KR20200120541A - 프로그램화된 세포 사멸 단백질 리간드-1 (pd-l1)에 대한 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PD-L1(Programmed death-ligand 1)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 병용 투여용 조성물에 관한 것이다.

Description

프로그램화된 세포 사멸 단백질 리간드-1 (PD-L1)에 대한 항체 및 이의 용도 {Antibodies Against Programmed death-ligand 1 and Uses Thereof}
본 발명은 PD-L1(Programmed death-ligand 1)에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법, 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 병용 투여용 조성물에 관한 것이다.
PD-L1은 세포외 부위에 2개의 Ig-유사 도메인, 막관통 도메인 및 짧은 세포질 도메인을 갖는, 1형 막관통 단백질이다. 세포질 도메인은 공지된 신호 전달 모티프 (signal transduction motif)를 가지고 있지 않아 PD-L1이 이의 수용체와의 상호 작용에 대한 신호 전달 (signaling)이 없다는 것을 알려준다. 이의 분자량은 40 kDa (290개 아미노산)이고, 각각 마우스 염색체 19 및 인간 염색체 9 상의 CD274 유전자에 의해 인코딩된다 (encoded). PD-L1은 B7 단백질 패밀리의 구성원이며, B7.1 및 B7.2와 약 20%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 인간 PD-L1은 각각 뮤린 및 시노몰구스 오르소로그 (cynomolgus ortholog)의 PD-L1과 70 % 및 93 % 아미노산 동일성을 공유한다.
PD-L1은 770 nM의 친화도 (KD)으로 이의 수용체 PD-1에 결합한다. PD-1은 활성화된 T 세포, B 세포 및 골수 세포 상에 발현되며, 세포 면역 반응의 활성화 또는 억제를 조절한다. 세포에 의한 PD-L1 발현은 세포독성 T 림프구 (CTL) 사멸에 대한 보호를 매개할 수 있으며, 이는 바이러스 감염 동안 만성 면역 반응을 둔화시키는 조절 메커니즘이다. 만성 및 전-염증성 질환 (pro-inflammatory disease)과 같은 암은, PD-L1 발현의 상향-조절을 통해 이러한 면역-보호 경로를 전복시켜 숙주 면역 반응을 회피한다. 활성 면역 반응의 맥락에서, IFNγ은 또한 PD-L1의 발현을 상향조절한다.
PD-L1은 또한 또 다른 단백질인 B7.1 (CD80으로도 알려짐)과의 상호작용을 통해 면역 억제를 매개하여, CD28을 통한 T 세포에 대한 활성화의 2차 신호 중 하나를 전달하는 이의 능력을 차단한다. 종양 세포 상의 PD-L1 발현 및 B7.1과의 결합 (engagement) 측면에서, 종양 면역 내성 (immune resistance)에서 이러한 특이적인 상호작용에 관한 관련성은 여전히 불명확하다.
우리 몸의 면역기능은 항원인지와 동시에 동시자극 신호 및 동시억제신호의 조절을 통하여 전체적인 T 림프구 기능을 조절한다. 이러한 조절 기전을 면역검문(immune checkpoint)라고 한다. 우리 몸의 면역기능은 종양세포에서 일어나는 돌연변이 등의 변화로 인해 발현되는 종양 특이 항원(tumor-specific neo-antigen)을 감지하고 이를 통하여 종양세포 또는 바이러스 감염원 등을 제거한다.
다만, 일부 종양세포는 반대로 이러한 면역공격을 회피하기 위하여 종양미세환경(tumor micro-environment)을 변화시켜 면역기능을 억제하거나 T세포 면역관용(immune tolerance) 또는 면역편집(immuno-editing) 등을 통하여 면역 회피(immune escape)를 한다.
이러한 회피 전략의 하나로서 면역검문(immune checkpoint) 기능의 변화를 통하여 종양 특이 T 림프구 세포의 기능을 억제한다. 즉, 종양세포에서 이러한 억제 면역검문을 활성화시킴으로써 종양 특이 T-림프구 세포의 공격을 회피한다. 이와 관련하여, PD-1 또는 리간드 PD-L1에 대한 단클론항체를 이용하여 그 기능을 억제함으로써 억제된 종양 특이 T-림프구 세포 활성 및 효과를 증강시킴으로써 항종양 효과를 얻을 수 있다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하기 위하여 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 PD-L1에 높은 친화력으로 결합하는 항-PD-L1 항체를 개발하고, 이러한 항-PD-L1 항체가 PD-1/PD-L1 복합체의 형성을 저해함으로써, 목적하는 면역항암제의 역할을 할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 PD-L1에 대한 신규 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 세포 및 이의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 또는 감염 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 다른 항암제와 투여하여 암을 예방 또는 치료하기 위한 병용 투여용 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 3 또는 서열번호 11의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호 5 또는 서열번호 13의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 6의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 서열번호 7의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는, PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 다른 항암제와 투여하여 암을 예방 또는 치료하기 위한 병용 투여용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 인간-마우스, 인간-원숭이 및 인간-개에 대한 교차반응성을 나타내고, PD-L1에 매우 높은 친화력으로 결합하면서도, PD-1/PD-L1 복합체의 형성을 저해함을 확인하였다. 또한, in vitro 세포 기반 어세이, in vivo 효능 실험 및 병용 실험에서 우수한 효과를 나타냄을 확인하였으며, 이를 통해 본 발명에 따른 PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 목적하는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 다른 항암제와의 병용 처치시 시너지 효과를 낼 수 있다.
도 1은 PD-L1 항원 단백질에 대한 파아지디스플레이 실험결과 얻어진 개별 항체클론들(약 1400개)의 결합여부를 검증하는 ELISA 반응을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 PD-L1 결합 항체클론들의 세포표면 항원단백질 결합특성 분석을 위해, 인위적으로 인간 PD-L1 유전자를 표면에 발현시킨 293T 세포에 대한 대표적 항체클론들의 FACS 실험을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 대표적 9개 항체클론들에 대한 PD-1/PD-L1 결합저해능 확인을 위한 SPR 기반 성능평가 시험법으로, PD-L1 항원 단백질만 포함된 용액조건 (Blue line) 대비 항체샘플이 함께 포함될 때의 SPR Sensorgram의 변화 검증 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 mIFN-γ 처리된 마우스 대장암세포주 MC38을 이용한 IgG 형태 PD-L1 타겟 항체후보들의 마우스 PD-L1 단백질에 대한 결합특성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 후보항체들의 in vitro 세포기반 성능검증 시험에서 PD-1/PD-L1 단백질간 결합저해 성능을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 마우스 유래 대장암 세포주 MC38과 C57BL/6 syngeneic 마우스 모델을 이용한 후보항체들의 in vivo 항암성능을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 선별된 후보항체(KL001)의 면역세포 활성증가 능력을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 후보항체의 affinity maturation 이후 선정된 KL001-13 후보항체에 대한 면역세포 활성증가 능력을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 후보항체의 성능개선 최적화 실험의 Panning 차수에 따른 output의 증가 패턴을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 친화도 개선 항체 선별을 위한 ELISA 반응을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 선별 항체에 대하여 인간 PD-L1 및 마우스 PD-L1에 대한 결합력 값을 Biacore 장비를 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 MC38 subcutaneous syngeneic mouse 모델에서 성능 최적화 항체 'KL001-13'과 최적화이전 항체 'KL001' 및 MPDL3280A 비교항체를 i.p. 투여하였을때 종양 성장 억제 효능을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 In vitro cell-based assay를 이용한 선별 항체의 IC50값 측정을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 IL-2와 KL001-13 항체 또는 MPDL3280A 비교항체의 병용처치에 대한 in vivo 항암 효과를 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 CTLA-4항체(9D9)와 KL001-13 항체 또는 MPDL3280A 비교항체의 병용처치에 대한 in vivo 항암 효과를 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명에 따른 항체의 CDR에 대하여 IMGT numbering 방식 외에 다른 numbering 방식에 따를 경우 가지는 서열을 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명에 따른 항체의 인간, 마우스, 원숭이 및 개에 대한 교차반응성을 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 3 또는 서열번호 11의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호 5 또는 서열번호 13의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 6의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 서열번호 7의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는, PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다.
본 명세서의 "PD-L1"은 활성화된 T 및 B 세포 상에서 주로 발현하는 면역억제 수용체 "프로그램된 사멸 수용체 1(PD-1)"에 대한 리간드로, PD-1과 리간드인 PD-L1 및/또는 PD-L2이 결합하는 경우 항원 수용체 시그날링을 부정적으로 조절할 수 있다. PD-1에 대한 리간드(PD-L1 및 PD-L2)는 구성적으로 발현되거나, 또는 비-조혈세포 조직 및 다양한 종양형을 포함하는 다수의 세포형에서 유도될 수 있다. PD-L1은 B 세포, T 세포, 골수세포 및 수지상 세포(DCs) 상에서 발현되지만, 또한 말초 세포, 유사 미세혈관 내피세포 및 심장, 폐 등과 같은 비-림프 기관 상에서도 발현된다. 대조적으로, PD-L2는 단지 대식세포 및 수지상 세포 상에서만 발견된다. PD-1 리간드의 발현 패턴은, 말초 내성을 유지하는데 있어 PD-1의 역할을 제시하고, 말초에서 자가-반응성 T-세포 및 B-세포 반응을 조절하는데 기여할 수 있다. PD-L1, PD-L2는 세포외 영역에서 IgV- 및 IgC-유사 도메인 둘 다를 포함하는 제1형 이동막 수용체이다. 리간드 둘다는 공지되지 않은 시그날링 모티프를 가진 짧은 세포질 영역을 포함한다.
다수의 연구는 PD-1과 이의 리간드의 상호작용이 시험관내 및 생체내에서 림프구 증식을 억제함을 밝혔다. PD-1/PD-L1 상호작용의 차단은 T 세포 증식 및 사이토카인 생산을 증가시키고, 세포 주기의 진행을 차단하는 것으로 알려졌다. PD-1/PD-L1 상호작용의 차단은 증강된 종양-특이적 T-세포 면역을 유도할 수 있으므로, 면역 시스템에 의해 종양 세포를 청소하는데 도움이 될 수 있다. 또한, 만성 HIV 감염시, HIV-특이적 CD8+ T 세포는 기능적으로 손상되고, 사이토카인 및 이펙터 분자를 생산하는 능력의 감소 및 증식하는 능력의 감소를 나타내고, PD-1는 HIV 감염된 개체의 HIV 특이적 CD8+ T 세포에 고발현되는데, PD-1/PD-L1 상호작용의 차단을 통해 HIV 펩티드 자극에 반응하여 HIV 특이적 T 세포가 증식하고 사이토카인을 생산하는 능력을 향상시킴으로써, T 세포 활성 또는 항 바이러스 면역 반응을 증대시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항-PD-L1 항체를 의미한다. 본 발명의 범위에는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태 뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각이다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 Fv 형태(예컨대, scFv)이거나, 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 또는 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.
"에피토프"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위 (determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는다는 점에서 구별된다.
"인간화" 형태의 비-인간 항체는 비-인간 (예: 뮤린) 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.
"인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.
중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
본 발명은 서열번호 1의 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, 서열번호 3 또는 서열번호 11의 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, 서열번호 5 또는 서열번호 13의 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, 서열번호 6의 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 서열번호 7의 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는, PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함한다 (본 특허에서 사용한 CDR numbering scheme은 'IMGT numbering'에 따름). 본 발명에 있어, 상기 PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 11의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어, 상기 PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 5의 경쇄 CDR1, 서열번호 6의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 7의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 6의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 7의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
[표 1: 본 발명에 따른 항체의 CDR 서열]
Figure pat00001
구체적으로, 본 발명에 있어, 상기 PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 5의 경쇄 CDR1, 서열번호 6의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 7의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역; 또는
서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 11의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 6의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 7의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.
PD-L1 항체는 1가 또는 2가이고, 단쇄 또는 이중 쇄를 포함한다. 기능적으로, PD-L1 항체의 결합 친화성은 10-5 M 내지 10-12 M 범위 내에 있다. 예를 들어, PD-L1 항체의 결합 친화성은 10-6 M 내지 10-12 M, 10-7 M 내지 10-12 M, 10-8 M 내지 10-12 M, 10-9 M 내지 10-12 M, 10-10 M 내지 10-12 M, 10-11 M 내지 10-12 M, 10-5 M 내지 10-11 M, 10-6 M 내지 10-11 M, 10-7 M 내지 10-11 M, 10-8 M 내지 10-11 M, 10-9 M 내지 10-11 M, 10-10 M 내지 10-11 M, 10-5 M 내지 10-10 M, 10-6 M 내지 10-10 M, 10-7 M 내지 10-10 M, 10-8 M 내지 10-10 M, 10-9 M 내지 10-10 M, 10-5 M 내지 10-9 M, 10-6 M 내지 10-9 M, 10-7 M 내지 10-9 M, 10-8 M 내지 10-9 M, 10-5 M 내지 10-8 M, 10-6 M 내지 10-8 M, 10-7 M 내지 10-8 M, 10-5 M 내지 10-7 M, 10-6 M 내지 10-7 M 또는 10-5 M 내지 10-6 M이다.
상기 PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 4 또는 서열번호 12의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 상기 PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 4 또는 서열번호 12의 중쇄 가변영역을 포함할 수 있다. 또한, 상기 PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편은 서열번호 8 또는 서열번호 14의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 구체적 실시예에서, 서열번호 4의 중쇄 가변영역 및 서열번호 8의 경쇄 가변영역; 또는 서열번호 12의 중쇄 가변영역 및 서열번호 14의 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다.
한편, CDR 서열(영역)에 대한 정의는 그 numbering 방식에 따라 동일한 가변영역을 가지는 항체에 대해서도 다소 달라질 수 있다.
구체적으로 표 2에 기재된 바와 같이, 동일한 가변영역에서도 numbering 방식에 따라 CDR 서열은 다르게 정의될 수 있다.
[표 2: Numbering 방식에 따른 CDR 서열(영역)]
Figure pat00002
이에 따라 본 발명에 따른 항체의 CDR 서열은 IMGT numbering 방식 외에 다른 numbering 방식에 따를 경우 표 3에 기재된 서열을 가진다(도 16 참조).
[표 3: Numbering 방식에 따른 본 발명에 따른 항체의 CDR 서열(영역)]
Figure pat00003
하나의 실시예에서, 본 발명에 따른 항체는 인간과 마우스, 인간과 인간 이외의 포유류에 교차반응성을 나타낸다. 구체적으로, 상기 인간 이외의 포유류는 원숭이 또는 개일 수 있다 (도 17). "파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
파지 디스플레이 기술은 특정 리간드 (예: 항원)와 결합하는 신규 단백질을 생성 및 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시키고, 표적 항원과 고 친화성으로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 바이러스성 외피 단백질, 예를 들어 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 유전자 III 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파지 디스플레이 시스템이 개발되었다. 1가 파지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합물이 저 수준으로 발현되고 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어 입자 감염성이 유지된다.
섬유상 파지 표면 상에서의 펩티드의 발현과 E. coli의 주변세포질에서의 기능성 항체 단편의 발현을 입증하는 것이 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 개발하는 데에 있어 중요하다. 항체 또는 항원 결합성 폴리펩티드의 라이브러리는 수 많은 방식, 예를 들어 무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 계열을 클로닝하는 방법으로 제조하였다. 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 특징을 수반한 항체 또는 항원 결합성 단백질의 발현에 관하여 스크리닝할 수 있다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇 가지 이점을 지니고 있다. 이러한 기술은 동물을 사용하지 않고서도 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있도록 한다. 하이브리도마의 제조나 인간화 항체의 제조는 수 개월의 제조기간을 필요로 할 수 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이 있거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 면역시킨, 비-면역시킨 인간, 생식세포계 서열, 또는 미감작 B 세포 Ig 레퍼토리 (repertoire)로부터 인간 항체를 생성시키는 기술을 사용할 수 있다. 각종 림프계 조직을 사용하여, 미감작 또는 비면역 항원 결합성 라이브러리를 제조할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세균성 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이시킴으로써 개선시킬 수 있다. 골격 영역의 서열은 세균성 세포에서 항체 파지 라이브러리를 생성시키는 경우에 적절한 폴딩을 제공하기 위한 하나의 요소이다.
고 친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 PD-L1을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-PD-L1 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 명시된 서열 또는 전체와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
"핵산"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.
상기 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유 전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.
다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHO-S, CHOK1, GS-CHO, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.
상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 PD-L1에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 환자에게 필요한 유효량으로 본 발명에 따른 PD-L1에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
상기 조성물은 상술한 본 발명의 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 기재를 생략한다.
PD-1에 PD-L1의 결합은 자가면역 및 면역병리의 관용 및 예방에 중요한 T 세포 항원 특이적 반응을 음성적으로 조절한다. 그러나, 만성 항원 자극에 의해 유발될 수 있는 과도한 PD-L1/PD-1 상호작용은 T 세포 고갈의 (exhaustion) 특징이 되는, T 세포 항원 특이적 반응의 억제 및 T 세포의 소실을 가져올 수 있다. T 세포 고갈은 만성 감염 및 암에서 일어날 수 있는 T 세포 기능 장애의 상태이다. 이는 불량한 이펙터 기능, 억제성 수용체의 지속적 발현, 및 기능적 이펙터 또는 기억 T 세포와는 다른 전사 상태로서 정의된다. 고갈은 감염 및 종양 진행의 관리를 방해한다.
하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 PD-L1에 높은 친화도로 결합하여 PD-1과 PD-L1 복합체 형성을 저해함으로써, 항-종양 T 세포 활성을 회피하는 T 세포 고갈을 유도하는 암을 치료하는 데에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 다른 항암제와 투여하여 암을 예방 또는 치료하기 위한 병용 투여용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 PD-L1에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암을 예방 또는 치료하기 위한 병용 투여용 조성물일 수 있다. 본 발명은 또한, 환자에게 필요한 유효량으로 본 발명에 따른 PD-L1에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여방법에 관한 것이다.
상기 조성물은 상술한 본 발명의 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 기재를 생략한다.
상기와 같이 본 발명에 따른 항체 이외에 다른 항암 치료제를 병용함으로써 PD-L1을 과발현하는 종양 세포를 효과적으로 표적화하고, 항-종양 T 세포 활성을 증가시켜, 종양 세포를 표적화하는 면역 반응을 증대시킬 수 있다.
기타 항-신생물제 또는 면역원성 제제[(예를 들면, 약화된 암 세포, 종양 항원(재조합 단백질, 펩타이드 및 탄수화물 분자를 포함함), 항원 전달 세포, 예를 들면, 종양 기원된 항원 또는 핵산으로 펄스된 가지세포, 면역 자극 사이토카인(예를 들면, IL-2, IFNα2, GM-CSF), 및 면역 자극 사이토카인을 암호화하는 유전자로 형질감염된 세포(예를 들면, GM-CSF를 포함하지만 이에 제한되지 않는다)]; 암 항원을 타겟으로 하는 항체를 포함하는 세포 (예를 들면, CAR-T, CAR-NK), 종양미세환경의 면역억제저해제 (예를 들면, IDO inhibitor), oncolytic virus, 표준 암 치료요법(예를 들면, 화학 치료요법, 방사선치료요법 또는 수술); 또는 기타 암 관련 항원들이 사용될 수 있다.
또한 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다른 항체(상기 PD-L1 항체 이외의 항체, 예를 들면 VEGF, EGFR, Her2/neu, VEGF 수용체, 기타 성장 인자 수용체, CD20, CD40, CTLA-4, OX-40, 4-IBB, 및 ICOS 등에 대한 항체가 예시될 수 있지만 이에 제한되지 않는다)와 함께 사용될 수 있다.
구체적으로 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 함께 사용될 수 있는 항체는 암 또는 자가면역질환 관련 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체라면 제한 없이 사용가능하며, 그러한 항원으로는 4-1BB, 인테그린, 안지오포에틴, 안지오포에틴 유사물질3, B세포 활성인자 (B-cell activating factor, BAFF), B7-H3, CCR4, CD3, CD4, CD6, CD11a, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD40, CD52, CD62, CD79b, CD80, CGRP, OX-40, ICOS, 클라우딘18 (Claudin-18), CTLA4, DLL3, EGF 수용체, Fc 수용체, FGF23, 폴레이트 (folate) 수용체, GD2, GM-CSF, HER2, Her2/neu, HER3, VEGF, VEGF 수용체, 인터페론 수용체, 인터페론 감마, IgE, IGF-1 수용체, 인터루킨1, 인터루킨2 수용체, 인터루킨4 수용체, 인터루킨5, 인터루킨5 수용체, 인터루킨6, 인터루킨6 수용체, 인터루킨7, 인터루킨12/23, 인터루킨13, 인터루킨17A, 인터루킨17수용체A, 인터루킨31 수용체, 인터루킨36 수용체, LAG3, LFA3, NGF, PVSK9, PD-1, PD-L1, RANK-L, SLAMF7 및 조직인자 (Tissue factor) 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 상기 항원에 결합하는 항체는
4-1BB에 대한 항체는 유토밀루맙 (Utomilumab);
인테그린에 대한 항체는 나탈리주맙 (Natalizumab), 에트롤리주맙 (Etrolizumab), 베돌리주맙 (Vedolizumab), 비마그루맙 (Bimagrumab);
아밀로이드 베타에 대한 항체는 바피네우주맙 (Bapineuzumab), 크레네주맙(Crenezumab), 솔라네주맙 (Solanezumab), 아두카누맙 (Aducanumab), 간테네루맙 (Gantenerumab);
안지오포에틴에 대한 항체는 AMG 780;
안지오포에틴 유사물질3에 대한 항체는 에비나쿠맙 (Evinacumab);
B세포 활성인자 (B-cell activating factor, BAFF)에 대한 항체는 타발루맙(Tabalumab), 라나루맙 (Lanalumab), 베리무맙 (Belimumab);
B7-H3에 대한 항체는 옴부르타맙 (omburtamab);
CCR4에 대한 항체는 모가물리주맙 (Mogamulizumab);
CD3에 대한 항체는 오텔릭시주맙 (Otelixizumab), 테플리주맙 (Teplizumab), 무로모납 (Muromonab)과 GP100과 CD3에 대한 이중 항체인 테벤타프스프 (Tebentafusp), CD19와 CD3에 대한 이중항체인 블리나투모맙 (Blinatumomab); CD20과 CD3에 대한 이중 항체인 REGN1979;
CD4에 대한 항체는 이발리주맙 (Ibalizumab), 자놀리무맙 (Zanolimumab);
CD6에 대한 항체는 이톨리주맙 (Itolizumab);
CD11a에 대한 항체는 에팔리주맙 (Efalizumab);
CD19에 대한 항체는 이네빌리주맙 (Inebilizumab), 타파시타맙 (Tafasitamab)과 ADC인 론카스툭시맙 테시린 (Loncastuximab tesirine);
CD20에 대한 항체는 오크렐리주맙 (Ocrelizumab), 우블리툭시맙 (Ublituximab), 오비누투주맙 (Obinutuzumab), 오파투무맙 (Ofatumumab), 리툭시맙 (Rituximab), 토시투모맙 (Tositumomab)과 ADC인 이브리투모맙 티욱세탄 (Ibritumomab tiuxetan);
CD22에 대한 항체는 에프라투주맙 (Epratuzumab)과 ADC인 이노투주맙 오조가마이신 (Inotuzumab ozogamicin), 목세투모맙 파수도톡스 (Moxetumomab pasudotox);
CD30에 대한 ADC는 브렌툭시맙 베도틴 (Brentuximab vedotin);
CD33에 대한 ADC는 바다스툭시맙 탈리닌 (Vadastuximab talirine), 젬투주맙 오조가마이신 (Gemtuzumab ozogamicin);
CD38에 대한 항체는 다라투무맙 (Daratumumab), 이사툭시맙 (Isatuximab);
CD52에 대한 항체는 알렘투주맙 (Alemtuxumab);
CD62에 대한 항체는 크리잔리주맙 (Crizanlizumab);
CD79b에 대한 ADC는 폴라투주맙 베도틴 (Polatuzumab vedotin);
CD80에 대한 항체는 갈릭시맙 (Galiximab);
CGRP에 대한 항체는 ??티네주맙 (Eptinezumab), 프레마네주맙 (Fremanezumab), 갈카네주맙 (Galcanezumab), 에레누맙 (Erenumab);
클라우딘18 (Claudin-18) 에 대한 항체는 졸베툭시맙 (Zolbetuximab);
CTLA4에 대한 항체는 트레멜리무맙 (Tremelimumab), 잘리프렐리맙 (Zalifrelimab), 이플리무맙 (Ipilimumab);
DLL3에 대한 ADC는 로발피투주맙 테시린 (Rovalpituzumab tesirine);
EGF 수용체에 대한 항체는 세툭시맙 (Cetuximab), 데파툭시주맙 (Depatuxizumab), 잘루투무맙 (Zalutumumab), 네시투무맙 (Necitumumab), 파니투무맙 (Panitumumab);
Fc 수용체에 대한 항체는 니포칼리맙 (Nipocalimab), 로잔놀릭시주맙 (Rozanolixizumab);
FGF23에 대한 항체는 부로스맙 (Burosumab);
폴레이트 (folate) 수용체에 대한 항체는 팔레투주맙 (Farletuzumab)과 ADC인 미르베툭시맙 소랍탄신 (Mirvetuximab soravtansine);
GD2에 대한 항체는 디누툭시맙 (Dinutuximab), 낙시타맙 (Naxitamab);
GM-CSF에 대한 항체는 오틸리맙 (Otilimab);
HER2에 대한 항체는 마르게툭시맙 (Margetuximab), 페르투주맙 (Pertuzumab), 트라스투주맙 (Trastuzumab)과 ADC는 트라수투주맙 데룩테칸 (Trastuzumab deruxtecan), 트라수투주맙 엠탄신 (Trastuzumab emtansine), 트라수투주맙 두오카르마진 (Trastuzumab duocarmazine);
HER3에 대한 항체는 파트리투맙 (Patritumab);
인터페론 수용체에 대한 항체는 아니프롤루맙 (Anifrolumab);
인터페론 감마에 대한 항체는 에마팔루맙 (Emapalumab);
IgE에 대한 항체는 리겔리주맙 (Ligelizumab), 오말리주맙 (Omalizumab);
IGF-1 수용체에 대한 항체는 달로투주맙 (Dalotuzumab), 피기투무맙 (Figitumumab), 테프로투무맙 (Teprotumumab);
인터루킨1에 대한 항체는 게보키주맙 (Gebokizumab), 카나키누맙(Canakinumab);
인터루킨2 수용체에 대한 항체는 다클리주맙 (Daclizumab), 바실릭시맙(Basiliximab);
인터루킨4 수용체에 대한 항체는 두필루맙 (Dupilumab);
인터루킨5에 대한 항체는 메폴리주맙 (Mepolizumab), 레슬리주맙 (Reslizumab);
인터루킨5 수용체에 대한 항체는 벤랄리주맙 (Benralizumab);
인터루킨6에 대한 항체는 클라자키주맙 (Clazakizumab), 올로키주맙 (Olokizumab), 시루쿠맙 (Sirukumab), 실툭시맙 (Siltuximab);
인터루킨6 수용체에 대한 항체는 사릴루맙 (Sarilumab), 사트랄리주맙 (Satralizumab), 토실리주맙 (Tocilizumab), REGN88;
인터루킨7에 대한 항체는 세쿠키누맙 (Secukinumab);
인터루킨12/23에 대한 항체는 우스테키누맙 (Ustekinumab), 브리아키누맙 (Briakinumab);
인터루킨13에 대한 항체는 레브리키주맙 (Lebrikizumab), 트랄로키누맙 (Tralokinumab);
인터루킨17A에 대한 항체는 익세키주맙 (Ixekizumab), 비메키주맙 (Bimekizumab);
인터루킨17 수용체A에 대한 항체는 브로달루맙 (Brodalumab);
인터루킨23에 대한 항체는 브라지쿠맙 (Brazikumab), 구셀쿠맙 (Guselkumab), 리산키주맙 (Risankizumab), 틸드라키주맙 (Tildrakizumab), 미리키주맙 (Mirikizumab);
인터루킨31 수용체에 대한 항체는 네몰리주맙 (Nemolizumab);
인터루킨36 수용체에 대한 항체는 스페솔리맙 (Spesolimab);
LAG3에 대한 항체는 렐라틀리맙 (Relatlimab);
NASP2에 대한 항체는 나르소플리맙 (Narsoplimab);
NGF에 대한 항체는 파시누맙 (Fasinumab), 타네주맙 (Tanezumab);
PVSK9에 대한 항체는 알리로쿠맙 (Alirocumab), 에볼로쿠맙 (Evolocumab), 보코시주맙 (Bococizumab);
PD-1에 대한 항체는 람브롤리주맙 (Lambrolizumab), 발스틸리맙 (Balstilimab), 캄렐리주맙 (Camrelizumab), 쎄미플리맙 (Cemiplimab), 도스탈리맙 (Dostarlimab), 프롤골리맙 (Prolgolimab), 신틸리맙 (Sintilimab), 스파르탈리주맙 (Spartalizumab), 티슬레리주맙 (Tislelizumab), 펨브롤리주맙 (Pembrolizumab), 니볼루맙 (Nivolumab);
PD-L1에 대한 항체는 아테졸리주맙 (Atezolizumab), 아벨루맙 (Avelumab), 엔바폴리맙 (Envafolimab), 둘발루맙 (Durvalumab)과 TGF bete와 PD-L1의 이중 항체인 빈트라푸스프 알파 (Bintrafusp alpha);
RANK-L에 대한 항체는 데노수맙 (Denosumab);
SLAMF7에 대한 항체는 엘로투주맙 (Elotuzumab);
조직인자 (Tissue factor)에 대한 항체는 콘시주맙 (Concizumab), 말스타시맙 (Marstacimab);
TNF, 특히 TNFα에 대한 항체는 인플릭시맙 (Infliximab), 아달리무맙 (Adalimumab), 골리무맙 (Golimumab)과 항체 단편인 세르톨리주맙 페골 (Certolizumab pegol), TNF와 알부민에 대한 이중항체인 오조랄리주맙 (Ozoralizumab);
VEGF에 대한 항체는 브롤루시주맙 (Brolucizumab), 라니비주맙 (Ranibizumab), 베바시주맙 (Bevacizumab)과 VEGF와 Ang2의 이중 항체인 파리시맙 (Faricimab); 및
VEGF 수용체에 대한 항체는 라무시루맙 (Ramucirumab) 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물에 적용되는 질환인 암은 전형적으로 면역치료요법에 반응하는 암, 및 지금까지 면역요법에 관련되지 않은 암을 포함한다. 치료용으로 바람직한 암의 비-제한적인 예는 흑색종(예를 들면, 전이성 악성 흑색종), 신장암(예를 들면, 투명세포암종), 전립선암(예를 들면, 호르몬 불응 전립선샘암종), 췌장샘암종, 유방암, 결장암, 폐암(예를 들면, 비-소세포 폐암), 식도암, 두경부편평세포암종, 간암, 난소암, 자궁경부암, 갑상샘암, 아교모세포종, 신경아교종, 백혈병, 림프종, 및 기타 신생물암종을 포함한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 성장을 억제할 수 있는 불응 또는 재발 암을 포함한다.
또한 본 발명에 따른 항체 또는 항체 단편은 단독, 또는 백신과 함께 사용되어 병원체, 독소, 및 자가-항원에 대한 면역 반응을 자극시킬 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 예를 들어, 사람 면역결핍 바이러스, 간염 바이러스 부류 A, B 및 C, 엡스테인 바르 바이러스(Eppstein Barr virus), 사람 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 사람 파필로마(papilloma) 바이러스, 헤르페스 바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 사람을 전염시키는 바이러스에 대한 면역 반응을 자극시키는데 사용될 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 세균 또는 진균 기생체, 및 기타 병원체의 감염에 대한 면역 반응을 자극시키는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 항체 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 유용 박테리아를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 유용 박테리아는 항암 효능을 가지는 박테리아 또는 프로바이오틱스(probiotics)에 이용되는 것으로서, Anaerococcus, Anaerostipes, Alistipes, Akkermansia, Bacillus, Bacteroides, Bifidobacterium, Blautia, Capnocytophaga, Clostridium, Collinsella, Desulfovibrio, Dorea, Enterococcus, Escherichia, Eubacterium, Faecalibacterium, Fusobacterium, Garnderella, Gemmiger, Kelbsiella, Lactobacillus, Leuconostoc, Moryella, Paraprevotella, Parabacteroides, Pharscolarctobacterium, Porphyromonas, Prevotella, Pseudobutyrivibrio, Roseburia, Rothia, Ruminococcus, Shigella, Streptococcus, Veillonella, Weissella 등이 예시될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다.
경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 암을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 약물이 접합된 항체-약물 접합체 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 약물이 접합된 항체-약물 접합체 및 이를 포함하는 약학 조성물을 이용하여 종양을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 링커를 통하여 약물에 결합될 수 있다. 상기 링커는 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 약물 사이를 연결하는 부위로, 예를 들어 상기 링커는 세포내 조건에서 절단 가능한 형태 즉, 세포 내 환경에서 항체에서 약물이 링커의 절단을 통해 방출될 수 있도록 한다.
상기 링커는 세포 내 환경 예를 들어 리소좀 또는 엔도좀에 존재하는 절단제에 의해 절단될 수 있으며, 예를 들어 세포 내 펩티다아제 또는 프로테아제 효소 예를 들어 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 펩타이드 링커일 수 있다. 일반적으로 펩타이드 링커는 적어도 2개 이상의 아미노산 길이를 가진다. 상기 절단제는 카텝신 B 및 카텝신 D, 플라스민을 포함할 수 있으며, 펩타이드를 가수분해 하여 약물을 표적 세포 내로 방출할 수 있도록 한다.
상기 펩타이드 링커는 티올 의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단될 수 있고, 이는 암 조직에서 과발현되며, 예를 들어 Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly 링커가 사용될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커는 예를 들어 세포 내 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 것으로, Val-Cit 링커이거나 Phe-Lys 링커일 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 절단성 링커는 pH 민감성으로, 특정 pH 값에서 가수분해에 민감할 수 있다. 일반적으로, pH 민감성 링커는 산성 조건에서 가수분해될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해될 수 있는 산성 불안정 링커 예를 들어, 하이드라존, 세미카바존, 티오세미카바존, 시스-아코니틱 아마이드 (cis-aconitic amide), 오르쏘에스테르, 아세탈, 케탈 등일 수 있다.
다른 실시예에서, 상기 링커는 환원 조건에서 절단될 수도 있으며, 예를 들어 이황화 링커가 이에 해당할 수 있다. SATA (N-succinimidyl-S-acetylthioacetate), SPDP (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate), SPDB (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrate) 및 SMPT (N-succinimidyl-oxycarbonyl-alpha-methyl-alpha-(2-pyridyl-dithio)toluene)를 사용하여 다양한 이황화 결합이 형성될 수 있다.
상기 약물 및/또는 약물-링커는 항체의 라이신을 통해 무작위로 접합되거나, 이황화 결합 사슬을 환원하였을 때 노출되는 시스테인을 통해 접합될 수 있다. 경우에 따라서, 유전공학적으로 제작된 태그, 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질에 존재하는 시스테인을 통해 링커-약물이 결합될 수 있다. 상기 유전공학적으로 제작된 태그 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질은 예를 들어, 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의하여 인식될 수 있는 아미노산 모티프를 포함할 수 있다. 상기 펩타이드 또는 단백질은 펩타이드 또는 단백질의 카복시 말단에서 결실(deletion)을 가지거나, 펩타이드 또는 단백질의 카복시(C) 말단에 스페이서 유닛의 공유결합을 통한 부가를 갖는다.
또한, 상기 링커는 예를 들어 비절단성 링커일 수 있으며, 항체 가수분해 한 단계만을 통해 약물이 방출되어, 예를 들어 아미노산-링커-약물 복합체를 생산한다. 이러한 유형의 링커는 티오에테르기 또는 말레이미도카프로일기 (maleimidocaproyl)일 수 있고, 혈액 내 안정성을 유지할 수 있다.
상기 항체-약물 접합체에서의 약물은 약리학적 효과를 나타내는 제제로 항체에 결합될 수 있으며, 구체적으로 화학요법제, 독소, 마이크로 RNA (miRNA), siRNA, shRNA 또는 방사성 동위원소일 수 있다. 상기 화학요법제는 예를 들어, 세포독성 제제 또는 면역억제제일 수 있다. 구체적으로 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, 또는 DNA 인터컬레이터로서 기능할 수 있는 화학요법제를 포함할 수 있다. 또한, 면역조절 화합물, 항암제 및 항바이러스제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
이러한 약물에는 예를 들어, 마이탄시노이드, 오리스타틴, 아미노프테린, 악티노마이신, 블레오마이신, 탈리소마이신, 캄프토쎄신, N8-아세틸 스퍼미딘, 1-(2 클로로에틸)-1,2-다이메틸 술포닐 하이드라자이드, 에스퍼라마이신, 에토포사이드, 6-머캅토퓨린, 돌라스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신, 탁솔(taxol), 탁산, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 A, 미토마이신 C, 클로람부실, 듀오카마이신, L-아스파라기나제(L-asparaginase), 머캡토퓨린(mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 시타라빈(cytarabine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 니트로소우레아(nitrosourea), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 미토마이신(mitomycin), 다카바진(dacarbazine), 프로카바진(procarbazine), 토포테칸(topotecan), 질소 머스터드(nitrogen mustard), 사이톡산(cytoxan), 에토포시드(etoposide), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), CNU(bischloroethylnitrosourea), 이리노테칸(irinotecan), 캄포토테신(camptothecin), 블레오마이신(bleomycin), 이다루비신(idarubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신(plicamycin), 미톡산트론(mitoxantrone), 아스파라기나제(asparaginase), 비노렐빈(vinorelbine), 클로로람부실(chlorambucil), 멜파란(melphalan), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 부설판(busuLfan), 트레오설판(treosulfan), 데카바진(decarbazine), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 9-아미노캠프토테신(9-aminocamptothecin), 크리스나톨(crisnatol), 미토마이신 C(mitomycin C), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 티아조퓨린(tiazofurin), 리바비린(ribavirin), EICAR(5-ethynyl-1-beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 데프록사민(deferoxamine), 플룩수리딘(floxuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 랄티트렉세드(raltitrexed), 시타라빈(cytarabine(ara C)), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 플루다라빈(fludarabine), 타목시펜(tamoxifen), 라록시펜(raloxifene), 메게스트롤(megestrol), 고세렐린(goserelin), 류프롤리드 아세 테이트(leuprolide acetate), 플루타미드(flutamide), 바이칼루타마이드(bicalutamide), EB1089, CB1093, KH1060, 베르테포르핀(verteporfin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 광감작제 Pe4(photosensitizer Pe4), 데메톡시-하이포크레린 A(demethoxy-hypocrellin A), 인터페론-α(Interferon-α), 인터페론-γ(Interferon-γ), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 겜사이타빈(Gemcitabine), 벨케이드(velcade), 레발미드(revamid), 탈라미드(thalamid), 로바스타틴(lovastatin), 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온(1-methyl-4-phenylpyridiniumion), 스타우로스포린(staurosporine), 악티노마이신 D(actinomycin D), 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신 A2(bleomycin A2), 블레오마이신 B2(bleomycinB2), 페플로마이신(peplomycin), 에피루비신(epirubicin), 피라루비신(pirarubicin), 조루비신(zorubicin), 마이토산트론(mitoxantrone), 베라파밀(verapamil) 및 탑시가르긴(thapsigargin), 핵산 분해 효소 및 세균이나 동식물 유래의 독소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, 다른 항원에 결합하는 항체가 결합된 이중항체(bispecific antibody)를 제공한다.
본 발명에 따른 항-PD-L1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 이중항체를 형성하는 항체로는 암 또는 자가면역질환 관련 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체라면 제한 없이 사용가능하며, 그러한 항원으로는 4-1BB, 인테그린, 안지오포에틴, 안지오포에틴 유사물질3, B세포 활성인자 (B-cell activating factor, BAFF), B7-H3, CCR4, CD3, CD4, CD6, CD11a, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD40, CD52, CD62, CD79b, CD80, CGRP, OX-40, ICOS, 클라우딘18 (Claudin-18), CTLA4, DLL3, EGF 수용체, Fc 수용체, FGF23, 폴레이트 (folate) 수용체, GD2, GM-CSF, HER2, Her2/neu, HER3, VEGF, VEGF 수용체, 인터페론 수용체, 인터페론 감마, IgE, IGF-1 수용체, 인터루킨1, 인터루킨2 수용체, 인터루킨4 수용체, 인터루킨5, 인터루킨5 수용체, 인터루킨6, 인터루킨6 수용체, 인터루킨7, 인터루킨12/23, 인터루킨13, 인터루킨17A, 인터루킨17수용체A, 인터루킨31 수용체, 인터루킨36 수용체, LAG3, LFA3, NGF, PVSK9, PD-1, PD-L1, RANK-L, SLAMF7 및 조직인자 (Tissue factor), TGF-β 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, 상기 항원에 결합하는 항체는
4-1BB에 대한 항체는 유토밀루맙 (Utomilumab);
인테그린에 대한 항체는 나탈리주맙 (Natalizumab), 에트롤리주맙 (Etrolizumab), 베돌리주맙 (Vedolizumab), 비마그루맙 (Bimagrumab);
아밀로이드 베타에 대한 항체는 바피네우주맙 (Bapineuzumab), 크레네주맙(Crenezumab), 솔라네주맙 (Solanezumab), 아두카누맙 (Aducanumab), 간테네루맙 (Gantenerumab);
안지오포에틴에 대한 항체는 AMG 780;
안지오포에틴 유사물질3에 대한 항체는 에비나쿠맙 (Evinacumab);
B세포 활성인자 (B-cell activating factor, BAFF)에 대한 항체는 타발루맙(Tabalumab), 라나루맙 (Lanalumab), 베리무맙 (Belimumab);
B7-H3에 대한 항체는 옴부르타맙 (omburtamab);
CCR4에 대한 항체는 모가물리주맙 (Mogamulizumab);
CD3에 대한 항체는 오텔릭시주맙 (Otelixizumab), 테플리주맙 (Teplizumab), 무로모납 (Muromonab)과 GP100과 CD3에 대한 이중 항체인 테벤타프스프 (Tebentafusp), CD19와 CD3에 대한 이중항체인 블리나투모맙 (Blinatumomab); CD20과 CD3에 대한 이중 항체인 REGN1979;
CD4에 대한 항체는 이발리주맙 (Ibalizumab), 자놀리무맙 (Zanolimumab);
CD6에 대한 항체는 이톨리주맙 (Itolizumab);
CD11a에 대한 항체는 에팔리주맙 (Efalizumab);
CD19에 대한 항체는 이네빌리주맙 (Inebilizumab), 타파시타맙 (Tafasitamab)과 ADC인 론카스툭시맙 테시린 (Loncastuximab tesirine);
CD20에 대한 항체는 오크렐리주맙 (Ocrelizumab), 우블리툭시맙 (Ublituximab), 오비누투주맙 (Obinutuzumab), 오파투무맙 (Ofatumumab), 리툭시맙 (Rituximab), 토시투모맙 (Tositumomab)과 ADC인 이브리투모맙 티욱세탄 (Ibritumomab tiuxetan);
CD22에 대한 항체는 에프라투주맙 (Epratuzumab)과 ADC인 이노투주맙 오조가마이신 (Inotuzumab ozogamicin), 목세투모맙 파수도톡스 (Moxetumomab pasudotox);
CD30에 대한 ADC는 브렌툭시맙 베도틴 (Brentuximab vedotin);
CD33에 대한 ADC는 바다스툭시맙 탈리닌 (Vadastuximab talirine), 젬투주맙 오조가마이신 (Gemtuzumab ozogamicin);
CD38에 대한 항체는 다라투무맙 (Daratumumab), 이사툭시맙 (Isatuximab);
CD52에 대한 항체는 알렘투주맙 (Alemtuxumab);
CD62에 대한 항체는 크리잔리주맙 (Crizanlizumab);
CD79b에 대한 ADC는 폴라투주맙 베도틴 (Polatuzumab vedotin);
CD80에 대한 항체는 갈릭시맙 (Galiximab);
CGRP에 대한 항체는 엡티네주맙 (Eptinezumab), 프레마네주맙 (Fremanezumab), 갈카네주맙 (Galcanezumab), 에레누맙 (Erenumab);
클라우딘18 (Claudin-18) 에 대한 항체는 졸베툭시맙 (Zolbetuximab);
CTLA4에 대한 항체는 트레멜리무맙 (Tremelimumab), 잘리프렐리맙 (Zalifrelimab), 이플리무맙 (Ipilimumab);
DLL3에 대한 ADC는 로발피투주맙 테시린 (Rovalpituzumab tesirine);
EGF 수용체에 대한 항체는 세툭시맙 (Cetuximab), 데파툭시주맙 (Depatuxizumab), 잘루투무맙 (Zalutumumab), 네시투무맙 (Necitumumab), 파니투무맙 (Panitumumab);
Fc 수용체에 대한 항체는 니포칼리맙 (Nipocalimab), 로잔놀릭시주맙 (Rozanolixizumab);
FGF23에 대한 항체는 부로스맙 (Burosumab);
폴레이트 (folate) 수용체에 대한 항체는 팔레투주맙 (Farletuzumab)과 ADC인 미르베툭시맙 소랍탄신 (Mirvetuximab soravtansine);
GD2에 대한 항체는 디누툭시맙 (Dinutuximab), 낙시타맙 (Naxitamab);
GM-CSF에 대한 항체는 오틸리맙 (Otilimab);
HER2에 대한 항체는 마르게툭시맙 (Margetuximab), 페르투주맙 (Pertuzumab), 트라스투주맙 (Trastuzumab)과 ADC는 트라수투주맙 데룩테칸 (Trastuzumab deruxtecan), 트라수투주맙 엠탄신 (Trastuzumab emtansine), 트라수투주맙 두오카르마진 (Trastuzumab duocarmazine);
HER3에 대한 항체는 파트리투맙 (Patritumab);
인터페론 수용체에 대한 항체는 아니프롤루맙 (Anifrolumab);
인터페론 감마에 대한 항체는 에마팔루맙 (Emapalumab);
IgE에 대한 항체는 리겔리주맙 (Ligelizumab), 오말리주맙 (Omalizumab);
IGF-1 수용체에 대한 항체는 달로투주맙 (Dalotuzumab), 피기투무맙 (Figitumumab), 테프로투무맙 (Teprotumumab);
인터루킨1에 대한 항체는 게보키주맙 (Gebokizumab), 카나키누맙(Canakinumab);
인터루킨2 수용체에 대한 항체는 다클리주맙 (Daclizumab), 바실릭시맙(Basiliximab);
인터루킨4 수용체에 대한 항체는 두필루맙 (Dupilumab);
인터루킨5에 대한 항체는 메폴리주맙 (Mepolizumab), 레슬리주맙 (Reslizumab);
인터루킨5 수용체에 대한 항체는 벤랄리주맙 (Benralizumab);
인터루킨6에 대한 항체는 클라자키주맙 (Clazakizumab), 올로키주맙 (Olokizumab), 시루쿠맙 (Sirukumab), 실툭시맙 (Siltuximab);
인터루킨6 수용체에 대한 항체는 사릴루맙 (Sarilumab), 사트랄리주맙 (Satralizumab), 토실리주맙 (Tocilizumab), REGN88;
인터루킨7에 대한 항체는 세쿠키누맙 (Secukinumab);
인터루킨12/23에 대한 항체는 우스테키누맙 (Ustekinumab), 브리아키누맙 (Briakinumab);
인터루킨13에 대한 항체는 레브리키주맙 (Lebrikizumab), 트랄로키누맙 (Tralokinumab);
인터루킨17A에 대한 항체는 익세키주맙 (Ixekizumab), 비메키주맙 (Bimekizumab);
인터루킨17 수용체A에 대한 항체는 브로달루맙 (Brodalumab);
인터루킨23에 대한 항체는 브라지쿠맙 (Brazikumab), 구셀쿠맙 (Guselkumab), 리산키주맙 (Risankizumab), 틸드라키주맙 (Tildrakizumab), 미리키주맙 (Mirikizumab);
인터루킨31 수용체에 대한 항체는 네몰리주맙 (Nemolizumab);
인터루킨36 수용체에 대한 항체는 스페솔리맙 (Spesolimab);
LAG3에 대한 항체는 렐라틀리맙 (Relatlimab);
NASP2에 대한 항체는 나르소플리맙 (Narsoplimab);
NGF에 대한 항체는 파시누맙 (Fasinumab), 타네주맙 (Tanezumab);
PVSK9에 대한 항체는 알리로쿠맙 (Alirocumab), 에볼로쿠맙 (Evolocumab), 보코시주맙 (Bococizumab);
PD-1에 대한 항체는 람브롤리주맙 (Lambrolizumab), 발스틸리맙 (Balstilimab), 캄렐리주맙 (Camrelizumab), 쎄미플리맙 (Cemiplimab), 도스탈리맙 (Dostarlimab), 프롤골리맙 (Prolgolimab), 신틸리맙 (Sintilimab), 스파르탈리주맙 (Spartalizumab), 티슬레리주맙 (Tislelizumab), 펨브롤리주맙 (Pembrolizumab), 니볼루맙 (Nivolumab);
PD-L1에 대한 항체는 아테졸리주맙 (Atezolizumab), 아벨루맙 (Avelumab), 엔바폴리맙 (Envafolimab), 둘발루맙 (Durvalumab);
RANK-L에 대한 항체는 데노수맙 (Denosumab);
SLAMF7에 대한 항체는 엘로투주맙 (Elotuzumab);
조직인자 (Tissue factor)에 대한 항체는 콘시주맙 (Concizumab), 말스타시맙 (Marstacimab);
TNF, 특히 TNFα에 대한 항체는 인플릭시맙 (Infliximab), 아달리무맙 (Adalimumab), 골리무맙 (Golimumab)과 항체 단편인 세르톨리주맙 페골 (Certolizumab pegol), TNF와 알부민에 대한 이중항체인 오조랄리주맙 (Ozoralizumab);
VEGF에 대한 항체는 브롤루시주맙 (Brolucizumab), 라니비주맙 (Ranibizumab), 베바시주맙 (Bevacizumab)과 VEGF와 Ang2의 이중 항체인 파리시맙 (Faricimab); 및
VEGF 수용체에 대한 항체는 라무시루맙 (Ramucirumab) 등이 예시될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. PD-L1 항원 발현 및 정제
PD-L1 cDNA 유전자가 포함되어 있는 벡터(Sinobiological 사)를 template로 이용하여, PD-L1 유전자 N 말단의 signal sequence에서 Extracellular 부위 (Met1~Thr239)를 포함하는 절편을 PCR 증폭하여 human Fc 절편 융합발현을 위한 벡터, pCEP4-Fc 벡터의 NheI, SfiI 제한효소 위치에 삽입하여 'pCEP4-PDL1-Fc' 벡터 제작하였다.
이후 세포형질전환 시약인 FectoPRO (Polyplus 사)를 이용하여 제조사에서 제공하는 형질전환방법에 따라 FreeStyle 293-F 세포에 PD-L1발현 벡터를 도입하고, 약 6~10일간의 배양을 통해 세포밖으로 항원단백질이 배출되도록 하였다.
세포배양액으로 배출된 PD-L1 항원단백질은 Protein A 레진(Amicogen 사)을 이용한 open 컬럼 정제법으로 정제하고, citric acid 로 용출한뒤, 1 M Tris pH9.4 용액으로 중화하였다. 중화된 항원 단백질은 1X PBS 버퍼로 5회 dialysis 과정을 거쳐 정제를 완료하고 이후 실험들에 사용하였다.
실시예 2. 파지 라이브러리 재증폭
1) PD-L1에 결합하는 인간항체 선별을 위하여 '파아지디스플레이'기법을 활용하였다. 파아지디스플레이를 통한 인간항체 후보 선별을 위해 3종류의 인간항체 라이브러리를 사용하였으며, 이는 1)'PNAS, 1999년 vol.96, pp.6953-6958'에 보고된 naive scFv 라이브러리, 2)'Molecules and Cells, 2009년 vol.27, pp.225-235'에 보고된 synthetic scFv 라이브러리, 3)엘지생명과학에서 개발한 '엘지 naive scFv 라이브러리'이다.
2) 파아지디스플레이를 위하여 대장균으로부터 파아지들을 재증폭하여 scFv가 디스플레이된 파아지들을 생산하였으며, 그 방법은 '1)'번 라이브러리는 논문상의 'Rescue of scFv-displaying phage' 방법과 '2)'번 라이브러리는 논문들에서 언급된 'Library rescue' 방법에 따라 생산을 진행하였으며, 3)의 라이브러리의 경우에는 별도의 방법으로 생산을 진행하였고, 자세한 방법은 아래와 같다.
3) 파아지포함 세포 1 vial을 녹여서 2xYT (1% glucose, 34 μg/ml 클로람페니콜, 5 mM MgCl2 포함) 2L에 접종하고, 37℃ 교반배양기에서 OD600 이 0.5가 나올 때까지 키운 뒤, VCSM13 helper 파아지를 20 MOI 값으로 섞어주고, 37℃ 온도에서 45분 교반없이 incubation함으로써 개별 세포들내로 Helper 파아지의 infection이 모두 일어날 수 있도록 하였다.
4) infection 이 끝난 세포들을 500ml sorvall tube로 옮겨 15분간 5000 rpm의 원심분리를 하고, 세포침전물을 2L 2xYT (1 mM IPTG, 34 μg/ml 클로람페니콜, 70 μg/ml 카나마이신, 5 mM MgCl2 포함)에 resuspend 시킨 후, 30℃ 진탕배양기에서 overnight 배양(220 rpm)을 통해 파아지들이 생산될 수 있도록 하였다.
5) Overnight 세포배양(220 rpm, 30℃)을 한 뒤, 세포배양액을 20분간 4℃, 8000 rpm에서 원심분리를 하여 세포배양 침전물들을 버리고, 상층액만을 취한 후, 상층액부피의 1/5 부피의 PEG/NaCl (20% w/v PEG 6000, 0.25 M NaCl) 용액을 넣고, Ice에서 1시간 가량 incubation 하여 파아지들이 뭉쳐 가라앉을 수 있도록 한 뒤, 20분간 4℃ 8000 rpm 의 원심분리를 통해 파아지 침전을 얻고, 상층액을 제거한 뒤, 파아지 침전물을 약 80 ml PBS에 녹여 파아지 용액 샘플을 얻고, 0.45 μm 주사기필터를 이용하여 파아지 용액샘플 내 불순물을 제거하여 파아지 라이브러리 시료 준비를 완성하였다.
실시예 3. 파지 패닝
1) Dynal 사의 Dynabeads™ M-270 Epoxy bead를 이용하여 제조사에서 제공한 실험방법에 따라 PD-L1 항원단백질 약 10 μg을 12.5 μl 부피의 bead에 결합시켜 항원단백질이 커플링된 magnetic bead를 준비한 뒤, 3% BSA 포함의 PBS 버퍼에서 실온 1시간 incubation을 통해 blocking 반응을 수행하였다.
2) PEG/NaCl 침전 및 주사기필터로 정제된 약 1013 개의 인간항체 표면 발현 파아지들을 1% BSA, 0.05% Tween 함유의 PBS 용액에 현탁하고, 미리 준비한 12.5 μg/ml 농도의 인간항체(녹십자, 아이비글로불린에스엔주 10%) 시료로 coating을 한 immuno-tube (Nunc)에 넣고 Fc 부위에 결합하는 파아지들을 제거하기 위한 subtraction 반응을 수행하였다 (실온 2시간).
3) Subtraction을 마친 파아지 용액과 항원단백질이 커플링된 마그네틱 bead를 섞고, 항원단백질과 결합할 수 있는 항체파아지들이 magnetic bead에 결합하도록 실온에서 2시간 정도 혼합교반시킨 후, 자성화된 MACS column (Miltenyi Biotech)에 넣어 항원단백질이 커플링된 마그네틱 bead에 결합된 항체들이 얻어지도록 하였다.
4) panning이 진행함에 따라서 1차 세척은 6 ml PBS 1회, 2차 및 3차 세척은 6 ml PBS 2회, 4차 세척은 7 ml PBS 3회 등으로 세척횟수를 증가시키면서 high affinity 항체들이 많이 선별될 수 있도록 stringency를 조절하였다.
5) PBS 버퍼로 세척후, MACS column에 0.25% trypsin 용액을 700 μl 주입하여 column 내에 trypsin 용액을 채운 후, column을 37℃ 항온기에서 30 min incubation하여 phage elution을 유도한 후, column을 1,000 rpm, 1분간 원심분리하여 elution된 파아지를 얻어낸 뒤에 Fresh하게 준비된 O.D.600=0.7~0.8 정도의 배양상태인 ER2738 (NEB) 대장균과 혼합하여 elution된 파아지들의 대장균 감염을 유도하였다.
6) 파아지들에 감염된 대장균은 해당 antibiotics들이 포함된 고형 LB plate (1% glucose 포함) 위에 도말하여 30℃ 배양기에서 overnight으로 incubation하여 대장균들이 모두 lawn으로 자랄수 있도록 하고, plate에서 다자란 대장균들은 scraper로 harvest하여 실시예 2에서 사용했던 방법으로 통해서 파아지 파티클들을 재증폭하였다.
실시예 4. ELISA 및 FACS 실험을 통한 PD-L1 항원단백질 결합 항체의 선별
1) PD-L1 항원단백질에 결합여부를 확인하기 위하여 개별항체를 발현하고 있는 박테리아균주들 약 1700개로부터 항체절편들이 포함되어 있는 periplasmic fraction을 얻어 ELISA 선별실험 및 FACS 선별 실험을 수행하였다.
2) 각각 대장균들로부터 항체절편 단백질을 얻기 위하여, 단일콜로니의 박테리아를 약 1 ml 의 LB 배지가 분주된 96-deep well plate에 접종한 뒤, 37℃ shaking incubator에서 배양하여, 약 OD600값이 0.7~0.8 정도에 도달하였을 때에 1 mM IPTG를 첨가하고, 30℃에서 overnight shaking incubation을 추가로 하여 대장균의 periplasm에 항체절편이 발현되도록 유도하였다.
3) 다음날 periplasmic 성분을 추출하기 위하여, 배양된 대장균들을 원심분리(4,000 rpm, 15분, 4℃)하여 상층액을 버리고, 대장균을 모두 80 μl 부피의 ice-cold 1X TES 버퍼(20% w/v sucrose, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 resuspend하고 ice 상태에서 30분간 방치하였다가 이후, 120 μl 의 ice-cold 0.2X TES 버퍼를 추가하여 섞어준 다음 30분 가량 추가적으로 방치하여 삼투압에 의해 periplasmic 성분이 추출되도록 유도하였다. 이후 세포들은 원심분리를 통해서 제거하고, 상층액을 항체절편이 포함된 periplasmic 성분으로 ELISA 및 FACS 검증실험에 이용하였다.
4) PD-L1 항원단백질과의 결합성 확인을 위한 ELISA 검증실험을 위하여 항원단백질을 100ng/well 정도를 100 μl 부피의 PBS 버퍼에 녹여 4℃ overnight incubation을 통해 half-well size ELISA plate(Corning사 3690)에 coating하고, 다음날 약 170 μl의 3% BSA를 포함한 PBS버퍼로 교환한 후, 1시간 가량 37℃ incubation을 통해 blocking 반응을 수행하였다.
5) periplasmic 성분 추출로 얻어진 상층액 50 μl + 50 μl PBS를 넣고 실온에서 1시간 가량 incubation 하여 항체절편들이 coating 되어있는 항원단백질에 결합할 수 있도록 하고, 이후, 2~3회 세척단계처리를 거쳐 anti-myc-HRP 항체 또는 anti-HA-HRP 2차항체들이 포함된 PBS 버퍼를 분주하고 실온에서 1시간가량 incubation 한 뒤, 2~3회의 PBS 버퍼를 이용한 세척과정을 거쳤다.
6) HRP의 substrate인 Tetramethylbenzidine (TMB)가 포함된 ELISA 반응 용액을 100 μl씩 분주하고, 발색반응을 관찰함으로써 항체절편의 PD-L1 항원 결합여부를 판별하였다.
7) 세포표면에 발현되는 PD-L1의 자연형의 구조에 선별된 항체절편들의 결합여부 검증을 위한 FACS 실험을 수행하였으며, 이를 위하여 PD-L1 항원단백질을 293T 세포에 형질전환을 통해 발현시킨 후, 항체 절편들의 표면발현 PD-L1 항원 결합여부를 유세포분석기를 통해 판별하였으며, 그 실험과정은 일반적인 FACS 실험방법에 따라 수행하였다.
8) PD-L1 단백질 발현벡터를 도입한 293T 세포를 5x105 ~1x106 cells/100 μl 정도크기로 나누어 96wells V-bottom plate에 분주하고, blocking 한 뒤, PD-L1 항체절편이 함유된 Periplasmic 성분을 PBS 버퍼와 1:1 로 혼합한 용액 100 μl와 30~60분 가량 4℃(또는 ice위에서) 반응을 통해 항원 단백질에 대한 항체절편의 결합을 유도. 이후, 원심분리(1,000 rpm for 1 min at 4℃)를 통해 비결합 성분들을 제거한 후, FACS 버퍼로 세척하고, Anti-tag-Alexa Fluor 488 이차항체를 1:400로 희석된 FACS 버퍼에 resuspend 한 후, 4℃에서 30~60분 추가반응시켰다. 이후, 원심분리(1,000 rpm, 1분, 4℃)를 통하여 비결합 성분들을 제거하고, 형광라벨된 세포들을 400~700 μl 부피의 FACS 버퍼에 resuspend 한 후, FACSCalibur (Becton Dickinson사) 유세포분석기를 이용하여 세포의 형광 염색 유무를 분석하였다.
도 1에 따르면, PD-L1 단백질에 대한 panning 실험 3차와 4차 elution에서 유래한 콜로니들 약 1800여개로부터 periplasmic 성분을 얻어 96well plate에 coating 된 PD-L1 항원 단백질에 대한 결합여부를 검증하는 ELISA 반응을 수행하고, 발색반응을 나타내는 클론들을 sequencing 분석해본 결과 약 72개의 개별 항체클론들이 얻어짐을 확인하였다.
도 2에 따르면, 이들 72개의 개별 클론들의 native conformation의 PD-L1 단백질에 대한 결합성을 검증하기 위하여 PD-L1 단백질을 도입시킨 293T 세포를 대상으로 FACS 실험을 수행한 결과 다수의 항체들이 PD-L1 단백질이 표면발현된 세포 표면에 결합함을 확인할 수 있었다.
실시예 5. BLI 기술 기반 PD-1/PD-L1 binding inhibition assay
1) Pall 사의 Octet 기기를 이용하여 'bio-layer interferometry (BLI)' 원리에 기반하여 기능성 항체의 선별실험을 진행하였다. 먼저 AR2G biosensor 들을 hydration 시킨 후, EDC/sulfo-NHS 활성화반응을 수행하고, pH 5의 10 mM sodium acetate에 5 μg/ml 농도의 PD-1 단백질을 coating 시킨 1 M ethanolamine 으로 미반응 작용기들을 비활성화시키고, 1X running 버퍼에 incubation하여 equilibration시켜주었다.
2) PD-L1 항원단백질과 항체절편의 결합으로 인한 PD-L1 항원과 PD-1 단백질과의 상호작용에의 간섭효과를 측정하기 위하여, PD-1단백질이 coating된 biosensor를 PD-L1 항원단백질과 PD-L1 결합항체(또는 비교항체)가 섞여있는 well에 담그어 용액속의 PD-L1 항원단백질의 결합에 따른 biosensor 표면의 질량 변화를 측정하였다.
3) 실험 결과는 Octet 기기전용의 data analysis software를 이용하여 분석하였다.
도 3에 따르면, Octet biosensor에 PD-1-Fc 단백질을 결합시킨 후, 선별된 scFv 항체와 PD-L1-Fc를 순차적으로 반응시켜 선별된 항체가 PD-L1에 결합함으로써 용액내의 PD-L1 항원단백질이 biosensor에 coating된 PD-1 단백질과 결합하는 것을 억제하는지 확인하였다.
중쇄와 경쇄의 가변영역이 다른 개별 항체후보들의 결합저해성능을 Octet 기기를 이용하여 모두 확인하여, 항체절편이 함께 incubation될 경우에 PD-L1 결합감소로 인한 Sensorgram의 패턴 증가폭이 감소하는 특성을 나타내는 항체후보들이 약 50개 이상(전체 72 후보항체 중)임을 확인하였다.
실시예 6: IgG conversion
1) 개별항체 클론들의 염기서열 분석을 통해 확인된 개별항체의 VH부위와 VL 부위를 증폭하기 위한 인간 항체 프라이머 셋트를 이용하여 약 58개의 개별 항체들의 가변영역 VH와 VL부위를 각각 PCR 증폭하고, 정제하였다.
2) VH 절편들은 KpnI 또는 BamHI, NheI 제한효소를 처리하고 정제하여, 중쇄발현을 위한 pCEP4-VH 벡터의 해당하는 제한효소 부위에 삽입하고, VL 절편들은 KpnI 또는 BamHI, BsiWI 제한효소를 처리하고 정제하여, 경쇄발현을 위한 pCEP4-VL 벡터의 해당 제한효소 부위에 삽입하여 개별항체들을 동물세포 내에서 발현시킬 수 있는 벡터들을 확보하였다 (중쇄 및 경쇄 발현 벡터 각각 58종).
3) 각각의 벡터들은 Qiagen 사의 DNA Maxi-prep kit를 이용하여 정제하였으며, Polyplus 사의 FectoPRO transfection 시약을 이용하여 Freestyle 293-F 세포에 형질전환을 시켜 각각의 항체들을 발현하였으며, 배양 후, 확보된 supernatant에 대하여 proteinA resin을 이용한 affinity 정제법을 이용하여 항체단백질을 정제하였다.
4) 대조군 항체로 사용하기 위하여 머크사에서 개발한 PD-1 타겟 항체인 MK3475와 제넨텍사에서 개발한 PD-L1 타겟 항체인 MPDL3280A 항체의 중쇄와 경쇄 가변영역 아미노산을 각각의 특허에서 확인하고 cDNA를 합성하여 pCEP4-VH 벡터와 pCEP4-VL 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제조하고, 후보항체들과 동일한 과정을 거쳐 두 항체를 생산 정제하여 대조항체로 사용하였다.
[표 4] MK3475 및 MPDL3280A 항체의 중쇄와 경쇄 가변영역 아미노산 서열
Figure pat00004
실시예 7. Mouse PD-L1 binding FACS assay
1) 마우스 PD-L1을 발현하는 Murine colon cancer 세포주인 'MC38' (5x106 cells/10 ml) 세포에 IFN-γ를 100 ng/ml 농도로 처리하여 48시간 정도 배양하여 암세포주 표면에 PD-L1 발현정도를 증가시켰다.
2) 배양 후, MC38 세포들을 5x105 ~1x106 cells/100 μl 정도 크기로 나누어 96wells V-bottom plate에 분주한 뒤, 일반적인 FACS 실험방법에 따라 blocking 과정 뒤, 정제되어있는 PD-L1 항체들을 10 μg/ml 농도로 30 ~ 60 분 가량 4℃(또는 ice위에서) 반응시킨 후, 원심분리(1,000 rpm for 1 min at 4℃)를 통하여 결합하지 않은 항체들은 FACS wash 버퍼를 이용하여 세척, 제거하였다.
3) 항체와 결합시킨 세포들은 goat α-human Alexa Fluor 488 이차항체가 1 : 400 비율로 희석된 FACS buffer에 resuspend 한 후, 4℃에서 30 ~ 60 min 가량 반응시켰다. 이 후, 원심분리(1,000 rpm for 1 min at 4℃)를 통하여 결합하지 않은 이차항체들은 FACS wash 버퍼를 이용하여 세척하였다.
4) 세포들을 400 ~ 700 μl 부피의 FACS 버퍼에 resuspend 한 후, FACSCalibur (Becton Dickinson사) 유세포분석기를 이용하여 세포의 형광 염색 유무를 분석함으로써, 1차 항체들의 마우스형 PD-L1 단백질에 대한 표면 결합성을 확인하였다.
도 4에 따르면, IgG 형태로 발현 정제된 후보항체들을 이용하여 마우스 PD-L1이 발현되는 MC38 세포표면 결합성을 FACS 실험을 통해서 확인해본 결과, 다수의 항체들이 마우스 PD-L1에 결합하는 특성을 가짐을 확인하였으며, 특히 KL001(PL110)과 PL112 항체의 경우 매우 강한 결합력을 가짐을 확인하였다.
실시예 8. PD-1/PD-L1 binding blockade assay
1) PD-1 면역관문단백질과 그 리간드 PD-L1 단백질의 결합 저해성능 확인을 위한 in vitro 세포기반 효능 검증 방법에는 다양한 실험법이 알려지고 있으나, Promega 사에서 제공하는 cell-based assay kit인 'PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay'를 이용하여 선별된 항체클론들의 PD-L1 성능 저해능을 검증하였으며, Promega 사의 kit에서는 세포에서 측정된 luminescence 값의 세기가 PD-1/PD-L1 결합저해 성능의 세기와 비례하여 나타났다.
2) 실험법은 Promega kit에서 제공하는 프로토콜에 따라 실험을 진행하였으며, 간략히 요약하면 아래와 같다.
3) Assay 실험 하루전에 37℃ water bath에서 'Thaw-and-Use PD-L1 세포'를 녹여 cell recovery 배지에 넣고 약하게 저어 혼합한 뒤, multi-channel pipette으로 white bottom assay plate에 100 μl 가량씩 분주하고, overnight incubation 실시하였다.
4) Assay 실험 당일, 상층액을 제거하고, 효능 평가를 위한 순차적으로 희석한 용액시료, 비교항체 및 후보항체 등의 시료들을 40 μl 용액부피로 각 well에 넣어준 뒤에 Thaw-and-use PD1 Effector cell (CS187105)을 냉동고에서 꺼내 37℃ waterbath에서 녹여 조심스럽게 assay buffer에 suspension 시키고, 앞서 항체시료가 처리된 well에 40 μl씩 분주하였다.
5) 6시간 동안 37℃ CO2 incubator 에서 Jurkat 세포(PD-1 effector cell) 활성화-저해 반응이 일어나게 한 뒤에 luciferase 기질이 포함되어있는 따뜻하게 가열된 Bio-Glo luciferase assay solution를 80 μl씩 각 well에 넣고 VICTOR multilabel plate reader (Perkin Elmer 사)를 이용하여 luminescence 값을 측정하였다.
도 5에 따르면, IgG 형태로 정제된 58개의 PD-L1 결합항체들에 대해 Promega 사의 in vitro PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay를 수행한 결과, 대조항체로 사용한 PD-1 타겟 항체(MK3475항체)와 PD-L1 타겟항체(MPDL3280A항체)와 비교해서 유사한 수준의 강한 PD-1/PD-L1 결합저해 성능의 후보클론들이 발굴되었음을 확인하였다.
후보항체들의 PD-1/PD-L1 결합저해 성능은 MK3475 항체의 저해성능을 100%로 고려했을 때의 상대적인 값이며, #50 클론의 경우 91%, KL001 클론의 경우 89% 저해성능을 가짐을 확인하였으며, 이중 KL001 클론은 인간-마우스 PD-L1 항원에 대한 교차 반응성을 보이고, #50 클론은 인간 PD-L1 에만 결합하는 특성을 보여 개발후보물질 코드명으로 각각, KL001, KL002로 명명하였다.
실시예 9. In vivo MC38/C57BL/6 syngeneic mouse model study
1) Murine colon cancer cell MC38을 37℃, 5% CO2 조건에서 10% fetal bovine serum 이 첨가된 배지에서 배양하였으며, 약 1주일간 배양하여 형태, 생존율, doubling time과 mycoplasma 오염 여부를 체크하여 오염되지 않은 정상 상태의 암세포가 동물실험에 사용되도록 준비하였으며, 실험동물에 주입시, 세포 생존율 95% 이상의 세포를 이용하였다.
2) MC38 세포는 trypsin-EDTA를 사용하여 수확하고, 이식을 위하여 1x107 cells/ml의 농도로 cold-PBS에 혼탁하여 준비하고, 준비된 세포 혼탁액을 5x105 cells/50 μl 이식용 주사기로 취하여 C57BL/6 mouse의 오른쪽 뒷다리 피하에 주입하여 이식하였다. 이후, 주기적으로 종양 형성과 성장을 관찰하며 측정된 종양 길이를 사용하여 아래 수식에 따라 종양의 부피를 계산하였다.
[종양부피 = (a2b)/2 ; a = 종양의 짧은길이, b = 종양의 큰길이]
3) 종양의 크기가 80 mm3ㅁ20에 도달했을 때, 마우스들을 부피에 따라 재분류하여 control 그룹(PBS처치군과 비교항체 처치군) 및 4종의 PD-L1 타겟 항체처치군으로 그룹화하고, 항체시료를 복강주입법 (Intraperitoneal injection) 으로 약 200 μg/200 μl의 항체를 투여하였으며, 투입주기는 1회 이후, 3일간격으로 3회 (1일, 4일, 7일) 투여하였다.
4) 암 조직의 성장은 항체시료 처치 개시 전에는 3일 간격으로 측정하고, 처치 개시 후부터는 2일에 한번씩 측정하였으며, 항체시료 처치 개시일로부터 시험 종료 (약 2주 가량) 시까지의 종양부피로 종양성장곡선을 작성하여 항체의 효능 평가 검증 자료로 활용할 수 있도록 준비하였다. 만일 종양부피가 동물실험윤리위원회 (IACUC) 규정의 한계치에 이르면 안락사 시켰으며, 실험 종료 시, 마우스는 안락사하고 종양을 적출하여 종양의 무게 측정과 종양 형상을 사진 촬영하였다.
5) in vitro 효능평가 시험에서 높은 저해성능을 나타내는 항체와 중간정도 성능을 나타내는 항체들의 in vivo 항암 성능과의 상관관계 비교를 위하여 4종의 항체, #50(=KL002), KL001(PL110), #8, #61와 대조항체 MPDL3280A 를 사용하여 in vivo 효능평가 실험을 수행하였다.
도 6에 따르면, 마우스유래 대장암 세포주 MC38과 C57BL/6 syngeneic 마우스 모델을 이용한 후보항체들의 in vivo 항암성능을 분석해본 결과, 인간-마우스 교차반응성을 갖고있는 KL001(PL110) 항체후보가 뛰어난 항암 효능을 나타냄을 관찰할 수 있었으며, 인간 PD-L1에만 결합하는 #50(=KL002) 항체의 경우엔 전혀 항암 효능이 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다.
in vitro 효능 실험에서 높지 않은 성능을 나타내었던 #8, #61 클론의 경우에도 in vivo 항암 효능성능이 비교적 높지 않음을 확인할 수 있었다.
실시예 10. KL001 항체의 ex vivo 면역조절능 시험
1) 인체내 면역세포들 사이에 면역활성 조건에서 유도되는 PD-1/PD-L1 결합으로 인한 면역활성 제한현상이 PD-L1 표적 후보항체의 결합에 의해 면역활성이 강화될 수 있는지 확인함으로써, 혈액 내의 면역세포들 간의 상호작용에 대한 후보항체의 ex vivo 효능을 검증하고자 인간 혈액으로부터 말초혈액단핵세포(PBMC)를 분리하여 superantigen, SEA 또는 SEB로 자극된 PBMC에 면역항암항체를 처리함으로써 면역세포들간의 활성변화를 측정하는 실험을 수행하였다.
2) 대한적십자사 혈액관리본부 생명윤리심의위원회(IRB) 승인 후 강원혈액원에서 적혈구 농축액(cRBC)을 구입하여, PBS와 1 : 1 희석하여 이를 Ficoll-Paque위에 올려 원심분리하면 세포의 비중에 의해 적혈구(RBC), 말초혈액단핵세포(PBMC) 및 혈장(plasma) 등을 분리되는데, 이 PBMC 부분을 추출하여 실험에 사용하였다.
3) 분리된 말초혈액단핵세포(PBMC)를 1x105 cells/100 μl로 96wells(u-bottom)에 분주한 뒤, SEB(Staphylococcal enterotoxin B, super-antigen, Toxin Technology사)를 0.003 μg/100 μl를 각각의 wells에 처리하고, 여기에 실험군 및 대조군 항체를 각각 10 μg/ml로 처리하여 면역세포 활성화 조건을 만들어 주었다. 이후, 96시간 뒤에 세포배양액 내에 면역세포 활성화로 인해 생성된 IL-2 양을 IL-2 ELISA kit를 이용하여 정량함으로써 후보항체의 인간 면역세포들에 대한 면역조절 활성 능력을 검증하였다.
도 7 및 도 8에 따르면, SEB assay를 통한 면역세포 활성시험에서는 SEB 처리시 APC와 T 세포간에 무작위적인 crosslinking이 일어나며 면역세포 활성이 증가하여 IL-2 분비가 늘어나는 것을 확인할 수 있었으며, 기존에 선별된 후보항체(KL001)의 면역세포 활성 능력을 확인할 수 있었으며(그림은 5회 실험 평균치), 후보항체의 affinity maturation 이후 선정된 KL001-13 후보항체에 대해서도 유사한 정도의 면역세포 활성 조절 능력을 확인할 수 있었다.
[표 5] 후보항체의 서열
Figure pat00005
실시예 11. Affinity maturation 실험
1) KL001 항체의 기본 골격에서 Heavy chain CDR 2, 3영역과 Light chain CDR 1, 3 영역에 집중하여 돌연변이화를 도입하여 focused mutagenesis library를 구축하였다.
2) KL001 클론의 VH 부위와 VL 부위에 Mutagenesis 가 도입된 절편들을 extension PCR를 사용하여 라이브러리 구축을 위한 insert로 증폭한 후, KL001 절편을 파아지디스플레이 벡터, 'pComb3XSS' 에 클로닝하기 위한 제한효소로 처리한 후, 동일 제한효소로 처리된 벡터에 Ligation 반응 수행하였다.
3) Ligation된 pComb3X 파아지 디스플레이 벡터와 insert를 ER2738세포로 제조한 electroporation competent cell에 transformation하여 KL001 항체 디스플레이 mutant library를 구축하였다.
4) VCSM13 helper phage를 이용하여 KL001 mutant 항체들이 디스플레이된 파아지들을 제조한 뒤, PEG와 NaCl을 이용한 침전법을 이용하여 정제하였다.
5) Biotinylation 한 PD-L1-Fc 항원을 이용하여 3~4번의 panning 과정을 수행하고, 3~4차 panning에서 얻어진 colony들을 친화도 개선 항체 선별을 위한 ELISA 반응에 이용하였다.
6) IPTG를 이용하여 periplasm에 선별항체 절편들을 발현시킨 이후, sucrose 를 이용해 periplasmic fraction을 얻어낸 이후, PD-L1 항원이 코팅된 plate를 이용한 ELISA 방법을 통하여, 결합력 증가가 예상되는 항체 후보들을 선별하였다.
7) competitive ELISA 방법을 이용하여 결합력 증가 후보항체들의 선별을 완료하였다.
도 9에 따르면, KL001 항체의 Heavy chain CDR 2, 3영역과 Light chain CDR 1, 3 영역에 site-directed 돌연변이화를 도입한 focused mutagenesis DNA 절편들을 overlap PCR로 연결하여 Fab 형태의 항체골격으로 제작한 후, 파아지디스플레이 벡터, 'pComb3XSS' 의 SfiI 제한효소 자리에 ligation을 통해 삽입하고, phage display를 위한 대장균 ER2738세포에 electroporation 방법으로 형질전환함으로써 '1.3 X 109' 크기의 KL001 항체 디스플레이 mutant library를 구축하였다. Biotinylation 한 PD-L1-Fc 항원을 이용하여 강한 결합력을 갖는 항체클론들을 enrich 하기위해서 항원의 양을 줄여가는 stringent 실험조건을 적용한 3~4번의 panning 과정을 수행하였다. 이때, panning을 통해 강한 binder들이 효과적으로 증가됨을 panning의 input vs output 측정결과에서 확인하였다.
도 10에 따르면, 3차와 4차 panning 결과 얻어진 약 1600개 가량(set1~set16)의 개별 콜로니들로부터 periplasmic fraction 을 얻어 친화도 개선 항체 선별을 위한 ELISA 반응을 수행하여 positive signal을 나타내는 후보클론들을 1차 선별하였다 (130여 클론들).
항원 결합력 개선 여부확인(Koff 값 개선여부)을 위하여 Competitive ELISA를 수행하여, 추가로 PD-L1 항원단백질이 포함된 용액에서 4시간가량 추가로 incubation을 한 뒤, 결합을 유지하고 있는 항체 클론들을 확인함으로써, KL001 대비 plate에 코팅된 PD-L1에서 강하게 결합하고 있는 약 27종의 항체 후보들을 확인하였다 (비교군인 오리지널 항체 KL001의 경우 ELISA 값이 '0.278'을 나타내었으며, 친화도 개선 항체들은 이보다 높은 값을 나타내는 클론들로 확인함).
표 6에 따르면, 결합력 증가가 예상되는 항체들을 모두 염기서열 분석을 실시하여 서로 다른 돌연변이가 도입된 항체들의 아미노산 서열을 확인하였다.
[표 6]
Figure pat00006
친화도 개선 항체들의 PD-L1 항원단백질과 항체절편의 결합으로 인한 PD-L1 항원과 PD-1 단백질과의 상호작용에의 간섭효과를 측정하기 위하여, 실시예 5에서 언급된 BLI 기반 Octet 기기를 이용하여 PD-1단백질이 coating된 biosensor를 PD-L1 항원단백질과 PD-L1 결합항체(또는 비교항체)가 섞여있는 well에 담그어 용액속의 PD-L1 항원단백질의 결합에 따른 biosensor 표면의 질량 변화를 측정하였다.
표 7의 실험 결과는 Octet 기기전용의 data analysis software를 이용하여 분석한 친화도 개선 항체들의 결합력을 나타내었다.
[표 7] 친화도 개선 항체들의 결합력
Figure pat00007
실시예 12. Biacore assay
1) 후보항체의 PD-L1 항원단백질에 대한 결합력을 측정하기 위하여 Surface Plasmon Resonance (SPR) 원리에 기반한 Biacore T200 기기를 이용하여 결합강도를 측정하였다.
2) Antibody capture 방법을 사용한 항 PD-L1 항체의 결합 친화력 분석에서는 제조사 제공의 실험법 가이드에 따라, Human Antibody Capture Kit를 사용하여 CM5 chip 표면에 먼저 Anti-Human IgG (Fc) antibody를 고정하고, 후보항체 KL001-8, KL001-13을 PBS-P running buffer에 희석하여 10 μl/min 유속으로 30초 동안 injection 하여, 300 ~ 330 RU 수준으로 capture한 뒤, human PD-L1 항원단백질(sinobiological사)을 각각 5 nM부터 2배씩 희석하여 30 μl/min 유속에서 association/dissociation 반응을 관찰하였다(반응시간은 각각 4분/7분으로 설정). Mouse PD-L1 항원단백질에 대한 결합력측정의 경우, 10 nM부터 2배씩 희석하여 30 μl/min 유속에서 association/dissociation 시간을 각각 4분/3분으로 하여 결합력을 측정하였다.
3) 모든 cycle마다 결합되어 있는 항체를 제거하기 위해, regeneration solution (3 M MgCl2)을 30 μl/min 유속으로 30초 동안 injection 하였으며, 실험데이터는 BIAevaluation software version 1.0의 1:1 binding model을 이용하여 산출하였다.
4) Antigen capture 방법을 사용한 항 PD-L1 항체의 결합 친화력 분석실험의 경우에는 His Capture Kit를 사용하여 manufacturer's instruction에 따라, CM5 chip 표면에 Anti-His antibody를 고정하고, PD-L1 항원단백질을 capture하게 한 뒤, 후보항체를 2.5 nM부터 2배씩 희석하여 30 μl/min 유속에서 association/dissociation 시간을 각각 4분/7분으로 하여 결합력을 측정하였다.
도 11에 따르면, Flow cell 3번, 4번에 Anti-Human IgG (Fc) antibody를 immobilization하였다. Human Antibody Capture Kit의 instruction에 따라 immobilization을 수행하여, 각 Flow cell에 대략 11,000 ~ 13,000 RU 범위 내로 immobilize됨을 확인하였으며, Running buffer (PBS-P)를 이용하여 항체 KL001-8, KL001-13을 capture 하고, PD-L1을 농도별로 희석하여 injection 하여 kinetics를 측정한 결과, KL001-8 항체는 인간 PD-L1에 대해 KD=6.714 x 10-11 M, 마우스 PD-L1에 대해 6.401 x 10-9 M, KL001-13 항체는 인간 PD-L1에 대해 KD=6.320 x 10-11 M, 마우스 PD-L1에 대해 2.797 x 10-9 M 정도의 결합력을 나타냄을 확인하였다.
실시예 13. In vivo syngeneic mouse 모델을 이용한 단독처치 항암효능 시험
In vivo syngeneic mouse 모델을 이용하여 항체 후보의 항암 효능을 확인하였다.
도 12에 따르면, MC38 subcutaneous syngeneic mouse 모델에서 성능최적화 항체 2종 및 MPDL3280A 항체를 i.p. 투여하여 종양 성장 억제 효능을 평가한 결과, PBS를 투여한 control 군과 비교하여 MPDL3280A 군은 94.3%, KL001 (PL110)군은 97.5%, 결합친화도 개선항체 KL001-13군은 98.9%으로 나타났으며, 약물에 의한 체중변화는 관찰되지 않았다.
[표 8]
Figure pat00008
TGI (% tumor growth inhibition, TGI% = (1-(T/C)) X 100 결과표
실시예 14. In vitro 효능 검증을 위한 IC50 측정시험
1) 친화도 개선 및 물성 개선 연구를 통해 도출된 후보항체들의 비교항체에 대한 in vitro 성능 개선 효과를 확인하기 위하여, Promega 사에서 제공하는 'PD-1/PD-L1 Blockade Bioassay' kit를 이용하여 순차적으로 희석된 후보항체 및 비교항체 시료들의 PD-1/PD-L1 결합저해능을 측정함으로써 저해효과에 대한 IC50 값을 검증하였다.
2) 실험은 Promega kit에서 제공하는 프로토콜에 따라 진행하였으며, 요약하면 아래와 같다.
3) Assay 실험 하루전에 37℃ water bath에서 'Thaw-and-Use PD-L1 세포'를 녹여 cell recovery 배지에 넣고 약하게 저어 혼합한 뒤, multi-channel pipette으로 white bottom assay plate에 100 μl 가량씩 분주하고, overnight incubation 실시하였다.
4) Assay 실험 당일, 상층액을 제거하고, 효능 평가를 위한 순차적으로 희석한 용액시료, 비교항체 및 후보항체 등의 시료들을 40 μl 용액부피로 각 well에 넣어준 뒤에 Thaw-and-use PD1 Effector cell (CS187105)을 냉동고에서 꺼내 37℃ waterbath에서 녹여 조심스럽게 assay buffer에 suspension 시키고, 앞서 항체시료가 처리된 well에 40 μl씩 분주하였다.
5) 6시간동안 37℃ CO2 incubator 에서 Jurkat 세포 활성화-저해 반응이 일어나게 한 뒤에 luciferase 기질이 포함되어있는 따뜻하게 가열된 Bio-Glo luciferase assay solution를 80 μl씩 각 well에 넣고 VICTOR multilabel plate reader (Perkin Elmer 사)를 이용하여 luminescence 값을 측정하였다.
도 13에 따르면, In vitro cell-based assay를 이용한 선별 항체의 IC50 값 측정을 수행하여 선별된 항체들의 성능 수준을 확인한 결과, 대부분의 친화도 개선 항체후보들이 상대적으로 비교항체인 MPDL3280A 대비 낮은 농도에서 IC50 값을 갖는 개선된 면역활성 조절성능을 가짐을 확인하였다.
[표 9] IC50 측정 실험 결과
Figure pat00009
실시예 15. In vivo 병용처치 항암효과 검증실험
1) PD-L1 면역항암 항체후보와 다른 항암제들과의 병용처치시, 항암성능평가 동물모델에서 시너지 효과가 관찰되는지 검증하기 위하여 대표적인 면역활성화 단백질인 재조합 IL-2와 CTLA-4 항체(9D9클론, BioXcell사) 및 PD-L1 타겟 후보항체(KL001-13)의 병용치료 효능 효과 검증 연구를 수행하였다.
2) KL001-13 항체의 병용치료법 개발을 위하여 MC38 마우스 대장암 세포주와 6주령 C57BL/6 male(♂) 마우스 모델을 이용하여, 그룹은 PBS, IL-2, CTLA-4, KL001-13 단독투여 4개 그룹과 IL-2+KL001-13, CTLA-4+KL001-13, IL-2+MPDL3280A, CTLA-4+MPDL3280A 병용투여 4개 그룹으로 총 8개의 그룹으로 나누어, 각 그룹당 8마리(n=8) 의 마우스들을 이용한 병용처치 실험을 수행하였다.
3) 마우스 colon cancer MC38 세포주는 70~90% cell density를 유지하여 배양 후, 0.25% Trypsin-EDTA를 처리하여 harvest하고, 1x106 cells/100 μl의 세포농도로 DMEM media(serum free)에 resuspension하여 cell viability ≥95%의 MC38 세포시료를 준비한 뒤, 2.5% Avertin으로 마취시킨 C57BL/6 마우스의 몸통 좌측에 준비된 1x106 cells/100 μl를 피하주사(subcutaneous injection)하여 실험동물 마우스 내에서 약 7~10일 동안 성장할 수 있도록 하고, 주사된 MC38 세포주의 종양 크기가 100 mm3 의 크기가 될 때까지 유지하였다. 이때 종양의 크기는 아래와 같이 계산하였다.
[종양부피 = (a2b)/2 ; a = 종양의 짧은길이, b = 종양의 큰길이]
4) 종양의 크기가 100 mm3에 도달하면 준비된 PBS, 후보항체, 비교항체 및 cytokine IL-2를 단독 및 병용으로 복강(Intraperitoneal)으로 투여(Injection) 하였고, 이때 KL001-13, MPDL3280A 및 CTLA-4 항체는 10 mg/kg (200 μg/100 μl) 농도로 3일 간격, 총 4회 단독 및 병용 투여하며, IL-2 cytokine은 1x104 IU/100 μl로 2일 간격으로, 총 5회 단독 및 병용 투여하였다. 종양 크기(mm3)는 주 3회 측정하면서 종양의 성장 추이를 관찰하였다. IL-2와 KL001-13항체의 병용효능 검증 시험에서는 IL-2의 동물 체내 짧은 반감기로 인해 동물실험시 매일 투여되는 것이 일반적이나 본 실험에서는 2일마다 소량 투여함으로써 면역활성 자극제로서의 IL-2의 기능이 PD-L1 표적 항체와 병용시너지 효과가 있는지 확인하는 것을 목표로 하였다.
도 14에 따르면, IL-2와 KL001-13 항체의 병용투여시, IL-2와 KL001-13 항체의 단독 투여시에 비해서 확연히 항암효능이 증가함을 관찰할 수 있었으며, 비교군으로 사용한 제넨텍사의 MPDL3280A 항체와 IL-2의 병용효과보다 더 우수한 항암효과를 나타냄을 관찰할 수 있었다.
도 15에 따르면, 면역검문 단백질 CTLA-4 타겟 항체(9D9클론, BioXcell사)와 KL001-13 항체의 단독 또는 병용투여 효능 검증 연구의 결과로는 CTLA-4 항체 단독투여군에 비하여 PD-L1 단독투여군에서 좋은 항암효과가 관찰되었고, 두 항체들의 병용투여시에는 암세포가 완전히 사멸되는 경우도 다수 관찰될 정도로 뛰어난 시너지 효과가 관찰되었으며, 특히 비교항체로 사용한 제넨텍사의 'MPDL3280A' 항체와 CTLA-4 항체와의 병용효능보다도 KL001-13항체의 병용효과가 더 우수함을 관찰할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 20 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 20 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 21 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 21 Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gln Thr Ile Gly Ala Gly Tyr Asp 20 25 30 Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Asn Leu Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Asp Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Arg Leu Gly 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln 115 120 125 Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140 Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly 145 150 155 160 Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala 165 170 175 Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser 180 185 190 Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val 195 200 205 Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 22 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 23 Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala 1 5 10 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 24 Ser Gly Tyr Ser Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 25 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 25 Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 26 Thr Gly Pro Thr Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 1 5 10 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 27 Thr Gly Gln Thr Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 1 5 10 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 28 Gly Asn Leu Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 29 Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 30 Ile Pro Ile Leu Gly Ile 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 31 Gly Pro Thr Ile Gly Gln Gly Tyr Asp 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 32 Gly Pro Pro Ile Gly Ala Gly Tyr Asp 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 33 Gly Gln Thr Ile Gly Ala Gly Tyr Asp 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 34 Gly Pro Gln Ile Gly Ala Gly Tyr Asp 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 35 Gly Pro Thr Ile Gln Ala Gly Tyr Asp 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 36 Gly Pro Val Ile Gly Ala Gly Tyr Asp 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 37 Gly Gln Thr Ile Gly Ala Gly Tyr Asp 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 38 Gly Pro Thr Ile Gly Ala Gly Phe Asp 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 39 Gln Pro Thr Ile Gly Ala Gly Tyr Asp 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 40 Gly Pro Thr Ile Gly Gln Gly Tyr Asp 1 5 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 41 Gly Gln Thr Ile Gly Ala Gly Tyr Asp 1 5 <210> 42 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 42 Gln Ser Tyr Asp Arg Thr Leu Gly Val Val 1 5 10 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 43 Gln Ser Tyr Asp Ser Thr Gln Gly Val Val 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 44 Gln Ser Tyr Asp Ser Thr Leu Gly Val Val 1 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 45 Gln Ser Tyr Asp Ser Thr His Gly Val Val 1 5 10 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 46 Gln Ser Tyr Asp Ser Thr Pro Gly Val Val 1 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 47 Gln Ser Tyr Asp Gln Thr Leu Gly Val Val 1 5 10 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 48 Gln Ser Tyr Asp Arg Thr Leu Gly Val Val 1 5 10 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 49 Gln Ser Tyr Asp Ser Ala Leu Gly Val Val 1 5 10 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 50 Gln Ser Tyr Asp Ser Thr Glu Gly Val Val 1 5 10 <210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 51 Gln Ser Tyr Asp Ser Thr Val Gly Val Val 1 5 10 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 52 Gln Ala Tyr Asp Ser Thr Leu Gly Val Val 1 5 10 <210> 53 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 53 Gln Ser Met Asp Ser Thr Leu Gly Val Val 1 5 10 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 54 Gln Ser Tyr Asp Ser Thr Asp Gly Val Val 1 5 10 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 55 Gly Gly Thr Phe Ser Gly Tyr Ala 1 5 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 56 Gln Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala 1 5 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 57 Ile Ile Pro Ala Leu Gly Ile Ala 1 5 <210> 58 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 58 Ile Ile Pro Ile Leu Gln Ile Ala 1 5 <210> 59 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 59 Ile Ile Pro Ile Met Gly Ile Ala 1 5 <210> 60 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 60 Ile Ile Pro Val Leu Gly Ile Ala 1 5 <210> 61 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 61 Ile Ser Pro Ile Leu Gly Ile Ala 1 5 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 62 Ile Ile Pro Ile Leu Gly Gln Ala 1 5 <210> 63 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 63 Ala Gln Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 64 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 64 Ala Arg Ser Gly His Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 65 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 65 Ala Arg Ser Gly Pro Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 66 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 66 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Ala Ala 1 5 10 <210> 67 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 67 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Met 1 5 10 <210> 68 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 68 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Val 1 5 10 <210> 69 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 69 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 70 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 70 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 71 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 71 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 72 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 72 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 73 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 73 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 74 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 74 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 75 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 75 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 76 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 76 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 77 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 77 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 78 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 78 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 79 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 79 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 80 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 80 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 81 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 81 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 82 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 82 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 83 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 83 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 84 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 84 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 85 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Sequence <400> 85 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Ala Tyr Gly Val Phe Asp His 1 5 10

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 CDR1,
    서열번호 2의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 CDR2,
    서열번호 3 또는 서열번호 11의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 CDR3,
    서열번호 5 또는 서열번호 13의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 CDR1,
    서열번호 6의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 CDR2,
    서열번호 7의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 CDR3를 포함하는, PD-L1에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역, 또는
    서열번호 1의 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 중쇄 CDR2, 및 서열번호 11의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 5의 경쇄 CDR1, 서열번호 6의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 7의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역, 또는
    서열번호 13의 경쇄 CDR1, 서열번호 6의 경쇄 CDR2, 및 서열번호 7의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 4 또는 서열번호 12의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 중쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  5. 제1항에 있어서, 서열번호 8 또는 서열번호 14의 서열과 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  6. 제1항에 있어서, 마우스 또는 인간 이외의 포유류에 교차결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 코딩하는 핵산.
  8. 제7항의 핵산을 포함하는 발현벡터.
  9. 제8항의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
  10. 다음 단계를 포함하는 PD-L1에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 제조방법:
    (a) 제9항의 세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 세포에서 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 회수하는 단계.
  11. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 다른 항암제와 투여하여 암을 예방 또는 치료하기 위한 병용 투여용 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 약물이 접합된 항체-약물 접합체(antibody-drug conjugate).
  14. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 다른 항원에 결합하는 항체가 결합된 이중항체(bispecific antibody).
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