JP2024506022A - 多機能性抗体 - Google Patents

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ゲール， レモン ファン
マリア， アントニア ヴァイデベン，
ウィレム， ヨハネス， ペトルス ヴグ，
ベーヴァー， ローリーン デ
ソラヤ ポパル，
ジョリン フーゲンブーム，
バーケル， サンダー， セバスティアーン ファン
デルフト， フロリス， ルイス ファン
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シンアフィックス ビー．ブイ．
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Abstract

本発明は、構造（１）または（２）の、少なくとも１つの抗体Ａｂと、２つの別個のペイロードＤ１およびＤ２と、を含む多機能性抗体構築物に関する。本発明に係る多機能性抗体構築物は、癌、ウイルス感染症、細菌感染症、神経疾患、自己免疫疾患、眼疾患、高コレステロール血症およびアミロイドーシスの治療における使用などの、医薬における使用に適している。（式中、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５は、リンカーであり；ｘ１およびｘ２は、それぞれ個別に１～８の範囲の整数であり、ｘ１＋ｘ２＝２～１０であり；ＢＭは、分枝部分であり；ｍおよびｎは、それぞれ独立して、０または１であり；ｘ３は、１～４の範囲の整数であり；Ｄ１およびＤ２は、ポリペプチド、小分子、細胞毒およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される２つの別個のペイロードであり、Ｄ１およびＤ２のうちの少なくとも１つは、ポリペプチドである。）TIFF2024506022000093.tif31149【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明
［発明の分野］
[0001]本発明は、複数の機能を有する抗体に関する。より具体的には、本発明は、２つ（またはそれ以上）の機能性部分が、結合の前に抗体の遺伝子操作を必要とせずに抗体に結合している構築物および組成物に関し、その機能性部分は、細胞毒、ポリペプチドまたは他のペイロードを含み得る。得られた多機能性抗体構築物は、例えば、治療法において有用であり得る。
［発明の背景］
[0002]慎重に選択された生物学的受容体に対するタンパク質リガンドとしてのモノクローナル抗体は、疾患領域または特定の病原体に対する選択的インビボ標的化のための理想的な送達プラットフォームを提供する。抗体（リガンドとしても知られる）は、低分子タンパク質フォーマット（ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディなど）であり得るが、一般に、所与の抗原に対する高い選択性および親和性、長い循環半減期、ならびに免疫原性がほとんどまたは全くないことに基づいて選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。例えば、特定の癌関連抗原と選択的に結合すると知られているモノクローナル抗体は、結合、内部移行、細胞内プロセシング、および最終的には活性な異化産物の放出を介して、化学的にコンジュゲートされた細胞傷害剤を腫瘍に送達するために使用することができる。細胞傷害剤は、小分子毒素、タンパク質毒素、またはオリゴヌクレオチドのような他のフォーマットであり得る。結果として、抗体によって標的化されていない正常細胞を残しながら、腫瘍細胞を選択的に根絶することができる。同様に、抗体への抗菌薬（抗生物質）の化学的コンジュゲーションは、細菌感染症の治療に適用することができ、抗炎症薬のコンジュゲートは、自己免疫疾患の治療のために研究中であり、例えば、抗体へのオリゴヌクレオチドの結合は、神経筋疾患を治療するための有望な潜在的アプローチである。ゆえに、最適な特定の細胞位置への活性な薬学的薬物の標的化送達の概念は、同じ薬物の全身送達と比べて多くの有益な態様を有する、広範囲の疾患の治療のための強力なアプローチである。
[0003]特定のタンパク質作用物質の標的化送達のためにモノクローナル抗体を使用する代替ストラテジーは、組換えＤＮＡ技術による抗体への後者のタンパク質の遺伝的融合、例えば、軽鎖もしくは重鎖（またはその両方）のＮ末端もしくはＣ末端、または２つの抗体ドメイン間での遺伝的融合によるものである。この場合、目的の生物学的に活性なタンパク質、例えば、シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ３８）のようなタンパク質毒素または抗ＣＤ３一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、場合によってはペプチドスペーサーを介してであるが必ずしもそうではない、抗体との融合物として遺伝的にコードされるので、その抗体は、融合タンパク質として発現される。ペプチドスペーサーは、プロテアーゼ感受性の切断部位を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
[0004]モノクローナル抗体はまた、タンパク質配列自体において遺伝子改変されることにより、その構造が改変され得、それによって特定の特性が導入（または除去）され得る。例えば、Ｆｃ－ガンマ受容体への結合を無くす（ｎｉｈｉｌａｔｅ）ために抗体Ｆｃフラグメントに変異を作ることができるか、ＦｃＲｎ受容体への結合もしくは特定の癌標的への結合を調節することができるか、またはｐＩを低下させ、循環からのクリアランス速度を制御するように抗体を操作することができる。
[0005]治療上の処置における新たなストラテジーは、参照により援用されるＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ ２０１５，２０，８３８－８４７に要約されているように、複数の抗原またはエピトープに同時に結合することができる抗体、いわゆる二重特異性抗体（２つの異なる抗原またはエピトープに同時に対処する）または三重特異性抗体（エピトープの３つの異なる抗原に対処する）などの使用を含む。「２標的」機能を有する二重特異性抗体は、例えば、癌、増殖または炎症過程に関連する複数の表面受容体またはリガンドを干渉し得る。二重特異性抗体はまた、１つの細胞上でのタンパク質複合体形成を支援するために、または細胞間の接触を引き起こすために、標的を近接して配置することができる。「強制接続」機能の例は、凝固カスケードにおけるタンパク質複合体形成を支持する二重特異性抗体、または腫瘍によって標的化される免疫細胞動員因子および／もしくは活性化因子である。二重特異性抗体は、作製方法および構造に応じて、抗原結合部位の数、幾何形状、血清中の半減期およびエフェクター機能が異なる。この点において、二重特異性は、二価と混同されるべきではなく、二価は、対称的なＩｇＧが２つの同一のＣＤＲのそれぞれを介して同時に２つの同一の標的に結合できることを指す。
[0006]二重特異性抗体または三重特異性抗体はまた、さらなる機能、例えば、細胞傷害剤、ポリペプチドサイトカイン、オリゴヌクレオチド、抗生物質または抗ウイルス剤を含み得る。これにより、二重特異性抗体が三機能性分子に、三重特異性抗体が四機能性分子に効果的に変換されるなどする。多機能性抗体における異なる機能はそれぞれ、結合、シグナル伝達、免疫細胞結合、エフェクター機能の誘導、チェックポイント阻害、細胞活性化、細胞のダウンレギュレーション、細胞殺滅、遺伝子サイレンシング、遺伝子活性化を含むがこれらに限定されない特異的な生物学的機能を有する。異なる機能は、特異的な生物学的応答を誘導するように独立して作用することができるか（相加効果）、またはそれらの活性を相互に増強することができる（相乗効果）。
[0007]参照により援用される、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ ２０１５，２０，８３８－８４７およびＹｕ ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１９，１４５，９４１－９５６によって要約されるように、多機能性抗体のための広範囲の種々のフォーマットが長年にわたって開発されており、これはＩｇＧ様（Ｆｃフラグメントを有する）フォーマットと非ＩｇＧ様（Ｆｃフラグメントを欠く）フォーマットとに大別することができる。ほとんどの二重特異性抗体は、２つのハイブリドーマ株の体細胞融合（クワドローマ）、遺伝子（タンパク質／細胞）工学、または架橋剤を用いた化学的コンジュゲーションによる３つの方法のうちの１つによって作製され、今日では合計６０を超える種々の技術プラットフォームがある。
[0008]完全ＩｇＧ分子構造に基づくＩｇＧ様フォーマットとしては、二重可変ドメイン（ＤＶＤ－Ｉｇ）を有するＩｇＧ、Ｄｕｏｂｏｄｙ技術、ノブインホール（ＫＩＨ）技術、一般的な軽鎖技術およびクロスｍＡｂ技術が挙げられるがこれらに限定されず、切断型ＩｇＧバージョンには、ＡＤＡＰＴＩＲ、ＸｍＡｂおよびＢＥＡＴ技術が含まれる。非ＩｇＧ様アプローチとしては、ＢＩＴＥ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂおよびＩｍｍＴＡＣ技術が挙げられるが、これらに限定されない。二重特異性抗体または三重特異性抗体はまた、異なる抗原結合部分（例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂ）を他のタンパク質ドメインに融合することによって作製することもでき、これによりさらなる機能を含めることが可能になる。例えば、２つのｓｃＦｖフラグメントがアルブミンに融合され、これにより、参照により援用されるＭｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００７，２８２，１２６５０－１２６６０によって実証されているように、それらの抗体フラグメントに長い血清アルブミンの循環時間が付与される。別の例は、参照により援用されるＲｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００６，１０３，６８４１－６８４６によって報告されているように、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡおよびプロテインＡキナーゼアンカータンパク質のヘテロ二量体化に基づく「ドックアンドロック」アプローチである。Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１２，２３，３０９－３２３によって示されているように、これらのドメインをＦａｂフラグメントおよび抗体全体に連結して、多価の二重特異性抗体を形成することができる。ドックアンドロックストラテジーには、プロテインＡキナーゼアンカータンパク質上にドッキングするために標的化抗体とペプチドフラグメントとの間の融合タンパク質の作製が必要である。治療用Ａｂフラグメント（ｓｃＦｖ、ダイアボディ）はまた、アルブミンまたはアルブミンに結合するタンパク質と融合され得、これにより、血液中の薬物の半減期が最大５～６倍増加する。そのような分子の構築は、予測不可能な結果をもたらし、それにより、異なるＡｂフラグメントの融合または他のタンパク質へのＡｂの結合の結果として作製される二重特異性抗体は、新しい治療分子の研究開発における適用が制限されている。
[0009]この意味で一般的に用いられるわけではないが、対称的なＹ字型ＩｇＧ抗体はいずれも、そのＦｃドメインに複合体Ｎ－グリカンを有する場合には、二重特異性抗体と見なすことができるだろう。そのような抗体は、（ａ）そのポリペプチド補体依存性領域（ＣＤＲ）を介して特異的抗原に、ならびに（ｂ）そのＮ－グリカンを介してＣＤ６４、ＣＤ３２およびＣＤ１６としても知られる様々なＦｃ－ガンマ受容体Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩに同時に結合することができる。例えば、トラスツズマブは、癌細胞上のＨＥＲ２抗原に結合する抗体であって、エフェクター機能、すなわち抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）（これらはすべて、その複合体Ｎ－グリカンが特定のタンパク質または受容体に結合することによってプライミングされる）によってその生物学的効果を（少なくとも部分的に）発揮する抗体である。同様に、任意の二重特異性抗体が、（ａ）２つの異なる特異的抗原（またはエピトープ）および（ｂ）免疫細胞受容体（そのグリカン）に結合することができる場合、それらを三重特異性と見なすことができる。例えば、カツマキソマブは、細胞表面受容体ＥｐＣａｍとＣＤ３とに同時に結合することができ、そのため、二重特異性抗体である公知の抗体である。それにもかかわらず、カツマキソマブは、抗体Ｆｃ部分に結合したその複雑なＮ－グリカンのおかげでＮＫ細胞上のＣＤ１６に同時に結合できることに起因して三重特異性抗体と呼ばれることが多い。誤解を避けるために、二重特異性抗体は、抗体がそのＦｃ領域において、Ｆｃ－ガンマ受容体へのＮ－グリカンの結合を無くすように変異されているか、またはＮ－グリカンの完全な除去などの別の手段によってＦｃサイレントにされている場合、決して三重特異性とは見なされない。
[0010]真の意味における多機能性抗体、すなわちＦｃ－グリカンの結合のことを指さず、同時に複数の標的に結合するＣＤＲを有することを指す多機能性抗体は、当該分野で公知であり、例えば、参照により援用されるＷｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃａｎｃｅｒ ２０２０，１，８６－９８には、ＣＤ３８、ＣＤ３およびＣＤ２８に結合する三重特異性三機能性融合ＩｇＧ抗体が記載されている。同様に、ＣＤＲ－Ｌｉｆｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｒ－ｌｉｆｅ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／＃ｐｉｐｅｌｉｎｅ）は、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１およびＣＤ３を標的とする三重特異性三機能性抗体を開発中である。Ｎｕｍａｂ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（ｗｗｗ．ｎｕｍａｂ．ｃｏｍ）は、ＰＤ－Ｌ１、ＨＥＲ－２、ＣＤ－３およびＨＳＡに結合する四価四機能性抗体を報告した。
[0011]二重特異性三機能性抗体も当該分野で公知であり、例えば、Ａｆｆｉｍｅｄ（ｗｗｗ．ａｆｆｉｍｅｄ．ｃｏｍ）は、２つの異なる抗原（例えば、ＣＤ２００およびＢＣＭＡ）ならびにＣＤ１６に結合することができる抗体に基づくａＴｒｉＦｌｅｘ技術を開発した。同様に、ＧＴ Ｂｉｏｐｈａｒｍａも、参照により援用されるＶａｌｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６，２２，３４４０－３４５１によって記載されているように、サイトカイン（ＩＬ－１５）に融合した２つの抗体フラグメント（抗ＣＤ３３および抗ＣＤ１６）の融合に基づく二重特異性三機能性タンパク質を開発中である。ＩＬ－１５に融合したＢ７－Ｈ３およびＣＤ１６に結合する類似の三機能性構築物は、参照により援用されるＶａｌｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒｓ ２０２０，１２，２６５９－２６７７に記載されている。例えば、参照により援用されるＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２０１６，２９，１１７－１２９によってＭＥＤＩ４２７６について報告されているような、二重特異性三機能性抗体－薬物コンジュゲートも当該分野で公知である。二重特異性三機能性抗体－薬物コンジュゲートの別の例は、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ（ｗｗｗ．ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ．ｃｏｍ）によって開発されたＺＷ４９であり、これは、ＨＥＲ－２上の２つの異なるエピトープを標的とし、アウリスタチンペイロードにコンジュゲートされた二パラトープ抗体に基づく。第３の例は、Ｍｅｒｃｋ－Ｓｅｒｏｎｏによって開発された、ＭＵＣ－１およびＥＧＦＲを標的とし、ヘミアステリン細胞傷害性ペイロードにコンジュゲートされた、二重特異性抗体であるＭ１２３１である。
[0012]本明細書では、Ｆｃ－ガンマ受容体にも結合できる任意の単一特異性ＩｇＧ抗体を、単一特異性二機能性と呼び、二重特異性抗体を二重特異性三機能性と呼ぶ。同じ理由で、Ｆｃサイレントである単一特異性または二重特異性ＩｇＧ抗体を、それぞれ単一特異性単機能性抗体または二重特異性二機能性抗体と呼ぶ。サイトカイン、オリゴヌクレオチドまたは細胞傷害性ペイロードにコンジュゲートされた（任意のタイプの）単一特異性抗体を、二機能性と呼び、サイトカイン、オリゴヌクレオチドまたは細胞傷害性ペイロードにコンジュゲートされた二重特異性ＩｇＧ抗体を、三機能性と呼ぶ。２つの異なる小分子、２つの異なるオリゴヌクレオチドもしくは２つの異なるペプチドフラグメント、またはこれらの組み合わせが共有結合している単一特異性抗体は、単一特異性三機能性と呼ばれる。
[0013]非ＩｇＧ型二重特異性抗体を作製するための化学的コンジュゲーションは、参照により援用されるＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８５，２２９，８１－８３によって初めて使用された：ウサギＩｇＧのペプシノリシスによって得られた２つのＦａｂ２フラグメントを還元し、次いで酸化して、二重特異性Ｆａｂ２を得た。同様に、システイン残基と相互作用するホモ二機能性試薬およびヘテロ二機能性試薬が、参照により援用されるＧｌｅｎｎｉｅ ｅｔ ａｌ．１９８７，１３９，２３６７－２３７５によって報告された。参照により援用されるＧａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２００５，３３，４５２－４５９によって示されるように、ＣＤ３およびＣＤ２０（リツキシマブ）に対するＡｂの化学的コンジュゲーションを使用して、二重特異性抗体でコーティングされた表面を有するＴ細胞を得た。二重特異性ＣＤ２０×ＣＤ３の作製は、ＯＫＴ３（抗ＣＤ３）をＴｒａｕｔ試薬で処理した後、マレイミド官能化リツキシマブ（リツキシマブをスルホスクシンイミジル４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）で前処理することによって得られる）と混合することによって確実にした。両方の抗体のランダムな化学的コンジュゲーションの後のランダムなヘテロ二量体化のおかげで、二重特異性抗体は、必然的に、非常に不均一な混合物（多量体も含む）として得られる。これまでに報告された、部位特異的でもある唯一の化学的方法は、参照により援用されるＤｏｐｐａｌａｐｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２００７，１７，５０１－５０６によって報告されたＣｏｖＸ－Ｂｏｄｙ技術であり、これは、アルドラーゼ触媒抗体部位を標的化抗体に設置した後、アゼチジノンモチーフで化学修飾されたペプチドフラグメントで処理して、自発的なライゲーションをもたらすことに基づく技術である。二重特異性抗体は、参照により援用されるＤｏｐｐａｌａｐｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１０，１０７，２２６１１－２２６１６によって報告されているように、ＶＥＧＦまたはアンジオポエチン２を阻害する２つの短いペプチドを分枝状リンカーに付加し、さらにＡｂに付加することによって作製された。
[0014]今日の化学的ＡｂまたはＡｂフラグメントコンジュゲーションに基づく二重特異性抗体作製のフォーマットは、特に（低純度の）生成物の収率が低いこと、および商品原価が高いことに起因して使用されていない。さらに、組換えＤＮＡ技術の進歩により、融合タンパク質の効率的な作製が可能になり、それによって肯定的な臨床結果が得られた。それにもかかわらず、非遺伝的化学修飾アプローチは、化学量論の部位特異性の適切な制御を保証できる場合には、臨床までの時間を有意に加速することができるだろう。
[0015]臨床開発されたまたは現在臨床開発中の二重特異性抗体（これらはすべてＦｃサイレントであり、したがって二機能性でもある）の例は、ブリナツモマブ（ＣＤ１９×ＣＤ３）、ＧＢＲ１３０２（Ｈｅｒ２×ＣＤ３）、ＭＥＤＩ－５６５（ＣＥＡ×ＣＤ３）、ＢＡＹ２０１０１１２（ＰＳＭＡ×ＣＤ３）、ＲＧ７２２１（アンジオポエチン×ＶＥＧＦ）、ＲＧ６０１３（ＦＩＸ×ＦＸ）、ＲＧ７５９７（Ｈｅｒ１×Ｈｅｒ３）、ＭＣＬＡ１２８（Ｈｅｒ２×Ｈｅｒ３）、ＭＭ１１１（Ｈｅｒ２×Ｈｅｒ３）、ＭＭ１４１（ＩＧＦ１Ｒ×Ｈｅｒ３）、ＡＢＴ１２２（ＴＮＦアルファ×ＩＬ１７）、ＡＢＴ９８１（ＩＬ１ａ×Ｉｌ１ｂ）、ＡＬＸ０７６１（ＩＬ１７Ａ×ＩＬ１７Ｆ）、ＳＡＲ１５６５９７（ＩＬ４×ＩＬ１３）、ＡＦＭ１３（ＣＤ３０×ＣＤ１６）およびＬＹ３１６４５３０（Ｈｅｒ１×ｃＭＥＴ）である。
[0016]癌治療の分野で一般的なストラテジーは、アップレギュレートされた腫瘍関連抗原（ＴＡＡまたは単に標的）に結合する１つのＣＤＲと、癌を破壊する免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）上に存在する受容体に結合する１つのＣＤＲとを含む二重特異性抗体の使用を使用する。そのような二重特異性抗体は、それぞれＴ細胞またはＮＫ細胞リダイレクト抗体としても知られている。免疫細胞をリダイレクトするアプローチは、すでに３０年以上前のものであるが、新しい技術は、第１世代の免疫細胞リダイレクト抗体の限界を克服しつつあり、特に、間欠投与を可能にする半減期の延長、免疫原性の低減、安全性プロファイルの改善をしつつある。現在、承認された薬物が１つあり（ブリナツモマブまたはＢｌｉｎｃｙｔｏ（登録商標））、３０を超える他の二重特異性フォーマットが様々な臨床開発段階にある。
[0017]重篤な疾患のための他の治療方法と同様に、治療用の二重特異性抗体は、種々の副作用を引き起こし、その最も一般的なものは、悪心、嘔吐、腹痛、疲労、白血球減少、好中球減少および血小板減少である。多くの患者において、治療用の二重特異性抗体に対するＡｂが、治療中に血液中に現れる。ほとんどの有害事象は、治療の初期に起こり、ほとんどの場合、副作用は、継続的な治療下で正常化する。治療用ＢｓＡｂの有害作用に関するデータの大部分は、ブリナツモマブおよびカツマキソマブで入手可能であるが、これはこれらの薬物が多数の臨床試験を経ているためである。ブリナツモマブおよびカツマキソマブ療法の一般的な副作用は、サイトカインレベルの上昇である「サイトカインストーム」およびいくつかの神経学的事象である。サイトカイン放出に関連する症状は、多くの治療用ｍＡｂの一般的な副作用であり、特定の作用機序：エフェクターとしての細胞傷害性Ｔ細胞の使用に起因して生じる。サイトカイン放出症候群の最小化は、その後の高用量、ならびにコルチコステロイド（デキサメタゾン）および抗ヒスタミン剤の前投薬と組み合わせて低初回量の薬物を用いることにより可能である。
[0018]免疫細胞関与療法に関連する有害事象、特にサイトカイン放出症候群を軽減する１つの方法、および漸増投薬レジメンの使用を回避する１つの方法が、参照により援用されるＢａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１８，２４，４７８５－４７９７によって報告された。有意により高い効力およびより安全な投与が、２：１の分子フォーマット、すなわち、ＣＤ２０への二価結合およびＣＤ３への一価結合を有するＣＤ２０×ＣＤ３ Ｔ細胞エンゲージャーを作製することによって達成され得、これは、完全ＩｇＧ抗ＣＤ２０抗体のＦａｂアームの１つに抗ＣＤ３フラグメントを挿入することによって達成されることが示された。得られる二重特異性抗体は、ＣＤ２０への高アビディティー二価結合ならびに２：１分子フォーマットのＢ細胞結合ドメインおよびＴ細胞結合ドメインのヘッドトゥーテール配向によって可能にされる長い半減期および高い効力に関連する。「ＰＧ ＬＡＬＡ」変異を有するヘテロ二量体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域を組み込むことにより、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）結合を維持しながら、Ｆｃｇ受容体および補体成分Ｃ１ｑへの結合を消失させて、長い循環半減期が可能になった。二重特異性ＣＤ２０－Ｔ細胞エンゲージャーは、臨床開発において他のＣＤ２０－ＴＣＢ抗体よりもかなり高い効力を示し、低レベルのＣＤ２０を発現する腫瘍細胞に対して有効である。ＣＤ２０－ＴＣＢはまた、低いエフェクター：標的比を有する原発腫瘍サンプルにおいて強力な活性を示す。
[0019]Ｔ細胞関与の目的でこれまでに最も研究されている受容体には、活性化Ｔ細胞上のＣＤ３受容体が含まれる。Ｔ細胞リダイレクト二重特異性抗体は、癌治療において最も使用されているアプローチの１つであり、二重特異性抗体が一方ではＴ細胞上のＣＤ３と特異的に会合し、他方ではＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とは無関係の癌細胞の抗原と特異的に会合した最初の報告が３０年前に発表された。Ｔ細胞リダイレクト抗体は、過去１０年間に血液悪性腫瘍および固形腫瘍の治療においてかなりの進歩を遂げてきた。カツマキソマブは、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）およびＣＤ３を標的とする同種類の最初の二重特異性抗体であり、これは、そのグリカンを介してＣＤ１６にも結合するので、実際には三重特異性である。カツマキソマブは、悪性腹水の治療に対して欧州（２００９）で承認された（しかし、商業的理由により２０１７年に撤退した）。この発見に続いて、別のＣＤ１９およびＣＤ３の二重特異性標的化が成功し（ブリナツモマブ）、これは２０１４年に再発性または難治性の前駆Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療に対してＦＤＡによって販売許可を与えられた。現在、多くの患者が、ブリナツモマブから恩恵を受けているが、臨床試験において潜在的な抗腫瘍有効性を示す異なるフォーマットおよび特性を有するＴ細胞リダイレクト抗体がいくつか存在する。
[0020]Ｔ細胞に結合すると知られている抗体が、当該分野で知られており、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３，１４８，１３６－１４７およびＲｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，２０，１２４７－１２５８（両方とも参照により援用される）によって強調されており、例えば、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ３、ＢＭＡ０３１およびそれらのヒト化バージョンである。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞に結合すると知られている抗体も知られている。例えば、参照により援用されるｄｅ Ｂｒｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７，１９８，３０８－３１７を参照のこと。
[0021]Ｔ細胞を腫瘍にリダイレクトするという概念は、現在、同時に共刺激性である他の受容体、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ２７またはＩＣＯＳにまで拡大されている。
[0022]Ｔ細胞の関与と同様に、腫瘍微小環境へのＮＫ細胞の動員が広範に調査されている。ＮＫ細胞の関与は、参照により援用されるＫｏｎｊｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０１７，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．５７７２／ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．６９７２９に要約されているように、通常、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＮＫｐ４６または他のＮＫ細胞特異的受容体への結合に基づく。ＮＫ細胞エンゲージャーは、腫瘍関連抗原に結合する完全ＩｇＧへのＮＫ結合抗体（フラグメント）の融合または挿入によって作製することができる。あるいは、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性が数多くの活性化ＮＫ細胞受容体および阻害性ＮＫ細胞受容体によって制御されることを考えると、特異的なサイトカインを使用することもでき、ＮＫ細胞受容体発現およびシグナル伝達の変化が細胞傷害性ＮＫ細胞機能の低下の根底にある。このことに基づいて、また、予測的なインビトロでの知見に基づいて、ＩＦＮα、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５およびＩＬ－１８を含むサイトカインが、全身的に、またはＮＫ細胞のエクスビボでの活性化および拡大のために使用されており、ＮＫ細胞活性化受容体の発現を増大させることによって、および細胞傷害性エフェクター分子を誘導することによって、改善されたＮＫ細胞抗腫瘍活性をもたらした。さらに、このサイトカインベースの治療は、ＮＫ細胞の増殖および調節機能を増強し、改善されたＮＫ細胞の活性および長寿命を有する新たに定義されたＮＫ細胞サブセットに相当する、サイトカイン誘導性メモリー様特性を示すＮＫ細胞を誘導することが示されている。癌の治療と慢性炎症の治療の両方のために、いくつかのサイトカインペイロードが開発され、前臨床試験において試験されている。ＩＬ－２、ＴＮＦおよびＩＬ－１２などの炎症促進性サイトカインは、腫瘍部位での白血球の局所浸潤を増加させ、活性化することが見出されているので、腫瘍療法について調査されている。例えば、ＩＬ－２単独療法は、アルデスロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））として承認されており、ニボルマブ（ＮＫＴＲ－２１４）と組み合わせた第ＩＩＩ相臨床試験中である。同様に、ＩＬ－１５の様々な組換えバージョンが、臨床評価段階にある（ｒｈＩＬ－１５またはＡＬＴ－８０３）。ＩＬ－１５の具体的な変異体は、例えば、Ｂｅｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２０１１，２４，２８３－２９０およびＳｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１９，５６５，１８６－１９１（両方ともが参照により援用される）によって報告されており、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００６，１０３，９１６６－９１７１（参照により援用される）によって報告されているような、ＩＬ－１５とＩＬ－１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）との複合体、およびＩＬ－１５とＩＬ－１５Ｒ（Ｓｕｓｈｉドメイン）との融合構築物も、抗腫瘍活性（例えば、参照により援用されるＢｅｓｓａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃ．Ｔｈｅｒ．２００９，８，２７３６－２７４５を参照のこと）について評価されている。さらに、例えば、Ｂｏｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００６，３１１，１９２４－１９２７、Ａｒｅｎａｓ－Ｒａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１６，８，ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｇ３１８７、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０２０，９，ｅ１６８１８６９，ＤＯＩ：１０．１０８０／２１６２４０２Ｘ．２０１９．１６８１８６９、国際公開第２０１７０７０５６１号、国際公開第２０１８２１７０５８号、国際公開第２０１６００５９５０号（すべて参照により援用される）によって報告されているように、最も好都合には通常ＩＬ－２Ｒαに結合するＩＬ－２ドメインに結合することによって内因性のＩＬ－２を動員し、それにより、Ｔｒｅｇの活性化を伴わずにＣＤ８＋Ｔ細胞の選択的活性化をもたらす抗体が開発されている。対照的に、ＩＬ－１０などの免疫抑制性サイトカインは、慢性炎症状態または他の疾患（例えば、子宮内膜症）の治療のためのペイロードと見なされ得る。
[0023]炎症促進性サイトカインの全身投与は、重度のオフターゲット関連有害作用をもたらすことがあり、それにより、用量が制限され、治療的に有効なレジメンへの段階的な拡大が妨げられることがある。ある特定のサイトカイン産物（例えば、ＩＬ－２、ＴＮＦ、ＩＬ－１２）は、１桁のミリグラム範囲（１人あたり）またはそれ未満の推奨用量を示している。炎症促進性サイトカインの静脈内投与に関連する有害作用には、低血圧、発熱、悪心またはインフルエンザ様症状が含まれ得、時折、重篤な血液学的事象、内分泌事象、自己免疫事象または神経学的事象も引き起こし得る。これらの考慮すべき事柄に照らすと、参照により援用されるＭｕｒｅｒ ａｎｄ Ｎｅｒｉ，Ｎｅｗ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９，５２，４２－５３に要約されているように、より良好に耐容され、疾患部位で優先的な作用を示し、正常組織を温存するのに役立つ、「次世代」サイトカイン製品の開発に対する明確な生物医学的必要性がある。したがって、腫瘍へのサイトカインの標的化送達は、免疫細胞を活性化および動員し得る局所的な炎症促進性環境を誘導することを目的とする。上記文献に記載されている抗体－サイトカイン融合物のリストは、参照により援用されるＨｕｔｍａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｎｅｒｉ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２０１８，１４１，６７－９１によって報告されている。臨床用のサイトカイン融合物のリストは、参照により援用されるＭｕｒｅｒ ａｎｄ Ｎｅｒｉ，Ｎｅｗ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９，５２，４２－５３に記載されている。様々なＩＬ－１５融合タンパク質が、参照により援用されるＬａ Ｍｅｒｉｅ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって公表された“Ｔ－ｃｅｌｌ＆ＮＫ－Ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｉｎｇ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２０１９：Ａ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ，Ｓｔａｋｅｈｏｌｄｅｒ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｉｐｅｌｉｎｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”，２０１９に要約されているように、前臨床評価中であり、例えば、Ｔｒｉｋｅ技術によって調製されたＯＸＳ－３５５０（ＣＤ３３－ＩＬ－１５－ＣＤ１６融合物）は、現在、第Ｉ相にある。
[0024]免疫細胞関与の分野における一般的なストラテジーは、Ｆｃ－ガンマ受容体に対する抗体の結合能の無効化（ｎｉｈｉｌａｔｉｏｎ）または除去を使用し、これは複数の薬学的意味を有する。Ｆｃ－ガンマ受容体への結合の除去の第１の結果は、例えば、マクロファージまたは巨核球による、抗体のＦｃ－ガンマ受容体媒介性取り込みの減少であり、これは、例えばＫａｄｃｙｌａ（登録商標）（トラスツズマブ－ＤＭ１）およびＬＯＰ６２８について報告されているように用量制限毒性をもたらし得る。インビボでの抗体の選択的な脱グリコシル化は、抗体媒介性自己免疫を有する患者を治療する機会を与える。高マンノースグリコフォームは、例えば、Ｇｏｒｏｖｉｔｓ ａｎｄ Ｋｒｉｎｏｓ－Ｆｉｏｒｏｔｔｉ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１３，６２，２１７－２２３およびＧｏｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１，２１，９４９－９５９（いずれも参照により援用される）に記載されているように、内在性のマンノース受容体による非特異的な取り込みおよび迅速なクリアランスに至ることよって治療効果を損なうと知られているので、治療用の組換え糖タンパク質中の高マンノースグリコフォームを除去することは有益であり得る。さらに、Ｖａｎ ｄｅ Ｂｏｖｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６，１９６，１４３５－１４４１（参照により援用される）には、高マンノースグリカンがどの程度免疫に影響を及ぼし得るかが記載されている。Ｒｅｕｓｃｈ ａｎｄ Ｔｅｊａｄａ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１５，２５，１３２５－１３３４（参照により援用される）により、モノクローナル抗体における不適当なグリコシル化が、発現されたＩｇ遺伝子からの無効な産生に寄与し得ることが記載された。
[0025]免疫療法の分野では、免疫細胞上のＦｃ－ガンマ受容体へのグリコシル化抗体の結合は、抗体が腫瘍関連抗原に結合する前に免疫系の全身活性化を誘導することがあり、それにより、サイトカインストーム（サイトカイン放出症候群、ＣＲＳ）がもたらされ得る。ゆえに、ＣＲＳのリスクを低下させるために、臨床における免疫細胞エンゲージャーの大部分は、Ｆｃ－ガンマ受容体に結合する能力を欠いている、Ｆｃがサイレンシングされた抗体に基づいている。さらに、二重特異性抗体の分野の様々な企業は、標的結合抗体ドメイン対免疫細胞結合抗体ドメインに関して、定義された比で分子構造を調整している。例えば、Ｒｏｃｈｅは、両方のＣＤＲによってＴＡＡ（例えば、ＣＤ２０またはＣＥＡ）に対する二価結合能を保持するが２つの重鎖の一方のみに操作された追加の抗ＣＤ３フラグメントを有する非対称モノクローナル抗体に基づくＴ細胞エンゲージャーを開発している（２：１の比の標的結合：ＣＤ３結合）。同様のストラテジーを、抗ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、抗ＯＸ４０、抗ＣＤ２７によるＴ細胞の結合／活性化、または抗ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＮＫｐ４６もしくは他のＮＫ細胞特異的受容体によるＮＫ細胞の結合／活性化のために使用することができる。
[0026]Ｆｃ－ガンマ受容体への結合の回避は、様々な方法で、例えば、抗体（具体的にはＦｃフラグメント）における特異的変異によって、またはＦｃフラグメント（ＣＨ２ドメイン、Ｎ２９７付近）に天然に存在するグリカンの除去によって、達成することができる。グリカンの除去は、Ｆｃドメインにおける遺伝的改変、例えば、Ｎ２９７Ｑ変異もしくはＴ２９９Ａ変異によって、または抗体の組換え発現後のグリカンの酵素的除去によって、例えば、ＰＮＧａｓｅ Ｆもしくはエンドグリコシダーゼを使用して、達成することができる。例えば、エンドグリコシダーゼＨは、高マンノース型およびハイブリッド型のグリコフォームをトリミングすると知られており、エンドグリコシダーゼＳは、複合型グリカン、およびある程度、ハイブリッドグリカンをトリミングすることができる。エンドグリコシダーゼＳ２は、複合型、ハイブリッド型および高マンノース型の両方のグリコフォームをトリミングすることができる。エンドグリコシダーゼＦ２は、複合型グリカンをトリミングすることができる（が、ハイブリッド型をトリミングすることはできず）、エンドグリコシダーゼＦ３は、１，６－フコシル化された複合型グリカンのみをトリミングすることができる。別のエンドグリコシダーゼであるエンドグリコシダーゼＤは、Ｍａｎ５（Ｍ５）グリカンだけを加水分解することができる。種々のエンドグリコシダーゼの比活性の概要は、参照により本明細書中に援用されるＦｒｅｅｚｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１０，８９：１７．１３Ａ．１－１７に開示されている。治療で使用するためのタンパク質の脱グリコシル化のさらなる利点は、バッチ間の一貫性の促進および均一性の有意な改善である。
[0027]二重特異性抗体または抗体－サイトカイン融合物を作製するための抗体－タンパク質コンジュゲートを調製するために、ＡＤＣ技術の分野から着想を得ることがある。
[0028]参照により援用されるＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，３ｒｄ Ｅｄ．２０１３に要約されているように、バイオコンジュゲーションのための多くの技術が知られている。リジン側鎖のアシル化またはシステイン側鎖のアルキル化のいずれかに基づくランダムなコンジュゲーションによるＡＤＣの調製のための主要な技術を２つ認識することができる。リジン側鎖のε－アミノ基のアシル化は、通常、活性化エステルまたは活性化カーボネート誘導体に基づく試薬に当該タンパク質を供することによって達成され、例えば、ＳＭＣＣは、Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）の製造に適用されている。システイン側鎖中のチオール基のアルキル化の主な化学は、例えば、Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）の製造に適用されているような、マレイミド試薬の使用に基づく。標準的なマレイミド誘導体のほかに、例えば、Ｊａｍｅｓ Ｃｈｒｉｓｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２０１５，２２０，６６０－６７０およびＬｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４，３２，１０５９－１０６２（両方ともが参照により援用される）によって実証されているように、より安定なシステインコンジュゲーションのために一連のマレイミドバリアントも適用されている。システイン側鎖へのコンジュゲーションのための別の重要な技術は、タンパク質毒素、化学療法薬およびプローブを担体分子に可逆的に接続するために利用されている生物活性化可能な接続であるジスルフィド結合によるものである（例えば、Ｐｉｌｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１７，８，３６６－３７０を参照のこと）。システインアルキル化の他のアプローチとしては、例えば、ハロアセトアミド（通常、ブロモアセトアミドまたはヨードアセトアミド）の求核置換（例えば、参照により援用されるＡｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２００８，１９，７５９－７６５を参照のこと）またはアクリレート試薬との反応などの不飽和結合へのマイケル付加に基づく様々なアプローチ（例えば、Ｂｅｒｎａｒｄｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６，７，ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１３１２８およびＡｒｉｙａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１７，２８，８９７－９０２（両方ともが参照により援用される）を参照のこと）、ホスホンアミデートとの反応（例えば、参照により援用されるＫａｓｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１９，５８，１１６２５－１１６３０を参照のこと）、アレンアミドとの反応（例えば、参照により援用されるＡｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１４，５３，７４９１－７４９４を参照のこと）、シアノエチニル試薬との反応（例えば、参照により援用されるＫｏｌｏｄｙｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１５，２６，１９７－２００を参照のこと）、ビニルスルホンとの反応（例えば、参照により援用されるＧｉｌ ｄｅ Ｍｏｎｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１９，１０，４５１５－４５２２）またはビニルピリジンとの反応（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｉｋｓｕｄａ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｃｅ／ｐｅｒｍａｌｉｎｋ／（２０２０年１月７日にアクセス））がある。メチルスルホニルフェニルオキサジアゾールとの反応は、参照により援用されるＴｏｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１３，５２，１２５９２－１２５９６によって、システインコンジュゲーションについても報告されている。
[0029]抗体中の１つ（またはそれ以上）の所定の部位への部位特異的コンジュゲーションによって、定義された薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有する抗体－薬物コンジュゲートの作製を可能にするいくつかのプロセスが開発されている。部位特異的コンジュゲーションは、典型的には、ペイロード結合のためのアンカーポイントとして働く抗体への特定のアミノ酸（または配列）の操作（例えば、参照により援用されるＡｇｇｅｒｗａｌ ａｎｄ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１４，５３，１７６－１９２を参照のこと）、最も典型的には、システインの操作によって達成される。その上、一連の他の部位特異的コンジュゲーション技術、最も顕著には、非天然のアミノ酸、例えば、オキシムライゲーションに適したｐ－アセトフェニルアラニン、またはクリックケミストリーコンジュゲーションに適したｐ－アジドメチルフェニルアラニンの遺伝子コード化が、過去１０年間で研究されてきた。抗体の遺伝子再操作に基づくアプローチの大部分は、ＤＡＲが約２のＡＤＣをもたらす。抗体を再操作することなく抗体コンジュゲーションを行う別のアプローチは、鎖間ジスルフィド架橋を還元した後、システイン架橋試薬、例えば、ビス－スルホン試薬（例えば、Ｂａｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２００７，１８，６１－７６およびＢｒｙａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０１５，１２，１８７２－１８７９（両方ともが参照により援用される）を参照のこと）、モノ－またはビス－ブロモマレイミド（例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１０，１３２，１９６０－１９６５およびＳｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４，３７，７２６１－７２６９（両方ともが参照により援用される）を参照のこと）、ビス－マレイミド試薬（例えば、国際公開第２０１４１１４２０７号を参照のこと）、ビス（フェニルチオ）マレイミド（例えば、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１４，３７，７２６１－７２６９およびＡｕｂｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１８，２９，３５１６－３５２１（両方ともが参照により援用される）を参照のこと）、ビス－ブロモピリダジンジオン（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＲＳＣ Ａｄｖａｎｃｅｓ ２０１７，７，９０７３－９０７７（参照により援用される）を参照のこと）、ビス（ハロメチル）ベンゼン（例えば、Ｒａｍｏｓ－Ｔｏｍｉｌｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１８，２９，１１９９－１２０８（参照により援用される）を参照のこと）または他のビス（ハロメチル）芳香族化合物（例えば、国際公開第２０１３１７３３９１号を参照のこと）に結合したペイロードを加えるものである。典型的には、システインの架橋によって調製されたＡＤＣは、約４の薬物対抗体負荷量（ＤＡＲ４）を有する。
[0030]Ｒｕｄｄｌｅ ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ ２０１９，１４，１１８５－１１９５は、最近、ＣＨ１とＣＬ鎖との間ジスルフィド鎖の選択的還元の後、２つのマレイミド単位を含む対称的なＰＤＢ二量体での処理によってフラグメントを再架橋することによって、抗体Ｆａｂフラグメント（完全抗体のパパイン消化または組換え発現によって調製される）からＤＡＲ１コンジュゲートを調製することができることを示した。得られたＤＡＲ１型Ｆａｂフラグメントは、高度に均一であり、血清中で安定であり、優れた細胞傷害性を示すことが示された。追跡調査の刊行物であるＷｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ２０１９，１１，５００－５１５およびまた参照により援用される国際公開第２０１９０３４７６４号では、抗体の事前の操作の後、ＤＡＲ１コンジュゲートを完全ＩｇＧ抗体から調製することもできることが示された：ヒンジ領域にただ１つの鎖内ジスルフィド架橋を有する抗体を使用するか（参照により援用されるＤｉｍａｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００９，３９３，６７２－６９２に報告されているＦｌｅｘｍａｂ技術）、または天然アミノ酸の変異（例えば、ＨＣ－Ｓ２３９Ｃ）もしくは配列への挿入（例えば、Ｄｉｍａｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．２０１７，１４，１５０１－１５１６によって報告されているＨＣ－ｉ２３９Ｃ）によって得られることがあるさらなる遊離システインを有する抗体を使用する。どちらの操作された抗体も、得られるシステイン操作されたＡＤＣとビスマレイミド由来ＰＢＤ二量体との反応によって、ＤＡＲ１ ＡＤＣの作製を可能にすることが示された。Ｆｌｅｘｍａｂ由来ＤＡＲ１ ＡＤＣは、血清中のペイロード損失に対して高度に耐性であり、ＨＥＲ２陽性胃癌異種移植モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を示すことが示された。さらに、このＡＤＣは、単一のマレイミド含有ＰＢＤ二量体を使用して調製された部位特異的ＤＡＲ２ ＡＤＣと比べて、２倍の用量でラットにおいて耐容性が示された。しかしながら、ＤＡＲ１ ＡＤＣ対ＤＡＲ２ ＡＤＣの最小有効用量（ＭＥＤ）が同じ係数２で増加したので、治療濃度域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）の改善は認められなかった。
[0031]国際公開第２０１４０６５６６１号およびｖａｎ Ｇｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１５，２６，２２３３－２２４２（両方ともが参照により援用される）において、抗体が、Ｎ２９７での天然抗体グリカンの酵素的リモデリング（エンドグリコシダーゼによるトリミングおよびグリコシルトランスフェラーゼの作用下でのアジド修飾ＧａｌＮＡｃ誘導体の導入）に続くクリックケミストリーを用いた細胞傷害性ペイロードの結合に基づいて部位特異的にコンジュゲートされ得ることが示された。アシル化スルファミドの導入により、治療指数に関してグリカンリモデリング技術がさらに改善され、得られた抗体－薬物コンジュゲートのＤＡＲが、特異的リンカーの選択によってＤＡＲ２またはＤＡＲ４に合わせることができることが、Ｖｅｒｋａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２０１８，７，１２によって実証された。コンジュゲーション前のグリカンのトリミングが、得られた抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の、Ｆｃ－ガンマ受容体への結合の無効化（Ｆｃサイレンシング）をもたらすことも実証された。この技術によって調製されたＡＤＣは、一連の他のコンジュゲーション技術および例えばＡＤＣＴ－６０１（ＡＤＣ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）において現在臨床応用されているグリカン－リモデリングコンジュゲーションの技術と比べて、有意に拡張された治療指数を示すことが見出された。
[0032]参照により援用されるＬｈｏｓｐｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．２０１５，１２，１８６３－１８７１に報告されている、抗体を、Ｆｃサイレンシングを伴うアジド修飾抗体に変換するための類似の酵素的アプローチは、細菌酵素のトランスグルタミナーゼ（ＢＴＧまたはＴＧａｓｅ）を使用する。ＰＮＧａｓｅ Ｆによる天然のグリコシル化部位Ｎ２９７の脱グリコシル化は、ＴＧａｓｅ媒介性導入のための基質となるように隣接するＮ２９５を遊離させ、それにより、ＴＧａｓｅの存在下でアジド担持分子に供すると、脱グリコシル化抗体がビスアジド抗体に変換されることが示された。その後、そのビスアジド抗体をＤＢＣＯ修飾細胞毒と反応させて、ＤＡＲ２を有するＡＤＣを作製した。Ｃ末端ＴＧａｓｅ媒介性アジド導入の後、金属フリークリックケミストリーを用いたＡＤＣにおける変換に基づく遺伝的方法が、参照により援用されるＣｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐ．２０１８，１７，２６６５－２６７５によって報告された。
[0033]小分子の結合に加えて、様々なクリックケミストリーがタンパク質－タンパク質コンジュゲートの作製に適していることも十分に実証されている。例えば、参照により援用されるＷｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１２，１０９，１１９９３－１１９９８は、２つの相補的なクリックプローブ（アジドおよびＤＢＣＯ）を２つの異なるタンパク質にソルターゼ媒介性導入の後、金属フリークリックケミストリー（歪み促進型アジド－アルキン付加環化またはＳＰＡＡＣ）に基づくシームレスライゲーションの組み合わせによって、非天然のＮ対ＮおよびＣ対Ｃタンパク質二量体を得ることができることを示した。参照により援用されるＷａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０１４，１１１，１６８２０－１６８２５は、このアプローチを適用して、抗インフルエンザｓｃＦｖによるＣ末端ソルタギング（ｓｏｒｔａｇｇｉｎｇ）に基づく二重特異性抗体を調製し、これをさらに、参照により援用されるＢａｒｔｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１９，１５４，９３－１０１によって、テトラジンとの逆電子要請型ディールス－アルダー付加環化に基づく金属フリークリックケミストリーに拡張した。テトラジンライゲーションは、例えば、Ｄｅｖａｒａｊ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００９，４８，７０１３－７０１６およびＲｏｂｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０１０，４９，３３７５－３３７８（両方ともが参照により援用される）によって、抗体へのｔｒａｎｓ－シクロオクテン（ＴＣＯ）の最初の（ランダムな）化学的な設置による抗体修飾のために以前に適用された。対照的に、抗体へのＴＣＯ（またはテトラジンライゲーションのためのテトラジンもしくはシクロプロペンの他のクリック部分）の部位特異的導入は、上に記載されたように、および例えば、Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２，１３４，１０３１７－１０３２０、Ｓｅｉｔｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２，１３４，２８９８－２９０１およびＯｌｌｅｒ－Ｓａｌｖｉａ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１８，５７，２８３１－２８３４（すべて参照により援用される）に報告されているように、抗体の事前の遺伝的改変に基づく多数の方法によって達成することができる。
[0034]ソルターゼは、Ｐｏｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００７，３，７０７－７０８によって最初に報告されたように、ソルターゼ認識配列の事前導入後のタンパク質の部位特異的修飾に適した酵素である。例えば、参照により援用されるＭｉｌｃｚｅｋ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１８，１１８，１１９－１４１によって要約されているように、他の多くの酵素－酵素認識配列の組み合わせも部位特異的タンパク質修飾について知られており、具体的には、Ｆａｌｃｋ ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２０１８，７，４（ｄｏｉ：１０．３３９０／ａｎｔｉｂ７０１０００４）およびｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ ａｎｄ ｖａｎ Ｄｅｌｆｔ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ：Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１８，３０，３－１０（両方ともが参照により援用される）によって要約されているように抗体に適用される。その上、参照により援用されるＫｏｎｉｅｖ ａｎｄ Ｗａｇｎｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２０１５，４４，５４９５－５５５１によって要約されているように天然タンパク質の非遺伝的改変、ならびにＲｏｓｅｎ ａｎｄ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１７，１３，６９７－７０５およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１７，８，２７１７２７２２（両方ともが参照により援用される）によって要約されているようにＮ末端修飾のために、広範囲の方法が利用可能である。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２０１１，４４，７６２－７７３およびＪｕｎｇ ａｎｄ Ｋｗｏｎ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍ．２０１６，７，４５８５－４５９８（両方ともが参照により援用される）によって要約されているように、上記のいずれのアプローチも、適切なクリックプローブをポリペプチド／タンパク質に組み込むために使用することができ、免疫細胞エンゲージャーまたはサイトカインに適用できる。相補的なクリックプローブを、腫瘍関連抗原を標的とする抗体に組み込むと、免疫細胞エンゲージャーを容易に作製することができる一方で、適切な技術の選択によって、免疫細胞結合剤に対する化学量論の腫瘍結合抗体を調整することができる。
[0035]また、参照により援用されるＢｒｕｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１７，２８，１１８９－１１９３によって、後に歪みアルキンまたはアルケンとの付加環化に供され得る中間体１，２－キノンを介した、適切に配置されたチロシンのチロシナーゼ媒介性酸化によって、抗体を細胞傷害性ペイロードに部位特異的にコンジュゲートすることができることも示された。この技術は、歪み促進型の、酸化によって制御されるキノン－アルキン付加環化（ＳＰＯＣＱ）と呼ばれる。
[0036]例えば、Ｙａｍａｄａ ａｎｄ Ｉｔｏ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．２０１９，２０，２７２９－２７３７によって強調されているように、事前の遺伝的改変を伴わない抗体の部位特異的修飾のための化学的アプローチも開発されている。
[0037]部位特異的修飾のための親和性ペプチドによる化学的コンジュゲーション（ＣＣＡＰ）は、ヒトＩｇＧ－Ｆｃに高親和性で結合するペプチドを使用することによりＦｃフラグメント中の単一リジンをビオチン部分または細胞傷害性ペイロードで選択的に修飾することを可能にすることによって、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１９によって開発された。同様に、Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１９，５８，５５９２－５５９７およびＭａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｏｍｅｇａ ２０１９，４，２０５６４－２０５７０（両方ともが参照により援用される）は、同様のアプローチ（ＡＪＩＣＡＰＴＭ技術）を抗体重鎖中の単一リジン上へのチオール基の部位特異的導入に適用できることを実証した。ＣＣＡＰまたはＡＪＩＣＡＰＴＭ技術は、アジド基または他の官能基の部位特異的導入にも使用され得る。
[0038]明らかなように、ＩｇＧへの免疫細胞エンゲージャーまたはサイトカインの遺伝的融合は、均一な産物をもたらす。抗体への免疫細胞エンゲージャーの化学的コンジュゲーションが適用されているが、これは、不均一な混合物をもたらす。今日まで、完全長ＩｇＧの事前の再操作を必要とせず、かつ／または免疫細胞結合ポリペプチドの数ならびにＩｇＧとポリペプチドとの間のスペーサーの長さおよび構造の調整を可能にする、均一な二重特異性抗体または抗体－サイトカイン融合物を調製するための方法は報告されていない。さらに、ＩｇＧをＦｃサイレントである二重特異性抗体に変換する非遺伝的方法も報告されていない。
[0039]さらに、２つの異なる官能基を制御された様式でＩｇＧに化学的にコンジュゲートし、それによって任意の単機能性抗体を三機能性抗体に、または二重特異性二機能性抗体を四機能性抗体に変換する方法も報告されていない。
［発明の要旨］
[0040]本発明者らは、ＩｇＧの遺伝的改変を必要とせずに、少なくとも２つの異なる機能（小分子、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、フルオロフォア、放射性標識など）の結合による多機能性抗体構築物を開発した。典型的には、その抗体は、腫瘍細胞に特異的であり、ポリペプチドペイロードは、免疫細胞に特異的である。本発明は、得られた多機能性抗体の分子フォーマットを、定義された比、すなわち、完全なＩｇＧ ＣＤＲ中の補体依存性領域対新たに設置された機能的標識の比に合わせることを可能にする。例えば、単一特異性単機能性完全長ＩｇＧ抗体は、２つの異なる機能性分子の正確に２つ（それぞれ１つ）を設置することによって２：１：１比の三機能性構築物に変換することができ、または１つの機能性および別の機能性の１つの４つの分子を設置することによって２：４：１比の三機能性構築物に変換することができる。さらに、本発明は、すでに二重特異性であるＩｇＧ（すなわち、２つの異なるＣＤＲ、例えばＤｕｏｂｏｄｙ、またはノブインホール技術もしくは制御されたＦａｂ交換技術によって得られた二重特異性ＩｇＧを用いて）への適用にも適しており、それによって、所与のフォーマット、例えば、完全ＩｇＧ ＣＤＲ（１：１）中の２つの補体依存性領域および２つの新たに設置された異なる機能性分子のことを指す１：１：１：１の四機能性抗体を生成する。最後に、ＩｇＧ抗体の機能化がエンドグリコシダーゼ媒介性の完全脱グリコシル化ステップまたはエンドグリコシダーゼ媒介性のトリミングステップを含む場合、得られる多機能性抗体構築物は、抗体を再操作することなくＦｃ－ガンマ受容体（Ｆｃサイレント）に結合することができなくなる。本発明はさらに、本発明に係る多機能性抗体構築物の医薬的使用に関する。
[0041]図１は、反応基との反応時に接続基Ｚをもたらす、天然に存在するかまたは工学的に導入される、生体分子中の官能基（Ｆ）の代表的な（包括的ではない）セットを示している。官能基Ｆは、天然に存在するか、または最適な任意の位置で生体分子に人工的に導入（操作）され得る。ピリダジン接続基は、Ｎ２の損失を伴う、テトラジンとアルキンとの反応時に形成されるテトラザビシクロ［２．２．２］オクタン接続基の再配列の生成物である。接続基Ｚは、本発明において使用される好ましい接続基である。 [0042]図２は、モノクローナル抗体を、コンジュゲーション用の反応部位（Ｆ）を含む抗体に非遺伝的に変換するための一般的なプロセスを示しており、その反応部位は、クリックプローブまたはチオール基であり得る。反応部位は、使用される技術に応じて、抗体の様々な位置に、抗体に対する所与の比で存在し得る。その抗体はまた、２つの異なる反応部位プローブ（下記の構造）または３つの異なる反応部位（右下）を含む抗体に、それぞれ抗体に関して所与の比で変換され得る。反応部位としてのアミノ基については、それがリジン中に側鎖として天然に存在するので、抗体修飾は必要ない。 [0043]図３（上）は、天然の官能基または抗体上に設置されたクリックプローブであり得る所与の数（ｘ）のプローブ（Ｆ）で修飾されたＩｇＧ抗体が、分枝構造を介して２つの異なる機能性分子ＡおよびＢを含む相補的プローブ（Ｑ）と反応して、反応時に安定な結合（Ｑ）を形成し、それによって三機能性抗体を形成することができる方法を示している。コンジュゲーション用のプローブは、図１に示されている任意の好適な組み合わせから選択され得る。得られた二重特異性抗体の化学量論は、天然に存在していたかまたはコンジュゲーション前に設置されていたプローブＦの数に依存し、必ずしもＦのすべての存在が反応するわけではない。対称的な二価のＩｇＧを使用してもよく（ＣＤＲ１＝ＣＤＲ２）、したがって２：ｘ：ｘ分子フォーマットを有する三機能性抗体がもたらされる。非対称的な抗体も使用してもよく（ＣＤＲ１≠ＣＤＲ２）、したがって１：１：ｘ：ｘ分子フォーマットを有する四機能性抗体がもたらされる。２つの異なるプローブＦ１およびＦ２が、存在するかまたは抗体に設置されている場合（下）、これらは、直鎖構造を介して機能性部分（それぞれＡまたはＢ）をそれぞれが含む２つの異なる相補的プローブ（Ｑ１およびＱ２）と反応することができ、分子フォーマットは、Ａ対Ｂの化学量論に関してさらに変化することがあり、例えば、２：ｘ：ｙ分子フォーマットがもたらされる。これら２つのストラテジーの組み合わせも可能である（図示せず）。 [0044]図４は、Ａの１つの存在およびＢの１つの存在を完全長抗体上に正確に設置するための３つの代替方法を示している（定義された２：１：１分子フォーマット）。ゆえに、完全長抗体は、最初に２つのクリックプローブＦ１で修飾されている。１つのアプローチ（下向き矢印）では、ＩｇＧ（Ｆ１）２を、分枝リンカーを介して２つの相補的なクリックプローブＱ１（これらの両方が抗体上のＦ１の１つの存在と反応する）に接続された２つの異なる機能性分子ＡおよびＢからなる構築物に供する。第２のアプローチ（矢印右）では、ＩｇＧ（Ｆ１）２を、３つの相補的プローブＱ１を含む三価の構築物に供し、その３つのうちの２つは、ＩｇＧ（Ｆ１）２と反応し、１単位のＱ１は、それぞれ１つのＡおよびＢの存在を含むＦ１修飾分枝構築物とのその後の反応のために遊離したままになる。第３のアプローチ（斜めの矢印）では、ＩｇＧ（Ｆ１）２を、２つの相補的プローブＱ１および１つの非反応性クリックプローブＦ２（これもＦ１とは異なる）を含む三価の構築物に供する。これら２つのクリックプローブＱは、ＩｇＧ（Ｆ１）２と反応し、ＡおよびＢを含むＱ２修飾構築物とのその後の反応のためにＦ２は残る。 [0045]図５は、金属フリークリックケミストリーに適したシクロオクチン、および反応性部分Ｑの好ましい実施形態を示している。このリストは、包括的ではなく、例えば、アルキンは、フッ素化、芳香環の置換、または芳香環へのヘテロ原子の導入によってさらに活性化され得る。 [0046]図６は、抗体コンジュゲートへのその後の変換のための出発物質としての一連の抗体バリアントを示している。 [0047]図７は、例えば、２位の３－メルカプトアルカノイル基（１１ａ）、アジドアセチル基（１１ｂ）、アジドジフルオロアセチル基（１１ｃ）、アルキン基（１１ｆ）もしくはオキソ－アルキル基（１１ｇ）、またはＮ－アセチルガラクトサミンの６位のアジド（アルキル）基（１１ｄ）、メルカプト（アルキル）基（１１ｅ）もしくはアルキン基（１１ｈ）で修飾され得るガラクトサミンのＵＤＰ糖の誘導体のいくつかの構造を示している。単糖（すなわち、ＵＤＰが除去されている）が、本発明において使用される好ましい部分Ｓｕである。 [0048]図８は、完全長ＩｇＧおよびアジド－シクロオクチンのクリックケミストリーのグリカンリモデリングに基づく２：２分子フォーマットの二重特異性抗体の形成の具体例を示している。このＩｇＧは、最初に、異なるすべてのグリコフォームのエンドグリコシダーゼ媒介性トリミングによって酵素的にリモデリングされ、その後、エンドグリコシダーゼによって遊離されたコアＧｌｃＮＡｃ上へのアジド糖のグリコシルトランスフェラーゼ媒介性転写が続く。次のステップでは、アジドリモデリングＩｇＧを、金属フリークリックケミストリー用の単一のシクロオクチン（ＳＰＡＡＣ）で修飾されたポリペプチド、例えば、免疫細胞結合ポリペプチドに供して、２：２分子フォーマットの二重特異性抗体を得る。そのシクロオクチン－ポリペプチド構築物は、シクロオクチンとポリペプチドとの間に特異的なスペーサーを有し、そのスペーサーは、ＩｇＧ－ポリペプチドの距離の調整を可能にするか、または得られる二重特異性抗体に他の特性を付与することも示されている。 [0049]図９は、最初に、ビス－アジド抗体上へのクリッピングに適した三価のシクロオクチン構築物に供し、アジド修飾されたポリペプチドを用いたその後のＳＰＡＡＣのために１つのシクロオクチンを遊離させ、ＩｇＧ上に１つのポリペプチドのみを効果的に導入することによって、アジド糖でリモデリングされた抗体を、２：１分子フォーマットを有する二重特異性に変換することができる方法の例示である。後者のポリペプチドはまた、シクロオクチンとの反応のための他の補体クリックプローブ、例えば、逆電子要請型ディールス－アルダー付加環化のためのテトラジン部分で修飾され得る。ここでは、ＦとＱとの任意の組み合わせ（図１）を想定することができる。 [0050]図１０は、ビス－アジド糖修飾ｍＡｂとの反応のための三価構築物の様々な選択肢を示している。その三価構築物は、ホモ三価またはヘテロ三価（２＋１フォーマット）であり得る。ホモ三価コントラクト（Ｘ＝Ｙ）は、３×シクロオクチンまたは３×アセチレンまたは３×マレイミドまたは３×他のチオール反応基からなり得る。ヘテロ三価構築物（Ｘ≠Ｙ）は、例えば、２つのシクロオクチン基および１つのマレイミド基または２つのマレイミド基および１つのｔｒａｎｓ－シクロオクテン基からなり得る。ヘテロ三価構築物は、ＸおよびＹが互いに反応性（例えば、マレイミド＋チオール）でない限り、ＸとＹとの任意の組み合わせで存在し得る。 [0051]図１１は、目的のタンパク質へのＣ末端（上）またはＮ末端（下）ライゲーションのためのタンパク質（一般的なアミノ酸略語の大文字）のソルターゼ媒介性ライゲーションの一般概念を示している。Ｃ末端ライゲーションの場合、目的のタンパク質のＣ末端に組換え的に融合されたＬＰＸＴＧＧ配列（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸であり得、ＧＧは、他のアミノ酸（配列）にさらに融合され得る）、およびソルターゼ媒介性ライゲーションは、基質ＧＧＧ－Ｒ（Ｒは目的の官能基である）で処理して新しいペプチド結合を形成することによって達成される。同様に、Ｎ末端ライゲーションの場合、ＬＰＸＴＧＧ配列（ここで、ロイシンは、目的の官能基Ｒで修飾され、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸であり得、ＧＧは、他のアミノ酸（配列）にさらに融合され得る）とのライゲーションのために、ＧＧＧ配列が目的のタンパク質のＮ末端に融合される。 [0052]図１２は、一連の二価のＢＣＮ試薬（１０５、１０７、１１８、１２５、１２９、１３４）、三価のＢＣＮ試薬（１４３、１４５、１５０）、およびソルタギングのための一価のＢＣＮ試薬（１５４、１５７、１６１、１６３、１６８）を示している。 [0053]図１３は、タンパク質のソルタギングに適した、Ｎ末端ＧＧＧ（１６９～１７１および１７６）またはＣ末端ＬＰＥＴＧＧ（１７２～１７５）を備えた一連の金属フリークリック試薬を示している。 [0054]図１４は、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦに基づく一連のビス－ＢＣＮ修飾細胞傷害性薬物を示している。 [0055]図１５は、ＭＭＡＥ（３０３）、ＰＢＤ二量体（３０４）、カリケアマイシン（３０５）またはＰＮＵ１５９，６８２（３０６）に基づく一連のさらなるビス－ＢＣＮ修飾細胞傷害性薬物を示している。 [0056]図１６は、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦに基づく、様々なシクロオクチン（様々なシクロオクチン間リンカーのバリエーションを有するＢＣＮ、ＤＩＢＯ、ＤＢＣＯ）またはアジドまたはマレイミドを有する一連の二価の細胞傷害性薬物を示している。 [0057]図１７は、ＭＭＡＥ（３１２およびＬＤ１４）またはＭＭＡＦ（３１３）に基づく３つの一価の直鎖リンカー－薬物の構造を示している。 [0058]図１８は、一連の二価または三価の架橋剤（ＸＬ０１～ＸＬ０９、ＸＬ１１、ＸＬ１２、ＸＬ１４）を示している。 [0059]図１９は、Ｃ末端ＬＰＥＴＧＧ、Ｃ末端Ｇ４ＳＹ、Ｎ末端ＳＬＲ（またはその両方）、場合によってはＧ４Ｓスペーサーも備えた、ｓｃＦｖのｈＯＫＴ３（２００）、ｍＯＫＴ３（ＰＦ０４）およびα－４－１ＢＢ（ＰＦ３１）の構造を示している。構造２０１～２０４およびＰＦ０１、ＰＦ０２、ＰＦ０４～ＰＦ０９は、酵素的または化学的誘導体化によって得られる好適なクリックプローブ（ＢＣＮ、テトラジンまたはアジド）を備えた、２００、ＰＦ０４またはＰＦ３１の誘導体である。 [0060]図２０は、２００の二価ビス－ＢＣＮ修飾誘導体を示している。 [0061]図２１は、ＩＬ－１５（ＰＦ１８）またはＩＬ－１５Ｒ－ＩＬ－１５融合タンパク質（２０７、２０８およびＰＦ２６、ＩＬ－１５Ｒ＝ＩＬ－１５受容体のＳｕｓｈｉドメイン）の様々な変異体、および好適なクリックプローブ（ＢＣＮ、テトラジンまたはアジド）またはマレイミドを備えたそれらの誘導体の構造を示しており、それぞれの場合において、部位特異的な修飾を可能にするようにＮ末端において修飾される。 [0062]図２２は、ビス－ＢＣＮ（ＰＦ２７およびＰＦ２９）またはビス－マレイミド（ＰＦ２８）を備えたＰＦ２６の二価誘導体、ならびにＰＦ１８から誘導されたビス－ＢＣＮ修飾ＩＬ－１５（ＰＦ３０）を示している。 [0063]一連の機能化タンパク質フラグメントを示している：ＰＦ３２は、ＸＬ１１とＰＦ０３との反応によって得られ、ＰＦ１９とのさらなる反応時に、ＰＦ３４がもたらされる。三価のＢＣＮ試薬１０５とＰＦ１８との反応により、ＰＦ３３がもたらされ、ＰＦ０９とＰＦ２７との反応によってＰＦ３５が得られる。 [0064]図２４は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示している：レーン１－リツキシマブ；レーン２－ｒｉｔ－ｖ１ａ；レーン３－ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５；レーン４－ｒｉｔ－ｖ１ａ－（２０１）２；レーン５－ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－２０４；レーン６－ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０１；レーン７－ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０２。ゲルをクマシーで染色して、総タンパク質を可視化した。非還元条件下の６％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左）および還元条件下の１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（右）においてサンプルを分析した。 [0065]図２５は、非還元条件下の６％ゲルにおけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示している：レーン１－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ；レーン２－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ０７）１；レーン３－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ０７）１－（ＰＦ３３）１；レーン４－ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ０７）１－（ＬＤ１１）１。ゲルをクマシーで染色して、総タンパク質を可視化した。 [0066]図２６は、非還元条件下の６％ゲルにおけるＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を示している：レーン１－ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－（ＰＦ０２）１；レーン２－ｒｉｔ－ｖ１０－［１４５－ＰＦ０２］－［ＬＤ０９］；レーン３－ｒｉｔ－ｖ１０－［１４５－ＰＦ０２］－［ＸＬ０１］；レーン４－ｒｉｔ－ｖ１０－［１４５－ＰＦ０２］－［ＸＬ０１－ＰＦ１９］；レーン５－ｒｉｔ－ｖ１０－［１４５－ＰＦ０２］－［ＸＬ０１－ＰＦ１３］。ゲルをクマシーで染色して、総タンパク質を可視化した。
［発明の詳細な説明］
[0067]定義
本明細書および特許請求の範囲で使用される「含む」という動詞およびその語形変化は、その語の前の項目が含まれ、具体的に言及されていない項目は除外されないことを意味するために非限定的な意味で使用される。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への言及は、文脈が、要素の１つのみが存在することを明確に要求しない限り、要素が２つ以上存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
[0068]本明細書および特許請求の範囲に開示されている化合物は、１つ以上の不斉中心を含むことがあり、それらの化合物の異なるジアステレオマーおよび／またはエナンチオマーが存在してもよい。本明細書および特許請求の範囲における任意の化合物の説明は、別段述べられない限り、すべてのジアステレオマーおよびそれらの混合物を含むことを意味する。さらに、本明細書および特許請求の範囲における任意の化合物の説明は、別段述べられない限り、個々のエナンチオマー、ならびにエナンチオマーのラセミまたはその他の任意の混合物の両方を含むことを意味する。化合物の構造が特定のエナンチオマーとして示されているとき、本願の発明は、その特定のエナンチオマーに限定されないことが理解されるべきである。
[0069]化合物は、異なる互変異性体で存在し得る。本発明に係る化合物は、別段述べられない限り、すべての互変異性体を含むことを意味する。化合物の構造が、特定の互変異性体として示されているとき、本願の発明は、その特定の互変異性体に限定されないことが理解されるべきである。
[0070]本明細書および特許請求の範囲に開示されている化合物は、さらにエキソジアステレオ異性体およびエンドジアステレオ異性体として存在し得る。別段述べられない限り、本明細書および特許請求の範囲における任意の化合物の説明は、化合物の個々のエキソジアステレオ異性体と個々のエンドジアステレオ異性体の両方、ならびにそれらの混合物を含むことを意味する。化合物の構造が、特定のエンドジアステレオマーまたはエキソジアステレオマーとして示されているとき、本願の発明は、その特定のエンドジアステレオマーまたはエキソジアステレオマーに限定されないことが理解されるべきである。
[0071]さらに、本明細書および特許請求の範囲に開示されている化合物は、シス異性体およびトランス異性体として存在し得る。別段述べられない限り、本明細書および特許請求の範囲における任意の化合物の説明は、化合物の個々のシス異性体と個々のトランス異性体の両方、ならびにそれらの混合物を含むことを意味する。一例として、化合物の構造が、シス異性体として示されているとき、対応するトランス異性体またはシス異性体とトランス異性体との混合物は、本願の発明から除外されないことが理解されるべきである。化合物の構造が、特定のシス異性体またはトランス異性体として示されているとき、本願の発明は、その特定のシス異性体またはトランス異性体に限定されないことを理解されるべきである。
[0072]本発明に係る化合物は、塩の形態で存在してもよく、これも本発明によって包含される。塩は、典型的には、薬学的に許容され得るアニオンを含む薬学的に許容され得る塩である。「その塩」という用語は、酸性プロトン、典型的には酸のプロトンが金属カチオンまたは有機カチオンなどのカチオンで置き換えられたとき形成される化合物を意味する。適用可能な場合、塩は、薬学的に許容され得る塩であるが、これは、患者への投与を意図されない塩には必要ではない。例えば、化合物の塩において、その化合物は、無機酸または有機酸の共役塩基を塩のアニオン成分として用いて、無機酸または有機酸によってプロトン化されてカチオンを形成し得る。
[0073]「薬学的に許容され得る」塩という用語は、哺乳動物などの患者への投与に許容され得る塩（所与の投与レジメンに対して許容され得る哺乳動物の安全性を有する対イオンとの塩）を意味する。そのような塩は、薬学的に許容され得る無機塩基または有機塩基および薬学的に許容され得る無機酸または有機酸から誘導され得る。「薬学的に許容され得る塩」は、当該分野で公知の種々の有機対イオンおよび無機対イオンから誘導され、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アンモニウム、テトラアルキルアンモニウムなどを含む、化合物の薬学的に許容され得る塩のことを指し、その分子が、塩基性官能基を含むとき、有機酸または無機酸の塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ギ酸塩、酒石酸塩、ベシル酸塩、メシル酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩などのことを指す。
[0074]「タンパク質」という用語は、本明細書ではその通常の科学的意味で使用される。本明細書では、約１０個以上のアミノ酸を含むポリペプチドをタンパク質と見なす。タンパク質は、天然のアミノ酸を含み得るが、非天然のアミノ酸も含み得る。
[0075]「単糖」という用語は、本明細書ではその通常の科学的意味で使用され、最も一般的には５個の炭素原子（ペントース）、６個の炭素原子（ヘキソース）または９個の炭素原子（シアル酸）を含む５～９個の（ヒドロキシル化された）炭素原子の鎖の環化時の分子内ヘミアセタール形成から生じる酸素含有複素環のことを指す。典型的な単糖は、リボース（Ｒｉｂ）、キシロース（Ｘｙｌ）、アラビノース（Ａｒａ）、グルコース（Ｇｌｕ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）およびＮ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）である。
[0076]「サイトカイン」という用語は、本明細書ではその通常の科学的意味で使用され、それらの同族受容体に結合し、その後の細胞シグナル伝達を引き起こすことによって免疫細胞の活性を調節する小分子タンパク質（５～２０ｋＤａ）である。サイトカインには、ケモカイン、インターフェロン（ＩＦＮ）、インターロイキン、モノカイン、リンフォカイン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が含まれる。サイトカインの例は、ＩＬ－１アルファ（ＩＬ１ａ）、ＩＬ－１ベータ（ＩＬ１ｂ）、ＩＬ－２（ＩＬ２）、ＩＬ－４（ＩＬ４）、ＩＬ－５（ＩＬ５）、ＩＬ－６（ＩＬ６）、ＩＬ８（ＩＬ－８）、ＩＬ－１０（ＩＬ１０）、ＩＬ－１２（ＩＬ１２）、ＩＬ－１５（ＩＬ１５）、ＩＦＮ－アルファ（ＩＦＮＡ）、ＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－Ｇ）およびＴＮＦ－アルファ（ＴＮＦＡ）である。
[0077]「抗体」という用語は、本明細書ではその通常の科学的意味で使用される。抗体は、特定の抗原を認識して結合することができる、免疫系によって生成されるタンパク質である。抗体は、糖タンパク質の一例である。本明細書における抗体という用語は、その最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体フラグメント、ならびに二本鎖抗体および一本鎖抗体を含む。「抗体」という用語は、本明細書では、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および癌抗原に特異的に結合する抗体も含むことを意味する。「抗体」という用語は、免疫グロブリン全体を含むことを意味するが、抗体の抗原結合フラグメントも含むことを意味する。さらに、この用語は、遺伝的に操作された抗体および抗体の誘導体を含む。抗体、抗体のフラグメントおよび遺伝的に操作された抗体は、当該分野で公知の方法によって得ることができる。抗体の典型的な例としては、とりわけ、アブシキシマブ、リツキシマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、エファリツマブ、アレムツズマブ、アダリムマブ、セツキシマブ、オマリズマブ、ベバシズマブ、ナタリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、エクリズマブ、ゴリムマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、ウステキヌマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、デノスマブ、ベリムマブ、イピリムマブおよびブレンツキシマブが挙げられる。
[0078]「抗体フラグメント」は、本明細書では、その抗原結合領域または可変領域を含むインタクトな抗体の一部と定義される。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント、ダイアボディ、ミニボディ、トリアボディ、テトラボディ、鎖状抗体、一本鎖抗体分子、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、抗体フラグメントから形成された多機能性抗体フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されたフラグメント、または標的抗原（例えば、癌細胞抗原、ウイルス抗原または微生物抗原）に免疫特異的に結合する上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。
[0079]「抗体構築物」という用語は、本明細書では、２つ以上の異なるタンパク質の共有結合的に連結された組み合わせと定義され、ここで、１つのタンパク質が、抗体または抗体フラグメントであり、他のタンパク質は、抗体、抗体フラグメントまたはサイトカインなどのポリペプチドである。典型的には、それらのタンパク質の１つは、腫瘍関連受容体または抗原に対して高い親和性を有する抗体または抗体フラグメントであり、他のタンパク質の１つ（またはそれ以上）は、免疫細胞上の受容体または抗原に対して高い親和性を有する抗体、抗体フラグメントまたはポリペプチドである。
[0080]「抗原」は、本明細書では、抗体が特異的に結合する実体と定義される。
[0081]「特異的結合」および「特異的に結合する」という用語は、本明細書では、抗体または抗体が標的抗原の対応するエピトープと結合し、他の多数の抗原とは結合しない高度に選択的な様式と定義される。典型的には、抗体または抗体誘導体は、少なくとも約１×１０－７Ｍ、好ましくは１０－８Ｍ～１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍまたは１０－１２Ｍの親和性で結合し、所定の抗原または近縁抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対する親和性よりも少なくとも２倍高い親和性で所定の抗原に結合する。
[0082]「二重特異性」という用語は、本明細書では、腫瘍細胞上または免疫細胞上に存在し得る２つの異なる受容体または抗原（または単一抗原上の異なるエピトープ）に対して親和性を有する抗体構築物と定義され、二重特異性は、様々な分子フォーマットであり得、異なる結合価を有し得る。
[0083]「三重特異性」という用語は、本明細書では、腫瘍細胞上または免疫細胞上に存在し得る３つの異なる受容体または腫瘍関連抗原（または単一抗原上の異なるエピトープ）に対して親和性を有する抗体構築物と定義され、三重特異性は、様々な分子フォーマットであり得、異なる結合価を有し得る。
[0084]「多重特異性」という用語は、本明細書では、腫瘍細胞上または免疫細胞上に存在し得る少なくとも２つの異なる受容体または抗原（または１つ以上の単一抗原上の異なるエピトープ）に対して親和性を有する抗体構築物と定義され、多重特異性は、様々な分子フォーマットであり得、異なる結合価を有し得る。
[0085]「二パラトープ」という用語は、本明細書では、２つの明確に異なるエピトープに対して親和性を有する抗体と定義されるが、両方のエピトープが、同じ受容体上または腫瘍関連抗原上に存在する。
[0086]「二機能性」という用語は、本明細書では、２つの明確に異なる特性を有する抗体、例えば、２つの明確に異なるエピトープもしくは腫瘍関連抗原に結合することができる抗体、または特定のエピトープもしくは腫瘍関連抗原に結合することができ、小分子ペイロードも担持する抗体と定義される。
[0087]「三機能性」という用語は、本明細書では、３つの明確に異なる特性を有する抗体、例えば、３つの明確に異なるエピトープまたは腫瘍関連抗原に結合することができる抗体、あるいは２つの明確に異なるエピトープもしくは腫瘍関連抗原に結合することができ、小分子ペイロードも担持する抗体、または特定のエピトープもしくは腫瘍関連抗原に結合することができ、２つの異なる小分子ペイロードも担持する抗体と定義される。
[0088]「多機能性」という用語は、本明細書では、多数の明確に異なる特性を有する抗体、例えば、複数の明確に異なるエピトープもしくは腫瘍関連抗原に結合することができる抗体、または特定のエピトープもしくは腫瘍関連抗原に結合することができ、複数の小分子ペイロードも担持する抗体またはそれらのバリエーションと定義される。
[0089]「Ｆｃサイレント」という用語は、本明細書では、Ｆｃ－ガンマ受容体ＩＩＩ（ＣＤ１６）への結合が有意に減少しているかまたは無くなっている抗体と定義される。
[0090]「実質的な」または「実質的に」という用語は、本明細書では、集団、混合物またはサンプルの大部分、すなわち＞５０％、好ましくは集団の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を超えるものと定義される。
[0091]「リンカー」は、本明細書では、化合物の２つ以上の要素を接続する部分と定義される。例えば、抗体コンジュゲートでは、抗体とペイロードとが、リンカーを介して互いに共有結合的に接続されている。リンカーは、リンカー内の様々な部分を接続する１つ以上のリンカーおよびスペーサー部分を含み得る。
[0092]「極性リンカー」は、本明細書では、リンカーの極性を増加させ、それによって水溶解度を改善することを特に目的とした構造要素を含むリンカーと定義される。極性リンカーは、例えば、エチレングリコール、カルボン酸部分、スルホネート部分、スルホン部分、アシル化スルファミド部分、ホスフェート部分、ホスフィネート部分、アミノ基またはアンモニウム基から選択される１つ以上の単位またはそれらの組み合わせを含み得る。
[0093]「スペーサー」またはスペーサー部分（Ｓｐ）は、本明細書では、リンカーの２つ（またはそれ以上の）部分の間隔を空け（すなわち、それらの間に距離を提供し）、それらを一緒に共有結合的に連結する部分と定義される。リンカーは、下記で定義されるように、例えば、リンカー構築物、リンカーコンジュゲートまたはバイオコンジュゲートの一部であり得る。スペーサーは、共有結合またはＣ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰから選択される少なくとも１個、好ましくは２～５０個の原子の鎖であり得る。本明細書では、原子の鎖は、スペーサーの末端から延びる最短の原子鎖のことを指す。鎖内の原子は、骨格原子と呼ばれることもある。当業者が理解するように、Ｃ、ＮおよびＰなどの３以上の結合価を有する原子は、これらの原子の結合価を完了させるように適切に官能化され得る。
[0094]「バイオコンジュゲート」は、本明細書では、生体分子がリンカーを介してペイロードに共有結合的に接続されている化合物と定義される。バイオコンジュゲートは、１つ以上の生体分子および／または１つ以上の標的分子を含む。
[0095]「生体分子」は、本明細書では、天然から単離することができる任意の分子、または天然由来の高分子構造、特に核酸、タンパク質、グリカンおよび脂質の構成要素であるより小さな分子基本単位から構成される任意の分子と定義される。生体分子の例としては、酵素、（非触媒）タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、オリゴヌクレオチド、単糖、オリゴ糖、多糖、グリカン、脂質およびホルモンが挙げられる。
[0096]「ペイロード」という用語は、抗体などの標的化部分に共有結合している部分のことを指す。したがって、ペイロードは、リンカーを介して標的化部分に共有結合している１つの開放末端を有する一価部分のことを指す。ペイロードは、小分子または生体分子であり得る。
[0097]「分子フォーマット」という用語は、抗体上の異なる官能基の数および相対化学量論のことを指し、２：１：１分子フォーマットは、同じ標的に結合する２つのＣＤＲドメインおよび結合した別の機能性分子の１つの存在を有する三機能性抗体を表し、１：１：２：２分子フォーマットは、２つの異なる標的（または同じエピトープ上の２つの標的）に結合する２つの異なるＣＤＲドメインおよび結合した別の機能性分子の１つの存在を有する二重特異性抗体に基づく四機能性抗体を表す。機能性部分自体の一方（または両方）は、抗体骨格の標的とは異なり得る、特定の標的に結合することができるポリペプチドフラグメントでもあり得る。「２：１分子フォーマット」という用語は、単一の機能的ペイロードにコンジュゲートされた二価のモノクローナル抗体からなるタンパク質コンジュゲートのことを指す。
[0098]「補体依存性領域」または「ＣＤＲ」という用語は、特定の受容体または抗原に結合することができる抗体の可変フラグメントのことを指す。
[0099]本発明
本発明者らは、一方では腫瘍細胞に特異的であり、他方ではＴ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージ、顆粒球などの免疫細胞に特異的である、多機能性抗体構築物を開発した。本発明の多機能性抗体構築物はさらに、腫瘍微小環境または腫瘍リソソームにおける特異的放出のための１つ以上の異なる小分子ペイロードを含み得る。初めて、分子フォーマットを完全に制御し、遺伝子操作を必要とせずに、そのような二機能性抗体構築物または多機能性抗体構築物を調製することが可能になった。本発明は、多機能性抗体構築物、ならびに本発明に係る多機能性抗体構築物の（医薬的）使用に関する。
[0100]ここで以下、分子部分は、出発物質、中間体および最終生成物において定義される。当業者は、分子のその部分が変換中に影響を受けない限り、それらのいずれか１つの好ましい実施形態の任意の定義が他の化合物に等しく適用されることを理解する。同様に、本発明に係るプロセスについて構造的に定義されるものはいずれも、本発明に係る化合物に等しく適用される。
[0101]多機能性抗体構築物
第１の態様において、本発明は、少なくとも１つの抗体（Ａｂ）と、２つの別個のペイロード（Ｄ１）および（Ｄ２）と、を含む多機能性抗体構築物に関する。本明細書において、ペイロードの少なくとも１つはポリペプチドであり、他のペイロードは別のポリペプチド、細胞毒、別の小分子またはオリゴヌクレオチドであり得る。１つの実施形態において、多機能性抗体構築物は、第３の別個のペイロード（Ｄ３）を含み得る。
[0102]本発明に係る多機能性抗体構築物は、構造（１）または（２）を有し得る。
Figure 2024506022000002
ここで、
Ａｂは、抗体であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５は、リンカーであり；
ｘ１およびｘ２は、それぞれ個別に１～８の範囲の整数であり、ｘ１＋ｘ２＝２～１０であり；
ＢＭは、分枝部分であり；
ｍおよびｎは、それぞれ独立して、０または１であり；
ｘ３は、１～４の範囲の整数であり；
Ｄ１およびＤ２は、ポリペプチド、小分子、細胞毒およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される２つの別個のペイロードであり、Ｄ１およびＤ２の少なくとも１つは、ポリペプチドである。
[0103]構造（１）に記載の多機能性抗体構築物は、抗体上の別個の結合点に接続された両方の別個のペイロードを有する。構造（２）に記載の多機能性抗体構築物は、同じ分枝リンカーに接続された両方の別個のペイロードを有し、そのリンカーは、抗体上に単一または複数の結合点を有し得る。下記でより詳細に説明されるように、ペイロードを抗体に結合させるための方法は、当該分野で公知の任意のコンジュゲーション技術であり得る。好ましくは、構造（１）に記載の多機能性抗体構築物の場合、２つの別個のペイロードに対して２つの異なるコンジュゲーション法が使用されるのに対して、構造（２）に記載の多機能性抗体構築物は、２つの別個のペイロードを有するリンカー－ペイロード構築物を接続する単一のコンジュゲーション法によって容易に調製することができる。
[0104]抗体
Ａｂは、抗体である。抗体は、当該分野で公知であり、抗体には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ミニボディ、アフィボディ、アフィリン（ａｆｆｙｌｉｎ）、アフィマー、アトリマー（ａｔｒｉｍｅｒｓ）、ファイノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、Ｃｙｓ－ノット、ＤＡＲＰｉｎ、アドネクチン／セントリイン（ｃｅｎｔｒｙｉｎ）、ノッチン、アンチカリン、ＦＮ３、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、ＯＢｏｄｙ、二環式ペプチドおよび三環式ペプチドが含まれる。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体であり、より好ましくは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体からなる群から選択される。さらにより好ましくは、Ａｂは、ＩｇＧ抗体である。ＩｇＧ抗体は、任意のＩｇＧアイソタイプであり得る。抗体は、任意のＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＩ３またはＩｇＧ４であり得る。好ましくは、Ａｂは、完全長抗体であるが、Ａｂは、Ｆｃフラグメントであってもよい。
[0105]抗体Ａｂは、典型的には、腫瘍細胞上の細胞外受容体に特異的であり、好ましくは、腫瘍細胞上の細胞外受容体は、５Ｔ４、ＡＤＡＭ－９、ＡＭＨＲＩＩ、ＡＳＣＴ２、ＡＳＬＧ６５９、ＡＳＰＨＤ１、ａｖ－インテグリン、Ａｘｌ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＢＣＭＡ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ブレビカン、ｃ－ＫＩＴ、ｃ－Ｍｅｔ、Ｃ４．４ａ、ＣＡ－ＩＸ、カドヘリン－６、ＣａｎＡｇ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８／シンデカン－１、ＣＤ１６６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０５、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２２８、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２４、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４８ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＥＡＣＡＭ５、クローディン－１８．２、クローディン－６、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＬ－１、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲＩＰＴＯ、ＣＳ１、ＣＸＣＲ５、ＤＬＫ－１、ＤＬＬ３、ＤＰＥＰ３、Ｅ１６、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ２Ｒ、ＥＴＢＲ、ＦＡＰ、ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２、ＦｃＲＨ５、ＦＧＦＲ２、フィブロネクチン、ＦＬＴ３、葉酸受容体アルファ、Ｇａｌ－３ＢＰ、ＧＤ３、ＧＤＮＦ－Ｒａ１、ＧＥＤＡ、ＧＦＲＡ１、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ｇｐＮＭＢ、ＧＰＲ１７２Ａ、ＧＰＲ１９、ＧＰＲ５４、グアニルシクラーゼＣ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ２０Ｒα、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＬＧＲ５、ＬＩＶ－１、ＬＲＲＣ１５、ＬＹ６４、Ｌｙ６Ｅ、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ、ＬＹ６Ｋ、ＭＤＰ、ＭＦＩ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＯＳＰＤ２、ＭＰＦ、ＭＳＧ７８３、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ＮＣＡ、ネクチン－４、Ｎｏｔｃｈ３、Ｐ－カドヘリン、Ｐ２Ｘ５、ＰＤ－Ｌ１、ＰＭＥＬ１７、ＰＲＬＲ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣＡ ｈｌｇ、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７、ＲＥＴ、ＲＮＦ４３、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、Ｓｅｍａ ５ｂ、ＳＬＩＴＲＫ６、ＳＳＴＲ２、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ７２、ＴＥＮＢ２、ＴＦ、ＴＩＭ－１、ＴＭ４ＳＦ、ＴＭＥＦＦ、ＴＭＥＭ１１８、ＴＭＥＭ４６、トランスフェリン、ＴＲＯＰ－２、ＴｒｐＭ４、ＴＷＥＡＫＲ、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、テネイシンからなる群から選択される。
[0106]構造（１）に記載の多機能性抗体構築物において、抗体は、ｘ１個のペイロードＤ１の存在およびｘ２個のペイロードＤ２の存在で機能化されている。ここで、ｘ１およびｘ２は、それぞれ個別に、１～８の範囲の整数であり、ｘ１＋ｘ２＝２～１０である。ｘ１およびｘ２の正確な数は、分子フォーマット比を決定し、使用されるコンジュゲーション法によって決定される。好ましい１つの実施形態において、ｘ１とｘ２は、同じであり、両方とも１～４の範囲の整数であり、好ましくは両方または１もしくは２であり、最も好ましくは両方とも１である。別の好ましい実施形態において、ｘ１は、１～８の範囲の整数であり、ｘ２は、１～４の範囲の整数であり、好ましくは、ｘ２は、１または２であり、最も好ましくは、ｘ２は、２である。あるいは、ｘ１は、１～４の範囲の整数であり、ｘ２は、１～８の範囲の整数であり、好ましくは、ｘ１は、１または２であり、最も好ましくは、ｘ１は、２である。
[0107]構造（２）に記載の多機能性抗体構築物において、抗体は、ペイロードＤ１とペイロードＤ２の両方を有するｘ３個のリンカー構築物の存在によって機能化される。ここで、ｘ３は、１～４の範囲の整数であり、好ましくは、ｘ３は、１、２または４であり、より好ましくは、ｘ３は、１または２である。
[0108]ペイロード
ペイロードの少なくとも１つ、典型的にはＤ１は、ポリペプチドである。そのポリペプチドペイロードは、抗体Ａｂとは異なる標的に対して親和性を有する。したがって、本発明に係る抗体構築物は、多機能性であり、少なくとも２つの別個の標的を標的とする。好ましくは、ポリペプチドは、免疫細胞エンゲージャー、チェックポイント阻害剤、および細胞表面受容体の結合剤から選択され、好ましくは、そのポリペプチドは、免疫細胞結合ポリペプチドまたはチェックポイント阻害ポリペプチドである。
[0109]免疫細胞結合ポリペプチドは、当該分野で公知であり、任意の公知のそのようなポリペプチドが、本発明の文脈で使用され得る。免疫細胞結合ポリペプチドは、好ましくは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージもしくは顆粒球上の細胞受容体に特異的であるか、またはＩＬ２もしくはＩＬ１５に特異的である。ここで、Ｔ細胞上の細胞受容体は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４、ＣＤ２７、Ｖγ９Ｖδ２およびＩＣＯＳからなる群から選択されること；ＮＫ細胞上の細胞受容体は、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ２８、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ、ＤＮＡＭ－１およびＣＤ１６１からなる群から選択されること；単球上またはマクロファージ上の細胞受容体はＣＤ６４であること；顆粒球上の細胞受容体はＣＤ８９であることが好ましい。
[0110]チェックポイント阻害ポリペプチドは、当該分野で公知であり、任意の公知のそのようなポリペプチドが、本発明の文脈において使用され得る。好ましくは、チェックポイント阻害ポリペプチドは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３またはＶＩＳＴＡに特異的である。
[0111]細胞表面受容体に結合するポリペプチドは、当該分野で公知であり、任意の公知のそのようなポリペプチドが、本発明の文脈において使用され得る。
[0112]特に好ましい実施形態において、上記ポリペプチドは、ＯＫＴ３、ＵＣＨＴ１、ＢＭＡ０３１、ＶＨＨ ６Ｈ４、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒ複合体、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒ融合物、ＩＬ２に特異的な抗体およびＩＬ１５に特異的な抗体からなる群から選択される。最も好ましくは、上記ポリペプチドは、ＯＫＴ３、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒ融合物、ＩＬ１５、ｍＡｂ６０２、Ｎａｒａ１またはＴＣＢ２である。
[0113]第２のペイロード、典型的にはＤ２は、ポリペプチドであってもよいし、細胞毒、別の小分子またはオリゴヌクレオチドであってもよい。第２のペイロードもポリペプチドである場合、それは、第１のペイロードとは異なるポリペプチドである。第２のペイロードは、細胞毒または他の小分子などの小分子であってもよい。小分子は、典型的には、低～中分子量の化合物、例えば、約１００～約２５００Ｄａ、好ましくは、約３００～約１７５０Ｄａを有する。これらには、下記で定義されるような活性物質（例えば、細胞毒）およびレポーター分子（例えば、フルオロフォア、放射標識）が含まれ得る。好ましい実施形態において、第２のペイロードは、ポリペプチド、細胞毒またはオリゴヌクレオチド、より好ましくは、ポリペプチドまたは細胞毒である。１つの実施形態において、第２のペイロードは、ポリペプチドである。別の実施形態において、第２のペイロードは、細胞毒である。
[0114]細胞毒は、抗体－コンジュゲートの分野において、特に癌の治療について、周知である。抗体－薬物コンジュゲートは、典型的には、細胞傷害性ペイロードを有し、任意のそのような細胞傷害性ペイロードが、本発明の文脈において使用され得る。本明細書において、「細胞毒」は、「抗癌剤」とも呼ばれ得る。細胞毒は、薬物またはプロドラッグであり得、薬学的に活性な化合物、特に、低～中分子量の化合物（例えば、約２００～約２５００Ｄａ、好ましくは、約３００～約１７５０Ｄａ）からなる群から選択される。
[0115]細胞毒の例としては、コルヒチン、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリチアマイシン、チューブリシン（ｔｕｂｕｌｙｓｉｎｓ）、イリノテカン、阻害性ペプチド、アマニチン、エリブリン、ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ、デュオカルマイシン、メイタンシン、アウリスタチン、エンジイン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）またはインドリノベンゾジアゼピン二量体（ＩＧＮ）またはＰＮＵ１５９，６８２が挙げられる。特に好ましい細胞毒には、ＭＭＡＥなどのアウリスタチン、メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）、カリチアマイシンおよびカンプトテシンが含まれる。
[0116]ペイロードＤ１およびＤ２の好ましい組み合わせは、以下のとおりである：
（ｉ）Ｄ１が、ＣＤ３標的化ポリペプチドであり、Ｄ２が、ＣＤ２８標的化ポリペプチドであるか；
（ｉｉ）Ｄ１が、ＩＬ１５またはＩＬ１５標的化ポリペプチドであり、Ｄ２が、ＣＤ１６標的化ポリペプチドであるか；
（ｉｉｉ）Ｄ１が、ＩＬ２またはＩＬ２標的化ポリペプチドであり、Ｄ２が、ＣＤ１６標的化ポリペプチドであるか；
（ｉｖ）Ｄ１が、ＮＫｐ４６標的化ポリペプチドであり、Ｄ２が、ＣＤ１６標的化ポリペプチドであるか；
（ｖ）Ｄ１が、細胞毒であり、Ｄ２が、チェックポイント阻害剤であり、好ましくは、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１を標的とするポリペプチドから選択されるか；
（ｖｉ）Ｄ１が、ＯＸ４０標的化ポリペプチドであり、Ｄ２が、ＣＤ１３７標的化ポリペプチドであるか；
（ｖｉｉ）Ｄ１が、ＰＤ－Ｌ１標的化ポリペプチドであり、Ｄ２が、ＣＤ１３７標的化ポリペプチドであるか；
（ｖｉｉｉ）Ｄ１が、細胞毒であり、Ｄ２が、ＩＬ１５またはＩＬ１５標的化ポリペプチドであるか；
（ｉｘ）Ｄ１が、細胞毒であり、Ｄ２が、ＩＬ２またはＩＬ２標的化ポリペプチドであるか；
（ｘ）Ｄ１が、細胞毒であり、Ｄ２が、ＣＤ１６標的化ポリペプチドであるか；または
（ｘｉ）Ｄ１が、ＴＬＲ７アゴニストまたはＴＲＬ８アゴニストであり、Ｄ２が、ＣＤ１６標的化ポリペプチドである。
[0117]実施形態（ｖ）では、任意のチェックポイント阻害剤が使用され得る。好ましいチェックポイント阻害剤には、ＰＤ－１標的化ポリペプチドおよびＰＤ－Ｌ１標的化ポリペプチドが含まれる。現在の癌治療では、抗体－薬物コンジュゲートは、チェックポイント阻害剤と同時投与されることが多い。本発明は、抗体－薬物コンジュゲートを単一の多機能性抗体構築物中のチェックポイント阻害剤と組み合わせるための汎用的な方法を提供し、それにより、現在使用されている併用療法が大幅に容易になる。したがって、細胞毒とチェックポイント阻害剤との組み合わせが、本発明の文脈において特に好ましい。
[0118]本発明に係る多機能性抗体構築物は、例えば、リンカーの１つが、典型的にはリンカーを介して、第３の別個のペイロードＤ３に接続された（追加の）分枝部分を含むとき、第３の別個のペイロードを含み得る。ペイロード分子は、抗体に共有結合した部分であってコンジュゲートの取り込み時および／またはリンカーの切断時に抗体から放出される部分として、当該分野、特に抗体コンジュゲートの分野で周知である。好ましい実施形態において、ペイロードは、活性物質、レポーター分子、ポリマー、固体表面、ヒドロゲル、ナノ粒子、微粒子および生体分子からなる群から選択される。特に好ましいペイロードは、活性物質およびレポーター分子、特に活性物質である。
[0119]本明細書における「活性物質」という用語は、薬理学的および／または生物学的物質、すなわち、生物学的および／または薬学的に活性な物質、例えば、薬物、プロドラッグ、細胞毒、診断薬、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドタグ、アミノ酸、グリカン、脂質、ビタミン、ステロイド、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡに関する。ペプチドタグの例としては、ヒトラクトフェリンまたはポリアルギニンのような細胞透過性ペプチドが挙げられる。グリカンの例は、オリゴマンノースである。アミノ酸の例は、リジンである。ペイロードが活性物質であるとき、その活性物質は、好ましくは、薬物およびプロドラッグからなる群から選択される。より好ましくは、活性物質は、薬学的に活性な化合物、特に、低～中分子量の化合物（例えば約２００～約２５００Ｄａ、好ましくは約３００～約１７５０Ｄａ）からなる群から選択される。さらに好ましい実施形態において、活性物質は、細胞毒、抗ウイルス剤、抗菌剤、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。細胞毒の例としては、コルヒチン、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリチアマイシン、チューブリシン、イリノテカン、阻害性ペプチド、アマニチン、エリブリン、ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ、デュオカルマイシン、メイタンシン、アウリスタチン、エンジイン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）またはインドリノベンゾジアゼピン二量体（ＩＧＮ）またはＰＮＵ１５９，６８２およびそれらの誘導体が挙げられる。好ましいペイロードは、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ、エキサテカン、ＳＮ－３８、ＤＸｄ、メイタンシノイド、カリケアマイシン、ＰＮＵ１５９，６８５およびＰＢＤ二量体から選択される。特に好ましいペイロードは、ＰＢＤ、ＭＭＡＥ、エキサテカンまたはＤＸｄである。１つの実施形態において、ペイロードは、メイタンシノイドである。１つの実施形態において、ペイロードは、エキサテカンまたはＤＸｄである。１つの実施形態において、ペイロードは、ＭＭＡＥである。１つの実施形態において、ペイロードは、ＰＤＢ二量体である。
[0120]本明細書における「レポーター分子」という用語は、その存在が容易に検出される分子、例えば、診断薬、色素、フルオロフォア、放射性同位体標識、造影剤、磁気共鳴イメージング剤または質量標識のことを指す。蛍光プローブとも呼ばれる多種多様のフルオロフォアが当業者に公知である。いくつかのフルオロフォアは、例えば、参照により援用されるＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，３ｒｄ Ｅｄ．２０１３，Ｃｈａｐｔｅｒ １０：“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ”，ｐ．３９５－４６３に詳細に説明されている。フルオロフォアの例としては、あらゆる種類のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（例えば、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５）、シアニン色素（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５）およびシアニン色素誘導体、クマリン誘導体、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体、ローダミンおよびローダミン誘導体、ボロンジピロメテン誘導体、ピレン誘導体、ナフタルイミド誘導体、フィコビリンタンパク質誘導体（例えば、アロフィコシアニン）、クロモマイシン、ランタニドキレートならびに量子ドットナノ結晶が挙げられる。
[0121]放射性同位体標識の例としては、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１１５Ｉｎ、１８Ｆ、１４Ｃ、６４Ｃｕ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、２１２Ｂｉ、８８Ｙ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、６６Ｇａ、６７Ｇａおよび１０Ｂが挙げられ、これは必要に応じて、キレート化部分、例えば、ＤＴＰＡ（無水ジエチレントリアミン五酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナンＮ，Ｎ’，Ｎ’’－三酢酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸）、ＤＴＴＡ（Ｎ１－（ｐ－イソチオシアナトベンジル）－ジエチレントリアミン－Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３－四酢酸）、デフェロキサミンまたはＤＦＡ（Ｎ’－［５－［［４－［［５－（アセチルヒドロキシアミノ）ペンチル］アミノ］－１，４－ジオキソブチル］ヒドロキシアミノ］ペンチル］－Ｎ－（５－アミノペンチル）－Ｎ－ヒドロキシブタンジアミド）またはＨＹＮＩＣ（ヒドラジノニコチンアミド）を介して接続される。同位体標識法は、当業者に公知であり、例えば、参照により援用されるＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，３ｒｄ Ｅｄ．２０１３，Ｃｈａｐｔｅｒ １２：“Ｉｓｏｔｏｐｉｃ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，ｐ．５０７－５３４に詳細に説明されている。
[0122]本発明に係る化合物中のペイロードＤ３として使用するのに適したポリマーは、当業者に公知であり、いくつかの例が、例えば、参照により援用されるＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，３ｒｄ Ｅｄ．２０１３，Ｃｈａｐｔｅｒ １８：“ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，ｐ．７８７－８３８に詳細に説明されている。ペイロードＤ３が、ポリマーであるとき、ペイロードＤ３は、好ましくは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、１，ｑ－ジアミノアルカンポリマー（ここで、ｑは、アルカン中の炭素原子の数であり、好ましくは、ｑは、２～２００、好ましくは２～１０の範囲の整数である）、（ポリ）エチレングリコールジアミン（例えば、１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン、およびより長いエチレングリコール鎖を含む等価物）、多糖（例えば、デキストラン）、ポリ（アミノ酸）（例えば、ポリ（Ｌ－リジン））およびポリ（ビニルアルコール）からなる群から独立して選択される。
[0123]ペイロードＤ３として使用するのに適した固体表面は、当業者に公知である。固体表面は、例えば、機能性表面（例えば、ナノ材料、カーボンナノチューブ、フラーレンまたはウイルスカプシドの表面）、金属表面（例えば、チタン、金、銀、銅、ニッケル、スズ、ロジウムまたは亜鉛表面）、金属合金表面（合金は、例えば、アルミニウム、ビスマス、クロム、コバルト、銅、ガリウム、金、インジウム、鉄、鉛、マグネシウム、水銀、ニッケル、カリウム、プルトニウム、ロジウム、スカンジウム、銀、ナトリウム、チタン、スズ、ウラン、亜鉛および／またはジルコニウムからのものである）、ポリマー表面（ポリマーは、例えば、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（ジメチルシロキサン）またはポリメチルメタクリレート、ポリアクリルアミド）、ガラス表面、シリコーン表面、クロマトグラフィー支持表面（クロマトグラフィー支持体は、例えば、シリカ支持体、アガロース支持体、セルロース支持体またはアルミナ支持体である）などである。ペイロードＤ３が、固体表面であるとき、Ｄは、機能性表面またはポリマー表面からなる群から独立して選択されることが好ましい。
[0124]ヒドロゲルは、当業者に公知である。ヒドロゲルは、ポリマー構成要素間の架橋によって形成される水膨潤ネットワークである。例えば、参照により援用されるＡ．Ｓ．Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．２０１２，６４，１８を参照のこと。ペイロードが、ヒドロゲルであるとき、ヒドロゲルは、ポリマーベースとしてポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）から構成されることが好ましい。
[0125]ペイロードＤ３として使用するのに適した微粒子およびナノ粒子は、当業者に公知である。種々の好適な微粒子およびナノ粒子が、例えば、参照により援用されるＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，３ｒｄ Ｅｄ．２０１３，Ｃｈａｐｔｅｒ １４：“Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”，ｐ．５４９－５８７に記載されている。微粒子またはナノ粒子は、任意の形状、例えば、球、棒、管、立方体、三角形および円錐であってもよい。好ましくは、微粒子またはナノ粒子は、球形である。微粒子およびナノ粒子の化学組成は、変動し得る。ペイロードＤ３が、微粒子またはナノ粒子であるとき、その微粒子またはナノ粒子は、例えば、ポリマー微粒子もしくはポリマーナノ粒子、シリカ微粒子もしくはシリカナノ粒子、または金微粒子もしくは金ナノ粒子である。粒子が、ポリマー微粒子またはポリマーナノ粒子であるとき、そのポリマーは、好ましくは、ポリスチレンもしくはスチレンのコポリマー（例えば、スチレンと、ジビニルベンゼン、ブタジエン、アクリレートおよび／またはビニルトルエンとのコポリマー）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルトルエン、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート（ｐＨＥＭＡ）またはポリ（エチレングリコールジメタクリレート／２－ヒドロキシエチルメタクリラ）［ポリ（ＥＤＧＭＡ／ＨＥＭＡ）］である。必要に応じて、微粒子またはナノ粒子の表面は、例えば、洗浄剤を用いて、２次ポリマーのグラフト重合によって、または別のポリマーもしくはスペーサー部分の共有結合などによって修飾される。
[0126]ペイロードＤ３は、生体分子であってもよい。生体分子およびその好ましい実施形態は、下記でより詳細に説明される。ペイロードＤ３が、生体分子であるとき、その生体分子は、タンパク質（抗体などの糖タンパク質を含む）、ポリペプチド、ペプチド、グリカン、脂質、核酸、オリゴヌクレオチド、多糖、オリゴ糖、酵素、ホルモン、アミノ酸および単糖からなる群から選択されることが好ましい。好ましい実施形態において、ペイロードＤ３は、オリゴヌクレオチドである。
[0127]本発明の文脈において、細胞傷害性ペイロードが特に好ましい。したがって、Ｄ２および／またはＤ３は、好ましくは、細胞毒であり、より好ましくは、コルヒチン、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、カンプトテシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキサン、カリケアマイシン、チューブリシン、イリノテカン、阻害性ペプチド、アマニチン、アマトキシン、エリブリン、ｄｅＢｏｕｇａｎｉｎ、デュオカルマイシン、エポチロン、マイトマイシン、コンブレタスタチン、メイタンシン、アウリスタチン、エンジイン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）またはインドリノベンゾジアゼピン二量体（ＩＧＮ）またはＰＮＵ１５９，６８２からなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、ペイロードは、ＭＭＡＥ、カリケアマイシンまたはエキサテカンである。
[0128]コンジュゲーション法
当該分野で公知の任意のコンジュゲーション法を使用して、本発明に係る多機能性抗体構築物を調製することができる。好適なコンジュゲーション法としては、チオールライゲーション、リジンライゲーション、付加環化（例えば、銅触媒クリック反応、歪み促進型アジド－アルキン付加環化、歪み促進型キノン－アルキン付加環化）が挙げられる。本発明の文脈において使用される好ましいコンジュゲーション法には、求核反応および付加環化が含まれ、好ましくは、付加環化は、［４＋２］付加環化または［３＋２］付加環化であり、求核反応は、マイケル付加または求核置換である。好適なコンジュゲーション法は、例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，３ｒｄ Ｅｄ．２０１３（ＩＳＢＮ：９７８－０－１２－３８２２３９－０）、国際公開第２０１４／０６５６６１号、ｖａｎ Ｇｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１５，２６，２２３３－２２４２、ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０５０５９４、ＰＣＴ／ＥＰ２０２１／０５０５９８およびＮＬ２０２６９４７に開示されている。
[0129]したがって、本発明に係るコンジュゲーションプロセスの好ましい実施形態において、コンジュゲーションは、求核置換またはマイケル反応などの求核反応を介して達成される。好ましい求核反応は、活性化エステルを用いた第１級アミノ基のアシル化である。好ましいマイケル反応は、バイオコンジュゲーションに広く用いられているマレイミド－チオール反応である。
[0130]したがって、本発明に係るコンジュゲーションプロセスの好ましい実施形態において、コンジュゲーションは、付加環化を介して達成される。好ましい付加環化は、（４＋２）付加環化（例えば、ディールス－アルダー反応）または（３＋２）付加環化（例えば、１，３－双極子付加環化）である。好ましくは、コンジュゲーション反応は、ディールス－アルダー反応または１，３－双極子付加環化である。好ましいディールス－アルダー反応は、逆電子要請型ディールス－アルダー付加環化である。別の好ましい実施形態において、１，３－双極子付加環化、より好ましくは、アルキン－アジド付加環化が用いられ、最も好ましくは、Ｑは、アルキン基であるかまたはアルキン基を含み、Ｆは、アジド基である。ディールス－アルダー反応および１，３－双極子付加環化などの付加環化は、当該分野で公知であり、当業者は、それらを行う方法を知っている。
[0131]接続基Ｚ
使用されるコンジュゲーション法の正確な性質は、本発明に係る多機能性抗体構築物に存在するリンカーの正確な構造を決定する。典型的には、抗体Ａｂに接続されるリンカーは、コンジュゲーション反応中に形成される接続基Ｚを含む。「接続基」という用語は、ある化合物の一部分と、同じ化合物の別の部分とを接続する構造要素のことを指す。例えば、Ｚは、抗体Ａｂを、必要に応じてＬ８などのリンカーを介して、ペイロードまたは分枝部分ＢＭに、必要に応じてＬ７などのリンカーを介して、接続し得る。当業者によって理解されるように、接続基の性質は、前記化合物の部分間の接続が得られる反応のタイプに依存する。一例として、Ｒ－Ｃ（Ｏ）－ＯＨ（またはその活性化エステル誘導体）のカルボキシル基を、Ｈ２Ｎ－Ｒ’のアミノ基と反応させてＲ－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－Ｒ’を形成するとき、Ｒは、接続基Ｚを介してＲ’に接続され、Ｚは、基－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－によって表される。接続基Ｚは、ＱとＦとの反応に由来するので、任意の形態をとることができる。さらに、本発明の実施にとって、接続基Ｚの性質は、重要ではない。
[0132]リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３は、典型的には、コンジュゲーション反応によって入手可能な接続基Ｚを含む。多機能性抗体構築物が構造（１）を有する場合、リンカーＬ１中の接続基Ｚの構造が、リンカーＬ２中のものと異なることが好ましく、それにより、多機能性抗体構築物の合成が単純化される。２つの別個のコンジュゲーション法を用いることにより、２つの別個のペイロードを接続することができる。しかしながら、同じコンジュゲーション法を両方のペイロードに対して使用する合成アプローチであって、Ｚの構造がリンカーＬ１とＬ２の両方において同じである合成アプローチも開発することができる。
[0133]接続基は、典型的には、反応性部分Ｆを含む抗体を、反応性部分Ｑを含むペイロードリンカー構築物と反応させることによって得られる。ここで、反応性部分Ｆと反応性部分Ｑは、相補的であり、これは、ＱがＦと反応して、接続基Ｚの形態の共有結合した構築物が形成されることを意味する。反応基Ｑを反応性部分Ｆに接続するために多数の有機反応が利用可能である。その結果として、多種多様な接続基Ｚが利用可能である。例えば、Ｚは、付加環化または求核反応によって入手可能であり得、好ましくは、付加環化は、［４＋２］付加環化または１，３－双極子付加環化であり、求核反応は、マイケル付加または求核置換である。コンジュゲーション反応は、当業者に公知であり、当業者は、適切な反応パートナーＦおよびＱを選択することができ、得られる接続基Ｚの性質を理解するだろう。反応基Ｑのいくつかの例示的な選択肢が、図５に提供されており、ＱおよびＦならびに対応する接続基Ｚのいくつかの例示的な組み合わせが、図１に提供されている。さらなる指針は、参照により援用されるＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，３ｒｄ Ｅｄ．２０１３（ＩＳＢＮ：９７８－０－１２－３８２２３９－０）、特にＣｈａｐｔｅｒ ３の２２９～２５８頁に提供されている。
[0134]例えば、Ｆが、チオール基を含むかまたはチオール基であるとき、相補的な基Ｑには、Ｎ－マレイミジル基およびアルケニル基が含まれ、対応する接続基Ｚは、図１に示されているとおりである。Ｆが、チオール基を含むかまたはチオール基であるとき、相補的な基Ｑには、アレンアミド基およびホスホンアミダイト基も含まれる。
[0135]例えば、Ｆが、ケトン基を含むかまたはケトン基であるとき、相補的な基Ｑには、（Ｏ－アルキル）ヒドロキシルアミノ基およびヒドラジン基が含まれ、対応する接続基Ｚは、図１に示されているとおりである。
[0136]例えば、Ｆが、アルキニル基を含むかまたはアルキニル基であるとき、相補的な基Ｑには、アジド基が含まれ、対応する接続基Ｚは、図１に示されているとおりである。
[0137]例えば、Ｆが、アジド基を含むかまたはアジド基であるとき、相補的な基Ｑには、アルキニル基が含まれ、対応する接続基Ｚは、図１に示されているとおりである。
[0138]例えば、Ｆが、シクロプロペニル基、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン基またはシクロアルキン基を含むかまたはそれらであるとき、相補的な基Ｑには、テトラジニル基が含まれ、対応する接続基Ｚは、図１に示されているとおりである。特定の場合において、Ｚは、中間構造にすぎず、Ｎ２を放出し、それによってジヒドロピリダジン（アルケンとの反応から）またはピリダジン（アルキンとの反応から）を生成する。
[0139]例えば、Ｆが、テトラジニル基を含むかまたはテトラジニル基であるとき、相補的な基Ｑには、シクロプロペニル基、ｔｒａｎｓ－シクロオクテン基またはシクロアルキン基が含まれ、対応する接続基Ｚは、図１に示されているとおりである。特定の場合において、Ｚは、中間構造にすぎず、Ｎ２を放出し、それによってジヒドロピリダジン（アルケンとの反応から）またはピリダジン（アルキンとの反応から）を生成する。
[0140]ＦおよびＱのさらなる好適な組み合わせ、ならびに得られる接続基Ｚの性質は、当業者に公知であり、例えば、参照により援用されるＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，３ｒｄ Ｅｄ．２０１３（ＩＳＢＮ：９７８－０－１２－３８２２３９－０），Ｃｈａｐｔｅｒ ３の２２９～２５８頁に記載されている。バイオコンジュゲーションプロセスに適した相補的な反応基のリストは、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，３ｒｄ Ｅｄ．２０１３（ＩＳＢＮ：９７８－０－１２－３８２２３９－０）のＣｈａｐｔｅｒ ３の２３０～２３２頁の表３．１に開示されており、この表の内容は、参照により本明細書中に明確に援用される。
[0141]好ましい実施形態において、各Ｚは、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－ＮＲ２－、－Ｎ＝Ｎ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ２－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ２、－ＮＲ２－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ２－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－ＮＲ２－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ２－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ２－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）２－ＮＲ２－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）－ＮＲ２－、－Ｏ－ＮＲ２－Ｃ（Ｏ）－、－Ｏ－ＮＲ２－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－ＮＲ２－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ２－、－ＮＲ２－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－、－ＮＲ２－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－ＮＲ２－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＲ２－、－Ｏ－ＮＲ２－Ｃ（Ｓ）－、－Ｏ－ＮＲ２－Ｃ（Ｓ）－Ｏ－、－Ｏ－ＮＲ２－Ｃ（Ｓ）－ＮＲ２－、－ＮＲ２－Ｏ－Ｃ（Ｓ）－、－ＮＲ２－Ｏ－Ｃ（Ｓ）－Ｏ－、－ＮＲ２－Ｏ－Ｃ（Ｓ）－ＮＲ２－、－Ｏ－Ｃ（Ｓ）－、－Ｏ－Ｃ（Ｓ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｃ（Ｓ）－ＮＲ２－、－ＮＲ２－Ｃ（Ｓ）－、－ＮＲ２－Ｃ（Ｓ）－Ｏ－、－ＮＲ２－Ｃ（Ｓ）－ＮＲ２－、－Ｓ－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｓ－Ｓ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｓ－Ｓ（Ｏ）２－ＮＲ２－、－ＮＲ２－Ｏ－Ｓ（Ｏ）－、－ＮＲ２－Ｏ－Ｓ（Ｏ）－Ｏ－、－ＮＲ２－Ｏ－Ｓ（Ｏ）－ＮＲ２－、－ＮＲ２－Ｏ－Ｓ（Ｏ）２－、－ＮＲ２－Ｏ－Ｓ（Ｏ）２－Ｏ－、－ＮＲ２－Ｏ－Ｓ（Ｏ）２－ＮＲ２－、－Ｏ－ＮＲ２－Ｓ（Ｏ）－、－Ｏ－ＮＲ２－Ｓ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｏ－ＮＲ２－Ｓ（Ｏ）－ＮＲ２－、－Ｏ－ＮＲ２－Ｓ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｏ－ＮＲ２－Ｓ（Ｏ）２－ＮＲ２－、－Ｏ－ＮＲ２－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒ２）２－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒ２）２－、－ＮＲ２－Ｐ（Ｏ）（Ｒ２）２－、および（Ｚ１）～（Ｚ７１）のうちのいずれか１つによって表される部分からなる群から独立して選択される。ここで、Ｒ２は、水素、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ２－Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２－Ｃ２４アルキニル基およびＣ３－Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立して選択され、そのアルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は、置換されていてもよい。
[0142]より好ましくは、各Ｚは、スクシンイミド、トリアゾール、シクロヘキセン、シクロヘキサジエン、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、ピラゾリン、ピペラジン、チオエーテル、アミドまたはイミド基からなる群から選択される部分を含む。好ましくは、Ｚは、トリアゾール、シクロヘキセン、シクロヘキサジエン、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、ピラゾリン、ピペラジン、チオエーテル、アミドまたはイミド基からなる群から選択されるから選択される部分を含む。特に好ましい実施形態において、Ｚは、トリアゾール部分またはスクシンイミド部分を含む。トリアゾール部分が、Ｚに存在することが特に好ましい。
[0143]第１の好ましい実施形態において、Ｚは、付加環化によって形成される。好ましい付加環化は、（４＋２）付加環化（例えば、ディールス－アルダー反応）または（３＋２）付加環化（例えば、１，３－双極子付加環化）である。好ましくは、コンジュゲーション反応は、ディールス－アルダー反応または１，３－双極子付加環化である。好ましいディールス－アルダー反応は、逆電子要請型ディールス－アルダー付加環化である。別の好ましい実施形態において、１，３－双極子付加環化、より好ましくは、アルキン－アジド付加環化が用いられ、最も好ましくは、Ｑは、アルキン基であるかまたはアルキン基を含み、Ｆは、アジド基である。ディールス－アルダー反応および１，３－双極子付加環化などの付加環化は、当該分野で公知であり、当業者は、それらを行う方法を知っている。
[0144]好ましくは、Ｚは、トリアゾール、シクロヘキセン、シクロヘキサジエン、［２．２．２］－ビシクロオクタジエン、［２．２．２］－ビシクロオクテン、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、ピラゾリン、ピペラジン、チオエーテル、アミドまたはイミド基からなる群から選択される部分を含む。トリアゾール部分が、Ｚに存在することが特に好ましい。１つの実施形態において、Ｚは、（ヘテロ）シクロアルケン部分を含み、すなわち、（ヘテロ）シクロアルキン部分を含むＱから形成される。別の実施形態において、Ｚは、（ヘテロ）シクロアルカン部分を含み、すなわち、（ヘテロ）シクロアルケン部分を含むＱから形成される。
[0145]好ましい実施形態において、Ｚは、構造（Ｚ１）を有する：
Figure 2024506022000003
[0146]ここで、－－－として示される結合は、単結合または二重結合である。さらに、
Ｒ１５は、水素、ハロゲン、－ＯＲ１６、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ１６、－Ｓ（Ｏ）３ （－）、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ６－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ７－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、そのアルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基および（ヘテロ）アリールアルキル基は、置換されていてもよく、２つの置換基Ｒ１５は、一緒に連結して、置換されていてもよい環化シクロアルキルまたは置換されていてもよい環化（ヘテロ）アレーン置換基を形成してもよく、Ｒ１６は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ６－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ７－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
Ｙ２は、Ｃ（Ｒ３１）２、Ｏ、Ｓ、Ｓ（＋）Ｒ３１、Ｓ（Ｏ）Ｒ３１、Ｓ（Ｏ）＝ＮＲ３１またはＮＲ３１であり、Ｓ（＋）は、Ｂ（－）によって平衡化されたカチオン性硫黄原子であり、Ｂ（－）は、アニオンであり、各Ｒ３１は、個別にＲ１５であるか、またはＬを介して接続される、Ｑ２もしくはＤとの接続であり；
ｕは、０、１、２、３、４または５であり；
ｕ’は、０、１、２、３、４または５であり、ここで、ｕ＋ｕ’＝０、１、２、３、４、５、６、７または８であり；
ｖ＝８～１６の範囲の整数であり；
環Ｚは、付加環化によって形成され、好ましくは、下記で定義される（Ｚａ）～（Ｚｎ）から選択される。
[0147]－－－として示される結合が二重結合である場合、ｕ＋ｕ’＝４、５、６、７または８であることが好ましい。好ましくは、＊でラベルされた波状結合は、必要に応じてリンカーを介して抗体Ａｂに接続され、＊＊でラベルされた波状結合は、必要に応じてリンカーを介してペイロードに接続される。
[0148]環Ｚは、付加環化反応によって形成され、好ましくは、トリアゾール、シクロヘキセン、シクロヘキサジエン、［２．２．２］－ビシクロオクタジエン、［２．２．２］－ビシクロオクテン、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、ピラゾリンまたはピペラジンである。最も好ましくは、環Ｚは、トリアゾール環である。環Ｚは、好ましくは、下記に示される（Ｚａ）～（Ｚｎ）から選択される構造を有し、＊＊でラベルされた炭素原子は、環Ｚが縮合している（ヘテロ）シクロアルカンまたは（ヘテロ）シクロアルケン環の２つの炭素原子に対応する。環Ｚが（ヘテロ）シクロアルケン環に縮合している場合、（Ｚ１）において－－－として上で示された結合は、二重結合であり、環Ｚは、好ましくは、下記に示される（Ｚａ）～（Ｚｊ）から選択される。好ましくは、環Ｚは、（Ｚａ）、（Ｚｉ）または（Ｚｊ）に記載のもの、最も好ましくは、（Ｚａ）に記載のものである。
Figure 2024506022000004
[0149]環Ｚが（ヘテロ）シクロアルカン環に縮合している場合、（Ｚ１）において－－－として上で示された結合は、単結合であり、環Ｚは、好ましくは、下記に示される（Ｚｋ）～（Ｚｎ）から選択される。好ましくは、環Ｚは、（Ｚｎ）に記載のものである。
Figure 2024506022000005
[0150]Ｚが（ヘテロ）シクロアルケン部分を含むこと、すなわち、－－－として示される結合が二重結合であることが特に好ましい。好ましい実施形態において、Ｚは、下記に示される構造（Ｚ２）～（Ｚ２０）から選択される。
Figure 2024506022000006
[0151]本明細書において、典型的にはリンカーを介した、ペイロードへの接続は、波状結合で示されている。Ｂ（－）は、アニオン、好ましくは、薬学的に許容され得るアニオンである。環Ｚは、付加環化反応によって形成され、好ましくは、上に示された（Ｚａ）～（Ｚｊ）から選択される構造を有し、＊＊でラベルされた炭素原子は、環Ｚが縮合している（Ｚ２）～（Ｚ２０）の（ヘテロ）シクロアルケン環の２つの炭素原子に対応する。
[0152]さらに好ましい実施形態において、Ｚは、下記に示される構造（Ｚ２１）～（Ｚ３８）から選択される。
Figure 2024506022000007
[0153]本明細書において、必要に応じてリンカーを介した、ペイロードへの接続は、波状結合で示されている。構造（Ｚ３８）において、Ｂ（－）は、アニオン、好ましくは、薬学的に許容され得るアニオンである。環Ｚは、上で定義されたような構造（Ｚａ）～（Ｚｊ）から選択される。環Ｚは、付加環化反応によって形成され、好ましくは、上に示された（Ｚａ）～（Ｚｊ）から選択される構造を有し、＊＊でラベルされた炭素原子は、環Ｚが縮合している（Ｚ２１）～（Ｚ３８）の（ヘテロ）シクロアルケン環の２つの炭素原子に対応する。
[0154]好ましい実施形態において、Ｚは、置換されていてもよい、構造（Ｚ８）、より好ましくは（Ｚ２９）に記載の（ヘテロ）シクロオクテン部分を含む。本実施形態の文脈において、Ｚは、好ましくは、下記に示されるような構造（Ｚ３９）に記載の（ヘテロ）シクロオクテン部分を含み、Ｖは、（ＣＨ２）ｌであり、ｌは、０～１０の範囲、好ましくは、０～６の範囲の整数である。より好ましくは、ｌは、０、１、２、３または４であり、より好ましくは、ｌは、０、１または２であり、最も好ましくは、ｌは、０または１である。基（Ｚ３９）の文脈において、ｌは、最も好ましくは、１である。最も好ましくは、Ｚは、下記でさらに定義される構造（Ｚ４２）に記載のものである。
[0155]別の好ましい実施形態において、Ｚは、置換されていてもよい、構造（Ｚ２６）、（Ｚ２７）または（Ｚ２８）に記載の（ヘテロ）シクロオクテン部分を含む。本実施形態の文脈において、Ｚは、好ましくは、下記に示されるような構造（Ｚ４０）または（Ｚ４１）に記載の（ヘテロ）シクロオクテン部分を含み、Ｙ１は、ＯまたはＮＲ１１であり、Ｒ１１は、水素、直鎖状もしくは分枝状のＣ１－Ｃ１２アルキル基またはＣ４－Ｃ１２（ヘテロ）アリール基からなる群から独立して選択される。（Ｚ４０）の芳香環は、１つ以上の位置において必要に応じてＯ－スルホニル化されるのに対し、（Ｚ４１）の環は、１つ以上の位置においてハロゲン化されてもよい。最も好ましくは、Ｚは、下記でさらに定義される構造（Ｚ４３）に記載のものである。
[0156]別の好ましい実施形態において、Ｚは、ヘテロシクロヘプテニル基を含み、構造（Ｚ３７）に記載のものである。
Figure 2024506022000008
[0157]特に好ましい実施形態において、Ｚは、シクロオクテニル基を含み、構造（Ｚ４２）：
Figure 2024506022000009
に記載のものであり、
ここで、
＊でラベルされた結合は、必要に応じてリンカーを介して、抗体に接続され、＊＊でラベルされた波状結合は、必要に応じてリンカーを介して、ペイロードに接続され；
Ｒ１５は、水素、ハロゲン、－ＯＲ１６、－ＮＯ２、
－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ１６、－Ｓ（Ｏ）３ （－）、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ５－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ７－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、そのアルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基および（ヘテロ）アリールアルキル基は、必要に応じて置換され、２つの置換基Ｒ１５が、一緒に連結して、置換されていてもよい環化シクロアルキルまたは置換されていてもよい環化（ヘテロ）アレーン置換基を形成してもよく、Ｒ１６は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ６－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ７－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
Ｒ１８は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ６－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ７－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
Ｒ１９は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ６－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ７－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、そのアルキル基は、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択されるより多くのヘテロ原子のうちの１つによって中断されていてもよく、そのアルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基および（ヘテロ）アリールアルキル基は、独立して必要に応じて置換されているか、またはＲ１９は、スペーサー部分を介して接続される、Ｄ３などのペイロードのさらなる存在であり；
ｌは、０～１０の範囲の整数である。
[0158]構造（Ｚ４２）に記載の基の好ましい実施形態において、Ｒ１５は、水素、ハロゲン、－ＯＲ１６、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ５－Ｃ６（ヘテロ）アリール基からなる群から独立して選択され、Ｒ１６は、水素またはＣ１－Ｃ６アルキルであり、より好ましくは、Ｒ１５は、水素およびＣ１－Ｃ６アルキルからなる群から独立して選択され、最も好ましくは、すべてのＲ１５がＨである。構造（Ｚ４２）に記載の基の好ましい実施形態において、Ｒ１８は、水素、Ｃ１－Ｃ６アルキル基からなる群から独立して選択され、最も好ましくは、両方のＲ１８がＨである。構造（Ｚ４２）に記載の基の好ましい実施形態において、Ｒ１９は、Ｈである。構造（Ｚ４２）に記載の基の好ましい実施形態において、Ｉは、０または１であり、より好ましくは、ｌは、１である。
[0159]特に好ましい実施形態において、Ｚは、（ヘテロ）シクロオクテニル基を含み、構造（Ｚ４３）に記載のものである：
Figure 2024506022000010
ここで、
＊でラベルされた結合は、必要に応じてリンカーを介して、抗体に接続され、＊＊でラベルされた波状結合は、必要に応じてリンカーを介して、ペイロードに接続され；
Ｒ１５は、水素、ハロゲン、－ＯＲ１６、－ＮＯ２、－ＣＮ、－Ｓ（Ｏ）２Ｒ１６、－Ｓ（Ｏ）３ （－）、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ５－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ７－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、そのアルキル基、（ヘテロ）アリール基、アルキル（ヘテロ）アリール基および（ヘテロ）アリールアルキル基は、置換されていてもよく、２つの置換基Ｒ１５が、一緒に連結して、置換されていてもよい環化シクロアルキルまたは置換されていてもよい環化（ヘテロ）アレーン置換基を形成してもよく、Ｒ１６は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ６－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ７－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され；
Ｙは、ＮまたはＣＲ１５である。
[0160]構造（Ｚ４３）に記載の基の好ましい実施形態において、Ｒ１５は、水素、ハロゲン、－ＯＲ１６、－Ｓ（Ｏ）３ （－）、Ｃ１－Ｃ６アルキル基、Ｃ５－Ｃ６（ヘテロ）アリール基からなる群から独立して選択され、Ｒ１６は、水素またはＣ１－Ｃ６アルキルであり、より好ましくは、Ｒ１５は、水素および－Ｓ（Ｏ）３ （－）からなる群から独立して選択される。構造（Ｚ４３）に記載の基の好ましい実施形態において、Ｙは、ＮまたはＣＨであり、より好ましくは、Ｙ＝Ｎである。
[0161]別の好ましい実施形態において、Ｚは、（ヘテロ）シクロアルカン部分を含み、すなわち、－－－として示される結合は、単結合である。（ヘテロ）シクロアルカン基は、ヘテロシクロアルカニル基またはシクロアルカニル基、好ましくは、シクロアルカニル基と呼ばれることもあり、（ヘテロ）シクロアルカニル基は、置換されていてもよい。好ましくは、（ヘテロ）シクロアルカニル基は、（ヘテロ）シクロプロパニル基、（ヘテロ）シクロブタニル基、ノルボルナン基、ノルボルネン基、（ヘテロ）シクロヘプタニル基、（ヘテロ）シクロオクタニル基、（ヘテロ）シクロノンニル基または（ヘテロ）シクロデカニル基であり、これらはすべて、必要に応じて置換されてもよい。（ヘテロ）シクロプロパニル基、（ヘテロ）シクロヘプタニル基または（ヘテロ）シクロオクタニル基が特に好ましく、（ヘテロ）シクロプロパニル基、ｔｒａｎｓ－（ヘテロ）シクロヘプタニル基または（ヘテロ）シクロオクタニル基は、置換されていてもよい。
[0162]好ましくは、Ｚは、構造（Ｚ４４）に記載のシクロプロパニル部分、構造（Ｚ４５）に記載のヘテレオシクロブタン部分、構造（Ｚ４６）に記載のノルボルナンもしくはノルボルネン基、構造（Ｚ４７）に記載の（ヘテロ）シクロヘプタニル部分または構造（Ｚ４８）に記載の（ヘテロ）シクロオクタニル部分を含む。ここで、Ｙ３は、Ｃ（Ｒ２３）２、ＮＲ２３またはＯから選択され、各Ｒ２３は、個別に水素、Ｃ１－Ｃ６アルキルであるか、または必要に応じてスペーサーを介して、Ｌに接続され、－－－とラベルされた結合は、単結合または二重結合である。さらに好ましい実施形態において、シクロプロパニル基は、構造（Ｚ４９）に記載のものである。別の好ましい実施形態において、（ヘテロ）シクロヘプタン基は、構造（Ｚ５０）または（Ｚ５１）に記載のものである。別の好ましい実施形態において、（ヘテロ）シクロオクタン基は、構造（Ｚ５２）、（Ｚ５３）、（Ｚ５４）、（Ｚ５５）または（Ｚ５６）に記載のものである。
Figure 2024506022000011
[0163]ここで、（Ｚ５０）および（Ｚ５１）中のＳｉ上のＲ基は、典型的には、アルキルまたはアリール、好ましくは、Ｃ１－Ｃ６アルキルである。環Ｚは、付加環化反応によって形成され、好ましくは、上に示された（Ｚｋ）～（Ｚｎ）から選択される構造を有し、＊＊でラベルされた炭素原子は、環Ｚが縮合している（Ｚ４４）～（Ｚ５６）の（ヘテロ）シクロアルカン環の２つの炭素原子に対応する。
[0164]第２の好ましい実施形態において、Ｚは、求核反応によって、好ましくは、求核アシル化またはマイケル付加によって、好ましくは、マイケル付加によって形成される。好ましいマイケル反応は、チオール－マレイミドライゲーションであり、最も好ましくは、Ｑがマレイミドであり、Ｆがチオール基である。好ましい実施形態において、接続基Ｚは、スクシンイミジル環またはその開環コハク酸アミド誘導体を含む。接続基Ｚの好ましい選択肢は、下記に示される（Ｚ５７）～（Ｚ７１）から選択される部分を含む。
Figure 2024506022000012
[0165]ここで、＊でラベルされた波状結合は、必要に応じてリンカーを介して、抗体Ａｂに接続され、標識なしの波状結合は、必要に応じてリンカーを介して、ペイロードに接続される。さらに、Ｒ２９は、Ｃ１－１２アルキル、好ましくは、Ｃ１－４アルキル、最も好ましくは、エチルであり、Ｘ１は、ＯまたはＳ、好ましくは、Ｘ１＝Ｏである。（Ｚ６７）～（Ｚ７１）において＊＊でラベルされた窒素原子は、抗体のリジン残基の側鎖の窒素原子に対応する。（Ｚ６９）および（Ｚ７０）のフェニル基の炭素原子は、置換されていてもよく、好ましくは、フッ素化されていてもよい。
[0166]好ましい実施形態において、接続基Ｚは、（Ｚ１）～（Ｚ７１）から選択される部分を含む。
[0167]リンカー
本発明に係る多重特異性抗体構築物は、いくつかのリンカーを含む。連結単位とも呼ばれるリンカーは、当該分野で周知であり、任意の好適なリンカーを使用してもよい。構造（１）の多重特異性抗体構築物において、リンカーＬ１は、抗体ＡｂをペイロードＤ１と接続し、リンカーＬ２は、抗体ＡｂをペイロードＤ２と接続する。構造（２）の多重特異性抗体構築物において、リンカーＬ３は、抗体Ａｂを分枝部分ＢＭと接続し、リンカーＬ４は、分枝部分ＢＭをペイロードＤ１と接続し、リンカーＬ５は、分枝部分ＢＭをペイロードＤ２と接続する。リンカーは、切断可能であってもよいし、切断不可能であってもよい。リンカーは、複数のペイロードＤを抗体Ａｂに結合させるための１つ以上の分枝点（ＢＭに加えて）を含み得る。
[0168]本発明に係る多機能性抗体構築物のために定義される各リンカーは、独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰから選択される少なくとも１個、好ましくは５～１００個の原子の鎖である。ここで、原子の鎖とは、連結単位の末端から延びる最も短い原子の鎖のことを指す。鎖内の原子は、骨格原子と呼ばれることもある。当業者が理解するように、Ｃ、ＮおよびＰなどの３以上の結合価を有する原子は、これらの原子の結合価を完了させるように適切に官能化され得る。換言すれば、骨格原子は、官能化されていてもよい。好ましい実施形態において、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３、ならびに存在する場合にはＬ４およびＬ５の各々は、独立して、Ｃ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰから選択される少なくとも５～５０個、好ましくは６～２５個の原子の鎖である。骨格原子は、好ましくは、Ｃ、ＮおよびＯから選択される。
[0169]リンカーは、例えば、直鎖状または分枝状のＣ１－Ｃ２００アルキレン基、Ｃ２－Ｃ２００アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ２００アルキニレン基、Ｃ３－Ｃ２００シクロアルキレン基、Ｃ５－Ｃ２００シクロアルケニレン基、Ｃ８－Ｃ２００シクロアルキニレン基、Ｃ７－Ｃ２００アルキルアリーレン基、Ｃ７－Ｃ２００アリールアルキレン基、Ｃ８－Ｃ２００アリールアルケニレン基、Ｃ９－Ｃ２００アリールアルキニレン基およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。必要に応じて、そのアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は、置換され得、必要に応じて前記基は、１つ以上のヘテロ原子、好ましくは、１～１００個のヘテロ原子によって中断され得、前記ヘテロ原子は、好ましくは、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｙおよびＮＲ１２からなる群から選択され、ｙは、０、１または２、好ましくは、ｙ＝２であり、Ｒ１２は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ６－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ７－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択される。リンカーは、（ポリ）エチレングリコールジアミン（例えば、１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタンまたはより長いエチレングリコール鎖を含む等価物）、（ポリ）エチレングリコールまたは（ポリ）エチレンオキシド鎖、（ポリ）プロピレングリコールまたは（ポリ）プロピレンオキシド鎖および１，ｚ－ジアミノアルカンを含み得、ここで、ｚは、アルカン中の炭素原子の数であり、例えば、２～２５の範囲であり得る。
[0170]各リンカーは、切断可能であってもよいし、切断不可能であってもよい。特に、ペイロードに直接結合したリンカー、すなわちＬ１および／もしくはＬ２またはＬ４および／もしくはＬ５は、切断可能であり得る。切断可能なリンカーは、それらが結合しているペイロードが細胞毒または受動拡散によって腫瘍細胞に入ることができる任意の小分子ペイロードである場合に特に好ましい。ここで、切断可能なリンカーは、好ましくは、腫瘍リソソームまたは腫瘍微小環境において切断可能である。したがって、１つの実施形態において、切断可能なリンカーは、腫瘍微小環境において切断可能である。腫瘍微小環境において切断可能なリンカーは、細胞毒ペイロードが腫瘍細胞の外側表面上の受容体を標的とするポリペプチドと組み合わされるとき、特に有利である。したがって、多機能性抗体構築物は、腫瘍微小環境において腫瘍細胞に結合し、そこで細胞毒に対するリンカーが切断され、細胞毒が腫瘍細胞に近接して放出される。次いで、細胞毒の内部移行が、腫瘍細胞の細胞死をもたらし得る。腫瘍微小環境において切断可能なリンカーは、当業者に公知であり、典型的には、タンパク質分解酵素、例えば、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、プロタンパク質転換酵素サブチリシン、フューリン、エラスターゼ、レグマイン、線維芽細胞活性化タンパク質、組織型プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）およびマトリプターゼによる加水分解を受けやすい。腫瘍リソソームにおいて切断可能なリンカーは、当業者に公知であり、典型的には、タンパク質分解酵素、例えば、グランザイム、カテプシン、プロタンパク質転換酵素サブチリシン、フューリン、レグマイン、カスパーゼおよびカリケレインによる加水分解を受けやすい。
[0171]そのような切断可能なリンカーは、当該分野で公知であり、典型的には、ペプチドスペーサーまたはペプチド誘導体（例えば、シクロブタン－１，１－ジカルボキサミド－Ｃｉｔ）を含む。切断可能なリンカーは、構造（２６）：
Figure 2024506022000013
のペプチドスペーサーを含むことが好ましく、ここで、Ｒ１７は、アミノ酸側鎖を表し、ｎは、１～１０の範囲の整数、好ましくは、ｎ＝１～８、より好ましくは、ｎ＝１～５、最も好ましくは、ｎ＝１～４、好ましくは、ｎ＝２である。
[0172]好ましくは、ペプチドスペーサーは、当該分野で公知であるようなジペプチドスペーサーまたはトリペプチドスペーサー、好ましくは、ジペプチドスペーサーである。好適なペプチドスペーサーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、Ｖａｌ－Ｇｌｎ、ＡｃＬｙｓ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ、ＡｃＬｙｓ－Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ｇｌｎ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｌｅｕ－Ｇｌｎ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ａｌａ－Ａｓｎ、Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ、Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｈｉｓ、Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－ＧｌｙおよびＬｙｓ、好ましくは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、ＡｃＬｙｓ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ、ＡｃＬｙｓ－Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ａｌａ－Ａｓｎ、より好ましくは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ａｌａ－Ａｓｎ、Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ、Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｈｉｓ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－ＧｌｙおよびＬｙｓからなる群から選択され、好ましくは、ペプチドスペーサーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－ＡｌａまたはＡｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎである。１つの実施形態において、ペプチドスペーサーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔである。１つの実施形態において、ペプチドスペーサーは、Ｖａｌ－Ａｌａである。
[0173]好ましい実施形態において、ペプチドスペーサーは、一般構造（２７）：
Figure 2024506022000014
によって表され、ここで、Ｒ１７は、アミノ酸側鎖を表し、好ましくは、Ｒ１７＝ＣＨ３（Ｖａｌ）またはＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２（Ｃｉｔ）である。
[0174]構造（２６）および（２７）における波線は、その分子の残りの部分への接続を示し、好ましくは、ペプチドスペーサーは、ＮＨ抗体を介して、典型的にはリンカーを介して、およびＣ（Ｏ）を介して、典型的にはリンカーを介して、ペイロードに接続される。
[0175]抗体Ａｂに直接結合したリンカーは、抗体に対する単一の結合点を有してもよいし、２つ以上の、典型的には２つの、結合点を有してもよい。これは、リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３についても同様である。リンカーＬ１とリンカーＬ２の両方が、２つ以上の結合点を有することも可能であるが、リンカーＬ１およびリンカーＬ２の一方が１つの結合点のみを有し、他方が１つまたは２つの結合点を有することが好ましい。
[0176]抗体Ａｂに対する２つの結合点を有するリンカーは、好ましくは、構造（Ｌ－Ａ）：
Figure 2024506022000015
によって表され、ここで、
Ｌ６、Ｌ７およびＬ８は、リンカーであり；
ｐおよびｑは、それぞれ個別に１または０であり；
ＢＭ１は、分枝部分であり；
Ｚは、接続基である。
[0177]好ましい実施形態において、リンカーＬ１またはリンカーＬ３は、構造（Ｌ－Ａ）を有する。リンカーＬ１が構造（Ｌ－Ａ）を有する場合、ｘ１は、１または２であることが好ましく、好ましくは、ｘ１は、１である。リンカーＬ３が構造（Ｌ－Ａ）を有する場合、ｘ３は、１または２であることが好ましく、好ましくは、ｘ３は、１である。
[0178]分枝部分ＢＭ１は、その好ましい実施形態を含めて、分枝部分ＢＭと同じ方法で定義される。本発明に係る多機能性抗体構築物が、分枝部分ＢＭとＢＭ１の両方を含む場合、両方の分枝部分は、同じであっても異なっていてもよい。
[0179]接続基Ｚは、さらに上で定義されている。好ましくは、Ｚの両方の存在は、同じである。本実施形態の文脈において、接続基Ｚは、好ましくは、上で定義されたような付加環化によって得られる。Ｚが付加環化によって得られる場合、好ましくは、両方のリンカーＬ８が存在し、ｑ＝１である。両方のリンカーＬ７が、好ましくは存在し、ｐ＝１である。最も好ましくは、ｑ＝ｐ＝１である。
[0180]Ｌ６は、好ましくは、構造（Ｌ－Ｄ）：
＊＊－（Ｌ２１）ｎ－（Ｌ２２）ｏ－（Ｌ２３）ｐ－（Ｌ２４）ｑ－＊＊＊
（Ｌ－Ｄ）
を有し、ここで、
＊＊とラベルされた結合は、ＢＭ１に接続され、＊＊＊とラベルされた結合は、ＢＭに接続され；
ｎ、ｏ、ｐおよびｑは、それぞれ独立して、０または１であり；
Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３およびＬ２４は、リンカーである。
[0181]リンカーＬ６は、多機能性抗体構築物の合成中に形成される接続基Ｚを含み得る。ＢＭ、Ｄ１およびＤ２を含むペイロード構築物は、ＢＭ１を含むリンカー構築物に接続されてもよく、これはリンカー構築物（特に反応性部分Ｑ）と機能化抗体（特に反応性部分Ｆ）との反応の前または後のいずれであってもよい。２つの代表的な合成アプローチを下記のスキーム１および２に示す。リンカーＬ３内の接続基は、連結単位Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３およびＬ２４のいずれかの接合点において形成されてもよいし、リンカーＬ３内に別々に存在してもよい。したがって、リンカーＬ３は、－Ｓｐ－Ｚ－Ｓｐ－（式中、Ｓｐは個別にスペーサーである）によって表され得る。これらのスペーサーは、典型的には、構造（Ｌ－Ｄ）によって定義されるリンカーの一部を含む。例えば、Ｌ３は、－Ｚ－（Ｌ２１）ｎ－（Ｌ２２）ｏ－（Ｌ２３）ｐ－（Ｌ２４）ｑ－または－（Ｌ２１）ｎ－Ｚ－（Ｌ２２）ｏ－（Ｌ２３）ｐ－（Ｌ２４）ｑ－によって表され得る。ここで、Ｚは、任意の形態をとってもよく、好ましくは、上で定義されたとおりである。
[0182]スキーム１：
Figure 2024506022000016
ここで、Ｒ３２＝Ｄ１またはＤ２（（１３）および（１）の場合）、またはＲ３２＝ＢＭ（（Ｌ４）ｍ－Ｄ１）（（Ｌ５）ｎ－Ｄ２）（（１４）および（２）の場合）である。
[0183]スキーム２：
Figure 2024506022000017
ここで、Ｒ３２＝Ｄ１もしくはＤ２（（１６）および（１）の場合）、またはＲ３２＝ＢＭ（（Ｌ４）ｍ－Ｄ１）（（Ｌ５）ｎ－Ｄ２）（（１７）および（２）の場合）である。
[0184]次に、リンカー構築物は、以下のようなコンジュゲーション反応によって調製され得る：
Figure 2024506022000018
ここで、Ｒ３２＝Ｄ１もしくはＤ２（（１６）および（１９）の場合）、またはＲ３２＝ＢＭ（（Ｌ４）ｍ－Ｄ１）（（Ｌ５）ｎ－Ｄ２）（（１７）および（２０）の場合）である。
[0185]リンカーＬ７は、ＢＭを接続基Ｚと接続する。Ｌ７が両方とも存在することが好ましく、すなわち、ｐの両方の存在が１であり、より好ましくは、それらは同じである。各Ｌ７は、直鎖状または分枝状のＣ１－Ｃ２００アルキレン基、Ｃ２－Ｃ２００アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ２００アルキニレン基、Ｃ３－Ｃ２００シクロアルキレン基、Ｃ５－Ｃ２００シクロアルケニレン基、Ｃ８－Ｃ２００シクロアルキニレン基、Ｃ７－Ｃ２００アルキルアリーレン基、Ｃ７－Ｃ２００アリールアルキレン基、Ｃ８－Ｃ２００アリールアルケニレン基およびＣ９－Ｃ２００アリールアルキニレン基からなる群より独立して選択され得、そのアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子によって置換されていてもよく、中断されていてもよく、Ｒ３は、水素、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ２－Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２－Ｃ２４アルキニル基およびＣ３－Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立して選択され、そのアルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は、置換されていてもよい。そのアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基が、上で定義されたような１つ以上のヘテロ原子によって中断されるとき、前記基は、１つ以上のＯ原子および／または１つ以上のＳ－Ｓ基によって中断されることが好ましい。
[0186]より好ましくは、各Ｌ７は、直鎖状または分枝状のＣ１－Ｃ１００アルキレン基、Ｃ２－Ｃ１００アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１００アルキニレン基、Ｃ３－Ｃ１００シクロアルキレン基、Ｃ５－Ｃ１００シクロアルケニレン基、Ｃ８－Ｃ１００シクロアルキニレン基、Ｃ７－Ｃ１００アルキルアリーレン基、Ｃ７－Ｃ１００アリールアルキレン基、Ｃ８－Ｃ１００アリールアルケニレン基およびＣ９－Ｃ１００アリールアルキニレン基からなる群から独立して選択され、そのアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子によって置換されていてもよく、中断されていてもよく、Ｒ３は、水素、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ２－Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２－Ｃ２４アルキニル基およびＣ３－Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立して選択され、そのアルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は、置換されていてもよい。
[0187]なおもより好ましくは、各Ｌ７は、直鎖状または分枝状のＣ１－Ｃ５０アルキレン基、Ｃ２－Ｃ５０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ５０アルキニレン基、Ｃ３－Ｃ５０シクロアルキレン基、Ｃ５－Ｃ５０シクロアルケニレン基、Ｃ８－Ｃ５０シクロアルキニレン基、Ｃ７－Ｃ５０アルキルアリーレン基、Ｃ７－Ｃ５０アリールアルキレン基、Ｃ８－Ｃ５０アリールアルケニレン基およびＣ９－Ｃ５０アリールアルキニレン基からなる群から独立して選択され、そのアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子によって置換されていてもよく、中断されていてもよく、Ｒ３は、水素、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ２－Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２－Ｃ２４アルキニル基およびＣ３－Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立して選択され、そのアルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は、置換されていてもよい。
[0188]さらになおもより好ましくは、各Ｌ７は、直鎖状または分枝状のＣ１－Ｃ２０アルキレン基、Ｃ２－Ｃ２０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ２０アルキニレン基、Ｃ３－Ｃ２０シクロアルキレン基、Ｃ５－Ｃ２０シクロアルケニレン基、Ｃ８－Ｃ２０シクロアルキニレン基、Ｃ７－Ｃ２０アルキルアリーレン基、Ｃ７－Ｃ２０アリールアルキレン基、Ｃ８－Ｃ２０アリールアルケニレン基およびＣ９－Ｃ２０アリールアルキニレン基からなる群から独立して選択され、そのアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子によって置換されていてもよく、中断されていてもよく、Ｒ３は、水素、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ２－Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２－Ｃ２４アルキニル基およびＣ３－Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立して選択され、そのアルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は、置換されていてもよい。
[0189]これらの好ましい実施形態において、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は、非置換であり、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子、好ましくはＯによって必要に応じて中断されることがさらに好ましく、Ｒ３は、水素およびＣ１－Ｃ４アルキル基、好ましくは、水素またはメチルからなる群から独立して選択される。
[0190]最も好ましくは、各Ｌ７は、直鎖状または分枝状のＣ１－Ｃ２０アルキレン基からなる群から独立して選択され、そのアルキレン基は、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子によって置換されていてもよく、中断されていてもよく、Ｒ３は、水素、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ２－Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２－Ｃ２４アルキニル基およびＣ３－Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立して選択され、そのアルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は、置換されていてもよい。この実施形態において、アルキレン基は、非置換であり、Ｏ、ＳおよびＮＲ３の群から選択される１つ以上のヘテロ原子、好ましくは、Ｏおよび／またはまたはＳ－Ｓによって必要に応じて中断されることがさらに好ましく、Ｒ３は、水素およびＣ１－Ｃ４アルキル基、好ましくは、水素またはメチルからなる群から独立して選択される。
[0191]好ましいリンカーＬ７としては、－（ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｎ１－、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ１ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－および－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｎ１－が挙げられ、ここで、ｎ１は、１～５０の範囲、好ましくは、１～４０の範囲、より好ましくは、１～３０の範囲、さらにより好ましくは、１～２０の範囲およびなおもさらにより好ましくは、１～１５の範囲の整数である。より好ましくは、ｎ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、より好ましくは、１、２、３、４、５、６、７または８、さらにより好ましくは、１、２、３、４、５または６、なおもさらにより好ましくは、１、２、３または４である。
[0192]好ましくは、構造（Ｌ－Ａ）を有するリンカーは、リンカーＬ８が部分的に抗体の（修飾された）グリカンを形成するように、抗体Ａｂの２つのグリコシル化部位に接続される。リンカーＬ８は、好ましくは、構造（Ｌ－Ｅ）：
＊－ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）ｄ－（Ｇ）ｅ－Ｓｕ－＊＊
（Ｌ－Ｅ）
を有し、ここで、
＊とラベルされた結合は、抗体Ａｂのアミノ酸に接続され、＊＊とラベルされた結合は、Ｚに接続され；
ｄは、０または１であり；
ｅは、０～１０の範囲の整数であり；
Ｓｕは、単糖であり；
Ｇは、単糖部分であり；
ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミン部分であり；
Ｆｕｃは、フコース部分である。
[0193]抗体Ａｂに対する１つの結合点を有するリンカーは、好ましくは、構造（Ｌ－Ｂ）または（Ｌ－Ｃ）：
＊－ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）ｄ－（Ｇ）ｅ－Ｓｕ－Ｚ－（Ｌ２１）ｎ－（Ｌ２２）ｏ－（Ｌ２３）ｐ－（Ｌ２４）ｑ－＊＊
（Ｌ－Ｂ）
＊－Ｚ－（Ｌ２１）ｎ－（Ｌ２２）ｏ－（Ｌ２３）ｐ－（Ｌ２４）ｑ－＊＊
（Ｌ－Ｃ）
によって表され、ここで、
＊とラベルされた結合は、抗体Ａｂの２つの別個のアミノ酸に接続され、＊＊とラベルされた結合は、必要に応じてリンカーを介して、ペイロードに接続され；
ｄ、ｎ、ｏ、ｐおよびｑは、それぞれ独立して、０または１であり；
ｅは、０～１０の範囲の整数であり；
Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３およびＬ２４は、リンカーであり；
Ｓｕは、単糖であり；
Ｇは、単糖部分であり；
ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミン部分であり；
Ｆｕｃは、フコース部分であり；
Ｚは、接続基である。
[0194]好ましい実施形態において、リンカーＬ１および／またはＬ２、好ましくは両方が、構造（Ｌ－Ｂ）または（Ｌ－Ｃ）を有する。構造（Ｌ－Ｂ）を有するリンカーは、抗体Ａｂに対する１つの結合点を有する好ましいリンカーである。リンカー（Ｌ－Ｂ）は、好ましくは、抗体Ａｂのグリコシル化部位、主にアスパラギンアミノ酸に結合しており、部分的に抗体の（修飾された）グリカンを形成する。リンカー（Ｌ－Ｃ）は、好ましくは、抗体のチロシン、システインまたはリジンアミノ酸、最も好ましくは、システインアミノ酸に結合している。
[0195]接続基Ｚは、上記でさらに定義されている。リンカーが、構造（Ｌ－Ｂ）を有する場合、接続基Ｚは、上で定義されたような付加環化によって得られることが好ましい。リンカーが、構造（Ｌ－Ｃ）を有し、システインまたはリジンアミノ酸に結合している場合、接続基Ｚは、上で定義されたような求核反応によって得られることが好ましい。リンカーが、構造（Ｌ－Ｃ）を有し、チロシンアミノ酸に結合している場合、接続基Ｚは、上で定義されたような付加環化によって得られることが好ましい。
[0196]抗体に対する１つの結合点を有するリンカーおよび２つの結合点を有するリンカーは、構造Ａｂ（（Ｌ８）ｑ－Ｆ）ｘの抗体に結合することができ、ｘの値は、調製される多機能性抗体構築物の正確な構造に依存する。例えば、ｘは、２または４であり得る。
[0197]構造Ａｂ（（Ｌ８）ｑ－Ｆ）ｘの抗体は、当該分野で公知の任意の手段によって調製され得る。例えば、抗体の鎖間ジスルフィド結合の還元は、すでにチオール基をＦに与えている。このような還元の後に、マレイミド構築物（または他のチオール反応性構築物）を含む規定数の反応性部分Ｆとの反応が続く場合、任意の反応性部分Ｆを抗体に接続することができる。抗体コンジュゲーションのより制御された部位特異的プロセスは、例えば、２つの不対システイン（重鎖あたり１つまたは軽鎖あたり１つ）を含むように抗体を遺伝子操作することによって達成することができ、それにより、抗体をＦ含有マレイミド構築物に供したとき、抗体上に正確に２つの反応性部分Ｆが提供される。遺伝子コード化は、ＡＭＢＥＲ終止コドンを適用することによって、予め定義された数の反応性部分Ｆを特定の部位に含めるように抗体を直接発現することを可能にする。例えば、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）、ソルターゼ、ホルミル－グリシン生成酵素（ＦＧＥ）などに基づいて、規定数の反応性部分Ｆを抗体上に設置するための一連の酵素的アプローチも報告されている。別の酵素的アプローチは、チロシナーゼの酸化作用によって、利用可能なチロシン残基オルト－キノン部分Ｆの側鎖を変換する。形成されたオルト－キノン部分は、付加環化においてアルケンおよびアルキンに対して反応性である。したがって、１つの実施形態において、機能化抗体は、鎖間ジスルフィド結合の還元とそれに続くＦ含有チオール反応性構築物との反応、不対システイン残基の導入とそれに続くＦ含有チオール反応性構築物との反応、反応性部分Ｆの酵素的導入、および遺伝子操作による反応性部分の導入によって調製される。遺伝子操作の使用は、本願の文脈において最も好ましくなく、反応性部分Ｆの酵素的導入が、最も好ましい。
[0198]好ましい実施形態において、ＧｌｙｃｏＣｏｎｎｅｃｔ技術（例えば、参照により援用される、国際公開第２０１４／０６５６６１号およびＶａｎ Ｇｅｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．２０１５，２６，２２３３－２２４２を参照のこと）は、モノクローナル抗体の重鎖に天然に存在するグリカンを利用して、固定数のクリックプローブ、特にアジドを導入する。したがって、好ましい実施形態において、機能化抗体は、（ｉ）必要に応じて、好適なエンドグリコシダーゼを用いて天然グリカンをトリミングし、それにより、典型的にはＡｓｎ－２９７上に存在する、コアＧｌｃＮＡｃを遊離させた後、（ｉｉ）好適なグリコシルトランスフェラーゼの作用下で、対応するＵＤＰ－糖から非天然アジド担持糖基質を転移させること、例えば、ガラクトシルトランスフェラーゼ変異体Ｇａｌ－Ｔ（Ｙ２８９Ｌ）を用いてＧａｌＮＡｚを転移させること、またはＧａｌＮＡｃ－トランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃ－Ｔ）を用いて６－アジドＧａｌＮＡｃを転移させることによって調製される。あるいは、ＧａｌＮＡｃ－Ｔを適用して、Ａｃ基に芳香族部分またはチオール官能基を有するコア－ＧｌｃＮＡｃにＧａｌＮＡｃ誘導体を設置することもできる。本発明に係る多機能性抗体構築物は、この技術を用いて得ることができ、トリミングステップ（ｉ）を、ｅ＝０を有する機能化抗体を得るために用いてもよいし、トリミングステップ（ｉ）は、ｅ＝１～１０を有する機能化抗体を得るために省略され得る。好ましくは、トリミングステップが行われ、ｅ＝０である。
[0199]好ましい実施形態において、抗体のグリカンは、１つ以上のペイロードを結合させるために使用される。本実施形態の文脈において、本発明に係る多機能性抗体構築物は、単糖Ｓｕが付加された構造－ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）ｂ－（Ｇ）ｅ－のグリカンを有する。Ｓｕは、反応基Ｆ（コンジュゲーション前）または接続基Ｚ（コンジュゲーション後）を含む官能化単糖である。ゆえに、Ｓｕは、単糖誘導体と見なすことができ、下記でさらに定義される。Ｓｕの単糖コア構造を考慮すると、それはグリカンの一部として見ることができるだろう。しかしながら、構造
－ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）ｂ－（Ｇ）ｅ－のグリカンは、Ｓｕが結合している抗体の元のグリカンに由来する。
[0200]したがって、グリカンの－ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）ｂ－（Ｇ）ｅ－は、典型的には元の抗体に由来し、ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミン部分であり、Ｆｕｃは、フコース部分である。Ｆｕｃは、典型的には、α－１，６－グリコシド結合を介してＧｌｃＮＡｃに結合する。通常、抗体は、（ｂ＝１）であり得るか、またはフコシル化されていなくてもよい（ｂ＝０）。ＧｌｃＮＡｃ残基は、コア－ＧｌｃＮＡｃ残基とも呼ばれることがあり、抗体のペプチド部分に直接結合している単糖である。
[0201]２つのＧｌｃＮＡｃ部分のそれぞれは、好ましくは、抗体ＡｂのＦｃフラグメント中の天然のＮ－グリコシル化部位に存在する。好ましくは、前記ＧｌｃＮＡｃ部分は、Ａｂの領域２９０～３０５のアスパラギンアミノ酸に結合している。さらに好ましい実施形態において、抗体は、ＩｇＧ型抗体であり、特定のＩｇＧ型抗体に応じて、前記ＧｌｃＮＡｃ部分は、抗体のアミノ酸アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７またはＮ２９７）上に存在する。
[0202]Ｇは、単糖部分であり、ｅは、０～１０の範囲の整数である。Ｇは、好ましくは、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）およびシアル酸およびキシロース（Ｘｙｌ）からなる群から選択される。より好ましくは、Ｇは、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）からなる群から選択される。
[0203]好ましい実施形態において、ｅは０であり、Ｇは存在しない。抗体のグリカンが、トリミングされるとき、Ｇは、典型的には存在しない。トリミングとは、フコシル化されていてもよい、グリカンのコアＧｌｃＮＡｃ部分のみが残るようなエンドグリコシダーゼによる処理のことを指す。
[0204]別の好ましい実施形態において、ｅは、１～１０の範囲の整数である。この実施形態において、Ｇは、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）またはシアル酸およびキシロース（Ｘｙｌ）からなる群から選択され、より好ましくは、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）からなる群から選択されることがさらに好ましい。
[0205]ｅが３～１０であるとき、（Ｇ）ｅは、直鎖状であっても分枝状であってもよい。分枝状オリゴ糖（Ｇ）ｅの好ましい例は、下記に示されるような（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｈ）および（ｈ）である。
Figure 2024506022000019
Figure 2024506022000020
[0206]Ｇが存在する場合、ＧはＧｌｃＮＡｃで終わることが好ましい。換言すれば、Ｓｕに直接接続している単糖残基は、ＧｌｃＮＡｃである。単糖誘導体Ｓｕは、末端ＧｌｃＮＡｃ残基へのグリコシル転移によって容易に導入され得るので、ＧｌｃＮＡｃ部分の存在は、機能化抗体の合成を促進する。構造（ａ）～（ｈ）を有する（Ｇ）ｅについての上記の好ましい実施形態において、部分Ｓｕは、末端ＧｌｃＮＡｃ残基のいずれか、すなわち抗体上のコアＧｌｃＮＡｃ残基に接続されている波状結合を有するものではないものに接続されてもよい。
[0207]Ｇが存在しないこと、すなわちｅ＝０であることが特に好ましい。ｅ＝０である多機能性抗体構築物の利点は、そのようなコンジュゲートが臨床的に使用されるとき、Ｆｃガンマ受容体ＣＤ１６、ＣＤ３２およびＣＤ６４への結合が、有意に低減されるかまたは完全に抑止されることである。
[0208]Ｓｕは、糖誘導体とも呼ばれる単糖誘導体である。好ましくは、糖誘導体は、グリコシル転移によって機能化抗体に組み込むことができる。より好ましくは、Ｓｕは、Ｇａｌ、Ｇｌｃ、ＧａｌＮＡｃまたはＧｌｃＮＡｃ、より好ましくは、ＧａｌまたはＧａｌＮＡｃ、最も好ましくは、ＧａｌＮＡｃである。導入され得るヌクレオチド－糖誘導体のいくつかの好ましい例については、図７を参照のこと。誘導体という用語は、（Ｇ）ｅおよびＦに接続するために適切に官能化されている単糖のことを指す。
[0209]リンカーＬ４は、ＢＭとペイロードＤ１とを接続する。リンカーＬ４は、存在していてもよいし（ｍ＝１）、存在しなくてもよく（ｍ＝０）、好ましくは、Ｌ４は、存在し、すなわちｍ＝１である。リンカーＬ５は、ＢＭとペイロードＤ２とを接続する。リンカーＬ５は、存在してもよいし（ｎ＝１）、存在しなくてもよく（ｎ＝０）、好ましくは、Ｌ５は、存在し、すなわちｎ＝１である。リンカーＬ４とＬ５は、同じであってもよいが、２つの別個のペイロードをＢＭに接続するために使用されるので、同じでないことが好ましい。
[0210]好ましい実施形態において、Ｌ４とＬ５は両方とも、下記でさらに定義される構造（Ｌ－Ｄ）を個別に有する。
＊＊－（Ｌ２１）ｎ－（Ｌ２２）ｏ－（Ｌ２３）ｐ－（Ｌ２４）ｑ－＊＊＊
（Ｌ－Ｄ）
ここで、
＊＊とラベルされた結合は、ＢＭに接続され、＊＊＊とラベルされた結合は、Ｄ１またはＤ２に接続され；
ｎ、ｏ、ｐおよびｑは、それぞれ独立して、０または１であり；
Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３およびＬ２４は、リンカーである。
[0211]リンカーＬ６と同様に、リンカーＬ４およびＬ５は、多機能性抗体構築物の合成中に形成される接続基Ｚを含み得る。ペイロードは、ＢＭを含むリンカー構築物に接続され得、その接続は、ＢＭ１を含むリンカー構築物の反応または機能化抗体との反応の前または後のいずれかであり得る。リンカーＬ４およびＬ５内の接続基は、連結単位Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３およびＬ２４のいずれかの接合点において形成されてもよいし、リンカーＬ４およびＬ５内に別々に存在してもよい。したがって、リンカーＬ４およびＬ５は、－Ｓｐ－Ｚ－Ｓｐ－によって表され得、式中、Ｓｐは、個別にスペーサーである。これらのスペーサーは、典型的には、構造（Ｌ－Ｄ）によって定義されるリンカーの一部を含む。例えば、Ｌ４およびＬ５は、－（Ｌ２１）ｎ－（Ｌ２２）ｏ－（Ｌ２３）ｐ－Ｚ－（Ｌ２４）ｑ－または－（Ｌ２１）ｎ－（Ｌ２２）ｏ－（Ｌ２３）ｐ－（Ｌ２４）ｑ－Ｚ－によって表され得る。ここで、Ｚは、任意の形態をとってもよく、好ましくは、上で定義されたとおりである。
[0212]Ｌ４、Ｌ５およびＬ６のそれぞれは、Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３およびＬ２４のうちの１つ以上を含み得る。Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３およびＬ２４は、一緒になって、下記でさらに定義されるようなリンカーＬ４、Ｌ５またはＬ６を形成するリンカーであり；ｎ、ｏ、ｐおよびｑは、個別に０または１である。好ましい実施形態において、少なくともリンカーＬ２１およびＬ２２が存在し（すなわち、ｎ＝１；ｏ＝１；ｐ＝０または１；ｑ＝０または１である）、より好ましくは、リンカーＬ２１、Ｌ２２およびＬ２３が存在し、Ｌ２４が存在するかまたは存在しない（すなわち、ｎ＝１；ｏ＝１；ｐ＝１；ｑ＝０または１である）。１つの実施形態において、リンカーＬ２１、Ｌ２２、Ｌ２３およびＬ２４が存在する（すなわち、ｎ＝１；ｏ＝１；ｐ＝１；ｑ＝１である）。１つの実施形態において、リンカーＬ２１、Ｌ２２およびＬ２３が存在し、Ｌ２４は存在しない（すなわち、ｎ＝１；ｏ＝１；ｐ＝１；ｑ＝０である）。１つの実施形態において、ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＝１、２、３または４、好ましくは、２、３または４、より好ましくは、３または４である。好ましい実施形態において、Ｌ２２およびＬ２３は、両方とも存在し、すなわち、ｏ＋ｐ＝２である。最も好ましくは、ｎ＋ｏ＋ｐ＋ｑ＝３または４である。
[0213]リンカーＬ２１は、存在しない（ｎ＝０）かまたは存在する（ｎ＝１）。好ましくは、リンカーＬ２１は存在し、ｎ＝１である。Ｌ２１は、例えば、直鎖状または分枝状のＣ１－Ｃ２００アルキレン基、Ｃ２－Ｃ２００アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ２００アルキニレン基、Ｃ３－Ｃ２００シクロアルキレン基、Ｃ５－Ｃ２００シクロアルケニレン基、Ｃ８－Ｃ２００シクロアルキニレン基、Ｃ７－Ｃ２００アルキルアリーレン基、Ｃ７－Ｃ２００アリールアルキレン基、Ｃ８－Ｃ２００アリールアルケニレン基、Ｃ９－Ｃ２００アリールアルキニレン基からなる群から選択され得る。アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は、置換されてもよく、前記基は、１つ以上のヘテロ原子、好ましくは、１～１００個のヘテロ原子によって中断されてもよく、前記ヘテロ原子は、好ましくは、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｙおよびＮＲ１５からなる群から選択され、ｙは、０、１または２、好ましくは、ｙ＝２であり、Ｒ１５は、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ６－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ７－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択される。
[0214]Ｌ２１は、（ポリ）エチレングリコールジアミン（例えば、１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタンまたはより長いエチレングリコール鎖を含む等価物）、ポリエチレングリコールまたはポリエチレンオキシド鎖、ポリプロピレングリコールまたはポリプロピレンオキシド鎖および１，ｚ－ジアミノアルカンを含み得、ｚは、アルカン中の炭素原子の数である（ｚは、例えば、１～１０の範囲の整数であり得る）。
[0215]好ましい実施形態において、リンカーＬ２１は、エチレングリコール基、カルボン酸部分、スルホネート部分、スルホン部分、ホスフェート部分、ホスフィネート部分、アミノ基、アンモニウム基またはスルファミド基を含む。
[0216]好ましい実施形態において、リンカーＬ２１は、スルファミド基、好ましくは構造（２３）に記載のスルファミド基を含む。
Figure 2024506022000021
[0217]波線は、化合物の残りの部分への接続、Ｌ４およびＬ５の場合、典型的にはＢＭおよびＬ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｄ１またはＤ２、好ましくはＢＭおよびＬ２２への接続を表す。好ましくは、（Ｏ）ａＣ（Ｏ）部分は、ＢＭに接続され、ＮＲ１３部分は、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｄ１またはＤ２、好ましくはＬ２２に接続され；Ｌ６の場合、典型的にはＢＭ１およびＢＭに接続される。好ましくは、（Ｏ）ａＣ（Ｏ）部分は、ＢＭ１に接続され、ＮＲ１３部分は、ＢＭに接続される。
[0218]構造（２３）において、ａ１＝０または１、好ましくは、ａ１＝１であり、Ｒ１３は、Ｏ、ＳおよびＮＲ１４から選択される１つ以上のヘテロ原子によって置換されていてもよく、中断されていてもよく、水素、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ３－Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ３－Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、Ｒ１４は、水素およびＣ１－Ｃ４アルキル基からなる群から独立して選択される。
[0219]あるいは、Ｒ１３は、おそらくスペーサー部分を介して、ペイロードに接続される。１つの実施形態において、環状構造が形成されるように、Ｒ１３も、ペイロードＤ１またはＤ２に接続される。例えば、Ｎは、炭素原子または窒素原子を介して、好ましくはピペラジン環の第２の窒素原子を介して、Ｄ１またはＤ２に接続されているピペラジン部分の一部である。好ましくは、環状構造、例えば、ピペラジン環は、下記でさらに定義されるように、－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｂ）ｇ１－Ｃ（Ｏ）－または－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｂ）ｇ１－Ｃ（Ｏ）－（Ｌ２２）ｏ－（Ｌ２３）ｐ－（Ｌ２４）ｑ－を介して、Ｄ１またはＤ２に接続される。
[0220]好ましい実施形態において、Ｒ１３は、水素またはＣ１－Ｃ２０アルキル基であり、より好ましくは、Ｒ１３は、水素またはＣ１－Ｃ１６アルキル基であり、さらにより好ましくは、Ｒ１３は、水素またはＣ１－Ｃ１０アルキル基であり、そのアルキル基は、Ｏ、ＳおよびＮＲ１４から選択される１つ以上のヘテロ原子、好ましくはＯによって置換されていてもよく、中断されていてもよく、Ｒ１４は、水素およびＣ１－Ｃ４アルキル基からなる群から独立して選択される。好ましい実施形態において、Ｒ１３は、水素である。別の好ましい実施形態において、Ｒ１３は、Ｃ１－Ｃ２０アルキル基、より好ましくは、Ｃ１－Ｃ１６アルキル基、さらにより好ましくは、Ｃ１－Ｃ１０アルキル基であり、そのアルキル基は、１つ以上のＯ原子によって中断されていてもよく、そのアルキル基は、－ＯＨ基、好ましくは、末端－ＯＨ基で置換されていてもよい。この実施形態では、Ｒ１３が、末端－ＯＨ基を含む（ポリ）エチレングリコール鎖であることがさらに好ましい。別の好ましい実施形態において、Ｒ１３は、水素、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチルおよびｔ－ブチルからなる群から選択され、より好ましくは、水素、メチル、エチル、ｎ－プロピルおよびｉ－プロピルからなる群、さらにより好ましくは、水素、メチルおよびエチルからなる群から選択される。なおもさらにより好ましくは、Ｒ１３は、水素またはメチルであり、最も好ましくは、Ｒ１３は、水素である。
[0221]好ましい実施形態において、Ｌ２１は、構造（２４）に記載のものである。
Figure 2024506022000022
[0222]ここで、ａおよびＲ１３は、上で定義されたとおりであり、Ｓｐ１およびＳｐ２は、独立してスペーサー部分であり、ｂ１およびｃ１は、独立して０または１である。好ましくは、ｂ１＝０または１かつｃ１＝１であり、より好ましくは、ｂ１＝０かつｃ１＝１である。１つの実施形態において、スペーサーＳｐ１およびＳｐ２は、直鎖状または分枝状のＣ１－Ｃ２００アルキレン基、Ｃ２－Ｃ２００アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ２００アルキニレン基、Ｃ３－Ｃ２００シクロアルキレン基、Ｃ５－Ｃ２００シクロアルケニレン基、Ｃ８－Ｃ２００シクロアルキニレン基、Ｃ７－Ｃ２００アルキルアリーレン基、Ｃ７－Ｃ２００アリールアルキレン基、Ｃ８－Ｃ２００アリールアルケニレン基およびＣ９－Ｃ２００アリールアルキニレン基からなる群から独立して選択され、そのアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は、Ｏ、ＳおよびＮＲ１６の群から選択される１つ以上のヘテロ原子によって置換されていてもよく、中断されていてもよく、Ｒ１６は、水素、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ２－Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２－Ｃ２４アルキニル基およびＣ３－Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立して選択され、そのアルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は、置換されていてもよい。そのアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基が、上で定義されたような１つ以上のヘテロ原子によって中断されるとき、前記基は、１つ以上のＯ原子および／または１つ以上のＳ－Ｓ基によって中断されることが好ましい。
[0223]より好ましくは、スペーサー部分Ｓｐ１およびＳｐ２は、存在する場合、直鎖状または分枝状のＣ１－Ｃ１００アルキレン基、Ｃ２－Ｃ１００アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ１００アルキニレン基、Ｃ３－Ｃ１００シクロアルキレン基、Ｃ５－Ｃ１００シクロアルケニレン基、Ｃ８－Ｃ１００シクロアルキニレン基、Ｃ７－Ｃ１００アルキルアリーレン基、Ｃ７－Ｃ１００アリールアルキレン基、Ｃ８－Ｃ１００アリールアルケニレン基およびＣ９－Ｃ１００アリールアルキニレン基からなる群から独立して選択され、そのアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は、Ｏ、ＳおよびＮＲ１６の群から選択される１つ以上のヘテロ原子によって置換されていてもよく、中断されていてもよく、Ｒ１６は、水素、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ２－Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２－Ｃ２４アルキニル基およびＣ３－Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立して選択され、そのアルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は、置換されていてもよい。
[0224]さらにより好ましくは、スペーサー部分Ｓｐ１およびＳｐ２は、存在する場合、直鎖状または分枝状のＣ１－Ｃ５０アルキレン基、Ｃ２－Ｃ５０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ５０アルキニレン基、Ｃ３－Ｃ５０シクロアルキレン基、Ｃ５－Ｃ５０シクロアルケニレン基、Ｃ８－Ｃ５０シクロアルキニレン基、Ｃ７－Ｃ５０アルキルアリーレン基、Ｃ７－Ｃ５０アリールアルキレン基、Ｃ８－Ｃ５０アリールアルケニレン基およびＣ９－Ｃ５０アリールアルキニレン基からなる群から独立して選択され、そのアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は、Ｏ、ＳおよびＮＲ１６の群から選択される１つ以上のヘテロ原子によって置換されていてもよく、中断されていてもよく、Ｒ１６は、水素、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ２－Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２－Ｃ２４アルキニル基およびＣ３－Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立して選択され、そのアルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は、置換されていてもよい。
[0225]なおもさらにより好ましくは、スペーサー部分Ｓｐ１およびＳｐ２は、存在する場合、直鎖状または分枝状のＣ１－Ｃ２０アルキレン基、Ｃ２－Ｃ２０アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ２０アルキニレン基、Ｃ３－Ｃ２０シクロアルキレン基、Ｃ５－Ｃ２０シクロアルケニレン基、Ｃ８－Ｃ２０シクロアルキニレン基、Ｃ７－Ｃ２０アルキルアリーレン基、Ｃ７－Ｃ２０アリールアルキレン基、Ｃ８－Ｃ２０アリールアルケニレン基およびＣ９－Ｃ２０アリールアルキニレン基からなる群から独立して選択され、そのアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は、Ｏ、ＳおよびＮＲ１６の群から選択される１つ以上のヘテロ原子によって置換されていてもよく、中断されていてもよく、Ｒ１６は、水素、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ２－Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２－Ｃ２４アルキニル基およびＣ３－Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立して選択され、そのアルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は、置換されていてもよい。
[0226]これらの好ましい実施形態において、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は、非置換であり、Ｏ、ＳおよびＮＲ１６の群から選択される１つ以上のヘテロ原子、好ましくはＯによって必要に応じて中断されることがさらに好ましく、Ｒ１６は、水素およびＣ１－Ｃ４アルキル基、好ましくは、水素またはメチルからなる群から独立して選択される。
[0227]最も好ましくは、スペーサー部分Ｓｐ１およびＳｐ２は、存在する場合、直鎖状または分枝状のＣ１－Ｃ２０アルキレン基からなる群から独立して選択され、そのアルキレン基は、Ｏ、ＳおよびＮＲ１６の群から選択される１つ以上のヘテロ原子によって置換されていてもよく、中断されていてもよく、Ｒ１６は、水素、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ２－Ｃ２４アルケニル基、Ｃ２－Ｃ２４アルキニル基およびＣ３－Ｃ２４シクロアルキル基からなる群から独立して選択され、そのアルキル基、アルケニル基、アルキニル基およびシクロアルキル基は、置換されていてもよい。この実施形態において、アルキレン基は、非置換であり、Ｏ、ＳおよびＮＲ１６の群から選択される１つ以上のヘテロ原子、好ましくは、Ｏおよび／またはまたはＳ－Ｓによって必要に応じて中断されることがさらに好ましく、Ｒ３は、水素およびＣ１－Ｃ４アルキル基、好ましくは、水素またはメチルからなる群から独立して選択される。
[0228]したがって、好ましいスペーサー部分Ｓｐ１およびＳｐ２としては、－（ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ－、－（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｒ－、－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－および－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）ｒ－が挙げられ、ｒは、１～５０の範囲、好ましくは、１～４０の範囲、より好ましくは、１～３０の範囲、さらにより好ましくは、１～２０の範囲、なおもさらにより好ましくは、１～１５の範囲の整数である。より好ましくは、ｒは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、より好ましくは、１、２、３、４、５、６、７または８、さらにより好ましくは、１、２、３、４、５または６、なおもさらにより好ましくは、１、２、３または４である。
[0229]あるいは、好ましいリンカーＬ２１は、－（Ｗ）ｋ１－（Ａ）ｄ１－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｃ（Ｏ））ｇ１－によって表され得、式中、
ｄ１＝０または１、好ましくはｄ１＝１であり；
ｅ１＝０～１０の範囲の整数、好ましくは、ｅ１＝０、１、２、３、４、５または６、好ましくは、１～１０の範囲の整数、最も好ましくは、ｅ１＝１、２、３または４であり；
ｆ１＝０または１、好ましくは、ｆ１＝０であり；
ここで、ｄ１＋ｅ１＋ｆ１は、少なくとも１であり、好ましくは、１～５の範囲であり；好ましくは、ｄ１＋ｆ１は、少なくとも１、好ましくは、ｄ１＋ｆ１＝１である。
ｇ１＝０または１、好ましくは、ｇ１＝１であり；
ｋ１＝０または１、好ましくは、ｋ１＝１であり；
Ａは、構造（２３）に記載のスルファミド基であり；
Ｂは、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－もしくは－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－部分であるか、または（Ｂ）ｅ１は、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｅ３－ＣＨ２－ＣＨ２－部分であり、ｅ３は、ｅ１と同じように定義され；
Ｗは、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ－または－（４－Ｐｈ）ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ－であり、好ましくは、Ｗは、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ－または－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－であり、ｍは、０～１０の範囲の整数であり、好ましくは、ｍ＝０、１、２、３、４、５または６、最も好ましくは、ｍ＝２または３であり；
好ましくは、Ｌ２１は、（Ａ）ｄ１－（Ｂ）ｅ１を介してＢＭまたはＢＭ１に接続され、（Ｃ（Ｏ））ｇ１、好ましくはＣ（Ｏ）を介して（Ｌ２２）ｏに接続される。
[0230]本実施形態の文脈において、構造（２３）の波線は、（Ｗ）ｋ１、（Ｂ）ｅ１および（Ｃ（Ｏ））ｇ１などの隣接する基への接続を表す。Ａは、ａ１＝１であり、Ｒ１３＝ＨまたはＣ１－Ｃ２０アルキル基、より好ましくはＲ１３＝Ｈまたはメチル、最も好ましくはＲ１３＝Ｈである構造（２３）に記載のものであることが好ましい。
[0231]好ましいリンカーＬ２１は、以下のとおりである。
（ａ）ｋ１＝０；ｄ１＝１；ｇ１＝１；ｆ１＝０；Ｂ＝－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－；ｅ１＝１、２、３または４、好ましくは、ｅ１＝２。
（ｂ）ｋ１＝１；Ｗ＝－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ－；ｍ＝２；ｄ１＝０；（Ｂ）ｅ１＝－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｅ３－ＣＨ２－ＣＨ２－；ｆ１＝０；ｇ１＝１；ｅ３＝１、２、３または４、好ましくは、ｅ１＝１。
（ｃ）ｋ１＝１；Ｗ＝－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－；ｄ１＝０；Ｂ＝－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－；ｇ１＝１；ｆ１＝０；ｅ１＝１、２、３または４、好ましくは、ｅ１＝２。
（ｄ）ｋ１＝１；Ｗ＝－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ－；ｍ＝２；ｄ１＝０；（Ｂ）ｅ１＝－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｅ３－ＣＨ２－ＣＨ２－；ｆ１＝０；ｇ１＝１；ｅ３＝１、２、３または４、好ましくは、ｅ３＝４。
（ｅ）ｋ１＝１；Ｗ＝－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－；ｄ１＝０；（Ｂ）ｅ１＝－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｅ３－ＣＨ２－ＣＨ２－；ｇ１＝１；ｆ１＝０；ｅ３＝１、２、３または４、好ましくは、ｅ３＝４。
（ｆ）ｋ１＝１；Ｗ＝－（４－Ｐｈ）ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ－、ｍ＝３；ｄ１＝０；（Ｂ）ｅ１＝－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｅ３－ＣＨ２－ＣＨ２－；ｇ１＝１；ｆ１＝０；ｅ３＝１、２、３または４、好ましくは、ｅ３＝４。
（ｇ）ｋ１＝０；ｄ１＝０；ｇ１＝１；ｆ１＝０；Ｂ＝－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－；ｅ１＝１、２、３または４、好ましくは、ｅ１＝２。
（ｈ）ｋ１＝１；Ｗ＝－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－；ｄ１＝０；ｇ１＝１；ｆ１＝０；Ｂ＝－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－；ｅ１＝１、２、３または４、好ましくは、ｅ１＝２。
[0232]１つの実施形態において、リンカーＬ２１は、ＢＭまたはＢＭ１と（Ｌ２２）ｏとの間の骨格に配置される分枝窒素原子であって、好ましくはリンカーを介してその分枝窒素原子に連結されたさらなる部分Ｄを置換基として含む分枝窒素原子を含む。分枝窒素原子の例は、構造（２３）中の窒素原子ＮＲ１３であり、Ｒ１３は、スペーサー部分を介してＤの第２の存在に接続されている。あるいは、分枝窒素原子は、構造－（Ｗ）ｋ１－（Ａ）ｄ１－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｃ（Ｏ））ｇ１－に記載のＬ２１内に配置され得る。１つの実施形態において、Ｌ２１は、－（Ｗ）ｋ１－（Ａ）ｄ１－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｃ（Ｏ））ｇ１－Ｎ＊［－（Ａ）ｄ１－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｃ（Ｏ））ｇ１－］２によって表され、式中、Ａ、Ｂ、Ｗ、ｄ１、ｅ１、ｆ１、ｇ１およびｋ１は、上で定義されたとおりであり、各存在について個別に選択され、Ｎ＊は、分枝窒素原子であり、その原子に－（Ａ）ｄ１－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｃ（Ｏ））ｇ１－の２つの例が接続される。ここで、両方の（Ｃ（Ｏ））ｇ１部分が、－（Ｌ２２）ｏ－（Ｌ２３）ｐ－（Ｌ２４）ｑ－Ｄに接続され、式中、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、ｏ、ｐ、ｑおよびＤは、上で定義されたとおりであり、それぞれ個別に選択される。最も好ましい実施形態において、そのような分枝原子は、存在せず、リンカーＬ２１は、さらなるペイロードへの接続を含まない。
[0233]リンカーＬ２２は、存在しない（ｏ＝０）かまたは存在する（ｏ＝１）。好ましくは、リンカーＬ２２は存在し、ｏ＝１である。リンカーＬ２２は、当該分野で公知であるようなペプチドスペーサーまたはその誘導体（例えば、シクロブタン－１，１－ジカルボキサミド－Ｃｉｔ）であり、好ましくは、２～５個のアミノ酸を含む。ペプチドスペーサーは、好ましくは、構造（２６）である：
Figure 2024506022000023
ここで、Ｒ１７は、アミノ酸側鎖を表し、ｎは、１～１０の範囲の整数、好ましくは、ｎ＝１～８、より好ましくは、ｎ＝１～５、最も好ましくは、ｎ＝１～４、好ましくは、ｎ＝２である。
[0234]好ましくは、ペプチドスペーサーは、当該分野で公知であるようなジペプチドスペーサーまたはトリペプチドスペーサー、好ましくは、ジペプチドスペーサーである。好適なペプチドスペーサーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、Ｖａｌ－Ｇｌｎ、ＡｃＬｙｓ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ、ＡｃＬｙｓ－Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ｇｌｎ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｌｅｕ－Ｇｌｎ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ａｌａ－Ａｓｎ、Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ、Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｈｉｓ、Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－ＧｌｙおよびＬｙｓ、好ましくは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、ＡｃＬｙｓ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ、ＡｃＬｙｓ－Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ａｌａ－Ａｓｎ、より好ましくは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ａｌａ－Ａｓｎ、Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ、Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｈｉｓ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－ＧｌｙおよびＬｙｓからなる群から選択され、好ましくは、ペプチドスペーサーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－ＡｌａまたはＡｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎである。１つの実施形態において、ペプチドスペーサーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔである。１つの実施形態において、ペプチドスペーサーは、Ｖａｌ－Ａｌａである。
[0235]これらのリンカーは、典型的には、タンパク質分解酵素、好ましくは、カテプシン、グランザイム、カスパーゼ、カリケレイン、プロタンパク質転換酵素サブチリシン、フューリン、エラスターゼ、レグマイン、線維芽細胞活性化タンパク質、組織型プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼおよびマトリプターゼの群から選択されるタンパク質分解酵素によって切断可能である。
[0236]好ましい実施形態において、ペプチドスペーサーは、一般構造（２７）：
Figure 2024506022000024
によって表される。ここで、Ｒ１７は、アミノ酸側鎖、好ましくは、Ｒ１７＝ＣＨ３（Ｖａｌ）またはＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２（Ｃｉｔ）を表す。
[0237]構造（２６）および（２７）の波線は、分子の残りの部分への接続を示し、好ましくは、ペプチドスペーサーは、ＮＨを介して、典型的にはリンカーを介して（Ｌ２１）に接続され、Ｃ（Ｏ）を介して、典型的にはリンカーを介してペイロードに接続される。
[0238]波線は、（Ｌ２１）ｎおよび（Ｌ２３）ｐへの接続を示し、好ましくは、構造（２６）または（２７）に記載のＬ２２は、ＮＨを介して（Ｌ２１）ｎに接続され、Ｃ（Ｏ）を介して（Ｌ２３）ｐに接続される。
[0239]リンカーＬ２３は、存在しない（ｐ＝０）かまたは存在する（ｐ＝１）。好ましくは、リンカーＬ２３は存在し、ｐ＝１である。リンカーＬ２３は、自己犠牲スペーサーとも呼ばれる自己切断可能なスペーサーである。好ましくは、Ｌ２３は、構造（２５）に記載のパラ－アミノベンジルオキシ（ＰＡＢ）誘導体、より好ましくは、ＰＡＢ誘導体である。
Figure 2024506022000025
ここで、
Ａは、置換されていてもよい５員または６員の芳香環または芳香族複素環であり；
ｂは、０または１であり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｒ４またはＣ（Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ２４（ヘテロ）アルキル基、Ｃ３－Ｃ１０（ヘテロ）シクロアルキル基、Ｃ２－Ｃ１０（ヘテロ）アリール基、Ｃ３－Ｃ１０アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３－Ｃ１０（ヘテロ）アリールアルキル基であり、これらは、Ｏ、ＳおよびＮＲ５から選択される１つ以上のヘテロ原子によって置換されていてもよく、中断されていてもよく、Ｒ５は、水素およびＣ１－Ｃ４アルキル基からなる群から独立して選択される。
[0240]ここで、波線は、（Ｌ２２）ｏおよび（Ｌ２４）ｑへの接続を示す。典型的には、ＰＡＢ誘導体は、ＮＨを介して（Ｌ２２）ｏに接続され、Ｏを介して（Ｌ２４）ｑに接続される。
[0241]Ｒ３は、Ｈ、Ｒ４またはＣ（Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ２４（ヘテロ）アルキル基、Ｃ３－Ｃ１０（ヘテロ）シクロアルキル基、Ｃ２－Ｃ１０（ヘテロ）アリール基、Ｃ３－Ｃ１０アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３－Ｃ１０（ヘテロ）アリールアルキル基であり、これらは、Ｏ、ＳおよびＮＲ５から選択される１つ以上のヘテロ原子によって置換されていてもよく、中断されていてもよく、Ｒ５は、水素およびＣ１－Ｃ４アルキル基からなる群から独立して選択される。好ましくは、Ｒ４は、Ｃ３－Ｃ１０（ヘテロ）シクロアルキルまたはポリアルキレングリコールである。そのポリアルキレングリコールは、好ましくは、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール、より好ましくは、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓＨまたは－（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓＨである。そのポリアルキレングリコールは、最も好ましくは、ポリエチレングリコール、好ましくは、－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｓＨであり、式中、ｓは、１～１０の範囲の整数であり、好ましくは、１～５、最も好ましくは、ｓ＝１、２、３または４である。より好ましくは、Ｒ３は、ＨまたはＣ（Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４＝４－メチル－ピペラジンまたはモルホリンである。最も好ましくは、Ｒ３は、Ｈである。好ましくは、Ａはフェニル環であり、ｂ＝１である。
[0242]リンカーＬ２４は、存在しない（ｑ＝０）かまたは存在する（ｑ＝１）。好ましくは、リンカーＬ２４は存在し、ｑ＝１である。リンカーＬ２４は、アミノアルカン酸スペーサー、すなわち、－Ｎ－（Ｃｈ－アルキレン）－Ｃ（Ｏ）－であり、式中、ｈは、１～２０、好ましくは、１～１０、最も好ましくは１～６の範囲の整数である。ここで、アミノアルカン酸スペーサーは、典型的には、窒素原子を介してＬ２３に接続され、カルボニル部分を介してペイロードに接続される。好ましいリンカーＬ２４は、６－アミノヘキサン酸（Ａｈｘ，ｈ＝６）、β－アラニン（ｈ＝２）およびグリシン（Ｇｌｙ，ｈ＝１）、さらにより好ましくは６－アミノヘキサン酸またはグリシンから選択される。１つの実施形態において、Ｌ２４＝６－アミノヘキサン酸である。１つの実施形態において、Ｌ２４＝グリシンである。あるいは、リンカーＬ２４は、構造－Ｎ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｅ６－（ＣＨ２）ｅ７－（Ｃ（Ｏ）－に記載のエチレングリコールスペーサーであり、式中、ｅ６は、１～１０の範囲の整数であり、ｅ７は、１～３の範囲の整数である。
[0243]分枝部分
本発明の文脈における「分枝部分」とは、３つの部分を接続するリンカーに埋め込まれた部分のことを指す。換言すれば、分枝部分は、他の部分に対する少なくとも３つの結合を含む。分枝部分ＢＭは、典型的にはリンカーＬ４を介したペイロードＤ１への１つの結合、典型的にはリンカーＬ５を介したペイロードＤ２への１つの結合、およびリンカーＬ３を介した抗体Ａｂへの１つの結合を含む。分枝部分ＢＭ１は、リンカーＬ６を介した分枝部分ＢＭへの１つの結合を含み、（Ｌ８）ｑ－Ｚ－（Ｌ７）ｐを介した抗体Ａｂへの２つの結合を含む。下記で定義される分枝部分は、ＢＭおよびＢＭ１に等しく適用される。
[0244]他の部分に対する少なくとも３つの結合を含む任意の部分が、本発明の文脈において分枝部分として適している。好適な分枝部分としては、炭素原子（ＢＭ－１）、窒素原子（ＢＭ－３）、リン原子（ホスフィン（ＢＭ－５）およびホスフィンオキシド（ＢＭ－６））、芳香環、例えば、フェニル環（例えば、ＢＭ－７）またはピリジル環（例えば、ＢＭ－９）、（ヘテロ）環（例えば、ＢＭ－１１およびＢＭ－１２）および多環式部分（例えば、ＢＭ－１３、ＢＭ－１４およびＢＭ－１５）が挙げられる。好ましい分枝部分は、炭素原子、窒素原子およびフェニル環から選択され、最も好ましくは、分枝部分は、炭素原子または窒素原子である。構造（ＢＭ－１）～（ＢＭ－１５）を下記に示し、３つの分枝、すなわち上で定義されたような他の部分への結合を＊で示す（＊でラベルされた結合）。
Figure 2024506022000026
[0245]（ＢＭ－１）において、＊でラベルされた分枝の１つは、－－－－で示される単結合または二重結合であり得る。（ＢＭ－１１）～（ＢＭ－１５）において、以下が該当する。
ｎ、ｐ、ｑおよびｑの各々は、個別に、０～５の範囲の整数、好ましくは、０または１、最も好ましくは、１であり；
Ｗ１、Ｗ２およびＷ３の各々は、Ｃ（Ｒ２１）ｗおよびＮから独立して選択され；
Ｗ４、Ｗ５およびＷ６の各々は、Ｃ（Ｒ２１）ｗ＋１、Ｎ（Ｒ２２）ｗ、ＯおよびＳから独立して選択され；
各－－－－は、単結合または二重結合を表し；
ｗは、０または１または２であり、好ましくは、０または１であり；
各Ｒ２１は、水素、ＯＨ、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ１－Ｃ２４アルコキシ基、Ｃ３－Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、そのＣ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ１－Ｃ２４アルコキシ基、Ｃ３－Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子によって置換されていてもよく、中断されていてもよく、Ｒ３は、水素およびＣ１－Ｃ４アルキル基からなる群から独立して選択され；
各Ｒ２２は、水素、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ３－Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から独立して選択され、そのＣ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ１－Ｃ２４アルコキシ基、Ｃ３－Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は、Ｏ、ＳおよびＮＲ３から選択される１つ以上のヘテロ原子によって置換されていてもよく、中断されていてもよく、Ｒ３は、水素およびＣ１－Ｃ４アルキル基からなる群から独立して選択される。
[0246]当業者は、ｗの値と－－－－によって表される結合の結合次数とが相互依存的であることを認識する。したがって、Ｗの存在が、環内二重結合に結合されるときはいつでも、Ｗの存在についてはｗ＝１であり、Ｗの存在が２つの環内単結合に結合されるときはいつでも、Ｗの存在についてはｗ＝０である。ＢＭ－１２の場合、ｏおよびｐの少なくとも一方は、０ではない。
[0247]構造（ＢＭ－１１）および（ＢＭ－１２）に記載の分枝部分の代表例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル、アジリジン、アゼチジン、ジアゼチジン、オキセタン、チエタン、ピロリジン、ジヒドロピロリル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、チオラニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、ジオキソラニル、ジチオラニル、ピペリジニル、オキサニル、チアニル、ピペラジニル、モルホリノ、チオモルホリノ、ジオキサニル、トリオキサニル、ジチアニル、トリチアニル、アゼパニル、オキセパニルおよびチエパニルが挙げられる。分枝部分として使用するための好ましい環状部分としては、シクロプロペニル、シクロヘキシル、オキサニル（テトラヒドロピラン）およびジオキサニルが挙げられる。３つの分枝の置換パターンは、分枝部分が構造（ＢＭ－１１）のものであるかまたは構造（ＢＭ－１２）のものであるかを決定する。
[0248]構造（ＢＭ－１３）～（ＢＭ－１５）に記載の分枝部分の代表例としては、デカリン、テトラリン、ジアリン、ナフタレン、インデン、インダン、イソインデン、インドール、イソインドール、インドリン、イソインドリンなどが挙げられる。
[0249]好ましい実施形態において、分枝部分は、炭素原子である。炭素原子が、構造（ＢＭ－１）に記載のものであり、別個の部分への４つすべての結合を有する場合、その炭素原子は、キラルである。炭素原子の立体化学は、本発明にとって重要ではなく、ＳであってもＲであってもよい。同じことがホスフィン（ＢＭ－６）にも当てはまる。最も好ましくは、炭素原子は、構造（ＢＭ－１）に記載のものである。構造（ＢＭ－１）に記載の炭素原子において＊で示される分枝の１つは、二重結合であり得、この場合、その炭素原子は、アルケンまたはイミンの一部であり得る。分枝部分が炭素原子である場合、その炭素原子は、アセタール、ケタール、ヘミケタール、オルトエステル、オルト炭酸エステル、アミノ酸などのより大きな官能基の一部であり得る。これは、分枝部分が窒素またはリン原子である場合にも当てはまり、その場合、分枝部分は、アミド、イミド、イミン、ホスフィンオキシド（ＢＭ－６におけるように）またはホスホトリエステルの一部であり得る。
[0250]好ましい実施形態において、分枝部分は、フェニル環である。最も好ましくは、そのフェニル環は、構造（ＢＭ－７）に記載のものである。フェニル環の置換パターンは、任意の位置化学のもの、例えば、１，２，３置換フェニル環、１，２，４置換フェニル環または１，３，５置換フェニル環であり得る。最適な屈曲性および立体配座の自由を可能にするために、フェニル環は、構造（ＢＭ－７）に記載のものであることが好ましく、最も好ましくは、フェニル環は１，３，５置換されている。同じことが（ＢＭ－９）のピリジン環にも当てはまる。
[0251]好ましい実施形態において、分枝部分は、炭素原子、窒素原子、リン原子、（ヘテロ）芳香環、（ヘテロ）環または多環式部分から選択される。
[0252]好ましい多機能性抗体構築物
本発明に係る特に好ましい多機能性抗体構築物は、構造（３）、（４）、（５）、（６）または（７）を有する。１つの実施形態において、多機能性抗体構築物は、構造（３）、（４）、（５）または（６）に記載のものである。１つの実施形態において、多機能性抗体構築物は、構造（３）、（４）または（６）に記載のものである。１つの実施形態において、多機能性抗体構築物は、構造（３）または（４）に記載のものである。
[0253]１つの実施形態において、多機能性抗体構築物は、構造（３）：
Figure 2024506022000027
を有し、式中、
ＢＭおよびＢＭ１は、分枝部分であり；
ｄ、ｍ、ｎおよびｐは、それぞれ独立して、０または１であり；
Ｄ１およびＤ２は、ポリペプチド、小分子、細胞毒およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される２つの別個のペイロードであり、Ｄ１およびＤ２のうちの少なくとも１つは、ポリペプチドであり；
ｅは、０～１０の範囲の整数であり；
Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６およびＬ７は、リンカーであり；
Ｓｕは、単糖であり；
Ｇは、単糖部分であり；
ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミン部分であり；
Ｆｕｃは、フコース部分であり；
Ｚ１は、接続基である。
[0254]多機能性抗体構築物が構造（３）を有する場合、ｎ＝ｍ＝１であることが好ましい。
[0255]１つの実施形態において、多機能性抗体構築物は、構造（４）：
Figure 2024506022000028
を有し、式中、
Ｄ１およびＤ２は、ポリペプチド、小分子、細胞毒およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される２つの別個のペイロードであり、Ｄ１およびＤ２のうちの少なくとも１つは、ポリペプチドであり；
ｄおよびｐは、それぞれ独立して、０または１であり；
ｅは、０～１０の範囲の整数であり；
ｘ２は、１～８の範囲の整数であり；
Ｌ６、Ｌ７およびＬ１４は、リンカーであり；
Ｓｕは、単糖であり；
Ｇは、単糖部分であり；
ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミン部分であり；
Ｆｕｃは、フコース部分であり；
ＢＭ１は、分枝部分であり；
Ｚ１およびＺ２は、接続基である。
[0256]多機能性抗体構築物が構造（４）を有する場合、Ｌ１４は、上で定義されたような構造（Ｌ－Ｄ）に記載のものであることが好ましい。接続基Ｚ１は、求核反応を介した付加環化および接続基Ｚ２によって得られることがさらに好ましい。
[0257]１つの実施形態において、多機能性抗体構築物は、構造（５）：
Figure 2024506022000029
を有し、式中、
Ｄ１およびＤ２は、ポリペプチド、小分子、細胞毒およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される２つの別個のペイロードであり、Ｄ１およびＤ２のうちの少なくとも１つは、ポリペプチドであり；
ｘ１およびｘ２は、それぞれ独立して、１、２または３であり；
各ｄは、独立して０または１であり；
ｅは、０～１０の範囲の整数であり；
Ｌ１５およびＬ１６は、リンカーであり；
Ｓｕは、単糖であり；
Ｇは、単糖部分であり；
ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミン部分であり；
Ｆｕｃは、フコース部分であり；
Ｚ１およびＺ２は、接続基である。
[0258]多機能性抗体構築物が構造（５）を有する場合、Ｌ１５とＬ１６は両方とも、個別に、上で定義されたような構造（Ｌ－Ｄ）に記載のものであることが好ましい。接続基Ｚ１とＺ２は両方とも、個別に付加環化によって得られることがさらに好ましい。典型的には、ｘ１とｘ２との合計は、多くとも４、好ましくは、２または４である。より好ましくは、ｘ１とｘ２は、同じであり、１または２である。
[0259]１つの実施形態において、多機能性抗体構築物は、構造（６）：
Figure 2024506022000030
を有し、式中、
Ｄ１およびＤ２は、ポリペプチド、小分子、細胞毒およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される２つの別個のペイロードであり、Ｄ１およびＤ２のうちの少なくとも１つは、ポリペプチドであり；
ｘ１は、１～８の範囲の整数であり、ｘ２は、１～４の範囲の整数であり、ｘ１＋ｘ２＝２～１０であり、
各ｄは、独立して０または１であり；
ｅは、０～１０の範囲の整数であり；
Ｌ１４およびＬ１５は、リンカーであり；
Ｓｕは、単糖であり；
Ｇは、単糖部分であり；
ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミン部分であり；
Ｆｕｃは、フコース部分であり；
Ｚ１およびＺ２は、接続基である。
[0260]多機能性抗体構築物が構造（６）を有する場合、Ｌ１４とＬ１５は両方とも、個別に、上で定義されたような構造（Ｌ－Ｄ）に記載のものであることが好ましい。接続基Ｚ１は、求核反応を介した付加環化および接続基Ｚ２によって得られることがさらに好ましい。ｘ２は、１～４の範囲の整数であり、好ましくは、ｘ２は、１または２であり、最も好ましくは、ｘ２は、２である。
[0261]１つの実施形態において、多機能性抗体構築物は、構造（７）：
Figure 2024506022000031
を有し、式中、
Ｄ１およびＤ２は、ポリペプチド、小分子、細胞毒およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される２つの別個のペイロードであり、Ｄ１およびＤ２のうちの少なくとも１つは、ポリペプチドであり；
ｘ３は、１～４の範囲の整数であり；
各ｄは、独立して０または１であり；
ｅは、０～１０の範囲の整数であり；
Ｌ４、Ｌ５およびＬ１７は、リンカーであり；
ＢＭは、分枝部分であり；
Ｓｕは、単糖であり；
Ｇは、単糖部分であり；
ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミン部分であり；
Ｆｕｃは、フコース部分であり；
Ｚ１およびＺ２は、接続基である。
[0262]多機能性抗体構築物が構造（７）を有する場合、Ｌ１７は、上で定義されたような構造（Ｌ－Ｄ）に記載のものであることが好ましい。接続基Ｚ１は、付加環化によって得られることがさらに好ましい。ｘ２は、１～４の範囲の整数であり、好ましくは、ｘ３は、２または４であり、最も好ましくは、ｘ３は、２である。さらに、ｍ＝ｎ＝１であることが好ましい。
[0263]用途
本発明に係る多機能性抗体構築物は、癌に対する複数の作用様式を単一分子内で組み合わせることによって、例えば癌の治療に特に適している。したがって、本発明はさらに、医薬における本発明に係る多機能性抗体構築物の使用に関する。さらなる態様において、本発明はまた、本発明に係る多機能性抗体構築物を被験体に投与するステップを含む、それを必要とする被験体を治療する方法に関する。この態様に係る方法はまた、治療において使用するための本発明に係る多機能性抗体構築物としても述べられ得る。この態様に係る方法はまた、薬の製造のための本発明に係る多機能性抗体構築物の使用としても述べられ得る。ここで、投与は、典型的には、治療有効量の本発明に係る多機能性抗体構築物を用いて行われる。
[0264]本発明に係る抗体構築物の多機能性が理由で、治療は、抗体の標的化の性質のおかげで、ペイロードＤ１とＤ２の両方を腫瘍に向かわせる。したがって、抗体－薬物コンジュゲートなどのペイロードＤ１に基づく１つの薬物と、別個に投与される追加の薬物（例えば、化学療法薬またはチェックポイント阻害剤）との同時投与は、もはや必要ではない。さらに、本発明に係る多機能性抗体構築物は、腫瘍関連抗原への結合、免疫細胞結合ポリペプチドまたはチェックポイント阻害剤の数、および小分子ペイロードなどの他のペイロードの数に関して、慎重に調整された化学量論を可能にする。最後に、本発明に係る多機能性抗体構築物は、腫瘍の多剤耐性に起因して従来の治療法を用いた治療に対して非感受性になった患者の治療に特に適し得る。したがって、特に好ましい１つの実施形態において、被験体は、従来の癌治療に対して多剤耐性を発症した癌患者である。
[0265]本発明はさらに、上で定義されたような本発明に係る多機能性抗体構築物の投与を含む、特定の疾患の治療を必要とする被験体における特定の疾患を治療するための方法に関する。その特定の疾患は、癌、ウイルス感染症、細菌感染症、神経疾患、自己免疫疾患、眼疾患、高コレステロール血症およびアミロイドーシスから選択され得、より好ましくは、癌およびウイルス感染症から選択され得、最も好ましくは、その疾患は、癌である。治療を必要とする被験体は、典型的には癌患者である。抗体－コンジュゲートの使用は、このような治療、特に、癌治療の分野で周知であり、本発明に係る多機能性抗体構築物は、この点において特に適している。この態様に係る方法において、多機能性抗体構築物は、典型的には治療有効量で投与される。本発明の本態様はまた、特定の疾患の治療を必要とする被験体における特定の疾患の治療において使用するため、好ましくは癌の治療のために使用するための本発明に係る多機能性抗体構築物としても述べられ得る。換言すれば、この態様は、特定の疾患の治療を必要とする被験体における特定の疾患の治療において使用するため、好ましくは癌の治療において使用するための薬または医薬組成物を調製するための本発明に係る多機能性抗体構築物の使用に関する。
[0266]本発明に係る多機能性抗体構築物は、Ｆｃサイレントであること、すなわち、臨床で使用されたとき、Ｆｃガンマ受容体ＣＤ１６に有意に結合しないことが好ましい。これは、Ｇが存在しない場合、すなわちｅ＝０の場合である。好ましくは、ＣＤ３２およびＣＤ６４に対する結合も有意に減少する。
[0267]本発明はさらに、免疫細胞を腫瘍細胞と会合させる方法に関する。免疫細胞および腫瘍細胞を含むサンプルを、本発明に係る多機能性抗体構築物と接触させる。免疫細胞は、免疫細胞結合ペプチドに結合し、腫瘍細胞は、本抗体に結合するため、腫瘍細胞と免疫細胞と多機能性抗体構築物との複合体会合物が形成される。別の実施形態において、本発明に係る方法は、腫瘍細胞およびチェックポイント阻害剤への同時結合のための方法である。ここで、チェックポイント阻害剤および腫瘍細胞を含むサンプルを、本発明に係る多機能性抗体構築物と接触させる。チェックポイント阻害剤は、チェックポイント阻害剤標的化ポリペプチドに結合し、腫瘍細胞は、本抗体に結合するため、腫瘍細胞とチェックポイント阻害剤と多機能性抗体構築物との複合体会合物が形成される。この接触は、インビトロのサンプル中、例えば被験体から採取したサンプル中で、または被験体内のインビボで（この場合、本発明に係る多機能性抗体構築物は被験体に投与される）行われ得る。
[0268]本発明の文脈における投与とは、全身投与のことを指す。ゆえに、１つの実施形態において、本明細書中で定義される方法は、多機能性抗体構築物の全身投与のための方法である。多機能性抗体構築物の特異性を考慮して、それらは、全身投与され得るが、目的の組織（例えば、腫瘍）内またはその近くでそれらの活性を発揮し得る。全身投与は、薬物が、イメージング技術では検出できない腫瘍転移にも到達することがあり、血液腫瘍に適用可能であり得るので、局所投与よりも大きな利点を有する。
[0269]本発明はさらに、本発明に係る抗体－ペイロードコンジュゲートおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物に関する。
本発明を以下の実施例によって例証する。
一般的な手順
化学物質は、通常使用される供給業者（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｃｒｏｓ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ、Ａｐｏｌｌｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬｔｄおよびＴＣＩ）から購入し、さらに精製することなく使用した。化学変換、ワークアップおよびクロマトグラフィーのための溶媒（乾燥溶媒を含む）は、Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）からＨＰＬＣグレードで購入し、さらに蒸留することなく使用した。シリカゲル６０Ｆ２５４分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートは、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）製であり、過マンガン酸カリウム染色またはアニスアルデヒド染色を用いてＵＶ光下で可視化した。クロマトグラフィー精製は、Ｂｕｃｈｉ Ｓｅｐａｃｏｒｅ Ｃ６６０フラクションコレクター（Ｆｌａｗｉｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と組み合わせてＡｃｒｏｓシリカゲル（０．０６－０．２００，６０Ａ）または充填済みカラム（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して行った。逆相ＨＰＬＣ精製は、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，ＰＮ１８６００２９８２）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２００システムを使用して行った。ＮＭＲ分光法に使用される重水素化溶媒は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。ビス－ｍａｌ－Ｌｙｓ－ＰＥＧ４－ＴＦＰエステル（１７７）は、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎから入手し、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ジエチレングリコール（ＸＬ０７）ならびに化合物３４４および１７９は、Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍから入手し、２，３－ビス（ブロモメチル）－６－キノキサリンカルボン酸（１７８）は、ＣｈｅｍＳｃｅｎｅから入手し、３２－アジド－５－オキソ－３，９，１２，１５，１８，２１，２４，２７，３０－ノナオキサ－６－アザドトリアコンタン酸（３４８）は、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈから入手した。化合物３１３ｍ（ＬＤ１４，マレイミドカプロイル－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ）は、Ｌｅｖｅｎａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａから入手した。アドセトリスおよびカドサイラは、薬局から入手した。
モノクローナル抗体およびＡＤＣの質量スペクトル分析のための一般的な手順
質量スペクトル分析の前に、Ｆｃ／２フラグメントの分析のためにＩｄｅＳ（ＦａｂｒｉｃａｔｏｒＴＭ）でＩｇＧを処理した。２０μｇの（修飾）ＩｇＧの溶液を、１０μＬの総体積において、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ６．６中の０．５μＬのＩｄｅＳ（５０Ｕ／μＬ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。サンプルを４０μＬに希釈した後、ＪＥＯＬ ＡｃｃｕＴＯＦにおいてエレクトロスプレーイオン化飛行時間型（ＥＳＩ－ＴＯＦ）分析を行った。デコンボリューションされたスペクトルを、Ｍａｇｔｒａｎソフトウェアを使用して得た。
分析用ＲＰ－ＨＰＬＣの一般的な手順
ＲＰ－ＨＰＬＣ分析の前に、ＩｇＧをＩｄｅＳで処理し、Ｆｃ／２フラグメントの分析を可能にした。（修飾）ＩｇＧ（１００μＬ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中１ｍｇ／ｍＬ）の溶液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ６．６中の１．５μＬのＩｄｅＳ／ＦａｂｒｉｃａｔｏｒＴＭ（５０Ｕ／μＬ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。４９％アセトニトリル、４９％水、２％ギ酸（１００μＬ）を加えることによって、反応をクエンチした。ＲＰ－ＨＰＬＣ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）において行った。サンプル（１０μＬ）を、７０℃のカラム温度を有するＺＯＲＢＡＸ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ ３００ ＳＢ－Ｃ８カラム（１×７５ｍｍ，５μｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ）に０．５ｍＬ／分で注入した。０．１％ＴＦＡ中の３０～５４％アセトニトリルおよび水という直線勾配を２５分で適用した。
分析用ＨＰＬＣ－ＳＥＣの一般的な手順
ＨＰＬＣ－ＳＥＣ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）において行った。サンプル（４μＬ，１ｍｇ／ｍＬ）をＸｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ２００Ａ（３．５μＭ，７．８×３００ｍｍ，ＰＮ１８６００７６４０ Ｗａｔｅｒｓ）カラムに０．８６ｍＬ／分で注入した。０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．９（ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４）を用いたアイソクラティック溶出を１６分間行った。
実施例１．化合物１０２の合成

ＤＣＭ（５００ｍＬ）中の４－ニトロフェニルクロロホルメート（３０．５ｇ，１５１ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）溶液に、ピリジン（２４．２ｍＬ，２３．７ｇ，２９９ｍｍｏｌ）を加えた。その反応混合物に、ＤＣＭ（２００ｍＬ）中のＢＣＮ－ＯＨ（１０１，１８．０ｇ，１２０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下した。添加が完了した後、ＮＨ４Ｃｌの飽和水溶液（５００ｍＬ）および水（２００ｍＬ）を加えた。分離後、水相をＤＣＭ（２×５００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。その粗材料をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、所望の生成物１０２をオフホワイト色の固体として得た（１８．７ｇ，５９ｍｍｏｌ，３９％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）８．３２－８．２３（ｍ，２Ｈ），７．４５－７．３４（ｍ，２Ｈ），４．４０（ｄ，Ｊ＝８．３ Ｈｚ，２Ｈ），２．４０－２．１８（ｍ，６Ｈ），１．６９－１．５４（ｍ，２Ｈ），１．５１（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝９．０ Ｈｚ，１Ｈ），１．１２－１．００（ｍ，２Ｈ）
実施例２．化合物１０４の合成
ＴＨＦ（３ｍＬ）中のアジド－ＰＥＧ１１－アミン（１０３）（１８２ｍｇ，０．３１９ｍｍｏｌ）の冷却溶液（－５℃）に、１０％ＮａＨＣＯ３水溶液（１．５ｍＬ）、およびＴＨＦ（２ｍＬ）に溶解された９－フルオレニルメトキシカルボニルクロリド（９９ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を加え、混合物をブライン（２×６ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製（ＤＣＭ中の０→１１％ＭｅＯＨ）により、１０４を透明な油状物として９８％収率で得た（２５１ｍｇ，０．３１６ｍｍｏｌ）。Ｃ３９Ｈ６０Ｎ４Ｏ１３ ＋（Ｍ＋Ｎａ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値８１５．４２、実測値８１５．５３。
実施例３．化合物１０５の合成
ＴＨＦ（３ｍＬ）および水（０．２ｍＬ）中の１０４（４８ｍｇ，０．０６０ｍｍｏｌ）の溶液を調製し、０℃に冷却した。トリメチルホスフィン（トルエン中１Ｍ，０．２４ｍＬ，０．２４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を２３時間撹拌したままにした。ＤＣＭ（６ｍＬ）で抽出することによって水を除去した。この溶液に、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１０２）（２５ｍｇ，０．０７９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１０μＬ，０．０７０ｍｍｏｌ）を加えた。２７時間後、混合物を濃縮し、残渣をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解した後、ピペリジン（４００μＬ）を加えた。１時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→２１％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、１０５を無色油状物として得た（８．３ｍｇ，０．００９２ｍｍｏｌ）。Ｃ４６Ｈ７６Ｎ２Ｏ１５ ＋（Ｍ＋ＮＨ４ ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値９１４．５２、実測値９１４．７３。
実施例４．化合物１０７の合成
乾燥ＤＣＭ（５００μＬ）中の（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１０２）（４．１ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）の溶液を、乾燥ＤＣＭ（５００μＬ）中のアミノ－ＰＥＧ２３－アミン（１０６）（１２．３ｍｇ，０．０１１４ｍｍｏｌ）の溶液にゆっくり加えた。２０時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→２５％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物１０７を７３％収率で得た（１２ｍｇ，０．００８０ｍｍｏｌ）。Ｃ７０Ｈ１２４Ｎ２Ｏ２７ ＋（Ｍ＋ＮＨ４ ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１４４３．７３、実測値１４４４．０８。
実施例５．化合物１０８の合成
ＭｅＣＮ（４５０ｍＬ）中のＢＣＮ－ＯＨ（１０１，２１．０ｇ，０．１４ｍｏｌ）の溶液に、ジスクシンイミジルカーボネート（５３．８ｇ，０．２１ｍｏｌ）およびトリエチルアミン（５８．５ｍＬ，０．４２ｍｏｌ）を加えた。混合物を１４０分間撹拌した後、これを真空中で濃縮し、残渣をＭｅＣＮ（４００ｍＬ）と１回共蒸発させた。残渣をＥｔＯＡｃ（６００ｍＬ）に溶解し、Ｈ２Ｏ（３×２００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→４％ＥｔＯＡｃ）によって精製し、１０８（１１．２ｇ，３８．４ｍｍｏｌ，２７％収率）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）４．４５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４ Ｈｚ），２．８５（ｓ，４Ｈ），２．３８－２．１８（ｍ，６Ｈ），１．６５－１．４４（ｍ，３Ｈ），１．１２－１．００（ｍ，２Ｈ）．
実施例６．化合物１１０の合成
ＤＣＭ（１５ｍＬ）中の（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルＮ－スクシンイミジルカーボネート（１０８）（５００ｍｇ，１．７１ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（７１８ｕＬ，５．１４ｍｍｏｌ）およびモノ－Ｆｍｏｃエチレンジアミン塩酸塩（１０９）（６５７ｍｇ，２．０６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を４５分間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）で希釈し、５０％飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。水層をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をＨ２Ｏ（１０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機抽出物を真空中で濃縮し、残渣の半分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→３％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物１１０を４２％収率で得た（３３２ｍｇ，０．７２ｍｍｏｌ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）７．７７（ｄ，Ｊ＝７．５ Ｈｚ，２Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝７．４ Ｈｚ，２Ｈ），７．４４－７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３６－７．２８（ｍ，２Ｈ），５．１２（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．９７（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４４．４１（ｄ，Ｊ＝６．８ Ｈｚ，２Ｈ），４．２１（ｔ，Ｊ＝６．７ Ｈｚ，１Ｈ），４．１３（ｄ，Ｊ＝８．０ Ｈｚ，２Ｈ），３．３３（ｂｒ ｓ，４Ｈ），２．３６－２．０９（ｍ，６Ｈ），１．６７－１．４５（ｍ，２Ｈ），１．３３（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝８．６ Ｈｚ，１Ｈ），１．０１－０．８５（ｍ，２Ｈ）．Ｃ２８Ｈ３１Ｎ２Ｏ４ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値４５９．２３、実測値４５９．５２。
実施例７．化合物１１１の合成
化合物１１０（３２７ｍｇ，０．７１３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（６ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（０．５ｍＬ）を加えた。２時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→３２％０．７Ｎ ＮＨ３ ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物１１１を黄色油状物として得た（１２８ｍｇ，０．５４２ｍｍｏｌ，７６％）。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ，ｒｏｔａｍｅｒｓ）５．２（ｂｓ，１Ｈ），４．１５（ｄ，Ｊ＝８．０ Ｈｚ，２Ｈ），３．４８－３．４０（ｍ，２／３Ｈ），３．３３－３．２７（ｍ，２／３Ｈ），３．２７－３．１９（ｍ，１ １／３Ｈ），２．８５－２．８０（ｍ，１ １／３Ｈ），２．３６－２．１７（ｍ，６Ｈ），１．６７－１．５０（ｍ，２Ｈ），１．３６（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝８．５ Ｈｚ，１Ｈ），１．０１－０．８９（ｍ，２Ｈ）．
実施例８．化合物１１４の合成
水（２０ｍＬ）中のジエタノールアミン（１１２）（２０８ｍｇ，１．９８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＭｅＣＮ（２０ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（２５０ｍｇ，２．９７ｍｍｏｌ）、およびＭｅＣＮ（２０ｍＬ）中のＦｍｏｃ－ＯＳｕ（１１３）（６０１ｍｇ，１．７８ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を２時間撹拌し、ＤＣＭ（５０ｍＬ）を加えた。分離後、有機相を水（２０ｍＬ）で洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。所望の生成物１１４を無色の濃厚な油状物として得た（５７３ｍｇ，１．７５ｍｍｏｌ，９８％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）７．７９－７．７４（ｍ，２Ｈ），７．６０－７．５４（ｍ，２Ｈ），７．４４－７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３６－７．３０（ｍ，２Ｈ），４．５８（ｄ，Ｊ＝５．４ Ｈｚ，２Ｈ），４．２３（ｔ，Ｊ＝５．３ Ｈｚ，１Ｈ），３．８２－３．７２（ｍ，２Ｈ），３．４８－３．３３（ｍ，４Ｈ），３．２５－３．１１（ｍ，２Ｈ）．
実施例９．化合物１１６の合成
ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の１１４（５６７ｍｇ，１．７３ｍｍｏｌ）の溶液に、４－ニトロフェニルクロロホルメート（１１５）（７６８ｍｇ，３．８１ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（１．２ｍＬ，８７５ｍｇ）を加えた。混合物を１８時間撹拌し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→１０％ＭｅＯＨ、次いでヘプタン中の２０％→７０％ＥｔＯＡｃ）によって精製することにより、３２ｍｇ（４９μｍｏｌ，２．８％）の所望の生成物１１６を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）８．３１－８．２０（ｍ，４Ｈ），７．８０－７．７４（ｍ，２Ｈ），７．５９－７．５４（ｍ，２Ｈ），７．４４－７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３７－７．２９（ｍ，６Ｈ），４．６１（ｄ，Ｊ＝５．４ Ｈｚ，２Ｈ），４．３９（ｔ，Ｊ＝５．１ Ｈｚ，２Ｈ），４．２５（ｔ，Ｊ＝５．５ Ｈｚ，１Ｈ），４．０２（ｔ，Ｊ＝５．０ Ｈｚ，２Ｈ），３．６７（ｔ，Ｊ＝４．８ Ｈｚ，２Ｈ），３．４５（ｔ，Ｊ＝５．２ Ｈｚ，２Ｈ）．
実施例１０．化合物１１７の合成
ＤＣＭ（２ｍＬ）中の１１６（３４ｍｇ，０．０５０ｍｍｏｌ）の溶液に、１１１（４９ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２０μＬ，０．１４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌したままにした。２３時間後、混合物を濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→４０％ＭｅＯＨ）で精製することにより、１１７を白色固体として６１％収率で得た（２７ｍｇ，０．０３１ｍｍｏｌ）。Ｃ４７Ｈ５７Ｎ５Ｏ１０ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値８５１．４１、実測値８５２．４９。
実施例１１．化合物１１８の合成
化合物１１８を１１７の調製中に得た（３．８ｍｇ，０．００６０ｍｍｏｌ）。Ｃ３２Ｈ４７Ｎ５Ｏ８ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値６２９．３４、実測値６３０．５４。
実施例１２．化合物１２１の合成
ＴＨＦ（６ｍＬ）中の、ジエチレントリアミン（１１９）（７３μＬ，０．６７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２８３μＬ，２．０３ｍｍｏｌ）の溶液を－５℃に冷却し、窒素雰囲気下に置いた。２－（Ｂｏｃ－オキシイミノ）－２－フェニルアセトニトリル（１２０）（３３４ｍｇ，１．３５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４ｍＬ）に溶解し、冷却した溶液にゆっくり加えた。２．５時間後、氷浴を除去し、混合物を室温でさらに２．５時間撹拌し、真空中で濃縮した。残渣をＤＣＭ（１５ｍＬ）に再溶解し、５％ＮａＯＨ水溶液（２×５ｍＬ）、ブライン（２×５ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→１４％ＭｅＯＨ）で精製することにより、１２１を無色油状物として９１％収率で得た（１８５ｍｇ，０．６１０ｍｍｏｌ）。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）５．０８（ｓ，２Ｈ），３．３０－３．１２（ｍ，４Ｈ），２．７４（ｔ，Ｊ＝５．９ Ｈｚ，４Ｈ），１．４５（ｓ，１８Ｈ）．
実施例１３．化合物１２３の合成
ＴＨＦ（２ｍＬ）中の１２１（３３．５ｍｇ，０．１１０ｍｍｏｌ）の冷却溶液（－１０℃）に、１０％ＮａＨＣＯ３水溶液（５００μＬ）、およびＴＨＦ（１ｍＬ）に溶解された９－フルオレニルメトキシカルボニルクロリド（１２２）（３４ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、混合物を濃縮し、残渣をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に再溶解し、ブライン（２×５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→５０％ＭｅＯＨ）で精製することにより、１２３を８６％収率で得た（５０ｍｇ，０．０９０ｍｍｏｌ）。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）７．７７（ｄ，Ｊ＝７．４ Ｈｚ，２Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝７．４ Ｈｚ，２Ｈ），７．４３－７．３８（ｍ，２Ｈ），７．３６－７．３１（ｍ，２Ｈ），５．５７（ｄ，Ｊ＝５．２ Ｈｚ，２Ｈ），４．２３（ｔ，Ｊ＝５．１ Ｈｚ，１Ｈ），３．４０－２．８３（ｍ，８Ｈ），１．４１（ｓ，１８Ｈ）．
実施例１４．化合物１２４の合成
ＤＣＭ（３ｍＬ）中の１２３（５０ｍｇ，０．０９５ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中の４Ｍ ＨＣｌ（２００μＬ）を加えた。混合物を１９時間撹拌し、濃縮し、白色固体を精製せずに得て（３５ｍｇ）、脱保護された中間体および（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１０２）（７０ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（３４μＬ，０．２４ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→２５％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、１２４を４８％で得た（３１ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）。Ｃ４１Ｈ４７Ｎ３Ｏ６ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値６７７．３５、実測値６７８．５７。
実施例１５．化合物１２５の合成
ＤＭＦ（５００μＬ）中の１２４（１０ｍｇ，０．０１４ｍｍｏｌ）の溶液に、ピペリジン（２０μＬ）を加えた。３．５時間後、混合物を濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→２０％ＭｅＯＨ）で精製することにより、１２５を５８％収率で得た（３．７ｍｇ，０．００８０ｍｍｏｌ）。Ｃ２６Ｈ３７Ｎ３Ｏ４ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値４５５．２８、実測値４５６．４１。
実施例１６．化合物１２７および１２８の合成
ＤＣＭ（２０ｍＬ）中のジエチレングリコール（１２６）（４４６μＬ，０．５０ｇ，４．７１ｍｍｏｌ）の溶液に、４－ニトロフェノールクロロホルメート（１１５）（１．４ｇ，７．０７ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（３．３．ｍＬ，２．４ｇ，２３．６ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を撹拌し、濾過し、真空中で濃縮した（５５℃で）。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ヘプタン中の１５％→７５％ＥｔＯＡｃ）によって精製し、２つの生成物を単離した。生成物１２７を白色固体として得た（５１１ｍｇ，１．１７ｍｍｏｌ，２５％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）８．３１－８．２３（ｍ，４Ｈ），７．４３－７．３４（ｍ，４Ｈ），４．５４－４．４４（ｍ，４Ｈ），３．９１－３．８３（ｍ，４Ｈ）．生成物１２８を無色油状物として得た（３２１ｍｇ，１．１８ｍｍｏｌ，２５％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）８．３２－８．２４（ｍ，２Ｈ），７．４３－７．３６（ｍ，２Ｈ），４．５０－４．４４（ｍ，２Ｈ），３．８６－３．８０（ｍ，２Ｈ），３．８１－３．７４（ｍ，２Ｈ），３．６９－３．６４（ｍ，２Ｈ）．

実施例１７．化合物１３１の合成
ＤＭＦ（２９５μＬ）中の１１８（２．３ｍｇ，３．７μｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＦ（６５μＬ）中の１２７（３．２ｍｇ，７．４μｍｏｌ）の溶液およびＥｔ３Ｎ（１．６μＬ，１．１ｍｇ，１１．１μｍｏｌ）を加えた。混合物を１７時間静置し、ＤＭＦ（１４μＬ）中のＨＯＢｔ（０．５ｍｇ，３．７μｍｏｌ）の溶液を加えた。４時間後、Ｅｔ３Ｎ（５．２μＬ，３．８ｍｇ，３７μｍｏｌ）およびＤＭＦ（２７６μＬ）中のｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡ（１３０，１３．８ｍｇ，１１μｍｏｌ）の溶液を加えた。３日後、混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８，水（１％ＡｃＯＨ）中の３０％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）によって精製した。所望の生成物１３１を無色のフィルム状物として得た（１．５ｍｇ，０．７８μｍｏｌ，２１％）。Ｃ９６Ｈ１４８Ｎ１５Ｏ２５ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１９１１．０８、実測値１９１２．０８。
実施例１８．化合物１３２の合成
ＤＣＭ（２ｍＬ）中の１２１（１６８ｍｇ，０．５５４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ（１ｍＬ）中の１２８（２４０ｍｇ，０．８９ｍｍｏｌ）の溶液、ＤＣＭ（１ｍＬ）およびＥｔ３Ｎ（１６９ｍｇ，２３３μＬ）を加えた。混合物を１７時間撹拌し、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘプタン中のＥｔＯＡｃのグラジエント）によって精製した。所望の生成物１３２を、わずかに黄色の油状物として得た（８５ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ，３５％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）５．２４－５．０２（ｍ，２Ｈ），４．３６－４．２０（ｍ，３Ｈ），３．８４－３．６７（ｍ，４Ｈ），３．６５－３．５８（ｍ，２Ｈ），３．４７－３．３４（ｍ，４Ｈ），３．３４－３．１８（ｍ，４Ｈ），１．４４（ｂｓ，１８Ｈ）．
実施例１９．化合物１３４の合成
ＤＣＭ（３ｍＬ）中の１３２（８１ｍｇ，０．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中の４Ｎ ＨＣｌ（７００μＬ）を加えた。混合物を１９時間撹拌し、濃縮し、残渣をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解した。Ｅｔ３Ｎ（１３２μＬ，９６ｍｇ，０．９５ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．５ｍＬ）および（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１０２）（１３２ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を２時間撹拌した。混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→３％ＭｅＯＨ）によって精製した。所望の生成物１３４を無色のフィルム状物として得た（６４ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ，５７％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）４．３１－４．２３（ｍ，２Ｈ），４．２２－４．０８（ｍ，４Ｈ），３．８０－３．６８（ｍ，４Ｈ），３．６６－３．５８（ｍ，２Ｈ），３．５０－３．２８（ｍ，８Ｈ），２．８０－２．６５（ｍ，１Ｈ），２．４０－２．１０（ｍ，１２Ｈ），１．６８－１．４８（ｍ，４Ｈ），１．３５（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝８．１ Ｈｚ，１Ｈ），１．０２－０．８７（ｍ，２Ｈ）．Ｃ３１Ｈ４６Ｎ３Ｏ８ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値５８８．３３、実測値５８８．４３。
実施例２０．化合物１３７の合成
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の１３４（６３ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）の溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（３５）（３２．６ｍｇ，０．１０７ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（３２．５ｍｇ，４５μＬ，０．３２ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後、７７μＬを主反応混合物から除去し、ＤＭＦ（２００μＬ）中のｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡ（１３０，１０ｍｇ，８．１μｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（３．４μＬ，２．５ｍｇ，２４μｍｏｌ）を加えた。１８時間後、２，２’－（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（４．９μＬ，５．０ｍｇ，３４μｍｏｌ）を加え、混合物を４５分間静置した。混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８，水（１％ＡｃＯＨ）中の３０％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）によって精製した。所望の生成物１３７を無色のフィルム状物として得た（８．７ｍｇ，５．０μｍｏｌ，６１％）。Ｃ９０Ｈ１３８Ｎ１３Ｏ２１ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１７３７．０１、実測値１７３８．０１。
実施例２１．化合物１３９の合成
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の１３４（６３ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ）の溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（３５）（３２．６ｍｇ，０．１０７ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（３２．５ｍｇ，４５μＬ，０．３２ｍｍｏｌ）を加えた。２０時間後、７７μＬを主反応混合物から除去し、ＤＭＦ（２４０μＬ）中のｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＦ．ＴＦＡ（１３８，９．６ｍｇ，８．２μｍｏｌ）の溶液およびＥｔ３Ｎ（３．４μＬ，２．５ｍｇ，２４μｍｏｌ）を加えた。３時間後、２，２’－（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（２０μＬ，２０ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を２０分間静置した。混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８，水（１％ＡｃＯＨ）中の３０％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）によって精製した。所望の生成物１３９を無色のフィルム状物として得た（５．３ｍｇ，３．２μｍｏｌ，３９％）。Ｃ８７Ｈ１３０Ｎ１１Ｏ２１ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１６６４．９４、実測値１６６５．９９。
実施例２２．化合物１４１の合成
ＤＣＭ（４００ｍｌ）中の（１Ｒ，８Ｓ，９Ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルＮ－スクシンイミジルカーボネート（１０８）（１６．３５ｇ，５６．１３ｍｍｏｌ）の溶液に、２－（２－アミノエトキシ）エタノール（１４０）（６．７６ｍｌ，６７．３５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２３．４７ｍｌ，１６８．３９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた薄黄色溶液を室温で９０分間撹拌した。混合物を真空中で濃縮し、残渣をアセトニトリル（４００ｍＬ）と１回共蒸発させた。得られた油状物をＥｔＯＡｃ（４００ｍＬ）に溶解し、Ｈ２Ｏ（３×２００ｍＬ）で洗浄した。有機層を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の５０％→８８％ＥｔＯＡｃ）によって精製し、１４１（１１．２ｇ，３９．８１ｍｍｏｌ，７１％収率）を薄黄色油状物として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）５．０１（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．１７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝１２．０ Ｈｚ），３．７９－３．６８（ｍ，２Ｈ），３．６４－３．５０（ｍ，４Ｈ），３．４７－３．３０（ｍ，２Ｈ），２．３６－２．１４（ｍ，６Ｈ），１．９３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），１．６８－１．４９（ｍ，２Ｈ），１．３７（ｑｕｉｎｔｅｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０ Ｈｚ），１．０１－０．８９（ｍ，２Ｈ）．
実施例２３．化合物１４２の合成
ＤＣＭ（１５ｍＬ）中の１４１（６６３ｍｇ，２．３６ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（９８６ｕＬ，７．０７ｍｍｏｌ）および４－ニトロフェニルクロロホルメート（１１５）（７１２ｍｇ，３．５３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を４時間撹拌し、真空中で濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の０→２０％ＥｔＯＡｃ）で精製することにより、１４２（４００ｍｇ，０．９ｍｍｏｌ，収率３８％）を薄黄色油状物として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）８．２９（ｄ，Ｊ＝９．４ Ｈｚ，２Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝９．３ Ｈｚ，２Ｈ），５．０５（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．４８－４．４１（ｍ，２Ｈ），４．１６（ｄ，Ｊ＝８．０ Ｈｚ，２Ｈ），３．８１－３．７５（ｍ，２Ｈ），３．６１（ｔ，Ｊ＝５．０ Ｈｚ，２Ｈ），３．４２（ｑ，Ｊ＝５．４ Ｈｚ，２Ｈ），２．３５－２．１６（ｍ，６Ｈ），１．６６－１．５０（ｍ，２Ｈ），１．３５（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝８．６ Ｈｚ，１Ｈ），１．０２－０．８８（ｍ，２Ｈ）．Ｃ２２Ｈ２６Ｎ２ＮａＯ８ ＋（Ｍ＋Ｎａ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値４６９．１６、実測値４６９．３６。
実施例２４．化合物１４３の合成
ＤＭＦ（４８μＬ）中の１４２（２．７ｍｇ，６．０μｍｏｌ）の溶液およびＥｔ３Ｎ（２．１μＬ，１．５ｍｇ，１５μｍｏｌ）を、ＤＭＦ（０．３２ｍＬ）中の１２５（２．３ｍｇ，５．０μｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物を４日間静置し、ＤＭＦ（１００μＬ）で希釈し、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８，水（１％ＡｃＯＨ）中の３０％→１００％のＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）によって精製した。生成物１４３を無色のフィルム状物として得た（２．８ｍｇ，３．７μｍｏｌ，７４％）。Ｃ４２Ｈ５９Ｎ４Ｏ９ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値７６３．４３、実測値７６３．５３。
実施例２５．化合物１４５の合成
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の１２８（２００ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（４１．６ｕＬ，０．３０ｍｍｏｌ）およびトリス（２－アミノエチル）アミン１４４（１４．９ｕＬ，０．１０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１５０分間撹拌した後、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の２５％→１００％ＥｔＯＡｃ、次いでＤＣＭ中の０％→１０％ＭｅＯＨ）によって精製し、１４５を４３％収率（４５．４ｍｇ，４２．５ｕｍｏｌ）で黄色油状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）５．６８－５．１８（ｍ，６Ｈ），４．３２－４．１８（ｍ，６Ｈ），４．１８－４．１１（ｄ，Ｊ＝７．９ Ｈｚ，６Ｈ），３．７４－３．６１（ｍ，６Ｈ），３．６１－３．５１（ｍ，６Ｈ），３．４３－３．２９（ｍ，６Ｈ），３．２９－３．１５（ｍ，６Ｈ），２．６５－２．４７（ｍ，６Ｈ），２．３７－２．１６（ｍ，１８Ｈ），１．６９－１．４９（ｍ，６Ｈ），１．３５（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝８．９ Ｈｚ，３Ｈ），１．０３－０．８７（ｍ，６Ｈ）．
実施例２６．化合物１４８の合成
ＤＣＭ（３００ｍＬ）中のＢＣＮ－ＯＨ（１０１）（３．０ｇ，２０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＳＩ（１４６）（１．７４ｍＬ，２．８３ｇ，２０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１５分間撹拌した後、Ｅｔ３Ｎ（５．６ｍＬ，４．０ｇ，４０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５分間撹拌し、２－（２－アミノエトキシ）エタノール（１４７）（２．２ｍＬ，２．３ｇ，２２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を１５分間撹拌し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（３００ｍＬ）を加えた。層を分離し、水相をＤＣＭ（２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％～１０％ＭｅＯＨ）によって精製した。所望の生成物を含む画分を濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に溶解し、濃縮した。所望の生成物１４８を、わずかに黄色の油状物として得た（４．２４ｇ，１１．８ｍｍｏｌ，５９％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）５．９９－５．７９（ｂｓ，１Ｈ），４．２９（ｄ，Ｊ＝８．３ Ｈｚ，２Ｈ），３．７８－３．７４（ｍ，２Ｈ），３．６６－３．５６（ｍ，４Ｈ），３．３７－３．３０（ｍ，２Ｈ），２．３６－２．１６（ｍ，６Ｈ），１．６３－１．４９（ｍ，２Ｈ），１．４０（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝８．７ Ｈｚ，１Ｈ），１．０５－０．９４（ｍ，２Ｈ）．
実施例２７．化合物１４９の合成
ＤＣＭ（２００ｍＬ）中の１４８（３．６２ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）の溶液に、４－ニトロフェニルクロロホルメート（１５）（２．０２ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（４．２ｍＬ，３．０４ｇ，３０．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を１．５時間撹拌し、濃縮した。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘプタン（１％ＡｃＯＨ）中の２０％→７０％ＥｔＯＡｃ（１％ＡｃＯＨ））によって精製した。生成物１４９を白色泡状物として得た（４．０７ｇ，７．７４ｍｍｏｌ，７４％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）８．３２－８．２６（ｍ，２Ｈ），７．４５－７．４０（ｍ，２Ｈ），５．６２－５．５２（ｍ，１Ｈ），４．４８－４．４２（ｍ，２Ｈ），４．２８（ｄ，Ｊ＝８．２ Ｈｚ，２Ｈ），３．８１－３．７６（ｍ，２Ｈ），３．７０－３．６５（ｍ，２Ｈ），３．３８－３．３０（ｍ，２Ｈ），２．３５－２．１６（ｍ，６Ｈ），１．６２－１．４６（ｍ，２Ｈ），１．３８（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝８．７ Ｈｚ，１Ｈ），１．０４－０．９３（ｍ，２Ｈ）．
実施例２８．化合物１５０の合成
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の１４９（２００ｍｇ，０．３８ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（３５．４ｕＬ，０．２４ｍｍｏｌ）およびトリス（２－アミノエチル）アミン（１４４）（１２．６ｕＬ，８４．６ｕｍｏｌ）を加えた。混合物を１２０分間撹拌し、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の２５％→１００％ＥｔＯＡｃ、次いでＤＣＭ中の０％→１０％ＭｅＯＨ）によって精製し、１５０を３６％収率（４０．０ｍｇ，３０．６ｕｍｏｌ）で白色泡状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）６．３４－５．７２（ｍ，６Ｈ），４．３４－４．１８（ｍ，１２Ｈ），３．７６－３．５８（ｍ，１２Ｈ），３．４３－３．３０（ｍ，６Ｈ），３．３０－３．１８（ｍ，６Ｈ），２．６４－２．４９（ｍ，６Ｈ），２．３８－２．１４（ｍ，１８Ｈ），１．６５－１．４７（ｍ，６Ｈ），１．３９（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝９．１ Ｈｚ，３Ｈ），１．０６－０．９０（ｍ，６Ｈ）．
実施例２９．化合物１５３の合成
無水ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１５１）（３１．２ｍｇ，７５．８μｍｏｌ）の混合物に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（４０μＬ，２９ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（３０．３ｍｇ，７９．６μｍｏｌ）を加えた。１０分後、テトラジン－ＰＥＧ３－エチルアミン（１５２）（３０．３ｍｇ，７５．８μｍｏｌ）を加え、混合物をボルテックスした。２時間後、混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８，水（１％ＡｃＯＨ）中の３０％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）によって精製した。所望の生成物を淡紅色のフィルム状物として得た（２４．１ｍｇ，３１．８μｍｏｌ，４２％）。Ｃ３８Ｈ４５Ｎ８Ｏ９ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値７５７．３３、実測値７５７．４６。
実施例３０．化合物１５４の合成
ＤＭＦ（５００μＬ）中の１５３（２４．１ｍｇ，３１．８μｍｏｌ）の溶液に、ジエチルアミン（２０μＬ，１４ｍｇ，１９１μｍｏｌ）を加えた。混合物を２時間静置し、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃ１８，水（１％ＡｃＯＨ）中の５％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）によって精製した。所望の目的物１５４を淡紅色のフィルム状物として得た（１７．５ｍｇ，３２．７μｍｏｌ，定量的）。Ｃ２３Ｈ３５Ｎ８Ｏ７ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値５３５．２６、実測値５３５．３７。
実施例３１．化合物１５６の合成
乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＮ－［（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチルオキシカルボニル］－１，８－ジアミノ－３，６－ジオキサオクタン（１５５）（６８ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）の溶液を、乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１５１）（８６ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）の溶液に移した。ＤＩＰＥＡ（１００μＬ，０．６３０ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（７９ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）を加えた。１．５時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→１１％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物１５６を３４％収率で得た（５２ｍｇ，０．０７２ｍｍｏｌ）。Ｃ３５Ｈ４７Ｎ５Ｏ９ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値７１７．３４、実測値７１８．３９。
実施例３２．化合物１５７の合成
化合物１５６（２１ｍｇ，０．０２９ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２．４ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（６００μＬ）を加えた。２０分後、混合物を濃縮し、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製することにより、所望の化合物１５７を白色固体として得た（９．３ｍｇ，０．０１８ｍｍｏｌ，６４％）。Ｃ２３Ｈ３７Ｎ５Ｏ７ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値４９５．２７、実測値４９６．５６。
実施例３３．化合物１５９の合成
ＤＣＭ（５ｍＬ）中のアミノ－ＰＥＧ１１－アミン（１５８）（１４３ｍｇ，０．２６０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解された（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１０２）（４１ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。１．５時間後、混合物を還元し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→２０％０．７Ｎ ＮＨ３ ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物１５９を透明な油状物として得た（６２ｍｇ，０．０８６ｍｍｏｌ，６６％）。Ｃ３５Ｈ４６Ｎ２Ｏ１３ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値７２０．４４、実測値７２１．５６。
実施例３４．化合物１６０の合成
乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中の１５９（６２ｍｇ，０．０８６ｍｍｏｌ）の溶液を、乾燥ＤＭＦ（２ｍＬ）中のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１５１）（３６ｍｇ，０．０８６ｍｍｏｌ）の溶液に移した。ＤＩＰＥＡ（４３μＬ，０．２５ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（３３ｍｇ，０．０８６ｍｍｏｌ）を加えた。１８時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→２０％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物１６０を６２％収率で得た（６０ｍｇ，０．０５４ｍｍｏｌ）。Ｃ５６Ｈ８３Ｎ５Ｏ１８＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１１１３．５７、実測値１１１４．９３。
実施例３５．化合物１６１の合成
化合物１６０（３６ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（２００μＬ）を加えた。２時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→４０％０．７Ｎ ＮＨ３ ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物１６１を黄色油状物として得た（１６．７ｍｇ，０．０１８７ｍｍｏｌ，５８％）。Ｃ４１Ｈ７３Ｎ５Ｏ１６ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値８９１．５１、実測値８９２．８２。
実施例３６．化合物１６２の合成
ＤＣＭ（３ｍＬ）中のアミノ－ＰＥＧ２３－アミン（１０６）（６０ｍｇ，０．０５６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解された（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１０２）（１２ｍｇ，０．０３７ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。４時間後、混合物を濃縮し、ＤＭＦ（２ｍＬ）に再溶解し、その後、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ（５１）（２３ｍｇ，０．０５６ｍｍｏｌ）、ＨＡＴＵ（２１ｍｇ，０．０５６ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２７μＬ，０．１６ｍｍｏｌ）を加えた。２０時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→２７％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物１６２を９３％で得た（５７ｍｇ，０．０４３ｍｍｏｌ）。Ｃ８０Ｈ１３１Ｎ５Ｏ３０ ＋（Ｍ＋ＮＨ４ ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１６４１．８９、実測値１６５９．９２。
実施例３７．化合物１６３の合成
化合物１６２（５７ｍｇ，０．０３４ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解し、ピペリジン（１２０μＬ）を加えた。２時間後、混合物を濃縮し、水に再溶解し、Ｆｍｏｃ－ピペリジン副産物をジエチルエーテル（３×１０ｍＬ）で抽出して除去した。凍結乾燥後、１６３を黄色油状物として得た（４６．１ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ，９５％）。Ｃ６５Ｈ１２１Ｎ５Ｏ２８ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１４１９．８２、実測値１４２０．９１。
実施例３８．化合物１６５の合成
（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメチル（４－ニトロフェニル）カーボネート（１０２）（２０４ｍｇ，０．６５０ｍｍｏｌ）の溶液に、アミノ－ＰＥＧ１２－アルコール（１６４）（４９６ｍｇ，０．９０８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３５０μＬ，２．２７ｍｍｏｌ）を加えた。１９時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の２→２０％ＭｅＯＨ）で精製することにより、１６５を透明な黄色油状物として得た（４１０ｍｇ，０．５６０ｍｍｏｌ，８７％）。Ｃ３５Ｈ６３ＮＯ１４ ＋（Ｍ＋Ｎａ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値７２１．４２、実測値７４４．４３。
実施例３９．化合物１６６の合成
ＤＣＭ（６ｍＬ）中の１６５（４１０ｍｇ，０．５６０ｍｍｏｌ）の溶液に、４－ニトロフェニルクロロホルメート（１７１，０．８４８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２６０μＬ，１．８９ｍｍｏｌ）を加えた。１８時間後、混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→７％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物１６６を透明な油状物として得た（３５０ｍｇ，０．３９４ｍｍｏｌ，７０％）。Ｃ４２Ｈ６６Ｎ２Ｏ１８ ＋（Ｍ＋Ｎａ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値８８６．４３、実測値９０９．６１。
実施例４０．化合物１６８の合成
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の１６６（１５ｍｇ，０．０１７ｍｍｏｌ）の溶液に、ペプチドＬＰＥＴＧＧ（１６７）（９．７ｍｇ，０．０１７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７μＬ，０．０５ｍｍｏｌ）を加えた。４６時間後、混合物を濃縮し、残渣を分取ＨＰＬＣによって精製することにより、所望の化合物１６８を６３％で得た（１４ｍｇ，０．０１０ｍｍｏｌ）。Ｃ６０Ｈ１０１Ｎ７Ｏ２５＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１３１９．６８、実測値１３２０．９２。
実施例４１．ＸＬ０１の合成
無水ＤＭＦ（１７０μＬ）中の１５５（９．７ｍｇ，０．０３ｍｍｏｌ）の溶液に、１７７（ビス－マレイミド－リジン－ＰＥＧ４－ＴＦＰ，Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ）（２０ｍｇ，０．０２４ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（９．９μＬ，０．０７１ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４２時間撹拌した後、混合物をＤＣＭ（０．４ｍＬ）で希釈し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→１８％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、ＸＬ０１を透明な油状物として得た（１０．２ｍｇ，０．０１０ｍｍｏｌ，４３％）。Ｃ４９Ｈ７２Ｎ７Ｏ１６ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１００３．１２、実測値１００３．６２。
実施例４２．ビス－マレイミドアジドＸＬ０２の合成
乾燥ＤＭＦ（４００μＬ）中の１７７（３２．９ｍｇ，３９．０μｍｏｌ，１．０当量）が入ったバイアルに、ＸＬ０７（９．２ｍｇ，４２．１μｍｏｌ，１．０８当量）を加え、その溶液を混合し、室温で約５０分間放置した。次に、ＤｉＰＥＡを加え、得られた溶液を混合し、室温で約２時間放置した。次いで、反応混合物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ中の１４％ＭｅＯＨ）によって直接精製した。所望の生成物ＸＬ０２を無色油状物として得た（２８．９ｍｇ，３２．２μｍｏｌ，８３％収率）。Ｃ３９Ｈ６２Ｎ９Ｏ１５ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値８９６．９７、実測値８９６．５２。
実施例４３．ＸＬ０３の合成
乾燥ＤＣＭ（７．５ｍＬ）中の２，３－ビス（ブロモメチル）－６－キノキサリンカルボン酸１７８（５１．４ｍｇ，１４２．８μｍｏｌ，１．００当量）が入ったバイアルに、ＤＩＣ（９．０ｍｇ，７１．４μｍｏｌ，０．５当量）を加えた。得られた混合物を室温で３０分間放置した後、乾燥ＤＣＭ（０．５ｍＬ）中のＸＬ０７（１７．７ｍｇ，７８．５μｍｏｌ，０．５５当量）の溶液を加えた。反応混合物を室温で約３５分間撹拌し、次いで、シリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭ→ＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨ）によって直接精製して、不純な生成物（７２ｍｇ）を白色固体として得た。その不純な生成物を１．０ｍＬのＤＭＦに溶解し、この溶液の５０％をトルエンと共蒸発させた（２×）。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（トルエン中の１２→３０％アセトン）によって精製した。所望の生成物ＸＬ０３を無色油状物として得た（２０．１ｍｇ，３５．９μｍｏｌ）。Ｃ１９Ｈ２５Ｂｒ２Ｎ６Ｏ４ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値５６１．０３、実測値５６１．１２
実施例４４．ＸＬ０５の合成
ＤＣＭ（０．３ｍＬ）中の１７８（３０ｍｇ，０．０９ｍｍｏｌ）の溶液に、３－マレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステル（２７ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（３８μＬ，０．２７ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２８時間撹拌した後、粗混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→１５％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、ＸＬ０５を透明な油状物として得た（２７ｍｇ，０．０５６ｍｍｏｌ，６２％）。Ｃ２４Ｈ３４Ｎ３Ｏ７ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値４７６．５４、実測値４７６．４６。
実施例４５．ＸＬ０６の合成
２４（１７．２ｍｇ，１－Ｈ－ｑＮＭＲによる８８重量％，１８．４μｍｏｌ，１．００当量）が入ったバイアルに、乾燥ＤＭＦ中の１７９の溶液（６０μＬ）を加えた。得られた無色溶液に、トリエチルアミン（４０．６μＬ，１５．８当量，２９１μｍｏｌ）を加えたところ、直ちに黄色溶液が生成された。反応混合物を室温で約２８時間放置し、次いで、Ｅｔ３Ｎの大部分が蒸発するまで真空中で濃縮した。次いで、残渣をＤＣＭ（１ｍＬ）で希釈し、シリカゲルクロマトグラフィー（第１のカラム：ＤＣＭ→ＤＣＭ中の２０％ＭｅＯＨ、第２のカラム：ＤＣＭ→ＤＣＭ中の２０％ＭｅＯＨ）によって直接精製した。所望の生成物（ＸＬ０６）を無色油状物として得た（４．３ｍｇ，１８．４μｍｏｌ，２６％収率）。Ｃ３４Ｈ６２Ｎ７Ｏ１９Ｓ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値９０４．３８、実測値９０４．５２。
実施例４６．１８６の合成
ＤＣＭ（１０ｍＬ）中のオクタ－エチレングリコール１８５の溶液に、トリエチルアミン（１．０ｍＬ，７．２４ｍｍｏｌ，２．５当量）を加えた後、ＤＣＭ（５ｍＬ）中の４－ニトロフェニルクロロホルメート（０．５８ｇ，２．９０ｍｍｏｌ，１当量）溶液を２８分で滴下した。混合物を９０分間撹拌した後、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の７５％→０％ＥｔＯＡｃの後、ＤＣＭ中の０％→７％ＭｅＯＨ）によって精製した。生成物１８６を無色油状物として３８％収率で得た（５８４．６ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ）。Ｃ２３Ｈ３８ＮＯ１３ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値５３６．２３、実測値５３６．９３。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）８．２８（ｄ，Ｊ＝１２．０ Ｈｚ，２Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝１２．０ Ｈｚ，２Ｈ），４．４７－４．４２（ｍ，２Ｈ），３．８４－３．７９（ｍ，２Ｈ），３．７５－３．６３（ｍ，２６Ｈ），３．６３－３．５９（ｍ，２Ｈ），２．７０－２．５５（ｂｓ，１Ｈ）．
実施例４７．１８８の合成
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の１８７（ＢｏｃＮＨ－ＰＥＧ２）２ＮＨ，２０２ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、調製された１８６の原液（ＤＣＭ（１ｍＬ）中の５８４ｍｇ）の一部（０．５ｍＬ，０．５４ｍｍｏｌ １．３当量）を加えた後、トリエチルアミン（１７６μＬ，１．２６ｍｍｏｌ，３当量）およびＨＯＢｔ（５７ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ，１当量）を加えた。混合物を８日間撹拌した後、真空中で濃縮した。残渣を、アセトニトリル（４．２ｍＬ）および０．１Ｎ ＮａＯＨ（ａｑ）（４．２ｍＬ，１当量）およびさらなる量の固体ＮａＯＨ（９１．５ｍｇ）の混合物に溶解した。混合物をさらに２１．５時間撹拌した後、混合物をＤＣＭ（３×４０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を真空中で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→１５％ＭｅＯＨ）によって精製した。生成物１８８を薄黄色油状物として８７％収率で得た（３２０．４ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）。Ｃ３９Ｈ７８Ｎ３Ｏ１８ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値８７６．５３、実測値８７６．５４。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）５．１５－５．０２（ｂｓ，２Ｈ），４．２５－４．１９（ｍ，２Ｈ），３．７６－３．４６（ｍ，５０Ｈ），３．３５－３．２６（ｍ，４Ｈ），２．７９－２．６９（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１．４４（ｓ，１８Ｈ）．
実施例４８．１８９の合成
１８８（３２０ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解した。次いで、ジオキサン中の４Ｍ ＨＣｌ（４５６μＬ，１．８３ｍｍｏｌ，５当量）を加えた。混合物を３．５時間撹拌した後、ジオキサン中のさらなる４Ｍ ＨＣｌ（４５０μＬ，１．８０ｍｍｏｌ，４．９当量）を加えた。混合物をさらに３．５時間撹拌した後、ジオキサン中のさらなる４Ｍ ＨＣｌ（４５０μＬ，１．８０ｍｍｏｌ，４．９当量）を加えた。混合物を１６．５時間撹拌した後、混合物を真空中で濃縮した。生成物１８９を白色の粘着性固体として定量的収率で得た。これを次のステップで直接使用した。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ（ｐｐｍ）８．０７－７．８１（ｂｓ，６Ｈ），４．１５－４．０６（ｍ，２Ｈ），３．７５－３．６６（ｍ，２Ｈ），３．６５－３．４８（ｍ，４８Ｈ），３．０３－２．９２（ｍ，４Ｈ）．
実施例４９．１９０の合成
ＤＣＭ（３ｍＬ）中のＢＣＮ－ＯＨ（１６４ｍｇ，１．１０ｍｍｏｌ，３当量）の溶液に、ＣＳＩ（７６μＬ，０．８８ｍｍｏｌ，２．４当量）を加えた。１５分間撹拌した後、トリエチルアミン（２５５μＬ，５．５０ｍｍｏｌ，５当量）を加えた。１８９の溶液を、ＤＣＭ（３ｍＬ）およびトリエチルアミン（５０８μＬ，１１．０ｍｍｏｌ，１０当量）を加えることによって調製した。この原液を、６分後に元の反応混合物に加えた。その混合物を２１．５時間撹拌した後、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→１０％ＭｅＯＨ）によって精製した。生成物１９０を薄黄色油状物として３９％収率で得た（１６５．０ｍｇ，１３９μｍｏｌ）。Ｃ４３Ｈ７２Ｎ５Ｏ１８Ｓ２ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１１８６．５４、実測値１１８６．６５。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）６．０９－５．８７（ｍ，２Ｈ），４．３１－４．１９（ｍ，６Ｈ），３．７６－３．５０（ｍ，５０Ｈ），３．４０－３．２９（ｍ，４Ｈ），２．３８－２．１６（ｍ，１２Ｈ），１．６６－１．４７（ｍ，４Ｈ），１．４０（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝８．０ Ｈｚ，２Ｈ），１．０４－０．９４（ｍ，４Ｈ）．
実施例５０．１９１の合成
ＤＣＭ（２．０ｍＬ）中の１９０（１０１ｍｇ，０．０８５ｍｍｏｌ）の溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（３９ｍｇ，０．１２７ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（３６ｕＬ，０．２５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４２時間撹拌した後、粗混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（Ａ．ＤＣＭ中の０％→２５％ＥｔＯＡｃ（ｐ－ニトロフェノールが回避されるまで）の後、グラジエントＢ．ＤＣＭ中の０％→１２％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、１９１を透明な油状物として得た（４９ｍｇ，０．０３６ｍｍｏｌ，４２％）。Ｃ５８Ｈ９１Ｎ６Ｏ２６Ｓ２ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１３５２．５０、実測値１３５２．７８。
実施例５１．ＸＬ１１の合成
無水ＤＭＦ（１３０μＬ）中の１９１（７ｍｇ，０．００５９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（２．２ｕＬ，０．０１５ｍｍｏｌ）およびＴＣＯ－アミン塩酸塩（Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ）（１．８ｍｇ，０．００６８ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１９時間撹拌した後、粗混合物をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→１５％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、ＸＬ１１を透明な油状物として得た（１．５ｍｇ，０．００１ｍｍｏｌ，１７％）。Ｃ６４Ｈ１１１Ｎ８Ｏ２５Ｓ２ ＋（Ｍ＋ＮＨ４ ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１４５６．７３、実測値１４５６．８１。
実施例５２．１９４の合成
ＤＣＭ（８．０ｍＬ）中の入手可能な１８７（６３８ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ）の溶液に、１２８（４７０ｍｇ，１．７３ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（５５６．０μＬ，４．０ｍｍｏｌ）および１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（１７９．０ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ）を加えた。外界温度で４１時間撹拌した後、混合物を真空中で濃縮し、ＭｅＣＮ（１０ｍＬ）に再溶解した後、０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液（１０ｍＬ）および固体ＮａＯＨペレット（１００．０ｍｇ）を加えた。１．５時間後、ＤＣＭ（２０ｍＬ）を加え、所望の化合物を４回抽出した。有機層を真空中で濃縮し、残渣をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→１２％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、１９４を透明な黄色油状物として得た（７３３ｍｇ，１．１９ｍｍｏｌ，９０％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）４．２９－４．２３（ｍ，２Ｈ），３．７７－３．６８（ｍ，４Ｈ），３．６５－３．５６（ｍ，１４Ｈ），３．５６－３．４９（ｍ，８Ｈ），３．３７－３．２４（ｍ，４Ｈ），１．４５（ｓ，１８Ｈ）．Ｃ２７Ｈ５４Ｎ３Ｏ１２ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値６１２．７３、実測値６１２．５５。
実施例５３．１９５の合成
ＤＣＭ（１．０ｍＬ）中の１９４（３１．８ｍｇ，０．０５２ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン（０．４ｍＬ）中の４．０Ｍ ＨＣｌを加えた。外界温度で２．５時間撹拌した後、反応混合物を真空中で濃縮し、その間にＤＣＭ（２ｍＬ）に再溶解し、濃縮した。化合物１９５を透明な油状物として定量的収率で得た。Ｃ１７Ｈ３８Ｎ３Ｏ８ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値４１２．５０、実測値４１２．４５
実施例５４．１９６の合成
ＤＣＭ（１．０ｍＬ）中の１９５（２１．４ｍｇ，０．０５２ｍｍｏｌ）の冷溶液（０℃）に、Ｅｔ３Ｎ（３６μＬ，０．２６ｍｍｏｌ）および２－ブロモアセチルブロミド（１０．５μＬ，０．１２ｍｍｏｌ）を加えた。氷上で１０分間撹拌した後、氷浴を取り外し、０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液（０．８ｍＬ）を加えた。室温で２０分間撹拌した後、水層をＤＣＭ（２×５ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、真空中で濃縮した。粗茶色油状物をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→１８％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、１９６を透明な油状物として得た（６．９ｍｇ，０．０１１ｍｍｏｌ，２０％）。Ｃ２１Ｈ４０Ｂｒ２Ｎ３Ｏ１０ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値６５４．３６、実測値６５４．２９。
実施例５５．ＸＬ１２の合成
ＤＣＭ（０．８ｍＬ）中の１９６（６．９ｍｇ，０．０１１ｍｍｏｌ）の溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（３．８ｍｇ，０．０１２ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（５μＬ，０．０３ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１８時間撹拌した後、ＤＣＭ（０．５ｍＬ）に溶解された１５５（ＢＣＮ－ＰＥＧ２－ＮＨ２，３．３ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）を加えた。さらに２時間撹拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（グラジエント：Ａ．ＤＣＭ中の０％→３０％ＥｔＯＡｃ（ｐ－ニトロフェノールが回避されるまで）、その後、グラジエントＢ．ＤＣＭ中の０％→２０％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、ＸＬ１２を透明な油状物として得た（１．０ｍｇ，０．００１ｍｍｏｌ，９％）。Ｃ３９Ｈ６６Ｂｒ２Ｎ５Ｏ１５ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１００４．７７、実測値１００４．５１。
実施例５６．ＸＬ１４の合成
乾燥ＤＭＦ（８０μＬ）中の１５２（メチルテトラジン－ＰＥＧ４－ＮＨ２．ＨＣｌ，７．８ｍｇ，０．０２ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（９μＬ，０．０６ｍｍｏｌ）の後、３３８（２５ｍｇ，０．０２ｍｍｏｌ）を加えた。室温で６．５時間撹拌した後、反応混合物をＤＭＦ（４００μＬ）でさらに希釈し、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５ｕｍ ＯＢＤ，３０ｘ１００ｍｍ，Ｈ２Ｏ中の５％→９０％ＭｅＣＮ（両方とも１％酢酸を含む））によって精製した。ＸＬ１４を淡紅色油状物として得た（１２．８ｍｇ，０．００８ｍｍｏｌ，４５％）。Ｃ６９Ｈ８６Ｎ１１Ｏ２１Ｓ２ ＋（Ｍ＋ＮＨ４ ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１４６９．６１、実測値１４６９．６９。
実施例５７．３１４の合成
水（６ｍＬ）中の３－メルカプトプロパン酸（２００ｍｇ，１．９ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した後、エタノール（３ｍＬ）中のメチルメタンチオスルホネート（２６３ｍｇ，２．１ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を一晩撹拌し、室温に加温した。続いて、飽和ＮａＣｌ水溶液（１０ｍＬ）およびＥｔ２Ｏ（２０ｍＬ）によって反応をクエンチした。水層をＥｔ２Ｏ（３×２０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮することにより、粗ジスルフィド生成物を得た（２６６ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ，９３％）。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ７．００（ｂｓ，１Ｈ），２．９６－２．９２（ｍ，２Ｈ），２．９４－２．８０（ｍ，２Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ）．
３－メルカプトプロパン酸（２６６ｍｇ，１．７ｍｍｏｌ）に由来する粗ジスルフィドをＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解した後、ＥＤＣ．ＨＣｌ（４８０ｍｇ，２．２ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（２７０ｍｇ，２．１ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を９０分間撹拌し、水（２０ｍＬ）でクエンチした。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２×２０ｍＬ）で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮することにより、粗生成物３１４（３４６ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ，８１％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ ３．１２－３．０７（ｍ，２Ｈ），３．０２－２．９９（ｍ，２Ｈ），２．８７（ｂｓ，４Ｈ），２．４４（ｓ，３Ｈ）．
実施例５８．３１６の合成
ＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ（それぞれ５ｍＬ）中の３１５（参照により援用される国際公開第２０１５０５７０６３号の実施例４０に従って調製したもの）（４２０ｍｇ，１．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、粗３１４（４２５ｍｇ，１．７１ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（２３６μＬ，１．７１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一晩撹拌した後、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー（１：０～６：４ ＭｅＣＮ：ＭｅＯＨ）により、３１６を得た（３５８ｍｇ，０．７ｍｍｏｌ，６０％）。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ ５．４６－５．４５（ｍ，１Ｈ），５．３３－５．２７（ｍ，１Ｈ），５．１５－５．１１（ｍ，１Ｈ），４．４３－４．４１（ｍ，１Ｈ），４．１７－４．０６（ｍ，２Ｈ），３．９７－３．８８（ｍ，１Ｈ），２．８９－２．８３（ｍ，２Ｈ），２．６９－２．５３（ｍ，２Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｓ，３Ｈ），１．９１（ｓ，３Ｈ），１．８６（ｓ，３Ｈ）．
実施例５９．ＵＤＰ ＧａｌＮＰｒｏＳＳＭｅ（３１８）の合成
ＤＭＦ（５ｍＬ）中のＵＭＰ．ＮＢｕ３（６３２ｍｇ，１．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＤＩ（２３４ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）を加え、３０分間撹拌した。メタノール（２５μＬ，０．６ｍｍｏｌ）を加え、１５分後、反応物を高真空下に１５分間置く。その後、３１６（３５８ｍｇ，０．７ｍｍｏｌ）およびＮＭＩ．ＨＣｌ（３３３ｍｇ，２．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、反応混合物に加える。一晩撹拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮することにより、粗生成物３１７を得る。
粗生成物３１７をＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ：Ｅｔ３Ｎ（７：３：３，１０ｍＬ）に溶解し、一晩撹拌した後、追加のＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ：Ｅｔ３Ｎ（７：３：３，５ｍＬ）を加える。４８時間後、全反応時間、反応混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物を陰イオン交換カラム（Ｑ ＨＩＴＲＡＰ，３×５ｍＬ，１×２０ｍＬカラム）によって２回に分けて精製した。緩衝液Ａ（１０ｍＭ ＮａＨＣＯ３）とともにロードすることによってカラムへの最初の結合を達成し、カラムを５０ｍＬ緩衝液Ａでリンスした。次に、７０％Ｂ（２５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３）までグラジエントを行い、ＵＤＰ ＧａｌＮＰｒｏＳＳＭｅ ３１８（３５５ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ，７２％）を溶出した。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）：δ ７．８６－７．８４（ｍ，１Ｈ），５．８６－５．８５（ｍ，１Ｈ），５．４４（ｂｓ，１Ｈ），４．２６－４．２２（ｍ，２Ｈ），４．１７－４．０８（ｍ，６Ｈ），３．９２（ｍ，１Ｈ），３．８４－３．８３（ｍ，１Ｈ），３．６６－３．６４（ｍ，２Ｈ），２．８８（ｔ，Ｊ＝７．２ Ｈｚ，２Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝７．２ Ｈｚ，２Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ）．
実施例６０．３１９の合成
ＤＣＭ（１ｍＬ）およびＤＭＦ（２００μＬ）中の化合物１２１（４４２ｍｇ，１．４６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ（１ｍＬ）およびトリエチルアミン（６０９μＬ，４．３７ｍｍｏｌ）中の化合物１２８の溶液を加えた。混合物を１６時間撹拌した後、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の５０％→１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製し、３１９（３１６ｍｇ）を得た。これをＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０ｘ１００ｍｍ，水（１％ＡｃＯＨ）中の５％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）によってさらに精製した。生成物３１９を無色油状物として１７％収率で得た（１１０ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）。Ｃ１９Ｈ３７Ｎ３ＮａＯ８ ＋（（Ｍ＋Ｎａ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値４５８．２５、実測値４５８．３３。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）５．４１－４．８９（ｍ，２Ｈ），４．３１－４．２４（ｍ，２Ｈ），３．７８－３．６８（ｍ，４Ｈ），３．６５－３．５９（ｍ，２Ｈ），３．４４－３．３４（ｍ，４Ｈ），３．３４－３．１９（ｍ，４Ｈ），１．４３（ｓ，１８Ｈ）．
実施例６１．３２０の合成
化合物３１９（１０７ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解した。次いで、ジオキサン中の４Ｍ ＨＣｌ（３００μＬ，１．２ｍｍｏｌ，４．８当量）を加えた。混合物を１５時間撹拌した後、沈殿物からデカントし、沈殿物をＤＣＭ（２ｍＬ）で１回洗浄した。生成物３２０を定量的収率で白色の粘着性固体として得た（８９．９ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ）。これを次のステップで直接使用した。
実施例６２．３２１の合成
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の１０１（７５ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ，２当量）の溶液に、ＣＳＩ（４１μＬ，０．４８ｍｍｏｌ，１．９当量）を加えた。６分間撹拌した後、トリエチルアミン（１３９μＬ，１．０ｍｍｏｌ，４当量）を加えた。ＤＭＦ（２００μＬ）およびＤＣＭ（２ｍＬ）を加えた後、トリエチルアミン（１３９μＬ，０．７５ｍｍｏｌ，３当量）を加えることによって、３２０の原液を調製した。この３２０の原液の一部（３２μＬ，０．２５ｍｍｏｌ）を、ＣＳＩを含む元の反応混合物に加えた。混合物を１６時間撹拌した後、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→１０％ＭｅＯＨ）によって精製した。生成物３２１を無色油状物として３％収率で得た（１１ｍｇ，１４．２μｍｏｌ）。Ｃ３１Ｈ４８Ｎ５Ｏ１２Ｓ２ ＋（（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値７４６．２７、実測値７４６．９６。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）６．３６－５．９４（ｍ，２Ｈ），４．３８－４．１７（ｍ，６Ｈ），３．８４－３．７９（ｍ，２Ｈ），３．７７－３．７２（ｍ，２Ｈ），３．６８－３．６３（ｍ，２Ｈ），３．５４－３．４５（ｍ，４Ｈ），３．３９－３．２７（ｍ，４Ｈ），２．３８－２．１６（ｍ，１２Ｈ），１．６７－１．４７（ｍ，５Ｈ），１．４０（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝８．０ Ｈｚ，２Ｈ），１．０５－０．９３（ｍ，４Ｈ）．
実施例６３．３０１（ＬＤ０１）の合成
ＤＣＭ（１００μＬ）中の３２１（１０．６ｍｇ，１４．２μｍｏｌ）の溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（４．３ｍｇ，１４．２μｍｏｌ，１．０当量）およびトリエチルアミン（５．９μＬ，４２．６μｍｏｌ，３．０当量）を加えた。６６時間撹拌した後、この混合物の一部を、ＤＭＦ中のｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡの原液（２００μＬ，５０ｍｇ／ｍＬ）およびさらなる量のトリエチルアミン（５．９μＬ，４２．６μｍｏｌ，３．０当量）で処理した。２４時間後、これを真空中で部分的に濃縮した。残渣をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０ｘ１００ｍｍ，水（１％ＡｃＯＨ）中の５％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）によって精製した。化合物３０１をフィルム状物として２８％収率で得た（３．４ｍｇ，１．９μｍｏｌ）。Ｃ９０Ｈ１４０Ｎ１５Ｏ２５Ｓ２ ＋（（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１８９４．９６、実測値１８９５．００。
実施例６４．３２２の合成
ＤＣＭ（１０ｍＬ）中の１８５（オクタエチレングリコール）の溶液に、トリエチルアミン（１．０ｍＬ，７．２４ｍｍｏｌ；２．５当量）を加えた後、ＤＣＭ（５ｍＬ）中の４－ニトロフェニルクロロホルメート（０．５８ｇ；２．９０ｍｍｏｌ；１当量）溶液を２８分で滴下した。混合物を９０分間撹拌した後、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の７５％→０％ＥｔＯＡｃの後、ＤＣＭ中の０％→７％ＭｅＯＨ）によって精製した。生成物３２２を無色油状物として３８％収率で得た（５８４．６ｍｇ；１．０９ｍｍｏｌ）。Ｃ２３Ｈ３８ＮＯ１３ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値５３６．２３、実測値５３６．９３。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）８．２８（ｄ，Ｊ＝１２．０ Ｈｚ，２Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝１２．０ Ｈｚ，２Ｈ），４．４７－４．４２（ｍ，２Ｈ），３．８４－３．７９（ｍ，２Ｈ），３．７５－３．６３（ｍ，２６Ｈ），３．６３－３．５９（ｍ，２Ｈ），２．７０－２．５５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ）．
実施例６５．３２３の合成
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の化合物１２１（１２７ｍｇ，０．４２ｍｍｏｌ）の溶液に、調製された３２２の原液（ＤＣＭ（１ｍＬ）中の５８４ｍｇ）の一部（０．５ｍＬ；０．５４ｍｍｏｌ；１．３当量）を加えた後、トリエチルアミン（１７６μＬ，１．２６ｍｍｏｌ；３当量）およびＨＯＢｔ（５７ｍｇ；０．４２ｍｍｏｌ；１当量）を加えた。混合物を４．５日間撹拌した後、真空中で濃縮した。残渣をアセトニトリル（４．２ｍＬ）および０．１Ｎ ＮａＯＨ（４．２ｍＬ，１当量）の混合物に溶解した。混合物を２４時間撹拌した後、さらなる固体ＮａＯＨ（１０４．５ｍｇ）を加えた。混合物をさらに５時間撹拌した後、混合物をＤＣＭ（２×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を真空中で濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→１５％ＭｅＯＨ）によって精製した。生成物３２３を薄黄色油状物として５４％収率で得た（１６４．５ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）。Ｃ２６Ｈ５４Ｎ３Ｏ１２ ＋（Ｍ－ＢＯＣ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値６００．３６、実測値６００．４９。１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）５．２７－５．０５（ｍ，２Ｈ），４．２６－４．２１（ｍ，２Ｈ），３．７６－３．５９（ｍ，３０Ｈ），３．４３－３．３３（ｍ，４Ｈ），３．３３－３．２２（ｍ，４Ｈ），１．４３（ｓ，１８Ｈ）．
実施例６６．３２４の合成
化合物３２３（１６４ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１ｍＬ）に溶解した。次いで、ジオキサン中の４Ｍ ＨＣｌ（２９３μＬ，１．１７ｍｍｏｌ，５当量）を加えた。混合物を１８時間撹拌した後、ジオキサン中のさらなる４Ｍ ＨＣｌ（２９３μＬ，１．１７ｍｍｏｌ，５当量）を加えた。混合物をさらに５時間撹拌した後、混合物を真空中で濃縮した。生成物３２４を定量的収率で白色の粘着性固体として得た（１３２ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）。これを次のステップで直接使用した。
実施例６７．３２５の合成
ＤＣＭ（２ｍＬ）中の１０１（８１ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ，２．３当量）の溶液に、ＣＳＩ（４３μＬ，０．４９ｍｍｏｌ，２．１当量）を加えた。１５分間撹拌した後、トリエチルアミン（１６４μＬ，１．１７ｍｍｏｌ，５当量）を加えた。ＤＣＭ（２ｍＬ）およびトリエチルアミン（１６４μＬ，１．１７ｍｍｏｌ，５当量）を加えることによって、３２４の溶液を調製した。この原液を、６分後に元の反応混合物に加えた。混合物を２３時間撹拌した後、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→１２％ＭｅＯＨ）によって精製した。生成物３２５を薄黄色油状物として３１％収率で得た（７３．０ｍｇ，７２．２μｍｏｌ）。Ｃ４３Ｈ７２Ｎ５Ｏ１８Ｓ２ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１０１０．４３、実測値１０１０．５０。
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（ｐｐｍ）６．２１－５．８５（ｍ，２Ｈ），４．３８－４．１７（ｍ，６Ｈ），３．８０－３．５７（ｍ，３０Ｈ），３．５７－３．４４（ｍ，４Ｈ），３．４４－３．３０（ｍ，４Ｈ），２．３８－２．１６（ｍ，１２Ｈ），１．６４－１．４８（ｍ，４Ｈ），１．４０（ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝８．０ Ｈｚ，２Ｈ），１．０５－０．９１（ｍ，４Ｈ）．
実施例６８．３０２（ＬＤ０２）の合成
ＤＣＭ（１００μＬ）中の３２５（１９．５ｍｇ，１９．７μｍｏｌ）の溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（６．０ｍｇ，１９．７μｍｏｌ，１．０当量）およびトリエチルアミン（８．２μＬ，５９．１μｍｏｌ，３．０当量）を加えた。６６時間撹拌した後、この混合物の一部を、ＤＭＦ中のｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡの原液（２００μＬ，５０ｍｇ／ｍＬ）およびさらなる量のトリエチルアミン（８．２μＬ，５９．１μｍｏｌ，３．０当量）で処理した。９５時間後、これを真空中で部分的に濃縮した。残渣をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０ｘ１００ｍｍ，水（１％ＡｃＯＨ）中の５％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）によって精製した。化合物３０２をフィルム状物として９％収率で得た（３．７ｍｇ，１．７１μｍｏｌ）。Ｃ１０２Ｈ１６５Ｎ１５Ｏ３１Ｓ２ ２＋（Ｍ＋２Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１０８０．５６、実測値１０８０．７４。
実施例６９．３２９の合成
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の１０１（１８ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、クロロスルホニルイソシアネート（ＣＳＩ）を加えた。３０分後、Ｅｔ３Ｎ（３７μＬ，２７ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）を加えた。ＤＣＭ（１ｍＬ）中の１９５（２６ｍｇ，０．０５４ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（３７μＬ，２７ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）を加えた。この混合物を反応混合物に加えた。４５分後、反応混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＤＣＭからＤＣＭ中の７％ＭｅＯＨ）によって精製した。生成物３２９を無色のフィルム状物として得た（２７ｍｇ，０．０２９ｍｍｏｌ，５４％）。Ｃ３９Ｈ６４Ｎ５Ｏ１６Ｓ２ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値９２２．３８、実測値９２２．５０。
実施例７０．３３０の合成
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の３２９の溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（８．９ｍｇ，２９．３μｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（１２．２μＬ，８．９ｍｇ，８７．９μｍｏｌ）を加えた。１日後、０．２８ｍＬを化合物３０３の調製に使用した。２日後、追加のビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（７．０ｍｇ，２３μｍｏｌ）を主反応混合物に加えた。１日後、反応混合物を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物３３０を無色のフィルム状物として得た（１７．５ｍｇ，０．０１６ｍｍｏｌ，５５％（７６％補正））。Ｃ４６Ｈ６７Ｎ６Ｏ２０Ｓ２ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１０８７．３８、実測値１０８７．４７。
実施例７１．３０３（ＬＤ０３）の合成
３３０の反応混合物（０．２８ｍＬ，理論的には８．８ｍｇ，８．１μｍｏｌを含む）に、Ｅｔ３Ｎ（３．４μＬ，２．５ｍｇ，２４．３μｍｏｌ）、およびＤＭＦ（２００μＬ）中のｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡ（１０ｍｇ，８．１μｍｏｌ）の溶液を加えた。２１時間後、２，２’－（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（４．７μＬ，４．８ｍｇ，３２μｍｏｌ）を加えた。４５分後、反応混合物を窒素ガス流下で濃縮した。残渣をＲＰ－ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ、水（１％ＡｃＯＨ）中の３０％～９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）によって精製した。生成物３０３を無色のフィルム状物として得た（５．６ｍｇ，２．７μｍｏｌ）。Ｃ９８Ｈ１５７Ｎ１５Ｏ２９Ｓ２ ２＋（（Ｍ＋２Ｈ＋）／２）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１０３６．５３、実測値１０３６．７０。
実施例７２．３３２の合成
脱気したＤＣＭ（４００μＬ，ＤＣＭにＮ２を５分間パージすることによって得た）中のＡｌｌｏｃ２－ｖａ－ＰＡＢＣ－ＰＢＤ ３３１（１０．０ｍｇ，０．００９ｍｍｏｌ）の溶液に、ピロリジン（１．９μＬ，０．０２７ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ３）４（１．６ｍｇ，０．００１４ｍｍｏｌ）を加えた。外界温度で１５分間撹拌した後、反応混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１０ｍＬ）を加えた。粗混合物をＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出した。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。黄色残渣をＤＭＦ（４５０μＬ）およびＭｅＣＮ（４５０μＬ）に再溶解し、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，Ｈ２Ｏ中の５％→９０％ＭｅＣＮ（両方とも０．１％ギ酸を含む））によって精製した。純粋な画分をＳＰＥカラム（ＰＬ－ＨＣＯ３ ＭＰ，５００ｍｇ／６ｍＬ）で中和し、濃縮し、ＭｅＣＮ（２×５ｍＬ）と共蒸発させることにより、３３２を白色固体として得た（４．８ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ，５８％）。Ｃ４９Ｈ６０Ｎ７Ｏ１１ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値９２３．０４、実測値９２３．６１。
実施例７３．３０４（ＬＤ０４）の合成
脱気した無水ＤＭＦ（６０μＬ，ＤＭＦにＮ２を５分間パージすることによって得た）中の３３２（４．８ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ）の溶液に、３３０（１０ｍｇ，０．００９ｍｍｏｌ，４８μＬの脱気した無水ＤＭＦに溶解したもの）、Ｅｔ３Ｎ（３．６μＬ，０．０２６ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（脱気した無水ＤＭＦ中の原液，５．１μＬ，０．３５ｍｇ，０．００２６ｍｍｏｌ，０．５当量）を加えた。暗所において外界温度で４１時間撹拌した後、粗反応混合物をＤＣＭ（３００μＬ）で希釈し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→１２％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、３０４を透明な黄色油状物として得た（４．０ｍｇ，０．００２１ｍｍｏｌ，４１％）。Ｃ８９Ｈ１２１Ｎ１２Ｏ２８Ｓ２ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１８７１．１１、実測値１８７１．０９。
実施例７４．３０５（ＬＤ０５）の合成
無水ＤＭＦ（６０μＬ）中の、参照により援用される国際公開第２０１９１１０７２５Ａ１号の実施例５－５に従って調製された３３３（２．９ｍｇ，０．００１３ｍｍｏｌ）の溶液に、３３０（１．４５ｍｇ，０．００１３ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（１．２μＬ，０．０２３ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４８時間撹拌した後、反応混合物をＤＭＦ（５００μＬ）で希釈し、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，Ｈ２Ｏ中の３０％→１００％ＭｅＣＮ（両方とも１％酢酸を含む））によって精製した。生成物３０５を無色のフィルム状物として得た（０．６ｍｇ，０．２０７μｍｏｌ，１６％）。Ｃ１２４Ｈ１８２ＩＮ１４Ｏ４６Ｓ５ ＋（Ｍ／２＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１４４７．０３、実測値１４４７．１９。
実施例７５．３０６（ＬＤ０６）の合成
無水ＤＭＦ（１５０μＬ）中の３３０（７ｍｇ，０．００６ｍｍｏｌ）の溶液に、無水ＤＭＦ中のｖｃ－ＰＡＢＣ－ＤＭＥＡ－ＰＮＵ（３３４）の原液（１２５μＬ，５．７ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（２μＬ，０．０１５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２５時間撹拌した後、反応混合物をＤＣＭ（０．３ｍＬ）で希釈し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→２０％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、３０６を赤色のフィルム状物として得た（５ｍｇ，０．００２４ｍｍｏｌ，４７％）。Ｃ９６Ｈ１３３Ｎ１３Ｏ３６Ｓ３ ＋（Ｍ／２＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１０５５．６４、実測値１０５５．５０。
実施例７６．３３７の合成
化合物３３６（ＤＩＢＯ，９５ｍｇ，０．４３ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．０ｍＬ）に溶解し、クロロスルホニルイソシアネート（３３．０μＬ，０．３７ｍｍｏｌ）を室温において加えたところ、２分後、不溶性物質が形成された。室温でさらに１５分間撹拌した後、Ｅｔ３Ｎ（１２０．０μＬ，０．８５ｍｍｏｌ）を加えると、すべての不溶性物質が消失し、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）およびＥｔ３Ｎ（１２０．０μＬ，０．８５ｍｍｏｌ）に溶解された１９５（７１ｍｇ，０．０１７１）の混合物の添加を行った。室温で１６時間撹拌した後、粗混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→１５％ＭｅＯＨ）によって精製し、その後、これをＥｔＯＡｃ（２×）と共蒸発させてＭｅＯＨを完全に除去した。生成物３３７を蝋様の白色固体として得た（１３６．０ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ，７５％）。Ｃ５１Ｈ６３Ｎ６Ｏ１６Ｓ２ ＋（Ｍ＋ＮＨ４ ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１０８０．２１、実測値１０８０．５９。
実施例７７．３３８の合成
ＤＣＭ（２．０ｍＬ）中の３３７（１３６．０ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、ビス－（４－ニトロフェニル）カーボネート（４７．０ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（５４．０μＬ，０．３８ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１８時間撹拌した後、粗混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（グラジエント：Ａ．ＤＣＭ中の０％→３５％ＥｔＯＡｃ（ｐ－ニトロフェノールが回避されるまで）の後、グラジエントＢ．ＤＣＭ中の０％→１３％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、３３８を淡黄色油状物として得た（８９．０ｍｇ，０．０７ｍｍｏｌ，６０％）。Ｃ４８Ｈ６６Ｎ７Ｏ２０Ｓ２ ＋（Ｍ＋ＮＨ４ ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１２４５．３１、実測値１２４５．６４。
実施例７８．３０７（ＬＤ０７）の合成
無水ＤＭＦ（９３．０μＬ）中の３３８（６．９５ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（２．４μＬ，０．０１７ｍｍｏｌ）、および無水ＤＭＦ中のｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡ（Ｌｅｖｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の原液（７０μＬ，７．０ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１８時間撹拌した後、ＤＭＦ（４５０μＬ）を加え、粗混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，Ｈ２Ｏ中の３０％→１００％ＭｅＣＮ（両方とも１％酢酸を含む））によって精製した。生成物３０７を無色のフィルム状物として得た（４．５ｍｇ，０．００２ｍｍｏｌ，３６％）。Ｃ１１０Ｈ１５２Ｎ１５Ｏ２９Ｓ２ ＋（Ｍ／２＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１１０６．３０、実測値１１０６．７９。
実施例７９．３４１の合成
化合物１０１（１６．３ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（０．８ｍＬ）に溶解し、クロロスルホニルイソシアネート（８．６μＬ，０．０９９ｍｍｏｌ）を室温において加えた。室温で１５分間撹拌した後、Ｅｔ３Ｎ（６９．０μＬ，０．４９ｍｍｏｌ）を加え、その後、ＤＣＭ（１．０ｍＬ）およびＥｔ３Ｎ（６９．０μＬ，０．４９ｍｍｏｌ）に溶解された３３５（４０ｍｇ，０．０９９ｍｍｏｌ）の混合物を加えた。この混合物を室温で１．５時間撹拌することにより（混合物１）、粗生成物３３９を得た。別のバイアルでは、３４０（ＤＢＣＯ－Ｃ２－ＯＨ，Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ）（３４．０ｍｇ，０．０９９ｍｍｏｌ）を室温のＤＣＭ（０．８ｍＬ）に溶解し、クロロスルホニルイソシアネート（７．７５μＬ，０．０８９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１５分間撹拌した後、Ｅｔ３Ｎ（６９．０μＬ，０．４９ｍｍｏｌ）を加え、その後、粗化合物３３９を加えた。室温でさらに２時間撹拌した後、反応混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→１５％ＭｅＯＨ）によって精製し、その後、これをＥｔＯＡＣ（２×）と共蒸発させてＭｅＯＨを完全に除去した。生成物３４１を透明な黄色油状物として得た（２０．０ｍｇ，０．０１７ｍｍｏｌ，１７％）。Ｃ５０Ｈ７０Ｎ７Ｏ１８Ｓ２ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１１２１．２６、実測値１１２１．５９。
実施例８０．３４２の合成
ＤＣＭ（１．０ｍＬ）中の３４１（２０．０ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）の溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（５．６ｍｇ，０．０１９ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（７．５μＬ，０．０５３ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４０時間撹拌した後、粗混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（グラジエント：Ａ．ＤＣＭ中の０％→３０％ＥｔＯＡｃ（ｐ－ニトロフェノールが回避されるまで）の後、グラジエントＢ．ＤＣＭ中の０％→２０％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、３４２を透明な淡黄色油状物として得た（６．９ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ，３０％）。Ｃ５７Ｈ７３Ｎ８Ｏ２２Ｓ２ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１２８６．３６、実測値１２８６．５７。
実施例８１．３０８（ＬＤ０８）の合成
無水ＤＭＦ（３５．０μＬ）中の３４２（３．６ｍｇ，０．００２８ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（１．２μＬ，０．００８ｍｍｏｌ）、および無水ＤＭＦ中のｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡ（Ｌｅｖｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の原液（３４μＬ，３．４ｍｇ，０．００２８ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２７時間撹拌した後、ＤＣＭ（４００μＬ）を加え、粗混合物をシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→３０％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、３０８を無色のフィルム状物として得た（３．７ｍｇ，０．００１６ｍｍｏｌ，５８％）。Ｃ１０９Ｈ１６１Ｎ１７Ｏ３１Ｓ２ ＋（Ｍ／２＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１１３５．８４、実測値１１３５．７３。
実施例８２．３０９（ＬＤ０９）の合成
無水ＤＭＦ中のｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡ（Ｌｅｖｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の原液（９１μＬ，９．１ｍｇ，０．００７３ｍｍｏｌ）に、Ｅｔ３Ｎ（５．１μＬ，０．０３７ｍｍｏｌ）および３４３（ビス－マレイミド－リジン－ＰＥＧ４－ＴＦＰ，Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ）（６．２ｍｇ，０．００７３ｍｍｏｌ）を加えた。室温で３時間撹拌した後、混合物をＤＣＭ（０．４ｍＬ）で希釈し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０％→３０％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、３０９を透明な油状物として得た（９．１ｍｇ，０．００５１ｍｍｏｌ，６９％）。Ｃ８９Ｈ１３８Ｎ１５Ｏ２４ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１８０２．１３、実測値１８０２．１１。
実施例８３．３１０（ＬＤ１０）の合成
３４４（４．３ｍｇ，６．０μｍｏｌ，１．７当量）が入ったＥｐｐｅｎｄｏｒｆバイアルに、ＤＭＦ中のｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＦ．ＴＦＡ塩（４．００ｍｇ，１００μＬ，３４．３１ミリモル濃度，３．４３μｍｏｌ，１．０当量）を加え、加えた後、トリエチルアミン（１．４３μＬ，１０．３μｍｏｌ，３．０当量）を加えた。混合物を混合し、得られた無色溶液を室温で約３時間放置した。次いで、反応混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，水（１％ＡｃＯＨ）中の３０％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）によって直接精製した。所望の生成物３１０を無色の残渣として得た（４．５ｍｇ，２．７μｍｏｌ，７９％収率）。Ｃ８０Ｈ１３４Ｎ１５Ｏ２２ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１６５６．９８、実測値１６５７．０３。
実施例８４．３４６の合成
１０２（５４．７ｍｇ，１．００当量，１７３μｍｏｌ）および３４５（トリグリシン，２８．８ｍｇ，０．８７８当量，１５２μｍｏｌ）が入ったＥｐｐｅｎｄｏｒｆバイアルに、乾燥ＤＭＦ（２５０μＬ）およびトリエチルアミン（５２．７ｍｇ，７２．５μＬ，３当量，５２０μｍｏｌ）を加えた。得られた黄色懸濁液を室温で２１時間撹拌した後、５０μＬのＨ２ＯをそのＲＭに加えた。反応混合物を室温でさらに１日間撹拌し、追加のＨ２Ｏ（２００μＬ）を加え、反応混合物を室温でさらに３日間撹拌した。次に、ＭｅＣＮ（約０．５ｍＬ）および追加のＥｔ３Ｎ（約１０滴）を加え、得られた懸濁液を室温で１時間撹拌した後、真空中で濃縮した。黄色残渣をＤＭＦ（６００μＬ）に溶解し、得られた黄色懸濁液をメンブランフィルターで濾過した。そのメンブランフィルターを２００μＬの追加のＤＭＦで洗浄し、合わせた濾液をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，水（１％ＡｃＯＨ）中の３０％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）によって直接精製した。所望の生成物３４６を茶色油状物として得た（４１．５ｍｇ，１１４μｍｏｌ，６６％収率）。Ｃ１７Ｈ２４Ｎ３Ｏ６ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値３６６．１７、実測値３６６．２７。
実施例８５．３４７の合成
無水ＤＭＦ（０．３ｍＬ）中の３４６（２１．６ｍｇ，０．０５６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（３０μＬ，０．１７１ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（２１．６ｍｇ，０．０５６ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１０分間撹拌した後、ＤＣＭ（３１０μＬ）に溶解された３２０（７．３７ｍｇ，０．０３１ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２４時間撹拌した後、混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，Ｈ２Ｏ中の３０％→１００％ＭｅＣＮ（両方とも１％ＡｃＯＨを含む））によって精製した。生成物３４７をオフホワイト色油状物として得た（５．２ｍｇ，０．００５ｍｍｏｌ，２０％）。Ｃ４３Ｈ６４Ｎ９Ｏ１４ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値９３１．０２、実測値９３１．６８。
実施例８６．３１１（ＬＤ１３）の合成
無水ＤＭＦ（２００μＬ）中の３４７（５．２ｍｇ，０．００５６ｍｍｏｌ）の溶液に、ビス（４－ニトロフェニル）カーボネート（１．９ｍｇ，０．００６ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（２．４μＬ，０．０１６ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２７時間撹拌した後、ｖｃ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ．ＴＦＡ（Ｌｅｖｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の原液（６６μＬ，６．６ｍｇ，０．００５３ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（２μＬ，０．０１４ｍｍｏｌ）を加えた。室温でさらに１７時間撹拌した後、粗混合物をＤＭＦ（２５０μＬ）で希釈し、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，Ｈ２Ｏ中の５％→９０％のＭｅＣＮ（両方とも１％ＡｃＯＨを含む））によって精製した。生成物３１１を透明な油状物として得た（０．６ｍｇ，０．２８μｍｏｌ，５％）。Ｃ１０２Ｈ１５６Ｎ１９Ｏ２７ ＋（Ｍ／２＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１０４０．７１、実測値１０４０．８５。
実施例８７．化合物３１２の合成
化合物３１２（ＬＤ１１）を、参照により援用されるＶｅｒｋａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ２０１８，７，ｄｏｉ：１０．３３９０／ａｎｔｉｂ７０１００１２に記載されている手順に従って調製した。
実施例８８．３１３（ＬＤ３１１）の合成
３４８（２．７ｍｇ，１．１当量，４．９μｍｏｌ）が入ったバイアルに、ＤＭＦ（６０μＬ）およびニートのトリエチルアミントリエチルアミン（１．９μＬ，３当量，１３μｍｏｌ）を加えた。次に、乾燥ＤＭＦ溶液中のＨＢＴＵ（２．０ｍｇ，１１μＬ，４７２ミリモル濃度，１．２当量，５．３μｍｏｌ）の溶液を加え、混合物を混合した。反応混合物を室温で３０分間放置した後、ｖａ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＦ．ＴＦＡ塩（５．２ｍｇ，０．１３ｍＬ，３４．３１ミリモル濃度，１当量，４．４μｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を混合し、室温で１１０分間放置し、次いで、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，水（１％ＡｃＯＨ）中の３０％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）によって直接精製した。所望の生成物３１３を無色油状物として得た（１．８ｍｇ，１．１μｍｏｌ，２６％収率）。Ｃ７７Ｈ１２７Ｎ１２Ｏ２３ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１５８７．９１、実測値１５８８．０５。

実施例８９．３５０の合成
ＤＣＭ（４００μＬ）中のメチルテトラジン－ＮＨＳエステル３４９（１９ｍｇ，０．０５７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ（８００μＬ）に溶解されたアミノ－ＰＥＧ１１－アミン（４７ｍｇ，０．０８６ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２０分間撹拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→５０％ＭｅＯＨ（０．７Ｍ ＮＨ３））によって精製することにより、所望の化合物３５０を淡紅色油状物として得た（１７ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ，３９％）。Ｃ３５Ｈ６１Ｎ６Ｏ１２ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値７５７．８９、実測値７５７．４６。
実施例９０．３５１の合成
無水ＤＭＦ（５００μＬ）中の１５１（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ，１０ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（１１μＬ，０．０６７ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（８．５ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、無水ＤＭＦ（５００μＬ）に溶解された３５０（１７ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１８．５時間撹拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→１７％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物３５１を淡紅色油状物として得た（２６ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ，定量的）。Ｃ５６Ｈ８３Ｎ１０Ｏ１７ ＋（Ｍ＋ＮＨ４ ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１１６８．３２、実測値１１６８．６７
実施例９１．１６９の合成
無水ＤＭＦ（５００μＬ）中の３５１（２６ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ）の溶液に、ジエチルアミン（１２μＬ，０．１１ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１．５時間撹拌した後、粗混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，Ｈ２Ｏ中の５％→９０％ＭｅＣＮ（両方とも１％酢酸を含む））によって精製した。生成物１６９を透明な淡紅色油状物として得た（１０．９ｍｇ，０．０１１ｍｍｏｌ，５３％）。Ｃ４１Ｈ７０Ｎ９Ｏ１５ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値９２９．０５、実測値９２９．６１。
実施例９２．３５２の合成
ＤＣＭ（２００μＬ）中の３４９（メチルテトラジン－ＮＨＳエステル，１０．３ｍｇ，０．０３１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ（２００μＬ）に溶解されたアミノ－ＰＥＧ２３－アミン（５０ｍｇ，０．０４６ｍｍｏｌ）を加えた。室温で５０分間撹拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→６０％ＭｅＯＨ（０．７Ｍ ＮＨ３））によって精製することにより、所望の化合物３５２を淡紅色油状物として得た（１７．７ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ，４４％）。Ｃ５９Ｈ１０９Ｎ６Ｏ２４ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１２８６．５２、実測値１２８６．７２。
実施例９３．３５３の合成
無水ＤＭＦ（５００μＬ）中の１５１（５．７ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（７μＬ，０．０４ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（５．３ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、無水ＤＭＦ（５００μＬ）に溶解された３５２（１７．７ｍｇ，０．０１３ｍｍｏｌ）を加えた。室温で６時間撹拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→１８％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物３５３を淡紅色油状物として得た（２１ｍｇ，０．０１２ｍｍｏｌ，９１％）。Ｃ８０Ｈ１３１Ｎ１０Ｏ２９ ＋（Ｍ／２＋ＮＨ４ ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値８５７．４５、実測値８５７．０８
実施例９４．１７０の合成
無水ＤＭＦ（５００μＬ）中の３５３（２１ｍｇ，０．０１２ｍｍｏｌ）の溶液に、ジエチルアミン（６．７μＬ，０．０６ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４時間撹拌した後、粗混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，Ｈ２Ｏ中の５％→９０％ＭｅＣＮ（両方とも１％酢酸を含む））によって精製した。生成物１７０を淡紅色油状物として得た（１１．６ｍｇ，０．００８ｍｍｏｌ，６６％）。Ｃ６５Ｈ１１８Ｎ９Ｏ２７ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１４５７．６８、実測値１４５７．９２。

実施例９５．３５６の合成
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の３５４（テトラフルオロフェニルアジド－ＮＨＳエステル，４０ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）の溶液に、３５５（Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ２－ＮＨ２，３３ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（５０μＬ，０．３６ｍｍｏｌ）を加えた。暗所において室温で３０分間撹拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→７％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物３５６を透明な油状物として得た（４７ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ，８４％）。Ｃ１８Ｈ２４Ｆ４Ｎ５Ｏ５ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値４６６．４１、実測値４６６．２３。
実施例９６．３５７の合成
ＤＣＭ（２ｍＬ）中の３５６（４７ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）の溶液に、ジオキサン中の４．０Ｍ ＨＣｌ（３００μＬ）を加えた。暗所において室温で１７．５時間撹拌した後、混合物を濃縮し、３５７を定量的収率で白色固体として得た（３６ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）。Ｃ１３Ｈ１６Ｆ４Ｎ５Ｏ３ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値３６６．２９、実測値３６６．２０。
実施例９７．３５８の合成
無水ＤＭＦ（６００μＬ）中の１５１（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ，４２ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（５０μＬ，０．３０ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（３９ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）を加えた。暗所で１５分後、無水ＤＭＦ（５００μＬ）に溶解された３５７（３６ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）を加えた。暗所において室温で４１時間撹拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→２０％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物３５８を透明な油状物として得た（３６ｍｇ，０．０４７ｍｍｏｌ，４７％）。Ｃ３４Ｈ３５Ｆ４Ｎ８Ｏ８ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値７５９．６８、実測値７５９．３８。
実施例９８．１７１の合成
無水ＤＭＦ（７５０μＬ）中の３５８（３６ｍｇ，０．０４７ｍｍｏｌ）の溶液に、ジエチルアミン（２４μＬ，０．２４ｍｍｏｌ）を加えた。暗所において室温で５５分間撹拌した後、粗混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，Ｈ２Ｏ中の５％→９０％ＭｅＣＮ（両方とも１％酢酸を含む））によって精製した。生成物１７１を透明な油状物として得た（１８．７ｍｇ，０．０３４ｍｍｏｌ，７４％）。Ｃ１９Ｈ２５Ｆ４Ｎ８Ｏ６ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値５３７．４５、実測値５３７．２９。
実施例９９．ＢＣＮ－ＬＰＥＴＧＧ（１７２）の合成
無水ＤＭＦ（５００μＬ）中の１０２（１０ｍｇ，０．０３１ｍｍｏｌ）の溶液に、ペプチド１６７（Ｈ－ＬＰＥＴＧＧ－ＯＨ，１８ｍｇ，０．０３１ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（１３μＬ，０．０９５ｍｍｏｌ）を加えた。室温で９３時間撹拌した後、粗混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，Ｈ２Ｏ中の５％→９０％ＭｅＣＮ（両方とも１％酢酸を含む））によって精製した。生成物１７２を透明な油状物として得た（１６．８ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ，７２％）。Ｃ３５Ｈ５３Ｎ６Ｏ１２ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値７４９．８３、実測値７４９．３９。
実施例１００．３５９の合成
ＤＣＭ（８ｍＬ）中の１０２（５６ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）の溶液に、アミノ－ＰＥＧ２４－アルコール（２１４ｍｇ，０．１９９ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（８０μＬ，０．５３ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２０時間撹拌した後、溶媒を真空中で減少させ、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の２→３０％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物３５９を９５％収率で黄色油状物として得た（２１０ｍｇ，０．１６８ｍｍｏｌ）。Ｃ５９Ｈ１１１ＮＯ２６Ｎａ＋（Ｍ＋Ｎａ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１２７３．５０、実測値１２７３．０７。
実施例１０１．３６０の合成
ＤＣＭ（７ｍＬ）中の３５９（１７０ｍｇ，０．１３６ｍｍｏｌ）および４－ニトロフェニルクロロホルメート（４４ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（６３μＬ，０．４０ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４１時間撹拌した後、溶媒を減少させ、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→１０％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物３６０を６７％収率で透明な油状物として得た（１２９ｍｇ，０．０９１ｍｍｏｌ）。Ｃ６６Ｈ１１４Ｎ２Ｏ３０Ｎａ＋（Ｍ＋Ｎａ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１４３８．５９、実測値１４３８．１３。
実施例１０２．１７３の合成
無水ＤＭＦ（８００μＬ）中の３６０（１６ｍｇ，０．０１１ｍｍｏｌ）の溶液に、１６７（ペプチドＨ－ＬＰＥＴＧＧ－ＯＨ，６．５ｍｇ，０．０１１ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（５μＬ，０．０４ｍｍｏｌ）を加えた。室温で９５時間撹拌した後、粗混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，Ｈ２Ｏ中の５％→９０％ＭｅＣＮ（両方とも１％酢酸を含む））によって精製した。生成物１７３を透明な油状物として得た（１２．６ｍｇ，０．００６８ｍｍｏｌ，６２％）。Ｃ８４Ｈ１５３Ｎ８Ｏ３７ ＋（Ｍ／２＋ＮＨ４ ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値９４２．５５、実測値９２４．２６。
実施例１０３．１７４の合成

無水ＤＭＦ（２３０μＬ）中の３６１（メチルテトラジン－ＰＥＧ５－ＮＨＳエステル，６．１ｍｇ，０．０１１ｍｍｏｌ）の溶液に、ペプチドＨ－ＬＰＥＴＧＧ－ＯＨ（６．５ｍｇ，０．０１１ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（４μＬ，０．０２８ｍｍｏｌ）を加えた。室温で２２時間撹拌した後、粗混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，Ｈ２Ｏ中の５％→９０％ＭｅＣＮ（両方とも１％酢酸を含む））によって精製した。生成物１７４を透明な淡紅色油状物として得た（９．９ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ，９１％）。Ｃ４４Ｈ７０Ｎ１１Ｏ１６ ＋（Ｍ＋ＮＨ４ ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１００９．０９、実測値１００９．６１。
実施例１０４．３６２の合成
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の３５４（３１ｍｇ，０．０９３ｍｍｏｌ）の溶液に、１８１（５６ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（４０μＬ，０．２８ｍｍｏｌ）を加えた。暗所において室温で２５分間撹拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→１５％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物３６２を透明な油状物として得た（５５ｍｇ，０．０７２ｍｍｏｌ，７７％）。Ｃ３１Ｈ５１Ｆ４Ｎ４Ｏ１３ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値７６３．７５、実測値７６３．０８。
実施例１０５．３６３の合成
ＤＣＭ（２ｍＬ）中の３６２（５５ｍｇ，０．０７２ｍｍｏｌ）の溶液に、４－ニトロフェニルクロロホルメート（１３ｍｇ，０．０６４ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（３０μＬ，０．２１ｍｍｏｌ）を加えた。暗所において室温で２１時間撹拌した後、混合物を真空中で濃縮し、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，水（１％ＡｃＯＨ）中の５％→９０％ＭｅＣＮ（１％ＡｃＯＨ）によって精製した。生成物３６３を黄色油状物として得た（１３．３ｍｇ，０．０１４ｍｍｏｌ，２０％）。Ｃ３８Ｈ５４Ｆ４Ｎ５Ｏ１７ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値９２８．８５、実測値９２８．５７。
実施例１０６．１７５の合成
無水ＤＭＦ（３００μＬ）中の３６３（１３．３ｍｇ，０．０１４ｍｍｏｌ）の溶液に、１６７（ペプチドＨ－ＬＰＥＴＧＧ－ＯＨ，８．２ｍｇ，０．０１４ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（６μＬ，０．０４３ｍｍｏｌ）を加えた。暗所で２６時間後、粗混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，Ｈ２Ｏ中の５％→９０％ＭｅＣＮ（両方とも１％酢酸を含む））によって精製した。生成物１７５を透明な油状物として得た（１１．４ｍｇ，０．００８４ｍｍｏｌ，５９％）。Ｃ５６Ｈ８９Ｆ４Ｎ１０Ｏ２４ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１３６２．３５、実測値１３６２．８１。
実施例１０７．３６５の合成
無水ＤＭＦ（３５０μＬ）中の１５１（Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ，２０ｍｇ，０．０４９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（２５μＬ，０．１５ｍｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（１８ｍｇ，０．０４９ｍｍｏｌ）を加えた。１０分後、無水物に溶解された化合物３６４（Ｎ－Ｂｏｃ－エチレンジアミン，７．８ｍｇ，０．０４９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で４５分間撹拌した後、混合物を真空中で濃縮し、シリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の０→３０％ＭｅＯＨ）によって精製することにより、所望の化合物３６５を透明な油状物として得た（１２．４ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ，４６％）。Ｃ２８Ｈ３６Ｎ５Ｏ７ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値５５４．６１、実測値５５４．４６。
実施例１０８．３６６の合成
ＤＣＭ（０．７ｍＬ）中の３６５（１２．４ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ジオキサン中の４．０Ｍ ＨＣｌ（４００μＬ）を加えた。室温で１時間撹拌した後、混合物を濃縮し、３６６を白色固体として得た（１１ｍｇ，０．０２２ｍｍｏｌ，定量的）。Ｃ２３Ｈ２８Ｎ５Ｏ７＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値５４５．５０、実測値４５４．３３。
実施例１０９．１７６の合成
無水ＤＭＦ（３００μＬ）中の１９１（８ｍｇ，０．００５９ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（２．５μＬ，０．０１７ｍｍｏｌ）、および無水ＤＭＦ中の３６６の原液（１１０μＬ，３．０ｍｇ，０．００５９ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１８時間撹拌した後、ジエチルアミン（２ｕＬ）を加えた。さらに２時間後、混合物をＲＰ ＨＰＬＣ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｘｂｒｉｄｇｅ ｐｒｅｐ Ｃ１８ ５μｍ ＯＢＤ，３０×１００ｍｍ，Ｈ２Ｏ中の５％→９０％ＭｅＣＮ（両方とも１％酢酸を含む））によって精製した。生成物１７６を透明な油状物として得た（１．３ｍｇ，０．０００９ｍｍｏｌ，１５％）。Ｃ６０Ｈ１０３Ｎ１０Ｏ２６Ｓ２ ＋（Ｍ＋Ｈ＋）についてのＬＣＭＳ（ＥＳＩ＋）計算値１４４４．６４、実測値１４４４．７５。
サイトカインおよびｓｃＦｖの発現
実施例１１０．ヒト化ＯＫＴ３ ２００
Ｃ末端ソルターゼ（ｈＯＫＴ３）Ａ認識配列（配列番号１によって特定されるＣ末端タグ）を有するヒト化ＯＫＴ３を、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｔｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）から入手した。質量スペクトル分析は、１つの主要生成物（観測質量２８８３６Ｄａ）を示した。
実施例１１１．抗４－１ＢＢ ＰＦ３１
抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖを、Ｃ末端ソルターゼＡ認識配列とそれに続くＨｉｓタグ（配列番号４によって特定されるアミノ酸配列）を用いて設計した。抗４－１ＢＢ ｓｃＦｖをＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現させた後、Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｔｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）がＩＭＡＣ精製した。質量スペクトル分析は、１つの主要生成物（観測質量２８０１３Ｄａ、予想質量２８０１８Ｄａ）を示した。
実施例１１２．ｐＥＴ３２ａ発現ベクターへのＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５ ＰＦ１８のクローニング
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）（配列番号５によって特定されるアミノ酸配列）を、Ｎ末端（Ｍ）ＳＹＲ配列を用いて設計し、メチオニンが、発現後に切断されて、Ｎ末端セリン、およびＳＹＲ配列とＩＬ１５との間に屈曲性の（Ｇ４Ｓ）３スペーサーが残る。コドン最適化されたＤＮＡ配列を、ｐＥＴ３２Ａ発現ベクターのＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間に挿入することにより、チオレドキシン融合タンパク質をコードする配列を除去した。そのコドン最適化されたＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡから入手した。
実施例１１３．ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５ ＰＦ１８のＥ．ｃｏｌｉ発現および封入体の単離
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）の発現は、ＢＬ２１細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）へのプラスミド（ｐＥＴ３２ａ－ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５）の形質転換から始める。形質転換細胞を、アンピシリンを含むＬＢ寒天上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。シングルコロニーを拾い、それを用いて５０ｍＬのＴＢ培地＋アンピシリンに接種した後、３７℃で一晩インキュベートした。次に、一晩培養物を用いて、１０００ｍＬのＴＢ培地＋アンピシリンに接種した。培養物を１６０ＲＰＭにて３７℃でインキュベートし、ＯＤ６００が１．５に達したら、１ｍＭ ＩＰＴＧ（１ｍＬの１Ｍ原液）で誘導した。１６０ＲＰＭにて３７℃で＞１６時間誘導した後、培養物を遠心分離（５０００×ｇ－５分）によってペレットにした。１０００ｍＬの培養物から得られた細胞ペレットを、１５００単位のベンゾナーゼを含む６０ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭに溶解し、ローラーバンク上で室温にて３０分間インキュベートした。溶解後、不溶性画分を遠心分離（１５分，１５０００×ｇ）によって可溶性画分から分離した。不溶性画分の半分を、リゾチーム（最終濃度：２００μｇ／ｍＬ）を含む３０ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭに溶解し、ローラーバンク上で１０分間インキュベートした。次に、溶液を６体積の１：１０希釈ＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭで希釈し、１５分間、１５０００×ｇで遠心分離した。ホモジナイザーを用いてペレットを２００ｍＬの１：１０希釈ＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭに再懸濁し、１０分間、１２０００×ｇで遠心分離した。最後のステップを３回繰り返した。
実施例１１４．単離された封入体からのＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５ ＰＦ１８のリフォールディング
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５ ＰＦ１８を含む精製封入体を、４０ｍＭシステアミンおよび２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を含む３０ｍＬの５Ｍグアニジンに溶解し、変性させた。その懸濁液を１６．０００×ｇで５分間遠心分離して、残りの細胞残屑をペレットにした。上清を４０ｍＭシステアミンおよび２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を含む５Ｍグアニジンで１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ローラーバンク上で室温において２時間インキュベートした。その１ｍｇ／ｍＬの溶液を、１０体積のリフォールディング緩衝液（ｐＨ８．０の、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０．５３ｍＭ ＮａＣｌ、０．４４ｍＭ ＫＣｌ、２．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５５％ＰＥＧ－４０００、０．５５Ｍ Ｌ－アルギニン、４ｍＭシステアミン、４ｍＭシスタミン）に４℃の低温室において必要な撹拌をしながら滴下した。溶液を４℃で少なくとも２４時間放置する。ＳｐｅｃｔｒｕｍＴＭＳｐｅｃｔｒａ／ＰｏｒＴＭ３ ＲＣ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｕｂｉｎｇ ３５００ Ｄａｌｔｏｎ ＭＷＣＯを使用して、溶液を１０ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に１×一晩および２×４時間透析する。リフォールディングされたＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において平衡化Ｑトラップ陰イオン交換カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ）にロードした。カラムを最初に緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で洗浄した。保持されたタンパク質を、緩衝液Ａから緩衝液Ｂまで３０ｍＬのグラジエントで緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で溶出した。質量分析は、ＰＦ１８に対応する１４１２２Ｄａ（予想質量：１４１２２Ｄａ）の重量を示した。精製されたＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用してＰＢＳに緩衝液交換した。
実施例１１５．ｐＥＴ３２ａ発現ベクターへのＨ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０７のクローニング
ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５融合タンパク質２０７（配列番号３によって特定されるアミノ酸配列）を、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ）とそれに続くソルターゼＡ認識配列（ＧＧＧ）を用いて設計した。コドン最適化されたＤＮＡ配列を、ｐＥＴ３２Ａ発現ベクターのＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間に挿入することにより、チオレドキシン融合タンパク質をコードする配列を除去した。そのコドン最適化されたＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡから入手した。
実施例１１６．Ｈｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０７のＥ．ｃｏｌｉ発現および封入体の単離
Ｈｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０７の発現は、ＢＬ２１細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）へのプラスミド（ｐＥＴ３２ａ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５）の形質転換から始める。次のステップは、ＢＬ２１細胞への５００ｍＬ培養物（ＬＢ培地＋アンピシリン）の接種だった。ＯＤ６００が０．７に達したら、培養物を１ｍＭ ＩＰＴＧ（５００μＬの１Ｍ原液）で誘導した。３７℃で４時間誘導した後、培養物を遠心分離によってペレットにした。５００ｍＬの培養物から得られた細胞ペレットを、６２５単位のベンゾナーゼを含む２５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭに溶解し、ローラーバンク上で室温にて２０分間インキュベートした。溶解後、不溶性画分を遠心分離（２０分，１２０００×ｇ，４℃）によって可溶性画分から分離した。不溶性画分を、リゾチーム（最終濃度：２００μｇ／ｍＬ）を含む２５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭに溶解し、ローラーバンク上で５分間インキュベートした。次に、溶液を６体積の１：１０希釈ＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭで希釈し、４℃で１５分間、９０００×ｇで遠心分離した。ホモジナイザーを用いてペレットを２５０ｍＬの１：１０希釈ＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭに再懸濁し、１５分間、９０００×ｇにて４℃で遠心分離した。最後のステップを３回繰り返した。
実施例１１７．単離された封入体からのＨｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０７のリフォールディング
Ｈｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０７を含む精製封入体を、２５ｍＬの変性緩衝液（５Ｍグアニジン、０．３Ｍ亜硫酸ナトリウム）および２．５ｍＬの５０ｍＭ ２－ニトロ－５－スルホベンゾナート二ナトリウム中、４℃で一晩スルホン化した。その溶液を１０体積の冷Ｍｉｌｌｉ－Ｑで希釈し、遠心分離した（８０００×ｇで１０分間）。ホモジナイザーを用いてペレットを１２５ｍＬの冷Ｍｉｌｌｉ－Ｑに溶解し、遠心分離した（８０００×ｇで１０分間）。最後のステップを３回繰り返した。精製されたＨｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０７を５Ｍグアニジンで変性させ、１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に希釈した。直径０．８ｍｍのシリンジを用いて、変性タンパク質を氷上の１０体積のリフォールディング緩衝液（ｐＨ８．０の、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０．５３ｍＭ ＮａＣｌ、０．４４ｍＭ ＫＣｌ、２．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５５％ＰＥＧ－４０００、０．５５Ｍ Ｌ－アルギニン、８ｍＭシステアミン、４ｍＭシスタミン）に滴下し、４℃で４８時間インキュベートした（撹拌は不要）。リフォールディングされたＨｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０７をＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上の２０ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐエクセルカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ）にロードした。そのカラムを最初に緩衝液Ａ（５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、２０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で洗浄した。保持されたタンパク質を、緩衝液Ａから緩衝液Ｂまで２５ｍＬのグラジエントで緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、５００ｍＭイミダゾール、５００ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で溶出した。画分をポリアクリルアミドゲル（１６％）においてＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。精製された標的タンパク質を含む画分を合わせ、４℃で一晩実施した透析によって緩衝液をＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５および１５０ｍＭ ＮａＣｌ２）と交換した。精製されたタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５，ＭＷＣＯ ３ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて少なくとも２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。質量スペクトル分析は、２５０４４Ｄａの重量を示した（予想：２５０４４Ｄａ）。生成物をさらに使用する前に－８０℃で保存した。
実施例１１８．ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０８を得るためのＨｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０７のＴＥＶ切断
Ｈｉｓ６－ＳＳＧＥＮＬＹＦＱ－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（２０７，３３０μＬ，ＴＢＳ ｐＨ７．５中の２．３ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ＴＥＶプロテアーゼ（５０．５μＬ，５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＴＣＥＰ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，５０％グリセロール，ｐＨ７．５中の１０単位／μＬ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加えた。反応物を３０℃で１時間インキュベートした。ＴＥＶ切断後、溶液を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。反応混合物を、移動相としてＴＢＳ ｐＨ７．５を使用し、０．５ｍＬ／分の流速で、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０８を１２ｍＬの保持時間で溶出した。精製されたタンパク質を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５，ＭＷＣＯ ３ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して少なくとも２ｍｇ／ｍＬに濃縮した。生成物を質量分析で分析したところ（観測質量：２２９６５Ｄａ、予想質量：２２９６４Ｄａ）、ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０８に対応した。生成物をさらに使用する前に－８０℃で保存した。
実施例１１９．ｐＥＴ３２ａ発現ベクターへのＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５ ＰＦ２６のクローニング
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５（ＰＦ２６）（配列番号６によって特定されるアミノ酸配列）は、Ｎ末端（Ｍ）ＳＹＲ配列を有するように設計され、メチオニンは、発現後に切断されて、Ｎ末端セリン、およびＳＹＲ配列とＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５との間に屈曲性の（Ｇ４Ｓ）３スペーサーが残る。コドン最適化されたＤＮＡ配列を、ｐＥＴ３２Ａ発現ベクターのＮｄｅＩとＸｈｏＩとの間に挿入することにより、チオレドキシン融合タンパク質をコードする配列を除去した。そのコドン最適化されたＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＵＳＡから入手した。
実施例１２０．ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５ ＰＦ２６のＥ．ｃｏｌｉ発現および封入体の単離
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５ ＰＦ２６の発現は、ＢＬ２１細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）へのプラスミド（ｐＥＴ３２ａ－ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５）の形質転換から始める。次のステップは、ＢＬ２１細胞への１０００ｍＬ培養物（ＴＢ培地＋アンピシリン）の接種だった。ＯＤ６００が１．５に達したら、培養物を１ｍＭ ＩＰＴＧ（１ｍＬの１Ｍ原液）で誘導した。１６０ＲＰＭにて３７℃で＞１６時間誘導した後、培養物を遠心分離（５０００×ｇ－５分）によってペレットにした。１０００ｍＬの培養物から得られた細胞ペレットを、１５００単位のベンゾナーゼを含む６０ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭに溶解し、ローラーバンク上で室温にて３０分間インキュベートした。溶解後、不溶性画分を遠心分離（１５分，１５０００×ｇ）によって可溶性画分から分離した。不溶性画分の半分を、リゾチーム（最終濃度：２００μｇ／ｍＬ）を含む３０ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭに溶解し、ローラーバンク上で１０分間インキュベートした。次に、溶液を６体積の１：１０希釈ＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭで希釈し、１５分間、１５０００×ｇで遠心分離した。ホモジナイザーを用いてペレットを２００ｍＬの１：１０希釈ＢｕｇＢｕｓｔｅｒＴＭに再懸濁し、１０分間、１２０００×ｇで遠心分離した。最後のステップを３回繰り返した。
実施例１２１．単離された封入体からのＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５ ＰＦ２６のリフォールディング
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５（ＰＦ２６）を含む精製封入体を、４０ｍＭシステアミンおよび２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を含む３０ｍＬの５Ｍグアニジンに溶解し、変性させた。その懸濁液を１６．０００×ｇで５分間遠心分離して、残りの細胞残屑をペレットにした。上清を４０ｍＭシステアミンおよび２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を含む５Ｍグアニジンで１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ローラーバンク上で室温において２時間インキュベートした。その１ｍｇ／ｍＬの溶液を、１０体積のリフォールディング緩衝液（ｐＨ８．０の、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０．５３ｍＭ ＮａＣｌ、０．４４ｍＭ ＫＣｌ、２．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５５％ＰＥＧ－４０００、０．５５Ｍ Ｌ－アルギニン、４ｍＭシステアミン、４ｍＭシスタミン）に４℃の低温室において必要な撹拌をしながら滴下した。溶液を４℃で少なくとも２４時間放置する。ＳｐｅｃｔｒｕｍＴＭＳｐｅｃｔｒａ／ＰｏｒＴＭ３ ＲＣ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｕｂｉｎｇ ３５００ Ｄａｌｔｏｎ ＭＷＣＯを使用して、溶液を１０ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０に１×一晩および２×４時間透析する。リフォールディングされたＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５（ＰＦ２６）を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において平衡化Ｑトラップ陰イオン交換カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈ ｃａｒｅ）にロードした。カラムを最初に緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で洗浄した。保持されたタンパク質を、緩衝液Ａから緩衝液Ｂまで３０ｍＬのグラジエントで緩衝液Ｂ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、１Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）で溶出した。質量分析は、ＰＦ２６に対応する２４１４６Ｄａの重量を示した（予想質量：２４１４６Ｄａ）。精製されたＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒａ－リンカー－ＩＬ１５（ＰＦ２６）を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてｃｙｔｉｖａ製のＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラムを使用してＰＢＳに緩衝液交換した。
サイトカインおよびｓｃＦｖの改変
実施例１２２．ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－ＢＣＮ ２０１を得るための、ソルターゼＡを使用したｈＯＫＴ３ ２００への化合物ＧＧＧ－ＰＥＧ２－ＢＣＮ（１５７）のＣ末端ソルタギング
本発明に係るバイオコンジュゲートを、ソルターゼＡ（配列番号２によって特定される）を使用したＣ末端ソルタギングによって調製した。ｈＯＫＴ３ ２００（５００μＬ，５００μｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中３５μＭ）の溶液に、ソルターゼＡ（５８μＬ，３８４μｇ，ＴＢＳ ｐＨ７．５＋１０％グリセロール中３０２μＭ）、ＧＧＧ－ＰＥＧ２－ＢＣＮ（１５７，２８μＬ，ＤＭＳＯ中５０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（６９μＬ，ＭＱ中１００ｍＭ）およびＴＢＳ ｐＨ７．５（３９μＬ）を加えた。反応物を３７℃で一晩インキュベートした後、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ－１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＨｉｓ－ｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール，ｐＨ７．５）で平衡化し、そのサンプルを１ｍＬ／分でロードした。フロースルーを収集したところ、質量スペクトル分析は、２０１に対応する１つの主要生成物（観測質量２７８２９Ｄａ）を示した。そのサンプルをＰＢＳ ｐＨ７．４に対して透析し、スピン濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５，Ｕｌｔｒａｃｅｌ－１０ Ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって濃縮して、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－ＢＣＮ ２０１（６０μＬ，１６９μｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中１０１μＭ）を得た。
実施例１２３．ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－ＢＣＮ ２０１を得るための、ソルターゼＡ五変異体を用いたｈＯＫＴ３ ２００への化合物ＧＧＧ－ＰＥＧ２－ＢＣＮ（１５７）のＣ末端ソルタギング
本発明に係るバイオコンジュゲートを、ソルターゼＡ五変異体（ＢＰＳ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，カタログ番号７１０４６）を使用したＣ末端ソルタギングによって調製した。ｈＯＫＴ３ ２００（１４．３μＬ，１４μｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中３５μＭ）の溶液に、ソルターゼＡ五変異体（０．５μＬ，１μｇ，４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中９２μＭ、１１０ｍＭ ＮａＣｌ、２．２ｍＭ ＫＣｌ、４００ｍＭイミダゾールおよび２０％グリセロール）、ＧＧＧ－ＰＥＧ２－ＢＣＮ（１５７，２μＬ，ＤＭＳＯ：ＭＱ＝２：３中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（２μＬ，ＭＱ中１００ｍＭ）およびＴＢＳ ｐＨ７．５（１．２μＬ）を加えた。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－ＢＣＮ ２０１に対応する１つの主要生成物（観測質量２７８２９Ｄａ）を示した。
実施例１２４．ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－テトラジンＰＦ０１を得るための、ソルターゼＡを用いたｈＯＫＴ３ ２００へのＧＧＧ－ＰＥＧ１１－テトラジン（１６９）のＣ末端ソルタギング
本発明に係るバイオコンジュゲートを、ソルターゼＡ（配列番号２によって特定される）を用いたＣ末端ソルタギングによって調製した。ｈＯＫＴ３ ２００（１９０８μＬ，５ｍｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中９１μＭ）の溶液に、ソルターゼＡ（８１μＬ，９４８μｇ，ＴＢＳ ｐＨ７．５＋１０％グリセロール中５３３μＭ）、ＧＧＧ－ＰＥＧ１１－テトラジン（１６９，３４７μＬ，ＭＱ中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（３４７μＬ，ＭＱ中１００ｍＭ）およびＴＢＳ ｐＨ７．５（７８９μＬ）を加えた。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－テトラジンＰＦ０１に対応する１つの主要生成物（観測質量２８２５８Ｄａ）を示した。その反応物を、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ－１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＨｉｓ－ｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール，ｐＨ７．５）で平衡化し、そのサンプルを１ｍＬ／分でロードした。フロースルーを収集し、ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＢＳ ｐＨ６．５に緩衝液交換した。ＰＢＳ ｐＨ６．５に対して追加の透析を４℃で３日間行い、残渣１６９を除去した。
実施例１２５．ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２３－テトラジンＰＦ０２を得るための、ソルターゼＡを用いたｈＯＫＴ３ ２００へのＧＧＧ－ＰＥＧ２３－テトラジン（１７０）のＣ末端ソルタギング
本発明に係るバイオコンジュゲートを、ソルターゼＡ（配列番号２によって特定される）を用いたＣ末端ソルタギングによって調製した。ｈＯＫＴ３ ２００（１９０８μＬ，５ｍｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中９１μＭ）の溶液に、ソルターゼＡ（８１μＬ，９４８μｇ，ＴＢＳ ｐＨ７．５＋１０％グリセロール中５３３μＭ）、ＧＧＧ－ＰＥＧ２３－テトラジン（１７０，３４７μＬ，ＭＱ中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（３４７μＬ，ＭＱ中１００ｍＭ）およびＴＢＳ ｐＨ７．５（７８９μＬ）を加えた。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２３－テトラジンＰＦ０２に対応する１つの主要生成物（観測質量２８７８７Ｄａ）を示した。その反応物を、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ－１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＨｉｓ－ｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール，ｐＨ７．５）で平衡化し、そのサンプルを１ｍＬ／分でロードした。フロースルーをＰＢＳ ｐＨ６．５に対して透析した後、移動相としてＰＢＳ ｐＨ６．５を使用してＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。
実施例１２６．ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－アリールアジドＰＦ０３を得るための、ソルターゼＡを用いたｈＯＫＴ３ ２００へのＧＧＧ－ＰＥＧ２－アリールアジド（１７１）のＣ末端ソルタギング
本発明に係るバイオコンジュゲートを、ソルターゼＡ（配列番号２によって特定される）を用いたＣ末端ソルタギングによって調製した。ｈＯＫＴ３ ２００（２０９２μＬ，５ｍｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中８３μＭ）の溶液に、ソルターゼＡ（９５μＬ，９５０μｇ，ＴＢＳ ｐＨ７．５＋１０％グリセロール中４５６μＭ）、ＧＧＧ－ＰＥＧ２－アリールアジド（１７１，３４７μＬ，ＭＱ中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（３４７μＬ，ＭＱ中１００ｍＭ）およびＴＢＳ ｐＨ７．５（５９１μＬ）を加えた。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－アリールアジドＰＦ０３に対応する１つの主要生成物（観測質量２７８６５Ｄａ）を示した。反応物を、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＨｉｓ－ｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール，ｐＨ７．５）で平衡化し、そのサンプルを１ｍＬ／分でロードした。フロースルーを、移動相としてＰＢＳ ｐＨ７．４を使用してＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。
実施例１２７．抗４－１ＢＢ ＰＦ０７を得るための、ソルターゼＡを用いた化合物ＧＧＧ－ＰＥＧ２３－ＢＣＮ（１６３）抗４－１ＢＢ ＰＦ３１のＣ末端ソルタギング
本発明に係るバイオコンジュゲートを、ソルターゼＡ（配列番号２によって特定される）を用いたＣ末端ソルタギングによって調製した。抗４－１ＢＢ－ＰＦ３１（６６５μＬ，２ｍｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中１０７μＭ）の溶液に、ソルターゼＡ（１００μＬ，１ｍｇ，ＴＢＳ ｐＨ７．５＋１０％グリセロール中３５７μＭ）、ＧＧＧ－ＰＥＧ２３－ＢＣＮ（１６３，１４０μＬ，ＭＱ中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（１４０μＬ，ＭＱ中１００ｍＭ）およびＴＢＳ ｐＨ７．５（３５５μＬ）を加えた。反応物を３７℃で一晩インキュベートした後、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ－１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＨｉｓ－ｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール，ｐＨ７．５）で平衡化し、そのサンプルを１ｍＬ／分でロードした。フロースルーを収集し、濃縮後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００カラム（Ｃｙｔｉｖａ）で精製した。質量スペクトル分析は、抗４－１ＢＢ－ＢＣＮ ＰＦ０７に対応する１つの主要生成物（観測質量２８４７８Ｄａ）を示した。
実施例１２８．抗４－１ＢＢ ＰＦ０９を得るための、ソルターゼＡを用いた化合物ＧＧＧ－ＰＥＧ２－アリールアジド（１７１）抗４－１ＢＢ－ＰＦ３１のＣ末端ソルタギング
本発明に係るバイオコンジュゲートを、ソルターゼＡ（配列番号２によって特定される）を用いたＣ末端ソルタギングによって調製した。抗４－１ＢＢ－ＰＦ３１（６６５μＬ，２ｍｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中１０７μＭ）の溶液に、ソルターゼＡ（１００μＬ，１ｍｇ，ＴＢＳ ｐＨ７．５＋１０％グリセロール中３５７μＭ）、ＧＧＧ－ＰＥＧ２－アリールアジド（１７１，１４０μＬ，ＭＱ中２０ｍＭ）、ＣａＣｌ２（１４０μＬ，ＭＱ中１００ｍＭ）およびＴＢＳ ｐＨ７．５（３５５μＬ）を加えた。反応物を３７℃で一晩インキュベートした後、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ－１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＨｉｓ－ｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール，ｐＨ７．５）で平衡化し、そのサンプルを１ｍＬ／分でロードした。フロースルーを収集し、質量スペクトル分析は、抗４－１ＢＢ－アジドＰＦ０９に対応する１つの主要生成物（観測質量２７５９２Ｄａ）を示した。
実施例１２９．ＢＣＮ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ１５を得るための、ＳＰＡＮＣによるＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ２６のＮ末端ＢＣＮ官能化
ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ２６（２．９ｍｇ，ＰＢＳ中５０μＭ）に、２当量のＮａＩＯ４（４．８μＬの、ＰＢＳ中の５０ｍＭ原液）および１０当量のＬ－メチオニン（１２．５μＬの、ＰＢＳ中の１００ｍＭ原液）を加えた。反応物を４℃で５分間インキュベートした。質量スペクトル分析は、対応するアルデヒドおよび水和物へのセリンの酸化を示した（観測質量２４１１４Ｄａおよび２４１３２Ｄａ）。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）を充填されたＰＤ－１０脱塩カラムを使用して反応混合物を精製し、ＰＢＳを使用して溶出した。溶出液（２．６ｍｇ，ＰＢＳ中５０μＭ）に、１６０当量のＮ－メチルヒドロキシルアミン．ＨＣｌ（３４０μＬの、ＰＢＳ中の５０ｍＭ原液）および１６０当量のｐ－アニシジン（３４０μＬの、ＰＢＳ中の５０ｍＭ原液）を加えた。反応混合物を２５℃で３時間インキュベートした。質量スペクトル分析は、Ｎ－メチル－イミン－オキシド－ＩＬ１５に対応する単一のピーク（観測質量２４１４３Ｄａ）を示した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）を充填されたＰＤ－１０脱塩カラムを使用して反応混合物を精製し、ＰＢＳを使用して溶出した。溶出液（２．４７ｍｇ，ＰＢＳ中５０μＭ）に、２５当量のビス－ＢＣＮ－ＰＥＧ１１（１０５）（５１μＬ，ＤＭＳＯ中５０ｍＭ）および１５０μＬのＤＭＦを加えた。反応物を室温で一晩インキュベートした。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて反応物を精製した。質量スペクトル分析は、ＢＣＮ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ１５に対応する１つの主要なピークを示した（観測質量２５０４１Ｄａ）。
実施例１３０．アジド－ＩＬ１５ ＰＦ１９を得るためのＩＬ１５ ＰＦ１８のＮ末端ジアゾ転移反応
ＩＬ１５ ＰＦ１８（５ｍｇ，０．１Ｍ ＴＥＡ緩衝液ｐＨ８．０中５０μＭ）に、イミダゾール－１－スルホニルアジド塩酸塩（７０８μＬ，５０ｍＭ ＮａＯＨ中５０ｍＭ）を加え、３７℃で一晩インキュベートした。反応物を、ＨｉＰｒｅｐＴＭ２６／１０脱塩カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して精製した。質量スペクトル分析は、アジド－ＩＬ１５ ＰＦ１９に対応する１つの主要なピーク（観測質量１４１４７Ｄａ）を示した。
実施例１３１．ビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２２を得るためのｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－アリールアジドＰＦ０３へのトリ－ＢＣＮ（１５０）のコンジュゲーション
ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－アリールアジドＰＦ０３（８７μＬ，１ｍｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中４１１μＭ）の溶液に、ＰＢＳ ｐＨ７．４（５５９μＬ）、ＤＭＦ（４９μＬ）および化合物１５０（２２μＬ，ＤＭＦ中４０ｍＭ溶液，２５当量）を加えた。反応物を室温で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析は、ビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２２に対応する１つの主要生成物（観測質量２９１７１Ｄａ）を示した。移動相としてＰＢＳ ｐＨ７．４を使用して、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で反応物を精製した。
実施例１３２．ＢＣＮ－ＰＥＧ１１－ＩＬ１５ ＰＦ３３を得るためのＳＰＡＮＣによるＩＬ１５ ＰＦ１８のＮ末端ＢＣＮ官能化
ＩＬ１５ ＰＦ１８（８０７０μＬ，ＰＢＳ中５０μＭ）に、２当量のＮａＩＯ４（１６．４μＬの、ＰＢＳ中５０ｍＭ原液）を加えた。反応物を４℃で５分間インキュベートした。質量スペクトル分析は、対応する水和物へのセリンの酸化を示した（観測質量１４１０９Ｄａ）。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）を充填されたＰＤ－１０脱塩カラムを使用して反応混合物を精製し、ＰＢＳを使用して溶出した。溶出液（１１５００μＬ，ＰＢＳ中３２μＭ）に、１６０当量のＮ－メチルヒドロキシルアミンＨＣｌ（５５８μＬの、ＰＢＳ中１００ｍＭ原液）および１６０当量のｐ－アニシジン（５５８μＬの、ＰＢＳ中１００ｍＭ原液）を加えた。反応混合物を２５℃で３時間インキュベートした。質量スペクトル分析は、Ｎ－メチル－イミン－オキシド－ＩＬ１５に対応する単一のピーク（観測質量１４１１９Ｄａ）を示した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）を充填されたＰＤ－１０脱塩カラムを使用して反応混合物を精製し、ＰＢＳを使用して溶出した。濃縮溶出液（５３７０，ＰＢＳ中６６μＭμＭ）に、２５当量のＢＣＮ－ＰＥＧ１１－ＢＣＮ（１０５）（１４２μＬ，ＤＭＳＯ中５０ｍＭ）および１５７６μＬのＰＢＳを加えた。反応物を室温で一晩インキュベートした。移動相としてＰＢＳ ｐＨ７．４を使用し、０．５ｍＬ／分の流速で、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）におけるＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に反応混合物をロードした。質量スペクトル分析は、ＢＣＮ－ＰＥＧ１１－ＩＬ１５ ＰＦ３３（観測質量１５０１６Ｄａ）に対応する１つの主要なピークを示した。
実施例１３３．アリールアジド－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ１３を得るための、ソルターゼＡを用いたＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ２０８へのアリールアジド－ＰＥＧ１１－ＬＰＥＴＧＧ（１７５）のＮ末端ソルタギング
タンパク質２０８を含む溶液（２０００μＬ，ＴＢＳ ｐＨ７．５中１４０μＭ）に、ＴＢＳ ｐＨ７．５（２６８６μＬ）、ＣａＣｌ２（５５９μＬ，１００ｍＭ）および１７５（８３μＬ，ＤＭＳＯ中５０ｍＭ）およびソルターゼＡ（２６０μＬ，ＴＢＳ ｐＨ７．５中５３７μＭ）を加え、３７℃で３時間インキュベートした（遮光して）。インキュベーション後、Ｎｉ－ＮＴＡビーズ（５００μＬビーズ＝１ｍＬスラリー）を使用して、その溶液からソルターゼＡを除去した。その溶液をローラーバンク上でＮｉ－ＮＴＡビーズとともに４℃で一晩インキュベートし、その後、溶液を遠心分離した（５分、７．０００×ｇ）。ペレットから上清を分離することによって、生成物ＰＦ１３を含む上清を回収した。移動相としてＰＢＳ ｐＨ７．４を使用し、０．５ｍＬ／分の流速で、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）におけるＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に反応混合物をロードした。質量分析は、ＰＦ１３に対応する２４１９３Ｄａの重量を示した（予想質量：２４１９３Ｄａ）。
実施例１３４．ビス－ＢＣＮ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ２７を得るための、歪み促進型アルキン－ニトロン付加環化を用いたＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ２６におけるトリ－ＢＣＮ（１５０）のＮ末端組み込み
ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ２６（３８４０μＬ，ＰＢＳ中５０μＭ）に、２当量のＮａＩＯ４（７．７μＬのＰＢＳ中５０ｍＭ原液）および１０当量のＬ－メチオニン（１９．２μＬのＰＢＳ中１００ｍＭ原液）を加えた。反応物を４℃で５分間インキュベートした。質量スペクトル分析は、対応するアルデヒドおよび水和物へのセリンの酸化を示した（観測質量２４１１４Ｄａおよび２４１３２Ｄａ）。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）を充填されたＰＤ－１０脱塩カラムを使用して反応混合物を精製し、ＰＢＳを使用して溶出した。濃縮溶出液（１８００μＬ，ＰＢＳ中５０μＭ）に、１６０当量のＮ－メチルヒドロキシルアミン．ＨＣｌ（３２０μＬのＰＢＳ中９０ｍＭ原液）および１６０当量のｐ－アニシジン（２８８μＬのＰＢＳ中１００ｍＭ原液）を加えた。反応混合物を２５℃で３時間インキュベートした。質量スペクトル分析は、Ｎ－メチル－イミン－オキシド－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５に対応する単一のピーク（観測質量２４１４３Ｄａ）を示した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５樹脂（Ｃｙｔｉｖａ）を充填されたＰＤ－１０脱塩カラムを使用して反応混合物を精製し、ＰＢＳを使用して溶出した。濃縮溶出液（３１００μＬ，ＰＢＳ中６０μＭ）に、２５当量のトリ－ＢＣＮ（１５０）（１１６μＬ，ＤＭＳＯ中４０ｍＭ）、２５６μＬのＤＭＦおよびＰＢＳ ｐＨ７．４（２４８μＬ）を加えた。反応物を室温で一晩インキュベートした。移動相としてＰＢＳ ｐＨ７．４を使用し、０．５ｍＬ／分の流速で、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）におけるＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に反応混合物をロードした。質量スペクトル分析は、所望のビス－ＢＣＮ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ２７（観測質量２５４４８Ｄａ、予想質量２５４４７）を示した。ＲＰ－ＨＰＬＣは、６０％の標識効率を示した。
実施例１３５．ｈＯＫＴ３－（ＴＣＯ）１－（ＢＣＮ）１ ＰＦ３２を得るための、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－アリールアジドＰＦ０３へのビス－ＢＣＮ－ＴＣＯ ＸＬ１１のコンジュゲーション
ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２－アリールアジドＰＦ０３を含む溶液（３５μＬ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中４１１μＭ）に、ＰＢＳ ｐＨ７．４（２２４．２μＬ）およびビス－ＢＣＮ－ＴＣＯ ＸＬ１１（２８．８μＬ，ＤＭＦ中１０ｍＭ、２０当量）を加えた。反応物を室温で１６時間インキュベートした。遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて過剰なビス－ＢＣＮ－ＴＣＯ ＸＬ１１を除去することにより、ＰＢＳ ｐＨ７．４中３．３９ｍｇ／ｍＬの濃度の最終サンプルを得た。質量スペクトル分析は、予想生成物ｈＯＫＴ３－（ＴＣＯ）１－（ＢＣＮ）１ ＰＦ３２に対応する１つの主要生成物（観測質量２９３０５Ｄａ）を示した。
実施例１３６．ｈＯＫＴ３－（ＩＬ１５）１－（ＴＣＯ）１ ＰＦ３４を得るための、ｈＯＫＴ３－（ＴＣＯ）１－（ＢＣＮ）１ ＰＦ３２へのアジド－ＩＬ１５ ＰＦ１９のコンジュゲーション
ｈＯＫＴ３－（ＴＣＯ）１－（ＢＣＮ）１ ＰＦ３２（５０μＬ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中１１６μＭ）を含む溶液に、アジド－ＩＬ１５ ＰＦ１９（５２μＬ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中２２５μＭ，２当量）を加えた。反応物を３７℃で１６時間インキュベートした。質量スペクトル分析は、予想生成物ｈＯＫＴ３－（ＩＬ１５）１－（ＴＣＯ）１ ＰＦ３４に対応する１つの主要生成物（観測質量４３４５３Ｄａ）を示した。
実施例１３７．ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５－（抗４－１－ＢＢ）１－（ＢＣＮ）１ ＰＦ３５を得るための、ビス－ＢＣＮ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ２７への抗４－１ＢＢ－ＰＥＧ２－アリールアジドＰＦ０９のコンジュゲーション
抗４－１ＢＢ－ＰＥＧ２－アリールアジドＰＦ０９（５２μＬ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中２００μＭ）を含む溶液に、ビス－ＢＣＮ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ２７（８０μＬ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中１６９μＭ）を加えた。反応物を室温で１６時間インキュベートした。移動相としてＰＢＳ ｐＨ７．４を使用し、０．５ｍＬ／分の流速で、ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）におけるＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に反応混合物をロードした。質量スペクトル分析は、ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５－（抗４－１－ＢＢ）１－（ＢＣＮ）１ ＰＦ３５に対応する５３０４３Ｄａの重量を示した（予想質量：５３０５０Ｄａ）。
抗体修飾
実施例１３８．アドセトリスからアドセトリス（６－Ｎ３ＧａｌＮＡｃ）２アドセトリス－ｖ１ａへの酵素的リモデリング
アドセトリス（薬局から調達）を緩衝液交換し、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５中、３５．６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。アドセトリス（８４μＬ，３ｍｇ，２０ｍＭヒスチジン，１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５中３５．６ｍｇ／ｍＬ）を、国際公開第２０１７１３７４５９Ａ１号に記載されているＥｎｄｏＳＨ（６μＬ，３１μｇ，５．２ｍｇ／ｍＬ）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（３２μＬ，１０６μｇ，３．３ｍｇ／ｍＬ）、６－Ｎ３ＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰ（５μＬ，ＭＱ中１００ｍＭ）（両方とも国際公開第２０１６１７０１８６号に記載されている）、ＭｎＣｌ２（１μＬ，ＭＱ中１Ｍ）および２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５（２２μＬ）とインキュベートした。反応物を３０℃で一晩インキュベートし、緩衝液交換し、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳ ｐＨ７．４中３５．６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ＩｄｅＳ処理後のサンプルの質量スペクトル分析は、予想生成物アドセトリス－ｖ１ａに対応する１つの主要なＦｃ／２生成物（観測質量２４３３３Ｄａ）を示した。さらに、ＲＰ－ＨＰＬＣ分析により、ＭＭＡＥが、抗体にコンジュゲートされたままであることが確認された（３．８という平均ＤＡＲが、アドセトリスとアドセトリス－ｖ１ａの両方で観察された）。
実施例１３９．カドサイラからカドサイラ（６－Ｎ３ＧａｌＮＡｃ）２カドサイラ－ｖ１ａへの酵素的リモデリング
カドサイラ（薬局から調達）を緩衝液交換し、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５中１７．８ｍｇ／ｍＬに濃縮した。カドサイラ（２２４μＬ，４ｍｇ，２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５中１７．８ｍｇ／ｍＬ）を、国際公開第２０１７１３７４５９Ａ１号に記載されているＥｎｄｏＳＨ（８μＬ，４２μｇ，５．２ｍｇ／ｍＬ）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（４２μＬ，１３９μｇ，３．３ｍｇ／ｍＬ）、６－Ｎ３ＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰ（７μＬ，ＭＱ中１００ｍＭ）（両方とも国際公開第２０１６１７０１８６号に記載されている）およびＭｎＣｌ２（２μＬ，ＭＱ中１Ｍ）とインキュベートした。反応物を３０℃で一晩インキュベートし、緩衝液交換し、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳ ｐＨ７．４中１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ＩｄｅＳ処理後のサンプルの質量スペクトル分析は、アジド修飾Ｆｃ／２フラグメントに対応する１つの主要なＦｃ／２生成物（観測質量２４３６３Ｄａ、総Ｆｃ／２フラグメントのおよそ８０％）、およびＤＭ１を含むアジド修飾Ｆｃ／２フラグメントに対応する１つのマイナーなＦｃ／２生成物（観測質量２５３２１Ｄａ、総Ｆｃ／２フラグメントのおよそ２０％）を示し、それによってカドサイラ－ｖ１ａの形成が確認された。
実施例１４０．トラスツズマブ－Ｓ２３９Ｃからトラスツズマブ－Ｓ２３９Ｃ（６－Ｎ３ＧａｌＮＡｃ）２ｔｒａｓｔ－ｖ９ａへの酵素的リモデリング
トラスツズマブ－Ｓ２３９Ｃ変異体（ＥｖｉｔｒｉａによってＣＨＯにおいて一過性に発現、重鎖変異Ｓ２３９Ｃ）を緩衝液交換し、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて２０ｍＭヒスチジン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５中２７．０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。トラスツズマブ－Ｓ２３９Ｃ（１４８μＬ，４ｍｇ，２０ｍＭヒスチジン，１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．５中２７．０ｍｇ／ｍＬ）を、国際公開第２０１７１３７４５９Ａ１号に記載されているＥｎｄｏＳＨ（８μＬ，４２μｇ，５．２ｍｇ／ｍＬ）、ＴｎＧａｌＮＡｃＴ（４２μＬ，１３９μｇ，３．３ｍｇ／ｍＬ）、６－Ｎ３ＧａｌＮＡｃ－ＵＤＰ（７μＬ，ＭＱ中１００ｍＭ）（両方とも国際公開第２０１６１７０１８６号に記載されている）およびＭｎＣｌ２（１μＬ，ＭＱ中１Ｍ）とインキュベートした。反応物を３０℃で一晩インキュベートし、緩衝液交換し、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳ ｐＨ７．４中１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ＩｄｅＳ処理後のサンプルの質量スペクトル分析は、システインとジスルフィドを形成するＣｙｓ２３９を含むアジド修飾Ｆｃ／２フラグメントに対応する１つの主要なＦｃ／２生成物（観測質量２４４９９Ｄａ，総Ｆｃ／２フラグメントのおよそ８０％）、およびＣ末端リジンを含むアジド修飾Ｆｃ／２フラグメントに対応する２つのマイナーなＦｃ／２生成物（観測質量２４６２５および２４６８５Ｄａ、総Ｆｃ／２フラグメントのおよそ１５％および５％）、およびグルタチオンとジスルフィドを形成するＣｙｓ２３９を含むアジド修飾Ｆｃ／２－フラグメントを示し、それにより、ｔｒａｓｔ－ｖ９ａの形成が確認された。
実施例１４１．トラスツズマブ－テトラジンｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１４を得るための、ビス－ＤＩＢＯ－テトラジンＸＬ１４によるトラスツズマブ（６－Ｎ３ＧａｌＮＡｃ）２ｔｒａｓｔ－ｖ１ａの分子内架橋
国際公開第２０１６１７０１８６号に従って調製されたトラスツズマブ（６－Ｎ３ＧａｌＮＡｃ）２（ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ）（１４９μＬ，５ｍｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中３３．６ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ＰＢＳ ｐＨ７．４（３５１μＬ）プロピレングリコール（４９７μＬ）およびビス－ＤＩＢＯ－テトラジンＸＬ１４（３．３μＬ，ＤＭＦ中４０ｍＭ溶液，ＩｇＧと比較して４．０当量）を加えた。反応物を室温で一晩インキュベートした後、移動相としてＰＢＳ ｐＨ７．４を使用してＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。ＩｄｅＳ消化サンプルの質量スペクトル分析は、分子内架橋されたＦｃ／２－フラグメントに対応する１つの主要生成物（観測質量５０１７７Ｄａ）を示し、それにより、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１４の形成が確認された。質量スペクトル分析を、精製されたモノマー画分に対して行ったので、分子間架橋を除外することができた。遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて最終サンプルを１１．９８ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
実施例１４２．トラスツズマブ－ＢＣＮ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５を得るための、トリ－ＢＣＮ １４５によるトラスツズマブ（６－Ｎ３ＧａｌＮＡｃ）２ｔｒａｓｔ－ｖ１ａの分子内架橋
国際公開第２０１６１７０１８６号に従って調製されたトラスツズマブ（６－Ｎ３ＧａｌＮＡｃ）２ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ（３２０μＬ，２ｍｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中５．５６ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、化合物１４５（８０μＬ，ＤＭＦ中１．６６ｍＭ溶液，ＩｇＧと比較して１０当量）を加えた。反応物を室温で１日間インキュベートした後、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて緩衝液をＰＢＳ ｐＨ７．４に交換した。ＩｄｅＳ消化サンプルの質量スペクトル分析は、分子内架橋されたトラスツズマブ誘導体ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５に対応する１つの主要生成物（計算質量４９７９６Ｄａ、観測質量４９８０７Ｄａ）を示した。ＨＰＬＣ－ＳＥＣは、＜４％の凝集を示したので、分子間架橋が除外された。
実施例１４３．リツキシマブ－ＢＣＮ ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５を得るための、トリ－ＢＣＮ１４５によるリツキシマブ（６－Ｎ３ＧａｌＮＡｃ）２ ｒｉｔ－ｖ１ａの分子内架橋
国際公開第２０１６１７０１８６号に従って調製されたｒｉｔ－ｖ１ａ（４９４μＬ，３０ｍｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中６０．７ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ＰＢＳ ｐＨ７．４（２５０６μＬ）、プロピレングリコール（２９８０μＬ）および三価リンカー１４５（２０μＬ，ＤＭＦ中４０ｍＭ溶液，ＩｇＧと比較して４．０当量）を加えた。反応物を室温で一晩インキュベートした後、移動相としてＰＢＳ ｐＨ７．４を使用してＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、架橋重鎖に対応する１つの主要なＨＣ生成物を示した（図２４の右のパネルのレーン３を参照のこと）ことから、ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５の形成が示された。さらに、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥは、ｒｉｔ－ｖ１ａと同じ高さ付近に１つの主要なバンドを示した（図２４の左のパネルのレーン３を参照のこと）ことから、分子内架橋のみが起こったことが実証された。
実施例１４４．カドサイラ－ＢＣＮ カドサイラ－ｖ１ａ－１４５を得るための、トリ－ＢＣＮ１４５によるカドサイラ（６－Ｎ３ＧａｌＮＡｃ）２カドサイラ－ｖ１ａの分子内架橋
カドサイラ－ｖ１ａ（４００μＬ，４ｍｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中１０ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、プロピレングリコール（３９７μＬ）および三価リンカー１４５（２．７μＬ，ＤＭＦ中４０ｍＭ溶液，ＩｇＧと比較して４．０当量）を加えた。反応物を室温で一晩インキュベートした後、移動相としてＰＢＳ ｐＨ７．４を使用してＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。ＩｄｅＳ消化サンプルの質量スペクトル分析は、０、１および２個のＤＭ１部分を有する分子内架橋されたＦｃ／２フラグメントに対応する３つの主要生成物（観測質量：４９７９５、５０７５２および５１７１１Ｄａ）を示し、それによって、カドサイラ－ｖ１ａ－１４５の形成が確認された。質量スペクトル分析を、精製されたモノマー画分に対して行ったので、分子間架橋を除外することができた。遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて最終サンプルを６．８８ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
実施例１４５．トラスツズマブ－Ｓ２３９Ｃ－ＢＣＮ ｔｒａｓｔ－ｖ９ａ－１４５を得るための、トリ－ＢＣＮ１４５によるトラスツズマブ－Ｓ２３９Ｃ（６－Ｎ３ＧａｌＮＡｃ）２ ｔｒａｓｔ－ｖ９ａの分子内架橋
ｔｒａｓｔ－ｖ９ａ（４００μＬ，４ｍｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中１０ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、プロピレングリコール（３９７μＬ）および三価リンカー１４５（２．７μＬ，ＤＭＦ中４０ｍＭ溶液，ＩｇＧと比較して４．０当量）を加えた。反応物を室温で一晩インキュベートした後、移動相としてＰＢＳ ｐＨ７．４を使用してＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。ＩｄｅＳ消化サンプルの質量スペクトル分析は、システインとジスルフィドを形成する１つのＣｙｓ２３９およびグルタチオンとジスルフィドを形成する１つのＣｙｓ２３９を有する分子内架橋されたＦｃ／２フラグメントに対応する１つの主要生成物（観測質量５０２５１Ｄａ）を示し、それによってｔｒａｓｔ－ｖ９ａ－１４５の形成が確認された。質量スペクトル分析を、精製されたモノマー画分に対して行ったので、分子間架橋を除外することができた。遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて最終サンプルを７．８８ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
二機能性抗体および多機能性抗体の作製
実施例１４６．２：１分子フォーマット（ＣＤＲ：抗４－１－ＢＢ）を有するｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ０７）１を得るための、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａへの抗４－１－ＢＢ－ＰＥＧ２３－ＢＣＮ ＰＦ０７のコンジュゲーション
国際公開第２０１６１７０１８６号に従って調製されたトラスツズマブ（６－Ｎ３ＧａｌＮＡｃ）２ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ（１ｍｇ，ＰＢＳ中３３．６ｍｇ／ｍＬ）を、抗４－１－ＢＢ－ＰＥＧ２３－ＢＣＮ ＰＦ０７（５５．８μＬ，ＰＢＳ ｐＨ７．５中６．８ｍｇ／ｍＬ）と３７℃で一晩インキュベートした後、過剰なＰＦ０７を除去し、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １００ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１７．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＩｄｅＳ処理後のサンプルの質量スペクトル分析は、未反応のＦｃ／２およびＦｃ／２－ＰＦ０７にそれぞれ対応する２つの主要なＦｃ／２生成物（観測質量２４３６２Ｄａおよび５２８４０Ｄａ）を示した。これにより、予想生成物ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ０７）１の形成が確認された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、この結論を支持した（図２５を参照のこと）。
実施例１４７．２：１：１分子フォーマット（ＣＤＲ：抗４－１－ＢＢ：ＭＭＡＥ）を有するｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ０７）１－（ＬＤ１１）１を得るための、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ０７）１へのＢＣＮ－ＭＭＡＥ（ＬＤ１１）のコンジュゲーション
Ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ０７）１（５．５６μＬ，ＰＢＳ中１７．５ｍｇ／ｍＬ）を、ＢＣＮ－ＭＭＡＥ ＬＤ１１（０．５７μＬ，ＤＭＦ中１０ｍＭ）と室温で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳ処理後のサンプルの質量スペクトル分析は、Ｆｃ／２－ＬＤ１１およびＦｃ／２－ＰＦ０７にそれぞれ対応する２つの主要なＦｃ／２生成物（観測質量２５８７２Ｄａおよび５２８４０Ｄａ）を示した。これにより、予想生成物ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ０７）１－（ＬＤ１１）１の形成が確認された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、この結論を支持した（図２５を参照のこと）。
実施例１４８．２：１：１分子フォーマット（ＣＤＲ：抗４－１－ＢＢ：ＩＬ１５）を有するｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ０７）１－（ＰＦ３３）１を得るための、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ０７）１へのＢＣＮ－ＩＬ１５ ＰＦ３３のコンジュゲーション
Ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ０７）１（５．５６μＬ，ＰＢＳ中１７．５ｍｇ／ｍＬ）を、ＢＣＮ－ＩＬ１５ ＰＦ３３（４．１３μＬ，ＰＢＳ ｐＨ７．５中８．２ｍｇ／ｍＬ）と３７℃で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳ処理後のサンプルの質量スペクトル分析は、Ｆｃ／２－ＰＦ３３およびＦｃ／２－ＰＦ０７にそれぞれ対応する２つの主要なＦｃ／２生成物（観測質量３９３７６Ｄａおよび５２８４２Ｄａ）を示した。これにより、予想生成物ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ０７）１－（ＰＦ３３）１の形成が確認された。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、この結論を支持した（図２５を参照のこと）。
実施例１４９．２：１：１分子フォーマット（ＣＤＲ：ｈＯＫＴ３：ＩＬ１５）を有する免疫細胞エンゲージャーｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１４－ＰＦ３４を得るための、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１４へのｈＯＫＴ３－（ＩＬ１５）１－（ＴＣＯ）１ ＰＦ３４のコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１４（４．２μＬ，５０μｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中１１．９８ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ｈＯＫＴ３－（ＩＬ１５）１－（ＴＣＯ）１ ＰＦ３４（１７．１μＬ，２９μｇ，ＰＢＳ ｐＨ６．５中３９μＭ，ＩｇＧと比較して２当量）を加えた。反応物を室温で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳ消化サンプルの質量スペクトル分析は、ＰＦ３４にコンジュゲートされた架橋Ｆｃ／２フラグメントに対応する１つの主要なＦｃ／２生成物（観測質量９３６０８Ｄａ）を示し、それにより、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１４－ＰＦ３４の形成が確認された。
実施例１５０．２：２：２分子フォーマット（ＣＤＲ：ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５：抗４－１－ＢＢ）を有するｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ３５）２を得るための、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａへのＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５－（抗４－１－ＢＢ）１－（ＢＣＮ）１ ＰＦ３５のコンジュゲーション
国際公開第２０１６１７０１８６号に従って調製されたトラスツズマブ（６－Ｎ３ＧａｌＮＡｃ）２ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ（１μＬ，５６μｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中５６．１ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５－（抗４－１－ＢＢ）１－（ＢＣＮ）１ ＰＦ３５（２２μＬ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中４ｍｇ／ｍＬ，ＩｇＧと比較して４当量）を加えた。反応物を室温で１６時間インキュベートした。ＩｄｅＳ消化サンプルの質量スペクトル分析は、コンジュゲートｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－（ＰＦ３５）２に対応する７７４１３Ｄａのピーク（予想質量７７４１３Ｄａ）を示した。
実施例１５１．２：１：１分子フォーマット（ＣＤＲ：ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５：抗４－１－ＢＢ）を有するｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１４－ＰＦ３５を得るための、トラスツズマブ－テトラジンｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１４へのＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５－（抗４－１－ＢＢ）１－（ＢＣＮ）１ ＰＦ３５のコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１４（３．２μＬ，３８μｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中１１．９８ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５－（抗４－１－ＢＢ）１－（ＢＣＮ）１（ＰＦ３５ ７μＬ，４ｍｇ／ｍＬ，ＩｇＧと比較して２当量）を加えた。反応物を室温で４時間インキュベートした。ＩｄｅＳ消化サンプルの質量スペクトル分析は、コンジュゲートｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－ＸＬ１４－ＰＦ３５に対応する１０３１９９のピーク（予想質量１０３１９７Ｄａ）を示した。
実施例１５２．２：４：１分子フォーマット（ＣＤＲ：ＭＭＡＥ：ｈＯＫＴ３）を有する免疫細胞エンゲージャーアドセトリス－ｖ１ａ－ＰＦ２２を得るための、アドセトリス－ｖ１ａへのビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２２のコンジュゲーション
アドセトリス－ｖ１ａ（３．６μＬ，７５μｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中２０．７５ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ビス－ＢＣＮ－ｈＯＫＴ３ ＰＦ２２（５．１μＬ，２９μｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中１９４μＭ，ＩｇＧと比較して２当量）を加えた。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳ消化サンプルの質量スペクトル分析は、アドセトリス－ｖ１ａ－ＰＦ２２の架橋Ｆｃ／２フラグメントに対応する１つの主要生成物（観測質量７７８３７Ｄａ）を示した。
実施例１５３．２：４：１分子フォーマット（ＣＤＲ：ＭＭＡＥ：ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５）を有する免疫細胞エンゲージャーアドセトリス－ｖ１ａ－ＰＦ２７を得るための、アドセトリス－ｖ１ａへのビス－ＢＣＮ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ２７のコンジュゲーション
アドセトリス－ｖ１ａ（３．６μＬ，７５μｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中２０．７５ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ビス－ＢＣＮ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ２７（３．５μＬ，２５μｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中２８５μＭ，ＩｇＧと比較して２当量）を加えた。反応物を３７℃で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳ消化サンプルの質量スペクトル分析は、アドセトリス－ｖ１ａ－ＰＦ２７の架橋Ｆｃ／２フラグメントに対応する１つの主要生成物（観測質量７４１２６Ｄａ）を示した。
実施例１５４．２：４：１分子フォーマット（ＣＤＲ：ＤＭ１：ｈＯＫＴ３）を有する免疫細胞エンゲージャーカドサイラ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０１を得るための、カドサイラ－ｖ１ａ－１４５へのｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－テトラジンＰＦ０１のコンジュゲーション
カドサイラ－ｖ１ａ－１４５（２２μＬ，１５０μｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中６．８８ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－テトラジンＰＦ０１（８．８μＬ，５７μｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中２３０μＭ，ＩｇＧと比較して２当量）を加えた。反応物を室温で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳ消化サンプルの質量スペクトル分析は、ＰＦ０１を有する分子内架橋されたＦｃ／２－フラグメント（観測質量７８０２４Ｄａ、総Ｆｃ／２フラグメントのおよそ４０％）ならびにＰＦ０１およびＤＭ１を有する分子内架橋されたＦｃ／２－フラグメント（観測質量７８９８５Ｄａ、総Ｆｃ／２フラグメントのおよそ６０％）に対応する２つの主要生成物を示し、それによって、カドサイラ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０１の形成が確認された。
実施例１５５．２：１分子フォーマット（ＣＤＲ：ｈＯＫＴ３）を有するＴ細胞エンゲージャーｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０２を得るための、リツキシマブ－ＢＣＮ ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５へのｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２３－テトラジンＰＦ０２のコンジュゲーション
ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５（２４７μＬ，６．３ｍｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中１７１μＭ）の溶液に、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ２３－テトラジンＰＦ０２（２６２μＬ，２．０ｍｇ，ＰＢＳ ｐＨ６．５中２６７μＭ，ＩｇＧと比較して１．７当量）を加えた。反応物を室温で一晩インキュベートした後、移動相としてＰＢＳ ｐＨ７．４を使用してＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ－１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、単一のｈＯＫＴ３にコンジュゲートされた抗体からなる１つの主要生成物を示し（図２４の左パネルのレーン７を参照のこと）、それにより、ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０２の形成が確認された。さらに、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、単一のｈＯＫＴ３にコンジュゲートされた２つの重鎖に対応する１つの主要なＨＣ生成物が確認された（図２４の右のパネルのレーン７を参照のこと）。
実施例１５６．２：１：１分子フォーマット（ＣＤＲ：ｈＯＫＴ３：ＭＭＡＥ）を有するｒｉｔ－ｖ１０－［１４５－ＰＦ０２］－［ＬＤ０９］を得るためのｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０２へのビス－マレイミド－ＭＭＡＥ（ＬＤ０９）のマレイミドコンジュゲーション
Ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０２（０．７ｍｇ，ＰＢＳ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡ中７．３４ｍｇ／ｍＬ）を０．８μＬの１０ｍＭ ＴＣＥＰと３７℃で２時間インキュベートした。反応混合物の一部（１３．６μＬ）に、ビスマレイミド－ＭＭＡＥ（ＬＤ０９）（１．７μＬ，ＤＭＦ中１ｍＭ）を加え、室温で３時間インキュベートした。ＤＴＴ還元後のサンプルの質量スペクトル分析は、予想生成物Ｒｉｔ－ｖ１０－［１４５－ＰＦ０２］－［ＬＤ０９］に対応する１つの主要なＨＣ生成物（観測質量１３０８９５Ｄａ）を示した。
実施例１５７．中間体ｒｉｔ－ｖ１０－［１４５－ＰＦ０２］－［ＸＬ０１］を得るための、ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０２へのビス－マレイミド－ＢＣＮ（ＸＬ０１）のマレイミドコンジュゲーション
Ｒｉｔ－ｖ１ａ－１４５－ＰＦ０２（０．７ｍｇ，ＰＢＳ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡ中７．３４ｍｇ／ｍＬ）を０．８μＬの１０ｍＭ ＴＣＥＰと３７℃で２時間インキュベートした。反応混合物の一部（８４μＬ）に、ビス－マレイミド－ＢＣＮ（ＸＬ０１）（１０．３μＬ，ＤＭＦ中１ｍＭ）を加え、室温で３時間インキュベートした後、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １００ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて９．８ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、予想生成物Ｒｉｔ－ｖ１０－［１４５－ＰＦ０２］－［ＸＬ０１］の形成が確認された（図２６を参照のこと）。
実施例１５８．２：１：１分子フォーマット（ＣＤＲ：ｈＯＫＴ３：ＩＬ１５）を有するｒｉｔ－ｖ１０－［１４５－ＰＦ０２］－［ＸＬ０１－ＰＦ１９］を得るためのＲｉｔ－ｖ１０－［１４５－ＰＦ０２］－［ＸＬ０１］へのアジド－ＩＬ１５ ＰＦ１９のコンジュゲーション
Ｒｉｔ－ｖ１０－［１４５－ＰＦ０２］－［ＸＬ０１］（９．８μＬ，ＰＢＳ中９．８ｍｇ／ｍＬ）をアジド－ＩＬ１５ ＰＦ１９（４．４９μＬ，ＰＢＳ ｐＨ７．５中７．２ｍｇ／ｍＬ）と室温で一晩インキュベートした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、予想生成物Ｒｉｔ－ｖ１０－［１４５－ＰＦ０２］－［ＸＬ０１－ＰＦ１９］の形成が確認された（図２６を参照のこと）。
実施例１５９．２：１：１分子フォーマット（ＣＤＲ：ｈＯＫＴ３：ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５）を有するＲｉｔ－ｖ１０－［１４５－ＰＦ０２］－［ＸＬ０１－ＰＦ１３］を得るための、ｒｉｔ－ｖ１０－［１４５－ＰＦ０２］－［ＸＬ０１］へのアリールアジド－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ１３のコンジュゲーション
Ｒｉｔ－ｖ１０－［１４５－ＰＦ０２］－［ＸＬ０１］（９．８μＬ，ＰＢＳ中９．８ｍｇ／ｍＬ）をアリールアジド－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ１３（１０．６μＬ，ＰＢＳ ｐＨ７．５中２．６ｍｇ／ｍＬ）と室温で一晩インキュベートした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、予想生成物Ｒｉｔ－ｖ１０－［１４５－ＰＦ０２］－［ＸＬ０１－ＰＦ１３］の形成が確認された（図２６を参照のこと）。
実施例１６０．２：１分子フォーマット（ＣＤＲ：ＭＭＡＦ）および未反応アジドを有する中間体ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－（ＬＤ１０）１を得るための、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５へのビス－アジド－ＭＭＡＦ ＬＤ１０のコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５（１５０μＬ，１ｍｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中６．７ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ビス－アジド－ＭＭＡＦ（ＬＤ１０，５０μＬ，ＤＭＦ中１．３３ｍＭ溶液，ＩｇＧと比較して１０当量）を加えた。反応物を室温で１６時間インキュベートした後、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて２０．７ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳ ｐＨ７．４に緩衝液交換した。ＩｄｅＳ消化サンプルの質量スペクトル分析は、分子内架橋を介して得られたコンジュゲートされたＡＤＣ ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－（ＬＤ１０）１に対応する１つの主要生成物（観測質量５１４５５Ｄａ）を示した。
実施例１６１．２：１：１分子フォーマット（ＣＤＲ：ＭＭＡＦ：ＩＬ１５）を有するｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－（ＬＤ１０）１－（ＰＦ３３）１を得るための、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－（ＬＤ１０）１へのＢＣＮ－ＩＬ１５ ＰＦ３３のコンジュゲーション
Ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－（ＬＤ１０）１（０．０７５ｍｇ，ＰＢＳ中２０．７ｍｇ／ｍＬ）をＢＣＮ－ＩＬ１５（ＰＦ３３）（３．６９μＬ，ＰＢＳ ｐＨ７．５中８．２ｍｇ／ｍＬ）と室温で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳ処理後のサンプルの質量スペクトル分析は、予想生成物ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－（ＬＤ１０）１－（ＰＦ３３）１に対応する１つの主要なＦｃ／２生成物（観測質量６６４７２Ｄａ）を示した。
実施例１６２．２：１：１分子フォーマット（ＣＤＲ：ＭＭＡＦ：ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５）を有するｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－（ＬＤ１０）１－（ＰＦ１５）１を得るためのｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－（ＬＤ１０）１へのＢＣＮ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ１５のコンジュゲーション
Ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－（ＬＤ１０）１（０．０７５ｍｇ，ＰＢＳ中２０．７ｍｇ／ｍＬ）をＢＣＮ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５ ＰＦ１５（７．４７μＬ，ＰＢＳ ｐＨ７．５中６．７ｍｇ／ｍＬ）と室温で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳ処理後のサンプルの質量スペクトル分析は、予想生成物ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－（ＬＤ１０）１－（ＰＦ１５）１に対応する１つの主要なＦｃ／２生成物（観測質量７６４９４Ｄａ）を示した。
実施例１６３．２：１：１分子フォーマット（ＣＤＲ：ＭＭＡＦ：ｈＯＫＴ３）を有するｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－（ＬＤ１０）１－（２０１）１を得るための、ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－（ＬＤ１０）１へのｈＯＫＴ３－ＢＣＮ（２０１）のコンジュゲーション
Ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－（ＬＤ１０）１（０．０７５ｍｇ，ＰＢＳ中２０．７ｍｇ／ｍＬ）をｈＯＫＴ３－ＢＣＮ ２０１（５．２５μＬ，ＰＢＳ ｐＨ５．５中１１ｍｇ／ｍＬ）と室温で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳ処理後のサンプルの質量スペクトル分析は、予想生成物ｔｒａｓｔ－ｖ１ａ－１４５－（ＬＤ１０）１－（２０１）１に対応する１つの主要なＦｃ／２生成物（観測質量７９２８０Ｄａ）を示した。
実施例１６４．２：１分子フォーマット（ＣＤＲ：ｈＯＫＴ３）を有する中間体ｔｒａｓｔ－ｖ９ａ－１４５－ＰＦ０１を得るための、ｔｒａｓｔ－ｖ９ａ－１４５へのｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－テトラジンＰＦ０１のコンジュゲーション
ｔｒａｓｔ－ｖ９ａ－１４５（１２７μＬ，１．２ｍｇ，ＰＢＳ ｐＨ７．４中７．８８ｍｇ／ｍＬ）の溶液に、ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－テトラジンＰＦ０１（５９μＬ，０．４ｍｇ，ＰＢＳ ｐＨ６．５中２３０μＭ，ＩｇＧと比較して２当量）を加えた。反応物を室温で一晩インキュベートした。ＩｄｅＳ消化サンプルの質量スペクトル分析は、両方のＣｙｓ２３９残基がシステインとジスルフィドを形成しているｔｒａｓｔ－ｖ９ａ－１４５－ＰＦ０１の架橋Ｆｃ／２フラグメントに対応する１つの主要Ｆｃ／２生成物（観測質量７８２９７Ｄａ）を示した。ｔｒａｓｔ－ｖ９ａ－１４５－ＰＦ０１を、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １００ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡでスピン濾過して、残留ｈＯＫＴ３－ＰＥＧ１１－テトラジンＰＦ０１を除去した。
２：１：１分子フォーマット（ＣＤＲ：ｈＯＫＴ３；ＭＭＡＥ）を有するｔｒａｓｔ－ｖ９ｂ－［１４５－ＰＦ０１］－［ＬＤ０９］を得るための、ビス－ｍａｌ－ＭＭＡＥ ＬＤ０９によるｔｒａｓｔ－ｖ９ａ－１４５－ＰＦ０１の分子内架橋
Ｔｒａｓｔ－ｖ９ａ－１４５－ＰＦ０１（０．８５ｍｇ，ＰＢＳ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡ中１７ｍｇ／ｍＬ）をＴＣＥＰ（４．９μＬ，ＭＱ中１０ｍＭ）と３７℃で２時間インキュベートした。還元抗体を、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ ＭＷＣＯ １０ｋＤａ，Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＰＢＳ＋１０ｍＭ ＥＤＴＡでスピン濾過し、５０μＬに希釈した。その後、ＤＨＡ（４．９μＬ，ＭＱ：ＤＭＳＯ（９：１）中１０ｍＭ）を加え、反応物を室温で３時間インキュベートした。反応混合物の一部（０．１７ｍｇ，１０μＬ）に、ビス－ｍａｌ－ＭＭＡＥ ＬＤ０９（１．５μＬ，ＤＭＦ中２ｍＭ，３当量）を加えた後、室温で１．５時間インキュベートした。ＩｄｅＳ処理後のサンプルの質量スペクトル分析は、予想生成物ｔｒａｓｔ－ｖ９ｂ－［１４５－ＰＦ０１］－［ＬＤ０９］に対応する１つの主要なＦｃ／２生成物（観測質量７９８５７Ｄａ）を示した。
配列表
Ｃ末端ソルターゼＡ認識配列（配列番号１）の配列同定：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ
ソルターゼＡ（配列番号２）の配列同定：
ＴＧＳＨＨＨＨＨＨＧＳＫＰＨＩＤＮＹＬＨＤＫＤＫＤＥＫＩＥＱＹＤＫＮＶＫＥＱＡＳＫＤＫＫＱＱＡＫＰＱＩＰＫＤＫＳＫＶＡＧＹＩＥＩＰＤＡＤＩＫＥＰＶＹＰＧＰＡＴＰＥＱＬＮＲＧＶＳＦＡＥＥＮＥＳＬＤＤＱＮＩＳＩＡＧＨＴＦＩＤＲＰＮＹＱＦＴＮＬＫＡＡＫＫＧＳＭＶＹＦＫＶＧＮＥＴＲＫＹＫＭＴＳＩＲＤＶＫＰＴＤＶＧＶＬＤＥＱＫＧＫＤＫＱＬＴＬＩＴＣＤＤＹＮＥＫＴＧＶＷＥＫＲＫＩＦＶＡＴＥＶＫ
Ｈｉｓ６－ＴＥＶ部位－ＧＧＧ－ＩＬ１５Ｒα－ＩＬ１５（配列番号３）の配列同定：
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＥＮＬＹＦＱＧＧＧＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
抗４－１ＢＢ ＰＦ３１（配列番号４）の配列同定：
ＤＩＶＭＴＱＳＰＰＴＬＳＬＳＰＧＥＲＶＴＬＳＣＲＡＳＱＳＩＳＤＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＤＧＨＳＦＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＳＳＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＥＩＮＰＧＮＧＨＴＮＹＳＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＶＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＦＴＴＡＲＡＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＰＥＴＧＧＨＨＨＨＨＨ
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５（ＰＦ１８）（配列番号５）の配列同定：
ＳＹＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
ＳＹＲ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ１５Ｒα－リンカー－ＩＬ１５（ＰＦ２６）（配列番号６）の配列同定：
ＳＹＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ

Claims (23)

  1. 少なくとも１つの抗体Ａｂと、２つの別個のペイロードＤ１およびＤ２と、を含む多機能性抗体構築物であって、前記構築物は、構造（１）または（２）：
    Figure 2024506022000082
    を有し、式中、
    Ａｂは、抗体であり；
    Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４およびＬ５は、リンカーであり；
    ｘ１およびｘ２は、それぞれ個別に１～８の範囲の整数であり、ｘ１＋ｘ２＝２～１０であり；
    ＢＭは、分枝部分であり；
    ｍおよびｎは、それぞれ独立して、０または１であり；
    ｘ３は、１～４の範囲の整数であり；
    Ｄ１およびＤ２は、ポリペプチド、小分子、細胞毒およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される２つの別個のペイロードであり、Ｄ１およびＤ２の少なくとも１つは、ポリペプチドである、多機能性抗体構築物。
  2. 前記ポリペプチドが、Ｆａｂ、ＶＨＨ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ミニボディ、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アトリマー、ファイノマー、Ｃｙｓ－ノット、ＤＡＲＰｉｎ、アドネクチン／セントリイン、ノッチン、アンチカリン、ＦＮ３、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、ＯＢｏｄｙ、二環式ペプチドおよび三環式ペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の多機能性抗体構築物。
  3. 前記ポリペプチドが、免疫細胞エンゲージャー、チェックポイント阻害剤、および細胞表面受容体の結合剤から選択され、好ましくは、前記ポリペプチドが、免疫細胞結合ポリペプチドまたはチェックポイント阻害ポリペプチドである、請求項１または２に記載の多機能性抗体構築物。
  4. 前記ポリペプチドが、免疫細胞結合ポリペプチドまたはチェックポイント阻害ポリペプチドであり、好ましくは、
    前記免疫細胞結合ポリペプチドは、Ｔ細胞上の細胞受容体に特異的であり、好ましくは、Ｔ細胞上の前記細胞受容体は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４、ＣＤ２７、Ｖγ９Ｖδ２およびＩＣＯＳからなる群から選択されるか；または
    前記免疫細胞結合ポリペプチドは、ＮＫ細胞上の細胞受容体に特異的であり、好ましくは、ＮＫ細胞上の前記細胞受容体は、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ２８、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＫＩＲ、ＤＮＡＭ－１およびＣＤ１６１からなる群から選択されるか；または
    前記免疫細胞結合ポリペプチドは、単球またはマクロファージ上の細胞受容体に特異的であり、好ましくは、前記単球またはマクロファージ上の前記細胞受容体は、ＣＤ６４であるか；または
    前記免疫細胞結合ポリペプチドは、顆粒球上の細胞受容体に特異的であり、好ましくは、前記顆粒球上の前記細胞受容体は、ＣＤ８９であり；
    前記免疫細胞結合ポリペプチドは、ＩＬ２またはＩＬ１５に特異的であるか；または
    前記チェックポイント阻害ポリペプチドは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３またはＶＩＳＴＡに特異的である、
    請求項３に記載の多機能性抗体構築物。
  5. 前記ポリペプチドが、ＯＫＴ３、Ｌ２Ｋ、ＵＣＨＴ１、ＢＭＡ０３１、ＶＨＨ６Ｈ４、ＩＬ２、ＩＬ１５、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒ複合体、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒ融合物、ＩＬ２に特異的な抗体およびＩＬ１５に特異的な抗体からなる群から選択され、好ましくは、前記ポリペプチドは、ＯＫＴ３、Ｌ２Ｋ、ＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒ融合物、ＩＬ１５、ｍＡｂ６０２、Ｎａｒａ１またはＴＣＢ２である、請求項１～４のいずれかに記載の多機能性抗体構築物。
  6. Ｌ１および／もしくはＬ２、またはＬ３が、構造（Ｌ－Ａ）：
    Figure 2024506022000083
    を有し、式中、
    ＊とラベルされた結合は、前記抗体Ａｂの２つの別個のアミノ酸に接続され、＊＊とラベルされた結合は、Ｄ１；Ｄ２またはＢＭに接続され；
    Ｌ６、Ｌ７およびＬ８は、リンカーであり；
    ｐおよびｑは、それぞれ個別に１または０であり；
    ＢＭ１は、分枝部分であり；
    Ｚは、接続基である、
    請求項１～５のいずれかに記載の多機能性抗体構築物。
  7. 各リンカーが、直鎖状または分枝状のＣ１－Ｃ２００アルキレン基、Ｃ２－Ｃ２００アルケニレン基、Ｃ２－Ｃ２００アルキニレン基、Ｃ３－Ｃ２００シクロアルキレン基、Ｃ５－Ｃ２００シクロアルケニレン基、Ｃ８－Ｃ２００シクロアルキニレン基、Ｃ７－Ｃ２００アルキルアリーレン基、Ｃ７－Ｃ２００アリールアルキレン基、Ｃ８－Ｃ２００アリールアルケニレン基、Ｃ９－Ｃ２００アリールアルキニレン基およびそれらの組み合わせからなる群から個別に選択され、前記アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、シクロアルキレン基、シクロアルケニレン基、シクロアルキニレン基、アルキルアリーレン基、アリールアルキレン基、アリールアルケニレン基およびアリールアルキニレン基は、置換されていてもよく、１つ以上のヘテロ原子によって中断されていてもよく、好ましくは、前記ヘテロ原子は、Ｏ、Ｓ（Ｏ）ｙおよびＮＲ１２からなる群から選択され、ここで、ｙは、０、１または２であり、Ｒ１２は、独立して、水素、ハロゲン、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ６－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ７－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ７－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の多機能性抗体構築物。
  8. Ｌ１および／もしくはＬ２またはＬ４および／もしくはＬ５が、腫瘍リソソームまたは腫瘍微小環境において切断可能であり、前記切断可能リンカーが、好ましくは、構造（２６）：
    Figure 2024506022000084
    のペプチドスペーサーを含み、
    式中、Ｒ１７は、アミノ酸側鎖を表し、ｎは、１～１０の範囲の整数であり、好ましくは、前記リンカーは、ＦＡＰ、カテプシン、グランザイム、カスパーゼ、カリクレイン、プロタンパク質転換酵素サブチリシン、フューリン、エラスターゼ、レグマイン、線維芽細胞活性化タンパク質、組織型プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼおよびマトリプターゼの群から選択される存在するタンパク質分解酵素によって切断可能であり、かつ／または前記ペプチドスペーサーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、Ｖａｌ－Ｇｌｎ、ＡｃＬｙｓ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ、ＡｃＬｙｓ－Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ｇｌｎ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｌｅｕ－Ｇｌｎ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ａｌａ－Ａｓｎ、Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ、Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｈｉｓ、Ｐｒｏ－Ｖａｌ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｇｌｙ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－ＧｌｙおよびＬｙｓから選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の多機能性抗体構築物。
  9. Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６およびＬ７のそれぞれが、構造－（Ｌ２１）ｎ－（Ｌ２２）ｏ－（Ｌ２３）ｐ－（Ｌ２４）ｑ－を有し、Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３およびＬ２４は、一体となってリンカーＬ４、Ｌ５、Ｌ６およびＬ７を形成するリンカーであり；ｎ、ｏ、ｐおよびｑは、個別に０または１であり、
    （ａ）リンカーＬ２１は、－（Ｗ）ｋ１－（Ａ）ｄ１－（Ｂ）ｅ１－（Ａ）ｆ１－（Ｂ）ｇ１－Ｃ（Ｏ）－によって表され、式中、
    ｄ１＝０または１であり；
    ｅ１＝１～１０の範囲の整数であり；
    ｆ１＝０または１であり；
    ｇ１＝０～１０の範囲の整数であり；
    ｋ１＝０または１であるが、但し、ｋ１＝１の場合、ｄ１＝０であり；
    Ａは、構造（２３）に記載のスルファミド基であり、
    Figure 2024506022000085
    式中、ａ１＝０または１であり、Ｒ１３は、水素、Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ３－Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基からなる群から選択され、前記Ｃ１－Ｃ２４アルキル基、Ｃ３－Ｃ２４シクロアルキル基、Ｃ２－Ｃ２４（ヘテロ）アリール基、Ｃ３－Ｃ２４アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３－Ｃ２４（ヘテロ）アリールアルキル基は、Ｏ、ＳおよびＮＲ１４から選択される１つ以上のヘテロ原子によって、置換されていてもよく、中断されていてもよく、ここで、Ｒ１４は、独立して、水素およびＣ１－Ｃ４アルキル基からなる群から選択されるか、またはＲ１３は、場合によってはスペーサー部分を介して、Ｎに接続されたＤであり；
    Ｂは、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－または－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－部分であるか、または（Ｂ）ｅ１は、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｅ３－ＣＨ２－ＣＨ２－部分であり、ここで、ｅ３は、ｅ１と同じように定義され；
    Ｗは、－ＯＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）ＮＨ－、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ－または－（４－Ｐｈ）ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ－であり、ここで、ｍは、０～１０の範囲の整数であり；
    （ｂ）リンカーＬ２２は、ペプチドスペーサー、好ましくは、ジペプチドであり、ここで、Ｌ２２は、一般構造（２７）：
    Figure 2024506022000086
    によって表され、式中、Ｒ１７＝ＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２であり；
    （ｃ）リンカーＬ２３は、自己犠牲スペーサー、好ましくは、構造（２５）に記載のパラ－アミノベンジルオキシ（ＰＡＢ）誘導体であり、
    Figure 2024506022000087
    式中、
    Ａは、置換されていてもよい５員または６員の芳香環または芳香族複素環であり；
    ｂは、０または１であり；
    Ｒ３は、Ｈ、Ｒ４またはＣ（Ｏ）Ｒ４であり、ここで、Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ２４（ヘテロ）アルキル基、Ｃ３－Ｃ１０（ヘテロ）シクロアルキル基、Ｃ２－Ｃ１０（ヘテロ）アリール基、Ｃ３－Ｃ１０アルキル（ヘテロ）アリール基およびＣ３－Ｃ１０（ヘテロ）アリールアルキル基であり、これらは、Ｏ、ＳおよびＮＲ５から選択される１つ以上のヘテロ原子によって、置換されていてもよく、中断されていてもよく、ここで、Ｒ５は、独立して、水素およびＣ１－Ｃ４アルキル基からなる群から選択され、
    好ましくは、Ｒ３は、ＨまたはＣ（Ｏ）Ｒ４であり、ここで、Ｒ４＝４－メチル－ピペラジンまたはモルホリンであり、最も好ましくは、Ｒ３は、Ｈであり；
    （ｄ）リンカーＬ２４は、構造－Ｎ－（Ｃｘ－アルキレン）－Ｃ（Ｏ）－に記載のアミノアルカン酸スペーサーであり、ここで、ｘは、１～１０の範囲の整数であるか；または
    リンカーＬ２４は、構造－Ｎ－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）ｅ６－（ＣＨ２）ｅ７－Ｃ（Ｏ）－に記載のエチレングリコールスペーサーであり、ここで、ｅ６は、１～１０の範囲の整数であり、ｅ７は、１～３の範囲の整数である、
    請求項１～８のいずれか一項に記載の多機能性抗体構築物。
  10. リンカーＬ１、Ｌ２およびＬ３が、コンジュゲーション反応によって入手可能な接続基Ｚを含み、好ましくは、コンジュゲーション反応によって個別に入手でき、好ましくは、求核反応および付加環化から選択されるコンジュゲーション反応によって入手可能な接続基Ｚを含み、好ましくは、前記付加環化は、［４＋２］付加環化または１，３－双極子付加環化であるか、または前記求核反応は、マイケル付加または求核置換である、請求項１～９のいずれかに記載の多機能性抗体構築物。
  11. 各接続基が、トリアゾール、シクロヘキセン、シクロヘキサジエン、［２．２．２］－ビシクロオクタジエン、［２．２．２］－ビシクロオクテン、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、ピラゾリン、ピペラジン、チオエーテル、スクシンイミジル環もしくは開環コハク酸アミド、アミドまたはイミド基を含む、請求項１０に記載の多機能性抗体構築物。
  12. Ｌ１およびＬ２の少なくとも一方、好ましくは両方が、構造（Ｌ－Ｂ）または（Ｌ－Ｃ）：
    ＊－ＧｌｃＮＡｃ（Ｆｕｃ）ｄ－（Ｇ）ｅ－Ｓｕ－Ｚ－（Ｌ２１）ｎ－（Ｌ２２）ｏ－（Ｌ２３）ｐ－（Ｌ２４）ｑ－＊＊
    （Ｌ－Ｂ）
    ＊－Ｚ－（Ｌ２１）ｎ－（Ｌ２２）ｏ－（Ｌ２３）ｐ－（Ｌ２４）ｑ－＊＊
    （Ｌ－Ｃ）
    を有し、式中、
    ＊とラベルされた結合は、前記抗体Ａｂの２つの別個のアミノ酸に接続され、＊＊とラベルされた結合は、Ｄ１またはＤ２に接続され；
    ｄ、ｎ、ｏ、ｐおよびｑは、それぞれ独立して、０または１であり；
    ｅは、０～１０の範囲の整数であり；
    Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３およびＬ２４は、請求項９において定義されたリンカーであり；
    Ｓｕは、単糖であり；
    Ｇは、単糖部分であり；
    ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミン部分であり；
    Ｆｕｃは、フコース部分であり；
    Ｚは、接続基である、
    請求項１～１１のいずれかに記載の多機能性抗体構築物。
  13. Ｌ４およびＬ５が、構造（Ｌ－Ｃ）
    ＊＊－（Ｌ２１）ｎ－（Ｌ２２）ｏ－（Ｌ２３）ｐ－（Ｌ２４）ｑ－＊＊＊
    （Ｌ－Ｄ）
    を有し、式中、
    ＊＊とラベルされた結合は、ＢＭに接続され、＊＊＊とラベルされた結合は、Ｄ１またはＤ２に接続され；
    ｎ、ｏ、ｐおよびｑは、それぞれ独立して、０または１であり；
    Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３およびＬ２４は、請求項９において定義されたリンカーであり；
    前記リンカーＬ４およびＬ５は、連結単位Ｌ２１、Ｌ２２、Ｌ２３およびＬ２４のいずれかの接合点に接続基Ｚをさらに含んでいてもよい、
    請求項１～１２のいずれかに記載の多機能性抗体構築物。
  14. 構造（３）：
    Figure 2024506022000088
    （式中、
    ｄおよびｐは、それぞれ独立して、０または１であり；
    ｅは、０～１０の範囲の整数であり；
    Ｌ６およびＬ７は、リンカーであり；
    ＢＭ１は、分枝部分であり；
    Ｓｕは、単糖であり；
    Ｇは、単糖部分であり；
    ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミン部分であり；
    Ｆｕｃは、フコース部分であり；
    Ｚ１は、接続基である。）
    を有する、請求項１～１１のいずれかに記載の多機能性抗体構築物。
  15. 構造（４）：
    Figure 2024506022000089
    （式中、
    ｄおよびｐは、それぞれ独立して、０または１であり；
    ｅは、０～１０の範囲の整数であり；
    Ｌ６、Ｌ７およびＬ１４は、リンカーであり；
    ＢＭ１は、分枝部分であり；
    Ｓｕは、単糖であり；
    Ｇは、単糖部分であり；
    ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミン部分であり；
    Ｆｕｃは、フコース部分であり；
    Ｚ１およびＺ２は、接続基である。）
    を有する、請求項１～１１のいずれかに記載の多機能性抗体構築物。
  16. 構造（５）：
    Figure 2024506022000090
    （式中、
    各ｄは、独立して０または１であり；
    ｅは、０～１０の範囲の整数であり；
    Ｌ１５およびＬ１６は、リンカーであり；
    Ｓｕは、単糖であり；
    Ｇは、単糖部分であり；
    ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミン部分であり；
    Ｆｕｃは、フコース部分であり；
    Ｚ１およびＺ２は、接続基であり；
    ｘ１およびｘ２は、それぞれ独立して、１、２または３である。）
    を有する、請求項１～１１のいずれかに記載の多機能性抗体構築物。
  17. 構造（６）：
    Figure 2024506022000091
    （式中、
    各ｄは、独立して０または１であり；
    ｅは、０～１０の範囲の整数であり；
    Ｌ１４およびＬ１５は、リンカーであり；
    Ｓｕは、単糖であり；
    Ｇは、単糖部分であり；
    ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミン部分であり；
    Ｆｕｃは、フコース部分であり；
    Ｚ１およびＺ２は、接続基であり；
    ｘ１は、１～４の範囲の整数である。）
    を有する、請求項１～１１のいずれかに記載の多機能性抗体構築物。
  18. 構造（７）：
    Figure 2024506022000092
    （式中、
    各ｄは、独立して０または１であり；
    ｅは、０～１０の範囲の整数であり；
    Ｌ１７は、リンカーであり；
    ＢＭは、分枝部分であり；
    Ｓｕは、単糖であり；
    Ｇは、単糖部分であり；
    ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ－アセチルグルコサミン部分であり；
    Ｆｕｃは、フコース部分であり；
    Ｚは、接続基である。）
    を有する、請求項１～１１のいずれかに記載の多機能性抗体構築物。
  19. （ｉ）Ｄ１が、ＣＤ３標的化ポリペプチドであり、Ｄ２が、ＣＤ２８標的化ポリペプチドであるか；
    （ｉｉ）Ｄ１が、ＩＬ１５またはＩＬ１５標的化ポリペプチドであり、Ｄ２が、ＣＤ１６標的化ポリペプチドであるか；
    （ｉｉｉ）Ｄ１が、ＩＬ２またはＩＬ２標的化ポリペプチドであり、Ｄ２が、ＣＤ１６標的化ポリペプチドであるか；
    （ｉｖ）Ｄ１が、ＮＫｐ４６標的化ポリペプチドであり、Ｄ２が、ＣＤ１６標的化ポリペプチドであるか；
    （ｖ）Ｄ１が、細胞毒であり、Ｄ２が、チェックポイント阻害剤であり、好ましくは、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１を標的とするポリペプチドから選択されるか；
    （ｖｉ）Ｄ１が、ＯＸ４０標的化ポリペプチドであり、Ｄ２が、ＣＤ１３７標的化ポリペプチドであるか；
    （ｖｉｉ）Ｄ１が、ＰＤ－Ｌ１標的化ポリペプチドであり、Ｄ２が、ＣＤ１３７標的化ポリペプチドであるか；
    （ｖｉｉｉ）Ｄ１が、細胞毒であり、Ｄ２が、ＩＬ１５またはＩＬ１５標的化ポリペプチドであるか；
    （ｉｘ）Ｄ１が、細胞毒であり、Ｄ２が、ＩＬ２またはＩＬ２標的化ポリペプチドであるか；
    （ｘ）Ｄ１が、細胞毒であり、Ｄ２が、ＣＤ１６標的化ポリペプチドであるか；または
    （ｘｉ）Ｄ１が、ＴＬＲ７－アゴニストまたはＴＲＬ８－アゴニストであり、Ｄ２が、ＣＤ１６標的化ポリペプチドである、
    請求項１～１８のいずれか一項に記載の多機能性抗体構築物。
  20. 前記抗体Ａｂが、腫瘍細胞上の細胞外受容体に特異的であり、好ましくは、前記腫瘍細胞上の前記細胞外受容体は、５Ｔ４、ＡＤＡＭ－９、ＡＭＨＲＩＩ、ＡＳＣＴ２、ＡＳＬＧ６５９、ＡＳＰＨＤ１、ａｖ－インテグリン、Ａｘｌ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＢＣＭＡ、ＢＭＰＲ１Ｂ、ブレビカン、ｃ－ＫＩＴ、ｃ－Ｍｅｔ、Ｃ４．４ａ、ＣＡ－ＩＸ、カドヘリン－６、ＣａｎＡｇ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８／シンデカン－１、ＣＤ１６６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０５、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２２８、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２４、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４８ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＥＡＣＡＭ５、クローディン－１８．２、クローディン－６、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＬＬ－１、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲＩＰＴＯ、ＣＳ１、ＣＸＣＲ５、ＤＬＫ－１、ＤＬＬ３、ＤＰＥＰ３、Ｅ１６、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ２Ｒ、ＥＴＢＲ、ＦＡＰ、ＦｃＲＨ１、ＦｃＲＨ２、ＦｃＲＨ５、ＦＧＦＲ２、フィブロネクチン、ＦＬＴ３、葉酸受容体アルファ、Ｇａｌ－３ＢＰ、ＧＤ３、ＧＤＮＦ－Ｒａ１、ＧＥＤＡ、ＧＦＲＡ１、Ｇｌｏｂｏ Ｈ、ｇｐＮＭＢ、ＧＰＲ１７２Ａ、ＧＰＲ１９、ＧＰＲ５４、グアニルシクラーゼＣ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ２０Ｒα、Ｌｅｗｉｓ Ｙ、ＬＧＲ５、ＬＩＶ－１、ＬＲＲＣ１５、ＬＹ６４、Ｌｙ６Ｅ、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ、ＬＹ６Ｋ、ＭＤＰ、ＭＦＩ２、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＭＯＳＰＤ２、ＭＰＦ、ＭＳＧ７８３、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮａＰｉ２ｂ、ＮＣＡ、ネクチン－４、Ｎｏｔｃｈ３、Ｐ－カドヘリン、Ｐ２Ｘ５、ＰＤ－Ｌ１、ＰＭＥＬ１７、ＰＲＬＲ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣＡ ｈｌｇ、ＰＳＭＡ、ＰＴＫ７、ＲＥＴ、ＲＮＦ４３、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、Ｓｅｍａ ５ｂ、ＳＬＩＴＲＫ６、ＳＳＴＲ２、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ７２、ＴＥＮＢ２、ＴＦ、ＴＩＭ－１、ＴＭ４ＳＦ、ＴＭＥＦＦ、ＴＭＥＭ１１８、ＴＭＥＭ４６、トランスフェリン、ＴＲＯＰ－２、ＴｒｐＭ４、ＴＷＥＡＫＲ、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、テネイシンからなる群から選択される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の多機能性抗体構築物。
  21. 医薬において使用するための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の多機能性抗体構築物。
  22. 癌、ウイルス感染症、細菌感染症、神経疾患、自己免疫疾患、眼疾患、高コレステロール血症およびアミロイドーシスの治療において、好ましくは癌の治療において使用するための、請求項１～２０のいずれか一項に記載の多機能性抗体構築物。
  23. 請求項１～２０のいずれか一項に記載の多機能性抗体構築物と、薬学的に許容され得る担体と、を含む医薬組成物。
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