BG108366A - Имуноконюгати от цитотоксични антитела за cd44 - Google Patents
Имуноконюгати от цитотоксични антитела за cd44 Download PDFInfo
- Publication number
- BG108366A BG108366A BG108366A BG10836603A BG108366A BG 108366 A BG108366 A BG 108366A BG 108366 A BG108366 A BG 108366A BG 10836603 A BG10836603 A BG 10836603A BG 108366 A BG108366 A BG 108366A
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- compound
- antibody molecule
- antibody
- cell carcinoma
- squamous cell
- Prior art date
Links
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 title abstract description 7
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 title abstract description 7
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 title description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 42
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 77
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 19
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 17
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 claims description 17
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 claims description 16
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 14
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 10
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 10
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 10
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 claims description 5
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 208000007276 esophageal squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 125000004105 2-pyridyl group Chemical group N1=C([*])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 4
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 2
- 102000048851 human CD44 Human genes 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 8
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 claims 3
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 claims 3
- 108010058905 CD44v6 antigen Proteins 0.000 claims 3
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 claims 3
- 208000036765 Squamous cell carcinoma of the esophagus Diseases 0.000 claims 3
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 claims 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims 3
- 201000006585 gastric adenocarcinoma Diseases 0.000 claims 3
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims 3
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 claims 3
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims 3
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 claims 3
- 201000010106 skin squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims 3
- ANZJBCHSOXCCRQ-FKUXLPTCSA-N mertansine Chemical compound CO[C@@H]([C@@]1(O)C[C@H](OC(=O)N1)[C@@H](C)[C@@H]1O[C@@]1(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](C)N(C)C(=O)CCS)CC(=O)N1C)\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 ANZJBCHSOXCCRQ-FKUXLPTCSA-N 0.000 abstract description 24
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 75
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 27
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 25
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 21
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 21
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- -1 4-succinimidyl-4- (2-pyridyldithio) -pentanoate Chemical compound 0.000 description 7
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 7
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 7
- WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N pyridine-2-thiol Chemical compound SC1=CC=CC=N1 WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 6
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 4
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 4
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 4
- QMXCRMQIVATQMR-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-pyridin-2-ylsulfanylpropanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSC1=CC=CC=N1 QMXCRMQIVATQMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 125000005414 dithiopyridyl group Chemical group 0.000 description 3
- 231100000371 dose-limiting toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 3
- GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[1-(pyridin-2-yldisulfanyl)ethyl]benzoate Chemical compound C=1C=C(C(=O)ON2C(CCC2=O)=O)C=CC=1C(C)SSC1=CC=CC=N1 GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- YSRRZPBAOWSVOD-UHFFFAOYSA-N 5-[[1-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)-2H-pyridin-2-yl]disulfanyl]pentanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCSSC1C=CC=CN1N1C(=O)CCC1=O YSRRZPBAOWSVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- OPQNCARIZFLNLF-UHFFFAOYSA-N ansamitocin P-3 Natural products CN1C(=O)CC(OC(=O)C(C)C)C2(C)OC2C(C)C(OC(=O)N2)CC2(O)C(OC)C=CC=C(C)CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 OPQNCARIZFLNLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OPQNCARIZFLNLF-JBHFWYGFSA-N ansamitocin P3 Chemical compound CO[C@@H]([C@@]1(O)C[C@H](OC(=O)N1)[C@@H](C)[C@@H]1O[C@@]1(C)[C@@H](OC(=O)C(C)C)CC(=O)N1C)\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 OPQNCARIZFLNLF-JBHFWYGFSA-N 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 2
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000011363 radioimmunotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 125000000101 thioether group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 2
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- HJVJLAOFAYPFHL-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-pyridin-2-ylpropanedithioate Chemical compound C=1C=CC=NC=1C(C)C(=S)SN1C(=O)CCC1=O HJVJLAOFAYPFHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVOOXRTYGGLORL-VKHMYHEASA-N (2r)-2-(methylamino)-3-sulfanylpropanoic acid Chemical class CN[C@@H](CS)C(O)=O DVOOXRTYGGLORL-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- MQLACMBJVPINKE-UHFFFAOYSA-N 10-[(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)methylidene]anthracen-9-one Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC=C1C=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=CC=CC=C21 MQLACMBJVPINKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBCIDWPRZANGJV-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)-3-(pyridin-2-yldisulfanyl)butanoic acid Chemical compound O=C1CCC(=O)N1C(C(O)=O)C(C)SSC1=CC=CC=N1 HBCIDWPRZANGJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQQYKEAYMIDISC-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)-3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoic acid Chemical compound O=C1CCC(=O)N1C(C(=O)O)CSSC1=CC=CC=N1 ZQQYKEAYMIDISC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGAYQLZJBWFZQV-UHFFFAOYSA-N 3-acetyloxolane-2,5-dione Chemical compound CC(=O)C1CC(=O)OC1=O AGAYQLZJBWFZQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000006267 AMP Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108700016228 AMP deaminases Proteins 0.000 description 1
- 241000123663 Actinosynnema Species 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100059521 Homo sapiens CD44 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 229910010199 LiAl Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 1
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 241000187681 Nocardia sp. Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000025337 Vulvar squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003080 antimitotic agent Substances 0.000 description 1
- 150000001504 aryl thiols Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N dihydromaleimide Natural products O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 201000003911 head and neck carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004904 long-term response Effects 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000000955 neuroendocrine Effects 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- OTIJNTWWDCIUNM-UHFFFAOYSA-N pentanethioic s-acid Chemical compound CCCCC(S)=O OTIJNTWWDCIUNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- CNHYKKNIIGEXAY-UHFFFAOYSA-N thiolan-2-imine Chemical compound N=C1CCCS1 CNHYKKNIIGEXAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005413 thiopyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Изобретението се отнася до нови конюгати от антитела с цитотоксични съединения, фармацевтични състави включващи такива съединения и тяхното приложение в туморната терапия.
Многократно са правени опити за подобряване на ефикасността на антинеопластичните лекарствени препарати, чрез конюгиране на такива лекарствени препарати с антитела срещу тумор-асоциирани антигени, за да се повиши локалната концентрация на лекарствените препарати при доставянето им до тумора. Много от тези подходи имат ограничен успех и в литературата са обсъдени няколко причини, които да обяснят този недостатък. За противо-раковите лекарствени препарати, които действат стехиометрично, като например доксорубицин или метотрексат, са необходими относително високи вътреклетъчни концентрации за да се прояви желаната цитотоксичност. Счита се, че тези концентрации се постигат трудно с много антитялолекарствен препарат конюгати, поради (а) недостатъчната мощност на много общи противо-ракови лекарствени препарати, (б) ниската концентрация на прицелни антигени върху клетъчната повърхност (в) не-ефективната интернализация на комплексите антиген-антитяло в прицелната клетка, и (г) не-ефективното освобождаване на свободна форма лекарствен препарат от конюгата вътре в прицелната клетката (Chari et al., 1992).
• · · ·
Две от горе-споменатите пречки, а именно (а) и (г) се отнасят до работата на Chari и сътрудници (Chari et al, 1992; Liu et al., 1996; U.S. Patent No. 5,208,020). Те разработват конюгати от антитела, при които антитялото е свързано с маитансиноид, чрез дисулфидна връзка. Маитансините принадлежат към клас Ansa макролидни антибиотици, които са получени от Nocardia sp. Маитансинът анзамитоцин Р-З, получен чрез бактериална ферментация, се използва като прекурсорна молекула за производство на маитансиноида DM1. Маитансинът и производните действат като анти-митотични средства (инхибитори на туболиновата полимеризация), подобно на винкристин, но със значително по-висока мощност от винкристина или другите установени хемотерапевтични средства (DM1 е токсичен за клетките in vitro при концентрация ~ 10’10 М). За разлика от високата цитотоксичност на свободния маитансиноид, конюгатът на антитялото има токсичност, която е няколко пъти по-ниска върху антиген-негативните клетки в сравнение с антигенпозитивните клетки. Връзката чрез дисулфидно свързване, притежава предимството че тези мостове веднага се късат вътре в прицелните клетки от вътреклетъчния глутатион, като се освобождава високо токсичния свободен лекарствен препарат. Този подход е приложен на антитела срещу тумор-асоциирани антигени, например C242-DM1 конюгат (Liu et al., 1996; Lambert et al., 1998), и HuN901-DMl (Chari et al., 2000). Приложението на тези конюгати, обаче е ограничено, поради ограничената експресия на съответните прицелни антигени. Например, антигенът разпознаван от N901 (CD56, N-САМ) предимно се експресира от тумори от невроендокринен произход, експресията • · · · на С242 антигена (CanAg) е ограничена най-вече до тумори с произход от стомашно-чревния тракт.
Все още, обаче, има нужда да се подобри подхода, чрез намиране на подходящи тумор-асоциирани антитела с подходящ модел на антигенна експресия, с висока и специфична концентрации на клетъчната повърхност на антигена в прицелната тъкан, и ефективен процес на интернализация на антигенът, който е в комплекс с конюгатите от антитялото в клетките.
CD44 е белтък, който се експресира в няколко различни изоформи върху повърхността на много клетъчни типове. Наймалката изоформа стандартната CD44 (CD44s), която се експресира върху различни клетки, се счита че медиира клетъчното прикрепване към компонентите на екстрацелуларния матрикс и може да пренася съпътстващ стимул при лимфоцитното и моноцитно активиране. От друга страна, експресията на сплайс варианти на CD44, които съдържат домена v6 (CD44v6) в извънклетъчната си област, е ограничена до определен набор от епителни клетки. Все още не е напълно изяснена ролята на CD44v6.
За CD44v6, както и за другите варианти на екзони (CD44v3, CD44v5, CD44v7/v8, CD44vlO) е показано че е тумор-асоцииран антиген с благоприятен модел на експресия в човешките тумори и нормалните тъкани (Heider et al., 1995; Heider et al., 1996; Dall et al., 1996; Beham-Schmid et al., 1998; Tempfer et al., 1998; Wagner et al., 1998) и че може да бъде обект на терапевтични подходи и диагностика на базата на антитяло, по-специално при • · · · радиоимунотерапия (RIT) на тумори (Verel et al., 2002; Stromer et al., 2000, WO 95/33771, WO 97/21104).
Предпоставка за ефективно убиване на туморни клетки, обаче, чрез конюгати на антитяло с маитансиноид, е същественото интернализиране на прицелният антиген. Налични са само много малко данни за интернализацията на CD44. Bazil и Horejsi съобщават, че подтискането на CD44 върху левкоцити, чрез стимулиране с РМА се причинява по-скоро чрез замаскиране на антигена, отколкото чрез интернализиране (Bazil et Horejsi, 1992). Маскирането на CD44 също се потвърждава от някои съобщения за разтворимия CD44 в серум от пациенти с тумори и нормални индивиди (Sliutz et al., 1995; Guo et al., 1994; Martin et al., 1997). B наскоро публикувана статия на Aguiar et al. се определя, че количеството на интернализиран CD44 върху матрикс-интактни хондроцити е приблизително 6% за 4 часа (Aguiar et al., 1999). Подобни ниски нива на интернализиран CD44v6 върху туморни клетки, са намерени при експерименти проведени чрез BIA. Всички тези данни взети заедно предполагат, че CD44 рецепторите са по-вероятно обект на маскиране, отколкото на интернализиране и следователно CD44 специфичните антитела не се считат за подходящи кандидати за подхода на маитансиноид конюгата. Това е подкрепено чрез анализи за in vitro клетъчна пролиферация, където AbCD44v6-DMl показва само леко повишаване на цитотоксичността срещу антиген-представящите клетки, в сравнение с тези в които липсва антиген.
Сега, неочаквано е намерено, че CD44 специфичните конюгати на антитела с високо токсични лекарствени препарати, • · ···· получени чрез линкер който се къса при вътреклетъчни условия, са много ефективни туморни терапевтици in vivo.
Настоящето изобретение осигурява нови съединения, съставени от конюгати на молекули от CD44 специфични антитела и силно цитотоксични лекарствени препарати, свързани чрез линкер който се разгражда във вътреклетъчни условия.
По-специално, настоящето изобретение осигурява съединение с формула
A(LB)n Формула (I) където
А е молекула на антитяло, което е специфично за CD44;
L е линкерна група;
В е съединение, което е токсично за клетки; и η е десетично число с η = 1 до 10
Молекулата на антитялото А притежава свързваща специфичност за CD44, предимно за вариант на CD44.
Терминът молекула на антитялото обхваща пълните имуноглобулини, както те се получават от лимфоцитите, например присъстващи в кръвния серум, моноклонални антитела, секретирани от хибридомни клетъчни линии, полипептиди получени от рекомбинантна експресия в клетки гостоприемници, които притежават свързваща специфичност на имуноглобулините или моноклонални антитела, и молекули които са получени от такива имуноглобулини, моноклонални антитела или
полипептиди, чрез последваща обработка, докато все още те запазват тяхната свързваща специфичност. По-специално, терминът молекула на антитяло включва пълните имуноглобулини, съставени от две тежки вериги и две леки вериги, фрагменти на тези имуноглобулини, като Fab, Fab', или F(ab)2 фрагментите (Kreitman et al., 1993), рекомбинантно получени полипептиди, такива като химерни, наподобяващи човешките или напълно човешки антитела (Breitling et Duebel, 1999; Shin et al., 1989; Gussow et Seemann, 1991, Winter et al., 1994, EP 0 239 400, EP 0519596; WO 90/07861 EP 0368684; EP 0438310; WO 9207075, WO 9222653, EP 0 680 040, EP 0 451 216), едноверижни антитела (scFv, Johnson et Bird, 1991) и други подобни. Днес антителата могат също така да бъдат получени без имунизиране на лабораторно животно, например чрез phage display методи (Aujame et al., 1997; US 5,885,793; US 5,969,108; US 6,300,064; US 6,248.516, US 6,291,158). Напълно човешките антитела могат да се получат, като се използват трансгенни мишки които носят функционални човешки Ig гени (ЕР 0 438 474; ЕР 0463 151; ЕР 0546 073). От гореизложените литературни справки, експертът знае как да получи тези типове молекули на антитела, като използва методите от предшестващото ниво на техниката, такива като автоматизирана пептидна и нуклеиновокиселинна синтеза, имунизиране на лабораторни животни, хибридомни техники, полимеразно-верижна реакция (PCR), технологии за експресия на вектори, култивиране на клетки гостоприемници и методи за пречистване на белтъци. По-нататък термините “антитяло” и “молекула на антитяло” се използват взаимо заменяемо.
·* ····
“Специфично за CD44” означава, че молекулата на антитялото има специфичен свързващ афинитет за епитоп, присъстващ в CD44. В предпочитан вариант, молекулата на антитялото от изобретението има свързваща специфичност за аминокиселинна секвенция, кодирана от екзонен вариант v6 на човешкия ген за CD44. Секвенцията на екзонния вариант v6, също така и на други екзонни варианти са известни от предшестващото ниво на техниката (Screaton et al., 1992; Tolg et al., 1993; Hofmann et al., 1991). Предпочитана молекула на антитяло от изобретението специфично се свързва с пептиди или полипептиди, които имат или съдържат аминокиселинна секвенция SEQ ID NO: 1 от придружаващият списък на секвенциите, или алелен вариант на споменатата секвенция. За предпочитане е споменатата молекула на антитялото да има свързваща специфичност за епитоп от споменатата секвенция. Още по-добре е молекулата на антитялото да се свързва специфично с пептид, който има аминокиселинна секвенция SEQ ID NO: 2, даже най-добре да има аминокиселинна секвенция SEQ ID NO: 3. Такива молекули на антитяло могат да се получат лесно с методите, известни от нивото на техниката (WO 95/33771, WO 97/21104), например чрез имунизиране на лабораторни животни с химично синтезирани пептиди, които имат гореспоменатите секвенции, например свързани с хаптен, или имунизирани с рекомбинантно получен рекомбинантен белтък, включващ споменатите секвенции и проявата им, съгласно методите известни от нивото на техниката (Harlow 1988; Catty 1988; Koopman et al., 1993; Heider et al., 1993).
За предпочитане е молекула на антитяло, съгласно изобретението да е мишето моноклонално антитяло, с означение ···· • ·· • ♦ · • ·· • · ·· ·· ··
VFF-18, което се получава от хибридомна клетъчна линия, която е депозирана на 07 Юни 1994 под номер за достъп DSM АСС2174 с DSM-Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, Deutschland/Germany. Fab, Fab' или споменатото моноклонално антитяло предпочитани. В друг предпочитан антитялото е наподобяващо човешкото, рекомбинантно антитяло, където комплиментарните детерминиращи области (CDR's) на VFF-18 са присадени в съответните гени имуноглобулинова тежка и лека вериги.
Под “комплиментарно-детерминиращи моноклоналното антитяло, трябва да се
D-3 8124 Braunschweig, F(ab)2 фрагментите на VFF-18 са също така вариант, молекулата на на човешката области” на разбира тези аминокиселинни секвенции, включени в специфичното свързване на антигена, съгласно Rabat et al., 1991, във връзка с Chothia and Lesk, 1987.
В друг предпочитан вариант, подходящи рамкови остатъци на такова CDR-присадено антитяло са върнати обратно към мишите остатъци за да се промени свързващия афинитет. От методите отнасящи се до нивото на техниката, експертите знаят как да получат CDR's от VFF-18, като започват с гореспоменатата хибридома с номер за достъп DSM АСС2174, за да изберат и получат подходящи човешки имуноглобулинови гени, да присадят CDR's в тези гени, за да модифицират избраните остатъци за рамка, за да се експресира CDR-присаденото антитяло в подходащи клетки-гостоприемници, например клетки от яйчник на китайски хамстер (СНО) и за да анализират получените рекомбинантни антитела за свързващият им афинитет и ·· ··«· ·· · ζ··· · ·Α· · ·> .! · ·· · у ····· · · ·· специфичност (виж например, литературните справки по-горе). В друг предпочитан вариант на изобретението, молекулата на антитялото е рекомбинантно антитяло, което има CDR's на антитялото VFF-18. За предпочитане, такова рекомбинантно антитяло е антитяло, наподобяващо човешкото и е пълен имуноглобулин, състоящ се от две пълни леки и две пълни тежки вериги. В друг предпочитан вариант от изобретението, молекулата на антитялото е рекомбинантно антитяло, което има същия идиотип, както и антитяло VFF-18. В друг предпочитан вариант от изобретението, молекулата на антитялото от изобретението е рекомбинантно антитяло, свързващо се със същия епитоп както и антитялото VFF-18.
В специално предпочитан вариант, молекулата на антитялото А е антитяло, включващо леки вериги, които имат аминокиселинна секвенция SEQ ID NO: 4 и тежки вериги, които имат аминокиселинна секвенция SEQ ID N0: 6. Това антитяло се нарича BIWA4. То е вариант на VFF-18 на антитяло, наподобяващо човешките, споменато по-горе, което има комплиментарни детерминиращи области от мишото моноклонално антитяло VFF-18 в комплиментарната човешка рамка и константни човешки области. Ето защо това е антитяло с много ниска имуногенност в хора, което е благоприятна характеристика. Обаче, тъй като няма остатъците на миша рамка за да оптимизира антигенното свързване, то има изключително нисък антиген-свързващ афинитет както неговото родителско антитяло VFF-18, и затова не се счита за добър кандидат за терапевтичен лекарствен препарат. Неочаквано е намерено, че BIWA4, освен неговият слаб свързващ афинитет, има много
♦ « ···· • · • · • · · ·· ·· благоприятно био-разпространение и in vivo усвояване в туморите, което го прави по-добро от останалите версии на VFF-18, наподобяващи човешките антитела с по-висок свързващ афинитет (Verel et al), 2002. В друг предпочитан вариант, молекулата на антитялото А е антитяло, включващо леките вериги, притежаващи аминокиселинна секвенция SEQ ID NO: 8 и тежките вериги, притежаващи аминокиселинна секвенция SEQ ID NO: 6. Това антитяло има по-висок свързващ афинитет, отколкото BIWA 4 и се нарича BIWA 8.
Тези антитела могат да се получат както следва. Молекулите нуклеинови киселини, кодиращи леката верига и тежката верига могат да се синтезират химично и ензимно, чрез стандартни методи. Първо, подходящите олигонуклеотиди могат да се синтезират с методи известни от нивото на техниката (например, Gait, 1984), които могат да се използват за синтетично получаване на гена. Методите за създаване на синтетични гени от олигонуклеотиди са известни от нивото на техниката (например, Stemmer et al. 1995; Ye et al. 1992; Hayden et Mandecki 1988; Frank et al. 1987). За предпочитане е молекулите нуклеинови киселини, кодиращи леката и тежката вериги на BIWA4 да имат нуклеотидните последователности, съответно на SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7. Тези секвенции включват секвенциите, кодиращи лидерните пептиди, които се разграждат от клеткатагостоприемник (SEQ ID NO: 5: първите 60 нуклеотида; SEQ ID N0:7: първите 57 нуклеотида). В друг вариант молекулите нуклеинови киселини, кодиращи леката и тежката вериги на молекулата на антитялото, съгласно изобретението имат нуклеотидни секвенции, съответно SEQ ID N0:9 и SEQ ID N0:7.
·« «···
Тези молекули нуклеинови киселини, кодиращи тежката и лека вериги на антитялото, след това могат да бъдат клонирани в експресионен вектор (или двете вериги в една векторна молеула или всяка верига в отделна векторна молекула), който след това се въвежда в клетка-гостоприемник. Подходящите експресионни вектори, за експресия на имуноглобулини в прокариотни или еукариотни клетки-гостоприемници, както и методите за въвеждането в клетки гостоприемници са добре известни от нивото на техниката. Обикновенно имуноглобулиновия ген в тях е във функционална връзка с подходящ промотор, такъв като например промотор от човешки цитомегаловирус (CMV), убиквитинов промотор от хамстер (WO 97/15664) или промотор на simain вирус (SV 40) локализирани upstream от Ig гена. За завършване на транскрипцията, може да се използва подходящо терминиращо/полиаденилирано място, като това на говеждия растежен хормон или на SV40. Обикновенно, експресионният вектор, също така съдържа маркерни гени за селекция, такива като гените за дихидрофолат редуктаза (DHFR), глутамин синтетаза, аденозин деаминаза, аденилат деаминаза или гените за резистентност към неомицин, блеомицин или пуромицин. Много експресионни вектори са налични в търговската мрежа, като например Strategene, La Jolla, СА; Invitrogen Carlsbad, СА; Promega, Madison, WI или BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA. Например, за експресия могат да бъдат използвани експресионните вектори pAD-CMVl (NCBI GenBank Accession No. A32111) или pAD-CMV19 (NCBI GenBank Accession No. A32110). Клетката-гостоприемник, за предпочитане е клеткагостоприемник от бозайник, например COS, СНО, или ВНК • ····
клетка, по-добре клетка от яйчник на китайски хамстер (СНО), например CHO-DUKX (Urlab and Chasin, 1980), CHO-DG44 (Urlaub et al., 1983) или CHO-K1 (ATCC CCL-61). Клетката гостоприемник след това се култивира в подходяща хранителна среда при условия, подходящи за получаване на антитялото и антитялото след това се изолира от културата, съгласно стандартни методи. Методи за получаване на антитела от рекомбинантна ДНК от рекомбинантна ДНК в клеткигостоприемници и съответните експресионни вектори са добре известни от нивото на техниката (виж например, WO 94/11523, WO 97/9351, ЕР 0481790, ЕР 0 669 986).
За да се свърже молекулата на антитялото А със съединението В, което е токсично за клетки, се използва свързваща група L. В най-простия случай, свързващата група L е химична връзка, за предпочитане ковалентна връзка, която се разгражда във вътреклетъчни условия. В един вариант от изобретението, връзката е между атом на сярата, присъстващ в молекулата на антитялото, например в страничната верига на цистеинов остатък и друг атом на сяра, присъстващ в токсичното съединение. В друг вариант, линкерната група L се състои от един или повече атоми или химични групи. Подходящи свързващи групи са добре известни от нивото на техниката и включват дисулфидни групи, тиоетерни групи, киселинно лабилни групи, фотолабилни групи, пептидазно лабилни групи или естеразно лабилни групи. Предпочитани са дисулфидните и тиоетерните групи.
Конюгати на молекули на антитела от изобретението и токсичното съединение могат да се образуват, като се използва ··♦·
всяка една от понастоящем известните или по-късно развитите техники. Токсичното съединение може да се модифицира, така че да носи свободна амино група и след това да се свърже с молекулата на антитялото чрез киселинно лабилен линкер или фотолабилен линкер. Токсичното съединение може да бъде кондензирано с пептид и след това свързано с молекулата на антитялото, за да се получи линкер, лабилен по отношение на пептидазите. Токсичното съединение може да се третира, така че да даде първична хидроксилна група, която може да е сукцинилирана и да е свързана с молекулата на антитялото, за да се получи конюгат, който може да се разгражда от вътреклетчни естерази за да се освободи свободния лекарствен препарат. Още по-добре е токсичното съединение да се третира така че да се създаде свободна или защитена тиолова група и след това едно или повече дисулфидни или тиол-съдържащи токсични съединения, които са ковалентно свързани с молекулата на антитялото, чрез дисулфиден (дисулфидни) мост (мостове).
Например, молекулите на антитялото могат да се модифицират с омрежващи реагенти, такива като Nсукцинимидил 3-(2-пирилдитио)пропионат (SPDP), 4сукцинимидил-оксикарбонил-алфа-метил-алфа -(2-пиридилдитио)толуен (SMPT), Ь1-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-бутират (SDPB), ?4-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)-пентаноат (SPP), Nсукцинимидил-5-(2-пиридилдитио)-пентаноат, 2-иминотиолан, или ацетилсукцинов анхидрид, чрез известни методи. Виж, Carlsson et al, 1978; Blattler et al 1985; Lambert et al, 1983; Klotz et al, 1962; Liu et al, 1979; Blakey and Thorpe, 1988; Worrell et al, 1986. В предпочитан вариант, линкерната група е 4-тиопентаноат, ♦ <* ···· получена от SPP, или 5-тиопентаноат. Молекулата на антитялото съдържаща свободни или защитени тиолови групи, получена по този начин, след това реагира с дисулфид- или тиол- съдържащо токсично съединение, за да се получат конюгати. Конюгатите могат да се пречистят чрез HPLC или чрез гел филтрация.
“Токсично” е съединение, което инхибира или предпазва функцията на клетките и/или причинява клетъчно разрушаване. Токсичните съединения, използвани за сдвояване могат да действат като цитостатици или цитотоксици и да водят до блокиране на клетъчния цикъл или до клетъчна смърт. Тези съединения могат да действат на различни етапи по време на клетъчния цикъл, например чрез намеса в синтезата на
нуклеиновите киселини, инактивиране на нуклеиновите киселини или чрез свързване с тубулин.
В предпочитан вариант, съединението В което е токсично за клетките е маитансиноид, т.е. производно на маитансина (CAS 35846538). В предпочитан вариант, то е С-3 естер на маитансинола. Маитансиноидите, подходящи за свързване с антитела за прилагане в раковата терапия, включително и приготвянето на споменатите маитансиноиди и тяхното свързване с молекулите на антитялото, са описани от Chari и сътрудници (Chari et al., 1992; Liu et al., 1996; U.S. Patent No. 5,208,020). Тези маитансиноиди могат да се използват за настоящето изобретение. В предпочитан вариант, токсичното съединение е N ’-деацетилН2’-(3-меркапто-1-оксопропил)-Маитансин (CAS Номер 13950450-0), отнасящо се също до DM1. За предпочитане, споменатият маитансиноид е маитансинолно производно, свързано с молекулата на антитялото, чрез дисулфиден мост при позиция С-3
от маитансинола. В специално предпочитан вариант, конюгатът на антитялото/маитансиноида може да се получи от маитансиноид с формула (Формула (II))
където
Ri представлява Н или SR4, където R4 представлява метил, етил, линеен алкил, разклонен алкил, цикличен алкил, прост или заместен арил или хетероциклик;
R2 представлява С1 или Н;
R3 представлява Н или СН3; и m представлява 1, 2 или 3.
За предпочитане, Rje Н, СН3 или SCH3, R2 е Cl, R3 е СН3 и m = 2.
····
Съединението с Ri= Н, R2 = Cl, R3 = CH3 и m = 2 е означено в литературата като DM1.
В предпочитан вариант, съединението от изобретението има формула
А е молекула на антитяло, което е специфично за CD44, за предпочитане специфична за екзонен вариант v6, за предпочитане специфична за аминокиселинна секвенция SEQ ID NO: 3;
(L') е избрана линкерна група р е десетично число с р = 1 до 10
За предпочитане р е 3 до 4, още по-добре около 3.5.
Методи за приготвяне на такива маитансиноиди са известни от нивото на техниката (виж по-специално US 5,208,020, Пример ···· ··
1). Обикновенно, в първия етап маитансиноидният С-3 естер анзамитоцин РЗ може да се получи, чрез бактериална ферментация от микроорганизми, принадлежащи към род Nocardia или Actinosynnema, например АТСС 31565, АТСС 31281 (US 4,356,265; US 4,450,234; WO 01/773 360). Анзамитоцин РЗ може да се екстрахира от култура, като се използват органични разтворители, такива като етил ацетат или толуен и по-нататък се пречистват чрез адсорбционна хроматография, като се използва например силика гел. След това той може да се редуцира до маитансинол ,като се използва L1AIH4 (US 4,360,462) или както е предложено наскоро, LiAl(OMe)3H или други хибриди на Li Al или NaAl (WO 02/16368). Маитансинолът след това може да се естерифицира в позиция С-3 с N-метил-Е-аланин или N-mcthh-Lцистеинови производни за да се получи дисулфид-съдържащ маитансиноид (US 5,208,020; US 5,416,064; US 6,333,410), например като се използва дициклохексилкарбодиимид (DCC) и каталитични количества от цинков хлорид (US 4, 137, 230; US 4,260,609). В предпочитан вариант, маитансиноидът е естерифициран със съединението N-MeTH4-N-(3метилдитиопропаноил)-В-аланин с формула
НО
за да се получи маитансиноид с Формула (II) с R3 = SR4, R4 = СН3, R2 = Cl, R3 = СН3 и m = 2.
Свободната тиолова група след това може да се освободи, чрез разграждане на дисулфидната връзка с дитиотриетол (DTT) за да се получи например DM1.
При вътреклетъчното разграждане се освобождава свободното токсично съединение от A(LB)n конюгата. Свободният лекарствен препарат се освобождава от съединението A(LB)n което може да има формула В-Х, където X е атом или химична група, която зависи от природата на реакцията на разграждане. За предпочитане X е водороден атом, като например когато линкерната група е проста ковалентна връзка между два атома, съдържащи сяра или хидроксилна група. Мястото на разграждане може също да бъде в линкерната група, ако линкерната група е химична група, водеща до разкъсване на свободен лекарствен препарат с формула B-L-X при разграждане, където X е атом или химична група, зависеща от природата на реакцията на разграждане. За предпочитане X е водороден атом или хидроксилна група.
В предпочитан вариант, съединението с формула (I) е помалко токсично от токсичното съединение В, В-Х или B-L-X освободено при вътреклетъчното разграждане. Методите за анализирането на цитотоксичност in vitro са известни от нивото на техниката (Goldmacher et al., 1985; Goldmacher et al., 1986; виж също US 5,208,020, Пример 2). За предпочитане, съединението (I) е 10 пъти или над, още по добре 100 пъти или над, или най-добре даже 1000 пъти или над 1000 пъти по-малко токсично от това, ·
• 9 *9 ·♦·· ·· ♦ 99 • а·· •9 •· •9 ·· · 99 при разграждането освободения на което се освобождава лекарствен препарат.
За предпочитане молекулата на антитялото/маитансоидните конюгати са тези които се свързват чрез дисулфиден мост, както е дискутирано по-горе, които са способни да доставят маитансиноидните молекули. Такива клетъчно-свързани конюгати се приготвят чрез известни методи, такива като модифициране на моноклонални антитела със сукцинимидил пиридилдитиопропионат (SPDP) или пентаноат (SPP) (Carlsson et al, 1978). Получената тиопиридил група след това се замества чрез третиране с тиол-съдържащи майтансиноиди за да се получат дисулфидно свързани конюгати. От друга страна, в случая на арилдитиомаитансиноидите, получаването на конюгати на антитела е повлияно от директното заместване на арил-тиол на маитансиноида от сулфхидрилни групи, които са въведени предварително в молекулите на антитялото. Конюгатите съдържащи от 1 до 10 маитансиноидни лекарствени препарати, свързани чрез дисулфиден мост, могат веднага да се приготвят чрез същия метод. В този контекст се разбира че десетичното число η във формулата A(LB)n е средно аритметично число, тъй като не всички молекулни конюгати от даден препарат могат да имат идентично цяло число на LB остатъците, закачени към молекулата на антитялото.
По-специално, разтворът на дитиопиридил модифицираното антитяло при концентрация 1 mg/ml в 0.1 М калиево фосфатен буфер с pH 7.0, съдържащ 1 mM EDTA е третиран с тиолсъдържащ маитансиноид (1.25 моларен еквивалент/дитиопиридил група). Освобождаването на пиридин-2-тион от модифицираното • · ·«··
• · • · ·· ·· антитяло се следи спектрофотометрично при 343 nm и се извършва напълно след около 30 минути. Антитяломаитансиноидният конюгат се пречиства и освобождава от нереагиралия лекарствен препарат и други материали е ниско молекулно тегло чрез гел-филтрация през колона Sephadex G-25. Броят на маитансиноидните връзки за молекула антитяло може да се определи, чрез измерване на съотношението на абсорбциите при 252 nm и 280 nm. Средно от 1-10 от маитансиноидните молекули/молекули на антитялото, могат да се свържат чрез дисулфидни връзки чрез този метод.
В следващ аспект, настоящето изобретение се отнася до конюгат на CD44v6 специфична молекула на антитяло и маитансиноид. Под “CD44v6 специфично” тук трябва да се разбира, че антитялото има специфичен афинитет на свързване е епитоп, който присъства в пептид, притежаващ аминокиселинна секвенция, кодирана от екзонен вариант v6 на CD44, предимно на човешки CD44. Предпочитаната молекула на антитяло от изобретението, се свързва специфично е пептиди или полипептиди, които притежават или съдържат аминокиселинна секвенция SEQ ID N0:1 от придружаващия списък на секвенциите или алелен вариант от споменатата секвенция. За предпочитане е споменатата молекула на антитялото да има свързваща специфичност за епитоп от споменатата секвенция. По-специално, молекулата на антитялото свързва специфично пептид, притежаващ аминокиселинна секвенция SEQ ID N0:2 и даже още по-добре, притежаващ аминокиселинна секвенция SEQ ID N0:3.
За предпочитане е, молекулата на антитялото в споменатият конюгат да е моноклоналното антитяло VFF-18 (DSM АСС 2174) ·· ····
.......... *..··..· или рекомбинантно антитяло, притежаващо комплиментарни детерминиращи области (CDRs) на VFF-18. По-добре, споменатото антитяло да включва леки вериги, притежаващи аминокиселинна секвенция SEQ ID NO: 4 или от друга страна SEQ ID N0:8 и тежки вериги, притежаващи SEQ ID N0: 6.
Маитансиноидът за предпочитане е свързан с антитялото, чрез дисулфидна група и има формула.
Формула (IV)
Където връзката с антитялото е чрез атом на сярата, показан във формула IV и чрез втори атом на сярата, присъстващ в молекулата на антитялото. За да се създаде такъв атом на сярата, необходим за свързването, молекула на антитяло може да се модифицира, чрез въвеждане на подходящ линкер, такъв като този
изложен по-горе. За предпочитане е маитансиноидът да е свързан с молекулата на антитялото чрез -S-CH2CH2-CO-, -SСН2СН2СН2СН2-СО, или -S-CH(CH3)CH2CH2-CO- група. Атомът на сярата в такава линкерна група, образува дисулфиден мост с маитансиноидът, докато карбонилната функционална група може да се свърже с амино-функционалната група, присъстваща в страничната верига на аминокиселинния остатък от молекулата на антитялото. По този начин, един или повече маитансиноидни остатъци могат да се свържат с молекулата на антитялото. За предпочитане е с молекула на антитялото да са свързани от 3 до 4 маитансиноидни остатъци.
Предимно предпочитан конюгат е този на CD44v6 специфичната молекула на антитялото и маитансиноидът, където антитялото включва леки вериги, притежаващи аминокиселинна секвенция SEQ ID N0:4 и тежки вериги, притежаващи секвенция SEQ ID N0:6, и където маитансиноидът има формула:
Формула (IV) и е свързан с антитялото чрез дисулфидна връзка. За предпочитане е -S-CH2CH2CH2CH2-CO, или -S-CH(CH3)CH2CH2СО- и броят на маитансиноидните остатъци на молекула антитяло да са от 3 до 4.
В следващ вариант, настоящето изобретение се отнася до метод за получаване на съединение е формула (I) включващ етапите на:
(а) въвеждане на свободни или защитени тиолови групи в молекулата на антитялото, което е специфично за CD44;
(б) взаимодействие на молекулата на антитялото от етап (а) със съединение, което е токсично за клетките, като споменатото съединение има една или повече дисулфидни или тиолови групи; и (в) събиране на получения конюгат.
За предпочитане е молекулата на антитялото да е специфична за CD44v6 и още по-добре, да е специфична за аминокиселинна секвенция SEQ ID NO: 3. Съединението, което е токсично за клетките е предимно маитансиноид, още по-добре с формула (II), най-добре с Rj= Н, R2 = Cl, R3 = СН3 и m = 2. В друг предпочитан вариант антитялото включва леки вериги, притежаващи аминокиселинна секвенция SEQ ID N0:4 или SEQ ID N0:8 и тежки вериги, притежаващи аминокиселинна секвенция SEQ ID N0:6.
В предпочитани варианти на такъв метод се използват Nхидрокси сукцинимиден естер на (2-пирил)-3-дитио пропаноева киселина (№сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)-пропионат), Nхидрокси сукцинимиден естер на (2-пирил)-4-дитиопентаноевата r* ···· киселина (К!-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)-пснтаноат, или Nхидрокси сукцинимиден естер на (2-пирил)-5-дитиопентаноева киселина (К-сукцинимидил-5-(2-пиридилдитио)-пентаноат) за въвеждане на свободни или защитени тиолови групи в молекулата на антитялото. Изобретението също така се отнася до съединения, получени чрез описания метод.
В следващ предпочитан вариант, настоящето изобретение се отнася до фармацевтичен състав, включващ съединение с формула (I) , или описан конюгат, за предпочитане заедно с фармацевтично приемлив носител, ексципиент или разредител.
Подходящи фармацевтично приемливи носители, разредители и ексципиенти са добре известни и могат да се определят от тези които са специалисти от нивото на техниката, като препоръчани при клинични ситуации. Примери за подходящи носители, разтворители и/или ексципиенти включват: (1) фосфатен солеви буфер на Dulbecco с pH около 7.4, съдържащ около 1 mg/ml до 25 mg/ml човешки серумен албумин, (2) 0.9 % солеви разтвор (0.9 % w/v NaCl) и (3) 5 % (w/v) декстроза.
Още по-добре е молекулата на антитялото, присъстваща във фармацевтичния състав да е моноклонално антитяло VFF-18 или рекомбинантно антитяло, което има CDR на антитялото VFF-18, за предпочитане човешка рамка. В друг предпочитан вариант, антитялото включва леките вериги, притежаващи аминокиселинна секвенция SEQ ID N0:4 или SEQ ID N0:8 и тежките вериги, притежаващи аминокиселинна секвенция SEQ ID N0: 6. За предпочитане, токсичното съединение е маитансиноид с формула (II) .
• · · ·
Съединенията от изобретението може да се използват във всички видове приложения, където токсичното съединение трябва да се насочи към клетките, експресиращи CD 44, за предпочитане CD44v6 върху клетъчната повърхност.
Конюгатът може например да се прилага клинично ex vivo за да отстрани туморните клетки от костния мозък, преди автоложна трансплантация при лечение на рак. Лечението може да се провежда както следва. Костният мозък се събира от пациента или от друг индивид и след това се инкубира в среда, съдържаща серум, към която се добавя съединение с формула (I) съгласно изобретението, като концентрациите се движат от около 10 μΜ до 1 рМд за около 30 минути до около 48 часа, при около 37 градуса С. Точните условия за концентрация и време на инкубация (= доза), се определят лесно от специалистите от нивото на техниката. След инкубирането, клетките от костния мозък се промиват със среда, съдържаща серум и се връщат в пациента, чрез i.v. инфузия, съгласно известните методи. В случаите при които пациентът е подложен на друго лечение, такова като курс на аблативна химиотерапия или общо облъчване на тялото между времето от събиране на костния мозък и обратното връщане на третираните клетки, третираните костно-мозъчни клетки се съхраняват замразени в течен азот, като се използва стандартно медицинско оборудване.
В друг вариант, настоящето изобретение се отнася до метод за лечение на рак, който включва прилагане на фармацевтичен състав на пациент, както е описано преди това. По специално, този вариант от изобретението се отнася до метод за лечение на рак при пациент нуждаещ се от такова лечение, включващо прилагане на • ····.
·· · ·. * ·» ....
* · · 1 · ·· • · · · Z . * ·· ·· ft ···· ft
.......... ·..··..· пациента на терапевтично ефективно количество от съединение, както е описано по-горе, или фармацевтичен състав, както е описано по-горе. За предпочитане, ракът е с произход от карциномни сквамозни клетки (SCC) на главата и врата, SCC на езофагуса, SCC на белите дробове, SCC на кожата, от аденокарцином (АС) на гърдата, АС на белия дроб, SCC на шийката на матката, АС на панкреаса, АС на дебелото черво или АС на стомаха.
За клинично лечение на рак, съединението с формула (I) съгласно изобретението ще се прилага под формата на разтвори, които са анализирани за стерилност и за нива на ендотоксини. Примери за подходящи протоколи за прилагане на конюгата са следните. Конюгатите могат да се дават един път седмично от 1 до 6 седмици или като i.v. болус, или като продължителна инфузия за 5 дни. Болус дозите могат да се дават по 50 до 100 ml в нормален солеви разтвор към който са добавени от 5 до 10 ml човешки серумен албумин. Продължителни инфуции могат да се прилагат от 250 до 500 ml в нормален разтвор, към който се добавят от 25 до 50 ml човешки серумен албумин, през период от 24 часа.
А
Дозите обикновено ще се прилагат от 10 mg до 400 mg/m площ от телесната повърхност. Дозата, прилагана на пациент като еднократно приложение, трябва да бъде доста висока, за да е ефективна, но трябва да е под дозата лимитираща токсичността (DLT). Най-общо, достатъчно добра допустима доза под DLT ще се счита като максимално допустима доза (MTD). Експертът знае как да определи MTD (Lambert et al., 1998). При седмични приложения, може да се очаква MTD да е в областта от 100 до 200 mg/m2. Съответно, интервалите между приложенията могат да ···· • · • · • · « ♦ · · · · • ♦ • · ·· ·· бъдат по-дълги, например от две до четири седмици, за предпочитане три седмици. В този случай може да се очаква MTD да е в областта от 200 до 300 mg/m2. Съответно, приложението може да е като 5 дневни дози, последвано от прекъсване за няколко седмици, след което лечението може да бъде повторено. В този случай, може да се очаква, че прилагането на MTD може да бъде по-ниско от 100 mg/m . Например, могат да се прилагат конюгати като единична i.v. инфузия със скорост от 3 mg/min на всеки 21 дена. Прилагат се до 7 цикъла на лечение. Трябва да е ясно, че приложените дози могат да бъдат извън обхвата, даден по-горе, ако го изисква клиничното състояние. Например, ако е намерено че MTD е по-високо от посоченото, еднократното приложение може да бъде с по-висока доза от 400 mg/m или седмичното може да бъде повече от 200 mg/m .
Обикновенно, дозата, начинът на подаване, схемата на прилагане, повторението и времетраенето на лечението, ще зависят от природата на заболяването (тип, степен и етап на тумора и т.н.) и от пациента (физическо състояние, възраст, пол и т.н.) и ще се определят от медицинското лице, отговорно за лечението. Терапевтичното приложение съгласно изобретението, може да бъде с особено предимство освен за лечение на твърди тумори и като адювант при хирургична интервенция за лечение на минимално остатъчно заболяване.
В друг вариант изобретението се отнася до използването на съединение с формула (I), за приготвяне на фармацевтичен състав за лечението на рак. По-специално, молекулата на антитялото, присъстваща във фармацевтичния състав е моноклоналното VFF18 или рекомбинантно антитяло, притежаващо CDR от антитялото
VFF-18, за предпочитане в човешка рамка. Най-предпочитано е молекула антитяло, включваща лека верига, притежаваща SEQ ID NO: 4 или SEQ ID N0:8 и тежка верига, притежаваща SEQ ID N0:
6. За предпочитане е, токсичното съединение да има формула (II). За предпочитане е ракът да е от сквамозни карциномни клетки (SCC) на главата и врата, SCC на езофагуса, SCC на белия дроб, SCC на кожата, аденокарцином (АС) на гърдата, АС на белите дробове, SCC на шийката на матката, АС на панкреаса, АС на дебелото черво, или АС на стомаха.
ЦИТИРАНА ЛИТЕРАТУРА
Aguiar DJ, Knudson W, and Knudson CB. Internalization of the hyaluronan receptor CD44 by chondrocytes. Exp.Cell.Res. 252: 292-302,1999.
Aujame L, Geoffrey F, Sodoyer R. High affinity human antibodies by phage display. Hum Antibodies 8(4):155-68 (1997).
Bazil V and Horejsi V. Shedding of the CD44 adhesion molecule from leukocytes induced by anti-CD44 monoclonal antibody simulating the effect of a natural receptor ligand. J Immunol 149 (3):747-753,1992.
Blattler et al, Biochem. 24: 1517-1524 (1985).
Breitling F, Duebel S: Recombinant Antibodies. John Wiley, New York 1999.
Carlsson et al, Biochem. J. 173: 723-737 (1978).
Catty D. Antibodies. Oxford IR Press 1988.
Chari RVJ, Martell BA, Gross JL, Cook SB, Shah SA, Blattler WA, McKenzie SJ,
Goldmacher VS. Immunoconjugates containing novel maytansinoids: promising anticancer drugs. Cancer Research 52: 127-31, 1992.
Chari RVJ, Derr SM, Steeves RM, Widdison WC: Dose-response of the anti-tumor effect of HUN901-DM1 against human small cell lung cancer xenografts. Proceedings of the American Association of Cancer Research (2000) 41(April 1-5) Abs 4405.
Chothia and Lesk. J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987).
Frank et al. Methods Enzymol. 154: 221-249 (1984)
Gait,M.J., Oligonucleotide Synthesis. A Practical Approach. IRL Press, Oxford, UK (1984).
Goldmacher et al., J Immunol 135: 3648-3651,1985.
Goldmacher et al., J Cell Biol 102: 1312-1319,1986.
Giissow D, Seemann G. Humanization of monoclonal antibodies. Methods Enzymol. 203: 99-121 (1991)
Guo YJ, Liu G, Wang X, Jin D, Wu M, Ma J, and Sy MS. Potential use of soluble CD44 in serum as indicator of tumor burden and metastasis in patients with gastric or colon cancer. Cancer Res 54 (2): 422-426, 1994.
Harlow L D. Antibodies. Cold Spring Harbor Lab. 1988
Hayden et Mandecki. Gene synthesis by serial cloning of oligonucleotides. DNA 7(8): 5717 (1988).
• * · ·
Heider, Κ.-H., Hofmann, M., Horst, E., van den Berg, F., Ponta, H., Herrlich, P., and Pals,
S.T. A human homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44 is expressed in colorectal carcinomas and adenomatous polyps. J. Cell Biol. 120: 227-233 (1993).
Heider KH, Mulder JWR, Ostermann E,Susani S, Patzelt E, Pals ST, Adolf GRA. Splice variants of the cell surface glycoprotein CD44 associated with metastatic tumor cells are expressed in normal tissues of humans and cynomolgus monkeys. Eur. J. Cancer 31 A: 2385-2391, 1995.
Heider KH, Sproll M, Susani S, Patzelt E, Beaumier P, Ostermann 0, Ahom H, Adolf GRA. Characterization of a high affinity monoclonal antibody antibody specific for CD44v6 as candidate for immunotherapy of squamous cell carcinomas. Cancer Immunology Immunotherapy 43: 245-253,1996.
Hofmann, M., Rudy, W., Zoller, M., T61g, C., Ponta, H., Herrlich P., and Giinthert, U. CD44 splice variants confer metastatic behavior in rats: homologous sequences are expressed in human tumor cell lines. Cancer Res. 51: 5292-5297 (1991).
Johnson S, Bird R E. Construction of single-chain derivatives of monoclonal antibodies and their production in Escherichia coli. Methods Enzymol. 203: 88-98 (1991).
Kabat E. A., Wu T. T., Perry Η. M., Gottesman K. S. and Foeller C. Sequences of Proteins of Immunological Interest (Sth Ed.). NIH Publication No. 91-3242. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991).
Klotz et al, Arch. Biochem. Biophys. 96: 605 (1962).
Koopman, G., Heider, Κ.-H., Horts, E., Adolf, G. R., van den Berg, F., Ponta, H., Herrlich,
P., Pals, S. T. Activated human lymphocytes and aggressive Non-Hodgkin's lymphomas express a homologue of the rat metastasis-associated variant of CD44. J. Exp. Med. 177: 897-904(1993).
• ···
Kreitman R J Hansen H J, Jones A L, FitzGerald D J P, Goldenberg D M, Pastan I. Pseudomonas exotoxin-based inununotoxins containing the antibody LL2 or LL2-Fab' induce regression of subcutaneous human B-cell lymphoma in mice. Cancer Res. 53: 819-825 (1993).
Lambert et al, Biochem. 22: 3913-3920 (1983).
Lambert JM, Derr SM, Cook S, Braman G, Widdison W, Chari RVJ. Pharmacokinetics, in vivo stability, and toxicity of the Tumor-activated prodrug, C242-DM1, a novel colorectal cancer agent. Proceedings of the American Association of Cancer Research (1998) 39: Abs 3550
Liu et al, Biochem. 18: 690 (1979), Blakey and Thorpe, Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 1: 1-16(1988).
Liu C, Tadayoni BM, Bourret LA, Mattocks KM, Derr SM, Widdison WC, Kedersha NL, Ariniello PD, Goldmacher VS, Lambert JM, Blattler WA, Chari RVJ. Eradication of large colon tumor xenografts by targeted delivery of maytansinoids. Proc Natl Acad Sci USA 93: 8618-23,1996.
Martin S, Jansen F, Bokelmann J, and Kolb H. Soluble CD44 splice variants in metastasizing human breast cancer. Int J Cancer 74 (4): 443-445,1997.
Screaton, G.R., Bell, M.V., Jackson, D.G., Cornells, F.B., Gerth, U., and Bell, J. I. Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 12160-12164 (1992).
Shin S-U, Morrison S L. Production and properties of chimeric antibody molecules. Methods Enzymol. 178: 459-476 (1989).
Sliutz G, Tempfer C, Winkler S, Kohlberger P, Reinthaller A, andKainz C. Immunohistochemical and serological evaluation of CD44 splice variants in human ovarian cancer. Br.J.Cancer 72: 1494-1497 (1995).
·♦ ··
Stemmer et al. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides, Gene 164(1): 49-53 (1995).
Stroomer JW, Roos JC, Sproll M, Quak J J, Heider KH, Wilhelm BJ, Castelijns JA, Meyer R, Kwakkelstein MO, Snow GB, Adolf GR, van Dongen GA. Safety and biodistribution of 99mTechnetium-labeled anti-CD44v6 monoclonal antibody BIWA 1 in head and neck cancer patients. Clin Cancer Res 6 (8):3046-55,2000
Tolg, C., Hofmann, M., Henlich, P., and Ponta, H. Splicing choice from ten variant exons establishes CD44 variability. Nucleic Acids. Res. 21: 1225-1229 (1993).
Tolcher AW et al. SB-408075, a maytansinoid immunoconjugate directed to the C242 antigen: a phase I pharmacokinetic and biologic correlative study. Poster presented at 11th Symp. on new drugs in cancer therapy (Nov 7-10, 2000 in Amsterdam).
Urlaub and Chasin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77(7): 4216-20 (1980)
Urlaub et al., Cell 33: 405-412 (1983)
Verel I, Heider KH, Siegmund M, Ostermann E, Patzelt E, Sproll M, Snow GB, Adolf GR, van Dongen GMS. Tumor targeting properties of monoclonal antibodies with different affinity for target antigen CD44v6 in nude mice bearing head-and-neck cancer xenografts. Int. J. Cancer 99: 396-402 (2002).
Winter, G., Griffith, A. D., Hawkins, R. E., Hoogenboom, H. R. Making antibodies by phage display technology. Ann. Rev. Immunol. 12: 433-455 (1994).
Worrell et al, Anti-Cancer Drug Design 1: 179-184 (1986).
Ye et al. Gene synthesis and expression in E. coli for pump, a human matrix metalloproteinase. Biochem Biophys Res Commun 186(1):143-9 (1992).
• 999 • 999
ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
1. Материали и методи
1.1. In vitro анализ за клетъчна пролиферация
За определяне на клетъчната жизненост се използва Cell Titer 96 ® AQUeous не-радиоактивен анализ за клетъчна пролиферация (Promega). Във всяка ямка на 96 ямкови плаки се залагат 5000 клетки в 90 μΐ среда без фенол ред. Клетките се оставят от 1 до 3 часа и след това се добавят серийни разреждания от имуноконюгата в 10 μΐ PBS. Клетки без имуноконюгат се използват като отрицателна контрола. Клетките се инкубират за 4 дена при 37° С в условия на влажност и 5 % СО2 и след това се добавят 20 μΐ MTS/ PMS, съгласно изискванията на производителя. След допълнителна инкубация в продължение на 1 до 4 часа при 37 0 С се отчита абсорбцията при 490 nm, като се използва апарат за отчитане на ELISA плака. За всяка клетъчна линия са анализирани по три повторения. Изчислява се процента на фракцията от преживели клетки и IC50 стойността, като се използва GraphPad Prism ® (Version 3.0) софтуер.
1.2. Получаване на BIWI1
Рекомбинантни антитела, наподобяващи човешките BIWA 4 и BIWA 8, които се свързват специфично с епитоп в SEQ ID NO: 1, се свързват с маитансиноид DM1, както е описано по-долу. Конюгатът на BIWA 4 с DM1 се означава като BIWI 1.
• ·· · ····
Получаване на стабилно трансфектирани клетъчни линии.
Гените, кодиращи леките и тежките вериги на BIWA 4, SEQ ID N0:5 и SEQ ID N0:7 се лигират в експресионен вектор pADCMV1 (W092/01055; NCBI GenBank Номер за достъп А32111) или pAD-CMV19 (NCBI GenBank Номер за достъп А32110). Във второто антитяло BIWA 8, леката верига се кодира от ген, който има SEQ ID N0:9, докато тежката верига е същата, като тази на BIWA 4. Стабилно трансфектираните клетъчни линии се получават чрез електропорация както следва. Използват се СНО DUX/57ss (dhfr негативни мутанти на клетки от яйчник на китайски хамстер, адаптирани като суспензионна култура в безсерумна среда). След трипсинизиране и инактивиране на трипсина с RPMI 10 (90 % RPMI 1640, 10 % топлинно инактивиран фетален телешки серум), клетките се промиват един път с RPMI-0 (RPMI 1640 без серум) и 1х107 клетки се ресуспендират в 0.8 ml RPMI-0. След добавянето на линеализирана ДНК (20 pg на плазмид за котрансфекция на леката и тежка верига), клетките се електропорират, като се използва Hoefer Electroporator при следните условия: 1080 pF, 320 V, 1000 msec, 1 пулс. Клетките се оставят за 5 минути и след това се разреждат до 12500 клетки/ml и 2500 клетки/ml в алфа-МЕМ 10d (90 % MEM алфа без рибонуклеозиди и без дезоксирибонуклеозиди (GIBCO BRL), 10 % топлинно инактивиран диализиран фетален телешки серум). Клетките се залагат в 96 ямкови микротитърни плаки (200 pl/ямка, което отговаря съответно на 2500 и 500 клетки/ямка). Клоновете се • »·· получават след 10 дена. Проследяват се само плаките с по 500 клетки/ямка (3-6 клона на ямка). След 14-15 дни, супернатантите от всяка ямка се анализират в κ/γ ELISA. 53 клона се залагат в 12 ямкови плаки в алфа-МЕМ 10d. След 3-6 дена (в зависимост от конфлуентността на клетките) супернатантите се анализират отново в κ/γ ELISA (серийни разреждания) и се определя количеството, като се използва човешки IgGl стандарт. Клетките се замразяват и се съхраняват в течен азот. IgG съдържанието на 53 клона е в обхвата от 12-417 ng/ml. Подбират се 10 клона с найвисоки нива на експресия и се субклонират както следва: Клетките от всеки клон се залагат в 96 ямкови микротитърни плаки с плътност от 1 и 5 клетки/ямка по 100 μΙ/ямка в алфа-МЕМ 10d (1 плака за всеки клон и за всяка плътност). 8 дена по-късно супернатантите се разреждат 1:2 и 100 μΐ от това разреждане се анализират в κ/γ ELISA и се определя количеството, като се използва BIWA 4 препарат като стандарт. 5 субклона от всеки клон се прехвърлят в 12 ямкови плаки. IgG съдържанието е в обхвата от 1.3 - 908 ng/ml. 14 клона с най-високи нива на експресия (384 - 908 ng/ml) се използват за амплификация с метотрексат, както следва: Първоначално клоновете се култивират в 25 cm2 матраци, които съдържат алфа-МЕМ 10d с 20, 50 и 100 пМ метотрексат. След размножаването на клоновете, супернатантите се анализират в κ/γ ELISA. При последващите цикли на амплификация, концентрацията на метотрексата се повишава до 2000 пМ. Първоначално, най-високото ниво на експресия е в обхвата от 10.5 - 14.8 pg/ml (клон А 31/100, 100 пМ метотрексат). Последващата амплификация с концентрация на метотрексат 500 пМ дава експресия от 19-20 pg/ml (АЗ 1/500).
• ···
Пречистване на антитялото.
Антитялото се пречиства от супернатантата на клетъчната култура, както следва. Супернатантата на тъканно клетъчната култура, съдържаща антитялото се нанася върху 5 ml протеин А сефарозна колона със скорост на потока 80-90 ml/час при 4°С. След промиване с 50 ml буфер за свързване (0.1 М натриев фосфат pH 7.5), Ig фракцията се елюира с буфер за елюиране (0.1 М глицин-HCl pH 2.7). Проследява се абсорбцията при 280 nm.
Модифициране на BIWA 4 с SPP за образуване на 4-SS-Py.
BIWA 4 се прилага в течна форма в концентрация от 5 mg/mL в PBS формулировка, съдържаща Tween 20. Преди свързването на DM1 I с Mab, Tween 20 се отстранява. МаЬ разтворът (40 mL) се разрежда 15 пъти с 25 mM MES буфер, pH 5.6, съдържащ 50 тМ NaCl (MES буфер) и след това се нанася върху колона (12.5 mL) от Sepharose S, уравновесена с MES буфер (скорост на потока: 100 см/час). Колоната се измива с 10 колонни обема от MES буфер. Антитялото се елюира с MES буфер, съдържащ 400 mM NaCl. Разтворът на антитялото се диализира срещу 50 тМ калиево фосфатен буфер, pH 6.5, съдържащ 50 тМ NaCl и 2 тМ EDTA (Буфер A). BIWA 4 антитялото се модифицира като се използва SPP (N-хидрокси сукцинимид естер на (2Пиридил)-5-дитиопентаноева киселина), за да се въведат дитиопиридил групи. МАЬ в Буфер А (185 mg, 8 mg/mL) се модифицира със 7-кратен моларен излишък от SPP в EtOH (5 % v/v от MAb разтвора). Реакцията продължава 90 минути на стайна температура. След това реакционната смес се подлага на хроматография, чрез гел-филтрация, през Sephadex G 25F (2.6 х
31.5 cm колона, 167 mL) уравновесена с Буфер А. МАЬсъдържащите фракции се събират и се определя степента на модификация чрез измерване на абсорбцията при 280 nm и промяната на абсорбцията при 343 nm, предизвикана от освобождаването на 2-меркаптопиридин при добавянето на DTT. Концентрацията на освободеният 2-меркаптопиридин се изчислява, като се използва e343nm от 8080 М'1 cm1, а концентрацията на МаЬ се изчислява, като се използва ε280ηηι от 224,000 М'1 cm’1, след като абсорбция при 280 nm се коригира поради участието на 2-меркаптопиридин. (2-меркаптопиридин А 280 nm = А 343 nm х 5100/8080). Възстановяването на МАЬ е 99.6 % с
5.5 освободени 2-меркаптопиридинови групи, свързани за МАЬ молекула.
Конюгиране на BIWA 4 - SS - Ру с DM1.
Гореописаното модифицирано МАЬ (184 mg) в Буфер А е конюгирано в концентрация 2.5 mg MAb/mL, като се използва 1.7пъти моларен излишък от DM1 в сравнение с 2меркаптопиридиновите групи, които се освобождават. DM1 се добавя в DMA (3 % v/v от разтвора на МАЬ) и реакционната смес се инкубира на стайна температура в продължение на 29 часа. Конюгатът след това се изолира, чрез хроматография с гелфилтрация върху колона от Sephacryl S 300 HR уравновесена в PBS (5 х 50 cm колона, 980 mL със скорост на потока 10 ст/час).
Конюгатът се елюира като единичен пик в позицията на t мономерното МАЬ с малко количество от белтъка, елюиран порано. Фракциите се анализират за броят на DM1 молекулите, свързани към МАЬ молекула (Свързаните DM1 молекули се определят, чрез измерване на абсорбцията, както при 252 nm, така и при 280 nm). Въз основа на резултатите се събират фракциите представляващи 63-77 % от обема на колоната. Намерено е, че съотношението DM 1/МАЬ в събрания разтвор е 3.1 и добивът на конюгирания BIWA 4 е 75 % въз основа на изходното МАЬ. Конюгатът BIWI 1 се оценява, чрез SDS-PAGE, която се провежда при не-редуциращи условия и е намерено, че е съставен предимно от мономерни видове (> 95 %) със минимално количество (< 5 %) от димерен конюгат.
Анализ на in vitro свързване на BIWI1
Определя се свързването на BIWA 4 анитяло и BIWI 1, конюгирани с антиген-положителни FaDu клетки. Клетките (1-2 х 10 ’5) се инкубират в 96 ямкови плаки с вариращи концентрации от антитяло или се конюгират върху лед в продължение на 1 час. Пробата за анализ се промива от плаката и се добавя FITCбелязано анти-човешко IgG и инкубацията върху лед продължава на тъмно в продължение на 1 час. След промиване, клетките се фиксират с 1 % параформалдехид и се анализират в флуоресцентно активиран клетъчен сортер (FACS). BIWA 4 антитялото се свързва с ясно дефинирана Ка от 1 х 10 9 М, a BIWI 1 се свързва с ясно дефинирана Ка от 1.8 х 10 “9 М. Следователно, конюгирането с DM1 променя свързващият афинитет на антитялото само съвсем слабо, ако въобще има такова.
1.3. Ефективност на изследванията с голи мишки
In vivo анти-туморната ефективност на BIWI 1 се анализира в два модела на кръстосани присадки в голи мишки, като се прилагат антиген-положителни човешки тумори, които се различават по произход на тумора, степен и хомогенност на CD44v6 експресията: А431 (АТСС # CRL 1555; епидермоидна карцинома от вулва), FaDu (АТСС # НТВ 43; сквамозна клетъчна карцинома от фарингс). Туморните клетъчни линии А431 и FaDu са получени от АТСС и са култивирани в RPMI 1640 среда, съдържаща 10 % фетален говежди серум и добавки. Мишките се разпределят случайно в следните групи за третиране (третиране/начален параметър на тумора, обем/тумор, обем обхват/брой на мишките):
A 431
Група 1
Група 2 мишки
Група 3 мишки
Група 4
Контрола (PBS)/185 + 217 mm3/19 - 424 mm3/5 мишки
BIWA 4 (21 mg/kg/d)/ 133 ± 115 mm3/42 - 302 mm3/ 5
BIWI 1 (2.1 mg/kg/d)/ 107 ± 63 mm3/42 - 205 mm3/ 5
BIWI 1 (7 mg/kg/d)/ 132 + 73 mm3/42 - 205 mm3/ 5 мишки ····
Група 5 BIWI 1 (21 mg/kg/d)/ 107 ± 63 mm3/42 - 205 mm3/ 5 мишки
FaDu
Група 1 Контрола (PBS)/ 142 + 82 mm3/34 - 268 mm3/ 8 мишки
Група 2 BIWA 4 (21 mg/kg/d)/ 134 + 86 mm3/42 - 268 mm3/ 6 мишки
Група 3 BIWI 1 (2.1 mg/kg/d)/ 149 + 96 mm3/50 - 268 mm3/ 6 Q мишки
Група 4 BIWI 1 (7 mg/kg/d)/ 132 + 97 mm3/42 - 268 mm3/ 6 мишки
Група 5 BIWI 1 (21 mg/kg/d)/ 129 ± 74 mm3/50 - 231 mm3/ 6 мишки x 106 туморни клетки се трансплантират подкожно в десния хълбок на 6 седмични женски мишки NMRI-nu/nu мишки. Третирането започва, когато туморите достигнат среден размер от 107 до 185 mm3. Третирането се състои от i.v. инжекции с BIWI 1 © давани в пет последователни дни, като се започва от ден 1. 3 различни дози от BIWI 1 се анализират паралелно: 2.1 mg/kg/d BIWI 1 съответстващ на 30 pg/kg/d DM1, 7 mg/kg/d BIWI 1 съответстващ на 100 pg /kg/d DM1, и 21 mg/kg/d BIWI 1 съответстващ на 300 pg/kg/d DM1. Контролните животни или не са третирани (PBS) или са третирани с не-конюгирано антитяло (контролно антитяло, 21 mg/kg/d). Туморният растеж се проследява чрез измерване на растежа на тумора. Туморният отговор се оценява като пълен отговор, когато туморът изчезне ♦ ··♦ напълно във всяко едно време след началото на лечението. Отговорът се оценява, като частичен отговор, когато туморният обем намалява след лечение, но след това отново започва растежа. Поносимостта на лечението се контролира, чрез измерване на теглото на мишката, по време на целия наблюдаван период.
2. Резултати и обсъждане
2.1. In vitro цитотоксичност на BIWI1
In vitro цитотоксичността на BIWI 1 се оценява чрез използване на антиген-положителните клетъчни линии А431 и FaDu и антиген-отрицателната клетъчна линия А459. Клетките се излагат на различни концентрации от BIWI 1 в продължение на 4 дни, след това се оцветяват с MTS/ PMS и се анализират с ELISA апарат за отчитане на плаки. След това се изчисляват фракциите с жизнените клетки, като се използва GraphPad Prism® софтуерен пакет. Резултатите са показани на Фигура 1. BIWI 1 е ефективен при убиване на антиген-положителните А 431 клетки, с 1С50 от
Q около 7.6 х 10' Ми втора антиген-положителна клетъчна линия, FaDu с 1С5о от около 2.4 х 10’8 М. Антиген-отрицателната клетъчна линия А549 се повлиява от конюгата с IC50 от около 1.3 х 10' М с фракция от преживели клетки от 50 % при най-високата анализирана концентрация на BIWI 1 (5 х 10‘7 М). Тези резултати показват, че BIWI 1 е само малко по-цитотоксичен за антигенпозитивните клетки, в сравнение с антиегн-негативните клетки in vitro. Показано е за сравнение, че друг DM 1-антитяло конюгат е ··♦· поне 1000 пъти по-цитотоксичен за антиген-позитивни клетки, в сравнение с антиген-негативни клетки (Chari et al., 1992).
2.2. Ефективност при А431 кръстосано-присаден модел на голи мишки
Групи от 5 мишки се третират съответно с 2.1 mg/kg/d BIWI 1, 7 mg/kg/d BIWI 1, 21 mg/kg/d BIWI 1 и 21 mg/kg/d контролно антитяло. Средният размер на тумора в началото на третирането е съответно 185 +/- 217 mm3 (PBS), 133 +/- 115 mm3 (контролно антитяло), 107 +/- 63 mm3 (21 mg/kg/d BIWI 1), 132 +/- 73 mm3 (7 mg/kg/d BIWI 1), и 107 +/- 63 mm3 (2.1 mg/kg/d BIWI 1). Ha Фигура 2 е показан средният обем на тумор за всяка група по време на периода на наблюдение. Туморите третирани с контролно антитяло показват сходен растеж по подобие на не-третираните тумори, времето за удвояване на туморния обем е приблизително 5 дена. При животни, третирани или със 7 mg/kg/d BIWI 1 или с 21 mg/kg/d BIWI 1 всички тумори отговарят напълно и изчезват около ден 17. До края на наблюдавания период (ден 134) не се наблюдава отново растеж на тумора. Туморите, третирани с 2.1 mg/kg/d отговарят напълно в 3/5 случая на не-туморния възстановяем растеж до 134 ден. Останалите 2 тумора, показват частичен отговор, но в крайна сметка започват да растат отново. Тези резултати показват, че BIWI 1 индуцира дозо-зависим антитуморен отговор в А431 кръстосано-присаден модел на голи мишки със завършени продължителни отговори от 2.1 mg/kg/d BIWI 1 до 21 mg/kg/d BIWI 1. Не-конюгираното контролно антитяло не показва противотуморен ефект.
Виж фигура 2.
2.3. Ефектнивост при FaDu кръстосано-присаден модел на голи мишки
Групи от 6 мишки се третират съответно с 2.1 mg/kg/d BIWI 1, 7 mg/kg/d BIWI 1, 21 mg/kg/d BIWI 1 и 21 mg/kg/d контролно антитяло. Средният размер на тумора в началото на третирането е съответно 142 +/- 82 mm3 (PBS), 134 +/- 86 mm3 (контролно антитяло), 129 +/- 74 mm3 (21 mg/kg/d BIWI 1), 132 +/- 97 mm3 (7 mg/kg/d BIWI 1), и 149 +/- 96 mm3 (2.1 mg/kg/d BIWI 1). Ha Фигура 3 е показан средният обем на тумор за всяка група по време на периода на наблюдение. Туморите третирани с контролно антитяло и с 2.1 mg/kg/d BIWI 1 показват сходен растеж по подобие на не-третираните тумори, времето за удвояване на туморния обем е приблизително 5 дена. При животни, третирани със 21 mg/kg/d BIWI 1 всички тумори отговарят напълно и изчезват около ден 24. До края на наблюдавания период (ден 107) не се наблюдава отново растеж на тумора. 1/6 от туморите, третирани със 7 mg/kg/d BIWI 1 отговарят напълно, а 3/6 от туморите показват частични отговори. Останалите 2 тумора растат по подобен начин в сравнение с не-третираната контрола. Тези резултати показват, че BIWI 1 индуцира дозо-зависим антитуморен отговор в FaDu кръстосано-присаден модел на голи мишки със завършени продължителни отговори от 7 mg/kg/d BIWI 1 до 21 mg/kg/d BIWI 1. Не-конюгираното контролно антитяло не показва противо-туморен ефект.
Виж Фигура 3.
2.4. Поносимост в голи мишки
Поносимостта на лечението е BIWI 1 се определя, чрез контролиране на теглото на мишките по време на цялото времетраене на експеримента в двата модела. Наблюдаваната средна максимална загуба на тегло за група е 5 % във FaDu крастосано-присаден модел мишки, третирани с 21 mg/kg/d BIWI 1 (Фигура 4). Загубата на тегло започва от третия ден на третирането и продължава до 10 ден, след което животните увеличават теглото и имат подобно поведение, подобно на контролните животни. Във всички други дозирани групи, загубата на тегло е сходна с контролната, която получава PBS. Средната загуба на тегло от 5 % или по-малко от всички третирани групи, показва добра поносимост на лечението с BIWI 1 при дадените дози в голи мишки. Тъй като BIWI 1 не реагира кръстосано с мишия BIWI 1 CD44v6, само антиген-независимите ефекти, такива като токсичност, причинена от свободен DM1 може да бъде контролирана в този експеримент.
3. In vivo анти-туморна ефективност в МРА - MB 453
3.1. Материали и методи
In vivo анти-туморната ефективност на BIWI 1 се анализира в кръстосано-присаден модел на голи мишки, като се прилага антиген-позитивен човешки тумор MDA-MB 453 (АТСС # НТВ
131; карцином на гърдата). Клетките се получават от АТСС и се култивират в RPMI 1640 среда, съдържаща 10 % фетален телешки серум и добавки. 1 х 10 6 туморни клетки се трансплантират подкожно в десния хълбок на женски 6 месечни NMRI-nu/nu мишки. Туморите, служещи за експеримент на туморна терапия, се подържат чрез пасажиране на туморни фрагменти. Лечението започва, когато туморите достигнат среден размер от 188 до 246 mm . Лечението се състои от i.v. инжекции на BIWI 1, който се подава ежеседмично за 4 седмици. Паралелно са анализирани 3 различни дози от BIWI 1: 6.25 mg/kg BIWI 1 съответстваща на 100 pg/kg DM 1, 12.5 mg/kg BIWI 1 съответстваща на 200 pg/kg DM 1 и 25 mg/kg BIWI 1 съответстваща на 400 pg/kg DM 1. PBS третираните животни служат като контрола за туморния растеж. Туморният растеж се следи чрез измерване на размера на тумора. Туморният отговор се оценява като пълен отговор, когато туморът изчезне напълно в което и да е време след началото на лечението.
3.2. Резултати и обсъждане
Групи от 6 мишки се третират съответно с 6.25 mg/kg BIWI 1, 12.5 mg/kg BIWI 1 и 25 mg/kg BIWI 1 веднъж седмично за 4 седмици. Средният размер на тумора в началото на третирането е съответно 246 +/- 79 mm3 (PBS), 216+/- 85 mm3 (6.25 mg/kg BIWI 1), 188 +/- 79 mm’ (12.5 mg/kg BIWI 1) и 207 +/- 96 mm3 (25 mg/kg BIWI 1). Средният обем на тумор за всяка група по време на периода на наблюдение е показан на Фигура 5. Времето за удвояване на началния обем на тумора на контролните тумори е приблизително 5 дена. При животни, третирани с 25 mg/kg BIWI 1, всички тумори отговарят напълно и изчезват около ден 22 след началото на третирането. До края на наблюдавания период (ден 64) не се наблюдава отново растеж на тумора. Туморите, третирани с 12.5 mg/kg или с 6.25 mg/kg отговарят напълно в 5/6 от случаите във всяка дозирана група и 4 животни от всяка група остават без тумори до края на експеримента. Тези резултати показват, че BIWI 1 индуцира отлични туморни отговори в MDAМВ 453 кръстосано-присаден модел мишки, когато се подава един път седмично за период от 4 седмици с пълни и продължителни отговори от 6.25 mg/kg BIWI 1 до 25 mg/kg BIWI 1.
ФИГУРИ
Фигура 1: In vitro цитотоксичност на BIWI 1. Използват се антиген-позитивните клетъчни линии А431 и FaDu, както и антиген-негативната клетъчна линия А549.
Фигура 2: Ефективност на BIWI 1 третирането при кръстосаноприсаден модел на голи мишки с А431 тумори. Показани са средните обеми на туморите за група със стандартните отклонения, посочени са третираните групи. Стрелката показва началото на лечението (ден 1).
Фигура 3: Ефективност на третирането с BIWI 1 при кръстосаноприсаден модел на голи мишки с FaDu тумори. Показани са средните обеми на туморите за група, със стандартните отклонения, посочени са третираните групи. Стрелката показва началото на лечението (ден 1).
··»·
Фигура 4: Поносимост на третирането с BIWI 1. Показана е промяната в средното телесно тегло на всички групи в 2 изследвани модела. Ден : начало на лечението.
Фигура 5: Ефективност на третирането с BIWI 1 в кръстосаноприсаден модел на голи мишки със MS-MDA-MB 453 тумори. Показани са средните обеми на туморите за група, със стандартните отклонения, посочени са третираните групи. Стрелките показват дните на третиране.
···· • ·
ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ
Claims (37)
- ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ1. Съединение с формулаA(LB)n къдетоА е молекула на антитяло която е специфична за CD44;L е линкерна група;В е съединение, което е токсично за клетки; и η е десетично число с η = 1 до 10
- 2. Съединението, съгласно Претенция 1 където спомената линкерна група има химична връзка, способна да се разгражда вътре в клетката.
- 3. Съединението, съгласно Претенция 2, където споменатата химична връзка е дисулфидна връзка.
- 4. Съединението, съгласно Претенции от 1 до 3, където молекулата на антитялото е специфична за екзона ν6 на човешки CD44.
- 5. Съединението, съгласно Претенции от 1 до 4, където молекулата на антитялото е специфична за епитоп от аминокиселинната последователност на SEQ ID NO: 3.
- 6. Съединението, съгласно Претенции от 1 до 5, където молекулата на антитялото е моноклоналното антитяло VFF-18 (DSM АСС2174) или рекомбинантно антитяло, което има комплиментарно детерминиращи области (CDRs) на VFF-18.
- 7. Съединението, съгласно Претенции от 1 до 6, където молекулата на антитялото включва леки вериги, които имат аминокиселинна последователност SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO:
··♦· * · * е 49 ·· · ·· • • • ♦ ·· • · • • • * · · ,· ···. • · · ! - 8 и тежки вериги, които имат аминокиселинна последователност SEQ ID NO: 6.8. Съединението, съгласно Претенции от 1 до 7, където токсичното съединение В е маитансиноид.
- 9. Съединението, съгласно Претенция 8, където маитансиноидът има формула (Формула (II)) къдетоRi представлява Н или SR4, където R4 представлява метил, етил, линеен алкил, разклонен алкил, цикличен алкил, прост или заместен арил, или хетероциклик;R2 представлява С1 или Н;R3 представлява Н или СН3; и m представлява 1,2, или 3.
• • · • • • ·** ···· • • • « • • • * · л 9 • • • 9 • • * .· ···. ·: : < • ·· • · · : А * · - 10. Съединението, съгласно Претенция 9, където R] е Н илиСН3, R2 е Cl, R3 е СН3, и m = 2
- 11. Съединението, съгласно Претенции от 1 до 10 с формулаА е молекула на антитяло, която е специфична за CD44, (L') е линкерна група по избор р е десетично число с р = 1 до 10
- 12. Съединението, съгласно Претенции от 1 до 11 където р е от 3 до 4.
- 13. Конюгат на молекула на антитяло специфична за CD44v6 и маитансиноид.
• ·· • • • ···· 9 • : · • ·· • • • • ··· 9 • ··· • ··· - 14. Конюгатът, съгласно Претенция 13, където молекулата на антитяло е специфична за епитоп от аминокиселинна секвенция SEQ ID N0:3.
- 15. Конюгат, съгласно Претенция 14, където молекулата на антитялото е моноклонално антитяло VFF-18 (DSM АСС2174) или рекомбинантно антитяло, имащо комплиментарно детерминиращи области (CDRs) от VFF-18.
- 16. Конюгатът, съгласно всяка една от Претенции от 13 до15, където споменатата молекула на антитялото включва леки вериги, притежаващи аминокиселинна секвенция SEQ ID N0:4 или SEQ ID N0: 8 и тежки вериги, притежаващи аминокиселинна секвенция SEQ ID N0: 6.
- 17. Конюгатът, съгласно всяка една от Претенции от 13 до16, където маитансиноидът е свързан с молекулата на антитялото, чрез дисулфидна група.
- 18. Конюгатът съгласно всяка една от Претенции от 13 до 17, където майтансиноидът има формулаФормула (IV) • ·· ·
- 19. Конюгатът на молекулата на антитяло специфично за CD44v6 и маитансинод, където антитялото включва леки вериги, които имат аминокиселинната последователност SEQ ID N0:4 и тежки вериги, които имат аминокиселинната последователност на секвенция SEQ ID N0: 6 и където маитансиноидът има формулатаФормула (IV) и е свързан с антитялото чрез дисулфидна връзка.
- 20. Конюгатът, съгласно всяка една от Претенции от 13 до 19, където един или повече маитансиноидни остатъци са свързани с молекула на антитялото.
- 21. Конюгатът, съгласно Претенция 20, където от 3 до 4 маитансиноидни остатъци са свързани за молекулата на антитялото.
- 22. Конюгатът, съгласно всяка една от Претенции от 13 до 21, където маитансиноидът е свързан с молекулата на антитялото • · • · · · чрез -S-CH2CH2-CO-, -S-CH2CH2CH2CH2-CO, или -SCH(CH3)CH2CH2-CO- група.
- 23. Метод за получаване на съединение A(LB)n, съгласно Претенции от 1 до 12, или конюгат съгласно Претенции от 13 до 22, характеризиращ се с това че включва етапите:(а) въвеждане на една или повече свободни или защитени тиолови групи в молекула на антитяло, която е специфична за CD44;(б) взаимодействие на молекулата на антитялото от етап (а) със съединение, което е токсично за клетките, като споменатото съединение има една или повече дисулфидни или тиолови групи; и (в) събиране на полученият конюгат
- 24. Методът, съгласно Претенция 23, характеризиращ се с това че молекулата на антитялото е специфична за CD44v6.
- 25. Методът, съгласно Претенция 24, характеризиращ се с това, че молекулата на антитялото е специфична за епитоп от SEQ ID N0:3.
- 26. Методът, съгласно всяка една от Претенции от 23 до 25, характеризиращ се с това, че токсичното съединение е маитансиноид.
- 27. Методът, съгласно Претенция 26, характеризиращ се с това, че маитансиноидът има формула • ··· • · • · ··· ·Формула II къдетоRi представлява Н или SR4, където R4 представлява метил, етил, линеен алкил, разклонен алкил, цикличен алкил, прост или заместен арил или хетероциклик;R.2 представлява С1 или Н;R3 представлява Н или СН3; и m представлява 1, 2 или 3.
- 28. Методът, съгласно Претенция 27, характеризиращ се с това, че Rt е Н или СН3, R2 е Cl, R3 е СН3 и m = 2.
- 29. Методът, съгласно всяка една от Претенции от 23 до 28, характеризиращ се с това че N-хидрокси сукцинимид естер на (2пиридил)-3-дитиопропаноевата киселина, N-хидрокси сукцинимид естер на (2-пиридил)-4-дитиопентаноевата киселина, или Nхидрокси сукцинимид естер на (2-пиридил)-5-дитиопентаноевата киселина се използва за да се въведат свободни или защитени тиолови групи в молекулата на антитялото.• · · · · · ·· « · 9 · ·55.......... *..··..*
- 30. Съединение, получено чрез метод, характеризиращ се съгласно всяка една от Претенции от 23 до 29.
- 31. Фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва съединение с формула A (LB)n, съгласно всяка една от Претенции от 1 до 12, или 30, или конюгат, съгласно Претенции от 13 до 22, и фармацевтично приемлив носител, разредител или ексципиент.
- 32. Използване на съединение A(LB)n, съгласно Претенции от 1 до 12, или 30, или конюгат съгласно Претенции от 13 до 22, за приготвяне на фармацевтичен състав за лечение на рак.
- 33. Използване, съгласно Претенция 32, където ракът е сквамозна клетъчна карцинома на главата и врата, сквамозна клетъчна карцинома на езофагуса, сквамозна клетъчна карцинома на белия дроб, сквамозна клетъчна карцинома на кожата, сквамозна клетъчна карцинома на шийката на матката, аденокарцинома на гърдите, аденокарцинома на белия дроб, аденокарцинома на панкреаса, аденокарцинома на дебелото черво или аденокарцинома на стомаха.
- 34. Използване на съединение A(LB)n, съгласно Претенции от 1 до 12 или 30, или на конюгат, съгласно Претенции от 13 до 22, или фармацевтичен състав, съгласно Претенция 31, за лечение на рак.
- 35. Използването, съгласно Претенция 34, където ракът е сквамозна клетъчна карцинома на главата и врата, сквамозна клетъчна карцинома на езофагуса, сквамозна клетъчна карцинома на белия дроб, сквамозна клетъчна карцинома на кожата, сквамозна клетъчна карцинома на шийката на матката, аденокарцинома на гърдите, аденокарцинома на белия дроб, • · «· аденокарцинома на панкреаса, аденокарцинома на дебелото черво или аденокарцинома на стомаха.
- 36. Използване, съгласно всяка една от Претенции от 1 до 12, или 30 или на конюгат съгласно Претенции от 13 до 22 или фармацевтичен състав, съгласно Претенция 31, за лечение на рак в пациент, който се нуждае от него, включващо прилагане на пациента на терапевтично ефективно количество от съединението A(LB)n.
- 37. Използването, съгласно Претенция 36, където ракът е сквамозна клетъчна карцинома на главата и врата, сквамозна клетъчна карцинома на езофагуса, сквамозна клетъчна карцинома на белия дроб, сквамозна клетъчна карцинома на кожата, сквамозна клетъчна карцинома на шийката на матката, аденокарцинома на гърдите, аденокарцинома на белия дроб, аденокарцинома на панкреаса, аденокарцинома на дебелото черво или аденокарцинома на стомаха.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01112227A EP1258255A1 (en) | 2001-05-18 | 2001-05-18 | Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid |
| PCT/EP2002/005413 WO2002094325A2 (en) | 2001-05-18 | 2002-05-16 | Cytotoxic cd44 antibody immunoconjugates |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG108366A true BG108366A (bg) | 2004-09-30 |
Family
ID=8177473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG108366A BG108366A (bg) | 2001-05-18 | 2003-11-17 | Имуноконюгати от цитотоксични антитела за cd44 |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1258255A1 (bg) |
| JP (1) | JP2004529963A (bg) |
| KR (1) | KR20030097883A (bg) |
| CN (1) | CN1509187A (bg) |
| AR (1) | AR035977A1 (bg) |
| BG (1) | BG108366A (bg) |
| BR (1) | BR0209862A (bg) |
| CA (1) | CA2443438A1 (bg) |
| CO (1) | CO5550468A2 (bg) |
| CZ (1) | CZ20033477A3 (bg) |
| EA (1) | EA200301159A1 (bg) |
| EE (1) | EE200300568A (bg) |
| HR (1) | HRP20030932A2 (bg) |
| HU (1) | HUP0400046A3 (bg) |
| IL (1) | IL157965A0 (bg) |
| MX (1) | MXPA03010432A (bg) |
| NO (1) | NO20035108D0 (bg) |
| NZ (1) | NZ530167A (bg) |
| PE (1) | PE20021097A1 (bg) |
| PL (1) | PL365480A1 (bg) |
| SK (1) | SK15582003A3 (bg) |
| WO (1) | WO2002094325A2 (bg) |
| YU (1) | YU91503A (bg) |
| ZA (1) | ZA200307364B (bg) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8071072B2 (en) * | 1999-10-08 | 2011-12-06 | Hoffmann-La Roche Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44 |
| US6441163B1 (en) | 2001-05-31 | 2002-08-27 | Immunogen, Inc. | Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents |
| US7084257B2 (en) | 2001-10-05 | 2006-08-01 | Amgen Inc. | Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity |
| EP1417974A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-05-12 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and radiotherapy |
| DE10256083A1 (de) * | 2002-11-29 | 2004-08-12 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung von heterologen Genprodukten und Selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante Zellen |
| US7384744B2 (en) | 2002-11-29 | 2008-06-10 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg | Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products |
| US7276497B2 (en) | 2003-05-20 | 2007-10-02 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising new maytansinoids |
| DK1651162T3 (en) * | 2003-05-20 | 2016-02-01 | Immunogen Inc | IMPROVED CYTOTOXIC AGENTS WITH NEW MAYTANSINOIDS |
| DE602004031239D1 (de) * | 2003-07-21 | 2011-03-10 | Immunogen Inc | Verfahren zu dessen anwendung |
| EP1716179A2 (en) * | 2004-02-12 | 2006-11-02 | Morphotek, Inc. | Monoclonal antibodies that specifically bind to folate receptor alpha |
| NZ555601A (en) * | 2004-12-09 | 2009-07-31 | Centocor Inc | Anti-integrin immunoconjugates, methods and uses |
| US20060182750A1 (en) * | 2005-02-11 | 2006-08-17 | Immunogen, Inc. | Process for preparing stable drug conjugates |
| EP1861425B1 (en) | 2005-03-10 | 2012-05-16 | Morphotek, Inc. | Anti-mesothelin antibodies |
| CN101374545B (zh) * | 2005-04-15 | 2012-03-28 | 免疫基因公司 | 消除肿瘤中的异质或混合细胞群体 |
| EP2172487A1 (en) | 2005-04-22 | 2010-04-07 | Morphotek Inc. | Antibodies with Immune Effector Activity that Internalize in Folate Receptor Alpha-Positive Cells |
| EP1928503B1 (en) | 2005-08-24 | 2012-10-03 | ImmunoGen, Inc. | Process for preparing maytansinoid antibody conjugates |
| EP1806365A1 (en) * | 2006-01-05 | 2007-07-11 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them |
| AR059900A1 (es) * | 2006-03-17 | 2008-05-07 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-tat226 e inmunoconjugados |
| PL2437790T3 (pl) | 2009-06-03 | 2019-09-30 | Immunogen, Inc. | Sposoby sprzęgania |
| TW201117814A (en) * | 2009-10-02 | 2011-06-01 | Sanofi Aventis | New maytansinoids and the use of said maytansinoids to prepare conjugates with an antibody |
| KR20220123130A (ko) | 2011-03-29 | 2022-09-05 | 이뮤노젠 아이엔씨 | 일-단계 방법에 의한 메이탄시노이드 항체 접합체의 제조 |
| CN102337298B (zh) * | 2011-08-19 | 2013-11-06 | 黄开红 | 一种输送siRNA的免疫纳米载体及其制备方法和应用 |
| SG11201502429YA (en) | 2012-10-04 | 2015-04-29 | Immunogen Inc | Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates |
| GB201220889D0 (en) * | 2012-11-21 | 2013-01-02 | Kit Karlsrusher Inst Fuer Technologie Und Inst Fuer Toxikologie Und Genetik And Amcure Gmbh | CD44v6-derived peptides for treating metastasizing cancers |
| GB201220891D0 (en) * | 2012-11-21 | 2013-01-02 | Kit Karlsrusher Inst Fuer Technologie Und Inst Fuer Toxikologie Und Genetik And Amcure Gmbh | CD44v6-derived peptides for treating breast cancers |
| GB201220901D0 (en) | 2012-11-21 | 2013-01-02 | Kit Karlsrusher Inst Fuer Technologie Und Inst Fuer Toxikologie Und Genetik And Amcure Gmbh | CD44v6-derived peptides for treating pancreatic cancer |
| GB201220899D0 (en) * | 2012-11-21 | 2013-01-02 | Kit Karlsrusher Inst Fuer Technologie Und Inst Fuer Toxikologie Und Genetik And Amcure Gmbh | CD44v6-derived pegylated peptides |
| KR102252925B1 (ko) | 2013-08-26 | 2021-05-18 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 마크롤라이드 디아스테레오머를 포함하는 약제학적 조성물, 이의 합성 방법 및 치료학적 용도 |
| GB201421647D0 (en) | 2014-12-05 | 2015-01-21 | Amcure Gmbh And Ruprecht-Karls-Universitat And Karlsruher Institut F�R Technologie | CD44v6-derived cyclic peptides for treating cancers and angiogenesis related diseases |
| WO2016150521A1 (en) * | 2015-03-26 | 2016-09-29 | Fundación Imdea Nanociencia | Functionalised magnetic nanoparticle |
| JP7540683B2 (ja) | 2016-06-06 | 2024-08-27 | ノースウェスタン ユニバーシティ | 融合タンパク質コンストラクト |
| EP3755717A4 (en) * | 2018-02-22 | 2022-01-26 | Multitude Inc. | THERAPEUTIC ANTIBODIES AND ASSOCIATED USES |
| CN114057874B (zh) * | 2020-07-31 | 2023-05-05 | 北京市神经外科研究所 | 抗cd44的单链抗体及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2026147C (en) * | 1989-10-25 | 2006-02-07 | Ravi J. Chari | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
| US5208020A (en) * | 1989-10-25 | 1993-05-04 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
| UY24389A1 (es) * | 1995-12-06 | 2001-10-25 | Karlsruhe Forschzent | Composición farmacéutica para el tratamiento de carcinoma de epitelio plano |
| DE19648209A1 (de) * | 1996-11-21 | 1998-05-28 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Tumorzelldepletion CD34-positiver Zellen |
| DE19708713C2 (de) * | 1997-03-04 | 2002-11-28 | Boehringer Ingelheim Int | Verwendung von anti-CD44 Antikörpern enthaltenden Präparationen zur Behandlung bestimmter Tumore und zur Unterdrückung von Immunreaktionen |
| ES2466715T3 (es) * | 1999-06-25 | 2014-06-11 | Immunogen, Inc. | Métodos de tratamiento usando conjugados de anticuerpo anti-ErbB-maitansinoide |
| CA2385528C (en) * | 1999-10-01 | 2013-12-10 | Immunogen, Inc. | Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents |
-
2001
- 2001-05-18 EP EP01112227A patent/EP1258255A1/en not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-05-16 EA EA200301159A patent/EA200301159A1/ru unknown
- 2002-05-16 NZ NZ530167A patent/NZ530167A/en unknown
- 2002-05-16 BR BR0209862-8A patent/BR0209862A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-05-16 KR KR10-2003-7015037A patent/KR20030097883A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-05-16 SK SK1558-2003A patent/SK15582003A3/sk not_active Application Discontinuation
- 2002-05-16 YU YU91503A patent/YU91503A/sh unknown
- 2002-05-16 HU HU0400046A patent/HUP0400046A3/hu unknown
- 2002-05-16 CZ CZ20033477A patent/CZ20033477A3/cs unknown
- 2002-05-16 EE EEP200300568A patent/EE200300568A/xx unknown
- 2002-05-16 WO PCT/EP2002/005413 patent/WO2002094325A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-05-16 PL PL02365480A patent/PL365480A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-05-16 JP JP2002591041A patent/JP2004529963A/ja active Pending
- 2002-05-16 CN CNA028101634A patent/CN1509187A/zh active Pending
- 2002-05-16 CA CA002443438A patent/CA2443438A1/en not_active Abandoned
- 2002-05-16 IL IL15796502A patent/IL157965A0/xx unknown
- 2002-05-16 MX MXPA03010432A patent/MXPA03010432A/es not_active Application Discontinuation
- 2002-05-16 EP EP02753054A patent/EP1395290A2/en not_active Withdrawn
- 2002-05-17 PE PE2002000420A patent/PE20021097A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-05-17 AR ARP020101829A patent/AR035977A1/es not_active Application Discontinuation
-
2003
- 2003-09-22 ZA ZA200307364A patent/ZA200307364B/en unknown
- 2003-11-14 HR HR20030932A patent/HRP20030932A2/xx not_active Application Discontinuation
- 2003-11-17 BG BG108366A patent/BG108366A/bg unknown
- 2003-11-17 NO NO20035108A patent/NO20035108D0/no not_active Application Discontinuation
- 2003-11-18 CO CO03101695A patent/CO5550468A2/es not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002094325A3 (en) | 2003-04-17 |
| PL365480A1 (en) | 2005-01-10 |
| KR20030097883A (ko) | 2003-12-31 |
| NZ530167A (en) | 2005-10-28 |
| CA2443438A1 (en) | 2002-11-28 |
| JP2004529963A (ja) | 2004-09-30 |
| HRP20030932A2 (en) | 2004-04-30 |
| NO20035108L (no) | 2003-11-17 |
| BR0209862A (pt) | 2004-06-08 |
| MXPA03010432A (es) | 2004-04-02 |
| HUP0400046A3 (en) | 2006-02-28 |
| EP1258255A1 (en) | 2002-11-20 |
| HUP0400046A2 (hu) | 2004-04-28 |
| YU91503A (sh) | 2006-05-25 |
| AR035977A1 (es) | 2004-07-28 |
| WO2002094325A2 (en) | 2002-11-28 |
| EA200301159A1 (ru) | 2004-06-24 |
| SK15582003A3 (sk) | 2004-04-06 |
| EE200300568A (et) | 2004-04-15 |
| PE20021097A1 (es) | 2003-02-13 |
| EP1395290A2 (en) | 2004-03-10 |
| CZ20033477A3 (en) | 2004-05-12 |
| NO20035108D0 (no) | 2003-11-17 |
| IL157965A0 (en) | 2004-03-28 |
| CN1509187A (zh) | 2004-06-30 |
| ZA200307364B (en) | 2004-04-20 |
| CO5550468A2 (es) | 2005-08-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BG108366A (bg) | Имуноконюгати от цитотоксични антитела за cd44 | |
| JP7423513B2 (ja) | 抗葉酸受容体α抗体コンジュゲート及びその使用 | |
| US7361347B2 (en) | Cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates | |
| EP2004696B1 (en) | Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them | |
| EP1391213A1 (en) | Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents | |
| KR101529810B1 (ko) | 항체-약물 접합체 | |
| US20050244413A1 (en) | Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents | |
| RU2745451C1 (ru) | Антитела к человеческому интерлейкину-2 и их применение | |
| TW200934511A (en) | Agents targeting CD138 and uses thereof | |
| KR20230170769A (ko) | 링커, 접합체 및 그 응용 | |
| KR20150003251A (ko) | 항 cdh3(p-카드헤린) 항체의 약물 콘쥬게이트 | |
| CN115666642A (zh) | 含有α-烯醇酶抗体的药物缀合物和其用途 | |
| US20240058467A1 (en) | Anti-ror1 antibody conjugates, compositions comprising anti ror1 antibody conjugates, and methods of making and using anti-ror1 antibody conjugates | |
| JP2022500454A (ja) | 抗葉酸受容体抗体コンジュゲートによる併用療法 | |
| JP2024517776A (ja) | ネクチン－４を標的とする抗体薬物コンジュゲート並びにその調製方法及びその使用 | |
| EP1417974A1 (en) | Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and radiotherapy | |
| CN112739339A (zh) | 抗cd137抗体药物缀合物(adc)在同种异体细胞疗法中的用途 | |
| WO2023190827A1 (ja) | ｐＨ依存性抗硫酸化グリコサミノグリカン抗体及び抗体薬物複合体 | |
| WO2024193605A1 (zh) | 靶向ror1的抗体、包含其的抗体偶联药物、制备方法和用途 | |
| AU2002313471A1 (en) | Cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates | |
| CN117295770A (zh) | 包含抗p-钙粘蛋白抗体的抗体缀合物及其用途 |