JP7302010B2 - プログラム細胞死タンパク質リガンド－１（ｐｄ－ｌ１）に対する抗体及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、ＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ １）に対する抗体又はその抗原結合断片、これをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された細胞、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法、これを含む癌の予防又は治療用組成物及び併用投与用組成物に関する。

ＰＤ－Ｌ１は、細胞外部位に２個のＩｇ様ドメイン、膜貫通ドメイン及び短い細胞質ドメインを有する、１型膜貫通タンパク質である。細胞質ドメインは公知の信号伝達モチーフ（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ）を持っておらず、ＰＤ－Ｌ１がその受容体との相互作用に対する信号伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）がないということを知らせる。その分子量は４０ｋＤａ（２９０個アミノ酸）であり、それぞれマウス染色体１９及びヒト染色体９上のＣＤ２７４遺伝子によってエンコードされる（ｅｎｃｏｄｅｄ）。ＰＤ－Ｌ１は、Ｂ７タンパク質ファミリーの構成員であり、Ｂ７．１及びＢ７．２と約２０％のアミノ酸配列同一性を共有する。ヒトＰＤ－Ｌ１はそれぞれ、ネズミ科（ｍｕｒｉｎｅ）及びカニクイザルオルソログ（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｏｒｔｈｏｌｏｇ）のＰＤ－Ｌ１と７０％及び９３％アミノ酸同一性を共有する。

ＰＤ－Ｌ１は、７７０ｎＭの親和度（ＫＤ）でその受容体ＰＤ－１に結合する。ＰＤ－１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞及び骨髄細胞上に発現し、細胞免疫反応の活性化又は抑制を調節する。細胞によるＰＤ－Ｌ１発現は、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）死に対する保護を媒介でき、これは、ウイルス感染中に慢性免疫反応を鈍化させる調節メカニズムである。慢性及び炎症性疾患（ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）のような癌は、ＰＤ－Ｌ１発現の上向き調節により、このような免疫保護経路を破綻させ、宿主免疫反応を回避する。活性免疫反応の脈絡から、ＩＦＮγは、また、ＰＤ－Ｌ１の発現を上向き調節する。

ＰＤ－Ｌ１は、また、他のタンパク質であるＢ７．１（ＣＤ８０とも知られている。）との相互作用によって免疫抑制を媒介し、ＣＤ２８を通じたＴ細胞に対する活性化の２次信号のうち一つを伝達するそれの能力を遮断する。腫瘍細胞上のＰＤ－Ｌ１発現及びＢ７．１との結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）の側面から、腫瘍免疫耐性（ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）においてこのような特異的な相互作用に関する関連性は依然として不明確である。

人体の免疫機能は、抗原認知と同時に同時刺激信号及び同時抑制信号の調節によって全体的なＴリンパ球機能を調節する。このような調節機転を免疫検問（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）という。人体の免疫機能は、腫瘍細胞で起きる突然変異などの変化によって発現する腫瘍特異抗原（ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｅｏ－ａｎｔｉｇｅｎ）を感知し、これにより、腫瘍細胞又はウイルス感染源などを除去する。

ただし、一部の腫瘍細胞は、逆に、このような免疫攻撃を回避するために、腫瘍微細環境（ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）を変化させて免疫機能を抑制したり、或いはＴ細胞免疫寛容（ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）又は免疫編集（ｉｍｍｕｎｏ－ｅｄｉｔｉｎｇ）などによって免疫回避（ｉｍｍｕｎｅ ｅｓｃａｐｅ）をする。

このような回避戦略の一つとして、免疫検問（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）機能の変化を用いて腫瘍特異Ｔリンパ球細胞の機能を抑制する。すなわち、腫瘍細胞においてこのような抑制免疫検問を活性化させることにより、腫瘍特異Ｔ－リンパ球細胞の攻撃を回避する。これと関連して、ＰＤ－１又はリガンドＰＤ－Ｌ１に対する単クローン抗体を用いてその機能を抑制することにより、抑制された腫瘍特異Ｔ－リンパ球細胞活性及び効果を増強させ、抗腫瘍効果を得ることができる。

このような技術的背景下で、本出願の発明者らは、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体を開発するために努力した。その結果、本発明者らは、ＰＤ－Ｌ１に高い親和力で結合する抗ＰＤ－Ｌ１抗体を開発し、このような抗ＰＤ－Ｌ１抗体がＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１複合体の形成を阻害することによって、目的とする免疫抗癌剤の役割を果たし得ることを確認し、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、ＰＤ－Ｌ１に対する新規抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された細胞及びその製造方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む癌又は感染疾患の予防又は治療用組成物を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を他の抗癌剤と共に投与して癌を予防又は治療するための併用投与用組成物を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３又は配列番号１１の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号５又は配列番号１３の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号７の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する。

本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。

本発明は、また、前記核酸を含むベクターを提供する。

本発明は、また、前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。

本発明は、また、次の段階を含む、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する：（ａ）前記細胞を培養する段階；及び、（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。

本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防又は治療用組成物を提供する。

本発明は、また、前記抗体又はその抗原結合断片を他の抗癌剤と共に投与して癌を予防又は治療するための併用投与用組成物を提供する。

ＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質に対するファージディスプレイ実験結果から得られた個別抗体クローン（約１４００個）の結合の有無を検証するＥＬＩＳＡ反応を行った結果である。

ＰＤ－Ｌ１結合抗体クローンの細胞表面抗原タンパク質結合特性分析のために、人為的にヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子を表面に発現させた２９３Ｔ細胞に対する代表的な抗体クローンのＦＡＣＳ実験を行った結果である。

代表的な９個抗体クローンに対するＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合阻害能の確認のためのＳＰＲベースの性能評価試験法であり、ＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質のみ含まれた溶液条件（Ｂｌｕｅ ｌｉｎｅ）に比べて抗体サンプルが共に含まれるときのＳＰＲセンサグラム（ＳＰＲ Ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）の変化検証結果である。

ｍＩＦＮ－γ処理されたマウス大腸癌細胞株ＭＣ３８を用いたＩｇＧ形態ＰＤ－Ｌ１ターゲット抗体候補のマウスＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する結合特性分析結果である。

候補抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベース性能検証試験においてＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１タンパク質間結合阻害性能を確認した結果である。

マウス由来大腸癌細胞株ＭＣ３８とＣ５７ＢＬ／６同種（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）マウスモデルを用いた候補抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌性能を分析した結果である。

選別された候補抗体（ＫＬ００１）の免疫細胞活性増加能力を確認した結果である。

候補抗体の親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）後に選ばれたＫＬ００１－１３候補抗体に対する免疫細胞活性増加能力を確認した結果である。

候補抗体の性能改善最適化実験のパンニング（Ｐａｎｎｉｎｇ）次数に従うアウトプット（ｏｕｔｐｕｔ）の増加パターンを確認した結果である。

親和度改善抗体の選別のためのＥＬＩＳＡ反応を行った結果である。

選別抗体に対してヒトＰＤ－Ｌ１及びマウスＰＤ－Ｌ１に対する結合力値をビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）装備で測定した結果である。

ＭＣ３８皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）同種マウスモデルにおいて性能最適化抗体‘ＫＬ００１－１３’と最適化以前抗体‘ＫＬ００１’及びＭＰＤＬ３２８０Ａ比較抗体をｉ．ｐ．投与した時、腫瘍成長抑制効能を評価した結果である。

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースアッセイ（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）を用いた選別抗体のＩＣ５０値測定を行った結果である。

ＩＬ－２とＫＬ００１－１３抗体又はＭＰＤＬ３２８０Ａ比較抗体の併用処置に対するｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効果を検証した結果である。

ＣＴＬＡ－４抗体（９Ｄ９）とＫＬ００１－１３抗体又はＭＰＤＬ３２８０Ａ比較抗体の併用処置に対するｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効果を検証した結果である。

本発明に係る抗体のＣＤＲに対してＩＭＧＴナンバリング（ＩＭＧＴ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）方式以外の他のナンバリング方式による場合に有する配列である。

本発明に係る抗体のヒト、マウス、サル及びイヌに対する交差反応性を示すものである。

特に断らない限り、本明細書で使われる技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術の分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書における命名法は、本技術分野でよく知られており、通常用いられるものである。

本発明は、一観点において、配列番号１の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３又は配列番号１１の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号５又は配列番号１３の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号７の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する。

本明細書における“ＰＤ－Ｌ１”は、活性化されたＴ及びＢ細胞上で主に発現する免疫抑制受容体“プログラム死受容体１（ＰＤ－１）”に対するリガンドであり、ＰＤ－１とリガンドであるＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２とが結合する場合、抗原受容体シグナリングを陰性的に（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ）調節できる。ＰＤ－１に対するリガンド（ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２）は構成的に発現したり、又は非造血細胞組織及び様々な腫瘍型を含む複数の細胞型から誘導され得る。ＰＤ－Ｌ１は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄細胞及び樹状細胞（ＤＣ）上で発現するが、さらには、末梢細胞、類似微細血管内皮細胞、及び心臓、肺などのような非リンパ器官上でも発現する。対照的に、ＰＤ－Ｌ２は、単に大食細胞及び樹状細胞上でのみ発見する。ＰＤ－１リガンドの発現パターンは、末梢耐性を維持する上でＰＤ－１の役割を提示し、末梢において自己反応性Ｔ細胞及びＢ細胞反応を調節するのに寄与できる。ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２は、細胞外領域でＩｇＶ及びＩｇＣ様ドメインの両方を含む第１型移動膜受容体である。両リガンドとも、公知されていないシグナリングモチーフを持つ短い細胞質領域を含む。

多数の研究は、ＰＤ－１とそのリガンドの相互作用が試験管内及び生体内でリンパ球増殖を抑制することを明らかにしている。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断は、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン生産を増加させ、細胞周期の進行を遮断すると知られている。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断は、増強した腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を誘導できるので、免疫システムによって腫瘍細胞を掃除することに役立ち得る。また、慢性ＨＩＶ感染時に、ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞は機能的に損傷され、サイトカイン及びエフェクター分子を生産する能力の減少及び増殖する能力の減少を示し、ＰＤ－１は、ＨＩＶ感染された個体のＨＩＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞に高発現するが、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用の遮断によってＨＩＶペプチド刺激に反応してＨＩＶ特異的Ｔ細胞が増殖し、サイトカインを生産する能力を向上させることにより、Ｔ細胞活性又は抗ウイルス免疫反応を増大させることができる。

本明細書で使われる用語“抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）”は、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ－Ｌ１抗体を意味する。本発明の範囲には、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する完全な抗体形態の他に、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。

完全な抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であり、各軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の定常領域は、カッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。

抗体の抗原結合断片又は抗体断片は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうち、Ｆａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の定常領域、及び重鎖の一番目の定常領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと異なる。

Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域だけを有する最小の抗体片である。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ）は、非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが連結されており、一本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ Ｆｖ，ｓｃＦｖ）は一般に、ペプチドリンカーを介して重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域とが共有結合で連結されたり又はＣ末端で直接連結されており、二重鎖Ｆｖと同様にダイマーのような構造をなすことができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すればＦａｂが得られ、ペプシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片が得られる。）、又は遺伝子組換え技術で作製してもよい。

一実施例において、本発明に係る抗体は、Ｆｖ形態（例えば、ｓｃＦｖ）であるか、完全な抗体形態である。また、重鎖定常領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）又はエプシロン（ε）のいずれか一つのアイソタイプから選ばれてよい。例えば、定常領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）又はガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ型でよい。

本明細書で使われる用語“重鎖”とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨと３個の定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３とを含む全長重鎖及びその断片を全て意味する。また、本明細書で使われる用語“軽鎖”とは、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬと定常領域ドメインＣＬとを含む全長軽鎖及びその断片を全て意味する。

本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦＶ）及び抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、これらの抗体のエピトープ結合断片などを含むが、これに限定されるものではない。

前記単一クローン抗体は、実質的に同質的な抗体集団から得た抗体、すなわち、集団を占めている個々の抗体が、微量で存在し得る可能な天然発生的突然変異の以外には同一であるものを指す。単一クローン抗体は、高度に特異的であるため、単一抗原部位に対抗して誘導される。典型的に、異なる決定因子（エピトープ）に対して指示された異なる抗体を含む通常の（ポリクロナール）抗体製剤とは違い、それぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一決定因子に対して指示される。

“エピトープ”は、抗体が特異的に結合可能なタンパク質決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を意味する。エピトープは、一般に化学的に活性である表面分子群、例えば、アミノ酸又は糖側鎖で構成され、一般に、特定の３次元の構造的特徴の他に、特定の電荷特性も有する。立体的エピトープ及び非立体的エピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は消失されるが、後者に対しては消失されないという点で区別される。

前記“ヒト化”形態の非ヒト抗体は、非ヒト（例えば、ネズミ科（ｍｕｒｉｎｅ））免疫グロブリンから由来した最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体は、受容者の超可変領域からの残基を、目的とする特異性、親和性及び能力を保有している非ヒト種（供与者抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類の超可変領域からの残基に置き換えたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。

“ヒト抗体”とは、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であり、相補性決定領域、構造領域を含む抗体を構成する全てのアミノ酸配列がヒトの免疫グロブリンで構成されているものを意味する。

重鎖及び／又は軽鎖の一部が特別な種から由来したり、又は特別な抗体部類又は亜部類に属する抗体内の相応する配列と同一であるか或いはそれと相同性であるのに対し、残りの鎖はさらに他の種から由来したり、又はさらに他の抗体部類又は亜部類に属する抗体内の相応する配列と同一であるか或いはそれと相同性である“キメラ”抗体（免疫グロブリン）の他、目的とする生物学的活性を示す前記抗体の断片も含まれる。

ここに使われている“抗体可変ドメイン”は、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖及び重鎖部分のことを指す。ＶＨは、重鎖の可変ドメインのことを指す。ＶＬは、軽鎖の可変ドメインのことを指す。

“相補性決定領域”（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、抗原結合のために必要な存在である抗体可変ドメインのアミノ酸残基のことを指す。各可変ドメインは典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。

本発明は、配列番号１の配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の配列を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号３又は配列番号１１の配列を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号５又は配列番号１３の配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号７の配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片を含む（本願で使用したＣＤＲナンバリングスキームは‘ＩＭＧＴナンバリング’に従う。）。本発明において、前記ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、又は配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含むことができる。

本発明において、前記ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、又は配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

具体的に、本発明において、前記ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

“骨格領域”（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは典型的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された４個のＦＲを有する。

ＰＤ－Ｌ１抗体は１価又は２価であり、一本鎖又は二本鎖を含む。機能的に、ＰＤ－Ｌ１抗体の結合親和性は、１０^－５Ｍ～１０^－１２Ｍの範囲内にある。例えば、ＰＤ－Ｌ１抗体の結合親和性は、１０^－６Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０－７Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－８Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－９Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－１０Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－１１Ｍ～１０^－１２Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－８Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－９Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－１０Ｍ～１０^－１１Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－８Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－９Ｍ～１０^－１０Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－８Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－８Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－８Ｍ、１０^－７Ｍ～１０^－８Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－７Ｍ、１０^－６Ｍ～１０^－７Ｍ又は１０^－５Ｍ～１０^－６Ｍである。

前記ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４又は配列番号１２の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含むことができる。前記ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４又は配列番号１２の重鎖可変領域を含むことができる。また、前記ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号８又は配列番号１４の配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含むことができる。

本発明に係る具体的な実施例において、配列番号４の重鎖可変領域及び配列番号８の軽鎖可変領域；又は、配列番号１２の重鎖可変領域及び配列番号１４の軽鎖可変領域を含むことができる。

一方、ＣＤＲ配列（領域）に対する定義は、そのナンバリング方式によって、同じ可変領域を有する抗体に対してもやや異なり得る。

具体的に、表２に記載するように、同じ可変領域でも、ナンバリング方式によってＣＤＲ配列は異なるように定義されてよい。

これにより、本発明に係る抗体のＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴナンバリング方式以外の別のナンバリング方式に従う場合、表３に記載の配列を有する（図１６参照）。

一実施例において、本発明に係る抗体は、ヒトとマウス、ヒトとヒト以外の哺乳類に交差反応性を示す。具体的に、前記ヒト以外の哺乳類は、サル又はイヌであってよい（図１７）。“ファージディスプレイ”は、変異体ポリペプチドを、ファージ、例えば繊維状ファージ粒子の表面上に、外皮タンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質としてディスプレイする技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化タンパク質変異体の大きいライブラリーを対象にして、標的抗原と高親和度で結合する配列を迅速ながらも効率的に分類できるということにある。ペプチド及びタンパク質ライブラリーをファージ上にディスプレイすることは、特異的結合特性を有するポリペプチドを見出すために、数百万個のポリペプチドをスクリーニングすることに用いられてきた。

ファージディスプレイ技術は、特定リガンド（例えば、抗原）と結合する新規タンパク質を生成及び選別するための強力な道具を提供している。ファージディスプレイ技術を用いて、タンパク質変異体の大きいライブラリーを生成させ、標的抗原と高親和性で結合する配列を迅速に分類することができる。変異体ポリペプチドを暗号化する核酸をウイルス性外皮タンパク質、例えば、遺伝子ＩＩＩタンパク質又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を暗号化する核酸配列と融合させる。タンパク質又はポリペプチドを暗号化する核酸配列を、遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部を暗号化する核酸配列と融合させた１価ファージディスプレイシステムが開発されている。１価ファージディスプレイシステムでは、遺伝子融合物が低レベルで発現し、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も発現して粒子感染性が維持される。

繊維状ファージの表面上におけるペプチドの発現とＥ．ｃｏｌｉの周辺細胞質における機能性抗体断片の発現を立証することが、抗体ファージディスプレイライブラリーを開発する上で重要である。抗体又は抗原結合性ポリペプチドのライブラリーは、多数の方式、例えば、無作為ＤＮＡ配列を挿入することによって単一遺伝子を変更させる方法、又は関連遺伝子系列をクローニングする方法で製造した。ライブラリーを対象にして、目的とする特徴を伴う抗体又は抗原結合性タンパク質の発現に関してスクリーニングすることができる。

ファージディスプレイ技術は、目的とする特徴を有する抗体を製造するための通常のハイブリドーマ及び組換え方法に比べて、いくつかの利点を有する。このような技術は、動物を使用しなくとも短時間で様々な配列を持つ大きい抗体ライブラリーを生成可能にする。ハイブリドーマの製造又はヒト化抗体の製造は、数ヶ月の製造期間がかかり得る。また、免疫が一切要求されないため、ファージ抗体ライブラリーは、毒性があるか又は抗原性の低い抗原に対しても抗体を生成させることができる。ファージ抗体ライブラリーを用いて新規な治療的抗体を生成及び確認することができる。

ファージディスプレイライブラリーを用いて免疫又は非免疫させたヒト、生殖細胞系配列、又は未感作Ｂ細胞Ｉｇレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）からヒト抗体を生成させる技術を用いることができる。各種リンパ系組織を用いて、未感作又は非免疫抗原結合性ライブラリーを製造することができる。

ファージディスプレイライブラリーから高親和性抗体を確認及び分離できる技術は、治療用新規抗体分離に重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離することは、ライブラリーのサイズ、細菌性細胞における生産効率及びライブラリーの多様性に左右され得る。ライブラリーのサイズは、抗体又は抗原結合性タンパク質の不適切なフォールディング及び停止コドンの存在による非効率的生産によって減少する。細菌性細胞での発現は、抗体又は抗原結合性ドメインが適切にフォールディングされない場合には抑制され得る。発現は、可変／定常界面の表面又は選別されたＣＤＲ残基における残基を交互に突然変異させることによって改善させることができる。骨格領域の配列は、細菌性細胞において抗体ファージライブラリーを生成させる場合に適切なフォールディングを提供するための一要素である。

高親和性抗体分離において抗体又は抗原結合性タンパク質の様々なライブラリーを生成させることが重要である。ＣＤＲ３領域は、それらがしばしば抗原結合に参加することが明らかにされた。重鎖上のＣＤＲ３領域は、サイズ、配列及び構造的立体形態面において非常に様々であり、これを用いて様々なライブラリーを製造することができる。

また、各位置において２０個アミノ酸を全て使用して可変重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域を無作為化することによって多様性を発生させることができる。２０個の全てのアミノ酸を使用すれば、多様性の大きい変異体抗体配列が生成され、新規の抗体を確認する機会が増加し得る。

本発明の抗体又は抗体断片は、ＰＤ－Ｌ１を特異的に認識できる範囲内で、本明細書に記載された本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の配列だけでなく、その生物学的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他生物学的特性をより改善させるために、抗体のアミノ酸配列に更なる変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいてなる。アミノ酸側鎖置換体のサイズ、形態及び種類に対する分析により、アルギニン、リジン（ｌｙｓｉｎｅ）及びヒスチジンはいずれも陽電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシン及びセリンは、類似のサイズを有し；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは類似の形態を有するということがわかる。したがって、このような考慮事項に基づき、アルギニン、リジン及びヒスチジン；アラニン、グリシン及びセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは生物学的に機能均等物といえる。

上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すると、本発明の抗体又はこれをコードする核酸分子は、配列番号に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、上記の本発明の配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当業界における通常のアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも９０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は、当業界に公知されている。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）は、ＮＢＣＩなどから接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して用いることができる。ＢＬＳＡＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌで確認できる。

これに基づき、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、明細書に記載の明示された配列又は全体と比較して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を有することができる。このような相同性は、当業界に公知の方法による配列比較及び／又は整列によって決定されてよい。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ ２．０）、手動整列、肉眼検査を用いて本発明の核酸又はタンパク質のパーセント配列相同性を決定することができる。

本発明は、他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸に関する。

本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を分離して抗体又はその抗原結合断片を組み換えて生産することができる。核酸を分離し、これを複製可能なベクター内に挿入して、さらにクローニングしたり（ＤＮＡの増幅）又はさらに発現させる。これに基づき、本発明は、さらに他の観点において、前記核酸を含むベクターに関する。

“核酸”は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドの他に、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は変形されてよい。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。

前記抗体を暗号化するＤＮＡは、通常の過程を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に分離又は合成する。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には一般に、次のいずれか一つ以上が含まれるが、それに制限されない：信号配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、及び転写終結配列。

本明細書で使われる用語、“ベクター”は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター；コスミドベクター；バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどを含む。前記ベクターにおいて抗体をコードする核酸はプロモーターと作動的に連結されている。

“作動的に連結”とは、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列間の機能的な結合を意味し、これによって、前記調節配列は前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節する。

原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させ得る強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合座及び転写／解読終結配列を含むのが一般である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例えば、メタロチオニンプロモーター、β－アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーターエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）が利用でき、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般に有する。

場合によって、ベクターはそれから発現する抗体の精製を容易にするために、他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘ Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。

前記ベクターは、選択標識として当業界において通常用いられる抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。

本発明は、さらに他の観点において、前記言及されたベクターで形質転換された細胞に関する。本発明の抗体を生成させるために用いられた細胞は、原核生物、酵母又は高等真核生物細胞でよいが、これに制限されるものではない。

エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルスサブチリス及びバチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビルス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びスタフィロコカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコカスカルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を用いることができる。

ただし、動物細胞に対する関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯＫ１、ＧＳ－ＣＨＯ、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０でよいが、これに制限されるものではない。

本発明は、さらに他の観点において、（ａ）前記細胞を培養する段階；及び、（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法に関する。

前記細胞は、各種の培地で培養できる。市販用の培地はいずれも培養培地として使用可能である。当業者に公知のその他全ての必須補充物が適度の濃度で含まれてよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどが発現のために選別された宿主細胞と共に既に用いられており、これは当業者にとって明白であろう。

前記抗体又はその抗原結合断片の回収は、例えば、遠心分離又は限外濾過によって不純物を除去し、その結果を、例えば、親和クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。追加のその他精製技術、例えば、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどを用いることができる。

本発明は、さらに他の観点において、前記抗体を有効成分として含む癌の予防又は治療用組成物に関する。

本発明は、例えば、（ａ）本発明に係るＰＤ－Ｌ１に対する抗体又はその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び、（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む癌の予防又は治療用薬剤学的組成物であってよい。本発明は、また、患者に必要な有効量で本発明に係るＰＤ－Ｌ１に対する抗体又はその抗原結合断片を投与する段階を含む癌の予防又は治療方法に関する。

前記組成物は、上述した本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片を有効成分として用いるので、これら両者に共通する内容は記載を省略する。

ＰＤ－１にＰＤ－Ｌ１の結合は、自己免疫及び免疫病理の寛容及び予防に重要なＴ細胞抗原特異的反応を陰性的に調節する。しかし、慢性抗原刺激によって誘発され得る過度なＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１相互作用は、Ｔ細胞枯渇の（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）特徴となる、Ｔ細胞抗原特異的反応の抑制及びＴ細胞の消失を招くことがある。Ｔ細胞枯渇は、慢性感染及び癌で起き得るＴ細胞機能障害の状態である。これは、不良なエフェクター機能、抑制性受容体の持続的発現、及び機能的エフェクター又は記憶Ｔ細胞とは異なる転写状態として定義される。枯渇は、感染及び腫瘍進行の管理を妨害する。

下記の実施例から立証されるように、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、ＰＤ－Ｌ１に高い親和度で結合してＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１複合体の形成を阻害することにより、抗腫瘍Ｔ細胞活性を回避するＴ細胞枯渇を誘導する癌を治療するのに有用に用いることができる。

本発明は、また、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を他の抗癌剤と共に投与して癌を予防又は治療するための併用投与用組成物に関する。

本発明は、例えば、（ａ）本発明に係るＰＤ－Ｌ１に対する抗体又はその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び、（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む癌を予防又は治療するための併用投与用組成物であってよい。本発明は、また、患者に必要な有効量で本発明に係るＰＤ－Ｌ１に対する抗体又はその抗原結合断片を投与する段階を含む、癌の予防又は治療のための併用投与方法に関する。

前記組成物は、上述した本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片を有効成分として用いるので、これら両者に共通する内容は記載を省略する。

上記のように、本発明に係る抗体と他の抗癌治療剤を併用することにより、ＰＤ－Ｌ１を過発現する腫瘍細胞を効果的に標的化し、抗腫瘍Ｔ細胞活性を増加させ、よって、腫瘍細胞を標的化する免疫反応を増大させることができる。

その他、抗新生物剤又は免疫原性製剤［（例えば、弱化した癌細胞、腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド及び炭水化物分子を含む）、抗原伝達細胞、例えば、腫瘍由来抗原又は核酸でパルスされた樹状細胞、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮα２、ＧＭ－ＣＳＦ）、及び免疫刺激サイトカインを暗号化する遺伝子で形質感染された細胞（例えば、ＧＭ－ＣＳＦを含むが、これに制限されない。）］；癌抗原をターゲットとする抗体を含む細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＫ）、腫瘍微細環境の免疫抑制阻害剤（例えば、ＩＤＯ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、腫瘍溶解性ウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖｉｒｕｓ）、標準癌治療療法（例えば、化学治療療法、放射線治療療法又は手術）；又はその他癌関連抗原が用いられてよい。

また、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、他の抗体（前記ＰＤ－Ｌ１抗体以外の抗体、例えば、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ受容体、その他成長因子受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ－４、ＯＸ－４０、４－ＩＢＢ、及びＩＣＯＳなどに対する抗体が挙げられるが、これに制限されない。）と共に使用されてよい。

具体的に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片と共に使用可能な抗体は、癌又は自己免疫疾患関連抗原に特異的に結合できる抗体であればいずれも使用可能であり、該抗原としては、４－１ＢＢ、インテグリン、アンジオポエチン、アンジオポエチン様物質３、Ｂ細胞活性因子（Ｂ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＢＡＦＦ）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ６２、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＧＲＰ、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、クローディン１８（Ｃｌａｕｄｉｎ－１８）、ＣＴＬＡ４、ＤＬＬ３、ＥＧＦ受容体、Ｆｃ受容体、ＦＧＦ２３、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）受容体、ＧＤ２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＨＥＲ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、インターフェロン受容体、インターフェロンガンマ、ＩｇＥ、ＩＧＦ－１受容体、インターロイキン１、インターロイキン２受容体、インターロイキン４受容体、インターロイキン５、インターロイキン５受容体、インターロイキン６、インターロイキン６受容体、インターロイキン７、インターロイキン１２／２３、インターロイキン１３、インターロイキン１７Ａ、インターロイキン１７受容体Ａ、インターロイキン３１受容体、インターロイキン３６受容体、ＬＡＧ３、ＬＦＡ３、ＮＧＦ、ＰＶＳＫ９、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＲＡＮＫ－Ｌ、ＳＬＡＭＦ７及び組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。

より具体的に、前記抗原に結合する抗体は、
４－１ＢＢに対する抗体は、ウトミルマブ（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）；
インテグリンに対する抗体は、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、エトロリズマブ（Ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ（Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）、ビマグルマブ（Ｂｉｍａｇｒｕｍａｂ）；
アミロイドベータに対する抗体は、バピネウズマブ（Ｂａｐｉｎｅｕｚｕｍａｂ）、クレネズマブ（Ｃｒｅｎｅｚｕｍａｂ）、ソラネズマブ（Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ）、アデュカヌマブ（Ａｄｕｃａｎｕｍａｂ）、ガンテネルマブ（Ｇａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ）；
アンジオポエチンに対する抗体は、ＡＭＧ７８０；
アンジオポエチン様物質３に対する抗体は、エビナクマブ（Ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ）；
Ｂ細胞活性因子（Ｂ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＢＡＦＦ）に対する抗体は、タバルマブ（Ｔａｂａｌｕｍａｂ）、ラナルマブ（Ｌａｎａｌｕｍａｂ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）；
Ｂ７－Ｈ３に対する抗体は、オムブルタマブ（ｏｍｂｕｒｔａｍａｂ）；
ＣＣＲ４に対する抗体は、モガムリズマブ（Ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＤ３に対する抗体は、オテリキシズマブ（Ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、テプリズマブ（Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）、ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）と、ＧＰ１００とＣＤ３に対する二重特異性抗体であるテベンタフスプ（Ｔｅｂｅｎｔａｆｕｓｐ）、ＣＤ１９とＣＤ３に対する二重特異性抗体であるブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）；ＣＤ２０とＣＤ３に対する二重特異性抗体であるＲＥＧＮ１９７９；
ＣＤ４に対する抗体は、イバリズマブ（Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）、ザノリムマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）；
ＣＤ６に対する抗体は、イトリズマブ（Ｉｔｏｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＤ１１ａに対する抗体は、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＤ１９に対する抗体は、イネビリズマブ（Ｉｎｅｂｉｌｉｚｕｍａｂ）、タファシタマブ（Ｔａｆａｓｉｔａｍａｂ）と、ＡＤＣであるロンカスツキシマブテシリン（Ｌｏｎｃａｓｔｕｘｉｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）；
ＣＤ２０に対する抗体は、オクレリズマブ（Ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、ウブリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）と、ＡＤＣであるイブリツモマブチウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）；
ＣＤ２２に対する抗体は、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）と、ＡＤＣであるイノツズマブオゾガマイシン（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、モキセツモマブパスドトクス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）；
ＣＤ３０に対するＡＤＣは、ブレンツキシマブベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）；
ＣＤ３３に対するＡＤＣは、バダスツキシマブタリリン（Ｖａｄａｓｔｕｘｉｍａｂ ｔａｌｉｒｉｎｅ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）；
ＣＤ３８に対する抗体は、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イサツキシマブ（Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ）；
ＣＤ５２に対する抗体は、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｘｕｍａｂ）；
ＣＤ６２に対する抗体は、クリザンラリズマブ（Ｃｒｉｚａｎｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＤ７９ｂに対するＡＤＣは、ポラツズマブベドチン（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）；
ＣＤ８０に対する抗体は、ガリキシマブ（Ｇａｌｉｘｉｍａｂ）；
ＣＧＲＰに対する抗体は、エプチネズマブ（Ｅｐｔｉｎｅｚｕｍａｂ）、フレマネズマブ（Ｆｒｅｍａｎｅｚｕｍａｂ）、ガルカネズマブ（Ｇａｌｃａｎｅｚｕｍａｂ）、エレヌマブ（Ｅｒｅｎｕｍａｂ）；
クローディン１８（Ｃｌａｕｄｉｎ－１８）に対する抗体は、ゾルべツキシマブ（Ｚｏｌｂｅｔｕｘｉｍａｂ）；
ＣＴＬＡ４に対する抗体は、デュルバルマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、ザリフレリマブ（Ｚａｌｉｆｒｅｌｉｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）；
ＤＬＬ３に対するＡＤＣは、ロバルピツズマブテシリン（Ｒｏｖａｌｐｉｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）；
ＥＧＦ受容体に対する抗体は、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、デパツキシズマブ（Ｄｅｐａｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）；
Ｆｃ受容体に対する抗体は、、ニプカリマブ（Ｎｉｐｏｃａｌｉｍａｂ）、ロザノリキシズマブ（Ｒｏｚａｎｏｌｉｘｉｚｕｍａｂ）；
ＦＧＦ２３に対する抗体は、ブロスマブ（Ｂｕｒｏｓｕｍａｂ）；
葉酸（ｆｏｌａｔｅ）受容体に対する抗体は、ファーレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）と、ＡＤＣであるミルベツキシマブソラブタンシン（Ｍｉｒｖｅｔｕｘｉｍａｂ ｓｏｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）；
ＧＤ２に対する抗体は、ジヌツキシマブ（Ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、ナキシタマブ（Ｎａｘｉｔａｍａｂ）；
ＧＭ－ＣＳＦに対する抗体は、オチリマブ（Ｏｔｉｌｉｍａｂ）；
ＨＥＲ２に対する抗体は、マルゲツキシマブ（Ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）と、ＡＤＣであるトラスツズマブデルクステカン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｄｅｒｕｘｔｅｃａｎ）、トラスツズマブエムタンシン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、トラスツズマブデュオカルマジン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｄｕｏｃａｒｍａｚｉｎｅ）；
ＨＥＲ３に対する抗体は、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）；
インターフェロン受容体に対する抗体は、アニフロルマブ（Ａｎｉｆｒｏｌｕｍａｂ）；
インターフェロンガンマに対する抗体は、エマパルマブ（Ｅｍａｐａｌｕｍａｂ）；
ＩｇＥに対する抗体は、リゲリズマブ（Ｌｉｇｅｌｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）；
ＩＧＦ－１受容体に対する抗体は、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ（Ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）；
インターロイキン１に対する抗体は、ゲボキズマブ（Ｇｅｂｏｋｉｚｕｍａｂ）、カナキヌマブ（Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）；
インターロイキン２受容体に対する抗体は、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）；
インターロイキン４受容体に対する抗体は、デュピルマブ（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）；
インターロイキン５に対する抗体は、メポリズマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、レスリズマブ（Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン５受容体に対する抗体は、ベンラリズマブ（Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン６に対する抗体は、クラザキズマブ（Ｃｌａｚａｋｉｚｕｍａｂ）、オロキズマブ（Ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ）、シルクマブ（Ｓｉｒｕｋｕｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）；
インターロイキン６受容体に対する抗体は、サリルマブ（Ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、サトラリズマブ（Ｓａｔｒａｌｉｚｕｍａｂ）、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、ＲＥＧＮ８８；
インターロイキン７に対する抗体は、セクキヌマブ（Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）；
インターロイキン１２／２３に対する抗体は、ウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、ブリアキヌマブ（Ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ）；
インターロイキン１３に対する抗体は、レブリキズマブ（Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）、トラロキヌマブ（Ｔｒａｌｏｋｉｎｕｍａｂ）；
インターロイキン１７Ａに対する抗体は、イキセキズマブ（Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、ビメキズマブ（Ｂｉｍｅｋｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン１７受容体Ａに対する抗体は、ブロダルマブ（Ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）；
インターロイキン２３に対する抗体は、ブラジクマブ（Ｂｒａｚｉｋｕｍａｂ）、グセルクマブ（Ｇｕｓｅｌｋｕｍａｂ）、リサンキズマブ（Ｒｉｓａｎｋｉｚｕｍａｂ）、チルドラキズマブ（Ｔｉｌｄｒａｋｉｚｕｍａｂ）、ミリキズマブ（Ｍｉｒｉｋｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン３１受容体に対する抗体は、ネモリズマブ（Ｎｅｍｏｌｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン３６受容体に対する抗体は、スペソリマブ（Ｓｐｅｓｏｌｉｍａｂ）；
ＬＡＧ３に対する抗体は、レラトリマブ（Ｒｅｌａｔｌｉｍａｂ）；
ＮＡＳＰ２に対する抗体は、ナルソプリマブ（Ｎａｒｓｏｐｌｉｍａｂ）；
ＮＧＦに対する抗体は、ファシヌマブ（Ｆａｓｉｎｕｍａｂ）、タネズマブ（Ｔａｎｅｚｕｍａｂ）；
ＰＶＳＫ９に対する抗体は、アリロクマブ（Ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、エボロクマブ（Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）、ボコシズマブ（Ｂｏｃｏｃｉｚｕｍａｂ）；
ＰＤ－１に対する抗体は、ランブロリズマブ（Ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、バルスチリマブ（Ｂａｌｓｔｉｌｉｍａｂ）、カムレリズマブ（Ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、セミプリマブ（Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）、ドスタルリマブ（Ｄｏｓｔａｒｌｉｍａｂ）、プロルゴリマブ（Ｐｒｏｌｇｏｌｉｍａｂ）、ンチリマブ（Ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ）、スパルタリズマブ（Ｓｐａｒｔａｌｉｚｕｍａｂ）、チスレリズマブ（Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）；
ＰＤ－Ｌ１に対する抗体は、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、エンバフォリマブ（Ｅｎｖａｆｏｌｉｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）と、ＴＧＦ ｂｅｔｅとＰＤ－Ｌ１の二重特異性抗体であるビントラフスアルファ（Ｂｉｎｔｒａｆｕｓｐ ａｌｐｈａ）；
ＲＡＮＫ－Ｌに対する抗体は、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）；
ＳＬＡＭＦ７に対する抗体は、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）；
組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ）に対する抗体は、コンシズマブ（Ｃｏｎｃｉｚｕｍａｂ）、マルスタシマブ（Ｍａｒｓｔａｃｉｍａｂ）；
ＴＮＦ、特に、ＴＮＦαに対する抗体は、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）と抗体断片であるセルトリズマブペゴル（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ＴＮＦとアルブミンに対する二重特異性抗体であるオゾラリズマブ（Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）；
ＶＥＧＦに対する抗体は、ブロルシズマブ（Ｂｒｏｌｕｃｉｚｕｍａｂ）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）と、ＶＥＧＦとＡｎｇ２の二重特異性抗体であるファリシマブ（Ｆａｒｉｃｉｍａｂ）；及び
ＶＥＧＦ受容体に対する抗体は、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）
などが挙げられるが、これに限定されるものではない。

前記組成物に適用される疾患である癌は、典型的に免疫治療療法に反応する癌、及びいままで免疫療法に関連していない癌を含む。治療用に好適な癌の非制限的な例は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓癌（例えば、透明細胞癌腫）、前立腺癌（例えば、ホルモン不応前立腺癌腫）、膵臓腺癌腫、乳癌、結腸癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、食道癌、頭頸部扁平細胞癌腫、肝癌、卵巣癌、子宮頸癌、甲状腺癌、膠芽細胞腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、及びその他新生物癌腫を含む。さらに、本発明は、本発明の抗体を用いて成長を抑制できる不応又は再発癌を含む。

また、本発明に係る抗体又は抗体断片は、単独、又はワクチンと共に使用され、病原体、毒素、及び自己抗原に対する免疫反応を刺激させることができる。抗体又はその抗原－結合断片は、例えば、ヒト免疫欠乏ウイルス、肝炎ウイルス部類Ａ、Ｂ及びＣ、エプスタインバールウイルス（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）、ヒトサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、ヒトパピローマ（ｐａｐｉｌｌｏｍａ）ウイルス、ヘルペスウイルスを含むが、これに制限されず、ヒトを伝染させるウイルスに対する免疫反応を刺激させるために用いられてよい。抗体又はその抗原－結合断片は、細菌又は真菌寄生体、及びその他病原体の感染に対する免疫反応を刺激させるために用いられてよい。

本発明は、また、本発明の抗体又はその抗原結合断片及び有用バクテリアを含む組成物に関する。前記有用バクテリアは、抗癌効能を有するバクテリア又はプロバイオティクス（ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ）に用いられるものであり、アナエロコッカス（Ａｎａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アナエロスティペス（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ）、アリスティペス（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ）、アッケルマンシア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラウティア（Ｂｌａｕｔｉａ）、カプノサイトファーガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリンセラ（Ｃｏｌｌｉｎｓｅｌｌａ）、デスルフォビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ドレア（Ｄｏｒｅａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ユウバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フィーカリバクテリウム（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ガードネレラ（Ｇａｒｎｄｅｒｅｌｌａ）、ゲミガー（Ｇｅｍｍｉｇｅｒ）、クレブシエラ（Ｋｅｌｂｓｉｅｌｌａ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、モリエラ（Ｍｏｒｙｅｌｌａ）、パラブレボテラ（Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、パラバクテイデス（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ファスコラークトバクテリウム（Ｐｈａｒｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、シュードブチリビブリオ（Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）、ロゼブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、ロシア（Ｒｏｔｈｉａ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。

本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に一般に用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロ－ス、ポリビニルピロリドン、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の組成物は、前記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むこともできる。

本発明の薬剤学的組成物は、経口又は非経口で投与でき、非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などで投与できる。

経口投与のとき、タンパク質又はペプチドは消化してしまうため、経口用組成物は、活性薬剤をコートしたり、或いは胃での分解から保護されるように剤形化する必要がある。また、薬剤学的組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与されてよい。

本発明に係る組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、熟練した通常の医師は、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。例えば、本発明の薬剤学的組成物の１日投与量は０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇである。本明細書において用語“薬剤学的有効量”は、癌を予防又は治療するのに十分な量を意味する。

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより、単位容量の形態で製造されたり、又は多回容量容器内に内入して製造されてよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液形態であるか、エキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。

本発明の組成物は、個別治療剤として投与したり、或いは他の治療剤と併用して投与されてよく、従来の治療剤とは順次に又は同時に投与されてよい。

一側面において、本発明は、本発明に係る抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片に薬物が接合された抗体－薬物コンジュゲート及びこれを含む薬学組成物を提供する。また、本発明は、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片に薬物が接合された抗体－薬物コンジュゲート及びこれを含む薬学組成物を用いて腫瘍を治療する方法を提供する。

前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片は、リンカーを介して薬物に結合してよい。前記リンカーは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片と薬物とを連結する部位であり、例えば、前記リンカーは、細胞内条件で切断可能な形態、すなわち、細胞内環境においてリンカーの切断により抗体から薬物が放出されることを可能にする。

前記リンカーは、細胞内環境、例えばリソソーム又はエンドソームに存在する切断剤によって切断でき、例えば、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素、例えばリソソーム又はエンドソームプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーであってよい。一般に、ペプチドリンカーは、少なくとも２個のアミノ酸長を有する。前記切断剤は、カテプシンＢ及びカテプシンＤ、プラスミンを含むことができ、ペプチドを加水分解して薬物を標的細胞内に放出可能にする。

前記ペプチドリンカーは、チオール依存性プロテアーゼカテプシン－Ｂによって切断され得、これは、癌組織で過発現し、例えば、Ｐｈｅ－Ｌｅｕ又はＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙリンカーが使用可能である。また、前記ペプチドリンカーは、例えば、細胞内プロテアーゼによって切断可能なものであり、Ｖａｌ－Ｃｉｔリンカーであるか、Ｐｈｅ－Ｌｙｓリンカーであってよい。

一実施例において、前記切断性リンカーはｐＨ敏感性であり、特定ｐＨ値で加水分解に敏感であり得る。一般に、ｐＨ敏感性リンカーは、酸性条件で加水分解され得るものを指す。例えば、リソソームで加水分解され得る酸性不安定リンカー、例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス－アコニット酸アミド（ｃｉｓ－ａｃｏｎｉｔｉｃ ａｍｉｄｅ）、オルトエステル、アセタール、ケタールなどであってもよい。

他の実施例において、前記リンカーは還元条件で切断されてもよく、例えば、二硫化リンカーがこれに該当し得る。ＳＡＴＡ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－Ｓ－ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ）、ＳＰＤＰ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、ＳＰＤＢ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｂｕｔｙｒａｔｅ）及びＳＭＰＴ（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ－ａｌｐｈａ－ｍｅｔｈｙｌ－ａｌｐｈａ－（２－ｐｙｒｉｄｙｌ－ｄｉｔｈｉｏ）ｔｏｌｕｅｎｅ）を用いて様々な二硫化結合を形成することができる。

前記薬物及び／又は薬物－リンカーは、抗体のリジンによって無作為に接合されたり、或いは二硫化結合鎖を還元した時に露出されるシステインによって接合され得る。場合によって、遺伝工学的に作製されたタグ、例えば、ペプチド又はタンパク質に存在するシステインによってリンカー－薬物が結合できる。前記遺伝工学的に作製されたタグ、例えば、ペプチド又はタンパク質は、例えば、イソプレノイドトランスフェラーゼによって認識可能なアミノ酸モチーフを含むことができる。前記ペプチド又はタンパク質は、ペプチド又はタンパク質のカルボキシ末端で欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を有したり、或いはペプチド又はタンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端にスぺーサユニットの共有結合による付加を有する。

また、前記リンカーは、例えば、非切断性リンカーであってもよく、抗体加水分解の単一段階によって薬物が放出され、例えば、アミノ酸－リンカー－薬物複合体を生産する。このような類型のリンカーは、チオエーテル基又はマレイミドカプロイル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）基であり得、血液内安定性が維持できる。

前記抗体－薬物コンジュゲートにおける薬物は、薬理学的効果を示す製剤として抗体に結合してよく、具体的に、化学療法剤、毒素、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又は放射性同位元素であってよい。前記化学療法剤は、例えば、細胞毒性製剤又は免疫抑制剤であってよい。具体的に、マイクロチューブリン抑制剤、有糸分裂抑制剤、トポイソメラーゼ抑制剤、又はＤＮＡインターカレータとして働き得る化学療法剤を含むことができる。また、免疫調節化合物、抗癌剤及び抗ウイルス剤、又はこれらの組合せを含むことができる。

このような薬物には、例えば、メイタンシノイド、オーリスタチン、アミノプテリン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、サリドマイド、カンプトテシン、Ｎ８－アセチルスペルミジン、１－（２クロロエチル）－１，２－ジメチルスルホニルヒドラジド、エスペラマイシン、エトポシド、６－メルカプトプリン、ドラスタチン、トリコテセン、カリケアミシン、タキソール（ｔａｘｏｌ）、タキサン、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、メトトレキサート、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ズオカルマイシン、Ｌ－アスパラギナーゼ（Ｌ－ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、メルカプトプリン（ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、チオグアニン（ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イホスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、窒素マスタード（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｍｕｓｔａｒｄ）、シトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、５－フルオロウラシル（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ＣＮＵ（ｂｉｓｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、プリカマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、クロランブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、カルムスチン（ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ）、ロムスチン（ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕＬｆａｎ）、トレオスルファン（ｔｒｅｏｓｕｌｆａｎ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テニポシド（ｔｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、９－アミノカンプトテシン（９－ａｍｉｎｏｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ）、クリスナトール（ｃｒｉｓｎａｔｏｌ）、マイトマイシンＣ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃ）、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘａｔｅ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、チアゾフリン（ｔｉａｚｏｆｕｒｉｎ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ＥＩＣＡＲ（５－ｅｔｈｙｎｙｌ－１－ｂｅｔａ－Ｄｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、ラルチトレキセド（ｒａｌｔｉｔｒｅｘｅｄ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ（ａｒａ Ｃ））、シトシンアラビノシド（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒａｂｉｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、酢酸リュープロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ビカルタミド（ｂｉｃａｌｕｔａｍｉｄｅ）、ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３、ＫＨ１０６０、ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）、フタロシアニン（ｐｈｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）、光感作剤Ｐｅ４（ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ Ｐｅ４）、デメトキシ－ヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ－ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ Ａ）、インターフェロン－α（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－α）、インターフェロン－γ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ベルケイド（ｖｅｌｃａｄｅ）、レブリミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）、タルアミド（ｔｈａｌａｍｉｄ）、ロバスタチン（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）、１－メチル－４－フェニルピリジニウムイオン（１－ｍｅｔｈｙｌ－４－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍｉｏｎ）、スタウロスポリン（ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシンＡ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ Ａ２）、ブレオマイシンＢ２（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎＢ２）、ペプロマイシン（ｐｅｐｌｏｍｙｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ゾルビシン（ｚｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）及びタプシガルギン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）、核酸分解酵素及び細菌や動植物由来の毒素からなる群から選ばれる一つ以上であり得るが、これに限定されない。

一側面において、本発明は、本発明に係る抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片と、他の抗原に結合する抗体が結合している二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を提供する。

本発明に係る抗ＰＤ－Ｌ１抗体又はその抗原結合断片と二重特異性抗体を形成する抗体としては、癌又は自己免疫疾患関連抗原に特異的に結合できる抗体であればいずれも使用可能であり、このような抗原としては、４－１ＢＢ、インテグリン、アンジオポエチン、アンジオポエチン様物質３、Ｂ細胞活性因子（Ｂ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、ＢＡＦＦ）、Ｂ７－Ｈ３、ＣＣＲ４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ６２、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＧＲＰ、ＯＸ－４０、ＩＣＯＳ、クローディン１８（Ｃｌａｕｄｉｎ－１８）、ＣＴＬＡ４、ＤＬＬ３、ＥＧＦ受容体、Ｆｃ受容体、ＦＧＦ２３、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）受容体、ＧＤ２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＨＥＲ２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、インターフェロン受容体、インターフェロンガンマ、ＩｇＥ、ＩＧＦ－１受容体、インターロイキン１、インターロイキン２受容体、インターロイキン４受容体、インターロイキン５、インターロイキン５受容体、インターロイキン６、インターロイキン６受容体、インターロイキン７、インターロイキン１２／２３、インターロイキン１３、インターロイキン１７Ａ、インターロイキン１７受容体Ａ、インターロイキン３１受容体、インターロイキン３６受容体、ＬＡＧ３、ＬＦＡ３、ＮＧＦ、ＰＶＳＫ９、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＲＡＮＫ－Ｌ、ＳＬＡＭＦ７及び組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ）、ＴＧＦ－βなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。

より具体的に、前記抗原に結合する抗体は、
４－１ＢＢに対する抗体は、ウトミルマブ（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）；
インテグリンに対する抗体は、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、エトロリズマブ（Ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ（Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）、ビマグルマブ（Ｂｉｍａｇｒｕｍａｂ）；
アミロイドベータに対する抗体は、バピネウズマブ（Ｂａｐｉｎｅｕｚｕｍａｂ）、クレネズマブ（Ｃｒｅｎｅｚｕｍａｂ）、ソラネズマブ（Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ）、アデュカヌマブ（Ａｄｕｃａｎｕｍａｂ）、ガンテネルマブ（Ｇａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ）；
アンジオポエチンに対する抗体は、ＡＭＧ７８０；
アンジオポエチン様物質３に対する抗体は、エビナクマブ（Ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ）；
Ｂ細胞活性因子（Ｂ－ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，ＢＡＦＦ）に対する抗体は、タバルマブ（Ｔａｂａｌｕｍａｂ）、ラナルマブ（Ｌａｎａｌｕｍａｂ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）；
Ｂ７－Ｈ３に対する抗体は、オムブルタマブ（ｏｍｂｕｒｔａｍａｂ）；
ＣＣＲ４に対する抗体は、モガムリズマブ（Ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＤ３に対する抗体は、オテリキシズマブ（Ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、テプリズマブ（Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）、ムロモナブ（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）と、ＧＰ１００とＣＤ３に対する二重特異性抗体であるテベンタフスプ（Ｔｅｂｅｎｔａｆｕｓｐ）、ＣＤ１９とＣＤ３に対する二重特異性抗体であるブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）；ＣＤ２０とＣＤ３に対する二重特異性抗体であるＲＥＧＮ１９７９；
ＣＤ４に対する抗体は、イバリズマブ（Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）、ザノリムマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）；
ＣＤ６に対する抗体は、イトリズマブ（Ｉｔｏｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＤ１１ａに対する抗体は、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＤ１９に対する抗体は、イネビリズマブ（Ｉｎｅｂｉｌｉｚｕｍａｂ）、タファシタマブ（Ｔａｆａｓｉｔａｍａｂ）と、ＡＤＣであるロンカスツキシマブテシリン（Ｌｏｎｃａｓｔｕｘｉｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）；
ＣＤ２０に対する抗体は、オクレリズマブ（Ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、ウブリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）と、ＡＤＣであるイブリツモマブチウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）；
ＣＤ２２に対する抗体は、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）と、ＡＤＣであるイノツズマブオゾガマイシン（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、モキセツモマブパスドトクス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）；
ＣＤ３０に対するＡＤＣはブレンツキシマブベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）；
ＣＤ３３に対するＡＤＣはバダスツキシマブタリリン（Ｖａｄａｓｔｕｘｉｍａｂ ｔａｌｉｒｉｎｅ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）；
ＣＤ３８に対する抗体は、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イサツキシマブ（Ｉｓａｔｕｘｉｍａｂ）；
ＣＤ５２に対する抗体は、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｘｕｍａｂ）；
ＣＤ６２に対する抗体は、クリザンラリズマブ（Ｃｒｉｚａｎｌｉｚｕｍａｂ）；
ＣＤ７９ｂに対するＡＤＣはポラツズマブベドチン（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）；
ＣＤ８０に対する抗体は、ガリキシマブ（Ｇａｌｉｘｉｍａｂ）；
ＣＧＲＰに対する抗体は、エプチネズマブ（Ｅｐｔｉｎｅｚｕｍａｂ）、フレマネズマブ（Ｆｒｅｍａｎｅｚｕｍａｂ）、ガルカネズマブ（Ｇａｌｃａｎｅｚｕｍａｂ）、エレヌマブ（Ｅｒｅｎｕｍａｂ）；
クローディン１８（Ｃｌａｕｄｉｎ－１８）に対する抗体は、ゾルべツキシマブ（Ｚｏｌｂｅｔｕｘｉｍａｂ）；
ＣＴＬＡ４に対する抗体は、デュルバルマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、ザリフレリマブ（Ｚａｌｉｆｒｅｌｉｍａｂ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）；
ＤＬＬ３に対するＡＤＣはロバルピツズマブテシリン（Ｒｏｖａｌｐｉｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）；
ＥＧＦ受容体に対する抗体は、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、デパツキシズマブ（Ｄｅｐａｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）；
Ｆｃ受容体に対する抗体は、、ニプカリマブ（Ｎｉｐｏｃａｌｉｍａｂ）、ロザノリキシズマブ（Ｒｏｚａｎｏｌｉｘｉｚｕｍａｂ）；
ＦＧＦ２３に対する抗体は、ブロスマブ（Ｂｕｒｏｓｕｍａｂ）；
葉酸（ｆｏｌａｔｅ）受容体に対する抗体は、ファーレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）と、ＡＤＣであるミルベツキシマブソラブタンシン（Ｍｉｒｖｅｔｕｘｉｍａｂ ｓｏｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）；
ＧＤ２に対する抗体は、ジヌツキシマブ（Ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、ナキシタマブ（Ｎａｘｉｔａｍａｂ）；
ＧＭ－ＣＳＦに対する抗体は、オチリマブ（Ｏｔｉｌｉｍａｂ）；
ＨＥＲ２に対する抗体は、マルゲツキシマブ（Ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）と、ＡＤＣであるトラスツズマブデルクステカン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｄｅｒｕｘｔｅｃａｎ）、トラスツズマブエムタンシン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、トラスツズマブデュオカルマジン（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｄｕｏｃａｒｍａｚｉｎｅ）；
ＨＥＲ３に対する抗体は、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）；
インターフェロン受容体に対する抗体は、アニフロルマブ（Ａｎｉｆｒｏｌｕｍａｂ）；
インターフェロンガンマに対する抗体は、エマパルマブ（Ｅｍａｐａｌｕｍａｂ）；
ＩｇＥに対する抗体は、リゲリズマブ（Ｌｉｇｅｌｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）；
ＩＧＦ－１受容体に対する抗体は、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ（Ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）；
インターロイキン１に対する抗体は、ゲボキズマブ（Ｇｅｂｏｋｉｚｕｍａｂ）、カナキヌマブ（Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）；
インターロイキン２受容体に対する抗体は、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）；
インターロイキン４受容体に対する抗体は、デュピルマブ（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）；
インターロイキン５に対する抗体は、メポリズマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、レスリズマブ（Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン５受容体に対する抗体は、ベンラリズマブ（Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン６に対する抗体は、クラザキズマブ（Ｃｌａｚａｋｉｚｕｍａｂ）、オロキズマブ（Ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ）、シルクマブ（Ｓｉｒｕｋｕｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）；
インターロイキン６受容体に対する抗体は、サリルマブ（Ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、サトラリズマブ（Ｓａｔｒａｌｉｚｕｍａｂ）、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、ＲＥＧＮ８８；
インターロイキン７に対する抗体は、セクキヌマブ（Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）；
インターロイキン１２／２３に対する抗体は、ウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、ブリアキヌマブ（Ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ）；
インターロイキン１３に対する抗体は、レブリキズマブ（Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）、トラロキヌマブ（Ｔｒａｌｏｋｉｎｕｍａｂ）；
インターロイキン１７Ａに対する抗体は、イキセキズマブ（Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、ビメキズマブ（Ｂｉｍｅｋｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン１７受容体Ａに対する抗体は、ブロダルマブ（Ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）；
インターロイキン２３に対する抗体は、ブラジクマブ（Ｂｒａｚｉｋｕｍａｂ）、グセルクマブ（Ｇｕｓｅｌｋｕｍａｂ）、リサンキズマブ（Ｒｉｓａｎｋｉｚｕｍａｂ）、チルドラキズマブ（Ｔｉｌｄｒａｋｉｚｕｍａｂ）、ミリキズマブ（Ｍｉｒｉｋｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン３１受容体に対する抗体は、ネモリズマブ（Ｎｅｍｏｌｉｚｕｍａｂ）；
インターロイキン３６受容体に対する抗体は、スペソリマブ（Ｓｐｅｓｏｌｉｍａｂ）；
ＬＡＧ３に対する抗体は、レラトリマブ（Ｒｅｌａｔｌｉｍａｂ）；
ＮＡＳＰ２に対する抗体は、ナルソプリマブ（Ｎａｒｓｏｐｌｉｍａｂ）；
ＮＧＦに対する抗体は、ファシヌマブ（Ｆａｓｉｎｕｍａｂ）、タネズマブ（Ｔａｎｅｚｕｍａｂ）；
ＰＶＳＫ９に対する抗体は、アリロクマブ（Ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、エボロクマブ（Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）、ボコシズマブ（Ｂｏｃｏｃｉｚｕｍａｂ）；
ＰＤ－１に対する抗体は、ランブロリズマブ（Ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、バルスチリマブ（Ｂａｌｓｔｉｌｉｍａｂ）、カムレリズマブ（Ｃａｍｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、セミプリマブ（Ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）、ドスタルリマブ（Ｄｏｓｔａｒｌｉｍａｂ）、プロルゴリマブ（Ｐｒｏｌｇｏｌｉｍａｂ）、ンチリマブ（Ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ）、スパルタリズマブ（Ｓｐａｒｔａｌｉｚｕｍａｂ）、チスレリズマブ（Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ）、ペムブロリズマブ（Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）；
ＰＤ－Ｌ１に対する抗体は、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）、エンバフォリマブ（Ｅｎｖａｆｏｌｉｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）；
ＲＡＮＫ－Ｌに対する抗体は、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）；
ＳＬＡＭＦ７に対する抗体は、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）；
組織因子（Ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ）に対する抗体は、コンシズマブ（Ｃｏｎｃｉｚｕｍａｂ）、マルスタシマブ（Ｍａｒｓｔａｃｉｍａｂ）；
ＴＮＦ、特に、ＴＮＦαに対する抗体は、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）と抗体断片であるセルトリズマブペゴル（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ＴＮＦとアルブミンに対する二重特異性抗体であるオゾラリズマブ（Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）；
ＶＥＧＦに対する抗体は、ブロルシズマブ（Ｂｒｏｌｕｃｉｚｕｍａｂ）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）と、ＶＥＧＦとＡｎｇ２の二重特異性抗体であるファリシマブ（Ｆａｒｉｃｉｍａｂ）；及び
ＶＥＧＦ受容体に対する抗体は、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）
などが挙げられるが、これに限定されるものではない。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されると解釈されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

実施例１．ＰＤ－Ｌ１抗原発現及び精製
ＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ遺伝子が含まれているベクター（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）とし、ＰＤ－Ｌ１遺伝子Ｎ末端のシグナル配列（ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）において細胞外の（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）部位（Ｍｅｔ１～Ｔｈｒ２３９）を含む切片をＰＣＲ増幅して、ヒトＦｃ切片融合発現のためのベクター、ｐＣＥＰ４－ＦｃベクターのＮｈｅＩ、ＳｆｉＩ制限酵素位置に挿入し、‘ｐＣＥＰ４－ＰＤＬ１－Ｆｃ’ベクターを作製した。

その後、細胞形質転換試薬であるＦｅｃｔｏＰＲＯ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社）を用いて、メーカーから提供する形質転換方法にしたがって、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞にＰＤ－Ｌ１発現ベクターを導入し、約６～１０日間の培養によって細胞外に抗原タンパク質を排出させた。

細胞培養液に排出されたＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａレジン（Ａｍｉｃｏｇｅｎ社）を用いたオープン（ｏｐｅｎ）カラム精製法で精製し、クエン酸で溶出した後、１ＭトリスｐＨ９．４溶液で中和した。中和した抗原タンパク質は、１Ｘ ＰＢＳバッファーで５回透析（ｄｉａｌｙｓｉｓ）過程を経て精製を完了し、以降の実験に使用した。

実施例２．ファージライブラリー再増幅
１）ＰＤ－Ｌ１に結合するヒト抗体選別のために‘ファージディスプレイ’手法を用いた。ファージディスプレイを用いたヒト抗体候補選別のために３種類のヒト抗体ライブラリーを使用し、これは、１）‘ＰＮＡＳ，１９９９年ｖｏｌ．９６，ｐｐ．６９５３－６９５８’に報告されたｎａｉｖｅ ｓｃＦｖライブラリー、２）‘Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ，２００９年ｖｏｌ．２７，ｐｐ．２２５－２３５’に報告されたｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｃＦｖライブラリー、３）ＬＧ生命科学で開発した‘ＬＧ ｎａｉｖｅ ｓｃＦｖライブラリー’である。

２）ファージディスプレイのために、大腸菌からファージを再増幅し、ｓｃＦｖのディスプレイされたファージを生産したが、その方法は、‘１）’番ライブラリーは論文上の‘Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｃＦｖ－ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｐｈａｇｅ’方法と‘２）’番ライブラリーは論文上の‘Ｌｉｂｒａｒｙ ｒｅｓｃｕｅ’方法によって生産を進行し、‘３）’番ライブラリーは、別の方法で生産を進行したが、その詳細な方法は、次のようである。

３）ファージ含有細胞１バイアル（ｖｉａｌ）を溶かして２ｘＹＴ（１％グルコース、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む）２Ｌに接種し、３７℃撹拌培養器でＯＤ６００が０．５になるまで育てた後、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを２０ ＭＯＩ値に混ぜ、３７゜Ｃ温度で４５分撹拌なしで培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）することにより、個別細胞内にヘルパーファージの感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を全て起こさせた。

４）感染済みの細胞を５００ｍｌのｓｏｒｖａｌｌチューブに移して１５分間５０００ｒｐｍで遠心分離をし、細胞沈殿物を２Ｌ ２ｘＹＴ（１ｍＭ ＩＰＴＧ、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、７０μｇ／ｍｌカナマイシン、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含む。）に再懸濁させた後、３０℃振盪培養器で一晩培養（２２０ｒｐｍ）をし、ファージが生産させた。

５）一晩細胞培養（２２０ｒｐｍ、３０゜Ｃ）をした後、細胞培養液を２０分間４゜Ｃ、８０００ｒｐｍで遠心分離をし、細胞培養沈殿物を捨てて上澄液だけを取った後、上澄液体積の１／５体積のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ ｗ／ｖ ＰＥＧ ６０００、０．２５Ｍ ＮａＣｌ）溶液を入れ、氷で約１時間培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）し、ファージが固まって沈むようにした後、２０分間４゜Ｃ、８０００ｒｐｍの遠心分離によってファージ沈殿を得、上澄液を除去した後、ファージ沈殿物を約８０ｍｌ ＰＢＳに溶かしてファージ溶液サンプルを得、０．４５μｍ注射器フィルターを用いてファージ溶液サンプル中の不純物を除去し、ファージライブラリー試料の準備を完了した。

実施例３．ファージパンニング
１）Ｄｙｎａｌ社のＤｙｎａｂｅａｄｓ^TM Ｍ－２７０エポキシビーズを用いて、メーカーから提供した実験方法によって、約１０μｇのＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質を１２．５μｌ体積のビーズに結合させ、抗原タンパク質のカップリングされた磁気ビーズを準備した後、３％ ＢＳＡ含有のＰＢＳバッファーで室温１時間培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）によりブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）反応を行った。

２）ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿及び注射器フィルターで精製された約１０^１３個のヒト抗体表面発現ファージを、１％ ＢＳＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ含有ＰＢＳ溶液に懸濁し、あらかじめ準備した１２．５μｇ／ｍｌ濃度のヒト抗体（緑十字社、ＩＶ－Ｇｌｏｂｕｌｉｎ－Ｓ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ １０％）試料でコートした免疫チューブ（ｉｍｍｕｎｏ－ｔｕｂｅ）（Ｎｕｎｃ）に入れ、Ｆｃ部位に結合するファージを除去するためのサブトラクション（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）反応を行った（室温２時間）。

３）サブトラクションを終えたファージ溶液と、抗原タンパク質のカップリングされたマグネチックビーズとを混ぜ、抗原タンパク質と結合し得る抗体ファージが磁気ビーズに結合するように、室温で約２時間混合撹拌させた後、磁性化されたＭＡＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に入れ、抗原タンパク質のカップリングされたマグネチックビーズに結合した抗体を得た。

４）パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）が進行するにつれて、１次洗浄は６ｍｌ ＰＢＳ １回、２次及び３次洗浄は６ｍｌ ＰＢＳ ２回、４次洗浄は７ｍｌ ＰＢＳ ３回などと洗浄回数を増加させ、高親和性抗体が多く選別され得るようにストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を調節した。

５）ＰＢＳバッファーで洗浄後に、ＭＡＣＳカラムに０．２５％トリプシン溶液を７００μｌ注入してカラム内にトリプシン溶液を満たした後、カラムを３７℃恒温器で３０分培養してファージ溶出（ｐｈａｇｅ ｅｌｕｔｉｏｎ）を誘導した後、カラムを１，０００ｒｐｍ、１分間遠心分離して、溶出されたファージを得た後、新鮮に準備したＯ．Ｄ．６００＝０．７～０．８程度の培養状態であるＥＲ２７３８（ＮＥＢ）大腸菌と混合して、溶出されたファージの大腸菌感染を誘導した。

６）ファージに感染された大腸菌は、該当の抗体が含まれた固形ＬＢプレート（１％グルコースを含む）上に塗抹し、３０゜Ｃ培養器で一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）培養して大腸菌をいずれもローン（ｌａｗｎ）に育て、プレートで完全に育った大腸菌は、スクレーパー（ｓｃｒａｐｅｒ）で収穫し、実施例２で用いられた方法によりファージ粒子を再増幅した。

実施例４．ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ実験を用いたＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質結合抗体の選別
１）ＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質への結合の有無を確認するために、個別抗体を発現している約１７００個のバクテリア菌株から、抗体切片が含まれているペリプラズム切片（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を得、ＥＬＩＳＡ選別実験及びＦＡＣＳ選別実験を行った。

２）それぞれ、大腸菌らから抗体切片タンパク質を得るために、単一コロニーのバクテリアを、約１ｍｌのＬＢ培地が分注された９６深ウェルプレートに接種した後、３７℃振盪培養器（ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で培養し、約ＯＤ６００値が０．７～０．８程度に到達した時に１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、３０℃で一晩振盪培養（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｓｈａｋｉｎｇ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）をさらに行い、大腸菌のペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）に抗体切片が発現するように誘導した。

３）翌日、ペリプラズム成分を抽出するために、培養された大腸菌を遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して上澄液を捨て、大腸菌を全て８０μｌ体積の冷たい（ｉｃｅ－ｃｏｌｄ）１Ｘ ＴＥＳバッファー（２０％ ｗ／ｖスクロース、５０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、アイス（ｉｃｅ）状態で３０分間放置するが、その後、１２０μｌの冷たい０．２Ｘ ＴＥＳバッファーを追加して混ぜた後、約３０分間さらに放置し、滲透圧によりペリプラズム成分が抽出されるように誘導した。その後、細胞は遠心分離により除去し、上澄液を、抗体切片の含まれたペリプラズム成分としてＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ検証実験に用いた。

４）ＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質との結合性確認のためのＥＬＩＳＡ検証実験のために、抗原タンパク質約１００ｎｇ／ｗｅｌｌを、１００μｌ体積のＰＢＳバッファーに溶かし、４℃で一晩培養（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）してハーフウェルサイズ（ｈａｌｆ－ｗｅｌｌ ｓｉｚｅ）ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社３６９０）にコートし、翌日、約１７０μｌの３％ ＢＳＡを含むＰＢＳバッファーに交換した後、約１時間３７℃培養によりブロッキング反応を行った。

５）ペリプラズム成分抽出から得られた上澄液５０μｌ＋５０μｌ ＰＢＳを入れ、室温で約１時間培養して、抗体切片をコートされている抗原タンパク質に結合させ、その後、２～３回洗浄段階処理を経て抗－ｍｙｃ－ＨＲＰ抗体又は抗－ＨＡ－ＨＲＰ ２次抗体が含まれたＰＢＳバッファーを分注し、室温で約１時間培養した後、２～３回のＰＢＳバッファーによる洗浄過程を行った。

６）ＨＲＰの気質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）であるＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）が含まれたＥＬＩＳＡ反応溶液を１００μｌずつ分注し、発色反応を観察することにより、抗体切片のＰＤ－Ｌ１抗原結合の有無を判別した。

７）細胞表面に発現するＰＤ－Ｌ１の自然型の構造への選別された抗体切片の結合の有無を検証するためのＦＡＣＳ実験を行った。そのために、ＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質を２９３Ｔ細胞に形質転換によって発現させた後、抗体切片の表面発現ＰＤ－Ｌ１抗原結合の有無を、流細胞分析機を用いて判別した。その実験過程は一般のＦＡＣＳ実験方法によって行った。

８）ＰＤ－Ｌ１タンパク質発現ベクターを導入した２９３Ｔ細胞を、約５×１０^５～１×１０^６ｃｅｌｌｓ／１００μｌのサイズに分けて９６ウェルＶ底プレートに分注し、ブロッキングした後、ＰＤ－Ｌ１抗体切片が含まれているペリプラズム成分を、ＰＢＳバッファーと１：１に混合した溶液１００μｌと約３０～６０分間４℃（又は、アイス上で）反応させることにより、抗原タンパク質に対する抗体切片の結合を誘導した。その後、遠心分離（１，０００ｒｐｍ、１分、４℃）により非結合成分を除去した後、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、Ａｎｔｉ－ｔａｇ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８二次抗体を、１：４００に希釈されたＦＡＣＳバッファーに再懸濁した後、４℃で３０～６０分間さらに反応させた。その後、遠心分離（１，０００ｒｐｍ、１分、４℃）によって非結合成分を除去し、発光ラベルされた細胞を４００～７００μｌ体積のＦＡＣＳバッファーに再懸濁した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）流細胞分析機を用いて細胞の発光染色の有無を分析した。

図１によれば、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対するパンニング実験３次と４次溶出に由来した約１８００個のコロニーからペリプラズム成分を得、９６ウェルプレートにコートされたＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質に対する結合の有無を検証するＥＬＩＳＡ反応を行い、発色反応を示すクローンをシーケンシング分析した結果、約７２個の個別抗体クローンが得られることを確認した。

図２によれば、これら７２個の個別クローンの天然立体配座（ｎａｔｉｖｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合性を検証するために、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を導入させた２９３Ｔ細胞を対象にＦＡＣＳ実験を行った結果、多数の抗体が、ＰＤ－Ｌ１タンパク質が表面発現している細胞表面に結合することが確認できた。

実施例５．ＢＬＩ技術ベースのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合阻害分析（ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
１）Ｐａｌｌ社のＯｃｔｅｔ機器を用いて‘ＢＬＩ（ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）’原理に基づいて機能性抗体の選別実験を進行した。まず、ＡＲ２Ｇバイオセンサーを水和（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）させた後、ＥＤＣ／ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ活性化反応を行い、ｐＨ５の１０ｍＭ酢酸塩に５μｇ／ｍｌ濃度のＰＤ－１タンパク質をコートさせた１Ｍエタノールアミンで未反応官能基を不活性化させ、１Ｘランニングバッファーに培養して平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ）させた。

２）ＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質と抗体切片の結合によるＰＤ－Ｌ１抗原とＰＤ－１タンパク質との相互作用への干渉効果を測定するために、ＰＤ－１タンパク質コートされたバイオセンサーを、ＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質とＰＤ－Ｌ１結合抗体（又は、比較抗体）とが混合されているウェルに浸し、溶液中のＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質の結合によるバイオセンサー表面の質量変化を測定した。

３）実験結果は、オクテット（Ｏｃｔｅｔ）機器専用のデータ分析ソフトウェア（ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析した。

図３によれば、オクテットバイオセンサーにＰＤ－１－Ｆｃタンパク質を結合させた後、選別されたｓｃＦｖ抗体とＰＤ－Ｌ１－Ｆｃを順次に反応させ、選別された抗体がＰＤ－Ｌ１に結合することによって、溶液内のＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質が、バイオセンサーにコートされたＰＤ－１タンパク質と結合することを抑制するかを確認した。

重鎖と軽鎖の可変領域が異なる個別抗体候補の結合阻害性能を、オクテット機器を用いて全て確認し、抗体切片が共に培養される場合に、ＰＤ－Ｌ１結合減少によるセンサグラムのパターン増加幅が減少する特性を示す抗体候補が約５０個以上（合計７２候補抗体のうち）であることを確認した。

実施例６：ＩｇＧ変換（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）
１）個別抗体クローンの塩基配列分析から確認された個別抗体のＶＨ部位とＶＬ部位を増幅するためのヒト抗体プライマーセットを用いて、約５８個の個別抗体の可変領域ＶＨとＶＬ部位をそれぞれＰＣＲ増幅し、精製した。

２）ＶＨ切片は、ＫｐｎＩ又はＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ制限酵素を処理し精製して、重鎖発現のためのｐＣＥＰ４－ＶＨベクターの該当する制限酵素部位に挿入し、ＶＬ切片は、ＫｐｎＩ又はＢａｍＨＩ、ＢｓｉＷＩ制限酵素を処理し精製して、軽鎖発現のためのｐＣＥＰ４－ＶＬベクターの該当の制限酵素部位に挿入することで、個別抗体を動物細胞内で発現させ得るベクターを確保した（重鎖及び軽鎖発現ベクターがそれぞれ５８種）。

３）それぞれのベクターは、Ｑｉａｇｅｎ社のＤＮＡ Ｍａｘｉ－ｐｒｅｐキットを用いて精製し、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ社のＦｅｃｔｏＰＲＯトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）試薬を用いてＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞に形質転換をさせてそれぞれの抗体を発現させ、培養後に、確保された上澄液に対してｐｒｏｔｅｉｎＡレジンを用いた親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）精製法を用いて抗体タンパク質を精製した。

４）対照群抗体として使用するために、Ｍｅｒｋ社で開発したＰＤ－１ターゲット抗体であるＭＫ３４７５とＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社で開発したＰＤ－Ｌ１ターゲット抗体であるＭＰＤＬ３２８０Ａ抗体の重鎖と軽鎖可変領域アミノ酸を、それぞれの特許から確認し、ｃＤＮＡを合成し、ｐＣＥＰ４－ＶＨベクターとｐＣＥＰ４－ＶＬベクターに挿入して発現ベクターを作製し、候補抗体と同じ過程を経て両抗体を生産精製し、対照抗体として使用した。

実施例７．マウスＰＤ－Ｌ１結合ＦＡＣＳ分析
１）マウスＰＤ－Ｌ１を発現させるマウス大腸癌（Ｍｕｒｉｎｅ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）細胞株である‘ＭＣ３８’（５×１０^６ｃｅｌｌｓ／１０ｍｌ）細胞にＩＦＮ－γを１００ｎｇ／ｍｌ濃度で処理して約４８時間培養し、癌細胞株の表面にＰＤ－Ｌ１発現程度を増加させた。

２）培養後、ＭＣ３８細胞を５×１０^５～１×１０^６ｃｅｌｌｓ／１００μｌ程度サイズに分けて９６ウェルＶ底プレートに分注した後、一般のＦＡＣＳ実験方法によってブロッキング過程後に、精製されているＰＤ－Ｌ１抗体を１０μｇ／ｍｌ濃度で約３０～６０分間４℃で（又は、アイス上で）反応させた後、遠心分離（１，０００ｒｐｍ、１分、４℃）によって結合しなかった抗体はＦＡＣＳ洗浄バッファーで洗浄、除去した。

３）抗体と結合させた細胞は、ヤギα－ヒトＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８二次抗体が１：４００の比率に希釈されたＦＡＣＳバッファーに再懸濁した後、４℃で約３０～６０分反応させた。その後、遠心分離（１，０００ｒｐｍ、１分、４℃）によって結合しなかった二次抗体は、ＦＡＣＳ洗浄バッファーで洗浄した。

４）細胞を４００～７００μｌ体積のＦＡＣＳバッファーに再懸濁した後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）流細胞分析機を用いて細胞の発光染色の有無を分析することにより、１次抗体のマウス型ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する表面結合性を確認した。

図４によれば、ＩｇＧ形態で発現精製された候補抗体を用いて、マウスＰＤ－Ｌ１が発現するＭＣ３８細胞表面結合性をＦＡＣＳ実験によって確認した結果、多数の抗体がマウスＰＤ－Ｌ１に結合する特性を有することを確認し、特に、ＫＬ００１（ＰＬ１１０）とＰＬ１１２抗体の場合、非常に強い結合力を有することを確認した。

実施例８．ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合遮断分析（ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋａｄｅ ａｓｓａｙ）
１）ＰＤ－１免疫関門タンパク質とそのリガンドＰＤ－Ｌ１タンパク質の結合阻害性能の確認のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベース効能検証方法には、様々な実験法が知らされているが、Ｐｒｏｍｅｇａ社で提供する細胞ベースの分析キット（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ ｋｉｔ）である‘ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ’を用いて、選別された抗体クローンのＰＤ－Ｌ１性能阻害能を検証した。Ｐｒｏｍｅｇａ社のキットでは、細胞から測定された発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）値の強度が、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合阻害性能の強度に比例して現れた。

２）実験法は、Ｐｒｏｍｅｇａキットで提供するプロトコルに従って実験を進行し、簡略に要約すれば次の通りである。

３）アッセイ実験の前日に、３７℃水槽（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で‘Ｔｈａｗ－ａｎｄ－Ｕｓｅ ＰＤ－Ｌ１細胞’を溶かして細胞回復（ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）培地に入れ、優しくかき混ぜた後、マルチチャネルピペット（ｍｕｌｔｉ－ｃｈａｎｎｅｌ ｐｉｐｅｔｔｅ）で白底アッセイプレート（ｗｈｉｔｅ ｂｏｔｔｏｍ ａｓｓａｙ ｐｌａｔｅ）に7約１００μｌずつ分注し、一晩培養をした。

４）アッセイ実験の当日に、上澄液を除去し、効能評価のための、順次に希釈した溶液試料、比較抗体及び候補抗体などの試料を、４０μｌ溶液体積で各ウェルに入れた後、Ｔｈａｗ－ａｎｄ－ｕｓｅ ＰＤ１エフェクター細胞（ＣＳ１８７１０５）を冷凍庫から取り出して３７℃水槽で溶かし、丁寧にアッセイバッファーに懸濁（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）させ、既に抗体試料の処理されているウェルに４０μｌずつ分注した。

５）６時間、３７℃ ＣＯ_２インキュベーターでＪｕｒｋａｔ細胞（ＰＤ－１エフェクター細胞）活性化－阻害反応を起こさせた後、ルシフェラーゼ基質が含まれている暖かく加熱したＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ溶液（ａｓｓａｙ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を８０μｌずつ各ウェルに入れ、ＶＩＣＴＯＲマルチラべルプレートリーダー（ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて発光値を測定した。

図５によれば、ＩｇＧ形態で精製された５８個のＰＤ－Ｌ１結合抗体に対して、Ｐｒｏｍｅｇａ社のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙを行った結果、対照抗体として使用したＰＤ－１ターゲット抗体（ＭＫ３４７５抗体）と、ＰＤ－Ｌ１ターゲット抗体（ＭＰＤＬ３２８０Ａ抗体）に比して類似のレベルの強いＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合阻害性能の候補クローンが発掘されていることを確認した。

候補抗体のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合阻害性能は、ＭＫ３４７５抗体の阻害性能を１００％と想定した時の相対的な値であり、＃５０クローンは９１％、ＫＬ００１クローンは８９％の阻害性能を有することを確認した。このうち、ＫＬ００１クローンは、ヒト－マウスＰＤ－Ｌ１抗原に対する交差反応性を示し、＃５０クローンは、ヒトＰＤ－Ｌ１にのみ結合する特性を示すことから、開発候補物質コード名をそれぞれ、ＫＬ００１、ＫＬ００２と名付けた。

実施例９．Ｉｎ ｖｉｖｏ ＭＣ３８／Ｃ５７ＢＬ／６同種マウスモデル研究
１）マウス大腸癌細胞（Ｍｕｒｉｎｅ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ）ＭＣ３８を、３７℃、５％ＣＯ_２条件で１０％ウシ胎児血清が添加された培地で培養し、約１週間培養して形態、生存率、倍加時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）、及びマイコプラズマ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）汚染の有無をチェックし、汚染していない正常状態の癌細胞が動物実験に使用されるように準備した。実験動物に注入時に、細胞生存率９５％以上の細胞を使用した。

２）ＭＣ３８細胞は、トリプシン－ＥＤＴＡを用いて収穫し、移植のために１×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で冷たい（ｃｏｌｄ）ＰＢＳに混濁して準備し、準備した細胞混濁液を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／５０μｌ移植用注射器で取り、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右後足の皮下に注入して移植した。その後、周期的に腫瘍の形成と成長を観察し、測定された腫瘍長を用い、次式によって腫瘍の体積を計算した。
［腫瘍体積＝（ａ^２ｂ）／２；ａ＝腫瘍の短い長さ、ｂ＝腫瘍の長い長さ］

３）腫瘍のサイズが８０ｍｍ^３±２０に到達した時、マウスを体積によって再分類し、対照群（ＰＢＳ処置群と比較抗体処置群）及び４種のＰＤ－Ｌ１ターゲット抗体処置群にグループ化し、抗体試料を腹腔注入法（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）で約２００μｇ／２００μｌの抗体を投与した。投入周期は、最初の投与後に３日間隔で３回（１日、４日、７日）投与した。

４）癌組織の成長は、抗体試料処置開始前には３日間隔で測定し、処置開始後からは２日に１回ずつ測定し、抗体試料処置開始日から試験終了（約２週）までの腫瘍体積により腫瘍成長曲線を作成し、抗体の効能評価検証資料として活用できるように準備した。万一、腫瘍体積が、動物実験倫理委員会（ＩＡＣＵＣ）規定の限界値に達すると安楽死させ、実験終了時に、マウスは安楽死させ、腫瘍を摘出して、腫瘍の重さを測定し、腫瘍形状を写真撮影した。

５）ｉｎ ｖｉｔｒｏ効能評価試験で高い阻害性能を示す抗体と中間程度の性能を示す抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌性能との相関関係の比較のために、４種の抗体、即ち、＃５０（＝ＫＬ００２）、ＫＬ００１（ＰＬ１１０）、＃８、＃６１と、対照抗体ＭＰＤＬ３２８０Ａを用いてｉｎ ｖｉｖｏ効能評価実験を行った。

図６によれば、マウス由来大腸癌細胞株ＭＣ３８とＣ５７ＢＬ／６同種マウスモデルを用いた候補抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌性能を分析した結果、ヒト－マウス交差反応性を有するＫＬ００１（ＰＬ１１０）抗体候補が、優れた抗癌効能を示していることが観察でき、ヒトＰＤ－Ｌ１にのみ結合する＃５０（＝ＫＬ００２）抗体では抗癌効能が一切観察されないことが確認できた。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ効能実験で高くない性能を示した＃８、＃６１クローンも、ｉｎ ｖｉｖｏ抗癌効能性能が比較的高くないことが確認できた。

実施例１０．ＫＬ００１抗体のｅｘ ｖｉｖｏ免疫調節能試験
１）人体内免疫細胞間に免疫活性条件で誘導されるＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合による免疫活性制限現象が、ＰＤ－Ｌ１標的候補抗体の結合によって免疫活性が強化され得るかを確認することによって、血液内の免疫細胞間の相互作用に対する候補抗体のｅｘ ｖｉｖｏ効能を検証するために、ヒト血液から末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離して、スーパー抗原（ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ）、ＳＥＡ又はＳＥＢで刺激されたＰＢＭＣに免疫抗癌抗体を処理することによって、免疫細胞間の活性変化を測定する実験を行った。

２）大韓赤十字社血液管理本部生命倫理審議委員会（ＩＲＢ）の承認後、カンウォン血液院から赤血球濃縮液（ｃＲＢＣ）を購入し、ＰＢＳと１：１希釈してこれをＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ上に載せて遠心分離すると、細胞の比重によって赤血球（ＲＢＣ）、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）及び血漿（ｐｌａｓｍａ）などが分離されるが、このＰＢＭＣ部分を抽出して実験に使用した。

３）分離された末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μｌで９６ウェル（ｕ底）に分注した後、ＳＥＢ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ、ｓｕｐｅｒ－ａｎｔｉｇｅｎ、Ｔｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）０．００３μｇ／１００μｌをそれぞれのウェルに処理し、ここに実験群及び対照群抗体をそれぞれ１０μｇ／ｍｌで処理して免疫細胞活性化条件にさせた。その後、９６時間後に、細胞培養液内に免疫細胞活性化によって生成されたＩＬ－２量を、ＩＬ－２ＥＬＩＳＡキットを用いて定量することにより、候補抗体のヒト免疫細胞に対する免疫調節活性能力を検証した。

図７及び図８によれば、ＳＥＢアッセイを用いた免疫細胞活性試験では、ＳＥＢ処理時に、ＡＰＣとＴ細胞間に無作為の交差結合（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）が起き、免疫細胞活性が増加してＩＬ－２分泌が増えることが確認でき、また、既存に選別された候補抗体（ＫＬ００１）の免疫細胞活性能力が確認でき（図面は５回実験平均値）、また、候補抗体の親和性成熟以降に選ばれたＫＬ００１－１３候補抗体に対しても、類似の程度の免疫細胞活性調節能力が確認できた。

実施例１１．親和性成熟（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）実験
１）ＫＬ００１抗体の基本骨格において重鎖ＣＤＲ２、３領域と、軽鎖ＣＤＲ１、３領域に集中して突然変異化を導入し、変異誘発ライブラリー（ｆｏｃｕｓｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｌｉｂｒａｒｙ）を構築した。

２）ＫＬ００１クローンのＶＨ部位とＶＬ部位に変異（Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が導入された切片を、拡張ＰＣＲ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ）を用いてライブラリー構築のためのインサート（ｉｎｓｅｒｔ）で増幅した後、ＫＬ００１切片をファージディスプレイベクター、‘ｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ’にクローニングするための制限酵素で処理した後、同一制限酵素で処理されたベクターにライゲーション（Ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応を行った。

３）ライゲーションされたｐＣｏｍｂ３Ｘファージディスプレイベクターとインサートを、ＥＲ２７３８細胞で作製した電気穿孔コンピテント細胞（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）に変形（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）して、ＫＬ００１抗体ディスプレイミュータントライブラリーを構築した。

４）ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを用いて、ＫＬ００１変異抗体のディスプレイされたファージを製造した後、ＰＥＧとＮａＣｌを用いた沈殿法で精製した。

５）ビオチン化（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）したＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ抗原を用いて３～４回のパンニング過程を行い、３～４次パンニングから得られたコロニー、親和度改善抗体の選別のためのＥＬＩＳＡ反応に用いた。

６）ＩＰＴＧを用いてペリプラズムに選別抗体切片を発現させた後、スクロースを用いてペリプラズム切片を得、ＰＤ－Ｌ１抗原がコートされたプレートを用いたＥＬＩＳＡ方法により、結合力増加が予想される抗体候補を選別した。

７）競合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）ＥＬＩＳＡ方法を用いて結合力増加候補抗体の選別を完了した。

図９によれば、ＫＬ００１抗体の重鎖ＣＤＲ２、３領域と軽鎖ＣＤＲ１、３領域に部位特異的な（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異化を導入した変異誘発（ｆｏｃｕｓｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）ＤＮＡ切片を重複（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲで連結してＦａｂ形態の抗体骨格として作製した後、ファージディスプレイベクター、‘ｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ’のＳｆｉＩ制限酵素位置にライゲーションによって挿入し、ファージディスプレイのための大腸菌ＥＲ２７３８細胞に電気穿孔方法で形質転換することにより、‘１．３Ｘ１０９’サイズのＫＬ００１抗体ディスプレイミュータントライブラリーを構築した。ビオチン化したＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ抗原を用いて、強い結合力を有する抗体クローンを強化（ｅｎｒｉｃｈ）するために、抗原の量を減らしていく厳格な（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）実験条件を適用した３～４回のパンニング過程を行った。このとき、パンニングにより、強いバインダーが効果的に増加することを、パンニングのインプット対アウトガスの測定結果から確認した。

図１０によれば、３次及び４次のパンニング結果から得られた約１６００個（ｓｅｔ１～ｓｅｔ１６）の個別コロニーからペリプラズム切片を得、親和度改善抗体の選別のためのＥＬＩＳＡ反応を行い、陽性信号（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｉｇｎａｌ）を示す候補クローンを１次選別した（約１３０個クローン）。

抗原結合力改善の有無の確認（Ｋｏｆｆ値改善の有無）のために、競合（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）ＥＬＩＳＡを行い、さらに、ＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質が含まれた溶液で４時間程度さらに培養をした後、結合を維持している抗体クローンを確認することにより、ＫＬ００１に比べて、プレートにコートされているＰＤ－Ｌ１で強く結合している約２７種の抗体候補を確認した（比較群であるオリジナル抗体ＫＬ００１では、ＥＬＩＳＡ値が‘０．２７８’を示し、親和度改善抗体は、これよりも高い値を示すクローンとして確認される。）。

表６によれば、結合力増加が予想される抗体をいずれも、塩基配列分析を実施し、それぞれ異なる突然変異が導入された抗体のアミノ酸配列を確認した。

親和度改善抗体のＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質と抗体切片の結合によるＰＤ－Ｌ１抗原とＰＤ－１タンパク質との相互作用への干渉効果を測定するために、実施例５で言及されたＢＬＩベースオクテット（Ｏｃｔｅｔ）機器を用いて、ＰＤ－１タンパク質がコートされたバイオセンサーを、ＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質とＰＤ－Ｌ１結合抗体（又は比較抗体）とが混合されているウェルに浸し、溶液中のＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質の結合によるバイオセンサー表面の質量変化を測定した。

表７の実験結果は、オクテット機器専用のデータ分析ソフトウェア（ｄａｔａ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて分析した親和度改善抗体の結合力を示している。

実施例１２．ビアコアアッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ ａｓｓａｙ）
１）候補抗体のＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質に対する結合力を測定するために、ＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）原理に基づくビアコアＴ２００（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）機器を用いて結合強度を測定した。

２）抗体捕獲（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃａｐｔｕｒｅ）方法を用いた抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合親和力分析では、メーカー提供の実験法ガイドにしたがって、ヒト抗体捕獲キット（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ）を用いて、ＣＭ５チップの表面にまず抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を固定し、候補抗体ＫＬ００１－８、ＫＬ００１－１３をＰＢＳ－Ｐランニングバッファーに希釈して１０μｌ／ｍｉｎ流速で３０秒間注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、３００～３３０ＲＵレベルで捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）した後、ヒトＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質（ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）をそれぞれ５ｎＭから２倍ずつ希釈し、３０μｌ／ｍｉｎ流速で結合／解離（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）反応を観察した（反応時間はそれぞれ、４分／７分に設定）。マウスＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質に対する結合力測定の場合、１０ｎＭから２倍ずつ希釈して３０μｌ／ｍｉｎ流速で結合／解離時間をそれぞれ４分／３分として結合力を測定した。

３）全サイクルごとに結合している抗体を除去するために、再生液（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（３Ｍ ＭｇＣｌ_２）を３０μｌ／ｍｉｎ流速で３０秒間注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、実験データは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．０の１：１結合モデル（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）を用いて算出した。

４）抗原捕獲（Ａｎｔｉｇｅｎ ｃａｐｔｕｒｅ）方法を用いた抗ＰＤ－Ｌ１抗体の結合親和力分析実験では、Ｈｉｓ捕獲キット（Ｈｉｓ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ）を用いて、メーカーの指示（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ’ｓ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）にしたがって、ＣＭ５チップ表面にＡｎｔｉ－Ｈｉｓ抗体を固定し、ＰＤ－Ｌ１抗原タンパク質を捕獲させた後、候補抗体を２．５ｎＭから２倍ずつ希釈し、３０μｌ／ｍｉｎ流速で結合／解離（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ／ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）時間をそれぞれ４分／７分として結合力を測定した。

図１１によれば、フローセル（Ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ）３番、４番に抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）した。ヒト抗体捕獲キットの指示（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）にしたがって固定化を行い、各フローセルに約１１，０００～１３，０００ＲＵの範囲内に固定化されることを確認したし、ランニングバッファー（ＰＢＳ－Ｐ）を用いて抗体ＫＬ００１－８、ＫＬ００１－１３を捕獲し、ＰＤ－Ｌ１を濃度別に希釈して注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）してキネティクス（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を測定した結果、ＫＬ００１－８抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１に対してＫＤ＝６．７１４×１０^－１１Ｍ、マウスＰＤ－Ｌ１に対して６．４０１×１０^－９Ｍ、ＫＬ００１－１３抗体は、ヒトＰＤ－Ｌ１に対してＫＤ＝６．３２０×１０^－１１Ｍ、マウスＰＤ－Ｌ１に対して２．７９７×１０^－９Ｍ程度の結合力を示すことを確認した。

実施例１３．Ｉｎ ｖｉｖｏ同種（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）マウスモデルを用いた単独処置抗癌効能試験
Ｉｎ ｖｉｖｏ同種マウスモデルを用いて抗体候補の抗癌効能を確認した。

図１２によれば、ＭＣ３８皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）同種マウスモデルにおいて２種の性能最適化抗体及びＭＰＤＬ３２８０Ａ抗体をｉ．ｐ．投与して腫瘍成長抑制効能を評価した結果、ＰＢＳを投与した対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、ＭＰＤＬ３２８０Ａ群は９４．３％、ＫＬ００１（ＰＬ１１０）群は９７．５％、結合親和度改善抗体ＫＬ００１－１３群は９８．９％と示され、薬物による体重変化は観察されなかった。

実施例１４．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ効能検証のためのＩＣ５０測定試験
１）親和度改善及び物性改善の研究から導出された候補抗体の、比較抗体に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ性能改善効果を確認するために、Ｐｒｏｍｅｇａ社から提供する‘ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｂｉｏａｓｓａｙ’キットを用いて、順次に希釈された候補抗体及び比較抗体試料のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１結合阻害能を測定することにより、阻害効果に対するＩＣ５０値を検証した。

２）実験はＰｒｏｍｅｇａ社キットから提供するプロトコルに従って進行し、要約すれば次の通りである。

３）アッセイ実験の前日に３７℃水槽で‘Ｔｈａｗ－ａｎｄ－Ｕｓｅ ＰＤ－Ｌ１細胞’を溶かし、細胞回復培地に入れて優しくかき混ぜた後、マルチチャネルピペットで白底アッセイプレートに約１００μｌずつ分注し、一晩培養を行った。

４）アッセイ実験の当日に、上澄液を除去し、効能評価のための順次に希釈した溶液試料、比較抗体及び候補抗体などの試料を４０μｌ溶液体積で各ウェルに入れた後、Ｔｈａｗ－ａｎｄ－ｕｓｅ ＰＤ１エフェクター細胞（ＣＳ１８７１０５）を冷凍庫から取り出して３７℃水槽で溶かし、丁寧にアッセイバッファーに懸濁させ、既に抗体試料が処理されているウェルに４０μｌずつ分注した。

５）６時間、３７℃ ＣＯ_２インキュベーターでＪｕｒｋａｔ細胞活性化－阻害反応を起こさせた後、ルシフェラーゼ基質含有の暖かく加熱したＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ溶液を８０μｌずつ各ウェルに入れ、ＶＩＣＴＯＲマルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて発光値を測定した。

図１３によれば、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースアッセイ（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）を用いた選別抗体のＩＣ５０値の測定を行い、選別された抗体の性能レベルを確認した結果、大部分の親和度改善抗体候補が、比較抗体であるＭＰＤＬ３２８０Ａに比べて、より低い濃度でＩＣ５０値を有する改善された免疫活性調節性能を有することを確認した。

実施例１５．Ｉｎ ｖｉｖｏ併用処置抗癌効果検証実験
１）ＰＤ－Ｌ１免疫抗癌抗体候補と他の抗癌剤との併用処置時に、抗癌性能評価動物モデルからシナジー効果が観察されるかを検証するために、代表的な免疫活性化タンパク質である組換えＩＬ－２とＣＴＬＡ－４抗体（９Ｄ９クローン、ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）及びＰＤ－Ｌ１ターゲット候補抗体（ＫＬ００１－１３）の併用治療効能効果の検証研究を行った。

２）ＫＬ００１－１３抗体の併用治療法開発のために、ＭＣ３８マウス大腸癌細胞株と６週齢のＣ５７ＢＬ／６雄（♂）マウスモデルを用いて、グループは、ＰＢＳ、ＩＬ－２、ＣＴＬＡ－４、ＫＬ００１－１３の単独投与４グループと、ＩＬ－２＋ＫＬ００１－１３、ＣＴＬＡ－４＋ＫＬ００１－１３、ＩＬ－２＋ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＣＴＬＡ－４＋ＭＰＤＬ３２８０Ａの併用投与４グループの、合計８個のグループに分け、各グループ当たりに８匹（ｎ＝８）のマウスを用いた併用処置実験を行った。

３）マウス大腸癌ＭＣ３８細胞株は、７０～９０％の細胞密度（ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を保ちつつ培養後に、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡを処理して収穫し、１×１０^６ｃｅｌｌｓ／１００μｌの細胞濃度でＤＭＥＭ培地（無血清）に再懸濁して細胞生存能力（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）≧９５％のＭＣ３８細胞試料を準備した後、２．５％アバチンで麻酔したＣ５７ＢＬ／６マウス胴体の左側に、準備した１×１０^６ｃｅｌｌｓ／１００μｌを皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）して実験動物マウス内で約７～１０日間成長させ、注射したＭＣ３８細胞株の腫瘍サイズが１００ｍｍ^３のサイズになるまで維持した。このとき、腫瘍のサイズは下記のように計算した。
［腫瘍体積＝（ａ^２ｂ）／２；ａ＝腫瘍の短い長さ、ｂ＝腫瘍の長い長さ］

４）腫瘍のサイズが１００ｍｍ^３になると、準備したＰＢＳ、候補抗体、比較抗体及びサイトカインＩＬ－２を、単独及び併用で腹腔（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ）に投与（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、このとき、ＫＬ００１－１３、ＭＰＤＬ３２８０Ａ及びＣＴＬＡ－４抗体は、１０ｍｇ／ｋｇ（２００μｇ／１００μｌ）濃度で３日間隔、総４回単独及び併用投与し、ＩＬ－２サイトカインは、１×１０^４ＩＵ／１００μｌで２日間隔で、総５回単独及び併用投与した。腫瘍サイズ（ｍｍ^３）は、週に３回測定しながら腫瘍の成長推移を観察した。ＩＬ－２とＫＬ００１－１３抗体の併用効能検証試験では、ＩＬ－２の動物体内の短い半減期のため、動物実験時に毎日投与するのが一般であるが、本実験では２日ごとに少量投与することにより、免疫活性刺激剤としてのＩＬ－２の機能がＰＤ－Ｌ１標的抗体と併用シナジー効果があるか確認することを目標にした。

図１４によれば、ＩＬ－２とＫＬ００１－１３抗体の併用投与時に、ＩＬ－２とＫＬ００１－１３抗体の単独投与時に比べて明確に抗癌効能が増加することが観察でき、比較群として使用したＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社のＭＰＤＬ３２８０Ａ抗体とＩＬ－２の併用効果に比べてもより優れた抗癌効果を示すことが観察できた。

図１５によれば、免疫検問タンパク質ＣＴＬＡ－４ターゲット抗体（９Ｄ９クローン、ＢｉｏＸｃｅｌｌ社）とＫＬ００１－１３抗体の単独又は併用投与効能検証研究の結果からは、ＣＴＬＡ－４抗体単独投与群に比べてＰＤ－Ｌ１単独投与群において良好な抗癌効果が観察され、これら２抗体の併用投与時には、癌細胞が完全に細胞死する場合も多数観察される程度に優れたシナジー効果が観察され、特に、比較抗体として使用したＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社の‘ＭＰＤＬ３２８０Ａ’抗体とＣＴＬＡ－４抗体との併用効能よりもＫＬ００１－１３抗体の併用効果が優れることが観察できた。

本発明に係るＰＤ－Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、ヒト－マウス、ヒト－サル及びヒト－イヌに対する交差反応性を示し、ＰＤ－Ｌ１に非常に高い親和力で結合しながらも、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１複合体の形成を阻害することを確認した。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースアッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏ効能実験及び併用実験において優れた効果を示すことを確認した。したがって、本発明に係るＰＤ－Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は、目的とする癌の予防又は治療に有用であり、他の抗癌剤との併用処置時にシナジー効果を出すことができる。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的記述は単に好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が制限されない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とそれらの等価物によって定義されるといえよう。

Claims (12)

1. 配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
   配列番号１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１１の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号７の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域、
   を含む、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片。
2. 配列番号４又は配列番号１２の配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
3. 配列番号８又は配列番号１４の配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
4. マウス又はヒト以外の哺乳類に交差結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
6. 請求項５に記載の核酸を含む発現ベクター。
7. 請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
8. 次の段階を含むＰＤ－Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法：
   （ａ）請求項７に記載の細胞を培養する段階；及び
   （ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。
9. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を有効成分として含む癌の予防又は治療用組成物。
10. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を他の抗癌剤と共に投与して癌を予防又は治療するための併用投与用組成物。
11. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片に薬物が接合された抗体－薬物コンジュゲート（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）。
12. 請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片と他の抗原に結合する抗体とが結合した二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）。

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