CZ20033477A3 - Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid - Google Patents
Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20033477A3 CZ20033477A3 CZ20033477A CZ20033477A CZ20033477A3 CZ 20033477 A3 CZ20033477 A3 CZ 20033477A3 CZ 20033477 A CZ20033477 A CZ 20033477A CZ 20033477 A CZ20033477 A CZ 20033477A CZ 20033477 A3 CZ20033477 A3 CZ 20033477A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- compound
- antibody
- antibody molecule
- conjugate
- maytansinoid
- Prior art date
Links
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 title claims abstract description 28
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 title claims abstract description 25
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 41
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 12
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims abstract description 10
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims abstract description 4
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 76
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 20
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 claims description 20
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 claims description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 14
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 12
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 11
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 11
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 7
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 7
- 125000004105 2-pyridyl group Chemical group N1=C([*])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 6
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 claims description 5
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 208000007276 esophageal squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 claims description 3
- 201000008274 breast adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 3
- 102000048851 human CD44 Human genes 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 7
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 claims 4
- 108010058905 CD44v6 antigen Proteins 0.000 claims 3
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims 3
- 208000036765 Squamous cell carcinoma of the esophagus Diseases 0.000 claims 3
- 201000006585 gastric adenocarcinoma Diseases 0.000 claims 3
- 201000010106 skin squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims 3
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 claims 2
- 201000010897 colon adenocarcinoma Diseases 0.000 claims 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims 2
- 201000005243 lung squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims 2
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 claims 2
- ORLXMIAIVLMGFR-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-3-pyridin-2-ylpyrrolidine-2,5-dione Chemical compound N1=C(C=CC=C1)C1C(=O)N(C(C1)=O)O ORLXMIAIVLMGFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 claims 1
- 206010041848 Squamous cell carcinoma of the cervix Diseases 0.000 claims 1
- 201000006612 cervical squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 229940125810 compound 20 Drugs 0.000 claims 1
- JAXFJECJQZDFJS-XHEPKHHKSA-N gtpl8555 Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)N[C@H](B1O[C@@]2(C)[C@H]3C[C@H](C3(C)C)C[C@H]2O1)CCC1=CC=C(F)C=C1 JAXFJECJQZDFJS-XHEPKHHKSA-N 0.000 claims 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 210000001562 sternum Anatomy 0.000 claims 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 abstract description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 76
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 37
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 26
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 24
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 24
- 229960005558 mertansine Drugs 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 23
- ANZJBCHSOXCCRQ-FKUXLPTCSA-N mertansine Chemical compound CO[C@@H]([C@@]1(O)C[C@H](OC(=O)N1)[C@@H](C)[C@@H]1O[C@@]1(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](C)N(C)C(=O)CCS)CC(=O)N1C)\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 ANZJBCHSOXCCRQ-FKUXLPTCSA-N 0.000 description 23
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 10
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 9
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 9
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- GTBCXYYVWHFQRS-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(pyridin-2-yldisulfanyl)pentanoate Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC(C)CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O GTBCXYYVWHFQRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 7
- 231100000682 maximum tolerated dose Toxicity 0.000 description 7
- WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N pyridine-2-thiol Chemical compound SC1=CC=CC=N1 WHMDPDGBKYUEMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 7
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 7
- QWPXBEHQFHACTK-KZVYIGENSA-N (10e,12e)-86-chloro-12,14,4-trihydroxy-85,14-dimethoxy-33,2,7,10-tetramethyl-15,16-dihydro-14h-7-aza-1(6,4)-oxazina-3(2,3)-oxirana-8(1,3)-benzenacyclotetradecaphane-10,12-dien-6-one Chemical compound CN1C(=O)CC(O)C2(C)OC2C(C)C(OC(=O)N2)CC2(O)C(OC)\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 QWPXBEHQFHACTK-KZVYIGENSA-N 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 6
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 5
- QWPXBEHQFHACTK-UHFFFAOYSA-N Maytansinol Natural products CN1C(=O)CC(O)C2(C)OC2C(C)C(OC(=O)N2)CC2(O)C(OC)C=CC=C(C)CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 QWPXBEHQFHACTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 4
- HJVJLAOFAYPFHL-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-pyridin-2-ylpropanedithioate Chemical compound C=1C=CC=NC=1C(C)C(=S)SN1C(=O)CCC1=O HJVJLAOFAYPFHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 229930126263 Maytansine Natural products 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- OPQNCARIZFLNLF-UHFFFAOYSA-N ansamitocin P-3 Natural products CN1C(=O)CC(OC(=O)C(C)C)C2(C)OC2C(C)C(OC(=O)N2)CC2(O)C(OC)C=CC=C(C)CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 OPQNCARIZFLNLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OPQNCARIZFLNLF-JBHFWYGFSA-N ansamitocin P3 Chemical compound CO[C@@H]([C@@]1(O)C[C@H](OC(=O)N1)[C@@H](C)[C@@H]1O[C@@]1(C)[C@@H](OC(=O)C(C)C)CC(=O)N1C)\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 OPQNCARIZFLNLF-JBHFWYGFSA-N 0.000 description 3
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 3
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 3
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 231100000371 dose-limiting toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- WKPWGQKGSOKKOO-RSFHAFMBSA-N maytansine Chemical compound CO[C@@H]([C@@]1(O)C[C@](OC(=O)N1)([C@H]([C@@H]1O[C@@]1(C)[C@@H](OC(=O)[C@H](C)N(C)C(C)=O)CC(=O)N1C)C)[H])\C=C\C=C(C)\CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 WKPWGQKGSOKKOO-RSFHAFMBSA-N 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- VQZYZXLBKBUOHE-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)butanoate Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC(C)CC(=O)ON1C(=O)CCC1=O VQZYZXLBKBUOHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[1-(pyridin-2-yldisulfanyl)ethyl]benzoate Chemical compound C=1C=C(C(=O)ON2C(CCC2=O)=O)C=CC=1C(C)SSC1=CC=CC=N1 GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 3-mercapto-1-oxopropyl Chemical group 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 125000005414 dithiopyridyl group Chemical group 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 2
- 230000005917 in vivo anti-tumor Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013392 nude mouse xenograft model Methods 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 210000003800 pharynx Anatomy 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000011363 radioimmunotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 125000000101 thioether group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N valeric acid Chemical compound CCCCC(O)=O NQPDZGIKBAWPEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 2
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 2
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- DVOOXRTYGGLORL-VKHMYHEASA-N (2r)-2-(methylamino)-3-sulfanylpropanoic acid Chemical class CN[C@@H](CS)C(O)=O DVOOXRTYGGLORL-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- YIXSKDRXJTZCHT-UHFFFAOYSA-N 2-acetylbutanedioic acid Chemical compound CC(=O)C(C(O)=O)CC(O)=O YIXSKDRXJTZCHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000006267 AMP Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108700016228 AMP deaminases Proteins 0.000 description 1
- 241000123663 Actinosynnema Species 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101100059521 Homo sapiens CD44 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- GDFAOVXKHJXLEI-UHFFFAOYSA-N L-N-Boc-N-methylalanine Natural products CNC(C)C(O)=O GDFAOVXKHJXLEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 1
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 1
- GDFAOVXKHJXLEI-VKHMYHEASA-N N-methyl-L-alanine Chemical compound C[NH2+][C@@H](C)C([O-])=O GDFAOVXKHJXLEI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 1
- 241000187681 Nocardia sp. Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 102220589754 YjeF N-terminal domain-containing protein 3_G25F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003080 antimitotic agent Substances 0.000 description 1
- 150000001504 aryl thiols Chemical class 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 1
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000004678 hydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000000955 neuroendocrine Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- OTIJNTWWDCIUNM-UHFFFAOYSA-N pentanethioic s-acid Chemical compound CCCCC(S)=O OTIJNTWWDCIUNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- CNHYKKNIIGEXAY-UHFFFAOYSA-N thiolan-2-imine Chemical compound N=C1CCCS1 CNHYKKNIIGEXAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005413 thiopyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000003744 tubulin modulator Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 201000004916 vulva carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000013013 vulvar carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Cytotoxické imunokonjugáty
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nových konjugátů protilátek s cytotoxickými sloučeninami, farmaceutických prostředků obsahujících tyto sloučeniny a jejich použití při terapii tumorů.
Dosavadní stav techniky
Byly již prováděny četné pokusy o zlepšení účinnosti protinádorových léčiv konjugací těchto léčiv s protilátkami proti antigenům souvisejícím s tumorem, aby se dosáhlo místního zakoncentrování léčiva cíleným dodáním do tumoru. U mnoha z těchto přístupů se podařilo dosáhnout omezeného úspěchu a v literatuře bylo diskutováno několik důvodů vysvětlujících toto selhání. Pro protirakovinná léčiva působící stechiometricky, jako je např.
doxorubicin nebo methotrexát jsou nezbytné vysoké intracelulární koncentrace pro dosažení míry požadované cytotoxicity. Předpokládá se, že je obtížné dosáhnout s mnoha konjugáty protilátka-léčivo těchto koncentrací, z důvodů (a) nedostatečné účinnosti mnoha běžných protirakovinných léčiv, (b) nízké koncentrace antigenních cílů na povrchu buněk, (c) neúčinného přenosu komplexů antigen-protilátka do vnitřního prostoru buněk a (d) neúčinného uvolňování volného léčiva z konjugátu uvnitř cílové buňky (Chari a další, 1992).
Dvou z výše uvedených nevýhod (totiž (a) a (d), se týkala práce Chariho a spolupracovníků (Chari a další, 1992; Liu a další, 1996; US patent No. 5,208,020). Autoři vyvinuli konjugáty s protilátkami, kde protilátka je navázána na maytansinoid disulfidickou vazbou.
Maytansiny patří do skupiny makrolidových antibiotik Ansa, které se odvozují od Nocardia sp. Maytansin ansamitocin P-3, produkovaný
fermentací bakterií, se používá jako prekurzorová molekula pro výrobu maytansinoidu DM1. Maytansin a jeho deriváty působí jako antimitotické prostředky (inhibitory polymerace tubulinu), podobně jako vinkristin, ale mají značně vyšší účinnost než vinkristin nebo jiné používané chemoterapeutické prostředky (DM1 je pro buňky in vitro toxický při koncentraci ~1O'10 M). Na rozdíl od vysoké cytotoxicity volného maytansinoidu má konjugát s protilátkou toxicitu pro antigennegativní buňky o několik řádů nižší než o antigen-pozitivní buňky. Spojení disulfidickou vazbou má výhodu v tom, že tyto vazby se uvnitř io cílových buněk snadno štěpí intracelulárním glutathionem, což vede k uvolňování vysoce toxického volného léčiva. Tento přístup byl použit pro antigeny asociované s protilátkami proti tumoru, např. u konjugátu C242-DM1 (Liu a další, 1996; Lambert a další, 1998), a HuN901-DMI (Chari a další, 2000). Použití těchto konjugátů je však omezené v důsledku omezené exprese odpovídajících cílových antigenů. Např. antigen rozpoznávaný N901 (CD56, N-CAM) je převážně exprimovaný tumory neuroendokrinního původu, a exprese antigenů C242 (CanAg) je většinou omezena na tumory odvozené z gastrointestinálního traktu.
Proto je stále zapotřebí zdokonalovat tento přístup hledáním vhodných protilátek souvisejících s tumory s výhodným rozložením exprese antigenů, vysokou a specifickou koncentrací antigenů na buněčném povrchu u cílové tkáně a účinným transportem (internalizací) konjugátu antigen-protilátka dovnitř buňky.
CD44 je protein, který je exprimován v několika různých isoformách na povrchu celé řady typů buněk. Nejmenší isoforma, standardní CD44 (CD44s), která je exprimována řadou různých buněk, zprostředkuje podle předpokladů přichycení buněk na složky extracelulární matrice, a může přenášet pomocné stimuly při aktivaci lymfocytů a monocytů. Naopak exprese sestříhaných variant CD44, které obsahují doménu v6 (CD44v6) v extracelulární oblasti je omezena na podskupinu epitelu. Fyziologická úloha CD44v6 dosud není úplně objasněna.
-3- ·**·· · β ·· · · ·
CD44v6, stejně jako jiné varianty exonů (CD44v3, CD44v5, CD44v7/v8, CD44v 10) byl ukázán jako antigen asociovaný s tumorem s výhodným rozložením exprese u lidských tumorů a normálních tkání (Heider a další, 1995; Heider a další, 1996; Dali a další, 1996; Beham5 Schmid a další, 1998;Tempfer a další, 1998; Wagner a další, 1998), a byl již předmětem diagnostických a terapeutických přístupů založených na protilátkách, zvláště při radioimunoterapii (RIT) tumorů (Verel a další, 2002; Stromer a další, 2000; WO 95/33771; WO 97/21104).
Nezbytným předpokladem účinného usmrcování tumorvých io buněk konjugáty protilátka-maytansinoid je však dostatečná internalizace cílového antigenu. Je známo pouze malé množství údajů týkajících se internalizace CD44. Bažil a Horejsi uvádějí, že regulace vedoucí ke snížení exprese CD44 na leukocytech po stimulaci PMA je způsobena šířením antigenu do okolí (antigen shedding) spíše než internalizací (Bažil a Horejsi, 1992). Šíření CD44 do okolí je také podporováno několika zprávami týkajícími se rozpustného CD44 v séru pacientů s tumory a normálních jedinců (Sliutz a další, 1995; Guo a další, 1994; Martin a další, 1997). V nedávném článku autorů Aguiar a další bylo zjištěno, že množství internalizovaného CD44 chondrocytech s intaktní matricí je přibližně 6 % během 4 hodin (Aguiar a další, 1999). Podobné nízké hladiny internalizovaného CD44v6 na tumorových buňkách byly nalezeny v experimentech prováděných BIA. Souhrnně tyto údaje ukazují, že receptory CD44 podléhají spíše šířením do okolí než internalizací, a protilátky specifické pro CD44 tedy nejsou považovány za vhodné kandidáty pro přístup využívající konjugátu s maytansinoidem. To bylo podpořeno testy proliferace buněk in vitro, kde konjugát AbcD44v6-DM1 ukázal pouze mírně zvýšenou cytotoxicitu proti buňkám předkládajícím antigen ve srovnání s buňkami bez antigenu.
Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že protilátky specifické pro
CD44 konjugované s vysoce cytotoxickými léčivy prostřednictvím
-4 propojovací skupiny, která se za intracelulárních podmínek odštěpuje, jsou velmi účinnými antitumorovými léčivy in vivo.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje nové sloučeniny složené z molekuly protilátky specifické pro CD44 konjugované s vysoce cytotoxickým léčivem prostřednictvím propojovací skupiny (linkeru), který se štěpí za intracelulárních podmínek.
Předkládaný vynález konkrétně poskytuje sloučeninu vzorce o
A(LB)n (vzorec (I)), kde
A je molekula protilátky specifické pro CD44; L je propojovací skupina;
B je sloučenina toxická pro buňky; a n je desetinné číslo, přičemž n = 1 až 10.
Molekula protilátky A má vazebnou specificitu pro CD44, s výhodou pro variantu CD44.
Termín „molekula protilátky“ bude zahrnovat úplné imunoglobuliny jak jsou produkovány lymfocyty, a například přítomné v krevním séru, monoklonální protilátky sekrenované hybridomovými buněčnými liniemi, polypeptidy produkované rekombinantní expresí v hostitelských buňkách, které mají vazebnou specificitu imunoglobulinů nebo monoklonálních protilátek a molekuly, které byly odvozeny z těchto imunoglobulinů, monoklonálních protilátek nebo polypeptidů dalším zpracováním při zachování jejich vazebné specificity. Termín „molekula protilátky“ zahrnuje zvláště kompletní
- 5 • · · ·· ···· ·· · ···· · · · · · · • ·· ·· · · · · · • · ··· · · · · ···· Q 4 · ® 9 9 9 9 9 9 • ·· · · ·· ·· ·· · imunoglobuliny obsahující dva těžké řetězce a dva lehké řetězce, fragmenty těchto imunoglobulinů jako fragmenty Fab, Fab’, nebo F(ab)2 (Kreitman a další, 1993), rekombinantně produkované polypeptidy jako chimérní, humanizované nebo úplně lidské protilátky s (Breitling a Duebel, 1999; Shin a další, 1989; Gussow a Seemann,
1991, Winter a další, 1994, EP 0 239 400; EP 0 519 596; WO
90/07861; EP 0 368 684; EP 0 438 310; WO 92/07075; WO 92/22653;
EP 0 680 040; EP 0451 216), jednořetězcové protilátky (scFv, Johnson a Bird, 1991) apod. Dnes je možno protilátky vyrábět také bez io imunizace laboratorního zvířete, například metodami exprese na povrchu fága (phage display) (Aujame a další, 1997; US 5,885,793;
US 5,969,108; US 6,300,064; US 6,248,516, US 6,291,158). Zcela lidské protilátky se mohou produkovat s využitím transgenních myší nesoucích funkční geny pro lidské Ig (EP 0438 474; EP 0 463151; EP is 0 546 073). Z výše uvedených odkazů na literaturu je odborníkovi zřejmé, jak připravit tyto typy molekul protilátek, s využitím způsobů podle stavu techniky jako je automatická syntéza peptidů a nukleových kyselin, imunizace laboratorních zvířat, hybridomové technologie, polymerázová řetězová reakce (PCR), technologie vektorů a exprese, kultivace hostitelských buněk a metod čištění proteinů. V následujícím textu se termíny „protilátka“ a „molekula protilátky“ používají zaměnitelně.
Termín „specifický pro CD44“ bude znamenat, že molekula protilátky má specifickou vazebnou afinitu pro epitop přítomný na
CD44. Ve výhodném provedení má molekula protilátky podle vynálezu vazebnou specificitu pro aminokyselinovou sekvenci kódovanou variantou exonu v6 lidského genu CD44. Sekvence varianty exonu v6 stejně jako jiných variant exonů jsou v oboru známé (Screaton a další, 1992; Tólg a další, 1993; Hofmann a další, 1991). Výhodná molekula protilátky podle vynálezu se specificky váže na peptidy nebo polypetidy, které mají nebo které obsahují aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO; 1 podle přiloženého výpisu sekvencí nebo sekvenci ♦ ·
- 6 - »·· *»·* ·· ·· ·· · alelické varianty uvedené sekvence. Tato molekula protilátky má s výhodou vazebnou specificitu pro epitop v rámci uvedené sekvence. Výhodněji se molekula protilátky specificky váže na peptid s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2, ještě výhodněji na peptid s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 3. Tyto molekuly protilátky se mohou snadno produkovat způsoby známými v oboru (WO 95/33771, WO 97/21104), například imunizací laboratorních zvířat chemicky syntetizovanými peptidy s výše uvedenými sekvencemi, např. navázanými na hapten, nebo imunizací rekombinantně io vyrobeným fuzním proteinem obsahujícím uvedené sekvence a s použitím dalších postupů známých v oboru (Harlow 1988; Catty
1988; Koopman a další, 1993; Heider a další, 1993).
Molekula protilátky podle vynálezu je s výhodou myší monoklonální protilátka s označením VFF-18, která je produkována hybridomovou buněčnou linií, která byla uložena 7. června 1994 pod depozitním číslem DSM ACC2174, ve sbírce DSM-Deutsche Sammlung fůr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Německo. Výhodné jsou také fragmenty Fab, Fab’, nebo F(ab)2 uvedené monoklonální protilátky
2o VFF-18. V dalším výhodném provedení je molekulou protilátky humanizovaná rekombinantní protilátka, kde do odpovídajících genů těžkých a lehkých řetězců lidského imunoglobulinu byly naroubovány oblasti určující komplementaritu (complementarity determining regions, CDR) VFF-18.
„Oblasti určující komplementaritu“ monoklonální protilátky se mají chápat jako ty aminokyselinové sekvence, které se účastní vazby specifického antigenu podle autorů Kabat a další, 1991, spolu s Chothia a Lesk, 1987.
V dalším výhodném provedení se odpovídající zbytky úseků základní struktury (framework region) této protilátky s naroubovanou CDR převádějí pro zlepšení vazebné afinity na myší zbytky. Ze
způsobů známých v oboru je odborníkům známo, jak získat oblasti CDR protilátky VFF-18, přičemž se vychází zvýše uvedeného hybridomu s depozitním číslem DSM ACC2174, jak vybrat a získat vhodné geny lidských imunoglobulinů, jak naroubovat do těchto genů oblasti CDR, jak modifikovat zvolené zbytky úseků základní struktury, jak exprimovat protilátku s naroubovanou CDR ve vhodných hostitelských buňkách, např. buňkách vaječníků čínského křečka (CHO), a jak testovat získané rekombinantní protilátky na vazebnou afinitu a specificitu (viz např. výše uvedené odkazy na literaturu).
V dalším výhodném provedení vynálezu je molekulou protilátky rekombinantní protilátka obsahující oblasti CDR protilátky VFF-18. Tato rekombinantní protilátka je s výhodou humanizovaná protilátka a jde o kompletní imunoglobulin složený ze dvou úplných lehkých a dvou úplných těžkých řetězců. V dalším výhodném provedení vynálezu je molekulou protilátky rekombinantní protilátka se stejným idiotypem jako protilátka VFF-18. V dalším výhodném provedení vynálezu je molekulou protilátky rekombinantní protilátka vázající se na stejný epitop jako protilátka VFF-18.
Ve výhodném provedení je molekula protilátky A protilátka obsahující lehké řetězce s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 4 a těžké řetězce s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 6. Tato protilátka se nazývá BIWA 4. Jde o humanizovanou verzi výše uvedené protilátky VFF-18 obsahující oblasti určující komplementaritu myší monoklonální protilátky VFF-18 v úplně lidské základní struktuře, a lidské konstantní oblasti. Proto je to protilátka s velmi nízkou imunogenicitou u člověka, což je výhodné. Protože však neobsahuje zbytky myší základní struktury pro optimalizaci vazby antigenu, má významně nižší vazebnou afinitu k antigenu ve srovnání s rodičovskou protilátkou VFF-18, a proto by nemusela být považována za dobrého kandidáta pro terapeuticky použitelné léčivo. Neočekávaně bylo zjištěno, že BIWA 4 přes špatnou vazebnou afinitu má velmi výhodnou biologickou distribuci a příjem tumorem in vivo, takže je výhodnější
než jiné humanizované verze protilátky VFF-18 s vyšší vazebnou afinitou (Verel a další, 2002). V dalším výhodném provedení je molekulou protilátky A protilátka obsahující lehké řetězce s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 8 a těžké řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6. Tato protilátka má vyšší vazebnou afinitu než BIWA 4 a nazývá se BIWA 8.
Tyto protilátky je možno produkovat následujícím způsobem. Molekuly nukleové kyseliny kódující lehký řetězec a těžký řetězec mohou být syntetizovány chemicky a enzymaticky standardními io metodami. Nejprve je možno syntetizovat vhodné oligonukleotidy způsoby známými v oboru (například Gait, 1984), které mohou být použity pro přípravu syntetického genu. Způsoby vytváření syntetických genů z oligonukleotidů jsou v oboru známé (např. Stemmer a další 1995; Ye a další 1992; Hayden a Mandecki 1988;
Frank a další 1987). Molekuly nukleových kyselin kódující lehký a těžký řetězec BIWA 4 mají nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 7. Tyto sekvence obsahují sekvence kódující úvodní peptidy, které jsou štěpeny hostitelskou buňkou (SEQ ID NO: 5: prvních 60 nukleotidů; SEQ ID NO: 7: prvních 57 nukleotidů). V dalším provedení mají molekuly nukleových kyselin kódující lehký a těžký řetězec molekuly protilátky podle vynálezu nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 7. Tyto molekuly nukleových kyselin kódující těžké a lehké řetězce protilátky potom mohou být klonovány do expresního vektoru (buď oba řetězce v jedné molekule vektoru nebo každý řetězec do oddělené molekuly vektoru), který se potom zavede do hostitelské buňky. Expresní vektory vhodné pro expresi imunoglobulinů v prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buňkách a způsoby zavádění vektorů do hostitelských buněk jsou v oboru dobře známé. Obecně je v nich imunoglobulinový gen ve funkčním spojení s vhodným promotorem, jako je např. promotor lidského cytomegaloviru (CMV), promotor křeččího ubikvitinu (WO 97/15664), nebo promotor opičího viru SV40, umístěným proti směru
- 9 4 4 4
4 4 4
44444 transkripce vzhledem ke genu Ig. Pro ukončení transkripce se může použít vhodné terminační/polyadenylační místo jako je místo bovinního růstového hormonu nebo SV40. Dále může být obsažena zesilující sekvence, jako je zesilující sekvence (enhancer) CMV nebo SV40.
Expresní vektor obvykle dále obsahuje geny pro selekční markéry, jako je gen pro dihydrofolátreduktázu (DHFR), glutaminsynthetázu, adenosindeaminázu, adenylátdeaminázu, nebo geny pro rezistenci na neomycin, bieomycin nebo puromycin. Celá řada expresních vektorů je komerčně dostupná u různých firem jako je např. Stratagene, La Jolla, io CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison, Wl nebo BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA. Pro expresi mohou být např. použity expresní vektory pAD-CMVI (NCBI GenBank, depozitní číslo A32111) nebo pAD-CMV19 (NCBI GenBank, depozitní číslo A32110). Hostitelskou buňkou je s výhodou savčí hostitelská buňka, např. buňka
COS, CHO nebo BHK, výhodněji buňka vaječníků čínského křečka (CHO), například buňka CHO-DUKX (Urlaub a Chasin, 1980), CHODG44 (Urlaub a další, 1983), nebo CHO-K1 (ATCC CCL-61). Hostitelská buňka se potom kultivuje ve vhodném kultivačním médiu za podmínek, při kterých se tvoří protilátka, a protilátka se potom z kultury izoluje standardními postupy. Postupy výroby protilátek z rekombinantní DNA v hostitelských buňkách a příslušných expresních vektorů jsou dobře známé v oboru (viz například WO 94/11523, WO97/9351, EP 0481 790, EP 0 669 986).
Aby bylo možno propojit molekulu protilátky A se sloučeninou B, která je toxická pro buňky, používá se propojovací skupina L. V nejjednodušším případě je propojující skupina L chemická vazba, s výhodou kovalentní vazba, která se za intracelulárních podmínek štěpí. V jednom provedení vynálezu je vazba mezi atomem síry přítomným v molekule protilátky, např. v postranním řetězci cysteinového zbytku, a dalším atomem síry přítomným v toxické sloučenině. V dalším provedení se propojovací skupina L skládá z jednoho nebo více atomů nebo chemických skupin. Vhodné
propojovací skupiny jsou v oboru dobře známé a zahrnují disulfidické skupiny, thioetherové skupiny, skupiny labilní vůči působení kyselin, fotolabilní skupiny, skupiny labilní vůči působení peptidáz a skupiny labilní vůči působení esteráz. Výhodné jsou disulfidické skupiny a thioetherové skupiny.
Konjugáty molekul protilátek podle vynálezu a toxické sloučeniny se mohou vytvářet jakýmikoli způsoby známými v současnosti nebo i vyvinutými později. Toxická sloučenina se může modifikovat za získání volné aminové skupiny a potom se může navázat na molekulu protilátky přes propojovací skupinu labilní vůči působení kyseliny nebo fotolabilní propojovací skupinu. Toxická sloučenina se může kondenzovat s peptidem a potom navázat na molekulu protilátky pro získání propojovací skupiny labilní vůči působení peptidáz. Toxická sloučenina se může zpracovat za získání primární hydroxylové skupiny, která se může sukcinylovat a navázat na molekulu protilátky za získání konjugátu, který se potom může štěpit intracelulárními esterázami pro uvolnění volného léčiva. Výhodněji se toxická sloučenina zpracuje tak, aby byla vytvořena volná nebo chráněná thiolová skupina, a potom se jedna nebo více toxických sloučenin s obsahem disulfidických nebo thiolových skupin navážou na molekulu protilátky jednou nebo více disulfidickými vzbami.
Molekuly protilátky se mohou např. modifikovat zesilujícími činidly jako je N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionát (SPDP), 4-sukcinimidyloxykarbonyl-a-methyl-a-(2-pyridyldithio)-toluen (SMPT),
N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-butyrát (SDPB), N-sukcinimidyi-4-(2-pyridyldithio)pentanoát (SPP), N-sukcinimidyl-5-(pyridyldithio)-pentanoát, 2-iminothiolan nebo anhydrid kyseliny acetyljantarové známými způsoby, viz Carlsson a další, 1978; Blattler a další 1985; Lambert a další, 1983; Klotz a další, 1962; Liu a další, 1979; Blakey a
Thorpe, 1988; Worrell a další, 1986. Ve výhodném provedení je propojovací skupina 4-thiopentanoát odvozený od SPP, nebo 5-thiopentanoátu. Molekula protilátky obsahující volné nebo chráněné
- 11 • φ
Φ Φ I ♦ ·Μ thiolové skupiny získaná tímto způsobem se potom ponechá reagovat s toxickou sloučeninou obsahující disulfid nebo thiol za získání konjugátů. Konjugáty se potom mohou čistit HPLC nebo gelovou filtrací.
„Toxická sloučenina“ je sloučenina, která inhibuje funkci buněk nebo zabrání funkci buněk a/nebo způsobí destrukci buňky. Toxické sloučeniny používané pro navázání mohou působit buď cytostaticky nebo cytotoxicky a mohou vést k zastavení buněčného cyklu nebo smrti buňky. Tyto sloučeniny mohou působit v různých stupních v průběhu buněčného cyklu, např. interferencí se syntézou nukleových kyselin, inaktivací nukleových kyselin nebo vazbou na tubulin.
Ve výhodném provedení je sloučeninou B, která je toxická pro buňky, maytansinoid, tj. derivát maytansinu (CAS 35846538). Ve výhodném provedení jde o C-3 ester maytansinolu. Maytansinoidy vhodné pro konjugaci s protilátkami pro použití při protirakovinné terapii, včetně přípravy těchto maytansinoidů a jejich vazby na molekuly protilátek, byly popsány autory Chari a další, 1992; Liu a další, 1996; US patent No. 5,208,020). Tyto maytansinoidy se mohou používat v rámci předkládaného vynálezu. Ve výhodném provedení je
2o toxická sloučenina N2-deacetyl-N2-(3-merkapto-1-oxopropyl)-maytansin (číslo CAS 139504-50-0), označovaná také jako DM1. Uvedený maytansinoid je s výhodou derivát maytansinolu navázaný na molekulu protilátky disulfidickým můstkem v poloze C-3 maytansinolu. Ve zvláště výhodném provedení může být konjugát protilátka/maytansinoid připraven z maytansinoidů vzorce
- 12 • · · t · · » · • e ·· · · · · · • * * í *· **í J · · t • · · · ·· ♦» ·
CH3 o
kde
Ri znamená H nebo SR4, kde R4 znamená methyl, ethyl, přímý alkyl, rozvětvený alkyl, cyklický alkyl, jednoduchý nebo substituovaný aryl, nebo heterocykl;
R2 znamená Cl nebo H;
R3 znamená H nebo CH3; a m znamená 1, 2 nebo 3.
S výhodou R1 je H, CH3 nebo SCH3, R2 je Cl, R3 je CH3, a m = 2.
Sloučenina, ve které R1 = H, R2 = Cl, R3 = CH3, a m = 2 se 20 v literatuře označuje jako DM1.
Ve výhodném provedení má sloučenina podle vynálezu vzorec
- 13 * · • · · • ····
A je molekula protilátky specifická pro CD44, s výhodou specifická pro variantu exonu v6, s výhodou specifická pro aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3;
(L’) je případná propojovací skupina p je desetinné číslo, kde p = 1 až 10.
S výhodou p je 3 až 4, výhodněji přibližně 3,5.
Způsoby výroby těchto maytansinoidů jsou známé v oboru (viz
2o zvláště US 5,208,020, příklad 1). V prvním kroku se může vyrobit ester maytansinoidů C-3 ansamitocin P3 bakteriální fermentací mikroorganismů z rodu Nocardia nebo Actinosynnema, například ATCC 31565, ATCC 31281 (US 4,356,265; US 4,450,234; WO 01/77360). Ansamitocin P3 může být extrahován z kultury použitím organických rozpouštědel jako je ethylacetát nebo toluen, a dále čištěn adsorpční chromatografií s použitím například silikagelu. Potom může být redukován na maytansinol použitím LiAIH4 (US 4,360,462) nebo, jak bylo navrhováno nedávno, LiAI(OMe)3H nebo jiných hydridů*LiAI
| • ·· | 44 4444 | 4 4 | 4 | ||
| • 4 4 | 4 | 4 4 | 4 | 4 | 4 |
| • ·· | • | 4 4 | 4 | 4 | 4 4 |
| • 4 4 | 4 4 | 4 4 | 4 4 | 4 | 44 4 |
| 4· 4 4 | 44 44 | 4 4 | • |
nebo NaAI (WO 02/16368). Maytansinol může být potom esterifikován v poloze C-3 deriváty N-methyl-L-alaninu nebo N-methyl-L-cysteinu za získání maytansinoidu obsahujícího disulfidickou skupinu (US 5,208,020; US 5,416,064; US 6,333,410), např. použitím dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) a katalytického množství chloridu zinečnatého (US 4,137,230; US 4,260,609). Ve výhodném provedení se maytansinol esterifikuje sloučeninou methyl-N-(3-methyldithiopropanoyl)-L-alanin vzorce
za získání maytansinoidu vzorce (II), kde Ri = SR4, R4 = CH3, R2 = Cl, R3 = CH3, a m = 2.
Volná thiolová skupina může být potom uvolněna rozštěpením disulfidické vazby dithiothreitolem (DTT), za získání např. DM1.
Po intracelulárním štěpení se z konjugátu A(LB)n uvolní volná toxická sloučenina. Volné léčivo uvolněné ze sloučeniny A(LB)n může mít vzorec B-X, kde X je atom nebo chemická skupina, v závislosti na povaze štěpící reakce. S výhodou je X atom vodíku, jako např. v případě, kdy propojovací skupina je pouze kovalentní vazba mezi dvěma atomy síry, nebo hydroxylová skupina. Místo štěpení může být také uvnitř propojovací skupiny, jestliže propojovací skupinou je chemická skupina, za vytvoření po rozštěpení volného léčiva vzorce B-L”-X, kde X je atom nebo chemická skupina, v závislosti na povaze štěpící reakce. X je s výhodou atom vodíku nebo hydroxylová skupina.
Ve výhodném provedení je sloučenina vzorce (I) méně toxická, než toxická sloučenina B, B-X nebo B-L”-X, uvolněná po intracelulárním štěpení. Způsoby testování cytotoxicity in vitro jsou
·« φφφφ ·· φ φ φ · φφφ φ φ φ φφφφ φ φ φφφ φφφφφ φ φ · φ φ · · známé v oboru (Goldmacher a další, 1985; Goldmacher a další, 1986; viz také US 5,208,020, příklad 2). S výhodou je sloučenina vzorce (I) 10 x nebo vícekrát, výhodněji 100 x nebo vícekrát, nebo dokonce 1000 x nebo vícekrát méně toxická než volné léčivo uvolněné po rozštěpení.
Konjugáty molekula protilátky/maytansinoid jsou s výhodou takové sloučeniny, které jsou spojené disulfidickou vazbou jak bylo diskutováno výše, které jsou schopné dodávat molekuly maytansinoidu. Tyto konjugáty vázající se na buňky se připravují io známými metodami, jako je modifikace monoklonálních protilátek sukcinimidylpyridyldithiopropionátem (SPDP) nebo pentanoátem (SPP) (Carlsson a další, 1978). Získaná thiopyridylová skupina se potom vytěsní působením maytansinoidů obsahujících thiolové skupiny za vytvoření konjugátů navázaných disulfidickou vazbou. Alternativně se v případě aryldithiomaytansinoidů provede tvorba konjugátu s protilátkou přímým vytěsněním arylthiolu maytansinoidu sulfhydrylovými skupinami předem zavedenými do molekul protilátky. Kteroukoli z těchto metod se snadno připraví konjugáty obsahující 1 až 10 molekul maytansinoidu navázaných disulfidickými můstky. V této souvislosti je třeba rozumět, že desetinné číslo n ve vzorci A(LB)n je průměrné číslo, protože ne všechny molekuly konjugátu daného preparátu musí mít identický celočíselný počet zbytků LB navázaných na molekulu protilátky.
Konkrétněji se na roztok dithiopyridylem modifikované protilátky v koncentraci 1 mg/ml v 0,1M pufru s fosforečnanem draselným při pH 7,0 obsahujícím 1 mM EDTA působí maytansinoidem s obsahem thiolu (1,25 mol ekvivalent/dithiopyridylová skupina). Uvolňování pyridin-2-thionu z modifikované protilátky se monitoruje spektrofotometricky při 343 nm a je ukončeno v průběhu přibližně 30 min.Konjugát protilátka30 maytansínoid se čistí a zbaví nezreagovaného léčiva a jiných nízkomolekulárních látek gelovou filtrací přes kolonu Sephadexu G-25. Počet maytansinoidů navázaných na molekulu protilátky se může zjistit
• · · · ·· · • · · * · • · · · · · • · · · · ···· • · · · » · měřením poměru absorbance při 252 nm a 280 nm. Tímto způsobem je možno navázat disulfidickými vazbami 1 až 10 molekul maytansinoidu na molekulu protilátky.
V dalším provedení se předkládaný vynález týká konjugátu molekuly protilátky specifické pro CD44v6 a maytansinoidu. Zde znamená „specifický pro CD44v6“, že protilátka má specifickou vazebnou afinitu na epitop, který je přítomný v peptidu s aminokyselinovou sekvencí kódovanou variantou exonu v6 CD44, s výhodou lidského CD44. Výhodná molekula protilátky podle vynálezu se specificky váže na peptidy nebo polypetidy, které mají nebo které obsahují aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1 z přiloženého výpisu sekvencí, nebo alelickou variantu uvedené sekvence. Tato molekula protilátky má s výhodou vazebnou specificitu pro epitop v rámci uvedené sekvence. Výhodněji se molekula protilátky specificky váže na peptid s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2, ještě výhodněji s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 3.
Molekula protilátky v uvedeném konjugátu je s výhodou monoklonální protilátka VFF-18 (DSM ACC2174) nebo rekombinantní protilátka s komplementárními determinačními oblastmi (CDR) protilátky VFF-18. Uvedená protilátka výhodněji obsahuje lehké řetězce s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 4, nebo alternativně SEQ ID NO: 8, a těžké řetězce s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 6.
Maytansinoid je s výhodou na protilátku navázán přes disulfidickou skupinu, a má vzorec (IV)
vzorec !V kde vazba na protilátku je prostřednictvím atomu síry ukázaného ve vzorci IV na druhý atom síry přítomný v molekule protilátky. Pro vytvoření takového atomu síry dostupného pro vazbu musí být molekula protilátky modifikována zavedením vhodné propojovací skupiny, jak bylo uvedeno výše. S výhodou je maytansinoid navázán na molekulu protilátky prostřednictvím skupiny -S-CH2CH2-CO-, -S-CH2CH2CH2CH2-CO- nebo -S-CH(CH3)CH2CH2-CO-. Atom síry v takové propojovací skupině tvoří disulfidickou vazbu s maytansinoidem, kde karbonylová funkční skupina může být navázána na aminovou funkční skupinu přítomnou na postranním řetězci aminokyselinového zbytku nebo molekuly protilátky.
Takto je možno navázat jeden nebo více maytansinoidových zbytků na molekulu protilátky. S výhodou jsou na molekulu protilátky navázány 3 až 4 zbytky maytansinoidu.
Výhodnější je konjugát molekuly protilátky specifické proti CD44v6 a maytansinoidu, kde protilátka obsahuje lehké řetězce s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 4, a těžké řetězce ····
- 18 • · • · * · · 4 4 4
4 4 4 4
4 · 4 ·
4·4 44 44
4
4 4
4 4 4
4 4444
4 4
4 s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 6, a kde maytansinoid má vzorec
a je navázán na protilátku přes disulfidickou vazbu. Propojovací skupina je s výhodou skupina -S-CH2CH2CH2CH2-CO- nebo -S15 -CH(CH3)CH2CH2-CO-, a počet zbytků maytansinoidu navázaných na molekulu protilátky je 3 až 4.
V dalším provedení se předkládaný vynález týká způsobu výroby sloučeniny vzorce (I) zahrnující následující kroky:
(a) do molekuly protilátky specifické pro CD44 se zavedou volné nebo chráněné thiolové skupiny:
(b) molekula protilátky z kroku (a) se ponechá reagovat se sloučeninou, která je toxická pro buňky, kde uvedená sloučenina obsahuje jednu nebo více disulfidických nebo thiolových skupin; a (c) výsledný konjugát se izoluje.
Molekula protilátky je s výhodou specifická pro CD44v6, výhodněji specifická pro aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3.
- 19 • «« «4 444· 44 · • 4 4 · 44 4 444 ··· 4 4 4 4444
444 4 444 44*44
4 4 4444 44 4
444 *4 44 44 44 4
Sloučenina, která je toxická pro buňky, je s výhodou maytansinoid, výhodněji vzorce (II), nejvýhodněji sloučenina, kde R1 = H, R2 = Cl, R3 = CH3, a m = 2. V dalším výhodném provedení obsahuje protilátka lehké řetězce s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 8, a těžké řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6.
Ve výhodných provedeních tohoto způsobu se pro zavedení volných nebo chráněných thiolových skupin do molekuly protilátky používají N-hydroxysukcinimidester kyseliny (2-pyridyl)-3-dithiopropanové (N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionát), N-hydroxysukcinimidester kyseliny (2-pyridyl)-4-dithiopentanové, (N-sukcinimidyl-4-(2-pyridyld ithio)pentanoát), nebo N-hydroxysukcinimidester kyseliny (2-pyridyl)-5-dithiopentanové, (N-sukcinimidyl-5-(2pyridyldithio)pentanoát). Předkládaný vynález se také týká sloučenin získatelných popisovaným způsobem.
V dalším provedení se předkládaný vynález týká farmaceutického prostředku obsahujícího sloučeninu vzorce (I) nebo popisovaného konjugátu, s výhodou spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, pomocnou látkou nebo ředivem.
Vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče, řediva a pomocné látky jsou známé a mohou být určeny odborníkem v oboru podle klinické situace. Příklady vhodných nosičů, řediv a/nebo pomocných látek zahrnují: (1) pufr Dulbecco's phosphate buffered šalině, pH přibližně 7,4, s obsahem přibližně 1 mg/ml až 25 mg/ml lidského sérového albuminu, (2) 0,9% solný roztok (0,9% hmotnost/objem NaCl), a (3) 5% (hmotnost/objem) dextróza.
Výhodněji je molekula protilátky přítomná ve farmaceutickém prostředku monoklonální protilátka VFF-18, nebo rekombinantní protilátka obsahující jednu nebo více CDR protilátky VFF-18, s výhodou v lidském rámci. V dalším výhodném provedení obsahuje protilátka lehké řetězce s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 4
- 20 nebo SEQ ID NO: 8, a těžké řetězce obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 6. Toxická sloučenina je s výhodou maytansinoid vzorce (II).
Sloučeniny podle vynálezu se mohou používat pro všechny druhy klinických nebo neklinických aplikací, kde má být toxická sloučenina směrována do buněk exprimujících na povrchu CD44, s výhodou CD44v6.
Konjugát se může například klinicky používat ex vivo pro odstranění tumorových buněk z kostní dřeně před autologní transplantací při léčbě rakoviny. Ošetření se může provádět následujícím způsobem: kostní dřeň se pacientovi nebo jinému jedinci odebere a inkubuje se v médiu obsahujícím sérum, ke kterému se přidá sloučenina vzorce (I) podle vynálezu v rozmezí koncentrací od přibližně 10 μΜ až 1 pM na dobu přibližně 30 min až přibližně 48 h při přibližně 37 °C. Přesné podmínky koncentrace a doby inkubace (= dávka) může snadno určit odborník v oboru. Po inkubaci se buňky kostní dřeně promyjí médiem obsahujícím sérum a vrátí se pacientovi i.v. infúzi známými způsoby. Pokud je pacient léčen jinými způsoby, jako je ablativní chemoterapie nebo ozáření celého těla mezi dobou odebrání kostní dřeně a reinfuzí ošetřených buněk, ošetřené buňky kostní dřeně se uchovávají zamražené v kapalném dusíku s použitím standardního lékařského vybavení.
V dalším provedení se předkládaný vynález týká způsobu léčení rakoviny, který zahrnuje aplikaci farmaceutického prostředku popisovaného výše pacientovi, toto provedení vynálezu se týká zvláště léčení rakoviny u pacienta v případě potřeby, které zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství výše popsané sloučeniny nebo farmaceutického prostředku popsaných výše pacientovi. S výhodou je rakovina karcinom skvamózních buněk hlavy a krku (SCC), SCC jícnu, SCC plic, SCC kůže, adenokarcinom prsu (AC), AC plic, SCC děložního čípku, AC pankreatu, AC tlusného střeva, nebo AC žaludku.
• ·· ·· • · · « • · · · • · · · · • · · · · ·· ·· ·* 9 • « • · · • ···· • < ·· ·
Pro klinické léčení rakoviny se sloučenina vzorce (I) podle vynálezu dodává ve formě roztoků, které jsou testované na sterilitu a hladinu endotoxinů. Příklady vhodných protokolů podávání konjugátu jsou následující. Konjugáty se mohou podávat týdně po dobu 1 až 6 týdnů bud’ jako jednorázová dávka i.v., nebo jako kontinuální infuze po dobu 5 dnů. Jednorázové dávky se mohou podávat v 50 až 100 ml normálního fyziologického roztoku, do kterého bylo přidáno 5 až 10 ml lidského sérového albuminu. Kontinuální infuze se může podávat ve 250 až 500 ml normálního fyziologického roztoku, do kterého bylo přidáno 25 až 50 ml lidského sérového albuminu, za 24 h. Dávkování je obecně 10 mg až 400 mg/m2 plochy tělesného povrchu na jednu aplikaci. Dávka aplikovaná pacientovi při podání musí být dostatečně vysoká pro dosažení účinnosti, ale musí být nižší než je toxicita omezující dávku (DLT). Obecně se za dostatečně tolerovanou dávku nižší než DLT považuje maximální tolerovaná dávka (MTD). Odborníkům v oboru je zřejmé, jak se určuje hodnota MTD (Lambert a další, 1998). Pro týdenní podávání je možno očekávat, že MTD bude v rozmezí 100 až 200 mg/m2. Alternativně mohou být intervaly mezi aplikacemi delší, například dva až čtyři týdny, s výhodou tři týdny.
V tomto případě je možno očekávat MTD v rozmezí 200 až 300 mg/m2. Alternativně může být aplikace v pěti denních dávkách následovaná přerušením na několik týdnů a potom se může léčení opakovat.
V tomto případě je očekávaná dávka MTD na podání nižší než 100 mg/m2. Konjugáty se mohou například podávat jako jediná i.v. infuze s rychlostí 3 mg/min každých 21 dnů. Používá se až sedmi cyklů ošetření. Je zřejmé, že aplikované dávky mohou být mimo výše uvedená rozmezí, jestliže to vyžaduje klinická situace. Jestliže se např. zjistí, že MTD je vyšší než uvedená, jednotlivé podání může být s vyšší dávkou než 400 mg/m2, nebo týdně může být vyšší než 200 mg/m2.
Dávka, způsob podání, schéma použití, opakování a trvání léčení bude obecně záviset na povaze onemocnění (typ, diferenciace • ·
9Λ 9 · · · · · · ·
I ·· · · · · · · ♦ • · « · 9 9 ··· ····· · · · · ·· · · · · a stadium tumoru atd.) a pacientovi (tělesná konstutuce, věk, pohlaví atd.) a bude je určovat odborník v oboru lékařství odpovědný za léčení. Kromě léčení pevných tumorů může být terapeutická aplikace podle vynálezu zvláště výhodná jako adjuvantní terapie k chirurgickému zákroku pro léčení minimálních zbytků onemocnění.
V dalším provedení se vynález týká použití sloučeniny vzorce (I) pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení rakoviny. Výhodněji je molekulou protilátky přítomnou ve farmaceutickém prostředku monoklonální protilátka VFF-18 nebo rekombinantní protilátka obsahující oblasti CDR protilátky VFF-18, s výhodou v lidském rámci. Nejvýhodnější je molekula protilátky obsahující lehký řetězec se SEQ ID NO: 4 nebo SEQ ID NO: 8, a těžký řetězec se SEQ ID NO: 6. Toxická sloučenina má s výhodou vzorec (II). Rakovina je s výhodou karcinom skvamózních buněk (SCC) hlavy a hrdla, SCC jícnu, SCC plic, SCC kůže, adenokarcinom (AC) prsu, AC plic, SCC děložního čípku, AC pankreatu, AC tlustého střeva nebo AC žaludku.
Odkazy
Aguiar D. J., Knudson W., a Knudson C. B., Internalization of the hyaluronan receptor CD44 by chondrocytes. Exp. Cell. Res. 252: 292 - 302, 1999.
Aujame L., Geoffroy F., Sodoyer R., High affinity human antibodies by phage display. Hum. Antibodies 8(4): 155 - 68 (1997).
Bažil V. a Horejsi V., Shedding of the CD44 adhesion molecule from leukocytes induced by anti-CD44 monoclonal antibody simulating the effect of a natural receptor ligand. J. Immunol. 149 (3): 747 - 753, 1992.
Blattler a další, Biochem. 24: 1517 - 1524 (1985).
Breitling F., Duebel S.: Recombinant Antibodies. John Wiley, New York 1999.
• · · ·
- 23 Carlsson a další, Biochem. J., 173: 723 - 737 (1978).
Catty D., Antibodies. Oxford IR Press 1988.
Chari R. V. J., Martell B. A., Gross J. L., Cook S. B., Shah S. A., Blátter W. A., McKenzie S. J., Goldmacher V. S.,
Immunoconjugates containing novel maytansinoids: promising anticancer drugs. Cancer Research 52: 127 - 31, 1992.
Chari R. V. J., Derr S. M., Steeves R. M., Widdison W. C., Doseresponse of the anti-tumor effect of HUN901-DM1 against human smáli cell lung cancer xenografts. Proceedings of the io American Association of Cancer Research (2000) 41 (1. - 5.
duben) Abs. 4405.
Chothia a Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 - 917 (1987).
Frank a další, Methods Enzymol. 154: 221 - 249 (1984).
Gait, M. J., Oligonucleotide Synthesis. A Practical Approach. IRL 15 Press, Oxford, UK (1984).
Goldmacher a další, J. Immunol 135: 3648 - 3651, 1985.
Goldmacher a další, J. Cell Biol. 102: 1312 - 1319, 1986.
Gussow D., Seemann G., Humanization of monoclonal antibodies. Methods Enzymol. 203: 99 - 121 (1991).
Guo Y. J., Liu G., Wang X., Jin D., Wu M., Ma J., a Sy M. S., Potential use of soluble CD44 in sérum as indicator of tumor burden and metastasis in patients with gastric or colon cancer. Cancer Res. 54 (2): 422 - 426, 1994.
Harlow L. D., Antibodies. Cold Spring Harbor Lab. 1988.
Hayden a Mandecki, Gene synthesis by seriál cloning of oligonucleotides. DNA 7 (8): 571 - 7 (1988).
Heider K.-H., Hofmann M., Horst E., van den Berg F., Ponta H., Herrlich P., a Pals S. T., A human homologue of the rat • · · · metastasis-associated variant of CD44 is expressed in colorectal carcinomas and adenomatous polyps., J. Cell Biol. 120: 227 233 (1993).
Heider K. H., Mulder J. W.R., Ostermann E., Susani S., Patzelt E., 5 Pals S. T., Adolf G. R. A., Splice variants of the cell surface glycoprotein CD44 associated with metastatic tumor cells are expressed in normál tissues of humans and cynomolgus monkeys., Eur. J. Cancer 31A: 2385 - 2391, 1995.
Heider K. H., Sproll M., Susani S., Patzelt E., Beaumier P., Ostermann io O., Ahorn H., Adolf G. R. A., Characterization of a high affinity monoclonal antibody antibody specific for CD44v6 as candidate for immunotherapy of squamous cell carcinomas., Cancer
Immunology Immunotherapy 43: 245 - 253, 1996.
Hofmann M., Rudy W., Zoller M., Tolg C., Ponta H., Herriich P., a 15 Gunthert, U., CD44 splice variants confer metastatic behavior in rats: homologous sequences are expressed in human tumor cell lineš., Cancer Res. 51: 5292 - 5297 (1991).
Johnson S., Bird R. E., Construction of single-chain derivatives of monoclonal antibodies and their production in Escherichia coli.,
Methods Enzymol. 203: 88 - 98 (1991).
Kabat E. A., Wu T. T., Perry Η. M., Gottesman K. S. a Foeller C., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5. vyd.)., NIH Publication No. 91 - 3242. US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health,
Bethesda, MD (1991).
Klotz a další, Arch. Biochem. Biophys. 96: 605 (1962).
Koopman G., Heider K.-H., Horts E., Adolf G. R., van den Berg F., Ponta H., Herriich P., Pals S. T., Activated human lymphocytes and aggressive Non-Hodgkin's lymphomas express a homologue • · • · · · • · of the rat metastasis-associated variant of CD44., J. Exp. Med. 177: 897 - 904 (1993).
Kreitman R. J., Hansen H. J., Jones A. L., Fitzgerald D. J. P., Goldenberg D. M., Pastan I., Pseudomonas exotoxin-based immunotoxins containing the antibody LL2 or LL2-Fab’ induce regression of subcutaneous human B-cell lymphoma in mice., Cancer Res. 53: 819 - 825 (1993).
Lambert a další, Biochem. 22: 3913 - 3920 (1983).
Lambert J. M., Derr S. M., Cook S., Braman G., Widdison W., Chari R. ίο V. J., Pharmacokinetics, in vivo stability, and toxicity of the
Tumor-activated prodrug, C242-DM1, a novel colorectal cancer agent., Proceedings of the American Association of Cancer
Research (1998) 39: Abs. 3550
Liu a další, Biochem. 18: 690 (1979), Blakey and Thorpe, Antibody, 15 Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 1:1 - 16 (1988).
Liu C., Tadayoni Β. M., Bourret L. A., Mattocks K. M., Derr S. M., Widdison W. C., Kedersha N. L., Ariniello P. D., Goldmacher V.
S., Lambert J. M., Bláttler W. A., Chari R. V. J., Eradication of large colon tumor xenografts by targeted delivery of maytansinoids., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 8618 - 23, 1996.
Martin S., Jansen F., Bokelmann J., a Kolb H., Soluble CD44 splice variants in metastasizing human breast cancer., Int. J. Cancer 74 (4): 443 - 445, 1997.
Screaton G. R., Bell Μ. V., Jackson D. G., Cornelis F. B., Gerth U., a 25 Bell J. I., Genomic structure of DNA encoding the lymphocyte homing receptor CD44 reveals at least 12 alternatively spliced exons., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89: 12160 - 12164 (1992).
Shin S.-U., Morrison S. L., Production and properties of chimeric antibody molecules., Methods Enzymol. 178: 459 - 476 (1989).
Sliutz G., Tempfer C., Winkler S., Kohlberger P., Reinthaller A., a Kainz C., Immunohistochemical and serological evaluation of CD44 splice variants in human ovarian cancer., Br. J. Cancer 72:1494 - 1497 (1995).
Stemmer a další, Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides, Gene 164(1): 49 - 53 (1995).
Stroomer J. W., Roos J. C., Sproll M., Quak J. J., Heider K. H., Wilhelm B. J., Castelijns J. A., Meyer R., Kwakkelstein M. O., io Snow G. B., Adolf G. R., van Dongen G. A., Safety and biodistribution of 99mTechnetium-labeled anti-CD44v6 monoclonal antibody BIWA 1 in head and neck cancer patients.,
Clin. Cancer Res. 6(8): 3046 - 55, 2000.
Tólg C., Hofmann M., Herrlich P., a Ponta H., Splicing choice from ten 15 variant exons establishes CD44 variability., Nucleic Acids. Res.
21:1225 - 1229 (1993).
Tolcher A. W. a další, SB-408075, a maytansinoid immunoconjugate directed to the C242 antigen: a phase I pharmacokinetic and biologie correlative study., Poster presented at 11th Symp. on new drugs in cancer therapy (7. - 10. listopad, 2000 v Amsterdamu).
Urlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77 (7): 4216 - 20 (1980). Urlaub a další, Cell 33: 405 - 412 (1983).
Verel I., Heider K. H., Siegmund M., Ostermann E., Patzelt E., Sproll 25 M., Snow G. B., Adolf G. R., van Dongen G. M. S., Tumor targeting properties of monoclonal antibodies with different affinity for target antigen CD44v6 in nudě mice bearing headand-neck cancer xenografts., Int. J. Cancer 99: 396 - 402 (2002).
• · 9 9 • ·
Winter G., Griffith A. D., Hawkins R. E., Hoogenboom H. R., Making antibodies by phage display technology., Ann. Rev. Immunol. 12: 433 - 455 (1994).
Worrell a další, Anti-Cancer Drug Design 1: 179 - 184 (1986).
Ye a další, Gene synthesis and expression in E. coli for pump, a human matrix metalloproteinase., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 (1): 143 - 9 (1992).
Přehled obrázků na výkresech io Obr. 1: Cytotoxicita BIWI 1 in vitro. Byly použity antigen-pozitivní buněčné linie A431 a FaDu a antigen-negativní buněčná linie A549.
Obr. 2: Účinnost ošetření BIWI 1 u nahých myší s xenografty tumorů A431. Jsou ukázány průměrné objemy tumorů ve skupině se standardními odchylkami, a jsou uvedeny skupiny podle ošetřování. Šipka ukazuje zahájení ošetřování (den 1).
Obr. 3: Účinnost ošetření BIWI 1 u nahých myší s xenografty tumorů FaDu. Jsou ukázány průměrné objemy tumorů ve skupině se standardními odchylkami a skupiny podle ošetření. Šipka ukazuje zahájení ošetření (den 1).
Obr. 4: Tolerance na ošetření BIWI 1. Je ukázána změna průměrné hmotnosti všech ošetřovaných skupin ve dvou testovaných modelech. Den 1: zahájení ošetřování.
Obr. 5: Účinnost ošetření BIWI 1 u nahých myší s xenografty tumorů 25 MDA-MB 453. Jsou ukázány průměrné objemy tumorů ve skupině se standardními odchylkami a skupiny podle ošetření.
Šipky ukazují dny ošetřování.
- 28 • ·
Příklady provedení vynálezu
1. Materiály a metody
1.1. Test proliferace buněk in vitro
Pro určení počtu životaschopných buněk byl použit test proliferace neradioaktivních buněk Cell Titer 96® AQueous nonradioactive cell proliferation assay (Promega). 5000 buněk na jamku bylo zaočkováno do 96-jamkových destiček v 90 μΙ média bez fenolové červeně. Buňky byly ponechány usadit 1 až 3 h a byla přidána sériová ředění imunokonjugátu v 10 μΙ PBS. Buňky bez imunokonjugátu sloužily jako negativní kontrola. Buňky byly inkubovány 4 dny při 37 °C v atmosféře zvlhčeného 5% CO2 a potom bylo přidáno 20 μΙ MTS/PMS podle doporučení výrobce. Po dalších 1 až 4 h inkubace při 37 °C byla zaznamenána absorbance při 490 nm použitím odečítacího zařízení pro destičky ELISA. Každá buněčná linie byla analyzována v triplikátech. Procento frakce přeživších buněk a hodnota IC50 byly vypočteny s použitím softwaru GraphPad Prism® (Version 3.0).
1.2, Příprava BIWI 1
Humanizované rekombinantní protilátky BIWA 4 a BIWA 8, které mají vazebnou specifitu pro epitop uvnitř SEQ ID NO: 1, byly navázány na maytansinoid DM1 jak bude popsáno dále. Konjugát BIWA 4 a DM1 byl označen BIWI 1.
Vytváření stabilně transfekovaných buněčných linií
Geny kódující lehké a těžké řetězce BIWA 4, SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 7, byly vloženy do expresního vektoru pAD-CMV1 (WO 092/01055; depozitní číslo NCBI GenBank A32111) nebo pAD-CMV19 (depozitní číslo NCBI GenBank A32110). Ve druhé protilátce BIWA 8 byl lehký řetězec kódován genem se sekvencí SEQ ID NO: 9, zatímco těžký řetězec byl stejný jako v případě BIWA 4. Stabilně transfekované • · · · • · buněčné linie byly vytvářeny elektroporací následujícím způsobem. Byly použity buňky CHO DUX/57ss (dhfr-negativní mutanta buněk vaječníků čínského křečka adaptovaná na bezsérové suspenzní kultury). Po trypsinizaci a inaktivaci trypsinu pomocí RPMI10 (90% RPMI 1640, 10% tepelně inaktivovaného fetálního telecího séra), byly buňky promyty jednou RPMI-0 (RPMI 1640 bez séra), a 1 x 107 buněk bylo resuspendováno v 0,8 ml RPMI-0. Po přidání linearizované DNA (20 pg na plasmid; kotransfekce vektorů kódujících lehký a těžký řetězec) byla provedena elektroporace buněk použitím zařízení Hoefer Electroporator za následujících podmínek: 1080 pF, 320 V, 1000 ms, 1 puls. Buňky byly ponechány stát 5 min a potom byly naředěny na 12 500 buněk/ml a 2500 buněk/ml v alfa-MEM 10d (90% MEM alfa bez ribonukleosidů a bez desoxyribonukleosidů (GIBCO BRL), 10% teplem inaktivované dialyzované fetální telecí sérum). Buňky byly zaočkovány na 96-jamkové mikrotitrační destičky (200 pl/jamku, odpovídá 2500, popř. 500 buněk/jamku). Klony se objevily po 10 dnech. Dále byly sledovány pouze destičky s počtem 500 buněk/jamku (3 až 6 klonů/jamku). Po 14 až 15 dnech byly testovány supernatanty z každé jamky metodou κ/γ ELISA. 53 klonů bylo zaočkováno do 12-jamkových destičky v médiu alfa-MEM 10d. Po 3 až 6 dnech (v závislosti na konfluenci buněk) byly supernatanty znovu testovány testem κ/γ ELISA (sériová ředění) a kvantifikovány použitím lidského standardu lgG1. Buňky byly zamraženy a uchovány v kapalném dusíku. Obsah IgG v těchto 53 klonech byl od 12 do 417 ng/ml. Deset klonů s nejvyšší mírou exprese bylo vybráno a subklonováno následujícím způsobem: buňky z každého klonu byly zaočkovány do 96-jamkových mikrotitračních destiček s hustotami 1 a 5 buněk/jamku ve 100 pl/jamku alfa-MEM 10d (1 destička na každý klon a každou hustotu). O 8 dnů později byly supernatanty zředěny 1 : 2 a 100 pl tohoto ředění bylo testováno metodou κ/γ ELISA a kvantifikováno použitím preparátu BIWA 4 jako standardu, Pět subklonů každého klonu bylo převedeno do 12-jamkových destiček. Obsah IgG se • ♦ · · pohyboval od 1,3 do 908 ng/ml. Čtrnáct klonů s nejvyšši hladinou exprese (384 až 908 ng/ml) bylo použito pro amplifikaci s methotrexátem následujícím způsobem: Klony byly nejprve kultivovány v lahvích 25 cm2 obsahujících alfa-MEM 10d s 20, 50 a 100 nM methotrexátem. Po nárůstu klonů byly supernatanty testovány testem κ/γ ELISA. V následujících amplifikačních cyklech byly koncentrace methotrexátu zvýšeny až na 2000 nM. Na počátku byla nejvyšši hladina exprese 10,5 až 14,8 pg/ml (klon A31/100, 100 nM methotrexát). Další amplifikaci s methotrexátem 500 nM byla získána io exprese 19 až 20 pg/ml (A31/500).
Čištění protilátky
Protilátka byla čištěna z supernatantu buněčné kultury následujícím způsobem. Supernatant tkáňové kultury obsahující protilátku byl nanesen na kolonu 5 ml protein A sepharose s průtokem 80 až 90ml/h při 4 °C. Po promytí 50 ml vazebného pufru (0,1 M fosforečnan sodný pH 7,5), byla frakce Ig eluována elučním pufrem (0,1M glycin-HCI pH 2,7). Byla monitorována absorpce při 280 nm.
Modifikace BIWA 4 použitím SPP za vytvoření BIWA 4-SS-Py.
BIWA 4 byl dodáván v kapalné formě s koncentrací 5 mg/ml ve formulaci s PBS obsahující Tween 20. Před navázáním DM1 na MAb byl Tween 20 odstraněn. Roztok MAb (40 ml) byl zředěn 15násobně pufrem 25 mM MES, pH 5,6, s obsahem 50 mM NaCI (pufr MES) a nanesen na kolonu (12,5 ml) Sepharose S ekvilibrované v pufru MES (průtok: 100 cm/h). Kolona byla promyta 10 objemy kolony pufru MES. Protilátka byla eluována pufrem MES obsahujícím 400 mM NaCI. Roztok protilátky byl dialyzován proti 50 mM pufru fosforečnanu draselného pH 6,5 obsahujícímu 50 mM NaCI a 2 mM EDTA (pufr A).
Protilátka BIWA 4 byla modifikována použitím SPP (N• · ·
-hydroxysukcinimidester kyseliny (2-pyridyl)-5-dithiopentanové) pro zavedení dithiopyridylových skupin. MAb v pufru A (185 mg, 8 mg/ml) byla modifikována sedminásobným molárním nadbytkem SPP v EtOH (5% obj./obj. roztok MAb). Reakce pokračovala 90 min při laboratorní teplotě. Reakční směs byla potom čištěna chromatografií gelovou filtrací přes Sephadex G25F (kolona 2,6 x 31,5 cm, 167 ml) ekvilibrovanou v pufru A. Frakce obsahující MAb byly spojeny a stupeň modifikace byl zjištěn měřením absorbance při 280 nm a změnou absorbance při 343 nm způsobenou uvolněním 2-merkaptopyridinu io přidáním DTT. Koncentrace uvolněného 2-merkaptopyridinu byla vypočtena použitím 8343 nm 8080 M'1cm'1 a koncentrace MAb byla vypočtena s použitím ε28ο nm 224 000 M'1cm'1. Po korekci absorbance při 280 nm na příspěvek 2-merkaptopyridinu (2-merkaptopyridin A280 nm = A343 nm x 5100/8080). Izolace MAb poskytla výtěžek 99,6 % s 5,5 uvolnitelnými 2-merkaptopyridinovými skupinami na molekulu MAb.
Konjugace BIWA 4-SS-Py s DM1
Výše modifikovaná MAb (184 mg) v pufru A byla konjugována s 2,5 mg MAb/ml použitím 1,7násobného molárního nadbytku DM1 vzhledem k uvolnitelným 2-merkaptopyridinovým skupinám. DM1 byl přidáván v DMA (3% obj./obj. roztoku MAb) a reakční směs byla inkubována při teplotě laboratoře 29 h. Konjugát byl potom izolován chromatografií gelovou filtrací na koloně Sephacryl S300 HR ekvilibrované v PBS (kolona 5 x 50 cm, 980 ml, průtok 10 cm/h).
Konjugát se eluoval jako jediný vrchol v poloze monomerní MAb s malým množstvím proteinu, který se eluoval dříve. Frakce byly testovány na počet molekul DM1 navázaných na molekulu MAb (navázané molekuly DM1 byly zjišťovány měřením absorbance při 252 nm a 280 nm). Na základě těchto výsledků byly spojeny frakce reprezentující 63 až 77 % objemu kolony. Poměr DM1/MAb ve spojeném roztoku byl 3,1 a výtěžek konjugované BIWA 4 byl 75 %,
9
9999 vztaženo na výchozí MAb. Konjugát BIWI 1 byl hodnocen elektroforézou SDS-PAGE prováděnou za neredukujících podmínek a bylo zjištěno, že je složen primárně z monomerních molekul (>95 %) s menším množstvím (<5 %) dimerního konjugátu.
Analýza vazby BIWI 1 in vitro
Byla zjišťována vazba protilátky BIWA 4 a konjugátu BIWI 1 na antigen-pozitivní buňky FaDu. Buňky (1 až 2 x 10'5) byly inkubovány v 96-jamkových destičkách s různými koncentracemi protilátky nebo io konjugátu na ledu 1 h. Testovaná směs byla odmyta z destičky a byla přidána protilátka proti lidskému IgG značená FITC a inkubace na ledu pokračovala v temnu 1 h. Po promytí byly buňky fixovány s 1% paraformaldehydem a analyzovány na přístroji pro třídění buněk s fluorescenční aktivací (FACS). Protilátka BIWA 4 se váže se zdánlivou konstantou KD 1 x 10'9 M a BIWI 1 se váže se zdánlivou konstantou KD 1,8 x 10'9 M. Konjugace s DM1 tedy mění vazebnou afinitu protilátky pouze nevýznamně, pokud vůbec.
1.3. Studie účinnosti u nahých myší
2o Antitumorová účinnost in vivo konjugátu BIWI 1 byla testována ve dvou xenograftových modelech nahých myší aplikací antigenpozitivních lidských tumorů, které se lišily původem tumoru, mírou a homogenitou exprese CD44v6: A431 (ATCC# CRL 1555; epidermoidní karcinom vulvy), FaDu (ATCC # HTB 43; karcinom skvamózních buněk faryngu). Linie tumorových buněk A431 a FaDu byly získány z ATCC a kultivovány v médiu RPMI1640 s obsahem 10% fetálního telecího séra a doplňků.
Myši byly náhodně rozděleny do následujcích skupin podle ošetření (způsob ošetření/počáteční střední objem tumoru/rozmezí
3o objemu tumoru/počet myší):
• · ··· ·
• · · • φφφ » φ φ φ « φφφ · φ ·« φφφ· » ·· ·
Α431
Skupina 1: Kontrola (PBS)/185 ±217 mm3/19 - 424 mm3/5 myší.
Skupina 2: BIWA 4 (21 mg/kg/den)/133 ±115 mm3/42 - 302 mm3/ myší.
Skupina 3: BIWI 1 (2,1 mg/kg/den)/107 ± 63 mm3/42 - 205 mm3/ myší.
Skupina 4: BIWI 1 (7 mg/kg/den)/132 ± 73 mm3/42 - 205 mm3/5 myší.
Skupina 5: BIWI 1 (21 mg/kg/den)/107 ± 63 mm3/42 - 205 mm3/ myší.
FaDu
Skupina 1: Kontrola (PBS)/142 ± 82 mm3/34 - 268 mm3/8 myší.
Skupina 2: BIWA 4 (21 mg/kg/den)/134 ± 86 mm3/42 - 268 mm3/ myší.
Skupina 3: BIWI 1 (2,1 mg/kg/den)/149 ± 96 mm3/50 - 268 mm3/ myší.
Skupina 4: BIWI 1 (7 mg/kg/den)/132 ± 97 mm3/42 - 268 mm3/6 myší.
Skupina 5: BIWI 1 (21 mg/kg/den)/129 ± 74 mm3/50 - 231 mm3/ myší.
x 106 tumorových buněk bylo transplantováno subkutánně do pravého boku 6 týdenních samic myší NMRl-nu/nu. Ošetření bylo zahájeno, když tumory dosáhly průměrné velikosti 107 až 185 mm3. Léčení se skládalo z i.v. injekcí BIWI 1 podávaného v pěti za sebou následujících dnech, přičemž počínaje dnem 1 byly testovány tři různé dávky BIWI 1 paralelně. 2,1 mg/kg/den BIWI 1 odpovídající 30 pg/kg/den DM1, 7 mg/kg/den BIWI 1 odpovídající 100 pg/kg/den DM1, a 21 mg/kg/den BIWI 1 odpovídající 300 pg/kg/den DM1. Kontrolní zvířata buď nebyla ošetřována (PBS) nebo byla ošetřována nekonjugovanou protilátkou (kontrolní protilátka, 21 mg/kg/den). Růst
4444 ♦ 4 4
4 4
4 4 4
4 4444
4 4
4 4 tumoru byl monitorován měřením velikosti tumoru. Reakce tumoru byla hodnocena jako kompletní reakce, jestliže tumor úplně zmizel v kterémkoli čase po zahájení ošetření. Reakce byla hodnocena jako částečná reakce, jestliže se objem tumoru zmenšil po ošetření, ale potom začal znovu růst. Schopnost tolerovat ošetření byla monitorována měřením hmotnosti myši po celou dobu pozorování.
2. Výsledky a diskuse
2.1. Cytotoxicita BIWI 1 in vitro io Cytotoxicita BIWI 1 in vitro byla hodnocena použitím antigenpozitivních buněčných linií A431 a FaDu, a antigen-negativní buněčné linie A459. Buňky byly vystaveny různým koncentracím BIWI 1 čtyři dny, potom barveny MTS/PMS a hodnoceny na čtecím zařízení destiček ELISA. Přežívající frakce buněk byly potom vypočteny pomocí balíku software GraphPad Prism®. Výsledky jsou ukázány na obr. 1. BIWI 1 měl účinnost při usmrcování antigen-pozitivních buněk A431 s konstantou IC5o přibližně 7,6 x 10'8 M a druhé antigen-pozitivní buněčné linie FaDu s konstantou IC50 přibližně 2,4 x 10’8 M. Antigennegativní buněčná linie A549 byla ovlivňována konjugátem s konstantou 1,3 x 10'7 M s přežívající frakcí 50 % při nejvyšší testované koncenttraci BIWI 1 (5 x 10'7 M). Tyto výsledky ukazují, že BIWI 1 má pouze mírně vyšší cytotoxicitu vůči antigen-pozitivním buňkám než vůči antigen-negativním buňkám in vitro. Pro porovnání bylo ukázáno, že další konjugát DM1-protilátka má alespoň
1000násobně vyšší cytotoxicitu proti antigen-pozitivním buňkám ve srovnání s antigen-negativními buňkami (Chari a další, 1992).
2.2. Účinnost A431 u nahých myší s xenografty
Skupiny 5 myší byly ošetřovány 2,1 mg/kg/den BIWI 1,
7 mg/kg/den BIWI 1, 21 mg/kg/den BIWI 1 a 21 mg/kg/den kontrolní • · ··4· • · ·
- 35 protilátky. Průměrná velikost tumoru při zahájení ošetřováni byla 185 ± 217 mm3 (PBS), 133 ± 115 mm3 (kontrolní protilátka), 107 ± 63 mm3 (21 mg/kg/den BIWI 1), 132 ± 73 mm3 (7 mg/kg/den BIWI 1), a 107 ± 63 mm3 (2,1 mg/kg/den BIWI 1). Průměrný objem tumoru v každé skupině v období pozorování je ukázán na obr. 2. Tumory ošetřované kontrolní protilátkou vykazovaly podobný růst jako neošetřené tumory, přičemž objem tumoru se zdvojnásobil přibližně v průběhu 5 dnů. U zvířat léčených buď 7 mg/kg/den BIWI 1 nebo 21 mg/kg/den BIWI 1 došlo k úplné reakci všech tumorů, které zmizely přibližně v den 17. Až io do konce období pozorování (den 134) nebyl pozorován žádný opakovaný růst tumorů. Tumory ošetřené koncentrací 2,1 mg/kg/den reagovaly úplně ve 3/5 případů, přičemž nebyl pozorován až do dne 134 žádný opakovaný růst tumorů. Zbývající dva tumory vykázaly částečnou reakci, ale nakonec znovu narostly. Tyto výsledky ukazují, že BIWI 1 indukuje antitumorovou odpověď u nahých myší s xenografty A431 v závislosti na dávce, přičemž úplné a dlouhotrvající reakce se projevují od koncentrace 2,1 mg/kg/den BIWI 1 do 21 mg/kg/den BIWI 1. Nekonjugovaná kontrolní protilátka nemá žádný antitumorový účinek, viz obr. 2.
2,2. Účinnost u nahých myší s xenografty FaDu
Skupiny 6 myší byly ošetřovány 2,1 mg/kg/den BIWI 1, 7 mg/kg/den BIWI 1, 21 mg/kg/den BIWI 1, a 21 mg/kg/den kontrolní protilátky. Průměrná velikost tumoru při zahájení ošetřování byla 142 ±
82 mm3 (PBS), 134 ± 86 mm3 (kontrolní protilátka), 129 ± 74 mm3 (21 mg/kg/den BIWI 1), 132 ± 97 mm3 (7 mg/kg/den BIWI 1), a 149 ± 96 mm3 (2,1 mg/kg/den BIWI 1). Průměrný objem tumoru v každé skupině v průběhu období pozorování je ukázán na obr. 3. Tumory ošetřené kontrolní protilátkou a 2,1 mg/kg/den BIWI 1 vykázaly podobný nárůst jako neošetřené tumory, přičemž doba zdvojení objemu tumoru byla přibližně 5 dnů. U zvířat ošetřovaných ····
- 36 4 ·
4
4 4
4 4 «
4 4
4444 mg/kg/den BIWI 1 všechny tumory reagovaly úplně a vymizely přibližně v den 24. Až do konce období pozorování (den 107) nebyl pozorován opakovaný růst tumoru. Jeden ze šesti tumorů ošetřených 7 mg/kg/den BIWI 1 reagoval úplně, tři ze šesti tumorů reagovaly částečně. Zbývající dva tumory rostly podobně jako neléčené kontrolní tumory. Tyto výsledky ukazují, že BIWI 1 indukuje u nahých myší s xenografty FaDu antitumorovou odpověď závislou na dávce, přičemž úplné a dlouhotrvající reakce byly pozorovány při koncentracích od 7 mg/kg/den BIWI 1 do 21 mg/kg/den BIWI 1. Nekonjugované kontrolní io protilátky nemají žádný antitumorových účinek, viz obr. 3.
2.4. Tolerance u nahých myší
Tolerance k ošetření BIWI 1 byla zjišťována monitorováním hmotnosti myší po celý průběh experimentu ve dvou modelech.
Maximální pozorovaný průměrný úbytek hmotnosti ve skupině byl 5 % u myší s xenografty FaDu ošetřovaných 21 mg/kg/den BIWI 1 (obr. 4). Úbytek hmotnosti byl pozorován počínaje přibližně dnem 3 ošetřování a končil do dne 10, přičemž potom zvířata nabyla původní hmotnost a chovala se podobně jako kontrolní zvířata. U všech dalších skupin podle dávky byl úbytek hmotnosti podobný jako u kontroly s vehikulem (PBS). Průměrný úbytek hmotnosti 5 % nebo nižší u všech ošetřovaných skupin ukazuje na dobrou toleranci ošetření BIWI 1 při daných dávkách u nahých myší. Protože BIWI 1 nereaguje zkříženě s myším CD44v6, při tomto experimentu mohly být monitorovány pouze účinky nezávislé na antigenu, jako je toxicita způsobená volným DM1.
• 4 ····
- 37 44 ·
4 4 ·
I
4 4
44
4 4
4 4
4 4 4
4 44444
4 4
4 4
3. Antitumorová účinnost u MDA-MB 453 in vivo
3.1. Materiál a metody
Antitumorová účinnost BIWI 1 in vivo byla testována na modelu xenograftů u nahých myší s použitím antigen-pozitivního lidského tumoru MDA-MB 453 (ATCC # HTB-131; karcinom prsu). Buňky byly získány z ATCC a kultivovány v médiu RPMI1640 s obsahem 10% fetálního telecího séra a doplňků. 1 x 106 tumorových buněk bylo podkožně transplantováno do pravého boku samic myší NMRl-nu/nu stáří šesti týdnů. Pro experimenty s terapií byly tumory udržovány io pasážováním tumorových fragmentů. Léčení bylo zahájeno, když tumory dosáhly průměrné velikosti 188 až 246 mm3. Ošetření zahrnovalo i.v. injekce BIWI 1 podávané týdně po dobu čtyř týdnů. Paralelně byly testovány tři různé dávky BIWI 1: 6,25 mg/kg BIWI 1 odpovídající 100 mg/kg DM1, 12,5 mg/kg BIWI 1 odpovídající
200 mg/kg DM1, a 25 mg/kg BIWI 1 odpovídající 400 mg/kg DM1.
Zvířata ošetřovaná PBS sloužila jako kontrola pro růst tumoru. Růst tumoru byl monitorován měřením velikosti tumoru. Reakce tumoru byla považována za úplnou reakci, pokud tumor úplně zmizel v jakémkoli čase po začátku ošetřování.
3.2. Výsledky a diskuse
Skupiny 6 myší byly ošetřovány 6,25 mg/kg BIWI 1, 12,5 mg/kg BIWI 1 a 25 mg/kg BIWI 1, jednou týdně po dobu čtyř týdnů. Průměrná velikost tumoru na začátku léčení byla 246 ± 79 mm3 (PBS), 216 ± 85 mm3 (6,25 mg/kg BIWI 1), 188 ± 79 mm3 (12,5 mg/kg BIWI 1) a 207 ± 96 mm3 (25 mg/kg BIWI 1). Průměrný objem tumoru v každé skupině v průběhu období pozorování je ukázán na obr. 5. Počáteční doba zdvojení objemu tumoru u kontrolních tumorů byla přibližně 5 dnů. U zvířat ošetřovaných koncentrací 25 mg/kg BIWI 1 všechny tumory reagovaly úplně a vymizely kolem dne 22 po zahájení léčení. Až do ukončení období pozorování (den 64) nebyl pozorován žádný
• · · 4 ·· ··
4« ·4»4
• · 4· * opakovaný růst tumorů. Tumory léčení 12,5 mg/kg nebo 6,25 mg/kg reagovaly úplně v pěti ze šesti případů v každé skupině a u čtyř zvířat v každé skupině se tumory nevyskytly až do konce experimentu. Tyto výsledky ukazují, že BIWI 1 indukuje vynikající antitumorové reakce u nahých myší s xenografty MDA-MB 453 při podávání jednou týdně po dobu čtyř týdnů, přičemž úplné a dlouhotrvající reakce se ukazují u 6,25 mg/kg BIWI 1 až 25 mg/kg BIWI 1.
Claims (37)
- PATENTOVÉ NÁROKYSloučenina vzorceA(LB)n kdeA je molekula protilátky specifická pro CD44; L je propojovací skupina;B je sloučenina toxická pro buňky; a n desetinné číslo, kde n = 1 až 10.
- 2. Sloučenina podle nároku 1, kde propojovací skupina obsahuje chemickou vazbu schopnou rozštěpení uvnitř buňky.15
- 3. Sloučenina podle nároku 2, kde uvedená chemická vazba je disulfidická vazba.
- 4. Sloučenina podle nároků 1 až 3, kde molekula protilátky je specifická pro exon v6 lidského CD44.
- 5. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 4, kde molekula protilátky je specifická pro epitop uvnitř aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 3.
- 6. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 5, kde molekula protilátky je monoklonální protilátka VFF-18 (DSM ACC2174)-40 ·· · · · · · · · • · · · · · • · · · · · · nebo rekombinantní protilátka obsahující oblasti určující komplementaritu neboli CDR protilátky VFF-18.
- 7. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 6, kde molekula5 protilátky obsahuje lehké řetězce s aminokyselinovou sekvencíSEQ ID No. 4 nebo SEQ ID No. 8, a těžké řetězce s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 6.
- 8. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 7, kde toxická io sloučenina B je maytansinoid.
- 9. Sloučenina podle nároku 8, kde maytansinoid má vzorec ch3 o (ch^sr.vzorec (II) kdeRi znamená H nebo SR4, kde R4 znamená methyl, ethyl, přímý alkyl, rozvětvený alkyl, cyklický alkyl, jednoduchý nebo substituovaný aryl, nebo heterocykl;R2 znamená Cl nebo H;R3 znamená H nebo CH3; a m znamená 1, 2 nebo 3.5
- 10. Sloučenina podle nároku 9, kde Ri je H nebo CH3, R2 je Cl, R3 je CH3 a m = 2.(A)
- 11. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 10 vzorce (L')·· kde20 A je molekula protilátky specifická pro CD44, (L’) je případná propojovací skupina, p je desetinné číslo, kde p = 1 až 10.
- 12. Sloučenina podle některého z nároků 1 až 11, kde p je 3 až 4.- 42
- 13. Konjugát molekuly protilátky specifické pro CD44v6 a maytansinoidu.
- 14. Konjugát podle nároku 13, kde molekula protilátky je specifická5 pro epitop v rámci aminokyselinové sekvence SEQ ID No. 3.
- 15. Konjugát podle nároku 14, kde molekula protilátky je monoklonální protilátka VFF-18 (DSM ACC2174) nebo rekombinantní protilátka obsahující oblasti určující io komplementaritu neboli CDR protilátky VFF-18.
- 16. Konjugát podle některého z nároků 13 až 15, kde molekula protilátky obsahuje lehké řetězce s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 4 nebo SEQ ID No. 8, a těžké řetězce15 s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 6.
- 17. Konjugát podle některého z nároků 13 až 16, kde maytansinoid je navázaný na molekulu protilátky prostřednictvím disulfidické skupiny.
- 18. Konjugát podle některého z nároků 13 až 17, kde maytansinoid má vzorec
- 19. Konjugát molekuly protilátky specifické pro CD44v6 a maytansinoidu, kde protilátka obsahuje lehké řetězce s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID No. 4 a těžké řetězce •o vzorec (IV) a je navázaný na protilátku přes disuIfidickou vazbu.- 44 • · · ····«· ·· · ···· · · 9 9 9 99 99 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 99999 99 99 99 99 9 9 9
- 20. Konjugát podle některého z nároků 13 až 19, kde na molekulu protilátky je navázán jeden nebo více zbytků maytansinoidu.5
- 21. Konjugát podle nároku 20, kde na molekulu protilátky jsou navázány tři až čtyři zbytky maytansinoidu.
- 22. Konjugát podle některého z nároků 13 až 21, kde maytansinoid je navázán na molekulu protilátky prostřednictvím skupiny -βίο -CH2CH2-CO-, -S-CH2CH2CH2CH2-CO- nebo -S-CH(CH3)CH2CH2-CO-.
- 23. Způsob výroby sloučeniny A(LB)n podle některého z nároků 1 až 12, nebo konjugátu podle některého z nároků 13 až 22,15 vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:(a) do molekuly protilátky, která je specifická pro CD44, se zavede jedna nebo více volných nebo chráněných thiolových skupin;2o (b) molekula protilátky z kroku (a) se ponechá reagovat se sloučeninou, která je toxická pro buňky, kde tato sloučenina obsahuje jednu nebo více disulfidických nebo thiolových skupin; a (c) získaný konjugát se izoluje.
- 24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, ž e molekula protilátky je specifická pro CD44v6.- 45 «· ······ ·· · ·· · · · · · · ·· · · · ··«· • · · · · ··· ···· • · · · «· · · ·
- 25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, ž e molekula protilátky je specifická pro epitop v rámci SEQ ID No. 3.5
- 26. Způsob podle některého z nároků 23 až 25, vyznačující se tím, že toxická sloučenina je maytansinoid.
- 27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, io že maytansinoid má vzorecČH3 O kdeR1 znamená H nebo SR4, kde R4 znamená methyl, ethyl, přímý alkyl, rozvětvený alkyl, cyklický alkyl, jednoduchý nebo substituovaný aryl, nebo heterocykl;R2 znamená Cl nebo H;R3 znamená H nebo CH3; a ·« « · · ···· • · · · · · · · ····- 46 m znamená 1, 2 nebo 3.
- 28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že Ri je H nebo CH3, R2 je Cl, R3 je CH3 a m = 2.
- 29. Způsob podle některého z nároků 23 až 28, vyznačující se tím, že pro zavedení volných nebo chráněných thiolových skupin do molekuly protilátky se použije N-hydroxysukcinimidester kyseliny (2-pyridy l)-310 -dithiopropanové, N-hydroxysukcinimidester kyseliny (2-pyridyl)-4-dithiopentanové a N-hydroxysukcinimidester kyseliny (2-pyridyl)-5-dithiopentanové.
- 30. Sloučenina získatelná způsobem podle některého z nároků 2315 až 29.
- 31. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje sloučeninu A(LB)n podle některého z nároků 1 až 12, nebo 30, nebo konjugát podle nároků 13 až 22, a20 farmaceuticky přijatelný nosič, ředivo nebo pomocnou látku.
- 32. Použití sloučeniny A(LB)n podle některého z nároků 1 až 12, nebo 30, nebo konjugátu podle některého z nároků 13 až 22, pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení rakoviny.
- 33. Použití podle nároku 32, kde rakovinou je karcinom skvamózních buněk hlavy a krku, karcinom skvamózních buněk jícnu, karcinom skvamózních buněk plic, karcinom skvamózních buněk kůže, karcinom skvamózních buněk • · · · · · · · ·· φ • · φφ φ φφφ φφ φφ φ φφφφ • · · φ φ · φ φ φφφφ- 47 děložního čípku, adenokarcinom prsu, adenokarcinom plic, adenokarcinom pankreatu, adenokarcinom tlustého střeva nebo adenokarcinom žaludku.5
- 34. Použití sloučeniny A(LB)n podle některého z nároků 1 až 12, nebo 30, nebo konjugátu podle některého z nároků 13 až 22, nebo farmaceutického prostředku podle nároku 31, pro léčení rakoviny.io
- 35. Použití podle nároku 34, kde rakovinou je karcinom skvamózních buněk hlavy a krku, karcinom skvamózních buněk jícnu, karcinom skvamózních buněk plic, karcinom skvamózních buněk kůže, karcinom skvamózních buněk děložního čípku, adenokarcinom prsu, adenokarcinom plic,15 adenokarcinom pankreatu, adenokarcinom tlustého střeva nebo adenokarcinom žaludku.
- 36. Způsob léčení rakoviny u pacienta v případě potřeby, který zahrnuje podávány terapeuticky účinného množství sloučeniny20 A(LB)n podle některého z nároků 1 až 12, nebo 30, nebo konjugátu podle některého z nároků 13 až 22, nebo farmaceutického prostředku podle nároku 31, pacientovi.
- 37. Způsob podle nároku 36, kde rakovinou je karcinom25 skvamózních buněk hlavy a krku, karcinom skvamózních buněk jícnu, karcinom skvamózních buněk plic, karcinom skvamózních buněk kůže, karcinom skvamózních buněk děložního čípku, adenokarcinom prsu, adenokarcinom plic, adenokarcinom pankreatu, adenokarcinom tlustého střeva30 nebo adenokarcinom žaludku.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01112227A EP1258255A1 (en) | 2001-05-18 | 2001-05-18 | Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20033477A3 true CZ20033477A3 (en) | 2004-05-12 |
Family
ID=8177473
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20033477A CZ20033477A3 (en) | 2001-05-18 | 2002-05-16 | Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP1258255A1 (cs) |
| JP (1) | JP2004529963A (cs) |
| KR (1) | KR20030097883A (cs) |
| CN (1) | CN1509187A (cs) |
| AR (1) | AR035977A1 (cs) |
| BG (1) | BG108366A (cs) |
| BR (1) | BR0209862A (cs) |
| CA (1) | CA2443438A1 (cs) |
| CO (1) | CO5550468A2 (cs) |
| CZ (1) | CZ20033477A3 (cs) |
| EA (1) | EA200301159A1 (cs) |
| EE (1) | EE200300568A (cs) |
| HR (1) | HRP20030932A2 (cs) |
| HU (1) | HUP0400046A3 (cs) |
| IL (1) | IL157965A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA03010432A (cs) |
| NO (1) | NO20035108D0 (cs) |
| NZ (1) | NZ530167A (cs) |
| PE (1) | PE20021097A1 (cs) |
| PL (1) | PL365480A1 (cs) |
| SK (1) | SK15582003A3 (cs) |
| WO (1) | WO2002094325A2 (cs) |
| YU (1) | YU91503A (cs) |
| ZA (1) | ZA200307364B (cs) |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8071072B2 (en) * | 1999-10-08 | 2011-12-06 | Hoffmann-La Roche Inc. | Cytotoxicity mediation of cells evidencing surface expression of CD44 |
| US6441163B1 (en) * | 2001-05-31 | 2002-08-27 | Immunogen, Inc. | Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents |
| US7084257B2 (en) | 2001-10-05 | 2006-08-01 | Amgen Inc. | Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity |
| EP1417974A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-05-12 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and radiotherapy |
| US7384744B2 (en) | 2002-11-29 | 2008-06-10 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg | Expression vector, methods for the production of heterologous gene products and for the selection of recombinant cells producing high levels of such products |
| DE10256083A1 (de) * | 2002-11-29 | 2004-08-12 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg | Expressionsvektor, Verfahren zur Herstellung von heterologen Genprodukten und Selektionsverfahren für hochproduzierende rekombinante Zellen |
| US7276497B2 (en) | 2003-05-20 | 2007-10-02 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising new maytansinoids |
| ES2559670T3 (es) * | 2003-05-20 | 2016-02-15 | Immunogen, Inc. | Agentes citotóxicos mejorados que comprenden nuevos maitansinoides |
| CN103145844B (zh) * | 2003-07-21 | 2016-08-03 | 伊缪诺金公司 | Ca6抗原特异性细胞毒性偶联物及其应用方法 |
| CA2556027C (en) | 2004-02-12 | 2015-11-24 | Morphotek, Inc. | Monoclonal antibodies that specifically block biological activity of a tumor antigen |
| AU2005314392B2 (en) | 2004-12-09 | 2011-04-14 | Centocor, Inc. | Anti-integrin immunoconjugates, methods and uses |
| AU2006213662B2 (en) * | 2005-02-11 | 2010-08-05 | Immunogen, Inc. | Process for preparing stable drug conjugates |
| AU2006223301B2 (en) | 2005-03-10 | 2010-11-04 | Eisai, Inc. | Anti-mesothelin antibodies |
| CN101374545B (zh) * | 2005-04-15 | 2012-03-28 | 免疫基因公司 | 消除肿瘤中的异质或混合细胞群体 |
| JP2009521206A (ja) | 2005-04-22 | 2009-06-04 | モルフォテック、インク． | 免疫エフェクター活性を有する葉酸受容体アルファ陽性細胞に内部移行する抗体 |
| EP2399609B1 (en) | 2005-08-24 | 2015-03-18 | ImmunoGen, Inc. | Process for preparing maytansinoid antibody conjugates |
| EP1806365A1 (en) * | 2006-01-05 | 2007-07-11 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them |
| AR059900A1 (es) * | 2006-03-17 | 2008-05-07 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-tat226 e inmunoconjugados |
| HUE043645T2 (hu) | 2009-06-03 | 2019-08-28 | Immunogen Inc | Konjugációs módszerek |
| TW201117814A (en) * | 2009-10-02 | 2011-06-01 | Sanofi Aventis | New maytansinoids and the use of said maytansinoids to prepare conjugates with an antibody |
| PT2691155T (pt) | 2011-03-29 | 2019-02-19 | Immunogen Inc | Preparação de conjugados de anticorpo de maitansinoide por processo de uma etapa |
| CN102337298B (zh) * | 2011-08-19 | 2013-11-06 | 黄开红 | 一种输送siRNA的免疫纳米载体及其制备方法和应用 |
| CA2886993A1 (en) | 2012-10-04 | 2014-04-10 | Immunogen, Inc. | Use of a pvdf membrane to purify cell-binding agent cytotoxic agent conjugates |
| GB201220891D0 (en) | 2012-11-21 | 2013-01-02 | Kit Karlsrusher Inst Fuer Technologie Und Inst Fuer Toxikologie Und Genetik And Amcure Gmbh | CD44v6-derived peptides for treating breast cancers |
| GB201220889D0 (en) * | 2012-11-21 | 2013-01-02 | Kit Karlsrusher Inst Fuer Technologie Und Inst Fuer Toxikologie Und Genetik And Amcure Gmbh | CD44v6-derived peptides for treating metastasizing cancers |
| GB201220901D0 (en) * | 2012-11-21 | 2013-01-02 | Kit Karlsrusher Inst Fuer Technologie Und Inst Fuer Toxikologie Und Genetik And Amcure Gmbh | CD44v6-derived peptides for treating pancreatic cancer |
| GB201220899D0 (en) * | 2012-11-21 | 2013-01-02 | Kit Karlsrusher Inst Fuer Technologie Und Inst Fuer Toxikologie Und Genetik And Amcure Gmbh | CD44v6-derived pegylated peptides |
| JP6608823B2 (ja) | 2013-08-26 | 2019-11-20 | レゲネロン ファーマシューティカルス，インコーポレーテッド | マクロライドジアステレオマーを含む医薬組成物、その合成方法、及び治療上の使用 |
| GB201421647D0 (en) | 2014-12-05 | 2015-01-21 | Amcure Gmbh And Ruprecht-Karls-Universitat And Karlsruher Institut F�R Technologie | CD44v6-derived cyclic peptides for treating cancers and angiogenesis related diseases |
| WO2016150521A1 (en) * | 2015-03-26 | 2016-09-29 | Fundación Imdea Nanociencia | Functionalised magnetic nanoparticle |
| JP2021519608A (ja) * | 2018-02-22 | 2021-08-12 | マルティチュード・インコーポレーテッド | 治療抗体およびその使用 |
| CN114057874B (zh) * | 2020-07-31 | 2023-05-05 | 北京市神经外科研究所 | 抗cd44的单链抗体及其在制备治疗肿瘤的药物中的用途 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2026147C (en) * | 1989-10-25 | 2006-02-07 | Ravi J. Chari | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
| US5208020A (en) * | 1989-10-25 | 1993-05-04 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use |
| UY24389A1 (es) * | 1995-12-06 | 2001-10-25 | Karlsruhe Forschzent | Composición farmacéutica para el tratamiento de carcinoma de epitelio plano |
| DE19648209A1 (de) * | 1996-11-21 | 1998-05-28 | Boehringer Ingelheim Int | Verfahren zur Tumorzelldepletion CD34-positiver Zellen |
| DE19708713C2 (de) * | 1997-03-04 | 2002-11-28 | Boehringer Ingelheim Int | Verwendung von anti-CD44 Antikörpern enthaltenden Präparationen zur Behandlung bestimmter Tumore und zur Unterdrückung von Immunreaktionen |
| NZ515975A (en) * | 1999-06-25 | 2004-01-30 | Genentech Inc | Anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates useful in the treatment of tumors characterised by the overexpression of an ErbB receptor |
| EP1229934B1 (en) * | 1999-10-01 | 2014-03-05 | Immunogen, Inc. | Compositions and methods for treating cancer using immunoconjugates and chemotherapeutic agents |
-
2001
- 2001-05-18 EP EP01112227A patent/EP1258255A1/en not_active Withdrawn
-
2002
- 2002-05-16 PL PL02365480A patent/PL365480A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-05-16 BR BR0209862-8A patent/BR0209862A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-05-16 EP EP02753054A patent/EP1395290A2/en not_active Withdrawn
- 2002-05-16 MX MXPA03010432A patent/MXPA03010432A/es not_active Application Discontinuation
- 2002-05-16 YU YU91503A patent/YU91503A/sh unknown
- 2002-05-16 HU HU0400046A patent/HUP0400046A3/hu unknown
- 2002-05-16 CA CA002443438A patent/CA2443438A1/en not_active Abandoned
- 2002-05-16 SK SK1558-2003A patent/SK15582003A3/sk not_active Application Discontinuation
- 2002-05-16 JP JP2002591041A patent/JP2004529963A/ja active Pending
- 2002-05-16 NZ NZ530167A patent/NZ530167A/en unknown
- 2002-05-16 EA EA200301159A patent/EA200301159A1/ru unknown
- 2002-05-16 CZ CZ20033477A patent/CZ20033477A3/cs unknown
- 2002-05-16 CN CNA028101634A patent/CN1509187A/zh active Pending
- 2002-05-16 KR KR10-2003-7015037A patent/KR20030097883A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-05-16 EE EEP200300568A patent/EE200300568A/xx unknown
- 2002-05-16 WO PCT/EP2002/005413 patent/WO2002094325A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-05-16 IL IL15796502A patent/IL157965A0/xx unknown
- 2002-05-17 AR ARP020101829A patent/AR035977A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-05-17 PE PE2002000420A patent/PE20021097A1/es not_active Application Discontinuation
-
2003
- 2003-09-22 ZA ZA200307364A patent/ZA200307364B/en unknown
- 2003-11-14 HR HR20030932A patent/HRP20030932A2/xx not_active Application Discontinuation
- 2003-11-17 BG BG108366A patent/BG108366A/bg unknown
- 2003-11-17 NO NO20035108A patent/NO20035108D0/no not_active Application Discontinuation
- 2003-11-18 CO CO03101695A patent/CO5550468A2/es not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| YU91503A (sh) | 2006-05-25 |
| EE200300568A (et) | 2004-04-15 |
| BR0209862A (pt) | 2004-06-08 |
| BG108366A (bg) | 2004-09-30 |
| ZA200307364B (en) | 2004-04-20 |
| PE20021097A1 (es) | 2003-02-13 |
| NO20035108L (no) | 2003-11-17 |
| PL365480A1 (en) | 2005-01-10 |
| KR20030097883A (ko) | 2003-12-31 |
| WO2002094325A2 (en) | 2002-11-28 |
| CA2443438A1 (en) | 2002-11-28 |
| MXPA03010432A (es) | 2004-04-02 |
| CN1509187A (zh) | 2004-06-30 |
| HUP0400046A3 (en) | 2006-02-28 |
| AR035977A1 (es) | 2004-07-28 |
| IL157965A0 (en) | 2004-03-28 |
| JP2004529963A (ja) | 2004-09-30 |
| CO5550468A2 (es) | 2005-08-31 |
| EA200301159A1 (ru) | 2004-06-24 |
| HRP20030932A2 (en) | 2004-04-30 |
| NO20035108D0 (no) | 2003-11-17 |
| SK15582003A3 (sk) | 2004-04-06 |
| EP1395290A2 (en) | 2004-03-10 |
| NZ530167A (en) | 2005-10-28 |
| WO2002094325A3 (en) | 2003-04-17 |
| EP1258255A1 (en) | 2002-11-20 |
| HUP0400046A2 (hu) | 2004-04-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20033477A3 (en) | Conjugates of an antibody to CD44 and a maytansinoid | |
| US7361347B2 (en) | Cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates | |
| EP1391213A1 (en) | Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents | |
| JP6860614B2 (ja) | フォレート受容体１抗体及びそのイムノコンジュゲート及び使用 | |
| US20050244413A1 (en) | Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents | |
| EP1806365A1 (en) | Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them | |
| JP7057980B2 (ja) | 抗－ヒトインターロイキン－２抗体及びその用途 | |
| CN104411329A (zh) | 用于靶向免疫疗法的化合物 | |
| JP2007500236A (ja) | 組換え抗ｃｄ３０抗体とその使用 | |
| CN115884793A (zh) | 具有含肽接头的位点特异性抗体-药物缀合物 | |
| CN115666642A (zh) | 含有α-烯醇酶抗体的药物缀合物和其用途 | |
| JP2022553839A (ja) | 抗－ｃｄ４５抗体及びそのコンジュゲート | |
| US20040120949A1 (en) | Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and radiotherapy | |
| EP1417974A1 (en) | Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and radiotherapy | |
| RU2814164C2 (ru) | Антитело против клаудина 18.2 и его конъюгат антитело-лекарственное средство | |
| AU2002313471A1 (en) | Cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates | |
| JP2022552349A (ja) | Ｂリンパ球特異的アマトキシン抗体コンジュゲート |