KR20240032220A - Psma에 대한 항체 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메릭 수용체(CAR), 상기 키메릭 수용체를 포함하는 면역 세포치료제, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체(ADC), 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 진단, 예방 또는 치료용 조성물, 암의 진단, 예방 또는 치료방법 및 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합단편은 기존의 항-PSMA 항체보다 우수한 결합력을 나타내며, 목적하는 종양 또는 암의 진단, 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

PSMA에 대한 항체 및 그의 용도 {Antibodies against PSMA and Uses thereof}

본 발명은 항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이를 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터로 형질감염된 숙주세포, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메릭 수용체(CAR), 상기 키메릭 수용체를 포함하는 면역 세포치료제, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체(ADC), 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 진단, 예방 또는 치료용 조성물, 암의 진단, 예방 또는 치료방법 및 용도에 관한 것이다.

전립선암은 피부암을 제외하고 남성에게 가장 흔한 암으로서, 남성의 암으로 인한 사망의 주요한 원인이다(World Cancer Report. World Health Organization. 2014.). 전립선암은 대부분 50세 이후의 남성에게서 발생하며, 통증, 배뇨곤란, 혈뇨 등의 증상을 수반한다. 전세계적으로 매년 약 백만명 이상의 환자가 발생하며, 수십만명이 전립선암으로 사망하고 있다(CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6): 394-424.). 약 89%의 전립선암은 전립선 또는 전립선 근처의 기관에 존재하는 국소단계(local or regional stage)에서 발견되며, 이 경우 5년 생존률은 99%로 거의 100%에 가깝다. 그러나, 여전히 일부 전립선 암환자는 신체의 다른 기관으로 전이된 이후에 진단되며, 이 때 5년 생존률은 약 30%로 급격하게 감소한다(Cancer Facts & Figures 2021).

전립선 특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen, PSMA)으로 알려진 글루타메이트 카르복시펩티다아제 II(Glutamate carboxypeptidase II, GCPII)는 인간 FOLH1 (folate hydrolase 1) 유전자에 의해 코딩된 막 당 단백질이다. PSMA의 기능에 대해서는 연구가 진행중에 있으며, 최근에는 세포 표면의 단백질을 엔도솜으로 내재화할 수 있는 내재화 신호 전달계를 갖는다는 것이 보고되었다(Mol Biol Cell. 2003;14:4835-4845.) PSMA는 전립선에서 주로 발현되며, 전립선암에서 PSMA의 발현이 비 종양 세포에 비해 8~12배 이상 증가하는 것으로 보고된다 (The Prostate. 58 (2): 200-10.). PSMA의 전립선암에서의 과발현으로인해, 전립선암의 진단, 예후 및 재발 가능성 예측 및 표적 치료를 위한 주요 바이오마커로 보고된다(Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3): 571-9.). 최근에는 전립선암뿐만 아니라, 다른 악성 종양, 특히 암과 관련된 신생혈관에서도 PSMA가 발현되어, 다양한 암종의 진단 및 표적 치료를 위해 유용한 것으로 보고되고 있다(Clin Cancer Res. 1997;3:81-85; Cancer Res. 1997;57:3629-3634; Clin Cancer Res. 1999;5:2674-2681).

전립선암에 대한 임상 분야에서, PSMA의 중요성으로 인해 PSMA에 특이적으로 결합하는 항체의 개발을 위한 노력이 지속되고 있다. 7E11은 LNCaP 전립선암 세포주를 기반으로 개발된 PSMA의 세포 내 또는 세포질 에피토프에 특이적으로 결합하는 최초의 항-PSMA 항체이다(Anticancer Res. 1987;7:927-936). 항-PSMA 항체 7E11의 방사성-면역접합체 ProstaScint　 (Cytogen Corporation, Princeton, NJ)은 FDA에 전립선암의 진단 도구로 승인된 바 있다.

또한, PSMA는 전립선암의 치료 항원 표적으로서도 매우 유용하게 사용되며, 최근 항-PSMA 항체와 방사성 동위원소를 결합한 화합물이 전이성 전립선암 및 신세포암과 같은 다양한 암의 치료가 가능함이 보고된 바 있다(J Nucl Med. 2003;44:610-617; J Urol. 2003;170(6 part 2):S84-S88. discussion S88-S89). 뿐만 아니라, PSMA 특이적 단일사슬 항체를 포함하는 CAR-T세포가 PSMA 양성 전립선암 세포의 성공적인 용해를 나타낼 수 있음이 보고되었으며(Prostate. 1998;35:144-151), 재조합 항-PSMA 항체(Abgenix, Fremont, CA)가 전립선 종양세포의 항체 의존적 세포독성을 유도하여, 종양의 사멸에 직접적으로 관여할 수 있음이 보고된 바 있다(J Clin Oncol. 2004;22(14S):2546).

전립선암 치료를 위해 PSMA를 타겟팅하는 면역 항암 치료제를 포함한 고형암 치료를 위한 다양한 치료제가 개발되고 있으나, 고형암 치료에는 여러 가지 한계점이 있다. 먼저, 종양세포 주변에 면역세포, 기질세포 외의 다양한 세포들과 혈관, 세포 외 요소들(cytokines, chemokines, 성장인자 등)로 이루어진 종양미세환경(Tumor MicroEnvironment, TME)이 형성되는데, 주로 산화스트레스, 영양 고갈, 낮은 pH 상태이며 종양 관련 대식세포(Tumor-associated macrophage, TAM), 골수 유래 면역억제세포(Myeloid-derived suppressor cell, MDSC), 조절 T 세포 (Regulatory T cell, Treg) 등의 면역 억제 세포의 존재 및 면역세포 침투를 막는 세포 외 기질 등의 특성으로 인해 CAR-T 세포 치료제를 포함한 다양한 항암제가 제대로 작동하지 못한다(Front. Immunol. 2018;9:1104).

또한, 고형암은 혈액암과 달리 높고 균일하게 발현되는 특정 종양 항원(Tumor-specific antigen)을 찾는 것이 어렵다. 예를 들어, PSMA는 암 조직 뿐만 아니라 전립선, 신장 등의 정상조직에도 발현되고 있어, 면역 항암 치료제의 적용 시 정상 조직을 파괴시키는 부작용이 발생할 수 있다(Stem Cell Res Ther. 2021;12:81).

현재까지 보고된 PSMA 특이적 항체는 완벽하게 전립선 암에 특이적이지 않아 정상 전립선 조직에서 발현하고 있는 PSMA에도 결합할 수 있으며(Clin Cancer Res. 1999;5:4034-4040), 특히 전립선 암에 대한 치료용도에 있어서, PSMA를 발현하는 정상 조직에 대한 항체 치료제의 부작용을 없애기 위해, 강력하고 정확하게 표적화된 효과를 나타내기 위해서는 PSMA 단백질에 대한 결합력은 유지하되 전립선 암 조직의 종양미세환경에서 활성을 나타내는 항체 및 PSMA의 다양한 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합하는 다양한 항체의 개발이 필수적이다(Urology. 1998;51:657-662).

전립선을 포함한 인체의 정상 조직은 대부분은 pH 7.4를 유지하고 있다. 그러나 종양 주변의 미세환경에서는 여러 요인(비정상적인 당 분해, 높은 젖산 생산, 양성자 축적 등)에 의해 상대적으로 낮은 (6.5~6.8) pH를 형성하게 된다. 이로 인해, 다양한 면역/세포 치료제들이 제대로 기능을 하지 못하도록 간섭을 받는다(Cancer Res. 2012;72(16):3938-3947).

본 발명에서 STACT (Solid Tumor Adapted CAR-T therapy) 기술은 정상 조직에서 PSMA와 결합하여 발생하는 부작용은 없애고, 산성화된 종양미세환경에서 활성을 나타낼 수 있는 항체 및 면역 세포 치료제 개발을 위한 것으로, 정상 pH 환경에서는 동일한 PSMA 단백질이라도 결합하지 않으면서 종양미세환경의 낮은 pH의 환경에서 PSMA에 결합하는 항체를 개발하였다.

이러한 배경기술 아래에서, 본 발명자들은 높은 PSMA에 대한 결합친화도, 전립선암 특이성 등이 개선된 신규 항-PSMA 항체를 개발하고자 예의 노력한 결과, 높은 PSMA 친화도를 나타내는 신규 항-PSMA 항체를 동정하였으며, 특히 공지의 항-PSMA 항체보다 전립선암 세포에 더욱 민감한 반응성을 가지는 차별화된 특성을 지닌 항체를 선별하였고, 선별된 항체가 목적하는 암 치료에 사용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 신규 PSMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 또는 상기 재조합 발현벡터가 도입된 재조합 숙주세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 PSMA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 PSMA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 pH 의존적인 PSMA 결합 항체를 개발하여 종양세포의 PSMA에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역 세포 치료제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체 (ADC)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체를 포함하는 암 진단, 예방 또는 치료용 조성물 또는 암 진단, 예방 또는 치료 방법 및 용도를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음을 포함하는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:

서열번호 23 내지 26으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;

서열번호 27 내지 30으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;

서열번호 31 내지 34 및 45로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;

서열번호 35 및 37 및 46으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;

서열번호 38 내지 41, 47 및 48로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및

서열번호 42 내지 44로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3.

본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 핵산 또는 상기 재조합 발현벡터가 도입된 재조합 숙주세포를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 숙주세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및 생성된 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, PSMA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 PSMA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor, CAR)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 키메라 항원 수용체를 표면에 발현하는 면역세포를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 키메라 항원 수용체 또는 이를 표면에 발현하는 면역세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 위한 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체 (ADC)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 항체-약물 접합체를 포함하는, 암 진단, 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 항체-약물 접합체를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 항체-약물 접합체의 암 진단, 예방 또는 치료용 조성물의 제조를 위한 사용을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 항체-약물 접합체의 암 진단, 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체를 제공한다.

본 발명에 따른 항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합단편은 PSMA 항원에 대해 우수한 결합력 뿐만 아니라 종양조직 특이적인 결합을 나타내며, 동물실험에서 우수한 항암효과를 확인하여, 목적하는 종양 또는 암의 진단, 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 PSMA에 반응성을 보이는 하이브리도마 클론을 선별하기 위한 효소결합면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay;ELISA) 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 PSMA를 발현하는 암세포주를 이용하여 PSMA에 대한 결합능을 유세포분석을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 도 1과 도 2를 통해 확인된 클론을 정제한 결과이다.
도 4는 정제한 항체의 PSMA에 대한 결합능을 PSMA를 발현하는 암세포주를 이용하여 유세포분석을 통해 확인한 결과이다.
도 5는 인간항체 41B11, 42E4, 45C3 및 46D3의 전립선암 세포주에 대한 항체 결합력을 유세포분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 인간항체 44H8의 전립선암 세포주에 대한 항체 결합력을 유세포분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 5종의 PSMA CAR-T 세포 생산 후, scFv-CAR의 도입 효율을 유세포분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 5종의 PSMA CAR-T 세포와 전립선암 세포주 LNCaP 세포와 PC3 세포를 공배양하여 CAR-T 세포의 항암효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 PSMA CAR-T 세포 PB41B11, PB42E4 및 PB46D3 세포를 각각 전립선암 세포와 공배양하였을 때, CAR-T 세포에서 인터페론 감마(IFN-γ) 및 그랜자임 B(granzyme B)의 분비를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 마우스에 전립선암 세포(LNCaP)를 피하주사하고, 암세포 투여 13일 차에 PSMA CAR-T 세포인 PB-CTA-42E4를 정맥주사하여 투여하여, in vivo에서 PSMA CAR-T 세포의 항암효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 모항체인 42E4 항체의 의 PSMA 항원에 대한 결합력을 pH 7.4 및 pH 6.0에서 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 STACT 항체인 PSMA36의 PSMA 항원에 대한 결합력을 pH 7.4 및 pH 6.0에서 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 STACT 항체인 PSMA37의 PSMA 항원에 대한 결합력을 pH 7.4 및 pH 6.0에서 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 STACT 항체인 PSMA38의 PSMA 항원에 대한 결합력을 pH 7.4 및 pH 6.0에서 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 STACT CAR-T 세포의 PSMA 항원 결합력을 pH 6.0 및 pH 7.4에서 유세포분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 마우스에 전립선암 세포(LNCaP)를 피하주사하고, 암세포 투여 13일 차에 STACT CAR-T 세포인 PB-CTA-PSMA36를 정맥주사하여 투여하여, in vivo에서 STACT CAR-T 세포의 항암효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

항체(Antibodies) 또는 이의 항원 결합 단편

본 발명은 일 관점에서, 다음을 포함하는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편에 관한 것이다:

서열번호 23 내지 26으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;

서열번호 27 내지 30으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;

서열번호 31 내지 34 및 45로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;

서열번호 35 및 37 및 46으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;

서열번호 38 내지 41, 47 및 48로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및

서열번호 42 내지 44로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3.

본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다:

서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;

서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;

서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;

서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;

서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및

서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3.

본 발명의 다른 양태는 다음을 포함하는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다:

서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;

서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;

서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;

서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;

서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및

서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3.

본 발명의 또 다른 양태는 다음을 포함하는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다:

서열번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;

서열번호 27로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;

서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;

서열번호 35로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;

서열번호 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및

서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3.

본 발명의 또 다른 양태는 다음을 포함하는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다:

서열번호 24로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;

서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;

서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;

서열번호 36로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;

서열번호 40로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및

서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3.

본 발명의 또 다른 양태는 다음을 포함하는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다:

서열번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;

서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;

서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;

서열번호 36로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;

서열번호 40로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및

서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3.

본 발명의 또 다른 양태는 다음을 포함하는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다:

서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;

서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;

서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;

서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;

서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및

서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3.

본 발명의 또 다른 양태는 다음을 포함하는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편이다:

서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;

서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;

서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;

서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;

서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및

서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3.

본 발명의 또 다른 양태는 다음을 포함하는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편이다:

서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;

서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;

서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;

서열번호 37으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;

서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및

서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3.

본 발명의 또 다른 양태는 다음을 포함하는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편이다:

서열번호 26으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;

서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;

서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;

서열번호 37으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;

서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및

서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3.

본 명세서에서 사용된 용어, "항체(antibody)"는 하나 이상의 상보성 결정 영역(Complementary Decision Region, CDR)을 포함하는 항체 단백질 분자의 집합, 하나의 완전한 항체 또는 이의 유도체를 의미한다. 본 발명에서, 상기 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체는 “항-PSMA 항체” 또는 “PSMA 항체” 와 동일한 의미에서 상호호환적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 범위에는 PSMA에 특이적으로 결합하는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.

완전한 항체는 일반적으로, 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 본 발명에서, 상기 항체의 항원 결합 단편은 전립선 특이적 막 항원을 인식하여 특이적으로 결합할 수 있는 기능을 보유하는 단편을 의미한다.

항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge-region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다.

Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각에 해당한다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용하거나 (예를 들어, 완전한 형태의 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2를 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작할 수 있다.

"Fv" 단편은 완전한 항체 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 결합된 이량체이다.

"Fab" 단편은 경쇄의 가변 및 불변 도메인과, 중쇄의 가변 및 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 Fab'단편 C-말단에 존재하는 힌지 영역의 시스테인에 의해 공유적으로 연결된 한 쌍의 Fab' 단편을 포함한다.

"단일쇄 Fv (scFv)" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 구성된 구조체이다. scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함할 수 있다.

하나의 실시예에서, 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단일클론 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, scFv, Fab 단편, F(ab')2 단편, 다이설파이드-결합 Fvs (sdFv) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변영역은 감마1 (IgG1), 감마 2 (IgG2), 감마 3 (IgG3) 또는 감마 4 (IgG4)이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 형일 수 있다.

상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대해 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체와는 대조적으로, 각각의 단일클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다.

“다클론 항체(polyclonal antibody)”는 동일하거나 상이한 항원의 하나 이상의 면역원성 결정인자(immunogenic determinant) 또는 에피토프에 결합하거나 이와 반응하는 상이한 항체 분자의 조성물을 의미한다. 상기 조성물 중의 각각의 개별 항체는 상이한 것을 특징으로 할 수 있으며, 각각 특정 에피토프와 결합 또는 반응할 수 있다. 예를 들어 일반적으로, 다클론 항체는 항체의 가변 영역, 예를 들어 경쇄 또는 중쇄의 상보성 결정영역(CDR1, CDR2 및 CDR3)에 의해 다양성이 결정될 수 있다. 또한, 상기 다클론 항체는 불변 영역에 존재하는 개별 항체 분자 사이의 차이에 의한 것일 수도 있으며. 예를 들어, Human isotype IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD, 및 IgE, 또는 murine isotype IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 및 IgA과 같은 2개 이상의 상이한 항체 이소타입을 포함하는 항체의 혼합물일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 다클론 항체는 포유 동물 혈액, 분비물, 기타 체액, 생식세포 등에서 분리되거나 동정 및 정제될 수 있으며, 상이한 단일클론 항체의 혼합물을 포함할 수 있고, 재조합 다클론 항체로서 제조될 수 있다.

상기 “재조합 다클론 항체”는 재조합 기술에 의해 제조된 다클론 항체를 지칭하며, 다클론 항체 내의 각 항체 분자는 하나 이상의 에피토프로 구성된 표적 항원에 대한 원하는 결합 활성을 나타낸다.

"에피토프(epitope)"는 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정부위(determinant)를 의미한다. 에피토프는 통상 화학적으로 활성인 표면 분자군, 예를 들어 아미노산 또는 당 측쇄로 구성되며, 일반적으로 특정한 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정한 전하 특성을 갖는다. 입체적 에피토프 및 비입체적 에피토프는 변성 용매의 존재하에서 전자에 대한 결합은 소실되지만 후자에 대해서는 소실되지 않는 점에서 구별된다.

상기 "인간화" 형태의 비-인간(예: 마우스) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.

상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.

중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체(면역글로불린)뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 영역" 또는 “항체 가변 도메인”은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.

"상보성 결정 영역” (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.

"골격 영역(FR)"은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4의 4개의 FR을 갖는다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CDR1 내지 CDR3를 포함하는 중쇄 및 경쇄를 각각 2개 이상, 바람직하게는 2개 포함할 수 있다. 이때, 각 중쇄 및 경쇄에 포함된 상보성 결정영역은 독립적이며 상이할 수 있다. 바람직하게는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 동일한 중쇄 및 경쇄를 각각 2개 포함하는 동종이량체 형태일 수 있으나, 상이한 중쇄 및 경쇄를 2개 이상 포함하는 이종 이량체 형태일 수 있다.

상기 “다중특이적 항체”는 둘 이상의 항원을 인식하고 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 경우에 따라 상기 다중특이적 항체는 각각 상이한 항원에 특이적으로 결합 가능한 상보성 결정 영역을 포함하는 둘 이상의 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있다.

다중특이적(Multi-specific) 항체는 사중특이적(Tetra-specific) 항체, 삼중특이적(Tri-specific) 항체 또는 이중특이적(Bi-specific) 항체를 포함한다. 일 예로 이중특이적 항체란 서로 다른 두 종류의 항원 (표적 단백질)에 결합할 수 있는 항체를 의미하고, 유전공학 또는 임의의 방법에 의해 제조된 형태이다.

다중특이적 항체는 적어도 2 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 가지는 항체로, 다중특이적 항체에 속하는 항체들은 scFv 기반 항체, Fab 기반 항체 및 IgG 기반 항체 등으로 구분할 수 있다. 이중특이적 항체의 경우 두 개의 신호를 동시에 억제 또는 증폭시킬 수 있기 때문에 하나의 신호를 억제/증폭하는 경우보다 더욱 효과적일 수 있으며, 각각의 신호를 각각의 신호억제제로 처리했을 경우와 비교하면, 저용량 투약이 가능하며, 동일한 시간 및 공간에서의 두 개의 신호를 억제/증폭시킬 수 있다.

이중특이적 항체의 제조 방법은 널리 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 두 개의 중쇄가 상이한 특이성을 가지는 조건에서 두 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동 발현을 근간으로 한다.

scFv를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 상이한 scFv들의 VL과 VH를 각기 서로 조합하여 혼성 scFv를 heterodimeric 형태로 제조하여 디아바디(diabody)를 만들 수 있고, 상이한 scFv를 서로 연결해서 tendem ScFv를 제조할 수 있으며, Fab의 CH1과 CL을 각각의 scFv의 말단에 발현시켜 heterodimeric 미니항체(miniantibody)를 제조할 수 있고, Fc의 homodimeric 도메인인 CH3 도메인의 일부 아미노산을 치환하여 'knob into hole' 형태의 heterodimeric 구조로 변경시켜, 이들 변경된 CH3 도메인을 상이한 각각의 scFv 말단에 발현시킴으로써 heterodimeric scFv형태의 미니바디(minibody)를 제조할 수 있다.

Fab을 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 특정 항원에 대한 개별 Fab'를 이황화 결합 또는 매개체를 이용해서 서로 조합하여 heterodimeric Fab 형태로 제조할 수 있고, 특정 Fab의 중쇄 또는 경쇄의 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 발현시킴으로써 항원 결합가(valency)를 2개로 하거나, Fab과 scFv 사이에 경첩 부위(hinge region)를 둠으로써 homodimeric 형태로 4개의 항원 결합가를 가지도록 제조할 수 있다. 또한, Fab의 경쇄 말단과 중쇄 말단에 상이한 항원에 대한 scFv를 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 만든 이중표적 바이바디(bibody), Fab의 경쇄말단과 중쇄말단에 상이한 scFv를 각각 융합시킴으로써 항원에 대한 결합가를 3개로 가지도록 한 삼중 표적 바이바디, 상이한 Fab 3개를 화학적으로 접합시킴으로써 수득할 수 있다.

IgG를 기반으로 하는 이중특이적 항체의 경우, 트리온파마(Trion Pharma)사에 의해 마우스와 렛트 하이브리도마를 다시 교잡함으로써, 하이브리드 하이브리도마, 일명 쿼드로마(quadromas)를 제조하여 이중특이적 항체를 생산하는 방법이 알려져 있다. 또한, 경쇄부분은 공유하면서, 상이한 중쇄에 대해서 Fc의 CH3 homodimeric 도메인의 일부 아미노산을 변형시켜 heterodimeric 형태로 제작한 이른 바 'Holes and Knob' 형태로 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. heterodimeric 형태의 이중특이적 항체 이외에, 상이한 2종의 scFv를 IgG의 경쇄와 중쇄의 가변 도메인 대신 constant 도메인에 각각 융합 발현시켜 homodimeric 형태의 (scFv)4-IgG로 제조할 수 있다.

매우 다양한 재조합 항체 포맷, 예를 들면, 2가 이상, 3가 이상 또는 4가 이상의 이중특이적 또는 다중특이적 항체가 개발되었다. 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO2001/077342호, 제WO2009/080251호, 제WO2009/080252호, 제WO2009/080253호, 제WO2009/080254호, 제WO2010/112193호, 제WO2010/115589호, 제WO2010/136172호, 제WO2010/145792호, 제WO2010/145793호 및 제WO2011/117330호에 기재된 2가 이상, 3가 이상 또는 4가 이상의　항체도 포함한다. 2가 이상, 3가 이상 또는 4가 이상의 항체는 각각 2개 이상의 결합 도메인, 3개 이상의 결합 도메인 또는 4개 이상의 결합 도메인이 항체 분자에 존재한다는 것을 표시한다.

본 발명에 따른 항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전립선 특이적 막항원에 높은 결합친화력을 갖는 항체를 선별 및 동정한 것으로, 전립선암 세포에 높은 특이성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음 경쇄 CDR1 내지 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:

서열번호 23 내지 26으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;

서열번호 27 내지 30으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;

서열번호 31 내지 34 및 45로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편은 다음 중쇄 CDR1 내지 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 중 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:

서열번호 35 및 37 및 46으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;

서열번호 38 내지 41, 47 및 48로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및

서열번호 42 내지 44로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3.

본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 12, 14, 16, 18, 20, 21 및 53으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 13, 15, 17, 19, 22 및 54 내지 56으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항체는 다음으로 구성되는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 조합을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:

i) 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 가변 영역;

ii) 서열번호 14로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역;

iii) 서열번호 16으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 17로 표시되는 중쇄 가변 영역;

iv) 서열번호 18로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 19로 표시되는 중쇄 가변 영역;

v) 서열번호 20으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 22로 표시되는 중쇄 가변 영역;

vi) 서열번호 21로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 22로 표시되는 중쇄 가변 영역;

vii) 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 54로 표시되는 중쇄 가변 영역;

viii) 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 55로 표시되는 중쇄 가변 영역; 및

ix) 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 56으로 표시되는 중쇄 가변 영역.

scFv는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄로 이루어진 구조체로, 항체 단편이다. scFv가 항원 결합을 위해 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함할 수 있다.

하나의 실시예에서, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 단일쇄 Fv (scFv)에서 VH 및 VL 도메인은 링커를 통해 연결될 수 있다. 서열번호 23 내지 34의 경쇄 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역은 서열번호 35 내지 44로 표시되는 중쇄 CDR을 포함하는 중쇄 가변영역과 연결될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 실시예의 표 2에 개시된 각 단일 클론 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 링커는 펩타이드 링커일 수 있으며, 약 10-25 aa 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 글리신 및/또는 세린과 같은 친수성 아미노산이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 링커는 예를 들어, (GS)_n, (GGS)_n, (GSGGS)_n 또는 (G_nS)_m (n, m은 각각 1 내지 10)을 포함할 수 있으나, 상기 링커는 예를 들어 (G_nS)_m (n, m은 각각 1 내지 10)일 수 있다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 PSMA를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 항-PSMA 항체의 서열뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 구성된다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 기재된 각 서열번호로 표시되는 서열은 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NCBI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.

이에 기초하여, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 명세서에 기재된 서열 전체 또는 일부와 비교하여 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 상동성을 가질 수 있다. 이러한 상동성은 당업계에 공지된 방법에 의한 서열 비교 및/또는 정렬에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 서열 비교 알고리즘(즉, BLAST 또는 BLAST 2.0), 수동 정렬, 육안 검사를 이용하여 본 발명의 핵산 또는 단백질의 퍼센트 서열 상동성을 결정할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산을 분리하여 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 재조합적으로 생산할 수 있다.

"핵산"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다. 본 발명의 중쇄 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산의 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실, 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다.

상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산은 통상적인 분자생물학적 수법을 사용하여 (예를 들어, 완전한 항체, 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 핵산(예, DNA)과 특이적으로 결합할 수 있는 올리코뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성할 수 있으며, 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나(핵산의 증폭) 또는 추가로 발현시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 1 내지 11 및 서열번호 49 내지 52로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

이를 바탕으로, 본 발명은 또 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다.

벡터의 성분으로는 일반적으로 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 항생제 내성 마커 유전자, 증강인자 요소, 프로모터, 전사 종결 서열. 항체를 코딩하는 핵산은 프로모터 및 전사 종결 서열 등과 같이 작동적으로 연결될 수 있다.

"작동적으로 연결"은 핵산 발현조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 따라 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 핵산 또는 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 벡터는 형질전환 또는 형질감염 등의 방법으로 숙주세포에 도입될 수 있다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다. 상기 벡터를 도입하기 위해, 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산(DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션(lipofection) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절 가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름 에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.

에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다.

다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO, CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 항-PSMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산이 직접적으로 숙주세포의 게놈에 도입되어 염색체 상 인자로서 존재할 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 있어 상기 유전자를 숙주세포의 게놈 염색체에 삽입하여서도 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 경우와 동일한 효과를 가질 것은 자명하다 할 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 상기 숙주세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 숙주세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 전립선 특이적 막 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조방법에 관한 것이다.

상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다.

상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.

키메라 항원 수용체(Chimeric Antigen Receptor; CAR)

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 키메라 항원 수용체는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 구성된 단일 쇄 가변 단편(single chain variable fragments; scFv)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 용어, '키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor; CAR)'는 표적 항원 및 해당 항원을 발현하는 세포에 대하여 특이적인 면역반응을 유도할 수 있도록 유전학적으로 조작된 수용체 단백질이다. CAR는 세포외 도메인, 막통과 도메인 및 신호전달 도메인을 포함한다. 암세포의 표면에 발현되는 암세포 표면 항원을 특이적으로 인식하는 수용체가 포함된 CAR 유전자를 면역세포에 인위적으로 도입하여, 암세포를 사멸시킬 수 있다. CAR를 발현하는 면역세포는 유전학적 방법을 통해 제작할 수 있다. 이러한 면역세포에는 T 세포, 자연살해(Natural killer;NK)세포, 대식세포(macrophage)일 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다. CAR가 도입된 면역세포는 CAR의 항원결합도메인과 결합할 수 있는 항원을 발현하는 암세포를 표적하여 면역반응을 일으킬 수 있다.

1세대 CAR에서는 암세포에서 특이적으로 발현하는 항원 인식 부위를 포함하는 세포외 도메인, 막통과 도메인 및 신호전달 도메인을 포함하고, 신호전달 도메인으로서 CD3ζ만을 이용하였는데, 암에 대한 치료 효과가 미미하였고, 지속시간이 짧다는 문제가 있었다. 이러한 1세대 CAR는 미국등록특허 제6,319,494호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입된다.

면역세포에 대한 반응성 향상을 위하여 보조자극 도메인(CD28 또는 CD137/4-1BB)과 CD3ζ를 결합한 2세대 CAR가 제조되었는데, 1세대 CAR와 비교하여 체내에 잔존하는 CAR 유전자를 발현하는 면역세포의 수가 현저히 증가하였다. 2세대 CAR는 한 가지의 보조자극 도메인을 이용한 것에 반해, 3세대 CAR에서는 두 가지 이상의 보조자극 도메인을 이용하였다. 생체 내 CAR를 포함하는 면역세포의 확장 및 지속성 달성을 위해 보조자극 도메인으로 4-1BB, CD28 또는 OX40 등을 이용할 수 있다. 2세대 CAR는 미국등록특허 제7,741,465호, 제7,446,190호 또는 제9,212,229호에 구체적으로 기재되어 있고, 3세대 CAR는 미국등록특허 제8,822,647호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입된다.

4세대 CAR에서는 IL-12 또는 IL-15와 같은 사이토카인을 암호화하는 추가 유전자를 포함하여, 이러한 사이토카인이 면역세포에서 추가로 발현될 수 있도록 하여 T세포의 활성을 증가시킴과 동시에 선천 면역세포등을 끌어들여 활성화시킬 수 있는 형태이다.

5세대 CAR는 면역세포 강화를 위해 인터루킨 리셉터 체인, 예를 들어, IL-2Rβ를 추가로 포함한다. 4세대 CAR는 미국등록특허 제10,316,102호, 5세대 CAR는 미국등록특허 제10,336,810호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입된다.

본 발명에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 막통과 도메인(transmembrane domain; TM)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 키메라 항원 수용체에 포함될 수 있는 막통과 도메인은 상기 세포외 도메인과 신호전달 도메인을 세포막 사이로 연결 가능하다면 어떠한 것이든 사용 가능하다. 바람직하게는 상기 막통과 도메인은 CD28 유래의 막통과 도메인 및/또는 CD8 유래의 막통과 도메인으로 이루어지며, 상기 CD28 유래의 막통과 도메인 및/또는 CD8 유래의 막통과 도메인의 전체 또는 일부를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 신호전달 도메인(signaling domain)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 신호전달 도메인은 면역세포의 세포막 안쪽, 즉 세포질에 위치하게 되는 부분으로서, 세포외 도메인에 포함된 항원 결합 도메인이 표적 항원에 결합하였을 때, 세포 내에 신호 전달하여 면역세포의 면역반응을 활성화시키는 부위를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 신호전달 도메인은 신호전달 도메인 및/또는 보조자극(co-stimulatory) 신호전달 영역을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 신호전달 도메인은 CAR가 위치한 면역세포의 기능에 대한 활성화를 유도할 수 있다. 예를 들어 사이토카인의 분비를 통해 세포용해 T 세포 활성화 또는 헬퍼 T 세포의 활성화를 유도할 수 있다. 상기 신호 전달 도메인은 효과기 기능 신호를 형질도입하기에 충분한 신호전달 도메인의 절단된 단편을 포함할 수 있다.

상기 신호전달 도메인으로 항원 수용체 관여 후 신호 전달을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 T 세포 수용체(TCR) 및 공동-수용체의 세포질이 포함될 수 있다.

TCR 단독을 통해 생성된 신호는 T 세포의 완전한 활성화를 위해 불충분하고 공동자극 신호가 필요하다는 것이 또한 알려져 있다. 따라서, T 세포 활성화에 TCR을 통해 항원-의존성 일차 활성화를 개시하는 것 및 이차 또는 공동자극 신호를 제공하도록 항원-의존성 방식으로 작용하는 것이 관여할 수 있다. 일차 세포질 신호전달 서열은 자극성 방식 또는 억제성 방식으로 TCR 복합체의 일차 활성화를 조절한다. 자극성 방식으로 작용하는 일차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체의 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. 일차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예로는 CD3 zeta(ζ), TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d를 포함할 수 있다.

보조자극 신호전달 영역은 보조자극 분자의 신호전달 도메인을 포함하는 CAR의 일부분을 의미한다. 예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS 림프구 기능-관련된 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 키메라 항원 수용체는 2개 이상의 신호전달 도메인을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 2개 이상의 신호전달 도메인을 포함하는 경우에는 신호전달 도메인들이 서로 직렬로 연결될 수 있다. 또는 2~10 아미노산으로 이루어지는 올리고 펩티드 링커 또는 폴리펩티드 링커를 통해 연결되어 있을 수도 있고, 이러한 링커 서열의 예로서 글리신-세린 연속 서열을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 신호전달 도메인은 CD28 또는 4-1BB의 보조자극 신호전달 영역 및 CD3 zeta의 신호전달 도메인으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 면역세포의 면역 기능 촉진 인자를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 면역세포의 면역 기능 촉진 인자는 인터루킨 신호 서열(interleukin signal sequence)인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 인터루킨 신호 서열은 IL(interleukin)-12, IL-8 또는 IL-2 발현을 유도하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 면역세포 중 T 세포의 면역 기능 촉진 인자로는 IL-7 또는 CCL19를 예로 들 수 있으며, T 세포의 면역 기능 촉진 인자와 관련하여 WO 2016/056228 A를 참조할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 JAK 결합 모티프 및 STAT 3/5 회합 모티프를 포함하는 인터루킨 수용체 사슬(interleukin receptor chain)을 추가로 포함할 수 있으며, IL-2Rβ를 그 예로 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 관련하여, WO 2016/127257 A를 참조할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 키메라 항원 수용체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 키메라 항원 수용체 코딩 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 바이러스에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, “바이러스”는 암의 치료 등에 사용하기 위해, 본 발명의 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 변형된 것을 의미한다. 유전적으로 변형되었다는 것은 세포에서 전체 유전자 재료로 DNA 또는 RNA의 형태로 외부 유전자 재료를 부가하는 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 키메라 항원 수용체를 표면에 발현하는 면역세포에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 면역세포는 면역을 유도하여 목적하는 암 치료 효과를 유발할 수 있는 것으로, 예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, 사이토카인 유도 살해세포(Cytokine Induced Killer cell, CIK), 마크로파지 및 수지상세포로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 T 세포인 것을 특징으로 할 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포는 CAR-T 세포(Chimeric Antigen Receptor T Cell), CAR-NK 세포(Chimeric Antigen Receptor Natural Killer Cell) 또는 CAR-NKT 세포(Chimeric Antigen Receptor Natural killer T Cell) 등일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 T 세포는 세포독성 T 림프구(Cytotoxic T lymphocyte; CTL); 종양 침윤 림프구(Tumor infiltrating lymphocyte; TIL) 및 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cell; PBMC)에서 분리한 T 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, “암”과 “종양”은 동일한 의미로 사용되며, 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 의미한다.

본 발명의 조성물로 치료할 수 있는 암 또는 암종은 특별히 제한되지 않으며, 고형암 및 혈액암을 모두 포함한다. 바람직하게는 고형암일 수 있으며, 이러한 암의 예로는 전립선암, 흑색종 등의 피부암, 간암, 간세포암(hepatocellular carcinoma), 간세포성암, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 이자암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 골육종, 신경아세포종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 신경모세포종 및 신경교종으로 구성된 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 바람직하게는, 상기 암은 PSMA 단백질이 발현 또는 과발현된 것을 특징으로 하며, 전립선암, 유방암, 췌장암, 폐암, 갑상선암, 위암, 난소암, 대장암, 간암, 담낭암, 신장암, 자궁경부암, 방광암, 급성골수성백혈병 또는 다발성골수종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다. 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 키메라 항원 수용체 또는 이를 발현하는 면역세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 암 치료를 위한 상기 면역세포의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 암 치료용 약제 제조를 위한 상기 면역세포의 사용에 관한 것이다.

상기 대상체는 종양을 가진 포유류일 수 있으며, 구체적으로는 인간일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역세포 또는 이를 포함하는 조성물은 경구투여, 주입(infusion), 정맥내 투여(intravenous injection), 근육내 투여(intramuscular injection), 피하 투여(subcutaneous injection), 복강내 투여(intraperitoneal injectoon), 직장내 투여(Intrarectal administration), 국소 투여(topical administration), 비내 투여(intranasal injection) 등으로 투여될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 암 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

STACT를 위한 항체

본 발명의 일 양태에서는 STACT(solid tumor adapted CAR-T therapy) 형태를 위하여, 정상 pH에서는 PSMA 단백질에 결합이 낮아지며, 종양미세환경(Tumor microenviroment, TME)의 낮은 pH에서 PSMA에 대한 특이적인 결합력을 유지할 수 있는 항체를 개발하였다.

산성환경(low pH)에서 결합하는 항체의 개발을 위하여, PSMA CAR-T 세포인 PB-CTA-42E4 클론의 중쇄 및 경쇄 CDR 서열의 특정 아미노산을 히스티딘으로 치환하여, STACT 항체(PSMA36, PSMA37 및 PSMA38)를 제작하였으며, PSMA 항원에 대한 결합력을 pH 7.4 및 pH 6.0에서 확인한 결과, STACT 항체인 PSMA36, PSMA37 및 PSMA38는 pH 6.0에서 PSMA 항원에 더 높은 결합력을 나타내는 것을 확인하였다(도 12~14). 아울러, 상기 항체에 대한 STACT CAR-T 세포를 제작하고, STACT CAR-T 세포의 PSMA 항원 결합력을 pH 6.0 및 pH 7.4에서 유세포분석으로 확인한 결과, STACT CAR-T 세포는 pH 7.4에서는 PSMA 항원과 특이적인 결합이 일어나지 않고, pH 6.0에서만 PSMA 항원과 특이적인 결합을 하는 것을 확인하였다(도 15).

따라서, 본 발명에 따른 STACT 항체는 종양미세환경에서 PSMA에 대한 우수한 결합력을 나타내어, 우수한 암치료효과를 기대할 수 있다.

따라서, 본 발명의 STACT 항체(PSMA36, PSMA37 및 PSMA38)는 pH 4~7에서 PSMA 항원과 결합특이성을 가지는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 pH 5.5~6.8에서 높은 항원 결합 특이성을 가지는 것을 특징으로 하고, 더욱 바람직하게는 5.8~6.5에서 결합 특이성을 갖는 것을 특징으로 한다.

항체-약물 접합체 (ADC)

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체 (ADC)에 관한 것이다.

본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 특이적으로 인식하고 결합하는 PSMA는 전립선암 세포 및 일부 암 세포에서 높은 수준으로 상향 조절되는 것으로 보고되며, 따라서, 상기 본 발명의 항체-약물 접합체는 PSMA를 발현하는 세포, 특히 PSMA의 발현이 상향조절된(과발현된) 암세포를 표적으로 할 수 있다.

항체-약물 접합체는 표적 암세포로 항암 약물을 전달하기 전까지 항암 약물이 항체에 안정적으로 결합되어 있어야 한다. 표적으로 전달된 약물은 항체로부터 유리되어 표적 세포의 사멸을 유도할 수 있다. 이를 위해서는 약물이 항체에 안정적으로 결합함과 동시에 표적 세포에서 유리될 때는 표적 세포의 사멸을 유도할 충분한 세포독성을 가져야 한다.

하나의 실시예에서, 상기 항체는 링커를 통하여 약물에 결합될 수 있다. 상기 링커는 항-PSMA 항체와 약물 사이를 연결하는 부위로, 세포내 조건에서 절단 가능한 형태 즉, 세포 내 환경에서 항체에서 약물이 방출될 수 있도록 하며, 항체의 긴 반감기를 반영하여 항체가 전신 순환 중에는 안정하고, 링커와 약물의 결합이 항체의 안정성 및 약물 동태에 영향을 주지 않아야 한다.

상기 링커는 예를 들어 절단성 링커 또는 비절단성 링커를 포함할 수 있다. 절단성 링커의 경우 펩타이드 링커와 같이 세포 내 펩티다아제 또는 프로테아제 효소 예를 들어 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제에 의해 절단될 수 있고, 비절단성 링커의 경우 예를 들어 티오에테르 링커는 항체가 세포내 가수분해에 의해 비선택적으로 분해된 후에 약물이 방출될 수 있다.

하나의 실시예에서, 상기 절단성 링커는 펩타이드 링커를 포함할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 적어도 2개 이상의 아미노산 길이를 가진다. 예를 들어, Val-Cit, Val-Ala, 또는 Val-Cit의 디펩티드 또는 Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly가 포함될 수 있다. 링커의 예시는 국제특허출원공개 제WO2004/010957호에 구체적으로 기재되어 있으며, 본 발명에 참조로서 도입될 수 있다.

상기 항체-약물 접합체는 표적 암세포의 항원에 ADC의 항체영역이 결합하여 ADC-항원 복합체를 형성한 후 엔도좀-리소좀 경로로 암세포 내부로 내포화될 수 있다. 이 경우 세포 독성 약물의 세포 내 방출은 엔도솜/리소좀의 내부 환경에 의해 조절된다.

하나의 실시예에서, 상기 절단성 링커는 pH 민감성으로, 특정 pH 값에서 가수분해에 민감할 수 있다. 일반적으로, pH 민감성 링커는 산성 조건에서 가수분해될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해될 수 있는 산성 불안정 링커 예를 들어, 하이드라존, 세미카바존, 티오세미카바존, 시스-아코니틱 아마이드 (cis-aconitic amide), 오르쏘에스테르, 아세탈, 케탈 등일 수 있다.

다른 실시예에서, 상기 링커는 환원 조건에서 절단될 수도 있으며, 예를 들어 이황화 링커가 이에 해당할 수 있다. SATA (N-succinimidyl-S-acetylthioacetate), SPDP (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate), SPDB (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)butyrate) 및 SMPT (N-succinimidyl-oxycarbonyl-alpha-methyl-alpha-(2-pyridyl-dithio)toluene)를 사용하여 다양한 이황화 결합이 형성될 수 있다. 이러한 이황화 링커는 세포내 글루타치온의 티올과 이황화 교환에 의해 분해될 수 있다.

상기 약물 및/또는 약물-링커는 항체의 라이신을 통해 무작위로 접합되거나, 이황화 결합 사슬을 환원하였을 때 노출되는 시스테인을 통해 접합될 수 있다. 경우에 따라서, 유전공학적으로 제작된 태그 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질에 존재하는 시스테인을 통해 링커-약물이 결합될 수 있다. 상기 유전공학적으로 제작된 태그 예를 들어, 펩타이드 또는 단백질은 이소프레노이드 트랜스퍼라제에 의하여 인식될 수 있는 아미노산 모티프를 포함할 수 있다. 상기 펩타이드 또는 단백질은 카복시 말단에서 결실(deletion)을 가지거나, 펩타이드 또는 단백질의 카복시(C) 말단에 스페이서 유닛의 공유결합을 통한 부가를 갖는다.

상기 펩타이드 또는 단백질은 아미노산 모티프와 바로 공유결합되거나 스페이서 유닛과 공유결합되어 아미노산 모티프와 연결될 수 있다. 상기 아미노산 스페이서 유닛은 1 내지 20개의 아미노산으로 구성되며, 그 중에서 글리신(Glycine) 유닛이 바람직하다.

상기 이소프레노이드 트랜스퍼라제는 예를 들어, 파네실트랜스퍼라제 (FTase, farnesyl protein transferase) 또는 게라닐게라닐트랜스퍼라제 (GGTase, geranylgeranyl transferase)일 수 있고, FTase 및 GGTase I은 앞서 언급한 화학식 1 중 CAAX 모티프를 인식할 수 있고, GGTase II는 XXCC, XCXC 또는 CXX 모티프(여기서 C는 시스테인이고, A는 지방족 아미노산이고, X는 이소프레노이드 트랜스퍼라제의 기질 특이성을 결정하는 아미노산이다)를 인식할 수 있다.

또 다른 실시예에서, 상기 링커는 리소좀에서 다수 존재하거나, 또는 몇몇 종양세포에서 과발현되는 베타-글루쿠로니데이즈(β-glucuronidase)에 의해 인식되어 가수분해 되는 베타-글루쿠로나이드 링커를 포함할 수 있다. 펩타이드 링커와는 달리 친수성(hydrophilicity)이 커서 소수성의 성질이 높은 약물과 결합시 항체-약물 복합체의 용해도를 증가시킬 수 있는 장점을 지닌다.

이와 관련하여, 국제특허출원공개 제WO2015/182984호에 개시된 베타-글루쿠로나이드 링커, 예를 들어 자가-희생기 (self-immolative group)를 포함하는 베타-글루쿠로나이드 링커를 사용할 수 있으며, 위 문헌은 참조로 도입된다.

경우에 따라서, 상기 링커는 예를 들어 비절단성 링커일 수 있으며, 세포 내에서 항체 가수분해 한 단계만을 통해 약물이 방출되어, 예를 들어 아미노산-링커-약물 복합체를 생산한다. 이러한 유형의 링커는 티오에테르기 또는 말레이미도카프로일기 (maleimidocaproyl group)일 수 있고, 혈액 내 안정성을 유지할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 항체의 이황화 결합 사슬을 환원하였을 때 노출되는 시스테인을 통해 링커-약물이 무작위 결합 또는 서열 GGGGGGGCVIM을 가지는 항체 말단 결합 펩타이드를 도입하여 링커-약물이 결합될 수 있다.

상기 약물 (화학식 (1)의 D 포함)은 약리학적 효과를 나타내는 제제로 항체에 결합될 수 있으며, 구체적으로 화학요법제, 독소, 마이크로 RNA (miRNA), siRNA, shRNA 또는 방사성 동위원소일 수 있다. 상기 화학요법제는 예를 들어, 세포독성 제제 또는 면역억제제일 수 있다. 구체적으로 마이크로투불린 억제제, 유사분열 억제제, 토포이소머라아제 억제제, 또는 DNA 인터컬레이터로서 기능할 수 있는 화학요법제를 포함할 수 있다. 또한, 면역조절 화합물, 항암제, 항바이러스제, 항박테리아제, 항진균제, 구충제 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

이러한 약물에는 예를 들어, 마이탄시노이드, 오리스타틴 (MMAE, MMAF 포함), 아미노프테린, 악티노마이신, 블레오마이신, 탈리소마이신, 캄프토쎄신, N8-아세틸 스퍼미딘, 1-(2 클로로에틸)-1,2-다이메틸 술포닐 하이드라자이드, 에스퍼라마이신, 에토포사이드, 6-머캅토퓨린, 돌라스타틴, 트리코테센, 칼리케아미신, 탁솔(taxol), 탁산, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 A, 미토마이신 C, 클로람부실, 듀오카마이신, L-아스파라기나제(L-asparaginase), 머캡토퓨린(mercaptopurine), 티오구아닌(thioguanine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 시타라빈(cytarabine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 니트로소우레아(nitrosourea), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 미토마이신(mitomycin), 다카바진(dacarbazine), 프로카바진(procarbazine), 토포테칸(topotecan), 질소 머스터드(nitrogen mustard), 사이톡산(cytoxan), 에토포시드(etoposide),5-플루오로우라실(5-fluorouracil), CNU(bischloroethylnitrosourea), 이리노테칸(irinotecan), 캄포토테신(camptothecin), 블레오마이신(bleomycin), 이다루비신(idarubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 닥티노마이신(dactinomycin), 플리카마이신(plicamycin), 미톡산트론(mitoxantrone), 아스파라기나제(asparaginase), 비노렐빈(vinorelbine), 클로로람부실(chlorambucil), 멜파란(melphalan), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 부설판(busuLfan), 트레오설판(treosulfan), 데카바진(decarbazine), 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 토포테칸(topotecan), 9-아미노캠프토테신(9-aminocamptothecin), 크리스나톨(crisnatol), 미토마이신 C(mitomycin C), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 티아조퓨린(tiazofurin), 리바비린(ribavirin), EICAR(5-ethynyl-1-beta-Dribofuranosylimidazole-4-carboxamide), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 데프록사민(deferoxamine), 플룩수리딘(floxuridine), 독시플루리딘(doxifluridine), 랄티트렉세드(raltitrexed), 시타라빈(cytarabine(ara C)), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 플루다라빈(fludarabine), 타목시펜(tamoxifen), 라록시펜(raloxifene), 메게스트롤(megestrol), 고세렐린(goserelin), 류프롤리드 아세 테이트(leuprolide acetate), 플루타미드(flutamide), 바이칼루타마이드(bicalutamide), EB1089, CB1093, KH1060, 베르테포르핀(verteporfin), 프탈로시아닌(phthalocyanine), 광감작제 Pe4(photosensitizer Pe4), 데메톡시-하이포크레린 A(demethoxy-hypocrellin A), 인터페론-α(Interferon-α), 인터페론-γ(Interferon-γ), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 겜사이타빈(Gemcitabine), 벨케이드(velcade), 레발미드(revamid), 탈라미드(thalamid), 로바스타틴(lovastatin), 1-메틸-4-페닐피리디늄 이온(1-methyl-4-phenylpyridiniumion), 스타우로스포린(staurosporine), 악티노마이신 D(actinomycin D), 닥티노마이신(dactinomycin), 블레오마이신 A2(bleomycin A2), 블레오마이신 B2(bleomycinB2), 페플로마이신(peplomycin), 에피루비신(epirubicin), 피라루비신(pirarubicin), 조루비신(zorubicin), 마이토산트론(mitoxantrone), 베라파밀(verapamil) 및 탑시가르긴(thapsigargin), 핵산 분해 효소 및 세균이나 동식물 유래의 독소로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경우에 따라서, 상기 약물은 링커 및 링커 시약 상의 친전자성 기와 공유결합을 형성하기 위해 반응할 수 있는 아민, 티올, 히드록실, 히드라지드, 옥심, 히드라진, 티오세미카바존, 히드라진 카르복실레이트, 및 아릴히드라지드기로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 친핵기를 포함할 수 있다.

암의 진단, 예방 및/또는 치료용 조성물

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 진단용 조성물에 관한 것이다.

전립선 특이적 막 항원이 전립선암을 비롯한 다양한 암의 진단을 위한 바이오마커로 사용할 수 있음은 많은 문헌을 통해 보고된 바 있다(Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3): 571-9.; Clin Cancer Res. 1997;3:81-85; Cancer Res. 1997;57:3629-3634; Clin Cancer Res. 1999;5:2674-2681). 뿐만 아니라, PSMA가 전립선암의 재발 가능성을 높은 정확도로 예측할 수 있음이 보고된 바 있다.

본 발명에 있어서, 상기 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 상태를 정확하게 파악하는 것을 의미한다. 예를 들어, 특정 질병 또는 질환에 대한 대상의 상태는 특정 질병 또는 질환에 대한 감수성(susceptibility), 현재 대상이 앓고 있는 질환의 판정뿐만 아니라, 대상의 예후(prognosis), 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 감수성 및 반응성에 대한 예측과 같은 질환의 특성에 대한 확인, 특정 약물의 치료 효을 확인하기 위해 대상의 상태를 확인하는 것과 같이 환자의 질병 및 상태에 따른 적절한 처치의 근거를 얻는 것, 나아가 특정 질병 또는 질환으로부터 완치된 대상에서의 재발 여부의 예측 및 확인을 포함하는 광의의 의미로 사용된다. 본 발명에 있어서, 바람직하게는, 상기 진단은 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하는 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 질환은 암으로, 고형암 및 혈액암을 모두 포함한다. 바람직하게는 고형암일 수 있으며, 이러한 암의 예로는 전립선암, 흑색종 등의 피부암, 간암, 간세포암(hepatocellular carcinoma), 간세포성암, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 이자암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 골육종, 신경아세포종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 신경모세포종 및 신경교종으로 구성된 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 바람직하게는, 상기 암은 PSMA 단백질이 발현 또는 과발현된 것을 특징으로 하며, 전립선암, 유방암, 췌장암, 폐암, 갑상선암, 위암, 난소암, 대장암, 간암, 담낭암, 신장암, 자궁경부암, 방광암, 급성골수성백혈병 또는 다발성골수종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "예후"는 의학적 귀추(예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대한 예상을 의미하며, 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 예후)를 포함하며, 상기 음성적 예후는 재발, 종양 성장, 전이, 약 저항성 등의 병의 진행 또는 치명성(mortality)을 포함하고, 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 종양 퇴행 등의 질병의 개선 또는 안정화(stabilization)를 포함한다.

본 발명에 있어서, 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 난소암으로 진단받은 환자의 병의 경과(병의 진행, 개선, 위암의 재발, 종양 성장, 약 저항성)를 미리 짐작하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출을 위해 방사성 동위원소, 형광염료와 같은 신호 분자와 연결된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 전립선 특이적 막 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 암의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 예를 들어, (a) 본 발명에 따른 전립선 특이적 막 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포의 약학적 유효량; 및 (b) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 또는 상기 키메라 항원 수용체를 포함하는 면역세포를 암 환자에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

"예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 암의 성장을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 암 발전의 억제, 종양의 경감 또는 암의 제거를 의미한다.

본 발명에 있어서, 본 발명에 있어서, 용어 '암'은 '종양'과 동일한 의미로 사용되며, 본 발명에 따른 예방 또는 치료용 조성물은 고형암(solid cancer) 및 혈액암을 포함한 모든 종류의 암에 적용이 가능하다. 고형암이란 혈액암과는 달리 장기(organ)에서 덩어리를 이루어 형성된 암을 의미하며, 대부분의 장기에서 발생하는 암이 이에 해당된다.

본 발명의 조성물로 치료할 수 있는 암 또는 암종은 특별히 제한되지 않으며, 고형암 및 혈액암을 모두 포함한다. 바람직하게는 고형암일 수 있으며, 이러한 암의 예로는 전립선암, 흑색종 등의 피부암, 간암, 간세포암(hepatocellular carcinoma), 간세포성암, 위암, 유방암, 폐암, 난소암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 이자암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 식도암, 담도암, 고환암, 직장암, 두경부암, 경추암, 요관암, 골육종, 신경아세포종, 섬유육종, 횡문근육종, 성상세포종, 신경모세포종 및 신경교종으로 구성된 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 바람직하게는, 상기 암은 PSMA 단백질이 발현 또는 과발현된 것을 특징으로 하며, 전립선암, 유방암, 췌장암, 폐암, 갑상선암, 위암, 난소암, 대장암, 간암, 담낭암, 신장암, 자궁경부암, 방광암, 급성골수성백혈병 또는 다발성골수종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다.

경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "약학적 유효량"은 암 또는 자가면역질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 예방 또는 치료용 조성물은 암, 면역 질환 또는 감염성 질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있으며, 예를 들어, 하나 이상의 다른 면역요법제, 화학요법제, 항체치료제 등과 병용 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 항암 요법 예를 들어, 방사선 요법, 직접적인 수술 요법, 식이요법과 같은 다양한 치료요법과 병행하여 투여되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 하나 이상의 항암제와의 병용하여 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 인간 PSMA 단백질에 대한 항체 개발

인간 PSMA에 대한 항체 생산을 위한 항원으로 PSMA 단백질(Acrobiosystems, Catalog #PSA-H52H3, Human PSMA / FOLH1 Protein, His Tag)을 이용하였다. 항원 100㎍을 Freund's Adjuvant(Sigma-Aldrich, Catalog #F5506, Freund's Adjuvant, Incomplete)과 혼합하여, H2L2 마우스(Harbour BioMed)의 복강에 주사하였다. 2주 간격으로 항원 100㎍을 PBS (Phosphate-Buffered Saline)에 희석하여 3회 복강주사 하였다. 3회 주사 후 3일 뒤 마우스의 비장을 적출하여 마우스 B세포를 분리하였다. 분리한 림프구를 마우스 골수종 유래 세포주인 SP2/0-Ag14(ATCC, Catalog #CRL-1581)와 5:1 비율로 혼합하고 PEG-1500(Roche, Catalog #10783641001, Polyethylene Glycol 1500)을 이용하여 SP2/0-Ag14 세포와 마우스의 B세포를 융합시켰다. 융합된 세포를 HAT supplement(Sigma-Aldrich, Catalog #H0262, HAT Media Supplement (50Х) Hybri-Max)가 포함된 배지에 배양하여 융합된 세포(하이브리도마, Hybridoma)를 선택적으로 선별하여 배양하였다. 얻어진 하이브리도마는 효소결합면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; ELISA)를 통해 항원과 결합하는 항체를 생산하는 세포인지를 확인하였다. 실험 방법은 다음과 같다. 항원으로 인간 PSMA 단백질(Acrobiosystems, Catalog #PSA-H52H3, Human PSMA / FOLH1 Protein, His Tag) 혹은 정제된 His tag 단백질을 1㎍/㎖의 농도로 Costar 96-웰 플레이트(Corning, Catalog #3590,96-well Clear Polystyrene Microplates)에 상온에서 2시간 동안 고착시켰다. His tag 단백질은 항체 생산을 위해 사용한 항원에 his tag이 결합되어 있기 때문에 PSMA에만 결합하고 his tag 단백질에는 결합하지 않는 항체를 선별하기 위해 사용하였다. 고착시킨 후 PBS-T(0.05% Tween20이 포함된 PBS) 완충액 300㎕로 3회 세척 후 1% BSA/PBS 완충액 300㎕을 넣어 상온에서 1시간 동안 blocking한다. Blocking한 플레이트를 3회 세척 후 하이브리도마 배양액을 넣고 상온에서 2시간 동안 항원과 반응시켰다. 3회 세척 후 2차 항체로 염소 항-Rat IgG-HRP 항체(Invitrogen, Catalog #31470, Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP)를 1% BSA/PBS 용액에 1:5,000으로 희석하여 넣고 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 3회 세척 후 TMB(SurModics, Catalog #TMBC-1000-01, TMB Conductivity One Component HRP Microwell Substrate)을 넣고 상온에서 5분간 발색하였으며, 1N 황산(Duksan, Catalog #255)을 추가하여 발색을 정지시켰다. Microplate reader(TECAN, Catalog #Infinite F50)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 OD₄₅₀ 값 0.7이상의 클론 14개를 선별하였다(도 1).

실시예 2: 개발된 항체의 세포 결합능 평가: 유세포 분석

인간 PSMA는 세포 표면에 발현되는 단백질이기 때문에 개발된 항체들이 PSMA를 발현하는 림프절 전이의 인간 전립선 선암세포에서 유래한 LNCaP(Lymph Node Carcinoma of the Prostate)세포에 결합하는지 여부를 도 1에서 선별된 14개 clone의 하이브리도마 배양액을 이용하여 유세포 분석을 통해 확인하였다. 실험 방법은 5x10⁵ 개의 세포와 하이브리도마 배양액 1 mL을 4 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 완충액(BD, Catalog #554656, Stain Buffer (FBS))로 2회 세척하였다.

형광이 결합 되어 있는 2차 항체(Invitrogen, catalog #A-11006, Goat anti Rat IgG(H+L) Cross-Absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488)와 1시간 동안 반응시켰다. 이후 완충액(BD Biosciences, Catalog #554656, Stain Buffer(FBS))으로 2회 세척한 후 유세포장비(BD FACSAriaII)를 이용하여 샘플을 분석하였다. 14개 클론 중 PSMA와 강하게 결합하는 8개의 clone을 선별하였으며 선별 기준은 형광 중앙값(median) 5000 이상이다. 실험에서 세포만 분석한 샘플과 2차 항체만 반응시킨 세포를 음성대조군으로 뒀으며, 양성대조군은 시중에서 판매되는 항체(LSBio, Calog # LS-C150527, Monoclonal Mouse antiHuman FOLH1 / PSMA Antibody (clone 107.1A4)를 사용하였다(도 2).

8개의 clone은 세포 연속 희석을 통해 단일 세포 클로닝을 진행하여 단일 클론 세포 선별을 진행하였다. 5번의 세포 연속 희석을 통해 하나의 세포에서 인간 PSMA 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 6개의 clone을 선별하였다. 선별된 6 개의 단일클론 하이브리도마 배양액에서 Protein G Agarose bead (Amicogen, Catalog #2010100, rProtein G Agarose Resin)를 이용하여 정제한 후 SDS-PAGE를 통해 확인하였다(도 3). 정제된 6개의 항체를 PSMA를 발현하는 세포주(LNCaP)를 이용하여 PSMA로의 결합 여부를 유세포 분석을 통해 확인하였다. 5x10⁵ 개 LNCaP 세포와 정제된 항체 2㎍을 4 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 완충액 (BD Biosciences, Catalog #554656, Stain Buffer (FBS))으로 2회 세척하였다. 이 세포는 형광이 결합 되어 있는 2차 항체(Invitrogen, catalog #A-11006, Goat anti Rat IgG(H+L) Cross-Absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488)와 1시간 동안 반응시켰다. 이후 완충액(BD Biosciences, Catalog#554656, Stain Buffer (FBS))로 2회 세척한 후 유세포장비(BD FACSAriaII)를 이용하여 샘플을 분석하였다. 그 결과 5개의 클론 모두 PSMA를 발현하는 LNCaP세포에 결합하는 것을 확인하였고, 이 중 46H11은 다른 클론들에 비해 LNCaP 세포에서 발현하는 PSMA와 친화도가 낮음을 확인하였다. 친화도의 기준은 형광 중앙값(median) 5000을 기준으로 선별하였다. 이 실험에서 세포만 분석한 샘플과 2차 항체만 반응시킨 세포를 음성대조군으로 뒀으며, 양성대조군은 시중에서 판매되는 항체를(LSBio, Catalog # LS-C150527, Monoclonal Mouse antiHuman FOLH1 / PSMA Antibody (clone 107.1A4)를 사용하였다. 이 결과를 바탕으로 46H11을 제외한 5개 클론의 서열을 분석하였다(도 4).

실시예 3: 각 클론 항체의 서열 분석

실시예 2에서 선별한 5개 항체 클론의 서열을 분석하였다.

서열분석 방법은 각 단일클론 하이브리도마에서 RNA를 추출한 후 cDNA를 합성하여 마우스 공급업체인 Harbour biomed사로부터 제공받은 프로토콜에 따라 진행하였다. PCR을 통해 VH 영역과 VL 영역을 각각 증폭시킨 후 gel extraction 과정을 거쳐 TA cloning을 하였다. TA cloning은 pJet1.2 cloning vector(Thermo, Catalog #K1232, CloneJET PCR Cloning Kit)에 했으며 서열은 코스모진텍을 통해 확인하였다. 확인된 서열은 IMGT 사이트(imgt.org)에서 CDR영역을 분석, 비교하여 표 1과 같은 결과를 얻었으며, 구체적인 아미노산 서열 및 CDR 서열은 표 2 내지 표 4와 같다.

유전자 서열

클론	서열		서열 번호
PSMA #41B11	LC	gatattgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgcatagtaatggatacaactatttggattggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatttgggttctaatcgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaagctctacaaactcctccgacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa	1
	HC	gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaactattactggtagtggtggtggcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaccacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaaggctactatggttcggggagttattattcctggtactacttctacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca	2
PSMA #42E4	LC	gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggttccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcaatttattactgtcagcagcgtagctactggcctctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa	3
	HC	Caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgacggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccagttatgatatcagctgggtgcgacaggccactggacaagggcttgagtggatgggatggatgaacccttacagtggtcacacaggctctgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacctccataagcacagccttcatggagctgcgcagcctgacatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaggcggtggatatagtggctacgatgatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttca	4
PSMA #44H8	LC	gatattgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgcatagtaatggatacaactatttggattggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatttgggttctaatcgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaagctctacaaactcctccgacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa	5
	HC	gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctgggaagtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaactattactggtagtggtggtggtacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaaggctactatggttcggggagttattattcctggtactacttctacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca	6
PSMA #45C3	LC	gatattgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctacatagtaatggatacaactatttggattggtacctgcagaagccagggcagtctccacagctcctgatctatttgggttctaatcgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaagctctacaaactcctccgacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa	7
	HC	gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcacctttagcagctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaactattagtggtagtggtggtggcacatactacgcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaccacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaaggctactatggttcggggagttattattcctggtactacttctacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca	8
PSMA #46D3	LC1: GAS	gaaatagtgatgacgcagtctccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcaacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggtatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagttcactctcaccatcagcagtctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtataataactggcctccgatcaccttcggccaagggacacgactggagattaaa	9
	LC2: KAS	gacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggccagtcagattattagtagctggttggcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctataaggcgtctagtttagaaagtggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgattttgcaacttattactgccaacagtataatagttattctccgtggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaa	10
	HC	caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcactagttatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaatagatactatgaagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctatgtattactgtgcgagagattattttcttcgcagtggctgggacggggtctactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca	11

항체 아미노산 서열

클론	서열		서열 번호
PSMA #41B11	LC	DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPPTFGQGTKVEIK	12
	HC	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTITGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKTTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGYYGSGSYYSWYYFYGMDVWGQGTTVTVSS	13
PSMA #42E4	LC	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWFQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAIYYCQQRSYWPLTFGGGTKVEIK	14
	HC	QVQLVQSGAEVKKPGASVTVSCKASGYTFTSYDISWVRQATGQGLEWMGWMNPYSGHTGSAQKFQGRVTMTRDTSISTAFMELRSLTSEDTAVYYCARGGGYSGYDDAFDIWGQGTMVTVSS	15
PSMA #44H8	LC	DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPPTFGQGTKVEIK	16
	HC	EVQLLESGGGLVQPGKSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTITGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGYYGSGSYYSWYYFYGMDVWGQGTTVTVSS	17
PSMA #45C3	LC	DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPPTFGQGTKVEIK	18
	HC	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKTTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGYYGSGSYYSWYYFYGMDVWGQGTTVTVSS	19
PSMA #46D3	LC1: GAS	EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPITFGQGTRLEIK	20
	LC2: KAS	DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQIISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSPWTFGQGTKVEIK	21
	HC	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNRYYEDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAMYYCARDYFLRSGWDGVYFDYWGQGTLVTVSS	22

항체의 CDR 서열(VL)

항체		VL
		Light	CDR1	서열번호	CDR2	서열번호	CDR3	서열번호
PSMA	41B11	Igκ	QSLLHSNGYNY	23	LGS	27	MQALQTPPT	31
	44H8	Igκ	QSLLHSNGYNY	23	LGS	27	MQALQTPPT	31
	45C3	Igκ	QSLLHSNGYNY	23	LGS	27	MQALQTPPT	31
	46D3	Igκ	QSVSSN	24	GAS	28	QQYNNWPPIT	32
			QIISSW	25	KAS	29	QQYNSYSPW	33
	42E4	Igκ	QSVSSY	26	DAS	30	QQRSYWPLT	34

항체의 CDR 서열(VH)

항체		VH
		Heavy	CDR1	서열번호	CDR2	서열번호	CDR3	서열번호
PSMA	41B11	IgG1	GFTFSSYA	35	ITGSGGGT	38	AKGYYGSGSYYSWYYFYGMDV	42
	44H8	IgG1	GFTFSSYA	35	ITGSGGGT	38	AKGYYGSGSYYSWYYFYGMDV	42
	45C3	IgG1	GFTFSSYA	35	ISGSGGGT	39	AKGYYGSGSYYSWYYFYGMDV	42
	46D3	IgG1	GFTFTSYG	36	IWYDGSNR	40	ARDYFLRSGWDGVYFD	43
	42E4	IgG1	GYTFTSYD	37	MNPYSGHT	41	ARGGGYSGYDDAFDI	44

실시예 4: 5종 항-PSMA 항체의 전립선암 세포주에 대한 항체 결합력 확인

전립선암 세포주(pancreatic cancer cell line)에 대한 5종 항체의 결합력을 확인하였다.

HEK293 세포주(ATCC CRL-1573)를 이용하여 인간 항체를 생산하고, 분리 정제하였다.

서열이 확인된 5종의 인간 항체(41B11, 44H8, 45C3, 46D3 및 42E4)의 VL region은 pFUSE2ss-CLIg-hK(InvivoGen, Catalog #pfuse2ss-hclk)에 삽입하여 5종의 DNA plasmid-VL를 제작하였고, VH region은 pFusess-CHIg-hG1(InvivoGen, #pfusess-hchg1)에 삽입하여 DNA plasmid-VH를 제작하여 항체 생산에 사용하였다. 5종의 경쇄 및 중쇄 DNA plasmid를 각각 ExpiCHO Expression system kit (Gibco, Catalog #A29133)를 이용하여 항체를 생산하고, 생산된 항체는 Protein G Agarose bead (Amicogen, Catalog #2010100, rProtein G Agarose Resin)를 이용하여 정제하였다.

상기 정제된 인간항체 41B11, 44H8, 45C3, 46D3 및 42E4 2㎍을 각각 PSMA 양성 세포주인 LNCaP 세포(ATCC, CRL-1740-LUC2) 및 PSMA 음성 세포주인 PC3 세포(ATCC, CRL-1435-LUC2)와 4℃에서 1시간 반응시켰다. 완충액(BD Biosciences, Catalog#554656, Stain Buffer (FBS))으로 2회 세척한 후 각 세포는 형광이 결합 되어 있는 2차 항체 (Biolegend, catalog #366903, PE anti-human IgG Fc Recombinant Antibody)와 1시간 동안 반응시켰다. 이 후 완충액(BD Biosciences, Catalog#554656, Stain Buffer (FBS))로 2회 세척한 후 유세포장비(BD FACSAriaII)를 이용하여 샘플을 분석하였다.

그 결과 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 5개 클론은 모두 강하게 LNCaP 세포(PSMA 양성)와 결합하였으며, PC3 세포와는 결합하지 않았다.

실시예 5: PSMA CAR-T 세포의 제작

PSMA에 결합하는 항체 (scFv)를 세포의 표면에 발현하면서 세포 내부에 신호전달 도메인을 가지는 렌티바이러스 벡터를 제작하였다. 인간 말초혈액단핵구 세포 (PBMC, Lonza)를 IL7과 IL15이 포함된 TexMACS 배지 (Miltynyi Biotec.)에 부유시키고, TransAct (Miltenyi Biotec, CD3와 CD28 agonist에 결합된 polymeric nanomatrix)를 더하여 G-REX 6 well plate (WILSONWOLF)에 seeding 하여 세포를 활성화시키고, 24시간 후에 렌티바이러스 벡터를 처리한다. 48시간 후에, IL7과 IL15이 포함된 TexMACS 배지를 추가로 넣어 주고 3~4일마다 새 배지로 교환하면서 10일간 추가 배양한다. 이 후, 5x10⁵ 개 CAR-T 세포에 FITC-PSMA 단백질 (Acro Biosystems, Catalog#. PSA-HF244, FITC-Labeled Human PSMA / FOLH1 Protein, His Tag) 500ng을 처리하고 4℃에서 1시간 반응시켰다. 이 후, 완충액(BD Biosciences, Catalog#554656, Stain Buffer (FBS))으로 2회 세척한 후 유세포장비(BD FACSAriaII)를 이용하여 샘플을 분석하였다. 그 결과, 5종의 항체에 대해 제작한 CAR-T 세포에 렌티바이러스 유래의 scFv-CAR 유전자가 도임된 비율을 도 7에서와 같이 확인하였다.

실시예 6: PSMA CAR-T 세포의 전림선암 세포주에 대한 세포 살상 효과 확인

실시예 5에서 제작한 5종의 PSMA CAR-T 세포(PB-CTA-41B11, PB-CTA-44H8, PB-CTA-45C3, PB-CTA-42E4 및 PB-CTA-46D3)와 전립선암 세포주 LNCaP 세포와 PC3 세포를 공배양하여 CAR-T 세포의 항암효과를 확인하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, PSMA를 표면 발현하는 전립선암 세포주 LNCaP 에 대하여, 5종의 PSMA CAR-T 세포 모두에서 살상효과를 나타내었으며, PSMA를 표면에 발현하지 않는 전립선암 세포인 PC3 세포에 대하여는 항암효과를 나타내지 않았다.

실시예 7: PSMA CAR-T 세포의 싸이토카인 분비 확인

PSMA CAR-T 세포 PB-CTA-41B11, PB-CTA-42E4 및 PB-CTA-46D3 세포를 각각 전립선암 세포와 공배양하였을 때, CAR-T 세포에서 인터페론 감마(IFN-γ) 및 그랜자임 B(granzyme B)의 분비를 확인하였다. 양성대조군으로는 항-PSMA scFv를 포함하는 CAR-T 세포인 PSMA-PC (WO2019/191728A1 특허 중 SEQ. NO. 1과 2를 인용하여 직접 제작함. 나머지 서열은 자사의 CAR-T 세포와 동일하게 사용)를 사용하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 3종의 CAR-T 세포가 양성대조군인 PSMA-PC보다 IFN-γ 및 그랜자임 B 분비능이 우수한 것을 확인하였다

실시예 8: in vivo 에서 PSMA CAR-T 세포의 항암 효과 화인

마우스 ( NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1sug/JicKoat, 수컷, 5주령, 코아텍)에 전립선암 세포(LNCaP) 5x 10⁶개를 피하주사하고, 암세포 투여 13일 차에 PSMA CAR-T 세포인 PB-CTA-42E4 5x 10⁶개를 정맥주사하여 투여하여 한후, 28일간 관찰하였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, PB-CTA-42E4 투여 그룹(2번 및 3번 개체)에서 종양이 완전히 사라지는 것을 확인하였다.

음성대조군인 1번 개체에서는 지속적으로 종양이 잔존하여 있었으며, 음성대조군인 4번 개체에서는 초기 암 생착이 제대로 되지 않아 시간이 지날수록 ivis 이미지 신호가 감소하였다.

실시예 9: 추가 변이를 통한 PSMA 항체 개선

STACT (solid tumor adapted CAR-T therapy)를 위하여는 종양미세환경(Tumor microenviroment, TME)의 낮은 pH에서는 타겟 항원에 대한 높은 결합력이 유지되면서 정상 pH 환경에서는 타겟 항원에 대한 결합력이 낮은항체를 개발하였다.

낮은 pH에서만 특이적으로 PSMA에 대한 결합력이 높은 항체를 개발하기 위하여, PSMA CAR-T 세포인 PB-CTA-42E4 클론의 중쇄 및 경쇄 CDR 서열의 특정 아미노산을 히스티딘으로 치환하여, STACT 항체를 제작하였다.

3종의 STACT 항체(PSMA36, PSMA37, PSMA38)는 42E4 클론의 DNA plasmid-VL의 CDR3의 3번 아미노산 R 잔기를 H 잔기로 치환하여 3종의 STACT 항체의 DNA plasmid-VL로 사용하였고 PSMA36의 DNA plasmid-VH는 42E4의 DNA plasmid-VH의 CDR1의 6번 아미노산 S 잔기를 H 잔기로 치환하여 제작하였고, PSMA37의 DNA plasmid-VH는 42E4의 DNA plasmid-VH의 CDR2의 4번 아미노산 Y 잔기를 H 잔기로 치환하여 제작하였고, PSMA38의 DNA plasmid-VH는 42E4의 DNA plasmid-VH의 CDR2의 5번 아미노산 S 잔기를 H 잔기로 치환하여 제작하여 항체 생산에 이용하였다. 서열의 잔기 치환은 Phusion Site-Directed Mutagenesis Kit (Thermo, Catalog #F541)을 이용하여 수행하였다.

PB-CTA-42E4에서 변이시킨 항체 서열을 표 5에 나타내었다.

표 6 및 표 7에는 STACT 항체 PSMA36, PSMA37 및 PSMA38의 CDR 서열을 나타내었다.

변이된 STACT 항체의 CDR 서열(VL)

항체		VL
		Light	CDR1	서열번호	CDR2	서열번호	CDR3	서열번호
PSMA	42E4	Igκ	QSVSSY	26	DAS	30	QQRSYWPLT	34
	PSMA36	Igκ	QSVSSY	26	DAS	30	QQ H SYWPLT	45
	PSMA37	Igκ	QSVSSY	26	DAS	30	QQ H SYWPLT	45
	PSMA38	Igκ	QSVSSY	26	DAS	30	QQ H SYWPLT	45

변이된 STACT 항체의 CDR 서열(VH)

항체		VH
		Heavy	CDR1	서열번호	CDR2	서열번호	CDR3	서열번호
PSMA	42E4	IgG1	GYTFTSYD	37	MNPYSGHT	41	ARGGGYSGYDDAFDI	44
	PSMA36	IgG1	GYTFT H YD	46	MNPYSGHT	41	ARGGGYSGYDDAFDI	44
	PSMA37	IgG1	GYTFTSYD	37	MNP H SGHT	47	ARGGGYSGYDDAFDI	44
	PSMA38	IgG1	GYTFTSYD	37	MNPY H GHT	48	ARGGGYSGYDDAFDI	44

STACT 항체 유전자 서열

클론	서열		서열 번호
PSMA #36	LC	gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggttccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcaatttattactgtcagcagcacagctactggcctctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa	49
	HC	caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgacggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcacccactatgatatcagctgggtgcgacaggccactggacaagggcttgagtggatgggatggatgaacccttacagtggtcacacaggctctgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacctccataagcacagccttcatggagctgcgcagcctgacatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaggcggtggatatagtggctacgatgatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttca	50
PSMA #37	LC	gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggttccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcaatttattactgtcagcagcacagctactggcctctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa	49
	HC	caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgacggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccagttatgatatcagctgggtgcgacaggccactggacaagggcttgagtggatgggatggatgaaccctcacagtggtcacacaggctctgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacctccataagcacagccttcatggagctgcgcagcctgacatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaggcggtggatatagtggctacgatgatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttca	51
PSMA #38	LC	gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagctacttagcctggttccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctcatctatgatgcatccaacagggccactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcaatttattactgtcagcagcacagctactggcctctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa	49
	HC	caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgacggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccagttatgatatcagctgggtgcgacaggccactggacaagggcttgagtggatgggatggatgaacccttaccacggtcacacaggctctgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacctccataagcacagccttcatggagctgcgcagcctgacatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaggcggtggatatagtggctacgatgatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttca	52

STACT 항체 아미노산 서열

클론	서열		서열 번호
PSMA #36	LC	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWFQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAIYYCQQHSYWPLTFGGGTKVEIK	53
	HC	QVQLVQSGAEVKKPGASVTVSCKASGYTFTHYDISWVRQATGQGLEWMGWMNPYSGHTGSAQKFQGRVTMTRDTSISTAFMELRSLTSEDTAVYYCARGGGYSGYDDAFDIWGQGTMVTVSS	54
PSMA #37	LC	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWFQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAIYYCQQHSYWPLTFGGGTKVEIK	53
	HC	QVQLVQSGAEVKKPGASVTVSCKASGYTFTSYDISWVRQATGQGLEWMGWMNPHSGHTGSAQKFQGRVTMTRDTSISTAFMELRSLTSEDTAVYYCARGGGYSGYDDAFDIWGQGTMVTVSS	55
PSMA #38	LC	EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWFQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAIYYCQQHSYWPLTFGGGTKVEIK	53
	HC	QVQLVQSGAEVKKPGASVTVSCKASGYTFTSYDISWVRQATGQGLEWMGWMNPYHGHTGSAQKFQGRVTMTRDTSISTAFMELRSLTSEDTAVYYCARGGGYSGYDDAFDIWGQGTMVTVSS	56

실시예 10: 낮은 pH에서 STACT 항체를 이용한 PSMA 항원에 대한 결합력 확인

실시예 9에서 제작한 STACT 항체(PSMA36, PSMA37 및 PSMA38)의 PSMA 항원에 대한 결합력을 pH 7.4 및 pH 6.0에서 확인하였다. 양성대조군으로는 모항체인 42E4 항체를 사용하였다.

효소결합면역흡착검사(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay; ELISA)를 통해 제작한 STACT 항체(PSMA36, PSMA37 및 PSMA38)의 PSMA 항원에 대한 결합력을 확인하였다. 실험 방법은 다음과 같다. 우선 제작한 STACT 항체(PSMA36, PSMA37, PSMA39)와 모항체 42E4에 EZ-LINK plus activated Peroxidase kit (Thermo, Catalog #31489, EZ-LINK plus activated Peroxidase kit)를 이용하여 HPR를 conjugation하여 준비한다. 항원으로 인간 PSMA 단백질(Acrobiosystems, Catalog #PSA-H52H3, Human PSMA)을 25ng/well, 5ng/well, 1ng/well로 Costar 96-웰 하프 플레이트(Corning, Catalog #3690, 96-well Half Area Clear Polystyrene Microplates)에 4℃에서 16시간 동안 고착시켰다. 고착시킨 후 PBS-T (0.05% Tween20이 포함된 PBS)완충액 180㎕로 3회 세척 후 1% BSA/PBS 완충액 100㎕을 넣어 상온에서 1시간 동안 blocking한다. Blocking한 플레이트를 3회 세척 후, HRP가 conjugation된 STACT 항체(PSMA36, PSMA37, PSMA39)와 모항체 42E4를 각각 pH6.0 및 pH7.4로 적정된 1% BSA/PBS 완충액에 각각 10,000ng/ml부터 1ng/ml까지 1/10씩 5개의 농도구배로 희석한 용액을 50ul씩 넣어 상온에서 2시간동안 항원과 반응시켰다. 반응이 완료된 플레이트를 각각 pH6.0 및 pH7.4로 적정된 PBS-T(0.05% Tween20이 포함된 PBS)완충액 180ul로 3회 세척한 후, TMB (SurModics, Catalog #TMBC-1000-01, TMB Conductivity One Component HRP Microwell Substrate)을 넣고 상온에서 5분간 발색하였다. 발색 반응이 완료된 플레이트에 1N 황산(Duksan, Catalog #255)을 추가하여 발색을 정지시켰다. Microplate reader (TECAN, Catalog #Infinite F50)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 각 OD₄₅₀ 값 비교를 통해 pH7.4 및 pH6.0에서 STACT 항체의 PSMA 항원에 대한 결합력을 확인하였다.

ELISA 실험 조건 :

-Ag coating : 25ng/well, 5ng/well, 1ng/well

-Ab Con.(ng/ml) : 1/3 Serial dilution (20,000ng/ml~0.339ng/ml)

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 모항체인 42E4는 pH 변화에 따른 PSMA와의 결합력에 차이가 없었으며, 도 12~14에 나타난 바와 같이, STACT 항체인 PSMA36, PSMA37 및 PSMA38는 pH 6.0에서 PSMA 항원에 더 높은 결합력을 나타내었다.

실시예 11: STACT 세포의 항원 결합력 확인

PSMA36, PSMA37 및 PSMA38 항체의 scFv 서열을 이용하여 STACT 세포 PB-CTA-PSMA36, PB-CTA-PSMA37 및 PB-CTA-PSMA38을 제작하였다. 실시예 5에서 PSMA CAR-T 세포를 제작한 방법과 동일한 과정을 따랐다.

PSMA36, PSMA37 및 PSMA38 항체의 scFv 서열과 CAR를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제작하고 실시예 5에서와 같이 PSMA CAR-T 세포 생산 및 렌티바이러스 도입 효율 측정을 위한 유세포 분석의 동일한 과정을 따랐다. 단, STACT 세포의 pH-의존적 결합력 확인을 위해 유세포 분석 시PSMA 항원 결합력을 pH 6.0 및 pH 7.4에서 각각 확인하였다. 양성대조군으로는 모세포인 PB-CTA-42E4를 사용하였다.

그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, STACT 세포는 pH 6.0에서만 PSMA 항원과 특이적인 결합을 하는 것을 확인하였다.

실시예 12: in vivo 에서 STACT 세포의 항암 효과 화인

마우스 ( NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1sug/JicKoat, 수컷, 5주령, 코아텍)에 전립선암 세포(LNCaP) 5x10⁷ 개를 피하주사하고, 암세포 투여 13일 차에 STACT CAR-T 세포인 PB-CTA-PSMA36을 5x10⁶ 개 정맥주사 한 후, 32일간 관찰하였다.

그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, PB-CTA-PSMA36 투여 그룹인 1번 개체에서 28일 째에 종양이 완전 사라지는 완전 관해를 확인하였으며, PB-CTA-PSMA36 투여 그룹인 2번 개체에서는 14일째에 완전 관해를 확인하였다.

음성대조군인 3번 개체와 4번 개체에서는 지속적으로 종양이 생장하는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

1. 다음을 포함하는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편:
   서열번호 23 내지 26으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1;
   서열번호 27 내지 30으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2;
   서열번호 31 내지 34 및 45로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3;
   서열번호 35 및 37 및 46으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1;
   서열번호 38 내지 41, 47 및 48로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2; 및
   서열번호 42 내지 44로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3.
   
2. 제1항에 있어서, 서열번호 12, 14, 16, 18, 20, 21 및 53으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함하는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
   
3. 제1항에 있어서, 서열번호 13, 15, 17, 19, 22 및 54 내지 56으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 서열로 표시되는 중쇄 가변 영역을 포함하는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편.
   
4. 제1항에 있어서, 다음으로 구성되는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 조합을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편:
   i) 서열번호 12로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 13으로 표시되는 중쇄 가변 영역;
   ii) 서열번호 14로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 15로 표시되는 중쇄 가변 영역;
   iii) 서열번호 16으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 17로 표시되는 중쇄 가변 영역;
   iv) 서열번호 18로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 19로 표시되는 중쇄 가변 영역;
   v) 서열번호 20으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 22로 표시되는 중쇄 가변 영역;
   vi) 서열번호 21로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 22로 표시되는 중쇄 가변 영역;
   vii) 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 54로 표시되는 중쇄 가변 영역;
   viii) 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 55로 표시되는 중쇄 가변 영역; 및
   ix) 서열번호 53으로 표시되는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 56으로 표시되는 중쇄 가변 영역.
   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 핵산.
   
6. 제5항의 핵산을 포함하는 재조합 발현벡터.
   
7. 제5항의 핵산 또는 이를 포함하는 재조합 발현벡터가 숙주세포에 도입된 재조합 세포.
   
8. 제7항의 재조합 세포를 배양하여 항체를 생성하는 단계; 및 생성된 항체를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편의 제조방법.
   
9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR).
   
10. 제9항의 키메라 항원 수용체를 표면에 발현하는 면역세포.
    
11. 제10항의 면역세포를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    
12. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합단편이 약물에 결합된 항체-약물 접합체 (ADC).
    
13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편, 또는 이를 포함하는 항체-약물 접합체를 포함하는 암의 진단, 예방 또는 치료용 조성물.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 유방암, 췌장암, 폐암, 갑상선암, 위암, 난소암, 대장암, 간암, 담낭암, 신장암, 자궁경부암, 방광암, 급성골수성백혈병 및 다발성골수종으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 진단, 예방 또는 치료용 조성물.
    
15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합단편을 포함하는 이중 또는 다중특이적 항체.