CN110914297A - 抗人白细胞介素2抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及与人白细胞介素2(hIL‑2)结合的抗体，更具体地说，涉及与hIL‑2的特定表位特异性结合从而抑制hIL‑2与CD25结合的抗hIL‑2抗体。本发明的抗hIL‑2抗体特异性结合hIL‑2的特定表位，从而抑制hIL‑2与CD25的结合，从而使Treg细胞的扩增最小。此外，它刺激表现出抗肿瘤活性的CD8⁺T细胞和NK细胞。因此，本发明的抗hIL‑2抗体可用作新的抗癌治疗剂。

Description

抗人白细胞介素2抗体及其用途

技术领域

本发明涉及与人白细胞介素2(hIL-2)结合的抗体，更具体地说，涉及与hIL-2的特定表位特异性结合从而抑制hIL-2与CD25结合的抗hIL-2抗体。

背景技术

白细胞介素2(IL-2)是一种多效细胞因子，其在多种表达IL-2受体的淋巴细胞的存活、扩增和功能中起着至关重要的作用，所述淋巴细胞包括Treg(Foxp3⁺CD4⁺调节性T)细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)等。白细胞介素2受体(IL-2R)以高亲和力IL-2受体(IL-2R)和低亲和力IL-2受体(IL-2R)的形式存在，具体取决于其亲和力。高亲和力IL-2受体由三条链，即IL-2Rγc(CD132)、IL-2Rβ(CD122)和IL-2Rα(CD25)组成，低亲和力IL-2受体仅由IL-2Rγc和IL-2Rβ链组成(Boyman,O.,et al.,Nat Rev Immunol,2012.12(3):p.180-90)。

由于IL-2刺激具有抗肿瘤活性的CD8⁺ T细胞和NK细胞，因此它在1990年代被美国和欧洲临床用于治疗转移性黑色素瘤和转移性肾癌(Rosenberg,S.A.,J Immunol,2014.192(12):p.5451-8)。但是，IL-2治疗仅在接受该治疗的癌症患者中不到10％有效，并且涉及严重的副作用。这是因为施用的IL-2在体内的半衰期非常短，并且具有抗肿瘤活性的CD8 T细胞和NK细胞表达低亲和力的IL-2受体，因而需要大量施用IL-2。因此，血管渗漏综合征和低血压会导致多器官严重疾病(Lotze,M.T.,et al.,J Immunol,1985.134(1):p.157-66,Schwartz,R.N.,et al.,Oncology(Williston Park),2002.16(11Suppl 13):p.11-20)。另一个问题是IL-2的给药会诱导Treg细胞强烈扩增，该Treg细胞表达高亲和力的IL-2受体，并抑制CD8⁺ T细胞和NK细胞介导的抗肿瘤免疫力(Brandenburg,S.,et al.,Eur J Immunol,2008.38(6):p.1643-53；Facciabene,A.,et al.,Cancer Res,2012.72(9):p.2162-71)。克服IL-2治疗的这些缺点的方法是延长IL-2的体内半衰期，同时选择性激活表达低亲和力IL-2受体的CD8+ T细胞和NK细胞。对此已经进行了许多尝试，但是几乎没有成功(Arenas-Ramirez,N.,et al.,Sci Transl Med,2016.8(367):p.367ra166)。

近年来，已经提出了对与高亲和力IL-2受体结合的IL-2的氨基酸残基进行修饰的解决方案。然而，该方法的局限性在于它会提供对降解人工引入的氨基酸序列的蛋白酶具有免疫原性或敏感性的经修饰的IL-2(Levin,A.M.,et al.,Nature,2012.484(7395):p.529-33)。

因此，本发明人进行了广泛的努力来开发一种方法，该方法延长IL-2的体内半衰期而不会引起IL-2的非天然修饰，同时选择性地激活表达低亲和力IL-2受体的CD8⁺ T细胞和NK细胞。结果，本发明人发现，当具有特定特异性的抗IL-2单克隆抗体(mAb)与IL-2结合时，它选择性地抑制IL-2与高亲和力IL-2受体的结合，从而完成本发明。

背景技术部分中公开的信息仅用于增强对本发明的背景的理解，因此，可能不包含构成本领域普通技术人员已经知道的现有技术的信息。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种抗hIL-2抗体或其抗原结合片段，其与人白细胞介素2(hIL-2)特异性结合，并抑制hIL-2与CD25的结合。

本发明的另一个目的是提供编码抗hIL-2抗体或其抗原结合片段的核酸、包含该核酸的载体、用该载体转化的细胞以及使用它们生产抗hIL-2抗体或其抗原结合片段的方法。

本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗癌症的组合物和治疗方法，其包含抗hIL-2抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

本发明的又一个目的是提供包含抗hIL-2抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体或抗体-药物缀合物，以及包含该双特异性抗体或抗体-药物缀合物作为活性成分的用于预防或治疗癌症的组合物和治疗方法。

本发明的另一目的是提供用于癌症治疗的联合给药组合物和治疗方法，其包含抗hIL-2抗体或其抗原结合片段和免疫检查点抑制剂。

技术解决方案

为了实现上述目的，本发明提供了一种抗hIL-2抗体或其抗原结合片段，其包括：重链可变区，其包含包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链CDR3；和轻链可变区，其包含包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链CDR3。

本发明还提供了编码抗hIL-2抗体或其抗原结合片段的核酸、包含该核酸的载体、用该载体转化的细胞、以及使用它们生产抗hIL-2抗体或其抗原结合片段的方法。

本发明还提供了一种复合物，其中抗hIL-2抗体或其抗原结合片段与hIL-2结合。

本发明还提供了用于预防或治疗癌症的组合物和治疗方法，其包含抗hIL-2抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

本发明还提供了包含抗hIL-2抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体或抗体-药物缀合物，以及包含双特异性抗体或抗体-药物缀合物作为活性成分的用于预防或治疗癌症的组合物和治疗方法。

本发明还提供了用于癌症治疗的联合给药组合物和治疗方法，其包含抗hIL-2抗体或其抗原结合片段和免疫检查点抑制剂。

本发明还提供了抗hIL-2抗体或其抗原结合片段用于预防或治疗癌症的用途。

本发明还提供了抗hIL-2抗体或其抗原结合片段在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。

本发明还提供了用于增强疫苗效力的组合物，其包含抗hIL-2抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

附图说明

图1显示了测试TCB2单克隆抗体针对hIL-2的结合特异性的结果。

图2显示了hIL-2/TCB2复合物的体内免疫刺激作用。图2A示出了分析免疫细胞的频率的结果；图2B显示了分析CD4和CD8 T细胞中CD44和CD62L表达的结果；图2C是实验统计分析的结果；并且图2D显示了hIL-2/MAB602或hIL-2/TCB2复合物对免疫细胞扩增的作用以及实验统计分析的结果(**p<0.01，***p<0.001(未配对t检验))。

图3显示了使用Biacore T100获得的抗hIL-2mAb对hIL-2的亲和力的表面细胞质基因组(plasmon)共振曲线。

图4显示了hIL-2/TCB2复合物对实体瘤的作用(***p＜0.001(第12天的双向ANOVA，第14天的未配对t检验))。

图5显示了TCB2 mAb对转移性肿瘤的作用(***p＜0.001(未配对t检验))。

图6显示了hIL-2/TCB2复合物和肿瘤肽疗法的组合在B6F10黑素瘤模型中的抗肿瘤作用(***p＜0.001(双向ANOVA))。

图7显示了hIL-2/TCB2复合物和抗CTLA-4抗体的组合在CT26肿瘤模型(Balb/C结肠癌)中的抗肿瘤作用(**p＜0.01(第17天的双向ANOVA)，第24天的未配对t检验))。

图8显示了hIL-2/TCB2复合物和抗PD-1抗体的组合在MC38肿瘤模型(B6结肠癌)中的抗肿瘤作用(*p<0.05，**p<0.01(第19天的双向ANOVA，第21天的未配对t检验)。

图9显示了hIL-2/hnTCB2复合物的体内免疫刺激和实验统计分析的结果。

图10显示了hIL-2/hnTCB2复合物和抗PD-1抗体的组合在MC38肿瘤模型(B6结肠癌)中的抗肿瘤作用(*p<0.05，**p<0.01(第19天和第22天的双向ANOVA，第25天的未配对t检验))。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。通常，本文使用的术语是本领域众所周知的并且通常使用的。

在本发明中，已经努力开发一种方法，该方法延长了IL-2的体内半衰期而不会引起IL-2的非天然修饰，同时选择性地激活表达低亲和力IL-2受体的CD8⁺ T细胞和NK细胞。结果发现，当具有特定特异性的抗IL-2单克隆抗体(mAb)与IL-2结合时，其选择性地抑制IL-2与高亲和力IL-2受体的结合。

在一方面，本发明涉及抗hIL-2抗体(在说明书中称为“TCB2”)或其抗原结合片段，其特异性结合人白细胞介素-2(hIL-2)并抑制hIL-2与CD25的结合。

如本文所使用的，术语“人白细胞介素2(hIL-2)”是指与任何其他因子没有实质序列同源性的133个氨基酸的蛋白质(15.4kDa)。

如本文所使用的，术语“CD25”是指IL-2受体的IL-2Rα链。IL-2受体以高亲和力IL-2受体(IL-2R)和低亲和力IL-2受体(IL-2R)的形式存在，具体取决于其亲和力，而CD25是在低亲和力的IL-2受体中不存在，并且仅存在于高亲和力的IL-2受体中的链。

本发明中使用的术语“抗体”是指通过免疫系统中的抗原刺激产生的物质，并且其种类没有特别限制。最近，所述抗体已被广泛用于治疗疾病。由于抗体在体内和体外都非常稳定，并且半衰期长，因此其有利于大量表达和生产。而且，由于抗体本质上具有二聚体结构，因此其具有相当高的亲和力。完整的抗体具有带有两个全长轻链和两个全长重链的结构，并且每个轻链通过二硫键与每个重链连接。抗体的恒定区分为重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区具有伽马(γ)、穆(μ)、阿尔法(α)、德尔塔(δ)和艾普西隆(ε)类型，并具有伽马1(γ1)、伽马2(γ2)、伽马3(γ3)、伽马4(γ4)，阿尔法1(α1)和阿尔法2(α2)作为其子类。轻链恒定区具有卡帕(κ)和兰姆达(λ)类型。

本发明中的抗体可以包括动物来源的抗体、嵌合抗体、人源化抗体或完全人源抗体。通过用所需抗原对动物进行免疫而产生的动物源抗体当以治疗目的施用于人时，通常会触发免疫排斥反应，并且已经开发出嵌合抗体来抑制这种免疫排斥反应。通过使用基因工程方法用人抗体的恒定区替换作为引起抗同种型反应的原因的动物源性抗体的恒定区，从而形成嵌合抗体。与动物源性的抗体相比，该嵌合抗体显著改善了抗同种型反应，但是动物源性的氨基酸仍存在于其可变区中，因此它仍然包含由抗个体基因型反应引起的潜在副作用。因此它是一种已开发出以改善此类副作用的人源化抗体。这是通过嫁接CDR(互补决定区)来制造的，在嵌合抗体的可变区中的这些CDR在抗原结合到人抗体框架中起重要作用。

本文所使用的“人源化抗体”包括人源化轻链可变域免疫球蛋白和人源化重链可变域免疫球蛋白。人源化抗体可包括部分或全部源自(包括合成类似物)一个或多个人基因序列的恒定区。预期人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的靶抗原。通常，除CDR之外，人源化抗体或免疫球蛋白的所有片段或部分与天然存在或共有的(consensus)人免疫球蛋白序列的相应片段或部分基本上相同或基本上同源。在制造人源化抗体的CDR嫁接技术中，关键是要选择一种可以最好地接受动物源性抗体的CDR的优化的人抗体，并且为此，要利用抗体数据库的使用、晶体结构的分析、分子建模技术等。但是，尽管将动物源抗体的CDR移植到优化的人抗体框架中，但在相当多的情况下，由于存在一些氨基酸会影响抗原结合，而这些氨基酸却位于动物源性的抗体的框架上，因此未保留抗原结合亲和力。在这方面，可能有必要应用其他抗体工程技术来恢复抗原结合亲和力。

如本文所使用的，术语“单克隆抗体(mAb)”具有与本发明所属技术领域中通常使用的含义相同的含义，并且是指识别抗原上的单个表位的抗体，其中该抗原与抗体结合。这与多克隆抗体相反，多克隆抗体是结合相同抗原但结合抗原的不同表位的不同抗体的集合。因此，单个抗原分子可以同时与多个多克隆抗体结合，但是对抗原特异的特定单克隆抗体只能与一个分子结合。在被单个单克隆抗体分子结合后，结合的表位被封闭，因此不能再被其他单克隆抗体结合。抗体的单克隆性质特别适合用作治疗剂。这是因为这些抗体是单一的、同源的分子种类，并且因此可以非常好地表征，可以可重复生产以及纯化。这些因素使得可以生产出生物学活性可以高度准确地预测的产品。这些因素特别重要，因为这些分子必须获得当局的许可才能对哺乳动物(特别是人类)进行治疗性给药。

如本文所使用的，术语“重链”可解释为包括全长重链及其片段，该全长重链包含可变区结构域VH、三个恒定区结构域CH1、CH2、CH3和铰链，该可变区结构域VH包括具有足以赋予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。另外，如本文所使用的，术语“轻链”可解释为包括全长轻链及其片段，该全长轻链包含可变区结构域VL和恒定区结构域CL，该可变区结构域VL包括具有足以赋予抗原特异性的可变区序列的氨基酸序列。

在本发明中，抗hIL-2抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，其包含选自SEQID NOS：3、23、28、32和34的氨基酸序列；轻链可变区，其包含选自SEQ ID NOS：4、24、26和30的氨基酸序列。优选地，抗hIL-2抗体或其抗原结合片段可包括：SEQ ID NO：3的重链可变区和SEQ ID NO：4的轻链可变区；SEQ ID NO：23的重链可变区和SEQ ID NO：24的轻链可变区；SEQ ID NO：28的重链可变区和SEQ ID NO：26的轻链可变区；SEQ ID NO：32的重链可变区和SEQ ID NO：30的轻链可变区；或SEQ ID NO：34的重链可变区和SEQ ID NO：30的轻链可变区。

如本文所使用的，术语“互补决定区(CDR)”是指免疫球蛋白的重链或轻链的高变区的氨基酸序列。重链和轻链中的每一个可包含三个CDR(即，重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3；以及轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3)。CDR可以提供重要的接触残基，以使抗体与抗原或表位结合。

在本发明中，抗hIL-2抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，其包含含有SEQID NO：5的DNA序列的重链CDR1，含有SEQ ID NO：6的DNA序列的重链CDR2，以及含有SEQ IDNO：7的DNA序列的重链CDR3；和轻链可变区，其包含含有SEQ ID NO：8的DNA序列的轻链CDR1，含有SEQ ID NO：9的DNA序列的轻链CDR2和含有SEQ ID NO：10的DNA序列的轻链CDR3。

在本发明中，抗hIL-2抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，其包含含有SEQID NO：11的氨基酸序列的重链CDR1，含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链CDR2和含有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链CDR3；和轻链可变区，其包含含有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链CDR1，含有SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链CDR2和含有SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链CDR3。

如本文所使用的，术语“特异性结合”具有与本领域普通技术人员通常已知的含义相同的含义，其表明抗原和抗体彼此特异性地相互作用以引起免疫应答。在本发明中，人单克隆抗体或其片段具有将人IL-2(hIL-2)与几种其他潜在抗原区分的能力。进行该区分使得该单克隆抗体或其片段仅或在很大程度上与作为多种不同抗原的库中的潜在结合伴侣的hIL-2结合。在这方面，“在很大程度上与hIL-2结合”是指作为多种相等可得的不同抗原的库中的潜在结合伴侣的hIL-2以比hIL-2以外的抗原高至少10倍，优选50倍，优选100倍的亲和力结合。

如本文所使用的，术语“抗原结合片段”作为免疫球蛋白的完整结构的片段，是指一些多肽，其包括抗原可以结合的部分。例如，其可以是scFv、(scFv)₂、Fab、Fab'或F(ab')₂，但不受限于此。在上述抗原结合片段中，Fab具有一个抗原结合位点，该Fab是具有轻链和重链可变区、轻链恒定区和重链第一恒定区(C_H1)的结构。Fab'与Fab的不同之处在于，Fab'具有在重链CH₁结构域的C-末端包括至少一个半胱氨酸残基的铰链区。当Fab'的铰链区的半胱氨酸残基通过二硫键连接时，会产生F(ab')₂。Fv是最小的抗体片段，其仅具有重链可变区和轻链可变区，并且用于产生Fv片段的重组技术是本技术领域众所周知的。双链Fv可以具有其中重链可变区通过非共价键与轻链可变区连接的结构，并且单链Fv通常可以如在双链Fv中那样形成二聚体结构，其中重链可变区通过肽接头共价结合至轻链可变区，或者重链可变区和轻链可变区在其C-末端彼此直接连接。接头可以是包含1至100或2至50个任何氨基酸的肽接头，并且其适当的序列是本领域已知的。抗原结合片段可以使用蛋白酶获得(例如，可以用木瓜蛋白酶消化完整抗体以获得Fab片段，或者可以用胃蛋白酶消化完整抗体以获得F(ab')₂片段)，或者可以通过基因重组技术制备。本发明的抗体的抗原结合片段可以是包括一个或多个CRD的片段。

在本发明中，抗hIL-2抗体或其抗原结合片段可以诱导CD8⁺ T细胞和NK细胞的扩增。在本发明的示例中，发现根据本发明的抗hIL-2抗体诱导CD8⁺ T细胞和NK细胞的活化，并且几乎不诱导Treg细胞的扩增。

另一方面，本发明涉及编码抗hIL-2抗体或其抗原结合片段的核酸。

在本发明中，编码抗hIL-2抗体或其抗原结合片段的核酸可以包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：33的序列。具体地，编码根据本发明的抗体的重链的核酸可以包含SEQ ID NO：27、31或33的序列，和/或编码根据本发明的抗体的轻链的核酸可包含SEQ ID NO：2、25或29的序列。本发明的抗体或其抗原结合片段可以通过分离编码抗体或其抗原结合片段的核酸来重组产生。分离核酸并将其插入可复制的载体中，以导致进一步的克隆(DNA的扩增)或进一步的表达。

如本文所使用的，术语“核酸”具有广泛的含义，包括DNA(gDNA和cDNA)和RNA分子。作为核酸的基本元件的核苷酸包括天然核苷酸以及糖或碱基被修饰的类似物。可以修饰编码本发明的重链和轻链可变区的核酸的序列。此类修饰包括核苷酸的添加、缺失或非保守取代或保守取代。

本发明的核酸被解释为包括与所述核苷酸序列具有实质同一性的核苷酸序列。实质同一性是指通过使本发明的核苷酸序列与任何其他序列尽可能地比对并且使用本技术领域常用的算法分析比对的序列而显示至少80％同源性，更优选至少90％同源性，最优选至少95％同源性的核苷酸序列。

可以使用常规方法(例如，使用能够与编码抗体的重链和轻链的DNA特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离或合成编码抗体的DNA。

在另一方面，本发明涉及包含核酸的重组载体。

许多载体可用。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

如本文所使用的，术语“载体”包括质粒载体；粘粒载体；噬菌体载体；病毒载体，例如腺病毒载体，逆转录病毒载体和腺相关病毒载体，作为在宿主细胞中表达靶基因的手段。载体中编码抗体的核酸与启动子可操作地连接。

如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(例如，启动子、信号序列或转录调节因子结合位点的阵列)与另一个核酸序列之间的功能性连接，并因此该控制序列控制其他核酸序列的转录和/或翻译。

当原核细胞用作宿主时，通常包括能够促进转录的强启动子(如tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、pLλ启动子、pRλ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子和T7启动子)，用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。此外，例如，当将真核细胞用作宿主时，来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子和人肌肉肌酸启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、HSV tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、HIV LTR启动子、单株病毒的爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)启动子和劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子)可以使用，并且通常具有作为转录终止序列的聚腺苷酸化序列。

任选地，可以将载体与另一序列融合，以便于纯化从其表达的抗体。融合序列包括例如谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，美国)、麦芽糖结合蛋白(NEB，美国)、FLAG(IBI，美国)和6×His(六组氨酸；Quiagen，美国)。

载体包括本技术领域通常用作选择性标记物的抗生素抗性基因，并且可以包括例如对氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素具有抗性的基因。

在另一方面，本发明涉及用重组载体转化的细胞。用于产生本发明抗体的细胞可以是原核细胞、酵母或其他高级真核细胞，但不受限于此。

在本发明中，作为转化细胞，可以使用原核宿主细胞，例如，属于芽孢杆菌属的菌株，例如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、链霉菌(Streptomyces)、假单胞菌(Pseudomonas)(例如假单胞菌(Pseudomonas putida))、变形杆菌(Proteus mirabilis)、葡萄球菌(Staphylococcus)(例如，葡萄球菌(Staphylococcus carnosus))。

同时，对动物细胞的兴趣最大，有用的宿主细胞系的示例可能是但不限于COS-7、BHK、CHO、CHOK1、DXB-11、DG-44、CHO/-DHFR、CV1、COS-7、HEK293、BHK、TM4、VERO、HELA、MDCK、BRL 3A、W138、Hep G2、SK-Hep、MMT、TRI、MRC 5、FS4、3T3、RIN、A549、PC12、K562、PER.C6、SP2/0、NS-0、U205或HT1080。

在另一方面，本发明涉及产生抗hIL-2抗体或其抗原结合片段的方法，其包括培养细胞，从而表达根据本发明的抗hIL-2抗体或其抗原结合片段。

可以在各种培养基中培养细胞。不受限制地，商业上可获得的培养基可以用作培养基。本领域技术人员已知的所有其他基本补充剂可以适当的浓度包括在内。所选的宿主细胞已经使用了培养条件(例如温度和pH)进行表达，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。

当回收抗体或其抗原结合片段时，可以例如通过离心或超滤除去杂质，并且可以例如通过亲和色谱法纯化所得物。可以使用其他纯化技术，例如阴离子或阳离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法和羟基磷灰石色谱法。

在另一方面，本发明涉及一种复合物，其中抗hIL-2抗体或其抗原结合片段与hIL-2结合。

在另一方面，本发明涉及抗体-药物缀合物(ADC)，其包含与抗-hIL-2抗体或其抗原结合片段缀合的药物。

抗体-药物缀合物(ADC)要求在将抗癌药物递送至靶癌细胞之前，应将抗癌药物与抗体稳定结合。递送至靶标的药物应从抗体中释放，并应诱导靶标细胞死亡。为此，药物应与抗体稳定结合，同时应具有足够的细胞毒性，以在从抗体中释放时诱导靶细胞死亡。

在本发明中，抗hIL-2抗体或其抗原结合片段和包括例如抗癌药之类的药物的细胞毒性物质可以通过例如共价键、肽键等相互连接，使得它们可用作结合物或融合蛋白(其中细胞毒性物质和/或标记物质是蛋白质)。细胞毒性物质可以是对癌细胞，特别是实体癌细胞具有毒性的任何物质，并且可以选自但不限于放射性同位素、细胞毒性化合物(小分子)、细胞毒性蛋白质、抗癌剂和类似物中的一种或多种。细胞毒性蛋白可以是选自但不限于蓖麻蛋白、皂草素(saporin)、白树毒素(gelonin)、苦瓜定(momordin)、去三角梅核糖体失活蛋白(debouganin)、白喉毒素和假单胞菌毒素中的一种或多种。放射性同位素可以是选自但不限于131I、188Rh和90Y中的一种或多种。细胞毒性化合物可以选自但不限于：倍癌霉素(duocarmycin)、单甲基奥利斯他汀E(MMAE)、单甲基奥利斯他汀F(MMAF)、N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1)-氧代丙基)美登素(DM1)和PBD(吡咯并苯二氮杂)二聚体。

在本发明中，抗体-药物缀合物可以根据本发明所属技术领域中众所周知的技术获得。

在本发明中，抗体-药物缀合物可以是其中抗体或其抗原结合片段通过接头与药物结合的化合物。

在本发明中，接头可以是可裂解的接头或不可裂解的接头。

接头是在抗hIL-2抗体和药物之间连接的区域。例如，配置接头以使其在细胞内条件下可裂解，即，可通过在细胞内环境中裂解接头将药物从抗体中释放出来。

接头可被细胞内环境中存在的裂解剂(例如溶酶体或内体)裂解。接头可以是可以被细胞内肽酶或蛋白酶，例如溶酶体或内体蛋白酶裂解的肽接头。通常，肽接头具有至少两个氨基酸的长度。所述裂解剂可以包括组织蛋白酶B，组织蛋白酶D和纤溶酶，并且能够水解所述肽以使所述药物能够释放到靶细胞中。肽接头可以被在癌组织中高度表达的硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶B裂解。例如，在本发明中使用的接头可以是Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly接头。另外，肽接头也可以是Val-Cit或Phe-Lys接头，其可被例如细胞内蛋白酶裂解。

在本发明中，可裂解的接头是pH敏感的，即在某些pH值下对水解敏感。通常，pH敏感的接头在酸性条件下可水解。例如，可以使用在溶酶体中可水解的酸不稳定的接头(例如，腙，缩氨脲(semicarbazone)、硫代缩氨脲(thiosemicarbazone)、顺式乌头酰胺、原酸酯、乙缩醛、缩酮等)。

该接头在还原条件下是可裂解的(例如二硫键)。可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基-羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)形成各种二硫键接头。

在本发明中，药物和/或药物接头可以通过抗体的赖氨酸随机地缀合，或者可以在二硫键链被还原时通过暴露的半胱氨酸来缀合。在某些情况下，接头-药物可以通过基因工程标签(例如肽或蛋白质)中存在的半胱氨酸结合。遗传工程标签，例如肽或蛋白质，可以包括可以被例如类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序。上述肽或蛋白质在肽或蛋白质的羧基末端具有缺失，或者通过与间隔单元共价键合而在肽或蛋白质的羧基(C)末端具有附加。肽或蛋白质可以直接与氨基酸基序共价键合，或者可以通过与间隔单元共价键合而与氨基酸基序连接。氨基酸间隔单元由1至20个氨基酸组成，并且优选为甘氨酸单元。

接头可包括β-葡萄糖醛酸苷接头，其被存在于溶酶体中或在某些肿瘤细胞中高度表达的β-葡萄糖醛酸苷酶识别并水解。与肽接头不同，β-葡糖醛酸苷接头的优点在于其具有高亲水性，因此当其与高疏水性药物结合时可增加抗体-药物缀合物的溶解性。

另外，接头可以是不可裂解的接头。在这种情况下，可以仅通过单个步骤(抗体水解)释放药物，从而产生例如氨基酸-接头-药物缀合物。这种类型的接头可以是硫醚或马来酰亚胺基己酰基，并可以在血液中保持其稳定性。

在本发明中，药物可以是化学治疗剂、毒素、微小RNA(miRNA)、siRNA、shRNA或放射性同位素。可以将表现出药理作用的制剂的药物与抗体缀合。

化疗剂可以是细胞毒性剂或免疫检查点抑制剂。具体地，化学治疗剂可包括能够起微管蛋白抑制剂、有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA嵌入剂作用的化学治疗剂。另外，化学治疗剂可包括免疫调节化合物、抗癌剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂或其组合。

药物可以是选自但不限于美登木素、奥利斯他汀(auristatin)、氨基蝶呤、放线菌素、博来霉素、他利霉素、喜树碱、N8-乙酰基亚精胺、1-(2-氯乙基)-1,2-甲基磺酰肼、依斯匹霉素、依托泊苷、6-巯基嘌呤、多拉司汀、单端孢霉烯族毒素(tricotecene)、加利车霉素、紫杉醇(taxol)、紫杉烷、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛、甲氨蝶呤、长春新碱、长春碱、阿霉素、美法仑、丝裂霉素、丝裂霉素A、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、倍癌霉素(duocarmycin)、L-天冬酰胺酶、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、环磷酰胺、异环磷酰胺、亚硝基脲、顺铂、卡铂、丝裂霉素、达卡巴嗪、丙卡巴嗪、托泊替康、氮芥、环磷酰胺、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、双氯亚硝基脲(BCNU)、伊立替康、喜树碱、博来霉素、伊达比星、柔红霉素、更生霉素、普卡霉素、米托蒽醌、天冬酰胺酶、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀、洛莫司汀、白消安、曲奥舒凡、去卡巴嗪、依托泊苷、替尼泊苷、托泊替康、9-氨基喜树碱、克立那托、丝裂霉素C、三甲曲沙、霉酚酸、噻唑羧胺核苷、利巴韦林、5-乙炔基-1-β-D-呋核亚硝脲咪唑-4-羧酰胺(5-ethynyl-1-beta-dribofuranosylimidazole-4-carboxamide)(EICAR)、羟基脲、去铁胺、氟尿苷、去氧氟尿苷、雷替曲塞、阿糖胞苷(ara C)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟达拉滨、他莫昔芬、雷洛昔芬、甲地孕酮、戈舍瑞林、醋酸亮丙瑞林、氟他胺、比卡鲁胺、EB1089、CB1093、KH1060、维替泊芬、酞菁、光敏剂Pe4、脱甲氧基-竹红菌素A、干扰素-α、干扰素-γ、肿瘤坏死因子、吉西他滨、万柯、瑞米德(revamid)、泰拉米德(thalamid)、洛伐他汀、1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridiniumion)、星形孢菌素、放线菌素D、放线菌素、博来霉素A2、博来霉素B2、培洛霉素、表柔比星、吡柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、维拉帕米和毒胡萝卜素、核酸酶以及来源于细菌或动物/植物的毒素。

在本发明中，药物可以包括一个或多个选自以下的亲核基团：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、硫代半卡巴腙、羧酸肼和芳基酰肼基团，它们可以反应以利用接头和接头试剂上的亲电子基团形成共价键。

在另一方面，本发明涉及包含抗hIL-2抗体或其抗原结合片段的双特异性抗体。

在本发明中，双特异性抗体是指这样的抗体形式，其中抗体的两个臂之一包含根据本发明的抗hIL-2抗体或其抗原结合片段，而另一个臂包含对hIL-2以外的抗原(优选与癌症相关的抗原或免疫检查点蛋白抗原)具有特异性的抗体，或与免疫效应器细胞相关的抗原特异性结合的抗体或其抗原结合片段。

双特异性抗体中包含的除抗hIL-2抗体以外的抗体所结合的抗原是癌相关的抗原或免疫检查点蛋白抗原，其可以选自Her2、EGFR、VEGF、VEGF-R、CD-20、MUC16、CD30、CD33、CD52、4-1BB、TIM3、PD-1、PD-L1、CTLA4、BTLA4、EphB2、E-选择素、EpCam、CEA、PSMA、PSA、ERB3、c-MET等等，并且免疫效应器细胞相关抗原可选自但不限于TCR/CD3、CD16(FcγRIIIa)、CD28、CD28、CD44、CD56、CD69、CD64(FcγRI)、CD89、CD11b/CD18(CR3)等。

在另一方面，本发明涉及用于预防或治疗癌症的组合物，其包含抗hIL-2抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

在另一方面，本发明涉及用于预防或治疗癌症的组合物，其包含双特异性抗体或抗体-药物缀合物作为活性成分。

“癌症”是指一种病症，其中细胞由于调节细胞的正常分裂、分化和死亡的功能中的问题而异常过度增殖，并侵袭周围的组织和器官，从而形成肿块并破坏现有结构或使现有结构变形。“实体癌”是指具有与血液癌不同的特征的癌症，其由通过各种实体器官(包括膀胱、乳房、肠、肾、肺、脑、食道、胆囊、卵巢、胰腺、胃、子宫颈、甲状腺、前列腺、皮肤等)中的细胞的不正常生长导致的物质组成。“转移性癌症”是由癌细胞从原发癌部位分离出来，通过血液、淋巴管等转移到另一个部位，以及所转移的癌细胞增殖而引起。本发明的组合物可用于预防或治疗实体癌和/或转移性癌症。本发明的组合物可以用于预防或治疗，例如但不限于皮肤癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、肺癌、肝癌、脑癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和膀胱癌，但不受限于此。

如本文所使用的，术语“预防(preventing)/预防(prevention)”是指通过施用所述组合物来抑制癌症的转移、生长等或延迟癌症发作的所有作用。如本文所使用的，术语“治疗/治疗”是指由于施用所述组合物而导致癌症症状改善或癌症有益改变的任何作用。

本发明的组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。通常用于药物制剂的载体可以是选自但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油中的一种或多种。另外，该组合物可以进一步包含选自赋形剂、润滑剂、湿润剂、甜味剂、芳族化合物、乳化剂、悬浮液和防腐剂中的一种或多种。

抗体的组合物或药物组合物可以口服或肠胃外给药。这样的肠胃外给药包括静脉内注射、皮下注射、肌内注射、腹膜内注射、内皮给药、局部给药、鼻腔给药、肺内给药、直肠内给药等。由于蛋白质或肽在口服给药时被消化，因此优选可以配制用于口服的组合物以包被活性物质或保护其不在胃中降解。而且，可以通过任何能够将活性物质转运至靶细胞的设备来施用组合物。

抗hIL-2抗体(TCB2 mAb)在组合物中的含量可以根据各种因素而变化，各种因素例如配制方法，给药方法，年龄，体重，患者的性别或病理状况，饮食，给药时间，给药间隔，给药途径，排泄率和反应敏感性。例如，抗hIL-2抗体(TCB2 mAb)的每日给药剂量可以在0.001至1000mg/kg的范围内，特别地0.01至100mg/kg，更特别地0.1至50mg/kg的范围内，但是不受限于此。可以将抗hIL-2抗体(TCB2 mAb)的单次给药的有效剂量配制成单位剂量形式的一种制剂或配制成合适的量，或者通过注入多剂量小瓶来制备。如本文所使用的，“药学有效剂量”可以指能够表现出期望的药理作用的活性成分的含量或剂量，并且可以根据各种因素而不同地确定，各种因素例如配制方法、给药方法、年龄、身体、体重、患者的性别或病理状况、饮食、给药时间、给药间隔、给药途径、排泄率和反应敏感性。

组合物可以根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易地进行的方法，与药学上可接受的载体和/或赋形剂一起配制，并且可以以单位剂量的形式提供，或封装到多剂量小瓶中。在此，组合物的制剂可以是在油性或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆或乳剂的形式，或者可以是提取物、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂，并且可以进一步包括分散剂或稳定剂。而且，该组合物可以单独给药或与其他治疗剂组合给药。

特别地，包含抗hIL-2抗体(TCB2 mAb)的组合物包含抗体，因此可以配制成免疫脂质体。可以根据相关技术领域众所周知的方法来制备包含抗体的脂质体。免疫脂质体是包含磷脂酰胆碱、胆固醇和聚乙二醇衍生的磷脂酰乙醇胺的脂质组合物，并且可以通过反相蒸发法制备。例如，抗体的Fab'片段可以通过二硫键交换反应与脂质体缀合。

在另一方面，本发明涉及用于癌症治疗的联合给药组合物，其包含抗hIL-2抗体或其抗原结合片段和免疫检查点抑制剂。

在本发明中，免疫检查点抑制剂(也称为“检查点抑制剂”)可以是抗CTLA-4抗体或抗PD-1抗体，但不受限于此。

如本文所使用的，术语“联合给药”(也称为“组合”)是指抗hIL-2抗体或其抗原结合片段和免疫检查点抑制剂可以同时、顺序或以相反顺序施用，并且抗hIL-2抗体或其抗原结合片段和免疫检查点抑制剂可以在本领域技术人员确定的范围内以适当有效量的活性成分组合施用。

在本发明的一示例中，发现当顺序地处理根据本发明的抗CTLA-4或抗PD-1抗体和抗hIL-2抗体时，肿瘤细胞的生长被进一步抑制。

所述联合给药组合物包含抗hIL-2抗体，并且与之相关的组分与上述用于预防或治疗癌症的组合物中包含的组分相同。因此，每种构成的描述均等地适用于联合给药组合物。

在另一方面，本发明涉及预防和/或治疗癌症的方法，其包括向患者施用治疗有效量的抗hIL-2抗体或其抗原结合片段、双特异性抗体或抗体-药物缀合物的步骤。

本发明的组合物可以作为单独的治疗剂或与其他治疗剂组合给药，并且可以与常规治疗剂顺序或同时给药。

任何抗癌药，例如顺铂，都有副作用，例如恶病质、肌肉减少症、肌肉消瘦、骨质消瘦或非自愿体重减轻。因此，本发明可以包括组合物或癌症治疗方法，其在治疗癌症的同时预防、最小化或降低恶病质、肌肉减少症、肌肉消瘦、骨质消瘦或非自愿体重减轻的严重性、频率或发生。

该方法包括以下步骤：将包含有效量的本发明的抗hIL-2抗体的药物组合物和至少一种抗癌剂组合施用。在特定的实施方案中，本发明包括一种方法，该方法在治疗癌症的同时预防、最小化或降低恶病质、肌肉减少症、肌肉消瘦、骨质消瘦或非自愿体重减轻的严重性、频率或发生，该方法包括以下步骤：将包含有效量的本发明的抗hIL-2抗体的药物组合物与一种或多种已知诱导或增加恶病质、肌肉减少症、肌肉消瘦、骨质消瘦或非自愿体重减轻的严重性、频率或发生的抗癌剂向患者组合施用。

在另一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，其包括将包含抗hIL-2抗体或其抗原结合片段的组合物与免疫检查点抑制剂联合给药的步骤。

在根据本发明的治疗癌症的方法中，抗hIL-2抗体或其抗原结合片段和免疫检查点抑制剂可以同时、顺序或以相反顺序施用。优选地，该方法可以包括以下步骤：(A)用免疫检查点抑制剂治疗；(B)用抗-hIL-2抗体或其抗原结合片段治疗，但不受限于此。

免疫检查点抑制剂可以是抗CTLA-4抗体或抗PD-1抗体，但不受限于此。治疗癌症的方法包括包含抗hIL-2抗体的组合物，并且与之相关的组分与上述组合物中包含的组分相同。因此，每种构成的描述均等地适用于通过联合给药治疗癌症的方法。

在另一方面，本发明涉及抗hIL-2抗体或其抗原结合片段在预防或治疗癌症中的用途。

在另一方面，本发明涉及抗hIL-2抗体或其抗原结合片段在制备用于预防或治疗癌症的药物中的用途。

在另一方面，本发明涉及用于增强疫苗效力的组合物，其包含抗-hIL-2抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

如本文所使用的，术语“疫苗”是指含有免疫活体的抗原的生物剂，并且是指通过向人或动物施用而在体内产生免疫力的免疫原性或抗原性物质以预防感染。

实施例

在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。对于本技术领域的普通技术人员而言显而易见的是，这些实施例仅用于说明目的，而不应被解释为限制本发明的范围。

实施例1：TCB2单克隆抗体针对hIL-2的结合特异性的实验

使用体内小鼠模型评估hIL-2/TCB2 mAb复合物的治疗效果。因此，为了检查TCB2mAb是否显示出与小鼠IL-2(mIL-2)的交叉反应性，测试了TCB2 mAb针对hIL-2的结合特异性。首先，将几周内用hIL-2免疫3-4次的BALB/c小鼠脾细胞与SP/2骨髓瘤细胞融合。当杂交瘤菌落可见时，将培养上清液进行ELISA。将5μg/ml的hIL-2或mIL-2添加至PBS中并与之混合，并且将总计50μl的混合物涂覆在ELISA板上。接下来，将200μl的10％FBS添加至PBS，并在室温下孵育30分钟，以防止非特异性结合，并且将滴定剂量的单克隆抗体孵育30分钟。用抗小鼠IgG HRP或抗大鼠IgG HRP检测单克隆抗体与涂覆的hIL-2或mIL-2的结合。在每个步骤中，将板用200μl的PBS洗涤3-5次。作为阳性对照，使用可商购的单克隆抗体。Mab602用作hIL-2的阳性对照，JES6-1和S4B6用作mIL-2的阳性对照。

结果，用作hIL-2的阳性对照的Mab602显示出低的交叉反应性，而TCB2 mAb显示出与mIL-2的无交叉反应性(图1)。因此，可以看出TCB2 mAb仅特异性结合hIL-2。

实施例2：hIL-2/TCB2复合物的体内免疫刺激作用

MAB602(一种先前报道的小鼠抗hIL-2mAb)刺激了人源化小鼠中的人CD8⁺ T细胞，从而证明了hIL-2/mAb复合物在临床应用中用于抗癌免疫疗法的功效。然而，尚未公开MAB602的CDR区的序列，并且不清楚MAB602当用作hIL-2/抗-hIL-2mAb复合物时，是否是具有最大抗癌作用的抗体。因此，尝试开发出优异的hIL-2mAb，其诱导CD8⁺ T细胞和NK细胞的最大活化和Treg细胞的最小扩增。

在第0、1、2和3天，将hIL-2/TCB2 mAb(0.8μg/8μg)复合物注入B6小鼠，在第5天，分析脾CD8⁺ T细胞和Treg细胞的细胞扩增程度。hIL-2/TCB2复合物使Treg细胞和CD4 T细胞的扩增最小化，但诱导了CD8⁺ T细胞和NK细胞的强烈扩增(图2)。具体而言，当注射hIL-2/TCB2 mAb复合物时，记忆表型(MP)CD8⁺ T细胞扩增了约59倍，并且扩增的MP CD8⁺ T细胞构成了大多数CD8⁺ T细胞。NK细胞也扩增了18倍，但Treg细胞仅扩增了约5倍，这低于CD8⁺ T细胞和NK细胞的扩增程度。对于hIL-2/TCB2mAb复合物，MP CD8⁺ T细胞与扩增的Treg细胞的有效比例为970％。因此，可以看出，TCB2 mAb是一种单克隆抗体，其可选择性刺激CD8⁺ T细胞和NK细胞，而非Treg细胞。

另外，对于hIL-2/TCB2 mAb复合物，MP CD8⁺ T细胞与扩增的Treg细胞的有效比例为970％，而对于hIL-2/MAB602复合物为530％(图2D)。因此，TCB2是优于MAB602的单克隆抗体。

实施例3：TCB2对hIL-2的亲和力分析

TCB2抗体对CD8⁺ T细胞和NK细胞的选择性刺激要求该抗体与hIL-2的表位结合。由于hIL-2的表位也可以被高亲和力的IL-2R(CD25)识别，因此TCB2可能会在与IL-2Rα链结合的位点附近与hIL-2结合。由于MAB602也可能在与IL-2Rα链结合的位点附近与hIL-2结合，因此与MAB602进行了竞争性分析TCB2，以观察作为抗hIL-2mAb的TCB2的特异性。可以商购获得并且已知与MAB602所结合的表位不同的表位结合的另一种抗hIL-2mAb(5344.111)用作为对照。

为了检测hIL-2，使用了夹心ELISA。通过胺偶联将900RU(Rmax＝90)的抗hIL-2克隆固定在CM5芯片上。使hIL-2的2倍稀释液(100nM)以10μl/min的速度在芯片上流动3分钟，然后监测hIL-2的解离10分钟。

从竞争分析中发现，TCB2与MAB602竞争。结果表明，由于其特异性，TCB2 mAb没有与5344.111竞争，但与MAB602竞争。结果，证实了TCB2对人IL-2的亲和力高于其他抗hIL-2mAb(图3)。

实施例4：hIL-2/TCB2复合物的抗肿瘤作用

实施例4-1：TCB2 mAb对实体瘤的作用

为了证明TCB2 mAb对实体瘤的临床实用性，将1×10⁶B16F10黑色素瘤细胞皮下注射到B6小鼠中，然后在第4至7天注射PBS，单独的hIL-2(0.8μg)或hIL-2/TCB2(0.8μg注射/8μg)复合物。接下来，监测肿瘤进展持续7天。

结果，实体瘤生长的抑制与细胞因子诱导的CD8⁺ T细胞和NK细胞的扩增的大小相关(图4)。hIL-2/TCB2 mAb复合物比单独的hIL-2抑制肿瘤的生长更好。

实施例4-2：TCB2 mAb对转移性肿瘤的作用

为了证明TCB2 mAb对转移性肿瘤的临床实用性，将3×10⁵B16F10黑色素瘤细胞静脉内注射到B6小鼠中。肿瘤注射后7天，从第7天到第10天注射单独的hIL-2(0.8μg)或hIL-2/TCB2(0.8μ/8μg)复合物。在第18天，测量肺肿瘤结节的数量。

结果，与hIL-2不同，抑制hIL-2/TCB2很好地抑制了肺肿瘤结节(图5)。因此，可以看出，当用作hIL-2/TCB2 mAb复合物时，TCB2 mAb具有有效的抗癌作用。

实施例5：hIL-2/TCB2复合物与其他抗癌疗法的联合的效果分析

当前在世界范围内开发的抗癌疗法包括使具有肿瘤新抗原的患者免疫的方法，以及使用检查点抑制剂(例如抗CTLA-4抗体或抗PD-1抗体)的方法。在该实施例中，分析了hIL-2/TCB2复合物是否可以与这些抗癌疗法联合使用。

实施例5-1：hIL-2/TCB2复合物与基于新抗原的抗癌治疗的联合的效果

为了测试hIL-2/TCB2复合物与基于新抗原的疗法的相容性，在第0天将1×10⁶B16F10细胞皮下注射到B6小鼠中。接下来，在第3天和第7天注射PBS或TRP2肽(100μg)与Poly I：C(100μg)的混合物。在第4天到第7天和第11天到第14天，分四次每天两次注射hIL-2/TCB2复合物(0.8μg/8μg)。接下来，监测肿瘤进展持续5天。

结果，注射hIL-2/TCB2复合物和基于新抗原的疗法在相似程度上抑制了B16F10肿瘤的生长。然而，当用hIL-2/TCB2复合物和基于新抗原的疗法联合治疗小鼠时，肿瘤的生长受到更多的抑制(图6)。因此，可以看出hIL-2/TCB2复合物可以与基于新抗原的疗法联合使用。

实施例5-2：hIL-2/TCB2复合物和检查点抑制剂的联合的效果

为了测试hIL-2/TCB2复合物是否可以与检查点抑制剂联合使用，使用了CT26(Balb/C结肠癌和MC38(B6结肠癌)模型，在将hIL-2/TCB2复合物与抗CTLA-4抗体或抗PD-1抗体联合进行治疗或用这些抗体中的每一种治疗，均观察到肿瘤生长。

对于使用hIL-2/TCB2复合物与抗CTLA-4抗体联合治疗的实验，将5×10⁵CT26细胞皮下注射到Balb/C小鼠中(第0天)，从第7天起每隔3天注射3次抗CTLA-4抗体(100μg)。从第8天到第11天，每天注射一次hIL-2/TCB2复合物(0.8μg/8μg)(四次)。结果，抗CTLA-4抗体强烈抑制了CT26肿瘤的生长，并且33％的小鼠中肿瘤被排斥。与注射抗CTLA-4抗体的小鼠相比，注射hIL-2/TCB2复合物的小鼠的肿瘤生长受到的抑制较小。但是，当用抗CTLA-4抗体与hIL-2/TCB2复合物联合治疗小鼠时，肿瘤生长比用抗CTLA-4抗体治疗受到更多抑制，并且63％的小鼠肿瘤被排斥(图7)。

对于其中用hIL-2/TCB2复合物与抗PD-1抗体联合治疗小鼠的实验，将5×10⁵MC38细胞皮下注射到B6小鼠中(第0天)。然后，从第7天起每隔3天注射3次抗PD-1抗体(100μg)，从第8天至第11天每天注射hIL-2/TCB2复合物(1.5μg/15μg)(四次)。结果，用抗PD-1抗体治疗不能有效地延缓肿瘤的生长(以低于最佳剂量的剂量使用抗PD-1抗体)，但是用hIL-2/TCB2复合物治疗在37％的小鼠中强烈抑制MC38肿瘤的生长并排斥该肿瘤。当将hIL-2/TCB2复合物和抗PD-1抗体一起注射时，肿瘤在100％的小鼠中被排斥(图8)。

实施例5-3：在用hIL-2/TCB2复合物进行的免疫抗癌治疗中对记忆应答获得的影响

为了检查拒绝肿瘤的小鼠是否会获得对同一肿瘤的记忆应答，将5×10⁵MC38细胞注射到天然B6小鼠(从未接种过肿瘤)或在实施例5-2(第25天)中通过hIL-2/TCB2拒绝肿瘤的小鼠中。MC38肿瘤在注射过它的天然B6小鼠中迅速生长，但在排斥该肿瘤的小鼠中却未生长(图8)。这表明用hIL-2/TCB2复合物进行的免疫疗法对预防患者的癌症复发特别有用。

综合这些结果，可以看出，hIL-2/TCB2复合物可与检查点抑制剂(例如抗CTLA-4抗体或抗PD-1抗体)联合使用，并且与这检查点抑制剂联合使用时更有效。

实施例6：对TCB2单克隆抗体的测序

对TCB2 mAb的互补决定区(CDR)进行了测序(表1-3)。

表1：TCB2抗体可变区的DNA序列和氨基酸序列

表2：TCB2抗体的CDR DNA序列

表3：TCB2抗体的氨基酸序列

可以看出，TCB2的氨基酸序列不同于Nara1的氨基酸序列(表4)，Nara1是由OnurBoyman和Natalia Ramirez最近开发的抗hIL-2mAb抗体(WO 2016005950A1)。TCB2和Nara1之间的CDR相似性对于重链CDR 1至3分别为40％、52.94％和8.33％，对于轻链CDR 1至3为33.33％、14.28％和55.55％(表5)。

表4：Nara1抗体的CDR氨基酸序列

表5：TCB2和Nara1抗体之间的CDR氨基酸序列的比较

根据测序数据，将TCB2 mAb的Fab区克隆到IgG2表达载体中。克隆的载体的氨基酸序列示于下表6。

表6：人嵌合TCB2的氨基酸序列

实施例7：人源化TCB2抗体

为了减少宿主对小鼠IgG的免疫应答，将TCB2 mAb人源化并用人IgG1 Fc表达(表7)。将小鼠TCB2(mTCB2)的CDR引入人IgG的可变区。然后，对于体内实验，选择了具有最高亲和力的三个人源化TCB2(hnTCB2)mAb克隆(VH1+VL2，VH2+VL2和AH03463(VL03463+VH03463))(表8)。

表7：人源化TCB2的可变区的DNA序列和氨基酸序列

用下划线标出了VL03463的氨基酸序列中的与VL2中的残基不同的残基。为了比较重链区的序列，用下划线标出了VH2和VH03463中的与VH1中的残基不同的残基。VL2与VH1或VH2一起使用以表达两种不同的人源化TCB2抗体(VL2+VH1或VL2+VH2)。

表8：人源化TCB2对hIL-2的亲和力

为了比较原始小鼠TCB2、人嵌合TCB2(hcTCB2)和人源化TCB2(hnTCB2)之间的免疫细胞激活功能，允许hIL-2与不同的TCB2s(小鼠TCB2(mTCB2)、hcTCB2和hnTCB2)形成复合物。从第0天到第3天每天一次将每种复合物注射到B6小鼠中(四次)，并且在第5天，通过流式细胞术分析脾脏免疫细胞。结果表明，hnTCB2的亲和力略低于mTCB2或hcTCB2的亲和力(表8)，但是hnTCB2激活免疫细胞的功能与mTCB2相似(图9；VL2+VH2由于其功能低而未显示)。因此，证明了mTCB2被成功地人源化。

为了检查hnTCB2除具有将免疫细胞激活的功能外是否还具有抗癌活性，在第0天将5×10⁵MC38细胞皮下注射到B6小鼠中，并从第7天开始在3天间隔注射抗PD-1抗体(200μg)。接下来，从第8天到第11天每天注射hIL-2/hnTCB2(VL2+VH1，1.5μg/15μ)复合物一次(四次)，然后观察到MC38肿瘤的生长。结果，即使单独用高浓度的抗PD-1抗体治疗，肿瘤的生长也被延迟，但是当用hIL-2/hnTCB2复合物治疗小鼠时，MC38肿瘤的生长被强烈抑制到与用hIL-2/mTCB2复合物治疗所显示的水平相似的水平，并且在40％的小鼠中肿瘤被排斥。当将hIL-2/hnTCB2或hIL-2/mTCB2复合物与抗PD-1抗体一起注射时，在85％的小鼠中肿瘤被排斥(图10)。因此，证实了原始mTCB2的功能在人源化TCB2中是保守的。

工业适用性

本发明的抗hIL-2抗体特异性结合hIL-2的特定表位，从而抑制hIL-2与CD25的结合，从而使Treg细胞的扩增最小。此外，它刺激表现出抗肿瘤活性的CD8⁺ T细胞和NK细胞。因此，本发明的抗hIL-2抗体可用作新的抗癌治疗剂。

尽管已经参考特定特征详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员显而易见的是，该描述仅用于优选实施方案，并且不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物来限定。

序列表自由文本

附电子文档

<110> 基础科学研究院

浦项工科大学校产学协力团

<120> 抗人白细胞介素2抗体及其用途

<130> PP-B2037

<150> KR 10-2017-0064815

<151> 2017-05-25

<160> 34

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

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tca 363

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atcagatgca taaccagcac tgatattgat gatgatatga actggtacca gcagaagcca 120

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gggaccaagc tggaaataaa a 321

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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

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Trp Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Glu Trp Ile Gly

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Arg Ser Leu Ala Thr Arg Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly

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Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp Met Asn

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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

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Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys

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Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val

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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

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Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

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Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

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Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

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Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser

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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

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<212> PRT

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<220>

<223> 人嵌合的TCB2轻链可变区(human chimericTCB2 Light chain Variableregion)

<400> 24

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly

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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

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<223> 人源化TCB2_VL03463(humanized TCB2_VL03463)

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<211> 363

<212> DNA

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<400> 27

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atggagctga gctccctgag gagcgaagat accgctgtct actattgcgc ccgctctctg 300

gctacaagag ggttctacgc tatggattat tggggacagg ggacactggt caccgtcagc 360

agc 363

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人源化TCB2_VH03463( humanized TCB2_VH03463)

<400> 28

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

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Trp Ile Gln Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ile Gln Asn Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

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<210> 29

<211> 321

<212> DNA

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<400> 29

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gggaccaaac tggaaatcaa a 321

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Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Leu Ala Thr Arg Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

Claims (19)

1.一种抗hIL-2抗体或其抗原结合片段，其与人白细胞介素2(hIL-2)特异性结合，并抑制hIL-2与CD25的结合。

2.根据权利要求1所述的抗hIL-2抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗hIL-2抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变区，其包含：包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的重链CDR2和包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的重链CDR3；和

轻链可变区，其包含：包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的轻链CDR3。

3.根据权利要求2所述的抗hIL-2抗体，其中，所述抗体是嵌合抗体或人源化抗体。

4.根据权利要求2所述的抗hIL-2抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗hIL-2抗体或其抗原结合片段包括：

重链可变区，其包含选自SEQ ID NOS：3、23、28、32和34的氨基酸序列；和

轻链可变区，其包含选自SEQ ID NOS：4、24、26和30的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的抗hIL-2抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗hIL-2抗体或其抗原结合片段包含：

SEQ ID NO：3的重链可变区和SEQ ID NO：4的轻链可变区；

SEQ ID NO：23的重链可变区和SEQ ID NO：24的轻链可变区；

SEQ ID NO：28的重链可变区和SEQ ID NO：26的轻链可变区；

SEQ ID NO：32的重链可变区和SEQ ID NO：30的轻链可变区；或者

SEQ ID NO：34的重链可变区和SEQ ID NO：30的轻链可变区。

6.根据权利要求1所述的抗hIL-2抗体或其抗原结合片段，其中所述抗hIL-2抗体或其抗原结合片段诱导CD8+T细胞和NK细胞的扩增。

7.一种核酸，其编码根据权利要求1至6中任一项所述的抗hIL-2抗体或其抗原结合片段。

8.一种重组载体，其包含根据权利要求7所述的核酸。

9.一种细胞，其由根据权利要求8所述的重组载体转化。

10.一种产生抗hIL-2抗体或其抗原结合片段的方法，其包括培养根据权利要求9所述的细胞。

11.一种复合物，其中的根据权利要求1至6中任一项所述的抗hIL-2抗体或其抗原结合片段与hIL-2结合。

12.一种预防或治疗癌症的组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗hIL-2抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述癌症选自皮肤癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肺癌、肝癌、脑癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和膀胱癌。

14.一种双特异性抗体或抗体-药物缀合物，其包含根据权利要求1所述的抗hIL-2抗体或其抗原结合片段。

15.一种用于预防或治疗癌症的组合物，其包含根据权利要求14所述的双特异性抗体或抗体-药物缀合物作为活性成分。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述癌症选自皮肤癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肺癌、肝癌、脑癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、子宫宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和膀胱癌。

17.一种用于癌症治疗的联合给药组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗hIL-2抗体或其抗原结合片段和免疫检查点抑制剂。

18.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述免疫检查点抑制剂是抗CTLA-4抗体或抗PD-1抗体。

19.一种用于增强疫苗功效的组合物，其包含根据权利要求1至6中任一项所述的抗hIL-2抗体或其抗原结合片段作为活性成分。

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