JP2020520672A - 抗−ヒトインターロイキン−２抗体及びその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、ヒトインターロイキン−２（ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２，ｈＩＬ−２）に結合する抗体に関し、より具体的には、ｈＩＬ−２の特定エピトープに特異的に結合することによって、ｈＩＬ−２がＣＤ２５に結合するのを阻害する抗−ｈＩＬ−２抗体に関する。本発明の抗−ｈＩＬ−２抗体は、ｈＩＬ−２の特定エピトープに特異的に結合してｈＩＬ−２がＣＤ２５に結合するのを阻害することによって、Ｔｒｅｇ細胞の拡張を最小化する。また、抗腫瘍活性を示すＣＤ８＋Ｔ細胞とＮＫ細胞を刺激させる。したがって、本発明の抗−ｈＩＬ−２抗体は、新しい抗癌治療剤として活用可能である。【選択図】図１

Description

本発明は、ヒトインターロイキン−２（ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２，ｈＩＬ−２）に結合する抗体に関し、より具体的には、ｈＩＬ−２の特定エピトープに特異的に結合することによって、ｈＩＬ−２がＣＤ２５に結合するのを阻害する抗−ｈＩＬ−２抗体に関する。

インターロイキン−２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２，ＩＬ−２）は、Ｔｒｅｇ（Ｆｏｘｐ３^＋ ＣＤ４^＋調節Ｔ）細胞、ナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ、ＮＫ細胞）などＩＬ−２受容体を発現するＴ細胞を含む多様なリンパ細胞の生存、拡張及び機能に必須の役割をする多面的発現（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ）サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）である。ＩＬ−２受容体（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＩＬ−２Ｒ）は、親和度によって高親和性ＩＬ−２受容体（ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ＩＬ−２Ｒ）と低親和性ＩＬ−２受容体（ｌｏｗ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ＩＬ−２Ｒ）として存在する。高親和性ＩＬ−２受容体は、ＩＬ−２Ｒγｃ（ＣＤ１３２）、ＩＬ−２Ｒβ（ＣＤ１２２）及びＩＬ−２Ｒα（ＣＤ２５）の３個の鎖から構成されており、低い親和性ＩＬ−２受容体は、ただＩＬ−２Ｒγｃ、ＩＬ−２Ｒβ鎖だけから構成されている（Ｂｏｙｍａｎ，Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１２．１２（３）：ｐ．１８０−９０）。

ＩＬ−２は、抗腫瘍活性（ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有するＣＤ８^＋ Ｔ細胞とＮＫ細胞を刺激するので、１９９０年代に米国とヨーロッパで転移性黒色腫と転移性腎臓癌の治療のために臨床的に使用された（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０１４．１９２（１２）：ｐ．５４５１−８）。しかしながら、ＩＬ−２治療は、治療を受ける癌患者の１０％未満だけで効果的であり、深刻な副作用を伴った。これは、投与されたＩＬ−２が生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で非常に短い半減期を有し、抗腫瘍活性を有するＣＤ８^＋ Ｔ細胞とＮＫ細胞が、低親和性ＩＬ−２受容体を発現するので、多量のＩＬ−２投与が要求され、これによって血管漏出症候群と低血圧による多器官の深刻な疾患を誘発するためである（Ｌｏｔｚｅ，Ｍ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９８５．１３４（１）：ｐ．１５７−６６，Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ Ｐａｒｋ），２００２．１６（１１ Ｓｕｐｐｌ １３）：ｐ．１１−２０）。他の問題点は、ＩＬ−２の投与が、高親和性ＩＬ−２受容体を発現し、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞により媒介される抗腫瘍免疫を抑制するＴｒｅｇ細胞の強力な拡張を誘導するということである（Ｂｒａｎｄｅｎｂｕｒｇ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００８．３８（６）：ｐ．１６４３−５３；Ｆａｃｃｉａｂｅｎｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２０１２．７２（９）：ｐ．２１６２−７１）。ＩＬ−２治療のこのような短所を解決する方法は、ＩＬ−２の生体内半減期を延長させ、同時に低親和性ＩＬ−２受容体を発現するＣＤ８^＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞を選択的に活性化させることであり、このために多くの試みがあったが、若干の成功があっただけである（Ａｒｅｎａｓ−Ｒａｍｉｒｅｚ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ、２０１６．８（３６７）：ｐ．３６７ｒａ１６６）。

最近、高親和性ＩＬ−２受容体に結合するＩＬ−２のアミノ酸残基の変形が解決方法として提案されたが、人為的に導入されたアミノ酸配列を分解するタンパク質分解酵素に対して免疫原性を有するか、又は感受性を有する変形されたＩＬ−２を提供することができるという限界点がある（Ｌｅｖｉｎ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ、２０１２．４８４（７３９５）：ｐ．５２９−３３）。

これより、本発明者らは、ＩＬ−２に不自然な変形を起こさず、ＩＬ−２の生体内半減期を延長させ、同時に低親和性ＩＬ−２受容体を発現するＣＤ８^＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞を選択的に活性化させる方法を開発するために努力した結果、ＩＬ−２に特定の特異性を有する抗−ＩＬ−２モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡＢ，ｍＡｂ）を結合させると、ＩＬ−２が高親和性受容体に結合するのを選択的に阻害することを確認することによって、本発明を完成するに至った。

本発明の背景技術の部分に記載された前記情報は、ただ本発明の背景に対する理解を向上させるためのものであり、これにより、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者にとってすでに知られた先行技術を形成する情報を含まないことがある。

本発明の目的は、ヒトインターロイキン−２（ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２，ｈＩＬ−２）に特異的に結合し、前記ｈＩＬ−２がＣＤ２５に結合するのを阻害する、抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、前記核酸を含むベクター及び前記ベクターで形質転換された細胞、これを利用した抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防又は治療用組成物及び治療方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異抗体又は抗体−薬物の接合体、これを有効成分として含む癌の予防又は治療用組成物及び治療方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片及び免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む癌治療用併用投与組成物及び治療方法を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片を提供する。

本発明は、また、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞及びこれを利用した抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する。

本発明は、また、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片とｈＩＬ−２が結合された複合体を提供する。

本発明は、また、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防又は治療用組成物及び治療方法を提供する。

本発明は、また、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異抗体又は抗体−薬物の接合体、これを有効成分として含む癌の予防又は治療用組成物及び治療方法を提供する。

本発明は、また、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片及び免疫チェックポイント阻害剤を含む癌治療用併用投与組成物及び治療方法を提供する。

本発明は、また、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片の癌の予防又は治療の使用を提供する。

本発明は、また、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片の癌の予防又は治療のための薬剤を製造するための使用を提供する。

本発明は、また、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含むワクチン効能増進用組成物を提供する。

図１は、ＴＣＢ２モノクローナル抗体のｈＩＬ−２に対する結合特異性の実験結果を示すものである。 図２は、ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体による生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）免疫刺激効果を示すものである。図２Ａは、免疫細胞頻度の分析結果、図２Ｂは、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞でＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの発現分析結果、図２Ｃは、実験統計の分析結果、図２Ｄは、ｈＩＬ−２／ＭＡＢ６０２又は、ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体による免疫細胞の拡張効果に対する結果と実験統計分析である（＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ ｔｅｓｔ））。 図３は、抗−ｈＩＬ−２ ｍＡｂｓのｈＩＬ−２に対する親和度をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００を利用して表面プラズモン共鳴曲線で示すものである。 図４は、固形腫瘍に対するｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体の効果を示すものである（＊＊＊ｐ＜０．００１（Ｔｗｏ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｆｏｒ ｄａｙ １２，ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄａｙ １４））。 図５は、転移性腫瘍に対するＴＣＢ２ ｍＡｂの効果を示すものである（＊＊＊ｐ＜０．００１（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ ｔｅｓｔ））。 図６は、Ｂ６Ｆ１０黒色腫モデルでｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体及びｔｕｍｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｙ併用の抗腫瘍効果を示すものである（＊＊＊ｐ＜０．００１（Ｔｗｏ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ））。 図７は、ＣＴ２６腫瘍モデル（Ｂａｌｂ／Ｃ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）でｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体及び抗−ＣＴＬＡ−４抗体併用の抗腫瘍効果を示すものである（＊＊ｐ＜０．０１（Ｔｗｏ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｆｏｒ ｄａｙ １７，ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄａｙ ２４））。 図８は、ＭＣ３８腫瘍モデル（Ｂ６ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）でｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体及び抗−ＰＤ−１抗体併用の抗腫瘍効果を示すものである（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１（Ｔｗｏ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｆｏｒ ｄａｙ １９，ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄａｙ ２１））。 図９は、ｈＩＬ−２／ｈｎＴＣＢ２複合体による生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）免疫刺激効果に対する結果と実験統計分析である。 図１０は、ＭＣ３８腫瘍モデル（Ｂ６ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）でｈＩＬ−２／ｈｎＴＣＢ２複合体及び抗−ＰＤ−１抗体併用の抗腫瘍効果を示すものである（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１（Ｔｗｏ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｆｏｒ ｄａｙ １９ ａｎｄ ２２，ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｄａｙ ２５））。

別途定義されない限り、本明細書で使用されたすべての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野において熟練した専門家により通常的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に本明細書で使用された命名法は、本技術分野においてよく知られており、通常的に使用されるものである。

本発明では、不自然な変形を起こさず、ＩＬ−２の生体内半減期を延長させ、同時に低親和性ＩＬ−２受容体を発現するＣＤ８^＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞を選択的に活性化させる方法を開発するために努力した結果、ＩＬ−２に特定の特異性を有する抗−ＩＬ−２モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＡＢ，ｍＡｂ）を結合させると、ＩＬ−２が高親和性受容体に結合することを選択的に阻害することを確認しようとした。

本発明は、一態様において、ヒトインターロイキン−２（ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２，ｈＩＬ−２）に特異的に結合し、前記ｈＩＬ−２がＣＤ２５に結合するのを阻害する、抗−ｈＩＬ−２抗体（本明細書内で「ＴＣＢ２」で示す）又はその抗原結合断片に関する。

本発明において、ヒトインターロイキン−２（ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２，ｈＩＬ−２）とは、どんな他の因子とも実質的な配列相同性を有しない１３３個のアミノ酸からなるタンパク質（１５．４ ｋＤａ）を示すものである。

本発明において、ＣＤ２５とは、ＩＬ−２受容体のＩＬ−２Ｒα鎖を示すものであって、ＩＬ−２受容体は、親和度によって高親和性ＩＬ−２受容体（ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ＩＬ−２Ｒ）と低親和性ＩＬ−２受容体（ｌｏｗ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ＩＬ−２Ｒ）として存在し、ＣＤ２５は、低い親和性ＩＬ−２受容体には存在せず、高親和性ＩＬ−２受容体にのみ存在する鎖である。

本明細書で使用された用語「抗体」とは、免疫系内で抗原の刺激によって作られる物質を意味するものであって、その種類は、特に制限されない。抗体は、最近、疾患治療剤の用途で多く使用されている。抗体は、生体外だけでなく、生体内でも非常に安定しており、半減期が長いので、大量発現及び生産に有利である。また、抗体は、本質的にダイマー（ｄｉｍｅｒ）構造を有するので、接着能（ａｖｉｄｉｔｙ）が非常に高い。完全な抗体は、２個の全長（ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）軽鎖及び２個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖と二硫化結合で連結されている。抗体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域に分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びイプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域は、キャパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。

本発明において、抗体は、動物由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体を全部含む。所望の抗原を被免疫動物に免疫させて生産する動物由来抗体は、一般的に治療目的でヒトに投与時に免疫拒否反応が起こり得、このような免疫拒否反応を抑制するために、キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）が開発された。キメラ抗体は、遺伝工学的方法を利用して抗−アイソタイプ（ａｎｔｉ−ｉｓｏｔｙｐｅ）反応の原因となる動物由来抗体の不変領域をヒト抗体の不変領域に置換したものである。キメラ抗体は、動物由来抗体に比べて抗−アイソタイプ反応において相当部分改善されたが、依然として動物由来アミノ酸が可変領域に存在していて、潜在的な抗−イディオタイプ（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ）反応に対する副作用を内包している。このような副作用を改善するために開発されたものが、ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）である。これは、キメラ抗体の可変領域のうち抗原の結合に重要な役割をするＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ、相補性決定領域）部位をヒト抗体骨格（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）に移植して製作される。

前記「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖可変ドメイン免疫グロブリン及びヒト化重鎖可変ドメイン免疫グロブリンを含む。ヒト化抗体は、一つ以上のヒト遺伝子配列で部分的に又は全体的に誘導された一定の領域（合成アナログを含む）を含むことができる。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ標的抗原に結合するものと期待される。通常、ヒト化抗体又は免疫グロブリンのすべてのセグメント又は部分は、ＣＤＲを除いて、自然発生又は保存（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）ヒト免疫グロブリン配列の対応するセグメント又は部分と実質的に同一であるか、実質的に同種性である。ヒト化抗体を製作するためのＣＤＲ移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）技術において最も重要なことは、動物由来抗体のＣＤＲ部位を最もよく受け入れることができる最適化したヒト抗体を選定することであり、このために抗体データベースの活用、結晶構造（ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）の分析、分子モデリング技術などが活用される。しかしながら、最適化したヒト抗体骨格に動物由来抗体のＣＤＲ部位を移植しても、動物由来抗体の骨格に位置しつつ、抗原結合に影響を及ぼすアミノ酸が存在する場合があるので、抗原結合力が保存されない場合が相当数存在するので、抗原結合力を復元するための更なる抗体工学技術の適用は必須と言える。

本発明の用語「モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｂ，ｍＡｂ）」とは、本発明の技術分野において通常的に使用される意味で使用されたものであって、結合された抗原上の単一エピトープを認識する抗体を意味するものである。この点が、同じ抗原に結合するが、その抗原の異なるエピトープに結合する区別される抗体の集合を意味するポリクローナル抗体と対比される。このような理由で、単一抗原分子は、複数のポリクローナル抗体により同時に結合され得るが、この抗原に特異的な特定のモノクローナル抗体は、ただ一つの分子だけにより結合され得る。単一モノクローナル抗体分子により結合された後、結合されたエピトープは遮断され、したがって、これ以上他の同じモノクローナル抗体により結合され得ない。抗体のモノクローナル性質は、治療剤としての使用に特に適合しており、これは、このような抗体が単一、同種性分子種であるので、非常によく特性化され得、再現可能に製造され、精製可能であるためである。このような要因は、生物学的活性が非常に高い水準の精密性で予測され得る製品を生産可能にし、このような分子は、哺乳類、特にヒトでの治療的投与に対して官庁での許可を得なければならないので、前記要因は、特に重要である。

本明細書で使用された用語「重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）」とは、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３とヒンジ（ｈｉｎｇｅ）を含む全長重鎖及びその断片を全部含むものである。本明細書で使用された用語「軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）」とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片を全部含むものである。

本発明において、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３、配列番号２３、配列番号２８、配列番号３２及び配列番号３４よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号４、配列番号２４、配列番号２６及び配列番号３０よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする。好ましくは配列番号３の重鎖可変領域及び配列番号４の軽鎖可変領域；配列番号２３の重鎖可変領域及び配列番号２４の軽鎖可変領域；配列番号２８の重鎖可変領域及び配列番号２６の軽鎖可変領域；配列番号３２の重鎖可変領域及び配列番号３０の軽鎖可変領域；又は配列番号３４の重鎖可変領域及び配列番号３０の軽鎖可変領域を含むことを特徴とする。

本明細書で使用された用語「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ）」とは、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の高可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）のアミノ酸配列を意味する。重鎖及び軽鎖は、それぞれ３個のＣＤＲを含むことができる（重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、重鎖ＣＤＲ３及び軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、軽鎖ＣＤＲ３）。前記ＣＤＲは、抗体が抗原又はエピトープに結合するにあたって主要な接触残基を提供することができる。

本発明において、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５のＤＮＡ配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号６のＤＮＡ配列を含む重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７のＤＮＡ配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号８のＤＮＡ配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号９のＤＮＡ配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１０のＤＮＡ配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする。

本発明において、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１；配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする。

本発明の用語「特異的に結合」とは、当業者に通常的に公知となっている意味と同じものであって、抗原及び抗体が特異的に相互作用して免疫学的反応をすることを意味する。本発明では、ヒトＩＬ−２（ｈＩＬ−２）が数個のｈＩＬ−２と異なるその他潜在的抗原を区別できるヒトモノクローナル抗体又はその断片の能力を指すものであり、前記区別は、複数の異なる抗原プールで潜在的結合パートナーとしてただｈＩＬ−２と結合したり相当な程度で結合する程度よりなる。この場合、「ｈＩＬ−２と相当な程度で結合」は、複数の同等に接近可能な異なる抗原プールで潜在的結合パートナーとしてｈＩＬ−２がｈＩＬ−２でない他の抗原より少なくとも１０倍、好ましくは５０倍、最も好ましくは１００倍又はそれ以上で結合することを意味する。

本発明の用語「抗原結合断片」とは、免疫グロブリン全体構造に対するその断片であって、抗原が結合し得る部分を含むポリペプチドの一部を意味する。例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ´又は、Ｆ（ａｂ´）_２であり得るが、これに限定されない。前記抗原結合断片のうちＦａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域（Ｃ_Ｈ１）を有する構造であって、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ´は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点からＦａｂと差異がある。Ｆ（ａｂ´）_２抗体は、Ｆａｂ´のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成して生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体断片であって、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は、当業界に広く公知されている。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変部位と軽鎖可変部位が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、一般的にペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合で連結されたり、又は、Ｃ−末端ですぐに連結されていて、二重鎖Ｆｖのようにダイマーのような構造を成すことができる。前記リンカーは、１〜１００個又は２〜５０個の任意のアミノ酸よりなるペプチドリンカーであり得、当業界に適切な配列が知られている。前記抗原結合断片は、タンパク質加水分解酵素を利用して得ることができ（例えば、全体抗体をパパインで制限切断すると、Ｆａｂを得ることができ、ペプシンで切断すると、Ｆ（ａｂ´）_２断片を得ることができる）、遺伝子組換え技術を用いて製作することができる。本発明の抗体の抗原結合断片は、前記ＣＤＲを一つ以上含む断片であり得る。

本発明において、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞とＮＫ細胞の拡張を誘導することを特徴とする。本発明の一実施例において、本発明による抗−ｈＩＬ−２抗体がＣＤ８^＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞活性化を誘導し、少ないＴｒｅｇ細胞拡張を誘導することを確認した。

本発明は、他の観点から、抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸に関する。

本発明において、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１又は配列番号３３の配列を含むことを特徴とする。具体的に、本発明による抗体の重鎖をコードする核酸配列は、配列番号２７、配列番号３１又は配列番号３３及び／又は本発明による抗体の軽鎖をコードする核酸配列は、配列番号２、配列番号２５又は配列番号２９である。

本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を分離して抗体又はその抗原結合断片を組換え的に生産することができる。核酸を分離し、これを複製可能なベクター内に挿入して追加にクローニングしたり（ＤＮＡの増幅）又は追加に発現させる。

本発明の用語「核酸」とは、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は変形され得る。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。

本発明の核酸は、前記ヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含む。実質的な同一性は、本発明のヌクレオチド配列と任意の他の配列を最大限対応するようにアラインし、当業界において通常的に利用されるアルゴリズムを利用してアラインされた配列を分析した場合に、最小８０％の相同性、より好ましくは最小９０％の相同性、最も好ましくは最小９５％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。

前記抗体を暗号化するＤＮＡは、通常の過程を使用して（例えば、抗体の重鎖と軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離又は合成する。

本発明は、さらに他の観点において、前記核酸を含む組換えベクターに関する。

多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には、一般的に、次のうち一つ以上が含まれるが、これに制限されない：信号配列、複製基点、一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、及び転写終結配列が可能である。

本明細書で使用される用語「ベクター」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であって、プラスミドベクター；コスミドベクター；バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどを含む。前記ベクターで抗体をコードする核酸は、プロモーターと作動的に連結されている。

本明細書で使用される用語「作動的に連結」とは、核酸発現調節配列（例：プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列間の機能的な結合を意味し、これによって前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節することになる。

原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合部位及び転写／解読終結配列を含むことが一般的である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムに由来したプロモーター（例：メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトヘログロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスに由来したプロモーター（例：アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が利用され得、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。

場合によって、ベクターは、それから発現する抗体の精製を容易にするために他の配列と融合されることもできる。融合される配列は、例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。

前記ベクターは、選択標識として当業界において通常的に利用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えばアンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。

本発明は、さらに他の観点において、前記組換えベクターで形質転換された細胞に関する。本発明の抗体を生成させるために使用された細胞は、原核生物、酵母又は高等真核生物細胞であり得るが、これに制限されるものではない。

本発明において、前記形質転換された細胞は、エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルスサブチルス及びバチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）又はスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコッカスカルノスス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を利用することができる。

ただし、動物細胞に対する関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ−７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ−Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０であり得るが、これに制限されるものではない。

本発明は、さらに他の観点において、前記細胞を培養して本発明による抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片を発現させる段階を含む抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片の製造方法に関する。

前記細胞は、各種培地で培養することができる。市販用培地のうち制限なしに培養培地として使用することができる。当業者に公知となっているその他すべての必須補充物が適当な濃度で含まれることもできる。培養条件、例えば温度、ｐＨなどが発現のために選別された宿主細胞とともにすでに使用されており、これは、当業者に明白だろう。

前記抗体又はその抗原結合断片の回収は、例えば遠心分離又は限外濾過によって不純物を除去し、その結果物を例えば親和クロマトグラフィーなどを利用して精製することができる。追加のその他精製技術、例えば陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどが使用され得る。

本発明は、さらに他の観点において、抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片とｈＩＬ−２が結合された複合体に関する。

本発明は、さらに他の観点において、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片に薬物が接合された抗体−薬物の接合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＡＤＣ）に関する。

抗体−薬物の接合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＡＤＣ）は、ターゲット癌細胞に抗癌薬物を伝達する前まで抗癌薬物が抗体に安定的に結合されていなければならない。ターゲットに伝達された薬物は、抗体から遊離してターゲット細胞の死滅を誘導しなければならない。このためには、薬物が抗体に安定的に結合すると同時に、ターゲット細胞から遊離するときは、ターゲット細胞の死滅を誘導する十分な細胞毒性を有しなければならない。

本発明において、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片と抗癌剤など薬物を含む細胞毒性物質は、互いに結合（例えば、共有結合、ペプチド結合などによる）されての接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）又は融合タンパク質（細胞毒性物質及び／又は標識物質がタンパク質である場合）の形態で使用され得る。前記細胞毒性物質は、癌細胞、特に固形癌細胞に対して毒性を有するすべての物質であり得、放射線同位元素、細胞毒素化合物（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、細胞毒性タンパク質、抗癌剤などよりなる群から選ばれる１種以上であり得るが、これに制限されるものではない。前記細胞毒素タンパク質は、リシン（ｒｉｃｉｎ）、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、ゲロニン （ｇｅｌｏｎｉｎ）、モモルジン（ｍｏｍｏｒｄｉｎ）、デボガニン（ｄｅｂｏｕｇａｎｉｎ）、ジフテリア毒素、緑膿菌毒素（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔｏｘｉｎ）などよりなる群から選ばれる１種以上であり得るが、これに制限されるものではない。前記放射線同位元素としては、^１３１Ｉ、^１８８Ｒｈ、^９０Ｙなどよりなる群から選ばれる１種以上であり得るが、これに制限されるものではない。前記細胞毒素化合物は、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ；ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ；ＭＭＡＦ）、Ｎ２´−ジアセチル−Ｎ２´−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）マイタンシン（Ｎ２´−ｄｅａｃｅｔｙｌ−Ｎ２´−（３−ｍｅｒｃａｐｔｏ−１−ｏｘｏｐｒｏｐｙｌ）ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ；ＤＭ１）、ＰＢＤ（Ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）ｄｉｍｅｒなどよりなる群から選ばれる１種以上であり得るが、これに制限されるものではない。

本発明において、前記抗体−薬物の接合体は、本発明の属する技術分野によく知られた技術によるものであり得る。

本発明において、前記抗体−薬物の接合体は、前記抗体又はその抗原結合断片がリンカーを介して薬物と結合されることを特徴とする。

本発明において、前記リンカーは、切断性リンカー又は非切断性リンカーであることを特徴とする。

前記リンカーは、抗−ｈＩＬ−２抗体と薬物の間を連結する部位であって、例えば前記リンカーは、細胞内条件で切断可能な形態、すなわち細胞内環境で抗体から薬物がリンカーの切断を通じて放出され得るようにする。

前記リンカーは、細胞内環境、例えばリソソーム又はエンドソームに存在する切断制により切断され得、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素、例えばリソソーム又はエンドソームプロテアーゼにより切断され得るペプチドリンカーであり得る。一般的にペプチドリンカーは、少なくとも２個以上のアミノ酸長さを有する。前記切断剤は、カテプシンＢ及びカテプシンＤ、プラスミンを含むことができ、ペプチドを加水分解して薬物を標的細胞内に放出することができるようにする。前記ペプチドリンカーは、チオール依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂにより切断され得、これは、癌組織で高発現され、例えばＰｈｅ−Ｌｅｕ又はＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙリンカーが使用され得る。また、前記ペプチドリンカーは、例えば細胞内プロテアーゼにより切断され得るものであって、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカーであるか、Ｐｈｅ−Ｌｙｓリンカーであり得る。

本発明において、前記切断性リンカーは、ｐＨ敏感性であり、特定のｐＨ値で加水分解に敏感であり得る。一般的に、ｐＨ敏感性リンカーは、酸性条件で加水分解され得ることを示す。例えば、リソソームで加水分解され得る酸性不安定リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニティクアミド（ｃｉｓ−ａｃｏｎｉｔｉｃ ａｍｉｄｅ）、オルソエステル、アセタール、ケタルなど）であり得る。

前記リンカーは、還元条件で切断されることもできる（例えば二硫化リンカー）。ＳＡＴＡ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）、ＳＰＤＰ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ＳＰＤＢ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｂｕｔｙｒａｔｅ）及びＳＭＰＴ（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−ａｌｐｈａ−ｍｅｔｈｙｌ−ａｌｐｈａ−（２−ｐｙｒｉｄｙｌ−ｄｉｔｈｉｏ）ｔｏｌｕｅｎｅ）を使用して多様な二硫化結合が形成され得る。

本発明において、前記薬物及び／又は薬物−リンカーは、抗体のリジンを介して無作為で接合されたり、二硫化結合鎖を還元したときに露出するシステインを介して接合され得る。場合によって、遺伝工学的に製作されたタグ、例えば、ペプチド又はタンパク質に存在するシステインを介してリンカー−薬物が結合され得る。前記遺伝工学的に製作されたタグ、例えば、ペプチド又はタンパク質は、例えば、イソプレノイドトラスフェラーゼにより認識され得るアミノ酸モチーフを含むことができる。前記ペプチド又はタンパク質は、ペプチド又はタンパク質のカルボキシ末端で欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を有したり、ペプチド又はタンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端にスペーサーユニットの共有結合を通した付加を有する。前記ペプチド又はタンパク質は、アミノ酸モチーフとすぐに共有結合されたり、スペーサーユニットと共有結合されてアミノ酸モチーフと連結され得る。前記アミノ酸スペーサーユニットは、１〜２０個のアミノ酸から構成され、そのうちグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）ユニットが好ましい。

前記リンカーは、リソソームで多数存在したり、又はいくつかの腫瘍細胞で過発現するベータ−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ）により認識されて加水分解されるベータ−グルクロニドリンカーを含むことができる。ペプチドリンカーとは異なって、親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）が大きくて、疎水性の性質が高い薬物と結合時に抗体−薬物の接合体の溶解度を増加させることができるという長所を有する。

また、前記リンカーは、非切断性リンカーであり得、抗体加水分解の一段階だけを通じて薬物が放出され、例えばアミノ酸−リンカー−薬物の接合体を生産する。このような類型のリンカーは、チオエーテル基又はマレイミドカプロイル基（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）であり得、血液内安定性を維持することができる。

本発明において、前記薬物は、化学療法剤、毒素、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は放射性同位元素であることを特徴とする。前記薬物は、薬理学的効果を示す製剤で抗体に結合され得る。

前記化学療法剤は、細胞毒性製剤又は免疫抑制剤であり得る。具体的にマイクロチューブリン抑制剤、類似分裂抑制剤、トポイソメラーゼ阻害薬、又はＤＮＡインターカレーターとして機能できる化学療法剤を含むことができる。また、免疫調節化合物、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗バクテリア剤、抗真菌剤、駆虫剤又はこれらの組合せを含むことができる。

前記薬物には、例えば、マイタンシノイド、オリスタチン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、タリソマイシン、カンプトテシン、Ｎ８−アセチルスペルミジン、１−（２クロロエチル）−１，２−ジメチルスルホニルヒドラジド、エスペラマイシン、エトポシド、６−メルカプトプリン、ドラスタチン、トリコテセン、カリケアマイシン、タキソル（ｔａｘｏｌ）、タキサン、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、デュオカルマイシン、Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニトロソウレア （ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、窒素マスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＣＮＵ（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、トレオサルファン（ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）、デカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、９−アミノカンプトテシン（９−ａｍｉｎｏｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、 トリメトレキサート （ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、マイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ＥＩＣＡＲ（５−ｅｔｈｙｎｙｌ−１−ｂｅｔａ−Ｄｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ−４−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ（ａｒａ Ｃ））、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、ロイプロリドアセテート（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３、ＫＨ１０６０、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、光減作剤Ｐｅ４（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ Ｐｅ４）、デメトキシ−ヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ−ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ）、インターフェロン−α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α）、インターフェロン−γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ベルケイド（ｖｅｌｃａｄｅ）、レバミド（ｒｅｖａｍｉｄ）、タラミド（ｔｈａｌａｍｉｄ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、１−メチル−４−フェニルピリジニウムイオン（１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｉｏｎ）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシンＡ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ａ２）、ブレオマイシンＢ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎＢ２）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）及びタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、核酸分解酵素及び細菌や動植物由来の毒素よりなる群から選ばれる一つ以上であり得るが、これに限定されるものではない。

本発明において、前記薬物は、リンカー及びリンカー試薬上の親電子性基と共有結合を形成するために反応できるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、及びアリールヒドラジド基よりなる群から選ばれる一つ以上の親核基を含むことができる。

本発明は、さらに他の観点において、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異抗体（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）に関する。

本発明において、前記二重特異抗体は、抗体の２個のアーム（ａｒｍ）のうち、一つのアーム（ａｒｍ）は、本発明による抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片を含み、残りの他のアーム（ａｒｍ）は、ｈＩＬ−２以外の他の抗原、好ましくは癌関連抗原又は免疫チェックポイントタンパク質抗原に特異的な抗体、又は免疫効能細胞関連抗原に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む形態を意味する。

前記二重抗体に含まれる抗−ｈＩＬ−２抗体以外の抗体が結合する抗原は、好ましくは癌関連抗原又は免疫チェックポイントタンパク質抗原としてＨｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ、ＣＤ−２０、ＭＵＣ１６、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＢＴＬＡ４、ＥｐｈＢ２、Ｅ−セレクチン（ｓｅｌｅｃｔｉｎ）、ＥｐＣａｍ、ＣＥＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＥＲＢ３、ｃ−ＭＥＴなどから選ばれ、免疫効能細胞関連抗原としては、ＴＣＲ／ＣＤ３、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ） ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ６９、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、ＣＤ８９及びＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８（ＣＲ３）などが選ばれるが、これに限定されるものではない。

本発明は、さらに他の観点において、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防又は治療用組成物に関する。

本発明は、さらに他の観点において、前記二重特異抗体又は抗体−薬物の接合体を有効成分として含む癌の予防又は治療用組成物に関する。

「癌」とは、細胞の正常な分裂、分化及び死滅の調節機能に問題が発生して非正常的に過多増殖して周囲組織及び臓器に浸潤して塊りを形成し、既存の構造を破壊したり変形させる状態を意味するものである。「固形癌（ｓｏｌｉｄ ｃａｎｃｅｒ）」は、血液癌とは区別される特徴を有し、膀胱、乳房、腸、腎臓、肺、肝、脳、食道、胆嚢、卵巣、すい臓、胃、子宮頸部、甲状腺、前立腺及び皮膚などの様々な固形臓器（ｓｏｌｉｄ ｏｒｇａｎ）で非正常的に細胞が成長して発生した塊りよりなる癌を意味するものである。「転移癌」は、癌が最初発生した部位から分離した癌細胞が血液、リンパ管などを介して他の部位に転移して増殖することによって発生する。本発明の組成物は、固形癌及び／又は転移癌の予防又は治療用に使用され得、例えば、皮膚癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、脳癌、食道癌、胆嚢岩、卵巣癌、すい臓癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌、膀胱癌の予防又は治療用に使用され得るが、これに制限されるものではない。

本明細書で使用された用語「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ／ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」とは、組成物の投与により癌の転移、成長などを抑制させたり発病を遅延させるすべての行為を意味するものであり、「治療」とは、組成物の投与により癌による症状が好転したり有利に変更するすべての行為を意味するものである。

本発明の組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、前記担体は、薬物の製剤化に通常的に利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどよりなる群から選ばれる１種以上であり得るが、これに限定されるものではない。前記組成物は、また、薬学組成物の製造に通常的に使用される希釈剤、賦形剤、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などよりなる群から選ばれる１種以上をさらに含むことができる。

前記組成物、又は前記抗体の薬学的有効量は、経口又は非経口で投与することができる。非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与することができる。経口投与時、タンパク質又はペプチドは、消化されるので、経口用組成物は、活性薬剤をコートしたり胃での分解から保護されるように剤形化され得る。また、前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置により投与され得る。

前記組成物内の抗−ｈＩＬ−２抗体（ＴＣＢ２ ｍＡｂ）の含有量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に処方され得る。例えば、前記抗−ｈＩＬ−２抗体（ＴＣＢ２ ｍＡｂ）の１日投与量は、０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、具体的に０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より具体的に０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得るが、これに制限されるものではない。前記抗−ｈＩＬ−２抗体（ＴＣＢ２ ｍＡｂ）の１日投与量は、単位用量の形態で一つの製剤に製剤化されたり、適切に分量して製剤化されたり、多用量の容器内に内入させて製造され得る。前記「薬学的有効量」は、所望の薬理的効果を示すことができる有効成分の含量又は投与量を意味するものであり、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与間隔、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に定められる。

本発明の組成物は、当該発明の属する技術分野において通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を利用して製剤化することによって、単位用量の形態で製造されたり、又は多用量の容器内に内入させて製造され得る。この際、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であり得、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。また、前記組成物は、他の治療剤とともに個別的に又は同時に投与され得る。

特に、前記抗−ｈＩＬ−２抗体（ＴＣＢ２ ｍＡｂ）を含む組成物は、抗体を含むので、免疫リポソームに剤形化され得る。抗体を含むリポソームは、当業界に広く知られた方法により製造され得る。前記免疫リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びポリエチレングリコール−誘導体化したホスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物であって、逆相蒸発法により製造され得る。例えば、抗体のＦａｂ´断片は、ジスルフィド−交換反応を通じてリポソームに接合され得る。

本発明は、さらに他の観点において、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片及び免疫チェックポイント阻害剤を含むことを特徴とする癌治療用併用投与組成物に関する。

本発明において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ又はｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを意味し、抗−ＣＴＬＡ−４抗体又は抗−ＰＤ−１抗体であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。

「併用（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ又はｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」は、抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片と免疫チェックポイント阻害剤それぞれが同時に、順次に、又は逆順に投与され得ることを意味するものであって、当業者の範囲内適切な有効量の組合せで投与され得る。

本発明の一実施例において、抗−ＣＴＬＡ−４抗体又は抗−ＰＤ−１抗体と本発明による抗−ｈＩＬ−２抗体を順次に処理した場合、腫瘍の成長をさらに抑制することを確認した。

前記併用投与組成物は、抗−ｈＩＬ−２抗体を含み、これと関連した構成は、前述した癌の予防又は治療用組成物に含まれた構成と同一なので、各構成に関する説明は、併用投与用組成物においても同一に適用される。

本発明は、さらに他の観点において、前記抗−ｈＩＬ−２抗体、その抗原結合断片、前記二重特異抗体又は前記抗体−薬物の接合体の薬学的に有効な量を患者に投与する段階を含む癌予防及び／又は治療方法を提供する。

本発明の前記組成物は、個別治療剤として投与されたり他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤とは順次に又は同時に投与され得る。

任意の抗癌剤、例えばシスプラチンは、悪液質、筋肉減弱症、筋肉消耗、骨消耗又は非自発的な体重減少のように副作用を有する。したがって、本発明は、悪液質、筋肉減弱症、筋肉消耗、骨消耗又は非自発的な体重の減少の重症度、頻度又は発生を予防したり最小化したり低減しつつ癌を治療するための組成物又は癌治療方法を含むことができる。

一つ以上の抗癌剤と組み合わせて本発明の抗−ｈＩＬ−２抗体の有効量を含む薬学的組成物を投与する段階を含む。特定の具現例において、本発明は、悪液質、筋肉減弱症又は筋肉消耗、骨消耗又は非自発的な体重減少の重症度、頻度又は発生を予防したり最小化したり低減しつつ癌を治療する方法を含み、方法は、悪液質、筋肉減弱症又は筋肉消耗、骨消耗又は非自発的な体重の減少の重症度、頻度又は発生を誘発したり増加させると知られている一つ以上の抗癌剤と組み合わせて本発明の抗−ｈＩＬ−２抗体の有効量を含む薬学的組成物を患者に投与する段階を含む。

本発明は、さらに他の観点において、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片を含む組成物を免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）と併用投与する段階を含む癌治療方法に関する。

本発明による癌治療方法は、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片と免疫チェックポイント阻害剤が同時に、順次に、又は逆順に投与され得る。好ましくは、前記方法は、下記段階を含むことができるが、これに制限されない：（Ａ）免疫チェックポイント阻害剤で治療する段階；及び（Ｂ）抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片で治療する段階。

前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗−ＣＴＬＡ−４抗体又は抗−ＰＤ−１抗体であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。前記癌治療方法は、抗−ｈＩＬ−２抗体を含む組成物及び上述した組成物に含まれた構成と同じ構成を含む。したがって、各構成に関する説明は、併用投与による癌治療方法にも同一に適用される。

本発明は、さらに他の観点において、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片の癌の予防又は治療のための使用に関する。

本発明は、さらに他の観点において、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片の癌の予防又は治療のための薬剤を製造するための使用に関する。

本発明は、さらに他の観点において、前記抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含むワクチン効能増進用組成物に関する。

本明細書で使用された用語「ワクチン」とは、生体に免疫をあたえる抗原を含有する生物学的な製剤であって、感染症の予防のためにヒトや動物に投与することによって、生体に免疫を生じるようにする免疫源又は抗原性物質を意味することである。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、ただ本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解されないことは、当業界において通常の知識を有する者にとって自明だろう。

実施例１：ＴＣＢ２モノクローナル抗体のｈＩＬ−２に対する結合特異性実験
ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２ ｍＡｂ複合体の治療効能を評価するために、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）マウスモデルを利用したので、ＴＣＢ２ ｍＡｂがマウスＩＬ−２（ｍＩＬ−２）に対する交差反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を示すかを確認するために、ＴＣＢ２ ｍＡｂのｈＩＬ−２に対する結合特異性実験を行った。まず、数週にわたってｈＩＬ−２で３〜４回免疫させたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞をＳＰ／２骨髄腫細胞株と融合させた。ハイブリドーマのコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）が可視化（ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ）されると、培養上澄み液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）でＥＬＩＳＡした。５μｇ／ｍｌのｈＩＬ−２又はｍＩＬ−２をそれぞれＰＢＳに入れて混合した後、総５０μｌの混合液をＥＬＩＳＡプレートにコートした。その後、非特異的結合（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ）を防止するために、２００μｌの１０％ＦＢＳをＰＢＳに混合して常温で３０分間インキューベートし、ｔｉｔｒａｔｅｄ ｄｏｓｅモノクローナル抗体を３０分間インキューベートした。コートされたｈＩＬ−２又はｍＩＬ−２とモノクローナル抗体の結合程度は、抗−マウスＩｇＧ ＨＲＰ又は抗−ラット（ａｎｔｉ−ｒａｔ）ＩｇＧ ＨＲＰで検出した。各段階ごとにプレートは、２００μｌ ＰＢＳで３〜５回ウォッシングした。陽性対照群は、市販のモノクローナル抗体を使用し、ｈＩＬ−２に対する陽性対照群は、Ｍａｂ６０２、ｍＩＬ−２に対する陽性対照群は、Ｊｅｓ６−１及びＳ４Ｂ６を使用した。

その結果、ｈＩＬ−２に対する陽性対照群として使用されたＭａｂ６０２は、ｍＩＬ−２に対する低い交差反応性を示す反面、ＴＣＢ２ ｍＡｂは、ｍＩＬ−２に対する交差反応性を示さなかった（図１）。したがって、ＴＣＢ２ ｍＡｂは、ｈＩＬ−２のみに対して特異的に結合することを確認することができた。

実施例２：ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体による生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）免疫刺激効果
従来報告されたマウス抗−ｈＩＬ−２ ｍＡｂであるＭＡＢ６０２は、ヒト化したマウスでヒトＣＤ８^＋ Ｔ細胞を刺激して臨床で癌免疫治療のためのｈＩＬ−２／ｍＡｂ複合体の効能を立証したが、ＣＤＲ ｒｅｇｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅが公開されておらず、ｈＩＬ−２／抗−ｈＩＬ−２ ｍＡｂ複合体として最大の抗癌効果を示すことができる抗体であるか不明確である。したがって、最大限のＣＤ８^＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞活性化と最小限のＴｒｅｇ拡張を誘導する優れた抗ｈＩＬ−２ ｍＡｂを開発しようとした。

０日、１日、２日、３日に毎日Ｂ６マウスにｈＩＬ−２／ＴＣＢ２ ｍＡｂ（０．８μｇ／８μｇ）複合体を注入し、５日目にＳｐｌｅｎｉｃ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞とＴｒｅｇ細胞の細胞拡張（ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）程度を分析した。ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体は、Ｔｒｅｇ細胞とＣＤ４ Ｔ細胞の拡張は最小化したが、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞とＮＫ細胞の強力な拡張を誘導した（図２）。具体的にｈＩＬ−２／ＴＣＢ２ ｍＡｂ複合体を注入すると、ｍｅｍｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ（ＭＰ）ＣＤ８^＋ Ｔ細胞が５９倍程度拡張され、拡張されたＭＰ ＣＤ８^＋ Ｔは、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の大部分になった。ＮＫ細胞も１８倍拡張されたが、Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ８^＋ Ｔ細胞とＮＫ細胞より低い水準である５倍程度だけ拡張されたことを確認した。ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２ ｍＡｂ複合体に対するＴｒｅｇ細胞拡張に対するＭＰ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の有効比率は、９７０％であった。したがって、ＴＣＢ２ ｍＡｂは、Ｔｒｅｇ細胞でないＣＤ８^＋ Ｔ細胞とＮＫ細胞を選択的に刺激するモノクローナル抗体であることを確認することができる。

また、ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体に対するＴｒｅｇ細胞拡張に対するＭＰ ＣＤ８^＋ Ｔ細胞の有効比率は、９７０％である反面、ｈＩＬ−２／Ｍａｂ６０２複合体に対しては、５３０％であった（図２Ｄ）。したがって、ＴＣＢ２は、Ｍａｂ６０２より優れたモノクローナル抗体である。

実施例３：ｈＩＬ−２に対するＴＣＢ２の親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）分析
ＴＣＢ２抗体によるＣＤ８^＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞の選択的刺激は、抗体がｈＩＬ−２のエピトープに結合されることが必要である。ｈＩＬ−２のエピトープは、高親和性ＩＬ−２Ｒ（ＣＤ２５）によっても認識されるので、ＴＣＢ２は、ＩＬ−２Ｒα鎖が結合する部位近くのｈＩＬ−２に結合する可能性がある。Ｍａｂ６０２も、ＩＬ−２Ｒα鎖が結合する部位近くのｈＩＬ−２に結合する可能性があるので、抗−ｈＩＬ−２ ｍＡｂであるＴＣＢ２の特異性を観察するために、Ｍａｂ６０２と競争分析した。商業的に市販中にあり、Ｍａｂ６０２とは異なるエピトープに結合するものと知られたさらに他の抗−ｈＩＬ−２ ｍＡｂ（５３４４．１１１）を対照群として使用した。

ｈＩＬ−２探知のためのｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡを利用した。抗−ｈＩＬ−２クローンの９００ ＲＵ（Ｒｍａｘ＝９０）をアミン反応を通じてＣＭ５チップ上に固定させた。ｈＩＬ−２の２倍希釈液（１００ｎＭで）を１０μｌ／ｍｉｎで３分間流して送った後、ｈＩＬ−２の解離を１０分間追跡した。

競争分析からＴＣＢ２がＭａｂ６０２と競争することを確認した。その特異性によって、ＴＣＢ２ ｍＡｂは、５３４４．１１１と競争しないが、Ｍａｂ６０２とは競争することを確認した。結果的に、他の抗−ｈＩＬ−２ ｍＡｂよりＴＣＢ２がｈｕｍａｎ ＩＬ−２に対して高い親和度を有することを確認した（図３）。

実施例４：ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体による抗腫瘍効果（ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔ）
実施例４−１：固形腫瘍に対するＴＣＢ２ ｍＡｂの効果
ＴＣＢ２ ｍＡｂの固形腫瘍拒否反応に対する臨床的有用性を立証するために、Ｂ６マウスに１×１０^６ Ｂ１６Ｆ１０黒色腫を皮下で（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）注射した後、ＰＢＳ、ｈＩＬ−２（０．８μｇ）単独又はｈＩＬ−２／ＴＣＢ２（０．８μｇ／８μｇ）複合体を４〜７日に注射した。次に、７日間腫瘍進行（ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）をモニタリングした。

その結果、固形腫瘍成長の抑制は、サイトカインにより誘導されたＣＤ８^＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞拡張の大きさと関係関係があった（図４）。ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２ ｍＡｂ複合体は、ｈＩＬ−２単独処理した場合より腫瘍の成長を優秀に抑制した。

実施例４−２：転移性腫瘍に対するＴＣＢ２ ｍＡｂの効果
ＴＣＢ２ ｍＡｂの転移性腫瘍に対する臨床的有用性を立証するために、Ｂ６マウスに３×１０^５ Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を静脈で（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ）注射した。腫瘍注入７日後、７〜１０日までｈＩＬ−２単独（０．８μｇ）又はｈＩＬ−２／ＴＣＢ２（０．８μｇ／８μｇ）複合体を注入し、１８日後に肺腫瘍結節の数を測定した。

その結果、ｈＩＬ−２は、そうでなかったが、ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体を注入した場合には、肺腫瘍結節の成長を優秀に抑制した（図５）。したがって、ＴＣＢ２ ｍＡｂは、ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２ ｍＡｂ複合体として使用されるとき、強力な抗癌効果があることを確認することができる。

実施例５：ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体と他の抗癌治療法の併用効果分析
現在全世界的に開発されている抗癌治療方法としてｔｕｍｏｒ ｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎで患者をｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎする方法と抗−ＣＴＬＡ−４抗体又は抗−ＰＤ−１抗体のようなｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを使用する方法がある。本実施例では、ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体がこのような抗癌治療療法と共に使用され得るかを分析した。

実施例５−１：Ｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎを利用した抗癌治療法とｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体の併用効果
Ｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎを利用した治療法とｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体の適合性をテストするために、１×１０^６ ｏｆ Ｂ１６Ｆ１０ ｃｅｌｌｓを０日にＢ６マウスに皮下で（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）注射した後、ＰＢＳ又はＴＲＰ２ ｐｅｐｔｉｄｅ（１００μｇ）とＰｏｌｙ Ｉ：Ｃ（１００μｇ）の混合物を３日、７日に注射した。ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体（０．８μｇ／８μｇ）は、４〜７日及び１１〜１４日にｔｗｏ ｒｏｕｎｄｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｄａｉｌｙ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓで注射した。次に、５日間腫瘍進行をモニタリングした。

その結果、ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体を注射したものとｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎを利用した療法でＢ１６Ｆ１０腫瘍の成長は、類似した程度に抑制された。しかしながら、マウスにｎｅｏ−ａｎｔｉｇｅｎを利用した療法とｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体を同時に処理した場合、腫瘍の成長がさらに抑制された（図６）。したがって、ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体は、ｎｅｏ ａｎｔｉｇｅｎを利用した抗癌治療法のように使用できることが分かる。

実施例５−２：ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体の併用効果
ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体がｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒと使用され得るかをテストするために、ＣＴ２６（Ｂａｌｂ／Ｃ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）及びＭＣ３８（Ｂ６ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）モデルを利用した。ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体を抗−ＣＴＬＡ−４抗体又は抗−ＰＤ−１抗体のように、又はそれぞれ処理した後、腫瘍の生長を観察した。

ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体と抗−ＣＴＬＡ−４抗体を一緒に処理する実験のために５×１０^５ ＣＴ２６ ｃｅｌｌｓをｂａｌｂ／Ｃマウスに皮下で注射し（０日）、抗−ＣＴＬＡ−４抗体（１００μｇ）を７日目から３日間隔で３回注射した。ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体（０．８μｇ／８μｇ）は、８日目から１日に１回１１日目まで４回注射した。その結果、ＣＴ２６腫瘍の成長は、抗−ＣＴＬＡ−４抗体により強く抑制され、３３％のマウスで腫瘍が除去された。ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体を注射したマウスでは、腫瘍成長が抗−ＣＴＬＡ−４抗体に比べて少なく抑制されたが、抗−ＣＴＬＡ−４抗体とｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体を一緒に処理した場合、抗−ＣＴＬＡ−４抗体を単独処理した場合よりさらに腫瘍の成長を抑制して６３％のマウスで腫瘍が除去された（図７）。

ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体と抗−ＰＤ−１抗体を一緒に処理する実験のために５× １０^５ ＭＣ３８ ｃｅｌｌｓをＢ６マウスに皮下で注射した後（０日）、抗−ＰＤ−１抗体（１００μｇ）を７日目から３日間隔で３回注射し、ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体（１．５μｇ／１５μｇ）は、８日目から１１日目まで１日に１回ずつ４回注射した。その結果、抗−ＰＤ−１抗体処理は、腫瘍の成長を遅延させるのに効果的でなかったが（抗−ＰＤ−１抗体は、最適以下の用量で使用された）、ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体の処理によってＭＣ３８腫瘍の成長は強く抑制され、３７％のマウスで腫瘍が拒絶（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）された。ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体及び抗−ＰＤ−１抗体を一緒に注射した場合、１００％のマウスで腫瘍が拒絶（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）された（図８）。

実施例５−３：ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体を利用した免疫抗癌治療の記憶応答（ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）獲得効果
腫瘍を拒絶（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）したマウスが同じ腫瘍に対して記憶応答（ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を取得したかを確認するために、５×１０^５ ＭＣ３８ ｃｅｌｌをｎａｉｖｅ Ｂ６（腫瘍が移植されたことないマウス）又は前記実施例５−２でｈＩＬ−２／ＴＣＢ２により腫瘍が除去されたマウス（２５日目）に注射した。ＭＣ３８腫瘍は、ｎａｉｖｅ Ｂ６マウスに注射された場合、速い成長を示したが、腫瘍を拒絶（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）したマウスでは成長しなかった（図８）。これは、ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体を利用した免疫抗癌治療が患者の癌再発を予防するのに特に役に立つことができることを示唆する。

このような結果を総合すると、ｈＩＬ−２／ＴＣＢ２複合体が抗−ＣＴＬＡ−４抗体又は抗−ＰＤ−１抗体のようなｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒと一緒に使用され得、共に使用する場合、さらに効果的であることを確認することができる。

実施例６：ＴＣＢ２モノクローナル抗体シーケンシング
ＴＣＢ２ ｍＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）を配列化した（表１〜表３）。

ＴＣＢ２のアミノ酸配列は、Ｏｎｕｒ ＢｏｙｍａｎとＮａｔａｌｉａ Ｒａｍｉｒｅｚ（ＷＯ２０１６００５９５０Ａ１）により最近開発された抗−ｈＩＬ−２ ｍＡｂであるＮａｒａ１（表４）と区別される他の抗体であることが分かる。ＴＣＢ２とＮａｒａ１のＣＤＲ類似度は、重鎖ＣＤＲ １−３の場合、それぞれ４０％、５２．９４％、８．３３％であり、軽鎖ＣＤＲ １−３の場合、それぞれ３３．３３％、１４．２８％、５５．５５％である（表５）。

配列分析データに基づいて、ＴＣＢ２ ｍＡｂのＦａｂ領域をヒトＩｇＧ２発現ベクターにクローニングし、クローニングされたベクターのアミノ酸配列を表６に示した。

実施例７：ＴＣＢ２ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）抗体
マウスＩｇＧに対する宿主免疫反応を減少させるために、ＴＣＢ２ ｍＡｂをヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）し、ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ＦＣとともに発現させた（表７）。マウスＴＣＢ２（ｍＴＣＢ２）のＣＤＲをヒトＩｇＧ可変領域に導入した後、ｉｎ ｖｉｖｏ試験のために最も親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）の高い３個のヒト化したＴＣＢ２（ｈｎＴＣＢ２）ｍＡｂ ｃｌｏｎｅ（ＶＨ１＋ＶＬ２，ＶＨ２＋ＶＬ２，ＡＨ０３４６３（ＶＬ０３４６３＋ＶＨ０３４６３））を選別した（表８）。

ＶＬ０３４６３アミノ酸配列でＶＬ２と異なる部分は、アンダーラインで表示した。重鎖可変領域配列比較のために、ＶＨ２及びＶＨ０３４６３でＶＨ１と異なる部分は、アンダーラインで表示した。ＶＬ２は、二つの異なるヒト化ＴＣＢ２（ＶＬ２＋ＶＨ１又はＶＬ２＋ＶＨ２）を発現させるためにＶＨ１又はＶＨ２とともに使用された。

本来のマウスＴＣＢ２、ヒトキメラＴＣＢ２（ｈｃＴＣＢ２）とヒト化したＴＣＢ２（ｈｎＴＣＢ２）の免疫活性機能を比較するために、ｈＩＬ−２をそれぞれ異なる形態のＴＣＢ２ｓ（マウスＴＣＢ２（ｍＴＣＢ２）、ｈｃＴＣＢ２，ｈｎＴＣＢ２）と複合体を形成させてＢ６マウスに１日に１回０日から３日目まで４回注射した後、５日目に脾臓の免疫細胞をフローサイトメトリーした。その結果、ｈｎＴＣＢ２の親和度がｍＴＣＢ２やｈｃＴＣＢ２より若干減少したが（表８）、免疫細胞を活性化させる機能は、ｍＴＣＢ２と類似していることを確認した（図９、ＶＬ２＋ＶＨ２は、低い機能性によって表示しなかった）。したがって、ｍＴＣＢ２は、成功裏にヒト化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ）されたことが立証された。

ｈｎＴＣＢ２が免疫細胞を活性化させる機能の他に抗癌能力を保有しているかをテストするために、５×１０^５ ＭＣ３８をＢ６マウスに０日目に皮下で注射し、抗−ＰＤ−１抗体（２００μｇ）を７日目から３日間隔で３回注射した後、ｈＩＬ−２／ｈｎＴＣＢ２（ＶＬ２＋ ＶＨ１，１．５μｇ／１５μｇ）複合体を８日目から１１日目まで１日に１回４回注射した後、ＭＣ３８腫瘍の成長を観察した。その結果、高い濃度の抗−ＰＤ−１抗体の単独処理によっても腫瘍の成長が遅延されたが、ｈＩＬ−２／ｈｎＴＣＢ２複合体を処理した場合、ｈＩＬ−２／ｍＴＣＢ２複合体処理と類似した水準にＭＣ３８腫瘍の成長が強く抑制され、４０％のマウスで腫瘍が拒絶（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）された。ｈＩＬ−２／ｈｎＴＣＢ２又はｈＩＬ−２／ｍＴＣＢ２複合体を抗−ＰＤ−１抗体とともに注射した場合、８５％のマウスで腫瘍が拒絶（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）された（図１０）。したがって、ヒト化ＴＣＢ２で本来のｍＴＣＢ２が有していた機能が保存されたことを確認した。

本発明の抗−ｈＩＬ−２抗体は、ｈＩＬ−２の特定エピトープに特異的に結合してｈＩＬ−２がＣＤ２５に結合するのを阻害することによって、Ｔｒｅｇ細胞の拡張を最小化する。これに加えて、抗腫瘍活性を示すＣＤ８^＋ Ｔ細胞とＮＫ細胞を刺激させる。したがって、本発明の抗−ｈＩＬ−２抗体は、新しい抗癌治療剤として活用するのに有用である。

以上、本発明内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的技術は、ただ好ましい実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されるものではない点は明白だろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物により定義されると言える。

Claims (19)

1. ヒトインターロイキン−２（ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２，ｈＩＬ−２）に特異的に結合し、前記ｈＩＬ−２がＣＤ２５に結合するのを阻害する抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片。
2. 配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）１；配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び
   配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片。
3. 前記抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体であることを特徴とする請求項２に記載の抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片。
4. 配列番号３、配列番号２３、配列番号２８、配列番号３２及び配列番号３４よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
   配列番号４、配列番号２４、配列番号２６及び配列番号３０よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項２に記載の抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片。
5. 配列番号３の重鎖可変領域及び配列番号４の軽鎖可変領域；
   配列番号２３の重鎖可変領域及び配列番号２４の軽鎖可変領域；
   配列番号２８の重鎖可変領域及び配列番号２６の軽鎖可変領域；
   配列番号３２の重鎖可変領域及び配列番号３０の軽鎖可変領域；又は
   配列番号３４の重鎖可変領域及び配列番号３０の軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項４に記載の抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片。
6. ＣＤ８^＋ Ｔ細胞とＮＫ細胞の拡張を誘導することを特徴とする請求項１に記載の抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片。
7. 請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
8. 請求項７に記載の核酸を含む組換えベクター。
9. 請求項８に記載の組換えベクターで形質転換された細胞。
10. 請求項９に記載の細胞を培養する段階を含む抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片の製造方法。
11. 請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片とｈＩＬ−２が結合された複合体。
12. 請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防又は治療用組成物。
13. 前記癌は、皮膚癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、脳癌、食道癌、胆嚢岩、卵巣癌、すい臓癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌及び膀胱癌よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
14. 請求項１に記載の抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）又は抗体−薬物の接合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。
15. 請求項１４に記載の二重特異抗体又は抗体−薬物の接合体を有効成分として含む癌の予防又は治療用組成物。
16. 前記癌は、皮膚癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、脳癌、食道癌、胆嚢岩、卵巣癌、すい臓癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、前立腺癌及び膀胱癌よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
17. 請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片及び免疫チェックポイント阻害剤を含む癌治療用併用投与組成物。
18. 前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗−ＣＴＬＡ−４抗体又は抗−ＰＤ−１抗体であることを特徴とする請求項１７に記載の組成物。
19. 請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の抗−ｈＩＬ−２抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含むワクチン効能増進用組成物。

Images