的。优选地，(杂)环烷基是(杂)环丙基、(杂)环丁基、降冰片烷基、降冰片烯基、(杂)环庚基、(杂)环辛基、(杂)环壬基或(杂)环癸基，它们都可以任选地被取代。特别优选(杂)环丙基、(杂)环庚基或(杂)环辛基，其中(杂)环丙基、反式(杂)环庚基或(杂)环辛基任选地被取代。
优选地，Z包括根据结构(Z44)的环丙基部分、根据结构(Z45)的杂环丁基部分、根据结构(Z46)的降冰片烷基或降冰片烯基、根据结构(Z47)的(杂)环庚基部分或根据结构(Z48)的(杂)环辛基部分。此处，Y3选自C(R23)2、NR23或O，其中每个R23单独为氢、C1-C6烷基或与L连接(任选地通过间隔基)，标记为的键为单键或双键。在另一个优选的实施方案中，环丙基如结构(Z49)所示。在另一个优选的实施方案中，(杂)环庚烷基团如结构(Z50)或(Z51)所示。在另一个优选的实施方案中，(杂)环辛烷基团如结构(Z52)、(Z53)、(Z54)、(Z55)或(Z56)所示。
此处，(Z50)和(Z51)中Si上的R基团通常为烷基或芳基，优选C1-C6烷基。环Z由环加成反应形成，优选具有选自上文描述的(Zk)-(Zn)的结构，其中标有**的碳原子对应于环Z与之融合的(Z44)-(Z56)的(杂)环烷环的两个碳原子。
在第二个优选的实施方案中，Z是通过亲核反应形成的，优选亲核酰化反应或迈克尔加成反应，优选迈克尔加成反应。优选的迈克尔反应是硫醇-马来酰亚胺连接，其中最优选地Q为马来酰亚胺，F为硫醇基团。在一个优选的实施方案中，连接基团Z包括琥珀酰亚胺环或其开环的琥珀酸酰胺衍生物。连接基团Z的优选方案包括选自下文描述的(Z57)-(Z71)的部分。
此处，用*标记的波浪键与抗体Ab(任选地通过接头)连接；不带标记的波浪键与有效负载(任选地通过接头)连接。此外，R29为C1-12烷基，优选C1-4烷基，最优选乙基，X1为O或S，优选X1＝O。在(Z67)-(Z71)中标有**的氮原子对应于抗体赖氨酸残基侧链的氮原子。(Z69)和(Z70)中苯基的碳原子任选地被取代，优选任选地被氟化。
在一个优选的实施方案中，连接基团Z包括选自(Z1)-(Z71)的部分。
接头
根据本发明的多特异性抗体构建体包含多个接头。接头(也称为连接单元)在本领域是众所周知的，并且其可以使用任何合适的接头。在结构(1)的多特异性抗体构建体中，接头L1连接抗体Ab与有效负载D1，接头L2连接抗体Ab与有效负载D2。在结构(2)的多特异性抗体构建体中，接头L3连接抗体Ab与支链部分BM，接头L4连接支链部分BM与有效负载D1，接头L5连接支链部分BM与有效负载D2。接头可以是可裂解的，也可以是不可裂解的。接头可包含一个或多个分支点(除BM外)，用于将多个有效负载D连接到抗体Ab上。
根据本发明的多功能抗体构建体定义的每个接头均独立地为至少1个，优选5至100个选自C、N、O、S和P的原子的链。在本文中，原子链是指从连接单元两端开始的最短原子链。链中的原子也可称为骨架原子。正如技术人员所理解的，具有两个以上价态的原子(如C、N和P)可以适当地官能化，以完成这些原子的价态。换言之，骨架原子可任选官能化。在一个优选的实施方案中，L1、L2和L3以及L4和L5(如果存在)中的每一个均独立地为至少5至50个，优选6至25个选自C、N、O、S和P的原子的链。骨架原子优选地选自C、N和O。
例如，接头可以选自直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200环亚烷基、C5-C200环亚烯基、C8-C200环亚炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基、C9-C200芳基亚炔基及它们的组合。亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烯基、芳基亚烯基和芳基亚炔基可以任选地被取代，所述基团可以任选地被一个或多个杂原子(优选1至100个杂原子)间断，所述杂原子优选选自O、S(O)y和NR12，其中y为0、1或2，优选y＝2，且R12独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基。接头可包含(聚)乙二醇二胺(如1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷或包含较长乙二醇链的等价物)、(聚)乙二醇或(聚)环氧乙烷链、(聚)丙二醇或(聚)环氧丙烷链和1,z-二氨基烷烃，其中z为烷烃中的碳原子数，例如范围为2-25。
每个接头可以是可裂解的，也可以是不可裂解的。特别是直接连接到有效负载上的接头(即L1和/或L2或L4和/或L5)可以是可裂解的。如果它们连接的有效负载是细胞毒素或任何能通过被动扩散进入肿瘤细胞的小分子有效负载，则特别优选可裂解接头。在本文中，可裂解接头优选在肿瘤溶酶体或肿瘤微环境中是可裂解的。因此，在一个实施方案中，可裂解接头可在肿瘤微环境中裂解。当细胞毒素有效负载与靶向肿瘤细胞外表面受体的多肽结合时，特别优选在肿瘤微环境中的接头是可裂解的。就其本身而言，多功能抗体构建体在肿瘤微环境中与肿瘤细胞结合，其中与细胞毒素连接的接头将被裂解，细胞毒素在肿瘤细胞附近释放。接下来，细胞毒素的内化可导致肿瘤细胞死亡。在肿瘤微环境中可裂解的接头为技术人员所熟知，且其通常易被蛋白水解酶水解，如FAP(成纤维细胞活化蛋白)、前蛋白转化酶枯草溶菌素、弗林蛋白酶(furin)、弹性蛋白酶、天冬氨酰内肽酶(legumain)、成纤维细胞活化蛋白、组织型纤溶酶原激活剂、尿激酶、基质金属蛋白酶(MMP)和蛋白裂解酶(matriptase)。在肿瘤溶酶体中可裂解的接头为技术人员所熟知，且其通常容易被蛋白水解酶水解，如颗粒酶、酪蛋白酶、前蛋白转化酶枯草溶菌素、弗林蛋白酶、天冬氨酰内肽酶、胱天蛋白酶和激肽释放酶。
这种可裂解接头在本领域是已知的，且其通常含有肽间隔基或肽衍生物(如环丁烷-1,1-二甲酰胺-Cit)。可裂解接头优选含有结构(26)的肽间隔基：
其中，R17代表氨基酸侧链，n为1-10，优选n＝1-8，更优选n＝1-5，最优选n＝1-4范围内的整数，优选n＝2。
优选地，肽间隔基是本领域已知的二肽或三肽间隔基，优选二肽间隔基。合适的肽间隔基选自以下：Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Arg、Val-Gln、AcLys-Val-Cit、AcLys-Val-Ala、Phe-Cit、Phe-Ala、Phe-Lys、Phe-Arg、Phe-Gln、Ala-Lys、Leu-Cit、Leu-Gln、Ile-Cit、Trp-Cit、Ala-Ala-Asn、Ala-Asn、Pro-Leu-Gly、Asn-Pro-Val、Lys-Ser-Gly-Arg-Ser-Asp-Asn-His、Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly和Lys，优选选自Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Arg、AcLys-Val-Cit、AcLys-Val-Ala、Phe-Cit、Phe-Ala、Phe-Lys、Phe-Arg、Ala-Lys、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Ala-Ala-Asn、Ala-Asn，更优选Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Phe-Cit、Phe-Ala、Phe-Lys、Ala-Ala-Asn、Ala-Asn、Pro-Leu-Gly、Asn-Pro-Val、Lys-Ser-Gly-Arg-Ser-Asp-Asn-His、Gly-Gly-Phe-Gly和Lys，优选地肽间隔基为Val-Cit、Val-Ala或Ala-Ala-Asn。在一个实施方案中，肽间隔基为Val-Cit。在一个实施方案中，肽间隔基为Val-Ala。
在一个优选的实施方案中，肽间隔基由一般结构(27)表示：
其中，R17代表氨基酸侧链，优选R17＝CH3(Val)或CH2CH2CH2NHC(O)NH2(Cit)。
结构(26)和(27)中的波浪线表示与分子其余部分的连接，优选肽间隔基通过NH(通常通过接头)与抗体连接，且其通过C(O)(通常通过接头)与有效负载连接。
直接连接到抗体Ab的接头可以具有连接到抗体的单个连接点，也可以具有一个以上(通常是两个)的连接点。这适用于接头L1、L2和L3。虽然接头L1和接头L2均可以具有一个以上的连接点，但优选接头L1和接头L2中的一个仅有一个连接点，另一个有一个或两个连接点。
与抗体Ab有两个连接点的接头优选由结构(L-A)表示：
其中
-L6、L7和L8为接头；
-p和q各自独立地为1或0；
-BM1为支链部分；
-Z为连接基团。
在一个优选的实施方案中，接头L1或接头L3具有结构(L-A)。在接头L1具有结构(L-A)的情况下，优选x1为1或2，优选x1为1。在接头L3具有结构(L-A)的情况下，优选x3为1或2，优选x3为1。
支链部分BM1的定义与支链部分BM相同，包括其优选实施方案。如果根据本发明的多功能抗体构建体同时包含支链部分BM和BM1，则两个支链部分可相同或可不同。
连接基团Z在上文进一步定义。优选地，Z的两次出现是相同的。在本实施方案的上下文中，连接基团Z优选通过如上文定义的环加成反应获得。如果Z通过环加成获得，则优选两个接头L8均存在，且q＝1。优选两个接头L7均存在，且p＝1。最优选地，q＝p＝1。
优选地，L6具有结构(L-D)：
**-(L21)n-(L22)o-(L23)p-(L24)q-***
(L-D)
其中
-标有**的键与BM1连接，标有***的键与BM连接；
-n、o、p和q各自独立地为0或1；
-L21、L22、L23和L24为接头。
接头L6可包含在合成多功能抗体构建体期间形成的连接基团Z。含有BM、D1和D2的有效负载-构建体可以连接到包含BM1的接头构建体上，这可以在接头构建体(特别是反应性部分Q)与功能化抗体(特别是反应性部分F)反应之前或之后进行。下文的方案1和2描述了两种有代表性的合成方法。接头L3中的连接基团可以在连接单元L21、L22、L23和L24中的任何一个连接处形成，也可以单独存在于接头L3中。因此，接头L3可以用-Sp-Z-Sp-来表示，其中Sp是单独地间隔基。这些间隔基通常包含结构(L-D)所定义的接头的一部分。例如，L3可用-Z-(L21)n-(L22)o-(L23)p-(L24)q-或-(L21)n-Z-(L22)o-(L23)p-(L24)q-表示。此处，Z可以为任何形式，优选如上文所定义的。
方案1：
其中，R32＝D1或D2(针对(13)和(1))，或R32＝BM((L4)m-D1)((L5)n-D2)(针对(14)和(2))。
方案2：
其中，R32＝D1或D2(针对(16)和(1))，或R32＝BM((L4)m-D1)((L5)n-D2)(针对(17)和(2))。
接头构建体可依次通过如下缀合反应制备：
其中，R32＝D1或D2(针对(16)和(19))，或者R32＝BM((L4)m-D1)((L5)n-D2)(针对(17)和(20))。
接头L7将BM与连接基团Z连接。优选L7均存在，即p的两次出现均为1，更优选它们相同。每个L7可独立选自直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200环亚烷基、C5-C200环亚烯基、C8-C200环亚炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基和C9-C200芳基亚炔基，亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子任选取代和任选间断，其中R3独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。当亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个如上文定义的杂原子间断时，优选所述基团被一个或多个O原子和/或一个或多个S-S基团间断。
更优选地，每个L7独立地选自直链或支链的C1-C100亚烷基、C2-C100亚烯基、C2-C100亚炔基、C3-C100环亚烷基、C5-C100环亚烯基、C8-C100环亚炔基、C7-C100烷基亚芳基、C7-C100芳基亚烷基、C8-C100芳基亚烯基和C9-C100芳基亚炔基，亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子任选取代和任选间断，其中R3独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
甚至更优选地，每个L7独立地选自直链或支链的C1-C50亚烷基、C2-C50亚烯基、C2-C50亚炔基、C3-C50环亚烷基、C5-C50环亚烯基、C8-C50环亚炔基、C7-C50烷基亚芳基、C7-C50芳基亚烷基、C8-C50芳基亚烯基和C9-C50芳基亚炔基，亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子任选取代和任选间断，其中R3独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
甚至还更优选地，每个L7独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基、C2-C20亚烯基、C2-C20亚炔基、C3-C20环亚烷基、C5-C20环亚烯基、C8-C20环亚炔基、C7-C20烷基亚芳基、C7-C20芳基亚烷基、C8-C20芳基亚烯基和C9-C20芳基亚炔基，亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子任选取代和任选间断，其中R3独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
在这些优选的实施方案中，进一步优选亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基是未取代的，并且任选地被一个或多个选自O、S和NR3(优选O)的杂原子间断，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基(优选氢或甲基)。
最优选地，每个L7独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基，所述亚烷基被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子任选取代和任选间断，其中R3独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。在本实施方案中，进一步优选的亚烷基是未取代的，且任选地被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子(优选O和/或或S-S)间断，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，优选氢或甲基。
优选的接头L7包括-(CH2)n1-、-(CH2CH2)n1-、-(CH2CH2O)n1-、-(OCH2CH2)n1-、-(CH2CH2O)n1CH2CH2-、-CH2CH2(OCH2CH2)n1-、-(CH2CH2CH2O)n1-、-(OCH2CH2CH2)n1-、-(CH2CH2CH2O)n1CH2CH2CH2-和-CH2CH2CH2(OCH2CH2CH2)n1-，其中n1为1至50范围内的整数，优选1至40范围内的整数，更优选1至30范围内的整数，甚至更优选1至20范围内的整数，甚至还更优选1至15范围内的整数。更优选n1为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选1、2、3、4、5或6，甚至还更优选1、2、3或4。
优选地，具有结构(L-A)的接头与抗体Ab的两个糖基化位点连接，这样接头L8以部分形成了抗体的(修饰的)聚糖。接头L8优选具有结构(L-E)：
*-GlcNAc(Fuc)d-(G)e-Su-**
(L-E)
其中
-标有*的键与抗体Ab的氨基酸连接，标有**的键与Z连接；
-d为0或1
-e为0-10范围内的整数；
-Su为单糖；
-G为单糖部分；
-GlcNAc为N-乙酰氨基葡萄糖部分；
-Fuc为岩藻糖部分。
与抗体Ab有一个连接点的接头优选由结构(L-B)或(L-C)表示：
*-GlcNAc(Fuc)d-(G)e-Su-Z-(L21)n-(L22)o-(L23)p-(L24)q-**
(L-B)
*-Z-(L21)n-(L22)o-(L23)p-(L24)q-**
(L-C)
其中
-标有*的键与抗体Ab的两个不同氨基酸连接，标有**的键与有效负载(任选地通过接头)连接；
-d、n、o、p和q各自独立地为0或1；
-e为0-10范围内的整数；
-L21、L22、L23和L24为接头；
-Su为单糖；
-G为单糖部分；
-GlcNAc为N-乙酰氨基葡萄糖部分；
-Fuc为岩藻糖部分；
-Z为连接基团。
在一个优选的实施方案中，接头L1和/或L2(优选两者都有)具有结构(L-B)或(L-C)。具有结构(L-B)的接头优选为与抗体Ab有一个连接点的接头。接头(L-B)优选连接到抗体Ab的糖基化位点，主要是天冬酰胺氨基酸，且以部分形成抗体的(修饰)聚糖。接头(L-C)优选连接到抗体的酪氨酸、半胱氨酸或赖氨酸氨基酸上，最优选半胱氨酸氨基酸。
连接基团Z如上文进一步定义。在接头具有结构(L-B)的情况下，连接基团Z优选通过如上文定义的环加成反应获得。如果接头具有结构(L-C)并连接到半胱氨酸或赖氨酸氨基酸上，则连接基团Z优选通过如上文定义的亲核反应获得。如果接头具有结构(L-C)并连接到酪氨酸氨基酸上，则连接基团Z优选通过如上文定义的环加成反应获得。
具有一个抗体连接点的接头和具有两个连接点的接头可以连接到结构为Ab((L8)q-F)x的抗体上，其中x的值取决于待制备的多功能抗体构建体的确切结构。例如，x可为2或4。
结构为Ab((L8)q-F)x的抗体可以通过本领域已知的任何方法制备。例如，抗体链间二硫键的还原已经为F提供了硫醇基团。如果这种还原之后再与一定数量的含有马来酰亚胺构建体(或其他硫醇反应构建体)的反应性部分F反应，则任何反应性部分F均可以连接到抗体上。例如，通过对抗体进行基因工程改造，使其含有两个未配对的半胱氨酸(每条重链一个或每条轻链一个)，从而在抗体与含有马来酰亚胺构建体的F接触时，将两个反应性部分F恰好连接到抗体上，这样就可以实现更可控的、位点特异性的抗体缀合过程。基因编码可直接表达抗体，以通过使用AMBER终止密码子，在特定位点含有预定数量的反应性部分F。也有报道称，有一系列酶法可在抗体中加入一定数量的反应性部分F，例如基于转谷氨酰胺酶(TGase)、分选酶、甲酰甘氨酸生成酶(FGE)等。另一种酶法是通过酪氨酸酶的氧化作用，将可用的酪氨酸残基侧链转化为邻醌部分F。形成的邻醌部分在环加成反应中对烯烃和炔烃具有反应性。因此，在一个实施方案中，功能化抗体的制备方法有：还原链间二硫键，然后与含F的硫醇反应性构建体反应；引入未配对的半胱氨酸残基，然后与含F的硫醇反应性构建体反应；酶法引入反应性部分F；以及通过基因工程引入反应性部分。在本申请的上下文中，最不优选使用基因工程改造，而最优选使用酶法引入反应性部分F。
在一个优选的实施方案中，GlycoConnect技术(例如参见WO 2014/065661和VanGeel等人,Bioconj.Chem.2015,26,2233-2242，通过引用纳入本文)利用单克隆抗体重链上天然存在的聚糖引入固定数量的点击探针，特别是叠氮化物。因此，在一个优选的实施方案中，功能化抗体的制备方法为：(i)任选地用合适的内切糖苷酶修剪天然聚糖，从而释放核心GlcNAc(通常存在于Asn-297)，然后(ii)在合适的糖基转移酶的作用下，将非天然的含叠氮的糖底物转移为相应的UDP-糖，例如，用半乳糖基转移酶突变体Gal-T(Y289L)转移GalNAz，或用GalNAc-转移酶(GalNAc-T)转移6-叠氮GalNAc。或者，GalNAc-T也可用于在核心-GlcNAc上安装GalNAc衍生物，所述核心-GlcNAc在Ac基团上含有芳香部分或硫醇功能。根据本发明的多功能抗体构建体可以通过这种技术获得，其中可以采用修剪步骤(i)来获得e＝0的功能化抗体，也可以省略修剪步骤(i)来获得e＝1-10的功能化抗体。优选地，进行修剪步骤，并且e＝0。
在一个优选的实施方案中，抗体的聚糖用于连接一个或多个有效负载。在本实施方案的上下文中，根据本发明的多功能抗体构建体具有结构为-GlcNAc(Fuc)b-(G)e-的聚糖，其中添加了单糖Su。Su是一种官能化单糖，包含反应性基团F(缀合前)或连接基团Z(缀合后)。因此，Su可被视为一种单糖衍生物，并在下文中进一步定义。鉴于Su的单糖核心结构，可以将其视为聚糖的一部分。然而，结构为-GlcNAc(Fuc)b-(G)e-结构的聚糖来源于抗体的原始聚糖，Su连接在其上。
因此，聚糖中的-GlcNAc(Fuc)b-(G)e-通常来源于原始抗体，其中GlcNAc为N-乙酰葡糖胺部分，Fuc为岩藻糖部分。Fuc通常通过α-1,6糖苷键与GlcNAc结合。通常，抗体可以(b＝1)或不可以被岩藻糖基化(b＝0)。GlcNAc残基也可称为核心-GlcNAc残基，且其为直接连接到抗体肽部分的单糖。
两个GlcNAc部分中的每一个优选均存在于抗体Ab的Fc-片段中的天然N-糖基化位点上。优选地，所述GlcNAc部分连接到Ab的290-305区域的天冬酰胺氨基酸上。在另一个优选的实施方案中，抗体为IgG型抗体，根据特定的IgG型抗体，所述GlcNAc部分存在于抗体的氨基酸天冬酰胺297(Asn297或N297)上。
G为单糖部分，e为0-10范围内的整数。G优选选自葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)和唾液酸及木糖(Xyl)。更优选地，G选自葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
在一个优选的实施方案中，e为0且G不存在。当抗体的聚糖被修剪时，G通常不存在。修剪是指用内切糖苷酶处理，使聚糖中仅保留任选地的岩藻糖基化核心GlcNAc部分。
在另一个优选的实施方案中，e为1-10范围内的整数。在该实施方案中，进一步优选G选自葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)或唾液酸及木糖(Xyl)，更优选选自葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
当e为3-10时，(G)e可以是直链或支链的。如下图所示，支链寡糖(G)e的优选实例为(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)和(h)。
/>
在存在G的情况下，优选以GlcNAc结尾。换言之，与Su直接连接的单糖残基为GlcNAc。GlcNAc部分的存在有利于功能化抗体的合成，因为单糖衍生物Su很容易通过糖基转移引入至末端GlcNAc残基上。在上述具有结构(a)-(h)的(G)e的优选实施方案中，部分Su可以连接到任何末端GlcNAc残基上，即不是连接到抗体上核心GlcNAc残基的带有波浪键的那个。
特别优选G不存在，即e＝0。其中e＝0的多功能抗体构建体的优点是，当这种缀合物用于临床时，与Fcγ受体CD16、CD32和CD64的结合显著减少或完全消失。
Su为单糖衍生物，也称为糖衍生物。优选地，糖衍生物能够通过糖基转移的方式引入到功能化抗体中。更优选地，Su为Gal、Glc、GalNAc或GlcNAc，更优选Gal或GalNAc，最优选GalNAc。可引入的核苷酸-糖衍生物的一些优选实例参见图7。术语衍生物是指单糖被适当地官能化，以便与(G)e和F连接。
接头L4将BM与有效负载D1连接。接头L4可以存在(m＝1)或不存在(m＝0)，优选L4存在，即m＝1。接头L5将BM与有效负载D2连接。接头L5可以存在(n＝1)或不存在(n＝0)，优选L5存在，即n＝1。虽然接头L4和L5可以相同，但优选它们不相同，因为它们用于将两个不同的有效负载连接到BM。
在一个优选的实施方案中，L4和L5均独立地具有结构(L-D)，所述结构将在下文中进一步定义。
**-(L21)n-(L22)o-(L23)p-(L24)q-***
(L-D)
其中
-标有**的键与BM连接，标有***的键与D1或D2连接；
-n、o、p和q各自独立地为0或1；
-L21、L22、L23和L24为接头。
与接头L6一样，接头L4和L5可包含连接基团Z，所述连接基团Z在合成多功能抗体构建体期间形成。有效负载可以与含有BM的接头构建体连接，这可以是在与含有BM1的接头构建体反应之前或之后，也可以是与功能化抗体反应之前或之后。接头L4和L5中的连接基团可以在连接单元L21、L22、L23和L24中的任一个连接处形成，也可以单独存在于接头L4和L5中。因此，接头L4和L5可以用-Sp-Z-Sp-来表示，其中Sp是单独的间隔基。这些间隔基通常包含由结构(L-D)定义的接头的一部分。例如，L4和L5可用-(L21)n-(L22)o-(L23)p-Z-(L24)q-或-(L21)n-(L22)o-(L23)p-(L24)q-Z-表示。此处，Z可以是任何形式，优选如上文所定义的。
L4、L5和L6中的每一个可包含一个或多个L21、L22、L23和L24。L21、L22、L23和L24为一起形成接头L4、L5或L6的接头，如下文进一步所定义的；n、o、p和q独立地为0或1。在一个优选的实施方案中，至少存在接头L21和L22(即n＝1；o＝1；p＝0或1；q＝0或1)，更优选存在接头L21、L22和L23，并且L24存在或不存在(即n＝1；o＝1；p＝1；q＝0或1)。在一个实施方案中，接头L21、L22、L23和L24均存在(即n＝1；o＝1；p＝1；q＝1)。在一个实施方案中，接头L21、L22和L23存在，并且L24不存在(即n＝1；o＝1；p＝1；q＝0)。在一个实施方案中，n+o+p+q＝1、2、3或4，优选2、3或4，更优选3或4。在一个优选的实施方案中，L22和L23均存在，即o+p＝2。最优选地，n+o+p+q＝3或4。
接头L21要么不存在(n＝0)，要么存在(n＝1)。优选地，接头L21存在且n＝1。例如，L21可以选自直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200环亚烷基、C5-C200环亚烯基、C8-C200环亚炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基、C9-C200芳基亚炔基。任选地，亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基可以被取代，并且任选地，所述基团可以被一个或多个杂原子(优选1至100个杂原子)间断，所述杂原子优选选自O、S(O)y和NR15，其中y为0、1或2，优选y＝2，且R15独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基。
L21可包含(聚)乙二醇胺(例如1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷或包含较长乙二醇链的等价物)、聚乙二醇或聚环氧乙烷链、聚丙二醇或聚环氧丙烷链和1,z-二氨基烷烃，其中z是烷烃中的碳原子数(例如z可以是1-10范围内的整数)。
在一个优选的实施方案中，接头L21包括乙二醇基团、羧酸部分、磺酸部分、砜部分、磷酸部分、膦酸部分、氨基、铵基或磺酰胺基团。
在一个优选的实施方案中，接头L21包括磺酰胺基团，优选根据结构(23)的磺酰胺基团：
波浪线表示与化合物其余部分的连接，L4和L5通常与BM和L22、L23、L24、D1或D2连接，优选与BM和L22连接。优选地，(O)aC(O)部分与BM连接，NR13部分与L22、L23、L24、D1或D2连接，优选与L22连接；对于L6，通常与BM1和BM连接。优选地，(O)aC(O)部分与BM1连接，NR13部分与BM连接。
在结构(23)中，a1＝0或1，优选a1＝1，且R13选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基和C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基被一个或多个选自O、S和NR14的杂原子任选取代和任选间断，其中R14独立地选自氢和C1-C4烷基。
或者，R13可能通过间隔基部分与有效负载连接。在一个实施方案中，R13还与有效负载D1或D2连接，从而形成环状结构。例如，N是哌嗪部分的一部分，通过碳原子或氮原子与D1或D2连接，优选通过哌嗪环的第二个氮原子连接。优选地，环状结构(如哌嗪环)通过-(B)e1-(A)f1-(B)g1-C(O)-或通过-(B)e1-(A)f1-(B)g1-C(O)-(L22)o-(L23)p-(L24)q-与D1或D2连接，如下文进一步所定义的。
在一个优选的实施方案中，R13为氢或C1-C20烷基，更优选R13为氢或C1-C16烷基，甚至更优选R13为氢或C1-C10烷基，其中烷基被一个或多个选自O、S和NR14(优选O)的杂原子任选取代和任选间断，其中R14独立地选自氢和C1-C4烷基。在一个优选的实施方案中，R13为氢。在另一个优选的实施方案中，R13为C1-C20烷基，更优选C1-C16烷基，甚至更优选C1-C10烷基，其中烷基被一个或多个O原子任选间断，并且烷基任选地被-OH基团(优选末端的-OH基团)取代。在本实施方案中，R13进一步优选为包含末端-OH基团的(聚)乙二醇链。在另一个优选的实施方案中，R13选自氢、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、s-丁基和叔丁基，更优选选自氢、甲基、乙基、正丙基和异丙基，甚至更优选选自氢、甲基和乙基。甚至还更优选地，R13为氢或甲基，最优选R13为氢。
在一个优选的实施方案中，L21如结构(24)所示：
其中，a和R13如上文所定义，Sp1和Sp2独立地为间隔基部分，b1和c1独立地为0或1。优选地，b1＝0或1，并且c1＝1，更优选地，b1＝0并且c1＝1。在一个实施方案中，间隔基Sp1和Sp2独立地选自直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200环亚烷基、C5-C200环亚烯基、C8-C200环亚炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基和C9-C200芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个选自O、S和NR16的杂原子任选取代和任选间断，其中R16独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。当亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个如上文所定义的杂原子间断时，优选所述基团被一个或多个O原子和/或一个或多个S-S基团间断。
更优选地，间隔基部分Sp1和Sp2(如果存在)独立地选自直链或支链的C1-C100亚烷基、C2-C100亚烯基、C2-C100亚炔基、C3-C100环亚烷基、C5-C100环亚烯基、C8-C100环亚炔基、C7-C100烷基亚芳基、C7-C100芳基亚烯基、C8-C100芳基亚烯基和C9-C100芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个选自O、S和NR16的杂原子任选取代和任选间断，其中R16独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
甚至更优选地，间隔基部分Sp1和Sp2(如果存在)独立地选自直链或支链的C1-C50亚烷基、C2-C50亚烯基、C2-C50亚炔基、C3-C50环亚烷基、C5-C50环亚烯基、C8-C50环亚炔基、C7-C50烷基亚芳基、C7-C50芳基亚烯基、C8-C50芳基亚烯基和C9-C50芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个选自O、S和NR16的杂原子任选取代和任选间断，其中R16独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
甚至还更优选地，间隔基部分Sp1和Sp2(如果存在)独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基、C2-C20亚烯基、C2-C20亚炔基、C3-C20环亚烷基、C5-C20环亚烯基、C8-C20环亚炔基、C7-C20烷基亚芳基、C7-C20芳基亚烯基、C8-C20芳基亚烯基和C9-C20芳基亚炔基，所述亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基被一个或多个选自O、S和NR16的杂原子任选取代和任选间断，其中R16独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。
在这些优选的实施方案中，进一步优选的亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烷基、芳基亚烯基和芳基亚炔基是未取代的，并且任选地被一个或多个选自O、S和NR16(优选O)的杂原子间断，其中R16独立地选自氢和C1-C4烷基，优选氢或甲基。
最优选地，间隔基部分Sp1和Sp2(如果存在)独立地选自直链或支链的C1-C20亚烷基，所述亚烷基被一个或多个选自O、S和NR16的杂原子任选取代和任选间断，其中R16独立地选自氢、C1-C24烷基、C2-C24烯基、C2-C24炔基和C3-C24环烷基，所述烷基、烯基、炔基和环烷基任选地被取代。在本实施方案中，进一步优选的亚烷基是未取代的，且任选地被一个或多个选自O、S和NR16的杂原子(优选O和/或或S-S)间断，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基，优选氢或甲基。
因此，优选的间隔基部分Sp1和Sp2包括-(CH2)r-、-(CH2CH2)r-、-(CH2CH2O)r-、-(OCH2CH2)r-、-(CH2CH2O)rCH2CH2-、-CH2CH2(OCH2CH2)r-、-(CH2CH2CH2O)r-、-(OCH2CH2CH2)r-、-(CH2CH2CH2O)rCH2CH2CH2-和-CH2CH2CH2(OCH2CH2CH2)r-，其中r为1至50范围内的整数，优选1至40范围内的整数，更优选1至30范围内的整数，甚至更优选1至20范围内的整数，甚至还更优选1至15范围内的整数。更优选r为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，更优选1、2、3、4、5、6、7或8，甚至更优选1、2、3、4、5或6，甚至还更优选1、2、3或4。
此外，优选的接头L21可以由-(W)k1-(A)d1-(B)e1-(A)f1-(C(O))g1-表示，其中：
-d1＝0或1，优选d1＝1；
-e1＝0-10范围内的整数，优选e1＝0、1、2、3、4、5或6，优选1-10范围内的整数，最优选e1＝1、2、3或4；
-f1＝0或1，优选f1＝0；
-其中d1+e1+f1至少为1，优选1-5范围内的整数；优选d1+f1至少为1，优选d1+f1＝1。
-g1＝0或1，优选g1＝1；
-k1＝0或1，优选k1＝1；
-A为根据结构(23)的磺酰胺基团；
-B为-CH2-CH2-O-或-O-CH2-CH2-部分，或(B)e1为-(CH2-CH2-O)e3-CH2-CH2-部分，其中e3的定义与e1相同；
-W为-OC(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)(CH2)mC(O)-、-C(O)(CH2)mC(O)NH-或-(4-Ph)CH2NHC(O)(CH2)mC(O)NH-，优选W为-OC(O)NH-、-C(O)(CH2)mC(O)NH-或-C(O)NH-，其中m为0-10范围内的整数，优选m＝0、1、2、3、4、5或6，最优选m＝2或3；
-优选地，其中L21通过(A)d1-(B)e1连接至BM或BM1，并且通过(C(O))g1(优选通过C(O))连接至(L22)o。
在本实施方案的上下文中，结构(23)中的波浪线表示与相邻基团如(W)k1、(B)e1和(C(O))g1的连接。优选A如结构(23)所示，其中a1＝1和R13＝H或C1-C20烷基，更优选R13＝H或甲基，最优选R13＝H。
优选的接头L21如下：
(a)k1＝0；d1＝1；g1＝1；f1＝0；B＝-CH2-CH2-O-；e1＝1、2、3或4，优选e1＝2。
(b)k1＝1；W＝-C(O)(CH2)mC(O)NH-；m＝2；d1＝0；(B)e1＝-(CH2-CH2-O)e3-CH2-CH2-；f1＝0；g1＝1；e3＝1、2、3或4，优选e1＝1。
(c)k1＝1；W＝-OC(O)NH-；d1＝0；B＝-CH2-CH2-O-；g1＝1；f1＝0；e1＝1、2、3或4，优选e1＝2。
(d)k1＝1；W＝-C(O)(CH2)mC(O)NH-；m＝2；d1＝0；(B)e1＝-(CH2-CH2-O)e3-CH2-CH2-；f1＝0；g1＝1；e3＝1、2、3或4，优选e3＝4。
(e)k1＝1；W＝-OC(O)NH-；d1＝0；(B)e1＝-(CH2-CH2-O)e3-CH2-CH2-；g1＝1；f1＝0；e3＝1、2、3或4，优选e3＝4。
(f)k1＝1；W＝-(4-Ph)CH2NHC(O)(CH2)mC(O)NH-，m＝3；d1＝0；(B)e1＝-(CH2-CH2-O)e3-CH2-CH2-；g1＝1；f1＝0；e3＝1、2、3或4，优选e3＝4。
(g)k1＝0；d1＝0；g1＝1；f1＝0；B＝-CH2-CH2-O-；e1＝1、2、3或4，优选e1＝2。
(h)k1＝1；W＝-C(O)NH-；d1＝0；g1＝1；f1＝0；B＝-CH2-CH2-O-；e1＝1、2、3或4，优选e1＝2。
在一个实施方案中，接头L21包括支链氮原子，所述支链氮原子位于BM或BM1与(L22)o之间的骨架中，并含有另一个部分D作为取代基，所述取代基优选通过接头与支链氮原子连接。支链氮原子的实例是结构(23)中的氮原子NR13，其中R13通过间隔基部分与第二个出现的D连接。或者，支链氮原子可根据结构-(W)k1-(A)d1-(B)e1-(A)f1-(C(O))g1-位于L21中。在一个实施方案中，L21由-(W)k1-(A)d1-(B)e1-(A)f1-(C(O))g1-N*[-(A)d1-(B)e1-(A)f1-(C(O))g1-]2表示，其中A、B、W、d1、e1、f1、g1和k1如上文所定义，并为每次出现单独选择，N*为支链氮原子，-(A)d1-(B)e1-(A)f1-(C(O))g1-的两个实体与之连接。此处，两个(C(O))g1部分均与-(L22)o-(L23)p-(L24)q-D连接，其中L22、L23、L24、o、p、q和D如上文所定义，并各自单独选择。在一个最优选的实施方案中，不存在这样的支链原子，并且接头L21不包含与另一个有效负载的连接。
接头L22或者不存在(o＝0)，或者存在(o＝1)。优选地，接头L22存在且o＝1。接头L22是本领域已知的肽间隔基或其衍生物(如环丁烷-1,1-二甲酰胺-Cit)，优选包含2-5个氨基酸。肽间隔基优选结构(26)：
其中，R17代表氨基酸侧链，n为1-10，优选n＝1-8，更优选n＝1-5，最优选n＝1-4范围内的整数，更优选n＝2。
优选地，肽间隔基是本领域已知的二肽间隔基或三肽间隔基，优选二肽间隔基。合适的肽间隔基选自以下：Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Arg、Val-Gln、AcLys-Val-Cit、AcLys-Val-Ala、Phe-Cit、Phe-Ala、Phe-Lys、Phe-Arg、Phe-Gln、Ala-Lys、Leu-Cit、Leu-Gln、Ile-Cit、Trp-Cit、Ala-Ala-Asn、Ala-Asn、Pro-Leu-Gly、Asn-Pro-Val、Lys-Ser-Gly-Arg-Ser-Asp-Asn-His、Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly和Lys，优选选自Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Arg、AcLys-Val-Cit、AcLys-Val-Ala、Phe-Cit、Phe-Ala、Phe-Lys、Phe-Arg、Ala-Lys、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Ala-Ala-Asn、Ala-Asn，更优选Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Phe-Cit、Phe-Ala、Phe-Lys、Ala-Ala-Asn、Ala-Asn、Pro-Leu-Gly、Asn-Pro-Val、Lys-Ser-Gly-Arg-Ser-Asp-Asn-His、Gly-Gly-Phe-Gly和Lys，优选地肽间隔基为Val-Cit、Val-Ala或Ala-Ala-Asn。在一个实施方案中，肽间隔基为Val-Cit。在一个实施方案中，肽间隔基为Val-Ala。
这些接头通常可被蛋白水解酶裂解，优选的蛋白水解酶选自组织蛋白酶、颗粒酶、胱门蛋白酶、kallikereins、前蛋白转化酶枯草溶菌素、弗林蛋白酶、弹性蛋白酶、天冬氨酰内肽酶、成纤维细胞活化蛋白、组织型纤溶酶原激活剂、尿激酶、基质金属蛋白酶和蛋白裂解酶。
在一个优选的实施方案中，肽间隔基由一般结构(27)表示：
其中，R17代表氨基酸侧链，优选R17＝CH3(Val)或CH2CH2CH2NHC(O)NH2(Cit)。
结构(26)和(27)中的波浪线表示与分子其余部分的连接，优选地肽间隔基通过NH(通常通过接头)与(L21)连接，并且通过C(O)(通常通过接头)与有效负载连接。
波浪线表示与(L21)n和(L23)p的连接，优选地，根据结构(26)或(27)的L22通过NH与(L21)n连接，并且通过C(O)与(L23)p连接。
接头L23要么不存在(p＝0)，要么存在(p＝1)。优选地，接头L23存在且p＝1。接头L23是一种可自裂解的间隔基，也称为自凋亡间隔基。优选地，L23是对氨基苄氧基(PAB)衍生物，更优选根据结构(25)的PAB衍生物。
其中
-A为任选取代的5或6元芳香族或杂芳环；
-b为0或1；
-R3为H、R4或C(O)R4，其中R4为C1-C24(杂)烷基、C3-C10
(杂)环烷基、C2-C10(杂)芳基、C3-C10烷基(杂)芳基和C3-C10(杂)芳基烷基，它们任选地被一个或多个选自O、S和NR5的杂原子任选取代和任选间断，其中R5独立地选自氢和C1-C4烷基。
此处，波浪线表示与(L22)o和与(L24)q的连接。通常，PAB衍生物通过NH与(L22)o连接，并且通过O与(L24)q连接。
R3为H、R4或C(O)R4，其中R4为C1-C24(杂)烷基、C3-C10(杂)环烷基、C2-C10(杂)芳基、C3-C10烷基(杂)芳基和C3-C10(杂)芳基烷基，它们任选地被一个或多个选自O、S和NR5的杂原子任选取代和任选间断，其中R5独立地选自氢和C1-C4烷基。优选地，R4为C3-C10(杂)环烷基或聚亚烷基二醇。聚亚烷基二醇优选聚乙二醇或聚丙二醇，更优选-(CH2CH2O)sH或-(CH2CH2CH2O)sH。聚亚烷基二醇最优选聚乙二醇，优选-(CH2CH2O)sH，其中s为1-10范围内的整数，优选1-5，最优选s＝1、2、3或4。更优选地，R3为H或C(O)R4，其中R4＝4-甲基哌嗪或4-甲基吗啉。最优选地，R3为H。优选地，A为苯环且b＝1。
接头L24要么不存在(q＝0)，要么存在(q＝1)。优选地，接头L24存在且q＝1。接头L24是氨基烷酸间隔基，即-N-(Ch-亚烷基)-C(O)-，其中h为1-20，优选1-10，最优选1-6范围内的整数。此处，氨基烷酸间隔基通常通过氮原子与L23连接，并且通过羰基部分与有效负载连接。优选的接头L24选自6-氨基己酸(Ahx，h＝6)、β-丙氨酸(h＝2)和甘氨酸(Gly，h＝1)，甚至更优选6-氨基己酸或甘氨酸。在一个实施方案中，L24＝6-氨基己酸。在一个实施方案中，L24＝甘氨酸。或者，接头L24为根据结构-N-(CH2-CH2-O)e6-(CH2)e7-(C(O)-的乙二醇间隔基，其中e6为1-10范围内的整数，并且e7为1-3范围内的整数。
支链部分
本发明的上下文中的“支链部分”是指嵌入连接三个部分的接头中的部分。换言之，支链部分包括至少三个与其他部分结合的键。支链部分BM包括与有效负载D1(通常通过接头L4)结合的一个键，与有效负载D2(通常通过接头L5)结合的一个键，以及通过接头L3与抗体Ab结合的一个键。支链部分BM1包括通过接头L6与支链部分BM结合的一个键，以及通过(L8)q-Z-(L7)p与抗体Ab结合的两个键。下文定义的支链部分同样适用于BM和BM1。
在本发明的上下文中，任何含有至少三个与其他部分结合的部分均适合作为支链部分。合适的支链部分包括碳原子(BM-1)、氮原子(BM-3)、磷原子(膦(BM-5)和氧化膦(BM-6))、芳环如苯环(如BM-7)或吡啶环(如BM-9)、(杂)环(如BM-11和BM-12)和多环部分(如BM-13、BM-14和BM-15)。优选的支链部分选自碳原子、氮原子和苯基环，最优选的支链部分是碳原子或氮原子。下文描述了结构(BM-1)至(BM-15)，其中三个支链，即与上文定义的其他部分结合的键，用*表示(用*标记的键)。
/>
在(BM-1)中，标有*的支链之一可以为单键或双键，用表示。在(BM-11)至(BM-15)中，适用以下内容：
-n、p、q和q各自独立地均为0-5范围内的整数，最优选0或1，
最优选1；
-W1、W2和W3各自独立地选自C(R21)w和N；
-W4、W5和W6各自独立选自C(R21)w+1、N(R22)w、O和S；
-每个均代表单键或双键；
-w为0或1或2，优选0或1；
-R21各自独立地选自氢、OH、C1-C24烷基、C1-C24烷氧基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，其中所述C1-C24烷基、C1-C24烷氧基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子任选取代和任选间断，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基；以及
-R22各自独立地选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，其中所述C1-C24烷基、C1-C24烷氧基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基被一个或多个选自O、S和NR3的杂原子任选取代和任选间断，其中R3独立地选自氢和C1-C4烷基。
技术人员应理解，w的值和所代表的键的键序是相互依存的。因此，每当W与环内双键键合出现时，对于W的出现，w＝1，而每当W与两个环内单键键合出现时，对于W的出现，w＝0。对于BM-12，o和p中至少有一个不为0。
根据结构(BM-11)和(BM-12)的支链部分的代表性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基、氮杂环丙烷、氮杂环丁烷、二氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、吡咯烷、二氢吡咯基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、咪唑啉基、吡唑烷基、噁唑烷基、异噁唑啉基、四氢噻唑基、异噻唑烷基、二氧戊环基、二硫环基、哌啶基、噁烷基(oxanyl)、噻烷基(thianyl)、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、二噁烷基、三噁烷基、二噻烷基、三噻烷基、氮杂基、氧杂环庚烷基和硫杂环庚烷基。用作支链部分的优选环状部分包括环丙烯基、环己基、噁烷基(四氢吡喃)和二噁烷基。三个支链的取代模式决定了支链部分是结构(BM-11)还是结构(BM-12)。
根据结构(BM-13)至(BM-15)的支链部分的代表性实例包括萘烷、四氢化萘、二氢化萘、萘、茚、二氢化茚、异茚、吲哚、异吲哚、二氢吲哚、异二氢吲哚等。
在一个优选的实施方案中，支链部分是碳原子。如果碳原子是根据结构(BM-1)并且具有连接不同部分的所有四个键，则碳原子是手性的。碳原子的立体化学对于本发明来说不是关键的，并且可以是S或R。这同样适用于膦(BM-6)。最优选地，碳原子如结构(BM-1)所示。根据结构(BM-1)，碳原子中用*表示的支链之一可以是双键，在这种情况下，碳原子可以是烯烃或亚胺的一部分。如果支链部分是碳原子，碳原子可以是较大官能团的一部分，例如乙缩醛、缩酮、半缩酮、原酸酯、原碳酸酯、氨基酸等。这也适用于支链部分是氮或磷原子的情况，在这种情况下，其可以是酰胺、酰亚胺、亚胺、氧化膦(如在BM-6中)或磷酸三酯的一部分。
在一个优选的实施方案中，支链部分是苯环。最优选地，苯环如结构(BM-7)所示。苯环的取代模式可以是任何区域选择性化学，例如1,2,3-取代的苯环、1,2,4-取代的苯环或1,3,5-取代的苯环。为了获得最佳的灵活性和构象自由度，优选苯环如结构(BM-7)所示，最优选苯环是1,3,5-取代的。这同样适用于(BM-9)的吡啶环。
在一个优选的实施方案中，支链部分选自碳原子、氮原子、磷原子、(杂)芳环、(杂)环或多环部分。
优选的多功能抗体构建体
根据本发明，特别优选的多功能抗体构建物具有结构(3)、(4)、(5)、(6)或(7)。在一个实施方案中，多功能抗体构建体如结构(3)、(4)、(5)或(6)所示。在一个实施方案中，多功能抗体构建体如结构(3)、(4)或(6)所示。在一个实施方案中，多功能抗体构建体如结构(3)或(4)所示。
在一个实施方案中，多功能抗体构建体具有结构(3)：
其中：
-BM和BM1为支链部分；
-d、m、n和p各自独立地为0或1；
-D1和D2为两个不同的选自多肽、小部分、细胞毒素和寡核苷酸的有效负载，其中D1和D2中的至少一个是多肽；
-e为0-10范围内的整数；
-L4、L5、L6和L7为接头；
-Su为单糖；
-G为单糖部分；
-GlcNAc为N-乙酰氨基葡萄糖部分；
-Fuc为岩藻糖部分；
-Z1为连接基团。
对于具有结构(3)的多功能抗体构建体，优选n＝m＝1。
在一个实施方案中，多功能抗体构建体具有结构(4)：
其中：
-D1和D2为两个不同的选自多肽、小部分、细胞毒素和寡核苷酸的有效负载，其中D1和D2中的至少一个是多肽；
-d和p各自独立地为0或1；
-e为0-10范围内的整数；
-x2为1-8范围内的整数；
-L6、L7和L14为接头；
-Su为单糖；
-G为单糖部分；
-GlcNAc为N-乙酰氨基葡萄糖部分；
-Fuc为岩藻糖部分；
-BM1为支链部分；
-Z1和Z2为连接基团。
对于具有结构(4)的多功能抗体构建体，优选L14为上述定义的结构(L-D)所示。进一步优选地，连接基团Z1通过环加成反应获得，连接基团Z2通过亲核反应获得。
在一个实施方案中，多功能抗体构建体具有结构(5)：
其中：
-D1和D2为两个不同的选自多肽、小部分、细胞毒素和寡核苷酸的有效负载，其中D1和D2中的至少一个是多肽；
-x1和x2各自独立地为1、2或3。
-每个d独立地为0或1；
-e为0-10范围内的整数；
-L15和L16为接头；
-Su为单糖；
-G为单糖部分；
-GlcNAc为N-乙酰氨基葡萄糖部分；
-Fuc为岩藻糖部分；
-Z1和Z2为连接基团。
对于具有结构(5)的多功能抗体构建体，优选L15和L16均独立地为上述定义的结构(L-D)所示。进一步优选地，连接基团Z1和Z2均独立地通过环加成反应获得。通常，x1和x2之和最多为4，优选2或4。更优选地，x1和x2相同且为1或2。
在一个实施方案中，多功能抗体构建体具有结构(6)：
其中：
-D1和D2为两个不同的选自多肽、小部分、细胞毒素和寡核苷酸的有效负载，其中D1和D2中的至少一个是多肽；
-x1为1-8范围内的整数，x2为1-4范围内的整数，其中x1+x2＝2-10
-每个d独立地为0或1
-e为0-10范围内的整数；
-L14和L15为接头；
-Su为单糖；
-G为单糖部分；
-GlcNAc为N-乙酰氨基葡萄糖部分；
-Fuc为岩藻糖部分；
-Z1和Z2为连接基团。
对于具有结构(6)的多功能抗体构建体，优选L14和L15均独立地为上述定义的结构(L-D)所示。进一步优选地，连接基团Z1通过环加成反应获得，连接基团Z2通过亲核反应获得。x2为1-4范围内的整数，优选x2为1或2，最优选x2是2。
在一个实施方案中，多功能抗体构建体具有结构(7)：
其中：
-D1和D2为两个不同的选自多肽、小部分、细胞毒素和寡核苷酸的有效负载，其中D1和D2中的至少一个是多肽；
-x3为1-4范围内的整数；
-每个d独立地为0或1
-e为0-10范围内的整数；
-L4、L5和L17为接头；
-BM为支链部分；
-Su为单糖；
-G为单糖部分；
-GlcNAc为N-乙酰氨基葡萄糖部分；
-Fuc为岩藻糖部分；
-Z1和Z2为连接基团。
对于具有结构(7)的多功能抗体构建体，优选L17为上述定义的结构(L-D)所示。进一步优选地，连接基团Z1通过环加成反应获得。x2为1-4范围内的整数，优选x3是2或4，最优选x3是2。此外，优选m＝n＝1。
应用
例如，根据本发明的多功能抗体构建体通过在单个分子中结合了多种抗癌作用模式而特别适用于治疗癌症。因此，本发明进一步涉及根据本发明的多功能抗体构建体在医学中的用途。在另一方面，本发明还涉及治疗需要其的受试者的方法，包括向受试者给予根据本发明的多功能抗体构建体。根据这一方面的方法也可以表述为根据本发明的多功能抗体构建体用于治疗。根据这一方面的方法也可以表述为将根据本发明的多功能抗体构建体用于制备药物。在本文中，给药通常与治疗有效量的根据本发明的多功能抗体构建体一起发生。
由于根据本发明的抗体构建体的多功能性，由于抗体的靶向性，治疗会将有效负载D1和D2带向肿瘤。因此，不再需要联合给药一种基于有效负载D1的药物(如抗体-药物缀合物)和一种单独给药的额外药物(如化疗药物或检查点抑制剂)。此外，根据本发明的多功能抗体构建体可以在与肿瘤相关抗原的结合、免疫细胞接合多肽或检查点抑制剂的数量以及其他有效负载(如小分子有效负载)的数量等方面精心定制的化学计量。最后，根据本发明的多功能抗体构建体可能特别适用于治疗因肿瘤的多药耐药性而对常规疗法不敏感的患者。因此，在一个特别优选的实施方案中，受试者是对常规癌症疗法产生多药耐药性的癌症患者。
本发明还涉及治疗需要其的受试者的特定疾病的方法，包括给予如上文定义的根据本发明的多功能抗体构建体。特定疾病可以选自癌症、病毒感染、细菌感染、神经系统疾病、自身免疫疾病、眼病、高胆固醇血症和淀粉样变性，更优选选自癌症和病毒感染，最优选的疾病是癌症。需要其的受试者通常是癌症患者。抗体-缀合物的用途在此类治疗中，尤其是在癌症治疗领域是众所周知的，并且根据本发明的多功能抗体构建体在这方面尤其适用。在根据该方面的方法中，多功能抗体构建体通常以治疗有效量给药。本发明的本方面也可以表述为根据本发明的多功能抗体构建体用于治疗需要其的受试者的特定疾病，优选用于治疗癌症。换言之，该方面涉及根据本发明的多功能抗体构建体在制备用于治疗需要其的受试者的特定疾病、优选用于治疗癌症的药物或药物组合物中的用途。
优选地，根据本发明的多功能抗体构建体是Fc沉默的，即在临床使用时不显著与Fcγ受体CD16结合。这是G不存在时的情况，即e＝0。优选地，与CD32和CD64的结合也会显著减少。
本发明还涉及将免疫细胞与肿瘤细胞结合的方法。将包含免疫细胞和肿瘤细胞的样品与根据本发明的多功能抗体构建体接触。免疫细胞与免疫细胞接合肽结合，肿瘤细胞与抗体结合，从而形成肿瘤细胞、免疫细胞和多功能抗体构建体的关联复合体。在另一个实施方案中，根据本发明的方法可同时与肿瘤细胞和检查点抑制剂结合。在本文中，包含检查点抑制剂和肿瘤细胞的样品与根据本发明的多功能抗体构建体接触。检查点抑制剂与检查点抑制剂-靶向多肽结合，肿瘤细胞与抗体结合，从而形成肿瘤细胞、检查点抑制剂和多功能抗体构建体的关联复合体。这种接触可以在体外样品中进行(例如从受试者身上取样)，也可以在受试者体内进行，在这种情况下，向受试者给予根据本发明的多功能抗体构建体。
本发明上下文中的给药是指全身给药。因此，在一个实施方案中，本文定义的方法用于全身给予多功能抗体构建体。鉴于多功能抗体构建体的特异性，它们可以全身给药，但在感兴趣的组织(如肿瘤)内或附近发挥其活性。全身给药比局部给药具有更大的优势，因为该药物也可能到达成像技术无法检测到的肿瘤转移，并且可能适用于血液肿瘤。
本发明还涉及包含根据本发明的抗体-有效负载缀合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
实施例
本发明通过以下实施例进行说明。
一般程序
化学品购自通用供应商(Sigma-Aldrich,Acros,Alfa Aesar,Fluorochem,ApolloScientific Ltd和TCI)，且使用时无需进一步纯化。用于化学转化、后续处理和色谱的溶剂(包括干燥的溶剂)购自Aldrich(Dorset，UK)，为HPLC级，且使用时无需进一步蒸馏。硅胶60F254分析薄层色谱(TLC)板购自Merck(Darmstadt,Germany)，在紫外光下用高锰酸钾染色剂或茴香醛染色剂进行可视化。使用Acros硅胶(0.06-0.200，60A)或预装柱(ScreeningDevices)结合Buchi Sepacore C660级分收集器(Flawil,Switzerland)进行色谱纯化。使用配备Waters Xbridge C18柱(5μm OBD，30×100mm，PN186002982)的Agilent 1200系统进行反相HPLC纯化。用于NMR光谱的氘代溶剂获得自Cambridge Isotope Laboratories。双-mal-Lys-PEG4-TFP酯(177)获得自Quanta Biodesign，O-(2-氨基乙基)-O'-(2-叠氮乙基)二乙二醇(XL07)以及化合物344和179获得自Broadpharm，2,3-双(溴甲基)-6-喹喔啉羧酸(178)获得自ChemScene，32-叠氮基-5-氧代-3,9,12,15,18,21,24,27,30-九氧杂-6-氮杂三十烷酸(348)获得自Carbosynth。化合物313m(LD14，马来酰亚胺己酰基-Val-Cit-PABC-MMAE)获得自Levena Biopharma。本妥昔单抗(Adcetris)和恩美曲妥珠单抗(kadcyla)购自药店。
单克隆抗体和ADC质谱分析的一般程序
在质谱分析之前，用IdeS(FabricatorTM)处理IgG以分析Fc/2片段。将20μg(修饰的)IgG的溶液与0.5μL IdeS(50U/μL)在pH 6.6的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在37℃下孵育1小时，总体积为10μL。将样品稀释至40μL，然后在JEOL AccuTOF上进行电喷雾电离飞行时间(ESI-TOF)分析。使用Magtran软件获得去卷积质谱。
分析型RP-HPLC的一般程序
在RP-HPLC之前，用IdeS处理IgG，其允许分析Fc/2片段。将(修饰的)IgG(100μL，1mg/mL在PBS pH 7.4中)的溶液与1.5μLIdeS/FabricatorTM(50U/μL)在pH 6.6的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在37℃下孵育1小时。通过加入49％乙腈、49％水、2％甲酸(100μL)终止反应。RP-HPLC分析在Agilent 1100系列(Hewlett Packard)上进行。以0.5mL/min将样品(10μL)进样到柱温为70℃的ZORBAX Poroshell300SB-C8柱(1×75mm，5pm，Agilent)。在25分钟内从30至54％乙腈和在水的0.1％ TFA中应用线性梯度。
分析型HPLC-SEC的一般程序
HPLC-SEC分析在Agilent 1100系列(Hewlett Packard)上进行。将样品(4μL，1mg/mL)以0.86mL/min进样到Xbridge BEH200A(3.5μM,7.8×300mm,PN186007640 Waters)柱。使用0.1M磷酸钠缓冲液pH 6.9(NaH2PO4/Na2HPO4)进行16分钟等度洗脱。
实施例1.化合物102的合成
向4-硝基苯基氯甲酸酯(30.5g，151mmol)在DCM(500mL)中的冷却溶液(0℃)中加入吡啶(24.2mL，23.7g，299mmol)。将BCN-OH(101，18.0g，120mmol)在DCM(200mL)中的溶液滴加到反应混合物中。加入完成后，加入饱和NH4Cl水溶液(500mL)和水(200mL)。分离后，水相用DCM(2×500mL)萃取。将合并的有机相干燥(Na2SO4)并浓缩。粗物质通过硅胶色谱法纯化，得到所需产物102，为灰白色固体(18.7g，59mmol，39％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.32-8.23(m,2H),7.45-7.34(m,2H),4.40(d,J＝8.3Hz,2H),2.40-2.18(m,6H),1.69-1.54(m,2H),1.51(五重峰,J＝9.0Hz,1H),1.12-1.00(m,2H)。
实施例2.化合物104的合成
向叠氮基-PEG11-胺(103)(182mg，0.319mmol)在THF(3mL)中的冷却溶液(-5℃)中加入10％ NaHCO3水溶液(1.5mL)和溶解在THF(2mL)中的9-芴基甲氧基碳酰氯(99mg，0.34mmol)。2小时后，加入EtOAc(20mL)，用盐水(2×6mL)洗涤混合物，用MgSO4干燥和浓缩。通过硅胶柱色谱法(0→11％MeOH的DCM溶液)纯化，得到透明油状的104，产率为98％(251mg，0.316mmol)。LCMS(ESI+)计算C39H60N4O13 +(M+Na+)为815.42，实测值为815.53。
实施例3.化合物105的合成
制备104(48mg，0.060mmol)在THF(3mL)和水(0.2mL)中的溶液并冷却至0℃。加入三甲基膦(1M在甲苯中，0.24mL，0.24mmol)并将混合物搅拌23小时。通过用DCM(6mL)萃取去除水。向该溶液中加入(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(102)(25mg，0.079mmol)和三乙胺(10μL，0.070mmol)。27小时后，将混合物浓缩并将残余物溶解在DMF(3mL)中，然后加入哌啶(400μL)。1小时后，将混合物浓缩并通过硅胶柱色谱法(0→21％MeOH的DCM溶液)纯化残余物，得到无色油状的105(8.3mg，0.0092mmol)。LCMS(ESI+)计算C46H76N2O15 +(M+NH4 +)为914.52，实测值为914.73。
实施例4.化合物107的合成
将(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(102)(4.1mg，0.013mmol)在无水DCM(500μL)中的溶液缓慢加入到氨基-PEG23-胺(106)(12.3mg，0.0114mmol)在无水DCM(500μL)中的溶液中。20小时后，将混合物浓缩并通过硅胶柱色谱法(0→25％MeOH的DCM溶液)纯化残余物，得到所需化合物107，产率为73％(12mg，0.0080mmol)。LCMS(ESI+)计算C70H124N2O27 +(M+NH4 +)为1443.73，实测值为1444.08。
实施例5.化合物108的合成
向BCN-OH(101，21.0g，0.14mol)在MeCN(450mL)中的溶液中加入碳酸二琥珀酰亚胺酯(53.8g，0.21mol)和三乙胺(58.5mL，0.42mol)。将混合物搅拌140分钟后，将其真空浓缩并将残余物与MeCN(400mL)共蒸发一次。将残余物溶解在EtOAc(600mL)中并用H2O(3×200mL)洗涤。有机层用Na2SO4干燥并真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(0→4％EtOAc的DCM溶液)纯化，并得到白色固体状的108(11.2g，38.4mmol，产率为27％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)4.45(d,2H,J＝8.4Hz),2.85(s,4H),2.38-2.18(m,6H),1.65-1.44(m,3H),1.12-1.00(m,2H)。
实施例6.化合物110的合成
向(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基N-琥珀酰亚胺碳酸酯(108)(500mg，1.71mmol)在DCM(15mL)中的溶液中加入三乙胺(718μL，5.14mmol)和单-Fmoc乙二胺盐酸盐(109)(657mg，2.06mmol)。将混合物搅拌45分钟，用EtOAc(150mL)稀释并用50％饱和NH4Cl水溶液(50mL)洗涤。水层用EtOAc(50mL)萃取，合并的有机层用H2O(10mL)洗涤。将合并的有机萃取物真空浓缩，将一半残余物通过硅胶柱色谱法(0→3％MeOH的DCM溶液)纯化，得到所需化合物110，产率为42％(332mg，0.72mmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.77(d,J＝7.5Hz,2H),7.59(d,J＝7.4Hz,2H),7.44-7.37(m,2H),7.36-7.28(m,2H),5.12(br s,1H),4.97(br s,1H),44.41(d,J＝6.8Hz,2H),4.21(t,J＝6.7Hz,1H),4.13(d,J＝8.0Hz,2H),3.33(br s,4H),2.36-2.09(m,6H),1.67-1.45(m,2H),1.33(五重峰,J＝8.6Hz,1H),1.01-0.85(m,2H)。LCMS(ESI+)计算C28H31N2O4 +(M+H+)为459.23，实测值为459.52。
实施例7.化合物111的合成
将化合物110(327mg，0.713mmol)溶解在DMF(6mL)中并加入哌啶(0.5mL)。2小时后，将混合物浓缩并通过硅胶柱色谱法(0→32％0.7N NH3 MeOH的DCM溶液)纯化残余物，得到所需黄色油状的化合物111(128mg，0.542mmol，76％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm,旋转异构体)5.2(bs,1H),4.15(d,J＝8.0Hz,2H),3.48-3.40(m,2/3H),3.33-3.27(m,2/3H),3.27-3.19(m,11/3H),2.85-2.80(m,11/3H),2.36-2.17(m,6H),1.67-1.50(m,2H),1.36(五重峰,J＝8.5Hz,1H),1.01-0.89(m,2H)。
实施例8.化合物114的合成
向二乙醇胺(112)(208mg，1.98mmol)在水(20mL)中的溶液中加入MeCN(20mL)、NaHCO3(250mg，2.97mmol)和Fmoc-OSu(113)(601mg，1.78mmol)在MeCN(20mL)中的溶液。将混合物搅拌2小时并加入DCM(50mL)。分离后，有机相用水(20mL)洗涤，干燥(Na2SO4)并浓缩。得到所需无色粘稠油状的产物114(573mg，1.75mmol，98％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.79-7.74(m,2H),7.60-7.54(m,2H),7.44-7.37(m,2H),7.36-7.30(m,2H),4.58(d,J＝5.4Hz,2H),4.23(t,J＝5.3Hz,1H),3.82-3.72(m,2H),3.48-3.33(m,4H),3.25-3.11(m,2H)。
实施例9.化合物116的合成
向114(567mg，1.73mmol)在DCM(50mL)中的溶液中加入4-硝基苯基氯甲酸酯(115)(768mg，3.81mmol)和Et3N(1.2mL，875mg)。将混合物搅拌18小时并浓缩。残余物通过硅胶色谱法(0％→10％MeOH的DCM溶液，随后20％→70％EtOAc的庚烷溶液)纯化，然后得到32mg(49μmol，2.8％)所需产物116。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.31-8.20(m,4H),7.80-7.74(m,2H),7.59-7.54(m,2H),7.44-7.37(m,2H),7.37-7.29(m,6H),4.61(d,J＝5.4Hz,2H),4.39(t,J＝5.1Hz,2H),4.25(t,J＝5.5Hz,1H),4.02(t,J＝5.0Hz,2H),3.67(t,J＝4.8Hz,2H),3.45(t,J＝5.2Hz,2H)。
实施例10.化合物117的合成
向116(34mg，0.050mmol)在DCM(2mL)中的溶液中加入111(49mg，0.21mmol)和三乙胺(20μL，0.14mmol)。混合物在室温下搅拌过夜。23小时后，将混合物浓缩。通过硅胶柱色谱法(0→40％MeOH的DCM溶液)纯化，得到白色固体状的117，产率为61％(27mg，0.031mmol)。LCMS(ESI+)计算C47H57N5O10 +(M+H+)为851.41，实测值为852.49。
实施例11.化合物118的合成
化合物118在制备117(3.8mg，0.0060mmol)期间得到。LCMS(ESI+)计算C32H47N5O8 +(M+H+)为629.34，实测值为630.54。
实施例12.化合物121的合成
将二亚乙基三胺(119)(73μL，0.67mmol)和三乙胺(283μL，2.03mmol)在THF(6mL)中的溶液冷却至-5℃并置于氮气气氛下。将2-(Boc-氧亚氨基)2-苯基乙腈(120)(334mg，1.35mmol)溶解在THF(4mL)中并缓慢加入冷却的溶液中。2.5小时后，移去冰浴并将混合物在室温下再搅拌2.5小时，并真空浓缩。将残余物重新溶解在DCM(15mL)中并用5％ NaOH水溶液(2×5mL)、盐水(2×5mL)洗涤并用MgSO4干燥。通过硅胶柱色谱法(0→14％MeOH的DCM溶液)纯化，得到无色油状的121，产率为91％(185mg，0.610mmol)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.08(s,2H),3.30-3.12(m,4H),2.74(t,J＝5.9Hz,4H),1.45(s,18H)。
实施例13.化合物123的合成
向121(33.5mg，0.110mmol)在THF(2mL)中的冷却溶液(-10℃)中加入10％ NaHCO3水溶液(500μL)和溶解在THF(1mL)中的9-芴基甲氧基碳酰氯(122)(34mg，0.13mmol)。1小时后，将混合物浓缩并将残余物重新溶解在EtOAc(10mL)中，用盐水(2×5mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。通过硅胶柱色谱法(0→50％MeOH的DCM溶液)纯化得到123，产率为86％(50mg，0.090mmol)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.77(d,J＝7.4Hz,2H),7.57(d,J＝7.4Hz,2H),7.43-7.38(m,2H),7.36-7.31(m,2H),5.57(d,J＝5.2Hz,2H),4.23(t,J＝5.1Hz,1H),3.40-2.83(m,8H),1.41(s,18H)。
实施例14.化合物124的合成
向123(50mg，0.095mmol)在DCM(3mL)中的溶液中加入二噁烷(200μL)中的4M HCl。将混合物搅拌19小时，浓缩并得到白色固体(35mg)。未经纯化，将去保护的中间体和(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(102)(70mg，0.22mmol)溶解在DMF(3mL)中，并加入三乙胺(34μL，0.24mmol)。2小时后，将混合物浓缩并通过硅胶柱色谱法(0→25％MeOH的DCM溶液)纯化残余物，得到124，产率为48％(31mg，0.045mmol)。LCMS(ESI+)计算C41H47N3O6 +(M+H+)为677.35，实测值为678.57。
实施例15.化合物125的合成
向124(10mg，0.014mmol)在DMF(500μL)中的溶液中加入哌啶(20μL)。3.5小时后，将混合物浓缩。通过硅胶柱色谱法(0→20％MeOH的DCM溶液)纯化得到125，产率为58％(3.7mg，0.0080mmol)。LCMS(ESI+)计算C26H37N3O4 +(M+H+)为455.28，实测值为456.41。
实施例16.化合物127和128的合成
向二亚乙基乙二醇(126)(446μL，0.50g，4.71mmol)在DCM(20mL)中的溶液中加入4-硝基苯基氯甲酸酯(115)(1.4g，7.07mmol)和Et3N(3.3mL，2.4g，23.6mmol)。将混合物搅拌、过滤并真空浓缩(在55℃下)。将残余物通过硅胶色谱法(15％→75％EtOAc的庚烷溶液)纯化并分离两种产物。得到白色固体状的产物127(511mg，1.17mmol，25％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.31-8.23(m,4H),7.43-7.34(m,4H),4.54-4.44(m,4H),3.91-3.83(m,4H)。得到无色油状的产物128(321mg,1.18mmol,25％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.32-8.24(m,2H),7.43-7.36(m,2H),4.50-4.44(m,2H),3.86-3.80(m,2H),3.81-3.74(m,2H),3.69-3.64(m,2H)。
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实施例17.化合物131的合成
向118(2.3mg，3.7μmol)在DMF(295μL)中的溶液中加入127(3.2mg，7.4μmol)在DMF(65μL)中的溶液和Et3N(1.6μL，1.1mg，11.1μmol)。将混合物静置17小时并加入HOBt(0.5mg，3.7μmol)在DMF(14μL)中的溶液。4小时后，加入Et3N(5.2μL，3.8mg，37μmol)和vc-PABC-MMAE.TFA(130，13.8mg，11μmol)在DMF(276μL)中的溶液。3天后，将混合物通过RPHPLC(C18，30％→90％MeCN(1％ AcOH)的水(1％ AcOH)溶液)进行纯化。得到所需无色薄膜状的产物131(1.5mg，0.78μmol，21％)。LCMS(ESI+)计算C96H148N15O25 +(M+H+)为1911.08，实测值为1912.08。
实施例18.化合物132的合成
向121(168mg，0.554mmol)在DCM(2mL)中的溶液中加入128(240mg，0.89mmol)在DCM(1mL)中的溶液和Et3N(169mg，233μL)。将混合物搅拌17小时，浓缩并通过硅胶色谱法(EtOAc在庚烷中的梯度)纯化。得到所需淡黄色油状的产物132(85mg，0.20mmol，35％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.24-5.02(m,2H),4.36-4.20(m,3H),3.84-3.67(m,4H),3.65-3.58(m,2H),3.47-3.34(m,4H),3.34-3.18(m,4H),1.44(bs,18H)。
实施例19.化合物134的合成
向132(81mg，0.19mmol)在DCM(3mL)中的溶液中加入二噁烷(700μL)中的4N HCl。将混合物搅拌19小时，浓缩并将残余物溶解在DMF(0.5mL)中。加入Et3N(132μL，96mg，0.95mmol)、DMF(0.5mL)和(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(102)(132mg，0.42mmol)并将所得混合物搅拌2小时。将混合物浓缩并通过硅胶色谱法(0％→3％MeOH的DCM溶液)纯化残余物。得到所需无色薄膜状的产物134(64mg，0.11mmol，57％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)4.31-4.23(m,2H),4.22-4.08(m,4H),3.80-3.68(m,4H),3.66-3.58(m,2H),3.50-3.28(m,8H),2.80-2.65(m,1H),2.40-2.10(m,12H),1.68-1.48(m,4H),1.35(五重峰,J＝8.1Hz,1H),1.02-0.87(m,2H)。LCMS(ESI+)计算C31H46N3O8 +(M+H+)为588.33，实测值为588.43。
实施例20.化合物137的合成
向134(63mg，0.11mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(35)(32.6mg，0.107mmol)和Et3N(32.5mg，45μL，0.32mmol)。2小时后，从主反应混合物中去除77μL，加入vc-PABC-MMAE.TFA(130，10mg，8.1μmol)在DMF(200μL)中的溶液和Et3N(3.4μL，2.5mg，24μmol)。18小时后，加入2,2'-(亚乙基二氧基)双(乙胺)(4.9μL，5.0mg，34μmol)并将混合物静置45分钟。将混合物通过RP HPLC(C18，30％→90％MeCN(1％ ACOH)的水(1％AcOH)溶液)纯化。得到所需无色薄膜状的产物137(8.7mg，5.0μmol，61％)。LCMS(ESI+)计算C90H138N13O21 +(M+H+)为1737.01，实测值为1738.01。
实施例21.化合物139的合成
向134(63mg，0.11mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(35)(32.6mg，0.107mmol)和Et3N(32.5mg，45μL，0.32mmol)。20小时后，从主反应混合物中去除77μL，加入vc-PABC-MMAF.TFA(138，9.6mg，8.2μmol)在DMF(240μL)中的溶液和Et3N(3.4μL，2.5mg，24μmol)。3小时后，加入2,2'-(亚乙基二氧基)双(乙胺)(20μL，20mg，0.14mmol)并将混合物静置20分钟。将混合物通过RP HPLC(C18，30％→90％MeCN(1％ AcOH)的水(1％AcOH)溶液)纯化。得到所需无色薄膜状的产物139(5.3mg，3.2μmol，39％)。LCMS(ESI+)计算C87H130N11O21+(M+H+)为1664.94，实测值为1665.99。
实施例22.化合物141的合成
向(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基N-琥珀酰亚胺碳酸酯(108)(16.35g，56.13mmol)在DCM(400ml)中的溶液中加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇(140)(6.76ml，67.35mmol)和三乙胺(23.47ml，168.39mmol)。将所得淡黄色溶液在室温搅拌90分钟。将混合物真空浓缩并将残余物与乙腈(400mL)共蒸发一次。将所得油状物溶解在EtOAc(400mL)中并用H2O(3×200mL)洗涤。将有机层真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(50％→88％EtOAc的庚烷溶液)纯化，得到浅黄色油状的141(11.2g，39.81mmol，产率为71％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)5.01(br s,1H),4.17(d,2H,J＝12.0Hz),3.79-3.68(m,2H),3.64-3.50(m,4H),3.47-3.30(m,2H),2.36-2.14(m,6H),1.93(br s,1H),1.68-1.49(m,2H),1.37(五重峰,1H,J＝8.0Hz),1.01-0.89(m,2H)。
实施例23.化合物142的合成
向141(663mg，2.36mmol)在DCM(15mL)中的溶液中加入三乙胺(986μL，7.07mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(115)(712mg，3.53mmol)。将混合物搅拌4小时并真空浓缩。通过硅胶柱色谱法(0→20％EtOAc的庚烷溶液)纯化，得到浅黄色油状的142(400mg，0.9mmol，产率为38％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.29(d,J＝9.4Hz,2H),7.40(d,J＝9.3Hz,2H),5.05(br s,1H),4.48-4.41(m,2H),4.16(d,J＝8.0Hz,2H),3.81-3.75(m,2H),3.61(t,J＝5.0Hz,2H),3.42(q,J＝5.4Hz,2H),2.35-2.16(m,6H),1.66-1.50(m,2H),1.35(五重峰,J＝8.6Hz,1H),1.02-0.88(m,2H)。LCMS(ESI+)计算C22H26N2NaO8 +(M+Na+)为469.16，实测值为469.36。
实施例24.化合物143的合成
将142(2.7mg，6.0μmol)在DMF(48μL)中的溶液和Et3N(2.1μL，1.5mg，15μmol)加入到125(2.3mg，5.0μmol)在DMF(0.32mL)中的溶液。将混合物静置4天，用DMF(100μL)稀释并通过RP HPLC(C18，30％→100％ MeCN(1％ AcOH)的水(1％ AcOH)溶液)纯化。得到无色薄膜状的产物143(2.8mg，3.7μmol，74％)。LCMS(ESI+)计算C42H59N4O9 +(M+H+)为763.43，实测值为763.53。
实施例25.化合物145的合成
向128(200mg，0.45mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入三乙胺(41.6μL，0.30mmol)和三(2-氨基乙基)胺144(14.9μL，0.10mmol)。将混合物搅拌150分钟后，将其真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(25％→100％EtOAc的DCM溶液，然后0％→10％MeOH的DCM溶液)纯化，得到黄色油状的145，产率为43％(45.4mg，42.5μmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)5.68-5.18(m,6H),4.32-4.18(m,6H),4.18-4.11(d,J＝7.9Hz,6H),3.74-3.61(m,6H),3.61-3.51(m,6H),3.43-3.29(m,6H),3.29-3.15(m,6H),2.65-2.47(m,6H),2.37-2.16(m,18H),1.69-1.49(m,6H),1.35(五重峰,J＝8.9Hz,3H),1.03-0.87(m,6H)。
实施例26.化合物148的合成
向BCN-OH(101)(3.0g，20mmol)在DCM(300mL)中的溶液中加入CSI(146)(1.74mL，2.83g，20mmol)。将混合物搅拌15分钟后，加入Et3N(5.6mL，4.0g，40mmol)。将混合物搅拌5分钟并加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇(147)(2.2mL，2.3g，22mmol)。将所得混合物搅拌15分钟并加入饱和NH4Cl水溶液(300mL)。分离各层，水相用DCM(200mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)并浓缩。残余物通过硅胶色谱法(0％至10％MeOH的DCM溶液)纯化。浓缩含有所需产物的级分。将残余物溶解在EtOAc(100mL)中并浓缩。得到所需淡黄色油状的产物148(4.24g，11.8mmol，59％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)5.99-5.79(bs,1H),4.29(d,J＝8.3Hz,2H),3.78-3.74(m,2H),3.66-3.56(m,4H),3.37-3.30(m,2H),2.36-2.16(m,6H),1.63-1.49(m,2H),1.40(五重峰,J＝8.7Hz,1H),1.05-0.94(m,2H)。
实施例27.化合物149的合成
向148(3.62g，10.0mmol)在DCM(200mL)中的溶液中加入4-硝基苯基氯甲酸酯(15)(2.02g，10.0mmol)和Et3N(4.2mL，3.04g，30.0mmol)。将混合物搅拌1.5小时并浓缩。将残余物通过硅胶色谱法(20％→70％EtOAc(1％ AcOH)的庚烷(1％ AcOH)溶液)纯化。得到白色泡沫状的产物149(4.07g，7.74mmol，74％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.32-8.26(m,2H),7.45-7.40(m,2H),5.62-5.52(m,1H),4.48-4.42(m,2H),4.28(d,J＝8.2Hz,2H),3.81-3.76(m,2H),3.70-3.65(m,2H),3.38-3.30(m,2H),2.35-2.16(m,6H),1.62-1.46(m,2H),1.38(五重峰,J＝8.7Hz,1H),1.04-0.93(m,2H)。
实施例28.化合物150的合成
向149(200mg，0.38mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入三乙胺(35.4μL，0.24mmol)和三(2-氨基乙基)胺(144)(12.6μL，84.6umol)。将混合物搅拌120分钟并真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(25％→100％EtOAc的DCM溶液，然后0％→10％MeOH的DCM溶液)纯化，得到白色泡沫状的150，产率为36％(40.0mg，30.6μmol)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)6.34-5.72(m,6H),4.34-4.18(m,12H),3.76-3.58(m,12H),3.43-3.30(m,6H),3.30-3.18(m,6H),2.64-2.49(m,6H),2.38-2.14(m,18H),1.65-1.47(m,6H),1.39(五重峰,J＝9.1Hz,3H),1.06-0.90(m,6H)。
实施例29.化合物153的合成
向Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH(151)(31.2mg，75.8μmol)在无水DMF(1mL)中的混合物中加入N,N-二异丙基乙胺(40μL，29mg，0.23mmol)和HATU(30.3mg，79.6μmol)。10分钟后，加入四嗪-PEG3-乙胺(152)(30.3mg，75.8μmol)并将混合物涡旋。2小时后，将混合物通过RPHPLC(C18，30％→90％MeCN(1％ AcOH)的水(1％AcOH)溶液)纯化。得到所需粉红色薄膜状的产物(24.1mg，31.8μmol，42％)。LCMS(ESI+)计算C38H45N8O9 +(M+H+)为757.33，实测值为757.46。
实施例30.化合物154的合成
向153(24.1mg，31.8μmol)在DMF(500μL)中的溶液中加入二乙胺(20μL，14mg，191μmol)。将混合物静置2小时并通过RP HPLC(C18，5％→90％MeCN(1％ AcOH)的水(1％ AcOH)溶液)纯化。得到所需粉红色薄膜状的产物154(17.5mg，32.7μmol，定量)。LCMS(ESI+)计算C23H35N8O7 +(M+H+)为535.26，实测值为535.37。
实施例31.化合物156的合成
将N-[(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基氧基羰基]-1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷(155)(68mg，0.21mmol)在无水DMF(2mL)中的溶液转移到Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH(151)(86mg，0.21mmol)在无水DMF(2mL)中的溶液中。加入DIPEA(100μL，0.630mmol)和HATU(79mg，0.21mmol)。1.5小时后，将混合物浓缩并通过硅胶柱色谱法(0→11％MeOH的DCM溶液)纯化残余物，得到所需化合物156，产率为34％(52mg，0.072mmol)。LCMS(ESI+)计算C35H47N5O9 +(M+H+)为717.34，实测值为718.39。
实施例32.化合物157的合成
将化合物156(21mg，0.029mmol)溶解在DMF(2.4mL)中并加入哌啶(600μL)。20分钟后，将混合物浓缩并通过制备型HPLC纯化残余物，得到所需白色固体状的化合物157(9.3mg，0.018mmol，64％)。LCMS(ESI+)计算C23H37N5O7 +(M+H+)为495.27，实测值为496.56。
实施例33.化合物159的合成
向氨基-PEG11-胺(158)(143mg,0.260mmol)在DCM(5mL)中的溶液中缓慢加入溶解在DCM(5mL)中的(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(102)(41mg，0.13mmol)。1.5小时后，将混合物还原并通过硅胶柱色谱法(0→20％0.7N NH3 MeOH的DCM溶液)纯化残余物，得到所需透明油状的化合物159(62mg，0.086mmol，66％)。LCMS(ESI+)计算C35H46N2O13 +(M+H+)为720.44，实测值为721.56。
实施例34.化合物160的合成
将159(62mg，0.086mmol)在无水DMF(2mL)中的溶液转移到Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH(151)(36mg，0.086mmol)在无水DMF(2mL)中的溶液中。加入DIPEA(43μL，0.25mmol)和HATU(33mg，0.086mmol)。18小时后，将混合物浓缩并通过硅胶柱色谱法(0→20％MeOH的DCM溶液)纯化残余物，得到所需化合物160，产率为62％(60mg，0.054mmol)。LCMS(ESI+)计算C56H83N5O18 +(M+H+)为1113.57，实测值为1114.93。
实施例35.化合物161的合成
将化合物160(36mg，0.032mmol)溶解在DMF(2mL)中并加入哌啶(200μL)。2小时后，将混合物浓缩并通过硅胶柱色谱法(0→40％0.7N NH3 MeOH的DCM溶液)纯化残余物，得到所需黄色油状的化合物161(16.7mg，0.0187mmol，58％)。LCMS(ESI+)计算C41H73N5O16 +(M+H+)为891.51，实测值为892.82。
实施例36.化合物162的合成
向氨基-PEG23-胺(106)(60mg，0.056mmol)在DCM(3mL)中的溶液中缓慢加入溶解在DCM(5mL)中的(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(102)(12mg，0.037mmol)。4小时后，将混合物浓缩并重新溶解在DMF(2mL)中，然后加入Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH(51)(23mg，0.056mmol)、HATU(21mg，0.056mmol)和DIPEA(27μL，0.16mmol)。20小时后，将混合物浓缩并通过硅胶柱色谱法(0→27％MeOH的DCM溶液)纯化残余物，得到93％的所需化合物162(57mg，0.043mmol)。LCMS(ESI+)计算C80H131N5O30 +(M+NH4 +)为1641.89，实测值为1659.92。
实施例37.化合物163的合成
将化合物162(57mg，0.034mmol)溶解在DMF(1mL)中并加入哌啶(120μL)。2小时后，将混合物浓缩，重新溶解于水中，用乙醚(3×10mL)萃取去除Fmoc-哌啶副产物。冷冻干燥后，得到黄色油状的163(46.1mg，0.032mmol，95％)。LCMS(ESI+)计算C65H121N5O28 +(M+H+)为1419.82，实测值为1420.91。
实施例38.化合物165的合成
向(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基(4-硝基苯基)碳酸酯(102)(204mg，0.650mmol)的溶液中加入氨基-PEG12-醇(164)(496mg，0.908mmol)和三乙胺(350μL，2.27mmol)。19小时后，将混合物浓缩并通过硅胶柱色谱法(2→20％MeOH的DCM溶液)纯化残余物，得到透明黄色油状的165(410mg，0.560mmol，87％)。LCMS(ESI+)计算C35H63NO14 +(M+Na+)为721.42，实测值为744.43。
实施例39.化合物166的合成
向165(410mg，0.560mmol)在DCM(6mL)中的溶液中加入4-硝基苯基氯甲酸酯(171，0.848mmol)和三乙胺(260μL，1.89mmol)。18小时后，将混合物浓缩并通过硅胶柱色谱法(0→7％MeOH的DCM溶液)纯化残余物，得到所需透明油状的化合物166(350mg，0.394mmol，70％)。LCMS(ESI+)计算C42H66N2O18 +(M+Na+)为886.43，实测值为909.61。
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实施例40.化合物168的合成
向166(15mg，0.017mmol)在DMF(2mL)中的溶液中加入肽LPETGG(167)(9.7mg，0.017mmol)和三乙胺(7μL，0.05mmol)。46小时后，将混合物浓缩并通过制备型HPLC纯化残余物，得到63％的所需化合物168(14mg，0.010mmol)。LCMS(ESI+)计算C60H101N7O25+(M+H+)为1319.68，实测值为1320.92。
实施例41.合成XL01
向155(9.7mg，0.03mmol)在无水DMF(170μL)中的溶液中加入177(双马来酰亚胺-赖氨酸-PEG4-TFP，Broadpharm)(20mg,0.024mmol)和Et3N(9.9μL，0.071mmol)。在室温下搅拌42小时后，将混合物用DCM(0.4mL)稀释，并通过硅胶快速柱色谱法(0％→18％ MeOH的DCM溶液)纯化，得到透明油状的XL01(10.2mg，0.010mmol，43％)。LCMS(ESI+)计算C49H72N7O16 +(M+H+)为1003.12，实测值为1003.62。
实施例42.双马来酰亚胺叠氮化物XL02的合成
向装有177(32.9mg，39.0μmol，1.0当量)的无水DMF(400μL)的小瓶中加入XL07(9.2mg，42.1μmol，1.08当量)，将溶液混合并在室温下放置约50分钟。然后，加入DiPEA，将所得溶液混合并在室温下放置约2小时。然后，将反应混合物直接通过硅胶色谱法(DCM→14％MeOH的DCM溶液)纯化。得到的所需无色油状的产物XL02(28.9mg，32.2μmol，产率为83％)。LCMS(ESI+)计算C39H62N9O15 +(M+H+)为896.97。实测值为896.52。
实施例43.合成XL03
向装有2,3-双(溴甲基)-6-喹喔啉羧酸178(51.4mg，142.8μmol，1.00当量)的无水DCM(7.5mL)的小瓶中加入DIC(9.0mg，71.4μmol，0.5当量)。将所得混合物在室温下放置30分钟，然后加入XL07(17.7mg，78.5μmol，0.55当量)在无水DCM(0.5mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌约35分钟，然后直接用硅胶色谱法(DCM→10％ MeOH的DCM溶液)纯化，得到白色固体状的纯产物(72mg)。在1.0mL DMF中提取不纯产物，然后用甲苯(2×)共蒸发该溶液的50％。将残留物通过硅胶色谱法(12→30％丙酮的甲苯溶液)纯化。得到所需无色油状的产物XL03(20.1mg，35.9μmol)。LCMS(ESI+)计算C19H25Br2N6O4 +(M+H+)为561.03。实测值为561.12。
实施例44.合成XL05
向178(30mg，0.09mmol)在DCM(0.3mL)中的溶液中加入3-马来酰亚胺丙酸NHS酯(27mg，0.10mmol)和Et3N(38μL，0.27mmol)。在室温下搅拌28小时后，将粗混合物真空浓缩，并通过硅胶快速柱色谱法(0％→15％ MeOH的DCM溶液)纯化，得到透明油状的XL05(27mg，0.056mmol，62％)。LCMS(ESI+)计算C24H34N3O7 +(M+H+)为476.54，实测值为476.46。
实施例45.合成XL06
向装有24(17.2mg，通过1-H-qNMR为88重量％，18.4μmol，1.00当量)的小瓶中加入179在无水DMF(60μL)中的溶液。向所得的无色溶液中加入三乙胺(40.6μL，15.8当量，291μmol)，立即生成黄色溶液。将反应混合物在室温下放置约28小时，然后在真空中浓缩，直至大部分Et3N蒸发。残留物用DCM(1mL)稀释，直接用硅胶色谱法(第1柱：DCM→20％ MeOH的DCM溶液，第2柱：DCM→20％ MeOH的DCM溶液)纯化。得到所需无色油状的产物(XL06)(4.3mg，18.4μmol，产率为26％)。LCMS(ESI+)计算C34H62N7O19S+(M+H+)为904.38。
实测值为904.52。
实施例46. 186的合成
向八乙二醇185在DCM(10mL)中的溶液中加入三乙胺(1.0mL，7.24mmol，2.5当量)，然后在28分钟内逐滴加入4-硝基苯基氯甲酸酯(0.58g，2.90mmol，1当量)在DCM(5mL)中的溶液。将混合物搅拌90分钟后，真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(75％→0％EtOAc的DCM溶液，然后是0％→7％MeOH的DCM溶液)纯化。得到无色油状的产物186，产率为36％(584.6mg，1.09mmol)。LCMS(ESI+)计算C23H38NO13 +(M+H+)为536.23，实测值为536.93。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)8.28(d,J＝12.0Hz,2H),7.40(d,J＝12.0Hz,2H),4.47-4.42(m,2H),3.84-3.79(m,2H),3.75-3.63(m,26H),3.63-3.59(m,2H),2.70-2.55(bs,1H)。
实施例47. 188的合成
向187((BocNH-PEG2)2NH，202mg，0.42mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入部分(0.5mL，0.54mmol，1.3当量)制备的186储备溶液(DCM(1mL)中584mg)，然后加入三乙胺(176μL，1.26mmol，3当量)和HOBt(57mg，0.42mmol，1当量)。将混合物搅拌8天后，真空浓缩。将残余物溶解在乙腈(4.2mL)和0.1N NaOH(aq)(4.2mL，1当量)和额外量固体NaOH(91.5mg)的混合物中。将混合物再搅拌21.5小时后，用DCM(3×40mL)萃取混合物。将合并的有机层真空浓缩并通过硅胶柱色谱法(0％→15％MeOH的DCM溶液)纯化残余物。得到浅黄色油状的产物188，产率为87％(320.4mg，0.37mmol)。LCMS(ESI+)计算C39H78N3O18 +(M+H+)为876.53，实测值为876.54。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)5.15-5.02(bs,2H),4.25-4.19(m,2H),3.76-3.46(m,50H),3.35-3.26(m,4H),2.79-2.69(br.s,1H),1.44(s,18H)。
实施例48. 189的合成
将188(320mg，0.37mmol)溶解在DCM(1mL)中。然后加入二噁烷中的4M HCl(456μL，1.83mmol，5当量)。将混合物搅拌3.5小时后，加入额外的二噁烷中的4M HCl(450μL，1.80mmol，4.9当量)。再将混合物搅拌3.5小时后，加入额外二噁烷中的4M HCl(450μL，1.80mmol，4.9当量)。将混合物搅拌16.5小时后，真空浓缩混合物。以定量产率得到白色粘性固体状的产物189。其直接用于下一步。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm)8.07-7.81(bs,6H),4.15-4.06(m,2H),3.75-3.66(m,2H),3.65-3.48(m,48H),3.03-2.92(m,4H)。
实施例49. 190的合成
向BCN-OH(164mg，1.10mmol，3当量)在DCM(3mL)中的溶液中加入CSI(76μL，0.88mmol，2.4当量)。搅拌15分钟后加入三乙胺(255μL，5.50mmol，5当量)。通过加入DCM(3mL)和三乙胺(508μL，11.0mmol，10当量)制备189的溶液。6分钟后将该储备溶液加入到原始反应混合物中。将混合物搅拌21.5小时后，真空浓缩。通过硅胶柱色谱法(0％→10％MeOH的DCM溶液)纯化残余物。得到浅黄色油状的产物190，产率为39％(165.0mg，139μmol)。LCMS(ESI+)计算C43H72N5O18S2 +(M+H+)为1186.54，实测值为1186.65。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)6.09-5.87(m,2H),4.31-4.19(m,6H),3.76-3.50(m,50H),3.40-3.29(m,4H),2.38-2.16(m,12H),1.66-1.47(m,4H),1.40(五重峰,J＝8.0Hz,2H),1.04-0.94(m,4H)。
实施例50. 191的合成
向190(101mg，0.085mmol)在DCM(2.0mL)中的溶液中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(39mg，0.127mmol)和Et3N(36μL，0.25mmol)。在室温下搅拌42小时后，将粗混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(A.0％→25％ EtOAc的DCM溶液(直到对硝基苯酚被洗脱)，然后为梯度B.0％→12％MeOH的DCM溶液)纯化，得到透明油状的191(49mg，0.036mmol，42％)。LCMS(ESI+)计算C58H91N6O26S2 +(M+H+)为1352.50，实测值为1352.78。
实施例51.XL11的合成
向191(7mg，0.0059mmol)在无水DMF(130μL)中的溶液中加入Et3N(2.2μL，0.015mmol)和TCO-胺盐酸盐(Broadpharm)(1.8mg，0.0068mmol)。在室温下搅拌19小时后，将粗混合物通过硅胶快速柱色谱法(0％→15％MeOH的DCM溶液)纯化，得到透明油状的XL11(1.5mg，0.001mmol，17％)。LCMS(ESI+)计算C64H111N8O25S2 +(M+NH4 +)为1456.73，实测值为1456.81。
实施例52. 194的合成
向可获得的187(638mg，1.33mmol)在DCM(8.0mL)中的溶液中加入128(470mg，1.73mmol)、Et3N(556.0μL，4.0mmol)和1-羟基苯并三唑(179.0mg，1.33mmol)。在环境温度下搅拌41小时后，将混合物真空浓缩并重新溶解在MeCN(10mL)中，然后加入0.1MNaOH水溶液(10mL)和固体NaOH颗粒(100.0mg)。1.5小时后，加入DCM(20mL)并将所需化合物萃取四次。将有机层真空浓缩，残余物通过硅胶快速柱色谱法(0％→12％MeOH的DCM溶液)纯化，得到透明黄色油状的194(733mg，1.19mmol，90％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)4.29-4.23(m,2H),3.77-3.68(m,4H),3.65-3.56(m,14H),3.56-3.49(m,8H),3.37-3.24(m,4H),1.45(s,18H)。LCMS(ESI+)计算C27H54N3O12 +(M+H+)为612.73，实测值为612.55。
实施例53. 195的合成
向194(31.8mg，0.052mmol)在DCM(1.0mL)中的溶液加入二噁烷(0.4mL)中的4.0MHCl。在环境温度下搅拌2.5小时后，将反应混合物真空浓缩并在其间重新溶解在DCM(2mL)中并浓缩。以定量产率得到透明油状的化合物195。LCMS(ESI+)计算C17H38N3O8 +(M+H+)为412.50，实测值为412.45。
实施例54. 196的合成
向195(21.4mg，0.052mmol)在DCM(1.0mL)中的冷却溶液(0℃)中加入Et3N(36μL，0.26mmol)和2-溴乙酰溴(10.5μL，0.12mmol)。在冰上搅拌10分钟后，移除冰浴并加入0.1MNaOH水溶液(0.8mL)。在室温下搅拌20分钟后，用DCM(2×5mL)萃取水层。将有机层合并并真空浓缩。将粗棕色油状物通过硅胶快速柱色谱法(0％→18％MeOH的DCM溶液)纯化，得到透明油状的196(6.9mg，0.011mmol，20％)。LCMS(ESI+)计算C21H40Br2N3O10 +(M+H+)为654.36，实测值为654.29。
实施例55.XL12的合成
向196(6.9mg，0.011mmol)在DCM(0.8mL)中的溶液中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(3.8mg，0.012mmol)和Et3N(5μL，0.03mmol)。在室温下搅拌18小时后，加入溶解在DCM(0.5mL)中的155(BCN-PEG2-NH2，3.3mg，0.01mmol)。再搅拌2小时后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(梯度：A.0％→30％EtOAc的DCM溶液(直到对硝基苯酚被洗脱)，然后为梯度B.0％→20％MeOH的DCM溶液)纯化，得到透明油状的XL12(1.0mg，0.001mmol，9％)。LCMS(ESI+)计算C39H66Br2N5O15 +(M+H+)为1004.77，实测值为1004.51。
实施例56.XL14的合成
向152(甲基四嗪-PEG4-NH2.HCl，7.8mg，0.02mmol)在无水DMF(80μL)中的溶液中加入三乙胺(9μL，0.06mmol)，然后加入338(25mg，0.02mmol)。在室温下搅拌6.5小时后，将反应混合物用DMF(400μL)进一步稀释并通过RP HPLC(柱Xbridge prep C18 5um OBD，30×100mm，5％→90％ MeCN的水溶液(均含1％乙酸)纯化。得到粉红色油状的XL14(12.8mg，0.008mmol，45％)。LCMS(ESI+)计算C69H86N11O21S2 +(M+NH4 +)为1469.61，实测值为1469.69。
实施例57. 314的合成
将3-巯基丙酸(200mg，1.9mmol)的水(6mL)溶液冷却至0℃，然后加入甲硫基磺酸甲酯(263mg，2.1mmol)的乙醇(3mL)溶液。将反应物搅拌过夜并升温至室温。随后，用饱和NaCl(10mL)水溶液和Et2O(20mL)淬灭反应。水层用Et2O(3×20mL)萃取，合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到粗二硫化物产物(266mg，1.7mmol，93％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ7.00(bs,1H),2.96-2.92(m,2H),2.94-2.80(m,2H),2.43(s,3H)。
将源自3-巯基丙酸(266mg，1.7mmol)的粗二硫化物溶解在CH2Cl2(20mL)中，然后加入EDC.HCl(480mg，2.2mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(270mg，2.1mmol)。将反应搅拌90分钟，用水(20mL)淬灭。将有机层用饱和NaHCO3(2×20mL)水溶液洗涤。将有机层用Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到粗314(346mg，1.4mmol，81％)。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ3.12-3.07(m,2H),3.02-2.99(m,2H),2.87(bs,4H),2.44(s,3H)。
实施例58. 316的合成
向315(根据WO2015057063实施例40制备，通过引用纳入本文)(420mg，1.14mmol)在CH2Cl2/DMF(各5mL)中的溶液加入粗314(425mg，1.71mmol)和Et3N(236μL，1.71mmol)。将反应混合物搅拌过夜，然后减压浓缩。经闪速色谱法(1:0-6:4MeCN:MeOH)得到316(358mg，0.7mmol，60％)。1H-NMR(400MHz,CD3OD):δ5.46-5.45(m,1H),5.33-5.27(m,1H),5.15-5.11(m,1H),4.43-4.41(m,1H),4.17-4.06(m,2H),3.97-3.88(m,1H),2.89-2.83(m,2H),2.69-2.53(m,2H),2.32(s,3H),2.04(s,3H),1.91(s,3H),1.86(s,3H)。
实施例59.UDP GalNProSSMe(318)的合成
向UMP.NBu3(632mg，1.12mmol)在DMF(5mL)中的溶液中加入CDI(234mg，1.4mmol)，然后搅拌30分钟。加入甲醇(25μL，0.6mmol)，15分钟后，将反应物置于高真空下15分钟。随后，将316(358mg，0.7mmol)和NMI.HCl(333mg，2.8mmol)溶解在DMF(2mL)中并加入至反应混合物中。搅拌过夜后，将反应混合物在减压下浓缩，得到粗317。
将粗产物317溶解在MeOH:H2O:Et3N(7:3:3，10mL)中并搅拌过夜，然后加入额外的MeOH:H2O:Et3N(7:3:3，5mL)。48小时的总反应时间后，将反应混合物在减压下浓缩。将粗产物通过阴离子交换柱(QHITRAP，3×5mL，1×20mL柱)分两部分纯化。首先用缓冲液A(10mMNaHCO3)上样来实现与柱的结合，然后用50mL缓冲液A冲洗柱。然后，进行70％ B(250mMNaHCO3)的梯度以洗脱UDP GalNProSSMe318(355mg，0.5mmol，72％)。1H-NMR(400MHz,D2O):δ7.86-7.84(m,1H),5.86-5.85(m,1H),5.44(bs,1H),4.26-4.22(m,2H),4.17-4.08(m,6H),3.92(m,1H),3.84-3.83(m,1H),3.66-3.64(m,2H),2.88(t,J＝7.2Hz,2H),2.68(t,J＝7.2Hz,2H),2.31(s,3H)。
实施例60. 319的合成
向化合物121(442mg，1.46mmol)在DCM(1mL)和DMF(200μL)中的溶液中加入化合物128在DCM(1mL)中的溶液和三乙胺(609μL，4.37mmol)。将混合物搅拌16小时后，真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(50％→100％EtOAc的庚烷溶液)纯化，得到319(316mg)。将其进一步通过RP HPLC(柱Xbridge prep C18 5μm OBD，30×100mm，5％→90％MeCN(1％AcOH)的水(1％ AcOH)溶液)纯化。得到无色油状的产物319，产率为17％(110mg，0.25mmol)。LCMS(ESI+)计算C19H37N3NaO8 +(M+Na+)为458.25，实测值为458.33。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)5.41-4.89(m,2H),4.31-4.24(m,2H),3.78-3.68(m,4H),3.65-3.59(m,2H),3.44-3.34(m,4H),3.34-3.19(m,4H),1.43(s,18H)。
实施例61. 320的合成
将化合物319(107mg，0.25mmol)溶解在DCM(1mL)中。然后加入二噁烷中的4M HCl(300μL，1.2mmol，4.8当量)。将混合物搅拌15小时后，将其从沉淀中倾倒出并将沉淀用DCM(2mL)洗涤一次。以定量产率得到白色粘性固体状的产物320(89.9mg，0.29mmol)。其直接用于下一步。
实施例62. 321的合成
向101(75mg，0.50mmol，2当量)在DCM(1mL)中的溶液中加入CSI(41μL，0.48mmol，1.9当量)。搅拌6分钟后，加入三乙胺(139μL，1.0mmol，4当量)。通过加入DMF(200μL)和DCM(2mL)，然后加入三乙胺(139μL，0.75mmol，3当量)来制备320的储备溶液。将部分这种320的储备溶液(32μL，0.25mmol)加入到含有CSI的原始反应混合物中。将混合物搅拌16小时后，真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(0％→10％MeOH的DCM溶液)纯化。得到无色油状的产物321，产率为3％(11mg，14.2μmol)。LCMS(ESI+)计算C31H48N5O12S2 +(M+H+)为746.27，实测值为746.96。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)6.36-5.94(m,2H),4.38-4.17(m,6H),3.84-3.79(m,2H),3.77-3.72(m,2H),3.68-3.63(m,2H),3.54-3.45(m,4H),3.39-3.27(m,4H),2.38-2.16(m,12H),1.67-1.47(m,5H),1.40(五重峰,J＝8.0Hz,2H),1.05-0.93(m,4H)。
实施例63. 301(LD01)的合成
向321(10.6mg，14.2μmol)在DCM(100μL)中的溶液中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(4.3mg，14.2μmol，1.0当量)和三乙胺(5.9μL，42.6μmol，3.0当量)。搅拌66小时后，用vc-PABC-MMAE.TFA在DMF中的储备溶液(200μL，50mg/mL)和额外量的三乙胺(5.9μL，42.6μmol，3.0当量)处理该混合物的一部分。24小时后，部分真空浓缩。将残余物通过RP HPLC(柱Xbridge prep C18 5μm OBD，30×100mm，5％→90％MeCN(1％ AcOH)的水(1％ AcOH)溶液)纯化。得到薄膜状的化合物301，产率为28％(3.4mg，1.9μmol)。LCMS(ESI+)计算C90H140N15O25S2 +(M+H+)为1894.96，实测值为1895.00。
实施例64. 322的合成
向185(八乙二醇)在DCM(10mL)中的溶液中加入三乙胺(1.0mL，7.24mmol；2.5当量)，然后在28分钟内逐滴加入4-硝基苯基氯甲酸酯(0.58g；2.90mmol；1当量)在DCM(5mL)中的溶液。将混合物搅拌90分钟后，真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(75％→0％EtOAc的DCM溶液，然后为0％→7％MeOH的DCM溶液)纯化。得到无色油状的产物322，产率为38％(584.6mg；1.09mmol)。LCMS(ESI+)计算C23H38NO13 +(M+H+)为536.23，实测值为536.93。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)8.28(d,J＝12.0Hz,2H),7.40(d,J＝12.0Hz,2H),4.47-4.42(m,2H),3.84-3.79(m,2H),3.75-3.63(m,26H),3.63-3.59(m,2H),2.70-2.55(br.s,1H)。
实施例65. 323的合成
向化合物121(127mg，0.42mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入部分(0.5mL；0.54mmol，1.3当量)制备的322的储备溶液(DCM(1mL)中584mg)，然后加入三乙胺(176μL，1.26mmol；3当量)和HOBt(57mg；0.42mmol；1当量)。将混合物搅拌4.5天后，真空浓缩。将残余物溶解在乙腈(4.2mL)和0.1N NaOH(4.2mL，1当量)的混合物中。将混合物搅拌24小时后，加入额外的固体NaOH(104.5mg)。将混合物再搅拌5小时后，混合物用DCM(2×10mL)萃取。将合并的有机层真空浓缩并将残余物通过硅胶柱色谱法(0％→15％MeOH的DCM溶液)纯化。得到浅黄色油状的产物323，产率为54％(164.5mg，0.23mmol)。LCMS(ESI+)计算C26H54N3O12 +(M-BOC+)为600.36，实测值为600.49。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)5.27-5.05(m,2H),4.26-4.21(m,2H),3.76-3.59(m,30H),3.43-3.33(m,4H),3.33-3.22(m,4H),1.43(s,18H)。
实施例66. 324的合成
将化合物323(164mg，0.23mmol)溶解在DCM(1mL)中。然后加入二噁烷中的4M HCl(293μL，1.17mmol，5当量)。将混合物搅拌18小时后，加入额外的二噁烷(293μL，1.17mmol，5当量)中的4M HCl溶液。将混合物再搅拌5小时后，将混合物真空浓缩。以定量产率得到白色粘性固体状的产物324(132mg，0.23mmol)。其直接用于下一步。
实施例67. 325的合成
向101(81mg，0.54mmol，2.3当量)在DCM(2mL)中的溶液中加入CSI(43μL，0.49mmol，2.1当量)。在搅拌15分钟后加入三乙胺(164μL，1.17mmol，5当量)。通过加入DCM(2mL)和三乙胺(164μL，1.17mmol，5当量)制备324的溶液。在6分钟后将该储备溶液加入到原始反应混合物中。将混合物搅拌23小时后，真空浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法(0％→12％MeOH的DCM溶液)纯化。得到浅黄色油状的产物325，产率为31％(73.0mg，72.2μmol)。LCMS(ESI+)计算C43H72N5O18S2 +(M+H+)为1010.43，实测值为1010.50。
1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ(ppm)6.21-5.85(m,2H),4.38-4.17(m,6H),3.80-3.57(m,30H),3.57-3.44(m,4H),3.44-3.30(m,4H),2.38-2.16(m,12H),1.64-1.48(m,4H),1.40(五重峰,J＝8.0Hz,2H),1.05-0.91(m,4H)。
实施例68. 302(LD02)的合成
向325(19.5mg，19.7μmol)在DCM(100μL)中的溶液中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(6.0mg，19.7μmol，1.0当量)和三乙胺(8.2μL，59.1μmol，3.0当量)。搅拌66小时后，用vc-PABC-MMAE.TFA在DMF中的储备溶液(200μL，50mg/mL)和额外量的三乙胺(8.2μL，59.1μmol，3.0当量)处理该混合物的一部分。95小时后，部分真空浓缩。将残余物通过RP HPLC(柱Xbridge prep C18 5μm OBD，30×100mm，5％→90％MeCN(1％ AcOH)的水(1％ AcOH)溶液)纯化。得到薄膜状的化合物302，产率为9％(3.7mg，1.71μmol)。LCMS(ESI+)计算C102H165N15O31S2 2+(M+2H+)为1080.56，实测值为1080.74。
实施例69. 329的合成
向101(18mg，0.12mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入氯磺酰基异氰酸酯(CSI)。30分钟后，加入Et3N(37μL，27mg，0.27mmol)。向195(26mg，0.054mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入Et3N(37μL，27mg，0.27mmol)。将该混合物加入到反应混合物中。45分钟后，将反应混合物浓缩并通过硅胶色谱法(DCM至7％MeOH的DCM溶液)纯化残余物。得到无色薄膜状的产物329(27mg，0.029mmol，54％)。LCMS(ESI+)计算C39H64N5O16S2 +(M+H+)为922.38，实测值为922.50。
实施例70. 330的合成
向329在DCM(1mL)中的溶液中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(8.9mg，29.3μmol)和Et3N(12.2μL，8.9mg，87.9μmol)。1天后，0.28mL用于制备化合物303。2天后，将额外的双(4-硝基苯基)碳酸酯(7.0mg，23μmol)加入到主反应混合物中。1天后，将反应混合物浓缩并通过硅胶柱色谱法纯化残余物。得到无色薄膜状的产物330(17.5mg，0.016mmol，55％(76％校正))。LCMS(ESI+)计算C46H67N6O20S2 2+(M+H+)为1087.38，实测值为1087.47。
实施例71. 303(LD03)的合成
向330的反应混合物(0.28mL，理论上含有8.8mg，8.1μmol)中加入Et3N(3.4μL，2.5mg，24.3μmol)和vc-PABC-MMAE.TFA(10mg，8.1μmol)在DMF(200μL)中的溶液。21小时后，加入2,2′-(乙烯二氧)双(乙胺)(4.7μL，4.8mg，32μmol)。45分钟后，反应混合物在氮气流下浓缩。将残余物通过RP-HPLC(柱Xbridge prep C18 5μm OBD，30×100mm，30％至90％ MeCN(1％ AcOH)的水(1％ AcOH)溶液)纯化。得到无色薄膜状的产物303(5.6mg，2.7μmol)。LCMS(ESI+)计算C98H157N15O29S2 2+((M+2H+)/2)为1036.53，实测值为1036.70。
实施例72. 332的合成
向Alloc2-va-PABC-PBD 331(10.0mg，0.009mmol)在脱气DCM(400μL，通过DCM吹扫N2 5分钟得到)中的溶液中加入吡咯烷(1.9μL，0.027mmol)和Pd(PPh3)4(1.6mg，0.0014mmol)。在环境温度下搅拌15分钟后，将反应混合物用DCM(10mL)稀释并加入饱和NH4Cl水溶液(10mL)。将粗混合物用DCM(3×10mL)萃取。合并有机层，用Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。将黄色残余物重新溶解在DMF(450μL)和MeCN(450μL)中，并通过RP HPLC(柱Xbridge prep C18 5μmOBD，30×100mm，5％→90％MeCN的H2O(均含有0.1％甲酸)溶液)纯化。通过SPE柱(PL-HCO3 MP，500mg/6mL)中和纯组分，浓缩并与MeCN(2×5mL)共蒸发，得到白色固体状的332(4.8mg，0.005mmol，58％)。LCMS(ESI+)计算C49H60N7O11 +(M+H+)为923.04，实测值为923.61。
实施例73. 304(LD04)的合成
向332(4.8mg，0.005mmol)在无水脱气DMF(60μL，通过DMF吹扫N2 5分钟得到)中的溶液中加入330(10mg，0.009mmol，溶于48μL无水脱气DMF)、Et3N(3.6μL，0.026mmol)和HOBt(无水脱气DMF储备溶液，5.1μL，0.35mg，0.0026mmol，0.5当量)。在环境温度下在黑暗中搅拌41小时后，将粗反应混合物用DCM(300μL)稀释并通过硅胶快速柱色谱法(0％→12％MeOH的DCM溶液)纯化，得到透明黄色油状的304(4.0mg，0.0021mmol，41％)。LCMS(ESI+)计算C89H121N12O28S2 +(M+H+)为1871.11，实测值为1871.09。
实施例74. 305(LD05)的合成
向333(2.9mg，0.0013mmol)(根据W2019110725A1，实施例5-5制备，通过引用纳入本文)在无水DMF(60μL)中的溶液中加入330(1.45mg，0.0013mmol)和Et3N(1.2μL，0.023mmol)。在室温下搅拌48小时后，将反应混合物用DMF(500μL)稀释并通过RP HPLC(柱Xbridge prep C18 5μm OBD，30×100mm，30％→100％ MeCN的H2O(均含有1％乙酸)溶液)纯化。得到无色薄膜状的产物305(0.6mg，0.207μmol，16％)。LCMS(ESI+)计算C124H182IN14O46S5 +(M/2+H+)为1447.03，实测值为1447.19。
实施例75. 306(LD06)的合成
向330(7mg，0.006mmol)在无水DMF(150μL)中的溶液中加入vcPABC-DMEA-PNU(334)在无水DMF(125μL，5.7mg，0.005mmol)中的储备溶液和Et3N(2μL，0.015mmol)中。在室温下搅拌25小时后，将反应混合物用DCM(0.3mL)稀释并通过硅胶快速柱色谱法(0％→20％MeOH的DCM溶液)纯化，得到红色薄膜状的306(5mg，0.0024mmol，47％)。LCMS(ESI+)计算C96H133N13O36S3 +(M/2+H+)为1055.64，实测值为1055.50。
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实施例76. 337的合成
将化合物336(DIBO，95mg，0.43mmol)溶解在DCM(1.0mL)中，在室温下加入异氰酸氯磺酰酯(33.0μL，0.37mmol)，2分钟后形成不溶物。在室温下再搅拌15分钟后，加入Et3N(120.0μL，0.85mmol)，所有不溶物消失，并加入溶解在DCM(1.0mL)和Et3N(120.0μL，0.85mmol)中的195(71mg，0.0171)。在室温下搅拌16小时后，将粗混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0％→15％MeOH的DCM溶液)纯化，然后与EtOAc(2×)共蒸发以完全去除MeOH。得到蜡状白色固体状的产物337(136.0mg，0.12mmol，75％)。LCMS(ESI+)计算C51H63N6O16S2 +(M+NH4 +)为1080.21，实测值为1080.59。
实施例77. 338的合成
向337(136.0mg，0.12mmol)在DCM(2.0mL)中的溶液中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(47.0mg，0.15mmol)和Et3N(54.0μL，0.38mmol)。在室温下搅拌18小时后，将粗混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(梯度：A.0％→35％EtOAc的DCM溶液(直到对硝基苯酚被洗脱)，然后为梯度B.0％→13％ MeOH的DCM溶液)纯化，得到淡黄色油状的338(89.0mg，0.07mmol，60％)。LCMS(ESI+)计算C48H66N7O20S2 +(M+NH4 +)为1245.31，实测值为1245.64。
实施例78. 307(LD07)的合成
向338(6.95mg，0.005mmol)在无水DMF(93.0μL)中的溶液中加入Et3N(2.4μL，0.017mmol)和vc-PABC-MMAE.TFA(Levena Bioscience)在无水DMF(70μL，7.0mg，0.005mmol)中的储备溶液。在室温下搅拌18小时后，加入DMF(450μL)，将粗混合物通过RPHPLC(柱Xbridge prep C18 5μm OBD，30×100mm，30％→100％MeCN的H2O(均含有1％乙酸)溶液)纯化。得到无色薄膜状的产物307(4.5mg，0.002mmol，36％)。LCMS(ESI+)计算C110H152N15O29S2 +(M/2+H+)为1106.30，实测值为1106.79。
实施例79. 341的合成
将化合物101(16.3mg，0.10mmol)溶解在DCM(0.8mL)中并在室温下加入氯磺酰基异氰酸酯(8.6μL，0.099mmol)。在室温下搅拌15分钟后，加入Et3N(69.0μL，0.49mmol)，然后加入溶解在DCM(1.0mL)和Et3N(69.0μL，0.49mmol)中的335(40mg，0.099mmol)。将该混合物在室温下搅拌1.5小时(混合物1)，得到粗产物339。在另一个小瓶中，将340(DBCO-C2-OH，Broadpharm)(34.0mg，0.099mmol)在室温下溶解在DCM(0.8mL)中，并加入氯磺酰基异氰酸酯(7.75μL，0.089mmol)。在室温下搅拌15分钟后，加入Et3N(69.0μL，0.49mmol)，然后加入粗品339。在室温下再搅拌2小时后，将反应混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0％→15％MeOH的DCM溶液)纯化，然后与EtOAC(2×)共蒸发以完全去除MeOH。得到透明黄色油状的产物341(20.0mg，0.017mmol，17％)。LCMS(ESI+)计算C50H70N7O18S2 +(M+H+)为1121.26，实测值为1121.59。
实施例80. 342的合成
向341(20.0mg，0.17mmol)在DCM(1.0mL)中的溶液中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(5.6mg，0.019mmol)和Et3N(7.5μL，0.053mmol)。在室温下搅拌40小时，将粗混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(梯度A.0％→30％EtOAc的DCM溶液(直到对硝基苯酚被洗脱)，然后为梯度B.0％→20％MeOH的DCM溶液)纯化，得到透明淡黄色油状的342(6.9mg，0.005mmol，30％)。LCMS(ESI+)计算C57H73N8O22S2 +(M+H+)为1286.36，实测值为1286.57。
实施例81. 308(LD08)的合成
向342(3.6mg，0.0028mmol)在无水DMF(35.0μL)中的溶液中加入Et3N(1.2μL，0.008mmol)和vc-PABC-MMAE.TFA(Levena Bioscience)在无水DMF(34μL，3.4mg，0.0028mmol)中的储备溶液。在室温下搅拌27小时后，加入DCM(400μL)，粗混合物通过硅胶快速柱色谱法(0％→30％MeOH的DCM溶液)纯化，得到无色薄膜状的308(3.7mg，0.0016mmol，58％)。LCMS(ESI+)计算C109H161N17O31S2 +(M/2+H+)为1135.84，实测值为1135.73。
实施例82. 309(LD09)的合成
向vc-PABC-MMAE.TFA(Levena Bioscience)在无水DMF(91μL，9.1mg，0.0073mmol)中的储备溶液中加入Et3N(5.1μL，0.037mmol)和343(双马来酰亚胺-赖氨酸-PEG4-TFP，Broadpharm)(6.2mg，0.0073mmol)。在室温下搅拌3小时后，将混合物用DCM(0.4mL)稀释并通过硅胶快速柱色谱法(0％→30％ MeOH的DCM溶液)纯化，得到透明油状的309(9.1mg，0.0051mmol，69％)。LCMS(ESI+)计算C89H138N15O24 +(M+H+)为1802.13，实测值为1802.11。
实施例83. 310(LD10)的合成
向装有344(4.3mg，6.0μmol，1.7当量)的Eppendorf小瓶中加入DMF(4.00mg，100μL，34.31毫摩尔，3.43μmol，1.0当量)中的vc-PABC-MMAF.TFA盐，然后加入三乙胺(1.43μL，10.3μmol，3.0当量)。混合混合物并将所得无色溶液在室温下放置约3小时。然后将反应混合物直接通过RP HPLC(柱Xbridge prep C18 5μm OBD，30×100mm，30％→90％MeCN(1％AcOH)的水(1％ AcOH)溶液)纯化。得到所需无色残渣状的产物310(4.5mg，2.7μmol，产率为79％)。LCMS(ESI+)计算C80H134N15O22 +(M+H+)为1656.98，实测值为1657.03。
实施例84. 346的合成
向装有102(54.7mg，1.00当量，173μmol)和345(三甘氨酸，28.8mg，0.878当量，152μmol)的Eppendorf小瓶中加入无水DMF(250μL)和三乙胺(52.7mg，72.5μL，3当量，520μmol)。将得到的黄色悬浮液在室温下搅拌21小时，然后将50μL H2O加入到RM中。将反应混合物在室温下再搅拌一天，然后加入额外的H2O(200μL)并将反应混合物在室温下再搅拌3天。接下来，加入MeCN(大约0.5mL)和额外的Et3N(约10滴)，并将所得悬浮液在室温下搅拌1小时，然后真空浓缩。将黄色残余物溶解在DMF(600μL)中并将所得黄色悬浮液通过膜过滤器过滤。用200μL额外的DMF洗涤膜过滤器，合并的滤液直接通过RP HPLC(柱Xbridge prepC18 5μm OBD，30×100mm，30％→90％MeCN(1％AcOH)的水(1％AcOH)溶液)纯化。得到所需棕色油状的产物346(41.5mg，114μmol，产率为66％)。LCMS(ESI+)计算C43H24N3O3 +(M+H+)为366.17，实测值为366.27。
实施例85. 347的合成
向346(21.6mg，0.056mmol)在无水DMF(0.3mL)中的溶液中加入DIPEA(30μL，0.171mmol)和HATU(21.6mg，0.056mmol)。在室温下搅拌10分钟后，加入溶解在DCM(310μL)中的320(7.37mg，0.031mmol)。在室温下搅拌24小时后，将混合物通过RP HPLC(柱Xbridgeprep C18 5μm OBD，30×100mm，30％→100％MeCN的H2O(均含有1％ AcOH)溶液)纯化。得到灰白色油状的产物347(5.2mg，0.005mmol，20％)。LCMS(ESI+)计算C43H64N9O14 +(M+H+)为931.02，实测值为931.68。
实施例86. 311(LD13)的合成
向347(5.2mg，0.0056mmol)在无水DMF(200μL)中的溶液中加入双(4-硝基苯基)碳酸酯(1.9mg，0.006mmol)和Et3N(2.4μL，0.016mmol)。在室温下搅拌27小时后，加入vc-PABC-MMAE.TFA(Levena Bioscience)(66μL，6.6mg，0.0053mmol)和Et3N(2μL，0.014mmol)的储备溶液。在室温下再搅拌17小时后，将粗混合物用DMF(250μL)稀释并通过RP HPLC(柱Xbridge prep C18 5μm OBD，30×100mm，5％rep C18 5％→90％MeCN的的H2O(均含有1％AcOH)溶液)纯化。得到透明油状的产物311(0.6mg，0.28μmol，5％)。LCMS(ESI+)计算C102H156N19O27 +(M/2+H+)为1040.71，实测值为1040.85。
实施例87.化合物312的合成
化合物312(LD11)根据Verkade等人,Antibodies 2018,7,doi:10.3390/antib7010012(通过引用纳入本文)记载的方法制备。
实施例88. 313(LD311)的合成
向装有348(2.7mg，1.1当量，4.9μmol)的小瓶中加入DMF(60μL)和纯三乙胺(1.9μL，3当量，13μmol)。接下来，加入HBTU在无水DMF(2.0mg，11μL，472毫摩尔，1.2当量，5.3μmol)中的溶液并将混合物混合。将反应混合物在室温下放置30分钟，然后加入va-PABC-MMAF.TFA盐(5.2mg，0.13mL，34.31mmol，1当量，4.4μmol)。将所得混合物混合并在室温下放置110分钟，然后直接通过RP HPLC(柱Xbridge prep C18 5μm OBD，30×100mm，30％→90％MeCN(1％AcOH)的水(1％AcOH)溶液)纯化。得到所需无色油状的产物313(1.8mg，1.1μmol，产率为26％)。LCMS(ESI+)计算C77H127N12O23 +(M+H+)为1587.91，实测值为1588.05。
实施例89. 350的合成
向甲基四嗪-NHS酯349(19mg，0.057mmol)在DCM(400μL)中的溶液中加入溶解在DCM(800μL)中的氨基-PEG11-胺(47mg，0.086mmol)。在室温下搅拌20分钟后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0→50％MeOH(0.7M NH3)的DCM溶液)纯化，得到所需粉红色油状的化合物350(17mg，0.022mmol，39％)。LCMS(ESI+)计算C35H61N6O12 +(M+H+)为757.89，实测值为757.46。
实施例90. 351的合成
向151(Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH，10mg，0.022mmol)在无水DMF(500μL)中的搅拌溶液中加入DIPEA(11μL，0.067mmol)和HATU(8.5mg，0.022mmol)。10分钟后，加入溶解在无水DMF(500μL)中的350(17mg，0.022mmol)。在室温下搅拌18.5小时后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0→17％ MeOH的DCM溶液)纯化，得到所需粉红色油状的化合物351(26mg，0 022mmol，定量)。LCMS(ESI+)计算C56H83N10O17 +(M+NH4 +)为1168.32，实测值为1168.67。
实施例91. 169的合成
向351(26mg，0.022mmol)在无水DMF(500μL)中的溶液中加入二乙胺(12μL，0.11mmol)。在室温下搅拌1.5小时后，将粗混合物通过RP HPLC(柱Xbridge prep C18 5μmOBD，30×100mm，5％→90％MeCN的H2O(均含有1％乙酸)溶液)纯化。得到透明粉红色油状的产物169(10.9mg，0.011mmol，53％)。LCMS(ESI+)计算C41H70N9O15 +(M+H+)为929.05，实测值为929.61。
实施例92. 352的合成
向349(甲基四嗪-NHS酯，10.3mg，0.031mmol)在DCM(200μL)中的溶液中加入溶解在DCM(200μL)中的氨基-PEG23-胺(50mg，0.046mmol)。在室温下搅拌50分钟后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0→60％MeOH(0.7M NH3)的DCM溶液)纯化，得到所需粉红色油状的化合物352(17.7mg，0.013mmol，44％)。LCMS(ESI+)计算C59H109N6O24 +(M+H+)为1286.52，实测值为1286.72。
实施例93. 353的合成
向151(5.7mg，0.013mmol)在无水DMF(500μL)中的搅拌溶液中加入DIPEA(7μL，0.04mmol)和HATU(5.3mg，0.013mmol)。10分钟后，加入溶解在无水DMF(500μL)中的352(17.7mg，0.013mmol)。在室温下搅拌6小时，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0→18％MeOH的DCM溶液)纯化，得到所需粉红色油状的化合物353(21mg，0.012mmol，91％)。LCMS(ESI+)计算C80H131N10O29 +(M/2+NH4 +)为857.45，实测值为857.08。
实施例94. 170的合成
向353(21mg，0.012mmol)在无水DMF(500μL)中的溶液中加入二乙胺(6.7μL，0.06mmol)。在室温下搅拌4小时后，将粗混合物通过RP HPLC(柱Xbridge prep C18 5μmOBD，30×100mm，5％→90％MeCN的H2O(均含有1％乙酸)溶液)纯化。得到粉红色油状的产物170(11.6mg，0.008mmol，66％)。LCMS(ESI+)计算C65H118N9O27 +(M+H+)为1457.68，实测值为1457.92。
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实施例95. 356的合成
向354(四氟苯基叠氮-NHS酯，40mg，0.12mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入355(Boc-NH-PEG2-NH2，33mg，0.13mmol)和Et3N(50μL，0.36mmol)。在室温下在黑暗中搅拌30分钟后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0→7％MeOH的DCM溶液)纯化，得到所需透明油状的化合物356(47mg，0.10mmol，84％)。LCMS(ESI+)计算C18H24F4N5O5 +(M+H+)为466.41，实测值为466.23。
实施例96. 357的合成
向356(47mg，0.10mmol)在DCM(2mL)中的溶液中加入二噁烷(300μL)中的4.0M HCl溶液。在室温下在黑暗中搅拌17.5小时后，将混合物浓缩并以定量产率获得白色固体状的357(36mg，0.10mmol)。LCMS(ESI+)计算C13H16F4N5O3 +(M+H+)为366.29，实测值为366.20。
实施例97. 358的合成
向151(Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH，42mg，0.10mmol)在无水DMF(600μL)中的搅拌溶液中加入DIPEA(50μL，0.30mmol)和HATU(39mg，0.10mmol)。在黑暗中15分钟后，加入溶解在无水DMF(500μL)中的357(36mg，0.10mmol)。在室温下在黑暗中搅拌41小时后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0→20％MeOH的DCM溶液)纯化，得到所需透明油状的化合物358(36mg，0.047mmol，47％)。LCMS(ESI+)计算C34H35F4N8O8 +(M+H+)为759.68，实测值为759.38。
实施例98. 171的合成
向358(36mg，0 047mmol)在无水DMF(750μL)中的溶液中加入二乙胺(24μL，0.24mmol)。在室温下在黑暗中搅拌55分钟后，将粗混合物通过RP HPLC(柱Xbridge prepC18 5pm OBD，30×100mm，5％→90％MeCN的H2O(均含有1％乙酸)溶液)纯化。得到透明油状的产物171(18.7mg，0.034mmol，74％)。LCMS(ESI+)计算C19H25F4N8O6 +(M+H+)为537.45，实测值为537.29。
实施例99.BCN-LPETGG(172)的合成
向102(10mg，0.031mmol)在无水DMF(500μL)中的溶液中加入肽167(H-LPETGG-OH，18mg，0.031mmol)和Et3N(13μL，0.095mmol)。在室温下搅拌93小时后，将粗混合物通过RPHPLC(柱Xbridge prep C18 5μm OBD，30×100mm，5％→90％ MeCN的H2O(均含1％乙酸)溶液)纯化。得到透明油状的产物172(16.8mg，0.022mmol，72％)。LCMS(ESI+)计算C35H53N6O12 +(M+H+)为749.83，实测值为749.39。
实施例100. 359的合成
向102(56mg，0.17mmol)在DCM(8mL)中的溶液中加入氨基-PEG24-醇(214mg，0.199mmol)和Et3N(80μL，0.53mmol)。在室温下搅拌20小时后，将溶剂真空浓缩，残余物通过快速硅胶柱色谱法(2→30％MeOH的DCM溶液)纯化，得到所需黄色油状的化合物359，产率为95％(210mg，0.168mmol)。LCMS(ESI+)计算C59H111NO26Na+(M+Na+)为1273.50，实测值为1273.07。
实施例101. 360的合成
向359(170mg，0.136mmol)和4-硝基苯基氯甲酸酯(44mg，0.22mmol)在DCM(7mL)中的溶液中加入Et3N(63μL，0.40mmol)。在室温下搅拌41小时后，将溶剂还原并通过快速硅胶柱色谱法(0→10％MeOH的DCM溶液)纯化残余物，得到所需透明油状的化合物360，产率为67％(129mg，0.091mmol)。LCMS(ESI+)计算C66H114N2O30Na+(M+Na+)为1438.59，实测值为1438.13。
实施例102. 173的合成
向360(16mg，0.011mmol)在无水DMF(800μL)中的溶液中加入167(肽H-LPETGG-OH，6.5mg，0.011mmol)和Et3N(5μL，0.04mmol)。在室温下搅拌95小时后，将粗混合物通过RPHPLC(柱Xbndge prep C18 5μm OBD，30×100mm，5％→90％MeCN的H2O(均含有1％乙酸)溶液)纯化。得到透明油状的产物173(12.6mg，0.0068mmol，62％)。LCMS(ESI+)计算C84H153N8O37 +(M/2+NH4 +)为942.55，实测值为924.26。
实施例103. 174的合成
向361(甲基四嗪-PEGs-NHS酯，6.1mg，0.011mmol)在无水DMF(230μL)中的溶液中加入肽H-LPETGG-OH(6.5mg，0.011mmol)和Et3N(4μL，0.028mmol)。在室温下搅拌22小时后，将粗混合物通过RP HPLC(柱Xbridge prep C18 5μm OBD，30×100mm，5％→90％MeCN的H2O(均含有1％乙酸)溶液)纯化。得到透明粉红色油状的产物174(9.9mg，0.01mmol，91％)。LCMS(ESI+)计算C44H70N11O16 +(M+NH4+)为1009.09，实测值为1009.61。
实施例104. 362的合成
向354(31mg，0.093mmol)在DCM(1mL)中的溶液中加入181(56mg，0.10mmol)和Et3N(40μL，0.28mmol)。在室温下在黑暗中搅拌25分钟后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0→15％MeOH的DCM溶液)纯化，得到所需透明油状的化合物362(55mg，0.072mmol，77％)。LCMS(ESI+)计算C31H51F4N4O13 +(M+H+)为763.75，实测值为763.08。
实施例105. 363的合成
向362(55mg，0.072mmol)在DCM(2mL)中的溶液中加入4-硝基苯基氯甲酸酯(13mg，0.064mmol)和Et3N(30μL，0.21mmol)。在室温下在黑暗中搅拌21小时后，将混合物真空浓缩并通过RP HPLC(柱Xbridge prep C18 5μm OBD，30×100mm，5％→90％MeCN(1％AcOH)的水(1％AcOH)溶液)纯化。得到黄色油状的产物363(13.3mg，0.014mmol，20％)。LCMS(ESI+)计算C38H54F4N5O17 +(M+H+)为928.85，实测值为928.57。
实施例106. 175的合成
向363(13.3mg，0.014mmol)在无水DMF(300μL)中的溶液中加入167(肽H-LPETGG-OH，8.2mg，0.014mmol)和Et3N(8μL，0.043mmol)。在黑暗中26小时后，将粗混合物通过RPHPLC(柱Xbridge prep C18 5μm OBD，30×100mm，5％→90％MeCN的H2O(均含有1％乙酸)溶液)纯化。得到透明油状的产物175(11.4mg，0.0084mmol，59％)。LCMS(ESI+)计算C56H89F4N10O24 +(M+H+)为1362.35，实测值为1362.81。
实施例107. 365的合成
向151(Fmoc-Gly-Gly-Gly-OH，20mg，0.049mmol)在无水DMF(350μL)中的搅拌溶液中加入DIPEA(25μL，0.15mmol)和HATU(18mg，0.049mmol)。10分钟后，加入溶于无水的化合物364(N-Boc-乙二胺，7.8mg，0.049mmol)。在室温下搅拌45分钟后，将混合物真空浓缩并通过硅胶快速柱色谱法(0→30％MeOH的DCM溶液)纯化，得到所需透明油状的化合物365(12.4mg，0.022mmol，46％)。LCMS(ESI+)计算C28H36N5O7 +(M+H+)为554.61，实测值为554.46。
实施例108. 366的合成
向365(12.4mg，0.022mmol)在DCM(0.7mL)中的搅拌溶液中加入二噁烷(400μL)中的4.0M HCl。在室温下搅拌1小时后，将混合物浓缩，得到白色固体状的366(11mg，0.022mmol，定量)。LCMS(ESI+)计算C23H28N5O7 +(M+H+)为545.50，实测值为454.33。
实施例109. 176的合成
向191(8mg，0.0059mmol)在无水DMF(300μL)中的溶液中加入Et3N(2.5μL，0.017mmol)和366在无水DMF(110μL，3.0mg，0.0059mmol)中的储备溶液。在室温下搅拌18小时后，加入二乙胺(2μL)。再过2小时后，将混合物通过RP HPLC(柱Xbridge prep C18 5μmOBD，30×100mm，5％→90％MeCN的H2O(均含有1％乙酸)溶液)纯化。得到透明油状的产物176(1.3mg，0.0009mmol，15％)。LCMS(ESI+)计算C60H103N10O26S2 +(M+H+)为1444.64，实测值为1444.75。
表达细胞因子和scFv’s
实施例110.人源化OKT3 200
从Absolute Antibody Ltd(Oxford，United Kingdom)获得具有C端分选酶A识别序列(C端标签由SEQ ID NO:1表示)的人源化OKT3(hOKT3)。质谱分析示出一种主产物(观测质量28836Da)。
实施例111.抗-4-1BB PF31
抗-4-1BB scFv设计为具有C端分选酶A识别序列，之后是His标签(氨基酸序列由SEQ ID NO:4表示)。抗-4-1BB scFv在HEK293细胞中瞬时表达，然后由Absolute AntibodyLtd(Oxford，United Kingdom)进行IMAC纯化。质谱分析示出一种主产物(观测质量28013Da，预期的质量28018Da)。
实施例112.将SYR-(G4S)3-IL15(PF18)克隆到pET32a表达载体中
将SYR-(G4S)3-IL15(PF18)(氨基酸序列由SEQ ID NO:5表示)设计为具有N端(M)SYR序列，其中甲硫氨酸在表达后将被切割，留下N端丝氨酸，以及SYR序列和IL15之间的柔性(G4S)3间隔基。将经密码子优化的DNA序列插入Ndel和Xhol之间的pET32A表达载体中，从而去除编码硫氧还蛋白融合蛋白的序列，且其获得自Genscript，Piscataway，USA。
实施例113.SYR-(G4S)3-/IL15(PF18)的大肠杆菌表达和包涵体分离
SYR-(G4S)3-/IL15(PF18)的表达始于将质粒(pET32a-SYR(G4S)3-IL15)转化到BL21细胞(Novagen)中。将转化的细胞铺在含有氨苄青霉素的LB-琼脂上，并在37℃下孵育过夜。挑取单菌落，并用于接种50mL TB培养基+氨苄青霉素，然后在37℃下孵育过夜。接下来，用过夜培养物接种1000mL TB培养基+氨苄青霉素。将培养物在37℃下以160RPM孵育，当OD600达到1.5时，用1mM IPTG(1mL 1M储备溶液)诱导。在37℃下以160RPM诱导＞16小时后，通过离心(5000×g-5分钟)沉淀培养物。将从1000mL培养物中获得的细胞沉淀在60mL含有1500单位的全能核酸酶(benzonase)的BugBusterTM中裂解，并在室温下在滚轴(rollerbank)上孵育30分钟。裂解后，通过离心(15分钟，15000×g)将不溶部分与可溶部分分离。将一半的不溶部分溶解在30mL含有溶菌酶的Bug BusterTM中(最终浓度：200μg/mL)，并在滚轴上孵育10分钟。接下来，将溶液用6倍体积的1:10稀释的BugBusterTM稀释，然后以15000×g离心15分钟。通过使用均质器将沉淀重悬于200mL 1:10稀释的BugBusterTM中，然后以12000×g离心10分钟。最后一步重复3次。
实施例114.从分离的包涵体中重折叠SYR-(G4S)3-IL15 PF18
将含有SYR-(G4S)3-IL15 PF18的纯化包涵体溶解在30mL含有40mM半胱胺和20mMTris pH 8.0的5M胍中并使其变性。将悬浮液以16.000×g离心5分钟以沉淀剩余的细胞碎片。用含有40mM半胱胺和20mM Tris pH 8.0的5M胍将上清液稀释至1mg/mL，并在滚轴上在室温下孵育2小时。在4℃的冷冻室中将1mg/mL溶液逐滴加入10倍体积的重折叠缓冲液(50mM Tris、10.53mM NaCl、0.44mM KCl、2.2mM MgCl2、2.2mM CaCl2、0.055％PEG-4000、0.55M L-精氨酸、4mM半胱胺、4mM胱胺，pH 8.0)，需要搅拌。将剩余溶液在4℃下至少放置24小时。使用SpectrumTMSpectra/PorTM3RC透析膜管3500道尔顿MWCO将溶液透析至10mM NaCl和20mM Tris pH 8.0，1×过夜和2×4小时。将重折叠的SYR-(G4S)3-/IL15(PF18)装载到AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上的平衡Q-trap阴离子交换柱(GE health care)上。该柱首先用缓冲液A(20mM Tris，10mM NaCl，pH 8.0)洗涤。用缓冲液B(20mM Tris缓冲液，1M NaCl，pH 8.0)在30mL从缓冲液A到缓冲液B的梯度上洗脱保留的蛋白质。质谱分析示出对应于PF18的重量为14122Da(预期质量：14122Da)。使用AKTA Purifier-10(GEHealthcare)上的HiPrepTM26/10脱盐柱(Cytiva)将纯化的SYR-(G4S)3-IL15(PF18)缓冲液交换为PBS。
实施例115.将H6-SSGENLYFQ-GGG-IL15Rα-IL15 207克隆至pET32a表达载体
将IL15Rα-IL15融合蛋白207(氨基酸序列由SEQ ID NO:3表示)设计为具有N端His-tag(HHHHHH)、TEV蛋白酶识别序列(SSGENLYFQ)，之后是分选酶A识别序列(GGG)。将经密码子优化的DNA序列插入至NdeI与XhoI之间的pET32A表达载体中，从而去除编码硫氧还蛋白融合蛋白的序列，且其获得自Genscript,Piscataway,USA。
实施例116.His6-SSGENLYFQ-GGG-IL15Rα-IL15 207的大肠杆菌表达和包涵体分离
His6-SSGENLYFQ-GGG-IL15Rα-IL15 207的表达始于将质粒(pET32a-IL15Rα-IL15)转化到BL21细胞(Novagen)中。接下来，将500mL培养液(LB培养基+氨苄青霉素)接种到BL21细胞中。当OD600达到0.7时，用1mM IPTG(500μL 1M储备溶液)诱导培养。在37℃下诱导4小时后，用离心机将培养物沉淀。将从500mL培养物中获得的细胞沉淀在25mL含有625单位的全能核酸酶的BugBusterTM中裂解，并在室温下在滚筒上孵育20分钟。裂解后，通过离心(20分钟，12000×g，4℃)将不溶部分与可溶部分分离。将不溶部分溶解在25mL含有溶菌酶的BugBusterTM中(最终浓度：200μg/mL)，并在滚筒上孵育5分钟。接下来，将溶液用6倍体积的1:10稀释的BugBusterTM稀释，然后在4℃下以9000×g离心15分钟。通过使用均质器将沉淀重悬于250mL 1:10稀释的BugBusterTM中，然后在4℃下以9000×g离心15分钟。最后一步重复3次。
实施例117.从分离的包涵体中重折叠His6-SSGENLYFQ-GGG-IL15Rα-IL15 207
将含有His6-SSGENLYFQ-GGG-IL15Rα-IL15 207的纯化包涵体在4℃下在25mL变性缓冲液(5M胍，0.3M亚硫酸钠)和2.5mL 50mM2-硝基-5-磺基苯二磺酸钠中磺化。将溶液用10倍体积的冷Milli-Q稀释，然后离心(以8000×g离心10分钟)。用匀浆器将沉淀溶解在125mL冷Milli-Q中，然后离心(以8000×g离心10分钟)。最后一步重复3次。将纯化的His6-SSGENLYFQ-GGG-IL15Rα-IL15 207在5M胍中变性，稀释至1mg/mL蛋白浓度。用直径为0.8mm的注射器将变性蛋白质在冰上滴加到10倍体积的重折叠缓冲液(50mM Tris、10.53mMNaCl、0.44mM KCl、2.2mM MgCl2、2.2mM CaCl2、0.055％ PEG-4000、0.55M L-精氨酸、8mM半胱胺、4mM胱胺，pH 8.0)中，然后在4℃下孵育48小时(无需搅拌)。将重折叠的His6-SSGENLYFQ-GGG-IL15Rα-IL15 207装载到AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上的20mLHisTrap excel柱(GE health care)上。该柱首先用缓冲液A(5mM Tris缓冲液、20mM咪唑、500mM NaCl，pH 7.5)洗涤。用缓冲液B(20mM Tris缓冲液、500mM咪唑、500mM NaCl，pH 7.5)在25mL从缓冲液A到缓冲液B的梯度上洗脱保留的蛋白质。将级分通过SDS-PAGE的聚丙烯酰胺凝胶(16％)进行分析。将含有纯化的目标蛋白质的级分合并，并将缓冲液交换为TBS(20mM Tris pH 7.5和150mM NaCl2)，在4℃下渗透过夜。使用Amicon Ultra-0.5，MWCO3kDa(Merck-Millipore)将纯化的蛋白质浓缩至至少2mg/mL。质谱分析示出其重量为25044Da(预期为：25044Da)。产物在进一步使用前储存在-80℃。
实施例118.TEV裂解His6-SSGENLYFQ-GGG-IL15Rα-IL15 207得到GGG-IL15Rα-IL15 208
向His6-SSGENLYFQ-GGG-IL15Rα-IL15(207，330μL，2.3mg/mL的pH 7.5的TBS溶液)的溶液中加入TEV蛋白酶(50.5μL，10单位/μL在50mM Tris-HCl中，250mM NaCl，1mM TCEP，1mM EDTA，50％丙三醇，pH 7.5，New England Biolabs)。将反应物在30℃下孵育1小时。TEV裂解后，将溶液使用排阻色谱法纯化。将反应混合物装载至在AKTA Purifier-10(GEHealthcare)上的Superdex 75 10/300GL柱(GE Healthcare)上，使用TBS pH 7.5作为流动相，流速为0.5mL/min。将GGG-IL15Rα-IL15 208在保留时间为12mL下洗脱。将纯化的蛋白质使用Amicon Ultra-0.5，MWCO 3kDa(Merck Millipore)浓缩至至少2mg/mL。将产物对应于GGG-IL15Rα-IL15 208用质谱分析(观测质量：22965Da，预期质量：22964Da)。产物在进一步使用前储存在-80℃。
实施例119.将SYR-(G4S)3-IL15Ra-接头-IL15 PF26克隆到pET32a表达载体中
SYR-(G4S)3-IL15Ra-接头-IL15(PF26)(氨基酸序列由SEQ ID NO:6表示)设计为具有N端(M)SYR序列，其中甲硫氨酸将在表达后被切割，留下N端丝氨酸，和SYR序列与IL15Ra-接头-IL15之间的柔性(G4S)3间隔基。将经密码子优化的DNA序列插入Ndel与Xhol之间的pET32A表达载体中，从而去除编码硫氧还蛋白融合蛋白的序列，并获得自Genscript，Piscataway，USA。
实施例120.SYR-(G4S)3-IL15Ra-接头-IL15 PF26的大肠杆菌表达和包涵体分离
SYR-(G4S)3-IL15Ra-接头-IL15 PF26的表达始于将质粒(pET32a-SYR-(G4S)3-IL15Ra-接头-IL15)转化到BL21细胞(Novagen)中。下一步是用BL21细胞接种1000mL培养物(TB培养基+氨苄青霉素)。当OD600达到1.5时，用1mM IPTG(1mL的1M储备溶液)诱导培养物。在37℃以160RPM诱导＞16小时后，通过离心(5000×g-5分钟)沉淀培养物。将从1000mL培养物中获得的细胞沉淀在60mL含有1500单位的全能核酸酶的BugBusterTM中裂解，并在室温下在滚轴上孵育30分钟。裂解后，通过离心(15分钟，15000×g)将不溶部分与可溶部分分离。将一半的不溶部分溶解在30mL含有溶菌酶的BugBusterTM中(最终浓度：200μg/mL)，并在滚轴上孵育10分钟。接下来，将溶液用6倍体积的1:10稀释的BugBusterTM进行稀释，并以15000×g离心15分钟。使用均质器将沉淀重悬于200mL 1:10稀释的BugBusterTM中，并以12000×g离心10分钟。最后一步重复3次。
实施例121.从分离的包涵体中重折叠SYR-(G4S)3-IL15Ra-接头-IL15 PF26
将含有SYR-(G4S)3-IL15Ra-接头-IL15 PF26的纯化包涵体溶解在30mL含有40mM半胱胺和20mM Tris pH 8.0的5M胍中并使其变性。将悬浮液以16.000×g离心5分钟以沉淀剩余的细胞碎片。用含有40mM半胱胺和20mM Tris pH 8.0的5M胍将上清液稀释至1mg/mL，并在滚轴上在室温下孵育2小时。在4℃的冷冻室中将1mg/mL溶液逐滴加入10倍体积的重折叠缓冲液(50mM Tris、10.53mM NaCl、0.44mM KCl、2.2mM MgCl2、2.2mM CaCl2、0.055％PEG-4000、0.55M L-精氨酸、4mM半胱胺、4mM胱胺，pH 8.0)中，需要搅拌。将剩余溶液在4℃下至少放置24小时。使用SpectrumTMSpectra/PorTM3RC透析膜管3500道尔顿MWCO将溶液透析至10mM NaCl和20mM Tris pH 8.0，1×过夜和2×4小时。将重折叠的SYR-(G4S)3-IL15Ra-接头-IL15(PF26)装载到AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上的平衡Q-trap阴离子交换柱(GE health care)上。该柱首先用缓冲液A(20mM Tris，10mM NaCl，pH 8.0)洗涤。用缓冲液B(20mM Tris缓冲液，1M NaCl，pH8.0)在30mL从缓冲液A到缓冲液B的梯度上洗脱保留的蛋白质。质谱分析示出对应于PF26的重量为24146Da(预期质量：24146Da)。使用AKTAPurifier-10(GE Healthcare)上的HiPrepTM26/10脱盐柱(cytiva)将纯化的SYR-(G4S)3-IL15Ra-接头-IL15(PF26)缓冲液交换为PBS。
修饰细胞因子和scFv’s
实施例122.使用分选酶A将化合物GGG-PEG2-BCN(157)的C端分选到hOKT3 200以获得hOKT3-PEG2-BCN 201
根据本发明的生物缀合物通过使用分选酶A(由SEQ ID NO：2表示)进行C端分选来制备。向hOKT3 200(500μL，500μg，35μM在PBS pH 7.4中)的溶液中加入分选酶A(58μL，384μg，302μM在TBS pH 7.5+10％甘油中)、GGG-PEG2-BCN(157，28μL，50mM在DMSO中)、CaCl2(69μL，100mM在MQ中)和TBS pH 7.5(39μL)。反应在37℃下孵育过夜，然后在AKTA Explorer-100(GE Healthcare)上的His-trap excel 1mL柱(GE Healthcare)上进行纯化。用缓冲液A(20mM Tris、200mM NaCl、20mM咪唑，pH 7.5)使柱平衡，并以1mL/min装载样品。收集流出物，质谱分析示出一种对应于201的主产物(观测质量27829Da)。将样品对PBS pH 7.4进行透析，并通过旋转过滤(Amicon Ultra-0.5，Ultracel-10膜，Millipore)浓缩以获得hOKT3-PEG2-BCN 201(60μL，169μg，101μM在PBS pH 7.4中)。
实施例123.使用分选酶A五突变体将化合物GGG-PEG2-BCN(157)的C端分选到hOKT3 200以获得hOKT3-PEG2-BCN 201
根据本发明的生物缀合物通过使用分选酶A五突变体(BPS Bioscience，目录号71046)进行C端分选来制备。向hOKT3 200(14.3μL，14μg，35μM在PBS pH 7.4中)的溶液中加入分选酶A五突变体(0.5μL，1μg，92μM在40mM Tris pH 8.0，110mM NaCl，2.2mM KCl，400mM咪唑和20％甘油中)、GGG-PEG2-BCN(157，2μL，20mM在DMSO:MQ＝2:3中)、CaCl2(2μL，100mM在MQ中)和TBS pH7.5(1.2μL)。将反应在37℃下孵育过夜。质谱分析示出一种对应于hOKT3-PEG2-BCN 201的主产物(观测质量27829Da)。
实施例124.使用分选酶A将GGG-PEG11-四嗪(169)的C端分选到hOKT3 200以获得hOKT3-PEG11-四嗪PF01
根据本发明的生物缀合物通过使用分选酶A(由SEQ ID NO:2表示)进行C端分选来制备。向hOKT3 200(1908μL，5mg，91μM在PBS pH 7.4中)的溶液中加入分选酶A(81μL，948μg，533μM在TBS pH 7.5+10％甘油中)、GGG-PEG11-四嗪(169，347μL，20mM在MQ中)、CaCl2(347μL，100mM在MQ中)和TBS pH 7.5(789μL)。将反应在37℃下孵育过夜。质谱分析示出一种对应于hOKT3-PEG11-四嗪PF01的主产物(观测质量28258Da)。反应在AKTA Explorer-100(GEHealthcare)上的His-trap excel 1mL柱(GE Healthcare)上纯化。用缓冲液A(20mM Tris、200mM NaCl、20mM咪唑，pH 7.5)使柱平衡，并以1mL/min装载样品。收集流出物，使用HiPrep26/10脱盐柱(GE Healthcare)将缓冲液交换为PBS pH 6.5。在4℃下对PBS pH 6.5额外进行透析3天，以去除残留的169。
实施例125.使用分选酶A将GGG-PEG23-四嗪(170)的C端分选到hOKT3 200以获得hOKT3-PEG23-四嗪PF02
根据本发明的生物缀合物通过使用分选酶A(由SEQ ID NO:2表示)进行C端分选来制备。向hOKT3 200(1908μL，5mg，91μM在PBS pH 7.4中)的溶液中加入分选酶A(81μL，948μg，533μM在TBS pH 7.5+10％甘油中)、GGG-PEG23-四嗪(170，347μL，20mM在MQ中)、CaCl2(347μL，100mM在MQ中)和TBS pH 7.5(789μL)。将反应在37℃下孵育过夜。质谱分析示出一种对应于hOKT3-PEG23-四嗪PF02的主产物(观测质量28787Da)。反应在AKTA Explorer-100(GEHealthcare)上的His-trap excel 1mL柱(GE Healthcare)上纯化。用缓冲液A(20mM Tris、200mM NaCl、20mM咪唑，pH 7.5)使柱平衡，并以1mL/min装载样品。将流出物透析至PBS pH6.5，然后在AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上的Superdex75 10/300GL柱(GEHealthcare)上使用PBS pH 6.5作为流动相进行纯化。
实施例126.使用分选酶A将GGG-PEG2-芳基叠氮(171)的C端分选到hOKT3 200以获得hOKT3-PEG2-芳基叠氮PF03
根据本发明的生物缀合物通过使用分选酶A(由SEQ ID NO:2表示)进行C端分选来制备。向hOKT3 200(2092μL，5mg，83μM在PBS pH 7.4中)的溶液中加入分选酶A(95μL，950μg，456μM在TBS pH 7.5+10％甘油中)、GGG-PEG2-芳基叠氮(171，347μL，20mM在MQ中)、CaCl2(347μL，100mM在MQ中)和TBS pH 7.5(591μL)。将反应在37℃下孵育过夜。质谱分析示出一种对应于hOKT3-PEG2-芳基叠氮PF03的主产物(观测质量27865Da)。反应在AKTA Explorer-100(GE Healthcare)上的His-trap excel 1mL柱(GE Healthcare)上纯化。用缓冲液A(20mM Tris、200mM NaCl、20mM咪唑，pH 7.5)使柱平衡，并以1mL/min装载样品。流出物在AKTA Punfier-10(GE Healthcare)上的Superdex75 10/300GL柱(GE Healthcare)上使用PBS pH 7.4作为流动相进行纯化。
实施例127.使用分选酶A对化合物GGG-PEG23-BCN(163)抗-4-1BB PF31进行C端分选以获得抗-4-1BB PF07
根据本发明的生物缀合物通过使用分选酶A(由SEQ ID NO:2表示)进行C端分选来制备。向抗-4-1BB PF07(665μL，2mg，107μM在PBS pH 7.4中)的溶液中加入分选酶A(100μL，1mg，357μM在TBS pH 7.5+10％甘油中)、GGG-PEG23-BCN(163，140μL，20mM在MQ中)、CaCl2(140μL，100mM在MQ中)和TBS pH 7.5(355μL)。将反应在37℃下孵育过夜，然后在AKTAExplorer-100(GE Healthcare)上的His-trap excel 1mL柱(GE Healthcare)上进行纯化。用缓冲液A(20mM Tris、200mM NaCl、20mM咪唑，pH 7.5)使柱平衡，并以1mL/min装载样品。收集流出物，浓缩后在Superdex75 10/300柱(Cytiva)上纯化。质谱分析示出一种对应于抗-4-1BB-BCN PF07的主产物(观测质量28478Da)。
实施例128.使用分选酶A对化合物GGG-PEG2-芳基叠氮(171)抗-4-1BB PF31进行C端分选以获得抗-4-1BB PF09
根据本发明的生物缀合物通过使用分选酶A(由SEQ ID NO:2表示)进行C端分选来制备。向抗-4-1BB-PF31(665μL，2mg，107μM在PBS pH 7.4中)的溶液中加入分选酶A(100μL，1mg，357μM在TBS pH 7.5+10％甘油中)、GGG-PEG2-芳基叠氮(171，140μL，20mM在MQ中)、CaCl2(140μL，100mM在MQ中)和TBS pH 7.5(355μL)。将反应在37℃下孵育过夜，然后在AKTAExplorer-100(GE Healthcare)上的His-trap excel 1mL柱(GE Healthcare)上进行纯化。用缓冲液A(20mM Tris、200mM NaCl、20mM咪唑，pH 7.5)使柱平衡，并以1mL/min装载样品。收集流出物，质谱分析示出一种对应于抗-4-1BB-叠氮PF09的主产物(观测质量27592Da)。
实施例129.通过SPANC对IL15Rα-IL15 PF26进行N端BCN功能化以获得BCN-IL15Rα-IL15 PF15
向IL15Rα-IL15 PF26(2.9mg，50μM在PBS中)中加入2当量NalO4(4.8μL 50mM PBS储备溶液)和10当量L-甲硫氨酸(12.5μL 100mM PBS储备溶液)。将反应在4℃下孵育5分钟。质谱分析示出丝氨酸被氧化为相应的醛和水合物(观测质量24114Da和24132Da)。使用装有Sephadex G-25树脂(Cytiva)的PD-10脱盐柱纯化反应混合物并使用PBS洗脱。向洗脱液(2.6mg，50μM在PBS中)中加入160当量N-甲基羟胺.HCl(340μL 50mM在PBS中的储备溶液)和160当量对氨基苯甲醚(340μL 50mM在PBS中的储备溶液)。将反应混合物在25℃下孵育3小时。质谱分析示出一个对应于N-甲基-亚胺-氧化物-IL15的单峰(观测质量24143Da)。使用装有Sephadex G-25树脂(Cytiva)的PD-10脱盐柱纯化反应混合物并使用PBS洗脱。向洗脱液(2.47mg，50μM在PBS中)中加入25当量双-BCN-PEG11(105)(51μL，50mM在DMSO中)和150μLDMF。反应在室温下孵育过夜。使用Superdex7510/300柱(Cytiva)纯化反应。质谱分析示出一个对应于BCN-IL15Rα-IL15 PF15的主峰(观测质量25041Da)。
实施例130.IL15 PF18的N端重氮转移反应以获得叠氮基-IL15PF19
向IL15 PF18(5mg，50μM在0.1M TEA缓冲液pH 8.0中)中加入咪唑-1-磺酰叠氮盐酸盐(708μL，50mM在50mM NaOH中)并在37℃下孵育过夜。使用HiPrepTM26/10脱盐柱(Cytiva)纯化反应。质谱分析示出一个对应于叠氮基-IL15 PF19的主峰(观测质量14147Da)。
实施例131.三-BCN(150)与hOKT3-PEG2-芳基叠氮PF03缀合以获得双-BCN-hOKT3PF22
向hOKT3-PEG2-芳基叠氮PF03(87μL，1mg，411μM在PBS pH7.4中)的溶液中加入PBSpH 7.4(559μL)、DMF(49μL)和化合物150(22μL，40mM的DMF溶液，25当量)。将反应在室温下孵育过夜。质谱分析示出一种对应于双-BCN-hOKT3 PF22的主产物(观测质量29171Da)。该反应物在AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上的Superdex75 10/300GL柱(GEHealthcare)上使用PBS pH 7.4作为流动相进行纯化。
实施例132.通过SPANC对IL15 PF18进行N端BCN功能化以获得BCN-PEG11-IL15PF33
向IL15 PF18(8070μL，50μM的PBS溶液)中加入2当量NaIO4(16.4μL 50mM的PBS储备溶液)。将反应物在4℃下孵育5分钟。质谱分析示出丝氨酸被氧化为相应的水合物(观测质量：14109Da)。将反应混合物使用填充Sephadex G-25树脂(Cytiva)的PD-10脱盐柱纯化，然后使用PBS洗脱。向洗脱物(11500μL，32μM的PBS溶液)中加入160当量N-甲基羟基胺HCl(558μL 100mM的PBS储备溶液)和160当量对氨基苯甲醚(558μL 100mM的PBS储备溶液)。将反应混合物在25℃下孵育3小时。质谱分析示出一个对应于N-甲基-亚胺-氧化物-IL15的单峰(观测质量：14119Da)。将反应混合物使用填充Sephadex G-25树脂(Cytiva)的PD-10脱盐柱纯化，然后使用PBS洗脱。向浓缩的洗脱物(5370，66μMμM的PBS溶液)中加入25当量BCN-PEG11-BCN(105)(142μL，50mM的DMSO溶液)和1576μLPBS。将反应物在室温下孵育过夜。将反应混合物装载至在AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上的Superdex 75 10/300GL柱(GEHealthcare)上使用PBS pH 7.4作为流动相，流速为0.5mL/min。质谱分析示出一个对应于BCN-PEG11-IL15 PF33的主峰(观测质量：15016Da)。
实施例133.使用分选酶A将芳基叠氮-PEG11-LPETGG(175)的N端分选到GGG-IL15Rα-IL15 208以获得芳基叠氮-IL15Rα-IL15 PF13
向含有蛋白质208(2000μL，140μM在TBS pH 7.5中)的溶液加入TBS pH 7.5(2686μL)、CaCl2(559μL，100mM)和175(83μL，50mM的DMSO溶液)以及分选酶A(260μL，537μM在TBSpH 7.5中)，然后在37℃下孵育3小时(避光)。孵育后，将分选酶A从溶液中使用Ni-NTA珠去除(500μL珠＝1mL浆液)。将溶液在4℃下用Ni-NTA珠在滚轴上持续孵育，随后离心溶液(5分钟，7.000×g)。通过从沉淀中分离的上清液中收集含有产物PF13的上清液。将反应混合物装载至在AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上的Superdex 75 10/300GL柱(GEHealthcare)上使用PBS pH 7.4作为流动相，流速为0.5mL/min。质谱分析示出对应于PF13的重量为24193Da(预期质量：24193Da)。
实施例134.在SYR-(G4S)3-IL15Rα-IL15 PF26中使用经应变促进的炔-硝酮环加成掺入三-BCN(150)的N端以获得Bis-BCN-IL15Rα-IL15PF27
向IL15Rα-IL15 PF26(3840μL，50μM的PBS溶液)中加入2当量NaIO4(7.7μL 50mM的PBS储备溶液)和10当量L-甲硫氨酸(19.2μL 100mM的PBS储备溶液)。将反应物在4℃下孵育5分钟。质谱分析示出丝氨酸被氧化为相应的醛和水合物(观测质量：24114Da和24132Da)。将反应混合物使用填充Sephadex G-25树脂(Cytiva)的PD-10脱盐柱纯化然后使用PBS洗脱。向浓缩的洗脱物(1800μL，50μM的PBS溶液)中加入160当量N-甲基羟基胺.HCl(320μL90mM的PBS储备溶液)和160当量对氨基苯甲醚(288μL 100mM的PBS储备溶液)。将反应混合物在25℃下孵育3小时。质谱分析示出一个对应于N-甲基-亚胺-氧化物-IL15Rα-IL15的单峰(观测质量：24143Da)。将反应混合物使用填充Sephadex G-25树脂(Cytiva)的PD-10脱盐柱纯化然后使用PBS洗脱。向浓缩的洗脱物(3100μL，60μM的PBS溶液)中加入25当量三-BCN(150)(116μL，40mM的DMSO溶液)、256μL DMF和PBS pH 7.4(248μL)。将反应物在室温下持续孵育。将反应混合物装载至在AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上的Superdex 75 10/300GL柱(GE Healthcare)上使用PBS pH 7.4作为流动相，流速为0.5mL/min。质谱分析示出所需的双-BCN-IL15Rα-IL15 PF27(观测质量：25448Da，预期质量：25447)。RP-HPLC示出标记效率为60％。
实施例135.将双-BCN-TCO XL11与hOKT3-PEG2-芳基叠氮PF03缀合以获得hOKT3-(TCO)1-(BCN)1PF32
向含有hOKT3-PEG2-芳基叠氮PF03(35μL，411μM的pH 7.4的PBS溶液)的溶液中加入PBS pH 7.4(224.2μL)和双-BCN-TCO XL11(28.8μL，10mM的DMF溶液，20当量)。将反应物在室温下孵育16小时。使用离心过滤器去除过量的双-BCN-TCO XL11(Amicon Ultra-0.5mLMWCO 10kDa，Merck Millipore)，在pH 7.4的PBS中获得浓度为3.39mg/mL的最终样品。质谱分析示出一种对应于预期产物hOKT3-(TCO)1-(BCN)1PF32的主产物(观测质量：29305Da)。
实施例136.将叠氮-IL15 PF19与hOKT3-(TCO)1-(BCN)1PF32缀合以获得hOKT3-(IL15)1-(TCO)1PF34
向含有hOKT3-(TCO)1-(BCN)1PF32(50μL，116μM的pH 7.4的PBS溶液)的溶液中加入叠氮-IL15 PF19(52μL，225μM的pH 7.4的PBS溶液，2当量)。将反应物在37℃下孵育16小时。质谱分析示出一种对应于预期产物hOKT3-(IL15)1-(TCO)1PF34的主产物(观测质量：43453Da)。
实施例137.将抗-4-1BB-PEG2-芳基叠氮PF09与双-BCN-IL15Rα-IL15 PF27缀合以获得IL15Rα-IL15-(抗-4-1-BB)1-(BCN)1PF35
向含有抗-4-1BB-PEG2-芳基叠氮PF09(52μL，200μM的pH 7.4的PBS溶液)的溶液中加入双-BCN-IL15Rα-IL15 PF27(80μL，169μM的pH 7.4的PBS溶液)。将反应物在室温下孵育16小时。将反应混合物装载至在AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上的Superdex 75 10/300GL柱(GE Healthcare)上使用PBS pH 7.4作为流动相，流速为0.5mL/min。质谱分析示出对应于IL15Rα-IL15-(抗-4-1-BB)1-(BCN)1PF35的重量为53043Da(预期质量：53050Da)。
抗体修饰
实施例138.将本妥昔单抗酶法重构为本妥昔单抗(6-N3GalNAc)2本妥昔单抗-v1a
使用离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 10kDa，Merck Millipore)将本妥昔单抗(来自药店)在20mM组氨酸中，150mM NaCl pH 7.5中进行缓冲液交换并浓缩至35.6mg/mL。用EndoSH(6μL，31μg，5.2mg/mL)孵育本妥昔单抗(84μL，3mg，35.6mg/mL在20mM组氨酸中，150mM NaCl pH 7.5)，记载于WO2017137459A1中；用TnGalNAcT(32μL，106μg，3.3mg/mL)、6-N3GalNAc-UDP(5μL，100mM的MQ溶液)孵育，均记载于WO2016170186中；用MnCl2(1μL，1M的MQ溶液)和20mM组氨酸，150mM NaCl pH 7.5(22μL)孵育。将反应物在30℃下孵育过夜，然后使用离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 10kDa，Merck Millipore)在PBS溶液pH7.4中进行缓冲液交换并浓缩至35.6mg/mL。对IdeS处理后的样品进行质谱分析示出一种对应于预期产物本妥昔单抗-v1a的主Fc/2产物(观测质量：24333Da)。此外，RP-HPLC分析证实MMAE仍与抗体缀合(本妥昔单抗和本妥昔单抗-v1a的平均DAR均为3.8)。
实施例139.将恩美曲妥珠单抗酶法重构为恩美曲妥珠单抗(6-N3GalNAc)2恩美曲妥珠单抗-v1a
使用离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 10kDa，Merck Millipore)将恩美曲妥珠单抗(来自药店)在20mM组氨酸中，150mM NaCl pH 7.5中进行缓冲液交换并浓缩至17.8mg/mL。用EndoSH(8μL，42μg，5.2mg/mL)孵育恩美曲妥珠单抗(224μL，4mg，17.8mg/mL在20mM组氨酸中，150mM NaCl pH 7.5)，记载于WO2017137459A1中；用TnGalNAcT(42μL，139μg，3.3mg/mL)、6-N3GalNAc-UDP(7μL，100mM的MQ溶液)孵育，均记载于WO2016170186中；以及用MnCl2(2μL，1M的MQ溶液)孵育。将反应物在30℃下孵育过夜，然后使用离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 10kDa，Merck Millipore)在PBS溶液pH 7.4中进行缓冲液交换并浓缩至10mg/mL。对IdeS处理后的样品进行质谱分析示出一种对应于经叠氮修饰的Fc/2-片段的主Fc/2产物(观测质量：24363Da，约总Fc/2-片段的80％)，并且对应于含DM1的经叠氮修饰的Fc/2-片段的一个主Fc/2产物(观测质量：25321Da，约总Fc/2-片段的20％)，从而证实恩美曲妥珠单抗-v1a的形成。
实施例140.将曲妥珠单抗-S239C酶法重构为曲妥珠单抗-S239C(6-N3GalNAc)2trast-v9a
使用离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 10kDa，Merck Millipore)将曲妥珠单抗-S239C突变体(由Evitria在CHO中瞬时表达，重链突变S239C)在20mM组氨酸中，150mMNaCl pH 7.5中进行缓冲液交换并浓缩至27.0mg/mL。用EndoSH(8μL，42μg，5.2mg/mL)曲妥珠单抗-S239C(148μL，4mg，27.0mg/mL在20mM组氨酸中，150mM NaCl pH 7.5)孵育，记载于WO2017137459A1中；用TnGalNAcT(42μL，139μg，3.3mg/mL)、6-N3GalNAc-UDP(7μL，100mM的MQ溶液)孵育，均记载于WO2016170186中；以及用MnCl2(1μL，1M的MQ溶液)孵育。将反应物在30℃下孵育过夜，然后使用离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 10kDa，MerckMillipore)在PBS溶液pH 7.4中进行缓冲液交换并浓缩至10mg/mL。对IdeS处理后的样品进行质谱分析示出一种对应于经叠氮修饰的Fc/2-片段的主Fc/2产物(观测质量：24499Da，约总Fc/2-片段的80％)，其中Cys239与半胱氨酸形成二硫化物，还显示两种对应于经叠氮修饰的Fc/2-片段的次Fc/2产物(观测质量：24625和24685Da，约总Fc/2-片段的15％和5％)，其中C端赖氨酸和含Cys239的经叠氮修饰的Fc/2-片段与谷胱甘肽形成二硫化物，从而证实trast-v9a的形成。
实施例141.曲妥珠单抗(6-N3GalNAc)2trast-v1a与双-DIBO-四嗪XL14分子内交联以得到曲妥珠单抗-四嗪trast-v1a-XL14
向根据WO2016170186制备的曲妥珠单抗(6-N3GalNAc)2(trast-v1a)(149μL，5mg，33.6mg/mL的pH 7.4的PBS溶液)的溶液中加入PBS pH 7.4(351μL)、丙二醇(497μL)和双-DIBO-四嗪XL14(3.3μL，40mM的DMF溶液，相较于IgG为4.0当量)。将反应物在室温下孵育过夜，然后在AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上的Superdex200 10/300GL柱(GEHealthcare)上使用PBS pH 7.4作为流动相进行纯化。IdeS消化样品的质谱分析示出一种对应于分子内交联的Fc/2片段的主产物(观测质量：50177Da)，从而证实trast-v1a-XL14的形成。由于质谱分析是在纯化的单体碎片上进行的，因此可以排除分子间交联的可能性。使用离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 10kDa，Merck Millipore)将最终样品浓缩至11.98mg/mL。
实施例142.曲妥珠单抗(6-N3GalNAc)2trast-v1a与三-BCN 145分子内交联以得到曲妥珠单抗-BCN trast-v1a-145
向根据WO2016170186制备的曲妥珠单抗(6-N3GalNAc)2trast-v1a(320μL，2mg，5.56mg/mL的pH 7.4的PBS溶液)的溶液中加入化合物145(80μL，1.66mM的DMF溶液，相较于IgG为10当量)。将反应物在室温下孵育1天，然后使用离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mLMWCO 10kDa，Merck Millipore)缓冲液交换为PBS pH 7.4。IdeS消化样品的质谱分析示出一种对应于分子内交联的曲妥珠单抗衍生物trast-v1a-145的主产物(计算质量：49796Da，观测质量：49807Da)。HPLC-SEC示出聚合度<4％，因此排除分子间交联。
实施例143.利妥昔单抗(6-N3GalNAc)2rit-v1a与三-BCN 145分子内交联以得到利妥昔单抗-BCN rit-v1a-145
向根据WO2016170186制备的rit-v1a(494μL，30mg，60.7mg/mL的pH 7.4的PBS溶液)的溶液加入PBS pH 7.4(2506μL)、丙二醇(2980μL)和三价接头145(20μL，40mM的DMF溶液，相较于IgG为4.0当量)。将反应物在室温下孵育过夜，然后在AKTA Purifier-10(GEHealthcare)上的Superdex200 10/300GL柱(GE Healthcare)上使用PBS pH 7.4作为流动相进行纯化。还原SDS-PAGE示出对应于交联重链的一个主HC产物(参见图24，右图，第3道)，表明形成了rit-v1a-145。此外，非还原SDS-PAGE示出一条与rit-v1a相同高度的主要条带(参见图24，左图，第3道)，证明仅发生了分子内交联。
实施例144.恩美曲妥珠单抗(6-N3GalNAc)2恩美曲妥珠单抗-v1a与三-BCN 145分子内交联以得到恩美曲妥珠单抗-BCN恩美曲妥珠单抗-v1a-145
向恩美曲妥珠单抗-v1a(400μL，4mg，10mg/mL的pH 7.4的PBS溶液)的溶液中加入丙二醇(397μL)和三价接头145(2.7μL，40mM的DMF溶液，相较于IgG为4.0当量)。将反应物在室温下孵育过夜，然后在AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上的Superdex200 10/300GL柱(GE Healthcare)上使用PBS pH 7.4作为流动相进行纯化。IdeS消化样品的质谱分析示出三种对应于具有0、1和2DM1部分的分子内交联的Fc/2-片段的主产物(观测质量：49795，50752和51711Da)，从而证实恩美曲妥珠单抗-v1a-145的形成。由于质谱分析在纯化的单体级分上进行，因此可以排除分子间交联的可能性。使用离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mLMWCO 10kDa，Merck Millipore)将最终样品浓缩至6.88mg/mL。
实施例145.曲妥珠单抗-S239C(6-N3GalNAc)2trast-v9a与三-BCN 145分子内交联以得到曲妥珠单抗-S239C-BCN trast-v9a-145
向trast-v9a(400μL，4mg，10mg/mL的pH 7.4的PBS溶液)的溶液中加入丙二醇(397μL)和三价接头145(2.7μL，40mM的DMF溶液，相较于IgG为4.0当量)。将反应物在室温下孵育过夜，然后在AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上的Superdex200 10/300GL柱(GEHealthcare)上使用PBS pH 7.4作为流动相进行纯化。IdeS消化样品的质谱分析示出一种主产物(观测质量：50251Da)，对应于分子内交联的Fc/2-片段，其中一个Cys239与半胱氨酸形成二硫化物，一个Cys239与谷胱甘肽形成二硫化物，从而证实trast-v9a-145的形成。由于质谱分析在纯化的单体级分上进行，因此可以排除分子间交联的可能性。使用离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 10kDa，Merck Millipore)将最终样品浓缩至7.88mg/mL。
生成双功能抗体和多功能抗体
实施例146.抗-4-1-BB-PEG23-BCN PF07与trast-v1a缀合以获得具有2:1分子形式的trast-v1a-(PF07)1(CDR:抗-4-1-BB)
将根据WO2016170186制备的曲妥珠单抗(6-N3GalNAc)2trast-v1a(1mg，33.6mg/mL的PBS溶液)用抗-4-1-BB-PEG23-BCN PF07(55.8μL，6.8mg/mL的pH 7.5的PBS溶液)在37℃下孵育过夜，然后使用离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 100kDa，Merck Millipore)去除过量的PF07并将缓冲液交换为PBS pH 7.4，浓度为17.5mg/mL。对IdeS处理后的样品进行质谱分析示出两种分别对应于未反应的Fc/2和Fc/2-PF07的主Fc/2产物(观测质量：24362Da和52840Da)。这证实了预期产物trast-v1a-(PF07)1的形成。SDS-PAGE分析支持了这一结论(参见图25)。
实施例147.BCN-MMAE(LD11)与trast-v1a-(PF07)1缀合以获得具有2:1:1分子形式的trast-v1a-(PF07)1-(LD11)1(CDR:抗-4-1-BB:MMAE)
将Trast-v1a-(PF07)1(5.56μL，17.5mg/mL的PBS溶液)与BCN-MMAE LD11(0.57μL，10mM in DMF)在室温下孵育过夜。对IdeS处理后的样品进行质谱分析示出两种分别对应于Fc/2-LD11和Fc/2-PF07的主Fc/2产物(观测质量：25872Da和52840Da)。这证实了预期产物trast-v1a-(PF07)1-(LD11)1的形成。SDS-PAGE分析支持了这一结论(参见图25)。
实施例148.BCN-IL15 PF33与trast-v1a-(PF07)1缀合以获得具有2:1:1分子形式的trast-v1a-(PF07)1-(PF33)1(CDR:抗-4-1-BB:IL15)
将Trast-v1a-(PF07)1(5.56μL，17.5mg/mL的PBS溶液)与BCN-IL15 PF33(4.13μL，8.2mg/mL的pH 7.5的PBS溶液)在37℃下孵育过夜。对IdeS处理后的样品进行质谱分析示出两种分别对应于Fc/2-PF33和Fc/2-PF07的主Fc/2产物(观测质量：39376Da和52842Da)。这证实了预期产物trast-v1a-(PF07)1-(PF33)1的形成。SDS-PAGE分析支持了这一结论(参见图25)。
实施例149.hOKT3-(IL15)1-(TCO)1PF34与trast-v1a-XL14缀合以获得具有2:1:1分子形式的免疫细胞衔接器trast-v1a-XL14-PF34(CDR:hOKT3:IL15)
向trast-v1a-XL14(4.2μL，50μg，11.98mg/mL的pH 7.4的PBS溶液)的溶液中加入hOKT3-(IL15)1-(TCO)1PF34(17.1μL，29μg，39μM的pH 6.5的PBS溶液，相较于IgG为2当量)。将反应物在室温下孵育过夜。对IdeS消化后的样品进行质谱分析示出一种对应于与PF34缀合的交联Fc/2-片段的主Fc/2产物(观测质量：93608Da)，从而证实了trast-v1a-XL14-PF34的形成。
实施例150.IL15Rα-IL15-(anti-4-1-BB)1-(BCN)1PF35与trast-v1a缀合以获得具有2:2:2分子形式的trast-v1a-(PF35)2(CDR:IL15Rα-IL15:抗-4-1-BB)
向根据WO2016170186制备的曲妥珠单抗(6-N3GalNAc)2trast-v1a(1μL，56μg，56.1mg/mL的pH 7.4的PBS溶液)的溶液中加入IL15Rα-IL15-(抗-4-1-BB)1-(BCN)1PF35(22μL，4mg/mL的pH 7.4的PBS溶液，相较于IgG为4当量)。将反应物在室温下孵育16小时。对IdeS消化后的样品进行质谱分析示出对应于缀合物trast-v1a-(PF35)2的77413Da的峰(预期质量：77413Da)。
实施例151.IL15Rα-IL15-(抗-4-1-BB)1-(BCN)1PF35与曲妥珠单抗-四嗪trast-v1a-XL14缀合以获得具有2:1:1分子形式的trast-v1a-XL14-PF35(CDR:IL15Rα-IL15:抗-4-1-BB)
向trast-v1a-XL14(3.2μL，38μg，11.98mg/mL的pH 7.4的PBS溶液)的溶液中加入IL15Rα-IL15-(抗-4-1-BB)1-(BCN)1(PF35 7μL，4mg/mL，相较于IgG为2当量)。将反应物在室温下孵育4小时。对IdeS消化后的样品进行质谱分析示出对应于缀合物trast-v1a-XL14-PF35的103199的峰(预期质量：103197Da)。
实施例152.双-BCN-hOKT3 PF22与本妥昔单抗-v1a缀合以获得具有2:4:1分子形式的免疫细胞衔接器本妥昔单抗-v1a-PF22(CDR:MMAE:hOKT3)
向本妥昔单抗-v1a(3.6μL，75μg，20.75mg/mL的pH 7.4的PBS溶液)的溶液中加入双-BCN-hOKT3 PF22(5.1μL，29μg，194μM的pH 7.4的PBS溶液，相较于IgG为2当量)。将反应物在37℃下孵育过夜。对IdeS消化后的样品进行质谱分析示出一种对应于本妥昔单抗-v1a-PF22的交联Fc/2片段的主产物(观测质量：77837Da)。
实施例153.双-BCN-IL15Rα-IL15 PF27与本妥昔单抗-v1a缀合以获得具有2:4:1分子形式的免疫细胞衔接器本妥昔单抗-v1a-PF27(CDR:MMAE:IL15Rα-IL15)
向本妥昔单抗-v1a(3.6μL，75μg，20.75mg/mL的pH 7.4的PBS溶液)的溶液在加入双-BCN-IL15Rα-IL15 PF27(3.5μL，25μg，285μM的pH 7.4的PBS溶液，相较于IgG为2当量)。将反应物在37℃下孵育过夜。对IdeS消化后的样品进行质谱分析示出一种对应于本妥昔单抗-v1a-PF27的交联Fc/2片段的主产物(观测质量：74126Da)。
实施例154.hOKT3-PEG11-四嗪PF01与恩美曲妥珠单抗-v1a-145缀合以获得具有2:4:1分子形式的免疫细胞衔接器恩美曲妥珠单抗-v1a-145-PF01(CDR:DM1:hOKT3)
向恩美曲妥珠单抗-v1a-145(22μL，150μg，6.88mg/mL的pH 7.4的PBS溶液)的溶液中加入hOKT3-PEG11-四嗪PF01(8.8μL，57μg，230μM的pH 7.4的PBS溶液，相较于IgG为2当量)。将反应物在室温下孵育过夜。对IdeS消化后的样品进行质谱分析示出两种对应于与PF01分子内交联的Fc/2-片段(观测质量：78024Da，约总Fc/2片段的40％)，以及与PF01和DM1分子内交联的Fc/2-片段(观测质量：78985Da，约总Fc/2片段的60％)的主产物，从而证实了恩美曲妥珠单抗-v1a-145-PF01的形成。
实施例155.hOKT3-PEG23-四嗪PF02与利妥昔单抗-BCN rit-v1a-145缀合以获得具有2:1分子形式的T细胞衔接器rit-v1a-145-PF02(CDR:hOKT3)
向rit-v1a-145(247μL，6.3mg，171μM的pH 7.4的PBS溶液)的溶液中加入hOKT3-PEG23-四嗪PF02(262μL，2.0mg，267μM的pH 6.5的PBS溶液，相较于IgG为1.7当量)。将反应物在室温下孵育过夜，然后在AKTA Purifier-10(GE Healthcare)上的Superdex20010/300GL柱(GE Healthcare)上使用PBS pH 7.4作为流动相进行纯化。非还原SDS-PAGE分析示出一个由抗体与单hOKT3缀合组成的主产物(参见图24，左图，第7道)，从而证实了rit-v1a-145-PF02的形成。此外，还原SDS-PAGE证实了一个对应于两条与单hOKT3缀合的重链的主HC产物(参见图24，右图，第7道)。
实施例156.双马来酰亚胺-MMAE(LD09)与rit-v1a-145-PF02进行马来酰亚胺缀合以获得具有2:1:1分子形式的rit-v10-[145-PF02]-[LD09](CDR:hOKT3:MMAE)
将Rit-v1a-145-PF02(0.7mg，7.34mg/mL的PBS溶液+10mM EDTA)与0.8μL 10mMTCEP在37℃下孵育2小时。向部分反应混合物(13.6μL)中加入双马来酰亚胺-MMAE(LD09)(1.7μL，1mM在DMF中)，然后在室温下孵育3小时。对DTT还原后的样品进行质谱分析示出一种对应于预期产物Rit-v10-[145-PF02]-[LD09]的主HC产物(观测质量：130895Da)。
实施例157.双马来酰亚胺-BCN(XL01)与rit-v1a-145-PF02进行马来酰亚胺缀合以获得中间体rit-v10-[145-PF02]-[XL01]
将Rit-v1a-145-PF02(0.7mg，7.34mg/mL的PBS溶液+10mM EDTA)与0.8μL 10mMTCEP在37℃下孵育2小时。向部分反应混合物(84μL)中加入双马来酰亚胺-BCN(XL01)(10.3μL，1mM in DMF)，然后在室温下孵育3小时，之后使用离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mLMWCO 100kDa，Merck Millipore)将缓冲液交换为PBS pH 7.4，浓度为9.8mg/mL。SDS-PAGE证实了预期产物Rit-v10-[145-PF02]-[XL01]的形成(参见图26)。
实施例158.叠氮-IL15 PF19与Rit-v10-[145-PF02]-[XL01]缀合以获得具有2:1:1分子形式的rit-v10-[145-PF02]-[XL01-PF19](CDR:hOKT3:IL15)
将Rit-v10-[145-PF02]-[XL01](9.8μL，9.8mg/mL的PBS溶液)与叠氮-IL15 PF19(4.49μL，7.2mg/mL的pH 7.5的PBS溶液)在室温下孵育过夜。SDS-PAGE分析证实了预期产物Rit-v10-[145-PF02]-[XL01-PF19]的形成(参见图26)。
实施例159.芳基叠氮-IL15Rα-IL15 PF13与rit-v10-[145-PF02]-[XL01]缀合以获得具有2:1:1分子形式的Rit-v10-[145-PF02]-[XL01-PF13](CDR:hOKT3:IL15Rα-IL15)
将Rit-v10-[145-PF02]-[XL01](9.8μL，9.8mg/mL的PBS溶液)与芳基叠氮-IL15Rα-IL15 PF13(10.6μL，2.6mg/mL的pH 7.5的PBS溶液)在室温下孵育过夜。SDS-PAGE分析证实了预期产物Rit-v10-[145-PF02]-[XL01-PF13]的形成(参见图26)。
实施例160.将双-叠氮-MMAF LD10与trast-v1a-145缀合以获得具有2:1分子形式的中间体trast-v1a-145-(LD10)1(CDR:MMAF)和未反应的叠氮化物
向trast-v1a-145(150μL，1mg，6.7mg/mL的pH 7.4的PBS溶液)的溶液中加入双-叠氮-MMAF(LD10，50μL，1.33mM的DMF溶液，相较于IgG为10当量)。将反应物在室温下孵育16小时，然后使用离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 10kDa，Merck Millipore)将缓冲液交换为PBS pH 7.4，浓度为20.7mg/mL。对IdeS消化后的样品进行质谱分析示出一种对应于通过分子内交联获得的缀合的ADC trast-v1a-145-(LD10)1的主产物(观测质量：51455Da)。
实施例161.将BCN-IL15 PF33与trast-v1a-145-(LD10)1缀合以获得具有2:1:1分子形式的trast-v1a-145-(LD10)1-(PF33)1(CDR:MMAF:IL15)
将Trast-v1a-145-(LD10)1(0.075mg，20.7mg/mL的PBS溶液)与BCN-IL15(PF33)(3.69μL，8.2mg/mL的pH 7.5的PBS溶液)在室温下孵育过夜。对IdeS处理后的样品进行质谱分析示出一种对应于预期产物trast-v1a-145-(LD10)1-(PF33)1的主Fc/2产物(观测质量：66472Da)。
实施例162.将BCN-IL15Rα-IL15 PF15与trast-v1a-145-(LD10)1缀合以获得具有2:1:1分子形式的trast-v1a-145-(LD10)1-(PF15)1(CDR:MMAF:IL15Rα-IL15)
将Trast-v1a-145-(LD10)1(0.075mg，20.7mg/mL的PBS溶液)与BCN-IL15Rα-IL15PF15(7.47μL，6.7mg/mL的pH 7.5的PBS溶液)在室温下孵育过夜。对IdeS处理后的样品进行质谱分析示出一种对应于预期产物trast-v1a-145-(LD10)1-(PF15)1的主Fc/2产物(观测质量：76494Da)。
实施例163.将hOKT3-BCN(201)与trast-v1a-145-(LD10)1缀合以获得具有2:1:1分子形式的trast-v1a-145-(LD10)1-(201)1(CDR:MMAF:hOKT3)
将Trast-v1a-145-(LD10)1(0.075mg，20.7mg/mL的PBS溶液)与hOKT3-BCN 201(5.25μL，11mg/mL的pH 5.5的PBS溶液)在室温下孵育过夜。对IdeS处理后的样品进行质谱分析示出一种对应于预期产物trast-v1a-145-(LD10)1-(201)1的主Fc/2产物(观测质量：79280Da)。
实施例164.将hOKT3-PEG11-四嗪PF01与trast-v9a-145缀合以获得具有2:1分子形式的中间体trast-v9a-145-PF01(CDR:hOKT3)
向trast-v9a-145(127μL，1.2mg，7.88mg/mL的pH 7.4的PBS溶液)的溶液在加入hOKT3-PEG11-四嗪PF01(59μL，0.4mg，230μM的pH 6.5的PBS溶液，相较于IgG为2当量)。将反应物在室温下孵育过夜。对IdeS处理后的样品进行质谱分析示出一种对应于trast-v9a-145-PF01的交联Fc/2片段的主Fc/2产物(观测质量：78297Da)，其中两个Cys239残基与半胱氨酸形成二硫化物。使用离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 100kDa，MerckMillipore)将trast-v9a-145-PF01与PBS+10mM EDTA进行旋滤，以移除残余的hOKT3-PEG11-四嗪PF01。
将trast-v9a-145-PF01与双-mal-MMAE LD09分子内交联以获得具有2:1:1分子形式的trast-v9b-[145-PF01]-[LD09](CDR:hOKT3；MMAE)
将Trast-v9a-145-PF01(0.85mg，17mg/mL的PBS溶液+10mM EDTA)与TCEP(4.9μL，10mM的MQ溶液)在37℃下孵育2小时。使用离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mL MWCO 10kDa，Merck Millipore)将还原的抗体与PBS+10mM EDTA进行旋滤，然后稀释至50μL。随后，加入DHA(4.9μL，10mM的MQ:DMSO(9:1)溶液)，将反应物在室温下孵育3小时。向部分反应混合物(0.17mg，10μL)中加入双-mal-MMAE LD09(1.5μL，2mM的DMF溶液，3当量)，然后在室温下孵育1.5小时。对IdeS处理后的样品进行质谱分析示出一种对应于预期产物trast-v9b-[145-PF01]-[LD09]的主Fc/2产物(观测质量：79857Da)。
序列表
C-端分选酶A识别序列的序列鉴定(SEQ.ID NO:1)：
GGGGSGGGGSLPETGGHHHHHHHHHH
分选酶A的序列鉴定(SEQ.ID NO:2):
TGSHHHHHHGSKPHIDNYLHDKDKDEKIEQYDKNVKEQASKDKKQQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRDVKPTDVGVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFVATEVK
His6-TEV位点-GGG-IL15Rα-IL15的序列鉴定(SEQ.ID NO:3)：
MGSSHHHHHHSSGENLYFQGGGITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
抗-4-1BB PF31的序列鉴定(SEQ.ID NO:4)：
DIVMTQSPPTLSLSPGERVTLSCRASQSISDYLHWYQQKPGQSPRLLIKYASQSISGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQDGHSFPPTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSSYWMHWVRQAPGQRLEWMGEINPGNGHTNYSQKFQGRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFTTARAFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSLPETGGHHHHHH
SYR-(G4S)3-IL15(PF18)的序列鉴定(SEQ.ID NO:5)：
SYRGGGGSGGGGSGGGGSNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
SYR-(G4S)3-IL15Rα-接头-IL15的序列鉴定(PF26)(SEQ.ID NO:6)：
SYRGGGGSGGGGSGGGGSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSGGSGGGGSGGGSGGGGSLQNWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS

Claims (23)

1.一种含有至少一种抗体Ab和两种不同的有效负载D1和D2的多功能抗体构建体，其中构建体具有结构(1)或(2)：
其中：
-Ab为抗体；
-L1、L2、L3、L4和L5为接头；
-x1和x2各自独立地为1-8范围内的整数，其中x1+x2＝2-10；
-BM为支链部分；
-m和n各自独立地为0或1；
-x3为1-4范围内的整数；
-D1和D2为两个不同的选自多肽、小分子、细胞毒素和寡核苷酸的有效负载，其中D1和D2中的至少一个是多肽。
2.根据权利要求1所述的多功能抗体构建体，其中所述多肽选自Fab、VHH、scFv、双特异抗体、微抗体、亲和体、affylin、affimers、atrimers、菲诺体、Cys-knot、DARPin、adnectin/centryin、knotin、抗运载蛋白、FN3、Kunitz结构域、OBody、双环肽和三环肽。
3.根据前述任一项权利要求所述的多功能抗体构建体，其中所述多肽选自免疫细胞接合器、检查点抑制剂和细胞表面受体粘合剂，优选地，其中所述多肽为免疫细胞接合多肽或检查点抑制多肽。
4.根据权利要求3所述的多功能抗体构建体，其中所述多肽为免疫细胞接合多肽或检查点抑制多肽，优选地，其中：
-免疫细胞接合多肽对T细胞上的细胞受体具有特异性，优选地，其中T细胞上的细胞受体选自CD3、CD28、CD137(4-1BB)、CD134、CD27、Vγ9Vδ2和ICOS；或
-免疫细胞接合多肽对NK细胞上的细胞受体具有特异性，优选地，其中NK细胞上的细胞受体选自CD16、CD56、CD335、
CD336、CD337、CD28、NKG2A、NKG2D、NKp46、KIR、DNAM-1和CD161；或
-免疫细胞接合多肽对单核细胞或巨噬细胞上的细胞受体具有特异性，优选地，其中单核细胞或巨噬细胞上的细胞受体为CD64；或
-免疫细胞接合多肽对粒细胞上的细胞受体具有特异性，优选地，其中粒细胞上的细胞受体为CD89；或
-免疫细胞接合多肽对IL2或IL15具有特异性；或
-检查点抑制多肽对CTLA-4、PD-1、PD-L1、TIGIT、TIM-3、LAG-3或VISTA具有特异性。
5.根据前述任一项权利要求所述的多功能抗体构建体，其中所述多肽选自OKT3、L2K、UCHT1、BMA031、VHH 6H4、IL2、IL15、IL15/IL15R复合体、IL15/IL15R融合体、IL2特异性抗体和IL15特异性抗体，优选地，其中所述多肽为OKT3、L2K、IL15/IL15R融合体、IL15、mAb602、Nara1或TCB2。
6.根据前述任一项权利要求所述的多功能抗体构建体，其中L1和/或L2，或L3具有结构(L-A)：
其中
-标有*的键与抗体Ab的两个不同氨基酸连接，标有**的键与D1、D2或BM连接；
-L6、L7和L8为接头；
-p和q各自独立地为1或0；
-BM1为支链部分；
-Z为连接基团。
7.根据前述任一项权利要求所述的多功能抗体构建体，其中每个接头独立地选自直链或支链的C1-C200亚烷基、C2-C200亚烯基、C2-C200亚炔基、C3-C200环亚烷基、C5-C200环亚烯基、C8-C200环亚炔基、C7-C200烷基亚芳基、C7-C200芳基亚烷基、C8-C200芳基亚烯基、C9-C200芳基亚炔基及它们的组合，其中亚烷基、亚烯基、亚炔基、环亚烷基、环亚烯基、环亚炔基、烷基亚芳基、芳基亚烯基、芳基亚烯基和芳基亚炔基可以被一个或多个杂原子取代和间断，优选地其中所述杂原子选自O、S(O)y和NR12，其中y为0、1或2，且R12独立地选自氢、卤素、C1-C24烷基、C6-C24(杂)芳基、C7-C24烷基(杂)芳基和C7-C24(杂)芳基烷基。
8.根据前述任一项权利要求所述的多功能抗体构建体，其中L1和/或L2或者L4和/或L5在肿瘤溶酶体或肿瘤微环境中为可裂解的，其中可裂解接头优选含有结构(26)的肽间隔基：
其中，R17代表氨基酸侧链，n为1-10范围内的整数，优选地，其中接头可通过存在的蛋白水解酶进行裂解，所述蛋白水解酶选自以下：FAP、组织蛋白酶、颗粒酶、胱门蛋白酶、kallikereins、前蛋白转化酶枯草溶菌素、弗林蛋白酶、弹性蛋白酶、天冬氨酰内肽酶、成纤维细胞活化蛋白、组织型纤溶酶原激活剂、尿激酶、基质金属蛋白酶和蛋白裂解酶，和/或其中所述间隔基选自以下：Val-Cit、Val-Ala、Val-Lys、Val-Arg、Val-Gln、AcLys-Val-Cit、AcLys-Val-Ala、Phe-Cit、Phe-Ala、Phe-Lys、Phe-Arg、Phe-Gln、Ala-Lys、Leu-Cit、Leu-Gln、Ile-Cit、Trp-Cit、Ala-Ala-Asn、Ala-Asn、Pro-Leu-Gly、Asn-Pro-Val、Lys-Ser-Gly-Arg-Ser-Asp-Asn-His、Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly、Val-Lys-Gly、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Phe-Gly和Lys。
9.根据前述任一项权利要求所述的多功能抗体构建体，其中每个L4、L5、L6和L7具有结构-(L21)n-(L22)o-(L23)p-(L24)q-，其中L21、L22、L23和L24为接头，它们一起形成L4、L5、L6和L7；n、o、p和q均独立地为0或1，其中：
(a)接头L21由-(W)k1-(A)d1-(B)e1-(A)f1-(B)g1-C(O)-表示，其中：
-d1＝0或1；
-e1＝0-10范围内的整数；
-f1＝0或1；
-g1＝0-10范围内的整数；
-k1＝0或1，条件是，如果k1＝1，则d1＝0；
-A为根据结构(23)的磺酰胺基团
其中，a1＝0或1，且R13选自氢、C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基，所述C1-C24烷基、C3-C24环烷基、C2-C24(杂)芳基、C3-C24烷基(杂)芳基和C3-C24(杂)芳基烷基被一个或多个选自O、S和NR14的杂原子任选取代和任选间断，其中R14独立地选自氢和C1-C4烷基，或者，R13可以通过间隔基部分将D与N连接；
-B为-CH2-CH2-O-或-O-CH2-CH2-部分，或(B)e1为-(CH2-CH2-O)e3-CH2-CH2-部分，其中e3的定义与e1相同；
-W为-OC(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-、-C(O)(CH2)mC(O)-、-C(O)(CH2)mC(O)NH-或-(4-Ph)CH2NHC(O)(CH2)mC(O)NH-，其中m为0-10范围内的整数；
(b)接头L21为肽间隔基，优选二肽，其中L22通过一般结构(27)表示：
其中，R17＝CH3或CH2CH2CH2NHC(O)NH2；
(c)接头L23为自凋亡间隔基，优选地，其为根据结构(25)的对氨基苄氧基(PAB)衍生物
其中
-A为任选取代的5或6元芳香族或杂芳环；
-b为0或1；
-R3为H、R4或C(O)R4，其中R4为C1-C24(杂)烷基、C3-C10(杂)环烷基、C2-C10(杂)芳基、C3-C10烷基(杂)芳基和C3-C10(杂)芳基烷基，它们任选地被一个或多个选自O、S和NR5的杂原子任选取代和任选间断，其中R5独立地选自氢和C1-C4烷基，
优选地，其中R3为H或C(O)R4，其中R4＝4-甲基哌嗪或吗啉，
最优选地，R3为H；并且
(d)接头L24为根据结构-N-(Cx-亚烷基)-C(O)-的氨基烷酸间隔基，
其中x为1-10范围内的整数；或者
接头L24为根据结构-N-(CH2-CH2-O)e6-(CH2)e7-C(O)-的亚乙基乙二醇间隔基，其中e6为1-10范围内的整数，e7为1-3范围内的整数。
10.根据前述任一项权利要求所述的多功能抗体构建体，其中含有连接基团Z的接头L1、L2和L3可通过缀合反应获得，优选地，其中它们各自通过缀合反应获得，优选地缀合反应选自亲核反应和环加成反应，优选地，其中所述环加成反应为[4+2]环加成反应或1,3-二极环加成反应，或亲核反应为迈克尔加成反应或亲核取代反应。
11.根据权利要求10所述的多功能抗体构建体，其中每个连接基团含有三唑、环己烯、环己二烯、[2.2.2]-双环辛二烯、[2.2.2]-双环辛烯、异噁唑啉、异噁唑烷、吡唑啉、哌嗪、硫醚、琥珀酰亚胺环或开环的琥珀酸酰胺、酰胺或亚胺基团。
12.根据前述任一项权利要求所述的多功能抗体构建体，其中L1和L2中的至少一个，优选两个具有结构(L-B)或(L-C)：
*-GlcNAc(Fuc)d-(G)e-Su-Z-(L21)n-(L22)o-(L23)p-(L24)q-**
(L-B)
*-Z-(L21)n-(L22)o-(L23)p-(L24)q-**
(L-C)
其中
-标有*的键与抗体Ab的两个不同氨基酸连接，标有**的键与D1或D2连接；
-d、n、o、p和q各自独立地为0或1；
-e为0-10范围内的整数；
-L21、L22、L23和L24为权利要求9中定义的接头；
-Su为单糖；
-G为单糖部分；
-GlcNAc为N-乙酰氨基葡萄糖部分；
-Fuc为岩藻糖部分；
-Z为连接基团。
13.根据前述任一项权利要求所述的多功能抗体构建体，其中L4和L5具有结构(L-D)
**-(L21)n-(L22)o-(L23)p-(L24)q-***
(L-D)
其中
-标有**的键与BM连接，标有***的键与D1或D2连接；
-n、o、p和q各自独立地为0或1；
-L21、L22、L23和L24为权利要求9中定义的接头；
其中，接头L4和L5可在任一连接单元L21、L22、L23和L24的连接处进一步含有连接基团Z。
14.根据权利要求1-11中任一项所述的多功能抗体构建体，其具有结构(3)：
其中：
-d和p各自独立地为0或1；
-e为0-10范围内的整数；
-L6和L7为接头；
-BM1为支链部分；
-Su为单糖；
-G为单糖部分；
-GlcNAc为N-乙酰氨基葡萄糖部分；
-Fuc为岩藻糖部分；
-Z1为连接基团。
15.根据权利要求1-11中任一项所述的多功能抗体构建体，其具有结构(4)：
其中：
-d和p各自独立地为0或1；
-e为0-10范围内的整数；
-L6、L7和L14为接头；
-BM1为支链部分；
-Su为单糖；
-G为单糖部分；
-GlcNAc为N-乙酰氨基葡萄糖部分；
-Fuc为岩藻糖部分；
-Z1和Z2为连接基团。
16.根据权利要求1-11中任一项所述的多功能抗体构建体，其具有结构(5)：
其中：
-每个d独立地为0或1；
-e为0-10范围内的整数；
-L15和L16为接头；
-Su为单糖；
-G为单糖部分；
-GlcNAc为N-乙酰氨基葡萄糖部分；
-Fuc为岩藻糖部分；
-Z1和Z2为连接基团；并且
-x1和x2各自独立地为1、2或3。
17.根据权利要求1-11中任一项所述的多功能抗体构建体，其具有结构(6)：
其中：
-每个d独立地为0或1；
-e为0-10范围内的整数；
-L14和L15为接头；
-Su为单糖；
-G为单糖部分；
-GlcNAc为N-乙酰氨基葡萄糖部分；
-Fuc为岩藻糖部分；
-Z1和Z2为连接基团；
-x1为1-4范围内的整数。
18.根据权利要求1-11中任一项所述的多功能抗体构建体，其具有结构(7)：
其中：
-每个d独立地为0或1
-e为0-10范围内的整数；
-L17为接头；
-BM为支链部分；
-Su为单糖；
-G为单糖部分；
-GlcNAc为N-乙酰氨基葡萄糖部分；
-Fuc为岩藻糖部分；
-Z为连接基团。
19.根据前述任一项权利要求所述的多功能抗体构建体，其中：
(i)D1为CD3靶向多肽，D2为CD28靶向多肽；
(ii)D1为IL15或IL15靶向多肽，D2为CD16靶向多肽；
(iii)D1为IL2或IL2靶向多肽，D2为CD16靶向多肽；
(iv)D1为NKp46靶向多肽，D2为CD16靶向多肽；
(v)D1为细胞毒素，D2为检查点抑制剂，优选选自靶向CTLA-4、TIGIT、LAG-3、TIM-3、VISTA、PD-1或PD-L1的多肽；
(vi)D1为OX40靶向多肽，D2为CD137靶向多肽；
(vii)D1为PD-L1靶向多肽，D2为CD137靶向多肽；
(viii)D1为细胞毒素，D2为IL15或IL15靶向多肽；
(ix)D1为细胞毒素，D2为IL2或IL2靶向多肽；
(x)D1为细胞毒素，D2为CD16靶向多肽；或
(xi)D1为TLR7-激动剂或TRL8-激动剂，D2为CD16-靶向多肽。
20.根据前述任一项权利要求所述的多功能抗体构建体，其中抗体Ab抗体对肿瘤细胞上的细胞外受体具有特异性，优选地，其中肿瘤细胞上的细胞外受体选自5T4、ADAM-9、AMHRII、ASCT2、ASLG659、ASPHD1、av-整合素、Axl、B7-H3、B7-H4、BAFF-R、BCMA、BMPR1B、短小蛋白聚糖、c-KIT、c-Met、C4.4a、CA-IX、钙粘着蛋白-6、CanAg、CD123、CD13、CD133、CD138/多配体蛋白聚糖-1、CD166、CD19、CD20、CD203c、CD205、CD21、CD22、CD228、CD25、CD30、CD324、CD33、CD37、CD38、CD45、CD46、CD48a、CD56、CD70、CD71、CD72、CD74、CD79a、CD79b、CEACAM5、封闭蛋白-18.2、封闭蛋白-6、CLEC12A、CLL-1、Cripto、CRIPTO、CS1、CXCR5、DLK-1、DLL3、DPEP3、E16、EGFR、ENPP3、EpCAM、EphA2、EphB2R、ETBR、FAP、FcRH1、FcRH2、FcRH5、FGFR2、纤连蛋白、FLT3、叶酸受体α、Gal-3BP、GD3、GDNF-Ra1、GEDA、GFRA1、Globo H、gpNMB、GPR172A、GPR19、GPR54、鸟苷酸环化酶C、HER2、HER3、HLA-DOB、IGF-1R、IL13R、IL20Rα、Lewis Y、LGR5、LIV-1、LRRC15、LY64、Ly6E、Ly6G6D、LY6K、MDP、MFI2、MICA/B、MOSPD2、MPF、MSG783、MUC1、MUC16、NaPi2b、NCA、粘连蛋白-4、Notch3、P-钙粘着蛋白、P2X5、PD-L1、PMEL17、PRLR、PSCA、PSCA hlg、PSMA、PTK7、RET、RNF43、RON、ROR1、ROR2、Sema 5b、SLITRK6、SSTR2、STEAP1、STEAP2、TAG72、TENB2、TF、TIM-1、TM4SF、TMEFF、TMEM118、TMEM46、转铁蛋白、TROP-2、TrpM4、TWEAKR、受体酪氨酸激酶(RTK)、腱生蛋白。
21.根据前述任一项权利要求所述的多功能抗体构建体，其用于医药。
22.根据权利要求1-20中任一项所述的多功能抗体构建体，其用于治疗癌症、病毒感染、细菌感染、神经系统疾病、自身免疫疾病、眼病、高胆固醇血症和淀粉样变性，优选用于治疗癌症。
23.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-20中任一项所述的多功能抗体构建体和药学上可接受的载体。
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