BR112019024745B1 - Anticorpo anti-hil-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo,ácido nucleico, vetor recombinante, célula procariótica transformada, método para a produção de um anticorpo anti-hil-2 ou um fragmento do mesmo e complexo - Google Patents

Abstract

a presente invenção se refere a um anticorpo que se liga à interleucina-2 humana (hil-2) e, mais particularmente, a um anticorpo anti-hil-2 que se liga especificamente a um epítopo específico de hil-2, inibindo a ligação da hil-2 a cd25. o anticorpo anti-hil-2 da presente invenção se liga especificamente a um epítopo específico de hil-2, inibindo a ligação da hil-2 a cd25, minimizando a expansão das células treg e estimulando as células t cd8+ e células nk que exibem atividade antitumoral. portanto, o anticorpo anti-hil-2 da presente invenção é útil como um novo agente terapêutico anticâncer.

Description

Campo técnico

[0001] A presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga a interleucina-2 humana (hIL-2) e, mais particularmente, a um anticorpo anti-hIL-2 que se liga especificamente a um epítopo particular de hIL-2, inibindo deste modo a ligação da hIL-2 a CD25.

Antecedentes da Invenção

[0002] A interleucina-2 (IL-2) é uma citocina pleiotrópica que desempenha um papel essencial na sobrevivência, expansão e função de vários linfócitos, incluindo Treg (reguladoras T Foxp3+ CD4+), células naturais assassinas (células NK) e semelhantes, que expressam o receptor de IL-2. O receptor de interleucina-2 (IL-2R) está presente na forma de receptor de IL-2 de alta afinidade (IL-2R) e de receptor de IL-2 de baixa afinidade (IL- 2R) dependendo de sua afinidade. O receptor de IL-2 de alta afinidade é constituído por três cadeias, IL-2RYC (CD132), IL-2Rβ (CD122) e IL-2Rα (CD25), e o receptor de IL-2 de baixa afinidade consiste apenas em cadeias IL-2RYC e IL-2Rβ (Boyman, O., et al, Nat Rev Immunol, 2012. 12(3): p. 180-90).

[0003] Uma vez que a IL-2 estimula as células T de CD8+ e células NK com atividade antitumoral, foi clinicamente utilizada nos EUA e na Europa nos anos 1990 para o tratamento do melanoma metastático e câncer renal metastático (Rosenberg, S.A., J Immunol, 2014. 192(12): p. 5451-8). No entanto, a terapia de IL-2 foi eficaz em apenas menos de 10% dos doentes com câncer que receberam a terapia, e envolvidos em efeitos colaterais graves. Isto é porque a IL-2 administrada tem uma meia-vida muito curta in vivo e as células T de CD8+ e as células NK com atividade antitumoral expressam o receptor de IL-2 de baixa afinidade e, assim, a administração de uma grande quantidade de IL-2 é requerida. Por esta razão, as doenças graves de múltiplos órgãos são causadas por síndrome de vazamento vascular e hipotensão (Lotze, M. T., et al., J Immunol, 1985. 134(1): p. 157-66, Schwartz, R. N., et al., Oncology (Williston Park), 2002. 16 (11 Suppl 13): p. 11-20). Outro problema é que a administração de IL-2 induz uma forte expansão de células T reguladoras, que expressam o receptor de IL-2 de alta afinidade e que inibem a imunidade antitumoral mediada por células T de CD8+ e células NK (Brandenburg, S., et al., Eur J Immunol, 2008. 38(6): p. 1643-53; Facciabene, A., et al., Cancer Res, 2012. 72(9): p 2162-71). Um método para superar estas desvantagens de terapia de IL-2 é estender a meia-vida in vivo de IL-2 e, ao mesmo tempo, ativar seletivamente as células T de CD8+ e células NK que expressam o receptor de IL-2 de baixa afinidade. Tem havido muitas tentativas para fazer isso, mas tem havido pouco sucesso (Arenas-Ramirez, N., et al., Sci Transl Med, 2016. 8(367): p. 367ra166).

[0004] Recentemente, a modificação dos resíduos de aminoácidos de IL-2 que se liga ao receptor de IL-2 de alta afinidade tem sido proposta como uma solução. No entanto, este método tem uma limitação na medida em que pode fornecer uma IL-2 modificada que tem a imunogenicidade ou a susceptibilidade a proteases que degradam a uma sequência de aminoácidos introduzidos artificialmente (Levin, A. M., et al., Nature, 2012. 484(7395): p. 529-33).

[0005] Consequentemente, os inventores do presente têm feito esforços intensos para desenvolver um método que estenda a meia vida in vivo de IL-2 sem causar uma alteração anormal de IL-2 e, ao mesmo tempo, ativa seletivamente as células T de CD8+ e células NK que expressam o receptor de IL-2 de baixa afinidade. Como resultado, os inventores do presente verificaram que, quando um anticorpo monoclonal anti-IL-2 (mAb) com uma especificidade particular é ligado a IL-2, inibe seletivamente a ligação de IL-2 ao receptor de IL-2 de alta afinidade, completando assim a presente invenção.

[0006] A informação descrita na secção de Antecedentes da Invenção é apenas para a melhoria do entendimento dos fundamentos da presente invenção e, portanto, não pode conter informações que formam um estado da técnica que já seria conhecido para um técnico no assunto.

Descrição da Invenção

[0007] É um objeto da presente invenção fornecer um anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a interleucina-2 humana (hIL-2), e inibe a ligação da hIL-2 a CD25.

[0008] Um outro objeto da presente invenção consiste em fornecer um ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-hIL-2 ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, um vetor compreendendo o ácido nucleico, uma célula transformada com o vetor e um método de produção de um anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo utilizando o mesmo.

[0009] Ainda um outro objeto da presente invenção consiste em fornecer uma composição e método de tratamento para a prevenção ou tratamento do câncer, que compreende o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo como um ingrediente ativo.

[0010] Ainda um outro objeto da presente invenção é fornecer um anticorpo bioespecífico ou um conjugado anticorpo-fármaco compreendendo a anticorpo anti-hIL-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, e uma composição e método de tratamento para a prevenção ou tratamento do câncer, que compreende o anticorpo bioespecífico ou o conjugado anticorpo-fármaco como ingrediente ativo.

[0011] Um outro objeto da presente invenção é fornecer uma composição de coadministração e método de tratamento para o tratamento de câncer, que compreende o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo e um inibidor do ponto de verificação imune.

Solução técnica

[0012] Para alcançar o objetivo acima, a presente invenção fornece um anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo que compreende: uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma CDR2 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[0013] A presente invenção também fornece um ácido nucleico que codifica para o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, um vetor compreendendo o ácido nucleico, uma célula transformada com o vetor e um método de produção de um anticorpo anti-hIL-2 ou fragmento de ligação do antígeno do mesmo utilizando para tal o mesmo.

[0014] A presente invenção também fornece um complexo em que o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo é ligado a hIL-2.

[0015] A presente invenção também fornece uma composição e método de tratamento para a prevenção ou tratamento de câncer, que compreende o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo como um ingrediente ativo.

[0016] A presente invenção também fornece um anticorpo bioespecífico ou o conjugado anticorpo-fármaco compreendendo a anticorpo anti-hIL-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo e um método de composição e método de tratamento para a prevenção ou tratamento do câncer, que compreende o anticorpo bioespecífico ou o conjugado anticorpo-fármaco como um ingrediente ativo.

[0017] A presente invenção também fornece uma composição de coadministração e método de tratamento para o tratamento de câncer, que compreende o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo e um inibidor do ponto de verificação imune.

[0018] A presente invenção também fornece o uso do anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo para a prevenção ou tratamento de câncer.

[0019] A presente invenção também fornece o uso do anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo para a preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de câncer.

[0020] A presente invenção também fornece uma composição para aumentar a eficácia da vacina, a qual compreende o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo como um ingrediente ativo.

Breve Descrição das Figuras

[0021] A Fig. 1 mostra os resultados dos testes da especificidade de ligação de um anticorpo monoclonal TCB2 contra hIL-2.

[0022] A Fig. 2 mostra o efeito imunoestimulador in vivo de um complexo hIL-2/TCB2. A Fig. 2A mostra os resultados da análise da frequência de células imunes; a Fig. 2B mostra os resultados da análise da expressão de CD44 e CD62L em células CD4 e CD8+ T; a Fig. 2C mostra os resultados da análise estatística experimental; e a Fig. 2D mostra o efeito de um complexo hIL-2/MAB602 ou hIL-2/TCB2 sobre a expansão de células imunes e os resultados da análise estatística experimental (**p < 0,01, *** p < 0,001 (teste t não emparelhado)).

[0023] A Fig. 3 mostra as curvas de ressonância de plasmon de superfície obtidas usando Biacore T100 para as afinidades de anti-hIL-2 mAb de hlL-2.

[0024] A Fig. 4 mostra o efeito de um complexo hIL-2/TCB2 contra um tumor sólido (***p < 0,001 (ANOVA de duas vias para o dia 12, teste t não emparelhado para o dia 14)).

[0025] A Fig. 5 mostra o efeito de TCB2 mAb contra um tumor metastático (***p < 0,001 (teste t não emparelhado)).

[0026] A Fig. 6 mostra o efeito antitumoral de uma combinação de um complexo hIL-2/TCB2 e terapia de peptídeos de tumor em modelos de melanoma B6F10 (***p < 0,001 (ANOVA)).

[0027] A Fig. 7 mostra o efeito antitumoral de uma combinação de um complexo hIL-2/TCB2 e um anticorpo anti-CTLA-4 em modelos de tumor CT26 (câncer de cólon em Balb/C) (**p < 0,01 (ANOVA de duas vias para o dia 17, teste t não emparelhado para o dia 24)).

[0028] A Fig. 8 mostra o efeito antitumoral de uma combinação de um complexo hIL-2/TCB2 e um anticorpo anti-DP-1 em modelos de tumor MC38 (câncer de cólon B6) (*p < 0,05, **p < 0,01 (ANOVA para o dia 19, teste t não emparelhado para o dia 21)).

[0029] A Fig. 9 mostra o imunoestimulador in vivo de um complexo hIL-2/hnTCB2 e os resultados da análise estatística experimental.

[0030] A Fig. 10 mostra o efeito antitumoral de uma combinação de um complexo hIL-2/hnTCB2 e um anticorpo anti-DP-1 em modelos de tumor MC38 (câncer de cólon B6) (*p < 0,05, **p < 0,01 (ANOVA para o dia 19 e 22, teste t não emparelhado para o dia 25)).

Melhor modo de realizar a invenção

[0031] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos utilizado no presente têm o mesmo significado que o comumente entendido por um técnico no assunto à qual pertence a presente descrição. Em geral, a nomenclatura utilizada no presente é bem conhecida e comumente utilizada no estado da técnica.

[0032] Na presente invenção, foram feitos esforços para desenvolver um método que estenda a meia vida in vivo de IL-2 sem causar uma alteração anormal de IL-2 e, ao mesmo tempo, ativa seletivamente as células T CD8+ e células NK que expressam o receptor IL-2 de baixa afinidade. Como resultado, verificou-se que, quando um anticorpo monoclonal (mAb) anti-IL-2 com uma especificidade particular é ligado a IL-2, inibe seletivamente a ligação de IL-2 ao receptor de IL-2 de alta afinidade.

[0033] Em um aspecto, a presente invenção é dirigid a um anticorpo anti-hIL-2 (referido como “TCB2” no relatório descritivo) ou a um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, que se liga especificamente a interleucina-2 humana (hIL-2) e inibe a ligação da hIL-2 a CD25.

[0034] Tal como utilizado no presente, o termo “interleucina-2 humana (hIL-2)” refere-se a uma proteína de 133 aminoácido (15,4 kDa) não tendo homologia de sequência substancial com quaisquer outros fatores.

[0035] Tal como utilizado no presente, o termo “CD25” refere-se à cadeia de IL-2Rα do receptor de IL-2. O receptor de IL-2 está presente como receptor de IL-2 de alta afinidade (IL-2R) e receptor de IL-2 de baixa afinidade (IL-2R) em função da sua afinidade, e CD25 é uma cadeia que não está presente no receptor de IL-2 de baixa afinidade e está presente apenas no receptor de IL-2 de alta afinidade.

[0036] O termo “anticorpo”, tal como utilizado na presente invenção, refere-se a uma substância produzida pelo estímulo de um antígeno no sistema imune e seus tipos não são particularmente limitados. Ultimamente, os anticorpos foram amplamente utilizados para o tratamento de doenças. Como os anticorpos são muito estáveis in vivo, bem como in vitro, e têm uma meia-vida longa, eles são favoráveis para a expressão e produção de massa. Além disso, uma vez que o anticorpo tem intrinsecamente uma estrutura de dímero, tem uma avidez relativamente alta. Um anticorpo intacto tem uma estrutura com duas cadeias leves de comprimento completo e duas cadeias pesadas de comprimento completo, e cada cadeia leve está ligada a cada cadeia pesada através de uma ponte de dissulfeto. A região constante de um anticorpo é dividida em uma região constante da cadeia pesada e uma região constante da cadeia leve e a região constante da cadeia pesada tem tipos gama (y), mu (μ), alfa (α), delta (δ) e épsilon (ε), e tem gamai (y1), gama2 (Y2), gama3 (y3), gama4 (y4), alfa1 (α1) e alfa2 (α2) como sua subclasse. A região constante de cadeia leve tem os tipos kappa (K) e lambda (À).

[0037] O anticorpo na presente invenção pode incluir um anticorpo derivado de animal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado ou um anticorpo totalmente humano. Um anticorpo derivado de animal que é produzido por imunização de um animal com um antígeno desejado pode geralmente desencadear uma resposta de rejeição imune quando administrado a seres humanos para fins de tratamento, e um anticorpo quimérico foi desenvolvido para suprimir tal resposta de rejeição imune. Um anticorpo quimérico é formado por substituição da região constante de um anticorpo derivado de animal, o que é uma causa de uma resposta anti-isotipo, com a região constante de um anticorpo humano utilizando métodos de engenharia genética. O anticorpo quimérico tem aprimorado consideravelmente a resposta anti-isotipo em comparação com anticorpos derivados de animais, mas os aminoácidos de origem animal ainda estão presentes nas suas regiões variáveis e, portanto, contém ainda efeitos colaterais potenciais resultantes de uma resposta anti-idiotípica. Ele é um anticorpo humanizado que foi assim desenvolvido para aprimorar tais efeitos colaterais. Este é fabricado por enxerto de CDR (regiões determinantes de complementaridade) que, das regiões variáveis de um anticorpo quimérico, têm um papel importante na ligação de antígeno em uma estrutura de anticorpo humano.

[0038] Um “anticorpo humanizado”, como utilizado no presente, inclui uma imunoglobulina de domínio de cadeia leve humanizada e uma imunoglobulina de domínio variável de cadeia pesada humanizada. O anticorpo humanizado pode incluir uma região constante parcialmente ou totalmente derivada de (incluindo análogos sintéticos) uma ou mais sequência de gene humano. Espera-se que um anticorpo humanizado se ligue ao mesmo antígeno alvo como um anticorpo doador que forneceu as CDRs. Tipicamente, todos os segmentos ou porções do anticorpo humanizado ou imunoglobulina, com a exceção das CDR, são substancialmente idênticos ou substancialmente homólogos a segmentos ou porções correspondente de ocorrência natural ou sequências de consenso de imunoglobulina humana. É importante na tecnologia de enxerto de CDR para a fabricação de um anticorpo humanizado selecionar um anticorpo humano otimizado que possa receber melhor a CDR de um anticorpo derivado de animal e, por isso, a utilização de base de dados de anticorpo, análise da estrutura de cristal, tecnologia de modelagem molecular, etc. são empregados. No entanto, embora a CDR de um anticorpo derivado de animal seja enxertada em uma estrutura de anticorpo humano otimizada, há um número considerável de casos em que a afinidade de ligação ao antígeno não é preservada porque existem aminoácidos que afetam a ligação ao antígeno enquanto estão posicionados no quadro do anticorpo derivado de animal. A este respeito, pode ser necessário aplicar uma tecnologia de engenharia de anticorpos adicional para restaurar afinidade de ligação antígeno.

[0039] Tal como utilizado no presente, o termo “anticorpo monoclonal (mAb)” tem o mesmo significado como comumente utilizado no campo técnico da presente invenção e significa um anticorpo que reconhece um único epítopo em um antígeno ao qual se liga. Isto contrasta com um anticorpo policlonal que é uma colecção de anticorpos diferentes que se ligam ao mesmo antígeno, mas se ligam a diferentes epítopos do antígeno. Por esta razão, uma única molécula de antígeno pode ser ligada simultaneamente por múltiplos anticorpos policlonais, mas um anticorpo monoclonal particular específico para o antígeno pode ser ligado por uma única molécula. Depois de ser ligado pela molécula de anticorpo monoclonal único, o epítopo ligado é bloqueado e, portanto, já não pode ser ligado por outros anticorpos monoclonais. A natureza monoclonal de anticorpos é particularmente adequada para o uso como agentes terapêuticos. Isto porque estes anticorpos são espécies moleculares homólogas únicas e, assim, podem ser muito bem caracterizadas, podem ser produzidas de forma reprodutível e purificadas. Esses fatores tornam possível a produção de produtos cuja atividade biológica pode ser prevista com um elevado nível de precisão. Estes fatores são particularmente importantes, uma vez que estas moléculas devem obter permissão de autoridades para administração terapêutica para mamíferos, particularmente humanos.

[0040] O termo “cadeia pesada”, tal como utilizado no presente, pode ser interpretado para incluir uma cadeia pesada de comprimento total, incluindo o domínio de região variável VH incluindo uma sequência de aminoácidos com uma sequência de região variável suficiente para conferir antígeno-especificidade, três domínios de regiões constantes CH1, CH2 e CH3, e uma dobradiça, e a um fragmento do mesmo. Além disso, o termo “cadeia leve”, tal como utilizado no presente, pode ser interpretado para incluir uma cadeia leve de comprimento total, incluindo o domínio da região variável VL incluindo uma sequência de aminoácidos com uma sequência de região variável suficiente para conferir antígeno-especificidade e um domínio de região constante CL e um fragmento do mesmo.

[0041] Na presente invenção, o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno pode compreender: uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 3, 23, 28, 32 e 34; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 4, 24, 26 e 30. De um modo preferido, o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo pode compreender: uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 4; uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 24; uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 28 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 26; uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 32 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 30; ou uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 34 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 30.

[0042] Tal como utilizado no presente, o termo “região determinante de complementaridade (CDR)” refere-se à sequência de aminoácidos da região hipervariável da cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina. Cada uma das cadeias pesada e leve podem compreender três CDRs (isto é, uma CDR1 de cadeia pesada, uma CDR2 da cadeia pesada e uma CDR3 de cadeia pesada; e uma CDR1 de cadeia leve, uma CDR2 de cadeia leve e uma CDR3 de cadeia leve). A CDR pode fornecer resíduos de contato importantes para a ligação do anticorpo a um antígeno ou um epítopo.

[0043] Na presente invenção, o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo pode compreender: uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 5, uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 6 e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 7; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de cadeia leve compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 8, uma CDR2 de cadeia leve compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 9 e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo uma sequência de DNA da SEQ ID NO: 10.

[0044] Na presente invenção, o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo pode compreender: uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, uma CDR2 de cadeia pesada que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma CDR2 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

[0045] Tal como utilizado no presente, o termo “ligar especificamente” tem o mesmo significado como geralmente conhecido por um técnico no assunto, o que indica que um antígeno e um anticorpo especificamente interagem um com o outro para levar a uma resposta imune. Na presente invenção, o anticorpo monoclonal humano ou fragmento do mesmo tem a capacidade de discriminar IL-2 humana (hIL-2) a partir de vários outros antígenos potenciais. A discriminação é conseguida de tal modo que o anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo se liga apenas a uma extensão significativa a hIL-2 como um potencial parceiro de ligação em uma reserva de vários antígenos diferentes. A este respeito, “se ligam de forma significativa a hIL-2” significa que hIL-2 como um potencial parceiro de ligação em uma reserva de uma série de antígenos diferentes igualmente acessíveis se liga com uma afinidade pelo menos 10 vezes, preferivelmente 50 vezes diferente de hIL-2.

[0046] Tal como utilizado no presente, o termo “fragmento de ligação a antígeno”, que é um fragmento da estrutura completa de uma imunoglobulina, refere-se a algum de um polipeptídeo incluindo uma porção a que um antígeno possa se ligar. Por exemplo, pode ser uma scFv, uma (scFv)2, um Fab, um Fab' ou F(ab')2, mas não está limitado a estes. Dentre os fragmentos de ligação ao antígeno acima, um Fab, que é uma estrutura que tem a cadeia leve e regiões variáveis da cadeia pesada, a região constante da cadeia leve e região constante da primeira cadeia pesada (CH1), tem um sítio de ligação a antígeno. Uma Fab’ difere do Fab pelo fato de que a Fab' tem uma região de dobradiça incluindo pelo menos um resíduo de cisteína na extremidade C-terminal do domínio CH1 de cadeia pesada. Uma F(ab')2 é produzida quando os resíduos de cisteína na região de dobradiça da Fab' estão ligados por uma ponte de dissulfeto. Um Fv é um fragmento de anticorpo mínimo, tendo apenas as regiões variáveis de cadeia pesada e as regiões variáveis da cadeia leve, e uma técnica recombinante para produzir o fragmento Fv é bem conhecido no estado da técnica. Um Fv de duas de cadeia pode ter uma estrutura em que as regiões variáveis da cadeia pesada estão ligadas às regiões variáveis da cadeia leve por uma ligação não-covalente, e um Fv de cadeia simples podem geralmente formar uma estrutura de dímero como nos Fv de duas cadeias, em que as regiões variáveis da cadeia pesada são covalentemente ligadas às regiões variáveis da cadeia leve através de um ligante peptídico ou regiões variáveis de cadeia pesada e leve são diretamente ligadas uma a outra nas posições C-terminais das mesmas. O ligante pode ser um ligante peptídico incluindo 1 a 100 ou de 2 a 50 de quaisquer aminoácidos, e sequências adequadas dos mesmos têm sido conhecidas no estado da técnica. O fragmento de ligação a antígeno pode ser obtido utilizando uma protease (por exemplo, um anticorpo completo pode ser digerido com papaína para se obter fragmentos de Fab, ou pode ser digerido com pepsina para se obter fragmentos F(ab')2), ou pode ser preparado por uma técnica recombinante genética. O fragmento de ligação a antígeno do anticorpo da presente invenção pode ser um fragmento que inclui uma ou mais CRD.

[0047] Na presente invenção, o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo pode induzir a expansão de células CD8+ T e células NK. Em um exemplo da presente invenção, verificou-se que o anticorpo anti-hIL-2 de acordo com a presente invenção induziu a ativação de células CD8+ T e células NK e induziu a pouca expansão de células Treg.

[0048] Em um outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[0049] Na presente invenção, o ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo pode compreender uma sequência da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 33. Mais especificamente, o ácido nucleico que codifica a cadeia pesada do anticorpo de acordo com a presente invenção pode compreender uma sequência da SEQ ID NO: 27, 31 ou 33 e/ou o ácido nucleico que codifica a cadeia leve do anticorpo de acordo com a presente invenção pode compreender uma sequência da SEQ ID NO: 2, 25 ou 29.

[0050] O anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo da presente invenção pode ser produzido de forma recombinante, isolando o ácido nucleico que codifica um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo. O ácido nucleico é isolado e inserido em um vetor replicável para resultar em clonagem adicional (amplificação do DNA) ou expressão adicional.

[0051] Tal como utilizado no presente, o termo “ácido nucleico” tem um significado amplo, incluindo DNA (DNAg e DNAc) e moléculas de RNA. Nucleotídeos, elementos básicos de ácidos nucleicos, incluem nucleotídeos naturais, bem como análogos, em que os sítios de açúcar ou bases são modificados. A sequência do ácido nucleico que codifica as regiões variáveis de cadeia pesada e leve da presente invenção pode ser modificada. Tais modificações incluem a adição, deleção ou substituição não conservativa ou substituição conservadora de nucleotídeos.

[0052] O ácido nucleico da presente invenção é interpretado para incluir uma sequência de nucleotídeos que apresenta uma identidade substancial com a sequência de nucleotídeos. A identidade substancial significa uma sequência de nucleotídeos que mostra pelo menos 80% de homologia, mais preferencialmente pelo menos 90% de homologia e, mais preferencialmente ainda, pelo menos 95% de homologia alinhando a sequência de nucleotídeos da presente invenção com qualquer outra sequência tanto quanto possível e analisando o sequência alinhada utilizando algoritmos comumente utilizados no estado da técnica.

[0053] O DNA que codifica o anticorpo pode ser facilmente separado ou sintetizado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, utilizando uma sonda de oligonucleotídeo capaz de se ligar especificamente ao DNA que codifica a cadeia pesada e a cadeia leve do anticorpo).

[0054] Em ainda outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um vetor recombinante incluindo o ácido nucleico.

[0055] Muitos vetores estão disponíveis. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento potenciador, um promotor e uma sequência de terminação da transcrição.

[0056] O termo “vetor”, tal como utilizado no presente, inclui um vetor de plasmídeo; um vetor de cosmídeo; um vetor de bacteriófago; e um vetor viral, por exemplo, um vetor de adenovírus, vetores retrovirais e vetores virais adenoassociados como um meio para a expressão de um gene alvo em uma célula hospedeira. O ácido nucleico que codifica o anticorpo no vetor está operacionalmente ligado a um promotor.

[0057] Tal como utilizado no presente, o termo “operacionalmente ligado” refere-se a uma ligação funcional entre uma sequência controle de expressão de ácido nucleico (por exemplo, uma matriz de promotor, sequência de sinal ou sítio de ligação do fator de regulação de transcrição) e uma outra sequência de ácido nucleico e, assim, a sequência controle controla a transcrição e/ou tradução de outra sequência de ácido nucleico.

[0058] Quando uma célula procariótica é usada como um hospedeiro, um promotor forte capaz de promover a transcrição (tal como um promotor tac, promotor lac, promotor lacUV5, promotor lpp, promotor pLA, promotor pRÀ, promotor rac5, promotor amp, promotor recA, promotor SP6, promotor trp e promotor T7), um sítio de ligação ao ribossomo para a iniciação da tradução e uma sequência de terminação de transcrição/tradução são geralmente incluídos. Além disso, por exemplo, quando uma célula eucariótica é usada como um hospedeiro, um promotor derivado de um genoma de uma célula de mamífero (por exemplo, um promotor de metalotioneína, um promotor de β-actina, um promotor de hemoglobina humana e um promotor de creatina muscular humana) ou um promotor derivado a partir de um vírus de mamífero (por exemplo, promotor tardio de adenovírus, promotor de 7,5K do vírus vaccinia, promotor de SV40, promotor de citomegalovírus (CMV), o promotor de tk de HSV, promotor de vírus tumoral mamário de camundongo (MMTV), promotor de HIV LTR, promotor de vírus Epstein barr (EBV) de vírus moloney e vírus Rous sarcoma (RSV)) podem ser utilizados e geralmente têm uma sequência de poliadenilação como uma sequência de terminação de transcrição.

[0059] Opcionalmente, o vetor pode ser fundido com outra sequência de modo a facilitar a purificação de um anticorpo expresso a partir deste. Sequências fundidas incluem, por exemplo, glutationa-S-transferase (Pharmacia, EUA), proteína de ligação a maltose (NEB, EUA), FLAG (IBI, EUA) e 6x His (hexa-histidina; Quiagen, EUA).

[0060] O vetor inclui um gene de resistência a antibiótico geralmente utilizado no estado da técnica como um marcador seletivo e pode incluir, por exemplo, genes que possuem resistência a ampicilina, gentamicina, carbenicilina, cloranfenicol, estreptomicina, canamicina, geneticina, neomicina e tetraciclina.

[0061] Em ainda outro aspecto, a presente invenção é dirigida a uma célula transformada com o vetor recombinante. As células utilizadas para produzir o anticorpo da presente invenção podem ser células procariotas, leveduras ou outras células eucarióticas superiores, mas não estão limitadas a estas.

[0062] Na presente invenção, como a célula transformada, a célula hospedeira procariótica pode ser utilizada, por exemplo, uma cepa que pertence ao gênero Bacilus, tais como Escherichia coli, Bacilus subtilis, e Bacilus thuringiensis, Streptomyces, Pseudomonas (por exemplo, Pseudomonas putida), Proteus mirabilis e Staphylococcus (por exemplo, Staphylococcus carnosus ).

[0063] Enquanto isso, o interesse em células animais é maior, e um exemplo de uma linha de célula hospedeira útil pode ser, mas não está limitado a COS-7, células BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U205 ou HT1080.

[0064] Em um aspecto adicional, a presente invenção é dirigida a um método de produção de um anticorpo anti-hIL-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreendendo a cultura da célula, expressando assim a anticorpo anti-hIL-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção.

[0065] As células podem ser cultivadas em vários meios. Os meios comercialmente disponíveis podem ser usados como um meio de cultura sem limitação. Todos os outros suplementos essenciais conhecidos para os técnico no assunto podem ser incluídos nas concentrações apropriadas. A cultura de condições, por exemplo, temperatura e pH já foram utilizadas com as células hospedeiras selecionadas para expressão, que serão evidentes para os técnicos no assunto.

[0066] Quando o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é recuperado, as impurezas podem ser removidas, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração, e o produto resultante pode ser purificado, por exemplo, por cromatografia de afinidade de ligação ao antígeno. Podem ser utilizadas técnicas de purificação adicionais, tais como cromatografia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia de interação hidrofóbica e cromatografia de hidroxiapatita.

[0067] Em ainda um outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um complexo em que um anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo é ligado a hIL-2.

[0068] Em ainda um aspecto adicional, a presente invenção é dirigida a um conjugado anticorpo-fármaco (ADC) que compreende um fármaco conjugado com o anticorpo anti-hIL- 2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[0069] Um conjugado anticorpo-fármaco (ADC) exige que o fármaco anticancerígeno deverá ser ligado de forma estável ao anticorpo antes de o fármaco anticancerígeno ser disponibilizado para as células cancerosas alvo. O fármaco disponibilizado ao alvo deve ser liberado do anticorpo e deve induzir a morte das células alvo. Para este fim, o fármaco deve ser ligado de forma estável ao anticorpo e, ao mesmo tempo, deve ter citotoxicidade suficiente para induzir a morte das células alvo quando for liberado do anticorpo.

[0070] Na presente invenção, o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo e substâncias citotóxicas, incluindo fármacos tais como fármacos anticancerígenos, podem ser ligados um ao outro por, por exemplo, uma ligação covalente, uma ligação peptídica ou semelhante, de forma que eles possam ser utilizados como conjugados ou proteínas de fusão (em que as substâncias citotóxicas e/ou substâncias de marcação são proteínas). A substância citotóxica pode ser qualquer substância tendo toxicidade contra células cancerosas, particularmente células de câncer sólido, e pode ser um ou mais selecionados a partir do grupo que consiste em, mas não se limitando a, radioisótopos, compostos citotóxicos (moléculas pequenas), proteínas citotóxicas, agentes anticancerígenos e similares. As proteínas citotóxicas pode ser uma ou mais selecionadas a partir do grupo que consiste em, mas não limitada a ricina, saporina, gelonina, momordina, debouganin, toxina da difteria e toxina de pseudomonas. Os radioisótopos podem ser um ou mais selecionado a partir do grupo consistindo em, mas não limitados a 131I, 188Rh e 90Y. Os compostos citotóxicos podem ser um ou mais selecionados a partir do grupo que consiste em, mas não limitado a, duocarmicina, auristatina monometila E (MMAE), auristatina monometila F (MMAF), N2'-desacetil-N2'- (3-mercapto-1-oxopropil)maitansina (DM1) e dímero PBD (pirrolbenzodiazepina).

[0071] Na presente invenção, o conjugado anticorpo-fármaco pode ser obtido de acordo com uma técnica bem conhecida no campo técnico ao qual a presente invenção pertence.

[0072] Na presente invenção, o conjugado anticorpo-fármaco pode ser um em que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo é ligado ao fármaco por meio de um ligante.

[0073] Na presente invenção, o ligante pode ser um ligante clivável ou um ligante não clivável.

[0074] O ligante é uma região que se conecta entre o anticorpo anti-hIL-2 por e o fármaco. Por exemplo, o ligante é configurado de tal modo que é clivável em condições intracelulares, ou seja, o fármaco pode ser liberado do anticorpo através da clivagem do ligante em um ambiente intracelular.

[0075] O ligante pode ser clivado por um agente de clivagem presente em um ambiente intracelular, por exemplo, lisossomo ou endossomo. O ligante pode ser um ligante peptídico que pode ser clivado pela peptidase intracelular ou enzima protease, por exemplo, protease de lisossomo ou de endossomo. Geralmente, o ligante peptídico tem um comprimento de pelo menos dois aminoácidos. Os agentes de clivagem podem incluir catepsina B, catepsina D e plasmina, e são capazes de hidrolisar o peptídico para permitir que o fármaco seja liberado para as células alvo. O ligante peptídico pode ser clivado pela protease tiol dependente de catepsina B que é altamente expressa em tecido de câncer. Por exemplo, o ligante que é utilizado na presente invenção pode ser um ligante Phe-Leu ou Gly-Phe-Leu- Gly. Além disso, o ligante peptídico pode também ser um ligante Val-Cit ou Phe-Lys que é clivável, por exemplo, pela protease intracelular.

[0076] Na presente invenção, o ligante clivável é sensível ao pH, isto é, sensível à hidrólise a valores de pH determinados. Tipicamente, o ligante sensível ao pH é hidrolisável sob condições ácidas. Por exemplo, um ligante lábil aos ácidos que é hidrolisável no lisossomo (por exemplo, uma hidrazona, semicarbazona, tio-semicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal ou semelhante) pode ser usado.

[0077] O ligante é clivável sob condições de redução (por exemplo, um ligante dissulfeto). Uma variedade de ligantes dissulfeto podem ser formadas usando SATA (N-succinimidil-S- acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3- (2- piridilditio)butirato) e SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio) tolueno).

[0078] Na presente invenção, o fármaco e/ou o ligante-fármaco pode ser conjugado aleatoriamente através da lisina do anticorpo ou pode ser conjugado através de uma cisteína que é exposta quando uma cadeia de ponte de dissulfeto é reduzida. Em alguns casos, o ligante-fármaco pode ser ligado por meio de uma cisteína presente em uma etiqueta geneticamente modificada, por exemplo, um peptídeo ou uma proteína. A etiqueta geneticamente modificada, por exemplo, um peptídeo ou uma proteína, pode incluir um motivo de aminoácido que pode ser reconhecido por, por exemplo, isoprenoide-transferase. O peptídeo ou proteína acima descrito tem uma deleção no terminal carboxila do peptídeo ou proteína, ou tem uma adição no terminal carboxila (C) do peptídeo ou proteína através de ligação covalente a uma unidade espaçadora. O peptídeo ou a proteína pode ser ligada de forma covalente diretamente ao motivo de aminoácidos ou pode ser ligada ao motivo de aminoácidos através de ligação covalente a uma unidade espaçadora. A unidade espaçadora de aminoácidos é composta de 1 a 20 aminoácidos e é, de preferência, uma unidade glicina.

[0079] O ligante pode incluir um ligante beta-glicuronídeo que é reconhecido e hidrolisado por β-glicuronidase que se encontra presente nos lisossomos ou é altamente expressa em algumas células tumorais. Ao contrário de um ligante peptídico, o ligante beta-glicuronídeo tem uma vantagem na medida em que tem uma alta hidrofilicidade e, portanto, pode aumentar a solubilidade de um conjugado anticorpo-fármaco, quando ele está ligado a um fármaco altamente hidrofóbico.

[0080] Além disso, o ligante pode ser um ligante não clivável. Neste caso, o fármaco pode ser liberado através de apenas uma única etapa (hidrólise de anticorpo) produzindo, assim, por exemplo, um conjugado de aminoácido-ligante-fármaco. Este tipo de ligante pode ser tioéter ou maleimidocaproíla e podem manter a sua estabilidade no sangue.

[0081] Na presente invenção, o fármaco pode ser um agente quimioterápico, toxina, micro- RNA (RNAmi), RNAsi, RNAsh ou radioisótopo. O fármaco que é uma formulação exibindo um efeito farmacológico pode ser conjugado com o anticorpo.

[0082] O agente quimioterápico pode ser um agente citotóxico ou um inibidor do ponto de verificação imune. Especificamente, o agente quimioterápico pode incluir um agente quimioterápico capaz de funcionar como um inibidor de microtubulina, um inibidor mitótico, um inibidor de topoisomerase ou um intercalador de DNA. Além disso, o agente quimioterápico pode incluir um composto imunomodulador, um agente anticancerígeno, um agente antiviral, um agente antibacteriano, um agente antifúngico, um agente antiparasítico ou uma combinação dos mesmos.

[0083] O fármaco pode ser um ou mais selecionado a partir do grupo consistindo em, mas não limitados a, por exemplo, de maitansinóide, auristatina, aminopterina, actinomicina, bleomicina, talisomicina, camptotecina, N8-acetil espermidina, 1-(2-cloroetil)-1,2- metilsulfonil-hidrazida, esperamicina, etoposídeo, 6-mercaptopurina, dolastatina, tricoteceno, caliqueamicina, taxol, taxano, paclitaxel, docetaxel, metotrexato, vincristina, vinblastina, doxorrubicina, melfalano, mitomicina A, mitomicina C, clorambucila, duocarmicina, L-asparaginase, mercaptopurina, tioguanina, hidroxiureia, citarabina, ciclofosfamida, ifosfamida, nitrosoureia, cisplatina, carboplatina, mitomicina, dacarbazina, procarbazina, topotecano, mostarda de nitrogênio, citoxana, etoposídeo, 5-fluorouracila, biscloroetilnitrosoureia (BCNU), irinotecano, camptotecina, bleomicina, idarrubicina, daunorrubicina, dactinomicina, plicamicina, mitoxantrona, asparaginase, vinorelbina, clorambucila, melfalano, carmustina, lomustina, bussulfano, treossulfano, decarbazina, etoposídeo, teniposídeo, topotecano, 9-aminocamptotecina, crisnatol, mitomicina C, trimetrexato, ácido micofenólico, tiazofurina, ribavirina, 5-etinil-1-beta- dribofuranosilimidazol-4-carboxamida (EICAR), hidroxiureia, deferoxamina, floxuridina, doxifluridina, raltitrexed, citarabina (ara C), citosina-arabinosídeo, fludarabina, tamoxifeno, raloxifeno, megestrol, goserelina, acetato de leuprolida, flutamida, bicalutamida, EB1089, CB1093, KH1060, verteporfina, ftalocianina, fotossensibilizador Pe4, desmetoxi-hipocrelina A, interferon-α, interferon—Y, fator de necrose tumoral, gemcitabina, velcade, revamid, talamid, lovastatina, 1-metil-4-fenilpiridiniumion, estaurosporina, actinomicina D, dactinomicina, bleomicina A2, bleomicina B2, peplomicina, epirrubicina, pirarrubicina, zorrubicina, mitoxantrona, verapamil e tapsigargina, nuclease, toxinas derivadas de bactérias ou animais/plantas.

[0084] Na presente invenção, o fármaco pode incluir um ou mais grupos nucleofílicos selecionados a partir do grupo que consiste em amina, tiol, hidroxila, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e grupos aril hidrazida, o qual podem reagir para formar ligações covalentes com o ligante e o grupo eletrofílico de um reagente ligante.

[0085] Em outro aspecto adicional, a presente invenção é dirigida a um anticorpo bioespecífico que compreende o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo.

[0086] Na presente invenção, o anticorpo bioespecífico significa uma forma de anticorpo em que um dos dois braços do anticorpo compreende o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo de acordo com a presente invenção, e o outro braço compreende tanto um anticorpo específico para um antígeno diferente de hIL-2, de preferência um antígeno relacionado com o câncer ou um antígeno de proteína de ponto de verificação imune, quanto um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga especificamente a um antígeno relacionado a células efetoras imunitárias.

[0087] O antígeno ao qual o anticorpo diferente do anticorpo anti-hIL-2 incluído no anticorpo bioespecífico se liga é um antígeno relacionado com o câncer ou um antígeno de proteína de ponto de verificação imune, que pode ser selecionado a partir de Her2, EGFR, VEGF, VEGF-R, CD-20, MUC16, CD30, CD33, CD52, 4-1BB, TIM3, PD-1, DP-L1, CTLA-4, BTLA4, EphB2, E-seletina, EpCam, CEA, PSMA, PSA, ERB3, c-MET e semelhantes, e o antígeno relacionado com células efetoras imunes pode ser selecionado dentre, mas não se limitando a, TCR/CD3, CD16 (FcyRIIIa), CD28, CD28, CD44, CD56, CD69, CD64 (FcyRI), CD89, CD11b/CD18 (CR3) e semelhantes.

[0088] Em outro aspecto ainda adicional, a presente invenção é dirigida a uma composição para a prevenção ou tratamento de câncer, a qual compreende o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo como um ingrediente ativo.

[0089] Em ainda um outro aspecto adicional, a presente invenção é dirigida a uma composição para a prevenção ou tratamento de câncer, a qual compreende o anticorpo bioespecífico ou o conjugado anticorpo-fármaco como ingrediente ativo.

[0090] “Câncer” refere-se a uma condição em que as células se proliferam de forma anormal e excessiva devido a um problema na função de regulação da divisão normal, diferenciação e morte das células, e invadem os tecidos circundantes e órgãos, formando assim uma massa e destruindo ou deformando as estruturas existentes. “Câncer sólido” refere-se a um câncer que tem características distintas das do câncer do sangue e que é composto por uma massa causada pelo crescimento anormal de células em vários órgãos sólidos, incluindo bexiga, mama, intestinos, rins, pulmões, cérebro, esôfago, vesícula biliar, ovário, pâncreas, estômago, colo do útero, tireoide, próstata, pele e semelhantes. O “câncer metastático” é causado pela metástase de células cancerígenas, separados a partir de um local de câncer primário, para um outro local através do sangue, vasos linfáticos ou semelhantes, e proliferação das células cancerosas metastizadas. A composição da presente invenção pode ser usada para a prevenção ou tratamento de tumores sólidos e/ou cânceres metastáticos. A composição da presente invenção pode ser usada para a prevenção ou tratamento de, mas não limitada a, por exemplo, câncer de pele, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de rim, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de cérebro, câncer de esôfago, câncer de vesícula biliar, câncer de ovário, câncer de pâncreas, câncer de estômago, câncer de colo do útero, câncer da tireoide, câncer de próstata e câncer de bexiga, mas não se limita a estes.

[0091] Tal como utilizado no presente, o termo "prevenir/prevenção" refere-se a todas as ações que inibem a metástase, crescimento e formas semelhantes de cânceres ou retardo do aparecimento de cânceres através da administração da composição. Tal como utilizado no presente, o termo “tratar/tratamento” refere-se a qualquer ação que resulte em melhoria dos sintomas de câncer ou a alteração benéfica de cânceres, devido à administração da composição.

[0092] A composição da presente invenção pode compreender ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. O veículo que é normalmente utilizado na formulação de fármacos pode ser um ou mais selecionado a partir do grupo que consiste em, mas não se limita a, lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, goma acácia, fosfato de cálcio, alginato, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água, xaropes, metilcelulose, hidroxibenzoato de metila, hidroxibenzoato de propila, talco, estearato de magnésio e óleo mineral. Além disso, a composição pode ainda compreender um ou mais selecionados a partir do grupo consistindo em excipientes, lubrificantes, agentes molhantes, edulcorantes, aromatizantes, emulsionantes, suspensões, e conservantes.

[0093] A composição farmacêutica ou composição de anticorpo pode ser administrada por via oral ou parenteral. Tal administração parenteral inclui injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, administração endotelial, administração tópica, administração nasal, administração intrapulmonar, administração intra-retal, etc. Uma vez que uma proteína ou peptídeo é digerido quando administrado por via oral, prefere-se que um composição para administração oral possa ser formulada para o revestimento de uma substância ativa ou seja protegida contra a degradação no estômago. Além disso, a composição pode ser administrada por qualquer dispositivo que possa transportar substâncias ativas a células alvo.

[0094] O conteúdo do anticorpo anti-hIL-2 (TCB2 mAb) na composição pode variar dependendo de vários fatores, tais como o método de formulação, método de administração, idade, peso corporal, sexo ou condição patológica do paciente, dieta, tempo de administração, intervalo de administração, via de administração, taxa de excreção e sensibilidade da reação. Por exemplo, uma dose de administração diária do anticorpo anti- hIL-2 (TCB2 mAb) pode estar na faixa de 0,001 a 1000 mg/kg, especialmente de 0,01 a 100 mg/kg, mais especificamente entre 0,1 e 50 mg/kg, mas não está limitado a estas. A dose eficaz para a administração única do anticorpo anti-hIL-2 (TCB2 mAb) pode ser formulada como uma formulação em uma forma de dose única ou formulada em uma quantidade apropriada, ou preparada por injeção dentro de um frasco de dose múltipla. A "dose farmaceuticamente eficaz", como usada como presente, pode se referir ao conteúdo ou a dose de um ingrediente ativo capaz de exibir um efeito farmacológico desejado e pode ser determinada de formas variadas dependendo de vários fatores, tais como método de formulação, método de administração, idade, peso corporal, sexo ou condição patológica do paciente, dieta, tempo de administração, intervalo de administração, via de administração, taxa de excreção e sensibilidade da reação.

[0095] A composição pode ser formulada com veículos e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis de acordo com um método que pode ser facilmente realizado por uma pessoa que tenha uma habilidade de técnico no assunto à qual a presente invenção pertence, e pode ser fornecida em uma forma de dose única ou encerrada em um frasco de dose múltipla. No presente, a formulação da composição pode estar na forma de uma solução, uma suspensão, xarope ou uma emulsão em meio oleoso ou aquoso, ou pode ser extratos, pós, grânulos, comprimidos ou cápsulas, e pode ainda incluir um agente de dispersão ou um estabilizador. Além disso, a composição pode ser administrada individualmente ou em combinação com outros agentes terapêuticos.

[0096] Em particular, a composição incluindo o anticorpo anti-hIL-2 (TCB2 mAb) inclui um anticorpo e, assim, podem ser formulada em imunolipossomas. O lipossoma incluindo um anticorpo pode ser preparado de acordo com um método bem conhecido na técnica pertinente. O imunolipossoma é uma composição de lipídeos incluindo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de polietilenoglicol, e pode ser preparado pelo método de evaporação de fase inversa. Por exemplo, o fragmento do anticorpo um fragmento Fab' pode ser conjugado com lipossomas através de uma reação de troca de dissulfeto.

[0097] Em ainda um outro aspecto adicional, a presente invenção é dirigida a uma composição de coadministração para o tratamento de câncer, que compreende o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo e um inibidor do ponto de verificação imune.

[0098] Na presente invenção, o inibidor de ponto de verificação imune (também, chamado “inibidor de ponto de verificação”) pode ser um anticorpo anti-CTLA-4 ou um anticorpo anti- DP-1, mas não está limitado a estes.

[0099] Tal como utilizado no presente, o termo “coadministração” (também chamado “combinação”) significa que o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo e o inibidor de ponto de verificação imune podem ser administrados simultaneamente, sequencialmente ou em ordem inversa, e o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo e o inibidor de ponto de verificação imune pode ser administrado em uma combinação de quantidades eficazes adequadas dos ingredientes ativos dentro da faixa determinada pelos técnicos no assunto.

[0100] Em um exemplo da presente invenção, verificou-se que quando o anticorpo anti- CTLA-4 ou anti-PD-1 e o anticorpo anti-hIL-2 de acordo com a presente invenção são tratados sequencialmente, o crescimento de células tumorais é ainda mais suprimido.

[0101] A composição de coadministração inclui o anticorpo anti-hIL-2 e os componentes a ele relacionados são os mesmos que os componentes incluídos na composição descrita acima para a prevenção ou tratamento do câncer. Assim, a descrição de cada constituição aplica-se igualmente à composição de coadministração.

[0102] Em ainda outro aspecto adicional, a presente invenção é dirigida a um método para a prevenção e/ou tratamento de câncer, o qual compreende uma etapa de administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, o anticorpo bioespecífico ou o conjugado anticorpo-fármaco.

[0103] A composição da presente invenção pode ser administrada como um agente terapêutico individual ou em combinação com outros agentes terapêuticos, e podem ser administrados sequencialmente ou em simultâneo com agentes terapêuticos convencionais.

[0104] Qualquer fármaco anticâncer, por exemplo, cisplatina, tem efeitos secundários, tais como caquexia, sarcopenia, perda de massa muscular, perda de massa óssea ou perda de peso corporal involuntária. Assim, a presente invenção pode incluir uma composição ou um método de tratamento de câncer que trata o câncer ao prevenir, minimizar ou diminuir a gravidade ou frequência de ocorrência de caquexia, sarcopenia, perda de massa muscular, perda de massa óssea ou perda de peso corporal involuntária.

[0105] O método compreende uma etapa de administração de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do anticorpo anti-hIL-2 da presente invenção em combinação com pelo menos um agente anticâncer. Em realizações particulares, a presente invenção inclui um método que trata o câncer ao prevenir, minimizar ou diminuir a gravidade, a frequência ou a ocorrência de caquexia, sarcopenia, perda de massa muscular, perda de massa óssea ou perda de peso corporal involuntária, o método compreendendo uma etapa de administração a um paciente de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz do anticorpo anti-a-hIL-2 da presente invenção em combinação com um ou mais agentes anticâncer conhecidos para induzir ou aumentar a severidade, a frequência ou a ocorrência de caquexia, sarcopenia, perda de massa muscular, perda de massa óssea ou perda de peso corporal involuntária.

[0106] Em ainda um outro aspecto adicional, a presente invenção é dirigida a um método para o tratamento de câncer, o qual compreende uma etapa de coadministração de uma composição compreendendo o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo com um inibidor do ponto de verificação imune.

[0107] No método para tratar o câncer de acordo com a presente invenção, o anticorpo anti- hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo e o inibidor de ponto de verificação imune podem ser administradas simultaneamente, sequencialmente ou em ordem inversa. De um modo preferido, o método pode compreender as etapas de: (a) tratamento com um inibidor do ponto de verificação imune; e (b) o tratamento com o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, mas não está limitado a eles.

[0108] O inibidor de ponto de verificação imune pode ser um anticorpo CTLA-4 ou um anticorpo anti-DP-1, mas não está limitado a eles. O método para o tratamento de câncer inclui a composição compreendendo o anticorpo anti-hIL-2 e os componentes a ele relacionados são os mesmos que os componentes incluídos na composição descrita acima. Assim, a descrição de cada constituição aplica-se igualmente ao método de tratamento de câncer por coadministração.

[0109] Em uma outra ainda outro aspecto, a presente invenção é dirigida para o uso do anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo para a prevenção ou tratamento de câncer.

[0110] Em uma outra ainda outro aspecto, a presente invenção é dirigida para o uso do anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo para a preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de câncer.

[0111] Em uma outra ainda outro aspecto, a presente invenção é dirigida a uma composição para aumentar a eficácia da vacina, o que compreende o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo como um ingrediente ativo.

[0112] Tal como utilizado no presente, o termo “vacina” refere-se a um agente biológico contendo um antígeno que imuniza um corpo vivo, e significa uma substância imunogênica ou antigênica que produz imunidade in vivo pela sua administração a seres humanos ou animais, a fim de prevenir a infecção.

Exemplos

[0113] Daqui em diante, a presente invenção será descrita em maior detalhes com referência aos exemplos. Será óbvio para um técnico no assunto que estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não são para serem interpretados para limitar o escopo da presente invenção.

Exemplo 1 Experimento sobre a especificidade de ligação de anticorpo monoclonal TCB2 contra hIL-2

[0114] Modelos de camundongo in vivo foram utilizados para avaliar a eficácia terapêutica de um complexo mAb TCB2/hIL-2. Por esta razão, a fim de examinar se o mAb TCB2 mostra reatividade cruzada com o camundongo IL-2 (mIL-2), a especificidade de ligação de mAb TCB2 contra hIL-2 foi testada. Em primeiro lugar, os esplenócitos de camundongos BALB/c imunizados com 3-4 vezes de hIL-2 ao longo de várias semanas foram fundidos com células de mieloma SP/2. Quando a colônia de hibridoma foi visualizada, o sobrenadante da cultura foi submetido a ELISA. 5 μg/ml de hIL-2 ou mIL-2 foram adicionados e misturados com PBS, e um total de 50 μl da mistura foi revestido em uma placa de ELISA. Em seguida, 200 μl de FBS a 10% foram adicionados ao PBS e incubados à temperatura ambiente durante 30 minutos, a fim de impedir a ligação não específica, e uma dose titulada do anticorpo monoclonal foi incubada durante 30 minutos. A ligação do anticorpo monoclonal ao revestimento de hIL-2 ou mIL-2 foi detectada com IgG HRP anti-camundongo ou IgG HRP de anti-rato. Em cada etapa, a placa foi lavada 3-5 vezes com 200 μl de PBS. Como controles positivos, foram utilizados anticorpos monoclonais disponíveis comercialmente. Como um controle positivo para a hIL-2, Mab602 foi utilizado, e como controles positivos para mIL-2, foram usados JES6-1 e S4B6.

[0115] Como resultado, Mab602 utilizado como o controle positivo para a hIL-2 mostrou baixa reatividade cruzada, ao passo que mAb TCB2 mostrou nenhuma reatividade cruzada com mIL- 2 (Fig. 1). Assim, pode ser visto que o mAb TCB2 se ligou especificamente apenas a hIL-2.

Exemplo 2 Efeito imunoestimulante in vivo de complexo hIL-2/TCB2

[0116] MAB602, um mAb anti-hIL-2 de camundongo previamente relatado, estimulou células T CD8+ humanas em camundongos humanizados, demonstrando assim a eficácia de um complexo hIL-2/mAb para imunoterapia anticâncer em aplicações clínicas. No entanto, a sequência da região CDR de MAB602 não foi publicada e não está claro se MAB602 é um anticorpo que tem um efeito anticâncer máximo quando usado como um complexo de mAb hIL-2/anti-hIL-2. Assim, tentou-se desenvolver um excelente mAb hIL-2 que induz a ativação máxima de células T CD8+ e células NK e a expansão mínima de células Treg.

[0117] Nos dias 0, 1, 2 e 3, um complexo de mAb hIL-2/TCB2 (0,8 μg/8 μg) foi injetado em camundongos B6 e, no dia 5, o grau de expansão das células T CD8+ esplênicas e células Treg foi analisado. O complexo de hIL-2/TCB2 minimizou a expansão de células Treg e células T CD4, mas induziu uma forte expansão de células T CD8+ e células NK (Fig. 2). Especificamente, quando o complexo de mAb hIL-2/TCB2 foi injetado, células T CD8+ de fenótipo de memória (MP) foram cerca de 59 vezes expandidas e as células T CD8+ MP constituíram a maioria de células T CD8+. Células NK foram também 18 vezes expandidas, mas as células Treg foram apenas cerca de 5 vezes expandidas, o qual foi menor do que a extensão da expansão de células T CD8 +Células T e as células NK. A proporção efetiva de células T CD8+ MP para células Treg expandidas foi de 970% para o complexo de mAb hIL- 2/TCB2. Portanto, pode ser visto que mAb TCB2 é um anticorpo monoclonal que estimula seletivamente células T CD8+ e células NK, não células Treg.

[0118] Além disso, a razão eficaz de células T CD8+ MP para células Treg expandidas foi de 970% para o complexo de mAb hIL-2/TCB2, mas de 530% para o complexo hIL-2/MAB602 (Fig. 2D). Assim, TCB2 é um anticorpo monoclonal superior a MAB602.

Exemplo 3 Análise da afinidade de TCB2 para hIL-2

[0119] A estimulação seletiva de células T CD8+ e de células NK pelo anticorpo TCB2 exige que o anticorpo seja ligado ao epítopo de hIL-2. Uma vez que o epítopo de hIL-2 também é reconhecido pela IL-2R (CD25) de alta afinidade, TCB2 é suscetível de se ligar a hIL-2 perto de um local ao qual a cadeia se liga a IL-2Rα. Uma vez que MAB602 também é suscetível de se ligar a hIL-2 perto de um local ao qual as cadeias IL-2Rα se ligam, TCB2 foi analisada de forma competitiva com MAB602 a fim de observar a especificidade de TCB2 que é um mAb anti-hIL-2. Outro anticorpo mAb anti-hIL-2 (5344.111), que está disponível comercialmente e sabe que se liga a um epítopo diferente de um epítopo ao qual se liga MAB602, foi utilizado como um controle.

[0120] Para a detecção de hIL-2, foi utilizada ELISA tipo sanduíche. 900 RU (Rmax = 90) de clones anti-2-hIL foram imobilizados em um chip CM5 por acoplamento de amina. Uma diluição de 2 vezes (100 nM) de hIL-2 foi deixada fluir sobre o chip com um caudal de 10 μl/min por 3 minutos e, em seguida, a dissociação da hIL-2 foi monitorada por 10 minutos.

[0121] A partir da análise competitiva, verificou-se que TCB2 competiu com MAB602. Foi demonstrado que, devido à sua especificidade, o mAb TCB2 não competiu com 5.344,111, mas completou com MAB602. Como resultado, confirmou-se que TCB2 teve uma afinidade mais elevada para a IL-2 humana do que outros mAbs anti-hIL-2 (Fig. 3).

Exemplo 4 Efeito antitumoral do complexo hIL-2/TCB2 Exemplo 4-1: Efeito de mAb TCB2 contra tumor sólido

[0122] A fim de demonstrar a utilidade clínica de TCB2 mAb contra um tumor sólido, células de melanoma B16F10 1x106 foram injetadas subcutaneamente em camundongos B6 e, em seguida, PBS, hIL-2 (0,8 μg) sozinho ou o complexo hIL-2/TCB2 (0,8 μg/8 g) foi injetado nos dias 4 a 7. Em seguida, a progressão do tumor foi monitorada durante 7 dias.

[0123] Como resultado, a inibição do crescimento do tumor sólido teve uma correlação com a magnitude de expansão induzida por citocinas de células T CD8+ e células NK (Fig. 4). O complexo de mAb hIL-2/TCB2 inibiu o crescimento tumoral melhor do que hIL-2 sozinho.

Exemplo 4-2: Efeito de mAb TCB2 contra o tumor metastático

[0124] A fim de demonstrar a utilidade clínica de mAb TCB2 contra um tumor metastático, células de melanoma B16F10 3x105 foram injetadas intravenosamente em camundongos B6. 7 dias após a injeção do tumor, hIL-2 por sozinho (0,8 μg) ou o complexo hIL-2/TCB2 (0,8 μ/8 μg) foi injetado a partir do dia 7 ao dia 10. No dia 18, o número de nódulos tumorais pulmonares foi medido.

[0125] Como resultado, a inibição da hIL-2/TCB2 bem inibiu nódulos tumorais pulmonares, ao contrário de hIL-2 (Fig. 5). Assim, pode ser visto que mAb TCB2 tem um efeito anticâncer potente, quando utilizado como o complexo de mAb hIL-2/TCB2.

Exemplo 5 Análise do efeito da combinação de complexo hIL-2/TCB2 e outras terapias anticâncer

[0126] Terapias anticâncer, as quais são atualmente desenvolvidas em todo o mundo, incluem um método que imuniza pacientes com um tumor neo-antígeno, e um método que utiliza inibidores de ponto de verificação, tais como anticorpos anti-CTLA-4 ou anticorpos anti-PD-1. Neste exemplo, foi analisado se o complexo hIL-2/TCB2 pode ser usado em combinação com estas terapias anticâncer.

Exemplo 5-1: Efeito da combinação de complexo hIL-2/TCB2 e terapia anticâncer baseada em neo-antígeno

[0127] De modo a testar a compatibilidade do complexo hIL-2/TCB2 com a terapia à base de neo-antígeno, células B16F10 1x106 foram injetadas subcutaneamente em camundongos B6 no dia 0. Em seguida, PBS ou uma mistura de peptídeo TRP2 (100 μg) e Poli I:C (100 μg) foi injetada nos dias 3 e 7. Um complexo hIL-2/TCB2 (0,8 μg/8 μg) foi injetado em dois ciclos de quatro injeções diárias nos dias 4 a 7 e dias 11 a 14. Em seguida, a progressão do tumor foi monitorado por 5 dias.

[0128] Como resultado, a injeção de complexo hIL-2/TCB2 e a terapia à base de neo-antígeno inibiu o crescimento do tumor B16F10 para extensões semelhantes. No entanto, quando os camundongos foram co-tratados com o complexo hIL-2/TCB2 e a terapia à base de neo- antígeno, o crescimento do tumor foi mais inibido (Fig. 6). Assim, pode ser visto que o complexo hIL-2/TCB2 pode ser utilizado em combinação com a terapia à base de neo-antígeno.

Exemplo 5-2: Efeito da combinação de complexo hIL-2/TCB2 e inibidor ponto de verificação

[0129] Para testar se o complexo de hIL-2/TCB2 pode ser utilizado em combinação com inibidores de ponto de verificação, modelos CT26 (Balb/câncer do cólon C) e MC38 (câncer do cólon B6) foram usados. Após o tratamento com o complexo hIL-2/ TCB2 em combinação com anticorpo anti-CTLA-4 ou anticorpo anti-DP-1 ou o tratamento com cada um destes anticorpos, foi observado o crescimento do tumor.

[0130] Para uma experiência em que os camundongos foram tratados com o complexo hIL- 2/TCB2 em combinação com o anticorpo anti-CTLA-4, células CT26 5x105 foram injetadas subcutaneamente em camundongos Balb/C (dia 0), e o anticorpo anti-CTLA-4 (100 μg) foi injetado três vezes em intervalos de 3 dias a partir do dia 7. O complexo hIL-2/TCB2 (0,8 μg/8 μg) foi injetado uma vez por dia desde o dia 8 até ao dia 11 (quatro vezes). Como resultado, o anticorpo anti-CTLA-4 inibiu fortemente o crescimento do tumor CT26, e o tumor foi rejeitado em 33% dos camundongos. Nos camundongos injetados com o complexo hIL-2/TCB2, o crescimento tumoral foi inibido menos do que nos camundongos injetados com o anticorpo anti-CTLA-4. No entanto, quando os camundongos foram tratados com a combinação de anti-CTLA-4 com complexo hIL-2/TCB2, o crescimento do tumor foi mais inibido do que o tratamento com o anticorpo anti-CTLA-4, e o tumor foi rejeitado em 63% dos camundongos (Fig. 7).

[0131] Para um experimento em que os camundongos foram tratados com o complexo hIL- 2/TCB2 em combinação com o anticorpo anti-DP-1, células MC38 5x105 foram injetados subcutaneamente em camundongos B6 (dia 0). Em seguida, o anticorpo anti-DP-1 (100 μg) foi injetado três vezes em intervalos de 3 dias a partir do dia 7, e o complexo hIL-2/TCB2 (1,5 μg/15 μg) foi injetado uma vez por dia desde o dia 8 até o dia 11 (quatro vezes). Como resultado, o tratamento com o anticorpo anti-DP-1 não foi eficaz em retardar o crescimento do tumor (o anticorpo anti-DP-1 foi utilizado a uma dose mais baixa do que a dose ótima), mas o tratamento com o complexo hIL-2/TCB2 inibiu fortemente o crescimento do tumor MC38 e rejeitou o tumor em 37% dos camundongos. Quando o complexo hIL-2/TCB2 e o anticorpo anti-DP-1 foram injetados em conjunto, o tumor foi rejeitado em 100% dos camundongos (Fig. 8).

Exemplo 5-3: Efeito na aquisição da resposta de memória imune em terapia anticâncer com complexo hIL-2/TCB2

[0132] A fim de examinar se os camundongos que rejeitaram um tumor adquiririam uma resposta de memória ao mesmo tumor, células MC38 5x105 foram injetadas em camundongos B6 ingênuos (que nunca foram inoculados com um tumor) ou os camundongos que rejeitaram o tumor por hIL-2/TCB2 nos Exemplos 2 a 5 (dia 25). O tumor MC38 cresceu rapidamente em camundongos B6 ingênuos injetados com ele, mas não cresceu nos camundongos que rejeitaram o tumor (Fig. 8). Isto sugere que a imunoterapia com o complexo hIL-2/TCB2 é particularmente útil na prevenção da recorrência do câncer em doentes.

[0133] Tomando estes resultados em conjunto, pode ser visto que o complexo hIL-2/TCB2 pode ser utilizado em combinação com inibidores de ponto de verificação, tais como anticorpo anti-CTLA-4 ou anti-DP-1 e é mais eficaz quando utilizado em combinação com estes inibidores de ponto de verificação.

Exemplo 6 Sequenciamento de anticorpo monoclonal TCB2

[0134] A região determinante de complementaridade (CDR) do mAb TCB2 foi sequenciada (Tabelas 1 a 3). Tabela 1 Sequência de DNA e sequência de aminoácido de região variável de anticorpo TCB2 Tabela 2 Sequência de DNA de CDR de anticorpo TCB2 Tabela 3 Sequência de aminoácido de CDR de anticorpo TCB2

[0135] Pode ser visto que a sequência de aminoácidos de TCB2 difere daquela de Nara1 (Tabela 4), que é um anticorpo mAb anti-hIL-2 recentemente desenvolvido por Onur Boyman e Natalia Ramirez (documento WO 2016/005950 A1). As semelhanças de CDR entre TCB2 e Nara1 são de 40%, 52,94% e 8,33% para as CDR de cadeia pesada 1 a 3, respectivamente, e 33,33%, 14,28% e 55,55% para a CDR de cadeia leve 1 a 3 (Tabela 5). Tabela 4 Sequência de aminoácido de CDR de anticorpo Nara1 Tabela 5

[0136] Com base nos dados de sequenciamento, a região Fab do mAb TCB2 foi clonada em um vetor de expressão de IgG2. A sequência de aminoácidos do vetor clonado é mostrada na Tabela 6 abaixo. Tabela 6 Sequência de aminoácido do TCB2 quimérico humano

Exemplo 7 Anticorpo Humanizado TCB2

[0137] A fim de reduzir a resposta imune do hospedeiro para IgG de camundongo, mAb TCB2 humanizado foi expresso e com IgG1 Fc humana (Tabela 7). A CDR de camundongo TCB2 (mTCB2) foi introduzida na região variável de IgG humana. Em seguida, para uma experiência in vivo, três clones de mAb TCB2 (hnTCB2) humanizados (VH1 + VL2, VH2 + VL2 e AH03463 (VL03463 + VH03463)) com a afinidade mais alta foram selecionados (Tabela 8). Tabela 7 Sequência de DNA e sequência de aminoácido de região variável de TCB2 humanizado

[0138] Resíduos na sequência de aminoácidos de VL03463, que eram diferentes daqueles em VL2, foram sublinhados. Por comparação da sequência da região de cadeia pesada, os resíduos em VH2 e VH03463, que eram diferentes daqueles em VH1, foram sublinhados. VL2 foi utilizado em conjunto com VH1 ou VH2 para expressar dois anticorpos TCB2 humanizados diferentes (VL2 + VH1 ou VL2 + VH2). Tabela 8 Afinidade de TCB2 humanizado para hIL-2

[0139] Para comparar a função de ativação das células imunes entre o TCB2 de camundongo original, TCB2 quimérico humano (hcTCB2) e TCB2 humanizado (hnTCB2), deixou-se que hIL-2 formasse complexos com diferentes TCB2s (TCB2 de camundongo (mTCB2), hcTCB2 e hnTCB2). Cada um dos complexos foi injetado em camundongos B6, uma vez por dia desde o dia 0 até ao dia 3 (quatro vezes, e no dia 5, as células esplénicas imunes foram analisadas por citometria de fluxo. Como resultado, foi demonstrado que a afinidade de hnTCB2 foi ligeiramente mais baixa do que a de mTCB2 ou hcTCB2 (Tabela 8), mas a função de hnTCB2 para ativar células imunes foi semelhante a do mTCB2 (Figura 9;. VL2+VH2 foi não indicado, devido à sua baixa funcionalidade). Assim, foi demonstrado que mTCB2 foi humanizado com sucesso.

[0140] A fim de analisar se hnTCB2 tem atividade anticâncer além da função de ativar células imunes, células MC38 5x105 foram injetadas subcutaneamente em camundongos B6 no dia 0, e anticorpo anti-DP-1 (200 μg) foi injetado três vezes em intervalos de 3 dias a partir do dia 7. Em seguida, o complexo hIL-2/hnTCB2 (VL2+VH1, 1,5 μg/15 μ) foi injetado uma vez por dia desde o dia 8 até ao dia 11 (quatro vezes) e, em seguida, o crescimento do tumor MC38 foi observado. Como resultado, o crescimento do tumor foi atrasado até mesmo por meio de tratamento com uma alta concentração do anticorpo anti-DP-1 sozinho, mas quando os camundongos foram tratados com o complexo hIL-2/hnTCB2, o crescimento do tumor MC38 foi fortemente inibido a um nível semelhante a um nível mostrado em tratamento com o complexo hIL-2/mTCB2, e o tumor foi rejeitado em 40% dos camundongos. Quando o complexo hIL-2/hnTCB2 ou o complexo hIL-2/mTCB2 foi injetado juntamente com o anticorpo anti-DP-1, o tumor foi rejeitado em 85% dos camundongos (Fig. 10). Assim, confirmou-se que a função de mTCB2 original foi conservada no TCB2 humanizado.

Aplicação industrial

[0141] O anticorpo anti-hIL-2 da presente invenção se liga especificamente a um epítopo particular de hIL-2 inibindo, assim, a ligação de hIL-2 a CD25, desse modo minimizando a expansão de células Treg. Além disso, ele estimula as células T CD8+ e células NK que exibem atividade antitumoral. Assim, o anticorpo anti-hIL-2 da presente invenção é útil como um novo agente terapêutico anticâncer.

[0142] Embora a presente invenção tenha sido descrito em detalhes com referência às características específicas, será evidente para os técnicos no assunto que esta descrição é apenas para uma realização preferida e não limita o escopo da presente invenção. Assim, o escopo substancial da presente invenção será definido pelas reivindicações anexas e seus equivalentes.

Claims (11)

1. ANTICORPO ANTI-hIL-2 OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO MESMO, capaz de se ligar especificamente a interleucina-2 humana (hIL-2) e inibir a ligação de hIL- 2 a CD25, dito anticorpo anti-hIL-2 ou fragmento de ligação ao antígeno caracterizado por compreender: - uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11, uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; e - uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, uma CDR2 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

2. ANTICORPO ANTI-hIL-2, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo quimérico ou humanizado.

3. ANTICORPO ANTI-hIL-2 OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO MESMO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo anti-hIL-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreender: - uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 3, 23, 28, 32 e 34; e - uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 4, 24, 26 e 30.

4. ANTICORPO ANTI-hIL-2 OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO MESMO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o anticorpo anti-hIL-2 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo compreender: - uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 4; - uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 24; - uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 28 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 26; - uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 32 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 30; ou - uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 34 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 30.

5. ANTICORPO ANTI-hIL-2 OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO DO MESMO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo induzir a expansão de células T CD8+ e células NK.

6. ÁCIDO NUCLEICO, caracterizado por codificar o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, conforme definido na reivindicação 1, em que o ácido nucleico compreende: - uma região variável de cadeia pesada que compreende uma CDR1 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 5, uma CDR2 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 6 e uma CDR3 de cadeia pesada compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 7; e - uma região variável de cadeia leve compreendendo uma CDR1 de cadeia leve compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 8, uma CDR2 de cadeia leve compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 9 e uma CDR3 de cadeia leve compreendendo uma sequência de DNA de SEQ ID NO: 10.

7. VETOR RECOMBINANTE, caracterizado por compreender o ácido nucleico conforme definido na reivindicação 6.

8. CÉLULA PROCARIÓTICA TRANSFORMADA, caracterizada por ser com o vetor recombinante conforme definido na reivindicação 7.

9. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO ANTI-hIL-2 OU UM FRAGMENTO DO MESMO, caracterizado por compreender uma cultura de células procarióticas conforme definida na reivindicação 8.

10. COMPLEXO, caracterizado por compreender o anticorpo anti-hIL-2 ou o fragmento de ligação a antígeno do mesmo, conforme definidos na reivindicação 1, e hIL-2, em que o anticorpo anti-hIL-2 ou fragmento de ligação ao antígeno estão ligados à hIL-2.

11. ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o ácido nucleico compreender uma região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 1 e uma região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 2.